TW201930588A - 幹細胞培養用支架材料及使用其之幹細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

本發明係一種幹細胞培養用支架材料，其包含合成樹脂，且100℃儲存彈性模數為1.0×10⁴Pa以上且1.0×10⁸Pa以下，25℃儲存彈性模數與100℃儲存彈性模數之比（（25℃之儲存彈性模數）／（100℃之儲存彈性模數））為1.0×10¹以上且1.0×10⁵以下。該幹細胞培養用支架材料具備適度之親水性及強度，幹細胞之接種後之固定性高，可高效率地進行細胞增殖，抗損傷性優異。

Description

幹細胞培養用支架材料及使用其之幹細胞培養方法

本發明係關於一種幹細胞培養用支架材料及使用其之幹細胞培養方法。

幹細胞被期待對藥物開發或再生醫療之應用。幹細胞係具有自我複製能力及分化能力之細胞，有可分化為所有細胞種之多潛能幹細胞、以及可僅分化為同系列之身體組織之構成細胞種之組織幹細胞及組織前驅細胞。多潛能幹細胞例如可列舉人類胚胎幹細胞（hESC）或人類人工多潛能幹細胞（hiPSC）等人類多潛能幹細胞（hPSC）等。安全且再現性佳地培養幹細胞並使之增殖，係於醫療應用該等細胞之方面成為必需之基礎技術。尤其於再生醫療之產業利用上，必須於未分化狀態下大量處理幹細胞。因此，對「使用天然及合成之高分子或餵養細胞進行幹細胞之增殖，並且維持多潛能性能（或多分化能力）」之技術進行廣泛之研究。尤其已知，若使用層連結蛋白、玻連蛋白等接著蛋白質或源自小鼠肉瘤之基質膠作為天然高分子，則接種後之細胞固定性非常高。

但是，列舉如下情況作為課題：天然高分子由於生產性非常低，故而較為昂貴；由於為源自天然之物質，故而於批次間可見偏差；有由源自動物之成分所引起之安全性上之顧慮。

為了解決上述課題，提出有一種使用合成樹脂之幹細胞培養樹脂載體。例如於專利文獻1之實施例之欄中，於小鼠纖維母細胞之培養中，為了提供親水性且耐水性優異之支架材料，揭示有一種縮醛化度為20~60莫耳%之聚乙烯縮醛化合物。於專利文獻2之實施例之欄中，於小鼠ES細胞之培養中，揭示有一種由丙烯酸聚合物所構成之水凝膠。於專利文獻3之實施例之欄，於小鼠iPS細胞之培養中，揭示有一種親水性且柔軟之聚輪烷凝膠。
[先前技術文獻]
[專利文獻]

[專利文獻1]日本特開2006－314285號公報
[專利文獻2]日本特開2010－158180號公報
[專利文獻3]日本特開2017－23008號公報

[發明所欲解決之課題]

然而，於專利文獻1中有「由於親水性高故而於培養基中膨潤，支架材料樹脂剝離」之問題。又，有「幹細胞或多潛能幹細胞之接種後之固定性低，未充分地增殖」之問題。於專利文獻2中，使用2－丙烯醯胺－2－甲基丙磺酸鈉鹽及對苯乙烯磺酸鈉、N,N'－二甲基丙烯醯胺，有「由於親水性高故而於培養基中膨潤，支架材料樹脂剝離」之問題。於專利文獻3中有「由於親水性高故而於培養基中膨潤，支架材料樹脂剝離」之問題。由於為柔軟之支架材料，故而有促進分化成心肌細胞之問題。
進而，列舉如下情況作為課題：於在培養容器內接種幹細胞之接種步驟中，因移液管前端與培養容器底面接觸而塗膜剝離，產生試驗批次間之偏差。

根據以上內容，謀求一種具備適度之親水性及強度之幹細胞培養用支架材料及使用其之幹細胞培養方法。
本發明之目的在於提供一種具備適度之親水性及強度，幹細胞之接種後之固定性較高，可高效率地進行細胞增殖，抗損傷性優異之幹細胞培養用支架材料及使用其之幹細胞培養方法。
[解決課題之技術手段]

本發明係關於以下之內容。
（1）一種幹細胞培養用支架材料，其含有合成樹脂，且100℃儲存彈性模數為1.0×10⁴ Pa以上且1.0×10⁸ Pa以下，25℃儲存彈性模數與100℃儲存彈性模數之比（（25℃之儲存彈性模數）／（100℃之儲存彈性模數））為1.0×10¹ 以上且1.0×10⁵ 以下。
（2）如（1）記載之幹細胞培養用支架材料，其中，上述合成樹脂為聚乙烯縮醛樹脂。
（3）如（1）或（2）記載之幹細胞培養用支架材料，其中，上述幹細胞為多潛能幹細胞。
（4）一種幹細胞培養用容器，其具備（1）至（3）中任一項記載之幹細胞培養用支架材料。
[發明之效果]

