JP5350217B2 - ジアリールチオヒダントイン化合物 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、ジアリールチオヒダントインを含むジアリールヒダントイン化合物およびそれらの合成方法ならびにホルモン抵抗性前立腺癌の治療の際のそれらの使用に関する。本出願は、同じ譲受人によってＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１１４１７を参照により組み込む。

（発明の背景）
前立腺癌は、最も一般的に発生する癌であり、西洋人における第２の主な癌死因である。この癌が局所に限定される場合、この疾患は、外科手術または放射線によって治療することができる。しかし、このような癌の３０％は遠隔転移が認められる疾患を伴って再発し、その他は診断時に進行した疾患を有していた。進行した疾患は、去勢および／または抗アンドロゲン物質の投与、いわゆるアンドロゲン枯渇療法によって治療される。去勢は、アンドロゲンの血中レベルを下げ、アンドロゲン受容体（ＡＲ）の活性を低減する。抗アンドロゲン物質の投与は、アンドロゲン結合と競合してこれを阻むことによりＡＲ機能を阻害するため、ＡＲ活性を低減する。これらの治療は、最初は有効であるが、すぐに効き目はなくなり、この癌はホルモン抵抗性となる。

最近、ＡＲの過剰発現は、ホルモン抵抗性前立腺癌の原因として確認され立証されてきた。参照により本明細書に組み込んだＣｈｅｎ，Ｃ．Ｄ．、Ｗｅｌｓｂｉｅ，Ｄ．Ｓ．、Ｔｒａｎ，Ｃ．、Ｂａｅｋ，Ｓ．Ｈ．、Ｃｈｅｎ，Ｒ．、Ｖｅｓｓｅｌｌａ，Ｒ．、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ｇ．、およびＳａｗｙｅｒｓ，Ｃ．Ｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ａｎｔｉａｎｄｒｏｇｅｎ ｔｈｅｒａｐｙ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１０巻：３３〜３９頁、２００４年を参照されたい。ＡＲの過剰発現は、ホルモン感受性からホルモン抵抗性の前立腺癌に進行させるのに十分であることから、現在の薬物より優れたＡＲ阻害剤は前立腺癌の進行を遅らせ得ることが示唆される。ＡＲおよびそのリガンドの結合は、ホルモン抵抗性前立腺癌の成長に必要であることが実証されたことから、ＡＲは、依然としてこの疾患の標的であることが示唆される。ＡＲの過剰発現により、抗アンドロゲン物質がホルモン抵抗性前立腺癌中でアンタゴニストからアゴニストに転換される（ＡＲアンタゴニストはＡＲ活性を阻害しＡＲアゴニストはＡＲ活性を刺激する）ことも実証された。この研究からのデータにより、去勢および抗アンドロゲン物質が前立腺癌の進行を防げない理由が説明され、ホルモン抵抗性前立腺癌の認識されていない特性が明らかにされている。

ビカルタミド（商標名：Ｃａｓｏｄｅｘ）は、最も汎用されている抗アンドロゲン物質である。これは、ホルモン感受性前立腺癌中のＡＲに対する阻害効果を有するが、癌がホルモン抵抗性になるとＡＲを抑制できない。現在の抗アンドロゲン物質の２つの欠点が原因で、前立腺癌がホルモン感受性工程からホルモン抵抗性疾患に進行するのを防ぎ、ホルモン抵抗性前立腺癌を効果的に治療することができない。一方はそれらの弱いアンタゴニスト活性であり、他方は、ＡＲがホルモン抵抗性前立腺癌中で過剰発現する場合のそれらの強いアゴニスト活性である。したがって、疾患進行を遅らせ致命的なホルモン抵抗性前立腺癌を治療するために、より強力なアンタゴニスト活性および最小限のアゴニスト活性を有するより良好なＡＲ阻害剤が必要とされる。

ビカルタミドなどの非ステロイド系抗アンドロゲン物質は、前立腺癌に対してステロイド化合物より好ましかったが、その理由は、それらが、より選択性であり、より少ない副作用を有するからである。この種の化合物は、それら全てを参照により本明細書に組み込んだ特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４および特許文献５、ならびに特許文献６などの多くの特許に記載されてきた。

特許文献７には、非常に多数の化合物を包含する広範な特許請求の範囲が含まれるが、合成経路はこれらの化合物のわずかに対してしか提示されておらず、また薬理学的データはそれらの化合物の２つについてしか提示されておらず、当業者は、他の具体的な化合物を容易に思いつくことができなかった。

ホルモン抵抗性前立腺癌のメカニズムは知られていなかったので、これらの特許に記載されているこれらの化合物を、ホルモン抵抗性前立腺癌に対するこれらの化合物の効果について試験する生体系がなかった。特に、阻害剤をアンタゴニストからアゴニストに切り替える、ホルモン抵抗性前立腺癌中のＡＲ過剰発現の能力は、認識されなかった。ホルモン抵抗性前立腺癌のいくつかの新たな特性は、それらを参照により本明細書に組み込んだＰＣＴ出願ＵＳ０４／４２２２１およびＵＳ０５／０５５２９に報告されている。ＰＣＴ国際出願ＵＳ０５／０５５２９では、化合物のアンドロゲン受容体アンタゴニスト特性およびアゴニスト特性を特定する方法論が提示された。しかし、作製される各化合物について、化合物のアンタゴニスト特性およびアゴニスト特性を決定する、時間のかかる方法を決めなければならない。即ち、化合物の化学構造のみから前立腺癌の治療に関連する特性を正確に予測する方法は全くない。

いくつかの化合物は、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）アンドロゲン受容体（ＡＲ）の阻害剤であると報告されてきた。いくつかは、例えばビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ）である、前立腺癌を治療する薬物として使用されてきた。例えば、チオヒダントイン、ＲＵ５９０６３およびＢＴＩＤであるＡＲ ＬＢＤのいくつかの結合剤が確認されてきた（Ｔｅｕｔｓｃｈ，Ｇ．、Ｇｏｔｔｂｅｔ，Ｆ．、Ｂａｔｔｍａｎｎ，Ｔ．、Ｂｏｎｆｉｌｓ，Ａ．、Ｂｏｕｃｈｏｕｘ，Ｆ．、Ｃｅｒｅｄｅ，Ｅ．、Ｇｏｆｆｌｏ，Ｄ．、Ｇａｉｌｌａｒｄ−Ｋｅｌｌｙ，Ｍ．、Ｐｈｉｌｉｂｅｒｔ．Ｄ．、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｏｉｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、１９９４年、４８巻、１１１〜１１９頁、Ｖａｎ Ｄｏｒｔ，Ｍ．Ｅ．、Ｒｏｂｉｎｓ，Ｄ．Ｍ．、Ｗａｙｂｕｒｎ，Ｂ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、４３巻、３３４４〜３３４７頁）。
米国特許第４，０９７，５７８号明細書 米国特許第５，４１１，９８１号明細書 米国特許第５，７０５，６５４号明細書 国際公開第９７／０００７１号パンフレット 国際公開第００／１７１６３号パンフレット 米国特許出願公開第２００４／０００９９６９号明細書 米国特許第５，４３４，１７６号明細書

望ましい薬理学的特性を有する新規のチオヒダントイン化合物、およびそれらを調製するための合成経路が必要である。活性は小さな構造変化に対して感受性であるため、一方の化合物は、前立腺癌を治療する上で有効となり得るが、第２の化合物は、第１の化合物と少ししか異なっていなくても、例えばたった１個の置換基の置換分しか異なっていなくても、無効である恐れがある。

アンドロゲン活性をアンタゴナイズする高い効力を有しかつ最小限のアゴニスト活性を有する化合物の特定により、ホルモン抵抗性前立腺癌（ＨＲＰＣ）は克服され、ホルモン感受性前立腺癌（ＨＳＰＣ）の進行は避けられまたは遅らされるはずである。したがって、当技術分野では、非ステロイド系、非毒性、および組織選択性である修飾物質などの、アンドロゲン受容体の選択性修飾物質の特定の必要がある。

本発明は、ＡＲに対して最小限のアゴニスト活性と共に強力なアンタゴニスト活性を有する一連の化合物を提供する。これらの化合物は、ホルモン抵抗性前立腺癌の成長を阻害する。

本発明の特定の化合物は、

を含む。

本発明は、前記化合物のいずれかによる化合物または医薬として許容可能なその塩を治療有効量含み、医薬として許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物も提供する。

本発明は、そのような治療の必要がある対象にそのような医薬組成物を投与することにより過剰増殖性障害を治療することを含む、過剰増殖性障害を治療するための方法を包含する。この過剰増殖性障害は、ホルモン抵抗性前立腺癌であってもよい。この投与量は、一日あたり約０．００１ｍｇ／体重ｋｇ〜一日あたり約１００ｍｇ／体重ｋｇ、一日あたり約０．０１ｍｇ／体重ｋｇ〜一日あたり約１００ｍｇ／体重ｋｇ、一日あたり約０．１ｍｇ／体重ｋｇ〜一日あたり約１０ｍｇ／体重ｋｇの範囲内にあってもよいし、一日あたり約１ｍｇ／体重ｋｇであってもよい。

この化合物は、静脈内注射により投与してもよく、組織中への注射により投与してもよく、腹腔内投与、経口投与、または経鼻投与してもよい。この組成物は、溶液、分散液、懸濁液、粉末、カプセル、錠剤、丸剤、徐放性カプセル、徐放性錠剤、および徐放性丸剤からなる群より選択される形態を有してもよい。

投与される化合物は、ＮＣ５４、ＮＣ５５、ＮＣ５６、もしくはＮＣ５７、または医薬として許容可能なそれらの塩からなる群より選択されてもよい。投与される化合物は、ＮＣ５３または医薬として許容可能なそれらの塩であってもよい。

本発明は、Ｎ−メチル−２−フルオロ−４−（１，１−ジメチル−シアノメチル）−アミノベンズアミドおよび４−イソチオシアナト−２−トリフルオロメチルベンゾニトリルをＤＭＦ中で混合し、加熱することにより第１の混合物を形成し、上記のように加工することを含むＮＣ５４の合成方法を提供する。

本発明は、Ｎ−メチル−２−フルオロ−４−（１−シアノシクロペンチル）アミノベンズアミド、４−イソチオシアナト−２−トリフルオロメチルベンゾニトリル、およびＤＭＦを混合し、還流下で加熱することにより第１の混合物を形成し、上記のように加工することを含む、ＮＣ５５の合成方法も提供する。

本発明は、更に、Ｎ，Ｎ−ジメチル４−［４−（１−シアノシクロブチルアミノ）フェニル］ブタンアミド、４−イソチオシアナト−２−トリフルオロメチルベンゾニトリル、およびＤＭＦを混合し、還流下で加熱することにより第１の混合物を形成し、上記のように加工することを含む、ＮＣ５６の合成方法も提供する。

本発明は、ＤＭＳＯ、ジクロロメタン、および塩化オキサリルを混合して、第１の混合物を形成し、４−（４−（７−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−８−オキソ−６−チオキソ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−５−イル）フェニル）ブタンアミドを第１の混合物に添加して、第２の混合物を形成し、トリエチルアミンを第２の混合物に添加することにより第３の混合物を形成し、第３の混合物を加湿し、ＮＨ_４Ｃｌ水溶液でクエンチすることにより第４の混合物を形成し、第４の混合物から有機層を抽出し、その有機層からその化合物を単離することを含む、ＮＣ５７の合成方法を提供する。

ある実施形態では、化合物は、式

を有する。

Ｒ１およびＲ２は独立に、メチル、またはそれらが結合している炭素と一緒になった４〜５個の炭素原子を有するシクロアルキル基であり、Ｒ３は、カルバモイル、アルキルカルバモイル、カルバモイルアルキル、アルキルカルバモイルアルキル、シアノ、およびシアノアルキルからなる群より選択され、Ｒ４は水素またはフッ素である。

ある実施形態では、医薬組成物は、治療有効量の請求項１に記載の化合物または医薬として許容可能なその塩と、医薬として許容可能な担体または希釈剤とを含む。

この化合物は、例えば、式

を有してもよい。

医薬組成物は、治療有効量の化合物ＮＣ５４または医薬として許容可能なその塩と、医薬として許容可能な担体または希釈剤を含んでもよい。医薬組成物は、治療有効量の請求項に記載の化合物ＮＣ５５または医薬として許容可能なその塩と、医薬として許容可能な担体または希釈剤を含んでもよい。

ある実施形態では、過剰増殖性障害を治療するための方法は、請求項２に記載の医薬組成物をそのような治療の必要がある対象に投与することにより過剰増殖性障害を治療することを含む。

この組成物は、例えば、溶液、分散液、懸濁液、粉末、カプセル、錠剤、丸剤、徐放性カプセル、徐放性錠剤、および徐放性丸剤からなる群より選択される形態を有してもよい。この化合物は、静脈内注射により投与してもよく、組織中への注射により投与してもよく、腹腔内投与、経口投与、または経鼻投与してもよい。この組成物は、一日あたり約０．００１ｍｇ／体重ｋｇ〜一日あたり約１００ｍｇ／体重ｋｇの範囲内にある化合物の投与量で投与してもよい。この組成物は、一日あたり約０．０１ｍｇ／体重ｋｇ〜一日あたり約１００ｍｇ／体重ｋｇの範囲内にある化合物の投与量で投与してもよい。この組成物は、一日あたり約０．１ｍｇ／体重ｋｇ〜一日あたり約１０ｍｇ／体重ｋｇの範囲内にある化合物の投与量で投与してもよい。この組成物は、一日あたり約１ｍｇ／体重ｋｇの化合物の投与量で投与してもよい。

医薬組成物をそのような治療の必要がある対象に投与することにより前立腺癌を治療することを含む、前立腺癌を治療するための方法がある。この医薬組成物は、前立腺特異抗原ｍＲＮＡの転写を妨げることができる。この医薬組成物は、アンドロゲン受容体タンパク質の核移行を防ぐことができる。この医薬組成物は、アンドロゲン受容体タンパク質を不安定化することができる。この組成物は、経口投与してもよい。この組成物は、カプセル、錠剤、および丸剤からなる群より選択される形態を有してもよい。

