KR20090088362A - 지질 함유 조성물 - Google Patents

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KR20090088362A
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케이. 나라야난나이르 자야프라카시
무투사미 자이라만
마틴 아. 마이어
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알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

핵산계 치료제, 예를 들면, 리포솜 및 리포플렉스와 같은 회합 복합체의 투여에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
Figure P1020097009148
핵산, 리포솜, 회합 복합체

Description

지질 함유 조성물 {Lipid containing formulations}
본 발명은 핵산계 치료제, 예를 들면, 리포솜 및 리포플렉스(lipoplex)와 같은 회합 복합체(association complex)의 투여에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
핵산계 치료제의 사용은 현재의 전형적인 약제로는 해결하지 못하는 의학적 문제에 대한 해결책을 제공하는 중요한 가능성을 갖는다. 점점 많은 수의 장애 관련 유전자의 위치와 서열이 동정되고 있으며, 각종 장애를 위한 핵산계 치료제의 임상학적 시험이 현재 진행 중이다.
핵산을 세포에 도입시키는 방법들 중의 하나는, 직접 미량 주사를 사용하는 기계적 방법이다. 그러나, 상기 방법은 일반적으로 환자의 전신 투여에는 효과적이지 못하다.
핵산 치료제의 전신 전달은, 핵산을 표적 세포에 분포시킨 후 표적 세포막을 통해 핵산을 치료 기능을 일으킬 수 있는 무손상 형태로 운반하는 것을 요구한다.
바이러스 벡터(viral vector)는, 몇몇 경우, 핵산계 치료제의 투여에 임상적 으로 성공적으로 사용된다. 그러나, 바이러스 벡터는 세포막을 통해 핵산을 이송하는 고유의 능력을 갖지만 이들은 여러 위험을 내포할 수 있다. 이러한 위험 중의 하나는, 바이러스 유전자 서열이 환자의 염색체에 무작위로 통합되어, 게놈을 잠재적으로 손상시키고 악성 형질전환을 일으킬 가능성이 있다는 것이다. 또 다른 위험은, 상기 바이러스 벡터가 돌연변이를 통해 또는 야생형 바이러스와의 유전자 교환을 통해 병원성 유전자형으로 복귀될 수 있다는 것이다.
지질-기재 벡터 또한 핵산 치료에 사용되며, 2가지 방법들 중의 하나로 제조된다. 1가지 방법에서는, 핵산을, 양이온성 지질과 중성 지질의 혼합물로 제조된 미리 형성된 리포솜 또는 리포플렉스에 도입한다. 이렇게 형성된 복합체는 불확실하고 복잡한 구조를 갖고, 혈청의 존재로 인해 전달 효율이 심하게 감소한다. 제2의 방법은, 중성 지질의 부재하에 모노- 또는 폴리-양이온성 지질과의 DNA 복합체를 형성시키는 것을 포함한다. 당해 복합체는 에탄올의 존재하에 제조되며 물에서는 안정하지 않다. 또한, 이들 복합체는 혈청에 의해 악영향을 받는다(참조: Behr, Ace. Chem. Res. 26:274-78 (1993)).
[발명의 개요]
본 발명은, 본원에 기재된 폴리아민 화합물 또는 지질 잔기를 포함하는 신규한 제제에 관한 것이다.
몇몇 양태에서, 본 발명은 화학식 I에 정의된 구조를 갖는 1종 이상의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 제제에 관한 것이다.
Figure 112009026592906-PCT00001
위의 화학식 I에서,
Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 C1-6 알킬렌이고,
n은 0, 1 , 2, 3, 4 또는 5이고,
R은 각각 독립적으로 H,
Figure 112009026592906-PCT00002
(Ra),
Figure 112009026592906-PCT00003
(Rb),
Figure 112009026592906-PCT00004
(Rc),
Figure 112009026592906-PCT00005
(Rd) 또는
Figure 112009026592906-PCT00006
(Re)이고,
여기서 상기 제제 중의 화학식 I의 화합물의 분자의 약 50% 이상(예를 들면, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 또는 거의 전부)에서 n+2개 이상의 R 잔기는 H가 아니고,
m은 1, 2, 3 또는 4이고,
Y는 O, NR2 또는 S이고,
R1은 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 이들 각각은 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되고,
R2는 H, 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 이들 각각은 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되고, 단 n이 0인 경우, n+3개 이상의 R 잔기는 H가 아니다.
몇몇 양태에서, R이 H가 아닌 경우, R은 Ra이고, 예를 들면, R이 H가 아닌 경우, 각각의 경우 R은 Ra이다.
몇몇 양태에서, R이 H가 아닌 경우, R은 Rb이고, 예를 들면, R이 H가 아닌 경우, 각각의 경우 R은 Rb이다.
몇몇 양태에서, R이 H가 아닌 경우, R은 Rc이고, 예를 들면, R이 H가 아닌 경우, 각각의 경우 R은 Rc이다.
몇몇 양태에서, R이 H가 아닌 경우, R은 Rd이고, 예를 들면, R이 H가 아닌 경우, 각각의 경우 R은 Rd이다.
몇몇 양태에서, R이 H가 아닌 경우, R은 Re이고, 예를 들면, R이 H가 아닌 경우, 각각의 경우 R은 Re이다.
몇몇 양태에서, 화학식 I의 n+2개의 R 잔기는 H가 아니다. 몇몇 양태에서, 화학식 I의 n+3개의 R 잔기는 H가 아니다. 몇몇 양태에서, 화학식 I의 n+4개의 R 잔기는 H가 아니다.
몇몇 양태에서, 화학식 I의 n+1의 R 잔기는 H가 아니다.
몇몇 양태에서, n은 0을 초과하고, 화학식 I의 NR의 하나 이상의 R은 H이다.
몇몇 양태에서, 화학식 I의 NR2의 하나 이상의 R은 H이다.
몇몇 양태에서, 분자들 중의 80% 이상은 단일 구조 이성체이다. 예를 들면, 화학식 I의 n+2개의 R 잔기는 H가 아니거나, 화학식 I의 n+3개의 R 잔기는 H가 아니거나, 화학식 I의 n+4개의 R 잔기는 H가 아니다.
몇몇 양태에서, n은 2 또는 0이다.
몇몇 양태에서, Xa 및 Xb는 C2 알킬렌이다.
몇몇 양태에서, n은 O이고 Xb는 에틸렌 또는 프로필렌이다.
몇몇 양태에서, n은 1을 초과하고 Xa는 하나 이상의 경우 가변적이다.
몇몇 양태에서, R이 H가 아닌 경우, R은
Figure 112009026592906-PCT00007
이다. 예를 들면, Y는 O 또는 NR2일 수 있다. 몇몇 양태에서, m은 2이다. 몇몇 양태에서, Y는 O 또는 NR2이고 m은 2이다. 몇몇 양태에서, m은 1이다. 몇몇 양태에서, m은 1이고 Y는 O 또는 NR2이다.
몇몇 양태에서, 하나 이상의 경우, 예를 들면, 각각의 경우 R1은 알킬이다.
몇몇 양태에서, 하나 이상의 경우, 예를 들면, 각각의 경우 R1은 알킬이고 R2는 H이다.
몇몇 양태에서, 하나 이상의 경우, 예를 들면, 각각의 경우 R1 및 R2는 H이다.
몇몇 양태에서, 하나 이상의 경우 R1은 알케닐이다.
몇몇 양태에서, R이 H가 아닌 경우, 하나 이상의 경우, 예를 들면, 각각의 경우 R은 Ra이고, Y는 O 또는 NH이다. 몇몇 양태에서, Y는 O이다. 몇몇 양태에서, Y는 NH이다. 몇몇 양태에서, R1은 알킬, 예를 들면, C10 -30 알킬 또는 C12 알킬이다. 몇몇 양태에서, n은 2이다. 몇몇 양태에서, 각각의 경우 Xa는 C2 알킬렌이고 Xb는 C2 알킬렌이다. 몇몇 양태에서, m은 2이다.
몇몇 양태에서, n은 2이고, R이 H가 아닌 경우, 하나 이상의 경우, 예를 들면, 각각의 경우 R은 Ra이다. 몇몇 양태에서, R1은 알킬, 예를 들면, C10 -18 알킬 또는 C12 알킬이다. 몇몇 양태에서, Y는 O이거나 Y는 NH이다. 몇몇 양태에서, 각각의 경우 Xa는 C2 알킬렌이고 Xb는 C2 알킬렌이다. 몇몇 양태에서, m은 2이다.
몇몇 양태에서, NR의 하나 이상의 R은 H이고, R은 H가 아닌 경우, 하나 이상의 경우, 예를 들면, 각각의 경우 R은 Ra이며, Y는 O 또는 NH이다. 몇몇 양태에서, Y는 O이거나 Y는 NH이다. 몇몇 양태에서, R1은 알킬, 예를 들면, C10 -18 알킬 또는 C12 알킬이다. 몇몇 양태에서, n은 2이다. 몇몇 양태에서, 각각의 경우 Xa는 C2 알킬렌이고 Xb는 C2 알킬렌이다. 몇몇 양태에서, m은 2이다.
몇몇 양태에서, n은 2이고 NR의 하나 이상의 R은 H이고, R이 H가 아닌 경우, 하나 이상의 경우, 예를 들면, 각각의 경우 R은 Ra이며, Y는 O 또는 NH이다. 몇몇 양태에서, R1은 알킬, 예를 들면, C10 -18 알킬 또는 C12 알킬이다. 몇몇 양태에서, Y는 O이거나 Y는 NH이다. 몇몇 양태에서, 각각의 경우 Xa는 C2 알킬렌이고 Xb는 C2 알킬렌이다. 몇몇 양태에서, m은 2이다.
몇몇 양태에서, 하나 이상의 경우, 예를 들면, 각각의 경우 NR2의 하나 이상의 R은 H이고 R은 Ra이며 Y는 O 또는 NH이다. 몇몇 양태에서, Y는 O이거나 Y는 NH이다. 몇몇 양태에서, R1은 알킬, 예를 들면, C10 -30 알킬, C10 -18 알킬 또는 C12 알킬이다. 몇몇 양태에서, n은 2이다. 몇몇 양태에서, 각각의 경우 Xa는 C2 알킬렌이고 Xb는 C2 알킬렌이다. 몇몇 양태에서, m은 2이다.
몇몇 양태에서, 하나 이상의 경우, 예를 들면, 각각의 경우 n은 2이고 NR2의 하나 이상의 R은 H이고 R은 Ra이며 Y는 O 또는 NH이다. 몇몇 양태에서, R1은 알킬, 예를 들면, C10 -18 알킬 또는 C12 알킬이다. 몇몇 양태에서, Y는 O이거나 Y는 NH이다. 몇몇 양태에서, 각각의 경우 Xa는 C2 알킬렌이고 Xb는 C2 알킬렌이다. 몇몇 양태에서, m은 2이다.
몇몇 양태에서, 상기 제제는 화학식
Figure 112009026592906-PCT00008
및
Figure 112009026592906-PCT00009
(여기서, R은 달리 특정되지 않는 한 H가 아니다)의 화합물 중의 하나 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
몇몇 양태에서, 상기 제제는 화학식
Figure 112009026592906-PCT00010
및
Figure 112009026592906-PCT00011
의 화합물 중의 하나 또는 이들의 혼합물로 필수적으로 이루어진다. 몇몇 양태에서, 각각의 R은
Figure 112009026592906-PCT00012
이다. 몇몇 양태에서, 각각의 R은
Figure 112009026592906-PCT00013
이다. 몇몇 양태에서, R1은 C10-C18 알킬(예: C12 알킬) 또는 C10-C30 알케닐이다.
몇몇 양태에서, R은
Figure 112009026592906-PCT00014
이다. 몇몇 양태에서, R1은 C10-C18 알킬, 예를 들면, C12 알킬이다. 몇몇 양태에서, R1은 C12 알킬이고 R2는 H이다.
몇몇 양태에서, n은 0이고 X는 프로필렌이다. 몇몇 양태에서, 하나의 R은 H이다. 몇몇 양태에서, R이 H가 아닌 경우, 하나 이상의 경우, 예를 들면, 각각의 경우 R은 Ra이다. 몇몇 양태에서, R1은 알킬, 예를 들면, C10 -30 알킬 또는 C12 알킬이다. 몇몇 양태에서, Y는 O이거나 Y는 NH이다. 몇몇 양태에서, m은 2이다.
몇몇 양태에서, 화학식 I은
Figure 112009026592906-PCT00015
이다. 몇몇 양태에서, R은
Figure 112009026592906-PCT00016
또는
Figure 112009026592906-PCT00017
이다. 몇몇 양태에서, R1은 C10-C18 알킬 또는 C10-C30 알케닐이다. 몇몇 양태에서, R은
Figure 112009026592906-PCT00018
이다. 몇몇 양태에서, R1은 C10-C18 알킬 또는 C10-C30 알케닐이고 R2는 H이다.
몇몇 양태에서, n은 2이고, 각각의 경우 Xa는 C2 알킬렌이고 Xb는 C2 알킬렌이고, 하나 이상의 경우, 예를 들면, 각각의 경우, 각각의 R은 H이거나
Figure 112009026592906-PCT00019
(Ra)이고, m은 2이고, Y는 NH 또는 O이고, R1은 C12 알킬이다. 몇몇 양태에서, 화학식 I의 화합물의 분자들 중의 80% 이상은 단일 구조 이성체이다. 몇몇 양태에서, Y는 NH이고, 이때, 예를 들면, 화학식 I의 화합물의 분자들 중의 80% 이상은 단일 구조 이성체이다. 몇몇 양태에서, R은 5가지 경우 Ra이다. 몇몇 양태에서, 화학식 I의 화합물의 분자들 중의 80% 이상에서, R은 5가지 경우 Ra이다. 몇몇 양태에서, Y는 NH이다.
몇몇 양태에서, 화학식 I의 화합물은 이의 무기 또는 유기 염, 예를 들면, 하이드로클로라이드 염과 같은 하이드로할라이드 염이다. 몇몇 양태에서, 하이드로클로라이드 염은 1당량의 HCl 내지 n+2당량의 HCl 범위이다. 몇몇 양태에서, 화학식 I의 화합물은 유기산의 염, 예를 들면, 아세테이트(상기 아세테이트 염은 1당량의 아세테이트 내지 n+2당량의 아세테이트 범위이다) 또는 포르메이트(상기 포르메이트 염은 1당량의 아세테이트 내지 n+2당량의 포르메이트 범위이다)이다.
몇몇 양태에서, 화학식 I의 화합물은 수화물의 형태를 갖는다.
몇몇 양태에서, 하나 이상의 경우, 예를 들면, 각각의 경우 R1은 알케닐 잔기를 포함하며, 예를 들면, R1은 시스 이중 결합을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물 및 핵산(예: siRNA 또는 dsRNA와 같은 RNA 또는 DNA)을 포함하는 제제에 관한 것이다. 몇몇 양태에서, 상기 제제는 융해성 지질 또는 PEG-지질과 같은 추가의 지질도 포함한다.
몇몇 양태에서, 상기 제제는 화학식 III의 화합물을 11중량% 미만으로 포함한다.
Figure 112009026592906-PCT00020
위의 화학식 III에서,
X 및 n은 상기 화학식 I에서 정의한 바와 같다.
몇몇 양태에서, 상기 제제는 화학식 IV의 화합물을 90중량% 미만으로 포함한다.
Figure 112009026592906-PCT00021
위의 화학식 IV에서,
Y 및 R1은 상기 화학식 I에 정의된 바와 같다.
몇몇 양태에서, 상기 제제는 다수의 화학식 I의 화합물을 포함한다.
몇몇 양태에서, 상기 제제는 화학식 I' 및 화학식 I"의 화합물의 혼합물을 포함한다. 몇몇 양태에서, 화학식 I' 및 화학식 I"의 화합물은 약 1:2 내지 약 2:1의 비로 존재한다.
화학식 I'
Figure 112009026592906-PCT00022
화학식 I"
Figure 112009026592906-PCT00023
위의 화학식 I"에서,
5개 이상의 R 잔기는 Ra이다.
한 측면에서, 본 발명은 화학식 III의 화합물을 촉진제의 존재하에 화학식 IV의 화합물과 반응시킴을 포함하는, 화학식 II의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
Figure 112009026592906-PCT00024
화학식 III
Figure 112009026592906-PCT00025
화학식 IV
Figure 112009026592906-PCT00026
위의 화학식 II, III 및 IV에서,
Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 C1-6 알킬렌이고,
n은 0, 1 , 2, 3, 4 또는 5이고,
R은 각각 독립적으로 H 또는
Figure 112009026592906-PCT00027
(Ra)이고,
m은 2이고,
Y는 O, NR2 또는 S이고,
R1은 알킬 또는 알케닐이고,
R2는 H 또는 C 알킬 또는 알케닐이다.
한 측면에서, 본 발명은 화학식 III의 화합물을 켄처(quencher)의 존재하에 화학식 IV의 화합물과 반응시킴을 포함하는, 화학식 II의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
화학식 II
Figure 112009026592906-PCT00028
화학식 III
Figure 112009026592906-PCT00029
화학식 IV
Figure 112009026592906-PCT00030
위의 화학식 II, III 및 IV에서,
Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 C1-6 알킬렌이고,
n은 0, 1 , 2, 3, 4 또는 5이고,
R은 각각 독립적으로 H 또는
Figure 112009026592906-PCT00031
(Ra)이고,
m은 2이고,
Y는 O, NR2 또는 S이고,
R1은 알킬 또는 알케닐이고,
R2는 H 또는 C 알킬 또는 알케닐이다.
한 측면에서, 본 발명은 화학식 III의 화합물을 화학식 IV의 화합물과 반응시키는 단계(여기서, 상기 반응 혼합물은 약 0.8 내지 약 1.2몰당량의 화학식 III의 화합물과 약 3.8 내지 약 6.5몰당량의 화학식 IV의 화합물을 포함한다)를 포함하는, 화학식 II의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
화학식 II
Figure 112009026592906-PCT00032
화학식 III
Figure 112009026592906-PCT00033
화학식 IV
Figure 112009026592906-PCT00034
위의 화학식 II, III 및 IV에서,
Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 C1-6 알킬렌이고,
n은 0, 1 , 2, 3, 4 또는 5이고,
R은 각각 독립적으로 H 또는
Figure 112009026592906-PCT00035
(Ra)이고,
m은 2이고,
Y는 O, NR2 또는 S이고,
R1은 알킬 또는 알케닐이고,
R2는 H 또는 C 알킬 또는 알케닐이다.
몇몇 양태에서, 상기 반응 혼합물은 약 0.8 내지 약 1.2몰당량의 화학식 III의 화합물과 약 5.5 내지 약 6.5몰당량의 화학식 IV의 화합물을 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 반응 혼합물은 약 1몰당량의 화학식 III의 화합물과 약 6몰당량의 화학식 IV의 화합물을 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 반응 혼합물은 약 1몰당량 의 화학식 III의 화합물과 약 5몰당량의 화학식 IV의 화합물을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 화학식 III의 화합물을 붕산과 물의 존재하에 화학식 IV의 화합물과 반응시키는 단계(여기서, 제1 단계 공정에서 상기 반응 혼합물은 약 0.8 내지 약 1.2몰당량의 화학식 III의 화합물과 약 3.8 내지 약 4.2몰당량의 화학식 IV의 화합물을 포함하고, 제2 단계 공정에서 약 0.8 내지 1.2몰당량의 화학식 IV의 화합물을 첨가한다)를 포함하는, 화학식 II의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
화학식 II
Figure 112009026592906-PCT00036
화학식 III
Figure 112009026592906-PCT00037
화학식 IV
Figure 112009026592906-PCT00038
위의 화학식 II, III 및 IV에서,
Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 C1 -6 알킬렌이고,
n은 0, 1 , 2, 3, 4 또는 5이고,
R은 각각 독립적으로 H 또는
Figure 112009026592906-PCT00039
(Ra)이고,
m은 2이고,
Y는 O, NR2 또는 S이고,
R1은 알킬 또는 알케닐이고,
R2는 H 또는 C 알킬 또는 알케닐이다.
한 측면에서, 본 발명은 화학식 III의 화합물을 화학식 IV의 화합물과 반응시키는 단계와, 반응 혼합물로부터 화학식 II의 1종 이상의 구조 이성체를 분리시켜, 1종의 화학식 II의 구조 이성체를 포함하는 실질적으로 순수한 제제를 제공하는 단계를 포함하는, 화학식 II의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
화학식 II
Figure 112009026592906-PCT00040
화학식 III
Figure 112009026592906-PCT00041
화학식 IV
Figure 112009026592906-PCT00042
위의 화학식 II, III 및 IV에서,
Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 C1-6 알킬렌이고,
n은 0, 1 , 2, 3, 4 또는 5이고,
R은 각각 독립적으로 H 또는
Figure 112009026592906-PCT00043
(Ra)이고,
m은 2이고,
Y는 O, NR2 또는 S이고,
R1은 알킬 또는 알케닐이고,
R2는 H 또는 C 알킬 또는 알케닐이다.
몇몇 양태에서, 화학식 II의 구조 이성체가 크로마토그래피 분리를 사용하여 반응 혼합물로부터 분리된다. 몇몇 양태에서, 상기 크로마토그래피 분리는 이성체들의 분리를 위한 섬광 실리카 겔을 사용한다. 몇몇 양태에서, 상기 크로마토그래피 분리는 실리카겔을 사용하는 이성체의 중력 분리이다. 몇몇 양태에서, 상기 크로마토그래피 분리는 이성체의 분리를 위한 이동층 크로마토그래피를 사용한다. 몇몇 양태에서, 상기 크로마토그래피 분리는 이성체들의 분리를 위한 액체 크로마토그래피(LC)를 사용한다. 몇몇 양태에서, 상기 크로마토그래피 분리는 이성체들의 분리를 위한 정상 HPLC이다. 몇몇 양태에서, 상기 크로마토그래피 분리는 이성체들의 분리를 위한 역상 HPLC이다.
몇몇 양태에서, 실질적으로 순수한 제제는 화학식 II의 구조 이성체를 약 80% 이상, 예를 들면, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 화학식 III의 화합물을 화학식 VI의 화합물과 반응시켜 화학식 V의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 제공하는 단계를 포함하는, 화학식 V의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염의 제조 방법에 관한 것이다.
화학식 III
Figure 112009026592906-PCT00044
Figure 112009026592906-PCT00045
Figure 112009026592906-PCT00046
위의 화학식 III, V 및 VI에서,
Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 C1-6 알킬렌이고,
n은 0, 1 , 2, 3, 4 또는 5이고,
R은 각각 독립적으로 H 또는
Figure 112009026592906-PCT00047
(Ra)이고,
m은 1이고,
Y는 O, NR2 또는 S이고,
R1은 알킬 또는 알케닐이고,
R2는 H 또는 알킬 또는 알케닐이고,
Q는 Cl, Br 또는 I이다.
몇몇 양태에서, 화학식 V의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 하이드로클로라이드 염이다.
한 측면에서, 본 발명은 화학식 X의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염에 관한 것이다.
Figure 112009026592906-PCT00048
위의 화학식 X에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 1 내지 4개의 R5로 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 1 내지 4개의 R5로 임의로 치환된 C2-C6 알케닐 또는 C(NR6)(NR6)2이고,
R3 및 R4는 각각 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐(이들 각각은 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도로 임의로 치환된다)이고,
L1 및 L2는 각각 독립적으로 -NR6C(O)-, -C(O)NR6-, -OC(O)-, -C(O)O-, -S- S-, -N(R6)C(O)N(R6)-, -OC(O)N(R6)-, -N(R6)C(O)O-, -O-N=C-, OR, -OC(O)NH-N=C- 또는 -NHC(O)NH-N=C-이고,
L1-R3 및 L2-R4(여기서, R3 및 R4는 상기 정의된 바와 같으며, H 또는 페닐일 수도 있다)는 함께 아세탈, 케탈 또는 오르토에스테르를 형성할 수 있고,
R5는 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, -OR7, -N(R8)(R9), -CN, SR10, S(O)R10 또는 S(O)2R10이고,
R6은 H 또는 C1-C6 알킬이고,
R7은 H 또는 C1-C6 알킬이고,
R8 및 R9는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고,
R10은 H 또는 C1-C6 알킬이고,
m은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고,
n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
몇몇 양태에서, 상기 화합물은 이의 무기 염, 예를 들면, 하이드로클로라이드 염과 같은 하이드로할라이드 염이다. 몇몇 양태에서, 상기 화합물은 이의 유기 염이다.
몇몇 양태에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1-C3 알킬이다.
몇몇 양태에서, R1은 메틸이다.
몇몇 양태에서, R2는 메틸이다.
몇몇 양태에서, R1과 R2는 둘 다 메틸이다.
몇몇 양태에서, R1은 H, 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 2-하이드록시에틸이다.
몇몇 양태에서, R2는 H이다.
몇몇 양태에서, R2는 메틸, 에틸, 프로필 또는 이소프로필이다.
몇몇 양태에서, R1은 H, 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 2-하이드록시에틸이고, R2는 H, 메틸, 에틸, 프로필 또는 이소프로필이다.
몇몇 양태에서, m은 1이다.
몇몇 양태에서, n은 1이다.
몇몇 양태에서, m과 n은 둘 다 1이다.
몇몇 양태에서, L1은 -NR6C(O)- 또는 -C(O)NR6-이다.
몇몇 양태에서, L1은 -OC(O)- 또는 -C(O)O-이다.
몇몇 양태에서, L1은 S-S-이다.
몇몇 양태에서, L1은 -N(R6)C(O)N(R6)-이다.
몇몇 양태에서, L1은 -OC(O)N(R6)- 또는 -N(R6)C(O)O-이다.
몇몇 양태에서, L1은 -O-N=C-이다.
몇몇 양태에서, L1은 -OC(O)NH-N=C- 또는 -NHC(O)NH-N=C-이다.
몇몇 양태에서, L2는 -NR6C(O)- 또는 -C(O)NR6-이다.
몇몇 양태에서, L2는 -OC(O)- 또는 -C(O)O-이다.
몇몇 양태에서, L2는 S-S-이다.
몇몇 양태에서, L2는 -N(R6)C(O)N(R6)-이다.
몇몇 양태에서, L2는 -OC(O)N(R6)- 또는 -N(R6)C(O)O-이다.
몇몇 양태에서, L2는 -O-N=C-이다.
몇몇 양태에서, L2는 -OC(O)NH-N=C- 또는 -NHC(O)NH-N=C-이다.
몇몇 양태에서, L1과 L2는 둘 다 -NR6C(O)- 또는 -C(O)NR6-이다.
몇몇 양태에서, L1과 L2는 둘 다 -OC(O)- 또는 -C(O)O-이다.
몇몇 양태에서, L1과 L2는 둘 다 S-S-이다.
몇몇 양태에서, L1과 L2는 둘 다 -N(R6)C(O)N(R6)-이다.
몇몇 양태에서, L1과 L2는 둘 다 -OC(O)N(R6)- 또는 -N(R6)C(O)O-이다.
몇몇 양태에서, L1은 -NR6C(O)-이고 L2는 -S-S-이다.
몇몇 양태에서, L1은 -OC(O)-이고 L2는 -S-S-이다.
몇몇 양태에서, L1은 -OC(O)N(R6) 또는 -N(R6)C(O)O-이고 L2는 -S-S-이다.
몇몇 양태에서, L1은 -N(R6)C(O)N(R6)-이고 L2는 -S-S-이다.
몇몇 양태에서, L1-R3 및 L2-R4는 함께 아세탈, 케탈 또는 오르토에스테르를 형성한다.
몇몇 양태에서, R3 및 R4는 각각 독립적으로 알킬이다.
몇몇 양태에서, R3와 R4는 둘 다 C6-C28 알킬이다.
몇몇 양태에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -S-S-, -OC(O)N(R6)- 또는 -N(R6)C(O)O-이다.
몇몇 양태에서, R3는 알킬이다.
몇몇 양태에서, R4는 알킬이다.
몇몇 양태에서, R3는 알케닐이다.
몇몇 양태에서, R4는 알케닐이다.
몇몇 양태에서, R3 및 R4는 각각 독립적으로 알케닐이고, 예를 들면, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C6-C30 알케닐이거나, R3 및 R4는 각각 동일한 알케닐 잔기이다.
몇몇 양태에서, R3 및 R4는 각각 2개의 이중 결합 잔기를 포함한다. 몇몇 양태에서, 이중 결합들 중의 하나 이상이 Z 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, 둘 모두의 이중 결합은 Z 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, R3 및 R4 중의 하나 이상은 화학식 II
Figure 112009026592906-PCT00049
(여기서, x는 1 내지 8의 정수이고, y는 1 내지 10의 정수이다)로 표시된다. 몇몇 양태에서, R3 및 R4는 둘 다 화학식 II로 표시된다. 몇몇 양태에서, 이중 결합들 중의 하나 이상이 E 배위를 갖고, 예를 들면, 둘 모두의 이중 결합은 E 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2 중의 하나 이상은 화학식 III
Figure 112009026592906-PCT00050
(여기서, x는 1 내지 8의 정수이고, y는 1 내지 10의 정수이다)으로 표시된다.
몇몇 양태에서, R1 및 R2는 각각 3개의 이중 결합 잔기를 포함한다. 몇몇 양태에서, 이중 결합들 중의 하나 이상이 Z 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, 2개 이상의 이중 결합은 Z 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, 3개의 이중 결합은 모두 Z 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2 중의 하나 이상은 화학식 IV
Figure 112009026592906-PCT00051
(여기서, x는 1 내지 8의 정수이고, y는 1 내지 10의 정수이다)로 표시된다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2는 둘 다 화학식 IV로 표시된다. 몇몇 양태에서, 이중 결합들 중의 하나 이상이 E 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, 2개 이상의 이중 결합은 E 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, 3개의 이중 결합은 모두 E 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2 중의 하나 이상은 화학식 V
Figure 112009026592906-PCT00052
(여기서, x는 1 내지 8의 정수이고, y는 1 내지 10의 정수이다)로 표시된다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2는 둘 다 화학식 V로 표시된다.
몇몇 양태에서, R1 및 R2는 각각 C1-C6 알킬(예: 메틸)이고, L1 및 L2는 각각 -OC(O)-이고, R3 및 R4는 각각 알케닐이다. 몇몇 양태에서, R3와 R4는 동일하다. 몇몇 양태에서, R3 및 R4는 둘 다 (예를 들면, 시스 결합을 갖는) 2개의 이중 결합을 포함한다. 몇몇 양태에서, R3 및 R4는 화학식 II
Figure 112009026592906-PCT00053
(여기서, x 는 1 내지 8의 정수, 예를 들면, 5이고, y는 1 내지 10의 정수, 예를 들면, 4이다)로 표시된다.
한 측면에서, 본 발명은 화학식 X의 화합물을 포함하는 제제에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 화학식 X의 화합물 및 핵산(예: siRNA 또는 dsRNA와 같은 RNA 또는 DNA)을 포함하는 제제에 관한 것이다. 몇몇 양태에서, 상기 제제는 융해성 지질 또는 PEG-지질과 같은 추가의 지질도 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 화학식 VI의 화합물을 커플링제의 존재하에 화학식 VII의 화합물과 반응시켜 화학식 X의 화합물을 제공하는 단계를 포함하는 화학식 X의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
화학식 VI
Figure 112009026592906-PCT00054
화학식 VII
Figure 112009026592906-PCT00055
화학식 X
Figure 112009026592906-PCT00056
위의 화학식 VI, VII 및 X에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 1 내지 4개의 R5로 임의로 치환된 C1-C6알킬이고,
R3는 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고,
L1은 -OC(O)-이고,
R5는 -OR7, -N(R8)(R9), -CN, SR10, S(O)R10 또는 S(O)2R10이고,
R6은 H 또는 C1-C6 알킬이고,
R7은 H 또는 C1-C6 알킬이고,
R8 및 R9는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고,
R10은 H 또는 C1-C6 알킬이고,
m 및 n은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
몇몇 양태에서, 커플링제는 EDCI와 같은 카보디이미드이다.
한 측면에서, 본 발명은 화학식 XV의 화합물에 관한 것이다.
Figure 112009026592906-PCT00057
위의 화학식 XV에서,
L1 및 L2는 각각 독립적으로 결합 또는 C(O)이고,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 이들은 각각 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되고,
X는 -C(O)NH-, C(S)NH, -C(O)C1-3알킬C(O)NH- 또는 -C(O)C1-3알킬C(O)O-이고,
m은 0 내지 11의 정수이고,
n은 1 내지 500의 정수이다.
몇몇 양태에서, L1 및 L2는 둘 다 결합이다.
몇몇 양태에서, L1 및 L2는 둘 다 C(O)이다.
몇몇 양태에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 알킬, 예를 들면, C6-C28 알킬, 예를 들면, C10-C18 알킬, 예를 들면, C13 알킬, C14 알킬, C15 알킬, 또는 C16 알킬이다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2는 둘 다 알킬, 예를 들면, 동일한 길이를 갖는 직쇄 알킬, 예를 들면, C6-C28 알킬, 예를 들면, C10-C18 알킬, 예를 들면, C13 알킬, C14 알킬, C15 알킬, 또는 C16 알킬이다. 몇몇 바람직한 양태에서, R1 및 R2는 둘 다 C14 알킬이다.
몇몇 양태에서, 화학식 XV는 라세미 혼합물을 나타낸다.
몇몇 양태에서, 화학식 XV의 화합물은 에난티오머 과량, 예를 들면, 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 R 이성체를 갖는다. 몇 몇 양태에서, 화학식 XV는 에난티오머적으로 순수한 'R' 이성체를 나타낸다.
몇몇 양태에서, 화학식 XV의 화합물은 에난티오머 과량, 예를 들면, 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 S 이성체를 갖는다. 몇몇 양태에서, 화학식 XV는 에난티오머적으로 순수한 'S' 이성체를 나타낸다.
몇몇 양태에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 알케닐이고, 예를 들면, R1 및 R2는 각각 독립적으로 C6-C30 알케닐이거나 R1 및 R2는 동일한 알케닐 잔기이다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2는 각각 단일 이중 결합을 포함하고, 단일 이중 결합은, 예를 들면, E 또는 Z 배위를 갖는다.
몇몇 양태에서, R1 및 R2는 각각 2개의 이중 결합 잔기를 포함한다. 몇몇 양태에서, 이중 결합들 중의 하나 이상이 Z 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, 둘 모두의 이중 결합은 Z 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2 중의 하나 이상은 화학식 II
Figure 112009026592906-PCT00058
(여기서, x는 1 내지 8의 정수이고, y는 1 내지 10의 정수이다)로 표시된다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2는 둘 다 화학식 II로 표시된다. 몇몇 양태에서, 이중 결합들 중의 하나 이상이 E 배위를 갖고, 예를 들면, 둘 모두의 이중 결합은 E 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2 중의 하나 이상은 화학식 III
Figure 112009026592906-PCT00059
(여기서, x는 1 내지 8의 정수이고, y는 1 내지 10의 정 수이다)로 표시된다.
몇몇 양태에서, R1 및 R2는 각각 3개의 이중 결합 잔기를 포함한다. 몇몇 양태에서, 이중 결합들 중의 하나 이상이 Z 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, 2개 이상의 이중 결합은 Z 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, 3개의 이중 결합은 모두 Z 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2 중의 하나 이상은 화학식 IV
Figure 112009026592906-PCT00060
(여기서, x는 1 내지 8의 정수이고, y는 1 내지 10의 정수이다)로 표시된다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2는 둘 다 화학식 IV로 표시된다. 몇몇 양태에서, 이중 결합들 중의 하나 이상이 E 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, 2개 이상의 이중 결합은 E 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, 3개의 이중 결합은 모두 E 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2 중의 하나 이상은 화학식 V
Figure 112009026592906-PCT00061
(여기서, x는 1 내지 8의 정수이고, y는 1 내지 10의 정수이다)로 표시된다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2는 둘 다 화학식 V로 표시된다.
몇몇 양태에서, X는 -C(O)NH-이고, 화학식 XV'
Figure 112009026592906-PCT00062
의 화합물을 제공한다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 알킬, 예를 들면, C6-C28 알킬, 예를 들면, C10-C18 알킬, 예를 들면, C13 알킬, C14 알킬, C15 알킬, 또는 C16 알킬이다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2는 둘 다 알킬, 예를 들면, 동일한 길이를 갖는 직쇄 알킬, 예를 들면, C6-C28 알킬, 예를 들면, C10-C18 알킬, 예를 들면, C13 알킬, C14 알킬, C15 알킬, 또는 C16 알킬이다. 몇몇 바람직한 양태에서, R1 및 R2는 둘 다 C14 알킬이다.
몇몇 양태에서, X는 -C(O)C1-3알킬C(O)O-이다.
몇몇 양태에서, m은 1 내지 10의 정수, 예를 들면, 2 내지 4의 정수, 또는 2이다.
몇몇 양태에서, n은 1 내지 500의 정수, 예를 들면, 40 내지 400, 100 내지 350, 40 내지 50 또는 42 내지 47의 정수이다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 화합물은 화학식 XV'
Figure 112009026592906-PCT00063
(여기서, L1 및 L2는 둘 다 결합이다)의 화합물이다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 알킬, 예를 들면, C6-C28 알킬, 예를 들면, C10-C18 알킬, 예를 들면, C14 알킬, C15 알킬, 또는 C16 알킬이다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2는 둘 다 알킬, 예를 들면, 동일한 길이를 갖는 직쇄 알킬, 예를 들면, C6-C28 알킬, 예를 들면, C10-C18 알킬, 예를 들면, C14 알킬, C15 알킬, 또는 C16 알킬이다. 몇몇 바람직한 양태에서, R1 및 R2는 둘 다 C14 알킬이다. 몇몇 양태에서, m은 1 내지 10의 정수, 예를 들면, 2 내지 4의 정수 또는 2이다. 몇몇 양태에서, n은 1 내지 500의 정수, 예를 들면, 40 내지 400, 또는 40 내지 50의 정수이다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 화합물은 L1 및 L2가 둘 다 결합이고 R1 및 R2가 둘 다 알킬(예: C6-C28 알킬, 예를 들면, C10-C18 알킬, 바람직하게는 C14 알킬)이며 n이 약 40 내지 400의 정수인 화학식 XV'의 화합물이다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 화합물은 화학식 XVI
Figure 112009026592906-PCT00064
(여기서, 반복되는 PEG 잔기는 평균 분자량이 2,000이고, n은 42 내지 47의 값이다)을 갖는다.
몇몇 양태에서, 화학식 XVI의 화합물은 에난티오머 과량, 예를 들면, 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 R 이성체를 갖는다. 몇몇 양태에서, 화학식 XVI의 화합물은 'R'의 바람직한 절대 배위를 갖는 입체 이성체이다.
한 측면에서, 본 발명은 콜레스테롤 잔기에 접합된 PEG 지질에 관한 것이다. 예를 들면, 본 발명은 화학식 XX의 화합물이다.
Figure 112009026592906-PCT00065
위의 화학식 XX에서,
X는 -C(O)NH-, C(S)NH, -C(O)C1-3알킬C(O)NH- 또는 -C(O)C1-3알킬C(O)O-이고,
m은 0 내지 11의 정수이고,
n은 1 내지 500의 정수이다.
몇몇 양태에서, 화학식 XX에서 콜레스테롤에 부착된 O는 콜레스테롤 잔기의 부분이다.
몇몇 바람직한 양태에서, X는 -C(O)NH- 또는 -C(O)C1-3알킬C(O)O-이다.
몇몇 양태에서, 화학식 XX의 화합물은 화학식 XX'
Figure 112009026592906-PCT00066
로 표시된다.
한 측면에서, 본 발명은 표적 잔기, 예를 들면, 당 잔기에 결합된 PEG 지질에 관한 것이다. 예를 들면, 화학식 XV 또는 XX의 화합물은 OMe 말단에서 표적 잔기로 변성된다. 몇몇 양태에서, 표적 잔기는 연결체를 통해 PEG 잔기에 결합한다. 대표적인 표적화 PEG 지질은 화학식 XXI 및 XXII로 표시된다.
한 양태에서, 상기 지질은 화학식 XXI의 화합물이다.
Figure 112009026592906-PCT00067
위의 화학식 XXI에서,
L1 및 L2는 각각 독립적으로 결합 또는 C(O)이고,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 이들은 각각 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되고,
X 및 X'는 각각 독립적으로 -C(O)NH-, -NHC(O)-, C(S)NH, C(S)NH, -C(O)C1-3알킬C(O)NH-, NHC(O)C1-3알킬C(O)-, -C(O)C1-3알킬C(O)O-, NHC(O)C1-3알킬-, 또는 C1-3알킬C(O)NH-이고,
m은 0 내지 11의 정수이고,
n은 1 내지 500의 정수이고,
p는 1 내지 6의 정수, 예를 들면, 3이고,
T는 글리코실 잔기(예: 당 잔기)와 같은 표적 잔기이다. 대표적인 표적 잔기는
Figure 112009026592906-PCT00068
를 포함한다.
몇몇 양태에서, L1 및 L2는 둘 다 결합이다.
몇몇 양태에서, L1 및 L2는 둘 다 C(O)이다.
몇몇 양태에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 알킬, 예를 들면, C6-C28 알킬, 예를 들면, C10-C18 알킬, 예를 들면, C14 알킬, C15 알킬, 또는 C16 알킬이다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2는 둘 다 알킬, 예를 들면, 동일한 길이를 갖는 직쇄 알킬, 예를 들면, C6-C28 알킬, 예를 들면, C10-C18 알킬, 예를 들면, C14 알킬, C15 알킬, 또는 C16 알킬이다. 몇몇 바람직한 양태에서, R1 및 R2는 둘 다 C14 알킬이다.
몇몇 양태에서, 화학식 XXI은 라세미 혼합물을 나타낸다.
몇몇 양태에서, 화학식 XXI의 화합물은 에난티오머 과량, 예를 들면, 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 R 이성체를 갖는다. 몇몇 양태에서, 화학식 XXI는 에난티오머적으로 순수한 'R' 이성체를 나타낸다.
몇몇 양태에서, 화학식 XXI의 화합물은 에난티오머 과량, 예를 들면, 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 S 이성체를 갖는다. 몇몇 양태에서, 화학식 XXI는 에난티오머적으로 순수한 'S' 이성체를 나타낸다.
몇몇 양태에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 알케닐이고, 예를 들면, R1 및 R2는 각각 독립적으로 C6-C30 알케닐이거나, R1 및 R2는 각각 동일한 알케닐 잔기이 다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2는 각각 단일 이중 결합을 포함하고, 단일 이중 결합은, 예를 들면, E 또는 Z 배위를 갖는다.
몇몇 양태에서, R1 및 R2는 각각 2개의 이중 결합 잔기를 포함한다. 몇몇 양태에서, 이중 결합들 중의 하나 이상이 Z 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, 둘 모두의 이중 결합은 Z 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2 중의 하나 이상은 화학식 II
Figure 112009026592906-PCT00069
(여기서, x는 1 내지 8의 정수이고, y는 1 내지 10의 정수이다)로 표시된다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2는 둘 다 화학식 II로 표시된다. 몇몇 양태에서, 이중 결합들 중의 하나 이상이 E 배위를 갖고, 예를 들면, 둘 모두의 이중 결합은 E 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2 중의 하나 이상은 화학식 III
Figure 112009026592906-PCT00070
(여기서, x는 1 내지 8의 정수이고, y는 1 내지 10의 정수이다)로 표시된다.
몇몇 양태에서, R1 및 R2는 각각 3개의 이중 결합 잔기를 포함한다. 몇몇 양태에서, 이중 결합들 중의 하나 이상이 Z 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, 2개 이상의 이중 결합은 Z 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, 3개의 이중 결합은 모두 Z 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2 중의 하나 이상은 화학식 IV
Figure 112009026592906-PCT00071
(여기서, x는 1 내지 8의 정수이고, y는 1 내지 10의 정수 이다)로 표시된다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2는 둘 다 화학식 IV로 표시된다. 몇몇 양태에서, 이중 결합들 중의 하나 이상이 E 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, 2개 이상의 이중 결합은 E 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, 3개의 이중 결합은 모두 E 배위를 갖는다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2 중의 하나 이상은 화학식 V
Figure 112009026592906-PCT00072
(여기서, x는 1 내지 8의 정수이고, y는 1 내지 10의 정수이다)로 표시된다. 몇몇 양태에서, R1 및 R2는 둘 다 화학식 V로 표시된다.
몇몇 양태에서, p는 3이다.
몇몇 양태에서, L은 NHC(O)C1-6알킬(예: NHC(O)C3알킬)이다.
몇몇 양태에서, 화학식 XXI의 화합물은 화학식 XXI'
Figure 112009026592906-PCT00073
의 화합물이다.
한 양태에서, 상기 지질은 화학식 XXII의 화합물이다.
Figure 112009026592906-PCT00074
위의 화학식 XXII에서,
X 및 X'는 각각 독립적으로 -C(O)NH-, -NHC(O)-, C(S)NH, C(S)NH, -C(O)C1-3 알킬C(O)NH-, NHC(O)C1- 3알킬C(O)-, -C(O)C1- 3알킬C(O)O-, NHC(O)C1- 3알킬- 또는 C1 - 3알킬C(O)NH-이고,
m은 0 내지 11의 정수이고,
n은 1 내지 500의 정수이고,
p는 1 내지 6의 정수, 예를 들면, 3이고,
T는 글리코실 잔기(예: 당 잔기)와 같은 표적 잔기이다. 대표적인 표적 잔기는
Figure 112009026592906-PCT00075
를 포함한다.