根據本發明，提供一種具備適度之親水性及強度，幹細胞之接種後之固定性高之幹細胞培養用支架材料及使用其之幹細胞培養方法。

以下，列舉實施形態進行本發明之說明，但本發明並不限定於以下之實施形態。

[幹細胞培養用支架材料]
本發明人等為了解決上述課題，自合成樹脂之物性方面之觀點進行努力研究，結果發現藉由使用具備特定之儲存彈性模數之合成樹脂，可解決上述課題，從而完成了本發明。即，本發明關於一種幹細胞培養用支架材料，其含有合成樹脂，且100℃儲存彈性模數為1.0×10⁴ Pa以上且1.0×10⁸ Pa以下，25℃儲存彈性模數與100℃儲存彈性模數之比（（25℃之儲存彈性模數）／（100℃之儲存彈性模數））為1.0×10¹ 以上且1.0×10⁵ 以下。
該幹細胞培養用支架材料由於具備適度之親水性及強度，故而幹細胞之接種後之固定性提昇。尤其於不含餵養細胞或接著蛋白質之無血清培養基培養中，幹細胞接種後之初期固定率提昇。

就使幹細胞更佳地接著之觀點而言，上述樹脂膜之100℃儲存彈性模數更佳為1.0×10⁵ Pa以上且1.0×10⁷ Pa以下，進而較佳為2.0×10⁵ Pa以上且8.0×10⁶ Pa以下，進而更佳為3.0×10⁵ Pa以上且5.0×10⁶ Pa以下。
就使幹細胞更佳地接著之觀點而言，上述樹脂膜之25℃儲存彈性模數較佳為1.0×10⁸ Pa以上且1.0×10¹⁰ Pa以下，更佳為3.0×10⁸ Pa以上且8.0×10⁹ Pa以下，更佳為5.0×10⁸ Pa以上且5.0×10⁹ Pa以下。
關於上述樹脂膜之25℃儲存彈性模數與100℃儲存彈性模數之比，較佳為1.0×10¹ 以上且1.0×10⁵ 以下，更佳為1.0×10² 以上且1.0×10⁴ 以下。若25℃儲存彈性模數及100℃儲存彈性模數值之值、25℃儲存彈性模數與100℃儲存彈性模數之比為上述範圍，則於接種步驟中，不會因移液管前端而損傷培養容器底面，可於37℃之培養條件下進行彈性模數變化，使幹細胞較佳地接著。
就使幹細胞較佳地接著之觀點而言，上述樹脂膜之玻璃轉移點較佳為－30℃以上且95℃以下，更佳為0℃以上且90℃以下，進而較佳為20℃以上且90℃以下。
再者，儲存彈性模數及玻璃轉移點可藉由以下之方法進行測定。具體而言，
1.利用熱壓機將試樣重疊，藉此獲得厚度500 μm之片材。
2.針對所獲得之片材，藉由動態黏彈性測定裝置（IT Meter. and Control公司製造，DVA－200），於拉伸條件下，以頻率10 Hz，以升溫速度5℃／分鐘於－150℃至150℃之溫度範圍內進行測定。根據所獲得之拉伸儲存彈性模數之圖表求出25℃及100℃之儲存彈性模數，算出25℃儲存彈性模數／100℃儲存彈性模數。
3.根據藉由儲存彈性模數測定所獲得之圖表求出損耗正切之峰值溫度，設為玻璃轉移溫度Tg。

關於100℃及25℃之儲存彈性模數，例如可藉由在主鏈及側鏈中導入剛性之官能基或結晶性高之官能基而降低高分子鏈之運動性，藉此提昇儲存彈性模數。
另一方面，可藉由在主鏈及側鏈中導入柔軟之官能基或結晶性低之官能基而降低高分子鏈之運動性，藉此降低儲存彈性模數。

幹細胞培養用支架材料只要滿足上述要件，則成分並無特別限制，較佳為含有合成樹脂。
合成樹脂係指以使聚合性單體（以下，亦簡稱為「單體」）進行聚合（亦包含縮聚）所獲得之聚合物（以下，亦簡稱為「聚合物」）作為主成分者。上述聚合物亦包含一種或兩種以上之聚合性單體之共聚物。

作為上述聚合物，例如可列舉由選自由如下化合物所組成之群中之一種以上之聚合性單體所構成之聚合物：（不）飽和烴、芳香族烴、（不）飽和脂肪酸、芳香族羧酸、（不）飽和酮、芳香族酮、（不）飽和醇、芳香族醇、（不）飽和胺、芳香族胺、（不）飽和硫醇、芳香族硫醇及有機矽化合物。
作為具體之上述聚合物，例如可列舉：聚烯烴、聚醚、聚乙烯醇、聚乙烯縮醛、聚酯、聚(甲基)丙烯酸酯、環氧樹脂、聚醯胺、聚醯亞胺、聚胺酯（polyurethane）、聚碳酸酯、纖維素及多肽等。於該等中，就幹細胞之固定性之觀點而言，較佳為聚(甲基)丙烯酸酯及聚乙烯縮醛，更佳為聚乙烯縮醛。
再者，該等聚合物可使用一種，亦可將兩種以上組合而使用。於組合兩種以上之聚合物之情形時，可將兩種以上之聚合物混合使用，亦可以使兩種以上之聚合物之骨架進行化學鍵結而成之聚合物的形式使用，又，共聚物結構亦可為接枝共聚物及嵌段共聚物以及其組合。因此，於組合多種聚合物作為合成樹脂之情形時，較佳為組合聚(甲基)丙烯酸酯與聚乙烯縮醛。

本說明書中之聚(甲基)丙烯酸酯係藉由使作為單體之(甲基)丙烯酸酯進行聚合所獲得之聚合物，但亦包含使(甲基)丙烯酸酯以外之單體進行共聚合而成者。
作為上述(甲基)丙烯酸酯，並無特別限定，較佳為含有選自由(甲基)丙烯酸烷基酯、(甲基)丙烯酸環狀烷基酯、(甲基)丙烯酸芳酯、(甲基)丙烯醯胺類、聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯類及(甲基)丙烯酸磷酸膽生僉所組成之群中之至少1種。

