KR20150120382A

KR20150120382A - 바이러스 감염의 치료를 위한 2-아미노피리미딘 유도체

Info

Publication number: KR20150120382A
Application number: KR1020157022968A
Authority: KR
Inventors: 고완 데이비드 크레이그 맥; 피에르 쟝-마리 베르나르 라보이송; 팀 휴고 마리아 욘커스
Original assignee: 얀센 사이언시즈 아일랜드 유씨
Priority date: 2013-02-21
Filing date: 2014-02-20
Publication date: 2015-10-27
Also published as: AU2014220717B2; MX367915B; WO2014128189A1; JP6404835B2; ES2733361T3; CA2897587A1; IL239859A0; US10259793B2; US20150376140A1; US20190308940A1; US20170342035A1; EP2958900A1; AU2018204422A1; NZ750323A; HK1213569A1; MY191389A; US10647684B2; DK2958900T3; JP2016509041A; UA118751C2

Abstract

본 발명은 2-아미노피리미딘 유도체, 그 제조 방법, 약학적 조성물 및 바이러스 감염의 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

바이러스 감염의 치료를 위한 2-아미노피리미딘 유도체{2-AMINOPYRIMIDINE DERIVATIVES FOR THE TREATMENT OF VIRAL INFECTIONS}

본 발명은 2-아미노피리미딘 유도체, 그 제조 방법, 약제학적 조성물 및 바이러스 감염 치료에서의 사용에 관한 것이다.

본 발명은 톨-유사 수용체(TLRs)의 조절 또는 작용이 관여하는 바이러스 감염, 면역 또는 염증 질환의 치료에서의 2-아미노피리미딘 유도체의 사용에 관한 것이다.

톨-유사 수용체는 세포외 루이신 풍부 도메인 및 보존 영역을 포함하는 세포질 확장을 특징으로 하는 1차 경막 단백질이다. 선천성 면역시스템은 특정 타입의 면역 세포의 세포 표면상에 발현된 이들 톨-유사 수용체들을 통해 병원체-관련 분자 패턴을 인식할 수 있다. 외래 병원체의 인식은 사이토킨의 생성 및 식세포상의 공-자극 분자의 상향 조절을 활성화한다. 이는 T 세포 행동의 조절을 이끈다.

대부분의 포유류 종은 10 내지 15개 타입의 톨-유사 수용체를 갖고 있는 것으로 추정되고 있다. 13개의 TLR들(간단히, TLR1 내지 TLR13로 명명)이 인간 및 마우스에서 확인되었으며, 이들 다수의 등가 형태가 다른 포유류 종에서 발견되었다. 그러나 인간에서 발견된 특정 TLR의 등가물들이 모든 포유류에 존재하는 것은 아니다. 예를 들면, 인간에서 TLR10과 유사한 단백질을 코딩하는 유전자가 마우스에 존재하지만, 레트로바이러스에 의해 과거 어떤 시점에서 손상된 것으로 보인다. 한편, 마우스는 TLR 11, 12 및 13을 발현하나, 이들 중 어떤 것도 인간에서는 나타나지 않는다. 다른 포유류는 인간에서 발견되지 않는 TLR들을 발현할 수 있다. 다른 비-포유류 종은, 타키푸구 복어에서 발견되는 TLR14에 의해 입증되는 바와 같이, 포유류와 다른 TLR들을 가질 수 있다. 이는 인간의 선천성 면역의 모델로서 실험 동물을 사용하는 과정을 복잡하게 할 수 있다.

TLR에 관한 리뷰는 하기 학술지 논문을 참조. Hoffmann, J.A., Nature, 426, p33-38, 2003; Akira, S., Takeda, K., and Kaisho, T., Annual Rev. Immunology, 21, p335-376, 2003; Ulevitch, R. J., Nature Reviews: Immunology, 4, p512-520, 2004.

WO 2006/117670에서의 퓨린 유도체, WO 98/01448 및 WO 99/28321에서의 아데닌 유도체 및 WO 2009/067081에서 피리미딘들과 같은 톨-유사 수용체에 대해 활성을 나타내는 화합물이 이전에 기술된 바 있다.

그러나, 선행기술의 화합물에 비해 바람직한 선택성, 더 높은 역가, 더 높은 대사 안정성 및 개선된 안전성 프로파일을 갖는 신규한 톨-유사 수용체 조절제에 대한 강한 요구가 존재한다.

