BRPI0709682A2 - compostos de diariltioidantoÍna - Google Patents

Abstract

<B>COMPOSTOS DE DIARILTIOIDANTOINA<D>A presente invenção refere-se a compostos de diariltioidantoína e a métodos para sintetização dos mesmos, para uso no tratamento de câncer da próstata refratário a hormônio.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOS-TOS DE DIARILTIOIDANTOÍNA".

A presente invenção refere-se a compostos de diarilidantoína,incluindo as diariltioidantoínas, e a métodos de sintetização dos mesmos,utilizando tais compostos no tratamento de câncer de próstata refratário ahormônio. O presente Pedido de Patente incorpora por referência o docu-mento de patente PCT/US 2006/011417 do mesmo Requerente.

Antecedentes da Invenção

O câncer de próstata é a incidência mais comum de câncer e asegunda causa que leva à morte de câncer nos homens ocidentais. Quandoo câncer é confinado localmente, a doença pode ser curada mediante cirur-gia ou radiação. Entretanto, 30% de tal tipo de câncer reincide com distantedoença metastática e outros apresentam um estágio avançado da doença nodiagnóstico. A doença em estágio avançado é tratada mediante castraçãoe/ou administração de antiandrógenos, a assim chamada terapia de destitui-ção de andrógenos. O procedimento de castração abaixa os níveis de circu-lação de andrógenos e reduz a atividade do receptor de andrógeno (AR). Aadministração de antiandrógenos bloqueia a função do AR através da con-corrência distante da ligação do andrógeno, portanto, reduzindo a atividadede AR. Embora inicialmente eficazes, esses tratamentos rapidamente apre-sentam deficiências e o câncer se torna refratário a hormônio.

Recentemente, a sobrexpressão de AR foi identificada e valida-da como causa do câncer de próstata refratário a hormônio. Ver, o artigo deChen C.D., Welsbie D.S., Tran C., Baek S.H., Chen R., Vessela R., Rosenfi-eld M.G., e Sawyers C.L., "Molecular determinants of resistance to antian-drogen therapy, Nat. Med., 10: 33-39, 2004, o qual é aqui incorporado poressa referência. A sobrexpressão do AR é suficiente para provocar a pro-gressão de hormônios sensíveis ao câncer de próstata refratário a hormônio,sugerindo que melhores inibidores de AR que as atuais fármacos podemretardar a progressão do câncer de próstata. Foi demonstrado que o AR esua ligação de ligando são necessários para o crescimento do câncer depróstata refratário a hormônio, indicando que o AR é ainda um alvo para es-sa doença. Foi também demonstrado que a sobrexpressão de AR converteantiandrógenos de antagonistas em agonistas no câncer de próstata refratá-rio a hormônio (um antagonista de AR inibe a atividade de AR e um agonistade AR estimula a atividade de AR). Os dados desse trabalho explicam o fatopelo qual a castração e a administração de antiandrógenos são deficientespara prevenir a progressão do câncer de próstata e revelam propriedadesnão-reconhecidas do câncer de próstata refratário a hormônio.

A Bicalutamida (nome comercial: Casodex) é o antiandrógenomais comumente usado. Conquanto apresente um efeito inibitório sobre oAR no câncer de próstata sensível a hormônio, essa fármaco é deficiente nasupressão do AR quando o câncer se torna refratário a hormônio. Duas fra-quezas dos atuais antiandrógenos são reclamadas quanto à deficiência paraprevenir a progressão do câncer de próstata do estágio sensível a hormônio,para a doença refratária a hormônio e para, efetivamente, o câncer de prós-tata refratário a hormônio. Uma delas é sua fraca atividade antagonística e aoutra é sua forte atividade antagonística quando o AR é sobrexpresso nocâncer de próstata refratário a hormônio. Portanto, melhores inibidores deAR com atividades antagonísticas mais potentes e mínimas atividades ago-nísticas são necessários para retardar a progressão da doença e para trataro fatal câncer de próstata refratário a hormônio.

Antiandrógenos não-esteróides, como, por exemplo, a bicaluta-mida, têm sido preferidos em relação aos compostos esteróides para o cân-cer de próstata pelo fato de que são mais seletivos e apresentam menoresefeitos colaterais. Essa classe de compostos foi descrita em diversas paten-tes, como, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 4.097.578, 5.411.981,5.705.654, Pedidos de Patente Internacionais do PCT WO 97/00071 e WO00/17163 e Pedido de Patente Publicado U.S. No. 2004/0009969, todos osquais são aqui incorporados por essas referências.

A Patente U.S. No. 5.434.176 inclui reivindicações amplas queabrangem um grande número de compostos, sendo que as rotas sintéticassão apenas apresentadas para uma pequena fração desses compostos e osdados farmacológicos são apenas apresentados para dois deles, pelo queum especialista versado na técnica não poderá facilmente enfocar outroscompostos específicos.

Pelo fato de que o mecanismo do câncer de próstata refratário ahormônio não é conhecido, não existe sistema biológico para testar essescompostos descritos nessas patentes quanto ao seu efeito em relação aocâncer de próstata refratário a hormônio. Particularmente, a capacidade dasobrexpressão de AR no câncer de próstata refratário a hormônio para trocarinibidores de antagonistas para agonistas não foi reconhecida. Algumas no-vas propriedades de câncer de próstata refratário a hormônio são relatadasnos Pedidos de Patente do PCT, US 04/42221 e US 05/05529, os quais sãoaqui incorporados por essas referências. O Pedido de Patente Internacionaldo PCT US 05/055529 apresentou uma metodologia para identificação dascaracterísticas antagonistas e agonistas do receptor de andrógeno dos com-postos. No entanto, para cada composto produzido, o tempo que gasta oprocesso para determinação das características antagonísticas e agonísticasde um composto deve ser determinado. Isto é, não existe nenhum métodopara precisamente prever as relevantes características para o tratamento docâncer de próstata com relação à estrutura química de um composto indivi-dual.

Alguns compostos foram relatados como sendo inibidores dodomínio de ligação do ligando (LBD) do receptor de andrógeno (AR). Diver-sos deles foram usados como fármacos no tratamento do câncer de prósta-ta, por exemplo, a Bicalutamida (Casodex). Diversos aglutinantes do LBD deAR foram identificados, por exemplo, tioidantoínas, RU59063 e BTID (Teuts-ch G., Goubet F., Battmann T., Bonfils A., Bouchoux F., Cerede E., Gofflo D.,Gaillard-Kelly M., Philibert D., J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 1994, 48,111-119; Van Dort M.E., Robins D, M., Wayburn B., J. Med. Chem., 2000,43, 3344-3347).

Existe uma necessidade de novos compostos de tioidantoínatendo desejáveis propriedades farmacológicas e percursos sintéticos parapreparação dos mesmos. Pelo fato de que essas atividades são sensíveis apequenas mudanças estruturais, um composto pode ser eficaz no tratamen-to do câncer de próstata, enquanto que um segundo composto pode ser ine-ficaz, mesmo que seja diferente apenas ligeiramente do primeiro composto,isto é, pela substituição de um único substituinte.

A identificação de compostos que apresentam alta potência paraantagonizar a atividade do andrógeno, e que apresentam mínima atividadeantagonística, devem superar o câncer de próstata refratário a hormônio(HRPC) e evitar ou diminuir a progressão do câncer de próstata sensível ahormônio (HSPC). Portanto, existe uma necessidade no segmento da técni-ca para a identificação de moduladores seletivos do receptor de andrógeno,tais como, os moduladores que não são esferóides, não-tóxicos e de tecidoseletivo.

Sumário da Invenção

A invenção proporciona uma série de compostos que apresen-tam fortes atividades antagonísticas, com mínimas atividades agonísticascontra o AR. Esses compostos inibem o crescimento do câncer de próstatarefratário a hormônio.

Particulares compostos da invenção incluem:

<formula>formula see original document page 5</formula><formula>formula see original document page 6</formula>

[NC56]

<formula>formula see original document page 6</formula>

[NC57]

A invenção também proporciona uma composição farmacêuticacompreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um compostode acordo com quaisquer dos compostos anteriores ou um sal farmaceuti-camente aceitável dos mesmos e um veículo ou diluente farmaceuticamenteaceitável.

A invenção inclui um método de tratamento de um distúrbio hi-perproliferativo, compreendendo a administração da dita composição farma-cêutica a um sujeito com necessidade de tal tratamento, dessa forma, tra-tando o distúrbio hiperproliferativo. O distúrbio hiperproliferativo pode ser umcâncer de próstata refratário a hormônio. A dosagem pode ser na faixa decerca de 0,001 mg/kg de peso de corpo, por dia, a cerca de 100 mg/kg depeso de corpo, por dia, cerca de 0,01 mg/kg de peso de corpo, por dia, acerca de 100 mg/kg de peso de corpo, por dia, cerca de 0,1 mg/kg de pesode corpo, por dia, a cerca de 10 mg/kg de peso de corpo, por dia, ou cercade 1 mg/kg de peso de corpo, por dia.

O composto pode ser administrado mediante injeção intraveno-sa, injeção dentro do tecido, pela via intraperitoneal, oral ou nasal. A compo-sição pode apresentar uma forma selecionada do grupo que consiste umasolução, dispersão, suspensão, pó, cápsula, comprimido, pílula, cápsula deliberação no curso do tempo, comprimido de liberação no curso do tempo epílula de liberação no curso do tempo.

O composto administrado pode ser selecionado do grupo queconsiste nos NC54, NC55, NC56 ou NC57 ou um sal farmaceuticamenteaceitável dos mesmos. O composto administrado pode ser um NC53 ou umsal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

A invenção proporciona um método de sintetização de um NC54,compreendendo a mistura de N-metil-2-flúor-4-(1,1-dimetil-cianometil)-aminobenzamida e 4-isotiocianato-2-trifluorometilbenzonitrila em dimetilfor-mamida (DMF), sob aquecimento, para formar uma primeira mistura, composterior processamento, conforme mencionado acima.

A invenção também proporciona um método de sintetização deum composto de fórmula NC55, compreendendo a mistura de N-metil-2-flúor-4-(1-cianociclopentil)-aminobenzamida e 4-isotiocianato-2-trifluorometilbenzonitrila, e dimetilformamida (DMF), sob aquecimento comrefluxo, para formar uma primeira mistura, com posterior processamento,conforme mencionado acima.

A invenção também proporciona um método de sintetização deum composto de fórmula NC56, compreendendo a mistura de N,N-dimetil-4-[4-(1-cianociclobutilamino)fenil]butanamida, 4-isotiocianato-2-trifluorometil-benzonitrila, e dimetilformamida (DMF), sob aquecimento com refluxo, paraformar uma primeira mistura, com posterior processamento, conforme men-cionado acima.

A invenção proporciona um método de sintetização de um com-posto de fórmula NC57, compreendendo a mistura de DMSO, diclorometanoe cloreto de oxalila, para formar uma primeira mistura, adicionando o com-posto de 4-(4-(7-(4-ciano-3-(trifluorometil)fenil)-8-oxo-6-tioxo-5,7-diazaspiro[3.4]octan-5-il)fenil)-butanamida à primeira mistura de modo a for-mar uma segunda mistura; adicionando trietilamina à segunda mistura demodo a formar uma terceira mistura; aquecendo a terceira mistura e resfri-ando rapidamente com NH4CI aquoso para formar uma quarta mistura; ex-traindo uma camada orgânica da quarta mistura; e isolando o composto dacamada orgânica.

Em uma modalidade, um composto apresenta a fórmula:

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em que:

- R1 e R2, independentemente, representam metila ou juntamen-te com o carbono ao qual se encontram ligados, um grupo cicloalquila de 4 aátomos de carbono;

- R3 é selecionado do grupo que consiste em carbamoíla, alquil-carbamoíla, carbamoilalquila, alquilcarbamoilalquila e cianoalquila; e

- R4 é hidrogênio ou flúor.

Em uma modalidade, uma composição farmacêutica compreen-de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com.a reivindicação 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e umveículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

O composto pode, por exemplo, apresentar as fórmulas:

<formula>formula see original document page 8</formula><formula> formula see orginal document page 9</formula>

Uma composição farmacêutica pode compreender uma quanti-dade terapeuticamente eficaz de um NC54 ou um sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.Uma composição farmacêutica pode compreender uma quantidade terapeu-ticamente eficaz de um composto de fórmula NC55 ou um sal farmaceutica-mente aceitável do mesmo, e um veículo ou diluente farmaceuticamente a-ceitável.

Em uma modalidade, um método de tratamento de um distúrbiohiperproliferativo compreende a administração de uma composição farma-cêutica de acordo com a reivindicação 2, a um sujeito em necessidade de taltratamento, dessa forma, tratando o distúrbio hiperproliferativo.

A composição pode, por exemplo, apresentar uma forma sele-cionada do grupo que consiste uma solução, dispersão, suspensão, pó, cáp-sula, comprimido, pílula, cápsula de liberação no curso do tempo, comprimi-do de liberação no curso do tempo e pílula de liberação no curso do tempo.

O composto pode ser administrado mediante injeção intravenosa, injeçãodentro do tecido, pela via intraperitoneal, oral ou nasal. A composição podeser administrada em uma dosagem do composto na faixa de cerca de 0,001mg/kg de peso de corpo, por dia, a cerca de 100 mg/kg de peso de corpo,por dia. A composição pode ser administrada em uma dosagem do compos-to na faixa de cerca de 0,01 mg/kg de peso de corpo, por dia, a cerca de 100mg/kg de peso de corpo, por dia. A composição pode ser administrada emuma dosagem do composto na faixa de cerca de 0,1 mg/kg de peso de cor-po, por dia, a cerca de 10 mg/kg de peso de corpo, por dia. A composiçãopode ser administrada em uma dosagem do composto de cerca de 1 mg/kgde peso de corpo, por dia.

Há um método para tratamento de câncer de próstata, compre-endendo a administração de uma composição farmacêutica a um sujeito emnecessidade de tal tratamento, dessa forma, tratando o câncer de próstata.A composição farmacêutica pode interferir com a transcrição do mRNA doantígeno específico da próstata. A composição farmacêutica pode prevenir atranslocação nuclear de uma proteína receptora de andrógeno. A composi-ção farmacêutica pode desestabilizar uma proteína receptora de andrógeno.A composição pode ser administrada oralmente. A composição pode apre-sentar uma forma selecionada do grupo que consiste em cápsula, comprimi-do e pílula.

Em uma modalidade, o composto pode ser de fórmula NC54,NC55, NC56, NC57, um sal farmaceuticamente aceitável de quaisquer des-tes ou combinações dos mesmos.

Um método de sintetização de um composto de diarila de fórmu-la:

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compreende a mistura do composto (I):

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Composto I

com o composto de fórmula (II)

<formula>formula see original document page 11</formula>

Composto II

em um primeiro solvente polar, de modo a formar uma mistura; aquecer amistura; adicionar um segundo solvente polar, o mesmo ou diferente do pri-meiro solvente polar e um ácido aquoso à mistura; refluxar a mistura; resfriara mistura e misturar com água e, separar o composto de diarila da mistura;R5I pode incluir uma cadeia de alquila de 1 a 4 átomos de carbono. R52 podeser ciano, hidróxi, metilcarbamoíla, alquila substituída por metilcarbamoíla,alquila substituída por metilssulfonocarbamoíla, metilaminometila, dimetila-minometila, metilssulfoniloximetila, metoxicarbonila, 3-ciano-4-trifluorometilfenilcarbamoíla, alquila substituída por carbamoíla, carboximeti-la, metoxicarbonilmetila, metanossulfonila, alquila substituída por 4-ciano-3-trifluorometilfenilcarbamoíla, alquila substituída por carbóxi, 4-metanossulfonil-1-piperazinila, piperazinila, alquila substituída por hidroxietil-carbamoila ou alquila substituída por hidroxietoxicarbonila. R53 pode ser se-lecionado do grupo que consiste em flúor e hidrogênio.

Em uma modalidade, R51 compreende uma cadeia alquílica de 1a 2 átomos de carbono, R52 é selecionado do grupo que consiste em carba-moíla e metilcarbamoíla e R53 é flúor.

Um método de sintetização de um composto de fórmula:

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[NC53]

pode compreender misturar 4-isotiocianato-2-trifluorometilbenzonitrila e N-metil-4-(1 -cianociclobutilamino)-2-fluorobenzamida em dimetilformamida,para formar uma primeira mistura; aquecer a primeira mistura para formaruma segunda mistura; adicionar álcool e ácido à segunda mistura para for-mar uma terceira mistura; refluxar a terceira mistura para formar uma quartamistura; resfriar a quarta mistura; misturar a quarta mistura com água e ex-trair uma camada orgânica; e isolar o composto da camada orgânica.