作為上述(甲基)丙烯酸烷基酯，例如可列舉：(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸正丙酯、(甲基)丙烯酸異丙酯、(甲基)丙烯酸正丁酯、(甲基)丙烯酸異丁酯、(甲基)丙烯酸第三丁酯、(甲基)丙烯酸正辛酯、(甲基)丙烯酸異辛酯、(甲基)丙烯酸2－乙基己酯、(甲基)丙烯酸壬酯、(甲基)丙烯酸異壬酯、(甲基)丙烯酸癸酯、(甲基)丙烯酸異癸酯、(甲基)丙烯酸月桂酯、(甲基)丙烯酸硬脂酯及(甲基)丙烯酸異十四烷基酯等。
再者，該等(甲基)丙烯酸烷基酯並無特別限制，氫原子可經碳原子數1~3之烷氧基、四氫糠基等各種取代基取代。作為氫原子經上述取代基取代之(甲基)丙烯酸烷基酯，例如可列舉：丙烯酸甲氧基乙酯及丙烯酸四氫糠酯等。
作為上述(甲基)丙烯酸環狀烷基酯，例如可列舉：(甲基)丙烯酸環己酯、(甲基)丙烯酸異莰酯等。
作為上述(甲基)丙烯酸芳酯，例如可列舉：(甲基)丙烯酸苯酯、(甲基)丙烯酸苄酯等。
作為上述丙烯醯胺類，例如可列舉：(甲基)丙烯醯胺、N－異丙基(甲基)丙烯醯胺、N－第三丁基(甲基)丙烯醯胺、N,N'－二甲基(甲基)丙烯醯胺、(3－(甲基)丙烯醯胺丙基)三甲基氯化銨、4－(甲基)丙烯醯口末啉、3－(甲基)丙烯醯基－2－口咢唑啶酮、N－[3－(二甲基胺基)丙基](甲基)丙烯醯胺、N－(2－羥基乙基)(甲基)丙烯醯胺、N－羥甲基(甲基)丙烯醯胺、6－(甲基)丙烯醯胺己酸等。
作為上述聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯類，例如可列舉：甲氧基－聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯、乙氧基－聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯、羥基－聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯、甲氧基－二乙二醇(甲基)丙烯酸酯、乙氧基－二乙二醇(甲基)丙烯酸酯、羥基－二乙二醇(甲基)丙烯酸酯、甲氧基－三乙二醇(甲基)丙烯酸酯、乙氧基－三乙二醇(甲基)丙烯酸酯、羥基－三乙二醇(甲基)丙烯酸酯等。
作為上述(甲基)丙烯酸磷酸膽生僉，例如可列舉2－(甲基)丙烯醯氧基乙基磷酸膽生僉。
作為(甲基)丙烯酸酯以外之單體，並無特別限定，可列舉：(甲基)丙烯酸、乙烯、乙烯酯等。
上述(甲基)丙烯酸酯可單獨使用，亦可併用2種以上。再者，於本說明書中，上述(甲基)丙烯酸係將丙烯酸及甲基丙烯酸總稱者，上述(甲基)丙烯酸酯採用將丙烯酸酯及甲基丙烯酸酯總稱者。
於合成樹脂中，較佳為使用聚乙烯縮醛樹脂。以下，對聚乙烯縮醛樹脂進行說明。

（聚乙烯縮醛樹脂）
聚乙烯縮醛樹脂係藉由利用醛對聚乙烯醇進行縮醛化所合成之樹脂，側鏈具有乙醯基、羥基及縮醛基。

作為上述縮醛化中所使用之醛，可列舉具有碳數1~10之鏈狀脂肪族基、環狀脂肪族基或芳香族基之醛。作為該等醛，可使用以往公知之醛。
上述醛之種類並無特別限定，可列舉：甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛、丙烯醛、苯甲醛、桂皮醛、紫蘇醛、甲醯基吡啶、甲醯基咪唑、甲醯基吡咯、甲醯基哌啶、甲醯基哌啶、甲醯基三唑、甲醯基四唑、甲醯基吲哚、甲醯基異吲哚、甲醯基嘌呤、甲醯基嘌呤、甲醯基苯并咪唑、甲醯基苯并三唑、甲醯基喹啉、甲醯基異喹啉、甲醯基喹口咢啉、甲醯基口辛啉、甲醯基喋啶、甲醯基呋喃、甲醯基氧雜環戊烷、甲醯基口咢烷、甲醯基噻吩、甲醯基硫雜環戊烷、甲醯基噻烷、甲醯基腺嘌呤、甲醯基鳥嘌呤、甲醯基胞嘧啶、甲醯基胸腺嘧啶、甲醯基尿嘧啶等。上述醛可為鏈狀，亦可為環狀。

上述醛較佳為甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、戊醛，進而較佳為丁醛。

上述聚乙烯醇亦可為與乙烯基化合物之共聚物。作為乙烯基化合物，可列舉：乙烯、烯丙胺、乙烯吡咯啶酮、順丁烯二酸酐、順丁烯二醯亞胺、伊康酸、(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酸酯等。

