TW201540829A - 細胞培養用載體及使用其之細胞培養方法 - Google Patents

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Chieko Okada
Takanori Shirai
Yasuhiro Takeda
Sumito Kiyooka
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Abstract

本發明提供一種細胞培養用載體及使用其之細胞培養方法，該細胞培養用載體係由含有濕熱接合性纖維且具有不織纖維構造之成形體構成，具有0.02~0.7g/cm3之視密度。

Description

細胞培養用載體及使用其之細胞培養方法
本發明係關於一種細胞培養用載體及使用該細胞培養用載體之細胞培養方法。本發明詳細而言，係一種適於進行貼附性細胞之立體培養(three-dimensional culture)之細胞培養用載體及細胞培養方法。
細胞培養技術於1)細胞產物之生產、2)對生物體患部(lesioned part)或缺損部之修補材料(prosthesis)、3)藥劑毒性及藥理活性評價用之模擬裝置等領域中正被研究及應用。
以往，細胞培養是在玻璃之表面上或經施加過各種處理的聚苯乙烯等之表面上進行(例如非專利文獻1及2)。例如，由藉電漿處理或電暈處理等進行過表面處理之聚苯乙烯；或塗佈有膠原蛋白、纖網蛋白、聚離胺酸等細胞接合性蛋白質之聚苯乙烯等構成之各種細胞培養用載體很普及。
又，作為細胞培養用載體，提出有表面經離子撞擊而改質之細胞接合性材料(專利文獻1)或具有藉由使用光罩而形成之排列圖案的細胞排列控制用具(專利文獻2)等。然而，藉由離子撞擊之表面改質或使用光罩之排列圖案的形成，需要非常高度的技術，有高成本等之缺點。
[專利文獻1]日本特開平5-49689號公報
[專利文獻2]日本特開平7-308186號公報
[非專利文獻1]Freshney, R.I, “Culture of animal cells; a manual of basic technique”，第2版，Wiley-Liss, London, p. 83 (1987)
[非專利文獻2]Kuhn, k., “Structure and function; The classical collagens types I, II and III”, R. Mayne and R.E. Burgeson編，Academic Press, NY, p. 1 (1987)
本發明之目的在於提供一種細胞培養用載體，其於細胞培養(尤其是貼附性細胞之立體培養)中具有成為細胞的立足點之充分寬廣度的細胞接合面，且形狀穩定性優異。
即，本發明係關於下述之細胞培養用載體及方法：
[1]一種細胞培養用載體，係由含有濕熱接合性纖維且具有不織纖維構造之成形體構成，具有0.02~0.7g/cm3之視密度。
[2]如上述[1]之細胞培養用載體，其中，視密度為0.025~0.3g/cm3。
[3]如上述[1]之細胞培養用載體，其中，視密度為0.03~0.1g/cm3。
[4]如上述[1]~[3]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維係含有選自由乙烯醇系聚合物、聚乳酸系樹脂及含(甲基)丙烯醯胺單元之(甲基)丙烯酸系共聚物組成之群中之至少一種的纖維。
[5]如上述[1]~[3]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維係含有含α-C2-10烯烴單元之乙烯醇系聚合物的纖維。
[6]如上述[1]~[3]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維係含有乙烯-乙烯醇系共聚物之纖維。
[7]如上述[1]~[3]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱 接合性纖維係藉乙烯-乙烯醇系共聚物與非濕熱接合性樹脂形成之複合纖維。
[8]如上述[7]之細胞培養用載體，其中，非濕熱接合性樹脂係聚酯系樹脂及/或聚醯胺系樹脂。
[9]如上述[7]之細胞培養用載體，其中，非濕熱接合性樹脂係聚酯系樹脂。
[10]如上述[7]之細胞培養用載體，其中，非濕熱接合性樹脂係芳香族聚酯系樹脂。
[11]如上述[7]之細胞培養用載體，其中，非濕熱接合性樹脂係聚對酞酸乙二酯系樹脂。
[12]如上述[7]之細胞培養用載體，其中，非濕熱接合性樹脂係聚對酞酸乙二酯。
[13]如上述[7]~[12]中任一項之細胞培養用載體，其中，該乙烯-乙烯醇系共聚物/該非濕熱接合性樹脂之質量比為90/10~10/90。
[14]如上述[7]~[12]中任一項之細胞培養用載體，其中，乙烯-乙烯醇系共聚物/非濕熱接合性樹脂之質量比為80/20~15/85。
[15]如上述[7]~[12]中任一項之細胞培養用載體，其中，乙烯-乙烯醇系共聚物/非濕熱接合性樹脂之質量比為60/40~20/80。
[16]如上述[1]~[3]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維係藉由藉乙烯-乙烯醇系共聚物構成之鞘部與藉聚酯系樹脂構成之芯部形成的芯鞘型複合纖維。
[17]如上述[16]之細胞培養用載體，其中，聚酯系樹脂係芳香族聚酯系 樹脂。
[18]如上述[16]之細胞培養用載體，其中，聚酯系樹脂係聚對酞酸乙二酯系樹脂。
[19]如上述[16]之細胞培養用載體，其中，聚酯系樹脂係聚對酞酸乙二酯。
[20]如上述[16]~[19]中任一項之細胞培養用載體，其中，乙烯-乙烯醇系共聚物/聚酯系樹脂之質量比為90/10~10/90。
[21]如上述[16]~[19]中任一項之細胞培養用載體，其中，乙烯-乙烯醇系共聚物/聚酯系樹脂之質量比為80/20~15/85。
[22]如上述[16]~[19]中任一項之細胞培養用載體，其中，乙烯-乙烯醇系共聚物/聚酯系樹脂之質量比為60/40~20/80。
[23]如上述[6]~[22]中任一項之細胞培養用載體，其中，乙烯-乙烯醇系共聚物中之乙烯單元的含量為10~60莫耳%。
[24]如上述[6]~[22]中任一項之細胞培養用載體，其中，乙烯-乙烯醇系共聚物中之乙烯單元的含量為20~55莫耳%。