몇몇 바람직한 양태에서, 화학식 XXII의 화합물은 화학식 XXII'
Figure 112009026592906-PCT00076
의 화합물이다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 화합물(예: 화학식 I의 화합물 또는 화학식 X의 화합물) 및 핵산(예: 단일 나선 RNA(siRNA) 또는 이중 나선 RNA(dsRNA)와 같은 RNA 또는 DNA)을 포함하는 화합물 제제를 포함한 회합 복합체에 관한 것이다. 몇몇 양태에서, 상기 회합 복합체는 리포플렉스 또는 리포솜이다. 몇몇 양태에서, 상기 회합 복합체는 표적 잔기, 융해성 지질, 페길화된 지질(예: 화학식 XV, XV' 또는 XVI의 PEG-지질과 같은 본원에 기재된 PEG-지질) 또는 구조적 잔기과 같은 1종 이상의 추가의 잔기를 포함한다. 몇몇 양태에서, PEG-지질은 본원에 기재 된 표적화된 PEG-지질, 예를 들면, 화학식 XXI, XXI', XXII 또는 XXII'의 화합물이다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 화합물(예: 화학식 I 또는 화학식 X의 화합물과 같은 본원에 기재된 지질)을 포함하는 지질 제제를 완충액의 존재하에 치료제와 접촉시키는 단계를 포함하며; 상기 완충액이 화학식 I의 분자들의 중의 거의 모든 아민을 양성자화시키기에 충분한 강도를 갖고, 100 내지 300mM로 존재하며, 20mM에서 동일한 완충액에 비해 훨씬 더 많은 양성자화를 제공하는 농도로 존재하는, 리포솜의 제조 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 리포솜에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 지질 제제(예: 화학식 I의 화합물 또는 화학식 X의 화합물을 포함하는 지질 제제)를 에탄올을 약 90% 이상의 포함하는 혼합물 중에서 치료제와 접촉시키고, 지질 제제를 치료제와 급속 혼합하여 약 200μM 미만의 직경을 갖는 입자를 제공함을 포함하는, 리포솜의 제조 방법에 관한 것이다. 몇몇 양태에서, 상기 입자는 약 50μM 미만의 직경을 갖는다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 지질 제제(예: 화학식 I의 화합물 또는 화학식 X의 화합물을 포함하는 지질 제제)를 약 100 내지 약 300mM의 농도를 갖는 완충액의 존재하에 치료제와 접촉시킴을 포함하는, 리포솜의 제조 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 제제(예: 화학식 I의 화합물 또는 화 학식 X의 화합물을 포함하는 지질 제제) 및 핵산을 포함하는 리포솜에 관한 것이다. 몇몇 양태에서, 상기 제제는 페길화된 지질, 예를 들면, 화학식 XV, XV' 또는 XVI의 PEG-지질과 같은 본원에 기재된 PEG-지질도 포함한다. 몇몇 양태에서, PEG-지질은 본원에 기재된 표적화된 PEG-지질, 예를 들면, 화학식 XXI, XXI', XXII 또는 XXII'의 화합물이다. 몇몇 양태에서, 상기 제제는 콜레스테롤과 같은 구조적 잔기도 포함한다. 몇몇 양태에서, 회합 복합체의 제제는 화학식 I 및 XV의 화합물 및 콜레스테롤을 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 핵산은 siRNA, 예를 들면, 분해에 저항하도록 변성된 siRNA, 폴리사카라이드 골격의 변성에 의해 변성된 siRNA, 또는 ApoB 유전자를 표적화하는 siRNA이다.
몇몇 양태에서, 상기 리포솜은 구조적 잔기 및 본원에 기재된 PEG-지질과 같은 페길화된 지질을 추가로 포함하고, 여기서 제제(예: 화학식 I의 화합물 또는 화학식 X의 화합물을 포함하는 지질 제제), 콜레스테롤과 같은 구조적 잔기, 페길화된 지질, 및 핵산의 중량 비는 8 내지 22 : 4 내지 10 : 4 내지 12 : 0.4 내지 2.2이다. 몇몇 양태에서, 구조적 잔기는 콜레스테롤이다. 몇몇 양태에서, 상기 비는 10 내지 20 : 0.5 내지 8.0 : 5 내지 10 : 0.5 내지 2.0, 예를 들면, 15:0.8:7:1이다. 몇몇 양태에서, 평균 리포솜 직경은 10 내지 750㎚, 예를 들면, 30 내지 200㎚ 또는 50 내지 100㎚이다. 몇몇 양태에서, 상기 제제는 15중량% 미만의 미반응 지질이다. 몇몇 양태에서, 상기 제제(예: 화학식 I의 화합물 또는 화학식 X의 화합물을 포함하는 지질 제제) / 콜레스테롤과 같은 구조적 잔기 / PEG 지질의 비는 약 42/48/10(몰 비)이다. 몇몇 양태에서, 핵산(예: siRNA)에 대한 전체 지질은 약 7.5중량%이다.
몇몇 양태에서, 본원에 기재된 회합 복합체는 핵산에 대한 전체 부형제의 중량 비가 약 15:1 미만, 예를 들면, 약 10:1, 7.5:1 또는 약 5:1이다.
한 측면에서, 본 발명은 다수의 지질 잔기들을 에탄올과 수성 NaOAc 완충액 중에서 혼합하여 입자를 제공하고, 상기 입자에 치료제를 첨가하여 회합 복합체를 형성시킴을 포함하는, 다수의 지질 잔기들과 치료제를 포함하는 회합 복합체의 제조 방법에 관한 것이다.
몇몇 양태에서, 상기 지질 잔기들은 100% 에탄올의 용액 중에 제공된다.
몇몇 양태에서, 상기 다수의 지질 잔기들은 양이온성 지질을 포함한다.
몇몇 양태에서, 상기 양이온성 지질은 본원에 기재된 지질이고, 예를 들면, 양이온성 지질은
Figure 112009026592906-PCT00077
또는
Figure 112009026592906-PCT00078
중의 하나 또는 이들의 혼합물인 지질이다. 몇몇 바람직한 양태에서, 양이온성 지질은
Figure 112009026592906-PCT00079
이다.
몇몇 양태에서, 다수의 지질 잔기들은 PEG-지질을 포함하고, 예를 들면, PEG-지질은 화학식
Figure 112009026592906-PCT00080
(여기서, L1 및 L2은 각각 독립적으로 결합 또는 C(O)이고, R1 및 R2는 각각 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 이들은 각각 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되고, X는 -C(O)NH-, C(S)NH, -C(O)C1- 3알킬C(O)NH- 또는 -C(O)C1- 3알킬C(O)O-이고, m은 0 내지 11의 정수이고, n은 1 내지 500의 정수이다)을 갖는다.
몇몇 바람직한 양태에서, PEG-지질은 화학식 XVI의 PEG 지질(여기서, 반복되는 PEG 잔기는, 예를 들면, 평균 분자량이 2,000이고, n은 42 내지 47의 값이다)이거나, 화학식
Figure 112009026592906-PCT00081
의 지질이다.
몇몇 양태에서, 다수의 지질 잔기들은 구조적 지질을 포함하고, 구조적 지질은, 예를 들면, 콜레스테롤이다.
몇몇 양태에서, PEG-지질은 본원에 기재된 바와 같은 표적화된 PEG-지질, 예를 들면, 화학식 XXI, XXI', XXII 또는 XXII'의 화합물이다.
몇몇 양태에서, 상기 방법은, 예를 들면, 치료제를 첨가하기 전에 지질 함유 입자를 압출시키는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 양태에서, 치료제는 핵산, 예를 들면, 분해에 저항하도록 변성된 siRNA, 폴리사카라이드 골격의 변성에 의해 변성된 siRNA, 또는 지질친화성 잔기에 접합된 siRNA와 같은 siRNA이다. 몇몇 양태에서, siRNA는 ApoB 유전자를 표적화한다.
몇몇 양태에서, 회합 복합체는 양이온성 지질, 구조적 지질, PEG-지질 및 핵산을 포함한다. 몇몇 양태에서, 양이온성 지질, 구조적 지질, PEG-지질 및 핵산의 몰 비는 36 내지 48 : 42 내지 54 : 6 내지 14, 예를 들면, 38 내지 46 : 44 내지 52 : 8 내지 12 또는 약 42:48:10이다. 몇몇 양태에서, 핵산에 대한 전체 부형제의 중량 비는 약 15:1 미만, 예를 들면, 약 10:1, 약 7.5:1 또는 약 5:1이다. 몇몇 바람직한 양태에서, 양이온성 지질은 화학식
Figure 112009026592906-PCT00082
을 갖고, PEG-지질은 화학식 XVI의 PEG 지질(여기서, 반복되는 PEG 잔기는, 예를 들면, 평균 분자량이 2,000이고, n은 42 내지 47의 값이다)이거나, 화학식
Figure 112009026592906-PCT00083
을 갖고, 구조적 지질은 콜레스테롤이고, 여기서 양이온성 지질, 구조적 지질 및 PEG-지질의 몰 비는 38 내지 46 : 44 내지 52 : 8 내지 12, 예를 들면, 약 42:48:10이다. 몇몇 바람직한 양태에서, 핵산에 대한 전체 부형제의 중량 비는 약 15:1 미만, 예를 들면, 약 10:1, 약 7.5:1, 또는 약 5:1이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법으로 제조된 회합 복합체에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 양이온성 지질, 구조적 지질, PEG-지질 및 핵산을 포함하고, 양이온성 지질은
Figure 112009026592906-PCT00084
또는
Figure 112009026592906-PCT00085
중의 하나 또는 이들의 혼합물인 지질이며, PEG-지질은 화학식 XVI의 PEG 지질(여기서, 반복되는 PEG 잔기는, 예를 들면, 평균 분자량이 2,000이고, n은 42 내지 47의 값이다)이거나, 화학식
Figure 112009026592906-PCT00086
을 갖고, 구조적 지질은 콜레스테롤인 회합 복합체에 관한 것이다. 몇몇 바람직한 양태에서, 핵산은 siRNA이다. 몇몇 바람직한 양태에서, 양이온성 지질은 화학식
Figure 112009026592906-PCT00087
을 갖는다. 몇몇 바람직한 양태에서, 양이온성 지질 제제, 구조적 지질(예: 콜레스테롤), PEG-지질 및 핵산의 몰 비는 36 내지 48 : 42 내지 54 : 6 내지 14, 예를 들면, 38 내지 46 : 44 내지 52 : 8 내지 12 또는 약 42:48:10이다. 몇몇 바람직한 양태에서, 핵산에 대한 전 체 부형제의 중량 비는 약 15:1 미만, 예를 들면, 약 10:1, 약 7.5:1, 또는 약 5:1이다.
몇몇 양태에서, 본원에 기재된 회합 복합체는 평균 직경 또는 입자 크기가 약 25,000㎚ 미만, 예를 들면, 약 20 내지 200㎚, 약 60㎚, 또는 약 50㎚이다.
몇몇 양태에서, 본원에 기재된 회합 복합체로서 투여되는 핵산은 혈청 반감기(예: 시험관내)가 약 4시간 이상, 예를 들면, 약 6시간 이상, 약 8시간 이상, 약 12시간 이상, 약 24시간 이상, 약 2일 이상, 약 3일 이상, 약 4일 이상, 약 1주일 이상, 약 2주일 이상, 또는 약 3주일 이상이다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 제제를 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 리포솜을 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 조성물, 예를 들면, 본원에 기재된 리포솜과 같은 회합 복합체 치료량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 치료 방법에 관한 것이다.
정의
"할로" 또는 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드와 같은 임의의 라디칼을 의미한다.
"알킬"은 표시된 수의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있는 탄 화수소 쇄를 의미한다. 예를 들면, C1-C36 알킬은 상기 그룹이 탄소수가 1 내지 36개(포함)일 수 있음을 나타낸다. "할로알킬"은 하나 이상의 수소 원자가 할로에 의해 치환된 알킬을 의미하고, 모든 수소가 할로로 치환된 알킬 잔기(예: 퍼플루오로알킬)도 포함한다. "아릴알킬" 또는 "아르알킬"은 알킬 수소 원자가 아릴 그룹으로 치환된 알킬 잔기를 의미한다. 아르알킬은 둘 이상의 수소 원자가 아릴 그룹으로 치환된 그룹을 포함한다. "아릴알킬" 또는 "아르알킬"의 예로는 벤질, 2-페닐에틸, 3-페닐프로필, 9-플루오레닐, 벤즈하이드릴 및 트리틸 그룹이 포함된다.
"알킬렌"이란 2가 알킬, 예를 들면, -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2-, 및 CH2CH2CH2CH2CH2CH2-를 의미한다.
"알케닐"은 탄소수가 2 내지 36이고 하나 이상의 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 쇄를 의미한다. 알케닐 그룹의 예로는 알릴, 프로페닐, 2-부테닐, 3-헥세닐 및 3-옥테닐 그룹이 제한 없이 포함된다. 이중 결합 탄소들 중의 하나는 임의로 알케닐 치환체의 결합점일 수 있다. "알키닐"은 탄소수가 2 내지 36이고 하나 이상의 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 쇄를 의미한다. 알키닐 그룹의 예로는 에티닐, 프로파르길 및 3-헥시닐이 제한 없이 포함된다. 삼중 결합 탄소들 중의 하나는 임의로 알키닐 치환체의 결합점일 수 있다.
"치환체"는 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로알케닐, 사이클로알케닐, 아릴, 또는 헤테로아릴 그룹의 임의의 원자에서 상기 그룹에 "치환된" 그룹을 의미한다. 임의의 원자가 치환될 수 있다. 적합한 치 환체로는 알킬(예: C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12 직쇄 또는 분지쇄 알킬), 사이클로알킬, 할로알킬(예: CF3와 같은 퍼플루오로알킬), 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 헤테로아르알킬, 헤테로사이클릴, 알케닐, 알키닐, 사이클로알케닐, 헤테로사이클로알케닐, 알콕시, 할로알콕시(예: OCF3와 같은 퍼플루오로알콕시), 할로, 하이드록시, 카복시, 카복실레이트, 시아노, 니트로, 아미노, 알킬아미노, SO3H, 설페이트, 포스페이트, 메틸렌디옥시(-O-CH2-O-, 여기서 산소들은 동일한 탄소 원자에 부착된다(같은 자리 치환)), 에틸렌디옥시, 옥소, 티옥소(예: C=S), 이미노(알킬, 아릴, 아르알킬), S(O)n알킬(여기서, n은 0 내지 2이다), S(O)n아릴(여기서, n은 0 내지 2이다), S(O)n헤테로아릴(여기서, n은 0 내지 2이다), S(O)n헤테로사이클릴(여기서, n은 0 내지 2이다), 아민(모노, 디, 알킬, 사이클로알킬, 아르알킬, 헤테로아르알킬, 아릴, 헤테로아릴, 및 이들의 배합물), 에스테르(알킬, 아르알킬, 헤테로아르알킬, 아릴, 헤테로아릴), 아미드(모노-, 디-, 알킬, 아르알킬, 헤테로아르알킬, 아릴, 헤테로아릴, 및 이들의 배합물), 설폰아미드(모노-, 디-, 알킬, 아르알킬, 헤테로아르알킬, 및 이들의 배합물)가 제한 없이 포함된다. 한 측면에서, 그룹 위의 치환체들은 독립적으로 임의의 한 단독 치환체이거나 상기 언급된 치환체들의 임의의 하위 집합이다. 다른 측면에서, 치환체는 그 자체가 상기 치환체들 중 어느 하나로 치환될 수 있다.
"구조 이성체"는, 프로필 알코올과 이소프로필 알코올과 같이, 분자식은 동 일하지만 구조식이 상이한 2종 이상의 임의의 화학적 화합물을 의미한다.
"기하 이성체" 또는 "입체이성체"는 동일한 수와 형태의 원자 및 결합을 함유하지만(즉, 원자 사이의 연결성은 동일하지만) 원자들의 공간 배치가 상이한 2종 이상의 화합물, 예를 들면, 이중 결합의 시스 및 트랜스 이성체, 에난티오머 및 디아스테레오머를 의미한다.
편의를 위해, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구의 범위에서 사용된 특정한 용어들의 의미를 아래에 설명하겠다. 본 명세서의 다른 부분에서 사용된 용어와 상기 단락에 설명된 상기 용어의 정의가 명백하게 일치하지 않을 경우에는 상기 단락에 설명된 정의를 우선적으로 따른다.
"G", "C", "A" 및 "U"는 각각 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실을 염기로 함유하는 뉴클레오티드이다. 그러나, "리보뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"는 아래에 추가로 설명된 바와 같은 변성된 뉴클레오티드, 또는 대리 대체 잔기를 의미할 수도 있다. 당업자는 이러한 대체 잔기를 함유한 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 염기 짝짓기 특성을 거의 변화시키지 않으면서, 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실이 다른 잔기들에 의해 대체될 수 있음을 잘 알고 있다. 예를 들면, 제한 없이, 이노신을 이의 염기로서 포함하는 뉴클레오티드는, 아데닌, 시토신 또는 우라실을 함유하는 뉴클레오티드와 염기쌍을 이룰 수 있다. 따라서, 우라실, 구아닌, 또는 아데닌을 함유하는 뉴클레오티드는 본 발명의 뉴클레오티드 서열에서, 예를 들면, 이노신을 함유한 뉴클레오티드에 의해 대체될 수 있다. 이러한 대체 잔기를 포함하는 서열은 본 발명의 양태이다.
"표적 서열"은 상응하는 유전자의 전사 과정에서 형성되는 mRNA 분자(이는 일차 전사 생성물의 RNA 가공의 생성물인 mRNA를 포함)의 뉴클레오티드 서열의 인접한 부분을 의미한다. 표적 영역은 RNAi 성분의 일부에 상호보완적인 표적 유전자 내의 단편이다.
"서열을 포함하는 가닥"은 해당 서열에 의해 묘사되는 뉴클레오티드의 쇄를 포함하는 올리고뉴클레오티드를, 표준 뉴클레오티드 명명법을 사용하여 일컫는 용어이다.
제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열의 관계를 설명할 때 사용되는 용어인 "상호보완적(complementary)"은, 달리 지시되지 않는 한, 당업자로부터 이해되는 바와 같이, 제1 뉴클레오티드 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가, 특정한 조건하에 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 함께 혼성화되어, 이중 구조를 형성할 수 있음을 의미한다. 이러한 조건은, 예를 들면, 400mM NaCl, 40mM PIPES(pH 6.4), 1mM EDTA, 50℃ 또는 70℃, 12 내지 16시간, 및 이후의 세척을 포함하는 엄격한 조건일 수 있다. 유기체 내에서 만날 수 있는 생리학적 조건과 같은 다른 조건들도 적용가능하다. 당업자는 혼성화된 뉴클레오티드의 궁극적인 용도에 따라 2개의 서열의 상호보완성 시험에 가장 적합한 조건들을 결정할 수 있을 것이다.
이는, 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐, 제1 뉴클레오티드 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와의 염기 짝짓기를 포함한 다. 이러한 서열은 서로에 관해 "완전히 상호보완적"이라고 말할 수 있다. 그러나, 제1 서열과 제2 서열이 완전히 상호보완적이거나, 혼성화시 하나 이상, 일반적으로는 4, 3 또는 2개 이하의 불일치 염기쌍을 형성하지만 이들의 궁극적인 적용에 가장 적절한 조건하에 혼성화되는 능력을 유지하는 경우, 두 서열은 "실질적으로 상호보완적"이라고 말한다. 그러나, 2개 올리고뉴클레오티드가 혼성화시 하나 이상의 단일 가닥 돌출부를 형성하도록 고안된 경우, 이러한 돌출부는 상호보완성의 측정시 불일치로 간주되지 않을 것이다. 예를 들면, 길이 21 뉴클레오티드의 한 올리고뉴클레오티드와 길이 23 뉴클레오티드의 또 다른 올리고뉴클레오티드를 포함하고 긴 올리고뉴클레오티드는 짧은 올리고뉴클레오티드에 완전히 상호보완적인 21 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제제는 본 발명의 목적상 "완전히 상호보완적"이라고 말할 수 있다.
본원에 기재된 "상호보완적" 서열들은, 이들의 혼성화 능력에 관한 상기 요건들이 충족되는 한 비-왓슨-크릭(non-Watson-Crick) 염기쌍 및/또는 합성되고 변성된 뉴클레오티드로부터 형성된 염기쌍 또한 포함하거나 전적으로 이로부터 형성될 수 있다.
본원에서 "상호보완적", "완전히 상호보완적" 및 "실질적으로 상호보완적"은, 이들이 사용되는 문맥으로부터 알 수 있듯, 올리고뉴클레오티드 제제의 센스(sense) 가닥과 안티센스(antisense) 가닥 사이, 또는 올리고뉴클레오티드 제제의 안티센스 가닥과 표적 서열 사이의, 염기 짝짓기에 관련해서 사용될 수 있다.
전령 RNA(mRNA)의 "적어도 일부에 실질적으로 상호보완적"인 폴리뉴클레오티 드는, 관심 mRNA의 근접 부분에 대해 실질적으로 상호보완적인 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들면, 당해 서열이 ApoB를 인코딩하는 mRNA의 비-차단된 부분에 실질적으로 상호보완적인 경우, 폴리뉴클레오티드는 ApoB mRNA의 적어도 일부에 상호보완적이다.
"올리고뉴클레오티드 제제"는 이의 표적에 대해 안티센스인 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 이들 둘 다 또는 이들의 변성체의 단일 가닥 올리고머 또는 중합체를 의미한다. 상기 용어는 자연 발생적 핵염기, 당 및 공유적 인터뉴클레오시드(골격) 연결부로 구성되는 올리고뉴클레오티드, 및 이와 유사하게 작용하는 비-자연 발생적 부분들을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 개질 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 향상된 세포 흡수, 핵산 표적에 대한 향상된 친화성, 및 뉴클레아제의 존재하의 증가된 안정성과 같은 바람직한 특성들로 인해 자연발생적 형태보다 종종 더 바람직하다.
올리고뉴클레오티드 제제는 핵산 표적(NAT: nucleic acid targeting) 올리고뉴클레오티드 제제과 단백질 표적(PT: protein targeting) 올리고뉴클레오티드 제제를 둘 다 포함한다. NAT 및 PT 올리고뉴클레오티드 제제는 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 이들 둘 다 또는 이들의 변성체의 단일 가닥 올리고머 또는 중합체를 의미한다. 상기 용어는 자연 발생적 핵염기, 당 및 공유적 인터뉴클레오시드(골격) 연결부로 구성되는 올리고뉴클레오티드, 및 이와 유사하게 작용하는 비-자연 발생적 부분들을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 변형 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 향상된 세포 흡수, 핵산 표적에 대 한 향상된 친화성, 및 뉴클레아제의 존재하의 증가된 안정성과 같은 바람직한 특성들로 인해 자연발생적 형태보다 종종 더 바람직하다. 특정한 RNA 또는 DNA 표적에 결합하도록 고안된 NAT는 표적 핵산의 10, 20 또는 30 또는 그 이상의 염기와 실질적으로 상호보완적이며(예를 들면, 70%, 80%, 90% 이상, 또는 100%의 상호보완성을 갖는다), 안티센스 RNA, 마이크로RNA, 안타고미르, 및 발현을 조절할 수 있는 다른 비-이중 구조물들을 포함한다. 다른 NAT 올리고뉴클레오티드 제제는 외부 안내 서열(EGS) 올리고뉴클레오티드(올리고자임), DNA자임, 및 리보자임을 포함한다. NAT 올리고뉴클레오티드 제제는 임의의 핵산, 예를 들면, miRNA, 예비-mRNA, mRNA, 또는 DNA를 표적화할 수 있다. 이들 NAT 올리고뉴클레오티드 제제는 왓슨-크릭 상호보완성을 통해 이의 표적에 결합할 수 있거나 결합할 수 없다. PT 올리고뉴클레오티드 제제는 바람직하게는 3차원적 상호작용의 효력에 의하여 단백질 표적에 결합하고, 단백질 활성을 조절한다. 이들은 데코이(decoy) RNA, 압타머(aptamer) 등을 포함한다.
이론에 구애되지 않으면서, 올리고뉴클레오티드 제제는 절단-의존성 또는 절단-비의존성 기전을 포함하는 다수의 기전 중의 하나 이상에 의해 작용할 수 있다. 절단에 기초한 기전은 RNAse H 의존성일 수 있고/있거나 RISC 복합체 기능을 포함할 수 있다. 절단-비의존성 기전은 miRNA에 의해 매개될 수 있는 것과 같은 점유-기반 전사 억류, 또는 압타머와 같은 올리고뉴클레오티드 제제의 단백질로의 결합을 포함한다. 올리고뉴클레오티드 제제는 예비-mRNA 내의 접속 부위의 선택을 변화시킴으로써 유전자의 발현을 변화시키는 데 사용될 수도 있다. 접속의 억제는 부적절하게 처리된 메시지의 분해를 일으켜서 유전자 발현을 하향 조절할 수도 있다.
"이중 가닥(double-stranded) RNA" 또는 "dsRNA"는 상기 정의된 바와 같이 실질적으로 상호보완적인 2개의 역평행 핵산 가닥을 포함하는 이중 구조의 리보핵산 분자의 복합체를 의미한다. 이중 구조를 형성하는 2개의 가닥은 하나의 더 큰 RNA 분자의 상이한 부분들이거나 별개의 RNA 분자들일 수 있다. 별개의 RNA 분자들의 경우, 이러한 dsRNA는 문헌에서 siRNA("short interfering RNA")라고 종종 불리운다. 2개의 가닥이 하나의 더 큰 분자의 부분이고 따라서 이중 구조를 형성하는 한 가닥의 3'-말단과 다른 가닥의 5'-말단 사이의 뉴클레오티드의 연속적 사슬에 의해 연결된 경우, 연결 RNA 쇄를 "헤어핀 루프(hairpin loop)", "짧은 헤어핀(short hairpin) RNA" 또는 "shRNA"라고 부른다. 2개의 가닥이 이중 구조를 형성하는 한 가닥의 3'-말단과 다른 가닥의 5'-말단 사이의 뉴클레오티드의 연속적 사슬이 아닌 공유 결합에 의해 연결되는 경우, 연결 구조물을 "연결체(linker)"라고 부른다. RNA 가닥은 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 염기쌍의 최대 개수는 dsRNA의 가장 짧은 가닥 내의 뉴클레오티드의 개수에서 이중 구조물 내에 존재하는 임의의 돌출부를 뺀 값이다. 이중 구조 이외에 dsRNA는 하나 이상의 뉴클레오티드 돌출부를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "dsRNA"는 다수의 뉴클레오티드에서의 실질적 변형과, 본 명세서에 설명되거나 당업계에 공지된 모든 형태의 변형을 포함하는, 리보뉴클레오티드의 화학적 변형을 포함할 수 있다. siRNA 타입의 분자에서 사용되는 바와 같은 이러한 임의 의 변형은, 본 명세서와 청구의 범위의 목적을 위해 "dsRNA"에 포함된다.
"뉴클레오티드 돌출부(overhang)"는, dsRNA의 한 가닥의 3'-말단이 다른 가닥의 5'-말단을 넘어서 연장되거나 그 반대일 때, dsRNA의 이중 구조로부터 돌출된 짝짓기 않은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들을 의미한다. "뭉툭함(blunt)" 또는 "뭉툭한 말단(blunt end)"은 dsRNA의 말단에서 짝짓지 않은 뉴클레오티드, 즉 뉴클레오티드 돌출부가 존재하지 않음을 의미한다. "뭉툭한 말단" dsRNA는 이의 전체 길이에 걸쳐 이중 가닥인 dsRNA, 즉 분자의 양쪽 말단에서 뉴클레오티드 돌출부를 갖지 않는 dsRNA이다. 명백하게 하기 위해, siRNA의 3'-말단 또는 5'-말단에 접합된 화학적 캡(cap) 또는 비-뉴클레오티드 화학 잔기는, siRNA가 돌출부를 갖는지 뭉툭한 말단인지를 결정하는 경우에는 참작되지 않는다.
"안티센스 가닥"은 표적 서열에 실질적으로 상호보완적인 영역을 포함하는 dsRNA의 가닥을 의미한다. "상호보완성의 영역"은 본 명세서에 정의된 바와 같은 서열(예: 표적 서열)에 실질적으로 상호보완적인 안티센스 가닥 위의 영역을 의미한다. 상호보완성의 영역이 표적 서열에 완전히 상호보완적이지 않은 경우, 불일치는 말단 영역에서 대부분 허용되며, 존재한다면, 예를 들면, 5' 및/또는 3' 말단의 6, 5, 4, 3, 또는 2 뉴클레오티드 이내의 말단 영역 또는 영역들에 일반적으로 존재한다.
"센스 가닥"은 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상호보완적인 영역을 포함하는 dsRNA의 가닥을 의미한다.
"사일런스(silence)" 및 "발현의 억제"는 이들이 표적 유전자를 일컫는 한에 있어서는, 상기 유전자의 발현이 억제되도록 처리된 제1 세포 또는 세포의 그룹으로부터 단리될 수 있는 유전자로부터 전사된 mRNA의 양이, 제1 세포 또는 세포의 그룹과 실질적으로 동일하되 그렇게 처리되지 않은 제2 세포 또는 세포의 그룹(대조 세포)에 비해 감소된 것으로부터 입증되는 바와 같이, 유전자 발현이 적어도 부분적으로 억제됨을 의미한다. 억제도는 일반적으로 다음과 같이 표현된다.
Figure 112009026592906-PCT00088
또는, 억제도는 유전자 전사와 기능적으로 관련된 인자, 예를 들면, 상기 유전자에 의해 암호화된 세포에 의해 분비되는 단백질의 양, 또는 특정한 표현형(예: 아폽토시스)을 나타내는 세포의 수의 감소로 표현될 수도 있다. 원리적으로, 유전자 사일런스는 표적물을 발현하는 임의의 세포에서 임의의 적합한 분석법에 의해 구성적으로 또는 게놈 공학에 의해 측정될 수 있다. 그러나, 주어진 dsRNA가 유전자의 발현을 특정한 정도로 억제함으로써 본 발명에 포함되는지를 측정하기 위해 참고가 필요할 경우 하기 실시예에 제공된 분석이 이러한 참고로서 이용될 것이다.
예를 들면, 특정한 경우, 유전자의 발현은 본 발명의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 투여에 의해 약 20%, 25%, 35% 또는 50% 이상 억제된다. 몇몇 양태에서, 유전자는 본 발명의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 투여에 의해 약 60%, 70% 또는 80% 이상 억제된다. 몇몇 양태에서, 유전자는 본 발명의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 투여에 의해 약 85%, 90% 또는 95% 이상 억제된다.
"치료"는 특정 유전자를 하향 조절함으로써 중재될 수 있는 병리학적 과정의 경감 또는 완화를 의미한다. 본 발명에서 "치료"가 (유전자의 하향 조절에 의해 중재될 수 있는 병리학적 과정 이외의) 후술되는 다른 임의의 질환에 관련되는 한, "치료"는 상기 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 경감 또는 완화, 또는 상기 질환의 진행의 완화 또는 역전을 의미한다.
"치료적 유효량" 및 "예방적 유효량"은 유전자의 하향 조절에 의해 중재될 수 있는 병리학적 과정 또는 유전자의 하향 조절에 의해 중재될 수 있는 병리학적 과정의 외적 증상의 치료, 예방 또는 처리에서 치료적 유익성을 제공하는 양을 의미한다. 특정한 치료적 유효량은 통상의 의료인에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 예를 들면, 유전자의 하향 조절에 의해 중재될 수 있는 병리학적 과정의 종류, 환자의 병력 및 연령, 유전자 발현의 하향 조절에 의해 중재될 수 있는 병리학적 과정의 단계, 및 유전자 발현의 하향 조절에 의해 중재될 수 있는 다른 병리학적 과정 억제제의 투여와 같은 당업계에 공지된 인자들에 의해 달라질 수 있다. 환자의 치료에 있어서 유효량은 치료적 유익성을 제공하기에 충분하다. 여기서 "치료적 유익성"은 환자의 세포 증식성 질환의 의학적 치료에 관하여 환자의 건강을 향상 또는 증진시키는 모든 것을 의미한다. 이의 예로는, 환자 수명의 연장, 질환의 신생물 성장의 감소 또는 지연, 과증식의 감소, 종양 성장의 감소, 전이의 지연, 암 세포, 종양 세포 또는 다른 임의의 과증식성 세포의 증식 속도 감소, 치료된 임의의 세포 또는 치료된 세포의 영향을 받은 임의의 세포의 세포사멸 유도, 및/또는 질환에 의해 일어날 수 있는 환자의 통증 감소가 포함된다.
"약제학적 조성물"은 약물학적 유효량의 올리고뉴클레오티드 제제 및 약제학 적으로 허용되는 담체를 포함한다. "약물학적 유효량", "치료적 유효량" 또는 간단히 "유효량"은 의도하는 약물학적, 치료적 또는 예방적 결과를 제공하는 데 효과적인 RNA의 양을 의미한다. 예를 들면, 질환 또는 장애과 관련된 측정가능한 인자가 25% 이상 감소할 때 제공된 임상 치료가 효과적인 것으로 간주되는 경우, 상기 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약물의 치료적 유효량은 상기 인자를 25% 이상 감소시키는 데 필요한 양이다.
"약제학적으로 허용되는 담체"는 치료제의 투여를 위한 담체를 의미한다. 이러한 담체로는, 제한 없이, 염수, 완충 염수, 덱스트로오스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 배합물이 포함되며, 아래에 더 상세히 설명한다. 상기 "담체"는 특별히 세포 배양 매질은 제외한다.
본 발명의 하나 이상의 양태들을 첨부된 도면과 아래의 설명을 통해 상세히 설명하겠다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 본 명세서의 설명과 도면 및 청구의 범위로부터 명백해질 것이다.
[도면의 간단한 설명]
도 1은 각종 ND98 조성물의 효능을 비교한 막대 그래프이다.
도 2는 각종 ND98 조성물의 효능을 비교한 막대 그래프이다.
도 3은 ND98의 6-말단 이성체의 효능을 나타내는 막대 그래프이다.
도 4는 2가지 상이한 방법을 사용하여 제조한 회합 복합체의 효능을 비교한 막대 그래프이다.
도 5는 각종 쇄 길이를 갖는 잔기들을 포함하는 각종 PEG 지질 잔기를 보여준다.
도 6은 회합 복합체의 효능을 비교한 막대 그래프이다.
도 7은 siRNA에 대한 지질의 비율이 감소할 때 각종 복합체의 내성을 비교한 막대 그래프이다.
도 8은 핵산이 부하된 회합 복합체의 제조 방법의 흐름도이다.
도 9는 FVII 및 ApoB의 2개의 표적을 갖는 siRNA의 효능을 보여주는 막대 그래프이다.
도 10은 핵산이 부하된 회합 복합체의 제조 방법의 흐름도이다.
도 11은 사일런싱(silencing) 분석에서 회합 복합체의 입자 크기가 핵산의 효능에 미치는 영향을 보여주는 막대 그래프이다.
도 12a 및 12b는 비제형화 및 제형화 형태의 핵산 치료제의 혈청 반감기를 비교한 막대 그래프이다.
도 13은 각종 쇄 길이를 갖는 PEG 지질을 갖는 회합 복합체의 효능을 비교한 막대 그래프이다.
본 명세서에서는 siRNA와 같은 핵산계 치료제를 투여하는 데 유용한 지질 제제 및 전달 장치가 설명된다.
양이온성 지질 화합물 및 지질 제제
폴리아민 지질 제제
본 출원인은 특정한 폴리아민 지질 잔기가 siRNA와 같은 핵산의 투여를 위해 바람직한 특성들을 제공함을 발견하였다. 예를 들면, 몇몇 양태에서는 지질 잔기를 인자 VII-표적화 siRNA와 함께 복합시켜 마우스와 같은 동물에 투여한다. 그런 다음 분비된 혈청 인자 VII의 농도를 정량화(투여 후 24시간째)하는데, 이때 인자 VII의 사일런스 정도는 생체내 siRNA 전달의 정도를 나타낸다. 따라서, siRNA와 같은 핵산의 향상된 생체내 전달을 제공하는 지질이 바람직하다. 특히, 본 출원인은 본원에 기재된 치환체를 갖는 폴리아민이 siRNA를 전달하기 위한 바람직한 특성들, 예를 들면, 생체이용율, 생체분해성 및 내성을 가질 수 있음을 발견하였다.
한 양태에서, 지질 제제는 아크릴아미드 또는 아크릴레이트 치환체와 같은 다수의 치환체들이 부착된 폴리아민 성분을 포함한다. 예를 들면, 지질 잔기는 화학식
Figure 112009026592906-PCT00089
(여기서, 하나 이상의 수소 원자는, 예를 들면, 장쇄 알킬, 알케닐 또는 알키닐 잔기(몇몇 양태에서 이들은 추가로 치환된다)를 포함하는 치환체로 치환된다)의 폴리아민 성분을 포함할 수 있다. Xa 및 Xb는 알킬렌 잔기이다. 몇몇 양태에서, Xa 및 Xb는 동일한 쇄 길이를 갖는데, 예를 들면, Xa 및 Xb는 둘 다 에틸렌 잔기이다. 다른 양태에서, Xa 및 Xb는 서로 다른 쇄 길이를 갖는다. 몇몇 양태에서, 폴리아민이 다수의 Xa 잔기를 포함하는 경우 Xa는 서로 다를 수 있다. 예를 들면, 폴리아민이 스페르민인 경우 Xa 중의 하나는 프로필렌이고 다른 Xa는 부틸렌이며, Xb는 프로필렌이다.
본 출원인은 몇몇 경우에는 폴리아민 위에 비교적 높은 치환도를 가짐이 바람직하다는 것을 발견하였다. 예를 들면, 몇몇 경우 본 출원인은 제제 중의 80% 이상(예: 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 또는 거의 전부)의 폴리아민이 n+2개 이상의 치환된 수소를 갖는 폴리아민 제제가 siRNA와 같은 핵산을 투여하는 데 바람직한 특성들을 제공함을 발견하였다.
몇몇 경우, 폴리아민의 질소 위의 치환체에 하나 이상의 헤테로 원자가 존재함이 바람직하다.
몇몇 양태에서, 상기 제제는 화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 포함한다.
화학식 I
Figure 112009026592906-PCT00090
위의 화학식 I에서,
Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 C1 -6 알킬렌이고,
n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고,
R은 각각 독립적으로 H,
Figure 112009026592906-PCT00091
(Ra),
Figure 112009026592906-PCT00092
(Rb),
Figure 112009026592906-PCT00093
(Rc),
Figure 112009026592906-PCT00094
(Rd) 또는
Figure 112009026592906-PCT00095
(Re)이고,
여기서, 상기 제제 중의 화학식 I의 화합물의 분자들 중의 약 80% 이상에서, n+2개 이상의 R 잔기는 H가 아니고,
m은 1, 2, 3 또는 4이고,
Y는 O, NR2 또는 S이고, R1은 알킬, 알케닐 또는 알키닐(이들 각각은 임의로 치환된다)이고,
R2는 H, 알킬, 알케닐 또는 알키닐(이들 각각은 임의로 치환된다)이되, 단 n이 0인 경우 n+3개 이상의 R 잔기는 H가 아니다.
앞서 언급한 바와 같이, 제제는 대칭 및 비대칭 폴리아민 유도체를 함유하는 분자를 포함한다. 따라서, 각각의 경우 Xa는 독립적이며 Xb는 Xa에 대해 독립적이다. 예를 들면, n이 2인 경우 Xa는 모두 동일하거나 모두 상이하거나 일부는 동일하고 다른 일부는 상이할 수 있다. Xb는 각각의 폴리아민 유도체에서 Xa의 수에 관계없이 Xa에 대해 독립적이다. Xa는 Xb에 대해 독립적으로 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌 또는 헥실렌일 수 있다. 폴리아민 유도체의 예로는 N1,N1'-(에탄-1,2-디일)디에탄-1,2-디아민, 에탄-1,2-디아민, 프로판-1,3-디아민, 스페르민, 스페르미딘, 푸트레신(putrecine), 및 N'-(2-아미노에틸)-프로판-1,3-디아민으로부터 유도된 폴리아민이 포함된다. 바람직한 폴리아민 유도체로는 프로판-1,3-디아민 및 N1,N1'-(에탄-1,2-디일)디에탄-1,2-디아민이 포함된다.
화학식 I의 폴리아민은 H가 아닌 n+2개 이상의 R 잔기로 치환된다. 일반적으로, 각각의 비-수소 R 잔기는 연결체를 통해 폴리아민 유도체의 질소에 부착된 알킬, 알케닐 또는 알키닐 잔기(이들은 하나 이상의 치환체로 임의로 치환된다)를 포함한다. 적합한 연결체로는 아미드, 에스테르, 티오에스테르, 설폰, 설폭사이드, 에테르, 아민, 및 티오에테르가 포함된다. 다수의 경우, 연결체 잔기는 알킬렌 잔기(예: 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 또는 부틸렌)를 통해 폴리아민의 질소에 결합된다. 예를 들면, 아미드 또는 에스테르 연결체는 메틸렌 또는 에틸렌 잔기를 통해 폴리아민의 질소에 부착된다.
바람직한 아민 치환체의 예는 화학식
Figure 112009026592906-PCT00096
,
Figure 112009026592906-PCT00097
,
Figure 112009026592906-PCT00098
및
Figure 112009026592906-PCT00099
이다. 아민이 에틸렌 그룹을 통해 연결체-R1 부분에 결합되는 경우, 1,4 접합된 전구체 아크릴레이트 또는 아크릴아미드가 폴리아민과 반응하여 치환된 폴리아민을 제공할 수 있다. 아민이 메틸렌 그룹을 통해 연결체-R1 부분에 결합되는 경우, 알파-클로로 잔기와 같은 알파-할로 치환체를 포함한 아미드 또는 에스테르가 폴리아민과 반응하여 치환된 폴리아민을 제공할 수 있다. 바람직한 양태에서, R2는 H이다.
H가 아닌 R 잔기는 모두 상기 표시된 바와 같은 R1 잔기를 필요로 한다. 일반적으로, R1 잔기는 C6-C32 알킬, C6-C32 알케닐, 또는 C6-C32 알키닐과 같은 장쇄의 잔기이다.
몇몇 바람직한 양태에서, R1은 알킬 잔기이다. 일례로 R1은 C10-C18 알킬, 예를 들면, C12 알킬이다. 특히 바람직한 R 잔기의 예는
Figure 112009026592906-PCT00100
및
Figure 112009026592906-PCT00101
이다.
화학식 I의 화합물을 포함하는 제제는 다수의 화학식 I의 화합물의 혼합물일 수 있다. 예를 들면, 제제는 폴리아민 성분 위의 각종 치환도를 갖는 화학식 I의 화합물들의 혼합물을 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 기재된 제제는 제제 중의 화학식 I의 화합물의 분자들 중의 약 80% 이상(예: 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 또는 거의 전부)에서 n+2개 이상의 R 잔기는 H가 아니다.
몇몇 양태에서, 상기 제제는 2개의 아미노 그룹을 갖는 폴리아민 성분을 포함하며, 이때 혼합물 중의 화학식 I의 분자들 중의 약 80% 이상(예: 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 또는 거의 전부)은 H가 아닌 3개의 R 잔기로 치환된다. 화학식 I의 화합물의 예는
Figure 112009026592906-PCT00102
및
Figure 112009026592906-PCT00103
이다.
몇몇 바람직한 양태에서, R은
Figure 112009026592906-PCT00104
또는
Figure 112009026592906-PCT00105
이다.
몇몇 바람직한 양태에서, R1은 C10-C18 알킬 또는 C10-C30 알케닐이다.
몇몇 양태에서, 상기 제제는 3 또는 4개(예: 4개)의 아미노 그룹을 갖는 폴리아민 성분을 포함하며, 이때 화학식 I의 분자들 중의 약 80% 이상(예: 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 또는 거의 전부)에서 n+2개 이상의 R 잔기는 H가 아니다. 4개의 아미노 잔기를 갖는 화학식 I의 화합물의 예는 아래와 같다.
모든(즉, n+4개의) R 잔기가 H가 아닌 폴리아민 잔기의 예는
Figure 112009026592906-PCT00106
이다.
몇몇 바람직한 양태에서, R은
Figure 112009026592906-PCT00107
또는
Figure 112009026592906-PCT00108
이다.
몇몇 바람직한 양태에서, R1은 C10-C18 알킬(예: C12 알킬) 또는 C10-C30 알케닐이다.
5개(즉, n+3)의 R 잔기가 H가 아닌 폴리아민 잔기의 예는
Figure 112009026592906-PCT00109
및
Figure 112009026592906-PCT00110
이다.
몇몇 바람직한 양태에서, R은
Figure 112009026592906-PCT00111
또는
Figure 112009026592906-PCT00112
이다.
몇몇 바람직한 양태에서, R1은 C10-C18 알킬(예: C12 알킬), 또는 C10-C30 알케닐이다.
4개(즉, n+2개)의 R 잔기가 H가 아닌 폴리아민 잔기의 예는
Figure 112009026592906-PCT00113
,
Figure 112009026592906-PCT00114
,
Figure 112009026592906-PCT00115
,
Figure 112009026592906-PCT00116
및
Figure 112009026592906-PCT00117
이다.
몇몇 바람직한 양태에서, R은
Figure 112009026592906-PCT00118
또는
Figure 112009026592906-PCT00119
이다.
몇몇 바람직한 양태에서, R1은 C10-C18 알킬(예: C12 알킬), 또는 C10-C30 알케닐이다.
몇몇 바람직한 양태에서, 폴리아민은 이성체(1)
Figure 112009026592906-PCT00120
또는 이성체(2)
Figure 112009026592906-PCT00121
의 화합물, 바람직하게는 이성체(1)의 화합물이다.
몇몇 양태에서, 화학식 I의 화합물을 포함하는 제제는 화학식 I을 갖는 분자들의 혼합물을 포함한다. 예를 들면, 혼합물은 동일한 폴리아민 코어를 갖지만 상이한 R 치환체(예를 들면, H가 아닌 R의 상이한 치환도)를 갖는 분자들을 포함할 수 있다.
몇몇 양태에서, 본원에 기재된 제제는 단일 폴리아민 코어를 갖고 폴리아민 코어의 각각의 R은 R이거나
Figure 112009026592906-PCT00122
또는
Figure 112009026592906-PCT00123
와 같은 단일 잔기인 화학식 I의 화합물을 포함한다. 따라서, 제제는 H인 각종 수의 R 잔기를 갖는 화학식 I의 폴리아민 화합물 및/또는 H가 아닌 한 가지 결정된 수의 R 잔기를 갖는 화학식 I의 폴리아민 화합물을 포함하는, 화학식 I을 갖는 분자들의 혼합물을 포함하고, 여기서 화학식 I의 화합물은 상기 제공된 구조 이성체와 같은 폴리아민의 구조 이성체이다.
몇몇 바람직한 양태에서, 제제는 분자들 중의 80% 이상(예: 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 또는 거의 전부)이 단일 구조 이성체가 되도록 화학식 I의 분자들을 포함한다.
몇몇 양태에서, 상기 제제는 2종 이상의 화학식 I의 화합물들의 혼합물을 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 제제는 동일한 화학식의 구조 이성체들의 혼합물이다. 몇몇 양태에서, 상기 제제는 화학적 성질이 다른 R 치환체들을 갖는 화학식 I의 화합물들의 혼합물이다. 예를 들면, 제제는 화학식 I
Figure 112009026592906-PCT00124
의 화합물(여기서, n은 0이고, R은 각각 독립적으로 H 또는
Figure 112009026592906-PCT00125
이다) 및 화학식 I
Figure 112009026592906-PCT00126
의 화합물(여기서, n은 2이고, R은 각각 독립적으로 H 또는
Figure 112009026592906-PCT00127
이다)의 혼합물을 포함할 수 있다.
몇몇 양태에서, 화학식 I의 화합물은 약제학적으로 허용되는 염과 같은 염의 형태를 갖는다. 염은, 예를 들면, 음이온과 본원에 기재된 화합물 위의 양으로 하전된 치환체(예: 아미노) 사이에서 형성될 수 있다. 적합한 음이온으로는 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 설페이트, 비설페이트, 니트레이트, 포스페이트, 시트레이트, 메탄설포네이트, 트리플루오로아세테이트, 아세테이트, 푸마레이트, 올레에이트, 발레레이트, 말레에이트, 옥살레이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 타르트레이트, 탄네이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 석시네이트, 겐티시네이트, 글루코네이트, 글루카로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 및 파모에이트가 포함된다. 몇몇 바람직한 양태에서, 화학식 I의 화합물은 하이드로클로라이드 염과 같은 하이드로할라이드 염이다.
