KR20200103763A - 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료 및 그것을 사용한 줄기 세포의 배양 방법 - Google Patents

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Abstract

합성 수지를 함유하는 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료로서, 합성 수지의 질소 함유량이 0.1질량％ 이상 10질량％ 이하인, 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료. 이 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료에 의하면, 적당한 친수성과 강도를 구비하여, 줄기 세포의 파종 후의 정착성이 높아, 고효율로 세포 증식이 가능하다.

Description

줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료 및 그것을 사용한 줄기 세포의 배양 방법
본 발명은 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료 및 그것을 사용한 줄기 세포의 배양 방법에 관한 것이다.
줄기 세포는 창약이나 재생 의료로의 응용이 기대되고 있다. 줄기 세포는, 자기 복제능과 분화능을 갖는 세포이며, 모든 세포종으로 분화 가능한 다능성 줄기 세포와, 동 계열의 체조직 구성 세포종으로만 분화 가능한 조직 줄기 세포 및 조직 전구 세포가 있다. 다능성 줄기 세포는, 예를 들어 인간 배아 줄기 세포(hESC)나, 인간 인공 다능성 줄기 세포(hiPSC) 등의 인간 다능성 줄기 세포(hPSC) 등을 들 수 있다. 줄기 세포를 안전하게, 그리고 재현성 좋게 배양하여, 증식시키는 것은, 이들 세포를 의료 응용함에 있어서는 필수적인 기반 기술이 된다. 특히, 재생 의료의 산업 이용 상에 있어서는, 줄기 세포를 미분화 상태에서 다량으로 다룰 필요가 있다. 그 때문에, 천연 및 합성의 고분자나 피더 세포를 사용하여 줄기 세포의 증식을 행함과 함께, 다능 성능(또는 다분화능)을 유지하는 기술에 대하여 광범위한 연구가 행하여지고 있다. 특히 천연 고분자로서 라미닌, 비트로넥틴 등의 접착 단백질이나 마우스 육종 유래의 마트리겔을 사용하면 파종 후의 세포 정착성이 매우 높은 것이 알려져 있다.
그러나, 천연 고분자는 생산성이 매우 낮기 때문에 고가인 것, 천연 유래 물질이기 때문에 로트 간에 변동이 보이는 것, 동물 유래의 성분에 의한 안전성 상의 우려가 있는 것을 과제로서 들 수 있다.
상기 과제를 해결하기 위해서, 합성 수지를 사용한 줄기 세포 배양 수지 담체가 제안되어 있다. 예를 들어, 특허문헌 1의 실시예의 란에는, 마우스 섬유 아세포의 배양에 있어서, 친수성 또한 내수성이 우수한 스캐폴드재를 제공하기 위하여 아세탈화도가 20 내지 60몰％인 폴리비닐아세탈 화합물이 개시되어 있다. 특허문헌 2의 실시예의 란에는 마우스 ES 세포의 배양에 있어서, 아크릴 폴리머에 의해 구성된 하이드로겔이 개시되어 있다. 특허문헌 3의 실시예의 란에는 마우스 iPS 세포의 배양에 있어서, 친수성을 갖고, 또한 유연한 폴리로탁산 겔이 개시되어 있다.
일본 특허 공개 제2006-314285호 공보 일본 특허 공개 제2010-158180호 공보 일본 특허 공개 제2017-23008호 공보
그러나, 특허문헌 1에는, 친수성이 높기 때문에 배지 중에서 팽윤하여, 스캐폴드재 수지가 박리되는 문제가 있다. 또한, 줄기 세포나 다능성 줄기 세포의 파종 후의 정착성이 낮아, 충분히 증식하지 않는다고 하는 문제가 있다. 특허문헌 2에는, 2-아크릴아미드-2-메틸프로판술폰산나트륨염, 및 p-스티렌술폰산나트륨, N,N'-디메틸아크릴아미드를 사용하고 있어, 친수성이 높기 때문에 배지 중에서 팽윤하여, 스캐폴드재 수지가 박리되는 문제가 있다. 특허문헌 3에는, 친수성이 높기 때문에 배지 중에서 팽윤하여, 스캐폴드재 수지가 박리되는 문제가 있다. 유연한 스캐폴드재이기 때문에 심근 세포로의 분화가 촉진된다고 하는 문제가 있다.
이상으로부터, 적당한 친수성과 강도를 구비하는 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료 및 그것을 사용한 줄기 세포의 배양 방법이 요구되고 있다.
본 발명은 적당한 친수성과 강도를 구비하여, 줄기 세포의 파종 후의 정착성이 높아, 고효율로 세포 증식이 가능한 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료 및 그것을 사용한 줄기 세포의 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 이하의 내용에 관한 것이다.
(1) 합성 수지를 함유하는 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료로서, 합성 수지의 질소 함유량이 0.1질량％ 이상 10질량％ 이하인 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료.
(2) 합성 수지가, 1몰％ 이상 50몰％ 이하로 브뢴스테드 염기성기를 구비하는 (1)에 기재된 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료.
(3) 브뢴스테드 염기성기를 갖는 화합물이 아민계 염기성기인 (2)에 기재된 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료.
(4) 합성 수지가, 아민 구조를 갖는 구성 단위, 이민 구조를 갖는 구성 단위 및 아미드 구조를 갖는 구성 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 구비하는 (2) 또는 (3)에 기재된 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료.
(5) 합성 수지가 아미드 구조를 갖는 구성 단위를 구비하는 (1), (2), (4) 중 어느 하나에 기재된 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료.
(6) 합성 수지가 이민 구조를 갖는 구성 단위 및 아민 구조를 갖는 구성 단위의 양쪽을 구비하는 (1), (2), (4) 중 어느 하나에 기재된 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료.
(7) 줄기 세포가 다능성 줄기 세포인 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료.
(8) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료를 구비하는 줄기 세포 배양용 용기.
(9) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료와,
다당류를 함유하는 줄기 세포 배양용 담체.
(10) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료를 구비하는 줄기 세포 배양용 섬유.
(11) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료를 사용하는 줄기 세포의 배양 방법.
본 발명에 따르면, 적당한 친수성과 강도를 구비하여, 줄기 세포의 파종 후의 정착성이 높은 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료 및 그것을 사용한 줄기 세포의 배양 방법이 제공된다.
도 1a는 실시 형태에 관계되는 줄기 세포 배양용 용기의 사시 개념도, 도 1b는 그의 측면 단면 개념도이다.
도 2는 실시 형태에 관계되는 6웰형의 줄기 세포 배양용 용기의 사시 개념도이다.
도 3은 세포 파종 후 24시간 후의 초기 접착성의 평가 기준을 도시하는 도면이다.
도 4a 및 도 4b 각각은, 실시예 및 비교예에 관계되는 세포의 파종 후 24시간 후의 위상차 현미경 사진이다.
도 5는 세포 파종 후 5일 후의 세포 증식성의 평가 기준을 도시하는 도면이다.
도 6a 및 도 6b 각각은, 실시예 및 비교예에 관계되는 세포의 파종 후 5일 후의 위상차 현미경 사진이다.
이하에, 실시 형태를 들어 본 발명의 설명을 행하지만, 본 발명은 이하의 실시 형태에 한정되는 것은 아니다.
[줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료]
본 발명자들은 예의 검토한 결과, 질소 함유량이 0.1％ 이상 10％ 이하인 합성 수지를 사용함으로써 상술한 과제를 해결할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 합성 수지를 함유하는 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료로서, 합성 수지의 질소 함유량이 0.1％ 이상 10％ 이하인 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료에 관한 것이다.
질소 함유량은 0.3질량％ 이상 8질량％ 이하가 보다 바람직하고, 0.5질량％ 이상, 5질량％ 이하가 보다 바람직하다. 합성 수지로서는, 브뢴스테드 염기성기를 1몰％ 이상 50몰％ 이하 포함하는 것이 바람직하고, 1몰％ 이상 30몰％ 이하 포함하는 것이 보다 바람직하다.
얻어진 합성 수지의 원소 조성은 X선 광전자 분광법(장치: 알백 파이사제, 다기능 주사형 X선 광전자 분광 분석 장치(XPS), PHI 5000 VersaProbe III)에 의해 분석할 수 있다. 검출된 전체 원소의 총량을 100％로 하고, 전체 원소 중에 있어서의 질소의 점유율(％)을 질소 함유량으로 한다.
또한, 본 발명의 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료에는, 합성 수지만을 포함하는 양태가 포함된다.