[25]如上述[6]~[22]中任一項之細胞培養用載體，其中，乙烯-乙烯醇系共聚物中之乙烯單元的含量為30~50莫耳%。
[26]如上述[6]~[25]中任一項之細胞培養用載體，其中，乙烯-乙烯醇系共聚物中之乙烯醇單元的皂化度為90~99.99莫耳%。
[27]如上述[6]~[25]中任一項之細胞培養用載體，其中，乙烯-乙烯醇系共聚物中之乙烯醇單元的皂化度為95~99.98莫耳%。
[26]如上述[6]~[25]中任一項之細胞培養用載體，其中，乙烯-乙烯醇 系共聚物中之乙烯醇單元的皂化度為96~99.97莫耳%。
[29]如上述[6]~[28]中任一項之細胞培養用載體，其中，於溫度190℃及負重2160g之條件下測量的乙烯-乙烯醇系共聚物之熔體指數為1.0~10g/10分。
[30]如上述[6]~[28]中任一項之細胞培養用載體，其中，於溫度190℃及負重2160g之條件下測量的乙烯-乙烯醇系共聚物之熔體指數為1.3~7.0g/10分。
[31]如上述[6]~[28]中任一項之細胞培養用載體，其中，於溫度190℃及負重2160g之條件下測量的乙烯-乙烯醇系共聚物之熔體指數為1.5~6.6g/10分。
[32]如上述[1]~[31]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維之平均纖度為0.01~100dtex。
[33]如上述[1]~[31]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維之平均纖度為0.1~50dtex。
[34]如上述[1]~[31]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維之平均纖度為0.5~30dtex。
[35]如上述[1]~[31]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維之平均纖度為1~10dtex。
[36]如上述[1]~[35]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維之平均纖維長度為10~100mm。
[37]如上述[1]~[35]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維之平均纖維長度為20~80mm。
[38]如上述[1]~[35]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維之平均纖維長度為25~75mm。
[39]如上述[1]~[35]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維之平均纖維長度為35~55mm。
[40]如上述[1]~[39]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維之捲曲率為1~50%。
[41]如上述[1]~[39]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維之捲曲率為3~40%。
[42]如上述[1]~[39]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維之捲曲率為5~30%。
[43]如上述[1]~[39]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維之捲曲率為10~20%。
[44]如上述[1]~[43]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維之捲曲數為1~100個/吋。
[45]如上述[1]~[43]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維之捲曲數為5~50個/吋。
[46]如上述[1]~[43]中任一項之細胞培養用載體，其中，濕熱接合性纖維之捲曲數為10~30個/吋。
[47]如上述[1]~[46]中任一項之細胞培養用載體，其中，成形體之纖維接合率為10~85%。
[48]如上述[1]~[46]中任一項之細胞培養用載體，其中，成形體之纖維接合率為10~70%。
[49]如上述[1]~[46]中任一項之細胞培養用載體，其中，成形體之纖維接合率為10~60%。
[50]如上述[1]~[46]中任一項之細胞培養用載體，其中，成形體之纖維接合率為10~35%。
[51]一種細胞培養方法，使用上述[1]~[50]中任一項之細胞培養用載體。
[52]如上述[51]之方法，其中，該細胞為貼附性細胞。
[53]如上述[51]之方法，其中，於使貼附性細胞附著於細胞培養用載體之狀態下進行培養。
本發明之細胞培養用載體的形狀穩定性優異，容易處理。又，本發明之細胞培養用載體具有不織纖維構造，故具有成為細胞之立足點之充分寬廣度的細胞接合面。因此，若使用本發明之細胞培養用載體，則可效率良好地進行細胞培養(尤其是貼附性細胞之立體培養)。又，本發明之細胞培養用載體不會因吉姆沙染色等之組織染色而被染色，故可只染色培養細胞而容易地進行其增殖之評價。
[圖1]為於試驗例1中使用製造例1之細胞培養載體進行細胞培養後(細胞播種濃度：5×105細胞/ml、5×106細胞/ml、5×107細胞/ml，培養日數：1日、4日、7日)，藉由吉姆沙染色進行染色之培養細胞及載體的照片。
[圖2]為於試驗例1中使用市售之膠原蛋白製細胞培養用載體進行細胞培養後(細胞播種濃度：5×105細胞/ml、5×106細胞/ml、5×107細胞/ml， 培養日數：1日、4日、7日)，藉由吉姆沙染色進行染色之培養細胞及載體的照片。
本發明之細胞培養用載體，係由含有濕熱接合性纖維且具有不織纖維構造之成形體構成，具有0.02~0.7g/cm3之視密度。此處所謂不織纖維構造，係指不編織纖維而使其接合形成之板狀結構。又，所謂本發明之細胞培養用載體之視密度，係該載體之質量除以具有含空隙之不織纖維構造的細胞培養載體(成形體)之體積所得之值。再者，此視密度亦可藉以下方式求得：測量細胞培養用載體之單位面積重量(即每單位面積之質量)及厚度，將單位面積重量除以厚度。