聚乙烯縮醛樹脂較佳為於其一部分具有布忍斯特鹼性基或布忍斯特酸性基。其原因在於：在聚乙烯縮醛樹脂之一部分經布忍斯特鹼性基或布忍斯特酸性基改質之情形時，於不含餵養細胞或接著蛋白質之無血清培養基培養中，幹細胞接種後之初期固定率提昇，容易進行幹細胞之培養。

上述布忍斯特鹼性基係可自其他物質接受氫離子H⁺ 之官能基之總稱。作為此種官能基，例如可列舉：胺基、亞胺基、醯胺基、醯亞胺基。
因此，作為此種聚乙烯縮醛樹脂，較佳為骨架中包含選自由具有胺結構之結構單元、具有亞胺結構之結構單元及具有醯胺結構之結構單元所組成之群中之至少一種的聚乙烯縮醛樹脂。

上述布忍斯特酸性基係可將氫離子H⁺ 轉移至其他物質之物質之總稱。
作為布忍斯特酸性基，可列舉：羧基、磺酸基、順丁烯二酸基、亞磺酸基、次磺酸基、磷酸基、膦酸基及該等之鹽等。其中，較佳為羧基。
作為藉由上述布忍斯特酸性基將上述聚乙烯縮醛樹脂改質之方法，並無特別限定，可藉由與上述伊康酸或(甲基)丙烯酸之共聚合或接枝而獲得。

於本發明中，上述亞胺結構係指具有C=N鍵之結構。上述改質聚乙烯縮醛樹脂較佳為側鏈中具有亞胺結構。又，上述亞胺結構可與構成改質聚乙烯縮醛樹脂之主鏈之碳直接鍵結，亦可經由伸烷基等連結基鍵結。再者，所謂側鏈中具有上述亞胺結構，包括於改質聚乙烯縮醛樹脂之接枝鏈中具有上述亞胺結構。作為具有上述亞胺結構之結構單元，例如可列舉下述式（1）所示之結構單元。

式（1）中，R¹ 表示單鍵或伸烷基，R² 表示具有亞胺結構之基。

上述式（1）中，於R¹ 為伸烷基之情形時，該伸烷基之碳數之較佳之下限為1，較佳之上限為12。若上述伸烷基之碳數超過12，則有無法獲得最佳強度之情況。於上述R¹ 為伸烷基之情形時，上述伸烷基之碳數之更佳之上限為5。

上述式（1）中，於R¹ 為伸烷基之情形時，作為該伸烷基，例如可列舉：亞甲基、伸乙基、三亞甲基、四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、八亞甲基、十亞甲基等直鏈狀伸烷基；甲基亞甲基、甲基伸乙基、1－甲基伸戊基、1,4－二甲基伸丁基等支鏈狀伸烷基；伸環丙基、伸環丁基、伸環己基等環狀伸烷基等。其中，較佳為亞甲基、伸乙基、三亞甲基、四亞甲基等直鏈狀烷基，更佳為亞甲基、伸乙基。

作為上述R² ，可列舉下述式（2）所示之官能基。

式（2）中，R³ 表示氫原子或碳數1~18之烴基，R⁴ 表示碳數1~18之烴基。

作為上述烴基，可列舉飽和烴基、不飽和烴基、芳香族系烴基等。再者，上述烴基可為僅由飽和烴基、不飽和烴基、芳香族系烴基所構成者，亦可為使用2種以上之烴基者。

作為上述飽和烴基，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、己基、庚基、2－乙基己基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十八烷基等。其中，較佳為甲基、乙基、正丙基、正丁基。
作為上述芳香族系烴基，例如可列舉：苯基、甲苯甲醯基、二甲苯基、第三丁基苯基、苄基等。

較佳為於上述改質聚乙烯縮醛樹脂中，於具有上述亞胺結構之結構單元中，R¹ 為單鍵，R³ 為氫原子、甲基或乙基，R⁴ 為甲基或乙基。

上述改質聚乙烯縮醛樹脂係具有亞胺結構之結構單元之含量之較佳之下限為0.1莫耳%，較佳之上限為20.0莫耳%。若具有上述亞胺結構之結構單元之含量為0.1莫耳%以上，則成為經時黏度穩定性良好者。若具有上述亞胺結構之結構單元之含量為20.0莫耳%以下，則可充分地進行縮醛化。具有上述亞胺結構之結構單元之含量之更佳之下限為1.0莫耳%，更佳之上限為15.0莫耳%。

於上述改質聚乙烯縮醛樹脂中，具有亞胺結構之結構單元之含量與下述縮醛化度之比率（具有亞胺結構之結構單元之含量／縮醛化度）較佳為0.001~0.5。藉由設為上述範圍內，可同時實現較高之強度及優異之接著性，提昇接著後之耐久性。

上述改質聚乙烯縮醛樹脂較佳為含有具有亞胺基（=NH）結構之結構單元。
上述改質聚乙烯縮醛樹脂較佳為側鏈中具有上述亞胺基。又，上述亞胺基可與構成改質聚乙烯縮醛樹脂之主鏈之碳直接鍵結，亦可經由伸烷基等連結基鍵結。

上述改質聚乙烯縮醛樹脂較佳為含有具有胺基或醯胺結構之結構單元。
上述改質聚乙烯縮醛樹脂較佳為側鏈中具有上述胺基或醯胺結構。又，上述胺基或醯胺結構可與構成改質聚乙烯縮醛樹脂之主鏈之碳直接鍵結，亦可經由伸烷基等連結基鍵結。進而，上述胺基可為一級胺，可為二級胺，可為三級胺，亦可為四級胺。於該等中，就細胞固定性之觀點而言，較佳為一級胺。
再者，側鏈中具有上述胺基或醯胺結構意指於改質聚乙烯縮醛樹脂之接枝鏈具有上述胺基或醯胺結構。
尤佳為上述胺基為－NH₂ 。再者，於本發明中，所謂醯胺結構係指具有－C(=O)－NH－之結構。其中，具有上述胺基之結構單元較佳為下述式（3）所示之結構。又，具有上述醯胺結構之結構單元較佳為下述式（4）所示之結構。