ある実施形態では、この化合物は、ＮＣ５４、ＮＣ５５、ＮＣ５６、ＮＣ５７、それらのいずれかの医薬として許容可能な塩、またはそれらの組合せであり得る。

式

のジアリール化合物の合成方法は、化合物Ｉ

と化合物ＩＩ

とを第１の極性溶媒中で混合して、混合物を形成する工程と、混合物を加熱する工程と、第１の極性溶媒と同じかまたはそれとは異なる第２の極性溶媒および水性酸を混合物に添加する工程と、混合物を還流する工程と、混合物を冷却し水と合わせる工程と、混合物からジアリール化合物を分離する工程とを含む。Ｒ５１は、１〜４個の炭素原子を有するアルキル鎖を含み得る。Ｒ５２は、シアノ、ヒドロキシ、メチルカルバモイル、メチルカルバモイル置換アルキル、メチルスルホンカルバモイル置換アルキル、メチルアミノメチル、ジメチルアミノメチル、メチルスルホニルオキシメチル、メトキシカルボニル、３−シアノ−４−トリフルオロメチルフェニルカルバモイル、カルバモイル置換アルキル、カルボキシメチル、メトキシカルボニルメチル、メタンスルホニル、４−シアノ−３−トリフルオロメチルフェニルカルバモイル置換アルキル、カルボキシ置換アルキル、４−メタンスルホニル−１−ピペラジニル、ピペラジニル、ヒドロキシエチルカルバモイル置換アルキル、またはヒドロキシエトキシカルボニル置換アルキルであり得る。Ｒ５３は、ＦおよびＨからなる群より選択することができる。

ある実施形態では、Ｒ５１は、１〜２個の炭素原子を有するアルキル鎖を含み、Ｒ５２は、カルバモイルおよびメチルカルバモイルからなる群より選択され、Ｒ５３はＦである。

式

の化合物の合成方法は、４−イソチオシアナト−２−トリフルオロメチルベンゾニトリルおよびＮ−メチル−４−（１−シアノシクロブチルアミノ）−２−フルオロベンズアミドをジメチルホルムアミド中で混合して、第１の混合物を形成する工程と、第１の混合物を加熱して、第２の混合物を形成する工程と、アルコールおよび酸を第２の混合物に添加することにより第３の混合物を形成する工程と、第３の混合物を還流することにより第４の混合物を形成する工程と、第４の混合物を冷却する工程と、第４の混合物を水と合わせ、有機層を抽出する工程と、化合物をその有機層から単離する工程とを含み得る。

請求項４に記載の化合物［ＮＣ５４］の合成方法は、Ｎ−メチル−２−フルオロ−４−（１，１−ジメチル−シアノメチル）−アミノベンズアミドおよび４−イソチオシアナト−２−トリフルオロメチルベンゾニトリルをＤＭＦ中で混合し加熱することにより第１の混合物を形成する工程と、アルコールおよび酸を第１の混合物に添加して、第２の混合物を形成する工程と、第２の混合物を還流する工程と、第２の混合物を冷却する工程と、第２の混合物を水と合わせ、有機層を抽出する工程と、化合物を有機層から単離する工程とを含み得る。

請求項６に記載の化合物［ＮＣ５５］の合成方法は、Ｎ−メチル−２−フルオロ−４−（１−シアノシクロペンチル）アミノベンズアミド、４−イソチオシアナト−２−トリフルオロメチルベンゾニトリル、およびＤＭＦを混合し還流下で加熱することにより第１の混合物を形成する工程と、アルコールおよび酸を第１の混合物に添加して、第２の混合物を形成する工程と、第２の混合物を還流する工程と、第２の混合物を冷却する工程と、第２の混合物を水と合わせ、有機層を抽出する工程と、化合物を有機層から単離する工程とを含み得る。

請求項８に記載の化合物［ＮＣ５６］の合成方法は、Ｎ，Ｎ−ジメチル４−［４−（１−シアノシクロブチルアミノ）フェニル］ブタンアミド、４−イソチオシアナト−２−トリフルオロメチルベンゾニトリル、およびＤＭＦを混合し還流下で加熱することにより第１の混合物を形成する工程と、アルコールおよび酸を第１の混合物に添加して、第２の混合物を形成する工程と、第２の混合物を還流する工程と、第２の混合物を冷却する工程と、第２の混合物を水と合わせ、有機層を抽出する工程と、化合物を有機層から単離する工程とを含み得る。

請求項９に記載の化合物［ＮＣ５７］の合成方法は、ＤＭＳＯ、ジクロロメタン、および塩化オキサリルを混合して、第１の混合物を形成する工程と、４−（４−（７−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−８−オキソ−６−チオキソ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−５−イル）フェニル）ブタンアミドを第１の混合物に添加して、第２の混合物を形成する工程と、トリエチルアミンを第２の混合物に添加することにより第３の混合物を形成する工程と、第３の混合物を加湿しＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチすることにより第４の混合物を形成する工程と、第４の混合物から有機層を抽出する工程と、前記化合物を有機層から単離する工程とを含み得る。

ある方法は、ジアリールチオヒダントイン化合物を少なくとも１つ提供する工程と、その化合物についてのアンドロゲン受容体活性の阻害を測定し、その阻害が第１の所定のレベルを超えるか否かを決定する工程と、その化合物についてのホルモン無反応性癌細胞中のアンドロゲン受容体活性の刺激を測定し、その刺激が第２の所定のレベル未満であるか否かを決定する工程と、その阻害が第１の所定のレベルを超え、その刺激が第２の所定のレベル未満であるならばその化合物を選択する工程とを含み得る。所定のレベルは、ビカルタミドのレベルであってもよい。阻害の測定は、ＡＲ応答レポーター系または前立腺特異抗原分泌系での阻害濃度（ＩＣ５０）を測定することを含み得る。刺激の測定は、ＡＲ応答レポーター系または前立腺特異抗原分泌系中の濃度を上げることによる誘導倍数（ｆｏｌｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を測定することを含み得る。阻害および／または刺激の測定は、動物中の腫瘍成長に対する化合物の効果を測定することを含み得る。アンドロゲン受容体活性の阻害および／または刺激を測定する工程は、化合物に対するアンドロゲン受容体の結合親和性を測定することを含んでもよい。アンドロゲン受容体活性の阻害および／または刺激を測定する工程は、前立腺特異抗原エンハンサーおよび前立腺特異抗原プロモーターの少なくとも１つへのアンドロゲン受容体補充の防止を測定することを含んでもよい。アンドロゲン受容体活性の阻害および／または刺激を測定する工程は、アンドロゲン受容体核移行防止を測定することを含んでもよい。アンドロゲン受容体活性の阻害および／または刺激を測定する工程は、アンドロゲン受容体タンパク質の不安定化を測定することを含んでもよい。

ある方法は、前立腺特異抗原を発現し得る哺乳類細胞と十分な量のジアリールチオヒダントイン化合物とを接触させることにより、前立腺特異抗原ｍＲＮＡの転写を妨げることを含み得る。このジアリールチオヒダントイン化合物は、ＮＣ５３、ＮＣ５４、ＮＣ５５、ＮＣ５６、およびＮＣ５７からなる群より選択できる。この化合物は、前立腺特異抗原遺伝子上での転写複合体の形成を防止し得る。この化合物は、アンドロゲン受容体タンパク質が前立腺特異抗原遺伝子と複合体形成するのを防止し得る。この化合物は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが前立腺特異抗原遺伝子と複合体形成するのを防止し得る。

ある方法は、哺乳類細胞と十分な量のジアリールチオヒダントイン化合物とを接触させることにより、アンドロゲン受容体タンパク質の核移行を防止しかつ／またはアンドロゲン受容体タンパク質を不安定化することを含む。

図面は、特定の化合物の薬理試験の結果を示す。

本発明の実施形態を、以下で詳細に論じる。実施形態を記載する上で、具体的な専門用語は明確さのために採用される。しかし、本発明が、そのように選択される具体的な専門用語に限定されることは意図しない。本発明の趣旨および範囲から逸脱しなければ他の等価部分が採用され他の方法が展開されてもよいことは、当業者であれば認識されよう。本明細書で引用した参考文献は全て、それぞれが個別に組み込まれたかのように参照により組み込んである。

ジアリールヒダントイン化合物の合成
（実施例５６）［ＮＣ５４］
以下では、オーブン乾燥ガラス器および標準シリンジ／隔壁技法を使用して、空気または水分に敏感な反応をアルゴン雰囲気下で行った。この反応は、ＵＶ光（２５４ｎｍ）の下でＳｉＯ_２ＴＬＣプレートを使用して監視し、次いでｐ−アニスアルデヒドまたはニンヒドリン染色溶液を使用して可視化した。カラムクロマトグラフィーをシリカゲル６０上で行った。特に述べない限り、^１Ｈ ＮＭＲスペクトルをＣＤＣｌ_３中で４００ＭＨｚで測定し、内部標準（ＴＭＳ、０．０ｐｐｍ）：化学シフト（多重度、積算、Ｈｚ単位のカップリング定数）からデータを以下の通りｐｐｍ（δ）単位で報告した。

過ヨウ素酸（１．６９ｇ、７．４１ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（２５ｍＬ）中に激しく撹拌することによって溶解し、次いで三酸化クロム（０．１６ｇ、１．６０ｍｍｏｌ）をその溶液中に溶解した。２−フルオロ−４−ニトロトルエン（０．３３ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を上記溶液に撹拌しながら添加した。発熱反応ですぐに白色沈殿物が形成した。１時間撹拌後、反応混合物の上清液をフラスコにデカントし、蒸発させることにより溶媒を除去した。残留物を、塩化メチレン（２×３０ｍＬ）および水（２×３０ｍＬ）で抽出した。有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濃縮することにより、白色固体として２−フルオロ−４−ニトロ安息香酸（式３７）（０．３２ｍｇ、８１％）を得た。

塩化チオニル（０．１５ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）を、−５℃に冷却された、２−フルオロ−４−ニトロ安息香酸（式３７）（０．２０ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液にゆっくり添加した。混合物を、−５℃で更に１時間撹拌した。過剰のメチルアミン（その４０％水溶液から蒸留されたばかりの）を、反応媒体に添加した。第２の混合物を更に１時間撹拌した。酢酸エチル（５０ｍＬ）を混合物に添加し、これをブライン（２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濃縮することにより、帯黄色固体としてＮ−メチル−２−フルオロ−４−ニトロベンズアミド（式３８）（０．１８ｇ、８５％）が生じた。

酢酸エチル（５ｍＬ）および酢酸（５ｍＬ）中に含まれるＮ−メチル−２−フルオロ−４−ニトロベンズアミド（式３８）（０．１８ｇ、０．９１ｍｍｏｌ）および鉄（０．３１ｇ、５．６０ｍｍｏｌ）の混合物を、１時間還流した。固体粒子を、濾過した。濾過物を、水で洗浄し酢酸エチルで抽出した。有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濃縮し、残留物をＳｉＯ_２カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：アセトン、９５：５）で精製することにより、オフホワイト色固体としてＮ−メチル−２−フルオロ−４−アミノベンズアミド（式３９）（０．１４ｇ、９２％）を得た。

Ｎ−メチル−２−フルオロ−４−アミノベンズアミド（式３９）（９６ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）、アセトンシアノヒドリン（０．３ｍＬ、３．１４ｍｍｏｌ）および硫酸マグネシウム（５０ｍｇ）の混合物を、８０℃に加熱し、１２時間撹拌した。媒体に酢酸エチル（２５ｍＬ）を添加し、次いで水（２×２５ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濃縮し、残留物をＳｉＯ_２カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：アセトン、９５：５）で精製することにより、白色固体としてＮ−メチル−２−フルオロ−４−（１，１−ジメチル−シアノメチル）−アミノベンズアミド（式４０）（１０１ｍｇ、７５％）を得た。

４−アミノ−２−トリフルオロメチルベンゾニトリル（２．２３ｇ、１２ｍｍｏｌ）を、室温で水（２２ｍＬ）中に含まれる、十分撹拌したチオホスゲン（１ｍＬ、１３ｍｍｏｌ）の不均一混合物中に、１５分間にわたって分けて添加した。撹拌を、更に１時間続けた。反応媒体を、クロロホルム（３×１５ｍｌ）で抽出した。この混合有機相を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、減圧下で蒸発させて乾燥することにより、所望の生成物４−イソチオシアナト−２−トリフルオロメチルベンゾニトリル（式４１）が帯褐色固体として生じ、これをそのまま次の工程のために使用した（２．７２ｇ、１１．９ｍｍｏｌ、９９％）。

５６−１） ＮＣ５４
ＤＭＦ（１ｍＬ）中に含まれるＮ−メチル−２−フルオロ−４−（１，１−ジメチル−シアノメチル）−アミノベンズアミド（式４０）（３０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）および４−イソチオシアナト−２−トリフルオロメチルベンゾニトリル（式４１）（５８ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の混合物を、マイクロ波照射下１００℃で１１時間加熱した。混合物に、メタノール（２０ｍＬ）および１Ｎ ＨＣｌ水溶液（５ｍＬ）を添加した。第２の混合物を、１．５時間還流した。室温まで冷却した後、反応混合物を、冷水（５０ｍＬ）中に注ぎ、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濃縮し、残留物をＳｉＯ_２カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：アセトン、９５：５）で精製することにより、無色結晶としてＮＣ５４（式４２）（１５ｍｇ、２５％）を得た。

（実施例５７）

Ｎ−メチル−２−フルオロ−４−アミノベンズアミド（式３９）（６２ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）、シクロペンタノン（０．０７ｍＬ、０．７４ｍｍｏｌ）およびＴＭＳＣＮ（０．１ｍＬ、０．７４ｍｍｏｌ）の混合物を、８０℃に加熱し、１３時間撹拌した。媒体に、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）を添加し、次いで水で（２×２０ｍＬ）洗浄した。有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：アセトン、９５：５）で精製することにより、白色固体としてＮ−メチル２−フルオロ−４−（１−シアノシクロペンチル）アミノベンズアミド（式４３）（６１ｍｇ、６３％）を得た。