本發明之細胞培養用載體由濕熱接合性纖維所形成，故形狀穩定性優異，於細胞培養之處理性優異。又，本發明之細胞培養用載體具有視密度為0.02~0.7g/cm3之不織纖維構造，故可令用於維持細胞之培養基、氧等通過。此視密度較佳為0.025~0.3g/cm3，更佳為0.03~0.1g/cm3。
本發明之細胞培養用載體於培養期間中可時常維持細胞之接合及增殖所需之空隙，故於細胞培養中保持細胞型態的能力高。因此，若藉由本發明之細胞培養用載體，則細胞尤其是貼附性細胞之固定化、貼附性細胞之立體培養等變得可能。
本發明之細胞培養用載體(即，具有不織纖維構造之成形體)未含浸樹脂，而實質性地以濕熱接合性纖維構成。進而，其不織纖維構造係藉由濕熱接合性纖維之接合而形成。該成形體例如於進行貼附性動物細胞之立體培養時，具有充分寬廣的細胞接合面，且形狀穩定性優異。因此， 藉由將本發明之細胞培養用載體用於生物反應器等，可效率良好地進行細胞增殖。
本發明之細胞培養用載體之形狀並無特別限定。作為其形狀，例如可舉球狀、板狀、棒狀、角狀、橢圓狀、圓盤狀、圓筒狀、圓柱狀等。於該等形狀中，較佳為球狀、圓盤狀。再者，於將本發明之細胞培養用載體用於生物反應器之情形時，較佳為球狀之載體。詳細而言，在用於流動性型之生物反應器的情形時，球狀之載體的流動性比其他形狀優異。在用於固定床(fixed bed type)型生物反應器之情形時，球狀之載體容易充填，且載體彼此間之接點小，不易產生凝集，故易於處理。
於本發明之細胞培養用載體為圓盤狀之情形時，其大小無特別限制，由處理性之觀點而言，例如參考一般通用之培養盤的尺寸而可適當地選擇。另一方面，本發明之細胞培養用載體為球狀之情形時，其平均粒徑由容易地進行載體之分離及回收的觀點而言，較佳為1mm以上，更佳為2mm以上，進而較佳為3mm以上，由增大每單位體積之細胞培養表面積的觀點而言，較佳為20mm以下，更佳為10mm以下，進而較佳為6mm以下。再者，該平均粒徑藉由如下方式獲得：使用遊標卡尺測量隨機選擇之10個細胞培養用載體的最大徑，將其等平均。
構成本發明之細胞培養用載體之成形體，由於具有適度地接合有濕熱接合性纖維之不織纖維構造，故即便為輕量且低密度，仍具有高彎曲應力。此成形體具有透氣性及隔熱性，同時具有高硬度，且耐折性或韌性亦優異。即，此成形體即便成形為板狀並於表面施加負重，亦不易產生局部之變形，對於所施加之應力進行彎曲、變形，藉此吸收此應力，故 耐震性高，即使施加強力衝擊亦不輕易地破損、斷裂。進而，此成形體可實質地僅以纖維組成，不需添加化學黏合劑或特殊藥劑，故不使用會產生有害成分(甲醛等之揮發性有機化合物等)之成分，對細胞為非活性。
此處所謂濕熱接合性纖維係指含有濕熱接合性樹脂，藉由高溫水蒸氣或熱水而可發揮接合功能之纖維；所謂濕熱接合性樹脂，係指藉由高溫水蒸氣或熱水進行軟化，而可發揮接合功能之樹脂。
作為濕熱接合性樹脂，可列舉以熱水(例如80~120℃，尤其是95~100℃左右)軟化，可自我接合或接合於其他纖維之熱塑性樹脂，尤其是親水性樹脂、水溶性樹脂。作為其例子，可列舉纖維素系樹脂(甲基纖維素等之C1-3烷基纖維素醚、羥基甲基纖維素等之羥基C1-3烷基纖維素醚、羧基甲基纖維素等之羧基C1-3烷基纖維素醚或其鹽等)、聚伸烷二醇(polyalkylene glycol)樹脂(聚乙烯氧(polyethylene oxide)、聚丙烯氧(polypropylene oxide)等之聚C2-4烯化氧等)、聚乙烯系樹脂(聚乙烯氫吡咯酮、聚乙烯醚、乙烯醇系聚合物(乙烯或丙烯等含α-C2-10烯烴單元之乙烯醇系聚合物，尤其是乙烯-乙烯醇系共聚物)、聚乙烯縮醛等)、丙烯酸系共聚物及其鹽(含有以(甲基)丙烯酸及其鹽、(甲基)丙烯醯胺等丙烯酸系單體構成之單元的共聚物(尤其是含有(甲基)丙烯醯胺單元之(甲基)丙烯酸系共聚物)等)、改質乙烯系共聚物(異丁烯、苯乙烯、乙烯、乙烯醚等之乙烯系單體與順丁烯二酸酐等之不飽和羧酸或其酸酐的共聚物或其鹽等)、導入有親水性之取代基的聚合物(導入有磺酸基或羧基、烴基等之聚酯、聚醯胺、聚苯乙烯或其鹽等)、脂肪族聚酯系樹脂(聚乳酸系樹脂(例如聚乳酸)等)等。進而，於聚烯烴系樹脂、聚酯系樹脂、聚醯胺系樹脂、聚胺甲酸酯系樹脂、熱塑 性彈性體或橡膠(苯乙烯系彈性體等)等中，藉熱水或高溫水蒸氣軟化而可表現接合功能之樹脂亦可用作濕熱接合性樹脂。
濕熱接合性樹脂可單獨或組合兩種以上而使用。作為濕熱接合性樹脂，較佳為乙烯-乙烯醇共聚物等之乙烯醇系聚合物、聚乳酸等之聚乳酸系樹脂、含有(甲基)丙烯醯胺單元之(甲基)丙烯酸系共聚物，更佳為乙烯或丙烯等含α-C2-10烯烴單元之乙烯醇系聚合物，進而較佳為乙烯-乙烯醇系共聚物。
乙烯-乙烯醇系共聚物中之乙烯單元之含量(共聚率)例如為10~60莫耳%，較佳為20~55莫耳%，進而較佳為30~50莫耳%左右。藉由使乙烯單元位於此範圍，可獲得具有濕熱接合性但無熱水溶解性之特異性質。若乙烯單元之比例過少，則乙烯-乙烯醇系共聚物於低溫之水蒸氣(水)容易膨潤或膠體化，只要被水濕潤過一次，形態便變得容易變化。另一方面，若乙烯單元之比例過多，則吸濕性降低，變得不易表現藉由濕熱之纖維接合，故製造具有具實用性之強度的成形體變得困難。乙烯單元之比例尤其若於30~50莫耳%之範圍，則由於濕熱接合性纖維之濕熱接合性樹脂軟化，纖維間之接合點容易形成，對成形體之片或板狀構造物之加工性特別優異。
乙烯-乙烯醇系共聚物中乙烯醇單元的皂化度例如為90~99.99莫耳%左右，較佳為95~99.98莫耳%，進而較佳為96~99.97莫耳%左右。若鹼化度過小，則熱穩定性降低，因熱分解或膠體化導致穩定性降低。另一方面，若皂化度過大，則纖維本身之製造變得困難。此處所謂乙烯醇單元的皂化度，係指存在於乙烯醇單元中之烷氧羰基(別名：酯基， RO-CO-)被水解而取代為羥基之程度，以皂化度表示羥基相對於羧基與羥基之合計數的百分率。皂化度係藉由氫氧化鈉滴定而測量。
乙烯-乙烯醇系共聚物中之黏度平均聚合度可視需要選擇，例如為200~2500，較佳為300~2000，進而較佳為400~1500左右。若聚合度於此範圍，則所獲得之濕熱性纖維的可紡性與濕熱接合性之平衡優異。此黏度平均聚合度(P)係使用下式自乙烯-乙烯醇系共聚物之黏度(η)算出。
logP=1.613log{{η}×104)/7.15}