Um método de sintetização do composto de acordo com a rei-vindicação 4 (NC54) pode compreender misturar N-metil-2-flúor-4-(1,1-dimetil-cianometil)-aminobenzamida e 4-isotiocianato-2-trifluorometilbenzo-nitrila em DMF e aquecer para formar uma primeira mistura; adicionar umálcool e um ácido à primeira mistura para formar uma segunda mistura; re-fluxar a segunda mistura; resfriar a segunda mistura; misturar a segundamistura com água e extrair uma camada orgânica; e isolar o composto dacamada orgânica.

Um método de sintetização do composto de acordo com a rei-vindicação 6 (NC55) pode compreender misturar N-metil-2-flúor-4-(cianociclopentil)-aminobenzamida, 4-isotiocianato-2-trifluorometilbenzonitrilae DMF, e aquecer sob refluxo para formar uma primeira mistura; adicionarum álcool e um ácido à primeira mistura para formar uma segunda mistura;refluxar a segunda mistura; resfriar a segunda mistura; misturar a segundamistura com água e extrair uma camada orgânica; e isolar o composto dacamada orgânica.

Um método de sintetização do composto de acordo com a rei-vindicação 8 (NC56) pode compreender misturar N-N-dimetil-4-[4-(1-cianociclobutilamino)fenil]butanamida, 4-isotiocianato-2-trifluorometilbenzo-nitrila e DMF, e aquecer sob refluxo para formar uma primeira mistura; adi-cionar um álcool e um ácido à primeira mistura para formar uma segundamistura; refluxar a segunda mistura; resfriar a segunda mistura; misturar asegunda mistura com água e extrair uma camada orgânica; e isolar o com-posto da camada orgânica.

Um método de sintetização do composto de acordo com a rei-vindicação 9 (NC57) pode compreender misturar DMSO1 diclorometano ecloreto de oxalila para formar uma primeira mistura; adicionar 4-(4-(7-(4-ciano-3-(trifluorometil)fenil)-8-oxo-6-tioxo-5,7-diazaspiro[3.4]octan-5-il)fenil)butanamida à primeira mistura para formar uma segunda mistura; adi-cionar trietilamina à segunda mistura para formar uma terceira mistura; a-quecer a terceira mistura e resfriar rapidamente com NH4CI aquoso paraformar uma quarta mistura; extrair uma camada orgânica da quarta mistura;e isolar o composto da camada orgânica.

Um método pode incluir a provisão de, pelo menos, um compos-to de diariltioidantoína, medição da inibição da atividade do receptor andró-geno para o composto e determinação se a inibição está acima de um pri-meiro predeterminado nível; medição da estimulação de atividade do recep-tor de andrógeno em células de câncer refratárias a hormônio para o com-posto e determinação se a estimulação está abaixo de um segundo prede-terminado nível; seleção do composto se a inibição estiver acima do primeiropredeterminado nível e a estimulação estiver abaixo do segundo predetermi-nado nível. Os níveis predeterminados são aqueles relativos à bicalutamida.A medição da inibição pode compreender a medição da concentração inibi-dora (IC5o) de um sistema repórter de resposta AR ou um sistema de secre-ção de antígeno específico de próstata. A medição de estimulação podecompreender medir a indução dobrada, mediante aumento das concentra-ções em um sistema repórter de resposta AR ou um sistema de secreção deantígeno específico de próstata. A medição de inibição e/ou estimulação po-de compreender a medição de um efeito de um composto sobre o cresci-mento do tumor em um animal. A etapa de medição de inibição e/ou estimu-lação da atividade do receptor de andrógeno pode compreender medir aprevenção do recrutamento do receptor de andrógeno para, pelo menos, umintensificador de antígeno específico de próstata e promotor de antígeno es-pecífico de próstata. A etapa de medição de inibição e/ou estimulação daatividade do receptor de andrógeno pode compreender medir a prevençãoda translocação nuclear do receptor de andrógeno. A etapa de medição deinibição e/ou estimulação da atividade do receptor de andrógeno pode com-preender medir a desestabilização de uma proteína receptora de andrógeno.

Um método pode compreender o contato de uma célula de ma-mífero capaz de expressar o antígeno específico da próstata com uma sufi-ciente quantidade de um composto de diariltioidantoína, de modo a interferircom a transcrição do mRNA do antígeno específico da próstata. O compostode diariltioidantoína pode ser selecionado do grupo que consiste nos NC53,NC54, NC55, NC56 e NC57. O composto pode prevenir a formação de umcomplexo de transcrição em um gene de antígeno específico de próstata. Ocomposto pode prevenir que uma proteína receptora de andrógeno se com-plexe com um gene de antígeno específico de próstata. O composto podeprevenir que uma polimerase II de RNA se complexe com um gene de antí-geno específico de próstata.

Um método inclui o contato de uma célula de mamífero com umasuficiente quantidade de um composto de diariltioidantoína, para prevenir a translocação nuclear de uma proteína receptora de andrógeno e/ou paradesestabilizar uma proteína receptora de andrógeno.Breve Descrição dos Desenhos

As figuras seguintes apresentam os resultados do exame farma-cológico de determinados compostos. A figura 1 é Urn gráfico que ilustra que a bicalutamida exibe umefeito agonístico sobre as células LNCaP sobrexpressas pelo AR (LNCaP-AR). As atividades agonísticas da bicalutamida sobre o câncer de próstatarefratário a hormônio sobrexpressou o receptor de andrógeno (AR). As célu-las LNCaP-AR foram tratadas com concentrações crescentes de DMSO co- mo veículo ou bicalutamida, na ausência de R1881. As atividades do repór-ter de resposta do AR foram medidas.

A figura 2 é um gráfico que ilustra um ensaio antagonístico dabicalutamida sobre as células LNCaP-AR. As atividades agonísticas da bica-lutamida sobre o câncer de próstata refratário a hormônio são mostradas. As células LNCaP foram tratadas com concentrações crescentes de DMSO co-mo veículo ou bicalutamida, na ausência de R1881. As atividades do repór-ter de resposta do AR foram medidas.

A figura 3 é um gráfico que ilustra o efeito dos compostos sobreas células LNCaP-AR. A figura 4 é um gráfico que ilustra o efeito de inibição sobre ascélulas LNCaP-AR.

A figura 5 mostra o efeito inibitório sobre a expressão de PSA demodelo de xenoenxerto de células LNCaP-AR sobrexpressas. Os camun-dongos foram tratados com veículo, 0,1, 1,0 ou 10 mg/kg do exemplo 7-3b (NC7) por 44 dias, oralmente, uma vez ao dia. Os tumores foram retiradosdos camundongos depois de 44 dias de tratamento, o Iisato do tumor foi ex-traído e o nível de PSA no Iisato de tecido foi determinado por ensaio ELISA.A figura 6 é um gráfico de volume de tumor em função do tempo,para tratamento com uma solução de veículo, Casodex e NC53.

A figura 7 é um gráfico de tamanho de tumor. As células LNCaP-AR foram injetadas, subcutaneamente, nos flancos de camundongos SCIDcastrados. Quando os tumores alcançaram cerca de 100 mm3, os mesmosforam distribuídos aleatoriamente em cinco grupos. Cada grupo tinha noveanimais. Depois de terem alcançado esse volume de tumor, eles receberamoralmente cada veículo, bicalutamida ou o NC53, em uma dosagem de 10ou 50 mg/kg, cada dia. Os tumores foram medidos tridimensionalmente, nalargura,"comprimento e profundidade, usando um compasso de calibre.

A figura 8 ilustra resultados experimentais do tamanho de tumor.No dia 18, os animais foram visualizados através de câmera ótica CCD, 3horas depois da última dose de tratamento. Um ROI foi desenhado sobre otumor para medição da atividade de Iuciferase em fóton/segundo. Os painéisà direita são representações das medições de ROI.

A figura 9 é um gráfico ilustrando as curvas farmacocinéticas doNC53 de administração intravenosa (curva superior) e administração oral(curva inferior).

A figura 10 é um gráfico de absorbância de fluorescência comouma função do Iogaritmo da concentração, o que reflete as afinidades deligação de diversos compostos a um receptor de andrógeno de rato.

A figura 11 apresenta imagens que refletem o estado de com-plexação do receptor de andrógeno e de polimerase Il de RNA para o inten-sificador de PSA e promotor de PSA, quando são adicionados Casodex ou oNC53.

A figura 12 apresenta imagens que refletem que o receptor deandrógeno se transloca dentro do núcleo, na presença de Casodex, porém,na ausência de NC53.

A figura 13 apresenta imagens que refletem que o receptor deandrógeno se transloca dentro do núcleo, na presença de Casodex, porém,na ausência de NC53.

A figura 14 apresenta imagens que refletem que a proteína re-ceptora de andrógeno é degradada na presença do NC53.

A figura 15 é um gráfico que ilustra o peso da próstata após tra-tamento com diversos compostos. Foram administrados por dia, 10, 25 ou50 mg do composto por quilograma de peso do corpo, conforme indicadopela etiqueta de uma barra. Os compostos foram administrados a camun-dongos saudáveis FVB. Após tratamento com o composto durante 14 diasfoi determinado o peso do trato urogenital, mediante remoção e pesagemdas vesículas intermediárias, próstata e bexiga. Os camundongos recebe-ram um determinado composto para obter os dados apresentados por umabarra no gráfico. Um conjunto de camundongos não foi tratado com umcomposto: os dados são apresentados na barra rotulada "não tratado". Outroconjunto de camundongos foi tratado somente com a solução do veículo: osdados são apresentados na barra rotulada "veículo".

A figura 16 é um gráfico que apresenta um ensaio de PSA exe-cutado juntamente com o protocolo experimental apresentado na figura 6.

A figura 17 é um gráfico que apresenta o efeito de diversos re-gimes de dosagem do NC53 sobre o volume do tumor.

A figura 18 é um gráfico que apresenta a velocidade de emissãode fóton associada com a atividade de luciferase no dia 17, relativa à veloci-dade no dia 0, após tratamento com o NC53, em doses de 0,1, 1,0 e 10mg/kg de peso do corpo, por dia, e sem tratamento com o NC53.

A figura 19 apresenta os resultados de um experimento em quecamundongos SCID foram injetados com a linha celular LN-AR (HR) parainduzir o crescimento do tumor. Um conjunto de camundongos foi tratadocom o NC53, em uma dosagem de 10 mg/kg de peso do corpo, por dia; ooutro conjunto de camundongos foi tratado somente com a solução do veícu-lo. (A) Volume de tumor relativo em função do tempo mostrado para cadaconjunto de camundongos. (B) Imagens de cada conjunto de camundongoscom emissão de fóton associada com a atividade de luciferase no dia 31,mostrado como contornos de cor. (C) Velocidade de emissão de fóton asso-ciada com a atividade de luciferase, mostrado em diversos instantes de tem-po para cada conjunto de camundongos.A figura 20 é um gráfico que apresenta a absorbância de PSAassociada com células LN-AR tratadas com diversas concentrações dosNC53, NC54, NC55 e NC57 e solução de veículo.

A figura 21 é um gráfico que apresenta a absorbância de PSAassociada com células LN-CaP tratadas com diversas concentrações doscompostos de fórmulas NC7, NC48, NC53, bicalutamida e DMSO.

A figura 22 apresenta os resultados de um experimento conduzi-do com camundongos não-transgênicos do tipo selvagem (WT)1 camundon-gos transgênicos de Iuciferase castrados (Cast) e camundongos transgêni-cos de Iuciferase não-castrados (Intact). Os dados sãõ mostrados para ca-mundongos transgênicos de Iuciferase castrados, tratados com um grânulode testosterona implantado, produzindo 12,5 mg/kg de peso do corpo, comum período de liberação de 90 dias (T/Cast) e são mostrados dados paracamundongos transgênicos de Iuciferase não-castrados, tratados com umgrânulo de testosterona implantado, produzindo 12,5 mg/kg de peso do cor-po, com um período de liberação de 90 dias (Intact + T). São também mos-trados dados para camundongos transgênicos de Iuciferase castrados, trata-dos com o grânulo de testosterona implantado e com bicalutamida(BIC+T/Cast) ou com NC53 (NC53+T/Cast), em uma quantidade de 10mg/kg de peso do corpo, por dia. (A) Peso do trato urogenital em 14 dias. (B)Velocidade de emissão de fóton em 14 dias. Em todos os casos, um estadode doença refratária a hormônio não foi induzido.

A figura 23 é um gráfico que ilustra a absorbância de PSA medi-da em células LN-AR após tratamento com diversas doses de diversos com-postos.

A figura 24 apresenta uma tabela que fornece diversas caracte-rísticas dos compostos. A figura 15 também apresenta um gráfico que forne-ce as características farmacocinéticas de diversos compostos, em termos deconcentração do soro do composto, em função do tempo.

A figura 25 é um gráfico da atividade de Iuciferase da linha celu-lar L1AR, dosada com diversos compostos administrados em concentraçõesvariando de 125 nmols a 1000 nmols.Descrição Detalhada

As modalidades da invenção são discutidas em detalhes abaixo.Na descrição das modalidades é utilizada uma terminologia específica paraum melhor entendimento. No entanto, a invenção não é idealizada de serlimitada à terminologia específica assim selecionada. Um especialista versa-do na técnica irá reconhecer que outras partes equivalentes poderão ser uti-lizadas e outros métodos serem desenvolvidos sem se afastar do espírito eescopo da presente invenção. Todas as referências aqui citadas são incor-poradas como referência, como se cada uma delas tivesse sido individual-mente incorporada.

Síntese dos Compostos de Diariltioidantoína

Exemplo 56 (NC54)

Na descrição feita a seguir, as reações sensíveis ao ar ou à u-midade foram conduzidas sob atmosfera de argônio, usando material de vi-dro seco ao forno e técnicas padrões de seringa/septa. As reações forammonitoradas com uma placa de TLC em SiO2, sob luz UV (254 nm), seguidode visualização com tingimento de uma solução de p-anisaldeído ou niidrina.A cromatografia em coluna foi realizada em sílica-gel 60. Os espectros de 1HRMN foram medidos em 400 MHz em CdCI3, a menos que indicado em con-trário, e os dados foram relatados em ppm (δ), a partir do padrão interno(TMS, 0,0 ppm): desvio químico (multiplicidade, integração, constante deacoplamento em Hz).

<formula>formula see original document page 19</formula>

Fórmula 37

Ácido periódico (1,69 g, 7,41 mmols) foi dissolvido em acetonitri-la (25 mL) mediante vigorosa agitação e, depois, trióxido de cromo (0,16 g,1,60 mmol) foi dissolvido na solução. Em seguida, foi adicionado o compostode 2-flúor-4-nitrotolueno (0,33 g, 2,13 mmols) à solução acima com agitação.Um precipitado branco se formou imediatamente com reação exotérmica.

Depois de 1 hora de agitação, o líquido sobrenadante da mistura reacionalfoi decantado em um frasco e o solvente foi removido por evaporação. Osresíduos foram extraídos com cloreto de metileno (2 χ 30 mL) e água (2 χ 30mL). A camada orgânica foi seca sobre MgS04 e concentrada, proporcio-nando o ácido 2-flúor-4-nitrobenzóico (Fórmula 37) (0,32 mg, 81%) na formade um sólido branco.

1H RMN δ 8,06 (ddd, 1H, J=9,9, 2,2 e 0,3), 8,13 (ddd, 1H, J=8,6, 2,2 e 0,9),8,25 (ddd, 1H, J=8,6, 7,0 e 0,3).

<formula>formula see original document page 20</formula>

Fórmula 38

Cloreto de tionila (0,15 g, 1,30 mmol) foi adicionado lentamentea uma solução de ácido 2-flúor-4-nitrobenzóico (Fórmula 37) (0,20 g, 1,10mmol) em DMF (5 mL) e resfriado para a temperatura de -5eC. A mistura foiagitada por um tempo adicional de 1 hora à temperatura de -59C. Um exces-so de metilamina (recém-destilada de sua solução aquosa a 40%) foi adicio-nado ao meio reacionai. A segunda mistura foi agitada por um tempo adicio-nal de 1 hora. Acetato de etila (50 mL) foi adicionado à mistura, a qual foilavada com salmoura (2 χ 50 mL). A camada orgânica foi seca sobre MgSÜ4e concentrada, produzindo o composto de N-metil-2-flúor-4-nitrobenzamida(Fórmula 38) (0,18 g, 85%), na forma de um sólido amarelado.