５７−１） ＮＣ５５
ＤＭＦ（３ｍＬ）中に含まれるＮ−メチル２−フルオロ−４−（１−シアノシクロペンチル）アミノベンズアミド（式４３）（５７ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）および４−イソチオシアナト−２−トリフルオロメチルベンゾニトリル（０．１５ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の混合物を、マイクロ波照射下（開放容器）、１３０℃で１２時間加熱した。混合物にメタノール（２０ｍＬ）および１Ｎ ＨＣｌ水溶液（５ｍＬ）を添加した。第２の混合物を、１．５時間還流した。室温まで冷却した後、反応混合物を、冷水（５０ｍＬ）中に注ぎ、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：アセトン、９５：５）で精製することにより、淡帯黄色固体として４−（３−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−４−オキソ−２−チオキソ−１，３−ジアザスピロ［４．４］ノナン−１−イル）−２−フルオロ−Ｎ−メチルベンズアミド、ＮＣ５５（式４４）（８ｍｇ、７％）を得た。

（実施例５８）

無水トリフルオロ酢酸（０．８５ｍＬ、６．１４ｍｍｏｌ）を、４−（４−アミノフェニル）酪酸（０．５ｇ、２．７９ｍｍｏｌ）の０℃クロロホルム（１０ｍＬ）溶液に添加した。混合物を、室温まで加湿し、３時間撹拌した。混合物を、クロロホルム（２０ｍＬ）および水（２０ｍＬ）で分配した。有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：アセトン、９：１）で精製することにより、４−［４−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）フェニル］ブタン酸（式４５）（０．５３ｇ、６９％）を得た。

塩化チオニル（７１ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を、−５℃に冷却した４−［４−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）フェニル］ブタン酸（式４５）（０．１５ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液にゆっくり添加した。混合物を、−５℃で更に１時間撹拌した。過剰のジメチルアミン（その４０％水溶液から蒸留されたばかりの）を、反応媒体に添加した。第２の混合物を更に１時間撹拌した。酢酸エチル（５０ｍＬ）を混合物に添加し、これをブライン（２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濃縮することにより、帯黄色固体としてＮ，Ｎ−ジメチル４−［４−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）フェニル］ブタンアミド（式４６）（０．１７ｇ、定量）が生じた。

１Ｎ ＮａＯＨ溶液（３ｍＬ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチル４−［４−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）フェニル］ブタンアミド（式４６）（０．１７ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）の室温メタノール（２ｍＬ）溶液に添加した。混合物を、１４時間撹拌した。混合物を、クロロホルム（２５ｍＬ）および水（２５ｍＬ）で分配した。有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：アセトン、９：１）で精製することにより、白色固体としてＮ，Ｎ−ジメチル４−（４−アミノフェニル）ブタンアミド（式４７）（７４ｍｇ、６６％）を得た。

Ｎ，Ｎ−ジメチル４−（４−アミノフェニル）ブタンアミド（式４７）（７４ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、シクロブタノン（５４ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）およびＴＭＳＣＮ（７７ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）の混合物を、８０℃に加熱し、１５時間撹拌した。媒体に酢酸エチル（２×２０ｍＬ）を添加し、次いで水（２×２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：アセトン、９：１）で精製することにより、白色固体としてＮ，Ｎ−ジメチル４−［４−（１−シアノシクロブチルアミノ）フェニル］ブタンアミド（式４８）（５８ｍｇ、５７％）を得た。

ＤＭＦ（３ｍＬ）中に含まれるＮ，Ｎ−ジメチル４−［４−（１−シアノシクロブチルアミノ）フェニル］ブタンアミド（式４８）（５８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）および４−イソチオシアナト−２−トリフルオロメチルベンゾニトリル（７４ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）の混合物を、還流下で２時間加熱した。混合物に、メタノール（２０ｍＬ）および１Ｎ ＨＣｌ水溶液（５ｍＬ）を添加した。第２の混合物を、１．５時間還流した。室温まで冷却した後、反応混合物を、冷水（５０ｍＬ）中に注ぎ、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：アセトン、９５：５）で精製することにより、淡帯黄色固体として４−（４−（７−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−８−オキソ−６−チオキソ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−５−イル）フェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタンアミド、ＮＣ５６（式４９）（４４ｍｇ、４２％）を得た。

（実施例５９）

４−（４−アミノフェニル）酪酸（０．２０ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）、シクロブタノン（０．１７ｍＬ、２．２３ｍｍｏｌ）およびＴＭＳＣＮ（０．３０ｍＬ、２．２３ｍｍｏｌ）の混合物を、８０℃に加熱し１３時間撹拌した。媒体に酢酸エチル（２×３０ｍＬ）を添加し、次いで水（２×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：アセトン、９：１）で精製することにより、帯黄色固体として４−［４−（１−シアノシクロブチルアミノ）フェニル］ブタン酸（式５０）（０．２１ｇ、７４％）を得た。

トルエン（１０ｍＬ）中に含まれる４−［４−（１−シアノシクロブチルアミノ）フェニル］ブタン酸（式５０）（０．２１ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）および４−イソチオシアナト−２−トリフルオロベンゾニトリル（０．２５ｇ、１．０８ｍｍｏｌ）の混合物を、還流下で１時間加熱した。混合物に、１Ｎ ＨＣｌ（５ｍＬ）水溶液を添加した。第２の混合物を、１．５時間還流した。室温まで冷却した後、反応混合物を、冷水（５０ｍＬ）中に注ぎ、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：アセトン、９５：５）で精製することにより、４−（４−（７−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−８−オキソ−６−チオキソ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−５−イル）フェニル）ブタン酸、ＮＣ１２２（式５１）（６０ｍｇ、１５％）を得た。

（実施例６１）

ＤＭＳＯ（０．０１ｍＬ、０．１２ｍｍｏｌ）の乾燥ジクロロメタン（１ｍＬ）溶液を、−７８℃で乾燥ジクロロメタン（２ｍＬ）中に含まれる塩化オキサリル（０．０１ｍＬ、０．０９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。１５分後、４−（４−（７−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−８−オキソ−６−チオキソ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−５−イル）フェニル）ブタンアミド、ＮＣ４７（式５２）（３５ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液を、反応混合物に添加した。撹拌を−７８℃で２０分間続け、次いでトリエチルアミン（０．０３ｍＬ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。−７８℃で３０分間経った後、反応混合物を室温まで加湿し、次いでＮＨ_４Ｃｌ飽和水溶液で反応物をクエンチした。反応混合物を、ジクロロメタンで希釈し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濃縮し、クロマトグラフィー（ジクロロメタン：アセトン、９５：５）を行うことにより、粘性油として４−（５−（４−（３−シアノプロピル）フェニル）−８−オキソ−６−チオキソ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−７−イル）−２−（トリフルオロメチル）ベンゾニトリル、ＮＣ５７（式５３）（２９ｍｇ、８７％）が生じた。

当業者なら、ここに記載した合成を改変しかつ／または組み合わせることにより、他のジアリールヒダントイン化合物を作製することができよう。

化合物の薬理試験
参照により本明細書に組み込んだＰＣＴ出願ＵＳ０４／４２２２１およびＵＳ０５／０５５２９のスクリーニング手順と同じ手順を利用する、ホルモン抵抗性前立腺癌細胞上での対ＡＲアンタゴニスト活性およびアゴニスト活性についてのスクリーニングを通じて、その合成経路が上記に記載されている化合物を特定した。いくつかの化合物は、ホルモン抵抗性前立腺癌中の過剰発現ＡＲに対して、最小限のアゴニスト活性と共に強力なアンタゴニスト活性を示した。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物学的アッセイ
レポーターアッセイによるＡＲに対する化合物の作用
ホルモン抵抗性前立腺癌細胞系中の人工ＡＲ応答レポーター系を使用して、化合物を試験した。このレポーター系では、この前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞を、内因性レベルより約５倍高いレベルのＡＲを安定発現させるように改変した。この外因性ＡＲと内因性ＡＲは、双方とも合成アンドロゲンＲ１８８１により安定化される点で同じ特性を有する。このＡＲ過剰発現細胞は、ＡＲ応答レポーターが安定的に組み込まれるようにも改変したが、これらの細胞のレポーター活性はホルモン抵抗性前立腺癌の特徴を示す。これは、低濃度の合成アンドロゲンＲ１８８１に応答し、高濃度のビカルタミド（表１参照）によってのみ阻害され、ビカルタミドによってアゴニスト活性を示す（図１および表２）。公表データと一致して、ビカルタミドは、ＡＲ応答レポーターを阻害したが、ホルモン感受性前立腺癌細胞中でアゴニスト活性を有さなかった（図２）。

表１
本発明者らは、その合成が上記に記載されている化合物のアンタゴニスト活性を１００ｐＭのＲ１８８１の存在下で試験した。改変ＬＮＣａＰ細胞（ＬＮＣａＰ−ＡＲ、ＬＮ−ＡＲとも略す）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＩｓｃｏｖｅ培地中に維持した。薬物処理の２日前に、この細胞を活性炭により除去処理された１０％ＦＢＳ（ＣＳ−ＦＢＳ）を含有するＩｓｃｏｖｅ培地中で成長させて、アンドロゲンを除去した。この細胞を、１００ｐＭのＲ１８８１および漸増の濃度試験化合物と共に１０％ＣＳ−ＦＢＳを含有するＩｓｃｏｖｅ培地中で分裂および成長させた。２日間のインキュベーションの後、レポーター活性をアッセイした。

表１に、ホルモン抵抗性前立腺癌中のＡＲを阻害するこれらの化合物のＩＣ５０を挙げる。対照物質ビカルタミドは、８８９ｎＭのＩＣ５０を有する。特定した化合物（ジアリールチオヒダントイン）のほとんどは、ホルモン抵抗性前立腺癌中のＡＲを阻害する際、１００〜２００ｎＭのＩＣ５０を有する。対照的に、米国特許第５７０５６５４号での実施例３０−２、３０−３、３１−２、３１−３、および２４−３（ＮＣ２４〜ＮＣ２８）などの実施例として挙げられている抗アンドロゲン化合物は、この系ではＡＲに対する阻害活性を有さない。

ＡＲ応答レポーターおよび内因性ＰＳＡ発現により測定される、ホルモン抵抗性前立腺癌中のＡＲに対するアンタゴニスト活性

（^＊）Ｎｏ：この化合物は、ＡＲ応答レポーターを阻害しなかった；（^＊＊）ｎ／ａ：この化合物は、このアッセイでは試験しなかった。

表２
ホルモン抵抗性前立腺癌中のＡＲ過剰発現のこれまで認識されてなかった一特性は、アンタゴニストをアゴニストに切り替える能力である。したがって、最小限のアゴニスト活性を有するまたはアゴニスト活性が全くないそれらの化合物のみが、この疾患に対して抗アンドロゲン物質であると見なされる。種々の化合物のアゴニスト活性を決定するために、本発明者らは、Ｒ１８８１の不在下のＬＮ−ＡＲ系中での測定としてＡＲ応答レポーターを使用して、ＡＲに対するこれらの刺激活性を試験した。表２に、種々の化合物のアゴニスト活性を挙げる。以前の結果と一致して、ビカルタミドはホルモン抵抗性前立腺癌中のＡＲを活性化させた。実施例７−３ｂ（ＮＣ７）、３３（ＮＣ３４）、３４（ＮＣ３５）、および３５（ＮＣ３６）などのジアリールチオヒダントイン誘導体は、アゴニスト活性を有さない。対照的に、ＲＵ５９０６３、ならびに米国特許第５７０５６５４号での実施例３０−２、３０−３、３１−２、３１−３、および２４−３（ＮＣ２４〜ＮＣ２８）などの実施例として挙げられている他の抗アンドロゲン化合物は、ホルモン抵抗性前立腺癌中のＡＲを強く活性化させた。

ホルモン抵抗性前立腺癌中のＡＲ応答レポーターに対する選択試験物質のアゴニスト活性

（^＊）誘導倍数：ＤＭＳＯ媒体中での活性に対する、特定の試験物質により誘導される活性；（^＊＊）ｎ／ａ：この化合物は、このアッセイでは試験しなかった。

ＡＲ阻害剤の特異性を試験するために、選択化合物を、核内受容体ファミリー中のＡＲの最も近いメンバーであるグルココルチコイド受容体（ＧＲ）の過剰発現を有するＬＮＣａＰ細胞中で試験した。これらの細胞はＧＲ応答レポーターも有し、このレポーター活性はデキサメタゾンによって誘導され、ＧＲアゴニストおよびその誘導は、ＧＲ阻害剤ＲＵ４８６によって遮断された。実施例７−３ｂ（ＮＣ７）（４−（８−オキソ−６−チオキソ−５−（４−メチルフェニル）−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクト−７−イル）−２−トリフルオロメチルベンゾニトリル）は、この系ではＧＲに対する作用はなかった。

前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の分泌レベルの測定による、ＡＲに対する化合物の作用
ＰＳＡレベルが前立腺癌中のＡＲ活性の指標であることは、十分確立されている。化合物が生理環境内でＡＲの機能に影響を及ぼすかどうかを試験するために、本発明者らは、ＡＲ過剰発現ＬＮＣａＰ細胞（ＬＮＣａＰ−ＡＲ、ＬＮ−ＡＲとも略す）中のＲ１８８１により誘導される内因性ＰＳＡの分泌レベルを決定した。このＬＮＣａＰ−ＡＲ細胞は、発現アンドロゲン受容体を発現させるプラスミドで形質導入された前立腺細胞のリンパ節癌の株である。ＬＮＣａＰ−ＡＲ細胞は、１０％ＦＢＳを含有するＩｓｃｏｖｅ培地中に維持した。薬物処理の２日前に、この細胞を１０％ＣＳ−ＦＢＳを含有するＩｓｃｏｖｅ培地中で成長させて、アンドロゲンを除去した。この細胞を、適切な濃度のＲ１８８１および試験化合物と共に１０％ＣＳ−ＦＢＳを含有するＩｓｃｏｖｅ培地中で分裂および成長させた。４日間のインキュベーションの後、ＰＳＡ分泌レベルを、ＰＳＡ ＥＬＩＳＡキット（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ、Ｓａｎ Ｃｌｅｍｅｎｔｅ、ＣＡ）を使用してアッセイした。