이 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료는, 적당한 친수성과 강도를 구비하기 때문에, 줄기 세포의 파종 후의 정착성이 향상된다. 특히 피더 세포나 접착 단백질을 포함하지 않는 무혈청 배지 배양에 있어서, 줄기 세포 파종 후의 초기 정착율이 향상된다.
줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료는, 상술한 요건을 충족시키면 성분은 특별히 제한되지 않지만, 합성 수지를 함유하는 것이 바람직하다.
합성 수지는, 중합성 모노머(이하, 간단히 「모노머」라고도 한다)를 중합(중축합도 포함한다)하여 얻어지는 폴리머(이하, 간단히 「폴리머」라고도 한다)를 주성분으로 하는 것을 말한다. 상기 폴리머는 1종 또는 2종 이상의 중합성 모노머의 코폴리머도 포함한다.
상기 폴리머로서는, 예를 들어, (불)포화 탄화수소, 방향족 탄화수소, (불)포화 지방산, 방향족 카르복실산, (불)포화 케톤, 방향족 케톤, (불)포화 알코올, 방향족 알코올, (불)포화 아민, 방향족 아민, (불)포화 티올, 방향족 티올, 유기 규소 화합물의 1종 이상 중합성 단량체를 포함하는 폴리머를 들 수 있다.
구체적인 상기 폴리머로서는, 예를 들어, 폴리올레핀, 폴리에테르, 폴리비닐알코올, 폴리비닐아세탈, 폴리에스테르, 폴리(메트)아크릴산에스테르, 에폭시 수지, 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리우레탄, 폴리카르보네이트, 셀룰로오스, 폴리펩티드 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 줄기 세포의 정착성의 관점에서, 폴리(메트)아크릴산에스테르, 폴리비닐아세탈이 바람직하고, 폴리비닐아세탈이 보다 바람직하다.
또한, 이들 폴리머는, 1종류로 사용해도 되고, 2종류 이상 조합하여 사용해도 된다. 2종류 이상의 폴리머를 조합하는 경우에는, 2종류 이상의 폴리머를 혼합하여 사용해도 되고, 2종류 이상의 폴리머의 골격을 화학 결합시킨 폴리머로서 사용해도 된다. 따라서, 합성 수지로서, 복수의 것을 조합하는 경우에는, 폴리(메트)아크릴산에스테르와, 폴리비닐아세탈을 조합하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 있어서의 「(메트)아크릴산류」란, (메트)아크릴산에스테르 및 (메트)아크릴산으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 말한다. 또한 폴리(메트)아크릴산류는, 그의 모노머인 (메트)아크릴산에스테르 또는 (메트)아크릴산을 중합함으로써 얻어지는 중합체인데, (메트)아크릴산에스테르 또는 (메트)아크릴산 이외의 모노머를 공중합한 것도 포함한다.
상기 (메트)아크릴산에스테르로서는 특별히 한정되지 않지만, (메트)아크릴산알킬에스테르, (메트)아크릴산 환상 알킬에스테르, (메트)아크릴산아릴에스테르, (메트)아크릴아미드류, (메트)아크릴산폴리에틸렌글리콜류, (메트)아크릴산포스포릴콜린으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 것이 바람직하다.
상기 (메트)아크릴산알킬에스테르로서는, 예를 들어, 메틸(메트)아크릴레이트, 에틸(메트)아크릴레이트, n-프로필(메트)아크릴레이트, 이소프로필(메트)아크릴레이트, n-부틸(메트)아크릴레이트, 이소부틸(메트)아크릴레이트, t-부틸(메트)아크릴레이트, n-옥틸(메트)아크릴레이트, 이소옥틸(메트)아크릴레이트, 2-에틸헥실(메트)아크릴레이트, 노닐(메트)아크릴레이트, 이소노닐(메트)아크릴레이트, 데실(메트)아크릴레이트, 이소데실(메트)아크릴레이트, 라우릴(메트)아크릴레이트, 스테아릴(메트)아크릴레이트, 이소테트라데실(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다.
또한, 이들 (메트)아크릴산알킬에스테르는, 특별히 제한은 없지만, 탄소 원자수 1 내지 3의 알콕시기, 테트라히드로푸르푸릴기 등의 다양한 치환기로 치환되어 있어도 된다. 예로서는, 메톡시에틸아크릴레이트, 테트라히드로푸르푸릴아크릴레이트 등을 들 수 있다.
상기 (메트)아크릴산 환상 알킬에스테르로서는, 예를 들어, 시클로헥실(메트)아크릴레이트, 이소보르닐(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다.
상기 (메트)아크릴산아릴에스테르로서는, 예를 들어, 페닐(메트)아크릴레이트, 벤질(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다.
상기 아크릴아미드류로서는, 예를 들어, (메트)아크릴아미드, N-이소프로필(메트)아크릴아미드, N-tert-부틸(메트)아크릴아미드, N,N'-디메틸(메트)아크릴아미드, (3-(메트)아크릴아미드프로필)트리메틸암모늄클로라이드, 4-(메트)아크릴로일모르폴린, 3-(메트)아크릴로일-2-옥사졸리디논, N-[3-(디메틸아미노)프로필](메트)아크릴아미드, N-(2-히드록시에틸)(메트)아크릴아미드, N-메틸올(메트)아크릴아미드, 6-(메트)아크릴아미드헥산산 등을 들 수 있다.
상기 (메트)아크릴산폴리에틸렌글리콜류로서는, 예를 들어, 메톡시-폴리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 에톡시-폴리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 히드록시-폴리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 메톡시-디에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 에톡시-디에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 히드록시-디에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 메톡시-트리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 에톡시-트리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 히드록시-트리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다.
상기 (메트)아크릴산포스포릴콜린으로서는, 예를 들어, 2-(메트)아크릴로일옥시에틸포스포릴콜린을 들 수 있다.
(메트)아크릴산에스테르 이외의 모노머로서는, 특별히 한정은 없고, (메트)아크릴산, 에틸렌, 비닐에스테르 등을 들 수 있다.
상기 (메트)아크릴산에스테르는 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다. 또한, 본 명세서에 있어서, 상기 (메트)아크릴산이란, 아크릴산 및 메타크릴산을 총칭하는 것이며, 상기 (메트)아크릴레이트란, 아크릴레이트 및 메타크릴레이트를 총칭하는 것으로 한다.
합성 수지 중에서도 폴리비닐아세탈 수지를 사용하는 것이 바람직하다. 이하, 폴리비닐아세탈 수지에 대하여 설명한다.
(폴리비닐아세탈 수지)
폴리비닐아세탈 수지는, 폴리비닐알코올에 대하여 알데히드에 의해 아세탈화함으로써 합성되는 수지이며, 측쇄에 아세틸기와 수산기, 그리고 아세탈기를 갖는다. 폴리비닐아세탈 수지는, 측쇄에 기타의 치환기(아세틸기, 수산기, 아세탈기 이외의 치환기)를 갖는 변성 폴리비닐아세탈 수지여도 된다. 기타의 치환기로서는, 후술하는 브뢴스테드 염기성기를 갖는 치환기가 바람직하다.
상기 아세탈화에 사용되는 알데히드로서는, 탄소수 1 내지 10의 쇄상 지방족기, 환상 지방족기 또는 방향족기를 갖는 알데히드를 들 수 있다. 이들 알데히드로서는, 종래 공지된 알데히드를 사용할 수 있다.
상기 알데히드의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 포름알데히드, 아세트알데히드, 프로피온알데히드, 부틸알데히드, 펜탄알, 헥산알, 헵탄알, 옥탄알, 노난알, 데칸알, 아크롤레인, 벤즈알데히드, 신남알데히드, 페릴알데히드, 포르밀피리딘, 포르밀이미다졸, 포르밀피롤, 포르밀피페리딘, 포르밀피페리딘, 포르밀트리아졸, 포르밀테트라졸, 포르밀인돌, 포르밀이소인돌, 포르밀퓨린, 포르밀퓨린, 포르밀벤즈이미다졸, 포르밀벤조트리아졸, 포르밀퀴놀린, 포르밀이소퀴놀린, 포르밀퀴녹살린, 포르밀신놀린, 포르밀프테리딘, 포르밀푸란, 포르밀옥솔란, 포르밀옥산, 포르밀티오펜, 포르밀티올란, 포르밀티안, 포르밀아데닌, 포르밀구아닌, 포르밀시토신, 포르밀티민, 포르밀우라실 등을 들 수 있다. 상기 알데히드는 쇄상이어도 되고, 환상이어도 된다.