화학식 I의 화합물은 본원에 기재된 수화물(예: (H2O)n) 및 용매 화합물의 형태로 존재할 수도 있다.
생체분해성의 양이온성 지질
본 출원인은 1종 이상의 생체분해성 잔기를 포함하는 특정한 양이온성 지질이 핵산 치료제(예: dsRNA)의 전달을 위한 리포솜과 같은 회합 복합체의 한 가지 잔기로서 사용될 수 있음을 발견하였다. 예를 들면, 본원에는 에스테라제, 아미다제 또는 디설파이드 분해 효소와 같은 효소를 통해 생체내에서 분해되는 양이온성 지질이 개시된다. 몇몇 경우, 지질은, 예를 들면, 아세탈 또는 케탈과 같은 산 분해성 잔기의 가수분해에 의해 화학적으로 분해된다. 몇몇 양태에서, 상기 지질은 시험관내에서 가수분해된 후 1종 이상의 에스테라제, 아미다제 또는 디설파이드 분해 효소에 의해 효소 분해되는 잔기를 포함한다. 이것은 엔도솜과 같은 세포의 소포체 구획에서 일어날 수 있다. 다른 산 민감성의 분해성 결합은 엔도솜의 산성 환경 내에서 분해되는 β-티오프로피오네이트 결합이다(Jeong et al., Bioconjugate chem. 2003, 4, 1426).
몇몇 양태에서, 본 발명은 화학식 X의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염에 관한 것이다.
화학식 X
Figure 112009026592906-PCT00128
위의 화학식 X에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 1 내지 4개의 R5로 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 1 내지 4개의 R5로 임의로 치환된 C2-C6 알케닐 또는 C(NR6)(NR6)2이고,
R3 및 R4는 각각 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐(이들 각각은 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도로 임의로 치환된다)이고,
L1 및 L2는 각각 독립적으로 -NR6C(O)-, -C(O)NR6-, -OC(O)-, -C(O)O-, -S-S-, -N(R6)C(O)N(R6)-, -OC(O)N(R6)-, -N(R6)C(O)O-, -O-N=O-, OR-OC(O)NH이거나,
L1-R3 및 L2-R4는 함께 아세탈 또는 케탈을 형성할 수 있고,
R5는 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, -OR7, -N(R8)(R9), -CN, SR10, S(O)R10 또는 S(O)2R10이고,
R6은 H 또는 C1-C6 알킬이고,
R7은 H 또는 C1-C6 알킬이고,
R8 및 R9는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고,
R10은 H 또는 C1-C6 알킬이고,
m은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고,
n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
몇몇 양태에서, R1은 H, 메틸, 에틸, 프로필 또는 이소프로필과 같은 저급 알킬, 또는 2-하이드록시에틸과 같은 치환된 알킬이다.
몇몇 양태에서, R2는 H 또는 메틸, 에틸, 프로필 또는 이소프로필과 같은 저급 알킬이다.
몇몇 양태에서, R1 또는 R2는 화학식 X의 질소와 함께 구아니딘 잔기를 형성한다.
L1-R3 및 L2-R4 또는 이들의 배합물은 생체내에서 분해되는 하나 이상의 잔기를 제공한다. 몇몇 양태에서, L1-R3 및 L2-R4는 둘 다 생체분해성이다. 예를 들면, L1-R3 및 L2-R4는 둘 다 독립적으로 (예를 들면, 에스테라제, 아미다제, 또는 디설파이드 분해 효소에 의해) 효소 분해된다. 몇몇 양태에서, L1 및 L2는 둘 다 에스테르, 아미드 또는 디설파이드와 같은 동일한 화학적 잔기이다. 다른 경우, L1 및 L2는 상이하며, 예를 들면, L1 또는 L2 중의 하나는 에스테르이고 L1 또는 L2 중 다른 하나는 디설파이드이다.
몇몇 경우, L1-R3 및 L2-R4는 함께 생체내에서 가수분해되는 아세탈 또는 케탈 잔기를 형성한다.
몇몇 양태에서, L1-R3 또는 L2-R4 중의 하나는 효소 분해된다. 예를 들면, L1-R3 또는 L2-R4 중의 하나는 생체내에서 분해되어 지질 위에 유리 하이드록실 잔기 또는 유리 아민을 제공하고, 이것이 나머지의 L1-R3 또는 L2-R4 잔기와 함께 화학적으로 반응할 수 있게 된다. 예시적 양태는 다음과 같다.
Figure 112009026592906-PCT00129
몇몇 바람직한 양태에서, 카바메이트 또는 우레아 잔기가 아미드, 에스테르 또는 디설파이드 잔기와 함께 포함된다. 예를 들면, 지질은 분해(예: 효소적 분해)시 카바메이트 또는 우레아 잔기와 화학적으로 반응할 수 있게 되는 에스테르 잔기를 포함한다. 일부의 바람직한 L1 및 L2의 조합으로는 2개의 아미드, 2개의 에스테르, 아미드와 에스테르, 2개의 디설파이드, 아미드와 디설파이드, 에스테르와 디설파이드, 카바메이트와 디설파이드, 및 우레아와 디설파이드가 포함된다. 화합물의 예는 다음과 같다.
Z 배위를 갖는 아미드 에스테르 결합(2개의 이중 결합)
Figure 112009026592906-PCT00130
Z 배위를 갖는 아미드 및 에스테르 결합(3개의 이중 결합)
Figure 112009026592906-PCT00131
E 배위를 갖는 아미드 및 에스테르 결합(2개의 이중 결합)
Figure 112009026592906-PCT00132
E 배위를 갖는 아미드 및 에스테르 결합(3개의 이중 결합)
Figure 112009026592906-PCT00133
디설파이드 결합
Figure 112009026592906-PCT00134
불포화 알킬 쇄를 갖는 E 및 Z 배위의 디설파이드 결합
Figure 112009026592906-PCT00135
포화 및 불포화 알킬 쇄를 갖는 아미드 및 디설파이드 결합
Figure 112009026592906-PCT00136
Figure 112009026592906-PCT00137
포화 및 불포화 알킬 쇄를 갖는 에스테르 및 디설파이드 결합
Figure 112009026592906-PCT00138
Figure 112009026592906-PCT00139
알킬 쇄를 갖는 카바메이트 또는 우레아 및 디설파이드 결합
Figure 112009026592906-PCT00140
불포화 알킬 쇄를 갖는 카바메이트 또는 우레아 및 디설파이드 결합
Figure 112009026592906-PCT00141
불포화 알킬 쇄를 갖는 카바메이트 또는 우레아 및 디설파이드 결합
Figure 112009026592906-PCT00142
불포화 알킬 쇄를 갖는 카바메이트 및 우레아 결합
Figure 112009026592906-PCT00143
몇몇 양태에서, 상기 지질은 산성 분해를 일으킬 수 있는 옥심 또는 하이드라존을 포함한다.
R3 및 R4는 일반적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐과 같은 장쇄의 소수성 잔기이다. 몇몇 양태에서, R3 또는 R4는 할로 잔기로 치환되어 예를 들면, 퍼플루오로알킬 또는 퍼플루오로알케닐 잔기를 제공한다. R3 및 R4는 서로 각각 독립적이다. 몇몇 양태에서, R3와 R4는 둘 다 동일하다. 몇몇 양태에서, R3와 R4는 상이하다.
몇몇 양태에서, R3 및/또는 R4는 알킬이다. 예를 들면, R3 및/또는 R4 중 어느 하나 또는 둘 모두는 C6 내지 C30 알킬, 예를 들면, C10 내지 C26 알킬, C12 내지 C20 알킬 또는 C12 알킬이다.
몇몇 양태에서, R3 및/또는 R4는 알케닐이다. 몇몇 바람직한 양태에서, R3 및/또는 R4는 2 또는 3개의 이중 결합을 포함한다. 예를 들면, R3 및/또는 R4는 2개의 이중 결합을 포함하거나, R3 및/또는 R4는 3개의 이중 결합을 포함한다. 이중 결합은 각각 독립적으로 Z 또는 E 배위를 가질 수 있다. 알케닐 잔기의 예로는 화학식
Figure 112009026592906-PCT00144
,
Figure 112009026592906-PCT00145
,
Figure 112009026592906-PCT00146
및
Figure 112009026592906-PCT00147
(여기서, x는 1 내지 8의 정수이고, y는 1 내지 10의 정수이다)가 있다. 몇몇 바람직한 양태에서, R3 및/또는 R4는, 예를 들면, 2개의 이중 결합(예: Z 배위를 갖는 2개의 이중 결합)을 갖는 C6 내지 C30 알케닐, 예를 들면, C10 내지 C26 알케닐, C12 내지 C20 알케닐, 또는 C17 알케닐이다. R3 및/또는 R4는 동일하거나 상이할 수 있다. 몇몇 바람직한 양태에서, R3와 R4는 동일하다.
몇몇 양태에서, R3 및/또는 R4는 알키닐이다. 예를 들면, C6 내지 C30 알키닐, 예를 들면, C10 내지 C26 알키닐, C12 내지 C20 알키닐이다. R3 및/또는 R4는 1 내지 3개의 삼중 결합, 예를 들면, 1, 2 또는 3개의 삼중 결합을 가질 수 있다.
몇몇 양태에서, 화학식 X의 화합물은 약제학적으로 허용되는 염과 같은 염의 형태를 갖는다. 염은, 예를 들면, 음이온과 본원에 기재된 화합물 위의 양으로 하전된 치환체(예: 아미노) 사이에서 형성될 수 있다. 적합한 음이온으로는 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 설페이트, 비설페이트, 니트레이트, 포스페이트, 시트레이트, 메탄설포네이트, 트리플루오로아세테이트, 아세테이트, 푸마레이트, 올레에이트, 발레레이트, 말레에이트, 옥살레이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 타르트레이트, 탄네이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 석시네이트, 겐티시네이트, 글루코네이트, 글루카로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 및 파모에이트가 포함된다. 몇몇 바람직한 양태에서, 화학식 X의 화합물은 하이드로클로라이드 염과 같은 하이드로할라이드 염이다.
화학식 X의 화합물은 본원에 기재된 수화물(예: (H2O)n) 및 용매 화합물의 형태로 존재할 수도 있다.
PEG-지질 화합물
본 출원인은 특정한 PEG 함유 지질 잔기가 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산(예: siRNA)과 같은 핵산 잔기의 투여를 위한 바람직한 특성들을 제공함을 발견하였다. 예를 들면, 본원에 기재된 지질과 같은 PEG 함유 지질을 siRNA와 같은 핵산 잔기과 함께 회합 복합체로서 제조하여 환자에 투여하는 경우 지질은 핵산 잔기의 향상된 전달을 제공한다. 이러한 향상된 전달은, 예를 들면, FVII의 사일런스와 같은 유전자 사일런싱 분석의 평가에 의해 측정될 수 있다. 특히, 본 출원인은 화학식 XV의 PEG-지질은 개선된 생체이용율, 생체분해성 및 내성을 포함하는 siRNA의 전달을 위한 바람직한 특성들을 가질 수 있음을 발견하였다.
몇몇 양태에서, PEG는 연결체 잔기를 통해 장쇄 알킬 잔기와 같은 2개의 소수성 잔기를 포함하는 구조물에 결합된다. PEG-지질의 예로는 상술된 바와 같이 화학식 XV, XV' 및 XVI로 표시되는 화합물들이 포함된다. 몇몇 바람직한 양태에서, PEG-지질은 화학식
Figure 112009026592906-PCT00148
(여기서, 키랄 중심의 바람직한 입체화학은 'R'이고, 반복되는 PEG 잔기는 약 2000달톤의 총 평균 분자량을 갖는다)을 갖는다.
몇몇 양태에서, 본원에 기재된 PEG 지질은 표적 잔기, 예를 들면,
Figure 112009026592906-PCT00149
과 같은 글리코실 잔기에 접합된다. 몇몇 양태에서, 표적 잔기는 연결체, 예를 들면, 본원에 기재된 연결체를 통해 PEG 지질에 결합된다. 표적화된 PEG 지질 화합물의 예로는 본원에 기재된 화학식 XXI, XXI', XXII 및 XXII'의 화합물이 있다. 이러한 지질의 제조 방법은, 예를 들면, 실시예 42 및 43에 설명되어 있다.
양이온성 지질 화합물 및 양이온성 지질 함유 제제의 제조 방법
본원에 기재된 화합물들은 상업적 구입원(예: Asinex, Moscow, Russia; Bionet, Camelford, England; ChemDiv, SanDiego, CA; Comgenex, Budapest, Hungary; Enamine, Kiev, Ukraine; IF Lab, Ukraine; Interbioscreen, Moscow, Russia; Maybridge, Tintagel, UK; Specs, The Netherlands; Timtec, Newark, DE; Vitas-M Lab, Moscow, Russia)으로부터 구입하거나 시판의 출발 재료와 시약을 사용하여 후술되는 바와 같은 통상의 방법으로 합성할 수 있다.
폴리아민 지질의 제조 방법
몇몇 양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 III의 폴리아민을 화학식 IV의 1,4 접합된 화합물과 함께 반응시켜 화학식 I의 화합물을 제공함으로써 제조될 수 있다.
화학식 III
Figure 112009026592906-PCT00150
화학식 IV
Figure 112009026592906-PCT00151
위의 화학식 III 및 IV에서,
Xa, Xb, n, Y 및 R1은 상기 정의된 바와 같다.
몇몇 양태에서, 화학식 III 및 IV의 화합물은 순물질 형태로 함께 반응된다(즉, 용매를 사용하지 않는다). 예를 들면, 화학식 III 및 IV의 화합물은 승온(예: 약 60℃ 이상, 약 65℃ 이상, 약 70℃ 이상, 약 75℃ 이상, 약 80℃ 이상, 약 85℃ 이상, 또는 약 90℃ 이상), 바람직하게는 약 90℃에서 순물질 형태로 함께 반응된다.
몇몇 양태에서, 화학식 III 및 IV의 화합물은 용매(예: 아세토니트릴 또는 DMF와 같은 극성의 비양성자성 용매) 중에 함께 반응된다. 예를 들면, 화학식 III 및 IV의 화합물은 약 50℃ 내지 약 120℃의 승온에서 용매 중에 함께 반응된다.
몇몇 양태에서, 화학식 III 및 IV의 화합물은 라디칼 켄처 또는 스캐빈저(scavenger)(예: 하이드로퀴논)의 존재하에 함께 반응된다. 라디칼 켄처를 포함하는 반응 상태는 순물질 형태이거나 용매, 예를 들면, 아세토니트릴 또는 DMF와 같은 극성의 비양성자성 용매 중일 수 있다. 반응은 승온에서 수행될 수 있다(예: 순물질 형태로 90℃와 같은 승온에서, 또는 용매 중에서 약 50℃ 내지 약 120℃와 같은 승온에서 수행). "라디칼 켄처" 또는 "라디칼 스캐빈저"는 반응 혼합물 중의 유리 라디칼을 흡수할 수 있는 화학적 성분을 의미한다. 라디칼 켄처/스캐빈저의 예로는 하이드로퀴논, 아스코르브산, 크레솔, 티아민, 3,5-디-3급-부틸-4-하이드록시톨루엔, 3급-부틸-4-하이드록시아니솔 및 티올 함유 성분이 포함된다.
몇몇 양태에서, 화학식 III 및 IV의 화합물은 반응 촉진제(예: 물 또는 마이클 첨가 촉진제, 예를 들면, 아세트산, 붕산, 시트르산, 벤조산, 토식산, 펜타플루오로페놀, 피크르산, 방향족산, 염, 예를 들면, 비카보네이트, 비설페이트, 모노 및 디-하이드로겐 포스페이트, 페놀, 퍼할로페놀, 니트로페놀, 설폰산, PTTS 등), 바람직하게는 붕산 포화 수용액과 같은 붕산의 존재하에 함께 반응된다. 반응 촉진제를 포함하는 반응 상태는 순물질 형태이거나 용매, 예를 들면, 아세토니트릴 또는 DMF와 같은 극성의 비양성자성 용매 중일 수 있다. 반응은 승온에서 수행될 수 있다(예: 순물질 형태로 90℃와 같은 승온에서, 또는 용매 중에서 약 50℃ 내지 약 120℃와 같은 승온에서 수행). "반응 촉진제"는 반응 혼합물 내에 사용시 반응의 속도를 가속화/향상시키는 화학적 성분을 의미한다.
화학식 IV의 화합물에 대한 화학식 III의 화합물의 비율을 변화시켜 화학식 III의 폴리아민의 각종 치환도를 제공할 수 있다. 일반적으로, 약 50% 이상의 수소 잔기가 비-수소 잔기로 치환된 폴리아민이 바람직하다. 따라서, 화학식 III/화학식 IV의 화합물의 비는 유리 아민의 비교적 높은 치환도(예: 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 99% 이상, 또는 거의 모두)를 갖는 생성물이 제공되도록 선택된다. 몇몇 바람직한 양태에서, 화학식 III에서 n은 0이고, 화학식 IV의 화합물에 대한 화학식 III의 화합물의 비는 약 1:3 내지 약 1:5, 바람직하게는 약 1:4이다. 몇몇 바람직한 양태에서, 화학식 III에서 n은 2이고, 화학식 IV의 화합물에 대한 화학식 III의 화합물의 비는 약 1:3 내지 약 1:6, 바람직하게는 약 1:5이다.
몇몇 양태에서, 화학식 III 및 IV의 화합물은 2단계 공정으로 반응된다. 예를 들면, 제1 단계 공정은 화학식 III의 화합물 약 0.8 내지 약 1.2몰당량과 화학식 IV의 화합물 약 3.8 내지 약 4.2몰당량을 갖는 반응 혼합물을 포함하고, 제2 단계 공정은 반응 혼합물에 화학식 IV의 화합물 약 0.8 내지 약 1.2몰당량을 첨가하는 단계를 포함한다.
반응의 완결시, 화학식 I을 갖는 1종 이상의 생성물이 반응 혼합물로부터 단리될 수 있다. 예를 들면, 화학식 I의 화합물은 단일 생성물(예: 단일 구조 이성체)로서 단리되거나 생성물들(예: 다수의 구조 이성체 및/또는 다수의 화학식 I의 화합물)의 혼합물로서 단리될 수 있다. 몇몇 양태에서, 1종 이상의 반응 생성물은 크로마토그래피, 예를 들면, 플래쉬 크로마토그래피, 중력 크로마토그래피(예: 실리카겔을 사용한 이성체들의 중력 분리), 칼럼 크로마토그래피(예: 정상 HPLC 또는 RPHPLC), 또는 이동층 크로마토그래피에 의해 단리 및/또는 정제될 수 있다. 몇몇 양태에서, 반응 생성물은 약 80% 이상(예: 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 99% 이상)의 단일 화합물(예: 단일 구조 이성체)을 제공하도록 정제된다.
몇몇 양태에서, 유리 아민 생성물은 생성물의 아민염(예: 하이드로클로라이드 염)을 제공하도록 HCl과 같은 산으로 처리된다. 몇몇 양태에서, 염 생성물은 상응하는 유리 아민 생성물에 비해 예를 들면, 취급 및/또는 저장을 위한 개선된 특성들을 제공한다. 몇몇 양태에서, 염 생성물은 상응하는 유리 아민에 비해 N-옥사이드 또는 N-카보네이트와 같은 분해 생성물의 형성 속도를 방지 또는 감소시킬 수 있다. 몇몇 양태에서, 염 생성물은 상응하는 유리 아민에 비해 치료 조성물에 사용하기 위한 개선된 특성들을 가질 수 있다.
몇몇 양태에서, 상기 반응 혼합물은, 예를 들면, 1종 이상의 생성물을 정제하거나 미반응 출발 재료와 같은 불순물을 제거하기 위해 추가로 처리된다. 몇몇 양태에서, 상기 반응 혼합물은 미반응 아크릴아미드를 포집할 수 있는 부동화(예: 중합체 결합된) 티올 성분으로 처리된다. 몇몇 양태에서, 단리된 생성물은 불순물을 추가로 제거하기 위해 처리될 수 있는데, 예를 들면, 단리된 생성물은 미반응 아크릴아미드 화합물을 포집하기 위해 부동화 티올 성분으로 처리될 수 있다.
몇몇 양태에서, 반응 생성물은 부동화(예: 중합체 결합된) 이소티오시아네이트로 처리될 수 있다. 예를 들면, 3급 아민을 포함하는 반응 생성물은 생성물로부터 1급 및/또는 2급 아민을 제거하기 위해 부동화 이소티오시아네이트로 처리될 수 있다.
몇몇 양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 III의 폴리아민을 화학식 VI의 화합물과 반응시켜 제조될 수 있다.
화학식 III
Figure 112009026592906-PCT00152
화학식 VI
Figure 112009026592906-PCT00153
위의 화학식 III 및 VI에서,
Xa, Xb, n, Y 및 R1은 상기 정의된 바와 같고,
Q는 Cl, Br, 또는 I이다.
몇몇 양태에서, 화학식 III 및 화학식 VI의 화합물은 순물질 형태로 함께 반응된다. 몇몇 양태에서, 화학식 III 및 화학식 VI의 화합물은 1종 이상의 용매, 예를 들면, 아세토니트릴 또는 DMF와 같은 극성의 비양성자성 용매의 존재하에 함께 반응된다. 몇몇 양태에서, 반응물(화학식 III 및 화학식 VI의 화합물)은 승온(예: 약 50℃ 이상, 약 60℃ 이상, 약 70℃ 이상, 약 80℃ 이상, 약 90℃ 이상, 약 100℃ 이상)에서 함께 반응된다.
몇몇 양태에서, 상기 반응 혼합물은 염기, 예를 들면, K2CO3와 같은 카보네이트도 포함한다.
몇몇 양태에서, 상기 반응 혼합물은 촉매도 포함한다.
몇몇 양태에서, 화학식 VI의 화합물은 아민 성분을 산 안하이드레이트 또는 산 할라이드(예: 산 클로라이드)와 같은 활성화 산과 반응시켜 화학식 VI의 화합물을 제공함으로써 제조된다.
화학식 VI의 화합물에 대한 화학식 III의 화합물의 비율을 변화시켜 화학식 III의 폴리아민의 각종 치환도를 제공할 수 있다. 일반적으로, 약 50% 이상의 수소 잔기가 비-수소 잔기로 치환된 폴리아민이 바람직하다. 따라서, 화학식 III/화학식 VI의 화합물의 비는 유리 아민의 비교적 높은 치환도(예: 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 99% 이상, 또는 거의 모두)를 갖는 생성물이 제공되도록 선택된다. 몇몇 바람직한 양태에서, 화학식 III에서 n은 0이고, 화학식 VI의 화합물에 대한 화학식 III의 화합물의 비는 약 1:3 내지 약 1:5, 바람직하게는 약 1:4이다. 몇몇 바람직한 양태에서, 화학식 III에서 n은 2이고, 화학식 VI의 화합물에 대한 화학식 III의 화합물의 비는 약 1:3 내지 약 1:6, 바람직하게는 약 1:5이다.
몇몇 양태에서, 화학식 III 및 VI의 화합물은 2단계 공정으로 반응된다. 예를 들면, 제1 단계 공정은 화학식 III의 화합물 약 0.8 내지 약 1.2몰당량과 화학식 VI의 화합물 약 3.8 내지 약 4.2몰당량을 갖는 반응 혼합물을 포함하고, 제2 단계 공정은 반응 혼합물에 화학식 VI의 화합물 약 0.8 내지 약 1.2몰당량을 첨가하는 단계를 포함한다.
몇몇 양태에서, 화학식 III의 폴리아민을 화학식 IV 또는 VI의 화합물과 반응시키기 전에 화학식 III의 하나 이상의 아민 잔기를 보호 그룹을 사용하여 선택적으로 보호함으로써 최종 생성물의 합성에서 개선된 선택성을 제공한다. 예를 들면, 화학식 III의 폴리아민의 하나 이상의 1급 아민을 화학식 IV 또는 VI의 화합물과의 반응 전에 보호시켜 화학식 IV 또는 VI의 화합물이 2급 아민과 반응하도록 선택성을 제공할 수 있다. 1급 아민에 대한 선택성을 제공하기 위해서 다른 보호 그룹 전략이 사용될 수 있는데, 예를 들면, 선택적으로 제거될 수 있는 직교의 보호 그룹을 사용할 수 있다.
반응의 완결시, 화학식 I을 갖는 1종 이상의 생성물이 반응 혼합물로부터 단리될 수 있다. 예를 들면, 화학식 I의 화합물은 단일 생성물(예: 단일 구조 이성체)로서 단리되거나 생성물들(예: 다수의 구조 이성체 및/또는 다수의 화학식 I의 화합물)의 혼합물로서 단리될 수 있다. 몇몇 양태에서, 1종 이상의 반응 생성물은 크로마토그래피, 예를 들면, 플래쉬 크로마토그래피, 중력 크로마토그래피(예: 실리카겔을 사용한 이성체들의 중력 분리), 칼럼 크로마토그래피(예: 정상 HPLC 또는 RPHPLC), 또는 이동층 크로마토그래피에 의해 단리 및/또는 정제될 수 있다. 몇몇 양태에서, 반응 생성물은 약 80% 이상(예: 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 99% 이상)의 단일 화합물(예: 단일 구조 이성체)을 제공하도록 정제된다.
몇몇 양태에서, 유리 아민 생성물은 생성물의 아민염(예: 하이드로클로라이드 염)을 제공하도록 HCl과 같은 산으로 처리된다. 몇몇 양태에서, 염 생성물은 상응하는 유리 아민 생성물에 비해 예를 들면, 취급 및/또는 저장을 위한 개선된 특성들을 제공한다. 몇몇 양태에서, 염 생성물은 상응하는 유리 아민에 비해 N-옥사이드 또는 N-카보네이트와 같은 분해 생성물의 형성 속도를 방지 또는 감소시킬 수 있다. 몇몇 양태에서, 염 생성물은 상응하는 유리 아민에 비해 치료 조성물에 사용하기 위한 개선된 특성들을 가질 수 있다.
몇몇 양태에서, 폴리아민 양이온성 지질은 위치선택적 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 위치선택적 합성 방법은 폴리아민 골격의 질소(들)에서의 위치 특이적 알킬화를 수행하여 특정한 관심 알킬화 유도체의 합성을 일으키는 편리한 방법을 제공한다. 일반적으로, 화학식 I의 화합물을 먼저 1급 아민 또는 말단 아민과 선택적으로 반응하는 반응물과 반응시켜 이들 아민이 추가의 반응을 일으키거나 방해하는 것을 차단시키고 이러한 차단을 표적 화합물 합성 중의 적절한 단계에서 선택적으로 제거할 수 있다. 화학식 I의 화합물의 말단 아민을 차단한 후, 하나 이상의 2급 아민을 적합한 몰비의 반응물 및 반응 조건을 사용하여 직교 아민 보호 그룹으로 선택적으로 차단시킬 수 있다. 선택적 알킬화 후 차단된 아민을 선택적으로 탈보호화하고 재생된 아민을 추가로 알킬화하고 설명된 반응 순서를 적합하게 반복하여 특정한 관심 화합물을 제공한다. 예를 들면, 트리에틸렌테트라민(1)의 말단 아민을 적합한 반응 조건하에 1급 아민 특이적 보호 그룹(예: 트리플루오로아세타미드)으로 선택적으로 차단시킨 후, 염기(예: 디이소프로필에틸아민)의 존재하에 과량의 직교 아민 보호 성분[예: (Boc)2O]과 반응시켜 모든 내부 아민(예: Boc)을 차단시킨다. 말단 보호 그룹을 선택적으로 제거한 후 말단 아민을 예로서 아크릴아미드를 사용하여 알킬화함으로써 전체 말단 아민이 알킬화된 화합물 1의 유도체를 제공한다. 내부 아민 보호 그룹을 탈차단한 후 예로서 적합한 양의 아크릴아미드로 알킬화함으로써 부분적으로 알킬화된 생성물 7을 수득한다. 화합물 7의 다른 제조 방법은 말단 보호된 화합물 1을 적합한 양의 직교 아민 보호 성분[예: (Boc)2O]과 반응시켜 부분적으로 보호된 화합물 1의 유도체를 얻는 것이다. 부분적으로 선택적 보호된 화합물 1의 말단 아민 보호 그룹을 제거한 후 모든 비보호 아민을 예로서 아크릴아미드로 알킬화함으로써 관심 화합물 7을 수득한다.
생체분해성 잔기를 갖는 지질의 제조 방법
몇몇 양태에서, 화학식 X의 화합물은 화학식 XI의 화합물을 화학식 XII의 화합물과 반응시켜 제조될 수 있다.
Figure 112009026592906-PCT00154
Figure 112009026592906-PCT00155
위의 화학식 XI 및 XII에서,
R1, R2 및 R3는 상기 정의된 바와 같다,
몇몇 양태에서, 화학식 XI 및 XII의 화합물은 카보디이미드(예: EDCI와 같은 수용성 카보디이미드)와 같은 커플링제의 존재하에 반응된다.
2개의 연결 그룹 L1 및 L2를 갖는 화학식 X의 화합물을 제공하기 위해 다른 화학적 반응 및 출발 재료를 사용할 수 있다. 예를 들면, 화학식 XI의 하이드록실 잔기를 아민 잔기로 치환시켜 아미드 또는 우레아 연결 그룹에 대한 전구체를 제공할 수 있다.
반응의 완결시, 화학식 X을 갖는 1종 이상의 생성물이 반응 혼합물로부터 단리될 수 있다. 예를 들면, 화학식 X의 화합물은 단일 생성물(예: 단일 구조 이성체)로서 단리되거나 생성물들(예: 다수의 구조 이성체 및/또는 다수의 화학식 X의 화합물)의 혼합물로서 단리될 수 있다. 몇몇 양태에서, 1종 이상의 반응 생성물은 크로마토그래피, 예를 들면, 플래쉬 크로마토그래피, 중력 크로마토그래피(예: 실리카겔을 사용한 이성체들의 중력 분리), 칼럼 크로마토그래피(예: 정상 HPLC 또는 RPHPLC) 또는 이동층 크로마토그래피에 의해 단리 및/또는 정제될 수 있다. 몇몇 양태에서, 반응 생성물은 약 80% 이상(예: 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 99% 이상)의 단일 화합물(예: 단일 구조 이성체)을 제공하도록 정제된다.
몇몇 양태에서, 유리 아민 생성물은 생성물의 아민염(예: 하이드로클로라이드 염)을 제공하도록 HCl과 같은 산으로 처리된다. 몇몇 양태에서, 염 생성물은 상응하는 유리 아민 생성물에 비해 예를 들면, 취급 및/또는 저장을 위한 개선된 특성들을 제공한다. 몇몇 양태에서, 염 생성물은 상응하는 유리 아민에 비해 N-옥사이드 또는 N-카보네이트와 같은 분해 생성물의 형성 속도를 방지 또는 감소시킬 수 있다. 몇몇 양태에서, 염 생성물은 상응하는 유리 아민에 비해 치료 조성물에 사용하기 위한 개선된 특성들을 가질 수 있다.
PEG-지질의 제조 방법
PEG-지질 화합물은, 예를 들면, 글리세라이드 성분(예: 디미리스틸 글리세라이드, 디팔미틸 글리세라이드, 또는 디스테아릴 글리세라이드)을 적합한 반응 조건하에 활성화 성분과 반응시켜 활성화 중간체를 제공한 후 이것을 아민 또는 하이드록실 그룹과 같은 반응 잔기를 갖는 PEG 성분과 반응시켜 PEG-지질을 수득함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 디알킬글리세라이드(예: 디미리스틸 글리세라이드)를 먼저 염기(예: 트리에틸아민)의 존재하에 N,N'-디석신이미딜 카보네이트와 반응시킨 후, 형성된 중간체를 피리딘과 같은 염기의 존재하에 PEG-아민(예: mPEG2000-NH2)과 반응시켜 관심 PEG-지질을 수득한다. 이러한 조건하에 PEG 성분은 카바메이트 연결기를 통해 지질 잔기에 결합한다. 다른 경우 PEG-지질은, 예를 들면, 글리세라이드 성분(예: 디미리스틸 글리세라이드, 디팔미틸 글리세라이드, 디스테아릴 글리세라이드, 디미리스토일 글리세라이드, 디팔미토일 글리세라이드 또는 디스테아로일 글리세라이드)을 석신산 무수물과 반응시킨 후 생성된 카복실을 활성화시키고 이어서 활성화된 중간체를 예를 들면, 아민 또는 하이드록실 그룹을 갖는 PEG 성분과 반응시켜 PEG-지질을 수득함으로써 제조될 수 있다. 일례로, 디미리스틸 글리세라이드를 DMAP와 같은 염기의 존재하에 석신산 무수물과 반응시켜 헤미-석시네이트를 수득한다. 이렇게 얻은 헤미-석시네이트의 유리 카복실 잔기를 HBTU 및 디이소프로필에틸아민과 같은 표준 카복실 활성화제를 사용하여 활성화한 후 활성화된 카복실을 예를 들면, mPEH2000-NH2와 반응시켜 PEG-지질을 수득한다. 상기 방법에서 PEG 성분은 석시네이트 다리를 통해 지질 잔기에 결합된다.
회합 복합체
본원에 기재된 지질 화합물 및 지질 제제는 회합 복합체, 예를 들면, 리포솜 또는 리포플렉스 중의 한 성분으로서 사용될 수 있다. 이러한 회합 복합체는 RNA(예: 단일 가닥 또는 dsRNA와 같은 이중 가닥 RNA)와 같은 핵산계 치료제를 투여하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 회합 복합체는 핵산을 표적화하고 그에 결합함으로써 유전자 발현을 변형시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 제제를 내포하는 데 유용할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 제제는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 예를 들면, dsRNA, 예비-mRNA, mRNA, 마이크로RNA(miRNA), miRNA 전구체(예비-miRNA), 플라스미드 또는 DNA, 또는 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 특징인 올리고뉴클레오티드 제제는, 예를 들면, dsRNA, 마이크로RNA, 안티센스 RNA, 안타고미르, 데코이 RNA, DNA, 플라스미드 및 압타머일 수 있다.
회합 복합체는 다수의 성분들을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 리포솜과 같은 회합 복합체는 핵산 치료제(예: 올리고뉴클레오티드 제제, 예를 들면, dsRNA)와 같은 활성 성분, 본원에 기재된 지질과 같은 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 회합 복합체는 다수의 치료제, 예를 들면, 2개 이상의 유전자 또는 동일 유전자의 사이한 영역을 표적화하는 2종 또는 3종의 단일 또는 이중 가닥 핵산 잔기를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 PEG-지질과 같은 PEG-지질, 또는 콜레스테롤과 같은 구조 성분을 포함하는 다른 성분들도 회합 복합체에 포함 될 수 있다. 몇몇 양태에서, 회합 복합체는 융해성 지질 또는 성분 및/또는 표적 분자도 포함한다. 몇몇 바람직한 양태에서, 회합 복합체는 dsRNA와 같은 올리고뉴클레오티드 제제, 화학식 I 또는 X의 화합물과 같은 본원에 기재된 지질, 본원에 기재된 PEG-지질(예: 화학식 XV의 PEG-지질)과 같은 PEG-지질, 및 콜레스테롤과 같은 구조적 잔기를 포함하는 리포솜이다.
단일 가닥 리보핵산
올리고뉴클레오티드 제제는 마이크로RNA(miRNA)를 포함한다. 마이크로RNA는 번역의 억제 또는 표적 mRNA의 분해를 통해 세포내 특정 유전자의 전사후 사일런스를 일으킬 수 있는 작은 비코딩 RNA이다. miRNA는 표적 핵산과 완전히 상호보완적이거나, 비상호보완성 영역을 가짐으로써 비상호보완성 영역에서 "팽창부"를 생성할 수 있다. 비상호보완성 영역(팽창부)은 충분한 상호보완성, 바람직하게는 완전한 상호보완성 영역의 측면에 위치하여 이중 구조를 형성한다. 바람직하게, 상호보완성 영역은 적어도 8 내지 10의 뉴클레오티드 길이(예: 8, 9 또는 10 뉴클레오티드 길이)를 갖는다. miRNA는 마이크로RNA가 표적 핵산에 완전히 상호보완적이지 않을 때에는 번역을 억제하거나, miRNA가 이의 표적에 완벽한 상호보완성으로 결합될 때에만 일어난다고 믿어지는 표적 RNA의 분해를 일으킴으로써 유전자 발현을 억제할 수 있다. 본 발명은 이들의 표적에 결합되었을 때 팽창부를 형성할 수 있거나 형성할 수 없는 miRNA의 이중 가닥 전구체도 포함할 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 특징인 올리고뉴클레오티드 제제는 내생성 miRNA 또는 예비-miRNA를 표적화할 수 있다. 본 발명의 특징인 올리고뉴클레오티드 제제는 자연 발생적 핵염기, 당 및 공유적 인터뉴클레오시드(골격) 연결부, 및 이와 유사하게 작용하는 비-자연 발생적 부분들을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 개질 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 향상된 세포 흡수, 내생성 miRNA 표적에 대한 향상된 친화성, 및/또는 뉴클레아제의 존재하의 증가된 안정성과 같은 바람직한 특성들로 인해 자연발생적 형태보다 종종 더 바람직하다. 특정한 내생성 miRNA에 결합하도록 고안된 올리고뉴클레오티드 제제는 표적 miRNA의 10, 20 또는 25 또는 그 이상의 염기와 실질적으로 상호보완적이다(예를 들면, 70, 80, 90% 이상, 또는 100%의 상호보완성을 갖는다).
miRNA 또는 예비-miRNA는 18 내지 100 뉴클레오티드의 길이, 더욱 바람직하게는 18 내지 80 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 성숙한 miRNA는 19 내지 30 뉴클레오티드, 바람직하게는 21 내지 25 뉴클레오티드, 특히 21, 22, 23, 24, 또는 25 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 마이크로RNA 전구체는 70 내지 100 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있고 헤어핀 구조를 갖는다. 마이크로RNA는 긴 예비-miRNA를 기능적 miRNA로 특이적으로 가공하는 디어(Dieer) 및 드로셔(Drosha)라고 불리우는 효소들에 의해 생체내에서 예비-miRNA로부터 생성될 수 있다. 본 발명의 특징인 마이크로RNA 또는 전구체 mi-RNA는 세포-기반 체계에 의해 생체내에서 합성되거나 화학적으로 합성될 수 있다. 마이크로RNA는 목적하는 특성들을 제공하는 변형을 포함하도록 합성될 수 있다. 예를 들면, 이러한 변형은 안정성, 표적 핵산과의 혼성화 열역학, 특정 조직 또는 세포 타입의 표적, 또는 세포 투과성을 예를 들면, 세포내 섭취작용-의존성 또는 비의존성 기전에 의해 향상시킬 수 있다. 변형은 또한 서열 특이성을 증가시킴으로써 다른 부위에의 표적화를 감소시킬 수도 있다. 합성 및 화학적 변형 방법은 아래에 더욱 상세히 설명된다.
센스 가닥 서열(예: cDNA 분자의 센스 가닥의 서열)이 주어지면 왓슨 크릭 염기 짝짓기의 규칙에 따라서 miRNA가 설계될 수 있다. miRNA는 RNA, 예를 들면, miRNA, 예비-miRNA, 예비-mRNA 또는 mRNA의 일부에 상호보완적일 수 있다. 예를 들면, miRNA는 mRNA 또는 예비-mRNA의 코딩 영역 또는 비코딩 영역, 예를 들면, 5' UTR과 같은 예비-mRNA 또는 mRNA의 번역 시작 위치 주변의 영역에 상호보완적일 수 있다. miRNA 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 약 12 내지 30 뉴클레오티드의 길이, 바람직하게는 약 15 내지 28 뉴클레오티드의 길이(예: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 뉴클레오티드의 길이)를 가질 수 있다.
특히, 본 발명의 특징인 miRNA 또는 예비-miRNA는 표적 핵산에 비상호보완성을 갖는 내부(즉, 비말단) 영역 내의 뉴클레오티드에 화학적 변형을 가질 수 있다. 예를 들면, 변형된 뉴클레오티드는 팽창부를 형성하는 miRNA의 영역 내에 혼입될 수 있다. 변형은, 예를 들면, 연결체를 통해 miRNA에 결합된 리간드를 포함할 수 있다(예: 하기 도표 OT-I 내지 OT-IV 참조). 변형은, 예를 들면, 치료적 miRNA의 약물동력학 또는 안정성을 향상시키거나, 표적 핵산에 대한 miRNA의 혼성화 특성(예: 혼성화 열역학)을 향상시킬 수 있다. 몇몇 양태에서, miRNA의 팽창부 영역에 혼입 또는 속박된 변형 또는 리간드의 방향은 팽창부 영역 내의 공간을 점유하도록 맞춰지는 것이 바람직하다. 예를 들면, 변형은 핵산 가닥 위의 변형된 염기 또는 당, 또는 인터컬레이터(intercalator)로서 작용하는 리간드를 포함할 수 있다. 이들은 바람직하게는 팽창부 내에 위치한다. 인터컬레이터는 방향족, 예를 들면, 폴리사이클릭 방향족 또는 헤테로사이클릭 방향족 화합물일 수 있다. 폴리사이클릭 인터컬레이터는 겹침 능력을 가질 수 있고, 2, 3 또는 4개의 융합된 고리를 갖는 계를 포함할 수 있다. 후술되는 보편적인 염기들이 miRNA에 혼입될 수 있다. 몇몇 양태에서, miRNA의 팽창부 영역에 혼입 또는 속박된 변형 또는 리간드의 방향은 팽창부 영역 내의 공간을 점유하도록 맞춰지는 것이 바람직하다. 이러한 방향은 miRNA의 개선된 혼성화 특성 또는 다른 목적하는 특성들을 촉진시킨다.
한 양태에서, miRNA 또는 예비-miRNA는 miRNA에 개선된 혼성화 특성 또는 개선된 서열 특이성을 제공할 수 있는 아미노글리코사이드 리간드를 포함할 수 있다. 아미노글리코사이드의 예로는 글리코실화 폴리리신, 갈락토실화 폴리리신, 네오마이신 B, 토브라마이신, 카나마이신 A, 및 네오-N-아크리딘, 네오-S-아크리딘, 네오-C-아크리딘, 토브라-N-아크리딘, 및 카나A-N-아크리딘과 같은 아미노글리코사이드의 아크리딘 접합체가 포함된다. 아크리딘 동족체의 사용은 서열 특이성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 네오마이신 B는 DNA에 비해 RNA에 대한 높은 친화성을 갖지만 낮은 서열 특이성을 갖는다. 아크리딘 동족체인 네오-S-아크리딘은 HIV RRE(Rev-response element)에 대한 증가된 친화성을 갖는다. 몇몇 양태에서, 아미노글리코사이드 리간드의 구아니딘 동족체(구아니디노글리코사이드)는 올리고뉴클레오티드 제제에 속박된다. 구아니디노글리코사이드에서, 아미노산 위의 아민 그룹은 구아니딘 그룹으로 치환된다. 구아니딘 동족체의 결합은 올리고뉴클레오티드 제제의 세포 투과성을 향상시킬 수 있다.
한 양태에서, 리간드는 표적 핵산의 절단에 의해 표적 유전자 억제에 기여하는 절단 그룹을 포함할 수 있다. 바람직하게, 절단 그룹은 팽창부 영역 내에 위치하는 방식으로 miRNA에 속박되고 여기서 이것은 표적 RNA에 접근하여 절단할 수 있다. 절단 그룹은, 예를 들면, 블레오마이신(예: 블레오마이신-A5, 블레오마이신-A2, 또는 블레오마이신-B2), 피렌, 페난트롤린(예: O-페난트롤린), 폴리아민, 트리펩타이드(예: lys-tyr-lys 트리펩타이드), 또는 금속 이온 킬레이트 그룹일 수 있다. 금속 이온 킬레이트 그룹은, 예를 들면, Lu(III)와 같은 유리 금속 이온에 의해 팽창부의 위치에서 표적 RNA의 선택적 절단을 촉진시킬 수 있는 Lu(III) 또는 EU(III) 마크로사이클릭 복합체, Zn(II) 2,9-디메틸페난트롤린 유도체, Cu(II) 테르피리딘, 또는 아크리딘을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 펩타이드 리간드는 miRNA 또는 예비-miRNA에 속박되어 예를 들면, 팽창부 영역에서의 표적 RNA의 절단을 촉진시킬 수 있다. 예를 들면, 1,8-디메틸-1,3,6,8,10,13-헥사아자사이클로테트라데칸(사이클람)은 (예를 들면, 아미노산 유도체에 의해) 펩타이드에 접합되어 표적 RNA 절단을 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 특징인 방법 및 조성물은 절단 또는 비절단 의존성 기전에 의해 표적 유전자 발현을 억제하는 miRNA를 포함한다.
miRNA 또는 예비-miRNA는 충분한 상호보완성의 영역의 측면에 인접한 비상호보완성 영역(예: 3, 4, 5 또는 6 뉴클레오티드 길이의 영역)을 포함하여 이중 구조(예: 7, 8, 9, 10 또는 11 뉴클레오티드 길이의 영역)를 형성하도록 설계 및 합성될 수 있다.
증가된 뉴클레아제 저항성 및/또는 표적에의 결합 친화성을 위해, miRNA 서열은 2'-O-메틸, 2'-불소, 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-아미노프로필, 2'-아미노, 및/또는 포스포로티오에이트 연결부를 포함할 수 있다. 고정된 핵산(LNA), 2-티오피리미딘(예: 2-티오-U), 2-아미노-A, G-클램프 변형, 및 에틸렌 핵산(ENA), 예를 들면, 2'-4'-에틸렌-다리결합 핵산의 포함도 표적에의 결합 친화성을 증가시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드 골격 내의 푸라노오스 당의 포함도 엔도뉴클레아제에 의한 절단을 감소시킬 수 있다. miRNA 또는 예비-miRNA는 3' 양이온성 그룹을 포함하거나 3' 말단에서 뉴클레오시드를 3'-3' 연결부로 전화시킴으로써 추가로 변형될 수 있다. 다른 방법으로, 3'-말단은 아미노알킬 그룹, 예를 들면, 3' C5-아미노알킬 dT로 차단될 수 있다. 다른 3' 접합체는 3'-5' 엑소뉴클레아제에 의한 절단을 억제할 수 있다. 이론에 구애되지 않길 바라면서, 나프록센 또는 이부프로펜과 같은 3' 접합체는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에의 결합으로부터 엑소뉴클레아제를 입체적으로 차단시킴으로써 엑소뉴클레아제에 의한 절단을 억제할 수 있다. 심지어 작은 알킬쇄, 아릴 그룹, 또는 헤테로사이클릭 접합체 또는 변형된 당(D-리보오스, 데옥시리보오스, 글루코오스 등)도 3'-5'-엑소뉴클레아제를 차단할 수 있다.