ＬＮＣａＰ−ＡＲ細胞のＰＳＡ分泌レベルは、２５ｐＭのＲ１８８１によって強く誘導された。対照的に、Ｒ１８８１の濃度が１００ｐＭに達するまで、ＰＳＡはＬＮＣａＰ親細胞中に誘導されなかった。これは、ホルモン抵抗性前立腺癌中のＡＲがアンドロゲンに対して過度に感受性であるという本発明者らの以前の報告と一致する。ＡＲ活性に対する用量依存的阻害を行って、ＰＳＡ発現の阻害における種々の化合物のＩＣ５０を決定し、この結果を表１に挙げた。ＰＳＡ発現に対する選択化合物のＩＣ５０が、レポーターアッセイにより測定されたＩＣ５０に酷似していることから、ジアリールヒダントイン誘導体は、ホルモン抵抗性前立腺癌中のＡＲの強力な阻害剤であることが確認される。

本発明者らは、代理マーカーとして分泌ＰＳＡを使用してホルモン抵抗性前立腺癌中のＡＲに対する選択化合物のアゴニスト活性も試験した。これを行うために、アンドロゲンが欠乏しているＡＲ過剰発現ＬＮＣａＰ細胞を、その合成が上記に記載されている漸増濃度の化合物と共にＲ１８８１の不在下でインキュベーションし、培地中の分泌ＰＳＡを４日後に測定した。

表３に選択化合物のアゴニスト活性を挙げる。レポーターアッセイから得られた結果と一致して、実施例７−３ｂ（ＮＣ７）、３３（ＮＣ３４）、３４（ＮＣ３５）、および３５（ＮＣ３６）などのジアリールチオヒダントイン誘導体は、アゴニスト活性を有しない。対照的に、ＲＵ５９０６３、ならびに米国特許第５７０５６５４号での実施例３０−２（ＮＣ２４）、３０−３（ＮＣ２５）、および３１−２（ＮＣ２６）などの実施例として挙げられている他の抗アンドロゲン化合物は、ホルモン抵抗性前立腺癌中のＰＳＡ発現を刺激した。

表３
ホルモン抵抗性前立腺癌中の内因性ＰＳＡに対する選択試験物質のアゴニスト活性
化合物の濃度を上げることによる誘導倍数

（^＊）誘導倍数：ＤＭＳＯ媒体中での活性に対する、特定の試験物質により誘導される活性；（^＊＊）ｎ／ａ：この化合物は、このアッセイでは試験しなかった。

ＭＴＳアッセイによるＡＲミトコンドリア活性に対する化合物の作用
ＬＮＣａＰ−ＡＲ細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＩｓｃｏｖｅ培地中で維持した。これらの化合物について、ホルモン抵抗性前立腺癌細胞の成長に対するそれらの作用を試験した。過剰発現ＬＮＣａＰ細胞は、これらの細胞がｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ（１）でホルモン抵抗性前立腺癌細胞として挙動するので使用した。本発明者らは、成長の代用であるＭＴＳアッセイによるミトコンドリア活性を測定した。過剰発現ＡＲ（ＬＮ−ＡＲ）を有するＬＮＣａＰ細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＩｓｃｏｖｅ培地中に維持した。薬物処理２日前に、この細胞を、１０％ＣＳ−ＦＢＳを含有するＩｓｃｏｖｅ培地中で成長させて、アンドロゲンを除去した。次いで、この細胞を、適切な濃度のＲ１８８１および漸増濃度の試験化合物と共に１０％ＣＳ−ＦＢＳを含有するＩｓｃｏｖｅ培地中で分裂および成長させた。４日間のインキュベーションの後、細胞成長をＭＴＳによって監視した（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。

レポーターアッセイおよびＰＳＡアッセイと一致して、ＡＲ過剰発現ＬＮＣａＰの成長は、２５マイクロＭのＲ１８８１によって刺激されたが、親細胞は、Ｒ１８８１濃度が１００マイクロＭに達するまで刺激されなかった。図２は、１００ｐＭのＲ１８８１の存在下での、ホルモン抵抗性前立腺癌の成長に対する選択化合物の阻害効果を示す。現在の臨床薬ビカルタミドは、ホルモン抵抗性前立腺癌を阻害しなかった。対照的に、実施例５−３ｂ（ＮＣ２）（４−［３−（４−メチルフェニル）−４，４−ジメチル−５−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−１−イル］−２−トリフルオロメチル−ベンゾニトリル）および実施例７−３ｂ（ＮＣ７）（４−（８−オキソ−６−チオキソ−５−（４−メチルフェニル）−５，７−ジアザスピロ［３，４］オクト−７−イル）−２−トリフルオロメチルベンゾニトリル）は、ホルモン抵抗性前立腺癌を高い効力で阻害した。

本発明者らは、ＭＴＳアッセイ中の成長阻害がＡＲを標的にすることにより生じるかどうかを試験し、実施例５−３ｂ（ＮＣ２）（４−［３−（４−メチルフェニル）−４，４−ジメチル−５−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−１−イル］−２−トリフルオロメチルベンゾニトリル）および実施例７−３ｂ（ＮＣ７）（４−（８−オキソ−６−チオキソ−５−（４−メチルフェニル）−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクト−７−イル）−２−トリフルオロメチルベンゾニトリル）を、ＡＲ発現を欠く前立腺癌細胞系であるＤＵ−１４５細胞中で試験した。これらの化合物では、ＤＵ−１４５細胞に対する成長阻害効果は全くなかった。これらの化合物は、２つの汎用される乳癌細胞ＭＣＦ７およびＳｋＢｒ３、または正常マウス線維芽細胞の細胞系３Ｔ３に対する成長効果がなかったので、ＡＲ発現前立腺癌細胞以外の細胞を阻害しなかった。

ジアリールチオヒダントイン誘導体のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性の実施例を、図３および４に示す。例えば、相対的なルシフェラーゼ活性に基づいて、図３は、濃度５００ｎＭで、これらの化合物は、次のように、最大活性から最小活性の順にＮＣ６７＞ＮＣ６８＞ＮＣ６６＞ＮＣ６９＞ＮＣ７７＝ＮＣ５３＞ビカルタミドとランク付けされたことを示す。例えば、相対ＰＳＡレベルに基づいて、濃度５００ｎＭで、これらの化合物は、次のように最大活性から最小活性の順にＮＣ５０＞ＮＣ４８＞ＮＣ７＞ＮＣ４３＞ＮＣ４４＞ＮＣ４９＞ＮＣ５０＞ＮＣ４５＞ビカルタミドとランク付けされることが見出された。例えば、相対的なＭＴＳ単位に基づいて、図４は、濃度５００ｎＭで、これらの化合物は、次のように最大活性から最小活性の順にＮＣ７０＞ＮＣ７＞ＮＣ１２２＞ＮＣ５３＞ビカルタミドとランク付けされたことを示す。

ホルモン抵抗性およびホルモン感受性前立腺癌異種移植腫瘍に対する阻害効果
本発明の化合物は、ジアリールヒダントイン誘導体が、ｉｎ ｖｉｖｏでホルモン抵抗性前立腺癌に対する効果を有するかどうかを試験するために使用する。まず、本発明者らは、ＡＲ過剰発現ＬＮＣａＰ細胞から樹立した異種移植腫瘍上でこの化合物を試験する。マトリゲル（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）中の改変細胞を、去勢雄のＳＣＩＤマウスの側腹部中に皮下注射する。腫瘍サイズを、カリパスを使用して週１回三次元測定する。異種移植腫瘍が樹立した後（少なくとも４０ｍｍ^３の腫瘍サイズ）、腫瘍を有するマウスを無作為化し、経口で毎日１回異なる用量の化合物で処置する。ＡＲ過剰発現ＬＮＣａＰ異種移植モデルの成長に対する阻害効果を、次のように観察する。樹立ＬＮ−ＡＲ異種移植腫瘍を有するマウスを、無作為化し、経口で毎日１回、示した化合物で処置する。腫瘍サイズを、内径によって測定する。

臨床観察と一致して、現在の臨床薬ビカルタミドは、ホルモン抵抗性前立腺癌の成長を阻害しなかった（ビヒクルと同様に）。対照的に、本発明による化合物はこれらの腫瘍の成長を阻害し、この阻害は用量依存的である。更に、これらの化合物は、ホルモン抵抗性前立腺癌用臨床マーカーである、ＰＳＡ発現を阻害する。

本発明の化合物は、ホルモン抵抗性前立腺癌の別の異種移植モデル、ホルモン抵抗性ＬＡＰＣ４中でも試験する。このモデルは去勢マウス中のホルモン感受性前立腺癌の継代から樹立したが、これは、前立腺癌の臨床的進行を模倣する（２）。ＡＲ過剰発現ＬＮＣａＰ異種移植モデルを使用した所見と同様に、現在の臨床薬ビカルタミドは、ホルモン抵抗性ＬＡＰＣ４異種移植モデル中の成長およびＰＳＡ発現を阻害しなかった（ビヒクルと同様に）。対照的に、本発明の化合物は、これらの腫瘍の成長およびＰＳＡ発現を阻害した。

図６は、ＬＮＣａＰホルモン感受性モデルからの細胞をマウス中に異種移植した実験の結果を表す（１０^６個のＬＮＣａＰ細胞をマウス中に注射した）。第１組のマウスをＮＣ５３で処置し、第２組のマウスをＣａｓｏｄｅｘで処置し、第３組のマウスをビヒクル溶液で処置した。各組には、６匹のマウスが含まれた。これらのマウスを、毎日１０ｍｇ／ｋｇで処置した。図６は、時間の関数としての腫瘍容積のグラフとしての結果を表す。対照としてのビヒクル溶液で処置したマウスは、最も急速な腫瘍容積増加を示した。Ｃａｓｏｄｅｘで処置したマウスおよびＮＣ５３で処置したマウスは類似の速度の腫瘍成長を示し、これらの速度は、ビヒクル溶液で処置したマウスより遅かった。

ホルモン感受性前立腺癌細胞の成長に対する阻害効果
ジアリールチアヒダントイン誘導体もホルモン感受性前立腺癌細胞を阻害するかどうかを決定するために、本発明者らは、ミトコンドリア活性のＭＴＳを測定することによってＬＮＣａＰ細胞の成長に対するいくつかの選択化合物を試験する。アンドロゲン欠乏ＬＮＣａＰ細胞を、漸増濃度のビヒクルとしてのＤＭＳＯまたは試験物質を使用して１ｐＭのＲ１８８１の存在下で処置する。４日間のインキュベーションの後、細胞成長をＭＴＳアッセイによって測定する。本発明の化合物は、ビカルタミドより高い効力でホルモン感受性前立腺癌を阻害する。

ｉｎ ｖｉｖｏバイオアッセイ
全ての動物実験を、Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓの指針に従って行った。動物を、Ｔａｃｏｎｉｃから購入し、画定されたフローラのコロニー内の層流塔中で維持した。ＬＮＣａＰ−ＡＲおよびＬＮＣａＰベクター細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地中に維持した。１００μｌのマトリゲルおよびＲＰＭＩ培地（１：１）中の１０^６個の細胞を、無傷のまたは去勢した雄ＳＣＩＤマウスの側腹部中に皮下注射した。腫瘍サイズを、カリパスを使用して週１回３次元（長さ×幅×深さ）測定した。マウスを、腫瘍サイズが約１００ｍｍ^３に達したときに処置群に無作為化した。薬物を、毎日１０ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇで経口投与した。薬力学的読み出しを得るために、動物を、処置の最終投与の３時間後に光学ＣＣＤカメラによって画像化した。光子／秒単位でルシフェラーゼ活性を測定するために、ＲＯＩを腫瘍上で描画する。右のパネルは、ＲＯＩ測定の表示であった。データを、図７および８に示す。１８日間にわたって、ＮＣ５３は、腫瘍成長を防止する効果があり、更に腫瘍を収縮させる効果さえもあり、ビカルタミドより際立って効果的であった。

ビカルタミド、４−［７−（４−シアノ−３−トリフルオロメチルフェニル）−８−オキソ−６−チオキソ−５，７−ジアザ−スピロ［３．４］オクト−５−イル］−トルエン［ＮＣ７］、Ｎ−メチル−４−｛４−［７−（４−シアノ−３−トリフルオロメチルフェニル）−８−オキソ−６−チオキソ−５，７−ジアザ−スピロ［３．４］オクト−５−イル］フェニル｝ブタンアミド［ＮＣ４８］、およびＮ−メチル−４−［７−（４−シアノ−３−トリフルオロメチルフェニル）−８−オキソ−６−チオキソ−５，７−ジアザ−スピロ［３．４］オクト−５−イル］−２−フルオロベンズアミド（５２ｄ）［ＮＣ５３］の薬物動態は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した生後８週間のＦＶＢマウスを使用してｉｎ ｖｉｖｏで評価した。各マウスを、各時点に対して３つの群に分けた。２匹のマウスを薬物で処置せず、他の２匹のマウスをビヒクル溶液で処置した。各群を、体重キログラム当たり１０ｍｇで処置した。

薬物を、１：５：１４のＤＭＳＯ：ＰＥＧ４００：Ｈ_２０（ビヒクル溶液）の混合物中に溶解し、尾静脈を介してマウス中に投与した。この動物を処置前に約２０分間加熱ランプの下で温めることにより、それらの尾静脈を拡張した。各マウスをマウスレストレーナー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．Ｃａｔ＃０１−２８８−３２Ａ）中に置き、薬物を含有するビヒクル溶液２００μｌを各マウスの拡張した尾静脈中に注射した。薬物投与後、この動物を、異なる時点：５ｍｎ、３０ｍｎ、２ｈ、６ｈ、１６ｈで、ＣＯ_２吸入によって安楽死させた。各動物を、ＣＯ_２暴露後すぐに心臓穿刺（１ｍｌ ＢＤシリンジ＋２７Ｇ５／８針）によって出血させた。経口投与の場合は、薬物を、給餌シリンジによる経口投与の前に５０：１０：１：９８９のＤＭＳＯ：カルボキシメチルセルロース：Ｔｗｅｅｎ８０：Ｈ２Ｏの混合物中に溶解した。