由紡絲之觀點而言，乙烯-乙烯醇系共聚物之熔體指數(MI)係為重要。MI表示熔融之熱塑性樹脂的流動性之大小，為熱塑性樹脂品質管理用之典型的指數。MI之測量係依據JIS K7210進行。乙烯-乙烯醇系共聚物之MI可視需要選擇。由所獲得之濕熱性纖維的可紡性與濕熱接合性之平衡之觀點而言，溫度190℃及負重2160g之條件下測量的乙烯-乙烯醇系共聚物之MI較佳為1.0~10g/10分，更佳為1.3~7.0g/10分，進而更佳為1.5~6.6g/10分。
濕熱性纖維之橫截面形狀(垂直於纖維之長度方向的剖面形狀)可為作為一般性之實體截面(solid cross section)形狀的圓形截面或異型截面(modified cross section)[扁平狀、橢圓狀、多角形狀、3~14葉狀、T字狀、H字狀、V字狀、狗骨狀(I字狀)等]，亦可為中空截面狀。濕熱接合性纖維亦可為由含有濕熱接合性樹脂之複數樹脂組成的複合纖維。複合纖維若於纖維表面之至少一部分具有濕熱接合性樹脂即可，但就接合性之觀點而言，較佳濕熱接合性樹脂於長度方向連續地占據表面之至少一部分。
作為濕熱接合性纖維占據表面之複合纖維的橫截面構造，例如可列舉芯鞘型、海島型、側對側(side by side)型或多層貼合型、放射狀貼合型、隨機複合型等之結構。該等橫截面結構中，就接合性高之觀點而言，較佳為濕熱接合性樹脂於長度方向連續占據整個表面之結構的芯鞘型結構(即，鞘部以濕熱接合性樹脂構成之芯鞘型構造)。
為複合纖維之情形，可將濕熱接合性樹脂彼此組合，亦可將濕熱接合性樹脂與非濕熱接合性樹脂組合。此處所謂非濕熱接合性樹脂，係指即使藉高溫水蒸氣及熱水之任一者亦不發揮接合功能之樹脂。
作為非濕熱接合性樹脂，例如非水溶性或疏水性樹脂，具體而言，可列舉聚烯烴係樹脂、(甲基)丙烯酸系樹脂、氯乙烯系樹脂、苯乙烯系樹脂、聚酯系樹脂、聚醯胺系樹脂、聚碳酸酯系樹脂、聚胺甲酸酯系樹脂、熱塑性彈性體等。該等非濕熱接合性樹脂可單獨亦可組合兩種以上使用。該等非濕熱接合性樹脂中，就耐熱性及尺寸穩定性之觀點而言，較佳為其熔點高於濕熱接合性樹脂(例如乙烯-乙烯醇系共聚物)的熔點之樹脂(例如聚丙烯系樹脂、聚酯系樹脂、聚醯胺系樹脂)，就耐熱性與纖維形成性等之平衡優異的觀點而言，更佳為聚酯系樹脂、聚醯胺系樹脂。
作為聚酯系樹脂，較佳為聚C2-4亞烷基芳酯(alkylene arylate)系樹脂等之芳香族聚酯系樹脂(聚對酞酸乙二酯(PET)等之聚對酞酸乙二酯系樹脂、聚對苯二甲酸丙二酯(polytrimethylene terephthalate)、聚伸丁基對苯二甲酸酯(polybutylene terephthalate)、聚萘二甲酸乙二酯(polyethylene naphthalate)等)、更佳為聚對酞酸乙二酯系樹脂。聚對酞酸乙二酯系樹脂較佳亦可於對酞酸乙二酯單元之外，以20莫耳%以下左右之比例含有其他二 羧酸(例如間苯二甲酸、萘-2,6-二羧酸(naphthalene-2,6-dicarboxylate)、鄰苯二甲酸、4,4’-二聯苯羧酸(4,4’-diphenyl carboxylic acid)、雙(羧基苯基)乙烷、5-鈉磺酸基間苯二甲酸(5-sodium sulfoisophtahlate)或二醇(例如二伸乙甘醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、1,6-己二醇、新戊二醇、環己烷-1,4-二甲醇、聚乙二醇、聚伸丁二醇等)所構成之單元。
作為聚醯胺系樹脂，較佳為聚醯胺6、聚醯胺66、聚醯胺610、聚醯胺10、聚醯胺12、聚醯胺6-12等之脂肪族聚醯胺及其共聚物；由芳香族二羧酸及脂肪族二胺合成之半芳香族聚醯胺等。該等聚醯胺系樹脂中亦可含有醯胺單元以外之單元。
為由濕熱接合性樹脂與非濕熱接合性樹脂(纖維形成性聚合物)構成的複合纖維之情形時，兩者之比例(質量比)可視結構(例如芯鞘型結構)而適當選擇。濕熱接合性樹脂/非濕熱接合性樹脂之質量比例如為90/10~10/90，較佳為80/20~15/85，進而較佳為60/40~20/80左右。若濕熱接合性樹脂之比例過多，則難以確保纖維之強度，若濕熱接合性樹脂之比例過少，則難以使濕熱接合性樹脂於纖維表面之長度方向連續存在，濕熱接合性降低。此傾向於將濕熱接合性樹脂塗佈於非濕熱接合性纖維的表面之情形時亦同。
為複合纖維之濕熱接合性纖維，較佳為由乙烯-乙烯醇系共聚物與非濕熱接合性樹脂形成之複合纖維，更佳為由乙烯-乙烯醇系共聚物與聚酯系樹脂形成之複合纖維及由乙烯-乙烯醇系共聚物與聚醯胺系樹脂形成之複合纖維，進而較佳為由乙烯-乙烯醇系共聚物與聚酯系樹脂形成之複合纖維。
為芯鞘型複合纖維之濕熱接合性纖維，較佳為由以乙烯-乙烯醇系共聚物構成之鞘部與以非濕熱接合性樹脂構成之芯部形成的芯鞘型複合纖維，更佳為由以乙烯-乙烯醇系共聚物構成之鞘部與以聚酯系樹脂構成之芯部形成的芯鞘型複合纖維及由以乙烯-乙烯醇系共聚物構成之鞘部與以聚醯胺系樹脂構成之芯部形成的芯鞘型複合纖維，進而較佳為由以乙烯-乙烯醇系共聚物構成之鞘部與以聚酯系樹脂構成之芯部形成的芯鞘型複合纖維。
濕熱接合性纖維之平均纖度例如為0.01~100dtex，較佳為0.1~50dtex，進而較佳為0.5~30dtex，尤佳為1~10dtex。若平均纖度於此範圍，則纖維之強度與濕熱接合性之表現的平衡優異。平均纖度係依據JIS L 1015之方法測量。
濕熱接合性纖維之平均纖維長例如為10~100mm，較佳為20~80mm，進而較佳為25~75mm，尤佳為35~55mm左右。若平均纖維長於此範圍，則纖維充分地纏繞，故成形體之機械強度提升。平均纖維長係依據JIS L 1015之方法測量。
濕熱接合性纖維之捲曲率例如為1~50%，較佳為3~40%，進而較佳為5~30%，尤佳為10~20%左右。又，捲曲數例如為1~100個/吋，較佳為為5~50個/吋，進而較佳為10~30個/吋左右。捲曲率及捲曲數係依據JIS L 1015之方法測量。
構成本發明之細胞培養用載體之成形體，亦可進而含有非濕熱接合性纖維。此處所謂非濕熱接合性纖維，係指即使藉高溫水蒸氣及熱水之任一者亦無法發揮接合功能之纖維。
