KR20060098340A - 푸린계 물질 생산균 및 푸린계 물질의 제조법 - Google Patents

푸린계 물질 생산균 및 푸린계 물질의 제조법 Download PDF

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Abstract

푸린뉴클레오시드 및/또는 푸린뉴클레오티드 등의 푸린계 물질의 발효 생산의 효율을 향상시킨다.
푸린계 물질 생산능을 가지며, 산화적 펜토스-인산 경로의 효소 활성을 증강시킨 바실러스(Bacillus) 속 세균 배지 중에서 배양하고, 당해 배지중 또는 균체내에 푸린계 물질을 생성 축적시키고, 동 배지중 또는 균체내로부터 푸린계 물질을 회수함으로써, 푸린계 물질을 제조한다.
푸린뉴클레오시드, 푸린뉴클레오티드, 푸린계 물질, 바실러스, 산화적 펜토스 인산 경로

Description

푸린계 물질 생산균 및 푸린계 물질의 제조법{Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance}
도 1은 푸린오페론의 구조를 도시한 도면이다. 박스로 둘러싼 서열은 푸린오페론 프로모터, 위에 실선으로 나타낸 서열은 안티터미네이터 2분(antiterminator dyad), 아래 파선으로 나타낸 서열은 터미네이터 2분(terminator dyad)이다. 결손된 서열(75bp)을 대문자로 나타내고 있다.
도 2은 각 개변형 푸린오페론의 프로모터의 전사 활성을 도시한 도면이다. WT는 KMBS296의 활성을 나타내고, ΔRpurR은 KMBS295의 활성을 나타내고, ΔR+Ppur1은 KMBS296의 활성을 나타내고, ΔR+Ppur3은 KMBS297의 활성을 나타내고, ΔR+Ppur5는 KMBS298의 활성을 나타내고, ΔR+Ppur-Δatts는 KMBS299의 활성을 나타내고, ΔR+Ppur1-Δatt는 KMBS300의 활성을 나타낸다.
본 발명은 5'-이노신산 및 5'-구아닐산이 대표적인 푸린뉴클레오티드 및 이들의 합성 원료로서 중요한 물질인 이노신 및 구아노신 등의 푸린뉴클레오시드 등의 푸린계 물질의 제조법에 사용되는 바실러스(Bacillus) 속 세균에 관한 것이다. 푸린계 물질은 조미료, 의약 및 이들의 원료 등으로서 유용하다.
발효법에 의한 이노신 및 구아노신의 생산에 관해서는, 아데닌 요구주 또는 추가로 푸린 동족체를 비롯한 각종 약제에 대한 내성을 부여한 바실러스속 미생물[참조: 특허문헌 1 내지 8], 및 브레비박테리움속의 미생물[참조: 특허문헌 9, 10 또는 비특허문헌 1] 등을 사용하는 방법이 공지되어 있다.
이러한 변이주를 취득하기 위해서는, 종래, 자외선 조사나 니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) 처리 등의 변이-유발 처리를 실시하여, 적당한 선택 배지를 사용하여 목적으로 하는 변이주를 취득하는 방법이 수행되어 왔다.
한편, 유전자 공학 기술을 사용한 푸린계 물질 생산주의 육종도 바실러스속의 미생물[참조: 특허문헌 11 내지 20], 브레비박테리움속의 미생물[참조: 특허문헌 21], 및 에세리키아속의 미생물[참조: 특허문헌 22]로 이루어지고 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 푸린오페론의 리프레서(repressor) 단백질 유전자(purR)가 파괴된 바실러스속 세균을 사용하여, 히포크산틴, 우라실, 구아닌 및 아데닌 등의 핵산계 물질을 효율적으로 제조하는 방법[참조: 특허문헌 23]이 개시되어 있다.
바실러스·서브틸리스에서는, 상기 리프레서 단백질은 푸린오페론의 유전자군 이외에, AMP 생합성에 관여하는 purA 유전자[참조: 비특허문헌 2], 포르밀테트 라하이드로엽산 생합성에 관여하는 glyA 유전자[참조: 비특허문헌 3] 및 히포크산틴/구아닌의 트랜스포터를 암호화하는 pbuG 유전자[참조: 비특허문헌 4] 등의 발현을 조절하는 것이 공지되어 있다.