この血清試料を、Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８カラム（３μ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）を備えたＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００ポンプ、Ｗａｔｅｒｓ ６００コントローラーおよびＷａｔｅｒｓ ２４８７検出器）によって、薬物の濃度を決定するために分析した。ＮＣ７、ＮＣ４８、およびＮＣ５３化合物を２５４ｎｍ波長で検出し、ビカルタミドを２７０ｎｍ波長で検出した。

ＨＰＬＣ分析用試料を、以下の手順に従って調製した。：
血球を、遠心分離によって血清から分離した。

４００μｌの血清に、内部標準の１０μＭ溶液８０μｌおよびアセトニトリル５２０μｌを添加した。沈殿物が生じた。

混合物を、３分間渦流撹拌し、次いで３０分間超音波下に置いた。

固体粒子を、濾過し、または遠心分離によって分離した。

濾過物を、アルゴン流の下で乾燥し、乾燥物にした。薬物濃度を決定するために、この試料を、アセトニトリルを使用して８０μｌに再構成してからＨＰＬＣによって分析した。

薬物の標準曲線を使用することによって精度を改善した。

静脈内投与および経口投与から生じる、時間の関数としての血漿中ＮＣ５３の濃度を、図９に示す。ビカルタミド、ＮＣ４８、およびＮＣ５３の定常状態濃度（Ｃｓｓ）を、表４に示す。ＮＣ５３の定常状態濃度は、本質的にビカルタミドの定常状態濃度と同様であり、ＮＣ４８より大幅によい。

表４．マウス血漿中のビカルタミド、ＮＣ４８、およびＮＣ５３の定常状態濃度
アンドロゲン受容体活性は、以下のもの：ＡＲ応答レポーター系または前立腺特異抗原分泌系での阻害濃度（ＩＣ５０）、ＡＲ応答レポーター系または前立腺特異抗原分泌系中の濃度増加と関連する誘導倍数、動物中の関連する腫瘍成長、アンドロゲン受容体と化合物との結合親和性、前立腺特異抗原エンハンサーまたは前立腺特異抗原プロモーターへのアンドロゲン受容体補充、アンドロゲン受容体核移行、およびアンドロゲン受容体タンパク質の不安定化を含めるがそれらに限らない、アンドロゲン受容体挙動の刺激および阻害のいくつかの側面を包含し得る。

ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
図１０は、競合アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して決定された、ラットのアンドロゲン受容体（ラットＡＲ）のリガンド結合ドメインに対する化合物の相対結合親和性を示す。蛍光偏光を、読み出し値として使用した。各ホルモン投与を３回行い、３つの値の標準誤差をそれらの平均から算出することにより相対誤差を決定した。この検討は、最小限の競合（ビヒクルのみ）、受容体無し、蛍光リガンド無し、および最大限の競合（１０^−５Ｍ Ｒ１８８１、プロゲステロン、Ｅ２またはデキサメタゾン）に対して調整された。この曲線は、単一結合部位競合モデルを使用して適合された（Ｐｒｉｓｍ統計分析ソフトウェアパッケージを使用した。Ｒ１８８１は、最低の平衡解離定数Ｋｉ＝４ｎＭを有した（したがって、ラットのアンドロゲン受容体は、４つの試験化合物の内Ｒ１８８１に対する親和性が最高であった）。ＲＵ５９０６３は平衡解離定数Ｋｉ＝２０ｎＭを有し、ＮＣ５３は平衡解離定数Ｋｉ＝０．８ｕＭを有した。Ｃａｓｏｄｅｘは、平衡解離定数Ｋｉ＝０．４ｕＭを有した（したがって、ラットのアンドロゲン受容体は、４つの試験化合物の内Ｃａｓｏｄｅｘに対する親和性が最低であった）。ＮＣ５３およびＣａｓｏｄｅｘは類似の平衡解離定数を有するため、ラットのアンドロゲン受容体はこれらの化合物に対して同様の親和性を有した。

ＮＣ５３は、ＰＳＡエンハンサーおよびＰＳＡプロモーターへのアンドロゲン受容体（ＡＲ）補充およびＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）補充を防止した。図１１は、この検討の結果を示す。使用される材料は、ＡＲ（Ｕｐｓｔａｔｅ、ｃａｔ＃０６−６８０）およびＰｏｌ ＩＩ（Ｃｏｖａｎｃｅ、ｃａｔ＃ＭＭＳ−１２６Ｒ）を有するＣｈｒｏｍａｔｉｎ ＩＰであった。ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ）細胞を、完全血清中にプレーティングした。実験の日に、このプレートを１×ＰＢＳで１回洗浄し、５％ＣＳＳを３日間添加した。第１組の実験の場合、１０ｕＭのＮＣ５３を添加し、第２組の実験の場合、１０ｕＭのビカルタミドを添加し（Ｃ）、第３組の実験の場合、１ｎＭのＲ１８８１を添加した（＋）。これらの化合物の各々を、６時間添加した。対照の第４組の実験では、添加した追加の化合物はなかった（−）。６時間の時点として、２８周期行った。Ｕｐｓｔａｔｅ製ＣｈＩＰキット（ｃａｔ＃１７−２９５）を使用した。エンハンサーおよびプロモータープライマーを、それぞれＬｏｕｉｅ（ＰＮＡＳ ２００３年、１００巻、２２２６〜２２３０頁）およびＳｈａｎｇ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ２００２年、９巻、６０１〜６１０頁）から入手した。ＮＣ５３を添加した実験の場合の像がより暗いことから、ＮＣ５３は、アンドロゲン受容体およびＲＮＡポリメラーゼＩＩが前立腺特異抗原（ＰＳＡ）遺伝子上で転写複合体を形成するのを防止したことが示された。それに反して、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ、Ｃ）を添加した実験の場合の像がより明るいことから、ビカルタミドの存在下でのアンドロゲン受容体およびＲＮＡポリメラーゼＩＩは、依然として、ＰＳＡ ｍＲＮＡを転写するＰＳＡエレメントに補充されることが示された。

ＮＣ５３は、ＬＮＣａＰ細胞中のアンドロゲン受容体核移行を阻害した。図１２および１３は、この検討の結果を示す。ＬＮＣａＰ細胞を、５％ＣＳＳ中にプレーティングした。第１組の細胞を、１０ｕＭ ＮＣ５３で処理し、第２組の細胞を、１０ｕＭビカルタミドで処理し（Ｃ）、第３組の細胞を、１ｎＭ Ｒ１８８１で処理した（＋）。第４組の細胞は、対照の役割をした（−）。ＴＯＰＯ Ｉ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｃａｔ＃ｓｃ−３２７３６）を核画分の制御に使用し、ＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｃａｔ＃ｓｃ−２０３５７）を細胞質画分の制御に使用した。ＬＮＣａＰ細胞を、細胞下分画用に収集するか、またはアンドロゲン受容体（ＡＲ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｃａｔ＃ｓｃ−８１５）に対するＦＩＴＣ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）標識抗体で染色した。この細胞質画分から、図１２に示される像を得た。ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ、Ｃ）で処理した試料の場合の核画分中の像はより暗いことから、ビカルタミドはアンドロゲン受容体核移行を誘導することが示された。ＮＣ５３で処理した試料の場合の像は明るいことから、ＮＣ５３は核移行をなくすことが示された。ＡＲ−ＦＩＴＣアッセイの場合、カバースリップを、ＤＡＰＩ含有培地を使用するガラススライド上に取り付け、細胞を、ＤＡＰＩおよびＦＩＴＣ用フィルターを有するＮｉｋｏｎ蛍光顕微鏡を使用して×６０で２４時間後に画像化した。ＡＲ−ＦＩＴＣアッセイでは、Ｒ１８８１で処理した細胞の核ビカルタミドの核で処理した細胞の核は、図１３に示されるように際立って緑色であったことから、アンドロゲン受容体の核移行が生じたことが示された。それに反して、ＤＭＳＯで処理した細胞の核およびＮＣ５３で処理した細胞の核で処理した細胞は、緑色がより少なかった。

ＮＣ５３は、ＬＮＣａＰ細胞中のアンドロゲン受容体タンパク質を不安定化した。図１４は、この検討結果を示す。この検討は、５％ＣＳＳ中の１０^５ ＬＮＣａＰ（ｆｇｃ）細胞を３日間プレーティングすることによって行った。１００ｐＭのＲ１８８１を、第１組の細胞に添加し（＋）、１０ｕＭのビカルタミドを、第２組の細胞に添加し（Ｂ）、１０ｕＭのＮＣ５３を、第３組の細胞に添加し（ＮＣ５３）、１００ｐＭのＲ１８８１および１０ｕＭのビカルタミドを、第４組の細胞に添加し（Ｂ＋）、１００ｐＭのＲ１８８１および１０ｕＭのＮＣ５３を、第５組の細胞に添加した（Ｒ１８８１＋ＮＣ５３）。Ｒ１８８１、ビカルタミド、ＮＣ５３のいずれも、第６組の細胞に添加しなかった（−）。これらの細胞を、添加したビカルタミド、ＮＣ５３、および／もしくはＲ１８８１と共に２４時間（または（−）組の場合では、これらのいずれも共にせず２４時間）放置した。図１４では、ビカルタミド（Ｂ）を添加した組ならびにビカルタミドおよびＲ１８８１（Ｂ＋）を添加した組の場合の暗い像から、アンドロゲン受容体タンパク質は、化合物のこれらの組合せを添加するときのレベルであることが示された。それに反して、ＮＣ５３（ＮＣ５３）を添加した組ならびにＮＣ５３およびＲ１８８１（Ｒ１８８１＋ＮＣ５３）を添加した組の場合の明るい像から、Ｒ１８８１の有無に関わらずＮＣ５３を添加するとアンドロゲン受容体タンパク質が分解することが示された。

化合物の階層ランク付け
表５〜１０は、階層１〜６にグループ分けしたジアリールヒダントイン化合物を示す。表１１は、階層中に配置されなかったジアリールヒダントイン化合物を示す。化合物の階層配置は、分析判断と併せて、利用できるデータに基づいた。考慮されるデータには、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（ＬＮＣａＰ細胞系中のＡＲ応答レポーター系、ＰＳＡレベル測定、ＭＴＳミトコンドリアアッセイ）およびｉｎ ｖｉｖｏ実験（直接的に測定されたまたはルシフェラーゼレポーター遺伝子により誘導された発光によって測定された腫瘍サイズ、血漿レベルに基づいた薬物動態アッセイ）が含まれた。全ての化合物が、各アッセイにかけられるとは限らなかった。得られたデータが、全て示されるとは限らない。前立腺癌の治療における各化合物の有用性について互いに比較した各化合物のランク付けの際に、特に、同じ実験を行わなかった２つの化合物をランク付けする際に判断を適用した。ランク付けを確立する際に考慮される特性には、ＡＲアンタゴニズム活性、ホルモン抵抗性細胞中のＡＲアゴニズムの欠如、腫瘍成長の防止、腫瘍収縮、および血液中のより長い滞留時間を有利とする薬物動態挙動が含まれる。

階層１
全般的に、階層１の化合物は、ヒダントインの右側炭素上で二置換されている、二置換されている左手のアリール環を有するジアリールチオヒダントインであり、ヒダントインの左側炭素上に酸素またはＮ置換基を有する。アミド置換基は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで、生体系中で遭遇するような水溶液中の酸素に対して加水分解すると予想される。左手のアリール環上のＣＦ_３置換基の代わりにヨウ素を有するＮＣ６３は、良好な活性を有する。

階層１の化合物（表５参照）は、前立腺癌の治療に関してビカルタミドよりかなり良好であると判断した。しかし、ＮＣ７およびＮＣ４８は、速く代謝する、即ち、血液中で短い滞留時間を有することが判明した。ＮＣ５３は、望ましい薬物動態を有した。

図１６は、ビカルタミドを使用した処置の下では、ＬＮＣａＰ細胞の場合のＰＳＡレベルが、ビヒクル溶液を使用した処置と比べて同等以上にあったが、ＮＣ５３を使用する処置の下では、ＰＳＡレベルが低下したことを示す。図１７から、ビヒクル溶液を使用した処置の下では、腫瘍のサイズが上昇し続けたことが示される。それに反して、ＮＣ５３を使用した処置の下では、一日あたり１ｍｇ／体重ｋｇの用量で、腫瘍増大の速度が低下し、腫瘍のサイズは約１７日後に安定化しているようであった。ＮＣ５３を使用した処置の下では、一日あたり１０ｍｇ／体重ｋｇの用量で、腫瘍サイズは経時で小さくなった。図１８から、ＮＣ５３を使用した処置の下では、一日あたり１０ｍｇ／体重ｋｇの用量で、ルシフェラーゼ活性と関連する光子放出が減少したことが示される。図１９は、この用量でのＮＣ５３を使用した処置の結果、腫瘍サイズが縮小または安定化し、ルシフェラーゼ活性と関連する光子放出が減少したことを示す。

図２０は、１００、２００、５００、および１０００ｎＭの用量でＮＣ５３、ＮＣ５４、ＮＣ５５、ＮＣ５６、およびＮＣ５７を使用した処置の下では、ＬＮ−ＡＲ細胞のＰＳＡレベルは低下したことを示す。更に、用量が高ければ高いほどＰＳＡレベルは低下した。図２２は、無傷マウスおよび去勢マウスについて、最初と、ビカルタミドまたはＮＣ５３で１４日間処置した後の尿生殖路重量およびルシフェラーゼ活性と関連する光子放出比率を示す。重量および光子放出比率は、無傷マウスおよび去勢マウスの双方の場合で増加した。ＮＣ５３を使用した去勢マウスの処置の結果、未治療去勢マウスに対して重量および光子放出が減少し、ビカルタミドを使用した処置も同様であった。