본 발명에 따르면, 화학식 (1)의 화합물, 그 약제학적으로 허용가능한 염, 토토머(들), 입체이성체 형태, 용매화물 또는 다형이 제공되되,

X는 S, S=O 또는 O=S=O를 나타내고,

R₁은 수소, (C_1-6)-알킬, (C_1-6)-알콕시 또는 아릴이고,

R₂는 (C_1-3)-알킬 또는 (C_3-6)-사이클로알킬이고,

n = 1 또는 2이다.

화학식 (I)의 화합물 및 그 약제학적으로 허용가능한 염, 토토머, 입체이성체 형태, 용매화물 또는 다형은 의약품으로서, 특히 톨-유사 수용체(특히 TLR7 및/또는 TLR8 활성)의 조절제로서의 활성을 갖는다.

추가 측면에서 본 발명은 화학식 (I) 화합물, 또는 그 약제학적으로 허용 가능한 염, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께, 토토머, 입체이성체 형태, 용매화물 또는 다형을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명에 따른 화학식 (I) 화합물, 또는 그 약제학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 토토머, 입체이성체 형태, 또는 다형 또는 상기 화학식 (I) 화합물, 또는 그 약제학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 토토머, 입체이성체 형태, 또는 다형을 포함하는 약제학적 조성물은 약제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 화학식 (I) 화합물, 또는 그 약제학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 토토머, 입체이성체 형태, 또는 다형 또는 상기 화학식 (I) 화합물, 또는 그 약제학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 토토머, 입체이성체 형태, 또는 다형을 포함하는 약제학적 조성물을 TLR들, 더욱 구체적으로, TLR7 및/또는 TLR8이 조절되는 임의의 질병의 치료에 사용할 수 있다는 것이다.

용어 "(C_1-6)-알킬" 또는 "(C_1-3)-알킬"은 특정 수의 탄소원자를 함유하는 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 포화 지방족 탄화수소를 지칭한다.

용어 "아릴"은 N, O 및 S, 특히 N 및 O로부터 선택된 하나 또는 2개의 헤테로원자를 선택적으로 포함하는 방향족 고리 구조를 의미한다. 상기 방향족 고리 구조는 4, 5, 6 또는 7개의 고리 원자를 가질 수 있다. 특히, 상기 방향족 고리 구조는 5 또는 6개의 고리 원자를 가질 수 있다.

용어 "(C_1-6)-알콕시는 예를 들어 메톡시기 또는 에톡시기와 같이 산소에 단일 결합된 알킬(탄소 및 수소 사슬)기를 지칭한다.

용어 "(C_3-6)-사이클로알킬"은 특정한 수의 탄소 원자를 함유하는 탄소환 고리를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 단지 실선으로 표시된 결합을 가지며 실선 웨지드 또는 해시 웨지드 결합을 갖지 않은 임의의 화학식은, 하나 이상의 원자 주변에 특정 배열(예, R, S)을 갖는 것으로 특별히 지시되지 않는 한, 각 가능한 입체이성체 또는 두개 이상의 입체이성체의 혼합물을 나타내는 것이다.

용어 "입체이성체", "입체이성체 형태" 또는 "입체화학적 이성체 형태"는 이상 또는 이하에서 상호 호환적으로 사용된다.

본 발명은 본 발명의 화합물의 모든 입체이성체를 순수한 입체이성체로서 또는 두개 이상의 입체이성체의 혼합물로서 포함한다.

거울상이성체는 서로 포개질 수 없는 거울상(non-superimposable mirror image)들인 입체이성체들이다. 한 쌍의 거울상이성체들의 1:1 혼합물이 라세미체 또는 라세미 혼합물이다.

디아스테레오머(또는 부분입체이성체)들은 거울상이성체들이 아닌 입체이성체들이며, 즉 이들은 거울상들로 관련되지 않는다. 만약 화합물이 이중 결합을 함유하는 경우, 치환체들은 E 또는 Z 배치일 수 있다. 만약 화합물이 최소한 이치환된 비-방향족 사이클기를 함유하는 경우, 이들 치환체는 시스 또는 트랜스 배치일 수 있다.