1H RMN (acetona-d6) δ 3,05 (d, 3H, J=4,3), 6,31 (dd, 1H, J=13,5 e 2,1), 6,40(dd, 1H, J=8,6 e 2,1), 7,64 (dd, 1H, J=8,6 e 8,6).

<formula>formula see original document page 20</formula>

Fórmula 39Uma mistura de N-metil-2-flúor-4-nitrobenzamida (Fórmula 38)

(0,18 g, 0,91 mmol) e ferro (0,31 g, 5,60 mmols) em acetato de etila (5 mL) eácido acético (5 mL) foi submetida a refluxo durante uma hora. As partículassólidas foram filtradas e o filtrado foi lavado com água e extraído com aceta-to de etila. A camada orgânica foi seca sobre MgSO4, concentrada e o resí-duo purificado por cromatografia de coluna com SiO2 (diclorometa-no:acetona, 95:5), proporcionando o composto de N-metil-2-flúor-4-aminobenzamida (Fórmula 39) (0,14 g, 92%) na forma de um sólido esbran-quiçado.

1H RMN (acetona-d6) δ 2,86 (d, 3H, J=4,3), 5,50 (br, s, 2H), 6,37 (dd, 1H,J=14,7 e 2,1), 6,50 (dd, 1H, J=8,6 e 2,1), 7,06 (br, s, 1H), 7,68 (dd, J=8,8 e8,8).

<formula>formula see original document page 21</formula>

Uma mistura de N-metil-2-flúor-4-aminobenzamida (Fórmula 39)(96 mg, 0,57 mmol), cianoidrina-acetona (0,3 mL, 3,14 mmols) e sulfato demagnésio (50 mg) foi aquecida à temperatura de 809C e agitada durante 12horas. Ao dito meio foi adicionado acetato de etila (25 mL), em seguida, omeio foi lavado com água (2 χ 25 mL). A camada orgânica foi seca sobreMgSO4 e concentrada e o resíduo purificado por meio de cromatografia decoluna com SiO2 (diclorometano:acetona, 95:5), proporcionando o compostode N-metil-2-flúor-4-(1,1-dimetil-cianometil)-aminobenzamida (Fórmula 40)(101 mg, 75%) na forma de um sólido branco.

1H RMN δ 1,74 (s, 6H), 2,98 (dd, 3H, J=4,8 e 1,1), 6,58 (dd, 1H, J=14,6 e2,3), 6,63 (dd, 1H, J=8,7 e 2,3), 6,66 (br, s, 1H), 7,94 (dd, 1H, J=8,7 e 8,7).<table>formula see original document page 22</column></row><table>

Fórmula 41

O composto de 4-amino-2-trifluorometilbenzonitrila (2,23 g, 12mmols) foi adicionado em porções durante 15 minutos a uma mistura hete-rogênea bem agitada de tiofosgênio (1 mL, 13 mmols) em água (22 mL) àtemperatura ambiente. A agitação continuou por um tempo adicional de 1hora. O meio reacional foi extraído com clorofórmio (3 χ 15 mL). A fase or-gânica combinada foi seca sobre MgSO4 e evaporada à secura sob pressãoreduzida, de modo a produzir o desejado produto de 4-isotiocianato-2-trifluorometilbenzonitrila (Fórmula 41) na forma de um sólido amarronzado, oqual foi usado como tal na etapa seguinte (2,72 g, 11,9 mmols, 99%).

1H RMN δ 7,49 (dd, 1H, J=8,3e2,1), 7,59 (d, 1H1 J=2,1), 7,84 (d, 1H, J=8,3).

<table>formula see original document page 22</column></row><table>

(56.1) NC54

Uma mistura de N-metil-2-flúor-4-(1,1-dimetil-cianometil)-aminobenzamida (Fórmula 40) (30 mg, 0,13 mmol) e 4-isotiocianato-2-trifluorometilbenzonitrila (Fórmula 41) (58 mg, 0,26 mmol) em DMF (1 mL) foiaquecida sob irradiação de microondas à temperatura de 100QC durante 11horas. A essa mistura foi adicionado metanol (20 mL) e HCI 1N aquoso (5mL). A segunda mistura foi submetida a refluxo durante uma hora e meia.Depois de ser resfriada à temperatura ambiente, a mistura reacional foi der-ramada em água fria (50 mL) e extraída com acetato de etila (50 mL). A ca-mada orgânica foi seca sobre MgSO4, concentrada e o resíduo purificadopor meio de cromatografia de coluna com S1O2 (diclorometano:acetona,95:5), proporcionando o composto NC54 (Fórmula 42) (15 mg, 25%) na for-ma de um cristal incolor.

1H RMN δ 1,61 (s, 6H), 3,07 (d, 3H, J=4,1), 6,71 (m, 1H), 7,15 (dd, 1H,J=11,7 e 2,0), 7,24 (dd, 1H, J=8,4 e 2,0), 7,83 (dd, 1H, J=8,2 e 2,1), 7,95 (d,1H, J=2,1), 7,99 (d, 1H, J=8,2), 8,28 (dd, 1H, J=8,4 e 8,4).

Exemplo 57

<formula>formula see original document page 23</formula>

Fórmula 43

Uma mistura de N-metil-2-flúor-4-aminobenzamida (Fórmula 39)(62 mg, 0,37 mmol), ciclopentanona (0,07 mL, 0,74 mmol) e TMSCN (0,1ml, 0,74 mmol) foi aquecida à temperatura de 80eC e agitada durante 13horas. Ao meio reacional foi adicionado acetato de etila (2 χ 20 mL), depois,foi lavado com água (2 χ 20 mL). A camada orgânica foi seca sobre MgSO4e concentrada e o resíduo foi purificado por meio de cromatografia de colunade sílica-gel (diclorometano:acetona, 95:5), proporcionando o composto deN-metil-2-flúor-4-(1-cianociclopentil)aminobenzamida (Fórmula 43) (61 mg,63%) na forma de um sólido branco.

1H RMN 5 7,95 (dd, 1H, J=8,8, 8,8 Hz), 6,65 (br, s, 1H), 6,59 (dd, 1H, J=8,8,2,3 Hz), 6,50 (dd, 1H, J=14,6, 2,3 Hz), 4,60 (br, s, 1H), 2,99 (dd, 3H, J=4,8,1,1 Hz), 2,36-2,45 (m, 2H), 2,10-2,18 (m, 2H), 1,82-1,95 (m, 4H).

<formula>formula see original document page 23</formula>

57.1) NC55Uma mistura de N-metil-2-flúor-4-(1-cianociclopentil)amino-benzamida (Fórmula 43) (57 mg, 0,22 mmol) e 4-isotiocianato-2-trifluorometil-benzonitrila (0,15 g, 0,65 mmol) em DMF (3 mL) foi aquecidasob irradiação de microondas (vaso aberto) à temperatura de 130-C durante12 horas. A essa mistura foi adicionado metanol (20 mL) e HCI1N aquoso (5mL). A segunda mistura foi submetida a refluxo durante uma hora e meia.Após ser resfriada para a temperatura ambiente, a mistura reacional foi der-ramada em água fria (50 mL). A camada orgânica foi seca sobre MgSO4,concentrada e o resíduo foi purificado por meio de cromatografia de colunaem sílica-gel (diclorometànõ.acetona, 95:5), proporcionando o composto de4-(3-(4-ciano-3-(trifluorometil)fenil)-4-oxo-2-tioxo-1,3-diazaspiro[4.4]nonan-1-il)-2-flúor-N-metilbenzamida, NC55 (Fórmula 44) (8 mg, 7%) na forma deum sólido amarelo-claro.

1H RMN δ 8,28 (dd, 1H, J=8,4, 8,4 Hz), 7,98 (d, 1H, J=8,3 Hz), 7,96 (d, 1H,J=1,8 Hz), 7,84 (dd, 1H, J=8,3, 1,8 Hz), 7,27 (dd, 1H, J=8,4, 1,8 Hz), 7,17(dd, 1H, J=11,7, 1,8 Hz), 6,67-6,77 (m, 1H), 3,07 (d, 3H, J=4,3 Hz), 2,32-2,41(m, 2H), 2,13-2,21 (m, 2H), 1,85-1,96 (m, 2H), 1,49-1,59 (m, 2H).

Exemplo 58

<formula>formula see original document page 24</formula>

Fórmula 45

Anidrido trifluoroacético (0,85 mL, 6,14 mmols) foi adicionado auma solução do ácido 4-(4-aminofenil)butírico (0,5 g, 2,79 mmols) em cloro-fórmio (10 mL) à temperatura de O9C. A mistura foi aquecida à temperaturaambiente e agitada durante 3 horas. A mistura foi fracionada com clorofórmio(20 mL) e água (20 mL). A camada orgânica foi seca sobre MgSO4, concen-trada e o resíduo foi purificado por meio de cromatografia de coluna em síli-ca-gel (diclorometano:acetona, 9:1), proporcionando o ácido 4-[4-(2,2,2-trifluoroacetilamino)fenil]butanóico (Fórmula 45) (0,53 g, 69%).

1H RMN δ 7,81 (br, s, 1H), 7,48 (d, 2H, J=8,5 Hz), 7,22 (d, 2H, J=8,5 Hz),2,68 (t, 2Η, J=7,5 Hz), 1,96 (p, 2H, J=7,5 Hz).

<formula>formula see original document page 25</formula>

Fórmula 46

Cloreto de tionila (71 mg, 0,60 mmol) foi adicionado lentamentea uma solução do ácido 4-[4-(2,2,2-trifluoroacetilamino)fenil]butanóico (Fór-mula 45) (0,15 g, 0,55 mmol) em DMF (5 mL), com posterior resfriamento àtemperatura de -5°C. A mistura foi agitada por um adicional de tempo de 1hora à temperatura de -5°C. Um excesso de dimetilamina (recém-destiladade sua solução aquosa a 40%) foi adicionado ao meio reacional. A segundamistura foi agitada por um tempo adicional de 1 hora. Acetato de etila (50mL) foi adicionado à mistura, a qual foi lavada com salmoura (2 χ 50 mL). Acamada orgânica foi seca sobre MgSO4 e concentrada, produzindo o com-posto de N,N-dimetil-4-[4-(2,2,2-trifluoroacetilamino)-fenil]-butanamida (Fór-mula 46)(0,17 g, quant.) na forma de um sólido amarelado.

1H RMN δ 9,70 (br, s, 1H), 7,55 (d, 2H, J=8,6 Hz), 7,11 (d, 2H,J=8,6 Hz), 2,91 (s, 3H), 2,89 (s, 3H), 2,60 (t, 2H, J=7,7 Hz), 2,27 (t, 2H, J=7,7Hz), 1,89 (ρ, 2H, J=7,7 Hz).

<formula>formula see original document page 25</formula>

Uma solução de NaOH 1N (3 mL) foi adicionada a uma soluçãode N,N-dimetil-4-[4-(2,2,2-trifluoroacetilamino)-fenil]-butanamida (Fórmula46) (0,17 g, 0,55 mmol) em metanol (2 mL) à temperatura ambiente. A mistu-ra foi agitada durante 14 horas e, depois, fracionada com clorofórmio (25mL) e água (25 mL). A camada orgânica foi seca sobre MgSO4 e concentra-da e o resíduo foi purificado por meio de cromatografia de coluna com sílica-gel (diclorometano:acetona, 9:1), proporcionando o composto de N,N-dimetil-4-(4-aminofenil)butanamida (Fórmula 47) (74 mg, 66%) na forma de um sóli-do branco.

'Ή RMN δ 6,97 (d, 2H, J=8,3 Hz), 6,61 (d, 2H, J=8,3 Hz), 3,56(br, s, 2H), 2,92 (s, 6H), 2,56 (t, 2H, J=7,7 Hz), 2,28 (t, 2H, J=7,7 Hz), 1,91(ρ, 2H, J=7,7 Hz).

<formula>formula see original document page 26</formula>

Fórmula 48

Uma mistura de N,N-dimetil-4-(4-aminofenil)butanamida (Fórmu-la 47) (74 mg, 0,36 mmol), ciclobutanona (54 mg, 0,78 mmol) e TMSCN (77mg, 0,78 mmol) foi aquecida à temperatura de 80eC e agitada durante 15horas. Ao meio reacional foi adicionado acetato de etila (2 χ 20 mL), depois,foi lavado com água (2 χ 20 mL). A camada orgânica foi seca sobre MgSO4e concentrada e o resíduo foi purificado por meio de cromatografia de colunacom sílica-gel (diclorometano:acetona, 9:1), proporcionando o composto deN,N-dimetil-4-[4-(1-cianociclobutilamino)fenil]butanamida (Fórmula 48) (58mg, 57%) na forma de um sólido branco.

1H RMN δ 7,07 (d, 2H, J=8,5 Hz), 3,94 (br, s, 1H), 2,94 (s, 3H),2,75-2,83 (m, 2H), 2,60 (t, 2H, J=7,6 Hz), 2,33-2,42 (m, 2H), 2,30 (t, 2H,J=7,6 Hz), 2,11 -2,28 (m, 2H), 1,93 (ρ, 2H, J=7,6 Hz).

<formula>formula see original document page 26</formula>

Uma mistura de N,N-dimetil-4-[4-(1-cianociclobutilamino)fenil]butanamida (Fórmula 48) (58 mg, 0,20 mmol) e 4-isotiocianato-2-trifluorometil-benzonitrila (74 mg, 0,32 mmol) em DMF (3 mL)foi aquecida sob refluxo durante 2 horas. A essa mistura foi adicionado me-tanol (20 mL) e HCI 1N aquoso (5 mL). A segunda mistura foi submetida arefluxo durante uma hora e meia. Depois de ser resfriada à temperatura am-biente, a mistura reacional foi derramada em água fria (50 mL) e extraídacom acetato de etila (50 mL). A camada orgânica foi seca sobre MgS04,concentrada e o resíduo purificado por meio de cromatografia de coluna comsílica-gel (diclorometano:acetona, 95:5), proporcionando o composto de 4-(4-(7-(4-ciano-3-(trifluorometil)fenil)-8-oxo-6-tioxo-5,7-diazaspiro[3.4]octan-5-il)fenil)-N,N-dimetilbutanamida, NC56 (Fórmula 49) (44 mg, 42%) na formade um sólido amarelo-pálido.

1H RMN δ 7,98 (s, 1H), 7,97 (d, 1H, J=8,2 Hz), 7,86 (d, 1H, J=8,2Hz), 7,42 (d, 2H, J=8,3 Hz), 7,22 (d, 2H, J=8,3 Hz), 2,99 (s, 3H), 2,96 (s, 3H),2,78 (t, 2H, J=7,5 Hz), 2,62-2,70 (m, 2H), 2,52-2,63 (m, 2H), 2,40 (t, 2H,J=7,5 Hz), 2,15-2,30 (m, 1H), 2,04 (ρ, 2H, J=7,5 Hz), 1,62-1,73 (m, 1H).

Exemplo 59

Fórmula 50

Uma mistura de ácido 4-(4-aminofenil)butírico (0,20 g, 1,12mmol), ciclobutanona (0,17 mL, 2,23 mmols) e TMSCN (0,30 mL, 2,23mmols) foi aquecida à temperatura de 809C e agitada durante 13 horas. Aomeio reacional foi adicionado acetato de etila (2 χ 30 mL), depois, foi lavadocom água (2 χ 30 mL). A camada orgânica foi seca sobre MgSÜ4 e concen-trada e o resíduo foi purificado por meio de cromatografia de coluna comsílica-gel (diclorometano:acetona, 9:1), proporcionando o ácido 4-[4-(1-cianociclobutilamino)fenil]butanóico (Fórmula 50) (0,21 mg, 74%) na formade um sólido amarelado.

1H RMN δ 7,06 (d, 2H, J=8,6 Hz), 6,59 (d, 2H, J=8,6 Hz), 2,75-2,83 (m, 2Η), 2,59 (t, 2Η, J=7,5 Hz), 2,37 (t, 2H, J=7,5 Hz), 2,33-2,42 (m,2H), 2,11-2,28 (m, 2H), 1,92 (ρ, 2H, J=7,5 Hz).

<formula>formula see original document page 28</formula>

Uma mistura de áeido 4-[4-(1-cianociclobutilamino)fenil]butanóico (Fórmula 50) (0,21 g, 0,83 mmol) e 4-isotiocianato -2-triflúor-benzonitrila (0,25 g, 1,08 mmol) em tolueno (10 mL) foi aquecida sob refluxodurante uma hora. A essa mistura foi adicionado HCI 1N aquoso (5 mL). Asegunda mistura foi submetida a refluxo durante uma hora e meia. Após serresfriada para a temperatura ambiente, a mistura reacional foi derramada emágua fria (50 mL) e extraída com acetato de etila (50 mL). A camada orgâni-ca foi seca sobre MgSO4, concentrada e o resíduo foi purificado por meio decromatografia de coluna em sílica-gel (diclorometano:acetona, 95:5), propor-cionando o ácido 4-(4-(7-(4-ciano-3-(trifluorometil)fenil)-8-oxo-6-tioxo-5,7-diazaspiro[3.4]octan-5-il)fenil)-butanóico, NC122 (Fórmula 51) (60 mg, 15%).