式（4）中，R⁵ 表示氫原子或碳數1~10之烴基。再者，作為上述烴基，可列舉：烷基、烯基、環烷基、環烯基。

具有上述胺基或醯胺結構之結構單元之含量之較佳之下限為0.1莫耳%，較佳之上限為20莫耳%。若具有上述胺基或醯胺結構之結構單元之含量為0.1莫耳%以上，則可使加成特性充分。若上述含量為20莫耳%以下，則溶解性不會過度上升，容易藉由沈澱法取出改質聚乙烯縮醛樹脂粉末。上述含量之更佳之下限為0.5莫耳%，更佳之上限為10莫耳%。再者，具有上述胺基或醯胺結構之結構單元之含量可藉由NMR等進行測定。又，具有上述胺基或醯胺結構之結構單元與具有亞胺結構之結構單元之合計含量的較佳之下限為0.1莫耳%，較佳之上限為20莫耳%。上述含量之更佳之下限為0.5莫耳%，更佳之上限為10莫耳%。

較佳為於上述改質聚乙烯縮醛樹脂中，具有亞胺結構之結構單元與具有胺基或醯胺結構之結構單元之含量的比率（具有亞胺結構之結構單元／具有胺基或醯胺結構之結構單元）為0.5／99.5~99.5／0.5。若上述比率為0.5／99.5以上，則可使經時黏度穩定性充分，若上述比率為99.5／0.5以下，則就固定性之觀點而言，可充分地發揮交聯性能。上述比率之更佳之下限為5／95，更佳之上限為75／25。

上述改質聚乙烯縮醛樹脂之縮醛化度並無特別限定，較佳之下限為60莫耳%，較佳之上限為90莫耳%。若縮醛化度為60莫耳%以上，則幹細胞之固定性優異，可高效率地進行細胞增殖。又，若縮醛化度為90莫耳%以下，則可使對溶劑之溶解性良好。更佳為高於60莫耳%，進而較佳為65莫耳%以上，且更佳為85莫耳%以下，進而較佳為80莫耳%以下。上述改質聚乙烯縮醛樹脂之縮醛度可藉由NMR等進行測定。

上述改質聚乙烯縮醛樹脂之乙醯基量並無特別限定，較佳之下限為0.0001莫耳%，較佳之上限為5莫耳%。

就剛接種後之細胞接著性之觀點而言，較佳為於聚乙烯縮醛樹脂之骨架中包含0.1~30莫耳%之選自由具有胺結構之結構單元、具有亞胺基之結構單元、及具有醯胺結構之結構單元所組成之群中之至少一種官能基。更佳為包含1~10莫耳%。
此處，進行本說明書中所使用之用語之說明。
「幹細胞」係指具有自我複製能力及分化能力之細胞。將幹細胞中具有自我複製能力，且可自1個細胞分化為內胚層、中胚層、外胚層之所有細胞者稱為「多潛能幹細胞」。
作為多潛能幹細胞，例如可列舉：人工多潛能幹細胞（induced pluripotent stem cell，以下稱為「iPS細胞」）、胚胎幹細胞（embryonic stem cells，以下稱為「ES細胞」）、Muse細胞（multilinege differentiating stress enduring cells）、胚胎癌細胞（embryonic germ cell）、胚胎生殖幹細胞（embryonic germ cell）、mGS細胞（multipotent germ stem cell）等。
將幹細胞中具有自我複製能力，屬於外胚層系組織、內胚層系組織、中胚層系組織、生殖系統組織中之任一者，表現出向其所屬於之器官之構成細胞種之有限分化能力者稱為「組織幹細胞」及「組織前驅細胞」。
作為組織幹細胞及組織前驅細胞，例如可列舉：神經幹細胞、神經塉幹細胞、視網膜幹細胞、角膜幹細胞、角質形成細胞表皮幹細胞、黑色素幹細胞、乳腺幹細胞、肝幹細胞、腸幹細胞、氣道幹細胞、造血幹細胞、間充質幹細胞、心臟幹細胞、血管內皮前驅細胞、血管外皮細胞、骨骼肌幹細胞、脂肪幹細胞、腎前驅細胞、精子幹細胞等。
藉由使用作為本發明之一實施態樣之幹細胞支架材料，上述幹細胞種並無特別限定，均可用作幹細胞支架材料。其中，較佳為用於多潛能幹細胞、尤其是iPS細胞之培養。於不含餵養細胞或接著蛋白質之無血清培養基培養中，幹細胞接種後之初期固定率提昇，可較佳地進行幹細胞之培養。
作為此種幹細胞，例如可列舉「更充分瞭解！幹細胞與再生醫療」（羊土公司，長船健二著）中記載之幹細胞。

聚乙烯縮醛樹脂之聚合度之下限較佳為100，更佳為200，進而較佳為500，進而更佳為1500。若聚合度為上述範圍，則即便於欲進行細胞培養之培養基中膨潤，亦可較佳地保持支架材料強度，故而細胞增殖性提昇。聚合度之上限較佳為6000，更佳為3000，進而較佳為2500。若聚合度為上述範圍，則操作性較佳，可使支架材料較佳地成形。