상기 알데히드는 포름알데히드, 아세트알데히드, 프로피온알데히드, 부틸알데히드, 펜탄알인 것이 바람직하고, 부틸알데히드가 더욱 바람직하다.
상기 알데히드의 첨가량으로서는, 목적으로 하는 아세탈기량에 맞춰서 적절히 설정할 수 있다. 특히, 폴리비닐알코올 100몰％에 대하여 상기 알데히드의 첨가량을 60 내지 95몰％, 바람직하게는 65 내지 90몰％로 하면, 아세탈화 반응이 효율적으로 행하여져, 미반응된 알데히드도 제거하기 쉽기 때문에 바람직하다.
상기 폴리비닐알코올은 비닐 화합물과의 공중합체여도 된다. 비닐 화합물로서는, 에틸렌, 비닐아민, 알릴아민, 비닐피롤리돈, 무수 말레산, 말레이미드, 이타콘산, (메트)아크릴산류를 들 수 있다.
상기 (메트)아크릴산류 중, (메트)아크릴산에스테르로서는 특별히 한정되지 않지만, (메트)아크릴산알킬에스테르, (메트)아크릴산 환상 알킬에스테르, (메트)아크릴산아릴에스테르, (메트)아크릴아미드류, (메트)아크릴산폴리에틸렌글리콜류, (메트)아크릴산포스포릴콜린으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 것이 바람직하다.
상기 (메트)아크릴산알킬에스테르로서는, 예를 들어, 메틸(메트)아크릴레이트, 에틸(메트)아크릴레이트, n-프로필(메트)아크릴레이트, 이소프로필(메트)아크릴레이트, n-부틸(메트)아크릴레이트, 이소부틸(메트)아크릴레이트, t-부틸(메트)아크릴레이트, n-옥틸(메트)아크릴레이트, 이소옥틸(메트)아크릴레이트, 2-에틸헥실(메트)아크릴레이트, 노닐(메트)아크릴레이트, 이소노닐(메트)아크릴레이트, 데실(메트)아크릴레이트, 이소데실(메트)아크릴레이트, 라우릴(메트)아크릴레이트, 스테아릴(메트)아크릴레이트, 이소테트라데실(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다.
상기 (메트)아크릴산 환상 알킬에스테르로서는, 예를 들어, 시클로헥실(메트)아크릴레이트, 이소보르닐(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다.
상기 (메트)아크릴산아릴에스테르로서는, 예를 들어, 페닐(메트)아크릴레이트, 벤질(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다.
상기 아크릴아미드류로서는, 예를 들어, (메트)아크릴아미드, N-이소프로필(메트)아크릴아미드, N-tert-부틸(메트)아크릴아미드, N,N'-디메틸(메트)아크릴아미드, (3-(메트)아크릴아미드프로필)트리메틸암모늄클로라이드, 4-(메트)아크릴로일모르폴린, 3-(메트)아크릴로일-2-옥사졸리디논, N-[3-(디메틸아미노)프로필](메트)아크릴아미드, N-(2-히드록시에틸)(메트)아크릴아미드, N-메틸올(메트)아크릴아미드, 6-(메트)아크릴아미드헥산산 등을 들 수 있다.
상기 (메트)아크릴산폴리에틸렌글리콜류로서는, 예를 들어, 메톡시-폴리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 에톡시-폴리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 히드록시-폴리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 메톡시-디에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 에톡시-디에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 히드록시-디에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 메톡시-트리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 에톡시-트리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 히드록시-트리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다.
상기 (메트)아크릴산포스포릴콜린으로서는, 예를 들어, 2-(메트)아크릴로일옥시에틸포스포릴콜린을 들 수 있다.
상기 (메트)아크릴산류는 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다. 또한, 본 명세서에 있어서, 상기 (메트)아크릴산이란, 아크릴산 및 메타크릴산을 총칭하는 것이며, 상기 (메트)아크릴레이트란, 아크릴레이트 및 메타크릴레이트를 총칭하는 것으로 한다.
상기 아세탈화도가 60％를 초과하도록 조정하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 아세탈화 반응 시에 상기 알데히드를 과잉량 첨가함으로써 아세탈화 반응을 충분히 진행시키는 것이 가능하다.
본 명세서에 있어서, 합성 수지는, 그 일부에 브뢴스테드 염기성기를 갖는 것이 바람직하다. 합성 수지의 일부가 브뢴스테드 염기성기에 의해 변성되어 있는 경우, 피더 세포나 접착 단백질을 포함하지 않는 무혈청 배지 배양에 있어서, 줄기 세포 파종 후의 초기 정착율이 향상되어, 줄기 세포의 배양을 하기 쉬워지기 때문이다.
상기 브뢴스테드 염기성기는, 수소 이온 H+를 다른 물질로부터 수취할 수 있는 치환기의 총칭이다. 상기 브뢴스테드 염기성기로서는, 예를 들어, 아민 구조를 갖는 치환기, 이민 구조를 갖는 치환기, 아미드 구조를 갖는 치환기, 이미드 구조를 갖는 치환기 등의 아민계 염기성기를 들 수 있다.
따라서, 이러한 합성 수지로서는, 이민 구조를 갖는 구성 단위, 아민 구조를 갖는 구성 단위, 아미드 구조를 갖는 구성 단위, 및 이미드 구조를 갖는 구성 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 구성 단위로서 포함하는 합성 수지가 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 이민 구조란, C=N 결합을 갖는 구조를 말한다. 상기 합성 수지는, 이민 구조를 측쇄에 갖는 것이 바람직하다. 또한, 상기 이민 구조는, 합성 수지의 주쇄를 구성하는 탄소에 직접 결합해도 되고, 알킬렌기 등의 연결기를 통하여 결합하고 있어도 된다. 또한, 상기 이민 구조를 측쇄에 갖는다란, 상기 이민 구조를 합성 수지의 그래프트쇄에 갖는 것을 포함한다. 상기 이민 구조를 갖는 구성 단위로서는, 예를 들어, 하기 식 (1)로 표시되는 구성 단위를 들 수 있다.
Figure pct00001
식 (1) 중, R1은, 단결합, 또는, 알킬렌기를 나타내고, R2는, 이민 구조를 갖는 기를 나타낸다.
상기 식 (1) 중, R1이 알킬렌기일 경우, 해당 알킬렌기의 탄소수의 바람직한 하한은 1, 바람직한 상한은 12이다. 상기 알킬렌기의 탄소수가 12를 초과하면, 최적의 강도가 얻어지지 않는 경우가 있다. 상기 R1이 알킬렌기일 경우, 상기 알킬렌기의 탄소수의 보다 바람직한 상한은 5이다.
상기 식 (1) 중, R1이 알킬렌기일 경우, 해당 알킬렌기로서는, 예를 들어, 메틸렌기, 에틸렌기, 트리메틸렌기, 테트라메틸렌기, 펜타메틸렌기, 헥사메틸렌기, 옥타메틸렌기, 데카메틸렌기 등의 직쇄상 알킬렌기, 메틸메틸렌기, 메틸에틸렌기, 1-메틸펜틸렌기, 1,4-디메틸부틸렌기 등의 분지상 알킬렌기, 시클로프로필렌기, 시클로부틸렌기, 시클로헥실렌기 등의 환상 알킬렌기 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 메틸렌기, 에틸렌기, 트리메틸렌기,
테트라메틸렌기 등의 직쇄상 알킬기가 바람직하고, 메틸렌기, 에틸렌기가 보다 바람직하다.
상기 R2로서는, 하기 식 (2)로 표시되는 관능기를 들 수 있다.
Figure pct00002
식 (2) 중, R3은 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 18의 탄화수소기를 나타내고, R4는 탄소수 1 내지 18의 탄화수소기를 나타낸다.
상기 탄화수소기로서는, 포화 탄화수소기, 불포화 탄화수소기, 방향족계 탄화수소기 등을 들 수 있다. 또한, 상기 탄화수소기는, 포화 탄화수소기, 불포화 탄화수소기, 방향족계 탄화수소기의 어느 한종만을 포함하는 것이어도 되고, 이들이 2종 이상 사용된 것이어도 된다.
상기 포화 탄화수소기로서는, 예를 들어, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, iso-부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, 펜틸기, 헥실기, 헵틸기, 2-에틸헥실기, 옥틸기, 노닐기, 데실기, 운데실기, 도데실기, 트리데실기, 테트라데실기, 펜타데실기, 옥타데실기 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, n-부틸기가 바람직하다.