Exemplo 61

<formula>formula see original document page 28</formula>

NC57 Fórmula 53

Uma solução de DMSO (0,01 mL, 0,12 mmol) em diclorometanoseco (1 mL) foi adicionada a uma solução agitada de cloreto de oxalila (0,01mL, 0,09 mmol) em diclorometano anidro (2 mL) à temperatura de -78'C.

Depois de 15 minutos, foi adicionada uma solução de diclorometano de 4-(4-(7-(4-ciano-3-(trifluorometil)fenil)-8-oxo-6-tioxo-5,7-diazaspiro[3.4]octan-5-il)fenil)-butanamida, NC47 (Fórmula 52) (35 mg, 0,07 mmol) à mistura rea-cional. A agitação continuou por 20 minutos à temperatura de -78QC e, de-pois, foi adicionado trietilamina (0,03 mL, 0,22 mmol). Após 30 minutos àtemperatura de -789C, a mistura reacional foi aquecida à temperatura ambi-ente e, depois, a reação foi resfriada brusacamente com uma solução aquo-sa saturada de NH4CI. A mistura reacional foi diluída com diclorometano eextraída com diclorometano. A camada orgânica foi seca sobre MgSO4, con-centrada e cromatografada (diclorometano:acetona, 95:5), proporcionando ocomposto de 4-(5-(4-(3-cianopropil)fenil)-8-oxo-6-tioxo-5,7-diazaspiro[3.4]octan-7-il)-2-(trifluorometil)benzonitrila, NC57 (Fórmula 53) (29 mg, 87%) naforma de um óleo viscoso.

1H RMN δ 7,98 (d, 1H, J=1,8 Hz), 7,98 (d, 1H, J=8,3 Hz), 7,86(dd, 1H, J=8,3, 1,8 Hz), 7,43 (d, 2H, J=8,4 Hz), 7,27 (d, 2H, J=8,4 Hz), 2,90(t, 2H, J=7,3 Hz), 2,63-2,73 (m, 2H), 2,52-2,62 (m, 2H), 2,42 (t, 2H, J=7,3Hz), 2,18-2,30 (m, 1H), 2,07 (ρ, 2H, J=7,3 Hz), 1,63-1,73 (m, 1H).

Um especialista versado na técnica poderá modificar e/ou com-binar as sínteses descritas acima para produzir outros compostos de diarili-dantoína.

Exame Farmacológico dos Compostos

Os compostos para os quais as vias sintéticas são descritas a-cima foram identificados através da seleção de células de câncer de próstatarefratário a hormônio para atividades antagonísticas e agonísticas contra oreceptor de andrógeno (AR), utilizando procedimentos de seleção similaresaqueles dos Pedidos de Patentes do PCT1 US 04/42221 e US 05/05529, osquais são aqui incorporados por essas referências. Um determinado númerode compostos exibiu potentes atividades antagonísticas com mínimas ativi-dades agonísticas para o AR sobrexpresso no câncer de próstata refratário ahormônio.

Ensaio Biológico In Vitro

Efeito dos Compostos sobre o AR. por um Ensaio Repórter

Os compostos foram submetidos a testes usando um sistemarepórter de resposta do receptor de andrógeno (AR) em uma linha celular decâncer de próstata refratário a hormônio. Nesse sistema, as células de LN-CaP de câncer de próstata foram construídas de modo a expressar de ma-neira estável, cerca de 5 vezes mais alto, o nível de AR, do que o nível en-dógeno. O receptor de andrógeno (AR) exógeno apresenta propriedadessimilares as do AR endógeno, pelo que, ambos são estabilizados por umandrógeno sintético R1881. As células sobrexpressas pelo AR foram tam-bém construídas de modo a incorporar estavelmente um repórter de respos-ta de AR e a atividade repórter dessas células mostra características decâncer de próstata refratário a hormônio. Elas respondem a baixas concen-trações de um andrógeno sintético R1881, são inibidas somente por altasconcentrações de bicalutamida (ver a Tabela 1) e exibem atividade agonísti-ca com a bicalutamida (Figura 1 e Tabela 2). Consistente com os dados pu-blicados, a bicalutamida inibiu o repórter de resposta de AR e não apresen-tou atividade agonística nas células de câncer de próstata sensível a hormô-nio (Figura 2).

Tabela 1

A atividade antagonística dos compostos para os quais a sínteseé descrita acima foi examinada na presença de 100 pM de R1881. As célu-las construídas de LNCaP (LNCaP-AR, também, abreviada como LN-AR)foram mantidas no meio de Iscove, contendo 10% de soro fetal bovino(FBS). Dois dias antes do tratamento com o fármaco, as células foram culti-vadas no meio de Iscove, contendo 10% de FBS em tiras/carvão vegetal(CS-FBS) para eliminação dos andrógenos. As células foram divididas e cul-tivadas no meio de Iscove contendo 10% de CS-FBS, com 100 pM de R1881e concentrações crescentes dos compostos de teste. Depois de dois dias deincubação, foram ensaiadas atividades repórter.

A Tabela 1 lista o IC50 desses compostos para inibir o receptorde andrógeno (AR) no câncer de próstata refratário a hormônio. A substân-cia de controle bicalutamida apresenta um IC50 de 889 nM. A maioria doscompostos identificados (diariltioidantoínas) apresentam IC50 entre 100 e 200nM, na inibição de AR no câncer de próstata refratário a hormônio. Ao con-trário, os compostos antiandrogênicos listados como Exemplos na PatenteUS No. 5.705.654, tal como, os exemplos 30-2, 30-3, 31-2, 31-3 e 24-3(NC24-NC28), não possuem atividade inibitória sobre o AR nesse sistema.Atividades Antagonísticas contra o AR no Câncer de Próstata Refratário aHormônio, Medidas por um Repórter de Resposta de AR e por Expressão dePSA Endóqeno

Tabela 1

<table>table see original document page 31</column></row><table><table>table see original document page 32</column></row><table><table>table see original document page 33</column></row><table><table>table see original document page 34</column></row><table><table>table see original document page 35</column></row><table><table>table see original document page 36</column></row><table>

(*) Não: o composto não inibiu o repórter de resposta do AR;

(**) n/a: o composto não foi examinado nesse ensaio.

Tabela 2

Uma propriedade não reconhecida anteriormente da sobrex-pressão do AR no câncer de próstata refratário a hormônio é a sua capaci-dade de modificar antagonistas para agonistas. Portanto, somente aquelescompostos com mínimas ou nenhuma atividade agonística são qualificadoscomo sendo antiandrógenos para essa doença. Para determinar as ativida-des agonísticas dos diferentes compostos, suas atividades de estimulaçãono AR foram examinadas usando o repórter de resposta de AR como medi-da do sistema LN-AR, na ausência de R1881. A Tabela 2 lista as atividadesagonísticas de diferentes compostos. Consistente com resultados anteriores,a bicalutamida ativou o AR no câncer de próstata refratário a hormônio. Osderivados de diariltioidantoína, tais como, nos Exemplos 7-3b (NC7), 33(NC34), 34 (NC35) e 35 (NC36) não apresentam atividade agonística. Aocontrário, o composto RU59063 e outros compostos anti-androgênicos lista-dos como Exemplos na Patente US No. 5.705.654, como nos exemplos, 30-2, 30-3, 31-2, 31-3 e 24-3 (NC24-NC28) ativaram fortemente o AR no câncerde próstata refratário a hormônio.

Atividades Agonísticas de Substâncias de Teste Seletivo em Repórter deResposta de AR no Câncer de Próstata Refratário a Hormônio

Tabela 2

Indução dobrada mediante aumento das concentrações doscompostos<table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table>

(*) Indução Dobrada: atividades induzidas por uma substância de teste es-pecífico sobre atividades em veículo de DMSO;

(**) n/a: o composto não foi examinado nesse ensaio.

Para examinar a especificidade dos inibidores de AR, foram tes-tados compostos seletivos nas células LNCaP com uma sobrexpressão doreceptor de glicocorticóide (GR), o elemento mais próximo do AR na famíliado receptor nuclear. Essas células também são portadoras de um repórterde resposta de GR e a atividade repórter foi induzida por dexametasona, umagonista de GR, e a indução foi bloqueada por RU486, um inibidor de GR. OExemplo 7-3b (NC7) (4-(8-oxo-6-tioxo-5-(4-metilfenil)-5,7-diazaspiro[3.4]-oct-7-il)-2-trifluorometil-benzonitrila) não induziu efeito sobre o GR nesse siste-ma.

Efeito dos Compostos sobre o AR. através da Medição dos Níveis Secreta-dos do Antígeno Específico da Próstata (PSA)

É bem estabelecido que os níveis de PSA são indicadores deatividades de AR no câncer de próstata. Para examinar se os compostosafetam a função do AR em um ambiente fisiológico, foram determinados osníveis secretados do PSA endógeno induzido pelo R1881 nas células LN-CaP sobrexpessas pelo receptor de andrógeno (AR) (LNCap-AR, tambémabreviado por LN-AR). As células LNCaP-AR constituem uma linha de carci-noma de nódulo de Iinfa de células de próstata transduzidas com um plas-mídeo que faz a expressão dos receptores de andrógeno. As células LN-CaP-AR foram mantidas no meio de Iscove contendo 10% de FBS. Dois diasantes do tratamento com a fármaco, as células foram cultivadas no meio deIscove1 contendo 10% de CS-FBS para eliminação dos andrógenos. As célu-las foram divididas e cultivadas no meio de Iscove contendo 10% de CS-FBS, com apropriadas concentrações de R1881 e compostos de teste. De-pois de quatro dias de incubação, os níveis de PSA secretados foram exa-minados usando kits ELISA para PSA (American Qualex1 San Clemente, CA).

O nível de PSA secretado das células LNCap_AR foi fortementeinduzido por 25 pM de R1881. Ao contrário, o PSA não foi induzido nas célu-las parenterais LNCaP até a concentração de R1881 ter alcançado 100 pM.Isso é consistente com os relatórios anteriores de que o AR no câncer depróstata refratário a hormônio é hipersensível a andrógenos. Uma inibiçãodependente da dose sobre a atividade de AR foi realizada para determinaros IC50s dos diferentes compostos na inibição da expressão do PSA e osresultados foram listados na Tabela 1. Os IC5Os dos compostos seletivos naexpressão do PSA se assemelham muito próximo daqueles medidos peloensaio repórter, confirmando que os derivados de diarilidantoína são fortesinibidores do AR no câncer de próstata refratário a hormônio.

Foram também examinadas as atividades agonísticas dos com-postos seletivos de AR no câncer de próstata refratário a hormônio, usandoo PSA secretado como marcador substituto. Para tal procedimento, célulasLNCaP sobrexpressas por AR famintas de andrógeno foram incubadas comconcentrações crescentes dos compostos para os quais uma síntese é des-crita acima, na ausência do R1881 e o PSA secretado no meio de cultura foimedido depois de quatro dias.

A Tabela 3 lista as atividades agonísticas dos compostos seleti-vos. Consistente com os resultados obtidos do ensaio repórter, os derivadosde diariltioidantoína, tais como, nos Exemplos 7-3b (NC7), 33 (NC34), 34(NC35) e 35 (NC36) não apresentam atividades agonísticas. Ao contrário, ocomposto RU59063 e outros compostos anti-androgênicos listados comoExemplos na Patente US No. 5.705.654, como nos exemplos, 30-2 (NC24),30-3 (NC25) e 31-2 (NC26) estimularam a expressão do PSA no câncer depróstata refratário a hormônio.

Tabela 3

Atividades Agonísticas de Substâncias de Teste Seletivo sobre o PSA Endó-geno no Câncer de Próstata Refratário a Hormônio

Indução dobrada mediante aumento das concentrações doscompostos

<table> table see orginal document page 40</column></row><table><table>formula see original document page 41</column></row><table>

(*) Indução Dobrada: atividades induzidas por uma substância de teste es-pecífico sobre atividades em veículo de DMSO;

(**) n/a: o composto não foi examinado nesse ensaio.Efeito dos Compostos sobre a Atividade Mitocondrial do AR pelo EnsaioMTS

As células LNCaP-AR foram mantidas no meio de Iscove con-tendo 10% de FBS. Os compostos foram examinados quanto ao seu efeitosobre o crescimento de células de câncer de próstata refratário a hormônio.As células LNCaP sobrexpressas foram usadas pelo fato de que essas célu-las se comportam como células de câncer de próstata refratário a hormônioin vitro e in vivo (I). A atividade mitocondrial foi medida por ensaio MTS1 umsubstituto para o crescimento. As células LNCaP com receptor de andrógeno(AR) sobrexpresso (LN-AR) foram mantidas no meio de Iscove contendo10% de FBS. Dois dias antes do tratamento com a fármaco, as células foramcultivadas no meio de Iscove contendo 10% de CS-FBS^para eliminação dosandrógenos. As células foram divididas e cultivadas no meio de Iscove con-tendo 10% de CS-FBS, com apropriadas concentrações de R1881 e com-postos de teste. Depois de quatro dias de incubação, o crescimento da célu-la foi monitorado por MTS (Promega, Madison, Wl).

Consistente com o ensaio repórter e o ensaio de PSA, o cresci-mento da célula LNCaP sobrexpresso por AR foi estimulado por 25 microMdo composto R1881, porém, as células parentais não foram estimuladas, atéque a concentração do R1881 tivesse alcançado 100 microM. A figura 2mostra o efeito inibitório dos compostos selecionados sobre o crescimentodo câncer de próstata refratário a hormônio, na presença de 100 pM docomposto R1881. O atual fármaco clínico bicalutamida não inibiu o câncerde próstata refratário a hormônio. Em contrapartida, no exemplo 5-3b, ocomposto de fórmula (NC2) (4-(3-(4-metilfenil)-4,4-dimetil-5-oxo-2-tioxoimidazolidin-1 -il]-2-trifluorometil-benzonitrila) e no exemplo 7-3b, o com-posto de fórmula (NC7) (4-(8-oxo-6-tioxo-5-(4-metilfenil)-5,7-diazaspiro[3.4]oct-7-il)-2-trifluorometil-benzonitrila) inibiram o câncer de prós-tata refratário a hormônio com alta potência.

Foi examinado se a inibição do crescimento no ensaio MTS o-corre mediante almejamento do AR, no exemplo 5-3b, o composto de fórmu-la (NC2) (4-(3-(4-metilfenil)-4,4-dimetil-5-oxo-2-tioxoimidazolidin-1-il]-2-trifluorometil-benzonitrila) e no exemplo 7-3b, o composto de fórmula (NC7)(4-(8-oxo-6-tioxo-5-(4-metilfenil)-5,7-diazaspiro[3.4]oct-7-il)-2-trifluorometil-benzonitrila) foram testados em células DU-145, uma linha celular de câncerde próstata que omite a expressão do receptor de andrógeno (AR). Essescompostos não apresentaram nenhum efeito inibidor sobre as células DU-145. Os compostos não inibiram células diferentes das células de câncer depróstata expressas por AR, na medida em que não apresentaram nenhumefeito de crescimento sobre MCF7 e SkBr3, duas células de câncer de ma-ma comumente usadas, ou 3T3, uma linha celular de fibroblasto de camun-dongo normal.

