JP2020105180A - ポリペプチドの組換え生産中におけるジスルフィド結合還元の防止 - Google Patents
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Abstract
Description
哺乳動物細胞は、主に正しく折り畳まれ組み立てられた異種タンパク質を生産するその能力と、翻訳後修飾のその能力のため、臨床用途のための哺乳動物タンパク質の生産のための優位な系になった。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、及び例えばマウスミエローマ(NS0)、ベビーハムスター腎臓(BHK)、ヒト胚腎臓(HEK-293)及びヒト網膜細胞、例えばヒト網膜細胞から単離されたPER.C6(登録商標)細胞株のような様々な他の哺乳動物源から得られた細胞株は、ヒト糖鎖修飾特性をもたらすが、ヒトの生理に適合する抗体を自然に生産することができ、生物製剤製品の製造のための規制機関によって承認されている。
細胞が十分な数まで増殖したとき、それらを大規模製造タンクに移し、長期間にわたって増殖させる。プロセスのこの点で、組換えタンパク質を収集することができる。典型的には、細胞を操作してポリペプチドを細胞培養培地中に分泌させるので、精製工程における最初の工程は培地から細胞を分離することである。典型的には、収集は、収集細胞培養液(HCCF)を生産するために遠心分離と濾過を含む。ついで、培地について、細胞片、望まれないタンパク質、塩、無機質又は他の望ましくない元素を除去する数種の更なる精製工程を実施する。精製プロセスの終わりには、組換えタンパク質は高度に純粋であり、ヒトの治療用途に適している。
一実施態様では、チオレドキシン阻害剤が収集前培養液に添加される。
他の実施態様では、チオレドキシン阻害剤が収集培養液添加される。
更なる実施態様では、チオレドキシン阻害剤はチオレドキシンの直接阻害剤である。
全ての実施態様において、チオレドキシン阻害剤は、例えば、アルキル−2−イミダゾリルジスルフィド又はナフトキノンスピロケタール誘導体でありうる。
更なる実施態様では、チオレドキシン阻害剤は、チオレドキシンレダクターゼの特異的阻害剤である。
また更なる実施態様では、チオレドキシン阻害剤は金錯体であり、ここで、金錯体は、例えばオーロチオグルコース(ATG)又は金チオリンゴ酸塩(ATM)でありうる。効果的な阻害濃度は変動し得、典型的には約0.1mM及び1mMの間である。同様に、最小の有効阻害濃度はポリペプチドの性質及び全体の状況に依存して変動し、典型的にはATG又はATG濃度が収集前又は収集培養液中のチオレドキシン濃度の少なくとも約4倍である場合に達する。
更なる実施態様では、チオレドキシン阻害剤は、限定するものではないが、金属イオンのキレーター、例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含むヘキソキナーゼ活性の阻害剤である。EDTAが典型的には添加され、約5mMと約60mMの間、又は約10mMと約50mMの間、又は約20mMと約40mMの間の濃度で効果的である。
他の実施態様では、チオレドキシン阻害剤は、チオレドキシン活性の阻害を間接的に生じせしめる手段である。この実施態様は、例えば、組換え宿主細胞の収集培養液の空気スパージング、及び/又は組換え宿主細胞の収集培養液のpHを低下させることを含む。
様々な実施態様では、チオレドキシン活性を阻害するための間接的な手段、例えば空気スパージング及び/又はpHの低減は、上に列挙したもののような直接的なチオレドキシン阻害剤の使用と組み合わせることができる。
全ての実施態様において、ポリペプチドは、例えば、抗体、又は抗体の生物学的に機能的な断片でありうる。代表的な抗体断片は、Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、(scFv)2、dAb、相補性決定領域(CDR)断片、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
治療用抗体は、限定するものではないが、抗HER2抗体;抗CD20抗体;抗IL−8抗体;抗VEGF抗体;抗CD40抗体、抗CD11a抗体;抗CD18抗体;抗IgE抗体;抗Apo−2レセプター抗体;抗組織因子(TF)抗体;抗ヒトα4β7インテグリン抗体;抗EGFR抗体;抗CD3抗体;抗CD25抗体;抗CD4抗体;抗CD52抗体;抗Fcレセプター抗体;抗癌胎児抗原(CEA)抗体;乳房上皮細胞に対する抗体;結腸癌細胞に結合する抗体;抗CD38抗体;抗CD33抗体;抗CD22抗体;抗EpCAM抗体;抗GpIIb/IIIa抗体;抗RSV抗体;抗CMV抗体;抗HIV抗体;抗肝炎抗体;抗CA125抗体;抗αvβ3抗体;抗ヒト腎細胞癌抗体;抗ヒト17−1A抗体;抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体;GD3ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体R24;抗ヒト扁平上皮癌;及び抗ヒト白血球抗原(HLA)抗体、及び抗HLA DR抗体を含む。
他の実施態様では、治療用抗体は、HERレセプター、VEGF、IgE、CD20、CD11a、CD40、又はDR5に結合する抗体である。
更なる実施態様では、HERレセプターは、HER1及び/又はHER2、好ましくはHER2である。HER2抗体は、例えば、配列番号16、17、18、及び19からなる群から選択される重鎖及び/又は軽鎖可変ドメイン配列を含みうる。
他の実施態様では、治療用抗体はCD20に結合する抗体である。抗CD20抗体は、例えば、配列番号1から15からなる群から選択される重鎖及び/又は軽鎖可変ドメイン配列を含みうる。
また別の実施態様では、治療用抗体はVEGFに結合する抗体である。抗VEGF抗体は、例えば、配列番号20から25からなる群から選択される重鎖及び/又は軽鎖可変ドメイン配列を含みうる。
更なる実施態様では、治療用抗体はCD11aに結合する抗体である。抗CD11a抗体は、例えば、配列番号26から29からなる群から選択される重鎖及び/又は軽鎖可変ドメイン配列を含みうる。
更なる実施態様では、治療用抗体は、DR5レセプターに結合する。抗DR5抗体は、例えば、Apomabs1.1、2.1、3.1、4.1、5.1、5.2、5.3、6.1、6.2、6.3、7.1、7.2、7.3,8.1、8.3、9.1、1.2、2.2、3.2、4.2、5.2、6.2、7.2、8.2、9.2、1.3、2.2、3.3、4.3、5.3、6.3、7.3、8.3、9.3、及び25.3からなる群から選択され得、好ましくはApomab8.3又はApomab7.3、最も好ましくはApomab7.3である。
全ての実施態様において、組換え宿主細胞はまた原核生物宿主細胞、例えば限定するものではないが大腸菌細胞を含む細菌細胞でありうる。
本発明において、一般に、又は任意の特定のタンパク質又は抗体に関して、抗体を含むタンパク質について、「還元」なる用語は、そのタンパク質又は抗体の一又は複数のジスルフィド結合の還元を指すために使用される。よって、例えば、「オクレリズマブ還元」なる用語は、「オクレリズマブジスルフィド結合還元」なる用語と交換可能に使用され、「抗体(Ab)還元」なる用語は「抗体(Ab)ジスルフィド結合還元」なる用語と交換可能に使用される。
「還元」又は「ジスルフィド結合還元」なる用語は、最も広義に使用され、完全な及び部分的な還元、及び抗体のようなタンパク質中に存在する鎖内又は鎖間のジスルフィド結合の幾らか又は全ての還元を含む。
「診断用抗体」なる用語は、疾患のための診断用試薬として使用される抗体を意味する。診断用抗体は、特定の疾患に特に関連し、又はそこでの発現増加を示す標的抗原に結合しうる。診断用抗体は、例えば、患者からの生体試料、又は患者における腫瘍のような疾患部位の診断画像における標的を検出するために使用することができる。診断用抗体の「生物学的に活性な断片」は、インタクトな抗体に起因する生物学的機能の幾らか又は全てとはいかないまでも少なくとも一つを示し、該機能は標的抗原への特異的結合を少なくとも含む。
「精製された」は、分子が、それが含まれている試料の少なくとも80−90重量%の濃度で試料中に存在することを意味する。
「本質的に純粋な」タンパク質は、組成物の全重量に基づいて少なくとも約90重量%、好ましくは少なくとも約95重量%のタンパク質を含むタンパク質組成物を意味する。
「本質的に均質な」タンパク質は、組成物の全重量に基づいて少なくとも約99重量%のタンパク質を含むタンパク質組成物を意味する。
上で述べたように、ある実施態様では、タンパク質は抗体である。「抗体」(Abs)及び「免疫グロブリン」(Igs)は同じ構造的特徴を有している糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体と抗原特異性を一般に欠く他の抗体様分子の双方を含む。 後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで、ミエローマによって増加したレベルで生産される。
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在しうる可能な変異、例えば自然に生じる変異を除いて、同一である。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別々の抗体の混合物ではないものとしての抗体の特性を示している。ある実施態様では、かかるモノクローナル抗体は、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を典型的に含み、ここで標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含む方法によって得られたものである。例えば、選択プロセスは、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン、又は組換えDNAクローンのプールのような複数のクローンからの独特のクローンの選択でありうる。選択された標的結合配列は、例えば標的に対する親和性を改善するため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養におけるその生産を改善するため、インビボでのその免疫原性を低減するため、多重特異性抗体を作製する等のために更に改変され得、改変された標的結合配列を含む抗体もまた本発明のモノクローナル抗体であることが理解されなければならない。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、それらが典型的には他の免疫グロブリンによって汚染されていない点が有利である。
「親和性成熟」抗体とは、改変を持たない親抗体と比較し、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめるその一又は複数のCDRs/HVRsに一又は複数の変化を有するものである。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルでさえの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当該分野において知られている方法によって生産される。Marks等 Bio/Technology 10:779-783(1992)は、VH及びVLドメインのシャッフリングによる親和性成熟について記載している。CDR/HVR及び/又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91: 3809-3813(1994);Schier等, Gene 169:147-155(1995);Yelton等, J. Immunol. 155:1994-2004(1995);Jackson等, J. Immunol. 154(7):3310-9(1995);及びHawkins等, J. Mol. Biol. 226:889-896(1992)に記載されている。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体間で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。それは、軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域(CDR)又は高頻度可変領域(HVR)と呼ばれる3つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、3つのCDRにより連結されたβシート配置を主にとる4つのFR領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のCDRは、FRにより近接して保たれ、他の鎖のCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)を参照)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害性への抗体の関与を示す。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体(免疫グロブリン)は異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには5つの主たるクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それらの幾つかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4、IgA1、及びIgA2に分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれa、d、e、g及びmと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び3次元構造はよく知られており、例えばAbbas等, Cellular and Mol. Immunology, 4版(2000)に一般に記載されている。抗体は、抗体と一又は複数の他のタンパク質又はペプチドとの共有又は非共有結合によって形成された大きな融合分子の一部であってもよい。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部のみを含み、その一部は、インタクトな抗体に存在する場合にその一部に通常関連する機能の少なくとも一で、多くは殆どないしは全てを保持する。一実施態様では、抗体断片はインタクトな抗体の抗原結合部位を含み、よって抗原結合能を保持している。他の実施態様では、抗体断片は、例えばFc領域を含み、インタクトな抗体に存在する場合にFc領域に通常関連する生物学的な機能の一つ、例えばFcRn結合、抗体半減期の調節、ADCC機能及び補体結合を保持する。一実施態様では、抗体断片は、インタクトな抗体と実質的に同様のインビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボ安定性を断片に与えることができるFc配列に結合した抗原結合アームを含んでいてもよい。
Fab断片は重鎖及び軽鎖可変ドメインを含み、また軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン(CH1)を含む。Fab'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に数残基が付加されている点でFab断片と相違する。Fab'-SHは、ここでは定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つFab'を表す。F(ab')2抗体断片は、元々は、その間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合もまた知られている。
「単鎖Fv」又は「scFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含み、ここで、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般には、scFvポリペプチドは、scFVが抗原結合のために望ましい構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをVH及びVLドメイン間に更に含む。scFvの概説については、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され及び単離され及び/又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク様又は非タンパク様溶質が含まれる。ある実施態様では、抗体は、(1)例えばローリー法で測定したときに95重量%より多くの抗体まで、ある実施態様では99重量%より多くの抗体まで、(2)例えばスピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15のN末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度に、あるいは、(3)例えばクーマシーブルーあるいは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのSDS-PAGEにより均一になるまで、精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツ抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