作為非濕熱接合性纖維，可列舉聚酯系纖維(聚對酞酸乙二酯纖維、聚對苯二甲酸丙二酯纖維、聚伸丁基對苯二甲酸酯纖維、聚萘二甲酸乙二酯纖維等之芳香族聚酯纖維等)、聚醯胺系纖維(聚醯胺6、聚醯胺66、聚醯胺11、聚醯胺12、聚醯胺610、聚醯胺612等之脂肪族聚醯胺系纖維、半芳香族聚醯胺系纖維、聚間苯二甲醯間苯二胺、聚對苯二甲醯六亞甲基酯、聚對苯二甲醯對苯二胺等之芳香族聚醯胺系纖維等)、聚烯烴系纖維(聚乙烯、聚丙烯等之聚C2-4烯烴纖維等)、丙烯酸系纖維(丙烯腈-氯乙烯共聚物等之具有丙烯腈單元之丙烯腈系纖維等)、聚乙烯系纖維(聚乙烯縮醛系等)、聚氯乙烯系纖維(聚氯乙烯、氯乙烯-醋酸乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯腈共聚物之纖維等)、聚氯亞乙烯系纖維(氯亞乙烯-氯乙烯共聚物纖維、氯亞乙烯-醋酸乙烯共聚物纖維等)、聚對苯苯并雙唑纖維(poly-p-phenylene benzobisoxazole fiber)、聚苯硫纖維、纖維素系纖維(例如縲縈纖維、醋酸纖維等)等。該等非濕熱接合性纖維可單獨亦可組合兩種以上而使用。
非濕熱接合性纖維之平均纖度及平均纖維長度與濕熱接合性纖維相同。
濕熱接合性纖維與非濕熱接合性纖維之比例(濕熱接合性纖維/非濕熱接合性纖維之質量比)例如為20/80~100/0，較佳為30/70~100/0。於製造硬質之成形體之情形時，較佳濕熱接合性纖維之比例多，濕熱接合性纖維/非濕熱接合性纖維之質量比更佳為80/20~100/0，進而較佳為90/10~100/0，尤佳為95/5~100/0左右。若濕熱接合性纖維之比例為此範圍，則可獲得可確保高表面硬度與彎曲行為(bending behavior)之成形體。於製造利用非濕熱接合性纖維的特性之成形體之情形時，濕熱接 合性纖維/非濕熱接合性纖維之質量比更佳為20/80~99/1，進而較佳為30/7~90/10，尤佳為40/60~80/20左右。
構成本發明之細胞培養用載體之成形體的纖維接合率較佳為10~85%，更佳為10~70%，進而較佳為10~60%，尤佳為10~35左右%。此處所謂纖維接合率係指相對於具有不織纖維構造之成形體截面中所有纖維之數目，接合有2根以上之纖維的比例(即，纖維接合率=100×成形體截面中接合有2根以上之纖維的數目/成形體截面中所有纖維的數目)。因此，纖維接合率低，意指複數根纖維彼此接合之比例(集中而接合之纖維的比例)少。
本發明中，進而構成不織纖維構造之纖維係藉各纖維之接點而接合，但為了盡可能藉少接點數而表現大彎曲應力，此接合點較佳沿著厚度方向自成形體表面至內部(中央)以及內面為止均勻分佈。若接合點集中於表面或內部等，則不僅變得難以確保充分之彎曲應力，且接合點少之部分的形狀穩定性降低。
對構成本發明之細胞培養用之成形體的製造方法進行說明。首先，將含有濕熱接合性纖維之纖維網化。做為網之形成方法，慣用之方法例如紡絲黏合法、熔噴(melt-blow)法等直接法、使用短纖維等之梳棉法(card method)、氣流(air lay)法等之乾式法。該等方法中，尤其以使用短纖維之梳棉法被廣泛使用。作為使用短纖維而得之網，例如可列舉隨機棉網(random web)、半隨機網(semirandom web)、平行網(parallel web)、十字接網(cross lap web)等。該等之網中，於使束狀融合纖維之比例多的情形時，較佳為半隨機網、平行網。繼而，所獲得之纖維網藉由傳送帶被送至下一步驟， 接著曝露於過熱水蒸氣或高溫水蒸氣(高壓蒸氣)流，藉此得到具有不織纖維構造之成形體。即，藉傳送帶搬運之纖維網在通過從上述水蒸氣噴射裝置之噴嘴噴出的高溫水蒸氣流之中時，纖維彼此藉由所吹附之高溫水蒸氣而立體地接合。
所使用之帶式輸送機基本上若可將用於加工之纖維網一面壓縮至目標之密度，一面進行高溫水蒸氣處理，則無特別限定，較佳使用無端傳送帶(endless conveyor)。再者，可為通常的單獨傳送帶，亦可視需要組合2台傳送帶，以於兩帶間夾持網之方式搬運。藉由如上述般進行搬運，於處理網時，藉由用於處理的水、高溫水蒸氣、傳送帶的震動等之外力搬運來之網的形態之變形可受到抑制。又，亦成為可藉由調整此帶之間隔而控制處理後之具有不織纖維構造的成形體之密度或厚度。
於組合2台傳送帶之情形時，用於供給水蒸氣至網的水蒸氣噴射裝置被安裝於一傳送帶內，透過傳送帶網(conveyer net)將水蒸氣供給至網。於相反側之傳送帶亦可安裝吸入箱。藉由吸入箱，可吸引排出通過網之過多的水蒸氣。又，為了一次對網之外及內兩側進行水蒸氣處理，亦可進而將吸入箱安裝於裝設有水蒸氣噴射裝置之側的傳送帶之下流部，將水蒸氣噴射裝置設置於裝設有此吸入箱之相反側之傳送帶內。於無下流部之水蒸氣噴射裝置及吸入箱之情形時，使經一次處理之纖維網的內外反轉而再度通過處理裝置內，藉此可對纖維網之內、外進行水蒸氣處理。
用於傳送帶之無端傳送帶只要不妨礙網之運送或高溫水蒸氣處理，則無特別限定。其中，於進行高溫水蒸氣處理之情形時，有時會根據其條件而於纖維網的表面轉印帶之表面形狀，故較佳視用途而適當選 擇。尤其在欲獲得表面之平坦成形體之情形時，只要使用網目細的網即可。再者，90網目左右為上限，較其更高之網目細的網通氣性低，水蒸氣難以通過。網帶(mesh belt)之材質以對水蒸氣處理之耐熱性等觀點而言，較佳為金屬、耐熱處理過之聚酯樹脂、聚苯硫系樹脂、聚芳酯(polyarylate)(全芳香族聚酯系樹脂)、芳香族聚醯胺系樹脂等之耐熱性樹脂。
自水蒸氣噴射裝置噴射之高溫水蒸氣為氣流，故與水流絡合(hydroentanglement)處理、針孔處理不同，不會使作為被處理體之網中的纖維大幅移動，而向網內部進入。藉由向此網中之水蒸氣流的進入作用及濕熱作用，認為水蒸氣流以濕熱狀態有效率地覆蓋存在於網內部之各纖維的表面，均勻之熱接合變得可行。又，由於此處理於高速氣流下極短時間地進行，故水蒸氣向纖維表面之熱傳導充足，但於向纖維內部之熱傳導變得充足前便結束處理，因此難以發生因高溫水蒸氣之壓力或熱導致處理之纖維網整體被壓碎或其厚度受損此類之變形。其結果，於纖維網不會產生大幅之變形，以表面及厚度方向之接合程度大致變得均勻的方式完成濕熱接合。
進而，於獲得表面硬度或彎曲強度高之成形體的情形時，在將高溫水蒸氣供給至網進行處理時，重要的是將處理之網以於輸送帶或滾筒間壓縮至目標視密度之狀態下暴露於高溫水蒸氣。尤其是欲獲得相對高密度之成形體的情形時，在以高溫水蒸氣處理時，必須以充足之壓力將纖維網加以壓縮。進而，亦可於滾筒間或傳送帶間適當地確保間隙，藉此調整至目標之厚度或密度。於傳送帶之情形時，由於難以一口氣將網壓縮，故較佳將帶之張力盡可能設定為高，自水蒸氣處理地點之上流慢慢地將間隙縮窄。進而，藉由調整水蒸氣壓力、處理速度，加工為具有想要之彎曲 硬度、表面硬度、輕量性、透氣度之成形體。