Exemplos de atividade biológica in vitro dos derivados de diarilti-oidantoína são mostrados nas figuras 3 e 4. Por exemplo, com base na ativi-dade relativa da luciferase, a figura 3 indica que em uma concentração de500 nM os compostos são classificados na ordem de mais ativos para me-nos ativos, como segue: NC67>NC68>NC66>NC69>NC77NC53>bicalutamida. Por exemplo, com base no nível relativo de PSA, foidescoberto que em uma concentração de 500 nM os compostos são classifi-cados na ordem de mais ativos para menos ativos, como segue:NC50>NC48>NC7>NC43>NC44>NC49>NC50>NC45>bicalutamida. Porexemplo, com base nas unidades relativas de MTS, a figura 4 indica que emuma concentração de 500 nM os compostos são classificados de mais ativospara menos ativos, como segue: NC70>NC7>NC122>NC53>bicalutamida.Efeito Inibidor sobre Tumores de Xenoenxerto de Câncer de Próstata Refra-tários a Hormônio e de Câncer de Próstata Sensíveis a Hormônio

Os compostos da invenção são usados para examinar se os de-rivados de diarilidantoína apresentam efeitos in vivo no câncer de próstatarefratário a hormônio. Primeiro, se examina o efeito desse composto nostumores de xenoenxerto estabelecidos a partir de células LNCaP sobrex-pressas por AR. As células construídas por Matrigel (Collaborative Biomedi-cal) são injetadas subcutaneamente nos flancos de camundongos machosSCID castrados. O tamanho do tumor é medido semanalmente em três di-mensões, usando compassos de calibre. Após os tumores de xenoenxertoserem estabelecidos (tamanho do tumor de, pelo menos, 40 mm3), os ca-mundongos com tumores são randomizados e tratados com diferentes dosesdos compostos, oralmente, uma vez ao dia. O efeito inibidor sobre o cresci-mento do modelo de xenoenxerto de células LNCaP sobrexpressas por AR éestudado como segue. Os camundongos com tumores de xenoenxerto deLN-AR estabelecidos são randomizados e tratados com os compostos indi-cados, oralmente, uma vez ao dia. O tamanho do tumor é medido por com-passo de calibre.

Consistente com observação clínica, o atual fármaco clínico debicalutamida não inibiu o crescimento do câncer de próstata refratário a hor-mônio (mesmo como veículo). Em contrapartida, os compostos de acordocom a invenção inibiram o crescimento desses tumores e a inibição é de-pendente da dosae. Além disso, os compostos inibem a expressão do PSA,o marcador clínico para o câncer de próstata refratário a hormônio.

Os compostos da invenção são também testados em outro mo-delo de xenoenxerto de câncer de próstata refratário a hormônio, o modelode célula LAPC4 refratária a hormônio. Esse modelo foi estabelecido atravésda passagem do câncer de próstata refratário a hormônio em camundongoscastrados, o que imita a progressão clínica do câncer de próstata (2). Similarà descoberta usando o modelo de xenoenxerto de LNCaP sobrexpresso porAR, o atual fármaco clínico de bicalutamida não inibiu o crescimento e ex-pressão do PSA no modelo de xenoenxerto de LAPC4 refratário a hormônio(mesmo como veículo). Em contrapartida, os compostos da invenção inibi-ram o crescimento e expressão do PSA nesses tumores.

A figura 6 apresenta os resultados de um experimento no qualas células de LNCaP do modelo sensível a hormônio foram submetidas axenoenxerto em camundongos (106 células de LNCaP foram injetadas noscamundongos). Um primeiro conjunto de camundongos foi tratado com umNC53, um segundo conjunto de camundongos foi tratado com Casodex e umterceiro conjunto de camundongos foi tratado com a solução veículo. Cadaconjunto incluiu 6 camundongos. Os camundongos foram tratados com 10mg/kg por dia. A figura 6 apresenta os resultados na forma de um gráfico devolume de tumor em função do tempo. Os camundongos tratados com a so-lução veículo como controle, exibiram o aumento mais rápido no volume dotumor. Os camundongos tratados com Casodex e os camundongos tratadoscom o NC53 exibiram velocidades similares de crescimento de tumor, maislenta que os camundongos tratados com a solução veículo.

Efeito Inibidor sobre o Crescimento de Células de Câncer de Próstata Sensí-veis a Hormônio

Para determinar se os derivados de diariltioidantoína tambéminibem as células de câncer de próstata sensíveis a hormônio, alguns com-postos seletivos foram testados quanto ao crescimento de células LNCaP1mediante medição pelo ensaio de MTS de atividades do mitocôndria. As cé-lulas de LNCaP famintas de andrógeno são tratadas com concentraçõescrescentes de DMSO como veículo ou substância de teste, na presença de 1pM do composto de R1881. Depois de 4 dias de incubação, o crescimentoda célula é medido pelo ensaio de MTS. Os compostos da invenção inibem ocâncer de próstata sensível a hormônio com uma maior potência que o com-posto de bicalutamida.

Ensaio Biológico In vivo

Todos os experimentos de animais foram realizados em confor-midade com as diretrizes do "Animal Research Committee of the Universityof Califórnia", em Los Angeles. Os animais foram comprados da Taconic e mantidos em uma torre de fluxo laminar, em uma colônia de flora definida.As células do vetor LNCaP-AR e LNCaP foram mantidas em um meio deRPMI suplementado com 10% de FBS. 106 células em 100 μί de um meiode Matrigel:RPMI (1:1) foram injetadas subcutaneamente nos flancos decamundongos machos SCID castrados. O tamanho do tumor foi medido se-manalmente em três dimensões (comprimento χ largura χ profundidade) u-sando compassos de calibre. Os camundongos foram randomizados paragrupos de tratamento quando o tamanho do tumor alcançou aproximada-mente 100 mm3. Os fármacos foram fornecidos oralmente a cada dia, emuma quantidade de 10 mg/kg e 50 mg/kg. Para se obter leitura farmacodi-nâmica, os animais foram visualizados através de uma câmera ótica CCD,depois de 3 horas da última dose de tratamento. Um ROI é desenhado sobreo tumor para medição da atividade de Iuciferase em fóton/segundo. Os pai-néis à direita representam medições de ROIs. Os dados são mostrados nasfiguras 7 e 8. Após 18 dias, o NC53 foi eficaz na prevenção do crescimentodo tumor e ainda provocou o seu encolhimento, sendo diferentemente maiseficaz do que a bicalutamida.

As propriedades farmacocinéticas da bicalutamida, do compostode fórmula (NC7) 4-[7-(4-ciano-3-trifluorometilfenil)-8-oxo-6-tioxo-5,7-diazaspiro[3,4]oct-5-il]tolueno, composto de fórmula (NC48) N-metil-4-[4-[7-30 (4-ciano-3-trifluorometilfenil)-8-oxo-6-tioxo-5,7-diazaspiro[3.4]oct-5-

il]fenil)butanamida, e composto de fórmula (NC53) (52d) N-metil-4-[7-(4-ciano-3-trifluorometilfenil)-8-oxo-6-tioxo-5,7-diazaspiro[3.4]oct-5-il]-2-fluorobenzamida foram avaliadas in vivo usando camundongos FVB de oitosemanas, adquiridos de Charles River Laboratories. Os camundongos foramdivididos em grupos de três para cada ponto de tempo. Dois camundongosnão foram tratados com fármacos e dois outros foram tratados com a solu-ção veículo. Cada grupo foi tratado com 10 mg/kg de peso do corpo.

O fármaco foi dissolvido em uma mistura de DM-SO:PEG400:H20 (1:5:14) (solução veículo) e foi administrado nos camun-dongos através da veia da cauda. Os animais foram aquecidos sob umalâmpada de aquecimento por aproximadamente 20 minutos, antes do trata-mento, para dilatar a veia da cauda. Cada camundongo foi colocado dentrode uma gaiola de camundongo (Fischer Sci., Catálogo No. 01-288-32a),sendo injetados 200 μί da fármaco na solução veículo dentro da veia dilata-da da cauda. Depois da administração do fármaco, os animais foram eutani-zados mediante inalação de CO2 em diferentes instantes de tempo: 5 minu-tos, 30 minutos, 2 horas, 6 horas e 16 horas. Os animais foram imediata-mente sangrados após a exposição ao C02 através de punctura cardíaca(seringa BD de 1 mL, com agulha 27G de 5/8). Para dosagem oral, o fárma-co foi dissolvido em uma mistura de DMSO:carboximetilcelu-lose:Tween80:H20 (50:10:1:989) antes da administração oral, através deuma seringa de alimentação.

As amostras de soro foram analisadas para determinar a con-centração do fármaco por meio de procedimento de HPLC (bomba 600 daWaters, controlador 600 da Waters e detector 600 da Waters), equipado comuma coluna C18 da Altima (3μ, 150 mm x 4,6 mm). Os compostos de fórmu-Ias NC7, NC48 e NC53 foram detectados em comprimento de onda de 254nm e a bicalutamida foi detectada em comprimento de onda de 270 nm.

As amostras para análise de HPLC foram preparadas de acordocom o seguinte procedimento:

- células do sangue foram separadas do soro mediante centrifugação;

- em 400 μL de soro, foram adicionados 80 μL de uma solução 10 μΜ de umpadrão interno e 520 μL de bicalutamida;

- a mistura foi submetida ao-turbilhonamento durante 3 minutos e, depois,colocada sob ultra-som por 30 minutos;

- as partículas sólidas foram filtradas ou separadas mediante centrifugação;

- o filtrado foi seco sob um fluxo de argônio até a secura. A amostra foi re-construída para 80 μΙ_ com acetonitrila, antes da análise por HPLC para de-terminar a concentração do fármaco;

- uma curva padrão do fármaco foi usado para melhorar a precisão.

A concentração do NC53 no plasma como função do tempo, re-sultante de administração intravenosa e administração oral é mostrada nafigura 9. As concentrações em estado uniforme (Css) da bicalutamida, doNC48 e NC53 são mostradas na Tabela 4. A concentração em estado uni-forme do NC53 é, essencialmente, tão satisfatória quanto da bicalutamida e,substancialmente, melhor que do NC48.

Tabela 4 - Concentração em estado uniforme da bicalutamida, NC48 eNC53 no plasma de camundongos

<table>table see original document page 47</column></row><table>

A atividade do receptor de andrógeno pode incluir diversos as-pectos de estimulação e de inibição do comportamento do receptor de an-drógeno, incluindo, mas não limitado aos seguintes: concentração inibidora(IC50) em um sistema repórter de resposta ao AR ou em um sistema de se-creção específica de antígeno; indução dobrada associada ao aumento dasconcentrações em um sistema repórter de resposta ao AR ou em um siste-ma de secreção específica de antígeno; crescimento de tumor associado emum animal; afinidade de ligação de um receptor de andrógeno a um compos-to; recrutamento de receptor de andrógeno para um intensificador de antíge-no específico da próstata ou um promotor de antígeno específico da prósta-ta; translocação nuclear de receptor de andrógeno; e desestabilização deuma proteína de receptor de andrógeno.

Ensaios In VitroA figura 10 apresenta as afinidades de ligação relativas doscompostos para os domínios de ligação do Iigante do receptor de andrógenode rato (AR do rato), conforme determinado pelos kits do ensaio do concor-rente (Invitrogen). A polarização por fluorescência foi usada como elementode leitura. Cada dose de hormônio foi realizada em triplicata e o erro relativofoi determinado mediante cálculo do erro padrão de três valores de média. Apesquisa foi controlada para uma concorrência mínima (somente o veículo),nenhum receptor, nenhum ligando fluorescente e concorrência máxima(R1881 10"5M, progesterona, E2 ou dexametasona). As curvas foram ade-quadas usando um único modelo de concorrência do local de ligação (foiusado o pacote de software de análise estatística de Prism). O compostoR1881 apresentou a constante de dissociação de equilíbrio mais baixa, Ki =4 nM (dessa forma, o receptor de andrógeno de rato apresentou a mais altaafinidade pelo composto R1881 dentre os quatro compostos testados). Ocomposto RU59063 apresentou uma constante de dissociação de equilíbrio,Ki = 20 nM, e o NC53 apresentou uma constante de dissociação de equilí-brio, Ki = 0,8 uM. O produto Casodex apresentou uma constante de dissoci-ação de equilíbrio, Ki = 0,4 uM (dessa forma, o receptor de andrógeno derato apresentou a mais baixa afinidade pelo Casodex dentre os quatro com-postos testados). O NC53 e o Casodex apresentaram constantes de dissoci-ação de equilíbrio similares e, assim, o receptor de andrógeno de rato apre-sentou uma afinidade similar para esses compostos.

O NC53 preveniu o recrutamento do receptor de andrógeno (AR)e de polimerase Il de RNA (Pol II) para o intensificador de PSA e promotorde PSA. A figura 11 apresenta os resultados dessa pesquisa. Os materiaisusados foram Cromatin IP com AR (Upstate, catálogo No. 06-680) e Pol Il(Covance, Catálogo No. MMS-126R). As células LNCaP (ATCC) foram pla-queadas no soro total. No dia do experimento, ácido nucléico placa foi lava-do uma vez com 1 χ PBS e foi adicionado 5% de CSS durante 3 dias. Paraum primeiro conjunto de experimentos, foram adicionados 10 uM do NC53(R), para um segundo conjunto de experimentos, foram adicionados 10 uMde bicalutamida (C) e para um terceiro conjunto de experimentos, foi adieisnado 1 nM do composto R1881 (+). Cada um desses compostos foi adicio-nado durante 6 horas. Em um quarto conjunto de experimentos, foi adiciona-do um controle (-), sem a adição de nenhum composto. O período de tempode 6 horas foi processado em 28 ciclos. Foram usados kits ChIP da Upstate(catálogo No. 17-295). Iniciadores do intensificador e promotor foram obtidosde Louie (PNAS, 2003, volume 100, páginas 2226-2230) e Shang (MolecularCell, 2002, volume 9, páginas 601-610), respectivamente. A imagem maisescura dos experimentos nos quais foi adicionado o NC53 (R), indica que oNC53 impediu que o receptor de andrógeno e polimerase Il de RNA formas- sem um complexo de transcrição sobre o gene do antígeno específico dapróstata (PSA). Em contrapartida, a imagem mais clara dos experimentosnos quais a bicalutamida (Casodex, C) foi adicionada, indica que na presen-ça da bicalutamida, o receptor de andrógeno e polimerase Il de RNA foramainda recrutados para os elementos de PSA, para a transcrição do mRNA do PSA.

O NC53 inibiu a translocação nuclear do receptor de andrógenonas células LNCaP. As figuras 12 e 13 apresentam os resultados da pesqui-sa. As células LNCaP foram plaqueadas em 5% de CSS. Um primeiro con-junto de células foi tratado com 10 uM de NC53 (R), um segundo conjunto de células foi tratado com 10 uM de bicalutamida (C) e um terceiro conjuntode células foi tratado com R1881 1 nM (+). Um quarto conjunto de célulasserviu como controle (-). O produto TOPO I (Santa Cruz, catálogo No. SC-32736) foi usado para o controle da fração nuclear e GAPDH (Santa Cruz,catálogo No. SC-20357) foi usado para o controle da fração citoplásmica. Ascélulas LNCaP foram colhidas para fracionamento subcelular ou tingimento,com um anticorpo rotulado FITC (Santa Cruz) contra o receptor de andróge-no (Santa Cruz, catálogo No. SC-815). A partir do fracionamento subcelular,foram obtidas imagens, conforme mostrado na figura 12. A imagem maisescura na fração nuclear para a amostra tratada com bicalutamida (Caso-dex, C), indicou que a bicalutamida induziu a translocação nuclear do recep-tor de andrógeno. A imagem clara da amostra tratada pelo NC53 (R), indicouque o NC53 anulou a translocação nuclear. Para o ensaio de FITC-AR, fo-ram montadas abas de cobertura sobre lâminas de vidro usando um meiocontendo DAPI e as células foram visualizadas 24 horas depois usando ummicroscópio fluorescente da Nikon, com ampliação de 60 vezes, contendofiltros para DAPI e FITC. No ensaio de FITC-AR, os núcleos das células tra-tadas com o composto R1881 e bicalutamida foram de tons de verde diferen-tes, conforme mostrado na figura 13, indicando que ocorreu a translocaçãonuclear do receptor de andrógeno. Em contrapartida, os núcleos das célulastratadas com DMSO e NC53 foram de um tom menos esverdeado.

O NC53 desestabilizou as proteínas receptoras de andrógenonas células LNCaP. A figura "14 mostra os resultados dessa pesquisa. Apesquisa foi conduzida mediante plaqueamento de 105 células LNCaP (fgc)em 5% de CSS, durante 3 dias. 100 pM do composto R1881 foram adiciona-das a um primeiro conjunto de células (+). 10 uM de bicalutamida foram adi-cionados a um segundo conjunto de células (B), 10 uM do NC53 foram adi-cionados a um terceiro conjunto de células (RD), 100 pM do compostoR1881 e 10 uM de bicalutamida foram adicionados a um quarto conjunto decélulas (B+) e 100 PM de R1881 e 10 uM de NC53 foram adicionados a umquinto conjunto de células (RD+). O composto de R1881, a bicalutamida ouo NC53 não foram adicionados a um sexto conjunto de células (-). As célulasforam deixadas residir com a os adicionados compostos de bicalutamida,NC53 e/ou R1881 durante 24 horas (ou no caso do conjunto (-), sem quais-quer destes por 24 horas). Na figura 14, a imagem escura para o conjunto aoqual a bicalutamida (B) foi adicionada e para o conjunto ao qual a bicaluta-mida e R1881 (B+) foram adicionados, indica que a proteína receptora deandrógeno foi nivelada quando essas combinações de compostos foram adi-cionadas. Em contrapartida, a imagem clara para o conjunto ao qual o NC53(RD) foi adicionado e para o conjunto ao qual NC53 e R1881 (RD+) foramadicionados, indica que a adição de NC53 resultou na degradação das pro-teínas receptoras de andrógeno, caso ou não esteja presente o compostoR1881.