5'-말단은 아미노알킬 그룹, 예를 들면, 5'-O-알킬아미노 치환체로 차단될 수 있다. 다른 5' 접합체는 5'-3' 엑소뉴클레아제에 의한 절단을 억제할 수 있다. 이론에 구애되지 않길 바라면서, 나프록센 또는 이부프로펜과 같은 5' 접합체는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에의 결합으로부터 엑소뉴클레아제를 입체적으로 차단시킴으로써 엑소뉴클레아제에 의한 절단을 억제할 수 있다. 심지어 작은 알킬쇄, 아릴 그룹, 또는 헤테로사이클릭 접합체 또는 변형된 당(D-리보오스, 데옥시리보오스, 글루코오스 등)도 3'-5'-엑소뉴클레아제를 차단할 수 있다.
한 양태에서, miRNA 또는 예비-miRNA는 표적화를 개선시키는 변형, 예를 들면, 본원에 기재된 표적화 변형을 포함한다. 특정한 세포 타입의 miRNA 분자를 표적화하는 변형의 예로는 갈락토오스, N-아세틸갈락토사민, 만노오스와 같은 탄수화물 당; 폴레이트와 같은 비타민; RGDs 및 RGD 모사물과 같은 다른 리간드; 및 나프록센, 이부프로펜 또는 다른 공지의 단백질 결합 분자를 포함하는 소분자가 포함된다.
miRNA 또는 예비-miRNA는 당업계에 공지된 방법을 사용한 화학적 합성 및/또는 효소적 결찰 반응에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, miRNA 또는 예비-miRNA는 천연 뉴클레오티드, 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 miRNA 또는 예비-miRNA와 표적 핵산 사이에 형성된 이중 구조물의 물리적 안정성을 증가시키도록 설계된 각종 변형 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있는데, 예를 들면, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 다른 적합한 핵산 변형은 본 명세서에서 설명된다. 다른 방법으로, miRNA 또는 예비-miRNA 핵산은 핵산이 안티센스 방향으로 서브클로닝되어 있는 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생성될 수도 있다(즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 관심의 표적 핵산에 대해 안티센스 방향을 이룰 것이다).
안티센스-타입 올리고뉴클레오티드 제제
본 발명의 특징인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 제제는 안티센스 핵산을 포함한다. "안티센스" 핵산은 유전자 발현 생성물을 암호화하는 "센스" 핵산에 상호보완적인 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 이중 가닥 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상호보완적이거나 RNA 서열(예: 예비-mRNA, mRNA, miRNA 또는 예비-miRNA)에 상호보완적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 안티센스 핵산은 센스 핵산 표적물과 함께 수소 결합을 형성한다.
코딩 가닥 서열(예: cDNA 분자의 센스 가닥의 서열)이 주어지면 왓슨 크릭 염기 짝짓기의 규칙에 따라서 안티센스 핵산이 설계될 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 RNA(예: 예비-mRNA 또는 mRNA)의 코딩 또는 비코딩 영역의 일부에 상호보완적일 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예비-mRNA 또는 mRNA의 번역 시작 위치 주변의 영역, 예를 들면, 5' UTR에 상호보완적일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 약 10 내지 25 뉴클레오티드의 길이(예: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 뉴클레오티드의 길이)를 가질 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miRNA 또는 예비-miRNA에도 상호보완적일 수 있다.
안티센스 핵산은 당업계에 공지된 방법을 사용한 화학적 합성 및/또는 효소적 결찰 반응에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 핵산(예: 안티센스 올리고뉴클레오티드)은 천연 뉴클레오티드, 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 안티센스와 표적 핵산 사이에 형성된 이중 구조물의 물리적 안정성을 증가시키도록 설계된 각종 변형 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있는데, 예를 들면, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 다른 적합한 핵산 변형은 본 명세서에서 설명된다. 다른 방법으로, 안티센스 핵산은 핵산이 안티센스 방향으로 서브클로닝되어 있는 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생성될 수도 있다(즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 관심의 표적 핵산에 대해 안티센스 방향을 이룰 것이다).
안티센스 성분은 리보뉴클레오티드 단독, 데옥시리보뉴클레오티드(예: 올리고데옥시뉴클레오티드) 단독, 또는 데옥시리보뉴클레오티드와 리보뉴클레오티드 둘 모두를 포함할 수 있다. 예를 들면, 리보뉴클레오티드만으로 구성된 안티센스 성분은 상호보완적 RNA에 혼성화되고 번역 장치가 표적 RNA 전사에 접근하지 못하게 함으로써 단백질 합성을 막을 수 있다. 데옥시리보뉴클레오티드 단독 또는 데옥시리보뉴클레오티드와 리보뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 분자, 예를 들면, 안티센스 성분의 5' 및 3' 말단에서 RNA 서열의 측면에 인접한 DNA 서열은 상호보완적 RNA에 혼성화될 수 있고, 이어서 RNA 표적물이 효소, 예를 들면, RNAse H에 의해 절단될 수 있다. 표적 RNA의 분해는 번역을 막는다. 측면에 인접한 RNA 서열은 2'-O-메틸화 뉴클레오티드 및 포스포로티오에이트 연결부를 포함할 수 있고, 내부 DNA 서열은 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연결부를 포함할 수 있다. 내부 DNA 서열은 RNAse H 활성에 의한 표적화가 요구되는 경우 바람직하게는 5 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
증가된 뉴클레아제 저항성을 위해, 안티센스 성분은 3' 말단에서 뉴클레오시드를 3'-3' 연결부로 전화시킴으로써 추가로 변형될 수 있다. 다른 방법으로, 3'- 말단은 아미노알킬 그룹으로 차단될 수 있다.
한 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 제제는 표적화를 개선시키는 변형, 예를 들면, 본원에 기재된 표적화 변형을 포함한다.
데코이-타입 올리고뉴클레오티드 제제
본 발명의 특징인 올리고뉴클레오티드 제제는 데코이 핵산, 예를 들면, 데코이 RNA일 수 있다. 데코이 핵산은 천연 핵산과 유사하나 천연 핵산의 활성을 억제하거나 방해하도록 변형된다. 예를 들면, 데코이 RNA는 리간드를 위한 천연 결합 도메인을 모사할 수 있다. 따라서, 데코이 RNA는 특정 리간드의 결합에 대해 천연 결합 표적물과 경쟁한다. 천연 결합 표적물은 내생성 핵산, 예를 들면, 예비-miRNA, miRNA, 예비-mRNA, mRNA 또는 DNA일 수 있다. 예를 들면, HIV TAR(trans-activation response) RNA의 과발현이 "미끼(데코이)"로 작용하여 HIV tat 단백질에 효과적으로 결합함으로써 이것이 HIV RNA 내에 암호화된 TAR 서열에 결합하는 것을 막을 수 있다.
한 양태에서, 데코이 RNA는 표적화를 개선시키는 변형, 예를 들면, 본원에 기재된 표적화 변형을 포함한다.
miRNA 및 안티센스 RNA에 대해 본원에 기재된 화학적 변형은 데코이 핵산에 사용하기에도 적합하다.
압타머-타입 올리고뉴클레오티드 제제
본 발명의 특징인 올리고뉴클레오티드 제제는 압타머일 수 있다. 압타머는 작은 유기 분자 또는 단백질, 예를 들면, 전사 또는 번역 인자와 같은 비-핵산 리간드에 결합하고, 이어서 활성을 변형(예: 억제)시킨다. 압타머는 비-핵산 리간드 위의 표적화된 결합 위치의 인식을 가리키는 특정한 구조로 접힐 수 있다. 압타머는 본원에 기재된 임의의 변형을 함유할 수 있다.
한 양태에서, 압타머는 표적화를 개선시키는 변형, 예를 들면, 본원에 기재된 표적화 변형을 포함한다.
miRNA 및 안티센스 RNA에 대해 본원에 기재된 화학적 변형은 데코이 핵산에 사용하기에도 적합하다.
본 발명의 하나 이상의 양태를 첨부된 도면을 통해 아래에 설명한다. 본 발명의 다른 특징 및 이점들은 본 명세서의 설명과 도면, 및 청구의 범위로부터 명백해질 것이다. 본 출원은 모든 목적을 위해 본원에 기재된 모든 문헌, 특허 및 특허 출원의 전문을 참조로 인용한다.
한 측면에서, 본 발명은 안타고미르를 특징으로 한다. 안타고미르는 마이크로RNA를 표적화하는 단일 가닥, 이중 가닥, 부분적 이중 가닥 및 헤어핀 구조의 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드이다.
안타고미르는 내생성 miRNA에 실질적으로 상호보완적인 12 이상의 인접한 뉴클레오티드들로 필수적으로 구성되거나 이들을 포함하고, 더욱 구체적으로 상기 성분은 miRNA 또는 예비-miRNA 뉴클레오티드 서열의 표적 서열에 실질적으로 상호보완적인 12 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 특징 인 안타고미르는 약 12 내지 25 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 15 내지 23 뉴클레오티드의 miRNA 표적 서열을 혼성화하기에 충분히 상호보완적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게, 표적 서열은 표 1에 도시된 서열로부터 1, 2 또는 3 뉴클레오티드 이하가 다르며, 한 양태에서 안타고미르는 표 2a-e에 기재된 성분이다. 한 양태에서, 안타고미르는 비-뉴클레오티드 성분, 예를 들면, 콜레스테롤 성분을 포함한다. 비-뉴클레오티드 성분은, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 제제의 3' 또는 5' 말단에 결합할 수 있다. 바람직한 양태에서, 콜레스테롤 성분은 올리고뉴클레오티드 제제의 3' 말단에 결합한다.
안타고미르는 변형(예: 뉴클레오티드 변형)의 혼입에 의해 뉴클레아제에 의한 분해에 대해 안정하다. 다른 양태에서, 안타고미르는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단에서 적어도 첫 번째, 두 번째 또는 세 번째 인터뉴클레오티드 연결부에 포스포로티오에이트를 포함한다. 또 다른 양태에서, 안타고미르는 2'-변형된 뉴클레오티드, 예를 들면, 2'-데옥시, 2'-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세타미도(2'-O-NMA)를 포함한다. 특히 바람직한 양태에서, 안타고미르는 하나 이상의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 몇몇 양태에서 안타고미르의 모든 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형을 포함한다.
비정상적 또는 바람직하지 않은 miRNA 활성, 또는 내생성 miRNA에 혼성화되는 표적 mRNA의 불충분한 활성이 질환 또는 장애에 연관될 때에는, 내생성 miRNA의 활성을 억제 또는 감소시키기 위해 miRNA의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상호보완적인 안타고미르를 세포 또는 사람에 전달할 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 특징인 안타고미르는 miR-122(표 1 참조)에 실질적으로 상호보완적인 뉴클레오티드 서열을 갖고, 이것은 알돌라제 A mRNA, N-myc 하향 조절 유전자(Ndrg3) mRNA, IQ 모티브 함유 GTPase 활성화 단백질-1(Iqgap1) mRNA, HMG-CoA-리덕타제(Hmgcr) mRNA, 및 시트레이트 신타제 mRNA 및 기타를 포함하는 다수의 RNA에 혼성화한다. 바람직한 양태에서, miR-122에 실질적으로 상호보완적인 안타고미르는 안타고미르-122이다(표 2a-e). 알돌라제 A 결핍은 용혈 빈혈, 선천성 다발성 관절만곡증, 뇌하수체 전위, 횡문근 용해, 및 고칼륨혈증을 포함하는 각종 질환과 관련있는 것으로 밝혀졌다. 알돌라제 A 결핍을 앓는 사람은 성장 및 발육 지연, 중앙면부 저성장, 간비대, 및 근질환 증상을 포함하는 증상들도 경험한다. 따라서 이들 질환 또는 증상을 앓고 있거나 진단을 받은 사람은 miR-122에 혼성화하는 안타고미르를 사용하여 치료를 받을 후보이다.
이중 가닥 리보핵산(dsRNA)
한 양태에서, 본 발명은 세포 또는 포유동물내 유전자의 발현을 억제하기 위해 리포솜과 같은 회합 복합체에 내포된 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 분자를 제공한다. 상기 dsRNA는 유전자 발현에서 형성된 mRNA의 적어도 일부에 상호보완적인 상호보완성 영역을 포함한 안티센스 가닥을 포함하고, 상호보완성 영역은 30 미만의 뉴클레오티드 길이, 일반적으로는 19 내지 24 뉴클레오티드의 길이를 갖고, 상기 dsRNA는 상기 유전자를 발현하는 세포와 접촉시 상기 유전자의 발현을 40% 이상 억제한다. dsRNA는 혼성화되어 이중 구조물을 형성하기에 충분히 상호보완적인 2개의 RNA 가닥을 포함한다. dsRNA의 하나의 가닥(안티센스 가닥)은 유전자의 발현 중에 형성된 mRNA의 서열로부터 유래된 표적 서열에 실질적으로 상호보완적인(일반적으로는 완전히 상호보완적인) 상호보완성 영역을 포함하고, 다른 가닥(센스 가닥)은 안티센스 가닥에 상호보완적인 영역을 포함함으로써, 2개의 가닥은 혼성화되어 적합한 조건하에 배합시 이중 구조물을 형성한다. 일반적으로, 이중 구조물은 15 내지 30, 더욱 일반적으로는 18 내지 25, 더욱 일반적으로는 19 내지 24, 가장 일반적으로는 19 내지 21 염기쌍의 길이를 갖는다. 유사하게, 표적 서열에 대한 상호보완성 영역은 15 내지 30, 더욱 일반적으로는 18 내지 25, 더욱 일반적으로는 19 내지 24, 가장 일반적으로는 19 내지 21 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 본 발명의 dsRNA는 하나 이상의 단일 가닥 뉴클레오티드 돌출부(들)를 추가로 포함할 수 있다. dsRNA는, 예를 들면, 자동화 DNA 합성 장치(제조원의 예: Biosearch, Applied Biosystems, Inc.)를 사용하여, 아래에 더 논의된 바와 같은 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 합성될 수 있다.
본원에 기재된 회합 복합체에 내포되기에 적합한 dsRNA는 18 내지 25 염기쌍(예: 21 염기쌍)의 이중 구조물을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, dsRNA는 21nt 이상의 길이를 갖는 하나 이상의 가닥을 포함한다. 다른 양태에서, dsRNA는 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 인접 뉴클레오티드 길이를 갖는 하나 이상의 가닥을 포함한다.
본원에 기재된 회합 복합체에 내포되기에 적합한 dsRNA는 표적 서열에 대해 하나 이상의 불일치를 함유할 수 있다. 바람직한 양태에서, dsRNA는 3개 이하의 불일치를 함유한다. dsRNA의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대한 불일치를 함유하는 경우, 불일치 부분은 상호보완성 영역의 중앙에 위치하지 않음이 바람직하다. dsRNA의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대한 불일치를 함유하는 경우, 불일치는 어느 한쪽 말단으로부터 5 뉴클레오티드(예: 상호보완성 영역의 5' 또는 3' 말단으로부터 5, 4, 3, 2, 또는 1 뉴클레오티드)에 제한됨이 바람직하다.
한 양태에서, dsRNA의 적어도 한 말단은 1 내지 4, 일반적으로 1 또는 2 뉴클레오티드의 단일 가닥 뉴클레오티드 돌출부를 갖는다. 일반적으로, 단일 가닥 돌출부는 안티센스 가닥의 3' 말단에 위치하거나 센스 가닥의 3' 말단에 위치한다. dsRNA는 일반적으로 안티센스 가닥의 5' 말단에 위치한 뭉툭한 말단을 가질 수도 있다. 이러한 dsRNA는 개선된 안정성 및 억제 활성을 가짐으로써 저용량(즉, 환자 체중 1㎏당 1일 5㎎ 미만)의 투여를 허용한다. 일반적으로, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-말단에 뉴클레오티드 돌출부를 갖고 5'-말단은 뭉툭하다. 다른 양태에서, 돌출부 내의 하나 이상의 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 티오포스페이트로 치환된다.
또 다른 양태에서, 리포솜과 같은 회합 복합체에 내포된 dsRNA는 안정성을 향상시키기 위해 화학적으로 변형된다. 이러한 핵산은 당업계에서 잘 확립된 방법에 의해 합성 및/또는 변형될 수 있다(참조: "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S. L. et al., (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 인용된다). 화학적 변형은 2' 변형, 올리고뉴클레오티드의 당 또는 염기의 다른 부위에서의 변형, 올리고뉴클레오티드 사슬로의 비-천연 염기의 도입, 리간드 또는 화학적 잔기에의 공유적 결합, 및 인터뉴클레오티드 포스페이트 연결부의 티오포스페이트와 같은 다른 연결부로의 치환이 제한 없이 포함된다. 이러한 변형 중 둘 이상이 사용될 수 있다.
2개의 분리된 dsRNA 가닥의 화학적 연결은, 예를 들면, 공유, 이온 또는 수소 결합의 도입, 소수성 상호작용, 반 데르 발스 또는 겹침 상호작용, 금속-이온 배위결합, 또는 푸린 동족체의 사용과 같은 잘 알려진 각종 기술에 의해 달성될 수 있다. 이러한 화학적으로 연결된 dsRNA는 본원에 기재된 회합 복합체에 내포되기에 적합하다. 일반적으로, dsRNA를 변형시키는 데 사용될 수 있는 화학적 그룹은 메틸렌 블루, 이관능성 그룹, 일반적으로 비스-(2-클로로에틸)아민, N-아세틸-N'-(p-글리옥실벤조일)시스타민, 4-티오우라실 및 프소랄렌을 제한 없이 포함된다. 한 양태에서, 연결체는 헥사-에틸렌 글리콜 연결체이다. 상기 경우, dsRNA는 고상 합성에 의해 생성되며 헥사-에틸렌 글리콜 연결체는 표준 방법에 따라서 혼입된다(예: Williams, D.J., 및 K.B. Hall, Biochem. (1996) 35:14665-14670). 특정한 양태에서, 안티센스 가닥의 5'-말단 및 센스 가닥의 3'-말단은 헥사에틸렌 글리콜 연결체를 통해 화학적으로 연결된다. 다른 양태에서, dsRNA의 하나 이상의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 그룹을 포함한다. dsRNA의 말단에서의 화학적 결합은 일반적으로 삼중-나선 결합에 의해 형성된다.
또 다른 양태에서, 2개의 단일 가닥 중 어느 하나 또는 둘 모두에서의 뉴클 레오티드는 세포 효소(예: 특정한 뉴클레아제)의 분해 활성을 방지 또는 억제하기 위해 변형될 수 있다. 핵산에 대해 세포 효소의 분해 활성을 억제하기 위한 기술은 당업계에 알려져 있으며, 2'-아미노 변형, 2'-아미노 당 변형, 2'-F 당 변형, 2'-F 변형, 2'-알킬 당 변형, 2'-O-알콕시알킬(예: 2'-O-메톡시에틸) 변형, 비하전 및 하전된 골격 변형, 모르폴리노 변형, 2'-O-메틸 변형, 및 포스포르아미데이트가 제한 없이 포함된다(예: Wagner, Nat. Med. (1995) 1:1116-8 참조). 따라서, dsRNA 위의 뉴클레오티드의 하나 이상의 2'-하이드록실 그룹은 화학적 그룹, 일반적으로는 2'-F 또는 2'-O-메틸 그룹에 의해 치환된다. 또한, 하나 이상의 뉴클레오티드는 고정된 뉴클레오티드를 형성하도록 변형될 수 있다. 이러한 고정된 뉴클레오티드는 리보오스의 2'-산소를 리보오스의 4'-탄소와 연결시키는 메틸렌 다리를 함유한다. 고정된 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 문헌에 설명되어 있다(참조: Koshkin, A.A. et al., Tetrahedron (1998), 54:3607-3630 및 Obika, S. et al., Tetrahedron Lett. (1998), 39:5401-5404). 고정된 뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드에 도입하면 상호보완적 서열에 대한 친화성이 향상되고 용융 온도가 수 도 증가한다(Braasch, D.A. 및 D.R. Corey, Chem. Biol. (2001), 8:1-7).
리간드를 dsRNA에 접합시키면 이의 세포 흡수를 향상시킬 수 있고 특정한 조직의 표적화 또는 간 세포와 같은 특정한 세포 타입에 의한 흡수를 향상시킬 수 있다. 특정한 경우, 소수성 리간드를 dsRNA에 접합시켜 세포막의 직접 투과 및/또는 간 세포를 통한 흡수를 촉진시킨다. 다른 방법으로, dsRNA에 접합된 리간드는 수 용체-매개된 세포내 섭취작용을 위한 기질이다. 이들 시도는 dsRNA 성분은 물론 안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포 투과를 촉진시키기 위해 사용된다. 예를 들면, 콜레스테롤을 각종 안티센스 올리고뉴클레오티드에 접합시켜 접합되지 않은 이들의 동족체에 비해 실질적으로 더 활성이 큰 화합물을 제공한다(참조: M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103). 올리고뉴클레오티드에 접합된 다른 지질친화성 화합물은 1-피렌 부티르산, 1,3-비스-O-(헥사데실)글리세롤, 및 멘톨을 포함한다. 수용체-매개된 세포내 섭취작용을 위한 리간드의 한 예는 폴산이다. 폴산은 폴레이트-수용체-매개된 세포내 섭취작용에 의해 세포에 들어간다. 폴산을 함유한 dsRNA 화합물은 폴레이트-수용체-매개된 세포내 섭취작용을 통해 세포 내로 효과적으로 운반될 것이다. 리(Li) 및 공동 연구자들은 폴산이 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 결합되면 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수가 8배 증가된다고 보고하였다(참조: Li, S.; Deshmukh, H. M.; Huang, L. Pharm. Res. 1998, 15, 1540). 올리고뉴클레오티드에 접합된 다른 리간드는 폴리에틸렌 글리콜, 탄수화물 덩어리, 가교커플링제, 포르피린 접합체, 전달 펩타이드 및 콜레스테롤과 같은 지질을 포함한다. siRNA를 위한 다른 화학적 변형은 문헌에 설명되어 있다(참조: Manoharan, M. RNA interference 및 chemically modified small interfering RNAs. Current Opinion in Chemical Biology (2004), 8(6), 570-579).
특정한 경우, 양이온성 리간드를 올리고뉴클레오티드에 접합시키면 뉴클레아제에 대한 향상된 저항성이 얻어진다. 양이온성 리간드의 대표적인 예는 프로필암 모늄 및 디메틸프로필암모늄이다. 흥미롭게도, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 양이온성 리간드가 상기 올리고뉴클레오티드 전체에 걸쳐 분산될 때 mRNA에 대한 높은 결합 친화성을 보유한다고 보고되었다(참조: M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103 및 이들의 참조 문헌).
본 발명의 리간드-접합된 dsRNA는 dsRNA에 연결 분자를 결합시켜 얻은 것과 같은 펜던트 반응성 관능기를 함유한 dsRNA를 사용함으로써 합성할 수 있다. 상기 반응성 올리고뉴클레오티드는 시판의 리간드, 각종 보호 그룹을 함유한 합성 리간드, 또는 연결 잔기가 결합된 리간드와 함께 직접 반응될 수 있다. 본 발명의 방법은 몇몇 바람직한 양태에서 리간드에 적합하게 접합되고 고상-지지체 재료에 추가로 결합될 수 있는 뉴클레오시드 단량체를 사용함으로써 리간드-접합 dsRNA의 합성을 용이하게 한다. 임의로 고상-지지체 재료에 결합되는 이러한 리간드-뉴클레오시드-접합체는, 본 발명의 방법의 몇몇 바람직한 양태에 따라서, 선택된 혈청-결합 리간드와 뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드의 5' 위치에 존재하는 연결 잔기를 반응시킴으로써 제조된다. 특정한 경우, dsRNA의 3'-말단에 결합된 아르알킬 리간드를 함유한 dsRNA는 먼저 단량체 빌딩 블록을 장쇄 아미노알킬 그룹을 통해 조절형 다공질유리 지지체에 공유 결합시킴으로써 제조된다. 그런 다음, 뉴클레오티드를 고상 지지체에 결합된 단량체 빌딩 블록에 표준 고상 합성 기술에 의해 결합시킨다. 단량체 빌딩 블록은 고상 합성에 사용될 수 있는 뉴클레오시드 또는 다른 유기 화합물일 수 있다.
본 발명의 접합체에 사용되는 dsRNA는 잘 알려진 고상 합성 기술을 통해 편 리하게 제조될 수 있다. 이러한 합성을 위한 장치는 여러 제조원(예: Applied Biosystems, Foster City, CA)으로부터 판매된다. 이러한 합성을 위해 당업계에 공지된 임의의 다른 수단을 추가로 또는 대신해서 사용할 수도 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체와 같은 다른 올리고뉴클레오티드의 유사한 제조 기술을 사용하는 것도 알려져 있다.
특정한 변형 올리고뉴클레오티드의 합성에 관한 기술은 폴리아민 접합된 올리고뉴클레오티드에 관한 미국 특허 제5,138,045호 및 제5,218,105호, 키랄 인 연결부를 갖는 올리고뉴클레오티드 제조용 단량체에 관한 미국 특허 제5,212,295호, 변형된 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드에 관한 미국 특허 제5,378,825호 및 제5,541,307호, 골격-변형된 올리고뉴클레오티드 및 환원성 결합을 통한 이의 제조에 관한 미국 특허 제5,386,023호, 3-데아자푸린 고리계 기재의 변형된 핵염기 및 이의 합성 방법에 관한 미국 특허 제5,457,191호, N-2 치환된 푸린 기재의 변형된 핵염기에 관한 미국 특허 제5,459,255호, 키랄 인 연결부를 갖는 올리고뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 미국 특허 제5,521,302호, 펩타이드 핵산에 관한 미국 특허 제5,539,082호, β-락탐 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드에 관한 미국 특허 제5,554,746호, 올리고뉴클레오티드의 합성을 위한 방법 및 재료에 관한 미국 특허 제5,571,902호, 알킬티오 그룹(이러한 그룹은 뉴클레오시드의 각종 위치에 결합된 다른 잔기의 연결체로서 사용될 수 있다)을 갖는 뉴클레오시드에 관한 미국 특허 제5,578,718호, 높은 키랄 순도의 포스포로티오에이트 연결부를 갖는 올리고뉴클레오티드에 관한 미국 특허 제5,587,361호 및 제5,599,797호, 2'-O-알킬 구아노신 및 2,6-디아미노푸린 화합물을 포함한 관련 화합물의 제조 방법에 관한 미국 특허 제5,506,351호, N-2 치환된 푸린을 갖는 올리고뉴클레오티드에 관한 미국 특허 제5,587,469호, 3-데아자푸린을 갖는 올리고뉴클레오티드에 관한 미국 특허 제5,587,470호, 접합된 4'-데스메틸 뉴클레오시드 동족체에 관한 미국 특허 제5,223,168호 및 제5,608,046호, 골격-변형된 올리고뉴클레오티드 동족체에 관한 미국 특허 제5,602,240호 및 제5,610,289호, 여러 가지 중에서도 2'-플루오로-올리고뉴클레오티드의 합성 방법에 관한 미국 특허 제6,262,241호 및 제5,459,255호에서 찾을 수 있다.
본 발명의 리간드-접합된 dsRNA 및 서열 특이적 연결 뉴클레오시드 함유 리간드-분자에서, 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오시드는 표준 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 전구체, 또는 이미 연결 잔기를 함유한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 접합 전구체, 이미 리간드 분자를 함유한 리간드-뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드-접합 전구체, 또는 비-뉴클레오시드 리간드-함유 빌딩 블록을 사용하여 적합한 DNA 합성 장치에서 조합될 수 있다.
이미 연결 잔기를 함유한 뉴클레오티드-접합 전구체를 사용할 때에는, 서열 특이적 연결 뉴클레오시드의 합성을 전형적으로 완료한 후 리간드 분자를 연결 잔기와 반응시켜 리간드-접합된 올리고뉴클레오티드를 형성한다. 스테로이드, 비타민, 지질 및 리포터 분자와 같은 각종 분자를 함유한 올리고뉴클레오티드 접합체는 이미 개시되어 있다(참조: Manoharan et al., PCT 출원 WO 제93/07883호). 바람직한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 연결된 뉴클레오시드는 리간드- 분자 접합체로부터 유도된 포스포라미다이트와, 올리고뉴클레오티드 합성에서 통상적으로 사용되는 시판의 표준 포스포라미다이트 및 비-표준 포스포라미다이트를 사용하여 자동화 합성 장치에 의해 합성된다.
본원에 기재된 회합 복합체에 내포된 dsRNA는 1종 이상의 변형된 뉴클레오시드, 예를 들면, 뉴클레오시드 내의 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-프로필, 2'-O-알릴, 2'-O-아미노알킬 또는 2'-데옥시-2'-플루오로 그룹을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 올리고뉴클레오티드에 향상된 혼성화 특성을 제공한다. 또한, 포스포로티오에이트 골격을 함유한 올리고뉴클레오티드는 향상된 뉴클레아제 안정성을 갖는다. 따라서, 관능화된 연결된 뉴클레오시드는 포스포로티오에이트 골격 또는 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-프로필, 2'-O-아미노알킬, 2'-O-알릴 또는 2'-데옥시-2'-플루오로 그룹 중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함하도록 확대될 수 있다. 당업계에 공지된 일부의 올리고뉴클레오티드 변형의 개요는, 예를 들면, PCT 공개 WO 제200370918호에 개시되어 있다.
몇몇 양태에서는, DNA 합성 장치를 사용하여 5'-말단에 아미노 그룹을 갖는 관능화된 뉴클레오시드 서열을 제조한 후, 이것을 선택된 리간드의 활성 에스테르 유도체와 반응시킨다. 활성 에스테르 유도체는 당업자들에게 잘 알려져 있다. 대표적인 활성 에스테르로는 N-하이드로석신이미드 에스테르, 테트라플루오로페놀 에스테르, 펜타플루오로페놀 에스테르 및 펜타클로로페놀 에스테르가 있다. 아미노 그룹과 활성 에스테르가 반응하면 선택된 리간드가 연결 그룹을 통해 5'위치에 결합된 올리고뉴클레오티드가 생성된다. 5'-말단의 아미노 그룹은 5'-아미노-변형자 C6 시약을 사용하여 제조할 수 있다. 한 양태에서는, 리간드가 연결체를 통해 5'-하이드록시 그룹에 직접 또는 간접적으로 연결된 리간드-뉴클레오시드 포스포라미다이트를 사용하여 리간드 분자를 5'-위치에서 올리고뉴클레오티드에 접합시킬 수 있다. 이러한 리간드-뉴클레오시드 포스포라미다이트를 자동화 합성 방법의 최종 단계에서 전형적으로 사용하여 5'-말단에서 리간드를 함유한 리간드-접합된 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
변형된 인터뉴클레오시드 연결부 또는 골격의 예로는 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트를 포함하는 포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상 3'-5'-연결부를 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 동족체, 및 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍들이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 역극성을 갖는 것들이 포함된다. 각족 염, 혼합염 및 유리-산도 포함된다.
상기 인 원자 함유 연결부의 제조 방법에 관한 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 제3,687,808호, 제4,469,863호, 제4,476,301호, 제5,023,243호, 제5,177,196호, 제5,188,897호, 제5,264,423호, 제5,276,019호, 제5,278,302호, 제5,286,717호, 제5,321,131호, 제5,399,676호, 제5,405,939호, 제5,453,496호, 제5,455,233호, 제5,466,677호, 제5,476,925호, 제5,519,126호, 제5,536,821호, 제5,541,306 호, 제5,550,111호, 제5,563,253호, 제5,571,799호, 제5,587,361호, 제5,625,050호, 및 제5,697,248호(이들은 각각 본 명세서에 참조로 인용된다)가 제한 없이 포함된다.
인 원자를 포함하지 않는 변형된 인터뉴클레오시드 연결부 또는 골격(즉, 올리고뉴클레오시드)의 예는 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 인터슈거(intersugar) 연결부, 혼합된 헤테로 원자 또는 알킬 또는 사이클로알킬 인터슈거 연결부, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 인터슈거 연결부에 의해 형성된 골격들이 포함된다. 이들은 (뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성된) 모르폴리노 연결부, 실록산 골격, 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격, 포르마세틸 및 티오포르마세틸 골격, 메틸렌 포르마세틸 및 티오포르마세틸 골격, 알켄 함유 골격, 설파메이트 골격, 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격, 설포네이트 및 설폰아미드 골격, 아미드 골격, 및 혼합 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 다른 골격들을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조 방법을 개시한 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 제5,034,506호, 제5,166,315호, 제5,185,444호, 제5,214,134호, 제5,216,141호, 제5,235,033호, 제5,264,562호, 제5,264,564호, 제5,405,938호, 제5,434,257호, 제5,466,677호, 제5,470,967호, 제5,489,677호, 제5,541,307호, 제5,561,225호, 제5,596,086호, 제5,602,240호, 제5,610,289호, 제5,602,240호, 제5,608,046호, 제5,610,289호, 제5,618,704호, 제5,623,070호, 제5,663,312호, 제 5,633,360호, 제5,677,437호, 및 제5,677,439호(이들은 각각 본 명세서에 참조로서 인용된다)가 있다.
특정한 경우, 리포솜과 같은 회합 복합체에 포함된 올리고뉴클레오티드는 비-리간드 그룹에 의해 변형될 수 있다. 다수의 비-리간드 분자가 올리고뉴클레오티드에 접합되어 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키고, 이러한 접합의 수행 방법은 과학 문헌에서 찾을 수 있다. 이러한 비-리간드 성분은 콜레스테롤(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), 콜산(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), 티오에테르, 예를 들면, 헥실-S-트리틸티올(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), 지방족 쇄, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), 인지질, 예를 들면, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), 팔미틸 성분(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시 콜레스테롤 성분(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)과 같은 지질 잔기들을 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조를 교시한 대표적인 미국 특허는 앞서 열거하였다. 전형적인 접합 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치에서 아미노 연결체를 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성을 포함한다. 이어서 아미노 그룹을 적합한 결합 또는 활성화 시약을 사용하여 분자와 반응시켜 접합한다. 접합 반응은 고상 지지체에 결합된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행하거나 용액상에서의 올리고뉴클레오티드의 절단 후 수행할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 접합체를 전형적으로 HPLC로 정제하여 순수한 접합체를 수득한다.
상술된 변형은 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드와 함께 사용되기에 적합하다.
융해성 지질
"융해성"은 지질 또는 다른 약물 전달계가 세포의 막을 융해시키는 성질을 의미한다. 막은 혈장 막 또는 세포기관(예: 엔도솜, 핵 등)을 둘러싸는 막일 수 있다. 적합한 융해성 지질의 예로는 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), DODAC, DODMA, DODAP, 또는 DLinDMA가 제한 없이 포함된다. 몇몇 양태에서, 회합 복합체는, 예를 들면, 엔도솜 방출을 위해 지질에 접합된 이미다졸 성분과 같은 소분자를 포함한다.
PEG 또는 PEG-지질
양이온성 및 융해성 지질 이외에, 회합 복합체는 ATTA-지질 또는 PEG-지질과 같은 이층 안정화 성분(BSC)을 포함한다. 이러한 지질의 예로는, 예를 들면, 국제 공개 WO 제05/026372호에 설명된 디알킬옥시프로필에 결합된 PEG(PEG-DAA), 예를 들면, 미국 특허 공개 제20030077829호 및 제2005008689호에 설명된 디아실글리세롤에 결합된 PEG(PEG-DAG), 포스파티딜에탄올아민(PE)에 결합된 PEG(PEG-PE), 또는 세라마이드에 접합된 PEG 또는 이들의 혼합물(참조: 미국 특허 제5,885,613호)이 포함된다. 바람직한 양태에서, 회합 복합체는 본원에 기재된 PEG-지질, 예를 들면, 화학식 XV, XV' 또는 XVI의 PEG-지질을 포함한다. 한 바람직한 양태에서, BSC는 SPLP의 응고를 억제하는 접합 지질이다. 적합한 접합 지질로는 PEG-지질 접합제, ATTA-지질 접합체, 양이온성-중합체-지질 접합체(CPLs) 또는 이들의 혼합물이 제한 없이 포함된다. 한 바람직한 양태에서, SPLP는 PEG-지질 접합체 또는 ATTA-지질 접합체를 CPL과 함께 포함한다.
PEG는 2개의 말단 하이드록실 그룹을 갖는 에틸렌 PEG 반복 단위들의 수용성 선형 중합체인 폴리에틸렌 글리콜이다. PEG들은 이들의 분자량에 의해 분류되는데, 예를 들면, PEG 2000은 약 2,000달톤의 평균 분자량을 갖고, PEG 5000은 약 5,000달톤의 평균 분자량을 갖는다. PEG는 시그마 케미칼 코.(Sigma Chemical Co.)사 및 다른 제조사로부터 시판되고, 예를 들면, 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(MePEG-OH), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-석시네이트(MePEG-S), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-석신이미딜 석시네이트(MePEG-S-NHS), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-아민(MePEG-NH.sub.2), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-트레실레이트(MePEG- TRES), 및 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-이미다졸릴-카보닐(MePEG-IM)을 포함한다. 또한, 모노메톡시폴리에틸렌글리콜-아세트산(MePEG-CH.sub.2COOH)는, 예를 들면, PEG-DAA 접합체를 포함하는 PEG-지질 접합체의 제조에 특히 유용하다.
바람직한 양태에서, PEG는 약 550달톤 내지 약 10,000달톤, 더욱 바람직하게는 약 750달톤 내지 약 5,000달톤, 더욱 바람직하게는 약 1,000달톤 내지 약 5,000달톤, 더욱 바람직하게는 약 1,500달톤 내지 약 3,000달톤, 특히 더 바람직하게는 약 2,000달톤, 또는 약 750달톤의 평균 분자량을 갖는다. PEG는 알킬, 알콕시, 아실 또는 아릴 그룹에 의해 임의로 치환될 수 있다. PEG는 지질에 직접 접합되거나 연결체 잔기를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG를 지질에 결합시키기에 적합한 연결체 잔기로는, 예를 들면, 비-에스테르 함유 연결체 잔기 및 에스테르-함유 연결체 잔기를 사용할 수 있다. 바람직한 양태에서, 연결체 잔기는 비-에스테르 함유 연결체 잔기이다. 여기서 "비-에스테르 함유 연결체 잔기"란 카복실 에스테르 결합(-OC(O)-)을 함유하지 않는 연결체 잔기를 의미한다. 적합한 비-에스테르 함유 연결체 잔기로는 아미도(-C(O)NH-), 아미노(-NR-), 카보닐(-C(O)-), 카바메이트(-NHC(O)O-), 우레아(-NHC(O)NH-), 디설파이드(-S-S-), 에테르(-O-), 석시닐(-(O)CCH.sub.2CH.sub.2C(O)-), 석신아미딜(-NHC(O)CH.sub.2CH.sub.2C(O-)NH-), 에테르, 디설파이드 등 및 이들의 배합물(예: 카바메이트 연결체 잔기와 아미도 연결체 잔기를 모두 함유하는 연결체)이 포함된다. 바람직한 양태에서는 PEG를 지질에 결합시키는 데 카바메이트 연결체가 사용된다.
다른 양태에서는 PEG를 지질에 결합시키는 데 에스테르 함유 연결체 잔기가 사용된다. 적합한 에스테르 함유 연결체 잔기로는 카보네이트(-OC(O)O-), 석시노일, 포스페이트 에스테르(-O-(O)POH-O-), 설포네이트 에스테르, 및 이들의 배합물이 포함된다.
표적화 성분
몇몇 양태에서, 회합 복합체는 표적화 성분을 포함한다. 예를 들면, 표적화 성분은 회합 복합체를 신체의 표적화된 영역으로 유도하는 것을 돕기 위해 회합 복합체(예: 리포솜)의 표면 안에 포함될 수 있다. 표적화 성분의 예로는 갈락토오스, 만노오스 및 폴레이트가 있다. 표적화 성분의 다른 예로는 소분자 수용체, 펩티드 및 항체가 포함된다. 몇몇 양태에서, 표적화 성분은 올리고뉴클레오티드 제제과 같은 치료 성분과 함께 접합된다. 몇몇 양태에서, 표적화 성분은 회합 복합체의 지질 잔기에 직접 결합된다. 몇몇 양태에서, 표적화 성분은 PEG(바람직하게는 2000amu의 평균 분자량을 갖는 PEG)를 통해 지질 잔기에 직접 결합된다. 몇몇 양태에서, 표적화 성분은, 예를 들면, 회합 복합체의 표면 위에서 비접합된다.
구조적 잔기
몇몇 양태에서, 회합 복합체는 복합체(예: 리포솜)의 구조를 개선시키는 하나 이상의 성분들을 포함한다. 몇몇 양태에서, dsRNA와 같은 치료제는 콜레스테롤과 같은 지질친화성 화합물에 결합(예: 접합)됨으로써 dsRNA에의 지질친화성 결합을 제공할 수 있다. 몇몇 양태에서 dsRNA와 지질친화성 성분(예: 콜레스테롤)의 접합은 회합 복합체의 캡슐화 효율을 향상시킬 수 있다.
회합 복합체의 특성
리포솜과 같은 회합 복합체는 일반적으로 약 25㎚ 내지 500㎚의 유체역학적 직경을 갖는 입자이다. 몇몇 바람직한 양태에서, 회합 복합체는 500㎚ 미만, 예를 들면, 약 25 내지 약 400㎚, 예를 들면, 약 25㎚ 내지 약 300㎚, 바람직하게는 약 120㎚ 또는 그 미만이다.
몇몇 양태에서, RNA에 대한 회합 복합체 내의 총 부형제의 중량 비는 약 20:1 미만, 예를 들면, 약 15:1이다. 몇몇 바람직한 양태에서, 중량 비는 10:1 미만, 예를 들면, 약 7.5:1이다.
몇몇 양태에서, 회합 복합체는 회합 복합체가 엔도솜 조건하에는 양성자화되지만(예를 들면, 복합체의 파열을 용이하게 한다), 생리학적 조건하에는 양성자화되지 않도록 하는 pKa를 갖는다.
몇몇 양태에서, 회합 복합체는 생체내에서 dsRNA와 같은 올리고뉴클레오티드의 개선된 전달을 제공한다. 올리고뉴클레오티드의 생체내 전달은 유전자 사일런싱 분석, 예를 들면, 인자 VII의 사일런스를 측정하는 분석을 사용하여 측정될 수 있다.
생체내 인자 VII 사일런스 실험
C57BL/6 마우스에 염수 또는 각종 지질 제제를 꼬리 정맥 주사한다. 지질- 배합된 siRNA를 각종 용량으로 동물 체중 1g당 10㎕의 주사 부피로 투여한다. 투여 후 24시간째에 안와후 출혈에 의해 혈청 시료를 모은다. 혈청 인자 VII 농도를 발색 진단 키트(Coaset Factor VII Assay Kit, DiaPharma)를 사용하여 제조자 프로토콜에 따라서 측정한다.
회합 복합체의 제조 방법
몇몇 양태에서, 회합 복합체는 올리고뉴클레오티드와 같은 치료제를 용매 및 완충액의 존재하에 지질과 접촉시켜 제조한다. 몇몇 양태에서, 다수의 지질, 예를 들면, 1종 이상의 양이온성 지질(예: 폴리아민 함유 지질 또는 본원에 기재된 바와 같은 생체분해성 성분을 포함한 지질), PEG-지질, 표적화 지질 또는 융해성 지질이 용매 중에 포함된다.
몇몇 양태에서, 완충액은 본원에 기재된 지질(예: 화학식 I 및 X의 지질)과 같은 아민 함유 지질의 거의 모든 아민을 양성자화시키기에 충분한 강도를 갖는다.
몇몇 양태에서, 완충액은 아세트산나트륨(pH 약 5)와 같은 아세테이트 완충액이다. 몇몇 양태에서, 완충액은 용액 중에서 약 100 내지 300mM의 농도로 존재한다.
몇몇 양태에서, 용매는 에탄올이다. 예를 들면, 몇몇 양태에서, 혼합물은 약 90% 이상의 에탄올 또는 100%의 에탄올을 포함한다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 방법은 혼합물을 압출시켜 유체역학적 직경이 약 500㎚ 미만(예: 약 25㎚ 내지 약 300㎚, 몇몇 바람직한 양태에서는 약 40 내지 120 ㎚ 범위)인 입자 크기를 갖는 회합 복합체를 제공하는 단계를 포함한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 방법은 혼합물을 압출시키는 단계를 포함하지 않는다.
한 양태에서, 상기 리포솜은 본원에 기재된 지질을 콜레스테롤, PEG, 에탄올 및 25mM 아세테이트 완충액과 함께 용액 중에서 혼합하여 pH 약 5의 혼합물을 제공함으로써 제조된다. 상기 혼합물을 온화하게 교반하고 수크로오스를 혼합물에 첨가한다. 그런 다음 혼합물을 수크로오스가 용해될 때까지 다시 교반한다. 상기 혼합물에 아세테이트 완충액 중의 siRNA의 용액을 첨가하고 약 20분간 가볍게 교반한다. 이어서 혼합물을 40℃에서 하나 이상의 필터(예: 2개의 200㎚ 필터)를 통해 (예를 들면, 약 10회 이상, 예를 들면, 11회 또는 그 이상) 압출시키고, 실온에서 약 90분간 PBS(pH 7.4)에 대해 투석한다.
한 양태에서, 상기 리포솜은 리포솜 혼합물의 압출 없이 제조된다. 본원에 기재된 지질은 100% 에탄올, 물, 및 약 100mM 내지 약 300mM의 농도를 갖는 아세테이트 완충액(pH 약 5) 중에서 콜레스테롤, PEG, 및 siRNA와 함께 배합된다. 상기 배합물을 90% 에탄올 중에서 급속 혼합한다. 완결시, 혼합물을 약 100mM 내지 약 300mM의 농도를 갖는 아세테이트 완충액(pH 약 5)에 대해 투석(또는 한외여과 처리)하여 에탄올을 제거한 후, PBS에 대해 투석(또는 한외여과 처리)하여 완충액 조건을 변화시킨다.
회합 복합체는 단일 또는 이중 가닥 핵산과 같은 치료제의 부재하에 형성될 수 있고, 형성시 복합체를 1종 이상의 치료 활성 단일 또는 이중 가닥 핵산 잔기으로 처리하여 부하된 회합 복합체, 즉 치료 활성 핵산으로 부하된 회합 복합체를 제 공할 수 있다. 핵산은 회합 복합체 내에 포집되거나 회합 복합체의 표면에 흡착되거나 상기 두 가지 모두일 수 있다. 예를 들면, 상기 리포솜과 같은 회합 복합체의 제조 방법은 핵산(예: siRNA와 같은 단일 또는 이중 가닥 RNA)과 같은 치료제를 함유하지 않는 회합 복합체를 형성하는 데 사용될 수 있다. 회합 복합체가 형성된 후 상기 복합체를 siRNA와 같은 치료제로 처리하여 부하된 회합 복합체를 제공할 수 있다.