상기 방향족계 탄화수소기로서는, 예를 들어, 페닐기, 톨루일기, 크실릴기, t-부틸페닐기, 벤질기 등을 들 수 있다.
상기 합성 수지에 있어서, 상기 이민 구조를 갖는 구성 단위 중, R1이 단결합, R3이 수소 원자, 메틸기 또는 에틸기, R4가 메틸기, 에틸기 또는 프로필기인 것이 바람직하다.
상기 합성 수지는, 이민 구조를 갖는 구성 단위의 함유량의 바람직한 하한이 0.1몰％, 바람직한 상한이 20.0몰％이다. 상기 이민 구조를 갖는 구성 단위의 함유량이 0.1몰％ 이상이면 경시 점도 안정성이 양호한 것이 된다. 상기 이민 구조를 갖는 구성 단위의 함유량이 20.0몰％ 이하이면, 줄기 세포의 정착성을 높일 수 있다. 상기 이민 구조를 갖는 구성 단위의 함유량의 보다 바람직한 하한은 1.0몰％, 보다 바람직한 상한은 15.0몰％이다.
상기 합성 수지에 있어서, 합성 수지로서 변성 폴리비닐아세탈 수지를 사용하는 경우, 이민 구조를 갖는 구성 단위의 함유량과, 후술하는 아세탈화도의 비율(이민 구조를 갖는 구성 단위의 함유량/아세탈화도)은 0.001 내지 0.5가 바람직하다. 상기 범위 내로 함으로써, 높은 강도 및 우수한 접착성을 양립하여, 접착 후의 내구성을 향상시키는 것이 가능하게 된다.
상기 합성 수지는, 아민 구조를 갖는 구성 단위 또는 아미드 구조를 갖는 구성 단위를 갖는 것이 바람직하다.
상기 합성 수지는, 상기 아민 구조 또는 아미드 구조를 측쇄에 갖는 것이 바람직하다. 또한, 상기 아민 구조 또는 아미드 구조는, 합성 수지의 주쇄를 구성하는 탄소에 직접 결합해도 되고, 알킬렌기 등의 연결기를 통하여 결합하고 있어도 된다. 또한, 상기 아민 구조는 제1급 아민이어도 되고, 제2급 아민이어도 되고, 제3급 아민이어도 되고, 제4급 아민이어도 된다. 이들 중에서도 세포 정착성의 관점에서, 제1급 아민이 바람직하다.
또한, 상기 아민 구조 또는 아미드 구조를 측쇄에 갖는다란, 상기 아민 구조 또는 아미드 구조를 합성 수지의 그래프트쇄에 갖는 것을 의미한다.
특히, 상기 아민 구조는, -NH2인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서, 아미드 구조란, -C(=O)-NH-을 갖는 구조를 말한다. 그 중에서도, 상기 아민 구조를 갖는 구성 단위는, 하기 식 (3)에 표시되는 구조인 것이 바람직하다. 또한, 상기 아미드 구조를 갖는 구성 단위는, 하기 식 (4)에 표시되는 구조인 것이 바람직하다.
Figure pct00003
Figure pct00004
식 (4) 중, R5는 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 10의 탄화수소기를 나타낸다. 또한, 상기 탄화수소기로서는, 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 시클로알케닐기를 들 수 있다.
상기 아민 구조 또는 아미드 구조를 갖는 구성 단위의 함유량의 바람직한 하한은 0.1몰％, 바람직한 상한은 20몰％이다. 상기 아민 구조 또는 아미드 구조를 갖는 구성 단위의 함유량이 0.1몰％ 이상이면 부가 특성을 충분한 것으로 할 수 있다. 상기 함유량이 20몰％ 이하이면, 용해성이 너무 높아질 일 없이, 침전법에 의한 변성 폴리비닐아세탈 수지 분말의 취출이 용이하게 된다. 상기 함유량의 보다 바람직한 하한은 0.5몰％, 보다 바람직한 상한은 10몰％이다. 또한, 상기 아민 구조 또는 아미드 구조를 갖는 구성 단위의 함유량은 NMR 등으로 측정 가능하다. 또한, 상기 아민 구조 또는 아미드 구조를 갖는 구성 단위와, 이민 구조를 갖는 구성 단위를 합계한 함유량의 바람직한 하한은 0.1몰％, 바람직한 상한은 20몰％이다. 상기 함유량의 보다 바람직한 하한은 0.5몰％, 보다 바람직한 상한은 10몰％이다.
상기 합성 수지에 있어서, 이민 구조와 아민 구조 또는 아미드 구조의 양쪽을 갖는 경우, 이민 구조를 갖는 구성 단위와, 아민 구조 또는 아미드 구조를 갖는 구성 단위의 함유량의 비율(이민 구조를 갖는 구성 단위/아미노기 또는 아미드 구조를 갖는 구성 단위)은 0.5/99.5 내지 99.5/0.5인 것이 바람직하다. 상기 비율이 0.5/99.5 이상이면 경시 점도 안정성을 충분한 것으로 할 수 있고, 상기 비율이 99.5/0.5 이하이면, 줄기 세포의 정착성의 관점에서 가교 성능을 충분히 발휘할 수 있다. 상기 비율의 보다 바람직한 하한은 5/95, 보다 바람직한 상한은 75/25이다.
상기 합성 수지로서 폴리비닐아세탈 수지를 사용하는 경우, 폴리비닐아세탈 수지의 아세탈화도는 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 하한이 60몰％, 바람직한 상한은 90몰％이다. 아세탈화도가 60몰％ 이상이면 줄기 세포의 정착성이 우수하여, 고효율로 세포 증식을 행할 수 있다. 또한, 아세탈화도가 90몰％ 이하이면, 용제에 대한 용해성을 양호한 것으로 할 수 있다. 보다 바람직한 하한이 65몰％, 보다 바람직한 상한이 85몰％이다. 상기 합성 수지의 아세탈도는 NMR 등으로 측정 가능하다.
상기 합성 수지로서 폴리비닐아세탈 수지를 사용하는 경우의 폴리비닐아세탈 수지의 아세틸기량은 특별히 한정되지 않고 바람직한 하한이 0.0001몰％, 바람직한 상한이 5몰％이다.
상기 합성 수지는, 아민 구조를 갖는 구성 단위, 이민 구조를 갖는 구성 단위 및 아미드 구조를 갖는 구성 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 구비하는 것이 바람직하다.
상기 합성 수지는, 이민 구조를 갖는 구성 단위 및 아민 구조를 갖는 구성 단위의 양쪽을 구비하는 것이 바람직하다.
상기 변성 폴리비닐아세탈 수지를 제작하는 방법으로서는, 예를 들어, 상기 이민 구조를 갖는 단량체와, 아세트산비닐을 공중합시킴으로써 얻어진 폴리아세트산비닐을 비누화하여 얻어진 폴리비닐알코올을, 종래 공지된 방법에 의해 아세탈화하는 방법을 들 수 있다. 또한, 아미노기 또는 아미드 구조를 갖는 구성 단위를 갖는 폴리비닐알코올을, 종래 공지된 방법에 의해 아세탈화함으로써 이민 구조를 도입하는 방법을 사용해도 된다. 아미노기 또는 아미드 구조를 갖는 구성 단위를 갖는 폴리비닐알코올을 후변성하여 얻어진 이민 구조를 갖는 변성 폴리비닐알코올을, 종래 공지된 방법에 의해 아세탈화하는 방법을 사용해도 된다. 또한, 미변성의 폴리비닐아세탈 수지를 후변성시킴으로써 이민 구조를 도입해도 된다. 즉, 상기 변성 폴리비닐아세탈 수지는, 아미노기 또는 아미드 구조를 갖는 구성 단위를 갖는 폴리비닐알코올의 아세탈화물이어도 된다. 이들 중에서는, 아미노기 또는 아미드 구조를 갖는 구성 단위를 갖는 폴리비닐알코올을 아세탈화하여 이루어지는 것으로 이민 구조를 갖는 변성 폴리비닐아세탈 수지를 얻는 방법이 바람직하다. 특히, 이러한 방법을 사용하는 경우, 아세탈화에 사용하는 알데히드, 산 촉매의 양을 과잉으로 첨가함으로써 이민 구조를 얻을 수 있다.
상기 알데히드를 과잉으로 첨가하는 방법에서는, 아미노기 또는 아미드 구조를 갖는 구성 단위를 갖는 폴리비닐알코올 100중량부에 대하여 알데히드를 70 내지 150중량부 첨가하는 것이 바람직하다. 특히, 알데히드로서는, 아세트알데히드, 프로피온알데히드, n-부틸알데히드, 이소부틸알데히드, n-발레르알데히드, 페닐알데히드가 바람직하다.