따라서, 본 발명은 화학적으로 가능할 때는 언제든지, 거울상이성체, 디아스테레오머, 라세미체, E 이성체, Z 이성체, 시스 이성체, 트랜스 이성체 및 이들의 혼합물을 포함한다.

이들 모든 용어, 즉, 거울상이성체, 디아스테레오머, 라세미체, E 이성체, Z 이성체, 시스 이성체, 트랜스 이성체 및 이들의 혼합물들의 의미는 당업자에게 알려진 것이다.

절대 배치는 칸-인골드-프렐로그 시스템(Cahn-Ingold-Prelog system)에 따라 규정된다. 비대칭 원자에서의 배치는 R 또는 S로 규정된다. 절대 배치가 알려져 있지 않은 분할된 입체이성질체는 이들이 평면 편광을 회전하는 방향에 따라 (+) 또는 (-)로 규정될 수 있다. 예를 들어, 절대 배치가 알려져 있지 않은 분할된 거울상이성체는 이들이 평면 편광을 회전하는 방향에 따라 (+) 또는 (-)로 규정될 수 있다.

특정 입체이성체가 확인될 때, 이는 상기 입체이성체에 다른 입체이성체들이 실질적으로 없음을, 즉 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더 바람직하게는 10% 미만, 더욱더 바람직하게는 5% 미만, 특히 2% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만으로 관련됨을 의미한다. 따라서, 화학식 (I)의 화합물이, 예를 들어 (R)로 규정될 때, 이는 이 화합물에 (S) 이성체가 실질적으로 없음을 의미하며; 화학식 (I)의 화합물이, 예를 들어 E로 규정될 때, 이는 이 화합물에 Z 이성체가 실질적으로 없음을 의미하며; 화학식 (I)의 화합물이, 예를 들어 시스로 규정될 때, 이는 이 화합물에 트랜스 이성체가 실질적으로 없음을 의미한다.

화학식 (I)의 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염은 이들의 산부가염 및 염기염을 포함한다. 적당한 산부가염은 비-독성염을 형성하는 산으로부터 형성된다. 적당한 염기염은 비-독성 염을 형성하는 염기로부터 형성된다.

본 발명의 화합물은 또한 비용매화 및 용매화 형태로 존재할 수 있다. 용어 "용매화물"은 본원에 본 발명의 화합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 용매 분자, 예를 들면, 에탄올을 포함하는 분자 복합체를 기술하기 위해 사용된다.

용어 "다형"은 둘 이상의 형태 또는 결정 구조로 존재하는 본 발명의 화합물의 능력을 지칭한다.

본 발명의 화합물은 결정형 또는 무정형 산물로 투여될 수 있다. 이들은 예를 들면 침전, 결정화, 동결 건조, 분무 건조 또는 증발 건조와 같은 방법에 의해 예컨대 고체 플러그, 분말 또는 필름으로서 수득될 수 있다. 이들은 단독으로 또는 본 발명의 하나 이상의 다른 화합물과 조합하여 또는 하나 이상의 다른 약물과 조합하여 투여될 수 있다. 일반적으로 이들은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 제제로서 투여될 것이다. 용어 "부형제"는 본 발명에서 본 발명의 화합물 이외의 임의의 성분을 기술하기 위해 사용된다. 부형제의 선택은 주로 특정 투여 모드, 용해도 및 안정성에 대한 부형제의 효과 및 제형의 성질과 같은 인자에 의존한다.