또한, purR 유전자 파괴 외에, 석시닐-AMP 신타제 유전자(purA)를 파괴하여 아데닌 요구성을 부여하는 것, 및 푸린뉴클레오시드포스포리라제 유전자(deoD)를 파괴하여, 이노신의 히포크산틴으로의 분해를 억제함으로써, 이노신을 효율적으로 제조하는 방법이 개시되어 있다[참조: 특허문헌 8].
산화적 펜토스 인산 경로는, 글루코스가 글루코스키나제에 의해 인산화되어 글루코스-6-인산이 생합성되고, 당해 글루코스-6-인산이 산화적으로 리보스 5-인산으로 전환되는 경로이다. 당해 경로와 푸린계 물질의 생합성 경로의 관계는 그다지 공지되어 있지 않으며, 미생물의 산화적 펜토스 인산 경로를 개변하여 푸린계 물질 생산균을 육종한다고 하는 시도는 이루어지고 있지 않았다.
특허문헌 1: 일본 특허공보 제(소)38-23099호
특허문헌 2: 일본 특허공보 제(소)54-17033호
특허문헌 3: 일본 특허공보 제(소)55-2956호
특허문헌 4: 일본 특허공보 제(소)55-45199호
특허문헌 5: 일본 특허공보 제(소)57-14160호
특허문헌 6: 일본 특허공보 제(소)57-41915호
특허문헌 7: 일본 공개특허공보 제(소)59-42895호
특허문헌 8: 일본 공개특허공보 2004-242610호
특허문헌 9: 일본 특허공보 제(소)51-5075호
특허문헌 10: 일본 특허공보 제(소)58-17592호
특허문헌 11: 일본 공개특허공보 제(소)58-158197호
특허문헌 12: 일본 공개특허공보 제(소)58-175493호
특허문헌 13: 일본 공개특허공보 제(소)59-28470호
특허문헌 14: 일본 공개특허공보 제(소)60-156388호
특허문헌 15: 일본 공개특허공보 제(평)1-27477호
특허문헌 16: 일본 공개특허공보 제(평)1-174385호
특허문헌 17: 일본 공개특허공보 제(평)3-58787호
특허문헌 18: 일본 공개특허공보 제(평)3-164185호
특허문헌 19: 일본 공개특허공보 제(평)5-84067호
특허문헌 20: 일본 공개특허공보 제(평)5-192164호
특허문헌 21: 일본 공개특허공보 제(소)63-248394호
특허문헌 22: 국제공개 제99/03988호 팜플렛
특허문헌 23: 미국특허 제6,284,495호
비특허문헌 1: Agric. Biol. Chem., 1978, 42, 399-405
비특허문헌 2: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 7455-7459
비특허문헌 3: J. Bacteriol., 2001, 183, 6175-6183
비특허문헌 4: J. Bacteriol., 2003, 185, 5200-5209,
본 발명은 발효법에 의해 푸린뉴클레오시드 및/또는 푸린뉴클레오티드 등의 푸린계 물질을 제조하기 위해서 적합한 바실러스속 세균을 제조하는 것 및 동세균을 사용한 푸린계 물질의 제조법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 실시하였다. 그 결과, 바실러스속 세균에 있어서, 산화적 펜토스-인산 경로의 효소 활성, 특히 글루코스-6-인산-탈수소효소 또는 리보스 5-인산이소메라제의 활성을 증강시킴으로써, 푸린뉴클레오시드나 푸린뉴클레오티드의 생산능이 향상되는 것을 밝혀냈다. 또한, 포스포리보실피로인산(PRPP) 신세타제, 또는 푸린뉴클레오티드 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 상승하도록 개변하는 것, 또는 푸린뉴클레오시드포스포리라제 활성이 감소되도록 개변함으로써, 더욱 바실러스속 세균의 푸린계 물질 생산능을 향상시킬 수 있는 것을 밝혀내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 푸린계 물질 생산능을 가지며, 산화적 펜토스 인산 경로의 효소의 활성이 상승되도록 개변됨을 특징으로 하는 바실러스속 세균.