상기 산 촉매를 과잉으로 첨가하는 방법에서는, 산 촉매를 전체의 0.5중량％ 이상 첨가하는 것이 바람직하다. 또한, 아미노기 또는 아미드 구조를 갖는 구성 단위를 갖는 폴리비닐알코올 100중량부에 대하여 산 촉매를 5.0 내지 70.0중량부 첨가하는 것이 바람직하다. 특히, 산 촉매로서는, 염산, 질산, 황산, 파라톨루엔술폰산이 바람직하다.
상기 아세탈화는, 공지된 방법을 사용할 수 있고, 수용매 중, 물과 물과의 상용성이 있는 유기 용매의 혼합 용매 중, 혹은 유기 용매 중에서 행하는 것이 바람직하다. 상기 물과의 상용성이 있는 유기 용매로서는, 예를 들어, 알코올계 유기 용제를 사용할 수 있다. 상기 유기 용매로서는, 예를 들어, 알코올계 유기 용제, 방향족 유기 용제, 지방족 에스테르계 용제, 케톤계 용제, 저급 파라핀계 용제, 에테르계 용제, 아민계 용제 등을 들 수 있다. 상기 알코올계 유기 용제로서는, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, tert-부탄올 등을 들 수 있다. 상기 방향족 유기 용제로서는, 예를 들어, 크실렌, 톨루엔, 에틸벤젠, 벤조산메틸 등을 들 수 있다.
상기 지방족 에스테르계 용제로서는, 예를 들어, 아세트산메틸, 아세트산에틸, 아세트산부틸, 프로피온산메틸, 프로피온산에틸, 부티르산메틸, 부티르산에틸, 아세토아세트산메틸, 아세토아세트산에틸 등을 들 수 있다.
상기 케톤계 용제로서는, 예를 들어, 아세톤, 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥사논, 메틸시클로헥사논, 벤조페논, 아세토페논 등을 들 수 있다. 상기 저급 파라핀계 용제로서는, 헥산, 펜탄, 옥탄, 시클로헥산, 데칸 등을 들 수 있다. 상기 에테르계 용제로서는, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 에틸렌글리콜디메틸에테르, 에틸렌글리콜디에틸에테르, 프로필렌글리콜디에틸에테르 등을 들 수 있다. 상기 아미드계 용제로서는, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸테세트아미드, N-메틸피롤리돈, 아세트아닐리드 등을 들 수 있다.
상기 아민계 용제로서는, 암모니아, 트리메틸아민, 트리에틸아민, n-부틸아민, 디n-부틸아민, 트리n-부틸아민, 아닐린, N-메틸아닐린, N,N-디메틸아닐린, 피리딘 등을 들 수 있다.
이들은, 단체로 사용할 수도 있고, 2종 이상의 용매를 혼합으로 사용할 수도 있다. 이들 중에서도 수지에 대한 용해성 및 정제 시의 간이성의 관점에서, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, 테트라히드로푸란이 특히 바람직하다.
상기 아세탈화는, 산 촉매의 존재 하에서 행하는 것이 바람직하다. 상기 산 촉매는 특별히 한정되지 않고 황산, 염산, 질산, 인산 등의 무기산이나, 포름산, 아세트산, 프로피온산 등의 카르복실산이나, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, 파라톨루엔술폰산 등의 술폰산을 들 수 있다. 이들 산 촉매는, 단독으로 사용되어도 되고, 2종 이상의 화합물을 병용해도 된다. 그 중에서도, 염산, 질산, 황산이 바람직하고, 염산이 특히 바람직하다.
상기 폴리비닐아세탈 수지는 상기 비닐 화합물과의 그래프트 공중합체여도 된다. 비닐 화합물로서는, 에틸렌, 알릴아민, 비닐피롤리돈, 무수 말레산, 말레이미드, 이타콘산, (메트)아크릴산류를 들 수 있다.
상기 그래프트 공중합체는 「폴리비닐아세탈을 포함하는 유닛」과 「비닐 화합물을 포함하는 유닛」을 갖는 그래프트 공중합체(이하, 간단히 「그래프트 공중합체」라고도 한다)를 함유한다. 비닐 화합물이란, 에테닐기(H2C=CH-)를 갖는 구성 단위를 갖는 화합물을 말한다.
본 발명에 있어서, 「폴리비닐아세탈을 포함하는 유닛」 및 「비닐 화합물을 포함하는 유닛」이란, 그래프트 공중합체 중에 존재하고 있는 「폴리비닐아세탈」, 「비닐 화합물을 포함하는 유닛」을 말한다. 또한, 폴리비닐아세탈을 포함하는 유닛 및 비닐 화합물을 포함하는 유닛을 포함하는 유닛을 갖는 그래프트 공중합체는, 주쇄를 구성하는 「폴리비닐아세탈을 포함하는 유닛」 또는 「비닐 화합물을 포함하는 유닛」에, 해당 주쇄와는 다른 측쇄를 구성하는 「폴리비닐아세탈을 포함하는 유닛」 또는 「비닐 화합물을 포함하는 유닛」이 결합한 분지상의 공중합체를 말한다.
상기 그래프트 공중합체의 분자량으로서는 특별히 제한은 없지만, 수 평균 분자량(Mn)이 10000 내지 600000이고, 중량 평균 분자량(Mw)이 20000 내지 1200000이며, 이들의 비(Mw/Mn)가 2.0 내지 40인 것이 바람직하다. Mn, Mw, Mw/Mn이 이러한 범위이면, 상기 줄기 세포 스캐폴드 재료의 강도가 적합하게 유지된다.
상기 그래프트 공중합체에 있어서의 아세탈화도는, 상기 크실렌에 있어서의 가용분을 중수소화디메틸술폭시드에 용해하고, 1H-NMR 측정에 의해 아세탈화도를 측정하는 방법 등을 들 수 있다.
폴리비닐아세탈 수지는, 이민 구조를 갖는 구성 단위, 아민 구조를 갖는 구성 단위, 및 아미드 구조를 갖는 구성 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 구성 단위를, 0.1 내지 30몰％ 포함하는 것이 바람직하다. 파종 직후의 세포 접착성의 관점에서 1 내지 10몰％ 포함하는 것이 보다 바람직하다.
또한, 아민 구조를 갖는 구성 단위, 아미드 구조를 갖는 구성 단위, 이민 구조를 갖는 구성 단위의 함유량을 확인하는 방법으로서는, 예를 들어, 1H-NMR로 확인하는 방법 등을 들 수 있다.
여기서, 본 명세서에서 사용되는 용어의 설명을 행한다.
「줄기 세포」란, 자기 복제능과 분화능을 갖는 세포를 말한다. 줄기 세포 중, 자기 복제능을 갖고, 또한, 하나의 세포로부터, 내배엽, 중간층, 외배엽의 모든 세포로 분화할 수 있는 것을 「다능성 줄기 세포」라고 한다.
다능성 줄기 세포로서는, 예를 들어, 인공 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell, 이하 「iPS 세포」라고 한다.), 배아 줄기 세포(embryonic stem cells, 이하 「ES 세포」라고 한다.), Muse 세포(multilinege differentiating stress enduring cells), 배성 암 세포(embryonic germ cell), 배성 생식 줄기 세포(embryonic germ cell), mGS 세포(multipotent germ stem cell) 등을 들 수 있다.
줄기 세포 중, 자기 복제능을 갖고, 외배엽계 조직, 내배엽계 조직, 중간층계 조직, 생식계 조직의 어느 것에 속하고, 그것이 속해 있는 장기의 구성 세포종으로의 한정된 분화능을 나타내는 것을 「조직 줄기 세포」 및 「조직 전구 세포」라고 한다.
조직 줄기 세포 및 조직 전구 세포로서는, 예를 들어, 신경 줄기 세포, 신경제 줄기 세포, 망막 줄기 세포, 각막 줄기 세포, 케라티노사이트 표피 줄기 세포, 멜라노사이트 줄기 세포, 유선 줄기 세포, 간 줄기 세포, 장 줄기 세포, 기도 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 간엽계 줄기 세포, 심장 줄기 세포, 혈관 내피 전구 세포, 혈관 주피 세포, 골격근 줄기 세포, 지방 줄기 세포, 신장 전구 세포, 정자 줄기 세포 등을 들 수 있다.
