KR20230096311A - 약물의 폐 전달용 나노입자 조성물 - Google Patents

약물의 폐 전달용 나노입자 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약물의 폐 전달용 나노입자 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 양친성 블록 공중합체에 의해 형성된 나노입자 내부에 음이온성 약물과 특정 지질의 복합체가 봉입된 형태의 약물-함유 나노입자를 포함함으로써 약물을 특정적으로 폐로 전달하기에 유용한 약물 전달용 조성물에 관한 것이다.

Description

약물의 폐 전달용 나노입자 조성물{Nanoparticle composition for drug delivery to lung}
본 발명은 약물의 폐 전달용 나노입자 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 양친성 블록 공중합체에 의해 형성된 나노입자 내부에 음이온성 약물과 특정 지질의 복합체가 봉입된 형태의 약물-함유 나노입자를 포함함으로써 약물을 특정적으로 폐로 전달하기에 유용한 약물 전달용 조성물에 관한 것이다.
핵산을 비롯한 음이온성 약물을 이용한 치료에 있어서, 안전하고 효율적인 약물 전달기술은 오랫동안 연구되어 왔으며, 다양한 전달체 및 전달기술이 개발되어 왔다. 전달체는 크게 아데노바이러스나 레트로바이러스 등을 이용한 바이러스성 전달체와 양이온성 지질 및 양이온성 고분자 등을 이용한 비바이러스성 전달체로 나뉜다. 바이러스성 전달체의 경우 비특이적 면역 반응 등의 위험성에 노출되어 있으며 생산 공정이 복잡하여 상용화하는 데 많은 문제점이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 최근 연구 방향은 비바이러스성 전달체를 이용하여 그 단점을 개선하는 방향으로 진행되고 있다. 비바이러스성 전달체는, 바이러스성 전달체에 비하여 생체 내 안전성의 측면에서 부작용이 적고, 경제성 측면에서 생산 가격이 저렴하다는 장점을 가지고 있다.
핵산 물질의 전달에 이용되는 비바이러스성 전달체로서 대표적인 것은 양이온성 지질을 이용한 양이온성 지질과 핵산의 복합체(lipoplex) 및 폴리양이온성(polycation) 고분자와 핵산의 복합체(polyplex)이다. 이러한 양이온성 지질 혹은 폴리양이온성 고분자는, 음이온성 약물과 정전기적 상호 작용을 통해 복합체를 형성함으로써 음이온성 약물을 안정화시키고, 세포 내 전달을 증가시킨다는 점에서 많은 연구가 진행되어 왔다(De Paula D, Bentley MV, Mahato RI, Hydrophobization and bioconjugation for enhanced siRNA delivery and targeting, RNA 13 (2007) 431-56; Gary DJ, Puri N, Won YY, Polymer-based siRNA delivery: Perspectives on the fundamental and phenomenological distinctions from polymer-based DNA delivery, J Control release 121 (2007) 64-73).
한편, 한국특허공개 제2003-0032897호는 다량의 난용성 약물을 가용화시키며, 수용액에서의 안정성이 우수한 혼합 고분자 나노입자 조성물을 제공하기 위하여, 친수성 블록과 소수성 블록으로 구성된 양친성 블록 공중합체 및, 카르복시산 말단기를 함유하는 폴리락트산 유도체를 포함하고, 체액 또는 수용액에서 고분자 나노입자를 형성할 수 있는 혼합 고분자 나노입자 조성물, 및 상기 혼합 고분자 나노입자 조성물로 이루어진 고분자 나노입자 내부에 난용성 약물이 포함된 약학적 조성물을 개시하고 있다.
본 발명의 목적은 약물을 특정적으로 폐로 전달하기에 유용한 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하고자 본 발명은, 약물-함유 나노입자를 포함하며, 상기 약물-함유 나노입자가 유효성분으로서 약물; 양친성 블록 공중합체; 및 하기 화학식 1로 표시되는 구조를 갖는 지질;을 포함하고, 상기 약물이 상기 지질과 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 상기 양친성 블록 공중합체가 형성하는 나노입자 구조체 내부에 봉입되어 있는 것인, 약물의 폐 전달용 나노입자 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서,
n은 1 내지 6의 정수이고,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수 12 내지 26개의 불포화 탄화수소기로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
일 구체예에서, 상기 화학식 1에서 n은 2 내지 4의 정수일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 화학식 1에서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -(C5-C12알킬렌)-CH=CH-(C5-C12알킬)일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 1에서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -(C6-C10알킬렌)-CH=CH-(C6-C10알킬)일 수 있다.
보다 더 구체적으로, 상기 화학식 1에서 R1 및 R2는 -(CH2)8CH=CH(CH2)7CH3일 수 있다.
