KR20160027254A - 디아릴티오히단토인 화합물 - Google Patents

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동원 유
찰스 엘. 소여스
크리스 트랜
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더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 발명은 디아릴티오히단토인 화합물, 이의 합성 방법 및 호르몬 불응성 전립선 암의 치료에서의 이의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

디아릴티오히단토인 화합물 {DIARYLTHIOHYDANTOIN COMPOUNDS}
본 발명은 디아릴티오히단토인을 비롯한 디아릴히단토인 화합물, 이의 합성 방법 및 호르몬 불응성 전립선 암의 치료에서의 이의 사용 방법에 관한 것이다. 본원은 동일한 출원인에 의한 PCT/US2006/011417을 참고로 포함한다.
전립선 암은 서구인들에게 있어서 가장 보편적으로 발생되는 암이며, 암 사망의 제2 주요 원인이다. 암이 국소적으로 국한된 경우, 그 질환은 수술 또는 방사선에 의해 치유될 수 있다. 그러나, 상기 암의 30％는 원격 전이성 질환으로 재발되며, 나머지는 진단시에 진행성 질환을 나타낸다. 진행성 질환은 거세 및/또는 항-안드로겐의 투여, 소위 안드로겐 차단 요법에 의해 치료된다. 거세는 안드로겐의 순환 수준을 낮추고, 안드로겐 수용체 (AR)의 활성을 감소시킨다. 항-안드로겐의 투여는 안드로겐 결합과 경쟁함으로써 AR의 기능을 차단하며, 따라서 AR 활성을 감소시킨다. 이러한 치료는 초기에는 효과적이지만, 급속히 약해지며 암이 호르몬 불응성이 되게 한다.
최근에, AR의 과다발현이 호르몬 불응성 전립선 암의 원인으로서 확인 및 입증되었다 (본원에 참고로 도입된 문헌 [Chen, C.D., Welsbie, D.S., Tran, C., Baek, S.H., Chen, R., Vessella, R., Rosenfeld, M.G., and Sawyers, C.L., Molecular determinants of resistance to antiandrogen therapy, Nat. Med., 10: 33-39, 2004] 참조). AR의 과다발현은 호르몬 불응성 전립선 암에 감수성인 호르몬으로부터 진행되기에 충분하므로, 이는 현행의 약물보다 우수한 AR 억제제가 전립선 암의 진행을 지연시킬 수 있음을 시사한다. AR 및 이의 리간드 결합이 호르몬 불응성 전립선 암의 성장에 필수적인 것으로 입증되었으며, 이는 AR이 여전히 상기 질환에 대한 표적임을 나타낸다. 또한, AR의 과다발현으로 인해 호르몬 불응성 전립선 암에서 항-안드로겐이 길항제에서 효능제로 전환된다는 것이 입증되었다 (AR 길항제는 AR의 활성을 억제하며, AR 효능제는 AR의 활성을 자극시킴). 이러한 연구로부터의 데이터는 거세 및 항-안드로겐이 전립선 암의 진행을 막지 못하는 이유를 설명하며, 호르몬 불응성 전립선 암의 인식되지 않은 특성을 나타낸다.
비칼루트아미드 (상품명: 카소덱스(Casodex))는 가장 통상적으로 사용되는 항-안드로겐이다. 이는 호르몬 감수성 전립선 암에서 AR에 대해 억제 효과를 갖지만, 암이 호르몬 불응성인 경우에는 AR을 억제하지 못한다. 현행 항-안드로겐의 2가지 단점은 호르몬 감수성 단계로부터 호르몬 불응성 질환으로의 전립선 암의 진행을 막지 못하며, 호르몬 불응성 전립선 암을 효과적으로 치료하지 못한다는 것이다. AR이 호르몬 불응성 전립선 암에서 과다발현되는 경우, 하나는 이의 약한 길항제 활성이고 다른 하나는 이의 강한 효능제 활성이다. 따라서, 보다 강력한 길항제 활성 및 최소의 효능제 활성을 갖는 보다 우수한 AR 억제제가 질환의 진행 지연 및 치명적인 호르몬 불응성 전립선 암의 치료를 위해 요구된다.
비스테로이드성 항-안드로겐, 예컨대 비칼루트아미드는 보다 선택적이며 부작용이 더 적기 때문에 전립선 암에 대한 스테로이드성 화합물보다 바람직하다. 이러한 부류의 화합물은 다수의 특허, 예컨대 미국 특허 제4,097,578호, 미국 특허 제5,411,981호, 미국 특허 제5,705,654호, PCT 국제 출원 WO 97/00071 및 WO 00/17163, 및 미국 공개 특허 출원 제2004/0009969호 (이들 모두는 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다.
미국 특허 제5,434,176호는 다수의 화합물을 포함하는 광범위한 청구의 범위를 포함하나, 이들 화합물 중 일부에 대한 합성 경로만이 제공되었으며, 약리 데이터는 이들 중 2종에 대해서만 제공되어 당업자는 다른 특정 화합물을 용이하게 도출해 낼 수 없다.
호르몬 불응성 전립선 암의 메카니즘이 공지되지 않았기 때문에, 호르몬 불응성 전립선 암에 대한 상기 특허에 기재된 화합물의 효과에 대해 이들 화합물을 시험하기 위한 생물학적 시스템은 존재하지 않는다. 특히, 억제제를 길항제에서 효능제로 전환시키는, 호르몬 불응성 전립선 암에서의 AR 과다발현의 능력은 인식되지 못했다. 호르몬 불응성 전립선 암의 특정한 신규 특성은 PCT 출원 US04/42221 및 US05/05529에 보고되어 있으며, 상기 출원은 참고로 본원에 도입되어 있다. PCT 국제 출원 US05/05529는 안드로겐 수용체 길항제를 확인하는 방법 및 화합물의 효능제 특성을 제시한다. 그러나, 제조된 각 화합물에 대해, 화합물의 길항제 및 효능제 특성을 결정하는 시간 소모적 과정을 거쳐야 한다. 즉, 화합물 단독의 화학적 구조로부터 전립선 암을 치료하기에 적절한 특성을 정확하게 예측하기 위한 방법이 없다.
일부 화합물은 리간드 결합 도메인 (LBD) 안드로겐 수용체 (AR)의 억제제인 것으로 보고되었다. 몇몇은 전립선 암을 치료하기 위한 약물, 예컨대 비칼루트아미드 (카소덱스)로서 사용되고 있다. 티오히단토인, RU59063 및 BTID와 같은 AR LBD의 수개의 결합제가 확인되었다 (문헌 [Teutsch, G.; Goubet, F.; Battmann, T.; Bonfils, A.; Bouchoux, F.; Cerede, E.; Gofflo, D.; Gaillard-Kelly, M.; Philibert. D. J., Steroid Boichem. Molec. Biol. 1994, 48, 111-119]; [Van Dort, M. E.; Robins, D. M.; Wayburn, B., J. Med. Chem. 2000, 43, 3344-3347]).
바람직한 약리 특성을 갖는 신규 티오히단토인 화합물, 및 이를 제조하기 위한 합성 경로가 요구된다. 활성은 작은 구조적 변화에도 민감하기 때문에, 한 화합물이 전립선 암을 치료하는데 효과적일 수 있는 반면, 하나의 치환기의 대체에 의해 제1 화합물과 단지 약간만 상이할지라도 제2 화합물은 효과적이지 못할 수 있다.
안드로겐 활성의 길항작용에 대해 고도의 효능을 가지며 최소의 효능제 활성을 갖는 화합물의 확인은 호르몬 불응성 전립선 암 (HRPC)을 극복해야 하고, 호르몬 감수성 전립선 암 (HSPC)의 진행을 막거나 지연시켜야 한다. 따라서, 안드로겐 수용체의 선택적 조정자, 예컨대 비-스테로이드성, 무독성 및 조직 선택적인 조정자의 확인이 당업계에서 요구된다.
<발명의 요약>
본 발명은 AR에 대해 최소의 효능제 활성을 가지면서 강력한 길항제 활성을 갖는 일련의 화합물을 제공한다. 이러한 화합물은 호르몬 불응성 전립선 암의 성장을 억제한다.
본 발명의 특정 화합물은 하기를 포함한다:
[NC54]
Figure pat00001
[NC55]
Figure pat00002
[NC56]
Figure pat00003
[NC57]
Figure pat00004
본 발명은 또한 치료적 유효량의 상기 화합물들 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 과증식성 장애의 치료가 필요한 대상체에게 상기 제약 조성물을 투여함으로써 과증식성 장애를 치료하는 것을 포함하는, 과증식성 장애의 치료 방법을 포함한다. 과증식성 장애는 호르몬 불응성 전립선 암일 수 있다. 투여량은 일일 체중 kg 당 약 0.001 mg 내지 일일 체중 kg 당 약 100 mg, 일일 체중 kg 당 약 0.01 mg 내지 일일 체중 kg 당 약 100 mg, 일일 체중 kg 당 약 0.1 mg 내지 일일 체중 kg 당 약 10 mg의 범위, 또는 일일 체중 kg 당 약 1 mg일 수 있다.
본 발명의 화합물은 정맥내 주사에 의해, 조직으로의 주사에 의해, 복강내로, 경구로 또는 비내로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 용액제, 분산액제, 현탁액제, 분말제, 캡슐제, 정제, 환제, 지속형(time release) 캡슐제, 지속형 정제 및 지속형 환제로 이루어진 군으로부터 선택된 형태를 가질 수 있다.
투여되는 화합물은 NC54, NC55, NC56 또는 NC57, 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 투여되는 화합물은 NC53 또는 그의 제약상 허용되는 염일 수 있다.
본 발명은 N-메틸-2-플루오로-4-(1,1-디메틸-시아노메틸)-아미노벤즈아미드 및 4-이소티오시아네이토-2-트리플루오로메틸벤조니트릴을 DMF 중에서 혼합하고 가열하여 제1 혼합물을 형성한 다음 상기와 같이 가공처리하는 것을 포함하는, NC54의 합성 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 N-메틸-2-플루오로-4-(1-시아노시클로펜틸)아미노벤즈아미드, 4-이소티오시아네이토-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 및 DMF를 혼합하고, 환류 가열하여 제1 혼합물을 형성한 다음 상기와 같이 가공처리하는 것을 포함하는, NC55의 합성 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 N,N-디메틸 4-[4-(1-시아노시클로부틸아미노)페닐]부탄아미드, 4-이소티오시아네이토-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 및 DMF를 혼합하고, 환류 가열하여 제1 혼합물을 형성한 다음 상기와 같이 가공처리하는 것을 포함하는, NC56의 합성 방법을 제공한다.
본 발명은 DMSO, 디클로로메탄 및 옥살릴 클로라이드를 혼합하여 제1 혼합물을 형성하고; 4-(4-(7-(4-시아노-3-(트리플루오로메틸)페닐)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥탄-5-일)페닐)부탄아미드를 상기 제1 혼합물에 첨가하여 제2 혼합물을 형성하고; 트리에틸아민을 상기 제2 혼합물에 첨가하여 제3 혼합물을 형성하고; 상기 제3 혼합물을 가온하고, 수성 NH4Cl을 사용하여 켄칭시켜 제4 혼합물을 형성하고; 상기 제4 혼합물로부터 유기 층을 추출하고; 상기 유기 층으로부터 화합물을 단리하는 것을 포함하는, NC57의 합성 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 화합물은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pat00005
식 중,
R1 및 R2는 독립적으로 메틸이거나, 또는 이들이 결합된 탄소와 함께 4 내지 5개 탄소 원자의 시클로알킬기이고, R3은 카르바모일, 알킬카르바모일, 카르바모일알킬, 알킬카르바모일알킬, 시아노 및 시아노알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R4는 수소 또는 불소이다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 치료적 유효량의 제1항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다.
본 발명의 화합물은 예를 들어, 하기 화학식을 갖는다:
[NC53]
Figure pat00006
[NC54]
Figure pat00007
[NC55]
Figure pat00008
[NC56]
Figure pat00009
[NC57]
Figure pat00010
제약 조성물은 치료적 유효량의 화합물 NC54 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 제약 조성물은 치료적 유효량의 화합물 NC55 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 과증식성 장애의 치료 방법은 과증식성 장애의 치료가 필요한 대상체에게 제2항의 제약 조성물을 투여함으로써 과증식성 장애를 치료하는 것을 포함한다.
본 발명의 조성물은 예를 들어, 용액제, 분산액제, 현탁액제, 분말제, 캡슐제, 정제, 환제, 지속형 캡슐제, 지속형 정제 및 지속형 환제로 이루어진 군으로부터 선택된 형태를 가질 수 있다. 본 발명의 화합물은 정맥내 주사에 의해, 조직으로의 주사에 의해, 복강내로, 경구로 또는 비내로 투여할 수 있다. 조성물은 일일 체중 kg 당 약 0.001 mg 내지 일일 체중 kg 당 약 100 mg 범위의 화합물의 양으로 투여될 수 있다. 조성물은 일일 체중 kg 당 약 0.01 mg 내지 일일 체중 kg 당 약 100 mg 범위의 화합물의 양으로 투여될 수 있다. 조성물은 일일 체중 kg 당 약 0.1 mg 내지 일일 체중 kg 당 약 10 mg 범위의 화합물의 양으로 투여될 수 있다. 조성물은 일일 체중 kg 당 약 1 mg의 화합물의 양으로 투여될 수 있다.
전립선 암의 치료가 필요한 대상체에게 제약 조성물을 투여함으로써 전립선 암을 치료하는 것을 포함하는, 전립선 암의 치료 방법이 있다. 제약 조성물은 전립선 특이 항원 mRNA의 전사를 방해할 수 있다. 제약 조성물은 안드로겐 수용체 단백질의 핵 전위를 방지할 수 있다. 제약 조성물은 안드로겐 수용체 단백질을 불안정하게 할 수 있다. 이러한 조성물은 경구로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 캡슐제, 정제 및 환제로 이루어진 군으로부터 선택된 형태를 가질 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 NC54, NC55, NC56, NC57, 이들 중 어느 하나의 제약상 허용되는 염, 또는 이들의 조합일 수 있다.
하기 화학식의 디아릴 화합물의 합성 방법은 화학식 I의 화합물을 제1 극성 용매 중에서 화학식 II의 화합물과 혼합하여 혼합물을 형성하고, 혼합물을 가열하고, 제1 극성 용매와 동일하거나 상이한 제2 극성 용매 및 수성 산을 상기 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 환류하고, 혼합물을 냉각시키고, 물과 합하고, 상기 혼합물로부터 디아릴 화합물을 분리하는 것을 포함한다:
Figure pat00011
<화학식 I>
Figure pat00012
<화학식 II>
Figure pat00013
식 중, R51은 1 내지 4개 탄소 원자의 알킬 쇄를 포함할 수 있다. R52는 시아노, 히드록시, 메틸카르바모일, 메틸카르바모일-치환된 알킬, 메틸술폰카르바모일-치환된 알킬, 메틸아미노메틸, 디메틸아미노메틸, 메틸술포닐옥시메틸, 메톡시카르보닐, 3-시아노-4-트리플루오로메틸페닐카르바모일, 카르바모일-치환된 알킬, 카르복시메틸, 메톡시카르보닐메틸, 메탄술포닐, 4-시아노-3-트리플루오로메틸페닐카르바모일-치환된 알킬, 카르복시-치환된 알킬, 4-메탄술포닐-1-피페라지닐, 피페라지닐, 히드록시에틸카르바모일-치환된 알킬 또는 히드록시에톡시카르보닐-치환된 알킬일 수 있다. R53은 F 및 H로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, R51은 1 내지 2개 탄소 원자의 알킬 쇄를 포함하고, R52는 카르바모일 및 메틸카르바모일로 이루어진 군으로부터 선택되고, R53은 F이다.