본 발명의 줄기 세포 스캐폴드 재료를 사용함으로써, 상기 줄기 세포종은 특별히 상관없지만, 줄기 세포 스캐폴드 재료로서 사용할 수 있다. 그 중에서도, 다능성 줄기 세포, 특히 iPS 세포의 배양에 사용되는 것이 바람직하다. 피더 세포나 접착 단백질을 포함하지 않는 무혈청 배지 배양에 있어서, 줄기 세포 파종 후의 초기 정착율이 향상되어, 줄기 세포의 배양을 적합하게 행할 수 있다.
이와 같은 줄기 세포로서는, 예를 들어 「더 잘 알 수 있어! 줄기 세포와 재생 의료」(요도샤, 오사후네 겐지 저)에 기재된 줄기 세포를 들 수 있다.
합성 수지로서, 폴리비닐아세탈 수지를 사용하는 경우의 폴리비닐아세탈 수지의 중합도의 하한은, 100이 바람직하고, 200이 보다 바람직하고, 500이 더욱 바람직하고, 1500이 더욱 보다 바람직하다. 중합도가 상기 범위이면, 세포 배양으로 하려고 하는 배지에서 팽윤해도 스캐폴드재 강도를 적합하게 유지할 수 있는 것으로부터, 세포 증식성이 향상된다. 중합도의 상한은 6000이 바람직하고, 3000이 보다 바람직하고, 2500이 더욱 바람직하다. 중합도가 상기 범위이면, 취급성이 좋아, 스캐폴드재를 적합하게 성형할 수 있다.
[줄기 세포의 배양 방법]
상술한 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료에 의하면, 여러가지 줄기 세포를 배양할 수 있는데, 그 특성을 고려하면, 줄기 세포 중에서도 다능성 줄기 세포의 배양에 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 다능성 줄기 세포는 파종 후의 배양의 정착율이 낮다고 되어 있지만, 상술한 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료는, 배양 배지의 수분에 의해 팽윤하기 어려워, 적당한 친수성과 강도를 유지할 수 있으므로, 다능성 줄기 세포의 파종 후의 정착율이 향상되기 때문이다.
[줄기 세포 배양용 용기]
본 발명은 상술한 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료를 사용한 줄기 세포 배양용 용기에도 관한 것이다. 즉, 줄기 세포 배양용 용기이며, 줄기 세포 배양용 용기는, 줄기 세포의 배양 영역의 적어도 일부에, 상술한 줄기 세포 스캐폴드 재료를 포함하는 수지막을 구비하는 줄기 세포 배양용 용기에 관한 것이다.
도 1a는 실시 형태에 관계되는 줄기 세포 배양용 용기의 사시 개념도, 도 1b는 그의 측면 단면 개념도이다. 줄기 세포 배양용 용기의 형상은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 도 1a에 도시하는 바와 같은 바닥이 있는 원주상의 샤알레(1)를 준비하고, 그 저면의 줄기 세포 배양 영역에, 도 1b에 도시하는 바와 같이 수지막(12)을 마련하는 양태를 들 수 있다.
줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료는, 줄기 세포의 배양에 있어서, 평면 배양(이차원 배양 방법)에 사용하는 것 이외에, 생체 내에 보다 가까운 상태, 예를 들어 다공질막이나 하이드로겔 등의 기재 상에서의 줄기 세포의 배양(삼차원 배양 방법)에 사용할 수 있다. 세포 배양용 스캐폴드 재료를 바이오리액터 등에 사용함으로써, 효율적으로 줄기 세포를 증식시킬 수 있기 때문이다.
세포 배양용 스캐폴드 재료는, 적당한 친수성과 강도를 구비하는 것으로부터, 이차원 배양 방법에 사용되는 것이 바람직하다.
평면 배양(이차원 배양 방법)용 용기로서는, 형상이나 크기는 특별히 한정되지 않지만, 1개 또는 복수의 웰(구멍)을 구비하는 세포 배양용 테스트 플레이트나, 세포 배양용 플라스크를 들 수 있다. 예를 들어, 도 2에 도시한 바와 같은 6개의 웰을 갖는 줄기 세포 배양용 용기를 사용할 수 있다. 상기 마이크로플레이트의 웰의 수는 한정되지 않고, 예를 들어, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 96, 384 등을 들 수 있다.
상기 웰의 형상은 특별히 한정되지 않지만, 진원, 타원, 삼각형, 정사각형, 직사각형, 오각형 등을 들 수 있다. 상기 웰 저면의 형상은 특별히 한정되지 않지만, 평평 바닥, 둥근 바닥, 요철 등을 들 수 있다.
1개 또는 복수의 웰(구멍)을 구비하는 세포 배양용 테스트 플레이트나, 세포 배양용 플라스크의 재질은 특별히 한정되지 않지만, 고분자 수지나 금속, 무기 재료를 들 수 있다. 상기 고분자 수지로서는, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트, 폴리에스테르, 폴리이소프렌, 시클로올레핀 폴리머, 폴리이미드, 폴리아미드, 폴리아미드이미드, (메트)아크릴 수지, 에폭시 수지, 실리콘 등을 들 수 있다. 금속으로서는, 스테인리스, 구리, 철, 니켈, 알루미늄, 티타늄, 금, 은, 백금 등을 들 수 있다. 무기 재료로서는, 산화규소(유리), 산화알루미늄, 산화티타늄, 산화지르코늄, 산화철, 질화규소 등을 들 수 있다.
상술한 것 외에도, 세포 배양용 스캐폴드 재료는, 줄기 세포를 배지 중에서 자유롭게 부유시켜서 성장시키는 부유 배양 방법에 사용할 수 있다.
[다능성 줄기 세포의 배양 방법]
다능성 줄기 세포의 배양 방법에 있어서는, 합성 수지를 함유하는 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료 상에 세포 덩어리를 파종하는 것이 바람직하다.
세포 덩어리는, 콘플루언트가 된 배양 용기에 세포 박리제를 첨가하고, 피펫팅에 의해 균일하게 파쇄 처리함으로써 얻을 수 있다. 세포 박리제로서는, 특별히 한정되지 않지만, 에틸렌디아민/인산 완충 용액이 바람직하다. 세포 덩어리의 크기는 50 내지 200㎛인 것이 바람직하다.
[기타의 실시 형태]
본 발명은 상술한 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료 이외에도, 기타의 실시 형태로서, 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료를 사용한 발명이 제공된다.
예를 들어, 상술한 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료와, 다당류를 함유하는 줄기 세포 배양용 담체(매체)가 제공된다. 다당류로서는, 특별히 제한없이 여러가지 다당류를 사용할 수 있다. 그 중에서도 수용성 다당류가 바람직하다.
그 밖에도, 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료를 구비하는 줄기 세포 배양용 섬유가 제공된다. 이 경우, 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료는, 섬유 상에 도포되어 있는 것이 바람직하다. 또한 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료는, 섬유 중에 함지되거나, 이겨 넣어져 있는 형태여도 된다. 줄기 세포 배양용 섬유는, 플라스크 등의 평면 구조에는 접착하기 어렵지만, 섬유(fibril)상 구조 등의 입체 구조에는 접착하기 쉬운 줄기 세포의 삼차원 배양 방법에 적합하다. 줄기 세포 중에서도 특히 지방 줄기 세포의 배양에 적합하다.
상기 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료는 가교되어 있어도 된다. 가교됨으로써 수팽윤성을 억제하여, 적합하게 강도를 높일 수 있기 때문이다. 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료에 또한 가교제를 첨가하여 가교시켜도 된다.
가교제로서는 특별히 한정되지 않지만, 폴리알코올이나 폴리카르복실산, 히드록시카르복실산, 금속 비누, 다당류 등을 들 수 있다.
폴리알코올로서는 특별히 한정되지 않지만, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부탄디올, 펜탄디올, 헥산디올, 헵탄디올, 옥탄디올, 노난디올, 데칸디올, 도데칸디올, 운데칸디올, 디에틸렌글리콜, 트리에틸렌글리콜, 테트라에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 카테콜, 피로갈롤, 디보론산, 메틸렌디보론산, 에틸렌디보론산, 프로필렌디보론산, 페닐렌디보론산, 비페닐디보론산, 비스페놀 유도체 등을 들 수 있다.
폴리카르복실산으로서는 특별히 한정되지 않지만, 옥살산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 세바스산, 프탈산, 폴리(메트)아크릴산 등을 들 수 있다.