본 발명의 화합물 또는 이들의 임의의 하위그룹은 투여 목적에 따라 다양한 약제학적 형태로 제제화될 수 있다. 적합한 조성물로서 전신 투여 약물에 통상적으로 채용되는 모든 조성물이 인용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물을 제조하기 위하여, 유효량의 특정 화합물, 선택적으로 염 형태를 활성성분으로서 약제학적으로 허용가능한 담체와 친밀한 혼합에 의해 합하고, 이때 담체는 투여에 바람직한 제제 형태에 따라 다양한 형태를 가질 수 있다. 이들 약제학적 조성물은 바람직하게 예를 들면, 경구, 직장 또는 경피 투여에 적합한 단일 제형으로 존재한다. 예를 들면, 경구 제형의 조성물을 제조하는데 임의의 통상적인 약제학적 매질이 채용될 수 있으며, 현탁액, 시럽, 엘릭실, 에멀젼 및 용액과 같은 경구 액체 제제의 경우에는 예를 들면, 물, 글리콜, 오일, 알콜 등; 분말, 필, 캡슐 및 정제의 경우에는 전분, 슈가, 카올린, 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제 등과 같은 고체 담체를 채용할 수 있다. 투여의 편의성 때문에, 정제 및 캡슐제는 가장 유용한 경구 복용 단위 형태를 대표하며, 이 경우 고체 약제학적 담체가 자명하게 채용된다. 또한 사용 직전 액체 형태로 전환될 수 있는 고체 형태 제제도 포함된다. 경피 투여에 적합한 조성물에서 담체는 선택적으로 투과 증강제 및/또는 적당한 습윤제를 포함하며, 선택적으로 피부에 상당한 유해효과를 일으키지 않는 적합한 임의의 성질의 첨가제를 부차적 비율로 조합할 수 있다. 상기 첨가제는 피부 투여를 촉진하며/하거나 원하는 조성물을 제조하는데 도움이 될 수 있다. 이들 조성물은 다양한 방식, 예컨대 경피 패치, 스폿-온, 연고로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 흡입 또는 통기를 통해 이러한 방식으로 투여하기 위해 당업계에 사용되는 방법 및 제형으로 투여될 수 있다. 따라서, 일반적으로 본 발명의 화합물은 용액, 현탁액 또는 건조 분말의 형태로 폐에 투여될 수 있다.

투여 편의성 및 용량 균일성을 위해 전술한 약제학적 조성물을 단위 제형으로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 발명에서 단위 제형은 요구되는 약제학적 담체와 함께 바람직한 치료학적 효과를 산출하도록 계산된 예정된 양의 활성 성분을 포함하는 단위로, 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 구별되는 단위들을 지칭한다. 이러한 단위 제형의 예는 정제(분할선이 있는 정제 또는 코팅된 정제를 포함), 캡슐, 필, 분말 패킷, 웨이퍼, 좌제, 주사 가능한 용액 또는 현탁액 등 및 이들의 분리된 배수들이다.

감염 질환의 치료분야의 당업자는 후술하는 검사 결과로부터 유효량을 결정할 수 있다. 일반적으로 유효 일일량은 0.01 mg/체중 kg 내지 50　mg/체중 kg, 더 바람직하게 0.1 mg/체중 kg 내지 10 mg/체중 kg으로 사료된다. 요구되는 용량을 하루에 걸쳐 적합한 간격으로 둘, 셋, 넷 이상의 하위-용량으로 투여하는 것이 적합할 수 있다. 상기 하위-용량은 예컨대 단위 제형당 1 내지 1000 mg, 및 특히 5 내지 200　mg의 활성성분을 포함하는 단위 제형으로서 제형화될 수 있다.

정확한 용량과 투여빈도는 당업자에 알려져 있는 바와 같이, 사용되는 특정 화학식 (I)의 화합물, 치료될 특정 병태, 치료될 병태의 심각도, 특정 환자의 나이, 체중 및 일반적인 신체적 상태 및 각자가 복용하고 있는 다른 약물에 좌우된다. 나아가, 치료되는 대상의 반응 및/또는 본 발명의 화합물을 처방하는 의사의 평가에 의존하여 유효량이 감소되거나 증가될 수 있음은 명백하다. 전술한 유효량 범위는 단지 가이드라인이며 본 발명의 범위나 사용을 임의의 정도로 제한하지 않는다.

화학식 (I)의 화합물의 제조

전체적 계획. 화합물 A를 WO2008147697 및 WO2009067081에 기술된 절차에 따라 제조하였다.

실험 섹션

트리에틸아민(10.5 g, 103.75 mmol, 2.4 eq.)을 0℃에서 CH₂Cl₂(200 mL) 중 A의 용액(10 g, 43.23 mmol, 1 eq.)에 첨가하였다. 메탄설포닐 클로라이드(6.4 g, 55.87 mmol, 1.3 eq.)를 용액에 적가하고, 0℃에서 1 .5 시간 동안 교반하였다. CH₂Cl₂(500 mL)을 첨가하였다. 용액을 NaHCO₃ 수용액, 염수로 세척하고, Na₂SO₄로 건조하였고, 고체를 여과로 제거하였고, 여과물의 용매를 감압 하에 제거하여 B를 제공하였다. 추가 정제 없이 다음과 같이 사용하였다.