보다 더 구체적으로, 상기 지질은 하기 구조를 갖는 것일 수 있다:
Figure pat00002
일 구체예에서, 상기 지질은, (1) 하기 화학식 a의 화합물을 메틸 아크릴레이트와 반응시켜 하기 화학식 b의 화합물을 얻는 단계; (2) 하기 화학식 b의 화합물을 하기 화학식 c-1의 화합물과 반응시키거나, 하기 화학식 c-1의 화합물 및 c-2의 화합물과 순차적으로 반응시켜, 각각 하기 화학식 d-1 또는 d-2의 화합물을 얻는 단계; 및 (3) 하기 화학식 d-1 또는 d-2의 화합물을 탈보호화하는 단계;를 포함하는 방법에 의하여 제조된 것일 수 있다:
[화학식 a]
Figure pat00003
[화학식 b]
Figure pat00004
[화학식 c-1]
R1-NH2
[화학식 c-2]
R2-NH2
[화학식 d-1]
Figure pat00005
[화학식 d-2]
Figure pat00006
상기에서,
P는 보호기이고,
n은 1 내지 6의 정수이고,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수 12 내지 26개의 불포화 탄화수소기로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
일 구체예에서, 상기 약물-함유 나노입자는 폴리락트산염을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은, 약물을 양친성 블록 공중합체에 의해 형성된 나노입자 내부에 봉입시킨 형태로 특정적으로 폐로 전달하기에 매우 유용하다.
도 1은 본 발명의 실시예에서 제조된 지질[2OA-PAMAM: 3,3'-((2-aminoethyl)azanediyl)bis(N-((Z)-octadec-9-en-1-yl)propanamide)의 NMR 데이터이다.
도 2는 본 발명의 시험예에서 수행된 약물 전달 실험 결과를 발광 측정 이미징 시스템으로 측정한 사진이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 조성물은 약물-함유 나노입자를 포함하며, 여기서 상기 약물-함유 나노입자는 유효성분으로서 약물; 양친성 블록 공중합체; 및 하기 화학식 1로 표시되는 구조를 갖는 지질;을 포함하고, 상기 약물이 상기 지질과 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 상기 양친성 블록 공중합체가 형성하는 나노입자 구조체 내부에 봉입되어 있는 것이다:
[화학식 1]
Figure pat00007
상기 화학식 1에서,
n은 1 내지 6의 정수이고, 보다 구체적으로는 2 내지 6의 정수이며,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수 12 내지 26개의 불포화 탄화수소기로 이루어진 군에서 선택된 것이고, 보다 구체적으로는 탄소수 14 내지 22개의 불포화 탄화수소기로 이루어진 군에서 선택된 것이며, 보다 더 구체적으로는 탄소수 16 내지 20개의 불포화 탄화수소기로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
일 구체예에서, 상기 화학식 1에서 n은 2 내지 4의 정수일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 화학식 1에서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -(C5-C12알킬렌)-CH=CH-(C5-C12알킬)일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 1에서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -(C6-C10알킬렌)-CH=CH-(C6-C10알킬)일 수 있다.
상기 “알킬렌” 및 “알킬”은 각각 독립적으로 비치환되거나, 치환된 것일 수 있으며, 이 때 치환기는, 예컨대, 히드록시기, 할로겐기 또는 C1-C4알킬기 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다,
보다 더 구체적으로, 상기 화학식 1에서 R1 및 R2는 -(CH2)8CH=CH(CH2)7CH3일 수 있다.
보다 더 구체적으로, 상기 지질은 하기 구조를 갖는 것일 수 있다:
Figure pat00008
일 구체예에서, 상기 지질은, (1) 하기 화학식 a의 화합물을 메틸 아크릴레이트와 반응시켜 하기 화학식 b의 화합물을 얻는 단계; (2) 하기 화학식 b의 화합물을 하기 화학식 c-1의 화합물과 반응시키거나, 하기 화학식 c-1의 화합물 및 c-2의 화합물과 순차적으로 반응시켜, 각각 하기 화학식 d-1 또는 d-2의 화합물을 얻는 단계; 및 (3) 하기 화학식 d-1 또는 d-2의 화합물을 탈보호화하는 단계;를 포함하는 방법에 의하여 제조된 것일 수 있다:
[화학식 a]
Figure pat00009
[화학식 b]
Figure pat00010
[화학식 c-1]
R1-NH2
[화학식 c-2]
R2-NH2
[화학식 d-1]
Figure pat00011
[화학식 d-2]
Figure pat00012
상기에서,
P는 보호기이고, 보다 구체적으로는 t-부톡시카르보닐기(t-BOC)이며,
n, R1 및 R2는 상기 화학식 1에서 정의된 바와 같다.
상기 지질 제조방법의 전체 합성 개요를 예시적으로 나타내면 다음과 같다:
Figure pat00013
일 구체예에서, 상기 약물-함유 나노입자는 폴리락트산염을 더 포함하며, 상기 복합체가 상기 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염이 형성하는 나노입자 구조체 내부에 봉입되어 있는 것일 수 있다.
상기 나노입자에서, 수성 환경에서는 양친성 블록 공중합체의 친수성 부분이 나노입자의 외벽을 형성하고, 양친성 블록 공중합체의 소수성 부분이 (폴리락트산염이 추가 함유된 경우, 이와 함께) 나노입자의 내벽을 형성하며, 그 형성된 나노입자의 내부에 약물과 상기 지질의 복합체가 봉입될 수 있다. 이러한 나노입자 구조는, 혈중 또는 체액 내에서 유효성분의 안정성을 향상시킨다.