此時，於欲提升硬度之情形時，若夾持網且將與噴嘴相反側之無端傳送帶之內側設為不鏽鋼板，形成水蒸氣無法通過之構造，則因通過作為被處理物之網的水蒸氣於此反射，故可藉由水蒸氣之保溫效果，牢固地接合濕熱接合性纖維。反之，於必須輕度之接合的情形時，亦可配置吸入箱，將多餘之水分向室外排出
用以噴射高溫水蒸氣之噴嘴，可使用特定之孔口連續地排列於寬度方向之板或模具，將其配置成孔口排列於被供給之網的寬度方向。孔口列只要有一列以上即可，亦可為複數列並排之配置排列。又，亦可將具有一列孔口列之噴嘴模具設置為複數台並排。
使用於板將孔口打開之類型的噴嘴之情形時，板之厚度可為0.5~1mm左右。關於孔口之直徑與間距，只要為可進行作為目標之纖維固定的條件則無特別限制。孔口之直徑通常為0.05~2mm，較佳為0.1~1mm，進而較佳為0.2~0.5mm左右。孔口之間距通常為0.5~3mm、較佳為1~2.5mm，進而較佳為1~1.5mm左右。若孔口之直徑過小，則噴嘴之加工精度變低，容易產生加工變得困難之設備上的問題與變得容易堵塞之運作上的問題。反之，若孔口之直徑過大，則水蒸氣噴射力降低。另一方面，若間距過小，噴嘴孔變得過密，故噴嘴本身之強度降低。另一方面，若間距過大，則會產生高溫水蒸氣未充分地碰撞網之整面的情況，故網中纖維間之接合變得不均勻，成形體之強度降低。
關於高溫水蒸氣，只要可實現作為目標之纖維的固定，則亦無特別限制，藉由所使用之纖維的材質或形態進行設定即可，但壓力例如 為0.05~2MPa、較佳為0.05~1.5MPa、進而較佳為0.1~1MPa左右。於水蒸氣壓力過高之情形時，有可能形成網之纖維移動而產生結構之紊亂，或纖維過於熔融而變得無法保持部分纖維形狀。又，若壓力過低，則有時會變得無法將纖維之融合所需之熱量賦予網，或水蒸氣無法穿透網，而於厚度方向產生纖維融合斑，並有時變得難以控制自噴嘴之水蒸氣之均勻噴出。
高溫水蒸氣之溫度例如為70~150℃、較佳為80~120℃、進而較佳為90~110℃左右。藉由高溫水蒸氣之網的處理速度例如為200m/分以下，較佳為0.1~100m/分，進而較佳為1~50m/分左右。
若有必要，亦可先於傳送帶賦予特定之凹凸形狀等，於將該等轉印而獲得之板製品賦予凹凸形狀等。又，亦可與其他材料積層而形成積層體，也可藉由成形加工而加工為想要之形態(圓柱狀、四角柱狀、球狀；橢圓體狀等之各種形狀)。
以此方式將纖維網之纖維部分地進行熱接合後，因為有時水分會殘留於所獲得之成形體，故亦可視需要將網加以乾燥。關於乾燥，接觸乾燥用加熱體之成形體的表面，必須在乾燥後纖維形態不會因纖維之熔融等而消失，只要可維持纖維形態，則可利用慣用之方法。例如，可使用用如不織布乾燥所使用之圓筒乾燥機或拉幅機(tenter)之大型乾燥設備，但因為殘留之水分為微量，多為藉由較輕度之乾燥手段而可乾燥的程度之情況，較佳為遠紅外線照射、微波照射、電子束照射等之非接觸法或使用熱風之方法。
進而，構成本發明之細胞培養用載體的成形體，可如上述般藉由高溫水蒸氣使濕熱接合性纖維接合而獲得，但部分亦可藉由其他之慣 用方法，例如熱壓融合(熱壓印加工等)、機械壓縮(針孔等)等之處理方法而被接合。例如，藉由濕熱接合而得之成形體彼此之接合等，亦可使用其他慣用之方法。
再者，關於濕熱接合性纖維，將纖維網浸漬於熱水亦可接合。但是，使用浸漬於熱水之方法難以控制纖維接合率，又難以獲得纖維接合率之均一性高的成形體。其原因可推測如下：由於纖維網中必然含有之空氣的影響，濕熱接合性會因位置而不同，及將此空氣擠壓出纖維網外造成之對結構的影響；將經濕熱接合之纖維網自熱水中取出時，提取滾筒(take off roller)造成之纖維內部的細微構造之變形或經提取之纖維網中所含之熱水的重量造成之上下方向的細微構造的變形之差異等。
將如上述方法獲得之成形體，藉由習知之方法(例如擠壓、裁切)進一步進行加工，可製造本發明之細胞培養用載體。
本發明提供一種使用上述之細胞培養用單體培養細胞的方法。若藉由使用上述之細胞培養用單體之本發明的細胞培養方法，可效率佳地使細胞，尤其是貼附性細胞增殖。又，若藉由本發明之細胞培養方法，可效率佳地進行立體培養。
本發明之方法可培養貼附性細胞，亦可培養懸浮性細胞。此處所謂貼附性細胞，係指於細胞培養時藉由貼附於載體而增殖之細胞，所謂懸浮性細胞，係指可微弱地附著於載體，但於細胞增殖中基本上不需要附著於載體的細胞。本發明之方法中，較佳培養貼附性細胞，更佳以使貼附性細胞附著於細胞培養用載體之狀態下進行培養。
作為懸浮性細胞，例如可列舉T細胞、B細胞、殺手細胞、 淋巴球、淋巴芽細胞等。作為貼附性細胞，例如可列舉骨母細胞、軟骨細胞、造血細胞、上皮細胞(乳腺上皮細胞等)、內皮細胞(血管內皮細胞等)、表皮細胞、纖維母細胞、源自間葉之細胞、心肌細胞、肌原細胞、平滑肌細胞、來自生物體之骨骼肌細胞、人類腫瘤細胞、纖維細胞、EB病毒突變細胞、肝細胞、腎細胞、骨髓細胞、巨噬細胞、肝實質細胞、胰臟β細胞、小腸細胞、乳腺細胞、唾腺細胞、甲狀腺細胞、皮膚細胞等。
本發明之細胞培養方法中，例如將細胞於水、培養液等之溶劑中，較佳以成為103~108細胞/ml、更佳以成為103~106細胞/ml左右之濃度懸浮，使所獲得之細胞懸浮液貼附於本發明之細胞培養用載體即可。繼而，使用適於培養對象之細胞的培養液，在適於細胞培養之條件下進行培養即可。作為上述條件，例如可舉於「培養細胞手冊 細胞培養之基本與分析方法之一切」，黑木登志夫、許南浩編，羊土社，2004年7月發行等記載之條件。
作為培養液，可舉根據細胞之慣用培養液。作為培養動物細胞之情形時的培養液，例如含有各種必需胺基酸、各種維生素、葡萄糖等醣類等之各種成分的培養基(例如達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium))等。培養液中之上述成分的含有量只要為適於培養細胞之量即可。又，作為上述培養基，例如可列舉胎牛血清(fetal bovine serum)培養基、無血清(serum-free)培養基、人類血清培養基等。
若藉由本發明之細胞培養方法，可效率佳地進行貼附性細胞之立體培養。因此，本發明之細胞培養方法對於需立足點分化而生長的細胞(例如神經細胞等)、組織或器官(血管等)之建構有用。