하기 화학식의 화합물 [NC53]의 합성 방법은 4-이소티오시아네이토-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 및 N-메틸-4-(1-시아노시클로부틸아미노)-2-플루오로벤즈아미드를 디메틸포름아미드 중에서 혼합하여 제1 혼합물을 형성하고, 상기 제1 혼합물을 가열하여 제2 혼합물을 형성하고, 알콜 및 산을 상기 제2 혼합물에 첨가하여 제3 혼합물을 형성하고, 상기 제3 혼합물을 환류하여 제4 혼합물을 형성하고, 상기 제4 혼합물을 냉각시키고 물과 합하고 유기 층을 추출하고, 상기 유기 층으로부터 화합물을 단리하는 것을 포함할 수 있다.
Figure pat00014
제4항의 화합물 [NC54]의 합성 방법은 N-메틸-2-플루오로-4-(1,1-디메틸-시아노메틸)-아미노벤즈아미드 및 4-이소티오시아네이토-2-트리플루오로메틸벤조니트릴을 DMF 중에서 혼합하고 가열하여 제1 혼합물을 형성하고, 알콜 및 산을 상기 제1 혼합물에 첨가하여 제2 혼합물을 형성하고, 상기 제2 혼합물을 환류하고 냉각시키고 물과 합하고 유기 층을 추출하고 유기 층으로부터 화합물을 단리하는 것을 포함할 수 있다.
제6항의 화합물 [NC55]의 합성 방법은 N-메틸-2-플루오로-4-(1-시아노시클로펜틸)아미노벤즈아미드, 4-이소티오시아네이토-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 및 DMF를 혼합하고 환류 가열하여 제1 혼합물을 형성하고, 알콜 및 산을 상기 제1 혼합물에 첨가하여 제2 혼합물을 형성하고, 상기 제2 혼합물을 환류하고 냉각시키고 물과 합하고 유기 층을 추출하고 유기 층으로부터 화합물을 단리하는 것을 포함할 수 있다.
제8항의 화합물 [NC56]의 합성 방법은 N,N-디메틸 4-[4-(1-시아노시클로부틸아미노)페닐]부탄아미드, 4-이소티오시아네이토-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 및 DMF를 혼합하고 환류 가열하여 제1 혼합물을 형성하고, 알콜 및 산을 상기 제1 혼합물에 첨가하여 제2 혼합물을 형성하고, 상기 제2 혼합물을 환류하고 냉각시키고 물과 합하고 유기 층을 추출하고 유기 층으로부터 화합물을 단리하는 것을 포함할 수 있다.
제9항의 화합물 [NC57]의 합성 방법은 DMSO, 디클로로메탄 및 옥살릴 클로라이드를 혼합하여 제1 혼합물을 형성하고, 4-(4-(7-(4-시아노-3-(트리플루오로메틸)페닐)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥탄-5-일)페닐)부탄아미드를 상기 제1 혼합물에 첨가하여 제2 혼합물을 형성하고, 트리에틸아민을 상기 제2 혼합물에 첨가하여 제3 혼합물을 형성하고, 상기 제3 혼합물을 가온하고 수성 NH4Cl을 사용하여 켄칭시켜 제4 혼합물을 형성하고, 상기 제4 혼합물로부터 유기 층을 추출하고, 유기 층으로부터 화합물을 단리하는 것을 포함할 수 있다.
방법은 1종 이상의 디아릴티오히단토인 화합물을 제공하고; 상기 화합물에 대한 안드로겐 수용체 활성의 억제율을 측정하고, 상기 억제율이 미리 측정된 제1 수준 초과인지의 여부를 결정하고; 상기 화합물에 대한 호르몬 불응성 암 세포에서 안드로겐 수용체 활성의 자극률을 측정하고, 상기 자극률이 미리 측정된 제2 수준 미만인지의 여부를 결정하고; 억제율이 미리 측정된 제1 수준 초과이고 자극률이 미리 측정된 제2 수준 미만인 경우의 화합물을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 미리 측정된 수준은 비칼루트아미드의 수준일 수 있다. 억제율의 측정은 AR 반응 리포터 시스템 또는 전립선 특이적 항원 분비 시스템에서 억제 농도 (IC50)를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 자극률의 측정은 AR 반응 리포터 시스템 또는 전립선 특이적 항원 분비 시스템에서 농도 증가에 의한 유도 배수를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 억제율 및/또는 자극률의 측정은 동물에서 종양 성장에 대한 화합물의 효과를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 안드로겐 수용체 활성의 억제율 및/또는 자극률의 측정 단계는 화합물에 대한 안드로겐 수용체의 결합 친화도를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 안드로겐 수용체 활성의 억제율 및/또는 자극률의 측정 단계는 1종 이상의 전립선 특이 항원 인핸서 및 전립선 특이 항원 프로모터에 대한 안드로겐 수용체 동원의 방지를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 안드로겐 수용체 활성의 억제율 및/또는 자극률의 측정 단계는 안드로겐 수용체 핵 전위의 방지를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 안드로겐 수용체 활성의 억제율 및/또는 자극률의 측정 단계는 안드로겐 수용체 단백질의 불안정화를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
방법은 전립선 특이 항원을 발현할 수 있는 포유류 세포를 충분한 양의 디아릴티오히단토인 화합물과 접촉시켜 전립선 특이 항원 mRNA의 전사를 방해하는 것을 포함할 수 있다. 디아릴티오히단토인 화합물은 NC53, NC54, NC55, NC56 및 NC57로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 화합물은 전립선 특이 항원 유전자 상에서의 전사 복합체의 형성을 방지할 수 있다. 본 발명의 화합물은 안드로겐 수용체 단백질이 전립선 특이 항원 유전자와 복합체화되는 것을 방지할 수 있다. 본 발명의 화합물은 RNA 폴리머라제 II가 전립선 특이 항원 유전자와 복합체화되는 것을 방지할 수 있다.
방법은 포유류 세포를 충분한 양의 디아릴티오히단토인 화합물과 접촉시켜 안드로겐 수용체 단백질의 핵 전위를 방지하고/거나 안드로겐 수용체 단백질을 불안정하게 하는 것을 포함한다.
하기 도면은 특정 화합물의 약리 실험 결과를 나타낸다.
도 1은 LNCaP-AR에 대한 비칼루트아미드의 효능제 효과를 도시하는 그래프이다 (AR-과다발현된 호르몬 불응성 전립선 암에서 비칼루트아미드의 효능제 활성). 과다발현된 AR을 갖는 LNCaP 세포를 R1881의 부재 하에, 비히클로서 증가하는 농도의 DMSO 또는 비칼루트아미드로 처치하였다. AR 반응 리포터의 활성을 측정하였다.
도 2는 LNCaP-AR에 대한 비칼루트아미드의 길항제 분석을 도시하는 그래프이다 (호르몬 감수성 전립선 암에서 비칼루트아미드의 효능제 활성). LNCaP 세포를 R1881의 부재 하에, 비히클로서 증가하는 농도의 DMSO 또는 비칼루트아미드로 처치하였다. AR 반응 리포터의 활성을 측정하였다.
도 3은 LNCaP-AR에 대한 화합물의 효과를 도시하는 그래프이다.
도 4는 LNCaP-AR에 대한 억제 효과를 도시하는 그래프이다.
도 5는 AR-과다발현된 LNCaP 이종이식편 모델의 PSA 발현에 대한 억제 효과이다. 마우스를 비히클, 0.1, 1 또는 10 mg/kg의 실시예 7-3b (NC7)로 44일 동안 1일 1회 경구로 처치하였다. 처치 44일 후에 마우스로부터 종양을 취하고, 종양 용해물을 추출하고, 조직 용해물 중 PSA 수준을 ELISA에 의해 측정하였다.
도 6은 비히클 용액, 카소덱스 및 NC53으로의 처치에 대해 시간 함수로서의 종양 부피의 그래프이다.
도 7은 종양 크기의 그래프이다. AR 과다발현 LNCaP 세포를 거세한 SCID 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 종양이 약 100 mm3에 이르렀을 때, 이들을 5개의 군으로 무작위화하였다. 각 군은 9 마리의 동물로 이루어졌다. 마우스가 상기 종양 부피에 도달한 후, 10 또는 50 mg/kg의 비히클, 비칼루트아미드 또는 NC53을 매일 경구로 제공하였다. 캘리퍼(caliper)를 이용하여 삼차원적으로 종양의 폭, 길이 및 깊이를 측정하였다.
도 8은 종양 크기의 실험 결과를 도시한다. 18일째에, 최종 투여한지 3시간 후 광학 CCD 카메라를 통해 동물을 영상화하였다. 루시퍼라제 활성 측정 (광자/초)을 위해 종양에 대해 ROI를 유도하였다. 오른쪽 패널은 ROI 측정치의 표식이다.
도 9는 정맥내 투여 (위쪽 곡선) 및 경구 투여 (아래쪽 곡선)로부터 NC53의 약동학 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 10은 래트 안드로겐 수용체에 대한 몇몇 화합물의 결합 친화도를 반영하는, 농도의 로그 함수로서 형광 흡광도의 그래프이다.
도 11은 카소덱스 또는 NC53이 첨가된 경우, PSA 인핸서 및 PSA 프로모터에 대한 안드로겐 수용체 및 RNA 폴리머라제 II의 복합체화 상태를 반영하는 영상을 나타낸다.
도 12는 카소덱스는 존재하나 NC53은 존재하지 않는 경우, 안드로겐 수용체가 핵 안으로 전위하는 것을 반영하는 영상을 나타낸다.
도 13은 카소덱스는 존재하나 NC53은 존재하지 않는 경우, 안드로겐 수용체가 핵 안으로 전위하는 것을 반영하는 영상을 나타낸다.
도 14는 안드로겐 수용체 단백질이 NC53의 존재 하에 분해되는 것을 반영하는 영상을 나타낸다.
도 15는 다양한 화합물로 처치한 후 전립선의 중량을 도시하는 차트이다. 일일 체중 kg 당 10, 25 또는 50 mg의 화합물을 막대에 표시하여 제시된 바와 같이 투여하였다. 건강한 FVB 마우스에게 화합물을 투여하였다. 14일 동안 화합물로 처치한 후, 정낭, 전립선 및 방광을 제거하여 칭량함으로써 비뇨생식기 관의 중량을 측정하였다. 3 마리의 마우스에게 제시된 화합물을 투여하여, 차트에서 막대로써 나타낸 데이터를 얻었다. 한 세트의 마우스는 화합물로 처치하지 않았고, 데이터는 막대에 "미처리"로 표시하여 나타냈다. 또다른 세트의 마우스는 비히클 용액만으로 처치하였고, 데이터는 막대에 "비히클"로 표시하여 나타냈다.
도 16은 도 6에 제시된 실험 프로토콜에 따라 수행한 PSA 분석을 나타내는 그래프이다.
도 17은 종양 부피에 대한 NC53의 다양한 투여 요법의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 18은 일일 체중 kg 당 0.1, 1 및 10 mg 양의 NC53으로 처치한 후 및 NC53으로 처치하지 않은 후, 0일째와 비교하여 17일째의 루시퍼라제 활성과 관련된 광자 방출률을 나타내는 그래프이다.
도 19는 SCID 마우스에 LN-AR (HR) 세포주를 주사하여 종양 성장을 유도한 실험의 결과를 나타낸다. 한 세트의 마우스는 일일 체중 kg 당 10 mg 양의 화합물 NC53으로 처치하였고, 다른 세트의 마우스는 비히클 용액만으로 처치하였다. (A) 각 세트의 마우스에 대해 시간의 함수로서 도시한 상대적 종양 부피. (B) 색상 윤곽으로 도시한, 31일째의 루시퍼라제 활성과 관련된 광자 방출로의 각 세트의 마우스의 영상. (C) 각 세트의 마우스에 대해 여러 시간에서 도시한 루시퍼라제 활성과 관련된 광자 방출률.
도 20은 다양한 농도의 NC53, NC54, NC55, NC57 및 비히클 용액으로 처치된 LN-AR 세포와 관련된 PSA 흡광도를 나타내는 그래프이다.
도 21은 다양한 농도의 NC7, NC48, NC53, 비칼루트아미드 및 DMSO로 처치된 LN-CaP 세포와 관련된 PSA 흡광도를 나타내는 그래프이다.
도 22는 야생형 비-트랜스제닉 마우스 (WT), 거세한 루시퍼라제 트랜스제닉 마우스 (Cast) 및 거세하지 않은 루시퍼라제 트랜스제닉 마우스 (Intact)를 이용하여 수행한 실험 결과를 나타낸다. 90일의 방출 기간으로 체중 kg 당 12.5 mg을 수득하는 이식된 테스토스테론 펠렛으로 처치된 거세한 루시퍼라제 트랜스제닉 마우스 (T/Cast)에 대해 데이터를 도시하였고, 90일의 방출 기간으로 체중 kg 당 12.5 mg을 수득하는 이식된 테스토스테론 펠렛으로 처치된 거세하지 않은 루시퍼라제 트랜스제닉 마우스 (Intact+T)에 대해 데이터를 도시하였다. 이식된 테스토스테론 펠렛, 및 일일 체중 kg 당 10 mg의 비칼루트아미드 (BIC+T/Cast) 또는 NC53 (NC53+T/Cast)으로 처치된 거세한 루시퍼라제 트랜스제닉 마우스에 대해 데이터를 도시하였다. (A) 14일째에 비뇨생식기 관의 중량. (B) 14일째에 광자 방출률. 모든 경우, 호르몬 불응성 질환 상태는 유도되지 않았다.
도 23은 다양한 양의 여러 화합물로 처치한 후 LN-AR 세포에 대해 측정된 PSA 흡광도를 도시하는 그래프이다.
도 24는 화합물의 여러 특성을 제공하는 표를 나타낸다. 도 24는 또한 시간의 함수로서 화합물의 혈청 농도 면에서 여러 화합물의 약동학 특성을 제공하는 그래프를 나타낸다.
도 25는 125 nmol 내지 1000 nmol의 농도로 투여된 다양한 화합물에 대한 L1AR 세포주의 루시퍼라제 활성 그래프이다.
본 발명의 실시양태는 하기에서 상세하게 논의된다. 실시양태를 기재하는데 있어, 명료하게 하기 위해 특정 용어가 사용된다. 그러나, 본 발명은 선택된 특정 용어로만 한정되는 것으로 의도되지는 않는다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 다른 등가물이 사용될 수 있으며 다른 방법이 개발될 수 있음을 인지할 것이다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각이 개별적으로 도입된 것과 같이 참고로 도입된다.
디아릴히단토인 화합물의 합성
실시예 56 [NC54]
하기에서, 공기 또는 수분에 민감한 반응은 오븐-건조된 유리 용기 및 표준 시린지/셉텀 기술을 사용하여 아르곤 분위기 하에서 수행하였다. 반응은 SiO2 TLC 플레이트를 사용하여 UV 광 (254 nm)에 이어서 p-아니스알데히드 또는 닌하이드린 발색 용액으로의 가시화에 의해 모니터링하였다. 컬럼 크로마토그래피는 실리카 겔 60 상에서 수행하였다. 1H NMR 스펙트럼은 달리 언급되지 않는다면 CDCl3 중에서 400 MHz에서 측정하였고, 데이터는 내부 기준물질 (TMS, 0.0 ppm)로부터 ppm (δ) 단위로 화학적 이동 (다중도, 적분법, 커플링 상수 (Hz))을 기록하였다.
<화학식 37>
Figure pat00015
퍼요오드산 (1.69 g, 7.41 mmol)을 격렬하게 교반함으로써 아세토니트릴 (25 mL) 중에 용해시킨 다음, 크로뮴 트리옥시드 (0.16 g, 1.60 mmol)를 상기 용액 중에 용해시켰다. 2-플루오로-4-니트로톨루엔 (0.33 g, 2.13 mmol)을 상기 용액에 교반하면서 첨가하였다. 백색 침전물이 발열 반응과 함께 즉시 형성되었다. 1시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물의 상등액을 플라스크에 따라 버리고, 용매를 증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 메틸렌 클로라이드 (2 x 30 mL) 및 물 (2 x 30 mL)로 추출하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 백색 고체로서 2-플루오로-4-니트로벤조산 (화학식 37) (0.32 mg, 81％)을 제공하였다.