したがって、階層１の化合物は、ＡＲアンタゴニスト、およびホルモン抵抗性前立腺癌用治療剤としての使用に特に有利である。これらは、良性前立腺過形成、脱毛および座瘡などの他のＡＲ関連疾患または病態を治療するのに有用となり得る。これらの化合物および関連化合物は、グルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体、およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体などの他の核内受容体の修飾物質、ならびに乳癌、卵巣癌、糖尿病、心疾患、および代謝関連疾患などの、核内受容体が役割を果たす疾患用の治療剤としても有用となり得る。これらは、アッセイに有用となり、例えば標準、または中間物もしくはプロドラッグとして有用となり得る。

階層２
階層２の化合物（表６参照）は、前立腺癌の治療に関してビカルタミドより有意に良好であったが、ＮＣ１２がアゴニストとして作用し得ることが示唆された。図３から、１２５ｎＭ〜１０００ｎＭの範囲の濃度で投与された階層１中の化合物ＮＣ６６、ＮＣ６７、ＮＣ６８、ＮＣ５３、およびＮＣ６９ならびに階層２中のＮＣ７７が、ＬＮＣａＰ−ＡＲ細胞中のルシフェラーゼ活性を低減する作用を有した一方、ＤＭＳＯおよびビカルタミドの対照溶液は効果がほとんどまたは全くなかったことが示される。濃度１０００ｎＭで、階層１中の化合物ＮＣ７およびＮＣ４８が、階層２中のＮＣ４３、ＮＣ４４、およびＮＣ５０よりＬＮＣａＰ−ＡＲ細胞のＰＳＡレベルを大きく低下させることが見出された。図７は、経時での腫瘍容積を示し、ビカルタミドまたはビヒクル溶液を使用した処置の下では、腫瘍が成長し続ける一方、階層１中のＮＣ５３を使用した処置の下では、腫瘍サイズが小さくなったことを示す。図８から、ビカルタミドを使用した処置の下での、ルシフェラーゼ活性と関連する光子放出は、ビヒクル溶液を使用した処置に対してほぼ同じかまたは増加したままであったが、ＮＣ５３を使用した処置の下では光子放出は減少したことが示される。図２３から、ビカルタミドを使用した処置の下では、ＰＳＡレベルがほとんどまたは全く低下しなかったが、ＮＣ４８およびＮＣ５３を使用する処置の下では、ＰＳＡレベルが低下したことが示される。図２４から、階層１中のＮＣ７、ＮＣ４８、およびＮＣ５３についてのＩＣ_５０は、ビカルタミドについてのＩＣ_５０よりはるかに低かったことが示される。

全般的に、階層２の化合物は、構造的に階層１の化合物と類似しているが、右手のアリール環上に異なる置換基がある。階層２の化合物は、ＡＲアンタゴニストとして、またホルモン抵抗性前立腺癌用治療剤としての使用に有利である。これらは、良性前立腺過形成、脱毛および座瘡などの他のＡＲ関連疾患または病態を治療するのに有用となり得る。これらの化合物および関連化合物は、エストロゲン受容体およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体などの他の核内受容体の修飾物質、ならびに乳癌、卵巣癌、糖尿病、心疾患、および代謝関連疾患などの、核内受容体が役割を果たす疾患用の治療剤としても有用となり得る。これらは、アッセイに有用となり、例えば標準、または中間物もしくはプロドラッグとして有用となり得る。

階層３
階層３の化合物（表７参照）は、前立腺癌の治療に関してビカルタミドよりわずかに良好であると判断した。ＮＣ４３、ＮＣ４４、およびＮＣ５０（階層２中の）は、階層３中のＮＣ４５およびＮＣ４９よりＬＮＣａＰ−ＡＲ細胞のＰＳＡレベルを大きく低下させた。これらの化合物は、全て、ビカルタミドよりＰＳＡレベルを大きく低下させた。

他の階層３の化合物（示していない）は、ジアリールチオヒダントインではなかったが、従来技術のモノアリールヒダントイン化合物ＮＣ８３、ＮＣ７９、およびＮＣ８０と比べて活性の面で遜色なかった。

したがって、階層３の化合物は、ＡＲアンタゴニストとして、またホルモン抵抗性前立腺癌用治療剤として有用である。これらは、良性前立腺過形成、脱毛および座瘡などの他のＡＲ関連疾患または病態を治療するのに有用となり得る。これらの化合物および関連化合物は、エストロゲン受容体およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体などの他の核内受容体の修飾物質、ならびに乳癌、卵巣癌、糖尿病、心疾患、および代謝関連疾患などの、核内受容体が役割を果たす疾患用の治療剤としても有用となり得る。これらは、アッセイに有用となり、例えば標準、または中間物もしくはプロドラッグとして有用となり得る。

階層４
階層４の化合物（表８参照）は、前立腺癌の治療に関してビカルタミドと同等であると判断した。階層４のＮＣ９３およびＮＣ９４ならびに階層１のＮＣ７は、例えば、ヒダントイン環の右側の低級炭素上の置換基しか異ならない。この右手のアリール環上の置換基も、活性に影響を及ぼし得る。

階層４の化合物（示したものおよび示していない他のものを含む）のいくつかは、ジアリール化合物ではなく（右手のアリール環を欠く）、チオヒダントインではなく、ヒダントイン環の右手の低級炭素上で二置換されていなく、かつ／またはヒダントイン環の左手の低級炭素上に酸素もしくはアミド以外の置換基を有した。このことは、ヒダントイン環の右手の低級炭素上で二置換されており、ヒダントイン環の左手の低級炭素上に酸素またはアミドを有するジアリールチオヒダントインの意外な利点の証拠を与える。

したがって、階層４の化合物は、ＡＲアンタゴニストとして、またホルモン抵抗性前立腺癌用治療剤として、ビカルタミドと比べて少なくとも遜色ない程度まで有用となり得る。これらは、良性前立腺過形成、脱毛および座瘡などの他のＡＲ関連疾患または病態を治療するのに有用となり得る。これらの化合物および関連化合物は、エストロゲン受容体およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体などの他の核内受容体の修飾物質、ならびに乳癌、卵巣癌、糖尿病、心疾患、および代謝関連疾患などの、核内受容体が役割を果たす疾患用の治療剤としても有用となり得る。これらは、アッセイに有用となり、例えば標準、または中間物もしくはプロドラッグとして有用となり得る。

階層５
階層５の化合物（表９参照）は、前立腺癌の治療に関して、不活性またはほとんど不活性であり、したがってビカルタミドより悪かった。右手のアリール環上の置換基は、活性を決定する上で重要となる。

階層５の化合物（示されているものも示されていないものもある）のいくつかは、ジアリール化合物ではなく（右手のアリール環を欠く）、チオヒダントインではなく、ヒダントイン環の右手の低級炭素上で二置換されていなく、かつ／またはヒダントイン環の左手の低級炭素上に酸素もしくはアミド以外の置換基を有した。このことは、ヒダントイン環の右手の低級炭素で二置換されており、ヒダントイン環の左手の低級炭素上に酸素またはアミドを有するジアリールチオヒダントインの意外な利点の証拠を与える。特に、ＮＣ１０３、ＮＣ１０４、およびＮＣ１０６中の末端置換基（Ｒ_ｘ、ｙがＨまたはメチルであるＣＨ_２ＮＲ_ｘＲ_ｙ）は、これらの化合物では活性に寄与するので見られない。

階層５の化合物は、前立腺癌の治療用にまたはＡＲアンタゴニストとして望ましくないであろうが、これらの化合物および関連化合物は、エストロゲン受容体およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体などの他の核内受容体の修飾物質、ならびに乳癌、卵巣癌、糖尿病、心疾患、および代謝関連疾患などの、核内受容体が役割を果たす疾患用の治療剤として有用となり得る。これらは、アッセイに有用となり、例えば標準、または中間物もしくはプロドラッグとして有用となり得る。

階層６
階層６の化合物（表１０参照）は、前立腺癌の治療に関して、不活性またはほとんど不活性であり、更に強いアゴニストであり、したがって、ビカルタミドよりかなり悪かった。この比較化合物は、本発明の化合物に対して非常に劣るとランク付けした。特に、左手のアリール環上に塩素置換基を有するＮＣ１０７の活性は極めて不十分であったが、トリフルオロメタンを有するＮＣ２およびヨウ素を有するＮＣ６３は階層１にランク付けされた。階層６の化合物についての結果は、ヒダントイン環の右手の低級炭素上で二置換されており、ヒダントイン環の左手の低級炭素上に酸素またはアミドを有し、左手のアリール環上にある種の置換基を有するジアリールチオヒダントインの意外な利点の証拠を与える。

階層６の化合物は、前立腺癌の治療用にもＡＲアンタゴニストとしても望ましくないであろう。

階層分けしていない化合物
いくつかの化合物については、これらをランク付けする実験データが不十分であった。これらの階層分けしていない化合物を、表１１に提示する。

本発明のデータおよび方法に基づいて、また、ここで示されていないいくつかのものを含めた多くの化合物の検討に基づく判断を適用することに基づいて、階層分けしていない化合物についていくらか評価することができる。比較例ＮＣ１０８は、比較例ＮＣ７８〜ＮＣ８０と共に階層３中にあると予測される。ＮＣ１１３は、ＮＣ７（階層１）に加水分解すると予測され、したがって、同等の活性を有するはずである。ＮＣ１１４はＮＣ１６（階層１）に加水分解すると予測され、したがって、同等の活性を有するはずである。ＮＣ１１５はＮＣ３（階層１）に加水分解すると予測され、ＮＣ１２０およびＮＣ１２１は、ＮＣ５０（階層２）に加水分解すると予測され、したがって、それらは同等の活性を有するはずである。

要するに、前立腺癌を治療する上でビカルタミドよりかなり優れているという証拠を示す新規化合物を、特定し、作製した。

構造差に対する化合物の抗癌活性の感受性
本発明者らは、ヒダントイン化合物の構造中の小さな変化であるように見えるものが、前立腺癌を治療する際の化合物の性能に大きな変化を結果としてもたらし得ることを究明した。例えば、ＮＣ７７およびＮＣ５３は、アリール環上の１個のフッ素置換基しか異ならないが、ＮＣ５３は階層１中に入る一方、ＮＣ７７は階層２に入り、双方が前立腺癌の治療に関してビカルタミドより良好であるが、ＮＣ５３の方が優れている。しかし、ＮＣ９８は、メチルカルバモイル基とアリール環との間に更に炭素原子を有するという点でしかＮＣ７７と異ならないが、前立腺癌の治療に関してビカルタミドと同等であり、階層４にランク付けされる。ルシフェラーゼ活性に対するＮＣ７７、ＮＣ５３、およびＮＣ９８の作用は、図２５に見ることができる。所与の濃度の化合物では、ＮＣ７７およびＮＣ５３に曝した際のルシフェラーゼ活性は、ＮＣ９８に曝した際のルシフェラーゼ活性より低い。

ＮＣ４は、ヒドロキシル基をアミノ基に置き換えたという点でしかＮＣ３と異ならない。しかし、ＮＣ３は、階層１に入り前立腺癌の治療に関してビカルタミドよりかなり良好である一方、ＮＣ４は、階層４に入りビカルタミドと同等である。１ＡＲ細胞系中のルシフェラーゼ活性に対するＮＣ３およびＮＣ４の作用は、１．２５〜１０μｍｏｌの範囲の濃度で種々の化合物を投与しＰＳＡレベルを観察することによって検討した。所与の用量では、ＮＣ３に曝した際のルシフェラーゼ活性は、ＮＣ４に曝した際のルシフェラーゼ活性より低い。４ＡＲ細胞系中のルシフェラーゼ活性に対するＮＣ３およびＮＣ４の作用は、１．２５〜１０μｍｏｌの範囲の濃度で種々の化合物を投与しルシフェラーゼ活性を観察することによって検討した。所与の用量では、ＮＣ３に曝した際のルシフェラーゼ活性は、ＮＣ４に曝した際のルシフェラーゼ活性より低い。ＬＮ／ＡＲ細胞系中のＰＳＡレベルに対するＮＣ３およびＮＣ４の作用は、１．２５〜１０μｍｏｌの範囲の濃度で種々の化合物を投与しルシフェラーゼ活性を観察することによって検討した。所与の用量では、ＮＣ３に曝した際のＰＳＡレベルは、ＮＣ４に曝した際のＰＳＡレベルより低い。

ＮＣ４７およびＮＣ４８は、カルバモイル基の末端上のメチル置換基の分しか互いに異ならず、双方の化合物は階層１にランク付けされるが、ＮＣ４８は特に有利であることが見出された。ＮＣ４６は、アミノ基をメトキシ基に置き換えたことを除き、ＮＣ４７と同じである。しかし、ＮＣ４６は階層３にランク付けされる。ＮＣ４２は、ＮＣ４６に類似しているが、エステル基をアリール環に結合している鎖中の炭素が１個少なく、ＮＣ４２は階層３にランク付けされる。ＬＮ／ＡＲ細胞系中のＰＳＡレベルに対するＮＣ４７、ＮＣ４８、ＮＣ４２、およびＮＣ４６の作用は、１２５ｎｍｏｌ〜１０００ｎｍｏｌの範囲の濃度で種々の化合物を投与しＰＳＡレベルを観察することによって検討した。所与の濃度では、ＮＣ４７およびＮＣ４８に曝した際のＰＳＡレベルは、ＮＣ４２およびＮＣ４６に曝した際のＰＳＡレベルより低い。

ＮＣ６８およびＮＣ１０３は、前者が、アリール環に結合しているメチルカルバモイル基およびチオヒダントイン基に結合しているジメチル置換基を有する一方、後者が、右手のアリール環に結合しているメチルアミノ基およびチオヒダントイン基に結合しているシクロブチル置換基を有する点で互いに異なる。ＮＣ６８は、階層１に入り前立腺癌の治療に関してビカルタミドよりかなり良好である一方、ＮＣ１０３は、階層５に入り前立腺癌の治療において不活性またはほぼ不活性である。ＬＮ／ＡＲ細胞系中のルシフェラーゼ活性に対するＮＣ６８およびＮＣ１０３の作用は、１２５ｎｍｏｌ〜１０００ｎｍｏｌの範囲の濃度で種々の化合物を投与しルシフェラーゼ活性を観察することによって検討した。所与の濃度では、ＮＣ６８に曝した際のルシフェラーゼ活性は、ＮＣ１０３に曝した際のルシフェラーゼ活性より低い。