[幹細胞之培養方法]
根據上述幹細胞培養用支架材料，可培養各種幹細胞，但若考慮其特性，則較佳為用於幹細胞中之多潛能幹細胞之培養。其原因在於：一般認為多潛能幹細胞接種後之培養之固定率較低，但上述幹細胞培養用支架材料不易因培養基之水分而膨潤，可維持適度之親水性及強度，故而多潛能幹細胞之接種後之固定率提昇。

[幹細胞培養用容器]
本發明亦關於一種使用上述幹細胞培養用支架材料之幹細胞培養用容器。即，關於一種幹細胞培養用容器，且該幹細胞培養用容器係於幹細胞之培養區域之至少一部分具備由上述幹細胞支架材料所構成之樹脂膜。
圖1A係實施形態之幹細胞培養用容器之立體概念圖，圖1B係其側面剖面概念圖。幹細胞培養用容器之形狀並無特別限制，例如可列舉如下態樣：準備如圖1A所示之有底圓柱狀之皮氏培養皿1，於其底面之幹細胞之培養區域，如圖1B所示般設置樹脂膜12。

幹細胞培養用支架材料於幹細胞之培養中，除用於平面培養（二維培養方法）以外，亦可用於更接近活體內之狀態、例如多孔質膜或水凝膠等基材上之幹細胞之培養（三維培養方法）。其原因在於：藉由將細胞培養用支架材料用於生物反應器等，可高效率地使幹細胞增殖。
就具備適度之親水性及強度之方面而言，細胞培養用支架材料較佳為用於二維培養方法。

作為平面培養（二維培養方法）用容器，形狀或大小並無特別限定，可列舉具備1個或多個孔（hole）之細胞培養用測試板、或細胞培養用燒瓶。例如可使用如圖2所示之具有6個孔之幹細胞培養用容器。上述微量盤之孔之數量並無限定，例如可列舉：2、4、6、12、24、48、96、384等。
上述孔之形狀並無特別限定，可列舉：真圓、橢圓、三角形、正方形、長方形、五邊形等。上述孔底面之形狀並無特別限定，可列舉：平底、圓底、凹凸等。
具備1個或多個孔（hole）之細胞培養用測試板、或細胞培養用燒瓶之材質並無特別限定，可列舉高分子樹脂或金屬、無機材料。作為上述高分子樹脂，可列舉：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酯、聚異戊二烯、環烯烴聚合物、聚醯亞胺、聚醯胺、聚醯胺醯亞胺、(甲基)丙烯酸樹脂、環氧樹脂、聚矽氧等。作為金屬，可列舉：不鏽鋼、銅、鐵、鎳、鋁、鈦、金、銀、鉑等。作為無機材料，可列舉：氧化矽（玻璃）、氧化鋁、氧化鈦、氧化鋯、氧化鐵、氮化矽等。

除上述以外，細胞培養用支架材料亦可用於使幹細胞於培養基中自由懸浮而生長之懸浮培養方法。

[其他實施形態]
本發明除上述幹細胞培養用支架材料以外，亦提供使用幹細胞培養用支架材料之發明作為其他實施形態。
例如提供一種含有上述幹細胞培養用支架材料及多醣類之幹細胞培養用載體（介質）。作為多醣類，並無特別限制，可使用各種多醣類。其中，較佳為水溶性多醣類。

除此以外，亦提供一種具備幹細胞培養用支架材料之幹細胞培養用纖維。於此情形時，較佳為幹細胞培養用支架材料係塗佈於纖維上。又，幹細胞培養用支架材料亦可為含浸或混練至纖維中之形態。幹細胞培養用纖維適於難以與燒瓶等平面結構接著，但容易與纖維（fibril）狀結構等立體結構接著之幹細胞之三維培養方法。適於幹細胞中尤其是脂肪幹細胞之培養。

上述幹細胞培養用支架材料亦可交聯。其原因在於：藉由交聯，可抑制水膨潤性，較佳地提高強度。亦可於幹細胞培養用支架材料中進而加入交聯劑進行交聯。
作為交聯劑，並無特別限定，可列舉：多元醇或多羧酸、羥基羧酸、金屬皂、多醣類等。
作為多元醇，並無特別限定，可列舉：乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、庚二醇、辛二醇、壬二醇、癸二醇、十二烷二醇、十一烷二醇、二乙二醇、三乙二醇、四乙二醇、聚乙二醇、鄰苯二酚、鄰苯三酚、二硼酸、亞甲基二硼酸、伸乙基二硼酸、伸丙基二硼酸、伸苯基二硼酸、聯苯二硼酸、雙酚衍生物等。
作為多羧酸，並無特別限定，可列舉：草酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、鄰苯二甲酸、聚(甲基)丙烯酸等。
作為羥基羧酸，並無特別限定，可列舉：乙醇酸、乳酸、羥基丙二酸、甘油酸、羥基丁酸、蘋果酸、酒石酸、檸蘋酸、檸檬酸、異檸檬酸、白胺酸、甲基二羥戊酸、泛解酸、蓖麻油酸、反蓖麻油酸、腦羥脂酸、奎尼酸、莽草酸、羥基苯甲酸、水楊酸、木餾油酸、香草酸、丁香酸、兒茶酚甲酸、二羥基苯甲酸、原兒茶酸、龍膽酸、苔色酸、沒食子酸、苦杏仁酸、二苯乙醇酸、2－苯乳酸、草木樨酸、根皮酸、香豆酸、繖形酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、羥基硬脂酸等。
作為金屬皂，並無特別限定，可列舉硬脂酸、月桂酸、蓖麻油酸、辛酸等脂肪酸與鋰、鈉、鎂、鈣、鋇、鋅、鋁等金屬之鹽。
作為多醣類，並無特別限定，可列舉：果膠、瓜爾膠、三仙膠、羅望子膠、角叉菜膠、丙二醇、羧甲基纖維素、直鏈澱粉、支鏈澱粉、肝糖、纖維素、甲殼素、瓊脂糖、角叉菜膠、肝素、玻尿酸、木葡聚糖、葡甘露聚糖酸等。
[實施例]