Figure pat00016
<화학식 38>
Figure pat00017
-5℃로 냉각시킨 DMF (5 mL) 중 2-플루오로-4-니트로벤조산 (화학식 37) (0.20 g, 1.10 mmol)의 용액에 티오닐 클로라이드 (0.15 g, 1.30 mmol)를 천천히 첨가하였다. 상기 혼합물을 -5℃에서 추가 1시간 동안 교반하였다. 과량의 메틸아민 (40％ 수용액으로부터 새롭게 증류됨)을 상기 반응 매질에 첨가하였다. 두번째 혼합물을 추가 1시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트 (50 mL)를 상기 혼합물에 첨가하고, 염수 (2 x 50 ml)로 세척하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 황색 고체로서 N-메틸-2-플루오로-4-니트로벤즈아미드 (화학식 38) (0.18 g, 85％)를 수득하였다.
Figure pat00018
<화학식 39>
Figure pat00019
에틸 아세테이트 (5 mL) 및 아세트산 (5 mL) 중 N-메틸-2-플루오로-4-니트로벤즈아미드 (화학식 38) (0.18 g, 0.91 mmol) 및 철 (0.31 g, 5.60 mmol)의 혼합물을 1시간 동안 환류하였다. 고체 입자를 여과제거하였다. 여과물을 물로 세척하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 잔류물을 SiO2 컬럼 크로마토그래피 (95:5의 디클로로메탄:아세톤)에 의해 정제하여 회백색 고체로서 N-메틸-2-플루오로-4-아미노벤즈아미드 (화학식 39) (0.14 g, 92％)를 제공하였다.
Figure pat00020
<화학식 40>
Figure pat00021
N-메틸-2-플루오로-4-아미노벤즈아미드 (화학식 39) (96 mg, 0.57 mmol), 아세톤 시아노하이드린 (0.3 mL, 3.14 mmol) 및 황산마그네슘 (50 mg)의 혼합물을 80℃로 가열하고 12시간 동안 교반하였다. 상기 매질에 에틸 아세테이트 (25 mL)를 첨가한 후에 물 (2 x 25 mL)로 세척하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 잔류물을 SiO2 컬럼 크로마토그래피 (95:5의 디클로로메탄:아세톤)에 의해 정제하여 백색 고체로서 N-메틸-2-플루오로-4-(1,1-디메틸-시아노메틸)-아미노벤즈아미드 (화학식 40) (101 mg, 75％)를 제공하였다.
Figure pat00022
<화학식 41>
Figure pat00023
물 (22 mL) 중 티오포스겐 (1 mL, 13 mmol)의 잘 교반되는 불균질 혼합물에 4-아미노-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 (2.23 g, 12 mmol)을 실온에서 15분에 걸쳐 조금씩 나누어 첨가하였다. 추가 1시간 동안 교반을 계속하였다. 반응 매질을 클로로포름 (3 x 15 ml)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 감압 하에 건조상태로 증발시켜 갈색 고체로서 목적하는 생성물 4-이소티오시아네이토-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 (화학식 41) (2.72 g, 11.9 mmol, 99％)을 수득하였고, 이를 다음 단계에서 그 자체로서 사용하였다.
Figure pat00024
NC54
<화학식 42>
Figure pat00025
56-1) NC54
DMF (1 mL) 중 N-메틸-2-플루오로-4-(1,1-디메틸-시아노메틸)-아미노벤즈아미드 (화학식 40) (30 mg, 0.13 mmol) 및 4-이소티오시아네이토-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 (화학식 41) (58 mg, 0.26 mmol)의 혼합물을 11시간 동안 100℃에서 마이크로웨이브 조사 하에 가열하였다. 상기 혼합물에 메탄올 (20 mL) 및 수성 1 N HCl (5 mL)을 첨가하였다. 두번째 혼합물을 1.5시간 동안 환류하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 빙수 (50 mL)에 붓고 에틸 아세테이트 (50 mL)로 추출하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 잔류물을 SiO2 컬럼 크로마토그래피 (95:5의 디클로로메탄:아세톤)에 의해 정제하여 무색 결정으로서 NC54 (화학식 42) (15 mg, 25％)를 제공하였다.
Figure pat00026
실시예 57
<화학식 43>
Figure pat00027
N-메틸-2-플루오로-4-아미노벤즈아미드 (화학식 39) (62 mg, 0.37 mmol), 시클로펜타논 (0.07 mL, 0.74 mmol) 및 TMSCN (0.1 mL, 0.74 mmol)의 혼합물을 80℃로 가열하고 13시간 동안 교반하였다. 상기 매질에 에틸 아세테이트 (2 x 20 mL)를 첨가한 다음 물 (2 x 20 mL)로 세척하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (95:5의 디클로로메탄:아세톤)에 의해 정제하여 백색 고체로서 N-메틸 2-플루오로-4-(1-시아노시클로펜틸)아미노벤즈아미드 (화학식 43) (61 mg, 63％)를 제공하였다.
Figure pat00028
NC55
<화학식 44>
Figure pat00029
57-1) NC55
DMF (3 mL) 중 N-메틸 2-플루오로-4-(1-시아노시클로펜틸)아미노벤즈아미드 (화학식 43) (57 mg, 0.22 mmol) 및 4-이소티오시아네이토-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 (0.15 g, 0.65 mmol)의 혼합물을 12시간 동안 130℃에서 마이크로웨이브 조사 하에 (용기 개방) 가열하였다. 상기 혼합물에 메탄올 (20 mL) 및 수성 1 N HCl (5 mL)을 첨가하였다. 두번째 혼합물을 1.5시간 동안 환류하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 빙수 (50 mL)에 붓고 에틸 아세테이트 (50 mL)로 추출하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (95:5의 디클로로메탄:아세톤)에 의해 정제하여 연황색 고체로서 4-(3-(4-시아노-3-(트리플루오로메틸)페닐)-4-옥소-2-티옥소-1,3-디아자스피로[4.4]노난-1-일)-2-플루오로-N-메틸벤즈아미드인 NC55 (화학식 44) (8 mg, 7％)를 제공하였다.
Figure pat00030
실시예 58
<화학식 45>
Figure pat00031
0℃의 클로로포름 (10 mL) 중 4-(4-아미노페닐)부티르산 (0.5 g, 2.79 mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산 무수물 (0.85 mL, 6.14 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온으로 가온하고 3시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 클로로포름 (20 mL)과 물 (20 mL) 사이에 분배하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (9:1의 디클로로메탄:아세톤)에 의해 정제하여 4-[4-(2,2,2-트리플루오로아세틸아미노)페닐]부탄산 (화학식 45) (0.53 g, 69％)을 제공하였다.
Figure pat00032
<화학식 46>
Figure pat00033
-5℃로 냉각시킨 DMF (5 mL) 중 4-[4-(2,2,2-트리플루오로아세틸아미노)페닐]부탄산 (화학식 45) (0.15 g, 0.55 mmol)의 용액에 티오닐 클로라이드 (71 mg, 0.60 mmol)를 천천히 첨가하였다. 상기 혼합물을 -5℃에서 추가 1시간 동안 교반하였다. 과량의 메틸아민 (40％ 수용액으로부터 새롭게 증류됨)을 상기 반응 매질에 첨가하였다. 두번째 혼합물을 추가 1시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트 (50 mL)를 상기 혼합물에 첨가하고, 염수 (2 x 50 ml)로 세척하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 황색 고체로서 N,N-디메틸 4-[4-(2,2,2-트리플루오로아세틸아미노)페닐]부탄아미드 (화학식 46) (0.17 g, 정량적)를 수득하였다.
Figure pat00034
<화학식 47>
Figure pat00035
메탄올 (2 mL) 중 N,N-디메틸 4-[4-(2,2,2-트리플루오로아세틸아미노)페닐]부탄아미드 (화학식 46) (0.17 g, 0.55 mmol)의 용액에 1 N NaOH 용액 (3 mL)을 실온에서 첨가하였다. 상기 혼합물을 14시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 클로로포름 (25 mL)과 물 (25 mL) 사이에 분배하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (9:1의 디클로로메탄:아세톤)에 의해 정제하여 백색 고체로서 N,N-디메틸 4-(4-아미노페닐)부탄아미드 (화학식 47) (74 mg, 66％)를 제공하였다.
Figure pat00036
<화학식 48>
Figure pat00037
N,N-디메틸 4-(4-아미노페닐)부탄아미드 (화학식 47) (74 mg, 0.36 mmol), 시클로부타논 (54 mg, 0.78 mmol) 및 TMSCN (77 mg, 0.78 mmol)의 혼합물을 80℃로 가열하고 15시간 동안 교반하였다. 상기 매질에 에틸 아세테이트 (2 x 20 mL)를 첨가한 다음 물 (2 x 20 mL)로 세척하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (9:1의 디클로로메탄:아세톤)에 의해 정제하여 백색 고체로서 N,N-디메틸 4-[4-(1-시아노시클로부틸아미노)페닐]부탄아미드 (화학식 48) (58 mg, 57％)를 제공하였다.
Figure pat00038
NC56
<화학식 49>
Figure pat00039
DMF (3 mL) 중 N,N-디메틸 4-[4-(1-시아노시클로부틸아미노)페닐]부탄아미드 (화학식 48) (58 mg, 0.20 mmol) 및 4-이소티오시아네이토-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 (74 mg, 0.32 mmol)의 혼합물을 2시간 동안 환류 가열하였다. 상기 혼합물에 메탄올 (20 mL) 및 수성 1 N HCl (5 mL)을 첨가하였다. 두번째 혼합물을 1.5시간 동안 환류하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 빙수 (50 mL)에 붓고 에틸 아세테이트 (50 mL)로 추출하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (95:5의 디클로로메탄:아세톤)에 의해 정제하여 연황색 고체로서 4-(4-(7-(4-시아노-3-(트리플루오로메틸)페닐)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥탄-5-일)페닐)-N,N-디메틸부탄아미드인 NC56 (화학식 49) (44 mg, 42％)을 제공하였다.
Figure pat00040
실시예 59
<화학식 50>
Figure pat00041
4-(4-아미노페닐)부티르산 (0.20 g, 1.12 mmol), 시클로부타논 (0.17 mL, 2.23 mmol) 및 TMSCN (0.30 mL, 2.23 mmol)의 혼합물을 80℃로 가열하고 13시간 동안 교반하였다. 상기 매질에 에틸 아세테이트 (2 x 30 mL)를 첨가한 다음 물 (2 x 30 mL)로 세척하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (9:1의 디클로로메탄:아세톤)에 의해 정제하여 황색 고체로서 4-[4-(1-시아노시클로부틸아미노)페닐]부탄산 (화학식 50) (0.21 g, 74％)을 제공하였다.
Figure pat00042
<화학식 51>
Figure pat00043
톨루엔 (10 mL) 중 4-[4-(1-시아노시클로부틸아미노)페닐]부탄산 (화학식 50) (0.21 g, 0.83 mmol) 및 4-이소티오시아네이토-2-트리플루오로벤조니트릴 (0.25 g, 1.08 mmol)의 혼합물을 1시간 동안 환류 가열하였다. 상기 혼합물에 수성 1 N HCl (5 mL)을 첨가하였다. 두번째 혼합물을 1.5시간 동안 환류하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 빙수 (50 mL)에 붓고 에틸 아세테이트 (50 mL)로 추출하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (95:5의 디클로로메탄:아세톤)에 의해 정제하여 4-(4-(7-(4-시아노-3-(트리플루오로메틸)페닐)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥탄-5-일)페닐)부탄산인 NC122 (화학식 51) (60 mg, 15％)를 제공하였다.
Figure pat00044
실시예 61
NC57
<화학식 53>
Figure pat00045
무수 디클로로메탄 (1 mL) 중 DMSO (0.01 mL, 0.12 mmol)의 용액을 -78℃의 무수 디클로로메탄 (2 mL) 중 옥살릴 클로라이드 (0.01 mL, 0.09 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 15분 후, 디클로로메탄 중 4-(4-(7-(4-시아노-3-(트리플루오로메틸)페닐)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥탄-5-일)페닐)부탄아미드인 NC47 (화학식 52) (35 mg, 0.07 mmol)의 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. -78℃에서 20분 동안 교반을 계속한 후에 트리에틸아민 (0.03 mL, 0.22 mmol)을 첨가하였다. -78℃에서 30분 후, 반응 혼합물을 실온으로 가온한 다음 포화 NH4Cl 수용액을 사용하여 반응물을 켄칭시켰다. 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 크로마토그래프하여 (95:5의 디클로로메탄:아세톤) 점성 오일로서 4-(5-(4-(3-시아노프로필)페닐)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥탄-7-일)-2-(트리플루오로메틸)벤조니트릴인 NC57 (화학식 53) (29 mg, 87％)을 수득하였다.
Figure pat00046
당업자는 본원에 기재된 합성을 변경하고/거나 조합하여 다른 디아릴히단토인 화합물을 제조할 수 있다.
화합물의 약리 검사
합성 경로가 상기에 기재한 바와 같은 화합물을, 본원에 참고로 포함되는 PCT 출원 US04/42221 및 US05/05529의 과정과 유사한 스크리닝 과정을 이용하여, AR에 대한 길항제 및 효능제 활성을 호르몬 불응성 전립선 암 세포에 대하여 스크리닝함으로써 동정하였다. 다수의 화합물이 호르몬 불응성 전립선 암에서 과다발현된 AR에 대하여 강력한 길항제 활성 및 최소의 효능제 활성을 나타내었다.
시험관내 생물학적 검정
리포터 검정에 의한 AR에 대한 화합물의 효과
호르몬 불응성 전립선 암 세포주에서 인공적인 AR 반응 리포터 시스템을 이용하여 화합물을 시험하였다. 이 시스템에서, AR을 내인성 수준보다 약 5 배 더 높은 수준으로 안정하게 발현하도록 전립선 암 LNCaP 세포를 조작하였다. 외인성 AR은 합성 안드로겐 R1881에 의해 안정화된다는 점에서 내인성 AR과 유사한 특성을 갖는다. 또한 AR 반응 리포터를 안정하게 혼입하도록 AR-과다발현된 세포를 조작하였으며, 이 세포의 리포터 활성은 호르몬 불응성 전립선 암의 특징을 나타낸다. 이는 저농도의 합성 안드로겐 R1881에 반응하고, 고농도의 비칼루트아미드에 의해서만 억제되며 (표 1 참조), 비칼루트아미드에 의한 효능제 활성을 나타낸다 (도 1 및 표 2). 공개된 데이터와 일치하는 것으로, 비칼루트아미드는 AR 반응 리포터를 억제하였으며, 호르몬 감수성 전립선 암 세포에서 효능제 활성을 갖지 않았다 (도 2).
본 발명자들은 상기에서 기재한 바와 같이 합성되는 화합물의 길항제 활성을 R1881 100 pM의 존재하에 검사하였다. 조작된 LNCaP 세포 (LNCaP-AR, 줄여서 LN-AR이라고도 함)를 10％ 소 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 이스코브(Iscove) 배지 내에 유지시켰다. 약물 처리 2 일 전, 10％ 목탄-스트립된 FBS (CS-FBS)를 함유하는 이스코브 배지에서 세포를 성장시켜 안드로겐을 결핍시켰다. 세포를 나누어 R1881 100 pM 및 증가하는 농도의 시험 화합물과 함께 10％ CS-FBS를 함유하는 이스코브 배지에서 세포를 성장시켰다. 2 일 동안 인큐베이션한 후, 리포터 활성을 검정하였다.