DMF(60 mL) 중 소디윰 티오메톡사이드(4.08 g, 58.17 mmol, 1.5 eq.) 및 B(12 g, 38.782 mmol, 1 eq.)의 혼합물을 70℃에서 밤새 교반하였다. 고체를 여과로 제거하였고, 여과물의 용매를 감압 하에 제거하였다. 미정제물(crude)을 에틸 아세테이트에 용해하고, 물, 염수로 세척하고, Na₂SO₄로 건조하였고, 고체를 여과로 제거하였고, 여과물의 용매를 감압 하에 제거하였다. 미정제물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리제: 40/1 내지 3/1의 페트롤륨 에테르/에틸 아세테이트)로 정제하여 C를 제공하였다.

¹H NMR (400 MHz, 클로로폼-d) δ ppm 0.70 - 0.85 (m, 5 H), 1.15 - 1.49 (m, 13 H), 1.49 - 1.61 (m, 1 H), 1.61 - 1.80 (m, 1 H), 2.05 (s, 3 H), 2.38 - 2.50 (m, 2 H), 3.51 (br. s., 1 H), 4.25 (br. s., 1 H)

CH₂Cl₂ 중 C(4.9 g, 18.74 mmol, 1 eq.)의 교반된 용액에 HCl/디옥산(47 mL, 187.43 mmol, 10 eq.)을 0℃에서 적가하고, 25℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 용액을 감압 하에 농축하여 D를 제공하였다. 다음 단계에서 다음과 같이 사용되었다.

에탄올(20 mL) 내에서 D(0.75 g, 3.79 mmol, 1 eq.), 2-아미노-4-클로로-5-메톡시피리미딘(0.908 g, 5.69 mmol, 1.5 eq.) 및 K₂CO₃(1.57 g 11.38 mmol, 3 eq.)를 혼합하였다. 혼합물을 30 분 간 120℃ 전자레인지 내에서 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 미정제물을 분취 실리카 박막 크로마토그래피(용리제: CH₂Cl₂: CH₃OH = 20:1)로 정제하여 E를 제공하였다.

¹H NMR (400 MHz, 클로로폼-d) δ ppm 1.05 - 1.15 (m, 3 H), 1.40 - 1.60 (m, 4 H), 1.95 (m, 2H), 2.15 (m, 1 H), 2.30 (d, 3 H), 2.70 (t, 1 H), 2.90 (t, 1 H), 3.55 (m, 1 H), 4.50 (m, 1 H), 3.95 (s, 3 H), 6.20 (d, 1H), 6.60 (br. s., 2 H), 7.45 (s, 1 H)

DMF(100 mL) 및 물(100 mL) 중 E(1.45 g, 3.773 mmol, 1 eq.)의 용액에 옥손(6.959 g, 11.32 mmol, 3 eq.)을 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 12 시간 동안 교반하였다. 고체를 여과로 제거하였고, 여과물을 포화 Na₂CO₃ 수용액으로 pH=8까지 염기화하였다. 얻어진 혼합물을 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 분취 고성능 액체 크로마토그래피(컬럼: gemini 150 x 30 mm x 5 μm, C18, 이동상: CH₃CN/물(0.05% HCl), 구배: 2~32% CH₃CN, 0~8 분, 유속: 30 mL/분)로 정제하였다. 가장 좋은 분획들을 합치고, 감압 하에 농축하여 1을 제공하였다.

LC-MS 3.88 분

¹H NMR (400 MHz, 메탄올-d ₄) δ ppm 0.92 (t, J=6.9 Hz, 3 H), 1.21 - 1.50 (m, 4 H), 1.69 (q, J=7.1 Hz, 2 H), 1.95 - 2.28 (m, 2 H), 2.98 (s, 3 H), 3.09 - 3.22 (m, 2 H), 3.87 (s, 3 H), 4.37 - 4.55 (m, 1 H), 7.26 (s, 1 H) 불안정한 양성자는 관찰되지 않음.