일 구체예에서, 상기 약물은 핵산, 폴리펩티드, 바이러스 또는 이들의 조합으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 “핵산”은, 예를 들어, DNA, RNA, siRNA, shRNA, miRNA, mRNA, 앱타머, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 “폴리펩티드”는 항체 또는 이의 절편, 시토킨, 호르몬 또는 그 유사체와 같은 체내에 활성을 갖는 단백질, 또는 항원, 이의 유사체 또는 전구체의 폴리펩티드 서열을 포함하여, 체내에서 일련의 과정을 통해 항원으로 인식될 수 있는 단백질을 의미할 수 있다.
일 예에서, 상기 나노입자의 입자 크기는 Z-평균 값으로 정의될 수 있고, 예컨대, 800 nm 이하, 600 nm 이하, 500 nm 이하, 400 nm 이하, 300 nm 이하, 200 nm 이하 또는 150 nm 이하일 수 있으며, 또한 10 nm 이상, 50 nm 이상, 또는 100 nm 이상일 수 있다. 일 구체예에서, Z-평균 값으로 정의된 상기 나노입자의 입자 크기는, 예를 들어, 10 내지 800 nm, 20 내지 600 nm, 30 내지 500 nm, 50 내지 400 nm, 또는 80 내지 300 nm, 일 수 있다.
상기 “Z-평균”은 동적빛산란(Dynamic light scattering, DSL)을 이용하여 측정한 입자 분포의 유체학적 지름(hydrodynamic diameter)의 평균을 의미할 수 있다. 상기 나노입자는 단순분산 입자 분포(monodisperse particle distribution)를 갖는 것으로서, 그 다분산도 지수(polydispersity index)는, 예컨대, 0.01 내지 0.50, 0.05 내지 0. 455, 또는 0.1 내지 0.40일 수 있다.
또한, 일 예에서, 상기 나노입자의 표면 전하는, 예컨대, 0 mV 이상, 1 mV 이상, 5 mV 이상 또는 10 mV 이상일 수 있고, 또한 80 mV 이하, 70 mV 이하, 또는 60 mV 이하 일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 나노입자의 표면 전하는, 예를 들어, 0 내지 80 mV, 1 내지 70 mV, 또는 5 내지 60 mV일 수 있다. 상기 표면 전하는 생물학적 환경에 가까운 환경에서 측정된 것일 수 있고, 예를 들어, 8 내지 12 mM HEPES 완충액(pH 7.0 내지 7.5)에서 측정될 수 있다.
나노입자의 입자 크기 및 표면 전하가 상기 수준을 유지할 경우, 나노입자 구조의 안정성 및 구성성분들의 함량과 체내에서 흡수도 및 약제학적 조성물로서 멸균의 편의성 측면에서 바람직하다. 예를 들어, 상기 유효성분이 핵산인 경우, 상기 핵산의 하나 이상의 말단은 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식될 수 있다. 상기 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산에는 콜레스테롤, 토코페롤 및 지방산의 각 유사체, 유도체, 및 대사체가 포함된다.
일 구체예에서, 상기 유효성분은, 상기 유효성분이 RNA인 경우, 전체 나노입자 중량을 기준으로, 예를 들어, 0.05 내지 30 중량%, 0.1 내지 25 중량%, 0.25 내지 20 중량%, 0.5 내지 15 중량%, 1 내지 10 중량%, 또는 1 내지 5 중량%일 수 있다. 유효성분의 함량이 전체 조성물의 중량을 기준으로 상기 범위보다 적으면 약물에 비하여 사용되는 전달체의 양이 너무 많아서 오히려 전달체에 의한 부작용이 있을 수 있고, 상기 범위를 초과하면, 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
일 구체예에서, 조성물 내의 상기 지질 함량은, 유효성분 1 중량부를 기준으로, 예컨대, 500 중량부 이하, 400 중량부 이하, 300 중량부 이하, 200 중량부 이하, 100 중량부 이하, 80 중량부 이하, 또는 60 중량부 이하일 수 있고, 또한 1 중량부 이상, 2 중량부 이상, 23 중량부 이상, 4 중량부 이상 또는 5 중량부 이상일 수 있다. 일 구체예에서, 조성물 내의 상기 지질의 함량은, 유효성분 1 중량부를 기준으로, 1 내지 500 중량부, 2 내지 400 중량부, 3 내지 300 중량부, 4 내지 200 중량부, 또는 5 내지 80 중량부일 수 있다. 조성물 내의 상기 지질의 함량이 상기 범위 미만이면 유효성분과 안정한 복합체를 형성하지 못할 수 있고, 상기 범위를 초과하면 나노입자의 크기가 너무 커져 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
상기 유효성분이 핵산인 경우, 상기 지질과 핵산은 정전기적 상호작용을 통해 결합하여 복합체를 형성한다. 일 구체예에서, 상기 핵산(P)과 지질(N)의 전하량의 비율(N/P; 핵산의 음이온 전하에 대한 지질의 양이온 전하 비율)은, 0.5 이상, 1 이상, 2 이상 또는 5 이상일 수 있고, 또한 200 이하, 150 이하, 100 이하 또는 60 이하일 수 있으며, 예를 들어, 0.5 내지 200, 1 내지 150, 2 내지 100, 또는 5 내지 60일 수 있다. 상기 비율(N/P)이 상기 범위 미만인 경우에는 충분한 양의 핵산을 포함하는 복합체를 형성하기 어려울 수 있는 반면, 상기 비율(N/P)이 상기 범위를 초과할 시에는 독성을 유발할 우려가 있다. 또한, N/P 값은 유효성분이 비장에서 특이적으로 발현하는데 중요하게 작용할 수 있다.