표 1은 호르몬 불응성 전립선 암에서 AR을 억제하는 상기 화합물의 IC50을 나타낸다. 대조 물질인 비칼루트아미드는 889 nM의 IC50을 갖는다. 동정된 대부분의 화합물 (디아릴티오히단토인)은 호르몬 불응성 전립선 암에서 AR을 억제하는 데 100 내지 200 nM의 IC50을 갖는다. 대조적으로, 미국 특허 제5,705,654호의 실시예로서 열거된 항-안드로겐 화합물, 예를 들면 실시예 30-2, 30-3, 31-2, 31-3 및 24-3 (NC24-NC28)의 화합물은 이 시스템에서 AR에 대한 어떤 억제 활성도 갖지 않는다.
AR 반응 리포터 및 내인성 PSA 발현에 의해 측정된, 호르몬 불응성 전립선 암에서의 AR에 대한 길항제 활성
IC50 (nM) IC50 (nM)
실시예 명칭 리포터 PSA
비칼루트
아미드
비교예		 N-[4-시아노-3-(트리플루오로메틸)페닐]-3-[(4-플루오로페닐)술포닐]-2-히드록시-2-메틸프로판아미드 889 >1000
29
비교예		 4-[3-(4-히드록시부틸)-4,4-디메틸-5-옥소-2-티옥소이미다졸리딘-1-일]-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 없음(*) 없음
6-2
(6b)[NC10]		 4-[3-페닐-4,4-디메틸-5-옥소-2-티옥소이미다졸리딘-1-일]-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 149 n/a(**)
5-3b
(5c)[NC2]		 4-[3-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-5-옥소-2-티옥소이미다졸리딘-1-일]-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 125 132
3-3
(3c)[NC3]		 4-[3-(4-히드록시페닐)-4,4-디메틸-5-옥소-2-티옥소이미다졸리딘-1-일]-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 137 122
2-4
(2d)[NC4]		 4-[3-(4-아미노페닐)-4,4-디메틸-5-옥소-2-티옥소이미다졸리딘-1-일]-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 273 n/a
4
(4a)[NC5]		 클로로아세트산 4-[3-(4-시아노-3-트리플루오로메틸페닐)-5,5-디메틸-4-옥소-2-티옥소이미다졸리딘-1-일]페닐 에스테르 131 n/a
8-2
(8b)[NC6]		 4-(4-옥소-2-티옥소-1-(4-메틸페닐)-1,3-디아자스피로[4.4]논-3-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 147 n/a
7-3b
(7c)[NC7]		 4-(8-옥소-6-티옥소-5-(4-메틸페닐)-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 124 128
9-3
(9c)[NC8]		 4-(4-옥소-2-티옥소-1-(4-메틸페닐)-1,3-디아자스피로[4.5]데스-3-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 194 n/a
10-3
(10c)[NC9]		 4-(4-옥소-2-티옥소-1-(4-메틸페닐)-1,3-디아자스피로[4.5]운데스-3-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 232 n/a
28
비교예
(28a)[NC10]		 4-(8-메틸-4-옥소-2-티옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데스-3-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 없음 n/a
27-3
(27c)[NC11]		 4-(8-메틸-4-옥소-2-티옥소-1-(4-메틸페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데스-3-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 638 n/a
26
(26a)[NC12]		 4-[1-(4-시아노페닐)-4-옥소-2-티옥소-1,3-디아자스피로[4.4]논-3-일]-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 469 n/a
25
(25a)[NC13]		 4-[1-(4-니트로페닐)-4-옥소-2-티옥소-1,3-디아자스피로[4.4]논-3-일]-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 498 n/a
12-2
(12b)[NC15]		 4-(8-옥소-6-티옥소-5-(4-비페닐)-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 283 n/a
11-2
(11b)[NC16]		 4-(8-옥소-6-티옥소-5-(4-히드록시페닐)-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 162 n/a
17
(17a)[NC17]		 4-[3-(4-히드록시페닐)-4,4-디메틸-2,5-디티옥소이미다졸리딘-1-일]-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 278 287
18
(18a)[NC18]		 4-[3-(4-히드록시페닐)-4,4-디메틸-2,5-디옥소이미다졸리딘-1-일]-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 369 511
22-2
(22b)[NC19]		 2-[3-(4-시아노-3-트리플루오로메틸페닐)-5,5-디메틸-4-옥소-2-티옥소이미다졸리딘-1-일]벤조산 523 >500
20-2
(20b)[NC20]		 4-(4,4-디메틸-5-옥소-2-티옥소-3-(4-트리플루오로메틸페닐)이미다졸리딘-1-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 143 144
21-2
(21b)[NC21]		 4-(4,4-비스클로로메틸-5-옥소-2-티옥소-3-(4-메틸페닐)이미다졸리딘-1-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 521 >500
19-2
(19b)[NC22]		 4-(4-플루오로메틸-4-메틸-5-옥소-2-티옥소-3-(4-메틸페닐)이미다졸리딘-1-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 126 129
23-2
(23b)[NC23]		 4-(8-옥소-6-티옥소-5-(2-메틸페닐)-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 258 232
30-2
비교예
(30b)[NC24]		 4-(5-메틸-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 없음 없음
30-3
비교예
(30c)[NC25]		 4-(5-메틸-6,8-디옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 없음 없음
31-2
비교예
(31b)[NC26]		 4-(1-메틸-4-옥소-2-티옥소-1,3-디아자스피로[4.4]논-3-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 없음 없음
31-3
비교예
(31c)[NC27]		 4-(1-메틸-2,4-디옥소-1,3-디아자-스피로[4.4]논-3-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 없음 없음
24-3
비교예
(24c)[NC28]		 4-(4-옥소-2-티옥소-1,3-디아자스피로[4.4]논-3-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 없음 없음
15-2
(15b)[NC29]		 4-[4,4-디메틸-3-(4-피리딘-2-일)-5-옥소-2-티옥소이미다졸리딘-1-일]-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 723 n/a
14-2
(14b)[NC30]		 4-[4,4-디메틸-3-(4-메틸피리딘-2-일)-5-옥소-2-티옥소이미다졸리딘-1-일]-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 457 n/a
16-2
비교예
(16b)[NC31]		 4-[5-(5-메틸-2H-피라졸-3-일)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자-스피로[3.4]옥트-7-일]-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 >1000 n/a
13-2
(12b)[NC32]		 4-(8-옥소-6-티옥소-5-(4-비페닐)-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 >1000 n/a
32
(32a)[NC33]		 4-(8-메틸이미노-6-티옥소-5-p-톨릴-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일)-2-트리플루오로메틸-벤조니트릴 222 421
33
(33a)[NC34]		 1-[3-(4-시아노-3-트리플루오로메틸-페닐)-5,5-디메틸-2-티옥소-1-p-톨릴-이미다졸리딘-4-일리덴]-3-에틸-티오우레아 157 239
34
(34a)[NC35]		 1-[7-(4-시아노-3-트리플루오로메틸-페닐)-6-티옥소-5-p-톨릴-5,7-디아자-스피로[3.4]옥트-8-일리덴]-3-페닐-티오우레아 176 276
35
(35a)[NC36]		 1-(4-시아노-3-트리플루오로메틸-페닐)-3-[7-(4-시아노-3-트리플루오로메틸-페닐)-6-티옥소-5-p-톨릴-5,7-디아자-스피로[3.4]옥트-8-일리덴]-티오우레아 144 158
36-2
(36b)[NC37]		 4-[8-(4-히드록시메틸-페닐)-5-옥소-7-티옥소-6-아자스피로[3.4]옥트-6-일]-2-트리플루오로메틸-벤조니트릴 311 337
37
(37a)[NC38]		 4-[5-(4-포르밀페닐)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일]-2-트리플루오로메틸-벤조니트릴 n/a 263
38
(38a)
[NC39]		 4-{5-[4-(1-히드록시에틸)-페닐]-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일]-2-트리플루오로메틸-벤조니트릴 n/a 187
39
(39a)
[NC40]		 3-{4-[7-(4-시아노-3-트리플루오로메틸페닐)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-5-일]-페닐}-아크릴산 에틸 에스테르 n/a 197
40
(40a)
[NC41]		 4-{5-[4-(3-히드록시프로페닐)-페닐]-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일}-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 n/a 114
41-2
(41b)
[NC42]		 3-{4-[7-(4-시아노-3-트리플루오로메틸페닐)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-5-일]-페닐}-프로피온산 메틸 에스테르 없음 n/a
41-4
(41d)
[NC43]		 3-{4-[7-(4-시아노-3-트리플루오로메틸페닐)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자-스피로[3.4]옥트-5-일]-페닐}-프로피온아미드 224 n/a
41-5
(41e)
[NC44]		 3-{4-[7-(4-시아노-3-트리플루오로메틸페닐)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자-스피로[3.4]옥트-5-일]-페닐}-N-메틸-프로피온아미드 234 n/a
41-6
(41f)
[NC45]		 3-{4-[7-(4-시아노-3-트리플루오로메틸페닐)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자-스피로[3.4]옥트-5-일]-페닐}-N-(2-히드록시에틸)-프로피온아미드 732 n/a
42-2
(42b)
[NC46]		 4-{4-[7-(4-시아노-3-트리플루오로메틸페닐)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-5-일]-페닐}-부티르산 메틸 에스테르 432 n/a
42-4
(42d)
[NC47]		 4-{4-[7-(4-시아노-3-트리플루오로메틸페닐)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자-스피로[3.4]옥트-5-일]-페닐}-부티르아미드 112 n/a
42-5
(42e)
[NC48]		 4-{4-[7-(4-시아노-3-트리플루오로메틸페닐)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자-스피로[3.4]옥트-5-일]-페닐}-N-메틸-부티르아미드 92 n/a
43-4
(43e)
[NC49]		 4-[8-옥소-5-(4-피페라진-1-일-페닐)-6-티옥소-5,7-디아자스피로[3.4]-옥트-7-일]-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 718 n/a
43-5
(43f)
[NC50]		 4-{5-[4-(4-메탄술포닐피페라진-1-일)-페닐]-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일}-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 138 n/a
44-2
(44b)
[NC51]		 44-2) 3-{4-[7-(4-시아노-3-트리플루오로메틸-페닐)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자-스피로[3.4]옥트-5-일]-페닐}-아크릴아미드 113
(*) 없음: 화합물이 AR 반응 리포터를 억제하지 않음; (**) n/a: 화합물이 이 검정에서 검사되지 않음.
호르몬 불응성 전립선 암에 있어서 종래 인식되지 않은 한 가지 AR 과다발현의 특성은 길항제에서 효능제로의 그의 변환 능력이다. 따라서, 효능제 활성이 최소이거나 전혀 없는 화합물들만이 이러한 질환을 위한 항-안드로겐으로 적합하다. 상이한 화합물의 효능제 활성을 판단하기 위해, 본 발명자들은 R1881의 부재하에 LN-AR 시스템에서의 측정수단으로 AR 반응 리포터를 사용하여 AR에 대한 상기 화합물의 자극 활성을 검사하였다. 표 2는 상이한 화합물의 효능제 활성을 나타낸다. 기존의 결과와 일치하는 것으로, 비칼루트아미드는 호르몬 불응성 전립선 암에서 AR을 활성화하였다. 디아릴티오히단토인 유도체, 예를 들면 실시예 7-3b (NC7), 33 (NC34), 34 (NC35), 및 35 (NC36)의 화합물은 효능제 활성이 없었다. 이와 달리, RU59063, 및 미국 특허 제5,705,654호에 예로서 기재된 다른 항-안드로겐 화합물, 예를 들면 실시예 30-2, 30-3, 31-2, 31-3 및 24-3 (NC24-NC28)의 화합물은 호르몬 불응성 전립선 암에서 AR을 강하게 활성화하였다.
호르몬 불응성 전립선 암에서 AR 반응 리포터에 대한 선택적 시험 물질의 효능제 활성
화합물 농도의 증가에 따른 유도 배수
실시예 명칭 0.1 μM 1 μM 10 μM
DMSO 디메틸 술폭사이드 1.00(*) 1.00 1.00
R1881 메틸트리에놀론 44.33 n/a(**) n/a
비칼루트
아미드		 N-[4-시아노-3-(트리플루오로메틸)페닐]-3-[(4-플루오로페닐)술포닐]-2-히드록시-2-메틸프로판아미드 1.66 3.04 10.40
29
화합물		 4-[3-(4-히드록시부틸)-4,4-디메틸-5-옥소-2-티옥소이미다졸리딘-1-일]-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 10.99 20.84 34.62
7-3b
(7c)
[NC7]		 4-(8-옥소-6-티옥소-5-(4-메틸페닐)-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 0.87 1.19 0.89
33
(33a)
[NC34]		 1-[3-(4-시아노-3-트리플루오로메틸-페닐)-5,5-디메틸-2-티옥소-1-p-톨릴-이미다졸리딘-4-일리덴]-3-에틸-티오우레아 1.30 1.18 1.28
34
(34a)
[NC35]		 1-[7-(4-시아노-3-트리플루오로메틸-페닐)-6-티옥소-5-p-톨릴-5,7-디아자-스피로[3.4]옥트-8-일리덴]-3-페닐-티오우레아 1.19 1.41 1.17
35
(35a)
[NC36]		 1-(4-시아노-3-트리플루오로메틸-페닐)-3-[7-(4-시아노-3-트리플루오로메틸-페닐)-6-티옥소-5-p-톨릴-5,7-디아자-스피로[3.4]옥트-8-일리덴]-티오우레아 1.26 1.10 1.30
30-2
화합물
(30b)
[NC24]		 4-(5-메틸-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 14.88 19.41 35.22
30-3
화합물
(30c)
[NC25]		 4-(5-메틸-6,8-디옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 11.39 14.26 30.63
31-2
화합물
(31b)
[NC27]		 4-(1-메틸-4-옥소-2-티옥소-1,3-디아자스피로[4.4]논-3-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 17.03 16.63 33.77
31-3
화합물
(31c)
[NC27]		 4-(1-메틸-2,4-디옥소-1,3-디아자-스피로[4.4]논-3-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 11.99 19.77 38.95
24-3
화합물
(24c)
[NC28]		 4-(4-옥소-2-티옥소-1,3-디아자스피로[4.4]논-3-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 14.88 22.48 37.09
(*) 유도 배수: DMSO 비히클에서의 활성에 비해 특정 시험 물질에 의해 유도된 활성; (**) n/a: 화합물이 이 검정에서 검사되지 않음.
AR 억제제의 특이성을 검사하기 위해, 핵 수용체 패밀리에서 AR의 가장 가까운 구성원인 글루코코르티코이드 수용체 (GR)가 과다발현된 LNCaP 세포에서 선택적 화합물을 시험하였다. 이들 세포는 또한 GR 반응 리포터를 운반하는데, 리포터 활성은 GR 효능제인 덱사메타손에 의해 유도되었으며, 그러한 유도는 GR 억제제인 RU486에 의해 차단되었다. 실시예 7-3b (NC7)의 화합물 (4-(8-옥소-6-티옥소-5-(4-메틸페닐)-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일)-2-트리플루오로메틸 벤조니트릴)은 이 시스템에서 GR에 어떤 영향도 주지 않았다.
전립선 특이적 항원 (PSA) 분비 수준의 측정에 의한 AR에 대한 화합물의 효과
PSA 수준이 전립선 암에서 AR 활성의 지표라는 것은 잘 알려져 있다. 화합물이 생리학적 환경에서 AR 기능에 영향을 미치는지를 검사하기 위해, 본 발명자들은 AR이 과다발현된 LNCaP 세포 (LNCaP-AR, 또한 줄여서 LN-AR이라고도 함)에서 R1881에 의해 유도된 내인성 PSA의 분비 수준을 판단하였다. LNCaP-AR 세포는 안드로겐 수용체를 발현시키는 플라스미드로 형질도입된 전립선 세포의 림프절 암종 라인이다. LNCaP-AR 세포를 10％ FBS를 함유하는 이스코브 배지 내에 유지시켰다. 약물 처리 2 일 전, 10％ CS-FBS를 함유하는 이스코브 배지에서 세포를 성장시켜 안드로겐을 결핍시켰다. 세포를 나누어 적정 농도의 R1881 및 시험 화합물과 함께 10％ CS-FBS를 함유하는 이스코브 배지에서 세포를 성장시켰다. 4 일 동안 인큐베이션한 후, PSA ELISA 키트 (미국 캘리포니아주 샌 클레멘트 소재의 아메리칸 퀄렉스사 제(American Qualex))를 사용해서 분비된 PSA 수준을 검정하였다.