(2) 상기 항목 (1)에 있어서, 상기 푸린계 물질이 이노신, 크산토신, 구아노신 및 아데노신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 푸린뉴클레오시드인 바실러스속 세균.
(3) 상기 항목 (1)에 있어서, 상기 푸린계 물질이 이노신산, 크산틸산, 구아닐산 및 아데닐산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 푸린뉴클레오티드인 바실러스 속 세균.
(4) 상기 항목 (1) 내지 (3) 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 산화적 펜토스 인산 경로의 효소가, 글루코스-6-인산-탈수소효소 또는 리보스 5-인산이소메라제인 바실러스속 세균.
(5) 상기 항목 (1) 내지 (4) 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 효소를 암호화하는 유전자의 카피수를 높이는 것, 또는 당해 유전자의 발현 조절 서열을 개변함으로써 산화적 펜토스 인산 경로의 효소 활성이 증강된 바실러스속 세균.
(6) 상기 항목 (5)에 있어서, 상기 효소가 글루코스-6-인산-탈수소효소이고, 당해 글루코스-6-인산-탈수소효소를 암호화하는 유전자가 하기 (A) 또는 (B)에 나타내는 단백질을 암호화하는 유전자인 바실러스속 세균.
(A) 서열번호 48에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는
(B) 서열번호 48에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 글루코스-6-인산-탈수소효소 활성을 갖는 단백질.
(7) 상기 항목 (5)에 있어서, 상기 효소가 리보스 5-인산이소메라제이고, 당해 리보스 5-인산이소메라제를 암호화하는 유전자가 하기 (E) 또는 (F)에 나타내는 단백질을 암호화하는 유전자인 바실러스속 세균.
(E) 서열번호 50에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는
(F) 서열번호 50에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 리 보스 5-인산이소메라제 활성을 갖는 단백질.
(8) 상기 항목 (6) 내지 (7) 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 수개가 2 내지 20개인, 바실러스속 세균.
(9) 상기 항목 (5)에 있어서, 상기 효소가 글루코스-6-인산-탈수소효소이고, 당해 글루코스-6-인산-탈수소효소를 암호화하는 유전자가 하기 (a) 또는 (b)에 나타내는 DNA인 바실러스속 세균.
(a) 서열번호 47에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는
(b) 서열번호 47에 기재된 염기 서열 또는 동 염기 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 DNA로서, 글루코스-6-인산-탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(10) 상기 항목 (5)에 있어서, 상기 효소가 리보스 5-인산이소메라제이고, 당해 리보스 5-인산이소메라제를 암호화하는 유전자가 하기 (e) 또는 (f)에 나타내는 DNA인 바실러스속 세균.
(e) 서열번호 49에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는
(f) 서열번호 49에 기재된 염기 서열 또는 동 염기 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 DNA로서, 리보스 5-인산이소메라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(11) 상기 항목 (1) 내지 (10) 중의 어느 한 항에 있어서, 추가로 포스포리보실피로인산 신세타제 활성이 상승되도록 개변됨을 특징으로 하는 바실러스속 세균.
(12) 상기 항목 (1) 내지 (11) 중의 어느 한 항에 있어서, 추가로 푸린오페론의 발현량이 상승되도록 개변됨을 특징으로 하는 바실러스속 세균.
(13) 상기 항목 (12)에 있어서, 푸린오페론의 리프레서를 암호화하는 유전자인 purR 유전자가 파괴된 것, 또는, 푸린오페론의 어테뉴에이터(attenuator) 영역의 일부가 제거됨으로써 푸린오페론의 발현량이 상승됨을 특징으로 하는 바실러스속 세균.
(14) 상기 항목 (1) 내지 (13) 중의 어느 한 항에 있어서, 추가로 푸린뉴클레오시드포스포리라제 활성이 저하되도록 개변됨을 특징으로 하는 바실러스속 세균.
(15) 상기 항목 (1) 내지 (14) 중의 어느 한 항에 따르는 바실러스속 세균을 배지에 배양하여 푸린계 물질을 축적시키고 푸린계 물질을 회수함을 특징으로 하는 푸린계 물질의 제조법.
(16) 상기 항목 (15)에 있어서, 푸린계 물질이 푸린뉴클레오시드 또는 푸린뉴클레오티드인 제조법.