以下，列舉實施例及比較例說明本發明，但本發明並不受以下之實施例限定解釋。再者，所獲得之合成樹脂之結構單元、例如具有胺基之結構單元之含量（莫耳%）、具有亞胺結構之結構單元之含量（莫耳%）、縮醛化度（莫耳%）、乙醯基量（莫耳%）、羥基量（莫耳%）等係將合成樹脂溶解於DMSO－d6（二甲基亞碸）中，使用¹ H－NMR（核磁共振譜）進行測定。

[實施例1]
（聚乙烯丁醛之製備）
於具備攪拌裝置之反應機中投入離子交換水2700 mL、平均聚合度300、皂化度99莫耳%之聚乙烯醇300 g，一面進行攪拌一面進行加熱溶解，獲得溶液。其次，以鹽酸濃度成為0.2質量%之方式於該溶液中添加作為觸媒之35質量%鹽酸，將溫度調整為15℃後，一面進行攪拌一面添加正丁醛（n－BA）20 g。其後，添加正丁醛（n－BA）130 g，結果白色粒子狀之聚乙烯丁醛樹脂析出。於析出後15分鐘後，以鹽酸濃度成為1.8質量%之方式添加35質量%鹽酸，加熱至50℃，於50℃下熟成2小時。繼而，將溶液冷卻，進行中和後，將聚乙烯丁醛樹脂進行水洗，使之乾燥，藉此獲得聚乙烯丁醛。
所獲得之聚乙烯丁醛係平均聚合度300、羥基量36莫耳%、乙醯基量1莫耳%、縮醛化度63莫耳%。

（細胞培養用容器之製備）
藉由使所獲得之聚乙烯丁醛1 g溶解於丁醇19 g中，而獲得聚乙烯丁醛溶液。將所獲得之聚乙烯丁醛溶液150 μL噴出至f22 mm之蓋玻璃上，使用旋轉塗佈機以2000 rpm旋轉20秒而獲得平滑之樹脂膜。將所獲得之上述樹脂膜連同蓋玻璃一併投入至f22 mm之聚苯乙烯培養皿，獲得細胞培養用容器。

於以下之條件下對具備樹脂膜之細胞培養用容器進行試驗。
（細胞培養試驗之方法）
於所獲得之細胞培養用容器中加入磷酸緩衝生理食鹽水1 mL並於37℃之培養箱內靜置1小時。去除培養皿內之磷酸緩衝生理食鹽水後，接種1.5×10⁴ 之h－iPS細胞253G1，於培養基TeSR E8（STEM CELL公司製造）1 mL及ROCK－Inhibitor（Y27632）10 μM之存在下，於37℃、CO₂ 濃度5%之培養箱內進行培養。每24小時去除培養基750 μL，加入250 μL之新TeSR E8，調整為ROCK－Inhibitor（Y27632）10 μM，藉此進行培養基更換。

（膜物性之評價方法）
（1）儲存彈性模數
藉由熱壓機將所獲得之樹脂膜重疊，藉此獲得厚度500 μm之片材。針對所獲得之片材，藉由動態黏彈性測定裝置（IT Meter. and Control公司製造，DVA－200），於拉伸條件下，以頻率10 Hz，以升溫速度5℃／分鐘於－150℃至150℃之溫度範圍內進行測定。根據所獲得之拉伸儲存彈性模數之圖表求出25℃及100℃之儲存彈性模數，算出25℃儲存彈性模數／100℃儲存彈性模數。
（2）Tg
根據藉由儲存彈性模數測定所獲得之圖求出損耗正切之峰值溫度，設為玻璃轉移溫度Tg。

（細胞塊培養試驗之方法）
於所獲得之細胞培養用容器中加入磷酸緩衝生理食鹽水1 mL並於37℃之培養箱內靜置1小時後，去除培養容器內之磷酸緩衝生理食鹽水。於35 mm培養皿中加入成為融合狀態之h－iPS細胞252G1之群落，其次加入1 mL之0.5 mM乙二胺／磷酸緩衝溶液，於室溫下靜置2分鐘。其後，去除乙二胺／磷酸緩衝溶液，將1.0×10⁵ 之於1 mL之TeSRE8培養基中利用移液破碎為50~200 μm之細胞塊接種於培養容器中，於培養基TeSR E8（STEM CELL公司製造）1 mL及ROCK－Inhibitor（Y27632）10 μM之存在下，於37℃、CO₂ 濃度5%之培養箱內進行培養。每24小時去除培養基750 μL，加入250 μL之新TeSR E8，藉此進行培養基更換。