한 양태에서, 화학식 I의 지질과 같은 양이온성 지질, 바람직하게는 화학식
Figure 112009026592906-PCT00156
의 양이온성 지질, 콜레스테롤, 본원에 기재된 PEG-지질, 예를 들면, 화학식
Figure 112009026592906-PCT00157
의 PEG-지질과 같은 PEG-지질을 포함하는 혼합물을 에탄올(예: 100% 에탄올) 중에서 제조하고, 수성 NaOAc와 같은 수성 완충액과 배합하여 부하되지 않은 회합 복합체를 제공한다. 그런 다음 회합 복합체를 임의로 압출시켜 더욱 균일한 크기 분포를 갖는 회합 복합체를 제공한다. 이어서 회합 복합체를 에탄올(예: 35% 에탄올) 중에서 siRNA와 같은 치료제로 처리함으로써 부하된 회합 복합체를 제공한다. 그런 다음 몇몇 양태에서는 회합 복합체를 투석과 같은 에탄올 제거 처리를 수행한다.
회합 복합체의 특성화
상술된 임의의 방법으로 제조된 회합 복합체들을 유사한 방식으로 특성화한다. 회합 복합체를 먼저 육안 검사로 특성화한다. 일반적으로, 바람직한 회합 복합체는 응집체 또는 침전물이 없는 약간 흰 반투명의 용액이다. 지질-나노입자의 입자 크기 및 입자 크기 분포는 맬버른 제타사이저 나노(Malvern Zetasizer Nano) ZS(Malvern, USA)를 사용하여 동적 광 산란법에 의해 측정한다. 바람직한 입자는 20 내지 300㎚, 더욱 바람직하게는 40 내지 100㎚의 크기를 갖는다. 몇몇 바람직한 양태에서, 입자 크기 분포는 단일 모드이다. 제제 및 포집된 분획물 중의 총 siRNA 농도는 염료 압출 분석을 사용하여 측정한다. 배합된 siRNA의 시료를 제제 분열 계면활성제, 0.5% 트리톤(Triton)-X100의 존재 또는 부재하에 RNA-결합 염료 리보그린(Ribogreen)(Molecular Probes)과 함께 배양한다. 제제 중의 총 siRNA는 표준 곡선에 대하여 계면활성제 함유 시료로부터 수득한 신호에 의해 측정한다. 포집된 분획물은 총 siRNA 함량에서 "유리" siRNA 함량(계면활성제 부재하의 신호에 의해 측정)을 뺌으로써 산출한다. siRNA의 포집율은 전형적으로 >85%이다.
회합 복합체 및 이를 포함한 조성물의 사용 방법
올리고뉴클레오티드 제제를 포함하는 약제학적 조성물
회합 복합체 내에 회합된 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 구조로 예를 들면, 세포 또는 사람에 투여될 수 있다. 이중 가닥 구조의 올리고뉴클레오티드 제제는 실질적으로 상호보완적인 올리고뉴클레오티드 가닥에 결합한다. 이중 가닥 구조의 올리고뉴클레오티드 제제의 전달은 뉴클레아제에 대한 증가된 저항성과 같은 특정한 이점을 올리고뉴클레오티드 제제에 부여할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 리포솜과 같은 회합 복합체에 내포된 올리고뉴클레오티드 제제, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 내포된 올리고뉴클레오티드 제제를 포함한 약제학적 조성물은 유전자 발현의 하향 조절에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정과 같은 표적 유전자의 발현 또는 활성과 관련한 질환 또는 장애의 치료에 유용하다. 이러한 약제학적 조성물은 전달 방식을 기준으로 제조된다. 한 예는 비경구 전달을 통해 간과 같은 특정한 기관/조직에 전달하기 위해 제조된 조성물이다.
본 발명의 특징인 약제학적 조성물은 표적 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 용량으로 투여된다.
일반적으로, 내포된 올리고뉴클레오티드 제제의 적합한 용량은 환자 체중 1㎏당 1일 0.01 내지 5.0㎎, 바람직하게는 환자 체중 1㎏당 1일 1㎍ 내지 1㎎의 올리고뉴클레오티드 제제를 전달하는 양일 것이다. 약제학적 조성물은 1일 1회 투여하거나, 하루 동안 2, 3 또는 그 이상의 하위 용량을 적합한 간격으로 투여하거나, 조절 방출형 제제를 통해 연속적 주입 또는 전달로 투여할 수 있다. 상기 경우, 각각의 하위 용량에 함유된 올리고뉴클레오티드 제제는 1일 총 용량을 달성하도록 그에 상응하게 보다 소량이어야 한다. 용량 단위는 수 일에 걸쳐 전달되도록 예를 들면, 내포된 올리고뉴클레오티드 제제를 수 일에 걸쳐 지속적으로 방출시키는 통상의 서방형 제제를 사용하여 제조될 수도 있다. 서방형 제제는 당업계에 잘 알려 져 있다.
당업자는 질환 또는 장애의 정도, 과거의 치료, 환자의 일반적 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 장애를 제한 없이 포함하는 특정한 인자들이 환자를 효과적으로 치료하기 위한 용량 및 시간에 영향을 미칠 수 있음을 인식할 것이다. 또한, 치료적 유효량의 조성물을 사용한 환자의 치료는 단일 치료 또는 일련의 치료들을 포함할 수 있다. 회합 복합체에 내포된 개별적 올리고뉴클레오티드 제제에 대한 유효 용량 및 생체내 반감기의 측정은 통상의 방법을 사용하거나 본원에 기재된 바와 같은 적합한 동물 모델을 사용한 생체내 시험을 기초로 수행될 수 있다.
마우스 유전체학의 진보는 사람의 각종 장애의 연구를 위한 다수의 마우스 모델을 제공한다. 이러한 모델은 지질친화성 조성물에 내포된 올리고뉴클레오티드 제제의 생체내 시험, 및 치료적 유효량의 측정을 위해 사용된다.
리포솜과 같은 회합 복합체에 내포된 올리고뉴클레오티드 제제를 포유동물에 투여하는 데에는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 투여는 직접, 경구, 또는 비경구(예: 피하, 뇌실내, 근육내, 또는 복강내 주사, 또는 정맥내 점적)로 달성될 수 있다. 투여는 (예를 들면, 주사에 의한) 신속 투여이거나, (예를 들면, 완속 주입 또는 서방형 제제의 투여에 의해) 일정 시간에 걸쳐 일어날 수 있다.
회합 복합체에 내포된 올리고뉴클레오티드 제제는 멸균 및 비-멸균 수성 용액, 알코올과 같은 통상의 용매 중의 비수성 용액, 또는 액체 또는 고체 오일 베이스 중의 용액과 같은 조성물로 제조될 수 있다. 이러한 용액은 완충액, 희석제, 및 다른 적합한 첨가제도 함유할 수 있다. 비경구, 수막강내, 또는 뇌실내 투여를 위해서는 올리고뉴클레오티드 제제를 완충액, 희석제 또는 다른 적합한 첨가제(예: 투과 증진제, 담체 화합물, 및 약제학적으로 허용되는 다른 담체)도 함유할 수 있는 멸균 수성 용액과 같은 조성물로 제조할 수 있다.
회합 복합체에 내포된 올리고뉴클레오티드 제제는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 내에서 제조될 수 있다. "약제학적으로 허용되는 담체"(본 명세서에서 "부형제"라고도 불리운다)는 약제학적으로 허용되는 용매, 현탁제, 또는 약물학적으로 불활성인 다른 임의의 운반체이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 액체 또는 고체일 수 있고, 계획된 투여 방식에서 목적하는 부피, 농도, 및 다른 적합한 이송 및 화학적 특성을 제공하도록 선택될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체의 전형적인 예로는 물, 염 용액, 커플링제(예: 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스), 충전제(예: 락토오스 및 다른 당, 젤라틴, 또는 칼슘 설페이트), 윤활제(예: 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 아세트산나트륨), 붕해제(예: 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트), 및 습윤제(예: 나트륨 라우릴 설페이트)가 제한 없이 포함된다.
실시예 1: 화합물 3, 4 및 4,5의 합성 및 정제: 마이클( Michael ) 첨가 조건하에의 트리에틸렌테트라민의 알킬화 - 방법 1 (반응식 1)
반응식 1a
Figure 112009026592906-PCT00158
a(i) 90℃, 순물질, 5일
350㎖ 가압 보틀에 N-도데실아크릴아미드 1(84g, 0.35mol)[참조: Slee, Deborah H.; Romano, Suzanne J.; Yu, Jinghua; Nguyen, True N.; John, Judy K.; Raheja, Neil K.; Axe, Frank U.; Jones, Todd K.; Ripka, William C. Journal of Medicinal Chemistry (2001), 44(13), 2094-2107]을 넣고 당해 용기를 아르곤하에 온화하게 가열하여 고체를 용융시킨다. 상기 용융물에 트리에틸렌테트라민 2(10.2g, 0.07mol)를 첨가하고 혼합물을 5일간 90℃로 가열한다. 트리에틸렌테트라민 2를 순물질 반응 조건하에 아크릴아미드 1에 마이클 첨가하여 2종의 5-알킬화 생성물과 1종의 6-알킬화 생성물을 수득한다. 반응 혼합물을 용리액으로서 CH2Cl2:MeOH:NEt3(90:5:5)을 사용하여 TLC에 의해 분석한다. TLC는 출발 아크릴아미드 1이 거의 완전히 소모되었음을 보여준다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(40㎖)에 용해시키고, 미리 충전된 실리카겔 칼럼에 부하시키고, 용리액 CH2Cl2:MeOH:NEt3(48:1:1 내지 8:1:1)을 사용하여 혼합물을 분리시킨다. 완전한 분 리를 달성하기 위해 다수의 칼럼을 동일한 조건을 사용하여 수행한 후 순수한 생성물을 수득한다. 필요한 5-부가 생성물 3 및 4가 6-부가 생성물 5와 함께 단리된다. 상기 조악한 반응 혼합물의 TLC 및 LC-MS에서는 일부의 더 낮은 부가 생성물도 반응 혼합물에서 검출된다.
N-도데실-3-((2-도데실카바모일-에틸)-{2-[(2-도데실카바모일-에틸)-2-{(2-도데실카바모일-에틸)-[2-(2-도데실카바모일-에틸아미노)-에틸]-아미노}-에틸-아미노)프로피온아미드. 2종의 5-알킬화 유도체 중의 하나인 화합물 3(이성체 I)은 담황색 발포체로서 단리된다(12g, 13%). MS m/z 672 (M+2H/2), 448 (M+3H/3). 1H NMR CDCl3 δ 0.87 (t, J=6.5Hz, 15H), 1.20-1.39 (m, 92H), 1.46-1.57 (m, 12H), 2.20-2.50 (m, 16H), 2.60-2.78 (m, 10H), 3.10-3.25 (m, 12H), 6.98 (bs, 3H), 7.41 (bs, 1H), 7.63 (bs, 1H), 8.85 (bs, 1H). 13C NMR CDCl3 δ 14.33, 22.90, 27.37, 29.59, 29.67, 29.88, 29.89, 29.92, 32.13, 39.74, 172.77.
(3-[(2-{2-[{2-비스-(2-도데실카바모일-에틸)-아미노]-에틸}-(2-도데실카바모일-에틸)-아미노]-에틸아미노}-에틸)-(2-도데실카바모일-에틸)-아미노]-N-도데실-프로피온아미드). 두 번째 5-알킬화 유도체인 화합물 4(이성체 II)는 백색 분말로서 단리된다(13.7g, 14%). MS m/z 672 (M+2H/2), 448 (M+3H/3). 1H NMR CDCl3 δ 0.87 (t, J=6.5Hz, 15H), 1.20-1.39 (m, 92H), 1.44-1.54 (m, 12H), 2.30-2.45 (m, 8H), 2.46-2.54 (m, 8H), 2.55-2.85 (m, 10H), 3.15-3.30 (m, 12H), 6.98 (bs, 3H), 7.41 (bs, 1H), 7.63 (bs, 1H), 8.85 (bs, 1H). 13C NMR CDCl3 δ 14.33, 22.89, 27.28, 27.38, 29.59, 29.69, 29.88, 29.89, 29.92, 32.13, 39.65, 39.74, 50.84, 172.63, 172.75, 172.81.
화합물 3과 4의 2:3(화합물 3:4) 비율의 순수한 혼합물도 함께 단리된다(11.6g, 12%).
3-[{2-[{2-[비스-(2-도데실카바모일-에틸)-아미노]-에틸}-(2-도데실카바모일-에틸)-아미노]-에틸}-(2-도데실카바모일-에틸)-아미노]-에틸}-(2-도데실카바모일-에틸)-아미노]-N-도데실-프로피온아미드. 6-알킬화 생성물 5는 크림색 분말로서 단리된다(16.3g, 17%). MS m/z 792 (M+2H/2), 528 (M+3H/3). 1H NMR DMSO-d6 δ 0.87 (t, J=7Hz, 18H), 1.15-1.40 (m, 112H), 1.45-1.53 (m, 12H), 2.20-2.35 (m, 12H), 2.37-2.50 (m, 12H), 2.64-2.78 (m, 12H), 3.10-3.25 (m, 12H), 7.26 (bs, 4H), 7.64 (bs, 2H). 13C NMR CDCl3 δ 14.32, 22.89, 27.34, 27.38 29.59, 29.69, 29.90, 29.92, 32.13, 39.77, 50.85, 172.80.
실시예 2: 화합물 3, 4 및 4의 합성 및 정제: 마이클 첨가 조건하에의 트리에틸렌테트라민의 알킬화 - 방법 2 (반응식 2)
다른 실험에서, 고온에서 출발 아크릴아미드 1의 중합을 방지하기 위해 반응 혼합물에 라디칼 켄처 벤조퀴논을 첨가한다.
반응식 2a
Figure 112009026592906-PCT00159
a(i) 90℃, 벤조퀴논 촉매량(15㎎), 5일
이 방법에서는 반응 혼합물에 라디칼 켄처 벤조퀴논을 첨가하는 것을 제외하고는 방법 1(실시예 1)의 것과 유사한 반응을 수행한다. 150㎖ 가압 보틀에 N-도데실아크릴아미드 1(24g, 100mmol)을 넣고 여기에 벤조퀴논 15㎎을 첨가하고 용기를 아르곤하에 온화하게 가열하여 고상의 아크릴아미드를 용융시킨다. 상기 용융물에 트리에틸렌테트라민 2(2.9g, 20mmol)를 첨가하고 혼합물을 5일간 90℃로 가열한다. 반응 혼합물을 용리액으로서 CH2Cl2:MeOH:NEt3(90:5:5)을 사용하여 TLC에 의해 분석한다. TLC는 출발 아크릴아미드 1이 거의 완전히 소모되었음을 보여준다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(40㎖)에 용해시키고, 목적 생성물 3, 4 및 5를 실시예 1에 설명된 바와 같이 단리한다. 상기 경우 6-부가 생성물의 양이 약간 증가된 것으로 관찰된다.
화합물 3: 5-부가 생성물인 이성체 I은 담황색 발포체로서 단리된다(3.4g, 13%). 상기 화합물에 대한 분석 및 스펙트럼 데이타는 방법 1에서 얻은 화합물 3 의 것과 동일하다.
화합물 4: 5-부가 생성물인 이성체 II은 백색 분말로서 단리된다(3.9g, 14%). 상기 화합물에 대한 분석 및 스펙트럼 데이타는 방법 1에서 얻은 화합물 4의 것과 동일하다. 이성체 3과 4의 순수한 혼합물(1.9g, 7%)도 단리된다.
화합물 5: 6-부가 생성물은 크림색 분말로서 단리된다(6.9g, 26%). 상기 화합물에 대한 분석 및 스펙트럼 데이타는 방법 1에서 얻은 화합물 5의 것과 동일하다.
실시예 3: 화합물 3, 4 및 4의 합성 및 정제: 마이클 첨가 조건하에의 트리에틸렌테트라민의 알킬화 - 방법 3 (반응식 3)
이 방법에서는 반응의 속도를 높이기 위해 붕산과 같은 촉진제의 존재하에 마이클 첨가를 수행한다(Chaudhuri, Mihir K.; Hussain, Sahid; Kantam, M. Lakshmi; Neelima, B. Tetrahedron Letters (2005), 46(48), 8329-8331.).
반응식 3a
Figure 112009026592906-PCT00160
a(i) 90℃, 수성 붕산, 2일
이 방법에서는 반응 혼합물에 마이클 첨가 촉진제인 붕산 포화 수용액을 첨가하는 것을 제외하고는 방법 1(실시예 1)의 것과 유사한 반응을 수행한다. 150㎖ 가압 보틀에 N-도데실아크릴아미드 1(24g, 100mmol)을 넣고 당해 용기를 아르곤하에 온화하게 가열하여 아크릴아미드를 용융시키고 여기에 붕산 수용액 3㎖를 첨가한다. 상기 용융물에 트리에틸렌테트라민 2(2.9g, 20mmol)를 첨가하고 혼합물을 2일간 90℃로 가열한다. 반응 혼합물을 용리액으로서 CH2Cl2:MeOH:NEt3(90:5:5)을 사용하여 TLC에 의해 분석한다. TLC는 출발 아크릴아미드 1이 거의 완전히 소모되었음을 보여준다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(100㎖)에 용해시키고 상기 용액을 고상의 중탄산나트륨과 함께 교반하고 유기층을 여과하고 회전 증발기에서 농축시킨다. 상기 조악한 생성물을 CH2Cl2:MeOH:NEt3(48:1:1 내지 8:1:1)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피(실리카겔)로 정제한다. 완전한 분리를 달성하기 위해 다수의 칼럼을 동일한 조건을 사용하여 수행한 후 순수한 생성물을 수득한다. 상기 반응 조건하에는 화합물 4(이성체 II)와 6-부가 생성물 5의 수율의 증가가 달성된다.
화합물 3: 5-부가 생성물 3인 이성체 I은 담황색 발포체로서 단리된다(3.1g, 11%). 상기 화합물에 대한 분석 및 스펙트럼 데이타는 방법 1에서 얻은 화합물 3의 것과 동일하다.
화합물 4: 5-부가 생성물 4인 이성체 II는 백색 분말로서 단리된다(5.7g, 20%). 상기 화합물에 대한 분석 및 스펙트럼 데이타는 방법 1에서 얻은 화합물 4의 것과 동일하다. 이성체 3과 4의 순수한 혼합물도 단리된다(2.1g, 7%).
화합물 5: 6-부가 생성물 5는 크림색 분말로서 단리된다(7.6g, 28%). 상기 화합물에 대한 분석 및 스펙트럼 데이타는 방법 1에서 얻은 화합물 5의 것과 동일하다.
실시예 4: 화합물 3 및 4의 합성 및 정제: 마이클 첨가 조건하에의 트리에틸렌테트라민의 알킬화 - 방법 4 (반응식 4)
다른 실험에서, 6-부가 생성물 5의 형성을 최소화하기 위해 용매의 사용을 시도한다.
반응식 4a
Figure 112009026592906-PCT00161
a(i) 90℃, 아세토니트릴 또는 DMF, 5일
이 방법에서는 반응을 용매의 존재하에 90℃에서 교반하면서 수행하는 것을 제외하고는 방법 1(실시예 1) 및 방법 2(실시예 2)의 것과 유사한 반응을 수행한다. 150㎖ 가압 보틀에서 N-도데실아크릴아미드 1(10g, 41.8mmol)을 아세토니트릴 또는 DMF 20㎖에 용해시킨다. 상기 용액에 트리에틸렌테트라민 2(1g, 6.8mmol)를 첨가하고 혼합물을 5일간 90℃로 가열한다. 반응 혼합물을 용리액으로서 CH2Cl2:MeOH:NEt3(90:5:5)을 사용하여 TLC에 의해 분석한다. TLC는 필요한 5-부가 생성물이 단지 소량만 형성되었음을 보여준다. 상기 반응에서의 주요 생성물은 4-부가 생성물과 매우 극성의 보다 낮은 부가 생성물의 혼합물이다.
실시예 5: 반응 혼합물 및/또는 단리된 생성물 3, 4 및 5로부터의 미반응 아크릴아미드의 분리
반응 혼합물로부터 미반응 아크릴아미드 1을 제거하기 위해, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 또는 DMF에 희석시키고 폴리스티렌 또는 중합체 결합된 티올(또는 머캅탄)과 함께 교반하여 모든 아크릴아미드를 포집한다. 상기 용액에 부동화 티올을 첨가하고 주위 온도에서 온화하게 진탕한 후 고체를 여과하여 제거한다. 부동화 티올의 아크릴아미드에의 마이클 첨가는 모든 미반응 아크릴아미드를 포집한다. 각각의 목적 이성체를 단리한 후 오염물로서 남은 미량의 아크릴아미드도 동일한 조건하에 완전히 제거될 수 있다. 단리된 생성물 3(또는 4 또는 5)를 DMF 또는 에틸 아세테이트에 용해시키고 부동화 아크릴아미드 켄처와 함께 온화하게 진탕한 후 여과하고 여액을 진공 증발시켜 아크릴아미드 오염물을 함유하지 않는 순수한 화합물 3(또는 4 또는 5)을 수득한다.
실시예 6: 화합물 5로부터 일차 및 이차 아민 오염물의 분리
화합물 5의 칼럼 크로마토그래피 분리 후, 미량의 일차 및 이차 아민 오염물 을 제거하기 위해, 화합물을 에틸 아세테이트 또는 DMF에 용해시키고 고상의 결합 또는 부동화 이소티오시아네이트와 함께 주위 온도에서 밤새 교반한다. 고체를 여과하고 여액을 증발시켜 일차 또는 이차 아민 오염물을 전혀 함유하지 않는 순수한 화합물 5를 수득한다.
실시예 7: 화합물 3 및 4로부터 일차 아민 오염물의 분리
반응의 완결 후 반응 혼합물을 실온의 디클로로메탄 중에서 트리에틸아민의 존재하에 테트라클로로프탈산 무수물로 처리하고 용매를 증발시킨 후 잔류물을 에틸 아세테이트와 함께 교반하고 고체를 여과하고 여액을 농축시켜 일차 아민 오염물을 함유하지 않는 생성물을 수득한다.
표 1
생성물 3 및 4의 합성 방법
방법 온도 촉진제 용매 라디칼 켄처 비고
1 90℃ 없음 순물질 없음 3과 4는 총 39%의 수율로 단리된다. 6-부가 생성물 5는 17%로 단리된다. 반응은 완결시까지 6일이 소요된다.
2 90℃ 없음 순물질 벤조퀴논 아크릴아미드 1의 중합을 방지하기 위해 벤조퀴논이 사용된다. 3과 4의 총 수율은 34%이다. 그러나 5도 26%로 단리된다. 반응 시간은 방법 1과 동일하다.
3 90℃ 붕산 순물질 없음 반응 속도가 향상된다. 반응은 2일 내에 완결된다. 3과 4의 총 수율은 38%이다. 추가로 28%의 5도 단리된다.
4 80 내지 120℃ 없음 DMF 없음 반응은 매우 느리다. 보다 낮은 부가 생성물만이 형성된다.
실시예 8: 생성물 3, 4 및 5의 하이드로클로라이드 염의 제조 방법
상기 열거된 화합물들의 취급 용이성과 안정성을 향상시키기 위해 이들을 이 들의 상응하는 하이드로클로라이드 염 6, 7 및 8로 전환시킨다.
화합물 3의 하이드로클로라이드 6: 아민 3(9.4g)을 고온의 무수 1,4-디옥산 100㎖에 용해시키고 디옥산 중의 4M HCl 100㎖를 첨가하고 상기 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 반응 혼합물에 1시간 동안 질소를 버블링하여 과량의 HCl을 제거하고 나머지 용액을 약 10㎖로 농축시킨다. 상기 불균일 혼합물에 EtOAc:헥산(1:1) 100㎖를 첨가하고 침전된 생성물을 여과한 후 에틸 아세테이트(50㎖)와 헥산(100㎖)으로 세척하고 얻어진 분말을 진공 건조시켜 순수한 생성물 6(9.99g, 96%)을 크림색 분말로서 수득한다. 1H NMR CDCl3 δ 0.83 (t, J=6.5Hz, 15H), 1.20-1.39 (m, 92H), 2.64-2.70 (m, 8H), 2.90-3.10 (m, 16H), 3.25-3.45 (m, 12H), 3.46-3.64 (m, 4H), 5.20-6.0 (bs, 2H), 8.05-8.15 (m, 5H), 10. (bs, 3H). 13C NMR CDCl3 δ 13.83, 22.04, 26.48, 28.69, 28.79, 28.90, 29.04, 31.26, 38.71, 168.38, 168.53. 원소 분석: 계산치: C81H163N9O5.4HCl.3H2O: C, 63.05; H, 11.30; N, 8.17; Cl, 9.19. 측정치: C, 63.13; H, 11.06; N, 8.21; Cl, 9.21.
반응식 5a
Figure 112009026592906-PCT00162
a(i) 1,4-디옥산 중의 4M HCl, 실온, 12시간
화합물 7: 상기 3을 6으로 전환시키는 데 사용된 것과 유사한 방법을 사용하여 아민 4(13.7g, 10.2mmol)를 상응하는 HCl 염 7로 전환시킨다. 테트라하이드로클로라이드 염 7은 백색 분말로서 단리된다(14.6, 96%). 1H NMR CDCl3 δ 0.82 (t, J=6.5Hz, 15H), 1.20-1.41 (m, 92H), 2.52-2.72 (m, 8H), 2.90-3.10 (m, 16H), 3.25-3.45 (m, 12H), 3.46-3.64 (m, 4H), 5.20-6.0 (bs, 2H), 8.05-8.15 (m, 5H), 10. (bs, 3H). 13C NMR CDCl3 δ 8.42, 13.84, 22.04, 26.48, 28.69, 28.79, 29.00, 31.26, 45.44, 168.53, 168.60. 원소 분석: 계산치: C81H163N9O5.4HCl.2H2O: C, 63.79; H, 11.30; N, 8.17; Cl, 9.34. 측정치: C, 63.78; H, 11.04; N, 8.40; Cl, 9.73.
반응식 6a
Figure 112009026592906-PCT00163
a(i) 1,4-디옥산 중의 4M HCl, 실온, 12시간
화합물 8: 상기 염 6에 대해 설명된 것과 유사한 방법을 사용하여 아민 5(13.7g, 1.2mmol)를 상응하는 HCl 염 8로 전환시킨다. 테트라하이드로클로라이드 염 8은 백색 분말로서 단리된다(1.3g, 96%). 1H NMR DMSO-d6 δ 0.87 (t, J=7Hz, 18H), 1.13-1.30 (m, 112H), 1.35-1.53 (m, 12H), 2.10-2.25 (m, 12H), 2.30-2.40 (m, 12H), 2.60-2.76 (m, 12H), 3.10-3.25 (m, 12H), 7.26 (bs, 4H), 7.64 (bs, 2H), 10.1 (bs, 4H).
반응식 7a
Figure 112009026592906-PCT00164
a(i) 1,4-디옥산 중의 4M HCl, 실온, 12시간
실시예 9: 화합물 3 및 4의 직접 합성을 위한 트리에틸렌테트라민 위의 아미노 그룹의 선택적 보호
단계 1: 화합물 10의 제조: 아세토니트릴(500㎖) 중의 트리에틸렌테트라민 2(20.55g, 140.52mmol, 구입처: Sigma-Aldrich)을 일정하게 교반하면서 얼음조 위에서 냉각시킨다. 에틸 트리플루오로아세테이트(35.20㎖, 295.09mmol)를 교반 용액에 첨가하고 20시간 동안 교반한다. 용매 및 휘발 물질을 감압하에 제거하고 높은 진공 중에서 건조시켜 9를 백색 고체로서 수득한다(44.4g, 94%). 이렇게 얻은 생성물은 추가의 정제 없이 후속 반응에 사용될 수 있다(Wender P. A. et al., Organic Letters, 2005 7, 4815).
조악한 화합물 9(23.70, 70mmol)를 아세토니트릴(400㎖)에 용해시키고 얼음 조 위에서 교반한다. N-(벤질옥시카보닐옥시) 석시네이트(Z-OSu, 43.73g, 175mmol, 구입처: Novabiochem) 및 트리에틸아민(23.40㎖, 210mmol)을 반응 혼합물에 첨가하고 밤새 교반한다. 용매를 제거하고 잔류물을 디클로로메탄(DCM)으로 추출하고 물(2회)과 염수로 연속해서 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨다. 용매를 진공 제거하고 이렇게 얻어진 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(구배 용리, 30-70% EtOAc/헥산)로 정제하여 화합물 10을 백색 고체로서 수득한다(38.2g, 89%). 1H NMR (DMSO-d6, 400MHz) δ= 9.60-9.50(m, 2H), 7.40-7.20(m, 10H), 5.02(s, 4H), 3.40-3.20(m, 12H). MS: C26H28F6N4O6 계산치: 606.19, 측정치: 607.2(M+).
단계 2: 화합물 11의 제조: 화합물 10(12.60g, 20.78mmol)을 주위 온도에서 메탄올(MeOH, 150㎖)에 현탁시키고 에탄올(40㎖) 중의 8M 메틸아민 용액을 일정하게 교반하면서 현탁액에 첨가한다. 주위 온도에서 1시간 동안 교반한 후 모든 고체가 용해되고, 혼합물을 50℃로 승온시키고 8시간 동안 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링한다. 감압하에 모든 용매를 제거하고 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(구배 용리, 10% MeOH/DCM 내지 10:10:80, MeOH:TEA:DCM)로 정제하여 생성물 11을 담황색의 고무상 액체로서 수득한다(7.80g, 91%). 1H NMR (DMSO-d6, 400MHz) δ= 7.80-7.40(m, 10H), 5.02-4.94(m, 4H), 3.45-3.05(m, 8H), 2.70-2.55(m, 4H), 2.20(bs, 4H). MS: C22H30N4O4 계산치: 414.23, 측정치: 415.20(M+)
단계 3: 화합물 13의 제조: 화합물(9)의 합성을 위한 단계 1에 설명된 바와 같이 트리에틸렌테트라민(100)(10.25g, 70.09mmol)을 1.1몰당량의 에틸 트리플루오로아세테이트(8.80㎖, 77.10mmol)와 반응시켜 화합물 12를 제조한다. 이렇게 얻은 조악한 화합물 12를 무수 DCM(400㎖)에 용해시키고 0℃로 냉각시킨다. (Boc)2O(53.53mmol, 245.31mmol) 및 트리에틸아민(48㎖, 350mmol)을 첨가하고 반응 혼합물을 밤새 교반한다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링한다. 용매를 진공 제거하고 잔류물을 DCM으로 추출한 후 물과 염수로 세척하고 건조시킨다. DCM을 제거하고 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(구배 용리 50%EtOAc/헥산 내지 EtOAc)로 정제하여 목적 생성물 13을 백색 고체로서 수득한다(34.20g, 92%). 1H NMR (DMSO-d6, 400MHz) δ= 9.51-9.38(m, 1H), 6.82(bs, 1H), 3.30-3.00(m, 12H), 1.58-1.30(s, 27H). MS: C23H41F3N4O7 계산치: 542.29, 측정치: 543.4(M+).
단계 4: 화합물 14의 제조: MeOH(200㎖) 중의 화합물 13(25g, 47.32mmol)의 용액을 50℃에서 물(1㎖)의 존재하에 K2CO3(50g)와 함께 교반한다. 반응의 과정을 TLC로 모니터링한다. 고체 K2CO3를 여과하고 MeOH로 세척하고 합한 세척액과 용매를 진공 제거한다. 얻어진 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 생성물 14를 백색 고체로서 수득한다(10.2g, 50%). 1H NMR (DMSO-d6, 400MHz) δ= 6.83(bs, 1H), 2.95-3.30(m, 12H), 2.62-2.50(m, 2H), 1.25-1.45(m, 27H). MS: C21H42N4O6 계산치: 446.31, 측정치: 447.4(M+).
반응식 8a
Figure 112009026592906-PCT00165
a트리에틸렌테트라민 질소의 선택적 보호
단계 5: 화합물 15의 제조: 화합물 9(23.0g, 68.02mmol)를 아세토니트릴/디클로로메탄(1:1, 300㎖)의 혼합물에 용해시키고 0℃로 냉각시킨다. Z-OSu(17.00g, 69mmol)를 상기 용액에 첨가하고 10분간 교반한다. 이어서 트리에틸아민(23.40㎖, 210mmol)을 반응 혼합물에 첨가하고 밤새 교반한다. 용매와 트리에틸아민을 진공 제거하고 잔류물을 DCM으로 추출한 후 물(2회)과 염수로 세척하고 건조시킨다. 용 매를 제거한 후 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(먼저 20-60% EtOAc/헥산으로 용리한 후 5% MeOH/DCM으로 용리한다)로 정제하여 부산물 10(8.5g)과 함께 목적 생성물 15(13.3g)를 백색 고체로서 수득한다. 1H NMR (DMSO-d6, 400MHz) δ= 9.60(bs, 1H), 9.30(bs, 1H), 7.40-7.28(m, 5H), 5.01(s, 2H), 3.40-3.10(m, 8H), 2.70-2.50(m, 4H). MS: C18H22F6N4O4 계산치: 472.15, 측정치: 473.1(M+).
단계 6: 화합물 16의 제조: 화합물 15(13.4g, 28.38mmol)를 단계 2에 설명된 바와 같이 메틸아민(50㎖, EtOH 중의 8M 용액)으로 처리하여 무색의 액체 화합물 16(6.10g, 79%)을 수득한다. 이렇게 얻은 생성물은 추가의 정제 없이 후속 반응에 사용될 수 있다. 1H NMR (DMSO-d6, 400MHz) δ= 7.45-7.20(m, 6H), 5.07(s, 2H), 3.45-2.90(m, 8H), 2.60-2.30(m, 4H). MS: C14H24N4O2 계산치: 280.19 측정치: 281.2(M+).
반응식 9a
Figure 112009026592906-PCT00166
a트리에틸렌테트라민의 단일 이차 질소의 선택적 차단
실시예 10: 5-알킬화 단일 이성체 4의 합성 - 방법 1
단계 1: 화합물 11과 N-도데실아크릴아미드의 반응: 디아민 11(1.00g, 2.41mmol)과 N-도데실아크릴아미드(3.47g, 14.50mmol)를 압력관 안에 함께 넣고 5일간 90℃로 가열한다. 반응을 TLC로 모니터링한다. 반응이 끝나면 혼합물을 디클로로메탄에 용해시키고 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 생성물 17, 18 및 19를 수득한다.
단계 2: 화합물 20의 제조: 화합물 19(2.00g, 1.46mmol)를 에틸아세테이트와 메탄올(1:2, 15㎖)의 혼합물에 용해시키고 여기에 2당량의 아세트산을 첨가한다. 혼합물을 촉매로서 팔라듐/탄소(0.200g, 10중량%)를 사용하여 압력(50psi)하에 수소화하여 목적 생성물 20을 수득한다.
단계 3: 단일 이성체 4의 제조: 화합물 20(1.50g, 1.36mmol)과 아크릴아미드 1(0.325mmol, 1.36mmol)을 톨루엔(4mL)에 용해시키고 90℃로 가열하여 화합물 4를 형성한다. 반응의 과정을 TLC로 모니터링한다. 반응이 완결된 후 혼합물을 실온으로 냉각시키고 DCM에 용해시키고 섬광 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 생성물 4를 수득한다.
반응식 10
Figure 112009026592906-PCT00167
실시예 11: 5-알킬화 단일 이성체 4의 제조 - 방법 2
단계 1: 화합물 21의 제조: 화합물 16(1.0g, 3.56mmol)과 N-도데실아크릴아미드(6.00g, 7당량)를 압력관 안에 함께 넣고 가열하여 화합물 21을 수득한다. 반응의 과정을 TLC로 모니터링한다. 반응이 완결된 후 혼합물을 DCM에 용해시키고 섬광 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물 21을 수득한다.
단계 2: 화합물 21로부터 화합물 4의 제조: 화합물 21(2.00g, 1.35mmol)을 에틸 아세테이트와 메탄올(1:2, 15㎖)의 혼합물에 용해시키고 여기에 2당량의 아세트산을 첨가한다. 혼합물을 팔라듐-탄소(0.200g, 10중량%)를 사용하여 압력(50psi)하에 수소화하여 목적하는 단일 이성체 4를 수득한다.
반응식 11
Figure 112009026592906-PCT00168
실시예 12: 5-알킬화 단일 이성체 3의 제조 - 방법 1
단계 1: 화합물 22의 제조: 화합물 14(5.06g, 11.30mmol)와 N-도데실아크릴아미드(2.94g, 12.43mmol)를 톨루엔에 넣고 5일간 90℃로 가열한다. TLC로 생성물의 형성을 확인한다. 반응 혼합물을 미리 충전된 실리카겔 칼럼에 직접 부하시키고 플래쉬 크로마토그래피(5% MeOH/DCM)로 정제하여 화합물 22를 수득한다(4.82g, 62%). 1H NMR (DMSO-d6, 400MHz) δ= 8.17(bs, 1H), 6.60(bs, 1H), 3.30-2.95(m, 12H), 2.70(t, J=5.80Hz, 2H), 2.60(t, J=6.00Hz, 2H), 2.18(t, J=6.40Hz, 2H), 1.35(m, 29H), 1.26-1.15(m, 18H), 0.83(t, J=6.00Hz, 3H). MS: C36H71N5O7 계산치: 685.54, 측정치: 686.5(M+).
단계 2: 화합물 23의 제조: 화합물 22(4.75g, 6.92mmol)를 디클로로메탄(100mL)에 용해시키고 0℃로 냉각시킨다. Z-OSu(2.59g, 1.5당량)를 상기 용액에 첨가하고 10분간 교반한다. 이어서 반응 혼합물을 트리에틸아민(2.82㎖, 20.76mmol)과 함께 밤새 교반한다. 용매와 트리에틸아민을 진공 제거하고 잔류물 을 디클로로메탄으로 추출한 후 물(2회)과 염수로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨다. 용매를 제거한 후 잔류물을 섬광 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(5-10% MeOH/DCM)로 정제하여 목적 화합물 23(5.33g, 94%)을 수득한다. 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 7.49-7.25(m, 5H), 5.11 (s, 2H), 3.60-3.02(m, 14H), 2.45-45(m, 4H), 1.50-1.35(m, 27H), 1.24-1.20(m, 18H), 0.87(t, J=6.00Hz, 3H). MS: C44H77N5O9 계산치: 819.57, 측정치: 820.7(M+).
단계 3: 화합물 24의 제조: 디옥산 중의 4M HCl(50㎖)을 디옥산(100㎖) 중의 화합물 23(5.30g, 6.50mmol)의 용액에 첨가한다. 이어서 반응 혼합물을 밤새 교반한다. 반응 과정 중에 생성물이 침전된다. 용매와 HCl을 진공 제거하여 백색 고체를 수득한다. 잔류물을 과량의 트리에틸아민을 함유한 MeOH에 넣고 상기 현탁액을 1시간 동안 교반하여 균일한 용액을 수득한다. 용매를 진공 제거하고 잔류물을 EtOAc로 연화하고 트리에틸아민 하이드로클로라이드 염을 여과한다. 합한 여액을 진공 증발시켜 고무상 액체 24(3.30g, 98%)를 수득한다. 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 7.37-7.28(m, 5H), 5.05(s, 2H), 3.60-3.20(m, 4H), 3.10-2.70(m, 10H), 2.40-2.20(m, 4H), 1.40-1.30(m, 2H), 1.25-1.17(m, 18H), 0.81(t, J=6.00Hz, 3H). MS: C29H53N5O3 계산치: 519.41, 측정치: 520.4(M+).
단계 4: 화합물 25의 제조: 화합물 24(1.00g, 1.925mmol)와 N-도데실아크릴 아미드(3.70g, 8당량)를 압력관에 함께 넣고 승온으로 가열하여 목적 화합물 25를 수득한다. 생성물의 형성을 TLC로 모니터링한 후 섬광 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 25를 수득한다.
단계 5: 화합물 3의 제조: 화합물 25(2.00g, 1.35mmol)를 에틸 아세테이트와 메탄올(1:2, 15㎖)의 혼합물에 용해시키고 여기에 2당량의 아세트산을 첨가한다. 혼합물을 팔라듐-탄소(0.200g, 10중량%)를 사용하여 압력(50psi)하에 수소화하여 목적 생성물 3을 수득한다.
반응식 12
Figure 112009026592906-PCT00169
실시예 13: 5-알킬화 단일 이성체 3의 합성 - 방법 2
단계 1: 화합물 26의 제조: 벤질 브로마이드(1.25㎖, 1.5당량)를 DMF(100㎖) 중의 화합물 22(4.80g, 7.00mmol)와 K2CO3(9.67g, 10당량)의 현탁액에 첨가하고 혼합물을 밤새 교반한다. 반응의 과정을 TLC로 모니터링한다. 고체를 여과하고 MeOH와 에틸 아세테이트로 세척한다. 합한 여액을 감압하에 농축하고 이렇게 얻은 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(50-100% EtOAc/헥산)로 정제하여 목적 화합물 26(3.30g, 61%)을 수득한다. 1H NMR (DMSO-d6, 400MHz) δ= 7.77(bs, 2H), 7.28-7.23(m, 5H), 6.85-6.70(m, 1H), 3.59(s, 2H), 3.20-2.20(m, 18H), 1.35(s, 27H), 1.30-1.23(m, 2H), 1.20-1.15(m, 18H), 6.81(t, J=6.00Hz, 3H). MS: C43H77N5O7 계산치: 775.58, 측정치: 776.5(M+)
단계 2: 화합물 27의 제조: 디옥산(50㎖) 중의 화합물 26(3.30g, 4.25mmol)을 디옥산 중의 4M HCl(50㎖)과 함께 밤새 교반한다. 반응 과정 중에 백색 침전물의 형성이 보인다. 용매와 산을 진공 제거하고 이렇게 얻은 백색 잔류물을 과량의 에틸아민을 함유한 메탄올에 재용해시킨다. 이어서 균일한 용액을 감압하에 증발시켜 백색 잔류물을 수득한다. 상기 잔류물을 EtOAc로 연화시키고 트리에틸아민 하이드로클로라이드 염을 여과한다. 여액을 진공하에 증발시켜 목적 화합물 27(2.36g, 99%)을 고무상 액체로서 수득한다. 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 8.05(t, J=5.5Hz, 1H), 7.40-7.20(m, 5H), 3.58(s, 2H), 3.10-2.30(m, 18H), 1.40-1.30(m, 2H), 1.25-1.15(m, 18H), 0.82(t, J=6.00Hz, 3H). MS: C28H53N5O 계산치: 475.43, 측정치: 498.4(M+Na)
단계 3: 화합물 28의 제조: 순물질 화합물 27(1.00g, 2.10mmol)과 N-도데실아크릴아미드(4.0g, 8당량)를 압력관에서 혼합하고 승온으로 가열하여 화합물 28을 수득한다. 화합물 28의 형성은 TLC 및 LC-MS로 모니터링한다. 반응이 완결된 후 생성물을 크로마토그래피 정제로 단리하여 순수한 화합물 28을 수득한다.
단계 4: 화합물 28로부터 화합물 3의 제조: 화합물 28(2.00g, 1.40mmol)을 에틸 아세테이트와 메탄올(1:2, 15㎖)의 혼합물에 용해시키고 여기에 6당량의 아세트산을 첨가한다. 혼합물을 팔라듐-탄소(0.200g, 10중량%)를 사용하여 압력(50psi)하에 수소화하여 화합물 3을 수득한다.
반응식 13
Figure 112009026592906-PCT00170
실시예 14: 이성체 3의 수렴형 합성 - 방법 1
단계 1: 화합물 30, 31 및 32의 제조: 에틸렌디아민 29(0.978ml, 14.63mmol), N-도데실아크릴아미드(7.00g, 29.26mmol) 및 붕산(100㎎)을 물 5㎖에 넣고 4일간 90℃로 가열한다. TLC 분석에 의해 아크릴아미드가 완전히 소멸됨을 확인한다. 반응 혼합물을 DCM에 용해시키고 물과 비카보네이트로 세척한 후 황산나트륨으로 건조시킨다. DCM을 제거하고 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래 피(2:2:96 내지 10:10:80% MeOH/TEA/DCM)로 정제하여 화합물 30을 수득한다(1.86g). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 7.05(bs, 2H), 3.21 (q, J=6.30Hz, 4H), 2.87(t, J=6.00Hz, 4H), 2.73(s, 4H), 2.34(t, J=6.00Hz, 4H), 1.57(bs, 2H), 1.49-1.45(m, 4H), 1.28-1.19(m, 40H), 0.87(t, J=6.8Hz, 6H) MS: C32H66N4O2 계산치: 538.52, 측정치: 539.50(M+). 화합물 31(3.50g) 1H NMR (DMSO-d6, 400MHz) δ= 8.20(bs, 1H), 3.20-2.15(m, 22H), 1.36-1.30(m, 6H), 1.25-1.15(m, 30H), 0.81(t, J=6.00Hz, 9H), MS: C47H95N5O3 계산치: 777.74, 측정치: 778.7(M+) 및 화합물 32(1.75g) 1H NMR (DMSO-d6, 400MHz) δ= 3.23-2.15(m, 28H), 1.35-1.45(m, 8H), 1.26-1.15(m, 40H), 0.82(t, J=6.00Hz, 12H). MS: C62H124N6O4 계산치: 1016.97, 측정치: 1018.0(M+).
단계 2: 화합물 33의 제조: 화합물 31(1.55g, 2mmol)과 K2CO3(2.76g, 20mmol)을 DMF에 넣는다. 여기에 클로로아세트알데하이드 디메틸 아세탈(0.453㎖, 4.00mmol)을 첨가하고 24시간 동안 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링하고 K2CO3를 여과하고 MeOH로 세척한다. 용매를 감압하에 제거하고 잔류물을 크로마토그래피로 정제하여 화합물 33을 수득한다.
단계 3: 화합물 34의 제조: 화합물 33(2.00g, 2.31mmol)을 MeOH과 DCM의 혼합물에 넣고 여기에 PTSA(2.0당량)을 첨가하고 반응 혼합물을 밤새 교반한다. 상 기 용액을 중탄산나트륨 용액으로 중화시키고 DCM으로 추출한 후 건조시킨다. 화합물을 크로마토그래피 분리로 정제하여 목적 생성물 34를 수득한다.
단계 4: 화합물 34로부터 단일 이성체 3의 제조: 화합물 34(2.00g, 2.43mmol)와 화합물 30(1.31g, 2.43mmol)을 DCM에 넣고, 여기에 활성화 분자체를 첨가하고 3시간 동안 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링한다. 반응이 끝나면 용매를 제거한다. 잔류물을 THF에 용해시키고 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드(5당량)와 아세트산을 첨가하고 밤새 교반한다. 용매를 제거하고 DCM으로 추출한 후 잔류물을 크로마토그래피 분리하여 순수한 이성체 3을 수득한다.