LNCaP-AR 세포의 PSA 분비 수준은 25 pM의 R1881에 의해 강하게 유도되었다. 이와 달리, R1881의 농도가 100 pM에 도달할 때까지 PSA는 모 LNCaP 세포에서 유도되지 않았다. 이는 호르몬 불응성 전립선 암에서의 AR이 안드로겐에 대해 과-감수성이라는 본 발명자들의 앞선 보고와 일치한다. AR 활성에 대한 투여량-의존적 억제를 수행하여 PSA 발현을 억제하는 데 있어서 상이한 화합물의 IC50을 판단하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다. PSA 발현에 대한 선택적 화합물의 IC50은 리포터 검정에 의해 측정된 값과 매우 유사하며, 이는 디아릴히단토인 유도체가 호르몬 불응성 전립선 암에서 AR의 강한 억제제임을 확증한다.
또한, 본 발명자들은 분비된 PSA를 대리 마커로 사용하여 호르몬 불응성 전립선 암에서 AR에 대한 선택적 화합물의 효능제 활성을 검사하였다. 이를 위해, 안드로겐-결핍된 AR 과다발현 LNCaP 세포를 R1881의 부재하에, 상기에서 기재한 바와 같이 합성되는 증가하는 농도의 화합물과 함께 인큐베이션하였고, 4 일 후에 배양 배지 중의 분비된 PSA를 측정하였다.
표 3은 선택적 화합물의 효능제 활성을 나타낸다. 리포터 분석으로부터 얻은 결과와 일치하는 것으로, 디아릴티오히단토인 유도체, 예를 들면 실시예 7-3b (NC7), 33 (NC34), 34 (NC35), 및 35 (NC36)의 화합물은 효능제 활성을 갖지 않는다. 이와 달리, RU59063, 및 미국 특허 제5,705,654호에 예로서 기재된 다른 항-안드로겐 화합물, 예를 들면 실시예 30-2 (NC24), 30-3 (NC25) 및 31-2 (NC26)의 화합물은 호르몬 불응성 전립선 암에서 PSA 발현을 자극하였다.
호르몬 불응성 전립선 암에서 내인성 PSA에 대한 선택적 시험 물질의 효능제 활성
화합물 농도의 증가에 따른 유도 배수
실시예 명칭 0.1 μM 1 μM 10 μM
DMSO 디메틸 술폭사이드 1.00(*) 1.00 1.00
R1881 메틸트리에놀론 20.69 n/a(**) n/a
비칼루트
아미드		 N-[4-시아노-3-(트리플루오로메틸)페닐]-3-[(4-플루오로페닐]술포닐]-2-히드록시-2-메틸프로판아미드 2.00 2.55 5.55
29
화합물		 4-[3-(4-히드록시부틸)-4,4-디메틸-5-옥소-2-티옥소이미다졸리딘-1-일]-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 6.88 11.50 21.50
7-3b
(7c)
[NC7]		 4-(8-옥소-6-티옥소-5-(4-메틸페닐)-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 1.25 1.20 1.15
33
(33a)
[NC34]		 1-[3-(4-시아노-3-트리플루오로메틸-페닐)-5,5-디메틸-2-티옥소-1-p-톨릴-이미다졸리딘-4-일리덴]-3-에틸-티오우레아 1.06 1.30 0.85
34
(34a)
[NC35]		 1-[7-(4-시아노-3-트리플루오로메틸-페닐)-6-티옥소-5-p-톨릴-5,7-디아자-스피로[3.4]옥트-8-일리덴]-3-페닐-티오우레아 1.31 1.05 0.90
35
(35a)
[NC36]		 1-(4-시아노-3-트리플루오로메틸-페닐)-3-[7-(4-시아노-3-트리플루오로메틸-페닐)-6-티옥소-5-p-톨릴-5,7-디아자-스피로[3.4]옥트-8-일리덴]-티오우레아 1.44 1.30 1.05
30-2
화합물
(30b)
[NC24]		 4-(5-메틸-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 6.25 17.95 25.65
30-3
화합물
(30c)
[NC25]		 4-(5-메틸-6,8-디옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 7.50 15.20 23.75
31-2
화합물
(31b)
[NC26]		 4-(1-메틸-4-옥소-2-티옥소-1,3-디아자스피로[4.4]논-3-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴 8.13 18.20 17.50
(*) 유도 배수: DMSO 비히클에서의 활성에 비해 특정 시험 물질에 의해 유도된 활성; (**) n/a: 화합물이 이 검정에서 검사되지 않음.
MTS 검정에 의한 AR 미토콘드리아 활성에 대한 화합물의 효과
LNCaP-AR 세포를 10％ FBS를 함유하는 이스코브 배지 내에 유지시켰다. 호르몬 불응성 전립선 암 세포의 성장에 대한 화합물의 효과를 검사하였다. 과다발현된 LNCaP 세포가 시험관내 및 생체내에서 호르몬 불응성 전립선 암 세포로서 거동하므로 이를 사용하였다 (1). 본 발명자들은 성장 대용인 MTS 검정으로 미토콘드리아 활성을 측정하였다. AR이 과다발현된 LNCaP 세포 (LN-AR)를 10％ FBS를 함유하는 이스코브 배지 내에 유지시켰다. 약물 처리 2 일 전, 10％ CS-FBS를 함유하는 이스코브 배지에서 세포를 성장시켜 안드로겐을 결핍시켰다. 이어서, 세포를 나누어 적정 농도의 R1881 및 증가하는 농도의 시험 화합물과 함께 10％ CS-FBS를 함유하는 이스코브 배지에서 세포를 성장시켰다. 4 일 동안 인큐베이션한 후, MTS (미국 위스콘신주 메디슨 소재의 프로메가(Promega)사 제)를 이용하여 세포 성장을 모니터링하였다.
리포터 검정 및 PSA 검정과 일치하는 것으로, AR이 과다발현된 LNCaP의 성장은 R1881 25 μM에 의해 자극되었지만, 모 세포는 R1881 농도가 100 μM에 도달할 때까지 자극되지 않았다. 도 2는 R1881 100 pM의 존재하에 호르몬 불응성 전립선 암의 성장에 대한 선택된 화합물의 억제 효과를 보여준다. 현재의 임상 약물인 비칼루트아미드는 호르몬 불응성 전립선 암을 억제하지 않았다. 이와 달리, 실시예 5-3b (NC2)의 화합물 (4-[3-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-5-옥소-2-티옥소이미다졸리딘-1-일]-2-트리플루오로메틸-벤조니트릴) 및 실시예 7-3b (NC7)의 화합물 (4-(8-옥소-6-티옥소-5-(4-메틸페닐)-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴)은 높은 효능으로 호르몬 불응성 전립선 암을 억제하였다.
본 발명자들은 AR을 표적화함으로써 MTS 검정에서 성장 억제가 일어났는지를 검사하고, 실시예 5-3b (NC2)의 화합물 (4-[3-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-5-옥소-2-티옥소이미다졸리딘-1-일]-2-트리플루오로메틸-벤조니트릴) 및 실시예 7-3b (NC7)의 화합물 (4-(8-옥소-6-티옥소-5-(4-메틸페닐)-5,7-디아자스피로[3.4]옥트-7-일)-2-트리플루오로메틸벤조니트릴)을 AR 발현이 결여된 전립선 암 세포주인 DU-145 세포에서 시험하였다. 이들 화합물은 DU-145 세포에 대해 어떤 성장 억제 효과도 갖지 않았다. 이들 화합물은 통상적으로 사용되는 두 가지 유방암 세포인 MCF7 및 SkBr3 또는 정상 마우스 섬유아세포 세포주인 3T3에 대해 어떤 성장 효과도 갖지 않았지만, AR이 과다발현된 전립선 암 세포 이외의 세포를 억제하지 않았다.
디아릴티오히단토인 유도체의 시험관내 생물학적 활성의 예는 도 3 및 4에 나타나 있다. 예를 들어, 상대적인 루시퍼라제 활성을 기초로, 도 3은 500 nM의 농도에서 화합물이 활성이 가장 높은 것에서 활성이 가장 낮은 것의 순서로 NC67 > NC68 > NC66 > NC69 > NC77 = NC53 > 비칼루트아미드의 순위가 됨을 나타낸다. 예를 들어, 상대적인 PSA 수준을 기초로, 500 nM의 농도에서 화합물은 활성이 가장 높은 것에서 활성이 가장 낮은 것의 순서로 NC50 > NC48 > NC7 > NC43 > NC44 > NC49 > NC50 > NC45 > 비칼루트아미드의 순위가 된다는 것이 확인되었다. 예를 들어, 상대적인 MTS 단위를 기초로, 도 4는 500 nM의 농도에서 화합물이 활성이 가장 높은 것에서 활성이 가장 낮은 것의 순서로 NC70 > NC7 > NC122 > NC53 > 비칼루트아미드의 순위가 됨을 나타낸다.
호르몬 불응성 전립선 암 이종이식 종양 및 호르몬 감수성 전립선 암 이종이식 종양에 대한 억제 효과
디아릴히단토인 유도체가 호르몬 불응성 전립선 암에 대해 생체내 효과를 갖는지를 검사하기 위하여 본 발명의 화합물을 사용한다. 먼저, 본 발명자들은 이 화합물을 AR이 과다발현된 LNCaP 세포로부터 확립된 이종이식 종양에 대해 검사하였다. 매트리겔(Matrigel)(Collaborative Biomedical)에서 조작된 세포를 거세된 수컷 SCID 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 캘리퍼를 사용해서 종양 크기를 매주 3 차원으로 측정하였다. 이종이식 종양이 확립된 후 (종양 크기가 40 mm3 이상), 종양을 가진 마우스를 무작위로 하여 1일 1회 상이한 투여량의 화합물로 경구 처리하였다. AR이 과다발현된 LNCaP 이종이식 모델의 성장에 대한 억제 효과를 다음과 같이 연구한다. LN-AR 이종이식 종양이 확립된 마우스를 무작위로 하여 1일 1회 지정된 화합물로 경구 처리한다. 종양 크기를 캘리퍼로 측정한다.
임상 관찰사항과 일치하는 것으로, 현재의 임상 약물인 비칼루트아미드는 호르몬 불응성 전립선 암의 성장을 억제하지 않았다 (비히클과 동일함). 이와 달리, 본 발명에 따른 화합물은 이들 종양의 성장을 억제하고, 그러한 억제는 투여량-의존적이다. 또한, 이들 화합물은 호르몬 불응성 전립선 암에 대한 임상 마커인 PSA 발현을 억제한다.
또한, 호르몬 불응성 전립선 암의 또다른 이종이식 모델인 호르몬 불응성 LAPC4에서 본 발명의 화합물을 시험한다. 이 모델은 거세된 마우스에 호르몬 감수성 전립선 암을 통과시키는 것으로부터 확립되고, 전립선 암의 임상 경과를 흉내낸다 (2). AR이 과다발현된 LNCaP 이종이식 모델을 이용하여 발견한 것과 유사하게, 현재의 임상 약물인 비칼루트아미드는 호르몬 불응성 LAPC4 이종이식 모델에서 성장 및 PSA 발현을 억제하지 않았다 (비히클과 동일함). 이와 달리, 본 발명의 화합물은 이들 종양의 성장 및 PSA 발현을 억제하였다.
도 6은 LNCaP 호르몬 감수성 모델 유래의 세포를 마우스에 이종이식시킨 실험 (106 개의 LNCaP 세포를 마우스에 주입)의 결과를 보여준다. 제1 세트의 마우스를 NC53으로 처리하고, 제2 세트의 마우스는 카소덱스로, 제3 세트의 마우스는 비히클 용액으로 처리하였다. 각 세트에는 6 마리의 마우스가 포함되었다. 이들 마우스를 하루에 10 mg/kg으로 처리하였다. 도 6은 그 결과를 종양 부피의 그래프로서, 시간의 함수로서 보여준다. 대조군으로서 비히클 용액으로 처리한 마우스는 종양 부피의 가장 급속한 증가를 나타내었다. 카소덱스로 처리한 마우스 및 NC53으로 처리한 마우스는 비히클 용액으로 처리한 마우스보다는 느린, 유사한 종양 성장 속도를 나타내었다.
호르몬 감수성 전립선 암 세포의 성장에 대한 억제 효과
또한, 디아릴티아히단토인 유도체가 호르몬 감수성 전립선 암 세포를 억제하는지 판단하기 위해, 본 발명자들은 미토콘드리아 활성의 MTS를 측정함으로써 LNCaP 세포의 성장에 대해 일부 선택적 화합물을 시험하였다. 안드로겐이 결핍된 LNCaP 세포를 R1881 1 pM의 존재하에서 비히클로서 증가하는 농도의 DMSO 또는 시험 물질로 처리하였다. 4일 동안 인큐베이션한 후, 세포 성장을 MTS 검정으로 측정하였다. 본 발명의 화합물은 비칼루트아미드보다 높은 효능으로 호르몬 감수성 전립선 암을 억제하였다.
생체내 생물학적 분석
모든 동물 실험은 미국 로스엔젤레스에 소재하는 캘리포니아 대학(University of California)의 동물 연구 위원회(Animal Research Committee)의 가이드라인에 따라 수행하였다. 동물은 타코닉(Taconic) 사로부터 구입하였으며, 한정된 균총 콜로니로 기류식(laminar flow) 타워 내에 유지시켰다. LNCaP-AR 및 LNCaP-벡터 세포를 10％ FBS가 보충된 RPMI 배지 내에 유지시켰다. 매트리겔 대 RPMI가 1:1인 100 ㎕ 배지 중에서 106 개의 세포를 무손상 또는 거세된 수컷 SCID 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 캘리퍼를 사용해서 종양 크기를 3 차원 (길이 x 너비 x 깊이)으로 매주 측정하였다. 종양 크기가 대략 100 mm3에 도달했을 때 마우스를 처리군으로 무작위화하였다. 약물을 매일 10 mg/kg 및 50 mg/kg으로 경구로 제공하였다. 약동학적 판독값을 구하기 위해, 마지막 투여 처리 3 시간 후에 광학 CCD 카메라를 통해 동물을 영상화하였다. ROI를 종양에 대해 광자/초의 루시퍼라제 활성 측정치로 도출해내었다. 우측 패널은 ROI 측정치를 나타낸다. 데이터를 도 7 및 8에 나타낸다. 18 일에 걸쳐 NC53은 종양의 성장을 방해하고, 심지어는 종양 수축을 유발하는 데 효과적이었으며, 비칼루트아미드보다 뚜렷하게 더 효과적이었다.
비칼루트아미드, 4-[7-(4-시아노-3-트리플루오로메틸페닐)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자-스피로[3.4]옥트-5-일]-톨루엔 [NC7], N-메틸-4-{4-[7-(4-시아노-3-트리플루오로메틸페닐-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자-스피로[3.4]옥트-5-일]페닐}부탄아미드 [NC48], 및 N-메틸-4-[7-(4-시아노-3-트리플루오로메틸페닐)-8-옥소-6-티옥소-5,7-디아자-스피로[3.4]옥트-5-일]-2-플루오로벤즈아미드 (52d) [NC53]의 약동학은 찰스 리버 래버러토리즈(Charles River Laboratories)로부터 구입한 8 주된 FVB 마우스를 이용하여 생체내에서 평가하였다. 마우스를 각 시점에서 3개의 군으로 분류하였다. 2 마리의 마우스는 약물 처리하지 않았으며, 다른 2 마리의 마우스는 비히클 용액으로 처리하였다. 각 군은 체중 1 kg 당 10 mg으로 처리하였다.