구체적인 일 태양에서, 상기 양친성 블록 공중합체는, 친수성 A 블록 및 소수성 B 블록을 포함하는 A-B 형 블록 공중합체일 수 있다. 상기 A-B 형 블록 공중합체는, 수용액 상에서, 소수성 B 블록이 코어(내벽)를 형성하고 친수성 A 블록이 쉘(외벽)을 형성하는 코어-쉘 타입의 고분자 나노입자를 형성한다.
일 구체예에서, 상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드 및 그 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 친수성 A 블록은 모노메톡시폴리에틸렌클리콜(mPEG), 모노아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 친수성 A 블록의 수평균분자량(g/mol)은 200 이상, 500 이상, 1,000 이상 또는 2,000 이상일 수 있고, 또한, 50,000 이하, 20,000 이하, 10,000 이하 또는 5,000 이하일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 필요에 따라, 상기 친수성 A 블록의 말단에 특정 조직이나 세포에 도달할 수 있는 작용기, 리간드, 또는 세포내 전달을 촉진할 수 있는 작용기를 화학적으로 결합시켜 양친성 블록 공중합체와 폴리락트산염으로 형성된 고분자 나노입자 전달체의 체내 분포를 조절하거나 상기 나노입자 전달체가 세포 내로 전달되는 효율을 높일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 작용기나 리간드는 단당류, 다당류, 비타민, 펩타이드, 단백질 및 세포 표면 수용체에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 작용기나 리간드는 아니사마이드(anisamide), 비타민 B9(엽산), 비타민 B12, 비타민A, 갈락토오스, 락토오스, 만노오스, 히알루론산, RGD 펩타이드, NGR 펩타이드, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체에 대한 항체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 소수성 B 블록은 생체적합성 생분해성 고분자로서, 일 구체예에서, 이는 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 소수성 B 블록은 폴리락타이드(PLA), 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리락타이드와 글리콜라이드의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리디옥산-2-온의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리카프로락톤의 공중합체 및 폴리글리콜라이드와 폴리카프로락톤의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 소수성 B 블록의 수평균분자량(g/mol)은 200 이상, 500 이상, 1,000 이상 또는 1,700 이상일 수 있고, 또한, 50,000 이하, 20,000 이하, 10,000 이하 또는 6,000 이하일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
예컨대, 상기 친수성 A 블록-소수성 B 블록의 수평균분자량 조합은 2,000-6,000, 2,000-4,000, 2,000-3,000, 2,000-1,700 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 일 구체예에서, 상기 소수성 B 블록은, 소수성 B 블록의 소수성을 증가시켜 나노입자의 안정성을 향상시키기 위하여, 소수성 B 블록 말단의 히드록시기에 토코페롤, 콜레스테롤, 또는 탄소수 10 내지 24개의 지방산을 화학적으로 결합시키는 것에 의하여 수식된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리락트산염은 나노입자의 코어(내벽)에 분포하여 코어의 소수성을 강화시켜 나노입자를 안정시킴과 동시에 체내에서 세망내피계(RES)를 효과적으로 회피하는 역할을 한다. 즉, 폴리락트산염의 카르복실산 음이온이 폴리락트산보다 효과적으로 양이온성 복합체와 결합하여 고분자 나노입자의 표면전위를 감소시켜 폴리락트산염을 포함하지 않는 고분자 나노입자에 비해 표면전위의 양성 전하가 감소하여 세망내피계에 의해 덜 포획되고, 이로 인하여 목적하는 부위(예컨대, 암세포, 염증세포 등)로의 전달 효율이 우수하다는 장점이 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리락트산염은 수평균분자량(g/mol)은 500 내지 50,000일 수 있고, 보다 구체적으로는 1,000 내지 10,000일 수 있다. 폴리락트산염의 수평균분자량이 500 미만이면 소수성이 너무 낮아 나노입자의 코어(내벽)에 존재하기 어려울 수 있고, 50,000을 초과하면 고분자 나노입자의 입자가 커지는 문제가 있을 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리락트산염(예컨대, 폴리락트산나트륨염)의 말단 중 카르복실산금속(예컨대, 카르복실산나트륨)의 반대편의 말단은, 히드록시, 아세톡시, 벤조일옥시, 데카노일옥시, 팔미토일옥시 및 탄소수 1 내지 2개의 알콕시로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나로 치환될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리락트산염은 하기 화학식 2 내지 7의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다(여기서 “COO”는 카르복실기, 즉 “C(=O)O”를 의미한다):
[화학식 2]
RO-CHZ-[A]m-[B]n-COOM
상기 식 2에서, A는 -COO-CHZ-이고; B는 -COO-CHY-, -COO-CH2CH2CH2CH2CH2- 또는 -COO-CH2CH2OCH2-이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸, 또는 에틸기이고; Z와 Y는 각각 수소원자, 또는 메틸 또는 페닐기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; n은 1 내지 30의 정수이며; m은 0 내지 20의 정수이다;
[화학식 3]
RO-CHZ-[COO-CHX]p-[COO-CHY']q-COO-CHZ-COOM
상기 식 3에서, X는 메틸기이고; Y'는 수소원자 또는 페닐기이며; p는 0 내지 25의 정수이고, q는 0 내지 25의 정수이되, 단 p+q는 5 내지 25의 정수이고; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; Z 는 수소 원자, 메틸 또는 페닐기이다;
[화학식 4]
RO-PAD-COO-W-M'
상기 식 4에서, W-M'는
Figure pat00014
또는
Figure pat00015
이고; PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체 및 D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이고; M은 독립적으로 Na, K, 또는 Li이다;
[화학식 5]
S-O-PAD-COO-Q
상기 식 5에서, S는
Figure pat00016