Classificação dos Compostos em Séries

As Tabelas 5-10 apresentam compostos de diarilidantoína agru-pados em Séries de 1-6. A Tabela 11 apresenta compostos de diarilidantoí-na que não foram incluídos em uma série. A inclusão dos compostos emséries foi baseada em dados disponíveis acoplados a um julgamento analíti-co. Os dados considerados incluídos se apresentam nos ensaios in vitro (sis-tema repórter de resposta ao AR na linha celular LNCaP, medição do nívelde PSA, ensaio mitocondrial por MTS) e em experimentos in vivo (tamanhodo tumor medido diretamente ou através de emissão induzida pelo gene re-pórter de luciferase, ensaios farmacocinéticos baseados nos níveis do plas-ma do sangue). Nem todos os compostos foram submetidos a tais ensaios enem todos~os dados que foram gerados são mostrados. O julgamento foiaplicado na classificação de compostos relativamente entre si, com relação asua utilidade no tratamento de câncer de próstata, em particular, quando daclassificação de dois compostos para os quais os mesmos experimentos nãoforam realizados. As características consideradas no estabelecimento daclassificação incluem a atividade de antagonismo de AR, a falta de agonismode AR nas células refratárias a hormônio, a prevenção de crescimento detumor, a diminuição do tumor e o comportamento farmacocinético, em queum tempo de residência mais longo no sangue é considerado vantajoso.

Geralmente, os compostos da Série 1 são diariltioidantoínas comum anel de arila dissubstituído à esquerda, dissubstituído no carbono à direi-ta da hidantoína, tendo um substituinte de oxigênio ou nitrogênio no carbonoà esquerda da hidantoína. É esperado que o substituinte de amido se hidro-lize em oxigênio nas soluções aquosas, tais como, aquelas encontradas emsistemas biológicos, in vitro e in vivo. O composto de fórmula NC63 apresen-ta uma satisfatória atividade com iodo, ao invés de um substituinte de CF3,no anel esquerdo de arila.

Os compostos da Série 1 (ver a Tabela 5) foram julgados comosendo muito melhores do que a bicalutamida, para tratamento do câncer depróstata. Entretanto, os compostos de fórmula NC7 e NC48 foram conside-rados de rápida metabolização, isto é, apresentam um curto período de tem-po de residência no sangue. O NC53 apresentou desejáveis propriedadesfarmacocinéticas. -=·A figura 16 mostra que sob tratamento com bicalutamida, os ní-veis de PSA para as células LNCaP apresentaram o mesmo efeito de tingi-mento ou um aumento relativo de tingimento, com relação ao tratamentocom a solução veículo, enquanto que sob tratamento com o NC53, os níveisde PSA diminuíram. A figura 17 ilustra que sob tratamento com a soluçãoveículo, os tumores continuaram a aumentar de tamanho. Em contrapartida,sob tratamento com o NC53 em uma dose de 1 mg/kg de peso do corpo, ataxa de aumento de tumor diminuiu e o tamanho do tumor pareceu se estabi-lizar depois de aproximadamente 17 dias. Sob tratamento com o NC53, emuma dose de 10 mg/kg de peso do corpo, por dia, o tamanho do tumor dimi:~nuiu no decorrer do tempo. A figura 18 ilustra que sob tratamento com oNC53, em uma dose de 10 mg/kg de peso do corpo, por dia, a emissão defóton associada com a atividade de Iuciferase diminuiu. A figura 19 mostraque o tratamento com o NC53 nessa dosagem, resultou em uma redução ouestabilização do tamanho do tumor e uma diminuição da emissão de fótonassociada com a atividade de luciferase.

A figura 20 mostra que sob tratamento com os NC53, NC54,NC55, NC56 e NC57, em dosagens de 100, 200, 500 e 1000 nM, os níveisde PSA das células LN-AR diminuíram. Além disso, quanto maior for a do-sagem, menor será o nível de PSA. A figura 22 apresenta o peso do tratourogenital e a velocidade de emissão de fóton associada com a atividade deluciferase, no início e depois de 14 dias de tratamento com bicalutamida oucom NC53, para camundongos intactos e castrados. O peso e a velocidadeda emissão de fóton aumentaram para os camundongos intactos e camun-dongos castrados. O tratamento dos camundongos castrados com o NC53resultou em uma diminuição de peso e de emissão de fóton com relação aoscamundongos castrados não-tratados, do mesmo modo que o tratamentocom a bicalutamida.

Assim, os compostos da Série 1 são particularmente vantajosospara uso como antagonistas do receptor de andrógeno (AR), e como agen-tes terapêuticos para o câncer de próstata refratário a hormônio. Essescompostos podem ser de utilidade no tratamento de outras doenças ou con-dicionamentos doentios correlacionados ao AR, como, por exemplo, hiper-plasia benigna de próstata, perda de cabelo e acne. Esses compostos e ou-tros correlacionados podem ser de utilidade como moduladores de outrosreceptores nucleares, como, por exemplo, receptor de glicocorticóide, recep-tor de estrogênio e receptor ativado pelo proliferador de peroxissomo e comoagentes terapêuticos para doenças em que os receptores nucleares desem-penham um importante papel, tais como, câncer de mama, câncer de ovário,diabetes, doenças cardíacas e doenças correlacionadas ao metabolismo.Eles podem ser de utilidade em ensaios, por exemplo, como padrões ou co-mo intermediários ou pró-fármacos.

Tabela 5

<table>table see original document page 53</column></row><table>Continuação...

<table>table see original document page 54</column></row><table>Série 2

Os compostos da Série 2 (ver a Tabela 6) foram significativa-mente melhores que a bicalutamida para o tratamento do câncer de próstata,embora haja indicações de que o composto de fórmula NC12 possa atuarcomo um agonista. A figura 3 ilustra que os compostos de fórmulas NC66,NC67, NC68, NC53 e NC69 na Série 1 e NC77 na Série 2, dosados em con-centrações variando de 125 nM a 1000 nM, atuaram para reduzir a atividadede Iuciferase nas células LNCaP-AR1 enquanto que as soluções de controlede DMSO e bicalutamida induziram pouco ou nenhum efeito. Foi descobertoque nas concentrações de 1000 nM, os compostos de fórmulas NC7 eNC48, na Série 1, provocaram uma maior diminuição no nível de PSA dascélulas LNCap-AR do que os NC43, NC44 e NC50, na Série 2. A figura 7apresenta volume de tumor no curso do tempo e ilustra que sob tratamentocom bicalutamida ou solução veículo, os tumores continuaram a crescer,enquanto que sob tratamento com o NC53, na Série 1, os tumores diminuí-ram de tamanho. A figura 8 ilustra que a emissão de fóton associada com aatividade de Iuciferase permaneceu praticamente a mesma ou aumentou sobtratamento com bicalutamida, em relação ao tratamento com a solução veí-culo, enquanto que a emissão de fóton diminuiu sob tratamento com oNC53. A figura 23 ilustra que sob tratamento com bicalutamida, ocorreu pou-ca ou nenhuma diminuição dos níveis de PSA, enquanto que sob tratamentocom os NC48 e NC53, os níveis de PSA diminuíram. A figura 24 ilustra que oIC5O para os compostos de fórmulas NC7, NC48 e NC53, na Série 1, foi mui-to menor que o IC50 para a bicalutamida.

De modo geral, os compostos da Série 2 são estruturalmentesimilares aos compostos da Série 1, mas, com diferentes substituintes noanel direito de arila. Os compostos da Série 2 são vantajosos para uso comoantagonistas de AR e como agentes terapêuticos para o câncer de próstatarefratário a hormônio. Esses compostos podem ser de utilidade no tratamen-to de outras doenças ou condicionamentos doentios correlacionados ao AR,tais como, hiperplasia benigna de próstata, perda de cabelo ou acne. Essescompostos e outros correlacionados podem ser de utilidade como modulado-res de outros receptores nucleares, como, por exemplo, receptor de estro-gênio e receptor ativado pelo proliferador de peroxissomo e como agentesterapêuticos para doenças em que os receptores nucleares desempenhamum importante papel, tais como, câncer de mama, câncer de ovário, diabe-tes, doenças cardíacas e doenças correlacionadas ao metabolismo. Elespodem ser de utilidade em ensaios, por exemplo, como padrões ou comointermediários ou pró-fármacos.

Tabela 6

<table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table>

Os compostos da Série 3 (ver a Tabela 7) foram julgados comosendo um pouco melhores do que a bicalutamida, com relação ao tratamen-to do câncer de próstata. Os NC43, NC44 e NC50 (na Série 2) provocaramuma maior diminuição no nível de PSA das células LNCaP-AR do que osNC45 e NC49, na Série 3. Todos esses compostos provocaram uma maiordiminuição no nível de PSA do que a bicalutamida.

Outros compostos da Série 3 (não mostrados) não incluíram asdiariltioidantoínas, e foram comparáveis em atividade aos compostos de mo-noariltioidantoína do estado da técnica, isto é, os compostos de fórmulasNC83, NC79 e NC80.

Dessa forma, os compostos da Série 3 são de utilidade comoantagonistas de AR e como agentes terapêuticos para o câncer de próstatarefratário a hormônio. Esses compostos podem ser de utilidade no tratamen-to de outras doenças ou condicionamentos doentios correlacionados ao AR,tais como, hiperplasia benigna de próstata, perda de cabelo ou acne. Essescompostos e outros correlacionados podem ser de utilidade como modulado-res de outros receptores nucleares, como, por exemplo, receptor de estro-gênio e receptor ativado pelo proliferador de peroxissomo e como agentesterapêuticos para doenças em que os receptores nucleares desempenhamum importante papel, tais como, câncer de mama, câncer de ovário, diabe-tes, doenças cardíacas e doenças correlacionadas ao metabolismo. Elespodem ser de utilidade em ensaios, por exemplo, como padrões ou comointermediários ou pró-fármacos.

Tabela 7

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Série 4

Os compostos da Série 4 (ver a Tabela 8) foram julgados comonão sendo melhores do que a bicalutamida para o tratamento do câncer depróstata. Os compostos de fórmulas NC93 e NC94 da Série 4 e NC7 da Sé-rie 1, por exemplo, diferem apenas no substituinte sobre o carbono inferior àdireita do anel de hidantoína. Os substituintes no anel arila situado à direitapodem também afetar a atividade.

Alguns compostos da Série 4 (incluindo aqueles mostrados eoutros não mostrados) não são compostos de diarila (falta o anel de arilasituado à direita), não são tioidantoínas, não são dissubstituídos no carbonoinferior à direita do anel de hidantoína e/ou apresentam substituintes diferen-tes de oxigênio ou amido no carbono inferior à esquerda do anel de hidanto-ína. Isso confirma a evidência das surpreendentes vantagens das diariltioi-dantoínas que são dissubstituídas no carbono inferior à direita do anel dehidantoína e que possuem oxigênio ou amido no carbono inferior à esquerdado anel de hidantoína.

Assim, os compostos da Série 4 podem ser de utilidade comoantagonistas de AR e como agentes terapêuticos para o câncer de próstatarefratário a hormônio, pelo menos, na proporção em que são comparáveiscom a bicalutamida. Esses compostos podem ser de utilidade no tratamentode outras doenças ou condicionamentos doentios correlacionados ao AR,tais como, hiperplasia benigna de próstata, perda de cabelo ou acne. Essescompostos e outros correlacionados podem ser de utilidade como modulado-res de outros receptores nucleares, como, por exemplo, receptor de estro-gênio e receptor ativado pelo proliferador de peroxissomo e como agentesterapêuticos para doenças em que os receptores nucleares desempenhamum importante papel, tais como, câncer de mama, câncer de ovário, diabe-tes, doenças cardíacas e doenças correlacionadas ao metabolismo. Elespodem ser de utilidade em ensaios, por exemplo, como padrões ou comointermediários ou pró-fármacos.Tabela 8

<table>table see original document page 60</column></row><table><table>table see original document page 61</column></row><table>

Série 5

Os compostos da Série 5 (ver a Tabela 9) foram ineficazes oupraticamente ineficazes e, assim, foram piores do que a bicalutamida para otratamento do câncer de próstata. Os substituintes dispostos à direita do a-nel de arila são importantes para determinação da atividade.

Alguns compostos da Série 5 (incluindo aqueles mostrados eoutros não mostrados) não são compostos de diarila (falta o anel de arilasituado à direita), não são tioidantoínas, não são dissubstituídos no carbonoinferior à direita do anel de hidantoína e/ou apresentam substituintes diferen-tes de oxigênio ou amido no carbono inferior à esquerda do anel de hidanto-ína. Isso confirma a evidência das surpreendentes vantagens das diariltioi-dantoínas que são dissubstituídas no carbono inferior à direita do anel dehidantoína e que possuem oxigênio ou amido no carbono inferior à esquerdado anel de hidantoína. Em particular, o substituinte terminal nos NC103,NC104 e NC106 (CH2NRxRy, onde Rxy = H ou metila) não é visto como umcontribuinte para a atividade desses compostos.Os compostos da Série 5 não seriam desejáveis para o trata-mento do câncer de próstata ou como antagonistas do receptor de andróge-no (AR), conquanto que esses e outros compostos correlacionados possamser de utilidade como moduladores de outros receptores nucleares, como,por exemplo, receptor de estrogênio e receptor ativado pelo proliferador deperoxissomo e como agentes terapêuticos para doenças em que os recepto-res nucleares desempenham um importante papel, tais como, câncer demama, câncer de ovário, diabetes, doenças cardíacas e doenças correlacio-nadas ao metabolismo. Eles podem ser de utilidade em ensaios, por exem-pio, como padrões ou como intermediários ou pró-fármacosr

Tabela 9

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Os compostos da Série 6 (ver a Tabela 10) foram ineficazes oupraticamente ineficazes e, além disso, foram fortes agonistas, dessa forma,muito piores do que a bicalutamida para o tratamento do câncer de próstata.Os compostos comparativos foram classificados como muito fracos em rela-ção aos compostos da invenção. Notadamente, o composto de fórmulaNC107 apresentou uma atividade muito fraca, com um substituinte de clorono anel esquerdo da arila, enquanto que o composto de fórmula NC2, comum trifluorometano e o composto de fórmula NC63, com iodo, foram classifi-cados na Série 1. Os resultados dos compostos da Série 6 confirmaram aevidência das surpreendentes vantagens dos compostos de diariltioidantoínaque são dissubstituídos no carbono inferior à direita do anel de hidantoína eque possuem oxigênio ou amido no carbono inferior à esquerda do anel dehidantoína, apresentando alguns substituintes no anel de arila situado à es-querda.

Os compostos da Série 6 não seriam desejáveis para o trata-mento do câncer de próstata ou como antagonistas de AR.

Tabela 10

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Compostos não Classificados em Séries

Para diversos compostos, os dados experimentais não foramsuficientes para classificação dos mesmos. Esses compostos não classifica-dos em Séries são apresentados na Tabela 11.

Com base nos dados e métodos da invenção e na aplicação dejulgamento baseado no re-exame de diversos compostos, incluindo algunsnão mostrados no presente relatório, é possível se fazer algumas observa-ções sobre os compostos não classificados em Séries. O Exemplo Compara-tivo referente ao composto NC108 é esperado de se dispor na Série 3 comos Exemplos Comparativos referentes aos compostos NC78-NC80. O com-posto NC113 é esperado de se hidrolisar no composto NC7 (Série 1) e, por-tanto, deve ter atividade comparável. O composto NC114 é esperado de sehidrolisar no composto NC16 (Série 1) e, portanto, deve ter atividade compa-rável. O composto NC115 é esperado de se hidrolisar no composto NC3(Série 1) e os compostos NC120 e NC121 são esperados de se hidrolisaremno composto NC50 (Série 2) e, portanto, devem ter atividades comparáveis.

Tabela 11

<table>table see original document page 64</column></row><table>Continuação...

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Em resumo, os novos compostos que mostraram evidência co-mo muito superiores à atividade da bicalutamida no tratamento do câncer depróstata foram identificados e produzidos.