약물을 DMSO:PEG400:H2O의 1:5:14 혼합물 (비히클 용액) 중에 용해시키고, 꼬리 정맥을 통해 마우스에 투여하였다. 마우스의 꼬리가 확장되도록 처리 전 약 20분 동안 동물들을 가열 램프 아래에 두어 따뜻하게 한다. 각 마우스를 마우스 억류장치 (Fisher Sci. Cat# 01-288-32A)에 두고, 확장된 꼬리 정맥에 비히클 용액 중의 약물 200 ㎕를 주사하였다. 약물 투여 후, 5 mn, 30 mn, 2 h, 6 h, 16 h의 여러 시점에서 CO2를 흡입시켜 동물들을 안락사시켰다. CO2에의 노출 후 심장 천공 (1 ml BD 주사기 + 27G 5/8 바늘)을 통해 즉시 채혈하였다. 경구 투여를 위해, 공급 주사기를 통한 경구 투여에 앞서 DMSO:카르복시메틸셀룰로스:트윈80:H20의 50:10:1:989 혼합물 중에 약물을 용해시켰다.
약물의 농도를 판단하기 위해, 알티마(Alltima) C18 컬럼 (3μ, 150 mm x 4.6 mm)이 장착된 HPLC (워터스 600 펌프, 워터스 600 컨트롤러 및 워터스 2487 검출기)를 이용하여 혈청 샘플을 분석하였다. NC7, NC48, 및 NC53 화합물은 254 nm 파장에서 검출되었으며, 비칼루트아미드는 270 nm 파장에서 검출되었다.
HPLC 분석을 위한 샘플은 이하의 과정에 따라 제조하였다:
- 원심분리에 의해 혈액 세포를 혈청으로부터 분리하였다.
- 혈청 400 ㎕에 내부 표준물 10 μM 용액 80 ㎕ 및 아세토니트릴 520 ㎕를 첨가하였다. 침전이 일어났다.
- 혼합물을 3 분 동안 볼텍싱한 다음, 초음파하에 30 분 동안 두었다.
- 고체 입자를 여과해 내거나 또는 원심분리에 의해 분리하였다.
- 여액을 아르곤 흐름하에 건조시켰다. 아세토니트릴을 사용해서 샘플을 80 ㎕로 재구성한 다음 HPLC에 의해 분석하여 약물 농도를 판단하였다.
- 표준 약물 곡선을 사용해서 정확도를 개선하였다.
정맥 및 경구 투여로부터 얻은 시간의 함수로서의 혈장 내 NC53의 농도를 도 9에 나타낸다. 비칼루트아미드, NC48 및 NC53의 정상 상태 농도 (Css)는 표 4에 나타낸다. NC53의 정상 상태에서의 농도는 본질적으로 비칼루트아미드의 농도만큼 양호하며, 실질적으로 NC48의 농도보다 우수하다.
명칭 IC50 [nM] LogP Css, 10 mg/kg
[μM]		 Css, 25 mg/kg
[μM]		 Css, 50 mg/kg
[μM]
비칼루트아미드 1000 2.91 10.0 11.4 11.9
NC48 92 3.44 0.39 0.43 0.40
NC53 122 3.20 9.9 10.7 10.2
마우스 혈장에서의 비칼루트아미드, NC48 및 NC53의 정상 상태 농도
안드로겐 수용체 활성은, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, AR 반응 리포터 시스템 또는 전립선 특이적 항원 분비 시스템에서의 억제 농도 (IC50); AR 반응 리포터 시스템 또는 전립선 특이적 항원 분비 시스템에서의 농도 증가와 관련된 유도 배수; 동물 내 관련 종양의 성장; 화합물에 대한 안드로겐 수용체의 결합 친화도; 전립선 특이적 항원 인핸서 또는 전립선 특이적 항원 프로모터에 대한 안드로겐 수용체의 결집; 안드로겐 수용체 핵 전위; 및 안드로겐 수용체 단백질의 불안정화를 비롯해서 여러가지 측면의 안드로겐 수용체 거동의 자극 및 억제를 포괄할 수 있다.
시험관내 검정
도 10은 경쟁 검정 키트 (인비트로겐(Invitrogen)사 제)에 의해 판단된 래트 안드로겐 수용체 (래트 AR)의 리간드 결합 도메인에 대한 화합물의 상대적인 결합 친화도를 나타낸다. 판독으로서 형광 편광을 사용하였다. 각각의 호르몬 투여를 3회 하였고, 평균치로부터 세 개의 값의 표준 오차를 계산하여 상대 오차를 판단하였다. 본 연구는 최소 경쟁 (비히클 단독), 무 수용체, 무 형광 리간드, 및 최대 경쟁 (10-5 M R1881, 프로게스테론, E2 또는 덱사메타손)을 조절하였다. 단일 결합 부위 경쟁 모델을 이용하여 곡선을 맞췄다 (프리즘 통계 분석 소프트웨어 패키지를 사용하였다). R1881이 가장 낮은 평형 해리 상수, Ki = 4 nM를 가졌다 (그리고 래트 안드로겐 수용체는 시험한 네 개의 화합물 중 R1881에 대해 가장 높은 친화도를 가졌다). RU59063은 Ki = 20 nM의 평형 해리 상수를 가졌고, NC53은 Ki = 0.8 μM의 평형 해리 상수를 가졌다. 카소덱스는 Ki = 0.4 μM의 평형 해리 상수를 가졌다 (그리고 래트 안드로겐 수용체는 시험한 네 개의 화합물 중 카소덱스에 대해 가장 낮은 친화도를 가졌다). NC53 및 카소덱스가 유사한 평형 해리 상수를 가지므로, 래트 안드로겐 수용체는 이들 화합물에 대해 유사한 친화도를 가진다.
NC53은 PSA 인핸서 및 PSA 프로모터에 대한 안드로겐 수용체 (NR)의 결집 및 RNA 폴리머라제 II (Pol II)의 결집을 방해한다. 도 11은 본 연구의 결과를 보여준다. 사용한 물질은 AR (업스테이트, cat# 06-680) 및 Pol II (캔버스, cat# MMS-126R)와 크로마틴 IP였다. LNCaP (ATCC) 세포를 충분한 혈청 내에서 평판 배양하였다. 실험날, 플레이트를 1 x PBS로 1회 세척하고, 5 ％ CSS를 3일 동안 첨가하였다. 제1 실험 세트에는 NC53 (R) 10 μM를 첨가하고, 제2 실험 세트에는 비칼루트아미드 (C) 10 μM를 첨가하고, 제3 실험 세트에서는 R1881 (+) 1 nM을 첨가하였다. 이들 각각의 화합물을 6시간 동안 첨가하였다. 제4 실험 세트는 대조군으로 어떤 부가적인 화합물도 첨가하지 않았다 (-). 6 시간 시점에 28 사이클 구동하였다. 업스테이트사의 ChIP 키트 (cat# 17-295)를 사용하였다. 인핸서 및 프로모터 프라이머는 각각 루이(Louie) (문헌 [PNAS 2003 Vol. 100, pp. 2226-2230]) 및 샹 (Shang) (문헌 [Molecular Cell 2002 vol. 9, pp. 601-610)으로부터 수득하였다. NC53 (R)를 첨가한 실험에서의 짙은 상은 NC53이 안드로겐 수용체를 방해하고, RNA 폴리머라제 II가 전립선 특이적 항원 (PSA) 유전자 상에서 전사 복합체를 형성하는 것을 방해함을 나타낸다. 이와 대조적으로, 비칼루트아미드 (카소덱스, C)를 첨가한 실험에서의 밝은 상은 비칼루트아미드의 존재하에서 안드로겐 수용체 및 RNA 폴리머라제 II가 PSA mRNA를 전사하기 위해 PSA 부위에 여전히 결집하고 있음을 나타낸다.
NC53은 LNCaP 세포에서 안드로겐 수용체 핵 전위를 억제한다. 도 12 및 13은 본 연구의 결과를 보여준다. LNCaP 세포를 5 ％ CSS 중에서 평판 배양하였다. 제1 세포 세트를 NC53 (R) 10 μM로 처리하고, 제2 세포 세트를 비칼루트아미드 (C) 10 μM로 처리하고, 제3 세포 세트를 R1881 (+) 1nM로 처리하였다. 제4 세포 세트는 대조군으로서 제공되었다 (-). 핵 분획을 조절하기 위해 TOPO I (산타 크루즈, cat# sc-32736)을 사용하였고, 세포질 분획을 조절하기 위해 GAPDH (산타 크루즈, cat# sc-20357)을 사용하였다. 세포이하 구성요소의 분리 (subcellular fractionation)를 위해 LNCaP 세포를 수확하거나, 안드로겐 수용체 (AR) (산타 크루즈, cat# sc-815)에 대해 FITC (산타 크루즈) 표지된 항체로 염색하였다. 세포이하 구성요소의 분리로부터 도 12에 나타낸 바와 같은 상을 얻었다. 비칼루트아미드 (카소덱스, C)가 처리된 샘플에 있어서 핵 분획에서의 짙은 상은 비칼루트아미드가 안드로겐 수용체 핵 전위를 유도함을 나타낸다. NC53 (R)이 처리된 샘플에서의 밝은 상은 NC53이 핵 전위를 봉쇄했음을 나타낸다. AR-FITC 검정을 위해 DAPI-함유 배지를 이용하여 유리 슬라이드 상에 커버 슬립을 올리고, DAPI 및 FITC에 대한 필터가 장착된 X60의 형광 니콘 현미경을 이용하여 세포를 24시간 넘게 상을 비추었다. AR-FITC 검정에서, R1881 및 비칼루트아미드가 처리된 세포의 핵은 도 13에서 도시한 바와 같이 뚜렷한 녹색이었고, 이것은 안드로겐 수용체의 핵 전위가 일어났음을 나타낸다. 이와 대조적으로, DMSO 및 NC53이 처리된 세포의 핵은 녹색이 덜했다.
NC53은 LNCaP 세포 내 안드로겐 수용체 단백질을 불안정하게 한다. 도 14는 본 연구의 결과를 보여준다. 본 연구는 105 개의 LNCaP (fgc) 세포를 5％ CSS 중에서 3일 동안 평판 배양시키는 것에 의해 수행되었다. R1881 100 pM을 제1 세포 세트에 첨가하였고 (+), 비칼루트아미드 10 μM을 제2 세포 세트에 첨가하였고 (B), NC53 10 μM을 제3 세포 세트에 첨가하였고 (RD), R1881 100 pM과 비칼루트아미드 10 μM을 제4 세포 세트에 첨가하였고 (B+), R1881 100 pM과 NC53 10 μM을 제5 세포 세트에 첨가하였다 (RD+). R1881, 비칼루트아미드 뿐만 아니라 NC53도 제6 세포 세트에는 첨가하지 않았다 (-). 첨가된 비칼투르아미드, NC53, 및/또는 R1881과 함께 24 시간 동안 (또는 (-) 세트의 경우에는 어떤 것도 없는 상태에서 24 시간 동안) 세포를 체류시켰다. 도 14에 있어서, 비칼루트아미드 (B)를 첨가한 세트 및 비칼루트아미드와 R1881 (B+)을 첨가한 세트에서의 짙은 상은 안드로겐 수용체 단백질이 이들 화합물의 조합을 첨가했을때의 수준임을 나타낸다. 이와 대조적으로, NC53 (RD)을 첨가한 세트 및 NC53과 R1881 (RD+)을 첨가한 세트에서의 밝은 상은 NC53의 첨가가, R1881의 존재 여부와 관계없이, 안드로겐 수용체 단백질의 분해를 야기함을 나타낸다.
Tier에서의 화합물의 순위
표 5 내지 10은 Tier 1-6으로 그룹화된 디아릴히단토인 화합물을 나타낸다. 표 11은 Tier로 분류되지 않은 디아릴히단토인 화합물을 나타낸다. 화합물을 Tier로 분류하는 것은 분석학적 판단과 연계된 이용가능한 데이터를 기초로 하였다. 고려된 데이터는 시험관내 검정 (LNCaP 세포주에서의 AR 반응 리포터 시스템, PSA 수준 측정, MTS 미토콘드리아 검정) 및 생체내 실험 (직접 측정되거나 루시퍼라제 리포터 유전자에 의해 유도된 방출에 의해 측정된 종양 크기, 혈액 혈장 수준을 기초로 한 약물동태학적 검정)을 포함하였다. 모든 화합물을 각각 검정한 것은 아니다. 산출된 모든 데이터를 나타내지는 않았다. 전립선 암 치료에서의 유용성에 대하여 화합물을 서로 상대적으로 순위를 매기는데 있어서, 특히 동일한 실험을 수행하지 않은 두 화합물의 순위를 매기는 경우에 판단을 적용하였다. 순위를 매기는데 있어서 고려된 특징들에는 AR 길항 활성, 호르몬 불응성 세포에서 AR 효능작용의 결여, 종양 성장 방해, 종양 수축, 및 약물동태학적 거동이 포함되며, 혈중에서의 체류 시간이 더 길수록 유리하였다.
Tier 1
일반적으로 Tier 1 화합물은 이치환된 좌방향 아릴 고리를 가진 디아릴티오히단토인으로 우측 히단토인 탄소 상에서 이치환되고, 좌측 히단토인 탄소 상에 산소 또는 N 치환체를 갖는다. 아미도 치환체는, 예컨대 시험관내 및 생체내의 생물학적 시스템에서 직면하게 되는 수용액 중에서 산소로 가수분해될 것으로 예측된다. NC63은 좌방향 아릴 고리상에 CF3 치환체 대신 요오드가 존재하며, 양호한 활성을 갖는다.
Tier 1 화합물 (표 5 참조)은 전립선 암 치료에 있어서 비칼루트아미드보다 훨씬 더 양호할 것으로 판단되었다. 그러나, NC7 및 NC48은 신속하게 대사되는 것으로, 즉 혈액 중의 체류 시간이 짧은 것으로 밝혀졌다. NC53은 바람직한 약동학을 갖는다.
도 16은 비칼루트아미드 처리시에는 LNCaP 세포에서의 PSA 수준이 비히클 용액 처리시와 동일하게 유지되거나 증가되지만, NC53 처리시에는 PSA 수준이 감소됨을 보여준다. 도 17은 비히클 용액 처리시에 종양 크기가 계속 증가됨을 보여준다. 이와 대조적으로, 체중 1 kg 당 1일 1 mg의 용량으로 NC53을 처리한 경우에는 종양의 증가 속도가 감소되었고, 약 17일 후에는 종양 크기가 안정화된 것으로 여겨졌다. 체중 1 kg 당 1일 10 mg의 용량으로 NC53을 처리한 경우에는 종양 크기가 시간에 따라 감소되었다. 도 18은 체중 1 kg 당 1일 10 mg일의 용량으로 NC53을 처리한 경우에 루시퍼라제 활성과 관련된 광자 방출이 감소됨을 보여준다. 도 19는 상기 용량의 NC53을 처리한 경우에 종양 크기가 감소되거나 안정화되고, 루시퍼라제 활성과 관련된 광자 방출이 감소됨을 보여준다.
도 20은 NC53, NC54, NC55, NC56, 및 NC57을 100, 200, 500 및 1000 nM의 용량으로 처리한 경우에 LN-AR 세포의 PSA 수준이 감소됨을 보여준다. 또한, 용량이 높을 수록 PSA 수준이 낮아진다. 도 22는 무손상 마우스 및 거세된 마우스에 대한 초기 및 비칼루트아미드 처리 또는 NC53 처리 14일 후의 비뇨생식관 중량 및 루시퍼라제 활성과 관련된 광자 방출 속도를 나타낸다. 중량 및 광자 방출 속도는 무손상 마우스와 거세된 마우스 둘 다에서 증가되었다. 거세된 마우스에 NC53을 처리하면, 비칼루트아미드 처리시와 마찬가지로, 미처리 거세된 마우스에 비하여 중량 및 광자 방출이 감소되었다.