이고; L은 -NR1- 또는 -0-이며, 여기서 R1은 수소원자 또는 C1-10알킬이고; Q는 CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2CH2CH3, 또는 CH2C6H5이고; a는 0 내지 4의 정수이며; b는 1 내지 10의 정수이고; M은 Na, K, 또는 Li이며; PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체, 및 D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이다;
[화학식 6]
Figure pat00017
또는
Figure pat00018
상기 식 6에서, R'는 -PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM이고, 여기서 PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체, D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이고, M은 Na, K, 또는 Li이며; a는 1 내지 4의 정수이다;
[화학식 7]
YO-[-C(O)-(CHX)a-O-]m-C(O)-R-C(O)-[-O-(CHX')b-C(O)-]n-OZ
상기 식 7에서, X 및 X'은 독립적으로 수소, 탄소수가 1~10인 알킬 또는 탄소수가 6~20인 아릴이고; Y 및 Z는 독립적으로 Na, K, 또는 Li이며; m 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이되, 5 < m + n < 100이고; a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며; R은 -(CH2)k-, 탄소수가 2~10인 2가 알케닐(divalent alkenyl), 탄소수가 6~20인 2가 아릴(divalent aryl) 또는 이들의 조합이고, 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.
일 구체예에서, 상기 폴리락트산염은 상기 화학식 2 또는 화학식 3의 화합물일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 나노입자는, 약물(예컨대, mRNA)의 세포 내 전달 효율을 증가시키기 위하여, 융합성 지질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 융합성 지질은 약물(예컨대, mRNA)과 상기 지질의 복합체에 혼합시, 소수성 상호작용으로 결합하여 약물(예컨대, mRNA)/상기 지질/융합성 지질의 복합체를 형성하고, 상기 융합성 지질을 포함하는 복합체는 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입된다.
보다 구체적으로, 상기 인지질은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamin, PE), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딘산(phosphatidic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamin, PE), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딘산은 하나 또는 2 개의 C10-24 지방산과 결합된 형태일 수 있다. 상기 콜레스테롤 및 토코페롤에는 콜레스테롤 및 토코페롤의 각 유사체, 유도체, 및 대사체가 포함된다.
보다 더 구체적으로, 상기 융합성 지질은 디라우로일 포스파티딜에탄올아민(dilauroyl phosphatidylethanolamine), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민(dimyristoyl phosphatidylethanolamine), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(dipalmitoyl phosphatidylethanolamine), 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(distearoyl phosphatidylethanolamine), 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine, DOPE), 디팔미토올레오일 포스포에탄올아민(1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPPE), 디리놀레오일 포스파티딜에탄올아민(dilinoleoyl phosphatidylethanolamine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜에탄올아민(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylethanolamine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜에탄올아민(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylethanolamine), 디팔미토올레오일 포스포콜린(1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 디올레오일 포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 디라우로일 포스파티딜콜린(dilauroyl phosphatidylcholine), 디미리스토일 포스파티딜콜린(dimyristoyl phosphatidylcholine), 디팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine), 디스테아로일 포스파티딜콜린(distearoyl phosphatidylcholine), 디올레오일 포스파티딜콜린(dioleoyl phosphatidylcholine), 디리놀레오일 포스파티딜콜린(dilinoleoyl phosphatidylcholine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜콜린(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylcholine), 디라우로일 포스파티딘산(dilauroyl phosphatidic acid), 디미리스토일 포스파티딘산(dimyristoyl phosphatidic acid), 디팔미토일 포스파티딘산(dipalmitoyl phosphatidic acid), 디스테아로일 포스파티딘산(distearoyl phosphatidic acid), 디올레오일 포스파티딘산(dioleoyl phosphatidic acid), 디리놀레오일 포스파티딘산(dilinoleoyl phosphatidic acid), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딘산(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidic acid), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딘산(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidic acid), 콜레스테롤 및 토코페롤로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다.