(17) 상기 항목 (16)에 있어서, 상기 푸린계 물질이 이노신, 크산토신, 구아노신 및 아데노신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 푸린뉴클레오시드인 제조법.
(18) 상기 항목 (16)에 있어서, 상기 푸린계 물질이 이노신산, 크산틸산, 구아닐산 및 아데닐산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 푸린뉴클레오티드인 제조법.
(19) 상기 항목 (17)에 따르는 방법에 의해 푸린뉴클레오시드를 제조하고 당 해 푸린뉴클레오시드에 폴리인산, 페닐인산 및 카르바밀인산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인산 공급체와 뉴클레오시드-5'-인산에스테르를 생성하는 능력을 갖는 미생물 또는 산성 포스파타제를 작용시켜 푸린뉴클레오티드를 생성시키고, 당해 푸린뉴클레오티드를 채취함을 특징으로 하는 푸린뉴클레오티드의 제조법.
<1> 본 발명의 바실러스속 세균
(I) 푸린계 물질 생산능의 부여
본 발명의 바실러스속 세균은, 푸린계 물질 생산능을 가지며, 산화적 펜토스-인산 경로의 효소 활성이 증강되도록 개변된 바실러스속 세균이다.
「푸린계 물질」로서는, 푸린 골격을 포함하는 물질을 말하지만, 푸린뉴클레오시드, 푸린뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 여기서 푸린뉴클레오시드란, 이노신, 크산토신, 구아노신, 아데노신 등을 의미하고, 푸린뉴클레오티드란 푸린뉴클레오시드의 5'-인산에스테르, 예를 들면 이노신산(이노신-5'-인산, 이하 「IMP」라고도 한다), 크산틸산(크산토신-5'-인산, 이하 「XMP」라고도 한다), 구아닐산(구아노신-5'-모노인산, 이하 「GMP」라고도 한다), 아데닐산(아데노신-5'-모노인산, 이하 「AMP」라고도 한다) 등을 의미한다.
「푸린계 물질 생산능」이란, 본 발명의 바실러스속 세균을 배지 중에서 배양했을 때에 푸린계 물질을 세포 또는 배지로부터 회수할 수 있을 정도로 세포내 또는 배지중에 분비, 생성, 축적할 수 있는 능력을 말한다. 또한, 본 발명의 바실 러스속 세균은 상기 푸린계 물질중 2종류 이상의 생산능을 갖는 것이라도 양호하다.
푸린계 물질 생산능을 갖는 바실러스속 세균으로서는, 본래 푸린계 물질 생산능을 갖는 것이라도 양호하지만, 이하에 나타내는 것과 같은 바실러스속 세균을 변이법이나 재조합 DNA법을 이용하여, 푸린계 물질 생산능을 갖도록 개변함으로써 수득되는 것이라도 양호하다. 또한, 후술하는 바와 같이 하여 산화적 펜토스 인산 합성 경로의 효소 활성이 상승하도록 개변함으로써 푸린계 물질 생산능이 부여된 바실러스속 세균이라도 양호하다.
본 발명의 바실러스속 세균을 수득하기 위해서 사용되는 바실러스속 세균으로서는, 바실러스·서브틸리스, 바실러스·아밀로리케파시엔스, 바실러스·푸밀러스 등을 들 수 있다.
바실러스·서브틸리스로서는, 바실러스·서브틸리스 168 Marburg(ATCC 6051), 바실러스· 서브틸리스 PY79[참조: Plasmid, 1984, 12, 1-9] 등이, 바실러스·아밀로리케파시엔스로서는, 바실러스·아밀로리케파시엔스T(ATCC 23842) 및 바실러스·아밀로리케파시엔스N(ATCC 23845) 등을 들 수 있다.