以下基於下述之製造例及試驗例對本發明進行詳細說明，但本發明並不限定於該等。
[製造例1(細胞培養用載體之製造)]
作為濕熱接合性纖維，準備芯成分為聚對酞酸乙二酯，鞘成分為乙烯-乙烯醇共聚物(乙烯含量44%，皂化度98.4莫耳%，MI(溫度190℃及負重2160g)5.5g/10分)之芯鞘型複合短纖維(可樂麗股份有限公司製造之sofista，平均纖度為3.3dtex，平均纖維長51mm，濕熱接合性纖維/非濕熱接合性纖維之質量比=50/50，捲曲數21個/吋，捲曲率13.5%)。使用此芯鞘型複合短纖維，藉由梳棉法製造單位面積重量為100g/m2之梳棉網，重疊3片此網製成合計單位面積重量為300g/m2之梳棉網。將此梳棉網送至裝備有50網目、寬度500mm之不鏽鋼製的無端網(endless net)之帶式輸送機。
再者，此帶式輸送機由下側傳送帶及上側傳送帶之一對傳送帶組成，兩者之傳送帶的帶內側各自設置有水蒸氣噴射噴嘴，透過帶可將高溫水蒸氣噴於所通過之網。進而，於較此噴嘴更上流側各自具備有網厚調整用的金屬滾筒(以下有時略稱為網厚調整用滾筒)。下側傳送帶之上面(即網之通過面)為平坦形狀，另一方面之上側傳送帶，形成下面沿著網厚調整用滾筒之彎曲的形狀，配置成上側傳送帶之網厚調整用滾筒與下側傳送帶之網厚調整用滾筒成對。
又，上側之傳送帶可上下地移動，藉此成為可將上側傳送帶與下側傳送帶之網厚調整用滾筒間調整為特定之間隔。進而，使上側傳送帶之上流側以相對於下流部將網厚調整用滾筒作為基點(相對於上側傳送 帶之下流側的下面)，以30°之角度傾斜，下流部彎曲成配置為與下側傳送帶成為平行。再者，於上側傳送帶上升下降之情形時，一邊保持此平行關係一邊移動。
該等之帶式輸送機各自以相同速度於相同方向旋轉，該等兩輸送帶及網厚調整用滾筒彼此一邊保持特定之間隔一邊形成可加壓之結構。此為所謂為了如砑光步驟般運作而調整水蒸氣處理前之網厚者。即，從上流側送入之梳棉網移動於下側傳送帶之上，但直至到達網厚調整用滾筒之間，與上側傳送帶的間隔慢慢變窄。而且，此間隔變得比網厚度更窄時，網被夾持於上下輸送帶間，一邊慢慢地被壓縮一邊行進。此網在成為幾乎與設置於網厚調整用滾筒之間隔相等前被壓縮，以此厚度之狀態進行水蒸氣處理，之後亦成為於傳送帶下流部一邊維持厚度一邊行進之結構。此處，網厚調整用之滾筒調整成線性負載成為50kg/cm。
繼而，對具備下側傳送帶之水蒸氣噴射裝置導入梳棉網，自此裝置將0.4MPa之高溫水蒸氣以朝向梳棉網之厚度方向通過之方式(垂直地)噴出而實施水蒸氣處理，得到具有不織纖維構造之成形體。此水蒸氣噴射裝置於下側之傳送帶內，噴嘴以隔著輸送帶網將高溫水蒸氣朝向網吹附之方式設置，吸入裝置被設置於上側之傳送帶。又，於此噴射裝置之網行進方向的下流側，設置有另一台噴嘴與吸入裝置之配置為相反之組合的噴射裝置，對網之內外兩面實施水蒸氣處理。
再者，水蒸氣噴射噴嘴之孔徑為0.3mm，使用噴嘴沿著傳送帶之寬度方向以1mm間距排列成1列的水蒸氣噴射裝置。加工速度為3m/分，噴嘴側與吸入側之上下輸送帶間之間隔(距離)設為10mm。噴嘴以於 輸送帶之內側幾乎與帶相接之方式配置。
以此方式獲得之成形體，具有板狀之形態，與一般之不織布相比非常地硬，形狀穩定性優異。又，所獲得之成形體的纖維接合率為14.4%。將以此方式獲得之成形體加工為厚度2mm之板狀，進而挖通為直徑6mm之圓盤狀而製成細胞培養用載體。將所獲得之細胞培養用載體的視密度示於表1。
[製造例2(細胞培養用載體之製造)]
作為濕熱接合性纖維，使用芯成分為聚對酞酸乙二酯，鞘成分為乙烯-乙烯醇共聚物(乙烯含量44%，皂化度98.4莫耳%，MI(溫度190℃及負重2160g)5.5g/10分)之芯鞘型複合短纖維(可樂麗股份有限公司製造之sofista，平均纖度為5.0dtex，平均纖維長51mm，濕熱接合性纖維/非濕熱接合性纖維之質量比=50/50，捲曲數16.2個/吋，捲曲率13.5%)，重疊10片單位面積重量100g/cm2之梳棉網製成合計單位面積重量1000g/m2之梳棉網，除了將上下輸送帶間之間隔(距離)設為20mm以外，以與製造例1相同之方式得到成形體(纖維接合率23.1%)。此成形體亦與製造例1所獲得之成形體大致相同地具有板狀形態，與一般之不織布相比，形狀穩定性優異。將以此方式獲得之成形體加工為厚度2mm之板狀，進而挖通為直徑6mm之圓盤狀而製成細胞培養用載體。將所獲得之細胞培養用載體的視密度示於表1。
[製造例3(細胞培養用載體之製造)]
作為濕熱接合性纖維，使用芯成分為聚對酞酸乙二酯，鞘成分為乙烯-乙烯醇共聚物(乙烯含量44%，皂化度98.4莫耳%，MI(溫度190℃及負重 2160g)5.5g/10分)之芯鞘型複合短纖維(可樂麗股份有限公司製造之sofista，平均纖度為3.3dtex，平均纖維長51mm，濕熱接合性纖維/非濕熱接合性纖維之質量比=50/50，捲曲數21個/吋，捲曲率13.5%)，重疊2片單位面積重量75g/m2之梳棉網製成合計單位面積重量150g/m2之梳棉網，除了將上下輸送帶間之間隔(距離)設為2mm以外，以與製造例1相同之方式得到成形體(纖維接合率33.6%)。此成形體亦與製造例1所獲得之成形體大致相同地具有板狀形態，與一般之不織布相比非常地硬，形狀穩定性優異。將以此方式獲得之成形體加工為厚度2mm之板狀，進而挖通為直徑6mm之圓盤狀而製成細胞培養用載體。將所獲得之細胞培養用載體的視密度示於表1。
[製造例4(細胞培養用載體之製造)]
作為濕熱接合性纖維，使用芯成分為聚對酞酸乙二酯，鞘成分為乙烯-乙烯醇共聚物(乙烯含量44%，皂化度98.4莫耳%，MI(溫度190℃及負重2160g)5.5g/10分)之芯鞘型複合短纖維(可樂麗股份有限公司製造之sofista，平均纖度為1.7dtex，平均纖維長51mm，濕熱接合性纖維/非濕熱接合性纖維之質量比=50/50，捲曲數22.9個/吋，捲曲率12.2%)，重疊7片單位面積重量100g/m2之梳棉網製成合計單位面積重量700g/m2之梳棉網，除了將上下輸送帶間之間隔(距離)設為7mm以外，以與製造例1相同之方式得到成形體(纖維接合率26.7%)。此成形體亦與製造例1所獲得之成形體大致相同地具有板狀形態，與一般之不織布相比非常地硬，形狀穩定性優異。將以此方式獲得之成形體加工為厚度2mm之板狀，進而挖通為直徑6mm之圓盤狀而製成細胞培養用載體。將所獲得之細胞培養用載體的 視密度示於表1。