ＮＣ１６およびＮＣ１８は、オキソ基をチオ基に置き換えジメチル置換基をシクロブチル置換基に置き換えた点で互いに異なる。ＮＣ１６は階層１に入る一方、ＮＣ１８は階層４に入る。

医薬組成物および投与
本発明の化合物は、治療有効量の本明細書で定義した本発明の化合物、および医薬として許容可能な担体または希釈剤を使用して調製される医薬組成物として有用である。

本発明のジアリールヒダントイン化合物は、医薬組成物として製剤し、選択される投与経路に適した様々な形態で、例えば経口的、経鼻的、腹腔内的もしくは非経口的に、静脈内、筋肉内、局所もしくは皮下経路により、または組織中への注射により、治療の必要がある対象、例えばヒトの患者などの哺乳類に投与してもよい。

したがって、本発明のジアリールヒダントイン化合物は、例えば、経口的に、不活性希釈剤もしくは吸収可能な可食性担体などの医薬として許容可能なビヒクルと組み合わせて、または吸入もしくは吹送により全身投与されてもよい。これらは、殻の硬いもしくは軟らかいゼラチンカプセル中に封入してもよく、固めて錠剤にしてもよく、または患者の食事の食物と直接組み合わせてもよい。治療のための経口投与の場合、ジアリールヒダントイン化合物を、１つまたは複数の賦形剤と組み合わせてもよく、摂取可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハーなどの形態で使用してもよい。ジアリールヒダントイン化合物は、不活性微粉末担体と組み合わせてもよく、対象により吸入してもよく、または吹送してもよい。このような組成物および調製物は、ジアリールヒダントイン化合物を少なくとも０．１％含有すべきである。組成物および調製物の比率は、当然変えてもよく、所与の単位投与形態の重量の約２％〜約６０％であるのが好都合となり得る。このような治療上有用な組成物中のジアリールヒダントイン化合物の量は、有効投与レベルが得られることになる量である。

錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどは、以下のものも含有してもよい：トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤、第二リン酸カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチ、ジャガイモでんぷん、アルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および蔗糖、果糖、乳糖もしくはアスパルテームなどの甘味剤またはペパーミント、ウィンターグリーン油もしくはサクランボ香味料などの香味料を添加してもよい。単位投与形態がカプセルであるとき、これは、上記種類の材料以外に、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体を含有してもよい。種々の他の材料は、コーティングとして存在してもよいし、そうでない場合は、固体の単位投与形態の物理的形状を変えるために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、ゼラチン、ワックス、シェラックまたは砂糖などでコーティングしてもよい。シロップまたはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としての蔗糖または果糖、保存料としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素ならびにサクランボまたはオレンジ香味料などの香味料を含有してもよい。当然、任意の単位投与形態の調製に使用される任意の材料は、採用される量で、医薬として許容可能であり実質的に非毒性であるべきである。更に、ジアリールヒダントイン化合物は、持続放出性調製物およびデバイス中に組み込んでもよい。例えば、ジアリールヒダントイン化合物は、徐放性カプセル、徐放性錠剤、および徐放性丸剤中に組み込んでもよい。

ジアリールヒダントイン化合物は、注入または注射によっても静脈内投与または腹腔内投与してもよい。ジアリールヒダントイン化合物の溶液は、非毒性界面活性剤を任意選択で混合して水中で調製してもよい。分散液は、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびそれらの混合物中でも調製してもよく、油中でも調製してもよい。通常の保管および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防ぐために保存料を含有してもよい。

注射または注入に適する医薬投与形態は、滅菌水溶液もしくは滅菌分散液、または注射もしくは注入可能な滅菌溶液もしくは滅菌分散液の即時調製に適合し任意選択でリポソーム中に封入されているジアリールヒダントイン化合物を含む滅菌粉末を含んでもよい。全ての場合において、究極の投与形態は、滅菌であり、流体であり、製造および保管条件下で安定しているべきである。液体の担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体のポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステル、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または液体の分散液ビヒクルであってもよい。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、分散液の場合での必要とされる粒度の維持によって、または界面活性剤の使用によって維持できる。微生物の活動の阻止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合では、等張剤、例えば、砂糖、緩衝液または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。

注射可能な滅菌溶液は、必要であれば上記に列挙した他の成分の種々のものと共に必要量のジアリールヒダントイン化合物を適切な溶媒中に組み込み、次いで濾過滅菌することによって調製される。注射可能な滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、調製の好ましい方法は、真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、これらの技術により、予め滅菌濾過された溶液中に存在する任意の所望の追加成分をプラスした活性成分の粉末が生じる。

局所投与の場合、ジアリールヒダントイン化合物を純粋形態で施用してもよい。しかし、通常、これらの化合物を、組成物または製剤として、固体であっても液体であってもよい皮膚薬として許容できる担体と組み合わせて皮膚に投与することが望ましいであろう。

有用な固体担体には、タルク、クレイ、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナなどの微粉固体が含まれる。他の固体担体には、非毒性ポリマーナノ粒子または微粒子が挙げられる。有用な液体担体には、水、アルコールもしくはグリコールまたは水／アルコール／グリコールブレンドが挙げられ、この担体中に、非毒性界面活性剤を任意選択で用いてジアリールヒダントイン化合物を有効レベルで溶解または分散してもよい。香料および追加の抗菌剤などのアジュバントを添加することにより、所与の使用のための特性を最適化してもよい。生じた液体組成物を、吸収パッドから塗布するか、帯具および他の包帯に含浸させるために使用するか、またはポンプ型もしくはエアロゾル噴霧器を使用して罹患領域上にスプレーしてもよい。

合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪アルコール、変性セルロースまたは変性無機物質などの増粘剤も、液体担体と共に採用することにより、塗り広げることが可能なペースト、ゲル、軟膏、せっけんなどを形成することによって、使用者の皮膚に直接塗布することができる。

ジアリールヒダントイン化合物を皮膚に送達するために使用できる有用な皮膚科用組成物の例は当技術分野で知られており、例えば、Ｊａｃｑｕｅｔら（米国特許第４６０８３９２号）、Ｇｅｒｉａ（米国特許第４９９２４７８号）、Ｓｍｉｔｈら（米国特許第４５５９１５７号）およびＷｏｒｔｚｍａｎ（米国特許第４８２０５０８号）を参照されたく、それら全ては参照により本明細書に組み込んである。

式Ｉの化合物の有用な投与量は、動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのそれらの化合物の活性を比較することによって決定できる。マウスおよび他の動物の有効投与量のヒトへの外挿法は当技術分野で知られており、例えば米国特許第４９３８９４９号を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込んである。

例えば、ローションなどの液体組成物中のジアリールヒダントイン化合物の濃度は、約０．１〜２５重量％または約０．５〜１０重量％であってもよい。ゲルまたは粉末などの半固体または固体組成物中の濃度は、約０．１〜５重量％または約０．５〜２．５重量％であってもよい。

治療に使用するのに必要なジアリールヒダントイン化合物の量は、選択される特定の塩に応じて変化するだけでなく、投与経路、治療されている病態の特性、ならびに患者の年齢および病態に応じて変化し、最終的には担当医または担当臨床医の裁量に委ねられよう。

本発明の薬剤の有効投与量および投与経路は、標準的である。薬剤の正確な量（有効用量）は、例えば種、年齢、体重および対象の一般的病態または臨床的病態、治療されている任意の障害の重症度またはメカニズム、使用される特定の薬剤またはビヒクル、投与方法およびスケジューリングなどに応じて、各対象によって変化するであろう。治療有効用量は、当業者に知られる従来の手順によって実験的に決定できる。例えば、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ版、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。例えば、有効用量は、細胞培養アッセイまたは適切な動物モデルで最初に評価することができる。この動物モデルは、適切な濃度範囲および投与経路を決定するためにも使用してもよい。次いで、このような情報を使用することにより、ヒトでの有用な用量および投与経路を決定してもよい。治療用量は、類似の治療薬の投与量から類推することによっても選択してもよい。

特定の投与方式および投与計画は、担当臨床医が症例の詳細（例えば対象、疾患、関与する病状、治療が予防的であるか否か）を考慮することによって選択されよう。治療は、数日から数カ月、または数年の期間にもわたって、化合物（複数も）を毎日または毎日数回投与する場合がある。

しかし、通常、適切な用量は、一日あたり約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重ｋｇ、例えば一日あたり約０．１ｍｇ／体重ｋｇを超えるような、約０．０１〜一日あたり約１００ｍｇ／体重ｋｇの用量の範囲内、または１日当たり、受容者体重キログラム当たり約１〜約１０ｍｇの範囲内にあろう。例えば、適切な用量は、一日あたり１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇ体重ｋｇであってもよい。

ジアリールヒダントイン化合物は、単位投与形態、例えば、単位投与形態当たり０．０５〜１００００ｍｇ、０．５〜１００００ｍｇ、５〜１０００ｍｇ、または約１００ｍｇの活性成分を含有する形態で便利に投与される。

ジアリールヒダントイン化合物は、例えば、約０．５〜約７５μＭ、約１〜５０μＭ、約２〜約３０μＭ、または約５〜約２５μＭの血漿ピーク濃度が達成されるように投与してもよい。例示的な望ましい血漿濃度には、少なくとも０．２５、０．５、１、５、１０、２５、５０、７５、１００もしくは２００μＭまたはそれら以下が挙げられる。例えば、血漿レベルは、約１〜１００マイクロモルまたは約１０〜約２５マイクロモルであってもよい。これは、例えばジアリールヒダントイン化合物０．０５〜５％の、任意選択で食塩水溶液とする溶液の静脈内注射によって達成してもよいし、ジアリールヒダントイン化合物を約１〜１００ｍｇ含有する丸薬として経口投与してもよい。望ましい血中レベルは、毎時体重ｋｇ当たり約０．００００５〜５ｍｇ、例えば少なくとも０．００００５、０．０００５、０．００５、０．０５、０．５、もしくは５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒまたはそれら以下を与えるように連続注入によって維持されてもよい。あるいは、このようなレベルは、体重ｋｇ当たり約０．０００２〜２０ｍｇ、例えば少なくとも体重ｋｇ当たり０．０００２、０．００２、０．０２、０．２、２、２０、もしくは５０ｍｇまたはそれら以下のジアリールヒダントイン化合物を含有する間欠的注入によって得てもよい。

ジアリールヒダントイン化合物は、単回用量で便利に供給してもよいし、分割用量として、例えば毎日２、３、４またはそれを超える回数の副用量として適切な間隔で投与してもよい。副用量それ自体は、例えば、吸入器からの複数回吸入などの、不連続の大まかに間隔を空けたいくつかの投与に更に分割してもよい。

上記で特定した化合物のいくつかは、ホルモン抵抗性前立腺癌細胞に対してアゴニスト活性をほとんどまたは全く示さない。これらの化合物は、強力なＡＲ阻害剤であるので、前立腺癌の治療だけでなく、他のＡＲ関連疾患または良性前立腺過形成、脱毛、および座瘡などの病態の治療にも使用できる。ＡＲは核内受容体のファミリーに属するので、これらの化合物は、エストロゲン受容体およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体などの他の核内受容体を標的とする薬物合成のための骨格としての役割を果たすことができる。したがって、これらは、乳癌、卵巣癌、糖尿病、心疾患、および代謝関連疾患などの、核内受容体が役割を果たす他の疾患のために更に発展させてもよい。

本発明によるいくつかの化合物の化学合成の順序を、以下に示す。シアノヒドリン１０ａｂｃは、３つの異なるアニリン１１ａｂｃとの反応によって４つの異なるシアノアミン１２ａｂｃｄに変換される（１０ａおよび１１ａは１２ａを与え、ｌ０ｂおよび１１ａは１２ｂを与え、１０ｃおよび１１ｂは１２ｃを与え、１０ｃおよび１１ｃは１２ｄを与える）。個別のプロセスでは、アニリン１３は、一工程でイソチオシアネート１４に変換される。１２ａｂｃｄを１４に添加し、次いで弱酸処理することによって、所望のチオヒダントイン４（ＮＣ５４）、５（ＮＣ５５）、６（ＮＣ５６）、および７が良好な収率で作製される。

本明細書中に例示し論じた実施形態は、本発明者らが知っている、本発明を作製し使用する最良の方法を当業者に教示することのみ意図される。本明細書では、本発明の範囲を限定するものとして考慮されるべきものは全くない。提示される全ての例は、代表であり非限定的である。本発明の上記実施形態は、本発明から逸脱することなく修正してもよいし変更してもよく、このことは、上記教示を踏まえて当業者によって認識される。したがって、本発明は、特許請求の範囲およびこれらの等価物の範囲内で、具体的に記載した場合とは別の方法で実行されてもよいことが理解されるべきである。