이노신 생산능을 갖는 바실러스속 세균은, 상기와 같은 바실러스속 세균에, 예를 들면, 아데닌 요구성, 또는 추가로 푸린 동족체 등의 약제에 대한 내성을 부여함으로써, 취득할 수 있다[참조: 일본 특허공보 제(소)38-23099, 일본 특허공보 제(소)54-17033, 일본 특허공보 제(소)55-45199, 일본 특허공보 제(소)57-14160, 일본 특허공보 제(소)57-41915, 일본 특허공보 제(소)59-42895, US2004-0166575A]. 영양 요구성 및 약제 내성을 갖는 바실러스속 세균은, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG), 또는 EMS(에탄메탄설포네이트) 등의 통상의 변이처리에 사용되고 있는 변이제에 의한 처리에 의해서 취득할 수 있다.
바실러스속에 속하는 이노신 생산주의 구체적인 예로서, 바실러스·서브틸리스 KMBS16주를 사용할 수 있다. 동균주는, 푸린오페론 리프레서를 암호화하는 purR 유전자의 결손(purR::spc), 석시닐-AMP 신타제를 암호화하는 purA 유전자의 결손(purA::erm), 및 푸린뉴클레오시드포스포리라제를 암호화하는 deoD 유전자의 결손(deoD::kan)이 도입된, 기지의 바실러스·서브틸리스 trpC2주(168 Marburg)의 유도체이다[참조: 일본 공개특허공보 2004-242610호]. 또한, 바실러스·서브틸리스 균주 AJ3772(FERM P-2555)[참조: 일본 공개특허공보 제(소)62-014794호] 등을 사용할 수도 있다.
구아노신 생산능을 갖는 바실러스속 세균으로서는, IMP 데하이드로게나제의 활성이 상승된 바실러스속 세균[참조: 일본 공개특허공보 제(평)3-58787], 푸린 동족체 내성 또는 데코이닌 내성 유전자가 편입되어 있는 벡터를 아데닌 요구성 변이주에 도입한 바실러스속 세균[참조: 일본 특허공보 제(평)4-28357] 등을 들 수 있다.
또한 푸린뉴클레오티드를 생산하는 바실러스속 세균으로서는, 이하의 것을 들 수 있다. 이노신산 생산균으로서는, 바실러스·서브틸리스의 포스파타제 활성이 약화된 이노신 생산주가 보고되어 있다[참조: Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805, Fujimoto, M. Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259]. 구아닐산 생산균으로서는, 아데닌 요구성을 가지며, 추가로 데코이닌 또는 메티오닌설폭사이드에 내성을 가지며, 5'-구아닐산(구아노신-5'-모노인산, 이하「GMP」라고도 한다) 생산능을 갖는 바실러스속의 변이주를 들 수 있다[참조: 일본 특허공보 제(소)56-12438호]
또한, 푸린계 물질 생산능을 갖는 바실러스속 세균을 육종하는 방법으로서, 이하의 방법을 들 수 있다. 푸린뉴클레오시드 및 푸린뉴클레오티드에 공통의 푸린 생합성에 관여하는 효소, 즉 푸린 생합성 효소의 세포내에서의 활성을 상승시키는 방법을 들 수 있다. 당해 효소의 세포내에서의 활성은, 바실러스속 세균의 비개변주, 예를 들면 야생형의 바실러스속 세균보다도 상승시키는 것이 바람직하다. 「활성이 상승된다」란, 예를 들면, 세포당 효소 분자의 수가 증가한 경우나, 효소 분자당 비활성이 상승된 경우 등이 해당된다. 예를 들면, 상기 효소의 유전자의 발현량을 상승시킴으로써 활성을 상승시킬 수 있다.
상기 푸린 생합성에 관여하는 효소로서는, 예를 들면, 포스포리보실피로인산(PRPP)아미드트랜스퍼라제, PRPP 신세타제 등을 들 수 있다.
펜토스-인산계에 주입된 글루코스 등의 당원이 대사에 의해 생성한 이화대사물(catabolite)의 일부는, 리불로스-5-인산을 경유하여 리보스-5-인산이 된다. 생합성된 리보스-5-인산으로부터, 푸린뉴클레오시드, 히스티딘 및 트립토판 생합성의 불가결한 전구물질인 PRPP가 생성된다. 구체적으로는, 리보스-5-인산은 포스포리보실피로인산 신세타제(PRPP 신세타제[EC:2.7.6.1])에 의해 PRPP로 전환된다. 따라서, PRPP 신세타제의 활성이 상승하도록 개변함으로써, 바실러스속 세균에 푸린 계 물질 생산능을 부여할 수 있으며, 펜토스-인산계 생합성계 효소의 강화와 조합하면 보다 효과적이다.