따라서, Tier 1 화합물은 AR 길항제로서, 또한 호르몬 불응성 전립선 암을 위한 치료제로서 사용하기에 특히 유익하다. 이것들은 기타 AR 관련 질환 또는 증상, 예컨대 양성 전립선 과다형성, 탈모 및 여드름의 치료에 유용할 수 있다. 이들 화합물 및 관련 화합물은 또한 기타 핵 수용체, 예컨대 글루코코르티코이드 수용체, 에스트로겐 수용체 및 퍼옥시좀 증식자-활성화 수용체의 조절자로서 유용할 수도 있고, 핵 수용체가 소정의 역할을 하는 질환, 예컨대 유방암, 난소암, 당뇨병, 심장 질환 및 대사 관련 질환의 치료제로서 유용할 수도 있다. 이것들은 검정시에 표준물 또는 중간체 또는 전구약물 등으로서 유용할 수 있다.
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Figure pat00048
Figure pat00049
Tier 2
NC12가 효능제로서 작용할 수 있다는 지표가 있었지만, Tier 2 화합물 (표 6 참조)이 전립선 암 치료에 있어서 비칼루트아미드보다 유의하게 더 양호하였다. 도 3은 125 nM 내지 1000 nM 범위의 농도로 투여된 Tier 1의 화합물 NC66, NC67, NC68, NC53, 및 NC69 및 Tier 2의 화합물 NC77이 LNCaP-AR 세포에서 루시퍼라제 활성을 감소시키는 작용을 하는 반면, DMSO 및 비칼루트아미드의 대조 용액은 효과가 거의 없거나 전혀 없음을 보여준다. 1000 nM 농도의 Tier 1의 화합물 NC7 및 NC48이 Tier 2의 NC43, NC44, 및 NC50 보다 LNCaP-AR 세포에서의 PSA 수준을 더 크게 감소시킨다는 것이 확인되었다. 도 7은 시간에 따른 종양의 부피를 보여주며, 비칼루트아미드 또는 비히클 용액 처리시에는 종양이 계속 성장하지만, Tier 1의 NC53 처리시에는 종양 크기가 감소됨을 보여준다. 도 8은 비칼루트아미드 처리시에는 루시퍼라제 활성과 관련된 광자 방출이 비히클 용액 처리시와 대략 동일하게 유지되거나 증가되지만, NC53 처리시에는 광자 방출이 감소됨을 보여준다. 도 23은 비칼루트아미드 처리시에는 PSA 수준이 거의 감소되지 않거나 전혀 감소되지 않지만, NC48 및 NC53 처리시에는 PSA 수준이 감소됨을 보여준다. 도 24는 Tier 1의 NC7, NC48, 및 NC53에 대한 IC50이 비칼루트아미드에 대한 IC50보다 훨씬 더 낮음을 보여준다.
일반적으로, Tier 2 화합물은 Tier 1 화합물과 구조적으로 유사하지만, 우방향 아릴 고리상의 치환체가 상이하다. Tier 2 화합물은 AR 길항제로서, 또한 호르몬 불응성 전립선 암을 위한 치료제로서 사용하기에 유익하다. 이것들은 기타 AR 관련 질환 또는 증상, 예컨대 양성 전립선 과다형성, 탈모 및 여드름의 치료에 유용할 수 있다. 이들 화합물 및 관련 화합물은 또한 기타 핵 수용체, 예컨대 에스트로겐 수용체 및 퍼옥시좀 증식자-활성화 수용체의 조절자로서 유용할 수도 있고, 핵 수용체가 소정의 역할을 하는 질환, 예컨대 유방암, 난소암, 당뇨병, 심장 질환 및 대사 관련 질환의 치료제로서 유용할 수도 있다. 이것들은 검정시에 표준물 또는 중간체 또는 전구약물 등으로서 유용할 수 있다.
Figure pat00050
Figure pat00051
Tier 3
Tier 3 화합물 (표 7 참조)은 전립선 암 치료에 있어서 비칼루트아미드보다 약간 더 양호한 것으로 판단되었다. NC43, NC44, 및 NC50 (Tier 2)은 LNCaP-AR 세포의 PSA 수준을 Tier 3의 NC45 및 NC49 보다 더 크게 감소시켰다. 이들 화합물 모두는 비칼루트아미드보다 PSA 수준을 더 크게 감소시켰다.
다른 Tier 3 화합물 (나타내지 않음)은 디아릴티오히단토인이 아니었으며, 활성 면에서 선행 기술의 모노아릴히단토인 화합물 NC83, NC79 및 NC80에 필적하였다.
따라서, Tier 3 화합물은 AR 길항제로서, 또한 호르몬 불응성 전립선 암을 위한 치료제로서 유용하다. 이것들은 기타 AR 관련 질환 또는 증상, 예컨대 양성 전립선 과다형성, 탈모 및 여드름의 치료에 유용할 수 있다. 이들 화합물 및 관련 화합물은 또한 기타 핵 수용체, 예컨대 에스트로겐 수용체 및 퍼옥시좀 증식자-활성화 수용체의 조절자로서 유용할 수도 있고, 핵 수용체가 소정의 역할을 하는 질환, 예컨대 유방암, 난소암, 당뇨병, 심장 질환 및 대사 관련 질환의 치료제로서 유용할 수도 있다. 이것들은 검정시에 표준물 또는 중간체 또는 전구약물 등으로서 유용할 수 있다.
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Tier 4
Tier 4 화합물 (표 8 참조)은 전립선 암 치료에 있어서 비칼루트아미드보다 더 양호하지는 않은 것으로 판단되었다. Tier 4의 NC93 및 NC94와 Tier 1의 NC7은, 예를 들어 히단토인 고리의 하부 우측 탄소 상의 치환체 만이 다르다. 우방향 아릴 고리 상의 치환체 또한 활성에 영향을 미칠 수 있다.
몇몇 Tier 4 화합물 (나타낸 것들과 나타내지 않은 것들 포함)은 디아릴 화합물이 아니고/거나 (우방향 아릴 고리가 없음), 티오히단토인이 아니고/거나, 하부 우방향 히단토인 고리 상의 탄소가 이치환되지 않고/거나, 히단토인 고리의 하부 좌방향 탄소 상에 산소 또는 아미도 이외의 치환체를 갖는다. 이는, 히단토인 고리의 하부 우방향 탄소에서 이치환되고 히단토인 고리의 하부 좌방향 탄소 상에 산소 또는 아미도를 갖는 디아릴티오히단토인이 매우 유익하다는 증거를 제공한다.
따라서, Tier 4 화합물은 적어도 비칼루트아미드와 동등한 정도까지는 AR 길항제로서, 또한 호르몬 불응성 전립선 암을 위한 치료제로서 유용할 수 있다. 이것들은 기타 AR 관련 질환 또는 증상, 예컨대 양성 전립선 과다형성, 탈모 및 여드름의 치료에 유용할 수 있다. 이들 화합물 및 관련 화합물은 또한 기타 핵 수용체, 예컨대 에스트로겐 수용체 및 퍼옥시좀 증식자-활성화 수용체의 조절자로서 유용할 수도 있고, 핵 수용체가 소정의 역할을 하는 질환, 예컨대 유방암, 난소암, 당뇨병, 심장 질환 및 대사 관련 질환의 치료제로서 유용할 수도 있다. 이것들은 검정시에 표준물 또는 중간체 또는 전구약물 등으로서 유용할 수 있다.
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Figure pat00054
Tier 5
Tier 5 화합물 (표 9 참조)은 불활성이거나 거의 불활성이었고, 따라서 전립선 암 치료에 있어서 비칼루트아미드보다 불량하였다. 우방향 아릴 고리상의 치환체는 활성을 결정하는데 중요하다.
몇몇 Tier 5 화합물 (일부는 나타내었고, 일부는 나타내지 않음)은 디아릴 화합물이 아니고/거나 (우방향 아릴 고리가 없음), 티오히단토인이 아니고/거나, 하부 우방향 히단토인 고리 상의 탄소가 이치환되지 않고/거나, 히단토인 고리의 하부 좌방향 탄소 상에 산소 또는 아미도 이외의 치환체를 갖는다. 이는, 히단토인 고리의 하부 우방향 탄소에서 이치환되고 히단토인 고리의 하부 좌방향 탄소 상에 산소 또는 아미도를 갖는 디아릴티오히단토인이 매우 유익하다는 증거를 제공한다. 특히, NC103, NC104, 및 NC106 (CH2NRxRy, 여기서 Rx,y = H 또는 메틸임)의 말단 치환체는 이들 화합물의 활성에 기여하는 것으로 보이지 않는다.
Tier 5 화합물은 전립선 암 치료용으로 또는 AR 길항제로서는 바람직하지 않았지만, 이들 화합물 및 관련 화합물은 기타 핵 수용체, 예컨대 에스트로겐 수용체 및 퍼옥시좀 증식자-활성화 수용체의 조절자로서 유용할 수 있고, 핵 수용체가 소정의 역할을 하는 질환, 예컨대 유방암, 난소암, 당뇨병, 심장 질환 및 대사 관련 질환의 치료제로서 유용할 수 있다. 이것들은 검정시에 표준물 또는 중간체 또는 전구약물 등으로서 유용할 수 있다.
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Tier 6
Tier 6 화합물 (표 10 참조)은 불활성이거나 거의 불활성인 데다가 강력한 효능제이므로, 전립선 암 치료에 있어서 비칼루트아미드보다 훨씬 더 불량하였다. 비교예 화합물은 본 발명의 화합물에 비해 매우 불량한 것으로 분류되었다. 특히, 좌방향 아릴 고리에 염소 치환체를 갖는 NC107은 Tier 1로 분류된 트리플루오로메탄을 갖는 NC2 및 요오드를 갖는 NC63에 비해 매우 불량한 활성을 가졌다. Tier 6 화합물에 대한 결과는, 히단토인 고리의 하부 우방향 탄소에서 이치환되고 히단토인 고리의 하부 좌방향 탄소 상에 산소 또는 아미도를 가지며, 좌방향 아릴 고리 상에 특정 치환체를 갖는 디아릴티오히단토인이 매우 유익하다는 증거를 제공한다.
Tier 6 화합물은 전립선 암 치료용으로 또는 AR 길항제로서는 바람직하지 않았다.
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Tier로 분류되지 않은 화합물
몇가지 화합물에 대해서는 순위를 매기기에 불충분한 실험 데이터를 얻었다. Tier로 분류되지 않은 이들 화합물을 표 11에 나타낸다.
본 발명의 데이타와 방법을 기초로 하고, 본원에 나타내지 않은 일부 화합물을 비롯한 많은 화합물에 대한 검토를 기초로 판단할 때, Tier로 분류되지 않은 화합물에 대하여 몇가지 사항을 관찰할 수 있다. 비교예 NC108은 비교예 NC78 내지 NC80과 더불어 Tier 3일 것으로 예측된다. NC113은 NC7 (Tier 1)로 가수분해될 것으로 예측되며, 따라서 그와 동등한 활성을 가질 것이다. NC114는 NC16 (Tier 1)로 가수분해될 것으로 예측되며, 따라서 그와 동등한 활성을 가질 것이다. NC115는 NC3 (Tier 1)으로 가수분해될 것으로 예측되고, NC120 및 NC121은 NC50 (Tier 2)으로 가수분해될 것으로 예측되며, 따라서 이들은 그와 동등한 활성을 가질 것이다.
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간략하게, 전립선 암의 치료에 있어서 비칼루트아미드보다 훨씬 우수할 것이라는 증거를 보이는 신규 화합물들이 동정되고 생성되었다.
화합물의 구조적 차이에 대한 항암 활성의 감수성
본 발명자들은 히단토인 화합물 구조상에서 작은 변화라 할 수 있는 무엇이 전립선 암 치료에 있어서의 화합물 성능에 큰 변화를 초래할 수 있는지를 판단하였다. 예를 들어, NC77 및 NC53은 아릴 고리에서의 단일 불소 치환체 만이 다르며, NC53은 Tier 1인 반면에 NC77은 Tier 2이고, 둘다 전립선 암의 치료에 있어서 비칼루트아미드보다는 양호하지만 NC53이 더 우수하다. 그러나, NC98은 메틸카르바모일기와 아릴 고리 사이에 추가로 탄소 원자를 갖는다는 점에서만 NC77과 다르지만, 전립선 암의 치료에 있어서 비칼루트아미드보다 더 양호하지는 않으며, Tier 4로 분류된다. NC77, NC53, 및 NC98이 루시퍼라제 활성에 미치는 효과는 도 25에서 확인할 수 있다. 화합물의 주어진 농도에서, NC77 및 NC53에 노출시의 루시퍼라제 활성은 NC98에 노출시의 루시퍼라제 활성보다 덜하다.
NC4는 히드록실기 대신 아미노기로 치환되어 있다는 점에서만 NC3과 다르다. 그러나, NC3은 Tier 1이고 전립선 암의 치료에 있어서 비칼루트아미드보다 훨씬 더 양호한 반면, NC4는 Tier 4이고, 비칼루트아미드보다 더 양호하지 않다. NC3 및 NC4가 1AR 세포주에서 루시퍼라제 활성에 미치는 효과는 다양한 화합물을 1.25 내지 10 μM 범위의 농도로 투여하고 PSA 수준을 관찰함으로써 연구하였다. 주어진 용량에서, NC3에 노출시의 루시퍼라제 활성은 NC4에 노출시의 루시퍼라제 활성보다 덜하다. NC3 및 NC4가 4AR 세포주에서 루시퍼라제 활성에 미치는 효과는 다양한 화합물을 1.25 내지 10 μM 범위의 농도로 투여하고 루시퍼라제 활성을 관찰함으로써 연구하였다. 주어진 용량에서, NC3에 노출시의 루시퍼라제 활성은 NC4에 노출시의 루시퍼라제 활성보다 덜하다. NC3 및 NC4가 LN/AR 세포주에서 PSA 수준에 미치는 효과는 다양한 화합물을 1.25 내지 10 μM 범위의 농도로 투여하고 루시퍼라제 활성을 관찰함으로써 연구하였다. 주어진 용량에서, NC3에 노출시의 PSA 수준은 NC4에 노출시의 PSA 수준보다 덜하다.
NC47 및 NC48은 카르바모일기 말단의 메틸 치환체만이 서로 다르며 둘다 Tier 1로 분류되지만, NC48이 특히 유리한 것으로 확인되었다. NC46은 아미노기 대신 메톡시기로 치환된 점을 제외하고는 NC47과 동일하다. 그러나, NC46은 Tier 3으로 분류된다. NC42는 NC46과 유사하지만, 아릴 고리에 에스테르기를 연결시키는 쇄 중의 탄소수가 1개 적다. NC42는 Tier 3으로 분류된다. NC47, NC48, NC42, 및 NC46이 LN/AR 세포주에서 PSA 수준에 미치는 효과는 다양한 화합물을 125 nM 내지 1000 nM 범위의 농도로 투여하고 PSA 수준을 관찰함으로써 연구하였다. 주어진 농도에서, NC47 및 NC48에 노출시의 PSA 수준은 NC42 및 NC46에 노출시의 PSA 수준보다 덜하다.
NC68 및 NC103은, NC68이 아릴 고리에 부착된 메틸카르바모일기 및 티오히단토인기에 부착된 디메틸 치환체를 갖는 반면에, NC103은 우방향 아릴 고리에 부착된 메틸아미노기 및 티오히단토인기에 부착된 시클로부틸 치환체를 갖는다는 점에서 서로 다르다. NC68이 Tier 1이고 전립선 암의 치료에 있어서 비칼루트아미드보다 훨씬 더 양호한 반면, NC103은 Tier 5이고 전립선 암의 치료에 있어서 불활성이거나 거의 불활성이다. NC68 및 NC103이 LN/AR 세포주에서 루시퍼라제 활성에 미치는 효과는 다양한 화합물을 125 nM 내지 1000 nM 범위의 농도로 투여하고 루시퍼라제 활성을 관찰함으로써 연구하였다. 주어진 농도에서, NC68에 노출시의 루시퍼라제 활성은 NC103에 노출시의 루시퍼라제 활성보다 덜하다.