보다 더 구체적으로, 상기 융합성 지질은 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine, DOPE), 디팔미토올레오일 포스포콜린(1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 디올레오일 포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 디스테로일포스파티딜콜린(Distearoylphosphatidylcholine, DSPC) 및 디팔미토올레오일 포스포에탄올아민(1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPPE)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 양친성 블록 공중합체의 사용량은, 상기 지질 1 중량부를 기준으로, 1 내지 500 중량부, 1 내지 400 중량부, 1 내지 300 중량부, , 2 내지 500 중량부, 2 내지 400 중량부, 2 내지 300 중량부, 3 내지 500 중량부, 3 내지 400 중량부, 3 내지 300 중량부, 4 내지 500 중량부, 4 내지 400 중량부, 또는 4 내지 300 중량부일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리락트산염의 사용량은, 상기 지질 1 중량부를 기준으로, 0.1 내지 100 중량부, 0.1 내지 80 중량부, 0.1 내지 50 중량부, 0.1 내지 30 중량부, 0.1 내지 10 중량부, 0.1 내지 5 중량부, 0.5 내지 100 중량부, 0.5 내지 80 중량부, 0.5 내지 50 중량부, 0.5 내지 30 중량부, 1 내지 100 중량부, 1 내지 80 중량부, 1 내지 50 중량부, 1 내지 30 중량부, 2 내지 100 중량부, 2 내지 80 중량부, 2 내지 50 중량부, 또는 2 내지 30 중량부일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 수성 용액, 수혼화성 유기용매 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 상기 “수성 용액”은 수용액과 같은 의미로 사용될 수 있고, 예를 들어, 물, 멸균정제수, 완충액, 주사액 등을 의미할 수 있으며, 유기산을 더 포함한 완충액일 수도 있다. 상기 수성 용액은 예를 들어, 시트르산 완충액, PBS 완충액 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 “수혼화성 유기용매”는 C1 내지 C4의 저급 알코올, 아세톤, 아세토니트릴, 이의 수혼합물 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 유효성분의 안정성을 향상시키는데 적절한 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 안정화제는, pH 조절제, 무기염, 당류, 계면활성제, 킬레이트제 등을 더 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 “당류”는 단당류, 이당류, 이들의 환원당인 당알코올, 단일 또는 혼합된 다수 당의 폴리머 등을 의미할 수 있고, 상기 다당류는 3당류 이상 당류를 의미할 수 있다. 상기 단당류는, 예를 들어, 만노스, 글루코스, 아라비노스, 프럭토스, 갈락토스 등이 있고; 상기 이당류로는, 수크로스, 트레할로스, 말토스, 락토스, 셀로비오스, 겐티오비오스, 이소말토스, 멜리보우스 등이 있고; 상기 당알코올은 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨 등이 있고; 상기 다당류로는, 라피노스, 덱스트란, 전분, 히드록시에틸 전분, 시클로덱스트린, 셀룰로스, 헤타스타치, 올리고당이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 “pH 조절제”는 트리스(Tris), 글라이신, 히스티딘, 글루타메이트, 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 아스파르테이트 또는 이들의 조합일 수 있고, 상기 “계면활성제”는 나트륨 라우릴 술페이트, 디옥틸 나트륨 술포숙시네이트, 디옥틸나트륨 술포네이트, 케노데옥시콜산, N-라우로일사르코신 나트륨염, 리튬 도데실 술페이트, 1-옥탄술폰산 나트륨염, 나트륨 콜레이트 수화물, 나트륨 데옥시콜레이트, 글리코데옥시콜산 나트륨염, 벤즈알코늄 클로라이드, 트리톤(Triton) X-100, 트리톤 X-114, 라우로마크로골(lauromacrogol) 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리소르베이트 20, 40, 60, 65 및 80 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 “킬레이트제”는 구연산, 폴리페놀릭산, EDTA, DTPA, EDDHA 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 “무기염”은 1가 또는 2가 금속의 염을 의미하는 것으로서, NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, MgSO4, CaSO4, CaCO3, MgCO3 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 자세하게 설명하나, 이들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 이들에 의하여 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
화학식 1의 지질(2OA-PAMAM)의 합성
(1) 디메틸 3,3'-((2-((tert-부톡시카보닐)아미노)에틸)아잔디일)디프로피오네이트(dimethyl 3,3'-((2-((tert-butoxycarbonyl)amino)ethyl)azanediyl)dipropionate, Boc-2MeO-PAMAM )의 제조
[Boc-2MeO-PAMAM]
Figure pat00019
100 mL 3구 둥근 바닥 플라스크(RBF)(반응기 1)에 N-tert-부톡시카보닐(N-Boc) 에틸렌디아민(ethylenediamine)(4 g, 24.97 mmol, 1 eq) 및 메탄올(MeOH)(30 mL)을 첨가하고, 0℃로 냉각한 후. 메틸 아크릴레이트(8.60 g, 99.87 mmol, 4 eq)를 반응기 1에 적가하였다. 그런 다음, 상온에서 24시간 교반하고, 진공으로 농축하였다[수득률: 8.25 g (99%)].