「포스포리보실피로인산 신세타제의 활성이 증강된다」란, 포스포리보실피로인산 신세타제의 활성이 야생주 또는 친주 등의 비개변주에 대하여 증가하고 있는 것을 말한다. 포스포리보실피로인산 신세타제의 활성은 예를 들면, Switzer 등의 방법[참조: Methods Enzymol., 1978, 51, 3-11], Roth 등의 방법[참조: Methods Enzymol., 1978, 51, 12-17]에 의해 측정할 수 있다. 포스포리보실피로인산 신세타제의 활성이 증강된 바실러스속 세균은, 예를 들면, 일본 공개특허공보 2004-242610호에 기재된 방법과 동일하게 하여, 플라스미드를 사용하는 방법이나 염색체 위에 편입하는 방법 등에 의해, 포스포리보실피로인산 신세타제를 암호화하는 유전자를 바실러스속 세균으로 고발현시킴으로써 제작할 수 있다. 본 발명에 이용할 수 있는 포스포리보실피로인산 신세타제를 암호화하는 유전자는, 서열번호 57에 기재된 바실러스속 세균 유래의 prs 유전자[참조: Genbank Accession No. NC000964(15913..17376)]를 들 수 있지만, 다른 세균 유래의 유전자, 동식물 유래의 유전자라도 바실러스속으로 포스포리보실피로인산 신세타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자이면, 어느 것이라도 사용할 수 있다.
한편, 푸린뉴클레오시드, 히스티딘 및 트립토판 생합성에 불가결한 전구물질 인 PRPP가 생성되면, 이의 일부는 푸린 생합성에 관여하는 효소군에 의해 푸린뉴클레오시드, 푸린뉴클레오티드로 변환된다. 이와 같은 효소군을 암호화하는 유전자로서는, 바실러스·서브틸리스의 purEKB-purC(orf)QLF-purMNH(J)-purD 오페론의 유 전자[참조; Ebbole DJ and Zalkin H, J. Biol. Chem., 1987, 262, 17, 8274-87][참조: 현재는 purEKBCSQLFMNHD라고도 불린다: Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: A. L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002], 및 에세리키아·콜리의 푸린오페론의 유전자[참조: Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996]가 예시된다.
따라서, 이러한 유전자의 발현을 증강시킴으로써, 푸린계 물질 생산능을 부여할 수도 있다. 또한, 본 발명에 사용할 수 있는 푸린오페론 유전자는 이러한 것에 한정되지 않으며, 다른 미생물이나 동식물 유래의 유전자도 이용할 수도 있다.
푸린오페론의 발현량을 증대시키는 방법으로서는, 후술의 산화적 펜토스 인산 경로의 효소 활성을 증대시키는 것과 마찬가지로, 플라스미드를 사용하는 방법이나 염색체 위에 편입하는 방법 등에 의해, 푸린오페론 유전자를 바실러스속 세균으로 고발현시키는 방법을 들 수 있다.
푸린오페론의 발현량을 증대시키는 제2의 방법으로서, 푸린오페론 고유의 프로모터를 보다 강력한 프로모터로 치환하는 것이나, 고유의 프로모터의 -35, -10 영역을 컨센서스 서열(consensus sequence)로 치환하는 것을 들 수 있다.
예를 들면, 바실러스·서브틸리스(B. subtilis 168 Marburg주; ATCC 6051)에서는, 푸린오페론의 -35 서열은 컨센서스 서열(TTGACA)이지만, -10 서열은 TAAGAT이고, 컨센서스 서열 TATAAT과는 상이하다[참조: Ebbole, D. J. and H. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287]. 따라서, -10 서열(TAAGAT)을 컨센서스 서열 TATAAT, 또는 TATGAT, TAAAAT이 되도록 개변함으로써, 푸린오페론의 전사 활성을 상승시킬 수 있다. 또한, 프로모터 서열의 치환은 하기의 유전자 치환과 동일한 방법으로 실시할 수 있다.