（培養評價之方法）
（1）掉落評價（抗損傷性評價）
於使f10 mm之氧化鋯球（YTZ－10）自高度1 cm掉落至支架材料時，藉由目測判別掉落痕跡之有無而進行評價。按照以下之基準進行判定。
○：未見掉落痕跡
×：可見掉落痕跡
（2）細胞增殖性
於細胞培養試驗中，使用相位差顯微鏡10×4倍之相位差顯微鏡（Olympus公司製造，IX73）取得細胞接種後經過5天後之細胞圖像。此時，取得表示培養容器內之最平均之接著形態之視野的圖像。藉由將所獲得之圖像與圖3之樣本1~樣本10對照，進行細胞增殖性之評價。於圖3中，群落越因細胞增殖而生長，則越設為高評價。再者，群落若於橫向（畫面之縱橫方向）過度生長，則於縱向（畫面之近前側方向）開始堆積，故而有光之穿透性變低之傾向。將所獲得之實施例及比較例之結果彙總示於圖4A、圖4B。

[實施例2]
使用平均聚合度250之聚乙烯醇，將正丁醛之投入量設為22 g及148 g，除此以外，以與實施例1相同之方式進行試驗。

[實施例3]
使用平均聚合度850之聚乙烯醇，除此以外，以與實施例2相同之方式進行試驗。

[實施例4]
使用平均聚合度1700之聚乙烯醇，除此以外，以與實施例2相同之方式進行試驗。

[實施例5]
使用平均聚合度2400之聚乙烯醇，且使用乙醛代替正丁醛（n－BA），除此以外，以與實施例2相同之方式進行試驗。

[實施例6]
使用平均聚合度850、皂化度98莫耳%、乙烯改質度4莫耳%之聚乙烯醇，除此以外，以與實施例2相同之方式進行試驗。

[實施例7]
使用平均聚合度250、皂化度99莫耳%、含有上述式（3）所示之具有胺基之結構單元2莫耳%之聚乙烯醇，除此以外，以與實施例2相同之方式進行試驗。

[實施例8]
使用平均聚合度1600、皂化度99莫耳%、含有上述式（3）所示之具有胺基之結構單元2莫耳%之聚乙烯醇，除此以外，以與實施例2相同之方式進行試驗。

[實施例9]
使甲基丙烯酸甲酯48重量份、甲基丙烯酸丁酯45重量份及丙烯酸甲氧基甲酯7重量份溶解於四氫呋喃300重量份中而獲得丙烯酸單體溶液。使Irgacure 184（BASF公司製造）2重量份溶解於所獲得之丙烯酸單體溶液中，塗佈於PET膜上。針對塗佈物，於25℃使用EYE GRAPHICS公司製造之UV輸送帶裝置「ECS301G1」，以累計光量2000 mJ／ cm² 照射365 nm之波長之光，藉此獲得丙烯酸樹脂溶液。使所獲得之丙烯酸樹脂溶液於80℃真空乾燥3小時，藉此獲得丙烯酸樹脂。將所獲得之丙烯酸樹脂調整為3重量%丁醇溶液，以與實施例1相同之方式進行試驗。所獲得之樹脂之重量平均分子量為約7萬。

[比較例1]
不使用支架材料樹脂，僅藉由聚苯乙烯培養皿，以與實施例1相同之方式進行試驗。

[比較例2]
使用N－異丙基丙烯醯胺100重量份作為丙烯酸單體，除此以外，以與實施例9相同之方式進行試驗。所獲得之樹脂之重量平均分子量為約10萬。

[比較例3]
使用甲基丙烯酸甲酯100重量份作為丙烯酸單體，除此以外，以與實施例9相同之方式進行試驗。所獲得之樹脂之重量平均分子量為約9萬。

[比較例4]
使用丙烯酸丁酯100重量份作為丙烯酸單體，除此以外，以與實施例9相同之方式進行試驗。所獲得之樹脂之重量平均分子量為約12萬。

[比較例5]
將兩末端Silaplane FM－7711（JNC公司製造）100重量份用於丙烯酸單體，除此以外，以與實施例9相同之方式進行試驗。關於所獲得之樹脂之重量平均分子量，無法測定分子量。

將所獲得之結果彙總示於表1。再者，於任一實施例及比較例中，均未觀察到分化之細胞。


[表1]

1‧‧‧皮氏培養皿

12‧‧‧樹脂膜

圖1A係實施形態之幹細胞培養用容器之立體概念圖，圖1B係其側面剖面概念圖。

圖2係實施形態之6孔型幹細胞培養用容器之立體概念圖。

圖3係表示細胞接種後5天後之細胞增殖性之評價基準之圖。

圖4A及圖4B分別為實施例及比較例之細胞之接種後5天後之相位差顯微鏡照片。

Claims (4)

1. 一種幹細胞培養用支架材料，其含有合成樹脂，且 100℃儲存彈性模數為1.0×10⁴ Pa以上且1.0×10⁸ Pa以下， 25℃儲存彈性模數與100℃儲存彈性模數之比（（25℃下之儲存彈性模數）／（100℃下之儲存彈性模數））為1.0×10¹ 以上且1.0×10⁵ 以下。
2. 如請求項1所述之幹細胞培養用支架材料，其中，上述合成樹脂為聚乙烯縮醛樹脂。
3. 如請求項1或2所述之幹細胞培養用支架材料，其中，上述幹細胞為多潛能幹細胞。
4. 一種幹細胞培養用容器，其具備請求項1至3中任一項所述之幹細胞培養用支架材料。