반응식 8
Figure 112009026592906-PCT00171
실시예 15: 이성체 3의 수렴형 합성 - 방법 2
목적하는 단일 이성체 3은 화합물 30으로부터 하나의 질소를 선택적으로 보호하여 화합물 35를 수득함으로써 제조될 수도 있다. 이어서 화합물 35를 환원성 조건하에 알데하이드 34와 반응시켜 화합물 36을 수득한다. 화합물 36을 산 처리하여 목적 화합물 3을 수득한다.
반응식 15
Figure 112009026592906-PCT00172
실시예 16: 이성체 3의 수렴형 합성 - 방법 3
목적하는 단일 이성체 3은 모노벤질 에틸렌디아민 37로부터 제조될 수도 있다. 화합물 37을 화합물 1로 알킬화하여 화합물 38, 39 및 40의 혼합물을 수득한다. 화합물 40을 환원성 조건하에 알데하이드 34와 반응시켜 화합물 41을 수득한다. 화합물 41을 수소 첨가 분해하여 목적 화합물 3을 수득한다.
반응식 16
Figure 112009026592906-PCT00173
실시예 17: 이성체 4의 수렴형 합성 - 방법 1
단계 1: 화합물 43의 제조: 150㎖ 가압 보틀에 N-도데실-아크릴아미드 1(16.4g, 68.8mmol)를 넣고 당해 용기를 아르곤하에 온화하게 가열하여 용융시키고 여기에 붕산 수용액 3㎖를 첨가한다. 상기 용융물에 Boc 보호된 에틸렌디아민 42(5g, 31.2mmol)을 첨가하고 혼합물을 밤새 90℃로 가열한다. 반응 혼합물을 용리액으로서 CH2Cl2:MeOH:NEt3(90:5:5)을 사용하여 TLC로 분석한다. TLC는 출발 아크릴아미드 1이 거의 완전히 소모되었음을 보여준다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(100㎖)에 용해시키고 상기 용액을 고상의 중탄산나트륨과 함께 교반한 후 유기층을 여과하고 회전 증발기에서 농축시킨다. 상기 조악한 생성물을 CH2Cl2:MeOH:NEt3(48:1:1 내지 8:1:1)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피(실리카겔)로 정제한다. 상기 반응에서 주요한 생성물은 이중 부가 생성물 43이다. 소량의 단일 부가물도 관찰된다.
단계 2: 화합물 44의 제조: 화합물 43(2.00g, 3.13mmol)을 디옥산(50㎖)에 넣고 여기에 HCl(20㎖, 디옥산 중의 4M 용액)을 첨가하고 밤새 교반한다. 용매를 제거하고 화합물 44를 수득한다.
단계 3: 화합물 34 및 44로부터 단일 이성체 4의 제조: 화합물 34(2.00g, 2.43mmol)와 화합물 44(1.31g, 2.43mmol)를 DCM에 넣고, 여기에 활성 분자체를 첨가하고 3시간 동안 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링한다. 반응이 끝나면 용매를 제거한다. 잔류물을 THF에 용해시키고 나트륨 트리아세톡시 보로하이드라이드(5당량)와 아세트산을 첨가하고 밤새 교반한다. 용매를 제거하고 DCM으로 추출하고 잔류물을 크로마토그래피 분리시켜 순수한 이성체 4를 수득한다.
반응식 17
Figure 112009026592906-PCT00174
실시예 18: N- 도데실아크릴아미드를 1,3- 디아미노프로판에 첨가한 후 아미드를 아민으로 환원시키는 방법
양이온성 지질에서 전하의 수의 영향을 연구하기 위해 아크릴아미드 1과 1,3-디아미노프로판 45의 마이클 부가물을 조사한다.
반응식 18a
Figure 112009026592906-PCT00175
a(i) 90℃, 수성 붕산, 16시간, (ⅱ) 1,4-디옥산 중의 4M HCl, 실온, 12시간 및 (ⅲ) BH3
단계 1: 화합물 46, 47 및 48의 합성: 150㎖ 가압 보틀에 N-도데실-아크릴아미드 1(15.4g, 64mmol)을 넣고 당해 용기를 아르곤하에서 온화하게 가열하여 용융시키고 여기에 붕산 수용액 3㎖를 첨가한다. 상기 용융물에 1,3-디아미노프로판 44(1.58g, 21mmol)를 첨가하고 혼합물을 밤새 90℃로 가열한다. 반응 혼합물을 용리액으로서 CH2Cl2:MeOH:NEt3(90:5:5)을 사용하여 TLC로 분석한다. TLC는 출발 아크릴아미드 1이 거의 완전히 소모되었음을 보여준다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(100㎖)에 용해시키고 상기 용액을 고상의 중탄산나트륨과 함께 교반하고 유기층을 여과하고 회전 증발기에서 농축시킨다. 상기 조악한 생성물을 CH2Cl2:MeOH:NEt3(48:1:1 내지 8:1:1)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피(실리카겔)로 정제한다. 상기 반응에서 주요한 생성물은 삼중 부가 생성물 46이다. 소량의 사중 부가물 47 및 이중 부가물 48도 단리된다.
N-도데실-3-{(2-도데실카바모일-에틸)-[3-(2-도데실카바모일-에틸아미노)-프로필]-아미노}-프로피온아미드 46. 삼중 부가 생성물 46은 백색 분말로서 단리된다(5.7g, 35%). MS m/z 793 (MH+). 1H NMR CDCl3 δ 0.87 (t, J=6.6Hz, 9H), 1.20-1.30 (m, 60H), 1.42-1.66 (m, 6H), 2.33 (t, J=6Hz, 4H), 2.38-2.46 (m, 4H), 2.60-2.70 (m, 4H), 2.84 (t, 2H), 3.15-3.28 (m, 6H), 6.65 (bs, 1H), 6.99 (bs, 3H).
4-[{3-[비스-(2-도데실카바모일-에틸)-아미노]-프로필}-(2-도데실카바모일-에틸)아미노]-N-도데실-부티라미드 47. 사중 부가 생성물 47도 소량으로 단리된다.
N-도데실-3-[-(2-도데실카바모일-에틸아미노)-프로필아미노]-프로피온아미드 48. 이중 부가물 48은 크림색 분말로서 단리된다(1.6g, 10%). MS m/z 553 (MH+). 1H NMR CDCl3 δ 0.89 (t, J=6.6Hz, 6H), 1.10-1.20 (m, 40H), 1.42- 1.66 (m, 4H), 2.20 (t, J=6Hz, 4H), 2.55 (t, 4H), 2.60 (t, 4H), 3.00 (m, 4H), 8.00 (bs, 2H).
단계 2: 아민 4, 35 및 36을 이들의 상응하는 하이드로클로라이드 염 49, 50 및 51로 전환시키는 단계.
아민 46(5.5 g)을 실시예 8에 설명된 것과 유사한 방법을 사용하여 상응하는 HCl 49로 전환시킨다. 디하이드로클로라이드 염 49는 백색 분말로서 단리된다(5.73g, 92%). 1H NMR DMSO-d6 δ 0.88 (t, J=7Hz, 9H), 1.17-1.30 (m, 66H), 1.35-1.45 (m, 6H), 2.10-2.25 (m, 2H), 2.55-2.70 (m, 6H), 2.95-3.15 (m, 10H), 3.20-3.35 (m, 6H), 8.16 (t, 1H), 8.24 (t, 1H), 9.15 (bs, 1H), 10.65 (bs, 1H).
실시예 8에 설명된 것과 유사한 방법에서 아민 47을 4M HCl로 처리하여 디하이드로클로라이드 염 50을 수득한다.
실시예 8에 설명된 것과 유사한 방법에서 아민 48을 4M HCl로 처리하여 디하이드로클로라이드 염 51을 수득한다.
단계 3: 아미드 46, 47 및 48의 아민 52, 53 및 54로의 환원: 아민 46을 과량의 디보란과 함께 THF 중에서 밤새 환류시킨 후 4M HCl로 처리하여 폴리아민의 하이드로클로라이드 염 52를 수득한다.
아민 47 및 48을 유사하게 처리하여 상응하는 환원 생성물 53 및 54를 이들의 각각의 하이드로클로라이드 염으로서 수득한다.
실시예 19: 폴리아미드 3, 4 및 5의 상응하는 폴리아민 덴드리머(dendrimer)로의 환원
화합물 3을 과량의 디보란과 함께 THF 중에서 환류시켜 상응하는 환원 생성물 55를 수득한다. 반응이 완결된 후 반응 혼합물을 4M HCl로 처리하고 마무리 처리하여 생성물을 이의 하이드로클로라이드 염으로서 단리한다. 56 및 57의 하이드로클로라이드 염도 각각 상응하는 전구체 4 및 5로부터 수득한다.
반응식 19a
Figure 112009026592906-PCT00176
a(i) BH3, THF, 환류
실시예 20: 폴리아미노 알킬 지질 - 아미드의 아민으로의 환원
화합물 32로부터 폴리아민 60의 제조: 화합물 32(1.02g, 1mmol)를 THF(20㎖)에 넣고 여기에 BH3.THF(60㎖, 1M THF 용액)를 첨가하고 2일간 환류시킨다. 반응을 TLC로 모니터링한다. THF를 제거하여 백색 잔류물을 수득하고 이것을 1M HCl로 처리하고 DCM으로 추출한다. 조악한 생성물을 크로마토그래피 분리하여 순수한 화합물 60을 수득한다.
화합물 30 및 31로부터 폴리아민 58 및 59의 제조: 화합물 60의 제조에서 설명된 것과 유사한 조건하에 아미드 30 및 31을 환원시켜 각각 화합물 58 및 59를 수득한다.
반응식 20
Figure 112009026592906-PCT00177
실시예 21: 폴리아미도 - 폴리아미노 알킬의 합성 - 알킬 할라이드를 사용한 아민의 알킬화
단계 1: 화합물 62의 제조: DCM(200㎖) 중의 클로로아세틸 클로라이드(10.31㎖, 129.37mmol)의 용액을 얼음조 위에서 냉각시키고 여기에 TEA(36.70㎖, 269.5mmol)를 함유하는 디클로로메탄 중의 도데실아민(61, 20.00g, 107.81mmol)의 용액을 1시간에 걸쳐 적가한다. 이때 반응 혼합물은 흑갈색으로 변한다. 0℃에서 한 시간 더 계속 교반한다. 반응 혼합물을 소결 깔대기를 통해 여과시키고 EtOAc로 세척한 후 클로로포름으로 희석시키고 물, 중탄산나트륨 용액, 1M HCl 및 염수로 순차적으로 세척한다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시킨다. 용매를 제거하고 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(5-50% EtOAc/헥산)로 정제하여 화합물 62(26.00g, 92%)를 갈색 고체로서 수득한다. 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 6.59(bs, 1H), 4.03(s, 2H), 3.25(q, J=6.00Hz, 2H), 1.54-1.49(m, 2H), 1.45-1.15(m, 18H), 0.86(t, J=6.00Hz, 3H). MS: C14H28ClNO 계산치: 261.19, 측정치: 262.20(M+).
단계 2: 화합물 63, 64 및 65의 제조: 트리에틸렌테트라민 2(1.00g, 6.83mmol)와 클로로아세트아미드 62(10.00g, 5.5당량)를 CH3CN/DMF(1:3)의 혼합물에 함께 넣고 여기에 K2CO3(9.43g, 10당량) 및 KI(50㎎)를 첨가하고 3일간 85℃로 가열한다. 반응 혼합물을 여과하여 고체를 제거하고 DCM으로 세척한 후 용매를 진공 제거하고 조악한 잔류물을 크로마토그래피 분리하여 순수한 화합물 63, 64 및 65를 수득한다.
반응식 21
Figure 112009026592906-PCT00178
실시예 22: 폴리아미도 - 폴리아미노 알킬의 합성 - 분지된 아미노알킬을 갖는 알킬 할라이드를 사용한 아민의 알킬화
단계 1: 화합물 67의 제조: 클로로아세틸 클로라이드(4.05㎖, 51mmol)를 DCM(100㎖)에 넣고 0℃ 미만으로 냉각시킨다. 여기에 N,N-디도데실아민(66, 15.00g, 42.41mmol)과 TEA(14.43㎖, 2.5당량)의 디클로로메탄 용액을 1시간에 걸쳐 적가한다. 이때 반응 혼합물은 흑갈색으로 변한다. 첨가 후 반응 혼합물을 주위 온도에서 24시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 소결 깔대기를 통해 여과하고 EtOAc로 세척한 후 클로로포름으로 희석하고 물, 중탄산나트륨 용액, 1M HCl 및 염수로 순차적으로 세척한다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시킨다. 용매를 진공 제거하고 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(5-50% EtOAc/헥산)로 정제하여 필요한 생성물 67(12.5g, 69%)을 갈색 액체로서 수득한다. 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 4.04(s, 2H), 3.30(m, 4H), 1.50-1.45(m, 2H), 1.40-1.20(m, 18H), 0.87(t, J=6.00Hz, 3H). MS: C26H52ClNO 계산치: 430.15, 측정치: 431.2(M+).
단계 2: 화합물 68, 69 및 70의 제조: 트리에틸렌테트라민 2(0.500g, 6.83mmol)와 클로로아세트아미드 67(8.10g, 5.5당량)을 CH3CN/DMF(1:3)의 혼합물에 함께 넣고 여기에 K2CO3(4.72g, 10당량) 및 KI(30㎎)를 첨가하고 3일간 85℃로 가열한다. 반응 혼합물을 여과하여 불용성 고체를 제거하고 DCM으로 세척한 후 용매를 제거하고 잔류물을 크로마토그래피 분리하여 화합물 68, 69 및 70을 수득한다.
반응식 22
Figure 112009026592906-PCT00179
실시예 23: N,N- 디알킬아크릴아미드의 폴리아민으로의 첨가
양이온성 지질에 보다 소수성인 쇄를 첨가하는 효과를 연구하기 위해, 아크릴아미드에 대한 전구체로서 디도데실아민을 사용한다.
반응식 23a
Figure 112009026592906-PCT00180
a(i) 아크릴로일 클로라이드, -10 내지 0℃, DIPEA, CH2Cl2, 4시간, (ⅱ) 90℃, 순물질, 5일간, 및 (ⅲ) HCl/디옥산
단계 1: N,N-디도데실아크릴아미드 71의 합성
무수 CH2Cl2(700㎖) 중의 디도데실아민 66(25g, 70.7mmol)과 디이소프로필에틸아민(18g, 141mmol)의 용액에 -10℃에서 CH2Cl2(100㎖) 중의 아크릴로일 클로라이드(7.68g, 85mmol)의 용액을 20분에 걸쳐 적가한다. 첨가를 완료한 후 반응 혼합물을 0℃에서 4시간 동안 교반한다. 이후 반응 혼합물의 TLC는 반응이 완결되었음을 보여준다. 반응 혼합물을 NaHCO3 포화 용액(200㎖), 물(200㎖) 및 염수(100㎖)로 세척하고 NaSO4로 건조시킨다. 유기층을 농축하여 생성물 71(28.4g, 100%)을 수 득하고 이것을 그대로 후속 단계에 사용한다. 1H NMR CDCl3 δ 0.94 (t, J= 6.5Hz, 6H), 1.05-1.69 (m, 40H), 3.15-3.60 (dt, 4H), 5.64 (d, 1H), 6.36 (d, 1H), 6.63 (m, 1H).
단계 2: 트리에틸렌테트라민 2와 화합물 71의 반응
아크릴아미드 71을 아민 2로 처리하고 일반적인 마무리 처리 및 칼럼 정제 후에 마이클 부가 생성물 72, 73 및 74를 단리한다.
단계 3: 하이드로클로라이드 염 75, 76 및 77의 합성: 얻어진 각각의 단일 화합물을 디옥산에 넣고 상기 용액에 디옥산 중의 4M HCl을 첨가하고 실시예 8에 설명된 바와 같이 교반하여 상응하는 하이드로클로라이드 염을 수득한다.
실시예 24: 마이클 첨가 조건하에 일불포화 N- 알킬 아크릴아미드를 사용한 폴리아민의 알케닐화
알킬쇄에서 이중 결합의 효과를 연구하기 위해 아크릴아미드 79에 대한 전구체로서 올레일아민을 사용한다.
반응식 24a
Figure 112009026592906-PCT00181
a(i) 아크릴로일 클로라이드, -10 내지 0℃, DIPEA, CH2Cl2, 4시간, (ⅱ) 90℃, 순물질, 5일간, 및 (ⅲ) HCl/디옥산
단계 1: 화합물 79의 합성: 무수 CH2Cl2(200㎖) 중의 올레일아민 78(26.75g, 100mmol)과 트리에틸아민(20g, 200mmol)의 용액에 -10℃에서 CH2Cl2(100㎖) 중의 아크릴로일 클로라이드(9.9g, 110mmol)의 용액을 20분에 걸쳐 적가한다. 첨가를 완료한 후 반응 혼합물을 0℃에서 4시간 동안 교반한다. 이후 반응 혼합물의 TLC는 반응이 완결되었음을 보여준다. 반응 혼합물을 NaHCO3 포화 용액(200㎖), 물(200㎖) 및 염수(100㎖)로 세척하고 NaSO4로 건조시킨다. 유기층을 농축하여 생성물 79(32g, 100%)를 수득하고 이것을 그대로 후속 단계에 사용한다. 1H NMR CDCl3 δ 0.91 (t, J= 6.5Hz, 3H), 1.05-1.35 (m, 24H), 1.42 (t, 2H), 1.96 (m, 4H), 5.31 (t, 1H), 5.33-5.36 (m, 1H), 5.54 (dd, 1H), 6.02 (dd, 1H), 6.18 (dd, 1H), 8.03 (bs, 1H).
단계 2: 화합물 79와 트리에틸렌테트라민의 반응
아크릴아미드 79를 트리에틸렌테트라민 2로 처리하고 일반적인 마무리 처리 및 마이클 부가 생성물의 칼럼 정제 후 순수한 화합물 80, 81 및 82를 수득한다.
단계 3: 하이드로클로라이드 염 83, 84 및 85의 합성: 얻어진 각각의 단일 화합물(80, 81 또는 82)을 디옥산에 넣고 상기 용액에 디옥산 중의 4M HCl을 첨가하고 실시예 8에 설명된 바와 같이 교반하여 상응하는 하이드로클로라이드 염을 수득한다.
실시예 25: 마이클 첨가 조건하에 일불포화 N- 알킬 아크릴아미드를 사용한 디아민의 알케닐화
반응식 25a
Figure 112009026592906-PCT00182
a(i) 90℃, 수성 붕산, 16시간 및 (ⅱ) HCl/디옥산
실시예 24의 것과 유사한 방법으로 아크릴아미드 79를 디아민 45로 처리하고 일반적인 마무리 처리 및 칼럼 정제 후 마이클 부가 생성물 86, 87 및 88을 단리한다. 이렇게 얻은 유리 아민을 디옥산 중의 HCl로 처리하여 각각 상응하는 하이드로클로라이드 염 89, 90 및 91을 수득한다.
실시예 26: 마이클 첨가 조건하에 다불포화 N-알킬 아크릴아미드를 사용한 폴리아민의 알케닐화
알킬쇄에서 다불포화의 영향을 연구하기 위해 아크릴아미드 93에 대한 전구체로서 리놀레일아민 92를 사용한다.
반응식 26a
Figure 112009026592906-PCT00183
a(i) 아크릴로일 클로라이드, -10 내지 0℃, DIPEA, CH2Cl2, 4시간, (ⅱ) 90 ℃, 순물질, 5일간, 및 (ⅲ) HCl/디옥산
단계 1: 화합물 93: 리놀레일아민 92를 실시예 24, 단계 1의 것과 유사한 방법으로 아크릴로일 클로라이드로 처리하고 상응하는 아크릴아미드 93을 단리한다.
단계 2: 화합물 93과 트리에틸렌테트라민의 반응
아크릴아미드 93을 실시예 3에 설명된 바와 같이 붕산의 존재하에 트리에틸렌테트라민 2로 처리하고 일반적인 마무리 처리 및 마이클 부가 생성물의 칼럼 정제 후 순수한 화합물 94, 95 및 96을 수득한다.
단계 3: 하이드로클로라이드 염 97, 98 및 99의 합성: 얻어진 각각의 단일 화합물(94, 95 또는 96)을 디옥산에 넣고 상기 용액에 디옥산 중의 4M HCl을 첨가하고 실시예 8에 설명된 바와 같이 교반하여 상응하는 하이드로클로라이드 염을 수득한다.
실시예 27: 마이클 첨가 조건하에 다불포화 N- 알킬 아크릴아미드를 사용한 디아민의 알케닐화
알킬쇄에서 다불포화의 영향을 연구하기 위해 아크릴아미드 93에 대한 전구체로서 리놀레일아민 92를 사용한다.
반응식 27a
Figure 112009026592906-PCT00184
a(i) 90℃, 수성 붕산, 16시간 및 (ⅱ) HCl/디옥산
실시예 3의 것과 유사한 방법으로 아크릴아미드 93을 붕산의 존재하에 디아민 45로 처리하고 일반적인 마무리 처리 및 칼럼 정제 후 마이클 부가 생성물 100, 101 및 102를 단리한다. 이렇게 얻은 유리 아민을 디옥산 중의 HCl로 처리하여 각각 상응하는 하이드로클로라이드 염 103, 104 및 105를 수득한다.
실시예 28: 마이클 첨가 조건하에 알킬 아크릴레이트를 사용한 폴리아민의 알케닐화
반응식 28a
Figure 112009026592906-PCT00185
a(i) 메탄올-물, 40℃; 또는 메탄올, 물, 붕산, 실온
방법 1: n-도데실아크릴레이트(106)를 40℃의 메탄올-물 중에서 트리에틸렌테트라민 2와 함께 교반하여 화합물 107, 108 및 109를 수득한다. 생성물을 크로마토그래피 분리에 의해 단리한다.
방법 2: n-도데실아크릴레이트(106)를 40℃의 메탄올-물 중에서 붕산의 존재하에 트리에틸렌테트라민 2와 함께 교반하여 화합물 107, 108 및 109를 수득한다. 생성물을 크로마토그래피 분리에 의해 단리한다.
실시예 29: 마이클 첨가 조건하에 알킬 아크릴레이트를 사용한 디아민의 알케닐화
반응식 29a
Figure 112009026592906-PCT00186
a(i) 메탄올-물, 40℃; 또는 메탄올, 물, 붕산, 실온
방법 1: n-도데실아크릴레이트(106)를 40℃의 메탄올-물 중에서 트리에틸렌테트라민 2와 함께 교반하여 화합물 110, 111 및 112를 수득한다. 생성물을 크로마토그래피 분리에 의해 단리한다.
방법 2: n-도데실아크릴레이트(106)를 40℃의 메탄올-물 중에서 붕산의 존재하에 트리에틸렌테트라민 2와 함께 교반하여 화합물 110, 111 및 112를 수득한다. 생성물을 크로마토그래피 분리에 의해 단리한다.
실시예 30: 옥타데카 -9,12- 디에노산 3-디메틸아미노-2- 옥타데카 -9,12- 디에노일옥시 -프로필 에스테르 3의 합성
Figure 112009026592906-PCT00187
무수 DMF(60㎖) 중의 리놀레산(25g, 89.1mmol)의 용액에 실온에서 디이소프로필 에틸아민(17㎖, 100mmol)을 교반하면서 첨가한 후 3-(디메틸아미노)-1,2-프로판디올(4.8g, 40.5mmol) 및 EDCI(17.25g, 89.9mmol)를 첨가하고 상기 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 반응 혼합물의 TLC(용리액 20% EtOAc/헥산)는 반응의 완결을 보여준다. 반응 혼합물을 얼음물에 붓고 에틸 아세테이트(2×100㎖)로 추출한다. 합한 유기층을 물(100㎖) 및 NaHCO3 포화 용액(100㎖)으로 세척하고 Na2SO4로 건조시킨다. 유기층을 농축시켜 얻은 조악한 생성물을 칼럼 크로마토그래피(실리카겔, 용리액: 20% EtOAc/헥산)로 정제한다. 순수한 생성물을 함유한 분획물을 모아서 농축시킨다. 순수한 에스테르가 투명한 액체로서 단리된다(5.7g, 22%). MS m/z 645 (M+H). 1H NMR CDCl3 δ 0.88(t,J=6.3Hz, 6H), 1.20-1.39(m, 28H), 1.61(t, J=4.9Hz, 12H), 2.03-2.08(m, 8H), 2.26-2.38(m, 10H), 2.44-2.56(m, 2H), 2.76(t, J=6.3Hz, 4H), 4.09(dd, J=6.1Hz & 11.9Hz, 1H), 4.36(dd, J=3.3 & 11.9Hz, 1H), 5.29-5.34(m, 1H), 5.34-5.41(m, 8H). 13C NMR CDCl3 δ 14.30, 22.79, 25.08, 25.10, 25.83, 27.40, 29.26, 29.30, 29.34, 29.42, 29.55, 29.83, 31.73, 34.32, 34.58, 46.01, 59.37, 64.02, 128.08, 128.24, 130.21, 130.42, 173.39, 173.65.
실시예 31: 압출을 사용한 리포솜의 예시적 제조 방법
100% 에탄올 중의 ND98(120㎎/㎖), 콜레스테롤(25㎎/㎖), 및 C16-PEG-Cer-2000(100㎎/㎖)의 저장 용액을 제조한다. -20℃에서 저장한다. 제제를 제조하기 전에 37℃의 수조에서 승온시킨다(30분 이하가 유용하다 - 콜레스테롤이 완전히 용해하는 데에는 짧은 시간이 소요된다).
2×2㎖ 제조
15㎖ Falcon 튜브에,
1) 지질 125㎕
2) 콜레스테롤 200㎕
3) PEG 70㎕
4) 100% 에탄올 5㎕
5) 25mM 아세트산나트륨(pH 5) 600㎕를 첨가하고,
6) 와동하에 온화하게 혼합하고(5로 설정),
7) 수크로오스 20㎎을 첨가하고,
8) 수크로오스가 용해될 때까지 다시 와동시키고,
9) 새로 제조한 25mM 아세트산나트륨 중의 siRNA 1㎎/㎖ 용액(= 10㎎/㎖ siRNA 100㎕ + 25mM 아세트산나트륨 900㎕) 1㎖를 (새로운 Falcon 튜브에) 가하고,
10) 20분간 가볍게 와동시키고(1로 설정, Falcon 튜브 홀더 어댑터 사용),
11) 15분 후(잔여 5분), 압출기를 세정하고,
12) 40℃에서 2개의 200㎚ 여과기를 통해 11회 압출시키고,
13) 3,500 MWCO Pierce 카세트에서 실온에서 90분간 PBS(pH 7.4)에 투석한다.
실시예 32: 압출을 사용하지 않는 리포솜의 예시적 제조 방법
100% 에탄올 중의 ND98(120㎎/㎖), 콜레스테롤(25㎎/㎖), 및 C16-PEG-Cer-2000(100㎎/㎖)의 저장 용액을 제조한다. -20℃에서 저장한다. 제제를 제조하기 전에 37℃의 수조에서 승온시킨다(30분 이하가 유용하다 - 콜레스테롤이 완전히 용해하는 데에는 짧은 시간이 소요된다).
15㎖ Falcon 튜브에,
1) 지질 125㎕
2) 콜레스테롤 200㎕
3) PEG 70㎕
4) 100% 에탄올 495㎕
5) 물 100㎕를 첨가하고,
6) 100 내지 300mM 아세트산나트륨(pH 약 5) 중의 1㎎/㎖ siRNA 1㎖를 제조하고,
7) 90% 에탄올 중의 지질을 아세테이트 완충액 중의 siRNA와 함께 급속 혼합하고,
8) 100 내지 300mM 아세트산나트륨(pH 약 5)에 투석(또는 한외여과 사용)하여 에탄올을 제거하고,
9) PBS에 투석(또는 한외여과 사용)하여 완충 조건을 변화시킨다.
실시예 33: 리포솜 시료 중의 RNA 를 정량하기 위한 예시적 프로토콜
하기 방법은 (1) 포집된 siRNA의 비율과 (2) 리포솜 중의 siRNA의 총량을 정량하는 데 사용될 수 있다.
재료:
리보그린(Molecular Probes)
2% 트리톤 X-100
TE 완충액
프로토콜(96-웰 플레이트 구성):
1. 시험 시료를 siRNA 농도가 약 2㎍/㎖(0.4 내지 4㎍/㎖)가 되도록 TE 완충액에 희석한다. 시료의 희석도에 주의한다.
2. 각각의 시료 50㎕를 2개의 웰 내에 배열한다(예: 시료를 2열의 마이크로 플레이트 내에 배열).
3. TE 완충액 50㎕를 2개의 시료 중 어느 하나(예: 상부 열의 시료)에 첨가한다. 상기 시료는 "유리" siRNA를 측정하는 데 사용될 것이다.
4. 2% 트리톤 X-100 50㎕를 2개의 시료 중 나머지 하나(예: 하부 열의 시료)에 첨가한다. 상기 시료는 "총" siRNA를 측정하는 데 사용될 것이다.
5. 정량 대상 siRNA 기지량을 사용하여 표준 siRNA 희석액을 제조한다. 4㎍/㎖ 50㎕로 출발하고 2배 희석을 한다. 2% 트리톤 X-100 50㎕를 각각의 표준 시료 희석액에 첨가한다.
6. 실온에서 15분간 배양한다.
7. 희석된 리보그린 100㎕를 모든 시료에 첨가한다. 희석된 리보그린은 희석도 1:100으로 사용된다.
8. 형광계(Victor2)에서 FITC 설정을 사용하여 플레이트를 판독한다.
산출:
웰 중의 최종 부피는 200㎕일 것이다.
리보그린은 최종 희석도 1:200일 것이다.
트리톤 X-100은 0.5%일 것이다.
표준물은 1㎍/㎖로부터 출발하는 희석액일 것이다.
표준 커브를 플로팅한다. 선형 적합을 수행한다.
포집율(%) = 100×(1-"유리" 신호/"총" 신호)를 측정한다.
[siRNA] 측정: 먼저 "총" 신호를 표준 곡선을 사용하여 농도로 전환시킨 후 희석 요율을 곱한다.
실시예 34: 리포솜 내에 배합된 지질 잔기들의 비교
지질이 siRNA 성분을 표적물에 전달하는 상대적 능력을 측정함으로써 지질 조성물의 유효성을 시험할 수 있다. 예를 들면, 표적물의 사일런스는 siRNA가 세포에 전달되었음을 나타낸다. 본 출원인은 인자 VII(FVII)를 사일런싱시키는 데 사용되는 siRNA와 함께 각각의 하기 지질 잔기들을 포함하는 리포솜 복합체들을 비교한다.
먼저 정제되지 않은 반응 혼합물을 사용한다. 상이한 ND:98 단량체 비율, 즉 ND:98=1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 및 6:1로 생성물을 합성하여 상이한 ND98 반응 혼합물들을 생성시킨다. ND98은 화학식
Figure 112009026592906-PCT00188
의 ND를 화학식
Figure 112009026592906-PCT00189
의 아민 98과 상기 비율(즉, ND:98=1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 및 6:1)로 반응시켜 생성시킨다.
리포솜은 ND98:콜레스테롤:FED2000-CerC16:siRNA=15:0.8:7:1(중량 비)로 배합된다. ND:98=1:1 및 2:1로 제조된 리포솜은 배합 중에 침전되고 추가로 특성화되지 않는다.
표 1은 각종 단량체 비율(즉, 숫자는 98에 대한 ND의 비율을 나타낸다)을 사용한 리포솜의 평균 입자 크기와 포집율을 보여준다.
Z-평균 입자 크기(㎚) 포집율(%)
ND98 3 56 > 95
ND98 4 56 > 95
ND98 5 81 93
ND98 6 72 74
도 1은 2㎍/㎏ siRNA의 실험적 용량을 사용한 각종 단량체 비율에 대한 FVII 사일런싱 분석의 결과를 보여준다. 상기 결과는 ND98 5 말단 잔기 및/또는 ND98 6 말단 잔기가 ND98 6:1 제제에 가장 풍부한 성분들이므로 이들이 활성 성분임을 제안한다. 5 말단 잔기는 출발 아민 98 위의 수소 중 5개가 출발 아크릴아미드 잔기 ND와 반응한 화합물을 가리킨다. 6 말단 잔기는 출발 아민 98 위의 수소 중 6개가 출발 아크릴아미드 잔기 ND와 반응한 화합물을 가리킨다. 따라서, "말단"의 수는 출발 아민 위의 반응된 수소의 수를 가리킨다.
실시예 35: 바람직한 지질 이성체의 측정
ND98 지질 생성물을 정제한다. ND98 지질 잔기는 화학식
Figure 112009026592906-PCT00190
의 ND를 화학식
Figure 112009026592906-PCT00191
의 아민 98과 반응시켜 생성된다.
ND98의 4-말단 혼합 이성체(즉, 아민 수소 중 4개가 상기 ND 아크릴아미드와 반응), 5-말단 ND98의 단일 구조 이성체(즉, 아민 수소 중 5개가 상기 ND 아크릴아미드와 반응)를 시험한다. 2종의 5 말단 이성체의 예로는
Figure 112009026592906-PCT00192
및
Figure 112009026592906-PCT00193
가 있다.
하기 성분들을 "ND98:콜레스테롤:PEG2000-CerC16:siRNA=15:5:7:1(중량 비)"의 비율로 사용하여 정제된 ND98 생성물의 리포솜을 배합한다.
표 2는 각종 단량체 비율(즉, 숫자는 98에 대한 ND의 비율을 나타낸다)을 사용한 리포솜의 평균 입자 크기와 포집율을 보여준다.
Z-평균 입자 크기(㎚) 포집율(%)
ND98 1 88 > 95
ND98 2 104 86
ND98 3 115 86
ND98 4 92 > 95
표 2 및 도 2의 목적상, ND98 1 = 5-말단(이성체 I); ND98 2 = 5-말단(이성체 I+II); ND98 3 = 5-말단(이성체 II); ND98 4 = 4-말단이다.
리포솜은 2.5㎎/㎏의 용량으로 siRNA와 함께 투여되고 FVII의 사일런스에 대해 평가된다. 도 2는 4 말단 이성체 혼합물, 단일 5 말단 이성체(즉, 이성체 I 및 II) 및 5 말단 이성체들의 혼합물(즉, 이성체 I 및 II)의 결과를 보여준다.
실시예 36: 바람직한 ND98 이성체의 측정
6-말단 ND98의 정제된 이성체를 제조하고 정제한다. ND98 구조는 실시예 34 및 35에 설명된 것들에 상응한다. 6 말단은 아민 98의 모든 수소가 ND 출발 재료와 반응하였음을 나타낸다. 상기 지질 출발 재료와 함께 리포솜을 하기 비율로 제조한다: ND98:콜레스테롤:PEG2000-CerC16:siRNA=15:5:7:1(중량 비). 도 3은 FVII를 효과적으로 사일런싱시키는 siRNA의 전달에서의 ND98 6 말단 이성체의 유효성을 입증한다.
실시예 37: 각종 ND98 지질 출발 재료를 사용한 리포솜 입자 크기
(실시예 34 및 35에 표시된 바와 같은) ND98 구조를 갖는 다수의 지질 출발 재료를 리포솜으로 배합한다. 리포솜의 입자 크기를 평가하고 그 결과를 표 3에 기재한다.
제제 입자 직경(㎚)
ND98 3 (실시예 1) 56
ND98 4 (실시예 1) 56
ND98 5 (실시예 1) 81
ND98 6 (실시예 1) 72
ND98 1 (실시예 2) 88
ND98 2 (실시예 2) 104
ND98 3 (실시예 2) 115
ND98 4 (실시예 2) 92
6-말단 ND98 (실시예 3) 127
실시예 38: 유리 리포솜 제제의 압출
ND98 지질을 사용하여 리포솜 복합체를 제조한다. 당해 제제는 ND98, 콜레스테롤, PEG2000-CerC16 및 siRNA를 "ND98:콜레스테롤:PEG2000-CerC16:siRNA= 15:5:7:1(중량 비)"의 비로 포함한다. 실시예 32에 일반적으로 설명된 바와 같이 리포솜을 압출 없이 제조한다. 2개의 시료를 제조하는데, 제1 시료는 100mM 아세테이트 중의 제1 투석 단계로 100mM 아세트산나트륨 중에 제조된 100mM siRNA을 갖고, 제2 시료는 300mM 아세테이트 중의 제1 투석 단계로 300mM 아세트산나트륨 중에 제조된 300mM siRNA을 갖는다.
도 4는 각종 방법을 사용하여 제조된 제제의 상대적 활성을 입증하는 FVII 사일런싱 분석의 결과를 보여준다.
실시예 39: 양이온성 지질 7의 위치선택적 합성 - 전략 1
반응식 31a
Figure 112009026592906-PCT00194
a양이온성 지질 7의 위치선택적 합성 - 방법 1
단계 1. 화합물 9의 제조: 무수 아세토니트릴(500㎖) 중의 트리에틸렌테트라민 1(48.83g, 0.334mol, 구입처: Sigma-Aldrich)을 일정하게 교반하면서 얼음조 위에서 냉각시킨다. 에틸 트리플루오로아세테이트(79.6㎖, 0.668mol)를 용액에 첨가하고 첨가를 마친 후 반응 혼합물을 실온으로 승온시키고 20시간 동안 교반한다. 용매 및 휘발 물질을 감압하에 제거하고 잔류물을 소량의 따뜻한 디클로로메탄(100㎖)에 용해시키고 여기에 차가운 헥산을 교반하면서 첨가한다. 침전된 생성물을 얼음 중에서 냉각시키고 여과하여 백색 고체를 수득한다(112.2g, 99%).
단계 2. (2-{3급-부톡시카보닐-[2-(2,2,2-트리플루오로-아세틸아미노)에틸]-아미노}-2-(2,2,2-트리플루오로-아세틸아미노)에틸]-카밤산 3급 부틸 에스테르 113의 합성
트리플루오로아세타미드 9(112.2g, 0.332mol)를 CH2Cl2/THF(600㎖/100㎖)에 용해시키고 여기에 디이소프로필에틸아민(129.25g, 1mol)을 첨가하고 얼음조 위에서 교반한다. CH2Cl2(100㎖) 중의 디-3급-부틸 디카보네이트(145g, 0.664mol, 구입처: Sigma Aldrich)를 반응 혼합물에 적가하고 밤새 교반한다. 용매를 제거하고 잔류물을 NaHCO3(400㎖) 포화 용액과 함께 교반하고 여과한 후 헥산(100㎖)으로 세척하고 45℃에서 진공 건조시켜 순수한 디boc 화합물을 백색 고체로서 수득한다(167g, 94%). 화합물 113에 대한 1H NMR (DMSO-d6, 400MHz) δ= 9.60-9.40(m, 2H), 3.35-3.15(m, 12H), 1.36(s, 18H) MS: C15H24F6N4O4 계산치: 438.17, 측정치: 439.20(M+) MS: C20H32F6N4O6 계산치: 538.22, 측정치: 539.20(M+).
단계 3. (2-아미노-에틸)-{2-((2-아미노-에틸)-3급- 부톡시카보닐-아미노]-에틸}카밤산 3급-부틸 에스테르의 합성
아세타미드 113(167g, 0.31mol)를 스테인레스강 압력 반응기에 넣고 여기에 에탄올(200㎖) 중의 메틸아민(33중량%)의 용액을 첨가한다. 혼합물을 90℃로 승온시키고 24시간 동안 교반한다. 반응을 질량 스펙트럼으로 모니터링한다. 모든 용매를 감압하에 제거하고 잔류물을 80℃에서 높은 진공으로 처리하여 생성물 114(103g, 96%)를 고무상 액체로서 수득한다. 상기 화합물은 추가의 정제 없이 후속 반응에 사용될 수 있다. 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 3.20-3.00(m, 4H), 2.62-2.38 (m, 8H), 1.32(s, 9H). MS: C11H26N4O2 계산치: 246.21, 측정치: 246.20(M+).
단계 4. 마이클 부가 생성물 115의 합성
디아민 114(103g, 0.297mmol), N-도데실아크릴아미드(356g, 1.487mol) 및 붕산 포화 수용액(30㎖)을 압력 반응기에 함께 넣고 4일간 90℃로 가열한다. 반응을 TLC 및 질량 스펙트럼으로 모니터링한다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(DCM)으로 추출하고 NaHCO3 용액과 염수로 순차적으로 세척한 후 무수 황산나트륨으로 건조시킨다. 용매를 진공 제거하고 이렇게 얻은 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(구배 용리- 에틸 아세테이트, 이어서 3-10% MeOH/DCM)로 정제하여 화합물 115를 담황색 고체로서 수득한다(228g, 59%). MS: C76H150N8O8 계산치: 1303.16, 측정치: 1304.20(M+).
단계 5. 디아민 116의 제조
디옥산 중의 4M HCl(500㎖)을 메탄올(100㎖) 중의 디boc 화합물 115(228g, 0.175mol)의 용액에 첨가하고 혼합물을 실온에서 2일간 교반한다. 반응을 질량 스펙트럼으로 모니터링한다. 출발 디boc 화합물이 완전히 소멸된 후, 침전된 하이드로클로라이드 염을 여과하고 THF(100㎖)로 세척한 후 건조시켜 순수한 염을 백색 분말로서 수득한다(178g, 93%). 상기 염을 NaHCO3 포화 용액(1ℓ)으로 처리하고 디클로로메탄(3×600㎖)으로 추출한다. 합한 유기 추출물을 건조시키고 농축하여 사량체를 백색 고체로서 단리한다(164g, 85%). MS: C66H134N8O4 계산치: 1103.05, 측정치: 1104.10(M+).
단계 6. 화합물 117의 합성
화합물 116(164g, 149mmol), N-도데실아크릴아미드(35.6g, 149mmol) 및 붕산 포화 수용액(30㎖)을 압력 반응기에 함께 넣고 3일간 90℃로 가열한다. 반응의 과정을 TLC 및 질량 스펙트럼으로 모니터링한다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(DCM)으로 추출하고, NaHCO3 용액과 염수로 순차적으로 세척한 후 무수 황산나트륨으로 건조시킨다. 용매를 진공 제거하고 이렇게 얻은 잔류물을 실리카겔(2㎏) 칼럼 크로마토그래피(구배 용리- 0:5:95-10:10:80% TEA/MeOH/DCM)로 정제하여 화합물 117을 담황색 고체로서 수득한다(83.8g, 42%). MS: C76H150N8O8 계산치: 1303.16, 측정치: 1304.20(M+). 재료를 기준 시료 TLC(정성), HPLC 및 질량 스펙트럼과 비교한다. MS: C81H163N9O5 계산치: 1342.28, 측정치: 1343.30(M+).
단계 7. 하이드로클로라이드 염 7의 합성
아민 117(54g, 40mmol)을 에탄올(100㎖)에 용해시키고 여기에 에테르 중의 2M HCl 200㎖를 첨가하고 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 반응 혼합물에 질소를 버블링하고 배출구를 드라이라이트(dryrite)를 통해 10% KOH 용액으로 통과시킨다. 30분 후 반응 혼합물을 농축 건조시키고 잔류물을 무수 에탄올 500㎖에 재용해시키고 혼합물을 회전 증발기에서 농축시킨다. 상기 과정을 한 번 더 반복하고 이렇게 얻은 잔류물을 43℃의 진공 오븐에서 밤새 건조시킨다. 순수한 생성물을 크림색 분말로서 단리한다(59.5g, 99%).
실시예 40: 양이온성 지질 7의 위치선택적 합성 - 전략 2
방법 1
Figure 112009026592906-PCT00195
단계 1: 겸용 교반기가 달린 5ℓ들이 4목 플라스크에서 아세토니트릴(2ℓ) 중의 트리에틸렌테트라민 1(200g, 1.37mol, 구입처: Sigma-Aldrich)을 일정하게 교반하면서 얼음조 위에서 냉각시킨다. 상기 교반 용액에 에틸 트리플루오로아세테이트(388.5g, 2.74mol)를 첨가하고 20시간 동안 교반한다. 용매 및 휘발 물질을 감압하에 제거하고 잔류물을 DCM/헥산의 혼합물로 연화시킨 후 여과하여 화합물 101을 백색 고체로서 수득한다(429g, 93%). 이렇게 얻은 생성물은 추가의 정제 없이 후속 반응에 사용될 수 있다. MS: C10H16F6N4O2 계산치: 338.12, 측정치: 339.0(M+).
단계 2: 조악한 화합물 101(427g, 1.26mol)을 용매 혼합물(3ℓ, THF/DCM(1:2))에 용해시키고 얼음-물 조 위에서 교반한다. 디-3급-부틸 디카보네이트((Boc)2O, 270g, 1.26mol, 구입처: Sigma-Aldrich) 및 DIEA(500㎖, 2.86mol)를 반응 혼합물에 첨가하고 밤새 교반한다. 용매를 제거하고 잔류물을 디클로로메탄(DCM, 1000㎖)으로 추출한 후 NaHCO3 용액(500㎖), 물(500㎖×2) 및 염수로 순차적으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨다. 용매를 진공 제거하고 이렇게 얻은 잔류물을 DCM/헥산(2:1)으로 연화시키고 여과한다. 용매를 제거하고 잔류물을 높은 진공하에 건조시켜 화합물 102를 고무상 액체로서 수득한다(523g).
화합물 102의 일부분을 실리카겔 크로마토그래피(구배 용리, 에틸 아세테이트, 이어서 3-10% MeOH/DCM)로 정제하여 화합물 102를 고무상 액체로서 수득한다(102.00g). 화합물 102에 대한 1H NMR (DMSO-d6, 400MHz) δ= 9.60-9.10(m, 3H), 3.35-3.25(m, 4H), 3.25-3.20(2, 2H), 3.20-3.10(m, 2H), 2.69-2.58(m, 4H), 1.35(s, 9H). MS: C15H24F6N4O4 계산치: 438.17, 측정치: 439.20(M+).
단계 3: 정제된 화합물 102(102.0g, 233.40mmol)를 압력 반응기 내에서 주위 온도에서 에탄올/메틸 아민(400㎖, EtOH 중의 33중량% 메틸아민 용액)에 용해시킨다. 혼합물을 90℃로 승온시키고 2일간 교반한다. 반응을 질량 스펙트럼으로 모니터링한다. 모든 용매를 감압하에 제거하고 잔류물을 80℃에서 높은 진공으로 처리하여 생성물 103(58.00g, 99%)을 고무상 액체로서 수득한다. 상기 화합물은 추가의 정제 없이 후속 반응에 사용될 수 있다. 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ=3.20-3,00(m, 4H), 2.62-2,38(m, 8H), 1.32(s, 9H). MS: C11H26N4O2 계산치: 246.21, 측정치: 247.20(M+).