푸린오페론의 발현량을 증대시키는 제3의 방법으로서, 푸린오페론의 리프레서의 발현량을 저하시키는 방법도 들 수 있다[참조: US 6,284,495호]
푸린 리프레서의 발현량을 저하시키기 위해서는, 예를 들면, 바실러스속 세균을 자외선 조사 또는 NTG 또는 EMS 등의 통상 변이 처리에 사용되고 있는 변이제에 의해서 처리하여, 푸린 리프레서의 발현량이 저하된 변이주를 선택하는 방법을 채용할 수 있다.
또한, 푸린 리프레서의 발현량이 저하된 바실러스속 세균은, 변이 처리 이외에, 예를 들면, 유전자 재조합법을 사용한 상동 재조합법[참조: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press(1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202]에 의해, 염색체 위의 푸린 리프레서를 암호화하는 유전자(purR; GenBank Accession NC_000964 서열번호 51)를, 정상적으로 기능하지 않는 유전자(이하, 「파괴형 유전자」라고 하는 경우가 있다)로 치환함으로써 수득할 수 있다.
파괴형 유전자로 숙주 염색체 위의 정상 유전자를 치환하기 위해서는, 예를 들면 이하와 같이 하면 양호하다. 또한, 이하의 예에서는, purR 유전자를 예로서 설명하지만, 다른 유전자, 예를 들면 후술의 purA 또는 deoD 유전자에 관해서도, 동일하게 하여 유전자를 파괴할 수 있다.
상동 재조합은 염색체 위의 서열과 상동성을 갖는 서열을 가지며, 바실러스속 세균내에서 복제할 수 없는 플라스미드 등이 균체내에 도입되면, 어느 일정 빈도로 상동성을 갖는 서열의 개소에서 재조합을 일으키고, 도입된 플라스미드 전체가 염색체 위에 편입된다. 이후 추가로 염색체 위의 상동성을 갖는 서열의 개소에서 재조합을 일으키면, 다시 플라스미드가 염색체 위에서 누락되지만, 이 때 재조합을 일으키는 위치에 의해 파괴된 유전자쪽이 염색체 위에 고정되어, 원래의 정상적인 유전자가 플라스미드와 함께 염색체 위에서 누락되는 경우도 있다. 이러한 균주를 선택함으로써, 염색체 위의 정상적인 purR 유전자가 파괴형 purR 유전자로 치환된 균주를 취득할 수 있다.
이러한 상동 재조합에 의한 유전자 파괴 기술은 이미 확립되어 있으며, 직쇄 DNA를 사용하는 방법, 온도 감수성 플라스미드를 사용하는 방법 등을 이용할 수 있다. 또한, 약제 내성 등의 마커 유전자가 내부에 삽입된 purR 유전자를 포함하며, 목적으로 하는 미생물 세포내에서 복제할 수 없는 플라스미드를 사용함으로써도, purR 유전자를 파괴할 수 있다. 즉, 상기 플라스미드로 형질 전환되어 약제 내성을 획득한 형질 전환체는, 염색체 DNA 중에 마커 유전자가 편입되어 있다. 이러한 마커 유전자는, 이의 양 말단의 purR 유전자 서열과 염색체 위의 purR 유전자의 상동 재조합에 의해서 편입될 가능성이 높기 때문에, 효율적으로 유전자 파괴주를 선택할 수 있다.
유전자 파괴에 사용하는 파괴형 purR 유전자는, 구체적으로는, 제한 효소 소화 및 재결합에 의해 purR 유전자의 일정 영역을 결실시키거나, purR 유전자에 다 른 DNA 단편(마커 유전자 등)을 삽입하거나, 부위 특이적 변이법[참조: Kramer, W. and Fritz, H. J., Methods Enzymol., 1987, 154, 350-367] 또는 재조합 PCR법[참조: PCR Technology, Stockton Press(1989)]나 차아황산나트륨, 하이드록실아민 등의 화학 약제에 의한 처리[참조: Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75, 2170-2174]에 의해서, purR 유전자의 암호 영역 또는 프로모터 영역 등의 염기 서열 중에 1개 또는 복수개의 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 일으키거나 하여 암호화되는 리프레서의 활성이 저하 또는 소실되었거나, 또는 purR 유전자의 전사가 저하 또는 소실된 것을 선택함으로써, 취득할 수 있다. 이러한 형태 중에서는, 제한 효소 소화 및 재결합에 의해 purR 유전자의 일정 영역을 결실시키는 방법, 또는 purR 유전자로 다른 DNA 단편을 삽입하는 방법이, 확실성 및 안정성의 점에서 바람직하다.