에탄올(40 mL) 중 E(40 mg, 0.14 mmol, 1 eq.)의 용액을 물(10 mL) 중 NaIO₄(0.2 g, 1 mmol, 7.5 eq.)의 용액으로 처리한 다음, 상온에서 밤새 교반하였다. 용액을 진공 하에 농축하였다. 잔류물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 모아진 유기층을 염수로 세척하고, Na₂SO₄로 건조하였고, 고체는 여과를 통해 제거하였고, 여과물의 용매를 감압 하에 제거하였다. 미정제물을 분취 고성능 액체 크로마토그래피(C18 컬럼, 용리제: 3/97 내지 33/67 CH₃CN, H₂O, 0.05% HCl)로 정제하였다. 원하는 분획들을 수집하고, 진공 하에 농축하여 2를 제공하였다.

LC-MS 3.78 분

¹H NMR (400 MHz, 메탄올-d ₄) δ ppm 0.90 (t, J=6.8 Hz, 3 H), 1.19 - 1.49 (m, 4 H), 1.67 (d, J=6.5 Hz, 2 H), 1.91 - 2.15 (m, 2 H), 2.63 (br. s., 3 H), 2.69 - 2.96 (m, 2 H), 3.85 (s, 3 H), 4.46 (br. s., 1 H), 7.25 (s, 1 H) 불안정한 양성자는 관찰되지 않음.

LC-MS 분석 방법

화학식 (I) 화합물의 생물학적 활성

생물학적 어세이의 기술

TLR7 및 TLR8 활성 평가

화합물의 인간 TLR7 및/또는 TLR8을 활성화시키는 능력을 TLR7 또는 TLR8 발현 벡터 및 NFκВ-luc리포터 구축체로 일시적으로 트랜스펙션된 HEK293 세포를 사용하여 세포 리포터 어세이에서 평가하였다.

간략하게, HEK293 세포를 배양 매질(10% FCS 및 2 mM 글루타민으로 보충한 DMEM)에서 성장시켰다. 15 cm 접시에서 세포를 트랜스펙션하기 위해, 세포를 트립신-EDTA로 분리시키고, CMV-TLR7 또는 TLR8 플라즈미드(1700 ng), NFκВ-luc 플라즈미드(850 ng) 및 트랜스펙션 시약의 믹스로 트랜스펙션하고, 습윤한 5% CO₂ 대기에서 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이후 트랜스펙션된 세포를 PBS에서 세척하고, 트립신-EDTA로 분리시키고 매질 내 1.25 x 10⁵ 세포 /mL의 밀도로 재현탁하였다. 이후 100% DMSO 내 화합물 200 nL가 이미 존재하는 384-웰 플레이트의 각 웰에 40 마이크로리터의 세포를 분배하였다. 그 후 37℃, 5% CO₂에서 6시간 인큐베이션하고,15 μL의 스테디 라이트 플러스 기질(Perkin Elmer)을 각 웰에 가하고 ViewLux ultraHTS 마이크로플레이트 이마저(Perkin Elmer) 상에서 판독하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 사중으로 수행된 측정으로부터 용량 반응 곡선을 생성하였다. 각 화합물에 대해 최저효과농도(LEC)값을 결정하였으며, LEC는 시험 표준편차의 적어도 두 배 위의 효과를 유발하는 농도로 정의된다.

병행하여, 화합물 독성은 384-웰 플레이트에서 유사한 일련의 화합물 희석액을 웰당 40 μL의 CMV-TLR7 구조체 단독(1.25 x 10⁵ 세포/mL)으로 트랜스팩션된 세포와 함께 사용하여 측정하였다. 세포 생육성은 웰당 15 μL의 ATP 라이트(Perkin Elmer)를 추가하고, 37℃, 5% CO₂에서 6시간 인큐베이션한 후 ViewLux ultraHTS 마이크로플레이트 이마저(Perkin Elmer)로 판독하여 측정하였다. 데이터는 CC₅₀로 나타내었다.

병행하여, 유사한 일련의 화합물 희석액(100% DMSO 내 200 nL의 화합물)을 웰당 40 μL의 NFκB-luc 리포터 구조체 단독(1.25 x 10⁵ cells/mL)으로 트랜스팩션된 세포와 함께 사용하였다. 37℃, 5% CO₂에서 6 시간 인큐베이션후, 15 μl의 Steady Lite Plus 기질(Perkin Elmer)을 각 웰에 가하여 루시퍼라제 활성을 측정하고, 판독은 ViewLux ultraHTS 마이크로플레이트 이마저(Perkin Elmer)상에서 수행하였다. 카운터스크린 데이터를 LEC로서 보고하였다.