단계 4: 트리아민 103(56.00g, 227.64mmol), N-도데실아크릴아미드(327.00g, 1365mmol) 및 붕산 포화 수용액(50㎖)을 압력 반응기에 함께 넣고 6일간 90℃로 가열한다. 반응을 TLC 및 질량 스펙트럼으로 모니터링한다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(DCM)으로 추출한 후 NaHCO3 용액(400㎖)으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨다. 용매를 진공 제거하고 이렇게 얻은 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(구배 용리- 에틸 아세테이트, 이어서 3-10% MeOH/DCM)로 정제하여 화합물 104를 담황색 고체로서 수득한다(186g, 57%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 7.20(bs, 1H), 7.05(bs, 1H), 6.85(bs, 1H), 6.74(bs, 1H), 3.25-3.03(m, 12H), 2.80-2.60 (m, 8H), 2.55-2.21(m, 12H) 1.52-1.45(m, 10H), 1.42(s, 9H), 1.34-1.20(m, 100H), 0.87(t, J=6.5Hz, 15H). MS: C86H171N9O7 계산치: 1442.33, 측정치: 1443.30(M+).
단계 5: 디옥산 중의 4M HCl(400㎖)을 디옥산(300㎖) 중의 화합물 105(184.00g, 127.23mmol)의 용액에 첨가한다. 이어서 반응 혼합물을 밤새 교반한다. 반응을 질량 스펙트럼으로 모니터링한다. 용액에 질소를 통과시켜 과량의 HCl을 제거한다. 용매를 진공 제거하고 잔류물을 에탄올(500㎖×3)로 3회 동시 증발시켜 담황색의 고무상 고체 7(186.00g, 98%)을 테트라하이드로클로라이드 염으로서 수득한다. 재료를 기준 시료 TLC(정성), HPLC 및 질량 스펙트럼과 비교한다. MS: C81H163N9O5 계산치: 1342.28, 측정치: 1343.30(M+).
방법 2
화합물 102를 방법 1, 단계 1 및 2에 설명된 바와 같이 제조한다. 방법 1의 단계 2로부터 수득한 조악한 생성물을 추가의 정제 없이 후속 반응에 사용한다.
단계 1: 화합물 102(103.45g, 238.90mmol, 방법 1, 단계 2로부터 수득한 조악한 화합물)를 압력 반응기에서 주위 온도에서 에탄올/메틸 아민(400㎖, EtOH 중의 33중량% 메틸아민 용액)에 용해시킨다. 혼합물을 90℃로 승온시키고 2일간 교반한다. 반응을 질량 스펙트럼으로 모니터링한다. 모든 용매를 감압하에 제거하고 잔류물을 수조 위에서 80℃에서 높은 진공으로 처리하여 생성물 103(63.50g)을 담황색의 고무상 액체로서 수득한다. 상기 화합물은 추가의 정제 없이 후속 반응에 사용될 수 있다.
단계 4: 트리아민 103(63.50g, 238mmol), N-도데실아크릴아미드(320.00g, 1338mmol) 및 붕산 포화 수용액(50㎖)을 방법 1, 단계 4에 설명된 바와 같이 압력 반응기에 함께 넣고 6일간 90℃로 가열한다. 반응을 TLC 및 질량 스펙트럼으로 모니터링한다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(DCM)으로 추출한 후 NaHCO3 용액(400㎖)으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨다. 용매를 진공 제거하고 이렇게 얻은 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(구배 용리- 에틸 아세테이트, 이어서 3-10% MeOH/DCM)로 정제하여 화합물 104를 담황색 고체로서 수득한다(65.2g, 20%).
단계 5: 에테르 중의 2M HCl(800㎖)을 화합물 105(65.00g, 45mmol)에 첨가한다. 이어서 반응 혼합물을 밤새 교반한다. 반응을 질량 스펙트럼으로 모니터링한다. 용액에 질소를 통과시켜 과량의 HCl을 제거한다. 용매를 진공 제거하고 잔류물을 에탄올(500㎖×3)로 3회 동시 증발시켜 담황색의 고무상 고체 7(66g, 98%)을 테트라하이드로클로라이드 염으로서 수득한다. 재료를 기준 시료 TLC(정성), HPLC 및 질량 스펙트럼과 비교한다. MS: C81H163N9O5 계산치: 1342.28, 측정치: 1343.30(M+).
방법 3
화합물 102를 방법 1, 단계 1 및 2에 설명된 바와 같이 제조한다. 방법 1의 단계 2로부터 수득한 조악한 생성물을 추가의 정제 없이 후속 반응에 사용한다.
단계 3: 화합물 102(105.20g, 240mmol, 방법 1로부터 수득한 조악한 화합물)를 압력 반응기에서 주위 온도에서 에탄올/메틸 아민(400㎖, EtOH 중의 33중량% 메틸아민)에 용해시킨다. 혼합물을 90℃로 승온시키고 2일간 교반한다. 반응을 질량 스펙트럼으로 모니터링한다. 모든 용매를 감압하에 제거하고 잔류물을 수조 위에서 80℃에서 높은 진공으로 처리하여 생성물 103(64.70g)을 담황색의 고무상 액체로서 수득한다. 상기 화합물은 추가의 정제 없이 후속 반응에 사용될 수 있다.
단계 4: 트리아민 103(64.70g, 240mmol), N-도데실아크릴아미드(370.00g, 1569mmol) 및 붕산 포화 수용액(50㎖)을 압력 반응기에 함께 넣고 6일간 90℃로 가열한다. 반응을 TLC 및 질량 스펙트럼으로 모니터링한다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(DCM)으로 추출한 후 NaHCO3 용액(400㎖)으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨다. 용매를 진공 제거하고 이렇게 얻은 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(구배 용리: 에틸 아세테이트, 이어서 3 내지 10% MeOH/DCM)로 정제하여 화합물 104를 담황색 고체로서 수득한다(192g).
단계 5: 화합물 104로부터 실시예 40의 방법 1, 단계 5에 설명된 바와 같이 목적 화합물 7(194g, 98%)을 테트라하이드로클로라이드 염으로서 수득한다. 재료를 기준 시료 TLC(정성), HPLC 및 질량 스펙트럼과 비교한다. MS: C81H163N9O5 계산치: 1342.28, 측정치: 1343.30(M+).
실시예 41: 상이한 PEG -지질 잔기를 갖는 각종 회합 복합체 내에 배합된 siRNA 의 활성 비교
지질이 siRNA 성분을 표적물에 전달하는 상대적 능력을 측정함으로써 지질 조성물의 유효성을 시험할 수 있다. 예를 들면, 표적물의 사일런스는 siRNA가 세포에 전달되었음을 나타낸다. 본 출원인은 인자 VII(FVII)를 사일런싱시키는 데 사용되는 siRNA와 함께 도 5에 표시된 13종의 상이한 PEG-지질 잔기 중의 하나를 포함하는 회합 복합체들을 비교한다.
PEG-지질 1 내지 13은 하기 방법을 사용하여 합성한다.
반응식 1a
Figure 112009026592906-PCT00196
a반응식 1: mPEG2000-1,2-디-O-알킬-sn3-카바모일글리세라이드
화합물 5의 제조: 1,2-디-O-테트라데실-sn-글리세라이드 1(30g, 61.80mmol) 및 N,N'-석신이미딜카보네이트(DSC, 23.76g, 1.5당량)를 디클로로메탄(DCM, 500㎖)에 넣고 얼음물 위에서 교반한다. 상기 교반 용액에 트리에틸아민(25.30㎖, 3당량)을 첨가한 후 반응 혼합물을 주위 온도에서 밤새 교반한다. 반응의 과정을 TLC로 모니터링한다. 반응 혼합물을 DCM(400㎖)으로 희석하고 유기층을 물(2×500㎖)과 NaHCO3 수용액(500㎖)으로 세척한 후 표준 마무리 처리한다. 얻어진 잔류물을 주위 온도에서 높은 진공하에 밤새 건조시킨다. 건조 후 이렇게 얻은 조악한 카보네이트 3을 디클로로메탄(500㎖)에 용해시키고 얼음조 위에서 교반한다. 상기 교반 용액에 mPEG20O0-NH2(4, 103.00g, 47.20mmol, 구입처: NOF Corporation, Japan) 및 무수 피리딘(80㎖, 과량)을 아르곤하에 첨가한다. 이어서 반응 혼합물을 주위 온도에서 밤새 교반한다. 용매 및 휘발 물질을 진공 제거하고 잔류물을 DCM(200㎖)에 용해시키고 에틸 아세테이트로 채워진 실리카겔 칼럼에 충전시킨다. 칼럼을 먼저 에틸 아세테이트로 용리한 후 디클로로메탄 중의 5-10% 메탄올의 구배로 용리하여 목적하는 PEG-지질 5를 백색 고체로서 수득한다(105.30g, 83%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 5.20-5.12(m, 1H), 4.18-4.01(m, 2H), 3.80-3.70(m, 2H), 3.70-3.20(m, -O-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 2.10-2.01(m, 2H), 1.70-1.60(m, 2H), 1.56-1.45(m, 4H), 1.31-1.15(m, 48H), 0.84(t, J=6.5Hz, 6H). MS 범위 측정치: 2660-2836.
화합물 4b의 제조: 1,2-디-O-헥사데실-sn-글리세라이드 1b(1.00g, 1.848mmol) 및 DSC(0.710g, 1.5당량)를 디클로로메탄(20㎖)에 함께 넣고 얼음물 중에서 0℃ 미만으로 냉각시킨다. 여기에 트리에틸아민(1.00㎖, 3당량)을 첨가하고 밤새 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링하고 DCM으로 희석하고 물(2회)과 NaHCO3 용액으로 세척한 후 황산나트륨으로 건조시킨다. 용매를 감압하에 제거하고 잔류물 2b를 높은 진공으로 밤새 처리한다. 상기 화합물은 추가의 정제 없이 후속 반응에 직접 사용된다. MPEG2000-NH2 3(1.50g, 0.687mmol, 구입처: NOF Corporation, Japan) 및 상기 단계 2b에서 얻은 화합물(0.702g, 1.5당량)을 아르곤하에 디클로로메탄(20㎖)에 용해시킨다. 반응물을 0℃로 냉각시킨다. 여기에 피리딘(1㎖, 과량)을 첨가하고 밤새 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링한다. 용매 및 휘발 물질을 진공 제거하고 잔류물을 크로마토그래피(먼저 에틸 에틸아세테이트, 이어서 5-10% MeOH/DCM로 구배 용리)로 정제하여 필요한 화합물 4b를 백색 고체로서 수득한다(1.46g, 76%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 5.17(t, J=5.5Hz, 1H), 4.13(dd, J=4.00Hz, 11.00Hz, 1H), 4.05(dd, J=5.00Hz, 11.00Hz, 1H), 3.82-3.75(m, 2H), 3.70-3.20(m, -O-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 2.05-1.90(m, 2H), 1.80-1.70(m, 2H), 1.61-1.45(m, 6H), 1.35-1.17(m, 56H), 0.85(t, J=6.5Hz, 6H). MS 범위 측정치: 2716-2892.
화합물 4c의 제조: 1,2-디-O-옥타데실-sn-글리세라이드 1c(4.00g, 6.70mmol) 및 DSC(2.58g, 1.5당량)를 디클로로메탄(60㎖)에 함께 넣고 얼음물 중에서 0℃ 미만으로 냉각시킨다. 여기서 트리에틸아민(2.75㎖, 3당량)을 첨가하고 밤새 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링하고 DCM으로 희석한 후 물(2회)과 NaHCO3 용액으로 세척하고 황산나트륨으로 건조시킨다. 용매를 감압하에 제거하고 잔류물을 높은 진공하에 밤새 처리한다. 상기 화합물은 추가의 정제 없이 후속 반응에 직접 사용된다. MPEG2000-NH2 3(1.50g, 0.687mmol, 구입처: NOF Corporation, Japan) 및 상기 단계 2c로부터 수득한 화합물(0.760g, 1.5당량)을 아르곤하에서 디클로로메탄(20㎖)에 용해시킨다. 반응물을 0℃로 냉각시킨다. 여기에 피리딘(1㎖, 과량)을 첨가하고 밤새 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링한다. 용매 및 휘발 물질을 진공 제거하고 잔류물을 크로마토그래피(먼저 에틸 에틸아세테이트, 이어서 5-10% MeOH/DCM로 구배 용리)로 정제하여 필요한 화합물 4c를 백색 고체로서 수득한다(0.92g, 48%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 5.22-5.15(m, 1H), 4.16(dd, J=4.00Hz, 11.00Hz, 1H), 4.06(dd, J=5.00Hz, 11.00Hz, 1H), 3.81-3.75(m, 2H), 3.70-3.20(m, -O-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 1.80-1.70(m, 2H), 1.60-1.48(m, 4H), 1.31-1.15(m, 64H), 0.85(t, J=6.5Hz, 6H). MS 범위 측정치: 2774-2948.
반응식 2a
Figure 112009026592906-PCT00197
a반응식 2: mPEG2000-1,2-디-O-알킬-sn3-석시닐글리세라이드
화합물 6a의 제조: 1,2-디-O-테트라데실-sn-글리세라이드 1a(1.00g, 2.06mmol), 석신산 무수물(0.416g, 2당량) 및 DMAP(0.628g, 2.5당량)를 디클로로메탄(20㎖)에 함께 넣고 밤새 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링하고 DCM로 희석하고 차가운 묽은 시트르산과 물로 세척한 후 황산나트륨으로 건조시킨다. 용매를 감압하에 제거하고 잔류물을 높은 진공으로 밤새 처리한다. 상기 화합물은 추가의 정제 없이 후속 반응에 직접 사용된다. MPEG2000-NH2 3(1.50g, 0.687mmol, 구입처: NOF Corporation, Japan), 상기 단계 5a로부터 수득한 화합물(0.66g, 1.12당량) 및 HBTU(0.430g, 1.13mmol)를 아르곤하에서 디클로로메탄/DMF 혼합물(2:1, 20㎖)에 용해시킨다. 여기에 DIEA(0.358㎖, 3당량)를 첨가하고 밤새 교반한다. 반응 혼합물을 큰 플라스크로 옮기고 용매와 휘발 물질을 감압하에 제거한다. 잔류물을 높은 진공하에 밤새 건조시키고 크로마토그래피(먼저 에틸 에틸아세테이트, 이어서 5-10% MeOH/DCM로 구배 용리)로 정제하여 필요한 화합물 6a를 백색 고체로서 수득한다(0.822g, 43%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 6.34-6.30(m, 1H), 4.16(dd, J=4.00Hz, 11.00Hz, 1H), 4.08(dd, J=5.00Hz, 11.00Hz, 1H), 3.82-3.78(m, 2H), 3.70-3.30(m, -O-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 2.64(t, J=7.00Hz, 2H), 2.43(t, J=6.80Hz, 2H), 1.76-1.72(m, 2H), 1.56-1.48(m, 4H), 1.34-1.16(m, 48H), 0.85(t, J=6.5Hz, 6H). MS 범위 측정치: 2644-2804.
화합물 6b의 제조: 1,2-디-O-헥사데실-sn-글리세라이드 1b(1.00g, 1.848mmol), 석신산 무수물(0.0.369g, 2당량) 및 DMAP(0.563g, 2.5당량)를 디클로로메탄(20㎖)에 함께 넣고 밤새 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링하고 DCM으로 희석한 후 차가운 묽은 시트르산과 물로 세척하고 황산나트륨으로 건조시킨다. 용매를 감압하에 제거하고 잔류물을 높은 진공하에 밤새 처리한다. 상기 화합물은 추가의 정제 없이 후속 반응에 직접 사용한다. MPEG2000-NH2 3(1.50g, 0.687mmol, 구입처: NOF Corporation, Japan), 상기 단계 5b로부터 수득한 화합물(0.66g, 1.03mmol) 및 HBTU(0.400g, 1.05mmol)를 아르곤하에 디클로로메탄/DMF 혼합물(2:1, 20㎖)에 용해시킨다. 여기에 DIEA(0.358㎖, 3당량)를 첨가하고 밤새 교반한다. 반응 혼합물을 큰 플라스크로 옮기고 용매와 휘발 물질을 감압하에 제거한다. 잔류물을 높은 진공하에 밤새 건조시키고 크로마토그래피(먼저 에틸 에틸아세테이트, 이어서 5-10% MeOH/DCM로 구배 용리)로 정제하여 필요한 화합물 6b를 백색 고체로서 수득한다(0.300g, 16%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 6.33-6.28(m, 1H), 4.18(dd, J=4.00Hz, 11.00Hz, 1H), 4.08(dd, J=5.00Hz, 11.00Hz, 1H), 3.82-3.76(m, 2H), 3.70-3.30(m, -O-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 2.65(t, J=7.08Hz, 2H), 2.44(t, J=6.83Hz, 2H), 1.76-1.68(m, 2H), 1.57-1.48(m, 4H), 1.32-1.17(m, 56H), 0.86(t, J=6.6Hz, 6H). MS 범위 측정치: 2640-2822.
화합물 6c의 제조: 1,2-디-O-옥타데실-sn-글리세라이드 1c(5.00g, 8.37mmol), 석신산 무수물(1.70g, 2당량) 및 DMAP(2.55g, 2.5당량)를 디클로로메탄(50㎖)에 함께 넣고 밤새 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링하고 DCM으로 희석한 후 차가운 묽은 시트르산과 물로 세척하고 황산나트륨으로 건조시킨다. 용매를 감압하에 제거하고 잔류물을 높은 진공하에 밤새 처리한다. 상기 화합물은 추가의 정제 없이 후속 반응에 직접 사용한다. MPEG2000-NH2 3(1.50g, 0.687mmol, 구입처: NOF Corporation, Japan), 상기 단계 5c로부터 수득한 화합물(0.718g, 1.03mmol) 및 HBTU(0.410g, 1.08mmol)를 아르곤하에 디클로로메탄/DMF 혼합물(2:1, 20㎖)에 용해시킨다. 여기에 DIEA(0.350㎖, 3당량)를 첨가하고 밤새 교반한다. 반응 혼합물을 큰 플라스크로 옮기고 용매와 휘발 물질을 감압하에 제거한다. 잔류물을 높은 진공하에 밤새 건조시키고 크로마토그래피(먼저 에틸 에틸아세테이트, 이어서 5-10% MeOH/DCM로 구배 용리)로 정제하여 필요한 화합물 6c를 백색 고체로서 수득한다(1.1g, 56%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 6.38-6.33(m, 1H), 4.19(dd, J=4.00Hz, 11.00Hz, 1H), 4.07(dd, J=5.00Hz, 11.00Hz, 1H), 3.81-3.74(m, 2H), 3.70-3.20(m, -O-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 2.63(t, J=7.03Hz, 2H), 2.43(t, J=6.87Hz, 2H), 1.76-1.68(m, 2H), 1.57-1.48(m, 4H), 1.32-1.17(m, 64H), 0.86(t, J=6.60Hz, 6H). MS 범위 측정치: 2680-2922.
반응식 3a
Figure 112009026592906-PCT00198
a반응식 3: mPEG2000-1,2-디-O-알킬-sn3-석시닐글리세라이드
화합물 8a의 제조: 1,2-디-O-테트라데실-sn-글리세라이드 1a(0.300g, 0.618mmol), MPEG-석시네이트 7(1.00g, 0.476mmol, 구입처: NOF Corporation, Japan), DCC(0.127g, 1.3당량) 및 DMAP(0.058g, 0.476mmol)를 아르곤하에 디클로로메탄(20㎖)에 넣고 밤새 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링한다. 밤새 교반한 후 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 침전된 고체를 여과한다. 휘발 물질 및 용매를 감압하에 제거하고 생성된 잔류물을 크로마토그래피(먼저 EtOAc, 이어서 5-10% DCM/MeOH로 구배 용리)로 정제하여 화합물 8a를 백색 고체로서 수득한다(0.590g, 48%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 4.25-4.18(m, 2H), 4.08(dd, J=5.60Hz, 11.50Hz, 1H), 3.80-3.73(m, 2H), 3.70-3.30(m, -O-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 1.56-1.47(m, 4H), 1.30-1.15(m, 48H), 0.85(t, J=6.60Hz, 6H). MS 범위 측정치: 2440-2708.
화합물 8b의 제조: 1,2-디-O-헥사데실-sn-글리세라이드 1b(0.334g, 0.618mmol), MPEG-석시네이트 7(1.00g, 0.476mmol, 구입처: NOF Corporation, Japan), DCC(0.127g, 1.3당량) 및 DMAP(0.058g, 0.476mmol)를 아르곤하에 디클로로메탄(20㎖)에 넣고 밤새 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링한다. 밤새 교반한 후 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 침전된 고체를 여과한다. 휘발 물질 및 용매를 감압하에 제거하고 생성된 잔류물을 크로마토그래피(먼저 EtOAc, 이어서 5-10% DCM/MeOH로 구배 용리)로 정제하여 화합물 8b를 백색 고체로서 수득한다(0.930g, 74%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 4.25-4.17(m, 2H), 4.09(dd, J=5.50Hz, 11.50Hz, 1H), 3.81-3.73(m, 2H), 3.70-3.30(m, -O-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 1.58-1.47(m, 4H), 1.30-1.17(m, 56H), 0.86(t, J=6.60Hz, 6H). MS 범위 측정치: 2452-2760.
화합물 8c의 제조: 1,2-디-O-옥타데실-sn-글리세라이드 1c(0.369g, 0.618mmol), MPEG-석시네이트 7(1.00g, 0.476mmol, 구입처: NOF Corporation, Japan), DCC(0.127g, 1.3당량) 및 DMAP(0.058g, 0.476mmol)를 아르곤하에 디클로로메탄(20㎖)에 넣고 밤새 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링한다. 밤새 교반한 후 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 침전된 고체를 여과한다. 휘발 물질 및 용매를 감압하에 제거하고 생성된 잔류물을 크로마토그래피(먼저 EtOAc, 이어서 5-10% DCM/MeOH로 구배 용리)로 정제하여 화합물 8c를 백색 고체로서 수득한다(0.960g, 75%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 4.27-4.20(m, 2H), 4.10(dd, J=5.80Hz, 11.50Hz, 1H), 3.83-3.74(m, 2H), 3.70-3.35(m, -O-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 1.54-1.46(m, 4H), 1.30-1.17(m, 64H), 0.86(t, J=6.60Hz, 6H). MS 범위 측정치: 2508-2816.
반응식 4a
Figure 112009026592906-PCT00199
a반응식 4: mPEG2000-1,2-디-O-알킬-sn3-석시닐글리세라이드
화합물 10a의 제조: 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤 9a(0.317g, 0.618mmol), MPEG-석시네이트 7(1.00g, 0.476mmol, 구입처: NOF Corporation, Japan), DCC(0.127g, 1.3당량) 및 DMAP(0.058g, 0.476mmol)를 아르곤하에 디클로로메탄(20㎖)에 넣고 밤새 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링한다. 밤새 교반한 후 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 침전된 고체를 여과한다. 휘발 물질 및 용매를 감압하에 제거하고 생성된 잔류물을 크로마토그래피(먼저 EtOAc, 이어서 5-10% DCM/MeOH로 구배 용리)로 정제하여 화합물 10a를 백색 고체로서 수득한다(0.960g, 78%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 5.26-5.20(m, 1H), 4.30-4.08(m, 6H), 3.81-3.73(m, 2H), 3.70-3.40(m, -O-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 2.65-2.60(m, 4H), 2.35-2.28(m, 4H), 1.63-1.52(m, 4H), 1.30-1.15(m, 44H), 0.86(t, J=6.60Hz, 6H). MS 범위 측정치: 2468-2732.
화합물 10b의 제조: 1,2-디팔미토일-sn-글리세롤 9b(0.352g, 0.618mmol), MPEG-석시네이트 7(1.00g, 0.476mmol, 구입처: NOF Corporation, Japan), DCC(0.127g, 1.3당량) 및 DMAP(0.058g, 0.476mmol)를 아르곤하에 디클로로메탄(20㎖)에 넣고 밤새 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링한다. 밤새 교반한 후 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 침전된 고체를 여과한다. 휘발 물질 및 용매를 감압하에 제거하고 생성된 잔류물을 크로마토그래피(먼저 EtOAc, 이어서 5-10% DCM/MeOH로 구배 용리)로 정제하여 화합물 10b를 백색 고체로서 수득한다(1.02g, 81%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 5.26-5.19(m, 1H), 4.30-4.05(m, 6H), 3.80-3.40(m, -O-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 2.65-2.60(m, 4H), 2.33-2.24(m, 4H), 1.63-1.50(m, 4H), 1.30-1.15(m, 52H), 0.85(t, J=6.60Hz, 6H). MS 범위 측정치: 2524-2792.
화합물 10c의 제조: 1,2-디스테아로일-sn-글리세롤 9c(0.387g, 0.618mmol), MPEG-석시네이트 7(1.00g, 0.476mmol, 구입처: NOF Corporation, Japan), DCC(0.127g, 1.3당량) 및 DMAP(0.058g, 0.476mmol)를 아르곤하에 디클로로메탄(20㎖)에 넣고 밤새 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링한다. 밤새 교반한 후 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 침전된 고체를 여과한다. 휘발 물질 및 용매를 감압하에 제거하고 생성된 잔류물을 크로마토그래피(먼저 EtOAc, 이어서 5-10% DCM/MeOH로 구배 용리)로 정제하여 화합물 10c를 백색 고체로서 수득한다(1.04g, 80%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 5.26-5.19(m, 1H), 4.30-4.05(m, 6H), 3.80-3.40(m, -O-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 2.66-2.59(m, 4H), 2.31-2.26(m, 4H), 1.63-1.52(m, 4H), 1.30-1.15(m, 52H), 0.85(t, J=6.60Hz, 6H). MS 범위 측정치: 2540-2844.
반응식 5a
Figure 112009026592906-PCT00200
a반응식 5: 콜레스테릴-mPEG2000
화합물 13의 제조: mPEG2000-OH 11(6.00g, 3mmol, 구입처: Sigma-Aldrich), 콜레스테롤 헤미석시네이트 12(1.50g, 3.08mmolmmol) 및 HBTU(1.23g, 3.23mmol)를 아르곤하에 디클로로메탄/DMF 혼합물(2:1, 100㎖)에 용해시킨다. 여기에 DIEA(1.60㎖, 3당량)를 첨가하고 밤새 교반한다. 용매 및 휘발 물질을 감압하에 제거한다. 잔류물을 높은 진공하에 밤새 건조시키고 크로마토그래피(먼저 에틸 아세테이트, 이어서 5-10% MeOH/DCM로 구배 용리)로 정제하여 필요한 화합물 13을 백색 고체로서 수득한다(5.05g, 68%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 5.35-5.25(m, 1H), 4.60-4.50(m, 1H), 4.22-4.18(m, 2H), 3.80-3.76(m, 2H), 3.72-3.40(m, -O-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 2.64-2.56(m, 4H), 2.31-2.20(m, 3H), 2.01-0.8(m, 44H). MS 범위 측정치: 2390-2654.
실시예 42: 표적화된 PEG -지질
Figure 112009026592906-PCT00201
화합물 19의 제조:
단계 1: 화합물 14(2.00g, 1.01mmol) 및 콜레스테롤 클로로포르메이트 15(0.453g, 1.01mmol)를 디클로로메탄(20㎖)에 함께 넣는다. 상기 혼합물을 얼음물 조에서 냉각시킨다. 트리에틸아민(0.448㎖)을 첨가하고 반응 혼합물을 밤새 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링한다. 용매를 제거하고 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(에틸 아세테이트, 이어서 5-10% MeOH/DCM)로 정제하여 목적 화합물 16을 수득한다(1.10g, 45.40%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 5.35(m, 1H), 5.15(m, 1H), 3.40-3.85(m, O-CH2-CH2-O), 3.10-3.25(m, 10H), 0.80-2.38(m, 44H, 콜레스테롤). MS 범위 측정치: 2220-2490.
단계 2: 화합물 16(1.00g, 0.417mmol), 17(0.235g, 0.542mmol) 및 HBTU(0.190g, 0.5mmol)를 DCM/DMF 혼합물(20㎖, 2:1)에 넣는다. 여기에 DIEA를 첨가하고 밤새 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링하고 용매를 감압하에 제거하고 잔류물을 크로마토그래피(5-10% MeOH/DCM)로 정제하여 목적 화합물 18(1.02g, 87%)을 수득한다. 1H NMR (DMSO-d6, 400MHz) δ= 7.52(d, J=8.06Hz, 1H), 7.33(t, J=7.02Hz, 1H), 7.25(t, J=7.32Hz, 1H), 5.27(m, 1H), 5.18(d, J=3.2Hz, 1H), 4.92(dd, J=3.17, 11.23Hz, 1H), 4.43(m, 1H), 3.60-4.02(m, 5H), 3.20-3.55(m, O-CH2-CH2-O), 2.90-3.10(m, 10H), 2.05(s, 3H), 1.96(s, 3H), 1.84(s, 3H), 1.77(s, 3H), 0.80-2.38(m, 44H, 콜레스테롤). MS 범위 측정치: 2680-2990.
단계 3: 화합물 18(1.02g, 0.362mmol)을 MeOH/DCM 혼합물(10㎖)에 용해시키고 여기에 메탄올(과량) 중의 0.5M NaOMe 용액을 첨가하고 밤새 교반한다. 반응의 과정을 TLC로 모니터링한다. 혼합물을 AcOH로 중화시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 잔류물을 크로마토그래피(5-10% MeOH/DCM)하여 화합물 19를 수득한다(280㎎, 30%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 5.38(m, 1H), 4.02-4.06(m, 7H), 3.30-3.80(m, O-CH2-CH2-O), 3.20-3.29(m, 8H), 2.08(s, 3H), 0.80-2.38(m, 44H, 콜레스테롤). MS 범위 측정치: 2600-2900.
실시예 43: 표적화된 PEG -지질
Figure 112009026592906-PCT00202
화합물 23의 제조:
단계 1: 화합물 14(2.00g, 1.01mmol) 및 화합물 20(0.453g, 1.01mmol)을 디클로로메탄(20㎖)에 함께 넣는다. 혼합물을 얼음물 조에서 냉각시킨다. 피리딘(1㎖, 과량)을 첨가하고 반응 혼합물을 밤새 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링한다. 용매를 제거하고 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(에틸 아세테이트, 이어서 5-10% MeOH/DCM)로 정제하여 목적 화합물 21을 수득한다(400㎎, 15%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 5.20(m, 1H), 4.05-4.20(m, 2H), 3.20-3.80(m, O-CH2-CH2-O), 1.70-1.82(m, 4H), 1.50-1.61(m, 2H), 1.18-1.38(m, 60H), 0.87(t, J=6.30Hz, 6H). MS 범위 측정치: 2400-2750.
단계 2: 화합물 21(0.415g, 0.159mmol), 17(0.100g, 1.3당량) 및 HBTU(0.90g, 1.15당량)를 DCM/DMF 혼합물(20㎖, 2:1)에 넣는다. 여기에 DIEA(0.2㎖)를 첨가하고 밤새 교반한다. 반응을 TLC로 모니터링하고 용매를 감압하에 제거하고 잔류물을 크로마토그래피(3-10% MeOH/DCM)로 정제하여 목적 화합물 22를 수득한다(0.450g, 94%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 6.21(d, J=8.70Hz, 1H), 5.33(d, J=2.70Hz, 1H), 5.15-5.20(m, 2H), 4.55(d, J=8.15Hz, 1H), 4.01-4.20(m, 4H), 3.20-3.90(m, O-CH2-CH2-O), 2.14(s, 3H), 2.03(s, 3H), 1.99(S, 3H), 1.93(s, 3H), 1.70-1.82(m, 4H), 1.50-1.61(m, 4H), 1.17-1.38(m, 60H), 0.86(t, J=6.32Hz, 6H). MS 범위 측정치: 2800-3200.
단계 3: 화합물 22(0.450g, 0.359mmol)를 MeOH/DCM 혼합물(5㎖)에 용해시키고 여기에 메탄올(과량) 중의 0.5M NaOMe 용액을 첨가하고 밤새 교반한다. 반응의 과정을 TLC로 모니터링한다. 혼합물을 AcOH로 중화시킨다. 용매를 진공하에 제거하고 잔류물을 크로마토그래피(5-10% MeOH/DCM)로 정제하여 화합물 23을 수득한다(365㎎, 85%). 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ= 5.18(m, 1H), 4.05-4.20(m, 4H), 3.20-3.90(m, O-CH2-CH2-O), 2.05(s, 3H), 1.71-1.80(m, 4H), 1.50-1.61(m, 4H), 1.17-1.38(m, 60H), 0.87(t, J=6.32Hz, 6H). MS 범위 측정치: 2760-3000.
도 6에 표시된 바와 같이, 제제들은 환자에 투여될 때 각종 FVII 사일런스 정도를 제공한다. 예를 들면, 제제 3은 제제 5, 6 및 12와 같이 비교적 높은 FVII 사일런스도를 제공한다.
실시예 44: 마우스에 투여시의 제제 LNP01 의 내성
조성물 ND98:콜레스테롤:PEG-C14=42:48:10(몰비)를 갖는 빈 리포솜을 실시예 45에 설명된 바와 같이 제조한다. 그런 다음 상이한 양의 siRNA를 미리 제조되고 압출된 빈 리포솜에 첨가하여 초기 총 부형제:siRNA 비율이 30:1, 20:1, 15:1, 10:1, 및 5:1(중량:중량)인 제제를 수득한다. 총 부형제:siRNA 비율이 5:1인 제제를 제조하면 제제 중의 siRNA가 과량이 되어 지질 부하 용량을 포화시킨다. 이어서 과량의 siRNA를 5 부피의 PBS에 대해 100,000 MWCO 막을 사용하여 접선 유동 여과에 의해 제거한다. 그런 다음 생성된 제제를 C57BL/6 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 10㎎/㎏ siRNA 용량으로 투여한다. 제제 투여 후 24시간 및 48시간에 동물의 체중 증가를 평가함으로써 제제의 내성을 분석하고, 그 결과를 도 7에 제공한다.
실시예 45: 먼저 비부하 복합체를 형성시킨 후, 비부하 복합체를 siRNA 로 처리하고, 2종의 치료제를 포함하는 회합 복합체를 투여함
2종의 상이한 핵산 잔기를 갖는 회합 복합체를 다음과 같이 제조한다. 에탄올 중의 ND98, 콜레스테롤 및 PEG-C의 저장 용액을, 각각 133㎎/㎖, 25㎎/㎖ 및 100㎎/㎖의 ND98, 콜레스테롤 및 PEG-C14의 농도로 제조한다. 이어서 상기 지질 저장 용액을 혼합하여 ND98:콜레스테롤:PEG-C14를 몰 비 42:48:10로 수득한다. 그런 다음 상기 혼합물을 수성 완충액에 첨가하여 35% 에탄올, 100mM 아세트산나트륨(pH 5) 중의 지질 나노입자의 자발적 형성을 일으킨다. 이어서 비부하 지질 나노입자를 압출기(Lipex, Northern Lipids)를 사용하여 0.08㎛ 막(Whatman, Nucleopore)을 통해 2회 통과시켜 크기가 20 내지 100㎚인 단일형태의 소포체를 수득한다. 적합한 양의 35% 에탄올 중의 siRNA를 미리 크기분류된 비부하 소포체에 7.5:1(중량:중량)의 총 부형제:siRNA 비율로 첨가한다. 이어서 얻어진 혼합물을 37℃에서 30분간 항온처리하여 siRNA가 지질 나노입자에 부하되게 +와 치료제의 첨가 순서를 보여주는 흐름도를 도 8에 제공한다.
ApoB와 인자 VII을 표적화하는 siRNA의 1:1 혼합물을 실시예 44에 설명된 바와 같이 제조한다. 별도로, 동일한 ApoB- 및 인자 VII-표적화 siRNA를 실시예 31에 설명된 바와 같이 따로 따로 제조한다. 그런 다음 3개의 제제를 각종 용량으로 동물의 체중 1g당 10㎕의 주사 부피로 투여한다. 투여 후 48시간째에 안와후 출혈에 의해 혈청 시료를 모으고 동물을 치사시키고 간을 적출한다. 혈청 인자 VII 농도를 발색 진단 키트(Coaset Factor VII Assay Kit, DiaPharma)를 사용하여 제조자 프로토콜에 따라서 측정한다. ApoB 및 인자 VII의 간 mRNA 농도를 분지된-DNA(bDNA) 분석(Quantigene, Panomics)을 사용하여 측정하고, 그 결과를 표 9에 제공한다. 두 치료제 사이의 억제에 대한 증거는 관찰되지 않는다. 오히려 두 치료제가 모두 투여될 때 유효성이 입증된다.
실시예 46: 미리 제조된 소포체를 사용한 회합 복합체의 제조 방법
지질 저장 용액의 제조
리피도이드(lipidoid) ND98·4HCl(MW 1487), 콜레스테롤, 및 PEG-C14의 저장 용액을 에탄올 중에서 각각 133㎎/㎖, 25㎎/㎖, 및 100㎎/㎖의 ND98, 콜레스테롤, 및 PEG-C14의 농도로 제조한다. 저장 용액을 50℃로 승온시켜 지질이 용액 중에 혼입되는 것을 돕는다.
빈 소포체의 제조
이어서 지질 저장 용액을 아래에 열거된 부피로 혼합하여 ND98:콜레스테롤:PEG-C14 몰비 42:48:10을 수득한다. 하기 표에 열거된 부피로 수성 혼합물도 제조한다.
부피: 지질 혼합물(㎖)
ND98 콜레스테롤 PEG 합계
56.250 90.000 31.500 177.750
수성 혼합물(㎖)
물 3M NaOAc 에탄올 합계
378.000 27.000 40.327 445.327
이어서 에탄올성 지질 혼합물을 자석 교반 플레이트 위에서 신속하게 교반하면서 수성 혼합물에 첨가한다. 혼합시 리피도이드 소포체가 자발적으로 형성된다. 그런 다음 생성된 소포체를 0.08㎛ 막(Whatman, Nucleopore)을 통해 압출시켜(2회 통과) 빈 소포체를 크기분류한다. 모든 처리는 실온에서 수행한다.
빈 소포체를 siRNA 로 부하
탈염된 듀플렉스(duplex)를 siRNA를 50mM 아세트산나트륨(pH 5)에 10㎎/㎖의 농도로 용해시켜 siRNA 저장 용액을 제조한다. 적합한 부피의 상기 siRNA 저장 용액을 적합한 부피의 에탄올과 혼합하여 35%(부피) 에탄올 중의 희석된 siRNA 용액을 수득한다(하기 표 참조).
siRNA 희석액
siRNA 저장 용액 (㎎/㎖) siRNA (50nM NaOAc) 에탄올 합계
10 180.000 96.923 276.923
희석된 siRNA 용액 277㎖를 자석 교반 플레이트 위에서 신속하게 교반하면서 빈 소포체 혼합물 623㎖에 첨가한다. 이어서 얻어진 배합 혼합물을 37℃에서 30분간 항온처리하여 siRNA가 부하되게 한다.
한외여과 및 최종의 0.2μ 여과
항온처리 후, 부하된 나노입자 혼합물 900㎖를 PBS 1.8ℓ에 희석시켜 2.7ℓ의 희석된 혼합물을 수득한다. 그런 다음 상기 희석된 혼합물을 약 1ℓ로 농축시키고 2개의 스택 100,000 MWCO 카트리지를 이용한 사토리우스(Sartorius) TFF 장치를 사용하여 10 부피의 PBS에 대해 접선 유동 여과함으로써 정용 여과한다. 카트리지에 후방 압력을 인가하지 않고, 펌프 속도는 300rpm으로 설정한다. 완충액 교환 후 생성된 용액을 대략 2㎎/㎖ siRNA로 농축시킨다.
용액을 0.2μ 필터 캡슐(Whatman, Polycap 36 AS)에 통과시켜 최종 여과를 수행한다.
이 과정을 보여주는 흐름도를 도 10에 도시한다.
실시예 47: 효능에 대한 입자 크기의 비교
실시예 46에 일반적으로 설명된 방법을 사용하여 회합 복합체를 제조한다. 그러나, 복합체를 크기를 기준으로 평가하고자 하므로 상이한 압출막을 사용하여 150㎚, 85㎚, 60㎚ 및 50㎚의 크기를 갖는 입자를 생성시킨다. 복합체에 부하된 siRNA는 인자 VII을 표적화한다.
입자를 인자 VII 사일런싱 분석으로 평가한다. 50㎚ 입자가 150㎚, 85㎚ 및 60㎚ 입자에 비해 가장 효과적임이 입증된다. 분석 결과를 도 11에 도시한다.
실시예 48: 회합 복합체에 배합 및 배합되지 않은 핵산 잔기의 반감기의 비교
회합 복합체에 배합된 siRNA의 반감기를 37℃의 사람 혈청에서 시험관내 평가한다. 회합 복합체는 실시예 46에 따라 제조한다. 비교를 위해서, 배합되지 않은 siRNA도 사람 혈청에서 시험관내 평가한다. HPLC에 의해 측정된 전장 생성물의 백분율을 배합 및 배합되지 않은 siRNA 모두에 대해 평가한다. 도 12에서 입증된 바와 같이, 배합된 siRNA는 시험관내의 사람 혈청에서 현저하게 개선된 반감기를 갖는다.
실시예 49: 각종 쇄 길이의 PEG 지질을 갖는 회합 복합체의 효능의 비교
회합 복합체를 PEG 지질의 알킬쇄의 길이를 달리하여 실시예 46에 따라 제조한다. 10, 11, 12, 13, 14, 15, 및 16의 알킬쇄 길이를 평가하고 인자 VII 사일런싱 분석에서 효능을 비교한다. 도 13에서 보듯이, 13, 14, 및 15의 쇄 길이가 분석에서 가장 높은 사일런싱 효과를 나타낸다.
본 발명의 여러 양태들을 설명하였다. 그러나 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않고서 각종 변형을 달성할 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 다른 양태들도 하기 청구의 범위 내에 포함된다.

Claims (349)

  1. 화학식 I에 정의된 구조를 각각 개별적으로 갖는 1종 이상의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 제제.
    화학식 I
    Figure 112009026592906-PCT00203
    위의 화학식 I에서,
    Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 C1 -6 알킬렌이고,
    n은 0, 1 , 2, 3, 4 또는 5이고,
    R은 각각 독립적으로 H,
    Figure 112009026592906-PCT00204
    (Ra),
    Figure 112009026592906-PCT00205
    (Rb),
    Figure 112009026592906-PCT00206
    (Rc),
    Figure 112009026592906-PCT00207
    (Rd) 또는
    Figure 112009026592906-PCT00208
    (Re)이고, 여기서, m은 1, 2, 3 또는 4이고, Y는 O, NR2 또는 S이고, R1은 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 이들 각각은 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되고,
    여기서, 상기 제제 중의 화학식 I의 화합물의 분자들 중의 약 80% 이상에서, n+2개 이상의 R 잔기는 H가 아니고,
    R2는 H, 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 이들 각각은 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되고, 단 n이 0인 경우, n+3개 이상의 R 잔기는 H가 아니다.
  2. 제1항에 있어서, R이 H가 아닌 경우 R이 Ra인, 제제.
  3. 제1항에 있어서, R이 H가 아닌 경우 R이 Rb인, 제제.
  4. 제1항에 있어서, R이 H가 아닌 경우 R이 Rc인, 제제.
  5. 제1항에 있어서, R이 H가 아닌 경우 R이 Rd인, 제제.
  6. 제1항에 있어서, R이 H가 아닌 경우 R이 Re인, 제제.
  7. 제1항에 있어서, 화학식 I의 n+2개의 R 잔기가 H가 아닌, 제제.
  8. 제1항에 있어서, 화학식 I의 n+3개의 R 잔기가 H가 아닌, 제제.
  9. 제1항에 있어서, 화학식 I의 n+4개의 R 잔기가 H가 아닌, 제제.
  10. 제1항에 있어서, n이 0을 초과하고, 화학식 I의 NR의 하나 이상의 R이 H인, 제제.
  11. 제1항에 있어서, 화학식 I의 NR2의 하나 이상의 R이 H인, 제제.
  12. 제1항에 있어서, 상기 분자들 중의 80% 이상이 단일 구조 이성체인, 제제.
  13. 제12항에 있어서, 화학식 I의 n+2개의 R 잔기가 H가 아닌, 제제.
  14. 제12항에 있어서, 화학식 I의 n+3개의 R 잔기가 H가 아닌, 제제.
  15. 제12항에 있어서, 화학식 I의 n+4개의 R 잔기가 H가 아닌, 제제.
  16. 제1항에 있어서, 화학식 I의 화합물의 약 90% 이상에서 화학식 I의 n+2개 이상의 R 잔기가 H가 아닌, 제제.
  17. 제1항에 있어서, 화학식 I의 화합물의 약 95% 이상에서 화학식 I의 n+2개 이상의 R 잔기가 H가 아닌, 제제.
  18. 제1항에 있어서, 화학식 I의 화합물의 약 99% 이상에서 화학식 I의 n+2개 이상의 R 잔기가 H가 아닌, 제제.
  19. 제1항에 있어서, n이 2인, 제제.
  20. 제1항에 있어서, n이 0인, 제제.
  21. 제1항에 있어서, Xa 및 Xb가 C2 알킬렌인, 제제.
  22. 제1항에 있어서, n이 0이고 Xb가 에틸렌 또는 프로필렌인, 제제.
  23. 제1항에 있어서, n이 1을 초과하고 Xa가 1회 이상 가변적인, 제제.
  24. 제1항에 있어서, R이 H가 아닌 경우, R이
    Figure 112009026592906-PCT00209
    인, 제제.
  25. 제24항에 있어서, Y가 O 또는 NR2인, 제제.
  26. 제24항에 있어서, m이 2인, 제제.
  27. 제24항에 있어서, Y가 O 또는 NR2이고 m이 2인, 제제.
  28. 제24항에 있어서, m이 1인, 제제.
  29. 제1항에 있어서, 하나 이상의 경우 R1이 알킬인, 제제.
  30. 제1항에 있어서, 각각의 경우 R1이 알킬인, 제제.
  31. 제1항에 있어서, R1이 알킬이고 R2가 H인, 제제.
  32. 제1항에 있어서, R1 및 R2가 H인, 제제.
  33. 제1항에 있어서, 하나 이상의 경우 R1이 알케닐인, 제제.
  34. 제1항에 있어서, 하나 이상의 경우 R1이 알케닐인, 제제.
  35. 제1항에 있어서, R이 H가 아닌 경우, R이 Ra이고, Y가 O 또는 NH인, 제제.
  36. 제35항에 있어서, Y가 O인, 제제.
  37. 제35항에 있어서, Y가 NH인, 제제.
  38. 제35항에 있어서, R1이 알킬인, 제제.
  39. 제38항에 있어서, R1이 C10 -30 알킬인, 제제.
  40. 제39항에 있어서, R1이 C12 알킬인, 제제.
  41. 제35항에 있어서, n이 2인, 제제.
  42. 제41항에 있어서, 각각의 경우 Xa가 C2 알킬렌이고 Xb가 C2 알킬렌인, 제제.