「クロマトグラフィー」なる用語は、混合物中の興味ある溶質が、混合物の個々の溶質が移動相の影響下で固定媒質を通って移動する速度の差の結果として、又は結合及び溶離プロセスで、他の溶質から分離されるプロセスを意味する。
「非アフィニティクロマトグラフィー」及び「非アフィニティ精製」なる用語は、アフィニティクロマトグラフィーが利用されない精製プロセスを意味する。非アフィニティクロマトグラフィーは、興味ある分子(例えばタンパク質、例えば抗体)と固相マトリックスの間の非特異的相互作用に依存するクロマトグラフィー技術を含む。
ここで用いられる「アニオン交換樹脂」は、正に荷電し、例えばそれに結合した第4級アミノ基等の一又は複数の正荷電リガンドを有する固相を意味する。市販のアニオン交換樹脂は、DEAEセルロース、QAE SEPHADEX(商品名)及びFAST Q SEPHAROSE(商品名)(GE Healthcare)を含む。
「負荷バッファー」は、対象とするポリペプチド分子及び一又は複数の汚染物質を含む組成物をイオン交換樹脂に充填するのに使用するものである。負荷バッファーは、対象とするポリペプチド分子(及び一般に一又は複数の汚染物質)がイオン交換樹脂に結合するような、又は対象とするタンパク質がカラムを流れる一方、不純物が樹脂に結合するような、伝導率及び/又はpHを有する。
「洗浄バッファー」なる用語は、ここで用いられる場合、対象とするポリペプチド分子の溶離に先立って、イオン交換樹脂を洗浄又は再平衡化するのに使用されるバッファーを意味する。簡便には、洗浄バッファー及び負荷バッファーは同じであってもよいが、そうである必要はない。
「再生バッファー」は、イオン交換樹脂を再生して再利用できるようにするのに使用される。再生バッファーは、実質的に全ての汚染物質と対象とするポリペプチドをイオン交換樹脂から除去するのに必要な伝導率及び/又はpHを有する。
ここで使用される「実質的に減少」、又は「実質的に異なる」という語句は、当業者が2つの数値(一般に、分子に関連するもの、及び参照/比較分子に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばKd値)によって測定される生物学的性質上統計学的に有意であると認められるほど、2つの数値が有意に異なっていることを意味する。前記2つの値間の差異は、参照/比較分子の値の関数として、例えば約10%より大きく、約20%より大きく、約30%より大きく、約40%より大きく、及び/又は約50%より大きい。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN−2のA及びBのプログラムのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。
アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、ここで使用する全ての%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN−2比較コンピュータプログラムを用いた直ぐ上の段落に記載されたようにして得られる。
「疾患」はタンパク質で治療することで恩恵を得るあらゆる症状のことである。これには、当該疾患に哺乳動物を罹患させる素因になる病理状態を含む、慢性及び急性の疾患又は病気が含まれる。ここで治療されるべき疾患の非限定的な例は癌腫及びアレルギーを含む。
治療の目的での「哺乳動物」は、ヒト、非ヒト高等霊長類、他の脊椎動物、家畜及び農業用動物、及び動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
「干渉RNA」又は「低分子干渉RNA(siRNA)」は、標的遺伝子の発現を低減させる約30ヌクレオチド長未満の二本鎖RNA分子である。干渉RNAは既知の方法を使用して同定され、合成され(Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003),国際公開第2003056012号及び国際公開第2003064621号)、siRNAライブラリーは例えばDharmacon, Lafayette, Coloradoから商業的に入手できる。しばしば、siRNAは遺伝子の5’端を標的とするために成功裏に設計され得る。
本発明の実施には、別段記載しない限り、一般的な分子生物学の技術等を使用するが、これは当業者の技量の範囲内である。かかる技術は文献に十分に説明されている。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook等, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989);Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel等編, 1987最新版);Essential Molecular Biology (T. Brown編, IRL Press 1991);Gene Expression Technology (Goeddel編, Academic Press 1991);Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell等編, Bartlett Publ. 1990);Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990);Recombinant DNA Methodology II (R. Wu等編, Academic Press 1995);PCR: A Practical Approach (M. McPherson等., IRL Press at Oxford University Press 1991);Oligonucleotide Synthesis (M. Gait編, 1984);Cell Culture for Biochemists (R. Adams編, Elsevier Science Publishers 1990);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller及びM. Calos編, 1987);Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler編, 1991);Animal Cell Culture (J. Pollard等編, Humana Press 1990);Culture of Animal Cells, 2版 (R. Freshney等編, Alan R. Liss 1987);Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed等編, Wiley-Liss 1990);シリーズMethods in Enzymology (Academic Press, Inc.);Wirth M.及びHauser H. (1993);Immunochemistry in Practice, 3版, A. Johnstone及びR. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996;Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock及びP. Petrusz編, Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989);Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir 及びC. Blackwell編);Current Protocols in Immunology (J. Coligan等編 1991);Immunoassay (E. P. Diamandis及びT.K. Christopoulos編, Academic Press, Inc., 1996);Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2版) Academic Press, New York;Ed Harlow及びDavid Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988;Antibody Engineering, 2版(C. Borrebaeck編, Oxford University Press, 1995);及びシリーズAnnual Review of Immunology;シリーズ Advances in Immunologyを参照のこと。
本発明は、組換え生産中におけるタンパク質のジスルフィド結合の還元を防止するための方法に関する。特に、本発明は、発酵に続くプロセシング中における組換えタンパク質のジスルフィド結合の還元を防止するための方法に関する。本発明の方法は、例えば製造規模におけるように、ジスルフィド結合含有タンパク質の大規模生産に対して特に貴重である。一実施態様では、本発明の方法は、5000Lを超える規模の大規模のタンパク質生産に有用である。
理論的には、かかる還元は、製造プロセス中の様々な因子及び条件から生じるかも知れず、様々な還元剤によって引き起こされるかも知れない。本発明は、この還元の根本的な原因がHCCF中の活性なチオレドキシン(Trx)又はチオレドキシン様系であるという認識に少なくとも部分的に基づいている。
あるいは、又は加えて、空気スパージング又はpH調節のような、他の非特異的方法をまた使用して、組換えタンパク質の組換え生産中に発酵後に、ジスルフィド結合還元を防止することができる。ここで考えられるある種の還元阻害方法は次の表1に列挙する。
非直接型アプローチはまた互いに及び/又は一又は複数のTrx阻害剤の使用と組み合わせることもできる。
例えば、哺乳動物細胞培養プロセス、例えばここの実施例に記載されたCHO抗体生産プロセスでは、硫酸銅(五水和物又は無水物形態のCuSO4)をTrx阻害剤として使用する場合、それは、約5μMから約100μM、例えば約10μMから約80μM、好ましくは約15μMから約50μMの濃度範囲でCCF又はHCCFに補充するために添加できる。幾つかの細胞培養物は銅(例えば、ここでの実施例で使用されたCHO細胞培養物では約0.04μMのCuSO4)を既に含んでいるので、この量は、銅に加えて、あるならば、細胞培養中に既に存在している。任意の銅(II)塩を、溶解度が問題でない限り、CuSO4の代わりに使用することができる。例えば、酢酸銅及び塩化銅は、共に水に可溶性であり、CuSO4の代わりに使用することができる。最小有効濃度はまた製造される抗体及び阻害剤が使用される段階に依存しうる。よって、例えば、硫酸銅が溶解前に添加される場合、抗体2H7(変異体A)では、最小有効濃度は約30μMであり、Apomabでは約75μMであり、抗体変異体C(表2を参照)では約50μMである。硫酸銅がCC培地に添加される場合、抗体2H7(変異体A)では、最小有効濃度は約15μMであり、Apomabでは約25μMであり、抗体変異体Cでは約20μMである。一つの典型的な最小CuSO4阻害剤濃度は2×Trx濃度(又はTrx均等物)である。
Trx阻害剤としてのDHEAは典型的には低い濃度で、例えば約0.05mMから約5mM、好ましくは約0.1mMから約2.5mMの濃度範囲で有効である。
他のTrx阻害剤、例えばオーロチオグルコース(ATG)及び金チオリンゴ酸塩(ATM)はジスルフィド結合の還元をμM濃度範囲で阻害する。よって、例えば、ATG又はATMは、約0.1mMから約1mMの濃度で添加されうる。最小阻害濃度は実際の条件に応じて変動するが、ATG及びATMでは、典型的には約4×TrxR濃度である。
全ての阻害剤は過剰量で使用することができ、従って系中のTrx又はTrxRの量は必ずしも分かる必要はない。
ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を製造するために使用される哺乳動物宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。市販培地、例えばハム(Ham)のF10(Sigma)、最小必須培地((MEM),Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、及びダルベッコの改良イーグル培地(DMEM,Sigma)が宿主細胞の培養に好適である。また、その全ての開示が出典明示によりここに援用されるHam及びWallace (1979), Meth. in Enz. 58:44、Barnes及びSato (1980), Anal. Biochem. 102:255、米国特許第4767704号;同第4657866号;同第4927762号;又は同第4560655号;国際公開第90/03430号;国際公開第87/00195号;米国特許再発行第30985号;又は米国特許第5122469号に記載された培地の何れかも宿主細胞のための培養培地として使用することができる。これらの培地は何れも、ホルモン及び/又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン(商品名)薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適切な濃度で含めることができる。培養条件、例えば温度、pH等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
細胞を撹拌タンクバイオリアクターシステムで培養することができ、流加培養法を用いる。好ましい流加培養では、哺乳動物宿主細胞と培養培地を最初に培養容器に供給し、培養中に培養物へ更なる培養栄養素を連続的に又は離散した増分で供給し、培養の終了前に周期的な細胞及び/又は産物の収集を行うか行わない。流加培養法は、例えば、周期的に(細胞及び培地を含む)全培養物が除去され新鮮な培地に置き換えられる半連続流加培養を含みうる。流加培養法は、(細胞及び全ての培養栄養分を含む)細胞培養のための全ての成分が培養プロセスの開始時点で培養容器に供給される単純なバッチ培養法とは区別される。流加培養法は、上清がプロセス中培養容器から除去されない限りにおいて潅流培養とも更に区別できる(潅流培養では、細胞は例えばマイクロキャリアへの固着化、被包、濾過等によって培地に拘束され、培養培地は連続的又は断続的に培養容器に導入され、除去される)。
特定の段階で、細胞を使用して、細胞培養の生産段階又は工程で播種することができる。あるいは、上に記載したように、生産段階又は工程は播種又は増殖段階又は工程と連続的であってもよい。
治療用抗体の工業的精製の更なる詳細については、その全体の開示が出典明示によりここに明示的に援用されるFahrner 等, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 18:301-27 (2001)を例えば参照のこと。