(2) tert-부틸(2-(비스(3-(((Z)-옥타데크-9-엔-1-일)아미노)-3-옥소프로필)아미노)에틸)카바메이트(tert-butyl (2-(bis(3-(((Z)-octadec-9-en-1-yl)amino)-3-oxopropyl)amino)ethyl)carbamate), Boc-2OA-PAMAM )의 제조
[Boc-2OA-PAMAM]
Figure pat00020
100 mL 3구 둥근 바닥 플라스크(RBF)(반응기 1)에 상기 (1)에서 제조된 Boc-2MeO-PAMAM(4 g, 12.04 mmol, 1 eq) 및 올레일아민(oleylamine)(9.66 g, 36.12 mmol, 3 eq)을 첨가하고, 80℃에서 6일 동안 교반하여 반응하였다. 그런 다음, 실리카겔 컬럼을 이용해 전개용매를 에틸 아세테이트(EA) 100%부터 EA:MeOH (20:1)로 변화시키면서 정제하였다[수득률: 4.6 g (48%)].
(3) 3,3'-((2-아미노에틸)아자네다이일)비스(N-((Z)-옥타데크-9-엔-1-일)프로판아미드) (3,3'-((2-aminoethyl)azanediyl)bis(N-((Z)-octadec-9-en-1-yl)propanamide)), 2OA-PAMAM )의 제조
[2OA-PAMAM]
Figure pat00021
100 mL 3구 둥근 바닥 플라스크(RBF)(반응기 1)에 상기 (2)에서 제조된 Boc-2OA-PAMAM (2.2 g, 2.74 mmol, 1 eq) 및 디클로로메탄(MC)(18 mL)을 첨가하고 0℃로 냉각하였다. 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)(2 mL)을 반응기 1에 적가한 후, 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 그런 다음 MC(200 mL)로 희석 후, NaHCO3 포화 수용액(200 mL)로 3회 추출하였다. 유기층을 취하여, Na2SO4로 수분을 제거한 후, 용매를 증발시켰다. 그런 다음, 실리카겔 컬럼을 이용해 전개용매를 EA:MeOH(1:2)로 하여 최종물질을 정제하였다[]. 수득된 최종물질의 NMR 데이터를 도 1에 나타내었다[수득률: 0.79g (41%)].
조성물의 제조 및 폐 전달 시험
(1) 성분별 용액 준비
하기 표 1에 나타낸 성분들을 각 희석 용매로 용해하여 하기 표 1에 나타낸 농도로 준비하였다. 녹일 때는 초음파 발생기(bath sonicator)를 약 5-10분간 사용하였고, 육안으로 미용해된 입자가 없는 것을 확인한 후, 사용하였다. 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine, DOPE) 및 콜레스테롤(cholesterol)의 경우 65℃오븐에서 약 5분 정도 인큐베이션(incubation)하여, 육안으로 미용해 침전이 없는 것을 확인 후 실험에 사용하였다.
[표 1]
Figure pat00022
(2) 조성물 제조
N/P 비율(지질 성분의 아민기/mRNA의 포스페이트기) 20에 맞추어 2OA-PAMAM:mPEG-PLA(2K-4K):DOPE:콜레스테롤 = 5:5:1:4 의 비율에 맞추어 성분들의 필요량을 혼합하였다(N/P 비율 10에 대해서도 마찬가지로 수행하였다). 에탄올 층에는 모든 성분들의 분자 합이 6.25-12.5 mM로 존재하도록 에탄올을 추가하고, 수상(aqueous phase)과 에탄올상(ethanol phase)은 3:1의 비를 유지하여 혼합하였다. 혼합 후 전체 에탄올 함량을 낮추기 위해 전체의 20배를 PBS로 희석한 뒤, Amicon-Ultra tube filter(Merk Millipore, UFC505096 또는 UFC805024, 공극 크기(pore size): 50K, 부피: 0.5 mL 또는 4 mL)를 사용하여 농축하였다. 수상에 사용되는 완충액(buffer)은 20 mM 초산나트륨 완충액(sodium acetate buffer)(pH 4.6)을 사용하였다. (이는, 3M 초산나트륨 완충액을 20 mM로 희석하고 1M HCl를 이용하여 pH 4.6으로 적정(titration)하여 준비하였다.) 보다 구체적인 조성물 제조 과정은 다음과 같다:
1) 멸균 튜브(autoclaved tube) 두 개를 준비하였다(튜브 (A), (B)).
2) 튜브 (A)에 실험 조건에 따라 계산된 몰 수의 2OA-PAMAM 및 DOPE, 콜레스테롤, mPEG-PLA(2K-4K)를 차례대로 첨가하고, 볼텍싱(voltexing)하여 섞어주었다.