NC16 및 NC18은 티오기 치환 vs. 옥소기 치환 및 시클로부틸 치환체 vs. 디메틸 치환체의 측면에서 서로 다르다. NC16은 Tier 1인 반면에 NC18은 Tier 4이다.
제약 조성물 및 투여
본 발명의 화합물은 본원에서 정의하는 바와 같은 치료상 유효량의 본 발명의 화합물 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제로 제조된 제약 조성물로서 유용하다.
본 발명의 디아릴히단토인 화합물은 제약 조성물로서 제형화되어, 치료가 필요한 대상체, 예를 들어 포유동물, 예컨대 인간 환자에게 선택된 투여 경로, 예를 들어 경구, 비측, 복강내, 또는 비경구, 정맥내, 근육내, 국소 또는 피하 경로, 또는 조직내 주사 등에 적합한 다양한 형태로 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명의 디아릴히단토인 화합물은 제약상 허용되는 비히클, 예컨대 불활성 희석제 또는 흡수성 식용 담체와 함께 예를 들면 경구로, 또는 흡입 또는 취입을 통해 전신 투여될 수 있다. 이들은 경질 또는 연질 껍질의 젤라틴 캡슐 내에 봉입되거나, 정제로 압착되거나, 또는 환자의 식사용 음식에 직접 혼입될 수 있다. 치료용 경구 투여의 경우, 디아릴히단토인 화합물은 1종 이상의 부형제와 배합되어 섭취가능한 정제, 협측 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘릭시르제, 현탁액제, 시럽제, 웨이퍼제 등의 형태로 사용될 수 있다. 디아릴히단토인 화합물은 미분 불활성 담체와 배합되어 대상체에 의해 흡입되거나 취입될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 0.1％ 이상의 디아릴히단토인 화합물을 함유해야 한다. 물론, 조성물 및 제제 중의 백분율은 달라질 수 있으며, 알맞게는 주어진 단위 투여 형태 중량의 약 2％ 내지 약 60％일 수 있다. 이와 같이 치료적으로 유용한 조성물 중의 디아릴히단토인 화합물의 양은 유효 투여 수준이 달성되는 양이다.
정제, 트로키제, 환제, 캡슐제 등은 또한 하기 성분을 함유할 수도 있다: 결합제, 예컨대 트라가칸트 고무, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 인산이칼슘; 붕해제, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트; 및 감미제, 예컨대 수크로스, 프럭토스, 락토스 또는 아스파르탐 또는 향미제, 예컨대 페퍼민트, 윈터그린 오일, 또는 체리향이 가해질 수 있다. 단위 투여 형태가 캡슐제인 경우, 상기 유형의 물질 이외에도 액체 담체, 예컨대 식물성유 또는 폴리에틸렌 글리콜을 함유할 수 있다. 다양한 기타 물질이 코팅물로서 존재할 수도 있고, 고체 단위 투여 형태의 물리적 형태가 달리 변형되도록 할 수도 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캡슐제는 젤라틴, 왁스, 쉘락 또는 당 등으로 코팅될 수 있다. 시럽제 또는 엘릭시르제는 활성 화합물, 감미제로서의 수크로스 또는 프럭토스, 보존제로서의 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 향미제, 예컨대 체리향 또는 오렌지향을 함유할 수 있다. 물론, 임의의 단위 투여 형태 제조에 사용되는 임의의 물질은 제약상 허용되는 것이어야 하고, 사용량에서 실질적으로 비-독성이어야 한다. 또한, 디아릴히단토인 화합물은 서방형 제제 및 장치로 혼입될 수 있다. 예를 들어, 디아릴히단토인 화합물은 지속 방출형 캡슐제, 지속 방출형 정제 및 지속 방출형 환제로 혼입될 수 있다.
디아릴히단토인 화합물은 또한 주입 또는 주사를 통해 정맥내 또는 복강내 투여될 수도 있다. 디아릴히단토인 화합물의 용액은 비독성 계면활성제와 임의로 혼합된 수중에서 제조할 수 있다. 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 트리아세틴 및 이들의 혼합물 및 오일 중에서 분산액제를 제조할 수도 있다. 통상의 저장 및 사용 조건하에서, 이들 제제는 미생물 성장을 방해하기 위한 보존제를 함유할 수 있다.
주사 또는 주입에 적합한 제약 투여 형태는, 임의로 리포좀 내에 캡슐화된 주사용 또는 주입용 멸균 용액 또는 분산액의 즉시 투여용 제제에 적합한 디아릴히단토인 화합물을 포함하는 멸균 수용액제 또는 분산액제 또는 멸균 산제를 포함할 수 있다. 모든 경우에 있어서, 궁극적인 투여 형태는 멸균된 액체여야 하고, 제조 및 저장 조건하에 안정적이어야 한다. 액체 담체 또는 비히클은 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성유, 비독성 글리세릴 에스테르 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 액체 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 리포좀의 형성, 분산액제의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지, 또는 계면활성제의 사용 등에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용 방해는 각종 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등을 사용하여 달성할 수 있다. 많은 경우에서, 등장화제, 예를 들어 당, 완충제 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장 흡수는 조성물 중에 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하여 달성할 수 있다.
주사용 멸균 용액제는 디아릴히단토인 화합물을, 필요한 경우에는 상기에서 열거한 다양한 기타 성분을 함유하는 적절한 용매 중에 필요량으로 혼입시킨 후에 멸균 여과시켜 제조한다. 주사용 멸균 용액제 제조용 멸균 산제의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술이고, 이것으로 활성 성분의 분말 및 앞서 멸균-여과시킨 용액 중에 존재하는 임의의 부가적인 목적으로 하는 성분이 수득된다.
국소 투여의 경우, 디아릴히단토인 화합물은 순수한 형태로 적용될 수 있다. 그러나, 이들을 피부과학적으로 허용되는 담체와 함께 조성물 또는 제제로서 피부에 투여하는 것이 일반적으로 바람직할 것이며, 이는 고체 또는 액체일 수 있다.
유용한 고체 담체로는 미분 고체, 예컨대 활석, 점토, 미세결정질 셀룰로스, 실리카, 알루미나 등이 있다. 그 밖의 고체 담체로는 비독성 중합체 나노입자 또는 마이크로입자가 있다. 유용한 액체 담체로는 물, 알콜 또는 글리콜 또는 물/알콜/글리콜 블렌드 등이 있으며, 디아릴히단토인 화합물은 임의로 비독성 계면활성제의 보조하에 유효 수준으로 이 중에 용해되거나 분산될 수 있다. 주어진 용도를 위한 성질을 최적화하기 위해 보조제, 예컨대 향료 및 부가적인 항-미생물제가 첨가될 수 있다. 생성된 액체 조성물은 붕대 및 기타 드레싱을 함침시키는데 사용되는 흡수 패드에 도포되거나, 펌프형 또는 에어로졸형 분무기에 의해 감염 부위에 분무될 수 있다.
또한, 증점제, 예컨대 합성 중합체, 지방산, 지방산 염 및 에스테르, 지방 알콜, 개질된 셀룰로스 또는 개질된 미네랄 물질을 액체 담체와 함께 사용하여, 사용자의 피부에 직접 도포하기 위한 산포가능한 페이스트제, 겔제, 연고제, 비누 등을 형성할 수 있다.
디아릴히단토인 화합물을 피부에 전달하는데 사용할 수 있는 유용한 피부 조성물의 예는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 재케트(Jacquet) 등의 미국 특허 제4,608,392호, 게리아(Geria)의 미국 특허 제4,992,478호, 스미스(Smith) 등의 미국 특허 제4,559,157호 및 워츠만(Wortzman)의 미국 특허 제4,820,508호를 참조하며, 이들은 모두 본원에 참고로 포함된다.
화학식 I 화합물의 유용한 투여량은 그들의 시험관내 활성 및 동물 모델에서의 생체내 활성을 비교함으로써 판단할 수 있다. 마우스 및 기타 동물에서의 유효 투여량을 인간에게 외삽적용하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,938,949호를 참조하고, 이는 본원에 참고로 포함된다.
예를 들어, 액체 조성물, 예컨대 로션제 중의 디아릴히단토인 화합물의 농도는 약 0.1 내지 25 중량％ 또는 약 0.5 내지 10 중량％일 수 있다. 반고체 또는 고체 조성물, 예컨대 겔제 또는 산제 중의 농도는 약 0.1 내지 5 중량％ 또는 약 0.5 내지 2.5 중량％일 수 있다.
치료에 요구되는 디아릴히단토인 화합물의 양은 선택된 특정 염 뿐만 아니라 투여 경로, 치료할 증상의 속성 및 환자의 연령 및 상태에 따라서도 달라질 것이고, 궁극적으로는 담당 의사 또는 임상의의 자유재량일 것이다.
본 발명의 작용제의 유효 투여량 및 투여 경로는 통상적이다. 작용제의 정확한 양 (유효 용량)은, 예를 들어 대상체의 종, 연령, 체중 및 일반적 상태 또는 임상적 상태, 치료될 임의의 장애의 중증도 또는 메카니즘, 사용되는 특정 작용제 또는 비히클, 투여 방법 및 스케쥴 등에 따라 대상체 마다 다를 것이다. 치료상 유효 용량은 당업자에게 공지된 통상의 과정에 따라 경험적으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, eds., Macmillan Publishing Co., New York]을 참조한다. 예를 들어, 세포 배양 검정 또는 적합한 동물 모델에서 유효 용량을 초기에 추정할 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 판단하는데 이용할 수 있다. 이후에는 이러한 정보를 이용하여 인간에서의 유용한 용량 및 투여 경로를 판단할 수 있다. 치료 용량은 또한 동등한 치료제의 투여량에 대한 유추를 통해 선택할 수도 있다.
특정 투여 방식 및 투약법은 담당 임상의가 사례의 세부사항 (예를 들어, 대상체, 질환, 관련된 질환 상태, 및 치료가 예방적인지의 여부)을 고려하여 선택할 것이다. 치료는 수 일 내지 수 개월 또는 심지어 수 년에 걸쳐 화합물(들)의 1일 투여 또는 1일 다회 투여를 포함할 수 있다.
그러나, 일반적으로 적합한 용량은 1일 체중 1 kg 당 약 0.001 내지 약 100 mg, 예를 들어 약 0.01 내지 약 100 mg, 예컨대 1 kg 당 약 0.1 mg 초과, 또는 1일 수용자의 체중 1 kg 당 1일 약 1 내지 약 10 mg의 범위일 것이다. 예를 들어, 적합한 용량은 1일 체중 1 kg 당 약 1 mg, 10 mg 또는 50 mg일 수 있다.
디아릴히단토인 화합물을, 예를 들면 단위 투여 형태 당 활성 성분을 0.05 내지 10000 mg, 0.5 내지 10000 mg, 5 내지 1000 mg, 또는 약 100 mg 함유하는 단위 투여 형태로 알맞게 투여한다.
디아릴히단토인 화합물을 최고 혈장 농도, 예를 들어 약 0.5 내지 약 75 μM, 약 1 내지 50 μM, 약 2 내지 약 30 μM, 또는 약 5 내지 약 25 μM에 이르도록 투여할 수 있다. 바람직한 혈장 농도의 예로는, 0.25, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100 또는 200 μM 이상, 또는 그 이하 등이 있다. 예를 들어, 혈장 수준이 약 1 내지 100 μM 또는 약 10 내지 약 25 μM일 수 있다. 이것은, 예를 들어 임의로는 염수 중의 디아릴히단토인 화합물 0.05 내지 5％ 용액을 정맥내 주사하여, 또는 디아릴히단토인 화합물을 약 1 내지 100 mg 함유하는 볼루스(bolus)로 경구 투여하여 달성할 수 있다. 바람직한 혈중 수준은 1시간에 체중 1 kg 당 약 0.00005 내지 5 mg, 예를 들어 1시간에 체중 1 kg 당 0.00005, 0.0005, 0.005, 0.05, 0.5, 또는 5 mg 이상 또는 그 이하가 제공되도록 연속 주입하여 유지시킬 수 있다. 별법으로, 그러한 수준은 체중 1 kg 당 디아릴히단토인 화합물을 약 0.0002 내지 20 mg, 예를 들어 체중 1 kg 당 0.0002, 0.002, 0.02, 0.2, 2, 20, 또는 50 mg 이상 또는 그 이하로 함유하는 간헐적 주입으로 달성할 수도 있다.
디아릴히단토인 화합물은 단일 용량으로, 또는 적절한 간격으로 투여되는 분할 용량으로, 예컨대 하루에 2회, 3회, 4회, 또는 그 이상의 소-용량으로 알맞게 존재할 수 있다. 소-용량 그 자체는, 예를 들어 수 회 불연속적이고 불균일한 간격의 투여로 더욱 분할될 수 있다 (예컨대 취입기로부터의 다중 흡입).
상기에서 동정된 다수의 화합물은 호르몬 불응성 전립선 암 세포에 대해 거의 또는 전혀 효능제 활성을 나타내지 않는다. 이들 화합물은 강력한 AR 억제제이기 때문에, 전립선 암을 치료하는데 뿐만 아니라 그 밖의 AR 관련 질환 또는 증상, 예컨대 양성 전립선 과다형성, 탈모 및 여드름을 치료하는데 사용할 수 있다. AR은 핵 수용체 패밀리에 속하므로, 이들 화합물은 그 밖의 핵 수용체, 예컨대 에스트로겐 수용체 및 퍼옥시좀 증식자-활성화 수용체를 표적으로 하는 약물 합성을 위한 틀로서 작용할 수 있다. 따라서, 이들 화합물은 핵 수용체가 소정의 역할을 하는 기타 질환들, 예컨대 유방암, 난소암, 당뇨병, 심장 질환, 및 대사 관련 질환을 위해 더욱 개발될 수 있다.
본 발명에 따른 몇몇 화합물의 화학적 합성 순서를 아래에 도시한다. 시아노히드린 10abc를 세 개의 상이한 아닐린 11abc와 반응시켜 네 개의 상이한 시아노아민 12abcd로 전환시킨다 (10a 및 11a는 12a를 생성하고, 10b 및 11a는 12b를 생성하고, 10c 및 11b는 12c를 생성하고, 10c 및 11c는 12d를 생성함). 별개의 방법에서 아닐린 13을 1 단계로 이소티오시아네이트 14로 전환시킨다. 14에 12abcd를 첨가한 후 약산으로 처리하여 목적으로 하는 티오히단토인 4 (NC54), 5 (NC55), 6 (NC56), 및 7을 양호한 수율로 생성한다.
Figure pat00059
본 명세서에서 설명되고 논의된 실시양태는 본 발명자들이 본 발명의 완성 및 이용과 관련하여 알고 있는 최상의 방법을 당업자에게 교시하고자 하는 것일 뿐이다. 본 명세서의 그 어떠한 것도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 제시된 모든 예는 대표적인 것일 뿐이지 제한적인 것이 아니다. 상기한 교시 내용을 주지한 당업자에게 인식되는 바와 같이, 상기한 본 발명의 실시양태는 본 발명에서 벗어남 없이 변형되거나 달라질 수 있다. 따라서, 청구의 범위 및 그의 등가물 내에서 본 발명은 구체적으로 기재한 것 이외의 다른 방식으로 실시될 수 있음이 이해되어야 한다.

Claims (1)

  1. 본원의 화합물을 바이러스 감염을 앓고 있는 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간에서 바이러스 감염을 치료하기 위한 방법.
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