好ましい実施態様では、本発明の方法は、治療用及び診断用抗体を含む抗体の鎖間及び/又は鎖内ジスルフィド結合の還元を防止するために使用される。本発明の範囲内の抗体には、限定されるものではないが、トラスツズマブ(HERCEPTIN(登録商標))を含む抗HER2抗体(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992)、米国特許第5725856号);CD20抗体、例えば米国特許第5736137号におけるようなキメラ抗CD20「C2B8」(リツキサン(登録商標))、米国特許第5721108号におけるような2H7抗体のキメラ又はヒト化変異体、又はトシツモマブ(BEXXAR(登録商標));抗IL-8(St John等, Chest, 103:932 (1993)、及び国際公開第95/23865号);抗VEGF抗体、例として、ヒト化及び/又は親和性成熟した抗VEGF抗体、例えばヒト化抗VEGF抗体huA4.6.1 アバスチン(登録商標)(Kim等, Growth Factors, 7:53-64 (1992)、1998年10月15日公開の国際公開第96/30046号及び同第98/45331号);抗PSCA抗体(国際公開第01/40309号);抗CD40抗体、例えばS2C6及びそのヒト化変異体(国際公開第00/75348号);抗CD11a抗体(米国特許第5622700号、国際公開第98/23761号、Steppe等, Transplant Intl. 4:3-7 (1991)及びHourmant等, Transplantation 58:377-380 (1994));抗IgE(Presta等, J. Immunol. 151:2623-2632 (1993)、及び国際公開第95/19181号);抗CD18(1997年4月22日発行の米国特許第5622700号、又は1997年7月31日公開の国際公開第97/26912号);抗IgE(E25,E26及びE27を含む;1998年2月3日発行の米国特許第5714338号、又は1992年2月25日発行の米国特許第5091313号、1993年3月4日公開の国際公開第93/04173号、又は1998年6月30日出願の国際出願第PCT/US98/13410号、米国特許第5714338号);抗Apo−2レセプター抗体(1998年11月19日公開の国際公開第98/51793号);抗TNF−α抗体、例えばcA2(REMICADE(登録商標))、CDP571及びMAK−195(1997年9月30日発行の米国特許第5672347号、Lorenz等, J. Immunol. 156(4):1646-1653 (1996)、及びDhainaut等, Crit. Care Med. 23(9):1461-1469 (1995)を参照);抗組織因子(TF)(1994年11月9日に権利付与された欧州特許第0420937号B1);抗ヒトα4β7インテグリン(1998年2月19日公開の国際公開第98/06248号);抗EGFR(1996年12月19日公開の国際公開第96/40210号の、キメラ化又はヒト化の225抗体);抗CD3抗体、例えばOKT3(1985年5月7日発行の米国特許第4515893号);抗CD25又は抗tac抗体、例としてCHI-621(SIMULECT(登録商標))及びZENAPAX(登録商標)(1997年12月2日発行の米国特許第5693762号を参照);抗CD4抗体、例えばcM-7412抗体(Choy等 Arthritis Rheum 39(1): 52-56 (1996));抗CD52抗体、例えばCAMPATH-1H(Riechmann等 Nature 332:323-337 (1988));抗Fcレセプター抗体、例えばGraziano等 J. Immunol. 155(10): 4996-5002 (1995)に記載のFcγRIに対するM22抗体;抗癌胎児性抗原(CEA)抗体、例えばhMN-14 (Sharkey等 Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995));胸部上皮細胞に対する抗体、例としてhuBrE-3、hu-Mc3及びCHL6(Ceriani等 Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995);及びRichman等 Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995));結腸癌細胞と結合する抗体、例えばC242(Litton等 Eur J. Immunol. 26(1): 1-9 (1996));抗CD38抗体、例えばAT13/5(Ellis等 J. Immunol. 155(2): 925-937 (1995));抗CD33抗体、例えばHuM195(Jurcic等 Cancer Res 55(23 Suppl): 5908s-5910s (1995))及びCMA-676又はCDP771;抗CD22抗体、例えばLL2又はLymphoCide(Juweid等, Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s (1995));抗EpCAM抗体、例えば17-1A(PANOREX(登録商標));抗GpIIb/IIIa抗体、例えばアブシキマブ(abciximab)又はc7E3 Fab(REOPRO(登録商標));抗RSV抗体、例えばMEDI-493(SYNAGIS(登録商標));抗CMV抗体、例えばPROTOVIR(登録商標);抗HIV抗体、例えばPRO542;抗肝炎抗体、例えば抗HepB抗体OSTAVIR(登録商標);抗CA125抗体 OvaRex;抗イディオタイプGD3エピトープ抗体 BEC2;抗αvβ3抗体VITAXIN(登録商標);抗ヒト腎臓細胞上皮癌抗体、例えばch-G250;ING-1;抗ヒト17-1A抗体(3622W94);抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体(A33);GD3ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体R24;抗ヒト扁平上皮癌(SF-25);及び抗ヒト白血球抗原(HLA)抗体、例えばSmart ID10及び抗HLA DR抗体オンコリン(Oncolym)(Lym-1)が含まれる。ここでの抗体に対する好ましい標的抗原は、HER2レセプター、VEGF、IgE、CD20、CD11a、及びCD40である。
これらの抗体の多くが、癌を含む様々な疾患を治療するために臨床実務において広く使用されている。
ある特定の実施態様では、本発明の方法は、次の抗体及び組換えタンパク質の生産のために使用される。
リツキシマブ(リツキサン(登録商標))は、CD20抗原に対する遺伝子操作されたキメラマウス/ヒトモノクローナル抗体である。リツキシマブは1998年4月7日に発行された米国特許第5736137号(Anderson等)において「C2B8」と呼ばれている抗体である。リツキシマブは、再発性又は難治性の軽度又はろ胞性の、CD20が陽性のB細胞性非ホジキンリンパ腫を患ってる患者に対して効能がある。インビトロの作用機序の研究では、リツキシマブはヒト補体に結合し、補体依存性細胞障害(CDC)によりリンパ系B細胞系を溶解することが証明されている(Reff等, Blood 83(2):435-445(1994))。また、抗体依存性細胞障害(ADCC)のアッセイでは、有意な活性を有する。より最近では、リツキシマブはトリチウム化チミジン導入アッセイにおいて抗増殖効果を有し、直接アポトーシスを誘導するが、他の抗CD20抗体ではこのようなことはないことが示されている(Maloney等, Blood 88(10):637a(1996))。また、リツキシマブと化学療法剤と毒素との相乗作用が実験的に観察されている。特にリツキシマブは、ドキソルビシン、CDDP、VP-16、ジフテリア毒素及びリシンの細胞毒性効果に対して薬剤耐性を有するヒトB細胞リンパ腫細胞系を感作させる(Demidem等, Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3):177-186(1997))。インビボでの前臨床的研究では、リツキシマブは、カニクイザルの末梢血、リンパ節及び骨髄からのB細胞を、おそらくは補体及び細胞媒介性プロセスにより涸渇させることが示されている(Reff等, Blood 83(2):435-445(1994))。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(配列番号1);及び
重鎖可変配列(VH):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(配列番号2)
を含む。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR(配列番号3)、及び
重鎖可変配列(VH):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSS(配列番号4)
を含む。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS(配列番号5)
を含む。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号6)
を含む。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号7)
を含む。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号8)
を含む。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号15)
を含む。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号9)
を含む。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号10)
を含む。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号11)
を含む。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号12)
を含む。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHWHYTQKSLSLSPGK(配列番号13)
を含む。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号14)
を含む。
IgGのNグリコシル化部位はCH2ドメインのAsn297である。本発明のヒト化2H7抗体組成物はFc領域を有する先のヒト化2H7抗体の何れかの組成物を含み、組成物中の抗体の約80−100%(好ましくは約90−99%)はフコースを欠損し、糖タンパク質のFc領域に結合した成熟コア炭水化物構造を含む。このような組成物はヒトIgGと相互作用する際にFc(RIIIA(V158)ほど効果的ではないが、Fc(RIIIA(F158)への結合を驚くほど改善することがここで証明された。Fc(RIIIA(F158)は正常で健康なアメリカ黒人及び白人において、Fc(RIIIA(V158)より一般的である。Lehrnbecher等 Blood 94:4220 (1999)参照。歴史的には、最も一般的に使用される工業的宿主の一つであるチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)において生産された抗体は、約2から6%をフコシル化されていない集団に含む。YB2/0及びLec13は、しかしながら、78から98%の非フコシル化種を持つ抗体を生産できる。Shinkawa等 J Bio. Chem. 278 (5), 3466-347 (2003)は、YB2/0及びLec13細胞で生産された抗体は、少ないFUT8活性を有し、インビトロで有意に増加したADCC活性を示すことを報告している。減少したフコース量の抗体の生産はまた例えばLi等, (GlycoFi) 「Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris」Nature Biologyオンライン刊行物 22 Jan. 2006;Niwa R.等, Cancer Res. 64(6):2127-2133 (2004);米国出願公開第2003/0157108号(Presta);米国特許第6602684号及び米国出願公開第2003/0175884号 (Glycart Biotechnology);米国出願公開第2004/0093621号、米国出願公開第2004/0110704号、米国出願公開第2004/0132140号(全て協和発酵工業)に記載されている。
マウスHER2抗体4D5の組換えヒト化体(huMAb4D5-8、rhuMAb HER2、トラスツズマブ又はハーセプチン(登録商標);米国特許第5821337号)は、広範な抗癌治療を前に受けたHER2過剰発現転移性乳癌を持つ患者において臨床的に活性であった(Baselga等, J. Clin. Oncol. 14:737-744(1996))。トラスツズマブは、腫瘍がHER2タンパク質を発現する転移性乳癌を有する患者の治療のために、1998年9月25日、食品医薬品局から販売許可を受けた。2006年11月には、FDAは、HER2陽性リンパ節陽性乳癌患者のアジュバント療法のための、ドキソルビシン、シクロホスファミド及びパクリタキセルを含む治療法の一部としてハーセプチンを承認した。
ヒト化2C4型574抗体VL(配列番号16)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK
及びヒト化2C4型574抗体VH(配列番号17)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS。
様々な性質を持つ他のHER2 抗体は、Tagliabue等, Int. J. Cancer 47:933-937 (1991);McKenzie等, Oncogene 4:543-548 (1989);Maier等, Cancer Res. 51:5361-5369 (1991);Bacus等, Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990);Stancovski等, PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991);Bacus等, Cancer Research 52:2580-2589 (1992);Xu等, Int. J. Cancer 53:401-408 (1993);国際公開第94/00136号;Kasprzyk等, Cancer Research 52:2771-2776 (1992);Hancock等, Cancer Res. 51:4575-4580 (1991);Shawver等, Cancer Res. 54:1367-1373 (1994);Arteaga等, Cancer Res. 54:3758-3765 (1994);Harwerth等, J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992);米国特許第5783186号;及びKlapper等, Oncogene 14:2099-2109 (1997)に記載されている。
抗VEGF抗体は、例えば次の配列を含みうる:
一実施態様では、抗VEGF抗体は次のVL配列(配列番号20):
DIQMTQTTSS LSASLGDRVI ISCSASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEP EDIATYYCQQ YSTVPWTFGG GTKLEIKR;及び
次のVH配列(配列番号21):
EIQLVQSGPE LKQPGETVRI SCKASGYTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLETSASTAY LQISNLKNDD TATYFCAKYP HYYGSSHWYF DVWGAGTTVT VSS
を含む。
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR;及び
次のVH配列(配列番号23):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS
を含む。
DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR; 及び
次のVH配列(配列番号25):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYDFT HYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP YYYGTSHWYF DVWGQGTLVT VSS
を含む。
ヒト化抗CD11a抗体であるエファリズマブ又はラプティバ(登録商標)(米国特許第6037454号)は、乾癬の治療について2003年10月27日に食品医薬品局から承認を受けた。一実施態様は、以下のHuMHM24のVL及びVH配列を含んでなる抗ヒトCD11a抗体を提供する:
VL(配列番号26):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPLTFGQGTKVEIKR;及び
VH(配列番号27):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGHWMNWVRQAPGKGLEWVGMIHPSDSETRYNQKFKDRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIYFYGTTYFDYWGQGTLVTVSS。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号28)
の配列を有するHuMHM24の完全長L鎖、又は、
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGHWMNWVRQAPGKGLEWVGMIHPSDSETRYNQKFKDRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIYFYGTTYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号29)
の配列を有するH鎖と共に上記のL鎖を含みうる。
抗体に加えて、本発明の方法は、ジスルフィド結合を含む他のポリペプチドの製造において有用性を見出す。かかるポリペプチドの代表的な例には、限定するものではないが、次の治療用タンパク質が含まれる:心筋梗塞の治療のための血栓溶解剤である組織プラスミノーゲン活性化因子(t−PAs)、例えばヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(htPA,アルテプラーゼ,ACTIVASE(登録商標))、単回ボーラス投与のための延長半減期及びフィブリン特異性を有するht−PA変異体であるTNKアーゼ(商標);小児及び成人における成長ホルモン欠乏症の治療のための組換えヒト成長ホルモン(rhGH,ソマトロピン,NUTROPIN(登録商標),PROTROPIN(登録商標));及び嚢胞性線維症(CF)の治療のための組換えヒトデオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)。
ここでの抗体及び他の組換えタンパク質は組換えDNA法のよく知られた技術によって生産することができる。よって、上で特に特定された抗体の他に、当業者は、例えば以下に起債される技術を使用して、興味ある抗原に対して抗体を産生させることができるであろう。