ISRE 프로모터 요소의 활성화

화합물의 IFN-I 유도 잠재성도 평가되었으며, 이는 PBMC로부터의 조절된 매질에 의해 인터페론-자극 반응성 요소(ISRE)의 활성화를 측정하여 평가되었다. ISRE 요소의 서열 GAAACTGAAACT는 IFN-I 가 그 수용체 IFNAR (Clontech, PT3372-5W)에 결합시 활성화된 STAT1-STAT2-IRF9 전사 인자에 매우 반응성이 높다. 플라즈미드 pISRE-Luc(Clontech사 (ref. 631913))는 ISRE 요소 5 카피, 이어 개똥벌레 루시퍼라제 ORF를 함유한다. pISRE-Luc(HEK-ISREluc)가 안정하게 트랜스펙션된 HEK293 세포주는 조절된 PBMC 세포 배양 매질 프로파일을 수립하였다.

간략하게, 표준 피콜 원심분리 프로토콜을 사용하여 적어도 두 공여자의 버피코트로부터 PBMC를 제조하였다. 분리된 PBMC를 10% 인간 AB 혈청으로 보충된 RPMI 배지에 재현탁하고, 2 x 10⁵ 세포/웰을 화합물(70 μL 총부피)을 함유하는 384-웰 플레이트에 배분하였다. 밤새 인큐베이션 후, 30 μL내 5 x 10³ HEK-ISR Eluc 세포/웰을 함유하는 384-웰 플레이트(하루전 플레이트됨)에 상등액 10 μL를 이송하였다. 이어서 24 시간 동안 인큐베이션하고, 40 μL/웰 Steady Lite Plus 기질(Perkin Elmer)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 어세이함으로써 ISRE 요소의 활성화를 측정하고, ViewLux ultraHTS 마이크로플레이트 이마저(Perkin Elmer)로 측정하였다. 각 화합물의 HEK-ISREluc 세포에 대한 자극 활성을 LEC값으로 나타내었다. LEC값은 시험 표준 편차의 적어도 두 배 위의 루시퍼라제 활성을 나타내는 PBMC에 적용된 화합물 농도로 정의된다. 차례로 LEC는 일정량의 PBMC 배양 배지의 이송에 ISRE 활성화 정도를 가리킨다. 재조합 인터페론 α-2a (Roferon-A)를 표준 대조 화합물로 사용하였다.

생물학적 활성
#	인간 TLR 7 (LEC) μM	인간 TLR 8 (LEC) μM	HEK-ISRE luc (LEC) μM
1	2.0	1.7	0.65
2	1.4	9.2	4.8
E	3.9	10	NA

NA = 불채용. 모든 화합물들은 최고 시험 농도에 이를 때까지 아무런 독성을 나타내지 않았다. 모든 화합물은 전술한 HEK 293 NF-kB 카운터스크린 어세이에서 아무런 활성을 나타내지 않았다(LEC >25 μM).

Claims

화학식 (I)의 화합물, 또는 그 약제학적으로 허용가능한 염, 토토머(들), 입체이성체 형태, 용매화물 또는 다형,

(여기서,
X는 S, S=O, 또는 O=S=O를 나타내고,
R₁은 수소, (C_1-6)-알킬, (C_1-6)-알콕시 또는 아릴이고,
R₂는 (C_1-3)-알킬 또는 (C_3-6)-사이클로알킬이고,
n=1 또는 2임).
제1항에 따른 화학식 (I)의 화합물, 또는 그 약제학적으로 허용가능한 염, 토토머(들), 입체이성체 형태, 용매화물 또는 다형과 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
의약품으로서 사용하기 위한, 제1항에 따른 화학식 (I)의 화합물, 또는 그 약제학적으로 허용가능한 염, 토토머(들), 입체이성체 형태, 용매화물 또는 다형 또는 제2항에 따른 약제학적 조성물.
TLR7 및/또는 TLR8의 조절이 관련된 질병 치료에 사용하기 위한, 제1항에 따른 화학식 (I)의 화합물, 그 약학적으로 허용가능한 염, 토토머(들), 입체이성체 형태, 용매화물 또는 다형 또는 제2항에 따른 약제학적 조성물.