히드록시카르복실산으로서는 특별히 한정되지 않지만, 글리콜산, 락트산, 타르트론산, 글리세린산, 히드록시부티르산, 말산, 타르타르산, 시토말산, 시트르산, 이소시트르산, 류신산, 메발론산, 판토산, 리시놀산, 리시넬라이드산, 세레브론산, 퀸산, 시킴산, 히드록시벤조산, 살리실산, 크레오소트산, 바닐린산, 시링산, 피로카테큐산, 레조르실산, 프로토카테큐산, 겐티스산, 오르셀린산, 갈산, 만델산, 벤질산, 아트로락틴산, 메릴로트산, 프롤레트산, 쿠마르산, 움벨산, 커피산, 페룰산, 시나프산, 히드록시스테아르산 등을 들 수 있다.
금속 비누로서는 특별히 한정되지 않지만, 스테아르산, 라우르산, 리시놀산, 옥틸산 등의 지방산과, 리튬, 나트륨, 마그네슘, 칼슘, 바륨, 아연, 알루미늄 등의 금속의 염을 들 수 있다.
다당류로서는 특별히 한정되지 않지만, 펙틴, 구아 검, 크산탄 검, 타마린드 검, 카라기난, 프로필렌글리콜, 카르복시메틸셀룰로오스, 아밀로스, 아밀로펙틴, 글리코겐, 셀룰로오스, 키틴, 아가로오스, 카라기난, 헤파린, 히알루론산, 자일로글루칸, 글루코만난산 등을 들 수 있다.
실시예
이하에, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명을 설명하지만 본 발명은 이하의 실시예에 한정 해석될 일은 없다. 또한, 얻어진 합성 수지에 있어서의, 아민 구조를 갖는 구성 단위의 함유량(몰％), 이민 구조를 갖는 구성 단위의 함유량(몰％), 아미드 구조를 갖는 구성 단위의 함유량(몰), 아세탈화도(몰％), 아세틸기량(몰％), 수산기량(몰％)은 합성 수지를 DMSO-d6(디메틸술폭시드)에 용해하고, 1H-NMR(핵자기 공명 스펙트럼)을 사용하여 측정하였다.
[실시예 1]
(폴리비닐부티랄의 조제)
교반 장치를 구비한 반응기에, 이온 교환수 2700mL, 상기 식 (3)에 표시되는 아미노기를 갖는 구성 단위를 2몰％ 함유하는 폴리비닐알코올(평균 중합도 250, 비누화도 97몰％)을 300g 투입하고, 교반하면서 가열 용해하여, 용액을 얻었다. 이어서, 이 용액에 촉매로서 35질량％ 염산을, 염산 농도가 0.2질량％로 되도록 첨가하고, 온도를 15℃로 조정한 후, 교반하면서 n-부틸알데히드(n-BA) 22g을 첨가하였다. 그 후, n-부틸알데히드(n-BA) 148g을 첨가한 바, 백색 입자상의 폴리비닐부티랄이 석출되었다. 석출되고 나서 15분 후에, 35질량％ 염산을, 염산 농도가 1.8질량％로 되도록 첨가하고, 550℃로 가열한 후, 50℃에서 2시간 숙성시켰다. 이어서, 용액을 냉각하고, 중화한 후, 폴리비닐부티랄을 수세하고, 건조시킴으로써, 폴리비닐부티랄을 얻었다.
얻어진 폴리비닐부티랄은, 평균 중합도 250, 수산기량 20몰％, 아세틸기량 1몰％, 아세탈화도 77몰％였다.
얻어진 수지의 원소 조성을 X선 광전자 분광법(장치: 알백 파이사제, 다기능 주사형 X선 광전자 분광 분석 장치(XPS), PHI 5000 VersaProbe III)에 의해 분석하고, 검출된 전체 원소의 총량을 100％로 하고, 전체 원소 중에 있어서의 질소의 점유율(％)을 질소 함유량으로 하였다.
(세포 배양용 용기의 조제)
얻어진 폴리비닐부티랄 1g을 부탄올 19g에 용해시킴으로써, 폴리비닐부티랄 용액을 얻었다. 얻어진 폴리비닐부티랄 용액 150μL를 φ22㎜의 커버 유리(마쓰나미사제, 22 환 No.1을 에어 더스터로 제진하여 사용) 상에 토출하고, 스핀 코터를 사용하여 2000rpm, 20초 회전시켜서 평활한 수지막을 얻었다. 얻어진 상기 수지막을 커버 유리마다 φ22㎜의 폴리스티렌 디쉬에 배치함으로써 세포 배양용 용기를 얻었다.
이하의 조건에 있어서 수지막을 구비하는 세포 배양용 용기에 대하여 시험을 행하였다.
(세포 배양 시험의 방법)
얻어진 세포 배양용 용기에 인산 완충 생리 식염수 1mL를 첨가하고 37℃의 인큐베이터 내에서 1시간 정치하였다. 디쉬 내의 인산 완충 생리 식염수를 제거한 후, h-iPS 세포 253G1을 1.5×104을 파종하고, 배지 TeSR E8(STEM CELL사제) 1mL 및 ROCK-Inhibitor(Y27632) 10μM 존재 하, 37℃, CO2 농도 5％의 인큐베이터 내에서 배양을 행하였다. 24시간마다 배지를 750μL 제거하고, 새로운 TeSR E8 250μL를 첨가하고, ROCK-Inhibitor(Y27632) 10μM로 조정함으로써 배지 교환을 행하였다.
(세포 덩어리 배양 시험의 방법)
얻어진 세포 배양용 용기에 인산 완충 생리 식염수 1mL를 첨가하고 37℃의 인큐베이터 내에서 1시간 정치 후, 배양 용기 내의 인산 완충 생리 식염수를 제거하였다. 35㎜ 디쉬에 콘플루언트 상태로 된 h-iPS 세포 252G1의 콜로니를 첨가하고, 다음으로 1mL의 0.5mM 에틸렌디아민/인산 완충 용액을 첨가하고, 실온에서 2분 정치하였다. 그 후, 에틸렌디아민/인산 완충 용액을 제거하고, 1mL의 TeSRE8 배지에서 피펫팅에 의해 50 내지 200㎛로 바수어진 세포 덩어리를 1.0×105를 배양 용기에 파종하고, 배지 TeSR E8(STEM CELL사제) 1mL 및 ROCK-Inhibitor(Y27632) 10μM 존재 하, 37℃, CO2 농도 5％의 인큐베이터 내에서 배양을 행하였다. 24시간마다 배지를 750μL 제거하고, 새로운 TeSR E8을 250μL 가함으로써 배지 교환을 행하였다.
(배양 평가의 방법)
(1) 초기 접착성
세포 배양 시험에 있어서, 세포 파종 후 24시간 후의 세포상을 위상차 현미경 10×10배의 위상차 현미경(올림푸스사제, IX73)을 사용하여 취득하였다. 그 때, 배양 용기 내의 가장 평균적인 접착 형태를 나타내는 시야의 화상 취득을 행하였다. 얻어진 화상을 도 3의 견본 1 내지 견본 10과 대조하고, 접착 세포수와 접착 세포 형태를 가미하여 초기 접착성의 평가를 행하였다. 또한, 도 3에 있어서, 견본 1로부터 견본 8로 향할수록 세포가 증가하고 있는 것이 나타나 있다. 또한 견본 8로부터 견본 10으로 향할수록, 세포의 위족이 신장하여, 보다 양호한 접착 상태에 있는 것이 나타나 있다. 얻어진 실시예 및 비교예의 결과를 도 4a, 도 4b에 정리하여 나타낸다.
(2) 세포 증식성
세포 배양 시험에 있어서, 세포 파종 후 5일 경과 후의 세포상을 위상차 현미경 10×4배의 위상차 현미경(올림푸스사제, IX73)을 사용하여 취득하였다. 그 때, 배양 용기 내의 가장 평균적인 접착 형태를 나타내는 시야의 화상 취득을 행하였다. 얻어진 화상을 도 5의 견본 1 내지 견본 10과 대조함으로써 세포 증식성의 평가를 행하였다. 도 5에 있어서, 세포 증식에 의해 콜로니가 성장할수록 고평가로 하였다. 또한, 콜로니는 가로 방향(화면의 종횡 방향)으로 너무 성장하면 세로 방향(화면의 전방측 방향)에 겹쳐지기 시작하기 때문에, 광의 투과성이 낮아지는 경향이 있다. 얻어진 실시예 및 비교예의 결과를 도 6a, 도 6b에 정리하여 나타낸다.
(3) 접착 유지성
세포 덩어리 배양 시험에 있어서, 세포 덩어리의 접착 유지 가능 시간을 이하의 기준에 따라서 평가하였다.