ここでの抗体は対象の抗原に対して産生される。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾病や疾患を患っている哺乳動物への抗体の投与によりその哺乳動物に治療的恩恵がもたらされうる。しかしながら、非ポリペプチド抗原(例えば腫瘍関連糖脂質抗原;米国特許第5091178号参照)に対して産生された抗体もまた考慮される。抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通型分子(例えばレセプター)又はリガンド、例えば増殖因子でありうる。例示的な抗原は、以下のセクション(3)に記述されるタンパク質を含む。本発明に包含される抗体に対する典型的な分子標的は、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD34、CD40のようなCDタンパク質;EGFレセプター、HER2、HER3あるいはHER4レセプターのようなErbBレセプターファミリーのメンバー;細胞接着分子、例えばLFA-1、Mac1、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM及びαv/β3インテグリンで、そのα又はβ何れかのサブユニットを含むもの(例えば抗CD11a、抗CD18あるいは抗CD11b抗体);VEGFのような増殖因子;IgE;血液型抗原;flk2/flt3レセプター;肥満(OB)レセプター;mplレセプター;CTLA-4;プロテインC、あるいはここで言及された他の抗原の任意のものを含む。上に列挙された抗体が結合する抗原は特にここでの範囲に含まれる。
抗体を調製するために有用な他の抗原及びその形態は当業者には明らかであろう。
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基による結合)、N-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、又はRとR1が異なったアルキル基であるR1N=C=NRにより結合させることが有用でありうる。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート100μg又は5μg(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント3容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。1ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の1/5ないし1/10のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。7ないし14日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び/又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合体として組換え細胞培養中で作製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えDNA法(米国特許第4816567号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスター又はマカクザルを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いてミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 590-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親のミエローマ細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親のミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、HGPRT欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含むであろう(HAT培地)。
所望の特異性、親和性、及び/又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、D-MEM又はRPMI-1640培地が含まれる。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティクロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。好ましくは、ここに記載されたプロテインAクロマトグラフィー手順が使用される。
DNAはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第4816567号;Morrison等, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 81:6851 (1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで、修飾できる。
更なる実施態様では、モノクローナル抗体は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載されている技術を使用して作製される抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用する、マウス及びヒト抗体の単離をそれぞれ記載している。次の刊行物は、鎖シャッフリング(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992))、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))による高親和性(nM範囲)のヒト抗体の生産を記載している。よって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なハイブリドーマ法に対する実行可能な代替手段である。
ヒト化抗体には非ヒトである供給源由来の一又は複数のアミノ酸残基がそこに導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的には齧歯動物のCDR又はCDR配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988))に従って実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4816567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には幾らかのCDR残基と場合によっては幾らかのFR残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトFRとして受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを数種の異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);Presta等, J. Immunol., 151:2623 (1993))。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク分解性消化を介して誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81 (1985)を参照)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてF(ab')2断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167[1992])。他のアプローチ法では、F(ab')断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Fv断片(scFV)である(国際公開第93/16185号を参照)。
多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。このような分子は通常は二つの抗原を結合させるのみであるが(すなわち、二重特異性抗体、BsAbs)、三重特異性抗体のような更なる特異性を持つ抗体もここで使用される場合この表現に包含される。
二重特異性抗体を製造する方法は当該分野で知られている。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖軽鎖対の同時発現に基づき、ここで該二つの鎖は異なる特異性を有している(Millstein等, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられるため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は10個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によりなされる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。類似の方法が国際公開第93/08829号及びTraunecker等,EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方はアビジンに結合され得、他方はビオチンに結合され得る。かかる抗体は、例えば、免疫系細胞を不要の細胞に向けるため(米国特許第4676980号)、及びHIV感染の治療のために提案されている(国際公開第91/00360号、国際公開第92/00373号、及び欧州特許出願公開第03089号)。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を使用して作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、多くの架橋技術と共に米国特許第4676980号に開示されている。
最近の進歩により、大腸菌からFab’−SH断片を直接回収できるようになり、これを化学的にカップリングさせて二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体F(ab’)2分子を記載している。各Fab’断片は別個に大腸菌から分泌され、インビトロでの定方向化学カップリングによって二重特異性抗体を形成した。このようにして形成された二重特異性抗体はErbB2レセプターを過剰発現する細胞及び正常なヒトT細胞に結合することができ、またヒト乳房腫瘍標的に対してヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を惹起させた。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
最も簡単で最も直接的なイムノアドヘシンの設計は、アドヘシンの結合ドメイン(例えば、レセプターの細胞外ドメイン(ECD))を免疫グロブリン重鎖のFc領域及びヒンジと組み合わせるものである。通常は、本発明のイムノアドヘシンを調製する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のN末端をコードする核酸にC末端的に融合させるが、N末端融合もまた可能である。
典型的には、そのような融合体において、コードされるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的に活性なヒンジ、CH2及びCH3ドメインを保持する。融合体はまた定常ドメインのFc領域のC末端に、又は重鎖のCH1又は軽鎖の対応する領域にN末端が直ぐに融合される。融合がなされる正確な部位は重要ではない;特定の部位はよく知られており、イムノアドヘシンの生物活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択されうる。
ACL-ACL;
ACH-(ACH,ACL-ACH,ACL-VHCH,又はVLCL-ACH)
ACL-ACH-(ACL-ACH,ACL-VHCH,VLCL-ACH,又はVLCL-VHCH);
ACL-VHCH-(ACH,又はACL-VHCH,又はVLCL-ACH);
VLCL-ACH-(ACL-VHCH,又はVLCL-ACH);及び
(A-Y)n-(VLCL-VHCH)2、
ここで、各Aは同一又は異なったアドヘシンアミノ酸配列を示し;
VLは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CHは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり;
nは1より大きい整数であり;
Yは共有結合架橋剤の残基を示す。
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の3’末端に、ヒンジとCH2ドメインの間、又はCH2とCH3ドメインの間の何れかで融合される。同様の作成物がHoogenboom等,Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要とはされないが、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されて存在するかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAが典型的にはアドヘシン免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするDNAと同時発現される。分泌時に、ハイブリッド重鎖及び軽鎖が共有的に結合されて、二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖軽鎖対を含む免疫グロブリン様構造を提供する。このような構造の調製に適した方法は、例えば1989年3月28日に発行された米国特許第4816567号に開示されている。
本明細書で引用される全ての特許及び文献についてその全体を出典明示によりここに援用する。
材料と方法の記載
次の材料と方法を以下の実施例2−8において使用した。
材料
実験実施例に記載された実験において使用された材料及び装置は、ステンレス鋼製バイアル(ミニタンク, Flow Components, Dublin, CA;低(50 cc)及び高(55 cc));透析チューブ(Spectra/Por, 6-8000 MWCO, カタログ番号132645)、0.22μmフィルター(Millipore Millipak Gamma Gold カタログ番号MPGL04GH2);リン酸緩衝生理食塩水(PBS, EMD, カタログ番号6506);エチレンジアミン四酢酸(EDTA, Sigma, カタログ番号E4884);α-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 (NADPH, Calbiochem, カタログ番号481973);デヒドロエピアンドロステロン (DHEA, TCI, カタログ番号D0044);硫酸銅 (Sigma, カタログ番号C8027)、グルコース-6-リン酸(G6P, Calbiochem, カタログ番号346764);オーロチオグルコース (ATG, USP, カタログ番号1045508);金チオリンゴ酸塩 (ATM, Alfa Aesar, カタログ番号39740);還元型グルタチオン(GSH, J.T. Baker, カタログ番号M770-01);モノブロモビマン(mBB, Fluka, カタログ番号69898);ヒスチジン(J.T. Baker, カタログ番号2080-05);硫酸ナトリウム(J.T. Baker, カタログ番号3897-05);Trx(Sigma, カタログ番号T8690);TrxR(Sigma, カタログ番号T9698)を含む。全ての化学薬品及び試薬は更なる精製なしに受け取ったまま使用した。EDTA(250mM,pH7.5)、CuSO4(10mM)、ATG(30mM)、ATM(30mM)、NADPH(75mM)、G6P(300mM)の原液を、ミニタンク経時変化研究での使用のために調製した。
様々な還元研究のためのオクレリズマブCCFを生成するために、代表的な小規模発酵プロセスを、過去に記載された方法と同様に利用した(Chaderjian等, 2005)。簡潔に述べると、傾斜ブレードインペラを装備した3リットルガラス攪拌タンクApplikon(登録商標)バオリアクターを、オクレリズマブ培地成分を含む接種材料列及び生産培養に使用した。バイオリアクターには、較正溶存酸素(DO)、pH及び温度プローブを装備した。DO、pH、温度、及び攪拌速度は、デジタル制御装置を使用してオクレリズマブ製造プロセスの定まったパラメータに制御した。接種材料列及び生産培養双方に対する作業体積は1.5Lであった。毎日の試料をNOVAバイオプロファイル血液ガスアナライザーで分析して、pH及び溶存酸素のオンライン値の精度を確実にし培養物中のグルコース、乳酸、アンモニウム、グルタミン、グルタミン酸、及びナトリウム濃度をモニターした。毎日の試料をまた採取して細胞増殖、生存率、及び力価をモニターした。細胞増殖は、ViCellを使用する生存細胞数と血中血球容積(PCV)ベースの双方で測定した。培養生存率はViCell機器でのトリパンブルー排除によって決定した。上清試料をHPLCベース法によってアッセイして、オクレリズマブ力価値を測定した。.