  43. 제35항에 있어서, m이 2인, 제제.
  44. 제1항에 있어서, n이 2이고, R이 H가 아닌 경우 R이 Ra인, 제제.
  45. 제44항에 있어서, R1이 알킬인, 제제.
  46. 제45항에 있어서, R1이 C10 -18 알킬인, 제제.
  47. 제46항에 있어서, R1이 C12 알킬인, 제제.
  48. 제44항에 있어서, Y가 O인, 제제.
  49. 제44항에 있어서, Y가 NH인, 제제.
  50. 제44항에 있어서, 각각의 경우 Xa가 C2 알킬렌이고, Xb가 C2 알킬렌인, 제제.
  51. 제44항에 있어서, m이 2인, 제제.
  52. 제1항에 있어서, NR의 하나 이상의 R이 H이고, R이 H가 아닌 경우 R이 Ra이고, Y가 O 또는 NH인, 제제.
  53. 제52항에 있어서, Y가 O인, 제제.
  54. 제52항에 있어서, Y가 NH인, 제제.
  55. 제52항에 있어서, R1이 알킬인, 제제.
  56. 제55항에 있어서, R1이 C10 -30 알킬인, 제제.
  57. 제56항에 있어서, R1이 C12 알킬인, 제제.
  58. 제52항에 있어서, n이 2인, 제제.
  59. 제58항에 있어서, 각각의 경우 Xa가 C2 알킬렌이고, Xb가 C2 알킬렌인, 제제.
  60. 제52항에 있어서, m이 2인, 제제.
  61. 제1항에 있어서, n이 2이고, NR의 하나 이상의 R이 H이고, R이 H가 아닌 경우 R은 Ra이고, Y가 O 또는 NH인, 제제.
  62. 제61항에 있어서, R1이 알킬인, 제제.
  63. 제62항에 있어서, R1이 C10 -18 알킬인, 제제.
  64. 제63항에 있어서, R1이 C12 알킬인, 제제.
  65. 제61항에 있어서, Y가 O인, 제제.
  66. 제61항에 있어서, Y가 NH인, 제제.
  67. 제61항에 있어서, 각각의 경우 Xa가 C2 알킬렌이고, Xb가 C2 알킬렌인, 제제.
  68. 제61항에 있어서, m이 2인, 제제.
  69. 제1항에 있어서, NR2의 하나 이상의 R이 H이고, R이 Ra이고, Y가 O 또는 NH인, 제제.
  70. 제69항에 있어서, Y가 O인, 제제.
  71. 제69항에 있어서, Y가 NH인, 제제.
  72. 제69항에 있어서, R1이 알킬인, 제제.
  73. 제72항에 있어서, R1이 C10 -30 알킬인, 제제.
  74. 제73항에 있어서, R1이 C12 알킬인, 제제.
  75. 제69항에 있어서, n이 2인, 제제.
  76. 제69항에 있어서, 각각의 경우 Xa가 C2 알킬렌이고, Xb가 C2 알킬렌인, 제제.
  77. 제69항에 있어서, m이 2인, 제제.
  78. 제1항에 있어서, n이 2이고, NR2의 하나 이상의 R이 H이고, R이 Ra이고, Y가 O 또는 NH인, 제제.
  79. 제78항에 있어서, R1이 알킬인, 제제.
  80. 제79항에 있어서, R1이 C10 -18 알킬인, 제제.
  81. 제80항에 있어서, R1이 C12 알킬인, 제제.
  82. 제78항에 있어서, Y가 O인, 제제.
  83. 제78항에 있어서, Y가 NH인, 제제.
  84. 제78항에 있어서, 각각의 경우 Xa가 C2 알킬렌이고, Xb가 C2 알킬렌인, 제제.
  85. 제78항에 있어서, m이 2인, 제제.
  86. 제1항에 있어서, n이 0이고 X가 프로필렌인, 제제.
  87. 제86항에 있어서, 하나의 R이 H인, 제제.
  88. 제86항에 있어서, R이 H가 아닌 경우, R이 Ra인, 제제.
  89. 제86항에 있어서, R1이 알킬인, 제제.
  90. 제89항에 있어서, R1이 C10 -30 알킬인, 제제.
  91. 제90항에 있어서, R1이 C12 알킬인, 제제.
  92. 제86항에 있어서, Y가 O인, 제제.
  93. 제86항에 있어서, Y가 NH인, 제제.
  94. 제86항에 있어서, m이 2인, 제제.
  95. 제1항에 있어서, n이 2이고, 각각의 경우 Xa가 C2 알킬렌이고 Xb가 C2 알킬렌이며, 각각의 R은 H 또는
    Figure 112009026592906-PCT00210
    (Ra)(여기서, m은 2이고, Y는 NH 또는 O이고, R1은 C12 알킬이다)인, 제제.
  96. 제95항에 있어서, 화학식 I의 화합물의 분자들 중의 80% 이상이 단일 구조 이성체인, 제제.
  97. 제95항에 있어서, Y가 NH인, 제제.
  98. 제97항에 있어서, 화학식 I의 화합물의 분자들 중의 80% 이상이 단일 구조 이성체인, 제제.
  99. 제98항에 있어서, 5가지 경우 R이 Ra인, 제제.
  100. 제95항에 있어서, 화학식 I의 화합물의 분자들 중의 80% 이상에서, 5가지 경우 R이 Ra인, 제제.
  101. 제100항에 있어서, Y가 NH인, 제제.
  102. 제95항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 이의 무기 또는 유기 염인, 제제.
  103. 제102항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 이의 하이드로할라이드 염인, 제제.
  104. 제103항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 이의 하이드로클로라이드 염인, 제제.
  105. 제1항에 있어서, 상기 하이드로클로라이드 염이 1당량의 HCl 내지 n+2당량의 HCl 범위인, 제제.
  106. 제1항에 있어서, 화학식 I의 화합물의 수화물을 포함하는, 제제.
  107. 제1항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 유기산의 염인, 제제.
  108. 제107항에 있어서, 상기 염이 아세테이트인, 제제.
  109. 제108항에 있어서, 상기 아세테이트 염이 1당량의 아세테이트 내지 n+2당량의 아세테이트 범위인, 제제.
  110. 제107항에 있어서, 상기 염이 포르메이트인, 제제.
  111. 제108항에 있어서, 상기 포르메이트가 1당량의 아세테이트 내지 n+2당량의 포르메이트트 범위인, 제제.
  112. 제1항에 있어서, R1이 알케닐 잔기를 포함하는, 제제.
  113. 제112항에 있어서, R1이 시스 이중 결합을 포함하는, 제제.
  114. 제1항에 있어서, 상기 제제가 화학식 III의 화합물을 11중량% 미만으로 포함하는, 제제.
    화학식 III
    Figure 112009026592906-PCT00211
    위의 화학식 III에서,
    X 및 n은 제1항의 화학식 I에서 정의한 바와 같다.
  115. 제1항에 있어서, 상기 제제가 화학식 IV의 화합물을 90중량% 미만으로 포함하는, 제제.
    화학식 IV
    Figure 112009026592906-PCT00212
    위의 화학식 IV의에서,
    Y 및 R1은 제1항의 화학식 I에서 정의한 바와 같다.
  116. 제1항에 있어서, 다수의 화학식 I의 화합물을 포함하는, 제제.
  117. 제116항에 있어서, 상기 제제가 화학식 I' 및 화학식 I"의 화합물의 혼합물을 포함하는, 제제.
    화학식 I'
    Figure 112009026592906-PCT00213
    화학식 I"
    Figure 112009026592906-PCT00214
    위의 화학식 I"에서,
    5개 이상의 R 잔기는 Ra이다.
  118. 제117항에 있어서, 화학식 I' 및 화학식 I"의 화합물이 약 1:2 내지 약 2:1의 비로 존재하는, 제제.
  119. 화학식 III의 화합물을 촉진제의 존재하에 화학식 IV의 화합물과 반응시킴을 포함하는, 화학식 II의 화합물의 제조 방법.
    화학식 II
    Figure 112009026592906-PCT00215
    화학식 III
    Figure 112009026592906-PCT00216
    화학식 IV
    Figure 112009026592906-PCT00217
    위의 화학식 II, III 및 IV에서,
    Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 C1 -6 알킬렌이고,
    n은 0, 1 , 2, 3, 4 또는 5이고,
    R은 각각 독립적으로 H 또는
    Figure 112009026592906-PCT00218
    (Ra)이고,
    m은 2이고,
    Y는 O, NR2 또는 S이고,
    R1은 알킬 또는 알케닐이고,
    R2는 H 또는 C 알킬 또는 알케닐이다.
  120. 화학식 III의 화합물을 켄처(quencher)의 존재하에 화학식 IV의 화합물과 반응시킴을 포함하는, 화학식 II의 화합물의 제조 방법.
    화학식 II
    Figure 112009026592906-PCT00219
    화학식 III
    Figure 112009026592906-PCT00220
    화학식 IV
    Figure 112009026592906-PCT00221
    위의 화학식 II, III 및 IV에서,
    Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 C1-6 알킬렌이고,
    n은 0, 1 , 2, 3, 4 또는 5이고,
    R은 각각 독립적으로 H 또는
    Figure 112009026592906-PCT00222
    (Ra)이고,
    m은 2이고,
    Y는 O, NR2 또는 S이고,
    R1은 알킬 또는 알케닐이고,
    R2는 H 또는 C 알킬 또는 알케닐이다.
  121. 화학식 III의 화합물을 화학식 IV의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 반응 혼합물이 약 0.8 내지 약 1.2몰당량의 화학식 III의 화합물과 약 3.8 내지 약 6.5몰당량의 화학식 IV의 화합물을 포함하는, 화학식 II의 화합물 의 제조 방법.
    화학식 II
    Figure 112009026592906-PCT00223
    화학식 III
    Figure 112009026592906-PCT00224
    화학식 IV
    Figure 112009026592906-PCT00225
    위의 화학식 II, III 및 IV에서,
    Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 C1-6 알킬렌이고,
    n은 0, 1 , 2, 3, 4 또는 5이고,
    R은 각각 독립적으로 H 또는
    Figure 112009026592906-PCT00226
    (Ra)이고,
    m은 2이고,
    Y는 O, NR2 또는 S이고,
    R1은 알킬 또는 알케닐이고,
    R2는 H 또는 C 알킬 또는 알케닐이다.
  122. 제121항에 있어서, 상기 반응 혼합물이 약 0.8 내지 약 1.2몰당량의 화학식 III의 화합물과 약 5.5 내지 약 6.5몰당량의 화학식 IV의 화합물을 포함하는, 방법.
  123. 제122항에 있어서, 상기 반응 혼합물이 약 1몰당량의 화학식 III의 화합물과 약 6몰당량의 화학식 IV의 화합물을 포함하는, 방법.
  124. 제121항에 있어서, 상기 반응 혼합물이 약 1몰당량의 화학식 III의 화합물과 약 5몰당량의 화학식 IV의 화합물을 포함하는, 방법.
  125. 화학식 III의 화합물을 붕산과 물의 존재하에 화학식 IV의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하고, 여기서, 제1 단계 공정에서 상기 반응 혼합물이 약 0.8 내지 약 1.2몰당량의 화학식 III의 화합물과 약 3.8 내지 약 4.2몰당량의 화학식 IV의 화합물을 포함하고, 제2 단계 공정에서 약 0.8 내지 1.2몰당량의 화학식 IV의 화합물을 첨가하는, 화학식 II의 화합물의 제조 방법.
    화학식 II
    Figure 112009026592906-PCT00227
    화학식 III
    Figure 112009026592906-PCT00228
    화학식 IV
    Figure 112009026592906-PCT00229
    위의 화학식 II, III 및 IV에서,
    Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 C1 -6 알킬렌이고,
    n은 0, 1 , 2, 3, 4 또는 5이고,
    R은 각각 독립적으로 H 또는
    Figure 112009026592906-PCT00230
    (Ra)이고,
    m은 2이고,
    Y는 O, NR2 또는 S이고,
    R1은 알킬 또는 알케닐이고,
    R2는 H 또는 C 알킬 또는 알케닐이다.
  126. 화학식 III의 화합물을 화학식 IV의 화합물과 반응시키는 단계, 및 상기 반응 혼합물로부터 화학식 II의 1종 이상의 구조 이성체를 분리시켜, 1종의 화학식 II의 구조 이성체를 포함하는 실질적으로 순수한 제제를 제공하는 단계를 포함하 는, 화학식 II의 화합물의 제조 방법.
    화학식 II
    Figure 112009026592906-PCT00231
    화학식 III
    Figure 112009026592906-PCT00232
    화학식 IV
    Figure 112009026592906-PCT00233
    위의 화학식 II, III 및 IV에서,
    Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 C1 -6 알킬렌이고,
    n은 0, 1 , 2, 3, 4 또는 5이고,
    R은 각각 독립적으로 H 또는
    Figure 112009026592906-PCT00234
    (Ra)이고,
    m은 2이고,
    Y는 O, NR2 또는 S이고,
    R1은 알킬 또는 알케닐이고,
    R2는 H 또는 C 알킬 또는 알케닐이다.
  127. 제126항에 있어서, 화학식 II의 구조 이성체가 크로마토그래피 분리를 사용하여 반응 혼합물로부터 분리되는, 방법.
  128. 제127항에 있어서, 상기 크로마토그래피 분리가 이성체들의 분리를 위한 섬광 실리카 겔을 사용하는, 방법.
  129. 제128항에 있어서, 상기 크로마토그래피 분리가 실리카겔을 사용하는 이성체의 중력 분리인, 방법.
  130. 제128항에 있어서, 상기 크로마토그래피 분리가 이성체의 분리를 위한 이동층 크로마토그래피를 사용하는, 방법.
  131. 제128항에 있어서, 상기 크로마토그래피 분리가 이성체들의 분리를 위한 액체 크로마토그래피(LC)를 사용하는, 방법.
  132. 제131항에 있어서, 상기 크로마토그래피 분리가 이성체들의 분리를 위한 정상 HPLC인, 방법.
  133. 제131항에 있어서, 상기 크로마토그래피 분리가 이성체들의 분리를 위한 역 상 HPLC인, 방법.
  134. 제126항에 있어서, 상기 실질적으로 순수한 제제가 화학식 II의 구조 이성체를 약 80% 이상 포함하는, 방법.
  135. 제134항에 있어서, 상기 실질적으로 순수한 제제가 화학식 II의 구조 이성체를 약 90% 이상 포함하는, 방법.
  136. 제135항에 있어서, 상기 실질적으로 순수한 제제가 화학식 II의 구조 이성체를 약 95% 이상 포함하는, 방법.
  137. 화학식 III의 화합물을 화학식 VI의 화합물과 반응시켜 화학식 V의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 제공하는 단계를 포함하는, 화학식 V의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염의 제조 방법.
    화학식 III
    Figure 112009026592906-PCT00235
    화학식 V
    Figure 112009026592906-PCT00236
    화학식 VI
    Figure 112009026592906-PCT00237
    위의 화학식 III, V 및 VI에서,
    Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 C1-6 알킬렌이고,
    n은 0, 1 , 2, 3, 4 또는 5이고,
    R은 각각 독립적으로 H 또는
    Figure 112009026592906-PCT00238
    (Ra)이고,
    m은 1이고,
    Y는 O, NR2 또는 S이고,
    R1은 알킬 또는 알케닐이고,
    R2는 H 또는 알킬 또는 알케닐이고,
    Q는 Cl, Br 또는 I이다.
  138. 제137항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 염이 화학식 V의 화합물의 하이드로클로라이드 염인, 방법.
  139. 화학식 X의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염.
    화학식 X
    Figure 112009026592906-PCT00239
    위의 화학식 X에서,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 1 내지 4개의 R5로 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 1 내지 4개의 R5로 임의로 치환된 C2-C6 알케닐 또는 C(NR6)(NR6)2이고,
    R3 및 R4는 각각 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐(이들 각각은 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도로 임의로 치환된다)이고,
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 -NR6C(O)-, -C(O)NR6-, -OC(O)-, -C(O)O-, -S-S-, -N(R6)C(O)N(R6)-, -OC(O)N(R6)-, -N(R6)C(O)O-, -O-N=C-, OR, -OC(O)NH-N=C- 또는 -NHC(O)NH-N=C-이고,
    L1-R3 및 L2-R4(여기서, R3 및 R4는 상기 정의된 바와 같으며, H 또는 페닐일 수도 있다)는 함께 아세탈, 케탈 또는 오르토에스테르를 형성할 수 있고,
    R5는 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, -OR7, -N(R8)(R9), -CN, SR10, S(O)R10 또는 S(O)2R10이고,
    R6은 H 또는 C1-C6 알킬이고,
    R7은 H 또는 C1-C6 알킬이고,
    R8 및 R9는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고,
    R10은 H 또는 C1-C6 알킬이고,
    m은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고,
    n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
  140. 제139항에 있어서, 상기 화합물이 이의 무기 염인, 화합물.
  141. 제140항에 있어서, 상기 화합물이 이의 하이드로할라이드 염인, 화합물.
  142. 제141항에 있어서, 상기 화합물이 이의 하이드로클로라이드 염인, 화합물.
  143. 제139항에 있어서, 상기 화합물이 이의 유기 염인, 화합물.
  144. 제139항에 있어서, R1 및 R2가 각각 독립적으로 C1-C3 알킬인, 화합물.
  145. 제139항에 있어서, R1이 메틸인, 화합물.
  146. 제139항에 있어서, R2가 메틸인, 화합물.
  147. 제139항에 있어서, R1 및 R2가 둘 다 메틸인, 화합물.
  148. 제139항에 있어서, R1이 H, 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 2-하이드록시에틸인, 화합물.
  149. 제148항에 있어서, R2가 H인, 화합물.
  150. 제148항에 있어서, R2가 메틸인, 화합물.
  151. 제148항에 있어서, R2가 에틸인, 화합물.
  152. 제148항에 있어서, R2가 프로필인, 화합물.
  153. 제148항에 있어서, R2가 이소프로필인, 화합물.
  154. 제139항에 있어서, R2가 H, 메틸, 에틸, 프로필 또는 이소프로필인, 화합물.
  155. 제139항에 있어서, R1이 H, 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 2-하이드록시에틸이고, R2가 H, 메틸, 에틸, 프로필 또는 이소프로필인, 화합물.
  156. 제139항에 있어서, m이 1인, 화합물.
  157. 제139항에 있어서, n이 1인, 화합물.
  158. 제139항에 있어서, m과 n이 둘 다 1인, 화합물.
  159. 제139항에 있어서, L1이 -NR6C(O)- 또는 -C(O)NR6-인, 화합물.
  160. 제139항에 있어서, L1이 -OC(O)- 또는 -C(O)O-인, 화합물.
  161. 제139항에 있어서, L1이 S-S-인, 화합물.
  162. 제139항에 있어서, L1이 -N(R6)C(O)N(R6)-인, 화합물.
  163. 제139항에 있어서, L1이 -OC(O)N(R6)- 또는 -N(R6)C(O)O-인, 화합물.
  164. 제139항에 있어서, L1이 -O-N=C-인, 화합물.
  165. 제139항에 있어서, L1이 -OC(O)NH-N=C- 또는 -NHC(O)NH-N=C-인, 화합물.
  166. 제139항에 있어서, L2가 -NR6C(O)- 또는 -C(O)NR6-인, 화합물.
  167. 제139항에 있어서, L2가 -OC(O)- 또는 -C(O)O-인, 화합물.
  168. 제139항에 있어서, L2가 S-S-인, 화합물.
  169. 제139항에 있어서, L2가 -N(R6)C(O)N(R6)-인, 화합물.
  170. 제139항에 있어서, L2가 -OC(O)N(R6)- 또는 -N(R6)C(O)O-인, 화합물.
  171. 제139항에 있어서, L2가 -O-N=C-인, 화합물.
  172. 제139항에 있어서, L2가 -OC(O)NH-N=C- 또는 -NHC(O)NH-N=C-인, 화합물.
  173. 제139항에 있어서, L1 및 L2가 둘 다 -NR6C(O)- 또는 -C(O)NR6-인, 화합물.
  174. 제139항에 있어서, L1 및 L2가 둘 다 -OC(O)- 또는 -C(O)O-인, 화합물.
  175. 제139항에 있어서, L1 및 L2가 둘 다 S-S-인, 화합물.
  176. 제139항에 있어서, L1 및 L2가 둘 다 -N(R6)C(O)N(R6)-인, 화합물.
  177. 제139항에 있어서, L1 및 L2가 둘 다 -OC(O)N(R6)- 또는 -N(R6)C(O)O-인, 화합물.
  178. 제139항에 있어서, L1이 -NR6C(O)-이고 L2가 -S-S-인, 화합물.
  179. 제139항에 있어서, L1이 -OC(O)-이고 L2가 -S-S-인, 화합물.
  180. 제139항에 있어서, L1이 -OC(O)N(R6)- 또는 -N(R6)C(O)O-이고 L2가 -S-S-인, 화합물.
  181. 제139항에 있어서, L1이 -N(R6)C(O)N(R6)-이고 L2가 -S-S-인, 화합물.
  182. 제139항에 있어서, L1-R3 및 L2-R4가 함께 아세탈, 케탈 또는 오르토에스테르를 형성하는, 화합물.
  183. 제139항에 있어서, R3 및 R4는 각각 독립적으로 알킬인, 화합물.
  184. 제139항에 있어서, R3 및 R4는 둘 다 C6-C28 알킬인, 화합물.
  185. 제184항에 있어서, L1 및 L2가 각각 독립적으로 -S-S-, -OC(O)N(R6)- 또는 -N(R6)C(O)O-인, 화합물.
  186. 제139항에 있어서, R3이 알킬인, 화합물.
  187. 제139항에 있어서, R4가 알킬인, 화합물.
  188. 제139항에 있어서, R3이 알케닐인, 화합물.
  189. 제139항에 있어서, R4가 알케닐인, 화합물.
  190. 제139항에 있어서, R3 및 R4가 각각 독립적으로 알케닐인, 화합물.
  191. 제190항에 있어서, R3 및 R4가 각각 독립적으로 C6-C30 알케닐인, 화합물.
  192. 제190항에 있어서, R3 및 R4가 각각 동일한 알케닐 잔기인, 화합물.
  193. 제139항에 있어서, R3 및 R4가 각각 2개의 이중 결합 잔기를 포함하는, 화합물.
  194. 제193항에 있어서, 이중 결합들 중의 하나 이상이 Z 배위를 갖는, 화합물.
  195. 제193항에 있어서, 이중 결합이 둘 다 Z 배위를 갖는, 화합물.
  196. 제190항에 있어서, R3 및 R4 중의 하나 이상이 화학식 II로 제공되는, 화합물.
    화학식 II
    Figure 112009026592906-PCT00240
    위의 화학식 II에서,
    x는 1 내지 8의 정수이고,
    y는 1 내지 10의 정수이다.
  197. 제196항에 있어서, R3 및 R4가 둘 다 화학식 II로 제공되는, 화합물.
  198. 제190항에 있어서, 이중 결합들 중의 하나 이상이 E 배위를 갖는, 화합물.
  199. 제198항에 있어서, 이중 결합이 둘 다 E 배위를 갖는, 화합물.
  200. 제198항에 있어서, R1 및 R2 중의 하나 이상이 화학식 III으로 제공되는, 화합물.
    화학식 III
    Figure 112009026592906-PCT00241
    위의 화학식 III에서,
    x는 1 내지 8의 정수이고,
    y는 1 내지 10의 정수이다.
  201. 제200항에 있어서, R1 및 R2가 둘 다 화학식 III으로 제공되는, 화합물.
  202. 제190항에 있어서, R1 및 R2가 각각 3개의 이중 결합 잔기를 포함하는, 화합물.
  203. 제202항에 있어서, 이중 결합들 중의 하나 이상이 Z 배위를 갖는, 화합물.
  204. 제203항에 있어서, 이중 결합들 중의 2개 이상이 Z 배위를 갖는, 화합물.
  205. 제204항에 있어서, 3개 이상의 이중 결합들 모두가 Z 배위를 갖는, 화합물.
  206. 제190항에 있어서, R1 및 R2 중의 하나 이상이 화학식 IV로 제공되는, 화합물.
    화학식 IV
    Figure 112009026592906-PCT00242
    위의 화학식 IV에서,
    x는 1 내지 8의 정수이고,
    y는 1 내지 10의 정수이다.
  207. 제206항에 있어서, R1 및 R2가 둘 다 화학식 IV로 제공되는, 화합물.
  208. 제190항에 있어서, 이중 결합들 중의 하나 이상이 E 배위를 갖는, 화합물.
  209. 제208항에 있어서, 이중 결합들 중의 2개 이상이 E 배위를 갖는, 화합물.
  210. 제209항에 있어서, 이중 결합들 중의 3개 이상이 E 배위를 갖는, 화합물.
  211. 제210항에 있어서, R1 및 R2 중의 하나 이상이 화학식 V로 제공되는, 화합물.
    화학식 V
    Figure 112009026592906-PCT00243
    위의 화학식 V에서,
    x는 1 내지 8의 정수이고,
    y는 1 내지 10의 정수이다.
  212. 제212항에 있어서, R1 및 R2가 둘 다 화학식 V로 제공되는, 화합물.
  213. 화학식 X의 화합물을 포함하는, 제제.
  214. 화학식 VI의 화합물을 커플링제의 존재하에 화학식 VII의 화합물과 반응시켜 화학식 X의 화합물을 제공하는 단계를 포함하는, 화학식 X의 화합물의 제조 방법.
    화학식 VI
    Figure 112009026592906-PCT00244
    화학식 VII
    Figure 112009026592906-PCT00245
    화학식 X
    Figure 112009026592906-PCT00246
    위의 화학식 VI, VII 및 X에서,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 1 내지 4개의 R5로 임의로 치환된 C1-C6알킬이고,
    R3는 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고,
    L1은 -OC(O)-이고,
    R5는 -OR7, -N(R8)(R9), -CN, SR10, S(O)R10 또는 S(O)2R10이고,
    R6은 H 또는 C1-C6 알킬이고,
    R7은 H 또는 C1-C6 알킬이고,
    R8 및 R9는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고,
    R10은 H 또는 C1-C6 알킬이고,
    m 및 n은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
  215. 제214항에 있어서, 상기 커플링제가 카보디이미드인, 방법.
  216. 제215항에 있어서, 상기 커플링제가 EDCI인, 방법.
  217. 제1항 또는 제213항의 지질 제제를 완충액의 존재하에 치료제와 접촉시키는 단계를 포함하며; 상기 완충액이 화학식 I의 분자들의 거의 모든 아민을 실질적으로 양성자화시키기에 충분한 강도를 갖고 100 내지 300mM로 존재하며 20mM에서 동일한 완충액에 비해 훨씬 더 많은 양성자화를 제공하는 농도로 존재하는, 회합 복합체(association complex)의 제조 방법.
  218. 제217항의 방법에 의해 제조된 회합 복합체.
  219. 제1항 또는 제213항의 지질 제제를 에탄올을 약 90% 이상의 포함하는 혼합물 중에서 치료제와 접촉시키고, 상기 지질 제제를 치료제와 급속 혼합하여 약 200μM 미만의 직경을 갖는 입자를 제공하는 단계를 포함하는, 회합 복합체의 제조 방법.
  220. 제219항에 있어서, 상기 입자가 약 50μM 미만의 직경을 갖는, 방법.
  221. 제1항 또는 제213항의 지질 제제를, 약 100 내지 약 300mM의 농도를 갖는 완 충액의 존재하에 치료제와 접촉시킴을 포함하는, 회합 복합체의 제조 방법.
  222. 제1항 또는 제213항의 제제 및 핵산을 포함하는, 회합 복합체.
  223. 제222항에 있어서, 페길화된 지질을 추가로 포함하는, 회합 복합체.
  224. 제222항에 있어서, 구조적 잔기를 추가로 포함하는, 회합 복합체.
  225. 제224항에 있어서, 상기 구조적 잔기가 콜레스테롤인, 회합 복합체.
  226. 제222항에 있어서, 상기 핵산이 siRNA인, 회합 복합체.
  227. 제226항에 있어서, 상기 핵산이 분해에 저항하도록 변성된 siRNA인, 회합 복합체.
  228. 제226항에 있어서, 상기 핵산이 폴리사카라이드 골격의 변성에 의해 변성된 siRNA인, 회합 복합체.
  229. 제226항에 있어서, 상기 siRNA가 관심 유전자 또는 유전자들을 표적화하는, 회합 복합체.
  230. 제229항에 있어서, 상기 관심 유전자 또는 유전자들이 간에서 내인성으로 발현되는, 회합 복합체.
  231. 제230항에 있어서, 상기 관심 유전자가 apoB인, 회합 복합체.
  232. 제230항에 있어서, 상기 관심 유전자가 FVII인, 회합 복합체.
  233. 제230항에 있어서, 상기 관심 유전자가 PCSK9인, 회합 복합체.
  234. 제230항에 있어서, 상기 관심 유전자가 VEGF인, 회합 복합체.
  235. 제230항에 있어서, 상기 관심 유전자가 KSP(eg5)인, 회합 복합체.
  236. 제230항에 있어서, 상기 관심 유전자가 헵시딘(hepcidin)인, 회합 복합체.
  237. 제230항에 있어서, 상기 관심 유전자가 HCV인, 회합 복합체.
  238. 제222항에 있어서, 상기 핵산이 단일 나선 핵산 또는 이의 유도체인, 회합 복합체.
  239. 제238항에 있어서, 상기 핵산이 안티센스(antisense) 핵산인, 회합 복합체.
  240. 제238항에 있어서, 상기 핵산이 마이크로RNA인, 회합 복합체.
  241. 제238항에 있어서, 상기 핵산이 마이크로RNA의 안티센스 올리고뉴클레오티드(안타고미르(antagomir))인, 회합 복합체.
  242. 제241항에 있어서, 상기 핵산이 마이크로RNA-122에 대비되는, 회합 복합체.
  243. 제241항에 있어서, 상기 핵산이 마이크로RNA-181에 대비되는, 회합 복합체.
  244. 제241항에 있어서, 상기 핵산이 마이크로RNA-155에 대비되는, 회합 복합체.
  245. 제241항에 있어서, 상기 핵산이 마이크로RNA-16에 대비되는, 회합 복합체.
  246. 제222항에 있어서, 구조적 잔기 및 페길화된 지질을 추가로 포함하고, 여기서, 제1항 또는 제213항의 제제, 구조적 잔기, 페길화된 지질, 및 핵산의 중량 비가 8 내지 22 : 0.4 내지 10 : 0.4 내지 12 : 0.4 내지 2.2인, 회합 복합체.
  247. 제246항에 있어서, 상기 구조적 잔기가 콜레스테롤인, 회합 복합체.
    [청구항 247]
    제247항에 있어서, 상기 비가 10 내지 20 : 0.5 내지 8.0 : 5 내지 10 : 0.5 내지 2.0인, 회합 복합체.
  248. 제248항에 있어서, 상기 비가 15:0.8:7.1인, 회합 복합체.
  249. 제246항에 있어서, 상기 평균 리포솜 직경이 10 내지 750㎚인, 회합 복합체.
  250. 제249항에 있어서, 상기 평균 회합 복합체 직경이 30 내지 200㎚인, 회합 복합체.
  251. 제250항에 있어서, 상기 평균 회합 복합체 직경이 50 내지 100㎚인, 회합 복합체.
  252. 제222항에 있어서, 상기 제제가 미반응 지질의 15중량% 미만인, 회합 복합체.
  253. 제1항 또는 제213항의 제제를 포함하는, 약제학적으로 허용되는 조성물.
  254. 제222항의 회합 복합체를 포함하는, 약제학적으로 허용되는 조성물.
  255. 제222항의 회합 복합체를 치료량으로 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 치료 방법.
  256. 제1항에 있어서, 화학식
    Figure 112009026592906-PCT00247
    및
    Figure 112009026592906-PCT00248
    (여기서, R은 달리 특정되지 않는 한 H가 아니다)의 화합물 중의 하나 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 제제.
  257. 제1항에 있어서, 화학식
    Figure 112009026592906-PCT00249
    및
    Figure 112009026592906-PCT00250
    의 화합물 중의 하나 또는 이들의 혼합물로 필수적으로 이루어진, 제제.
  258. 제257항에 있어서, 각각의 R이
    Figure 112009026592906-PCT00251
    인, 제제.
  259. 제258항에 있어서, 각각의 R이
    Figure 112009026592906-PCT00252
    인, 제제.
  260. 제256항 또는 제257항에 있어서, R1이 C10-C18 알킬(예: C12 알킬), 또는 C10-C30 알케닐인, 제제.
  261. 제256항에 있어서, R이
    Figure 112009026592906-PCT00253
    인, 제제.
  262. 제261항에 있어서, R1이 C10-C18 알킬인, 제제.
  263. 제261항에 있어서, R1이 C12 알킬이고 R2가 H인, 제제.
  264. 제253항에 있어서, 화학식 I이
    Figure 112009026592906-PCT00254
    (여기서, R은 특정되지 않는 한 H가 아니고, R은
    Figure 112009026592906-PCT00255
    이다)인, 제제.
  265. 제264항에 있어서, R1이 C12 알킬이고 R2가 H인, 제제.
  266. 제256항에 있어서, 화학식 I이
    Figure 112009026592906-PCT00256
    (여기서, R은 특정되지 않는 한 H가 아니고, R은
    Figure 112009026592906-PCT00257
    이다)인, 제제.
  267. 제266항에 있어서, R1이 C12 알킬이고 R2가 H인, 제제.
  268. 제1항에 있어서, 화학식 I이
    Figure 112009026592906-PCT00258
    (여기서, R은 특정되지 않는 한 H가 아니다)인, 제제.
  269. 제268항에 있어서, R이
    Figure 112009026592906-PCT00259
    또는
    Figure 112009026592906-PCT00260
    인, 제제.
  270. 제269항에 있어서, R1이 C10-C18 알킬 또는 C10-C30 알케닐인, 제제.
  271. 제268항에 있어서, R이
    Figure 112009026592906-PCT00261
    인, 제제.
  272. 제271항에 있어서, R1이 C10-C18 알킬 또는 C10-C30 알케닐이고 R2가 H인, 제제.
    [청구항 271]
    에탄올과 수성 NaOAc 완충액 중에서 다수의 지질 잔기들을 혼합하여 입자를 제공하고, 상기 입자에 상기 치료제를 첨가하여 회합 복합체를 형성하는 단계를 포함하는, 다수의 지질 잔기들과 치료제를 포함하는 회합 복합체의 제조 방법.
    [청구항 272]
    제271항에 있어서, 상기 지질 잔기들이 100% 에탄올의 용액 중에 제공되는, 방법.
  273. 제271항에 있어서, 상기 다수의 지질 잔기들이 양이온성 지질을 포함하는, 방법.
  274. 제273항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 제1항 또는 제213항의 지질인, 방법.
  275. 제274항에 있어서, 상기 양이온성 지질이
    Figure 112009026592906-PCT00262
    또는
    Figure 112009026592906-PCT00263
    중의 하나 또는 이들의 혼합물의 지질인, 방법.
  276. 제271항에 있어서, 상기 다수의 지질 잔기들이 PEG-지질을 포함하는, 방법.
  277. 제276항에 있어서, 상기 PEG-지질이 화학식
    Figure 112009026592906-PCT00264
    (여기서, L1 및 L2은 각각 독립적으로 결합 또는 C(O)이고; R1 및 R2는 각각 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 이들은 각각 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되고; X는 -C(O)NH-, C(S)NH, -C(O)C1- 3알킬C(O)NH- 또는 -C(O)C1- 3알킬C(O)O-이고; m은 0 내지 11의 정수이고; n은 1 내지 500의 정수이다)을 갖는, 방법.
  278. 제277항에 있어서, 상기 PEG-지질이
    Figure 112009026592906-PCT00265
    인, 방법.
  279. 제271항에 있어서, 상기 다수의 지질 잔기가 구조적 지질을 포함하는, 방법.
  280. 제279항에 있어서, 상기 구조적 지질이 콜레스테롤인, 방법.
  281. 제271항에 있어서, 상기 지질 함유 입자를 압출시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  282. 제271항에 있어서, 상기 지질 함유 입자가 치료제를 첨가하기 전에 압출되는, 방법.
  283. 제271항에 있어서, 상기 치료제가 핵산인, 방법.
  284. 제283항에 있어서, 상기 핵산이 siRNA인, 방법.
    [청구항 284]
    제283항에 있어서, 상기 핵산이 분해에 저항하도록 변성된 siRNA인, 방법.
  285. 제283항에 있어서, 상기 핵산이 폴리사카라이드 골격의 변성에 의해 변성된 siRNA인, 방법.
  286. 제283항에 있어서, siRNA가 지질친화성 잔기에 접합된, 방법.
  287. 제284항에 있어서, 상기 siRNA가 관심 유전자 또는 유전자들을 표적화하는, 방법.
  288. 제287항에 있어서, 상기 유전자 또는 유전자들이 간에서 내인성으로 발현되는 유전자인, 방법.
  289. 제288항에 있어서, 상기 관심 유전자가 apoB인, 방법.
  290. 제288항에 있어서, 상기 유전자가 FVII인, 방법.
  291. 제288항에 있어서, 상기 유전자가 PCSK9인, 방법.
  292. 제288항에 있어서, 상기 유전자가 VEGF인, 방법.
  293. 제288항에 있어서, 상기 유전자가 KSP(eg5)인, 방법.
  294. 제288항에 있어서, 상기 유전자가 헵시딘인, 방법.
  295. 제288항에 있어서, 상기 유전자가 HCV인, 방법.
  296. 제283항에 있어서, 상기 핵산이 단일 가닥 핵산 또는 이의 유도체인, 방법.
  297. 제296항에 있어서, 상기 핵산이 안티센스 핵산인, 방법.
  298. 제296항에 있어서, 상기 핵산이 마이크로RNA인, 방법.
  299. 제296항에 있어서, 상기 핵산이 안티마이크로RNA(안타고미르)인, 방법.
  300. 제271항에 있어서, 상기 회합 복합체가 양이온성 지질, 구조적 지질, PEG-지질 및 핵산을 포함하는, 방법.
  301. 제300항에 있어서, 상기 양이온성 지질, 구조적 지질, PEG-지질 및 핵산의 몰 비가 36 내지 48 : 42 내지 54 : 6 내지 14인, 방법.
  302. 제301항에 있어서, 상기 양이온성 지질, 구조적 지질, PEG-지질 및 핵산의 몰 비가 38 내지 46 : 44 내지 52 : 8 내지 12인, 방법.
  303. 제302항에 있어서, 상기 양이온성 지질, 구조적 지질, PEG-지질 및 핵산의 몰 비가 약 42:48:10인, 방법.
  304. 제271항에 있어서, 핵산에 대한 전체 부형제의 중량 비가 약 15:1 미만인, 방법.
  305. 제304항에 있어서, 핵산에 대한 전체 부형제의 중량 비가 약 10:1인, 방법.
  306. 제305항에 있어서, 핵산에 대한 전체 부형제의 중량 비가 약 7.5:1인, 방법.
  307. 제305항에 있어서, 핵산에 대한 전체 부형제의 중량 비가 약 5:1인, 방법.
  308. 제300항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 화학식
    Figure 112009026592906-PCT00266
    를 갖고, 상기 PEG-지질이 화학식
    Figure 112009026592906-PCT00267
    를 갖고, 상기 구조적 지질이 콜레스테롤인, 방법.
  309. 제308항에 있어서, 상기 양이온성 지질, 구조적 지질 및 PEG-지질의 몰 비가 38 내지 46 : 44 내지 52 : 8 내지 12인, 방법.
  310. 제309항에 있어서, 상기 양이온성 지질, 구조적 지질 및 PEG-지질의 몰 비가 약 42:48:10인, 방법.
    [청구항 310]
    제308항에 있어서, 핵산에 대한 전체 부형제의 중량 비가 약 15:1 미만인, 방법.
  311. 제310항에 있어서, 핵산에 대한 전체 부형제의 중량 비가 약 10:1인, 방법.
  312. 제310항에 있어서, 핵산에 대한 전체 부형제의 중량 비가 약 7.5:1인, 방법.
  313. 제310항에 있어서, 핵산에 대한 전체 부형제의 중량 비가 약 5:1인, 방법.
  314. 제271항 내지 제313항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, 회합 복합체.
  315. 양이온성 지질, 구조적 지질, PEG-지질 및 핵산을 포함하고, 여기서, 상기 양이온성 지질이 또는
    Figure 112009026592906-PCT00269
    중의 하나 또는 이들의 혼합물의 지질이고, 상기 PEG-지질이 화학식
    Figure 112009026592906-PCT00270
    를 갖고, 상기 구조적 지질이 콜레스테롤인, 회합 복합체.
  316. 제315항에 있어서, 상기 핵산이 siRNA인, 회합 복합체.
  317. 제315항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 화학식
    Figure 112009026592906-PCT00271
    를 갖는, 회합 복합체.
  318. 제315항에 있어서, 상기 양이온성 지질, 구조적 지질, PEG-지질 및 핵산의 몰 비가 36 내지 48 : 42 내지 54 : 6 내지 14인, 방법.
  319. 제318항에 있어서, 상기 양이온성 지질, 구조적 지질, PEG-지질 및 핵산의 몰 비가 38 내지 46 : 44 내지 52 : 8 내지 12인, 방법.
  320. 제319항에 있어서, 상기 양이온성 지질, 구조적 지질, PEG-지질 및 핵산의 몰 비가 약 42:48:10인, 방법.
  321. 제315항에 있어서, 핵산에 대한 전체 부형제의 중량 비가 약 15:1 미만인, 방법.
  322. 제321항에 있어서, 핵산에 대한 전체 부형제의 중량 비가 약 10:1인, 방법.
  323. 제321항에 있어서, 핵산에 대한 전체 부형제의 중량 비가 약 7.5:1인, 방법.
  324. 제321항에 있어서, 핵산에 대한 전체 부형제의 중량 비가 약 5:1인, 방법.
  325. 화학식 XV의 화합물.
    화학식 XV
    Figure 112009026592906-PCT00272
    위의 화학식 XV에서,
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 결합 또는 C(O)이고,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 이들은 각각 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되고,
    X는 -C(O)NH-, -C(S)NH, -C(O)C1- 3알킬C(O)NH- 또는 -C(O)C1- 3알킬C(O)O-이고,
    m은 0 내지 11의 정수이고,
    n은 1 내지 500의 정수이다.
  326. 제325항에 있어서, L1 및 L2가 둘 다 결합인, 화합물.
  327. 제325항에 있어서, L1 및 L2가 둘 다 C(O)인, 화합물.
  328. 제325항에 있어서, R1 및 R2가 각각 독립적으로 알킬인, 화합물.
  329. 제328항에 있어서, R1 및 R2가 각각 독립적으로 C6-C28 알킬, 예를 들면, C10-C18 알킬, 예를 들면, C14 알킬인, 화합물.
  330. 제325항에 있어서, R1 및 R2가 둘 다 알킬, 예를 들면, 동일한 길이를 갖는 직쇄 알킬, 예를 들면, C6-C28 알킬, 예를 들면, C10-C18 알킬, 예를 들면, C14 알킬 또는 C16 알킬인, 화합물.
  331. 제330항에 있어서, R1 및 R2가 둘 다 C14 알킬인, 화합물.
  332. 제325항에 있어서, 화학식 XV가 라세미 혼합물인, 화합물.
  333. 제325항에 있어서, 화학식 XV가 에난티오머적으로 순수한 'R' 이성체(예: 에난티오머 과량, 예를 들면, 약 95%ee 이상 또는 97%ee 미만, 98% 또는 99% 이상의 R 이성체를 갖는 화합물)인, 화합물.
  334. 제325항에 있어서, 화학식 XV가 에난티오머적으로 순수한 'S' 이성체(예: 에난티오머 과량, 예를 들면, 약 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 R 이성체를 갖는 화합물)인, 화합물.
  335. 제325항에 있어서, R1 및 R2가 각각 독립적으로 알케닐, 예를 들면, R1 및 R2 가 각각 독립적으로 C6-C30 알케닐이고, 또는 R1 및 R2가 각각 동일한 알케닐 잔기인, 화합물.
  336. 제335항에 있어서, R1 및 R2가 각각 단일 이중 결합, 예를 들면, E 또는 Z 배위의 단일 이중 결합을 포함하는, 화합물.
  337. 제335항에 있어서, R1 및 R2가 2개의 이중 결합 잔기를 포함하는, 화합물.
  338. 제325항에 있어서, X가 -C(O)NH-이고, 화학식 XV'
    Figure 112009026592906-PCT00273
    의 화합물을 제공하는, 화합물.
  339. 제325항에 있어서, X가 -C(O)C1- 3알킬C(O)O-인, 화합물.
  340. 제325항에 있어서, m이 1 내지 10의 정수, 예를 들면, 2 내지 4의 정수, 또는 2인, 화합물.
  341. 제325항에 있어서, n이 1 내지 500의 정수, 예를 들면, 40 내지 400의 정수, 100 내지 350의 정수, 40 내지 50의 정수, 또는 42 내지 47의 정수인, 화합물.
  342. 제325항에 있어서, 상기 화합물이 화학식 XV'
    Figure 112009026592906-PCT00274
    (여기서, L1 및 L2는 둘 다 결합이다)인, 화합물.
  343. 제342항에 있어서, R1 및 R2가 각각 독립적으로 알킬, 예를 들면, C6-C28 알킬, 예를 들면, C10-C18 알킬, 예를 들면, C14 알킬인, 화합물.
  344. 제343항에 있어서, R1 및 R2가 둘 다 알킬, 예를 들면, 동일한 길이를 갖는 직쇄 알킬, 예를 들면, C6-C28 알킬, 예를 들면, C10-C18 알킬, 예를 들면, C14 알킬 또는 C16 알킬인, 화합물.
  345. 제342항에 있어서, m이 1 내지 10의 정수, 예를 들면, 2 내지 4의 정수, 또는 2인, 화합물.
  346. 제342항에 있어서, n이 1 내지 500의 정수, 예를 들면, 40 내지 400, 또는 40 내지 50의 정수인, 화합물.
  347. 제342항에 있어서, L1 및 L2가 둘 다 결합이고, R1 및 R2가 둘 다 알킬(예: C6-C28 알킬, 예를 들면, C10-C18 알킬, 바람직하게는 C14 알킬)이고, n이 약 40 내지 400의 정수인, 화학식 XV'의 화합물.
  348. 제325항에 있어서, 상기 화합물이 화학식 XVI
    Figure 112009026592906-PCT00275
    (여기서, 반복되는 PEG 잔기는 평균 분자량이 2,000이고, n은 42 내지 47의 값이다)를 갖는, 화합물.
  349. 제348항에 있어서, 화학식 XVI의 화합물이 'R'의 바람직한 절대 배위를 갖는 입체 이성체인, 화합물(예를 들면, 에난티오머 과량, 예를 들면, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 R 이성체를 갖는 화합물).
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