Sensibilidade da Atividade Anti-câncer de Determinados Compostos a Dife-renças Estruturais

Os presentes inventores determinaram que o que possa pareceruma pequena modificação na estrutura dos compostos de hidantoína, poderesultar em uma grande modificação do desempenho dos compostos no tra-tamento do câncer de próstata. Por exemplo, os compostos de fórmulasNC77 e NC53 diferem apenas por um único substituinte de flúor sobre o anelde arila e o NC53 se classifica na Série 1, enquanto o NC77 está classifica-do na Série 2, ambos sendo melhores que a bicalutamida para o tratamentodo câncer de próstata, mas, o NC53 é superior. Entretanto, o composto defórmula NC98 que difere do NC77 apenas por ter um adicional átomo decarbono entre o grupo metilcarbamoíla e o anel de arila, não é melhor que abicalutamida para o tratamento do câncer de próstata, sendo classificado naSérie 4. O efeito proporcionado pelos compostos de fórmulas NC77, NC53 eNC98 sobre a atividade da Iuciferase pode ser observado na Figura 25. Sobuma dada concentração do composto, a atividade da Iuciferase após exposi-ção aos compostos de fórmulas NC77 e NC53 é menor que a atividade daluciferase após a exposição ao composto de fórmula NC98.

O NC4 difere do NC3 apenas em que o grupo amino é substituí-do por um grupo hidroxila. Entretanto, enquanto o composto NC3 está classi-ficado na Série 1, ou seja, muito melhor que a bicalutamida para o tratamen-to de câncer de próstata, o NC4 está classificado na Série 4, ou seja, não émelhor que a bicalutamida. O efeito dos NC3 e NC4 sobre a atividade daIuciferase na linha celular 1AR foi estudado mediante administração de di-versos compostos em concentrações variando de 1,25 a 10 μιτιοΙ, observan-do-se os níveis de PSA. Para uma determinada dose, a atividade da Iucife-rase após exposição ao NC3 é menor que a atividade da Iuciferase apósexposição ao NC4. O efeito proporcionado pelos NC3 e NC4 sobre a ativi-dade da Iuciferase na linha celular 4AR foi estudado através da administra-ção de diversos compostos em concentrações variando de 1,25 a 10 μιηοΙ eobservando a atividade da luciferase. Para uma determinada dose, a ativi-dade da luciferase após exposição ao NC3 é menor que a atividade da Iuci-ferase após exposição ao NC4. O efeito proporcionado pelos NC3 e NC4sobre os níveis de PSA na linha celular LN/AR foi estudado através da ad-ministração de diversos compostos em concentrações variando de 1,25 a 10μmol e observando a atividade da luciferase. Para uma determinada dose, onível de PSA após exposição ao NC3 é menor que a atividade da luciferaseapós exposição ao NC4.

Os NC47 e NC48 diferem entre si apenas por um substituinte demetila na extremidade de um grupo carbamoíla e ambos os compostos sãoclassificados na Série 1, embora o NC48 tenha sido encontrado como sendoparticularmente vantajoso. O NC46 é idêntico ao NC47, com exceção de umgrupo metóxi que é substituído por um grupo amino. Entretanto, o NC42 ésimilar ao NC46, mas tem menos um carbono na cadeia que liga o grupoéster ao anel de arila; o composto NC42 está classificado na Série 3. O efei-to proporcionado pelos NC47, NC48, NC42 e NC46 sobre os níveis de PSAna linha celular LN/AR foi estudado através da administração de diversoscompostos, em concentrações variando de 125 nmol a 1000 nmol, obser-vando-se os níveis de PSA. Para uma dada concentração, o nível de PSAapós exposição aos compostos NC47 e NC48 é inferior ao nível de PSA a-pós exposição aos NC42 e NC46.

Os NC68 e NC103 diferem entre si devido ao primeiro apresen-tar um grupo metilcarbamoíla fixado a um anel de arila e um substituinte dedimetila fixado ao grupo tioidantoína, enquanto que o último, apresenta umgrupo metilamino fixado ao anel de arila situado à~ direita e um substituintede ciclobutila fixado ao grupo tioidantoína. Enquanto que NC68 está classifi-cado na Série 1, ou seja, muito melhor que a bicalutamida para o tratamentodo câncer de próstata, o NC103 está classificado na Série 5, ou seja, inefi-caz ou praticamente ineficaz no tratamento do câncer de próstata. O efeitoproporcionado pelos compostos NC68 e NC103 sobre a atividade da Iucife-rase na linha celular LN/AR foi estudado através da administração de diver-sos compostos, em concentrações variando de 125 nmol a 1000 nmol, ob-servando-se a atividade da luciferase. Para uma dada concentração, a ativi-dade da luciferase após exposição ao NC68 é inferior à atividade da Iucife-rase após exposição ao NC103.

Os NC16 e NC18 diferem entre si no que se refere à substituiçãode um grupo tio por um grupo oxo e de um substituinte de dimetila por umsubstituinte de ciclobutila. Enquanto que o NC16 está classificado na Série1, o composto NC18 está na Série 4.

Composições Farmacêuticas e Administração

Os compostos da invenção são de utilidade como composiçõesfarmacêuticas preparadas com uma quantidade terapeuticamente eficaz deum composto da invenção, conforme aqui definido, e um veículo ou diluentefarmaceuticamente aceitável.

Os compostos de diarilidantoína da invenção podem ser formu-lados como composições farmacêuticas e administrados a um sujeito emnecessidade de tratamento, por exemplo, um mamífero, tahcomo, um paci-ente humano, em uma variedade de formas adaptadas para a via de admi-nistração escolhida, por exemplo, pelas rotas oral, nasal, intraperitoneal ouparenteral, pelas rotas intravenosa, intramuscular, tópica ou subcutânea ouatravés de injeção dentro do tecido.

Assim, os compostos de diarilidantoína da invenção podem seradministrados de forma sistêmica, por exemplo, oralmente, em combinaçãocom um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como, um diluente inerte oucomo um veículo comestível assimilável ou através de inalação ou insufla-ção. Esses compostos podem ser incluídos em cápsulas de gelatina de cas-ca dura ou elástica, podem sercomprimidos na forma de comprimidos oupodem ser diretamente incorporados ao alimento na dieta do paciente. Paraadministração terapêutica oral, os compostos de diarilidantoína podem sercombinados com um ou mais excipientes e usados na forma de comprimidosque podem ser ingeridos, comprimidos de disposição na boca, saquinhos,cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, folheados e similares. Os compos-tos de diarilidantoína podem ser combinados com um veículo em pó fino i-nerte e inalado peJo sujeito ou então insuflado. Essas composições e prepa-rações devem conter, pelo menos, 0,1% em peso dos compostos de diarili-dantoína. A percentagem das composições e preparações pode, Iogicamen-te, ser variada e, de modo conveniente, se situar entre cerca de 2% a cercade 60% em peso, com relação a uma determinada forma de dosagem unitá-ria. A quantidade dos compostos de diarilidantoína em tais composições te-rapeuticamente úteis é tal que um nível eficaz de dosagem será obtido.

Os comprimidos, saquinhos, pílulas, cápsulas e outras formaspodem conter os seguintes ingredientes: aglutinantes, tais como, goma detragacanto, acácia ou goma arábica, amido de milho ou gelatina; excipientes,tais como, fosfato dicálcico; um agente de desintegração, tal como, amido demilho, amido de batata, ácido algínico e outros; um lubrificante, tal como,estearato de magnésio; e um agente adoçante, tal como, sacarose, frutose,lactose ou aspartame ou um agente aromatizante, tal como, hortelã, óleo degaultéria ou aromatizante de cereja podem ser adicionados. Quando a formade dosagem unitária é uma cápsula, a mesma pode conter, além dos mate-riais do tipo acima, um veículo líquido, tal como, óleo vegetal ou propilenogli-col. Diversos outros materiais podem Ester presentes como revestimentosou, de outro modo, como modificadores da forma física da forma de dosa-gem unitária sólida. Por exemplo, os comprimidos, pílulas ou cápsulas po-dem ser revestidos com gelatina, cera, goma-laca ou açúcar e outros. Umxarope ou elixir pode conter o composto ativo, sacarose ou frutose comoagente adoçante, metila e propilparabem como conservante, um corante earomatizante, tal como, aromatizante de cereja ou laranja. Logicamente,qualquer material usado na preparação da forma de dosagem unitária deveser farmaceuticamente aceitável e substancialmente não-tóxico nas quanti-dades empregadas. Além disso, os compostos de diarilidantoína podem serincorporados em preparações e dispositivos de liberação constante. Por e-xemplo, os compostos de diarilidantoína podem ser incorporados em cápsu-las de liberação no curso do tempo, comprimidos de liberação no curso dotempo e pílulas de liberação no curso do tempo.

Os compostos de diarilidantoína podem também ser administra-dos pela via intravenosa ou pela via intraperitoneal, mediante infusão ou in-jeção. Soluções dos compostos de diarilidantoína podem ser preparadas emágua e, opcionalmente, misturadas com um tensoativo não-tóxico. As dis-persões podem também ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líqui-dos, triacetina e misturas dos mesmos em óleos. Sob condições comuns dearmazenamento e uso, essas preparações podem conter um conservantepara prevenir o crescimento de microorganismos.

As formas de dosagem farmacêuticas adequadas para injeçãoou infusão podem incluir soluções ou dispersões aquosas estéreis ou pósestéreis compreendendo os compostos de diarilidantoína, que podem seradaptados para preparação improvisada de soluções ou dispersões injetá-veis ou de infusão estéreis, opcionalmente, encapsuladas em lipossomos.Em todos os casos, tais formas de dosagem devem ser estéreis, fluidas eestáveis sob condições de fabricação e armazenamento. O veículo líquidoou veículo pode ser um solvente ou um meio de dispersão líquido contendo,por exemplo, águam eíanol, um poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol,polietilenoglicóis líquidos e outros), óleos vegetais, ésteres glicerílicos não-tóxicos e adequadas misturas dos mesmos. Uma adequada fluidez pode sermantida, por exemplo, mediante formação de lipossomos, manutenção dotamanho de partícula requerido no caso de dispersões ou mediante uso detensoativos. A prevenção da ação de microorganismos pode ser produzidaatravés de diversos agentes antibacterianos e antifungos, por exemplo, pa-rabém, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e outros. Em muitos ca-sos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, tam-pões ou cloreto de sódio. Uma prolongada absorção das composições inje-táveis pode ser produzida mediante uso de agentes retardadores de absor-ção nas composições, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

As soluções estéreis injetáveis são preparadas mediante incor-poração dos compostos de diarilidantoína na quantidade necessária no a-propriado solvente, com diversos dos outros ingredientes mencionados aci-ma, conforme necessário, seguido de filtração estéril. No caso de pós esté-reis para preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidosde preparação incluem as técnicas de secagem a vácuo e secagem porcongelamento, que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer in-grediente adicional desejado, presente nas soluções estéreis filtradas anteri-ormente.

Para administração tópica, os compostos de diarilidantoína po-dem ser aplicados na forma pura. Entretanto, será geralmente desejável aadministração dos mesmos na pele na forma de composições ou formula-ções, em combinação com um veículo dermatologicamente aceitável, o qualpode ser sólido ou líquido.

Os veículos sólidos úteis incluem os sólidos finamente divididos,tais como, talco, argila, celulose microcristalina, sílica, alumina e outros. Ou-tros veículos sólidos incluem nanopartículas ou micropartículas poliméricasnão-tóxicas. Os veículos líquidos úteis incluem água, alcoóis ou glicóis oumisturas de água/álcool/glicol, nas quais os compostos de diarilidantoínapodem ser dissolvidos ou dispersos em níveis eficazes, opcionalmente, coma ajuda de tensoativos não-tóxicos. Adjuvantes, tais como, agentes de fra-grância e adicionais agentes antimicrobianos podem ser adicionados paraotimizar as propriedades para um determinado uso. As composições líquidasresultantes podem ser aplicadas através de panos acolchoados absorventes,usados paras impregnação de bandagens e outros curativos, ou mediantepulverização sobre a área afetada usando pulverizadores tipo bomba ou ae-rossol.

Agentes de espessamento, tais como, polímeros sintéticos, áci-dos graxos, sais e ésteres de ácidos graxos, alcoóis graxos, celuloses modi-ficadas ou materiais minerais modificados podem também ser empregadoscom veículos líquidos para formar pastas que podem ser espalhadas, formargéis, pomadas, tipos de sabões e outros produtos, para aplicação direta napele do usuário.

Exemplos de composições dermatológicas úteis que podem serusadas para liberar os compostos de diarilidantoína na pele são conhecidasno estado da técnica; por exemplo, consultar a Patente US No. 4.608.392,concedida a Jacquet e outros; Patente US No. 4.459.157, concedida a Smithe outros; e Patente US No. 4.820.508, concedida a Wortzman, todas asquais sendo aqui incorporadas por essas referências.

Dosagens úteis dos compostos de fórmula (I) podem ser deter-minadas mediante comparação de sua atividade in vitro e atividade in vivonos modelos de animais. Os métodos para extrapolação de dosagens efica-zes em camundongos e outros animais para seres humanos são conhecidosno estado da técnica, por exemplo, consultar a Patente US No. 4.938.949, aqual é aqui incorporada por essa referência.

Por exemplo, a concentração dos compostos de diarilidantoínaem uma composição líquida, tal como, uma loção, pode ser de cerca de 0,1-25% em peso, ou de 0,5-10% em peso. A concentração em uma composi-ção semi-sólida ou sólida, tal como, um gel ou um pó, pode ser de cerca de0,1-5% em peso, ou cerca de 0,5-2,5% em peso.

A quantidade de compostos de diarilidantoína necessária parauso no tratamento irá variar, não apenas com o particular sal selecionado,como também com a via de administração escolhida, com a natureza docondicionamento doentio que está sendo tratado e idade e condicionamentofísico do paciente e, ainda, conforme o critério aplicado pelo médico ou clínico atendente.

Dosagens eficazes e rotas de administração de agentes da invenção são convencionais. A quantidade exata (dose eficaz) do agente irávariar de pessoa para pessoa, dependendo, por exemplo, do tipo, idade, pe-so e condicionamento geral ou clínico da pessoa, da gravidade ou mecanis-mo de qualquer distúrbio que está sendo tratado, do particular agente ouveículo usado, do método e esquema de administração, e outros fatores.

Uma dosagem terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamen-te, através de procedimentos convencionais conhecidos para os especialis-tas versados na técnica. Consultar, por exemplo, o artigo The Pharmacologi-cal Basis of Therapeutics, de autoria de Goodman e Gilman, Edit. MacmillanPublishing Co., N. York. Assim, uma dose eficaz pode ser estimada inicial-mente nos ensaios de cultura celular ou em adequados modelos de animais.

O modelo de animal pode também ser usado para determinar as apropriadasfaixas de concentração e rotas de administração. Essa informação podetambém ser usada para a determinação de doses convenientes e rotas deadministração em seres humanos. Uma dose terapêutica pode ser tambémselecionada por analogia para dosagens de agentes terapêuticos análogos.

O modo particular de administração e o regime de dosagem seráselecionado pelo médico atendente, levando em consideração os detalhesde cada caso (por exemplo, a pessoa, a doença, o estado da doença envol-vido e se o tratamento é profilático). O tratamento pode envolver doses diá-rias ou de várias vezes ao dia do(s) composto(s), durante um período depoucos dias a meses ou, até mesmo, durante anos.

No entanto, em geral, uma dose adequada se situa na faixa decerca de 0,001 a cerca de 100 mg/kg, por exemplo, de cerca de 0,01 a cerca100 mg/kg de peso do corpo, por dia, tal como, cerca de 0,1 mg/kg ou emuma faixa de cerca de 1 a cerca de 10 mg/kg de peso do corpo do receptor,por dia. Assim, por exemplo, uma dose adequada pode ser de cerca de 1mg/kg, 10 mg/kg ou 50 mg/kg de peso do corpo, po^dia.Os compostos de diarilidantoína são convenientemente adminis-trados na forma de dosagem unitária; por exemplo, contendo de 0,05 a10000 mg, 0,5 a 10000 mg, 5 a 1000 mg ou cerca de 100 mg de ingredienteativo por forma de dosagem unitária.