CCFの完全な溶解は、Microfluidics HC-8000 ホモジナイザーを使用して高圧ホモジナイゼーションによって達成した。機器の圧力調整器を4000−8000psiに設定し、CCFを、ホモジナイザーを通して引き込み、単一パス後に完全な細胞溶解(膜破壊)を達成した。系に水をパージしたところで、CCFホモジネートを集めた。ホモジネートを遠心ボトルに移し、20℃にてSorval RC-3Bローター遠心機で4500rpmで30分間遠心分離した。遠心物をデカントした後、デプスフィルターで濾過し、ついでシリコンチュービングを備えた蠕動ポンプを使用して0.22μmの滅菌濾過を施し、ホモジナイズされたCCF(100%細胞溶解物)から最終HCCFを生成した。別法では、CCFをホモジナイゼーションなしに発酵槽からそのまま遠心分離した後、遠心物を0.22μmの滅菌フィルターで濾過してHCCFを生成した。
層流フードを全てのミニタンクのハンドリングにおいて使用し、HCCFインキュベーション実験において使用した全ての材料をオートクレーブするか70%のイソプロパノールを使用してすすいで細菌汚染を最小にした。
乳酸デヒドロゲナーゼアッセイについては、出典明示によりここに援用されるBabson及びBabson (1973)及びLegrand等, (1992)を参照のこと。
透析実験を、オクレリズマブの還元を引き起こす成分が小分子か巨大分子(つまり、酵素)かを決定するために実施した。3mLの精製し製剤化したオクレリズマブの試料(30.2mg/mL)を1Lのリン酸緩衝生理食塩水(PBS,10mM pH7.2)で24時間透析し、PBSを8時間後に変えた。ついで、オクレリズマブ試料の濃度を、280NMでの吸光度を使用して1mg/mLに調節した。アリコートを使用前に−70℃で保存した。透析チュービングを0.05%のアジド溶液で一晩水和させ、使用前に滅菌水ですすいだ。3Lの発酵槽からCCFのホモジナイゼーションから得られたHCCFを解凍し、蠕動ポンプを使用して0.22μmのMillipakフィルターで濾過した。6つの短いミニタンクに30mLのHCCFをそれぞれ満たした。各ミニタンクに、密封した透析チュービング内の500μLのオクレリズマブ試料を加えた。ミニタンクを密封し、35rpmと雰囲気温度で操作するベンチトップミキサー(Barnstead Lab-Line MAX Q 4000)中に入れた。各時点で、一つのミニタンクをミキサーから取り除き、HCCF(ミニタンク中)及びオクレリズマブ試料(透析バッグ中)のアリコートを取り上げて、遊離チオールアッセイ及びバイオアナライザーアッセイ(以下に記載)で分析するまで、−70℃で保存した。
高いミニタンクに27mLのHCCFを満たした。実験設計に応じて、様々な試薬(NADPH,G6P,G6PD又はTrxRの阻害剤)を所望の濃度まで加え、ミニタンク内の最終容積を、PBS(10mM pH7.2)を用いて30mLにした。ミニタンクを密封し、35rpm及び雰囲気温度で操作するベンチトップミキサー中に入れた。サンプリングの各時点で、ミニタンクの外部を70%のIPAで滅菌し、アリコートの除去のために層流フード中で開放した。ついで、ミニタンクを再密封し、ベンチトップミキサー中に戻した。全てのアリコートを、遊離チオールアッセイ及びバイオアナライザーアッセイ(以下に記載)で分析するまで、−70℃で保存した。
市販のTrxR(ラット肝臓)溶液(4μM)を水で希釈して2.86μMの溶液を得た。凍結乾燥したTrx(ヒト)をPBS(10mM,pH7.2)で再構成して500μMの溶液を得た。20mMのNADPHと10mMのATGの溶液及びATM溶液を水で調製した。
黒色ポリプロピレンの1.5mLのマイクロ遠心管、437μLのPBS、25μLのNADPH、16μLの製剤化オクレリズマブ溶液(30.2mg/mL)及び5μLのTrxを穏やかに混合した。17.5μLのTrxRを添加して反応を開始させた。反応物を室温で24時間インキュベートした。20μLのアリコートを各サンプリング時点で採取して、バイオアナライザーアッセイによる分析(以下参照)まで−70℃で保存した。コントロールは、反応混合物中のTrx及び/又はTrxRの何れかを等容量のPBSに置き換えることにより酵素を省略した場合に酵素経路が活性かどうかを決定するために実施した。
Trx系の阻害を、5μLのATG又はATMを添加して上述と同じ反応条件を使用して証明した。Cu2+によるTrx系の阻害を証明するため、同じ酵素であるが異なったバッファー(10mMのヒスチジン、10mMのNa2SO4、137mMのNaCl、2.5mMのKCl,pH7.0)を使用する反応混合物に2.5μLのCuSO4(10mM)を加えて不溶性Cu3(PO4)2の形成を防いだ。
GSHを使用する標準曲線をPBS(10mM,pH6.0±0.05)で生成した。110mMのGSH溶液から、連続希釈によって0、5.5、11、22、44、55、110及び550μMの濃度で標準体を調製した。mBBのアセトニトリル原液(−20℃で保存した10mM)から、mBBの100μM溶液をPBS(10mM,pH10.0±0.05)中で調製し、光を遮蔽して保存した。
黒色の平底の96ウェルプレートにおいて、100μLのmBBを各ウェルに分配した。標準曲線に対して、10μLの標準GSH溶液を加え、8.0±0.2の作用pHを得た。試料は、10μLの試料をウェルに加えた。全てのウェルを三組調製した。プレートを暗所にて室温で1時間インキュベートし、ついで390nmの励起波長と490nmの発光波長で蛍光プレートリーダー(Molecular Devices SpectraMaxR Gemini XS)を使用して読み取った。線形標準曲線を、GSH濃度に対してプロットした3つの標準ウェルの平均結果を使用して作成した。試料中の遊離チオール量は、3つの試料ウェルの平均値を使用して標準曲線の線形式から計算した。
Agilent 2100バイオアナライザーを使用してキャピラリー電気泳動測定値を獲得した。試料調製は、若干の変化を加えて、Agilentプロテイン230アッセイプロトコル(マニュアルパート番号G2938−90052)に記載されたようにして実施した。HCCF試料を1:4に希釈し、プロテインA試料を、調製前に1.0g/Lに水で希釈した。変性工程でのHCCF試料では、提供された2μLの変性溶液に加えて、24μLの50mMのヨードアセトアミド(IAM)、0.5%のSDS溶液を加えた。プロテインAの試料では、IAMのない0.5%のSDSと2mLの変性溶液を使用した。ゲル様デジタル画像を、Agilent 2100 Expertソフトウェアを使用して作成した。
3種の別個の原液を研究室規模のHCCF保持時間研究において使用した:(1)EDTA、二ナトリウム二水和物(Mallinckrodt,カタログ番号7727−06又はSigma,カタログ番号E−5134)及びEDTA、四ナトリウム二水和物(Sigma,カタログ番号E−6511)を使用して調製した250mMのEDTA原液、(2)硫酸銅五水和物の50mMの原液(CuSO4,Sigma,カタログ番号C−8027)、及び(3)1Mの酢酸溶液(Mallinckrodt,カタログ番号V193)。
250mMのEDTA又は50mMのCuSO4の原液をホモジナイゼーション前のCCFに添加して最終濃度の範囲を評価して、抗体のジスルフィド還元を防止した。最終HCCFをホモジナイズされたCCFから生成したところで、希釈し100%最大以下まで細胞溶解物の全レベルを減少させるためにホモジナイズされていないCCF(またEDTA又はCuSO4を含む)から生成したHCCFとこれら溶液をついで混合した。あるいは、1Mの酢酸の原液を週の配合HCCF溶液(ホモジナイズされたCCF及びホモジナイズされていないCCF)に加え、抗体のジスルフィド還元を防止するために溶液のpHを減少させた。
およそ30−50mLの各HCCF溶液(EDTA、CuSO4、酢酸を含むか、又はコントロールでは無添加)を50mLの316Lステンレス鋼製バイアルに入れた。バイアルをクランプで密封し、溶液は曝気又は攪拌はしなかった。バイアルを室温(18−22℃)で保存した。予め定めた時点で、溶液を取り除き、実験室規模のプロテインAアフィニティ樹脂で精製した。
同様の結果を、他の酸化剤、例えばシスチン及び酸化型グルタチオンを用いて得ることができる。
抗体のジスルフィド還元を防止するためのホモジナイズされたCCFから生産したHCCFの空気スパージングを評価するために、3Lのガラス製又は15Lのステンレス鋼製容器を利用した。およそ1−5LのHCCFを0.22μmで滅菌濾過し、各滅菌容器に入れた。実験条件は、二酸化炭素の添加によってpH制御を伴うか伴わないで18−22℃及び50(15L発酵槽)又は275rpm(3L発酵槽)に維持した。溶液に空気をスパージングして空気飽和状態まで溶存酸素レベルを増加させるか窒素(コントロール)をスパージングして溶液中の溶存酸素を除去した。各容器へのガス流は、一定の曝気速度が使用されたか又は最小レベルの溶存酸素が維持されたかに応じて変動した。予め定めた時点で、25−50mLの試料を両方の容器から取り除き、分析の前に実験室規模のプロテインAアフィニティ樹脂で精製した。
収集細胞培養液試料中の抗体は、特異的アフィニティクロマトグラフィー樹脂を使用して捕捉し精製することができる。プロテインA樹脂(Millipore, Prosep-vA High Capacity)を抗体精製のためのアフィニティ樹脂として選択した。樹脂を、14cmの床高の0.66cm内径のガラスカラム(Omnifit(登録商標))に充填し、4.8mLの最終カラム体積にした。カラムクロマトグラフィーを、AKTA Explorer 100 クロマトグラフィー系(GE Healthcare)を使用して実施した。
樹脂を350−560cm/時の線形流速でバッファー及びHCCFにさらした。樹脂を25mMのトリス、25mMのNaCl、5mMのEDTA,pH7.1で平衡にした。各精製に対して、樹脂を樹脂1mL当たり5−15mg抗体で充填した。HCCF中の抗体濃度を、固定化プロテインAのHPLCカラム(Applied Biosystems, POROS A)を使用して決定した。充填後、樹脂を25mMのトリス、25mMのNaCl、5mMのEDTA、0.5MのTMAC,pH7.1で洗浄し、ついで、抗体を0.1Mの酢酸,pH2.9を使用して溶離させた。溶離プール化はカラム後でインラインで測定した280nmでのUV吸光度に基づいた。精製した溶離プールは、1MのナトリウムHEPESを使用してpH5.0−5.5にpH調節した。0.1Mのリン酸での樹脂の再生後に、同じか又は類似の充填樹脂を、他のHCCF溶液の続く精製に使用した。
精製したプロテインAプール中の抗体濃度は280nmでのUV分光測定法を使用して測定した。精製したプロテインA溶離プールをバイオアナライザーアッセイによって分析して、150kDaの分子量のインタクトな抗体の割合を定量した。
透析実験
透析実験を設計し、実施して、オクレリズマブの還元が小還元分子又は巨大分子(例えば酵素)によって引き起こされたかどうかを決定した。この透析実験では、精製されたインタクトなオクレリズマブを、7000の分子量カットオフ(MWCO)の透析バッグ中に配し、ステンレス鋼製ミニタンク内でオクレリズマブを含むHCCF中の透析バッグでインキュベートした。図1及び2に示されているように、バッグ内のオクレリズマブは、インキュベーション期間後に還元されなかったが(図1)、HCCF中のバッグ外のオクレリズマブはインキュベーションの開始の直ぐ後に有意に還元された。これは、インタクトなオクレリズマブ(〜150kDa)の消失とオクレリズマブ断片(重鎖及び軽鎖の様々な組合せ)の形成によって裏付けられた(図2)。還元製造実験からのプロテインA溶離プール中のオクレリズマブの質量分析は、その観察された断片が鎖間ジスルフィド結合のみの還元によって形成されたことを示していた。
遊離チオールの測定は、インキュベーションの最初に透析バッグ内に遊離チオールが存在していなかったことを示している;しかしながら、透析バッグ内外の遊離チオールレベルが、インキュベーション開始後5時間以内に比較できるようになり、HCCF中の小分子成分が透析バッグ内外で完全に平衡になったことを示している(図3)。還元は7000DaのMWCOの透析バッグの外側のみで観察され内部では観察されなかったので、還元分子の分子量は7000Daよりも大きくなければならない。よって、酵素反応がオクレリズマブの還元の原因である。
インビトロでのTrx/TrxRによるオクレリズマブ(rhuMAb2H7,変異体A)の還元
Trx系を、インタクトなオクレリズマブをTrx、TrxR、及びNADPHと共にインキュベートすることによってインビトロでオクレリズマブを還元するその能力について試験した。バイオアナライザーは、オクレリズマブがTrx系によってインビトロで還元されていることを示している(図5)。このインビトロ系における還元速度は、(例えば図2に示される還元と比較して)HCCF中のものよりも遅いと思われる。これは、Trx系の反応速度が酵素濃度とバッファー系の双方に依存するので、インビトロ反応において使用される低濃度の酵素(Trx及びTrx−R)及び/又はバッファー系のためであるようである。
Trx系の阻害剤
(i)硫酸銅による組換え抗体の還元の阻害
硫酸銅は酸化還元電位を提供するその能力で知られており、組換え抗体分子における遊離チオールレベル(つまり、不対システインを最小化)を最小化するために細胞培養過程で使用されている(上掲のChaderjian等, 2005)。硫酸銅を、Trx系をインビトロで阻害する効果と続くオクレリズマブの還元について試験した。このインビトロ還元実験では、バッファー系をPBSからヒスチジン硫酸に変えて不溶性Cu3(PO4)2の形成を避けた。図8は、オクレリズマブがヒスチジン硫酸バッファー(PBSバッファー中では更に速く)中でTrx系によって直ぐに還元されたことを示している。この反応へのCuSO4の添加がオクレリズマブの還元を明らかに阻害する(図9)。