[試驗例1(細胞培養)]
將製造例1之細胞培養用載體以80重量%之乙醇水溶液洗淨2次。其後，將上述細胞培養用載體以注射用蒸餾水洗淨3次後，進行乾燥。繼而，以最終細胞濃度成為5×105細胞/ml、5×106細胞/ml、5×107細胞/ml之方式，將MC3T3-E1小鼠類骨母細胞(貼附性細胞)懸浮於伊格爾氏基本成分培養基(Eagle's minimal essential medium)(α-MEM，含10重量%之胎牛血清，GIBCO公司製造)，製作細胞懸浮液。將上述細胞懸浮液0.05ml滴加至上述細胞培養用載體，靜置2小時。其後，於上述細胞培養用載體進一步靜靜地加入上述伊格爾氏基本成分培養基1ml，將上述細胞培養用載體移至37℃之二氧化碳培養箱(5體積%之二氧化碳)，培養7日。開始培養1日後、4日後及7日後，取出上述細胞培養用載體。其後，於上述細胞培養用載體靜靜地加入作為固定液之10重量%的中性緩衝甲醛水溶液(和光純藥製)，於4℃將培養細胞固定一晚。除去固定液後，於上述細胞培養載體加入吉姆沙染色液(和光純藥：原液)1ml，於室溫將培養細胞染色1小時。除去染色液後，將剩餘之染色液至上清液之藍色消失為止，使用異丙醇洗淨上述細 胞培養用載體5~10次。洗淨後之上述細胞培養用載體之照片示於圖1。
自圖1可知，藉由使用製造例1之細胞培養用載體，細胞之增殖可效率佳地進行。其原因在於，製造例1之細胞培養用載體令用於細胞培養之培養基成分或氧等充分地通過。進而，於吉姆沙染色中，細胞培養用載體未被染色，僅培養細胞被染色，故細胞增殖之評價容易。
為了比較，使用市售之細胞培養用載體(高研股份有限公司製造，「Honeycomb Disc 96」，膠原蛋白製，厚度2mm，直徑6mm之圓盤狀)，與上述同樣地進行細胞培養。具體而言，以最終細胞濃度成為5×105細胞/ml、5×106細胞/ml、5×107細胞/ml之方式，將MC3T3-E1小鼠類骨母細胞(貼附性細胞)懸浮於伊格爾氏基本成分培養基(Eagle's minimal essential medium)(α-MEM，含10重量%之胎牛血清，GIBCO公司製造)，製作細胞懸浮液。將上述細胞懸浮液0.05ml滴加於市售之膠原蛋白製細胞培養用載體，靜置2小時。其後，以上述方法進行觀察。將其結果示於圖2。由圖2明瞭，於使用市售之膠原蛋白製細胞培養用載體之情形時，在吉姆沙染色時不僅培養細胞，細胞培養用載體亦被染色，細胞增殖之評價困難。
又，為了比較，使用市售之細胞培養用載體(GC公司製造，「GC研究用scaffold(block HAP+)」乳酸系聚合物(PLGA)與羥磷灰石(HAP)之混和物質(hybrid material)，厚度2mm，直徑5mm之圓盤狀)，與上述同樣地進行細胞培養。具體而言，以最終細胞濃度成為5×105細胞/ml、5×106細胞/ml、5×107細胞/ml之方式，將MC3T3-E1小鼠類骨母細胞(貼附性細胞)懸浮於伊格爾氏基本成分培養基(Eagle's minimal essential medium)(α-MEM，含10重量%之胎牛血清，GIBCO公司製造)，製作細胞懸浮液。將 上述細胞懸浮液0.05ml滴加於市售之膠原蛋白製細胞培養用載體，靜置2小時。其後，以上述方法進行觀察。此市售之細胞培養用載體之疏水性高，使用製造例1之細胞培養用載體之上述方法無法將細胞導入細胞培養用載體中進行培養。
[試驗例2(形狀穩定性)]
使用數位式測微計測量製造例1~4之細胞培養用載體及市售之細胞培養用載體(高研股份有限公司製造，「Honeycomb Disc 96」，膠原蛋白製，厚度2mm，直徑6mm之圓盤狀)的尺寸。其後，將上述細胞培養用載體以80重量%之乙醇水溶液洗淨2次，以注射用蒸餾水洗淨3次後，進行乾燥。繼而，將伊格爾氏基本成分培養基(α-MEM，含10重量%之胎牛血清，GIBCO公司製造)1ml靜靜地滴加至上述細胞培養用載體，將上述細胞培養用載體移至37℃之二氧化碳培養箱(二氧化碳濃度：5體積%)，培養10日。開始培養10日後，取出上述細胞培養用載體。其後，使用數位式測微計測量細胞培養用載體之尺寸。由所測量之結果計算底面積保持率(%)(=100×培養後之底面積/培養前之底面積)、高度保持率(%)(=100×培養後之高度/培養前之高度)、體積保持率(%)(=100×培養後之體積/培養前之體積)。將該等結果示於表2。
製造例1~4之細胞培養用載體於10日之培養後，自培養箱取出時之尺寸變化少，形狀穩定性優異。由該等結果可知，製造例1~4之細胞培養載體之處理性優異。另一方面，所使用的市售之膠原蛋白製細胞培養用載體為形狀穩定性差，處理性差者。
本發明之細胞培養用載體具有成為細胞的立足點之充分寬廣度的細胞接合面，且形狀穩定性優異。因此，若使用本發明之細胞培養用載體，可效率佳地進行細胞培養(尤其是貼附性細胞之立體培養)。又，本發明之細胞培養用載體，可利用作為用於生產細胞製造之產物的生物反應器用之細胞培養用載體。又，若藉由使用上述載體之本發明的細胞培養方法，可效率佳地進行細胞培養(尤其是貼附性細胞之立體培養)，功能性組織之生產變得可能。
本案以在日本申請之特願2014-039047號為基礎，其內容全部包含於本說明書中。

Claims (6)

  1. 一種細胞培養用載體，係由含有濕熱接合性纖維且具有不織纖維構造之成形體形成，具有0.02~0.7g/cm3之視密度。
  2. 如申請專利範圍1之細胞培養用載體，其中，該濕熱接合性纖維為乙烯-乙烯醇系共聚物與非濕熱接合性樹脂形成之複合纖維。
  3. 如申請專利範圍1之細胞培養用載體，其中，該濕熱接合性纖維為由以乙烯-乙烯醇系共聚物構成之鞘部與以聚酯系樹脂構成之芯部形成的芯鞘型複合纖維。
  4. 一種細胞培養方法，使用申請專利範圍第1~3項中任一項之細胞培養用載體。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中，該細胞為貼附性細胞。
  6. 如申請專利範圍第4項之方法，其中，於將貼附性細胞貼附於細胞培養用載體之狀態下進行培養。
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