Os compostos de diarilidantoína podem ser administrados demodo a se obter concentrações de pico no plasma de, por exemplo, cerca de0,5 a cerca de 75 μΜ, 1 a 50 μΜ, cerca de 2 a cerca de 30 μΜ ou cerca de 5a cerca de 25 μΜ. Exemplos de concentrações de plasma desejáveis inclu-em, pelo menos, ou não mais que 0,25, 0,5, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100 ou 200μΜ. Por exemplo, os níveis de plasma podem ser de cerca de 1 a 100 mi-cromoles ou de cerca de 10 a cerca de 25 micromoles. Isso pode ser obtido,por exemplo, mediante injeção intravenosa de uma solução a 0,05 a 5% doscompostos de diarilidantoína, opcionalmente, em uma solução salina ou o-ralmente administrado como um volume de massa contendo cerca de 1-100mg dos compostos de diarilidantoína. Os níveis desejados no sangue podemser mantidos através de infusão contínua, de modo a prover cerca de0,00005-5 mg/kg de peso do corpo, por hora, por exemplo, pelo menos, ounão mais que 0,00005, 0,0005, 0,005, 0,5 ou 5 mg/kg/h. Alternativamente,esses níveis podem ser obtidos mediante infusões intermitentes contendocerca de 0,0002-20 mg/kg de peso do corpo, por exemplo, pelo menos, ounão mais que 0,0002, 0,002, 0,02, 0,2, 2, 20 ou 50 mg dos compostos dediarilidantoína por kg de peso do corpo.

Os compostos de diarilidantoína podem, convenientemente, seapresentar em uma única dose ou na forma de doses divididas, administra-das em apropriados intervalos, por exemplo, na forma de duas, três, quatroou mais sub-doses, por dia. A dita sub-dose pode ser ainda dividida, por e-xemplo, em um número de administrações distintas pouco espaçadas; como,por exemplo, múltiplas inalações a partir de um insuflador.

Um determinado número de compostos acima identificados exi-biu pouca atividade agonística ou nenhuma de tal atividade, com relação àscélulas de câncer de próstata refratário a hormônio. Pelo fato de que essescompostos são fortes inibidores do receptor de andrógeno (AR), eles podemser usados não apenas no tratamento do câncer de próstata, mas, também,no tratamento de outras doenças ou condicionamentos doentios correlacio-nados ao AR, tais como, hiperplasia benigna de próstata, perda de cabelo eacne. Pelo fato de que o receptor de andrógeno (AR) pertence à família dosreceptores nucleares, esses compostos podem servir de alicerces para asíntese de fármacos que almeja outros receptores nucleares, tais como, oreceptor de estrogênio e o receptor ativado pelo proliferador de peroxissomo.

Portanto, esses compostos podem ser ainda desenvolvidos para outras do-enças, tais como, câncer de mama, câncer de ovário, diabetes, doençascardíacas e doenças correlacionadas ao metabolismo, nas quais os recepto-res nucleares desempenham um importante papel.

Uma seqüência para a síntese química de diversos compostosde acordo com a invenção é mostrada abaixo. As cianoidrinas (10abc) sãoconvertidas em quatro diferentes cianoaminas (12abcd) mediante reaçãocom três diferentes anilinas (11abc) [(10a) e (11a) proporcionam (12a), (10b)e (11a) proporcionam (12b), (10c) e (11b) proporcionam (12c), e (10c) e(11c) proporcionam (12d)]. Em um processo separado, a anilina (13) é con-vertida em uma única etapa no isotiocianato (14). A adição de (12abcd) a(14), seguido do tratamento com ácido brando produz as desejadas tioidan-toínas (4) (NC54), 5 (NC55), 6 (NC56) e 7 com um satisfatório rendimento.

<formula>formula see original document page 74</formula>

10b R = R = (CH2)4 12b R = R = (CH2)4 X=FY = CONHMe

10c R = R = (CH2)3 12c R = R = (CH2)3 X=HY= (CH2)3CONMez

12d R = R = (CH2)3 X=HY= (CH2)3CONMe2CN<formula>formula see original document page 75</formula>

As modalidades ilustradas e discutidas no presente relatóriodescritivo são idealizadas apenas para ensinamento aos especialistas ver-sados na técnica a melhor maneira conhecida pelos inventores de utilizaçãoda presente invenção. Nada no presente relatório descritivo deve ser.consi-derado como limitativo do escopo da presente invenção. Todos os exemplosapresentados são representativos e não-limitativos. As modalidades da in-venção acima descritas podem ser modificadas ou variadas, sem que sejamafastadas do escopo da mesma, conforme observado pelos especialistasversados na técnica, diante dos ensinamentos acima. Portanto, deverá serentendido que dentro do escopo das reivindicações e de seus equivalentes,a invenção poderá ser praticada de outro modo, diferente do modo especifi-camente aqui descrito.

Claims (48)

1. Composto terido a fórmula:<formula>formula see original document page </formula>em que:- Ri e R2, independentemente, representam metila ou juntamente com o car-bono ao qual se encontram ligados, um grupo cicloalquila de 4 a 5 átomosde carbono;- R3 é selecionado do grupo que consiste em carbamoíla, alquilcarbamoíla,carbamoilalquila, alquilcarbamoilalquila e cianoalquila; e- R4 é hidrogênio ou flúor.

2. Composição farmacêutica, compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um composto como definido na reivindicação 1,ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um veículo ou diluentefarmaceuticamente aceitável.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, tendo a fórmula:<formula>formula see original document page 76</formula>

4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, tendo a fórmula:<formula>formula see original document page 76</formula>

5. Composição farmacêutica, compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um composto como definido na reivindicação 4,ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um veículo ou diluentefarmaceuticamente aceitável.

6. Composto, de acordo com a reivindicação 1, tendo a fórmula:<formula>formula see original document page 77</formula>[NC55]

7. Composição farmacêutica, compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um composto como definido na reivindicação 6,ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um veículo ou diluentefarmaceuticamente aceitável.

8. Composto, de acordo com a reivindicação 1, tendo a fórmula:<formula>formula see original document page 77</formula>[NC56]

9. Composto, de acordo com a reivindicação 1, tendo a fórmula:<formula>formula see original document page 77</formula>[NC57]

10. Método para tratamento de um distúrbio hiperproliferativo,compreendendo a administração de uma composição farmacêutica comodefinida na reivindicação 2, a um sujeito em necessidade de tal tratamento,dessa forma proporcionando o tratamento do distúrbio hiperproliferativo.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que a com-posição tem uma forma selecionada do grupo que consiste em uma solução,dispersão, suspensão, pó, cápsula, comprimido, pílula, cápsula com libera-ção de tempo, comprimido com liberação de tempo e pílula com liberação detempo.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que o com-posto é administrado por meio de injeção intravenosa, injeção dentro do te-cido e pelas vias intraperitoneal, oral ou nasal.

13. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que a com-posição é administrada em uma dosagem do composto na faixa de cerca de 0,001 mg por quilo de peso de corpo, por dia, a cerca de 100 mg por quilo depeso de corpo, por dia.

14. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que a com-posição é administrada em uma dosagem do composto na faixa de cerca de 0,01 mg por quilo de peso de corpo, por dia, a cerca de 100 mg por quilo depeso de corpo, por dia.

15. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que a com-posição é administrada em uma dosagem do composto na faixa de cerca de 0,1 mg por quilo de peso de corpo, por dia, a cerca de 10 mg por quilo depeso de corpo, por dia.

16. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que a com-posição é administrada em uma dosagem do composto de cerca de 1 mgpor quilo de peso de corpo, por dia.

17. Método para o tratamento de câncer de próstata, compreen-dendo a administração de uma composição de acordo com o parágrafo 2, aum sujeito em necessidade de tal tratamento, dessa forma, proporcionandoo tratamento do câncer de próstata.

18. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que a com-posição farmacêutica interfere com a transcrição do mRNA do antígeno es-pecífico da próstata.

19. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que a com-posição farmacêutica evita a translocação nuclear de uma proteína receptorade andrógeno.

20. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que a com-posição farmacêutica désestabiliza uma proteína receptora de andrógeno.

21. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que a com-posição farmacêutica é administrada oralmente.

22. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que a com-posição farmacêutica apresenta uma forma selecionada do grupo que con-siste em uma cápsula, comprimido e pílula.

23. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que a com-posição farmacêutica é selecionada do grupo de compostos que consistemnas fórmulas NC54, NC55, NC56 e NC57, um sal farmaceuticamente aceitá-vel de quaisquer destes e misturas dos mesmos.

24. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que o com-posto é NC53 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

25. Método de sintetização de um composto de diarila de fórmula:<formula>formula see original document page 79</formula>compreendendo misturar o composto de fórmula (I)<formula>formula see original document page 80</formula>em um primeiro solvente polar de modo a formar uma mistura; aquecer amistura; adicionar um segundo solvente polar, o mesmo ou diferente do pri-meiro solvente polar e um ácido aquoso à mistura; refluxar a mistura; resfriara mistura e misturar com água e, separar o eomposto de diarila da mistura;em que:- R51 compreende uma cadeia de alquila de 1 a 4 átomos de carbono;- R52 é selecionado do grupo que consiste em ciano, hidróxi, metilcarbamoí-la, alquila substituída por metílcarbamoíla, alquila substituída por metilssulfo-nocarbamoíla, metilaminometila, dimetilaminometila, metilssulfoniloximetila,metoxicarbonila, 3-ciano-4-trifluorometilfenilcarbamoíla, alquila substituídapor carbamoíla, carboximetila, metoxicarbonilmetila, metanossulfonila, alqui-la substituída por 4-ciano-3-trifluorometilfenilcarbamoíla, alquila substituídapor carbóxi, 4-metanossulfonil-1-piperazinila, piperazinila, alquila substituídapor hidroxietilcarbamoHa e alquila substituída por hidroxietoxicarbonila; e- R53 é selecionado do grupo que consiste em flúor e hidrogênio.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, em que R51 com-preende uma cadeia de alquila de 1 a 2 átomos de carbono, R52 é selecio-nado do grupo que consiste em carbamoíla e metilcarbamoíla e R53 é flúor.

27. Método de sintetização de um composto de fórmula:<formula>formula see original document page 80</formula>compreendendo:misturar 4-isotiocianato-2-trifluorometilbenzonitríla e N-metil-4-(1-cianociclobutilamino)-2-fluorobenzamida em dimetilformamida, para formaruma primeira mistura;- aquecer a primeira mistura para formar uma segunda mistura;- adicionar álcool e ácido à segunda mistura para formar uma terceira mistura;- refluxar a terceira mistura para formar uma quarta mistura;- resfriar a quarta mistura;- misturar a quarta mistura com água e extrair uma camada orgânica; e- isolar o composto da camada orgânica.

28. Método de sintetização do composto como definido na rei-vindicação 4 (NC54), compreendendo:- misturar N-metil-2-flúor-4-(1,1-dimetil-cianometil)-aminobenzamida e 4-isotiocianato-2-trifluorometilbenzonitrila em DMF e aquecer para formar umaprimeira mistura;- adicionar um álcool € um ácido à primeira mistura para formar uma segun-da mistura;- refluxar a segunda mistura;- resfriar a segunda mistura;- misturar a segunda mistura com água e extrair uma camada orgânica; e- isolar o composto da camada orgânica.

29. Método de sintetização do composto como definido na rei-vindicação 6 (NC55), compreendendo:- misturar N-metil-2-flúor-4-(cianociclopentil)-aminobenzamida, 4-isotiocianato-2-trifluorometilbenzonitrila e DMF, e aquecer sob refluxo paraformar uma primeira mistura;- adicionar um álcool e um ácido à primeira mistura para formar uma segun-da mistura;- refluxar a segunda mistura;- resfriar a segunda mistura;- misturar a segunda mistura com água e extrair uma camada orgânica; e- isolar o composto da camada orgânica.

30. Método de sintetização do composto como defindo na reivin-dicação 8 (NC56), compreendendo:- misturar N-N-dimetil-4-[4-(1-cianociclobutilamino)fenil]butanamida, 4-isotiocianato-2-trifluorometilbenzonitrila e DMF, e aquecer sob refluxo para formar uma primeira mistura;- adicionar um álcool e um ácido à primeira mistura para formar uma segun-da mistura;- refluxar a segunda mistura;- resfriar a segunda mistura; - misturar a segunda mistura com água e extrair uma camada orgânica; e- isolar o composto da camada orgânica.

31. Método de sintetização do composto como defindo na reivin-dicação 9 (NC57), compreendendo:- misturar DMSO, diclorometano e cloreto de oxalila para formar uma primei- ra mistura;- adicionar 4-(4-(7-(4-ciano-3-(trifluorometil)fenil)-8-oxo-6-tioxo-5,7-diazaspiro[3,4joctan-5-il)fenil)butanamida à primeira mistura para formaruma segunda mistura;- adicionar trietilamina à segunda mistura para formar uma terceira mistura;- aquecer a terceira mistura e resfriar rapidamente com NH4CI aquoso paraformar uma quarta mistura;- extrair uma camada orgânica da quarta mistura;- isolar o composto da camada orgânica.

32. Método, compreendendo: - prover pelo menos um composto de diariltioidantoína;- medir a inibição da atividade do receptor andrógeno para o composto edeterminar se a inibição está acima de um primeiro predeterminado nível;- medir a estimulação de atividade do receptor de andrógeno em células decâncer refratárias a hormônio para o composto e determinar se a situação está abaixo de um segundo predeterminado nível;- selecionar o composto se a inibição estiver acima do primeiro predetermi-nado nível e a estimulação estiver abaixo do segundo predeterminado nível.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que os prede-terminados níveis são aqueles de bicalutamida.

34. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que a etapade medição da inibição compreende a medição da concentração inibidora(IC50) em um sistema repórter de resposta AR ou um sistema de secreçãode antígeno específico de próstata.

35. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que a etapade medição de estimulação compreende medir a indução dobrada medianteaumento das concentrações em um sistema repórter de resposta AR ou umsistema de secreção de antígeno específico de próstata.

36. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que as eta-pas de medição de inibição e/ou estimulação compreendem a medição deum efeito de um composto sobre o crescimento do tumor em um animal.

37. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que a etapade medição de inibição e/ou estimulação da atividade do receptor de andró-geno compreende medir a afinidade de ligação do receptor de andrógeno aocomposto.

38. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que a etapade medição de inibição e/ou estimulação da atividade do receptor de andró-geno compreende medir a prevenção do recrutamento do receptor de an-drógeno para, pelo menos, um intensificador de antígeno específico de prós-tata e promotor de antígeno específico de próstata.

39. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que a etapade medição de inibição e/ou estimulação da atividade do receptor de andró-geno compreende medir a prevenção da translocação nuclear do receptor deandrógeno.

40. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que a etapade medição de inibição e/ou estimulação da atividade do receptor de andró-geno compreende medir a desestabilização de uma proteína do receptor deandrógeno.

41. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que o com-posto de diariltioidantoína apresenta a fórmula:<formula>formula see original document page 84</formula>em que:- Ri e R2, independentemente, representam metila ou juntamente com ocarbono ao qual se encontram ligados, um grupo cicloalquila de 4 a 5 áto-mos de carbono;- R3 é selecionado do grupo que consiste em carbamoíla, alquilcarbamoíla,carbamoilalquila, alquilcarbamoilalquila e cianoalquila; e- R4 é hidrogênio ou flúor.

42. Método compreendendo contatar uma célula de mamíferocapaz de expressar o antígeno específico da próstata com uma suficientequantidade de um composto de diariltioidantoína, de modo a interferir com atranscrição do mRNA do antígeno específico da próstata.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, em que o com-posto de diariltioidantoína apresenta a fórmula:<formula>formula see original document page 84</formula>em que:- R1 e R2, independentemente, representam metila ou juntamente com ocarbono ao qual se encontram ligados, um grupo cicloalquila de 4 a 5 áto-mos de carbono;- R3 é selecionado do grupo que consiste em carbamoíla, alquilcarbamoíla,carbamoilalquila, alquilcarbamoilalquila e cianoalquila; e- R4 é hidrogênio ou flúor.

44. Método, de acordo com a reivindicação 42, em que o com-posto de diariltioidantoína é selecionado do grupo que consiste nos NC53,NC54, NC55, NC56 e NC57.

45. Método, de acordo com a reivindicação 42, em que o com-posto previne a formação de um complexo de transcrição sobre um gene deantígeno específico da próstata.

46. Método, de acordo com a reivindicação 42, em que o com-posto previne uma proteína receptora de andrógeno de complexar com umgene de antígeno específico da próstata.

47. Método, de acordo-com a reivindicação 42, em que o com-posto previne uma polimerase Il de RNA de complexar com um gene de an-tígeno específico da próstata.

48. Método, compreendendo contatar uma célula de mamíferocom uma suficiente quantidade de um composto de diariltioidantoína, demodo a prevenir a translocação nuclear de uma proteína receptora de an-drógeno e/ou desestabilizar uma proteína receptora de andrógeno.