TrxRの2種の市販の特異的阻害剤オーロチオグルコース(ATG)及び金チオリンゴ酸塩(ATM)について、インビトロでTrx系を阻害しオクレリズマブの還元を阻害するその能力を試験した。ATG及びATM共、上述のアッセイにおいてオクレリズマブの還元を効果的に阻害することができる(図6及び7を参照)。図5の脚注に記載したものと同じ反応混合物に1mMの濃度でオーロチオグルコース又は金チオリンゴ酸塩を添加すると、バイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像に示されているようにオクレリズマブの還元を効果的に阻害した。
Trx系がHCCF中で活性であり、還元オクレリズマブが還元抗体分子を生じる製造実験又は実験室規模の実験で観察されるならば、双方の金化合物(ATG及びATM)がHCCF中のオクレリズマブの還元を阻害することができなければならない。図10は、インキュベーションの期間後3Lの発酵槽から生成したホモジナイズされたCCTからのHCCF中においてオクレリズマブが直ぐに還元されたことを示している。しかしながら、オクレリズマブ還元事象は、1mMのATGかATMがHCCFに添加されたときには完全に阻害された(図11及び12)。これらの結果は、Trx系がHCCFにおいて活性であり、オクレリズマブの還元の直接的な原因であることを証明している。
Trx系活性のためのNADPHの供給源と還元機構におけるG6Pとグルコースの役割
Trx系によるジスルフィドの還元は、NADPHからの還元均等物を必要とする(図4)。全ての還元的生合成反応に対してNADPHを提供する主要な細胞代謝経路はペントースリン酸経路である。抗体還元事象が生じるためには、この経路における酵素はTrx系を活性に維持するためにはHCCF中で尚活性でなければならない。最小では、(G6PDによって触媒される)ペントースリン酸経路における最初の工程は、G6Pを6−ホスホグルコノラクトンに転化させながらNADP+をNADPHに還元させるために活性でなければならない。また、G6Pは、HCCF中のヘキソキナーゼ活性によってグルコース及びアデノシン5’−トリリン酸(ATP)から生産される可能性が高い。オクレリズマブの還元の全機構は図4にまとめられている。
HCCF中の還元活性は、ある場合には一過性であると思われ、ある保存条件下又は複数の凍結/解凍サイクル後に経時的に阻害されうる。還元活性を完全に失ったHCCFは、Trx系によるオクレリズマブの還元におけるNADPH及びG6Pの役割を探求する機会を提供した。
これは、他の実験によって証明された。10mMのG6Pを、ベータ実験から繰り返しで凍結解凍させたHCCFに添加した。このG6P添加は、続いてHCCFインキュベーション実験においてオクレリズマブを還元したTrx系を再活性化した(図15)。これは、HCCF中でのオクレリズマブの還元がTrx系とG6PDの双方の活性によって引き起こされることを証明した。更に、G6PDはベータ実験の繰り返し凍結/解凍したHCCFにおいて尚も活性である;この繰り返し凍結/解凍したHCCFベータ実験における還元活性の消失はG6Pの枯渇のためのようであり、これがNADPHへのNADP+の転化を排除した。
DHEAによる組換え抗体の還元の阻害
デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)、並びに他の同様のG6PD阻害剤は、G6PD活性 (上掲のGordon等, 1995)を効果的に阻害する。G6PD阻害剤はまたNADPHの生成を阻止することによって、HCCF中の抗体、例えば、オクレリズマブの還元を防止する。オクレリズマブの還元を阻害するDHEAの能力は、HCCFインキュベーション実験において証明されている。HCCFへのDHEAの添加は抗体還元を防止する。
DHEAは典型的には約0.05mMから約5mMの濃度範囲で使用される。DHEAはまた典型的には約0.1mMから約2.5mMの濃度範囲で使用される。
(i)EDTA、(ii)硫酸銅、及び(iii)酢酸の添加による組換え抗体の還元の阻害
4種の異なったHCCFを保存し、ステンレス鋼製バイアルに入れた。溶液は、ホモジナイズされたCCFからのHCCFをホモジナイズされていないCCFからのHCCFで希釈することによって生成された細胞溶解物の量では同様であった。例えば、150mLの第一溶解溶液を、50mLの第二溶液とそれぞれ混合した。この研究で評価された4種のHCCF混合物は、(1)20mMのEDTA、(2)30μMのCuSO4、(3)15mMの酢酸(pH5.5)の何れかを含んでおり、(4)コントロール溶液には化学的阻害剤は添加しなかった。4種全ての混合物からのオクレリズマブ抗体はプロテインAクロマトグラフィーを使用して直ぐに(t=0時間)精製し、ついでステンレス鋼製バイアル中に20時間及び40時間保存した後に再び生成した。精製したプロテインA溶離プールをバイオアナライザーアッセイによって分析して、インタクトな抗体(150kDa)の割合を定量した。結果は、90%のインタクトな抗体が初期時点で4種全ての混合物中に存在していることを示している(図19)。しかしながら、20時間の時点では、インタクトな抗体はコントロール混合物(添加なし)では検出されず、抗体ジスルフィド結合の還元を示している。他の3種の混合物では、90%を越えるインタクトな抗体が20時間及び40時間の双方の時点でも尚検出されており、試験した3種全ての阻害剤によるジスルフィド結合の還元の防止を証明している。
HCCFの空気スパージングによる組換え抗体の還元の阻害
ホモジナイズされたCCFから生成した一つのHCCF混合物を保存し、二つの別個の10Lのステンレス鋼製発酵槽に入れた。一方の容器に空気をスパージすると共に、他方の容器に窒素ガスをスパージした。オクレリズマブ抗体は、プロテインAクロマトグラフィーを使用して、初期混合物から直ぐに(t=0時間)精製した。選択された時点で、50mLの試料を各容器から除去し、抗体をプロテインAクロマトグラフィーを使用して精製した。ついで、精製したプロテインA溶離プールをバイオアナライザーアッセイによって分析して、150kDaのインタクトな抗体の割合を定量した。結果は、およそ85%のインタクトな抗体が初期溶液中に存在していることを示しており(図20)、酸素への暴露(つまり発酵槽への空気スパージ)の前の抗体ジスルフィド結合のある程度の初期の還元を示している。混合物に2時間の間、空気をスパージすると、36時間の研究の残りに対して90%より多いインタクトな抗体が測定された。これに対して、混合物に窒素ガスをスパージした場合は、2時間(28%の150kDaピーク)及び6時間(5%の150kDaピーク)に測定したところ抗体還元事象が継続した。これらの結果は、ホモジナイズされたCCFから生成したHCCF混合物が酸素に暴露されると、抗体中のジスルフィド結合の還元を防止できることを証明している。
標的siRNA又はアンチセンスヌクレオチドTrx阻害剤の設計
CHO細胞に見出される遺伝子に対する標的siRNAs又はアンチセンスヌクレオチドの設計は、公的に利用可能な配列、例えば大腸菌チオレドキシンTrxA(配列番号30)、大腸菌チオレドキシンレダクターゼTrxB(配列番号31);マウスチオレドキシン1(配列番号32)、マウスチオレドキシン2(配列番号33)、マウスチオレドキシンレダクターゼ1(配列番号34)、及びマウスチオレドキシンレダクターゼ2(配列番号35)のものを使用して行うことができる。当業者はこれらの配列を用いて配列を選択し、異なった生物及び/又は細胞、例えばCHO細胞における酵素を標的にするためのTrx阻害剤を設計することができる。
ATG TTA CAC CAA CAA CGA AAC CAA CAC GCC AGG CTT ATT CCT GTG GAG TTA TAT ATG AGC GAT AAA ATT ATT CAC CTG ACT GAC GAC AGT TTT GAC ACG GAT GTA CTC AAA GCG GAC GGG GCG ATC CTC GTC GAT TTC TGG GCA GAG TGG TGC GGT CCG TGC AAA ATG ATC GCC CCG ATT CTG GAT GAA ATC GCT GAC GAA TAT CAG GGC AAA CTG ACC GTT GCA AAA CTG AAC ATC GAT CAA AAC CCT GGC ACT GCG CCG AAA TAT GGC ATC CGT GGT ATC CCG ACT CTG CTG CTG TTC AAA AAC GGT GAA GTG GCG GCA ACC AAA GTG GGT GCA CTG TCT AAA GGT CAG TTG AAA GAG TTC CTC GAC GCT AAC CTG GCG TAA(配列番号30)である。
ATG GGC ACG ACC AAA CAC AGT AAA CTG CTT ATC CTG GGT TCA GGC CCG GCG GGA TAC ACC GCT GCT GTC TAC GCG GCG CGC GCC AAC CTG CAA CCT GTG CTG ATT ACC GGC ATG GAA AAA GGC GGC CAA CTG ACC ACC ACC ACG GAA GTG GAA AAC TGG CCT GGC GAT CCA AAC GAT CTG ACC GGT CCG TTA TTA ATG GAG CGC ATG CAC GAA CAT GCC ACC AAG TTT GAA ACT GAG ATC ATT TTT GAT CAT ATC AAC AAG GTG GAT CTG CAA AAC CGT CCG TTC CGT CTG AAT GGC GAT AAC GGC GAA TAC ACT TGC GAC GCG CTG ATT ATT GCC ACC GGA GCT TCT GCA CGC TAT CTC GGC CTG CCC TCT GAA GAA GCC TTT AAA GGC CGT GGG GTT TCT GCT TGT GCA ACC TGC GAC GGT TTC TTC TAT CGC AAC CAG AAA GTT GCG GTC ATC GGC GGC GGC AAT ACC GCG GTT GAA GAG GCG TTG TAT CTG TCT AAC ATC GCT TCG GAA GTG CAT CTG ATT CAC CGC CGT GAC GGT TTC CGC GCG GAA AAA ATC CTC ATT AAG CGC CTG ATG GAT AAA GTG GAG AAC GGC AAC ATC ATT CTG CAC ACC AAC CGT ACG CTG GAA GAA GTG ACC GGC GAT CAA ATG GGT GTC ACT GGC GTT CGT CTG CGC GAT ACG CAA AAC AGC GAT AAC ATC GAG TCA CTC GAC GTT GCC GGT CTG TTT GTT GCT ATC GGT CAC AGC CCG AAT ACT GCG ATT TTC GAA GGG CAG CTG GAA CTG GAA AAC GGC TAC ATC AAA GTA CAG TCG GGT ATT CAT GGT AAT GCC ACC CAG ACC AGC ATT CCT GGC GTC TTT GCC GCA GGC GAC GTG ATG GAT CAC ATT TAT CGC CAG GCC ATT ACT TCG GCC GGT ACA GGC TGC ATG GCA GCA CTT GAT GCG GAA CGC TAC CTC GAT GGT TTA GCT GAC GCA AAA TAA(配列番号31)である。
ATGGTGAAGCTGATCGAGAGCAAGGAAGCTTTTCAGGAGGCCCTGGCCGCCGCGGGAGACAAGCTTGTCGTGGTGGACTTCTCTGCTACGTGGTGTGGACCTTGCAAAATGATCAAGCCCTTCTTCCATTCCCTCTGTGACAAGTATTCCAATGTGGTGTTCCTTGAAGTGGATGTGGATGACTGCCAGGATGTTGCTGCAGACTGTGAAGTCAAATGCATGCCGACCTTCCAGTTTTATAAAAAGGGTCAAAAGGTGGGGGAGTTCTCCGGTGCTAACAAGGAAAAGCTTGAAGCCTCTATTACTGAATATGCCTAA(配列番号32)である。
ATGGCTCAGCGGCTCCTCCTGGGGAGGTTCCTGACCTCAGTCATCTCCAGGAAGCCTCCTCAGGGTGTGTGGGCTTCCCTCACCTCTAAGACCCTGCAGACCCCTCAGTACAATGCTGGTGGTCTAACAGTAATGCCCAGCCCAGCCCGGACAGTACACACCACCAGAGTCTGTTTGACGACCTTTAACGTCCAGGATGGACCTGACTTTCAAGACAGAGTTGTCAACAGTGAGACACCAGTTGTTGTGGACTTTCATGCACAGTGGTGTGGCCCCTGCAAGATCCTAGGACCGCGGCTAGAGAAGATGGTCGCCAAGCAGCACGGGAAGGTGGTCATGGCCAAAGTGGACATTGACGATCACACAGACCTTGCCATTGAATATGAGGTGTCAGCTGTGCCTACCGTGCTAGCCATCAAGAACGGGGACGTGGTGGACAAGTTTGTGGGGATCAAGGACGAGGACCAGCTAGAAGCCTTCCTGAAGAAGCTGATTGGCTGA(配列番号33)である。