3) 에탄올상에는 모든 성분들의 분자 합이 12.5 mM 이내로 존재하도록, 필요시 에탄올을 추가하였다(mPEG-PLA의 경우, 최소 3% 이상의 물이 존재하여야 완전히 용해되므로, 에탄올 첨가 후 용액이 탁해지면 물을 최소량 첨가하여 용해시켰다).
4) 튜브 (B)에 mRNA와 20 mM 초산나트륨 완충액(pH 4.6)을 섞어주었다. 그때 비율은 수상이 에탄올상의 총 3배가 되도록 계산하여 첨가하였다.
5) 튜브 (B)의 용액을 튜브 (A)로 옮겨 섞어주었다. 이때, 최대한 빠르게 섞어주어 제형이 고르게 만들어질 수 있도록 하고, 이후 볼텍싱하여 섞어주었다.
6) 만들어진 제형을 총 부피 20배의 PBS에 첨가하여 에탄올 함량이 5% 이하가 되도록 희석하였다.
7) 희석 후 용도에 따라 원하는 부피로 농축될 때까지 Amicon Ultra Centrifugal Filter Units(50K)로 원심분리(centrifuge)해 주었다.
(3) 조성물 투여
위의 방법대로 제조된 제형을 mRNA 기준 2μg/200μL로 준비하고, 이를 마우스에 정맥투여하였다. 4시간 후, 멸균수(sterile water)에 용해되어 있는 루시페린(luciferin)을 15 μg/μL로 준비하여 20g 마우스 기준 개체 당 3mg의 루시페린이 투여되도록 복강 투여한다. 루시페린 복강 투여 15분 후 발광 측정 이미징 시스템으로 단백질 발현 결과를 측정하여 도 2에 나타내었다.
도 2로부터 확인되듯이, 본 발명에 따른 약물-함유 나노입자 제형은 정맥 투여시 폐로의 전달 효율이 매우 우수하였다.
한편, 비교예로서 SM102(Heptadecan-9-yl 8-((2-hydroxyethyl) (6-oxo-6-(undecyloxy)hexyl) amino) octanoate, SINOPEG에서 구매) 및 D-Lin-MC3-DMA(dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyrate, MedChemExpress에서 구매)를 이용하여 LNP를 제조한 후 실시예와 동일한 양의 mRNA(2μg/200μL)를 마우스에 정맥투여하고, 4시간 후, 상기 실시예와 동일한 방법으로 이미징한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2로부터 확인되듯이, 비교예 제형들은 정맥 투여시 간으로 전달되었다.

Claims (8)

  1. 약물-함유 나노입자를 포함하며,
    상기 약물-함유 나노입자가 유효성분으로서 약물; 양친성 블록 공중합체; 및 하기 화학식 1로 표시되는 구조를 갖는 지질;을 포함하고,
    상기 약물이 상기 지질과 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 상기 양친성 블록 공중합체가 형성하는 나노입자 구조체 내부에 봉입되어 있는 것인,
    약물의 폐 전달용 나노입자 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00023

    상기 화학식 1에서,
    n은 1 내지 6의 정수이고,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수 12 내지 26개의 불포화 탄화수소기로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
  2. 제1항에 있어서, n은 2 내지 4의 정수인, 약물의 폐 전달용 나노입자 조성물.
  3. 제1항에 있어서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 -(C5-C12알킬렌)-CH=CH-(C5-C12알킬)인, 약물의 폐 전달용 나노입자 조성물.
  4. 제1항에 있어서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 -(C6-C10알킬렌)-CH=CH-(C6-C10알킬)인, 약물의 폐 전달용 나노입자 조성물.
  5. 제1항에 있어서, R1 및 R2는 -(CH2)8CH=CH(CH2)7CH3인, 약물의 폐 전달용 나노입자 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 지질이 하기 구조를 갖는 것인, 약물의 폐 전달용 나노입자 조성물:
    Figure pat00024
  7. 제1항에 있어서, 지질이, (1) 하기 화학식 a의 화합물을 메틸 아크릴레이트와 반응시켜 하기 화학식 b의 화합물을 얻는 단계; (2) 하기 화학식 b의 화합물을 하기 화학식 c-1의 화합물과 반응시키거나, 하기 화학식 c-1의 화합물 및 c-2의 화합물과 순차적으로 반응시켜, 각각 하기 화학식 d-1 또는 d-2의 화합물을 얻는 단계; 및 (3) 하기 화학식 d-1 또는 d-2의 화합물을 탈보호화하는 단계;를 포함하는 방법에 의하여 제조된 것인, 약물의 폐 전달용 나노입자 조성물:
    [화학식 a]
    Figure pat00025

    [화학식 b]
    Figure pat00026

    [화학식 c-1]
    R1-NH2
    [화학식 c-2]
    R2-NH2
    [화학식 d-1]
    Figure pat00027

    [화학식 d-2]
    Figure pat00028

    상기에서,
    P는 보호기이고,
    n은 1 내지 6의 정수이고,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수 12 내지 26개의 불포화 탄화수소기로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 약물-함유 나노입자가 폴리락트산염을 더 포함하는, 약물의 폐 전달용 나노입자 조성물.
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