0: 배지 교환 후 30분 미만에 모든 세포가 박리되었다.
1: 배지 교환 후 30분 이상 접착 유지했지만, 1시간 미만에 모든 세포가 박리되었다.
2: 배지 교환 후 1시간 이상 접착 유지했지만, 24시간 미만에 모든 세포가 박리되었다.
3: 배지 교환 후 24시간 이상 접착 유지하였다.
얻어진 세포 덩어리는 알칼리 포스파타아제(ALP) 염색 시험에 의해 미분화성이 유지되어 있음을 확인하였다.
[실시예 2]
상기 식 (3)에 표시되는 아미노기를 갖는 구성 단위를 2몰％ 함유하는 폴리비닐알코올(평균 중합도 250, 비누화도 97몰％) 대신에, 평균 중합도 1600, 비누화도 97몰％, 상기 식 (3)에 표시되는 아미노기를 갖는 구성 단위를 2몰％ 함유하는 폴리비닐알코올을 사용한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 하여 시험을 행하였다.
[실시예 3]
상기 식 (3)에 표시되는 아미노기를 갖는 구성 단위를 2몰％ 함유하는 폴리비닐알코올(평균 중합도 250, 비누화도 97몰％) 대신에, 평균 중합도 250, 비누화도 97몰％의 폴리비닐알코올을 사용하는 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여 폴리비닐아세탈을 얻었다. 얻어진 중합도 약 250의 폴리비닐아세탈 100중량부, 및 N-비닐피롤리돈 1중량부를 500중량부의 테트라히드로푸란에 용해시켜서 수지 용액을 얻었다. 얻어진 수지 용액에 Irgacure184(BASF사제) 0.05중량부를 용해시켜, PET 필름 상에 도포하였다. 도포물을 25℃에서 아이 그래픽스사제, UV 컨베이어 장치 「ECS301G1」을 사용하여, 365㎚의 파장의 광을 적산 광량 2000mJ/㎠로 조사함으로써 복합 수지 용액을 얻었다. 얻어진 복합 수지 용액을 80℃, 3시간 진공 건조시킴으로써 복합 수지를 얻었다. 얻어진 수지에 대해서, 칼럼으로서 Waters사제 「2690 Separations Model」을 사용하여, GPC법에 의해 폴리스티렌 환산에 의한 중량 평균 분자량을 측정한 바, 약 4만이었다. 얻어진 복합 수지를 3중량％ 부탄올 용액으로 조정하고, 실시예 1과 마찬가지로 하여 시험을 행하였다.
[실시예 4]
폴리비닐아세탈 100중량부에 대하여 N-비닐피롤리돈 10중량부를 첨가한 것 이외에는, 실시예 3과 마찬가지로 하여 시험을 행하였다. 얻어진 수지의 중량 평균 분자량은 약 6만이었다.
[실시예 5]
폴리비닐아세탈 100중량부에 대하여 N-비닐피롤리돈 30중량부를 첨가한 것 이외에는, 실시예 3과 마찬가지로 하여 시험을 행하였다. 얻어진 수지의 중량 평균 분자량은 약 5만이었다.
[실시예 6]
폴리비닐아세탈 100중량부에 대하여 N-이소프로필아크릴아미드 2중량부를 첨가한 것 이외에는, 실시예 3과 마찬가지로 하여 시험을 행하였다. 얻어진 수지의 중량 평균 분자량은 약 6만이었다.
[실시예 7]
폴리비닐아세탈 100중량부에 대하여 폴리아미드 2중량부를 첨가한 것 이외에는, 실시예 3과 마찬가지로 하여 시험을 행하였다. 얻어진 수지의 중량 평균 분자량은 약 6만이었다.
[실시예 8]
폴리비닐아세탈 100중량부에 대하여 폴리-L-라이신 2중량부를 첨가한 것 이외에는, 실시예 3과 마찬가지로 하여 시험을 행하였다. 얻어진 수지의 중량 평균 분자량은 약 5만이었다.
[실시예 9]
N-비닐피롤리돈 5중량부, 및 부틸메타크릴레이트 15중량부, 에틸아크릴레이트 30중량부, 메틸메타크릴레이트 50중량부를 테트라히드로푸란 300중량부에 용해시켜서 아크릴 모노머 용액을 얻었다. 얻어진 아크릴 모노머 용액에 Irgacure184(BASF사제) 2중량부를 용해시켜, PET 필름 상에 도포하였다. 도포물을 25℃에서 아이 그래픽스사제, UV 컨베이어 장치 「ECS301G1」을 사용하여, 365㎚의 파장의 광을 적산 광량 2000mJ/㎠로 조사함으로써 아크릴 수지 용액을 얻었다. 얻어진 아크릴 수지 용액을 80℃, 3시간 진공 건조시킴으로써 아크릴 수지를 얻었다. 얻어진 아크릴 수지를 3중량％ 부탄올 용액으로 조정하고, 실시예 1과 마찬가지로 하여 시험을 행하였다. 얻어진 수지의 중량 평균 분자량은 약 9만이었다.
[비교예 1]
스캐폴드재 수지를 사용하지 않고, 폴리스티렌 디쉬만으로 실시예 1과 마찬가지로 시험을 행하였다.
[비교예 2]
n-부틸알데히드의 첨가량을 실시예 1의 22g, 및 148g 대신에 22g, 및 88g로 한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여 시험을 행하였다.
[비교예 3]
합성 수지로서 평균 중합도 1000, 비누화도 98몰％의 폴리비닐알코올을 사용한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 하여 시험을 행하였다.
[비교예 4]
N-이소프로필아크릴아미드 100중량부, 아세트산에틸 75중량부, 아조비스이소부티로니트릴 0.5중량부를 혼합하고, 질소 분위기 하에서, 65℃에서 8시간 중합을 행함으로써 폴리아크릴아미드 수지를 얻었다. 얻어진 수지에 대해서, 칼럼으로서 Waters사제 「2690 Separations Model」을 사용하여, GPC법에 의해 폴리스티렌 환산에 의한 중량 평균 분자량을 측정한 바, 약 9만(중합도 약 800)이었다. 합성 수지로서, 얻어진 폴리아크릴아미드 수지를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여 시험을 행하였다.
[비교예 5]
N-이소프로필아크릴아미드 100중량부 대신에 에틸아크릴레이트 100중량부를 사용한 것 이외에는 비교예 4와 마찬가지로 하여 시험을 행하였다. 얻어진 수지의 중량 평균 분자량은 약 6만이었다.
[비교예 6]
N-이소프로필아크릴아미드 100중량부 대신에 부틸메타크릴레이트 100중량부를 사용한 것 이외에는 비교예 4와 마찬가지로 하여 시험을 행하였다. 얻어진 수지의 중량 평균 분자량은 약 8만이었다.
[비교예 7]
폴리비닐아세탈 30중량부에 대하여 N-비닐피롤리돈 70중량부를 첨가한 것 이외에는, 실시예 3과 마찬가지로 하여 시험을 행하였다. 얻어진 수지의 중량 평균 분자량은 약 9만이었다.
얻어진 결과를 정리하여 표 1에 나타내었다. 또한, 어느 실시예 및 비교예에 있어서든 분화된 세포는 관찰되지 않았다.
Figure pct00005

Claims (11)

  1. 합성 수지를 함유하는 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료로서,
    상기 합성 수지의 질소 함유량이 0.1질량％ 이상 10질량％ 이하인, 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료.
  2. 제1항에 있어서, 상기 합성 수지가, 브뢴스테드 염기성기를 1몰％ 이상 50몰％ 이하 포함하는, 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료.
  3. 제2항에 있어서, 상기 브뢴스테드 염기성기가 아민계 염기성기인, 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 합성 수지가, 아민 구조를 갖는 구성 단위, 이민 구조를 갖는 구성 단위 및 아미드 구조를 갖는 구성 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 구비하는, 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료.
  5. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 수지가 아미드 구조를 갖는 구성 단위를 구비하는, 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료.
  6. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 수지가 이민 구조를 갖는 구성 단위 및 아민 구조를 갖는 구성 단위의 양쪽을 구비하는, 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 다능성 줄기 세포인, 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료를 구비하는, 줄기 세포 배양용 용기.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료와,
    다당류를 함유하는, 줄기 세포 배양용 담체.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료를 구비하는, 줄기 세포 배양용 섬유.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 줄기 세포 배양용 스캐폴드 재료를 사용하는, 줄기 세포의 배양 방법.
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