ATGAATGGCTCCAAAGATCCCCCTGGGTCCTATGACTTCGACCTGATCATCATTGGAGGAGGCTCAGGAGGACTGGCAGCAGCTAAGGAGGCAGCCAAATTTGACAAGAAAGTGCTGGTCTTGGATTTTGTCACACCGACTCCTCTTGGGACCAGATGGGGTCTCGGAGGAACGTGTGTGAATGTGGGTTGCATACCTAAGAAGCTGATGCACCAGGCAGCTTTGCTCGGACAAGCTCTGAAAGACTCGCGCAACTATGGCTGGAAAGTCGAAGACACAGTGAAGCATGACTGGGAGAAAATGACGGAATCTGTGCAGAGTCACATCGGCTCGCTGAACTGGGGCTACCGCGTAGCTCTCCGGGAGAAAAAGGTCGTCTATGAGAATGCTTACGGGAGGTTCATTGGTCCTCACAGGATTGTGGCGACAAATAACAAAGGTAAAGAAAAAATCTATTCAGCAGAGCGGTTCCTCATCGCCACAGGTGAGAGGCCCCGCTACCTGGGCATCCCTGGAGACAAAGAGTACTGCATCAGCAGTGATGATCTTTTCTCCTTGCCTTACTGCCCGGGGAAGACCCTAGTAGTTGGTGCATCCTATGTCGCCTTGGAATGTGCAGGATTTCTGGCTGGTATCGGCTTAGACGTCACTGTAATGGTGCGGTCCATTCTCCTTAGAGGATTTGACCAAGACATGGCCAACAAAATCGGTGAACACATGGAAGAACATGGTATCAAGTTTATAAGGCAGTTCGTCCCAACGAAAATTGAACAGATCGAAGCAGGAACACCAGGCCGACTCAGGGTGACTGCTCAATCCACAAACAGCGAGGAGACCATAGAGGGCGAATTTAACACAGTGTTGCTGGCGGTAGGAAGAGATTCTTGTACGAGAACTATTGGCTTAGAGACCGTGGGCGTGAAGATAAACGAAAAAACCGGAAAGATACCCGTCACGGATGAAGAGCAGACCAATGTGCCTTACATCTACGCCATCGGTGACATCCTGGAGGGGAAGCTAGAGCTGACTCCCGTAGCCATCCAGGCGGGGAGATTGCTGGCTCAGAGGCTGTATGGAGGCTCCAATGTCAAATGTGACTATGACAATGTCCCAACGACTGTATTTACTCCTTTGGAATATGGCTGTTGTGGCCTCTCTGAAGAAAAAGCCGTAGAGAAATTTGGGGAAGAAAATATTGAAGTTTACCATAGTTTCTTTTGGCCATTGGAATGGACAGTCCCATCCCGGGATAACAACAAATGTTATGCAAAAATAATCTGCAACCTTAAAGACGATGAACGTGTCGTGGGCTTCCACGTGCTGGGTCCAAACGCTGGAGAGGTGACGCAGGGCTTTGCGGCTGCGCTCAAGTGTGGGCTGACTAAGCAGCAGCTGGACAGCACCATCGGCATCCACCCGGTCTGTGCAGAGATATTCACAACGTTGTCAGTGACGAAGCGCTCTGGGGGAGACATCCTCCAGTCTGGCTGCTGA(配列番号34)である。
ATGGCGGCGATGGTGGCGGCGATGGTGGCGGCGCTGCGTGGACCCAGCAGGCGCTTCCGGCCGCGGACACGGGCTCTGACACGCGGGACAAGGGGCGCGGCGAGTGCAGCGGGAGGGCAGCAGAGCTTTGATCTCTTGGTGATCGGTGGGGGATCCGGTGGCCTAGCTTGTGCCAAGGAAGCTGCTCAGCTGGGAAAGAAGGTGGCTGTGGCTGACTATGTGGAACCTTCTCCCCGAGGCACCAAGTGGGGCCTTGGTGGCACCTGTGTCAACGTGGGTTGCATACCCAAGAAGCTGATGCATCAGGCTGCACTGCTGGGGGGCATGATCAGAGATGCTCACCACTATGGCTGGGAGGTGGCCCAGCCTGTCCAACACAACTGGAAGACAATGGCAGAAGCCGTGCAAAACCATGTGAAATCCTTGAACTGGGGTCATCGCGTCCAACTGCAGGACAGGAAAGTCAAGTACTTTAACATCAAAGCCAGCTTTGTGGATGAGCACACAGTTCGCGGTGTGGACAAAGGCGGGAAGGCGACTCTGCTTTCAGCTGAGCACATTGTCATTGCTACAGGAGGACGGCCAAGGTACCCCACACAAGTCAAAGGAGCCCTGGAATATGGAATCACAAGTGACGACATCTTCTGGCTGAAGGAGTCCCCTGGGAAAACGTTGGTGGTTGGAGCCAGCTATGTGGCCCTAGAGTGTGCTGGCTTCCTCACTGGAATTGGACTGGATACCACTGTCATGATGCGCAGCATCCCTCTCCGAGGCTTTGACCAGCAAATGTCATCTTTGGTCACAGAGCACATGGAGTCTCATGGCACCCAGTTCCTGAAAGGCTGTGTCCCCTCCCACATCAAAAAACTCCCAACTAACCAGCTGCAGGTCACTTGGGAGGATCATGCTTCTGGCAAGGAAGACACAGGCACCTTTGACACTGTCCTGTGGGCCATAGGGCGAGTTCCAGAAACCAGGACTTTGAATCTGGAGAAGGCTGGCATCAGTACCAACCCTAAGAATCAGAAGATTATTGTGGATGCCCAGGAGGCTACCTCTGTTCCCCACATCTATGCCATTGGAGATGTTGCTGAGGGGCGGCCTGAGCTGACGCCCACAGCTATCAAGGCAGGAAAGCTTCTGGCTCAGCGGCTCTTTGGGAAATCCTCAACCTTAATGGATTACAGCAATGTTCCCACAACTGTCTTTACACCACTGGAGTATGGCTGTGTGGGGCTGTCTGAGGAGGAGGCTGTGGCTCTCCATGGCCAGGAGCATGTAGAGGTTTACCATGCATATTATAAGCCCCTAGAGTTCACGGTGGCGGATAGGGATGCATCACAGTGCTACATAAAGATGGTATGCATGAGGGAGCCCCCACAACTGGTGCTGGGCCTGCACTTCCTTGGCCCCAACGCTGGAGAAGTCACCCAAGGATTTGCTCTTGGGATCAAGTGTGGGGCTTCATATGCACAGGTGATGCAGACAGTAGGGATCCATCCCACCTGCTCTGAGGAGGTGGTCAAGCTGCACATCTCCAAGCGCTCCGGCCTGGAGCCTACTGTGACTGGTTGCTGA(配列番号35)である。
インビトロTrx/Trxレダクターゼ研究
材料と方法
市販のTrxR(ラット肝臓)溶液(4μM)を水で希釈して2.86μMの溶液を得た。凍結乾燥したTrx(ヒト)をPBS(10mM,pH7.2)で再構成して、500μMの溶液を得た。20mMのNADPHと10mMのATGの溶液とATM溶液を水で調製した。
黒色ポリプロピレンの1.5mLのマイクロ遠心管、437μLの反応バッファー(10mMのヒスチジン、10mMのNa2SO4、137mMのNaCl、2.5mMのKCl,pH7.0)、25μLのNADPH、16μLの製剤化オクレリズマブ溶液(30.2mg/mL)及び5μLのTrxを穏やかに混合した。17.5μLのTrxRを添加して反応を開始させた。反応物を室温で24時間インキュベートした。20μLのアリコートを各サンプリング時点で採取して、バイオアナライザーアッセイによる分析まで−70℃で保存した。
Trx系の阻害を、様々な阻害剤を添加して上述と同じ反応条件を使用して証明した。
図24は、インタクトなオクレリズマブ(「2H7」ヒト化抗CD20抗体、上では「変異体A」と呼ばれる)(1mg/mL)を0.1μMのTrxR(ラット肝臓)、5μMのTrx(ヒト)及び10mMのヒスチジン硫酸バッファー中の1mMのNADPHと共にインキュベートすると、1時間以内にオクレリズマブの還元が生じることを示すバイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像(各レーンは時点を表す)を示す。
オーロチオグルコース(ATG)を次の濃度で上述のオクレリズマブ混合物に添加した:1mM;0.6μM(6:1 ATG:TrxR);0.4μM(4:1 ATG:TrxR);及び0.2μM(2:1 ATG:TrxR)。
図25−27に示されたバイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像によって証明されているように、1mM、0.6μM、及び0.4μMの濃度で添加されたオーロチオグルコースは、チオレドキシン系によるオクレリズマブの還元を効果的に阻害する。しかしながら、図28に示されているように、これらの実験条件では、0.2μMの濃度で添加されたオーロチオグルコースは24時間後でもオクレリズマブの還元を阻害できない。
金チオリンゴ酸塩(ATM)を、0.1mM及び0.01mMの濃度で上述のオクレリズマブ混合物に加えた。図29及び30に示されたバイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像によって証明されているように、ATMは、試験した両方の濃度でチオレドキシン系によるオクレリズマブの還元を効果的に阻害する。
CuSO4を、20μM(4:1 Cu2+:Trx);10μM(2:1 Cu2+:Trx);及び5μM(1:1 Cu2+:Trx)の濃度で上述のオクレリズマブ混合物に加えた。図31−33に示されるように、CuSO4は、20μM及び10μMの濃度でオクレリズマブのチオレドキシンに誘発された還元を効果的に阻害する(図31及び32)が、5μMの濃度は還元の完全な阻害には不十分である(図33)。
シスタミンを次の濃度で上述のオクレリズマブ混合物に加えた:532μM(20:1 シスタミン:2H7(変異体A)ジスルフィド);266μM(10:1 シスタミン:2H7(変異体A)ジスルフィド);133μM(5:1 シスタミン:2H7ジスルフィド);及び26.6μM(1:1 シスタミン:2H7(変異体A)ジスルフィド)。図34−37に示されるように、シスタミンは、532μM(20:1 シスタミン:2H7(変異体A)ジスルフィド)及び266μM(10:1 シスタミン:2H7(変異体A))(図34及び35)の濃度でオクレリズマブのチオレドキシンに誘発された還元を効果的に阻害するが、133μM(5:1 シスタミン:2H7(変異体A)ジスルフィド)及び26.6μM(1:1 シスタミン:2H7(変異体A)ジスルフィド)濃度は24時間後でもオクレリズマブの還元を阻害するには不十分である(図36及び37)。
シスチンを2.6mMの濃度で上述のオクレリズマブ混合物に加えた。図38に示されるように、この濃度では、シスチンは、チオレドキシン系によるオクレリズマブの還元を効果的に阻害する。シスチンの最小の有効濃度は(他の阻害剤の有効最小濃度のように)実際の環境に依存し、抗体のような異なったタンパク質に対して異なるかもしれないし、添加のタイミングに依存して変わるかも知れないことに留意される。よって、例えば、シスチンが溶解前に添加される場合、抗体2H7(変異体A)に対する最小有効濃度は、約1.3mMであり、Apomabでは約1mM、抗体変異体Cでは約4.5mMである。シスチンが細胞培養培地に添加される場合、最小の有効濃度は典型的には些か高く、2H7(変異体A)には約5.2mM、Apomabには6mM、抗体変異体Cには9mMである。通常は、シスチン、シスタミン及び酸化型グルタチオン(以下参照)では、最小の有効な阻害濃度は抗体濃度(μM)の約40×である。
GSSGを、2.6mMの濃度で上述のオクレリズマブ混合物に加えた。図39に示されるように、この濃度では、GSSGは、チオレドキシン系によるオクレリズマブの還元を効果的に阻害する。しかしながら、酸化型グルタチオンの最小の有効濃度は(他の阻害剤のもののように)実際の環境、例えば製造されるタンパク質の性質(例えば抗体)及び添加のタイミングに依存することに留意される。例えば、抗体2H7(変異体A)では、最小有効濃度は、溶解前の添加に対して約1.3mMである。
図40は、インタクトなオクレリズマブ(「2H7」ヒト化抗CD20抗体、変異体A)(1mg/mL)を10μg/mLのヘキソキナーゼ、50μg/mLのグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、5μMのチオレドキシン、0.1μMのチオレドキシンレダクターゼ、2mMのグルコース、0.6mMのATP、2mMのMg2+、及びpH7.38で緩衝させた50mMのヒスチジン硫酸中の2mMのNADPと共にインキュベートすると、約1時間以内にオクレリズマブの還元が生じることを示すバイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像(各レーンは時点を表す)を示す。既知のグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤である0.1mMのHDEAの添加は還元を阻害しない。