ビカルタミドが、ＬＮＣａＰ−ＡＲに対するアゴニスト効果を表すことを示すグラフである。ＡＲ過剰発現ホルモン抵抗性前立腺癌中のビカルタミドのアゴニスト活性。過剰発現ＡＲを有するＬＮＣａＰ細胞を、Ｒ１８８１の不在下、漸増濃度のビヒクルとしてのＤＭＳＯまたはビカルタミドで処理した。ＡＲ応答レポーターの活性を測定した。 ＬＮＣａＰ−ＡＲに対するビカルタミドのアンタゴニストアッセイを示すグラフである。ホルモン感受性前立腺癌中のビカルタミドのアゴニスト活性。ＬＮＣａＰ細胞を、Ｒ１８８１の不在下、漸増濃度のビヒクルとしてのＤＭＳＯまたはビカルタミドで処理した。ＡＲ応答レポーターの活性を測定した。 ＬＮＣａＰ−ＡＲに対する各化合物の作用を示すグラフである。 ＬＮＣａＰ−ＡＲに対する阻害効果を示すグラフである。 ＡＲ過剰発現ＬＮＣａＰ異種移植モデルのＰＳＡ発現に対する阻害効果。マウスを、４４日間、経口で毎日１回、ビヒクル、ｋｇ当たり０．１、１、または１０ｍｇの実施例７−３ｂ（ＮＣ７）で処置した。４４日間の処置後、腫瘍をマウスから取り出し、腫瘍溶解物を抽出し、組織溶解物中のＰＳＡレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。 ビヒクル溶液、Ｃａｓｏｄｅｘ、およびＮＣ５３で治療した場合の時間の関数としての腫瘍容積のグラフである。 腫瘍サイズのグラフである。ＡＲ過剰発現ＬＮＣａＰ細胞を去勢ＳＣＩＤマウスの側腹部中に皮下注射した。腫瘍が約１００立方ｍｍに達したら、それらを５群に無作為化した。各群は９匹の動物を有した。腫瘍がこの腫瘍容積に達したら、それらに、毎日１０または５０ｍｇ／ｋｇで、ビヒクル、ビカルタミドまたはＮＣ５３を経口投与した。各腫瘍を、カリパスを使用して幅、長さおよび深さの３次元で測定した。 腫瘍サイズの実験結果を示す図である。１８日目の処置の最終投与の３時間後、動物を光学ＣＣＤカメラによって画像化した。光子／秒単位でルシフェラーゼ活性を測定するために、ＲＯＩを腫瘍上で描画した。右のパネルは、ＲＯＩ測定の表示である。 静脈内（上側の曲線）および経口投与（下側の曲線）からのＮＣ５３の薬物動態曲線を示すグラフである。 ラットのアンドロゲン受容体へのいくつかの化合物の結合親和性を反映する、濃度の対数の関数としての蛍光吸光度のグラフである。 ＣａｓｏｄｅｘまたはＮＣ５３を添加するときの、ＰＳＡエンハンサーおよびＰＳＡプロモーターへのアンドロゲン受容体およびＲＮＡポリメラーゼＩＩの複合体形成状態を反映する像を示す図である。 Ｃａｓｏｄｅｘの存在下であるが、ＮＣ５３の不在下で、アンドロゲン受容体が核内に移行することを反映する像を示す図である。 Ｃａｓｏｄｅｘの存在下であるが、ＮＣ５３の不在下で、アンドロゲン受容体が核内に移行することを反映する像を示す図である。 アンドロゲン受容体タンパク質がＮＣ５３の存在下で分解することを反映する像を示す図である。 種々の化合物で治療した後の前立腺重量を示すチャートである。バーのラベルによって示されるように、体重ｋｇ当たり１０、２５、または５０ｍｇの化合物を毎日投与した。各化合物を、正常なＦＶＢマウスに投与した。１４日間化合物で治療した後、尿生殖路重量を、セミベシクル（ｓｅｍｉ−ｖｅｓｉｃｌｅ）、前立腺、および膀胱を取り出し量ることによって決定した。チャート中のバーにより示されるデータを得るために、所与化合物を３匹のマウスに投与した。一組のマウスを、化合物を使用して治療しなかった：「未治療」とラベルしたバーにデータを示す。別の組のマウスをビヒクル溶液のみで治療した：「ビヒクル」とラベルしたバーにデータを示す。 図６に示される実験プロトコルと共に行われるＰＳＡアッセイを示すグラフである。 腫瘍容積に対するＮＣ５３の種々の投与計画の効果を示すグラフである。 一日あたり０．１、１、および１０ｍｇ／体重ｋｇの用量でＮＣ５３を使用する治療の後ならびにＮＣ５３を使用する治療のない治療の後の、０日目でのルシフェラーゼ活性と関連する光子放出比率に対する、１７日目での該比率を示すグラフである。 ＳＣＩＤマウスにＬＮ−ＡＲ（ＨＲ）細胞系を注射することにより腫瘍成長を誘導した実験の結果を示す図である。一組のマウスを、一日あたり１０ｍｇ／体重ｋｇの用量で化合物ＮＣ５３を使用して治療した。他の組のマウスを、ビヒクル溶液のみで処置した。（Ａ）各組のマウスの場合に示される時間の関数としての相対腫瘍容積。（Ｂ）色の輪郭として示される３１日目でのルシフェラーゼ活性と関連する光子放出による各組のマウスの像。（Ｃ）各組のマウスについての、いくらかの倍数で示されるルシフェラーゼ活性と関連する光子放出比率。 種々の濃度のＮＣ５３、ＮＣ５４、ＮＣ５５、およびＮＣ５７ならびにビヒクル溶液を使用して処理したＬＮ−ＡＲ細胞と関連するＰＳＡ吸光度を示すグラフである。 種々の濃度のＮＣ７、ＮＣ４８、ＮＣ５３、ビカルタミド、およびＤＭＳＯを使用して処理したＬＮ−ＣａＰ細胞と関連するＰＳＡ吸光度を示すグラフである。 野生型非遺伝子組み換えマウス（ＷＴ）、去勢ルシフェラーゼ遺伝子組み換えマウス（Ｃａｓｔ）、および非去勢ルシフェラーゼ遺伝子組み換えマウス（無傷）を使用して行われた実験の結果を示す図である。９０日間の放出期間で体重キログラム当たり１２．５ｍｇを生ずる移植テストステロンペレットを使用して治療した去勢ルシフェラーゼ遺伝子組み換えマウス（Ｔ／Ｃａｓｔ）についてのデータを示し、９０日間の放出期間で体重キログラム当たり１２．５ｍｇを生ずる移植テストステロンペレットを使用して治療した非去勢ルシフェラーゼ組み換えマウス（無傷＋Ｔ）についてのデータを示す。一日あたり１０ｍｇ／体重ｋｇで移植テストステロンペレットおよびビカルタミド（ＢＩＣ＋Ｔ／Ｃａｓｔ）またはＮＣ５３（ＮＣ５３＋Ｔ／Ｃａｓｔ）を使用して処置した去勢ルシフェラーゼ遺伝子組み換えマウスについてのデータを示す。（Ａ）１４日目での尿生殖路重量。（Ｂ）１４日目の光子放出速度。全ての場合で、ホルモン抵抗性疾患状態は誘導されなかった。 種々の用量のいくつかの化合物を使用して処理した後のＬＮ−ＡＲ細胞について測定したＰＳＡ吸光度を示すグラフである。 各化合物のいくつかの特性を与える表を示す。図１５は、時間の関数としての化合物血清濃度の点から見た、いくつかの化合物の薬物動態特性を与えるグラフも示す。 １２５ｎｍｏｌ〜１０００ｎｍｏｌの範囲の濃度で投与される種々の化合物を使用して投与されたＬ１ＡＲ細胞系のルシフェラーゼ活性のグラフである。

Claims (14)

1. 式
   

   

   （式中、Ｒ_１およびＲ_２はそれらが結合している炭素と一緒になった４〜５個の炭素原子を有するシクロアルキル基であり、
   Ｒ_３は、ジメチルカルバモイルアルキル、およびシアノアルキルからなる群より選択され、
   Ｒ_４は、水素またはフッ素である）
   を有する化合物。
2. 式
   

   

   （式中、Ｒ_１およびＲ_２はそれらが結合している炭素と一緒になった４〜５個の炭素原子を有するシクロアルキルであり、
   Ｒ_３は、ジメチルブタンアミド、およびシアノプロピルからなる群より選択され、
   Ｒ_４は、水素またはフッ素である）
   を有する、請求項１に記載の化合物。
3. 式
   

   

   （式中、Ｒ_１およびＲ_２はそれらが結合している炭素と一緒になった４個の炭素原子を有するシクロアルキルであり、
   Ｒ_３は、ジメチルカルバモイルアルキル、およびシアノアルキルからなる群より選択され、
   Ｒ_４は、水素である）
   を有する、請求項１に記載の化合物。
4. 式
   

   

   （式中、Ｒ_１およびＲ_２はそれらが結合している炭素と一緒になった４個の炭素原子を有するシクロアルキルであり、
   Ｒ_３は、ジメチルブタンアミド、およびシアノプロピルからなる群より選択され、
   Ｒ_４は、水素である）
   を有する、請求項１に記載の化合物。
5. 式
   

   

   または
   

   

   を有する、請求項１に記載の化合物。
6. 治療有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物または医薬として許容可能
   なその塩と、医薬として許容可能な担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
7. 過剰増殖性障害を治療するための方法、または前立腺癌を治療するための方法において使用するための請求項６に記載の医薬組成物。
8. （ａ）前記組成物が、溶液、分散液、懸濁液、粉末、カプセル、錠剤、丸剤、徐放性カプセル、徐放性錠剤、および徐放性丸剤からなる群より選択される形態を有する、あるいは、
   （ｂ）前記組成物が、カプセル、錠剤、および丸剤からなる群より選択される形態を有する、あるいは、
   （ｃ）前記組成物が、静脈内注射により投与されるか、組織中への注射により投与されるか、腹腔内投与されるか、経口投与されるか、または経鼻投与される、あるいは、
   （ｄ）前記組成物が、一日あたり０．００１ｍｇ／体重ｋｇ〜一日あたり１００ｍｇ／体重ｋｇの範囲内にある前記化合物の投与量で投与される、あるいは、
   （ｅ）前記組成物が、一日あたり０．０１ｍｇ／体重ｋｇ〜一日あたり１００ｍｇ／体重ｋｇの範囲内にある前記化合物の投与量で投与される、あるいは、
   （ｆ）前記組成物が、一日あたり０．１ｍｇ／体重ｋｇ〜一日あたり１０ｍｇ／体重ｋｇの範囲内にある前記化合物の投与量で投与される、あるいは、
   （ｇ）前記組成物が、一日あたり１ｍｇ／体重ｋｇの前記化合物の投与量で投与される、あるいは、
   （ｈ）前記組成物が前立腺特異抗原ｍＲＮＡの転写を妨げる、あるいは、
   （ｉ）前記組成物がアンドロゲン受容体タンパク質の核移行を防止する、あるいは、
   （ｊ）前記組成物がアンドロゲン受容体タンパク質を不安定化する、
   請求項７に記載の組成物。
9. 式
   

   

   のジアリール化合物の合成方法であって、
   化合物Ｉ
   

   

   と化合物ＩＩ
   

   

   とを第１の極性溶媒中で混合して、混合物を形成する工程と、
   該混合物を加熱する工程と、
   第１の極性溶媒と同じかまたはそれとは異なる第２の極性溶媒および水性酸を該混合物に添加する工程と、
   該混合物を還流する工程と、
   該混合物を冷却し、水と合わせる工程と、
   該混合物から該ジアリール化合物を分離する工程と、
   を含み、
   ここで、Ｒ_５１は、１〜２個の炭素原子を有するアルキル鎖を含み、Ｒ_５２は、シアノアルキル、およびジメチルカルバモイル置換アルキルからなる群より選択され、Ｒ_５３は、ＦおよびＨからなる群より選択される、
   方法。
10. Ｒ_５１が、１〜２個の炭素原子を有するアルキル鎖を含み、Ｒ_５２が、シアノプロピル、およびジメチルブタンアミドからなる群より選択され、Ｒ_５３がＦおよびＨからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
11. 化合物［ＮＣ５６］の合成方法であって、
    

    

    
    Ｎ，Ｎ−ジメチル４−［４−（１−シアノシクロブチルアミノ）フェニル］ブタンアミド、４−イソチオシアナト−２−トリフルオロメチルベンゾニトリル、およびＤＭＦを混合し、還流下で加熱することにより第１の混合物を形成する工程と、
    アルコールおよび酸を該第１の混合物に添加して、第２の混合物を形成する工程と、
    該第２の混合物を還流する工程と、
    該第２の混合物を冷却する工程と、
    該第２の混合物を水と合わせ、有機層を抽出する工程と、
    該化合物を該有機層から単離する工程と
    を含む、方法。
12. 化合物［ＮＣ５７］の合成方法であって、
    

    

    
    ＤＭＳＯ、ジクロロメタン、および塩化オキサリルを混合して、第１の混合物を形成する工程と、
    ４−（４−（７−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−８−オキソ−６−チオキソ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−５−イル）フェニル）ブタンアミドを該第１の混合物に添加して、第２の混合物を形成する工程と、
    トリエチルアミンを該第２の混合物に添加することにより第３の混合物を形成する工程と、
    該第３の混合物を温め、ＮＨ _４ Ｃｌ水溶液でクエンチすることにより第４の混合物を形成する工程と、
    該第４の混合物から有機層を抽出する工程と、
    該化合物を該有機層から単離する工程と
    を含む、方法。
13. 前立腺特異抗原を発現し得る哺乳類細胞と十分な量のジアリールチオヒダントイン化合物とを接触させ、前立腺特異抗原ｍＲＮＡの転写を妨げることを含むインビトロでの方法であって、該ジアリールチオヒダントイン化合物は、
    式
    

    

    
    （式中、Ｒ _１ およびＲ _２ はそれらが結合している炭素と一緒になった４〜５個の炭素原子を有するシクロアルキル基であり、
    Ｒ _３ は、ジメチルカルバモイルアルキル、およびシアノアルキルからなる群より選択され、
    Ｒ _４ は、水素またはフッ素である）
    を有するか、または
    該ジアリールチオヒダントイン化合物は、以下：
    式
    

    

    
    および
    

    

    
    からなる群より選択される、方法。
14. 哺乳類細胞と十分な量のジアリールチオヒダントイン化合物とを接触させ、アンドロゲン受容体タンパク質の核移行を防止しかつ／またはアンドロゲン受容体タンパク質を不安定化することを含むインビトロでの方法であって、該ジアリールチオヒダントイン化合物は、
    式
    

    

    
    （式中、Ｒ _１ およびＲ _２ はそれらが結合している炭素と一緒になった４〜５個の炭素原子を有するシクロアルキル基であり、
    Ｒ _３ は、ジメチルカルバモイルアルキル、およびシアノアルキルからなる群より選択され、
    Ｒ _４ は、水素またはフッ素である）
    を有するか、または
    該ジアリールチオヒダントイン化合物は、以下：
    式
    

    

    
    および
    

    

    
    からなる群より選択される、方法。

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