図41のバイオアナライザー分析からのゲル様デジタル画像に示されるように、インタクトなオクレリズマブ(1mg/mL)を5μMのチオレドキシン、0.1μMのチオレドキシンレダクターゼ、及び50mMのpH7.38のヒスチジン硫酸バッファー中の2mMのNADPと共にインキュベートした場合、オクレリズマブ抗体の還元を生じない。オクレリズマブの還元は、ヘキソキナーゼ及びグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ及びNADPHを生成するためのその基質なしには生じ得ない。
ここに述べた全ての米国特許及び出願;外国特許及び出願;化学的文献;本;及び刊行物は、図面、図及び表を含む各個々の特許又は刊行物が、全体が記載された状態で特にかつ個々に出典明示により援用された旨が示されているかの如く、その全体が出典明示によりここに援用される。
Claims (63)
- 組換え宿主細胞中で発現されるポリペプチドにおけるジスルフィド結合の還元を防止する方法であって、組換え宿主細胞の収集前又は収集培養液にチオレドキシン阻害剤を補充することを含む方法。
- 上記チオレドキシン阻害剤を収集前培養液に添加する請求項1に記載の方法。
- 上記チオレドキシン阻害剤を収集培養液に添加する請求項1に記載の方法。
- 上記チオレドキシン阻害剤がチオレドキシンの直接阻害剤である請求項1に記載の方法。
- 上記チオレドキシン阻害剤がアルキル−2−イミダゾリルジスルフィド又はナフトキノンスピロケタール誘導体である請求項4に記載の方法。
- 上記チオレドキシン阻害剤がチオレドキシンレダクターゼの特異的阻害剤である請求項1に記載の方法。
- 上記チオレドキシン阻害剤が金錯体である請求項6に記載の方法。
- 上記金錯体がオーロチオグルコース(ATG)又は金チオリンゴ酸塩(ATM)である請求項7に記載の方法。
- 上記ATG又は上記ATMを、約0.1mMと約1mMの間の濃度で添加する請求項8に記載の方法。
- 上記ATG又は上記ATMを、上記収集前又は収集培養液中のチオレドキシンレダクターゼ濃度の少なくとも約4倍の濃度で添加する請求項8に記載の方法。
- 上記チオレドキシン阻害剤が金属イオンである請求項1に記載の方法。
- 上記金属イオンが、Hg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、及びMn2+からなる群から選択される請求項11に記載の方法。
- 上記金属イオンが、硫酸銅の形態で存在するCu2+である請求項12に記載の方法。
- 上記硫酸銅が、五水和物形態又は無水物形態である請求項13に記載の方法。
- 上記硫酸銅を、約5mMと約100mMの間の濃度で添加する請求項13に記載の方法。
- 上記硫酸銅を、約10mMと約80mMの間の濃度で添加する請求項13に記載の方法。
- 上記硫酸銅を、約15mMと約50mMの間の濃度で添加する請求項13に記載の方法。
- 上記硫酸銅を、上記収集前又は収集培養液中のチオレドキシン濃度の少なくとも約2倍の濃度で添加する請求項13に記載の方法。
- 上記チオレドキシン阻害剤がG6PDの阻害剤としてである請求項1に記載の方法。
- 上記チオレドキシン阻害剤が、ピリドキサール5’−リン酸,1フルオロ−2,4ジニトロベンゼン,デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)及びエピアンドロステロン(EA)からなる群から選択される請求項19に記載の方法。
- 上記DHEAを、約0.05mMと約5mMの間の濃度で添加する請求項20に記載の方法。
- 上記DHEAを、約0.1mMと約2.5mMの間の濃度で添加する請求項20に記載の方法。
- 上記チオレドキシン阻害剤が、ヘキソキナーゼ活性の阻害剤である請求項1に記載の方法。
- 上記チオレドキシン阻害剤が金属イオンのキレート剤である請求項23に記載の方法。
- 金属イオンの上記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)である請求項24に記載の方法。
- 上記EDTAを、約5mMと約60mMの間の濃度で添加する請求項25に記載の方法。
- 上記EDTAを、約10mMと約50mMの間の濃度で添加する請求項25に記載の方法。
- 上記EDTAを、約20mMと約40mMの間の濃度で添加する請求項25に記載の方法。
- 上記チオレドキシン阻害剤が、ソルボース−1−リン酸、ポリリン酸、6−デオキシ−6−フルオログルコース、2−C−ヒドロキシ−メチルグルコース、キシロース、及びリキソースからなる群から選択される請求項23に記載の方法。
- 上記チオレドキシン阻害剤が、シスチン、システイン、又は酸化グルタチオンである請求項1に記載の方法。
- 上記シスチン、システイン、又は酸化グルタチオンを、上記収集前又は収集培養液中の上記ポリペプチドの濃度の少なくとも約40倍の濃度で添加する請求項30に記載の方法。
- 上記チオレドキシン阻害剤が、チオレドキシンレダクターゼに特異的に結合するsiRNA、アンチセンスヌクレオチド、又は抗体である請求項1に記載の方法。
- 上記チオレドキシン阻害剤が、チオレドキシン活性の阻害を間接的に生じさせる手段である請求項1に記載の方法。
- 上記手段が、上記組換え宿主細胞の収集培養液への空気散布である請求項33に記載の方法。
- 上記手段が、上記組換え宿主細胞の収集培養液のpHを低下させることである請求項33に記載の方法。
- 上記組換え宿主細胞の収集培養液へ空気散布する工程を更に含む請求項1から33の何れか一項に記載の方法。
- 上記組換え宿主細胞の収集培養液のpHを低下させる工程を更に含む請求項1から33の何れか一項に記載の方法。
- 上記ポリペプチドが、抗体又は抗体の生物学的に機能的な断片である請求項1に記載の方法。
- 上記抗体断片が、抗体断片から形成されたFab、Fab′、F(ab′)2、scFv、(scFv)2、dAb、相補性決定領域(CDR)断片、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、及び多重特異的抗体から選択される請求項38に記載の方法。
- 上記抗体又は抗体断片が、治療用抗体又はその生物学的に機能的な断片である請求項38に記載の方法。
- 上記治療用抗体が、抗HER2抗体;抗CD20抗体;抗IL−8抗体;抗VEGF抗体;抗CD40抗体,抗CD11a抗体;抗CD18抗体;抗IgE抗体;抗Apo−2レセプター抗体;抗組織因子(TF)抗体;抗ヒトα4β7インテグリン抗体;抗EGFR抗体;抗CD3抗体;抗CD25抗体;抗CD4抗体;抗CD52抗体;抗Fcレセプター抗体;抗癌胎児抗原(CEA)抗体;乳房上皮細胞に対する抗体;結腸癌細胞に結合する抗体;抗CD38抗体;抗CD33抗体;抗CD22抗体;抗EpCAM抗体;抗GpIIb/IIIa抗体;抗RSV抗体;抗CMV抗体;抗HIV抗体;抗肝炎抗体;抗CA125抗体;抗αvβ3抗体;抗ヒト腎細胞癌抗体;抗ヒト17−1A抗体;抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体;GD3ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体R24;抗ヒト扁平上皮癌;及び抗ヒト白血球抗原(HLA)抗体,及び抗HLADR抗体からなる群から選択される請求項40に記載の方法。
- 上記治療用抗体が、HERレセプター、VEGF、IgE、CD20、CD11a、CD40、又はDR5に結合する抗体である請求項40に記載の方法。
- 上記HERレセプターがHER1及び/又はHER2である請求項42に記載の方法。
- HERレセプターがHER2である請求項43に記載の方法。
- 上記治療用抗体が、配列番号16、17、18、及び19からなる群から選択される重鎖及び/又は軽鎖可変ドメイン配列を含む請求項44に記載の方法。
- 上記治療用抗体が、CD20に結合する抗体である請求項42に記載の方法。
- 上記治療用抗体が、配列番号1から15からなる群から選択される重鎖及び/又は軽鎖可変ドメイン配列を含む請求項46に記載の方法。
- 上記治療用抗体が、VEGFに結合する抗体である請求項42に記載の方法。
- 上記治療用抗体が、配列番号20から25からなる群から選択される重鎖及び/又は軽鎖可変ドメイン配列を含む請求項48に記載の方法。
- 上記治療用抗体が、CD11aに結合する抗体である請求項42に記載の方法。
- 上記治療用抗体が、配列番号26から29からなる群から選択される重鎖及び/又は軽鎖可変ドメイン配列を含む請求項50に記載の方法。
- 上記治療用抗体がDR5レセプターに結合する請求項42に記載の方法。
- 上記治療用抗体が、Apomabs1.1、2.1、3.1、4.1、5.1、5.2、5.3、6.1、6.2、6.3、7.1、7.2、7.3,8.1、8.3、9.1、1.2、2.2、3.2、4.2、5.2、6.2、7.2、8.2、9.2、1.3、2.2、3.3、4.3、5.3、6.3、7.3、8.3、9.3,及び25.3からなる群から選択される請求項52に記載の方法。
- 上記治療用抗体がApomab8.3又はApomab7.3である請求項52に記載の方法。
- 上記治療用抗体がApomab7.3である請求項54に記載の方法。
- 上記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである請求項1に記載の方法。
- 治療用ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン及び牛成長ホルモンを含む成長ホルモン;成長ホルモン放出因子;副甲状腺ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク質;α−1−アンチトリプシン;インスリンA鎖;インスリンB鎖;プロインスリン;卵胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体形成ホルモン;グルカゴン;第VIIIC因子、第IX因子、組織因子、及びフォン・ヴィルブランド因子等の凝固因子;プロテインC等の抗凝固因子;心房性ナトリウム利尿因子;肺サーファクタント;ウロキナーゼ又はヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子(t−PA)等のプラスミノーゲン活性化因子;ボンベシン;トロンビン;ヘモポイエチン増殖因子;腫瘍壊死因子−α及びβ;エンケファリナーゼ;RANTES(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted);ヒトマクロファージ炎症性タンパク質(MIP−1−α);ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン;ミュラー管抑制因子;レラキシンA鎖;レラキシンB鎖;プロレラキシン;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;β−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質;DNアーゼ;IgE;CTLA−4等の細胞傷害性Tリンパ球抗原(CTLA);インヒビン;アクチビン;血管内皮増殖因子(VEGF);ホルモン又は増殖因子の受容体;プロテインA又はD;リウマチ因子;骨由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン−3、−4、−5、又は−6(NT−3、NT−4、NT−5、又はNT−6)、又はNGF−β等の神経成長因子等の神経栄養因子;血小板由来増殖因子(PDGF);aFGF及びbFGF等の線維芽細胞増殖因子;表皮増殖因子(EGF);TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、TGF−β4又はTGF−β5を含む、TGF−α及びTGF−β等のトランスフォーミング増殖因子;インスリン様増殖因子−I及びII(IGF−I及びIGF−II);デス(1−3)−IGF−I(脳IGF−I);インスリン様増殖因子結合タンパク質;CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34、及びCD40等のCDタンパク質;エリスロポイエチン;骨誘導因子;イムノトキシン;骨形成タンパク質(BMP);インターフェロン−α、−β、−γ等のインターフェロン;コロニー刺激因子(CSF)、例えばM−CSF、GM−CSF及びG−CSF;インターロイキン(IL)、例えばIL−1からIL−10;スーパーオキシドジスムターゼ;T細胞受容体;表面膜タンパク質;崩解促進因子;例えばAIDSエンベロープのタンパク質等のウイルス抗原;輸送タンパク質;ホーミング受容体;アドレシン;調節タンパク質;インテグリン、例えばCD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA−4及びVCAM;腫瘍関連抗原、例えばHER2、HER3又はHER4レセプター;及び上記ポリペプチドの断片からなる群から選択される請求項56に記載の方法。
- 上記組換え宿主細胞が真核生物宿主細胞である請求項1に記載の方法。
- 上記真核生物宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である請求項58に記載の方法。
- 上記哺乳動物宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である請求項59に記載の方法。
- 組換え宿主細胞が原核生物宿主細胞である請求項1に記載の方法。
- 原核生物宿主細胞が細菌細胞である請求項61に記載の方法。
- 細菌細胞が大腸菌細胞である請求項62に記載の方法。
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