또한, purR 유전자는 푸린오페론을 갖는 미생물의 염색체 DNA로부터, 공지의 purR 유전자의 염기 서열에 기초하여 제작한 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하는 PCR법에 의해서 취득할 수 있다. 또한, 푸린오페론을 갖는 미생물의 염색체 DNA 라이브러리로부터, 공지의 purR 유전자의 염기 서열에 기초하여 제작한 올리고뉴클레오티드를 프로브로 하는 하이브리드화법에 의해서, purR 유전자를 취득할 수 있다. 바실러스·서브틸리스 168 Marburg주에서는, purR 유전자의 염기 서열이 보고되어 있다[참조: GenBank Accession No.D26185(암호 영역은 염기 번호118041 내지 118898), NC_000964(암호 영역은 염기 번호 54439 내지 55296)]. purR 유전자의 염기 서열 및 동유전자에 의해서 암호화되는 아미노산 서열을, 서열 목록의 서 열번호 51 및 52에 나타낸다[참조: 일본 공개특허공보 2004-242610호].
purR 유전자를 수득하기 위한 PCR에 사용하는 프라이머로서는, purR 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 것이면 양호하며, 구체적으로는 서열번호 59(GAAGTTGATGATCAAAA) 및 서열번호 60(ACATATTGTTGACGATAAT)에 나타내는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 등을 들 수 있다.
파괴형 유전자의 제작에 사용하는 purR 유전자는, 반드시 전장을 포함할 필요는 없으며, 유전자 파괴를 일으키는 데 필요한 길이를 갖고 있으면 양호하다. 또한, 각 유전자의 취득에 사용하는 미생물은, 동유전자가 유전자 파괴주의 제조에 사용하는 바실러스속 세균의 purR 유전자와 상동 재조합을 일으킬 정도의 상동성을 갖고 있으면 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 통상적으로는 목적으로 하는 바실러스속 세균과 동일한 세균에 유래하는 유전자를 사용하는 것이 바람직하다.
바실러스속 세균의 purR 유전자와 상동 재조합을 일으킬 수 있는 DNA는, 서열번호 52에 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA라도 양호하다. 상기「수개」는, 예를 들면 2 내지 50개, 바람직하게는 2 내지 30개, 보다 바람직하게는 2 내지 10개이다.
상기 바실러스속 세균의 purR 유전자와 상동 재조합을 일으킬 수 있는 DNA로서는 구체적으로는, 서열번호 51에 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA와, 예를 들면 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 서열번호 51 에 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA와, 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 DNA를 들 수 있다. 엄격한 조건으로서는, 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염농도로 세정이 이루어지는 조건을 들 수 있다.
상기 마커 유전자로서는, 스펙티노마이신 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자 등의 약제 내성 유전자를 들 수 있다. 엔테로코커스·페칼리스(Enterococcus faecalis) 유래의 스펙티노마이신 내성 유전자는, 바실러스 제네틱 스톡 센터(BGSC)로부터 시판되고 있는 에세리키아·콜리 ECE101주로부터, 플라스미드 pDG1726를 제조하고, 당해 플라스미드로부터 카세트로서 취출함으로써, 취득할 수 있다. 또한, 스타필로코커스·아우레우스(Staphylococcus aureus)의 에리스로마이신 내성 유전자는, 바실러스 제네틱 스톡 센터(BGSC)로부터 시판되고 있는 에세리키아·콜리 ECE91주로부터 플라스미드 pDG646를 제조하고, 당해 플라스미드로부터 카세트로서 취출함으로써, 취득할 수 있다. 또한, 카나마이신 내성 유전자는 스트렙토코커스·페칼리스(Streptococcus faecalis) 유래 카나마이신 내성 유전자는, 바실러스 제네틱 스톡 센터(BGSC)로부터 시판되고 있는 에세리키아·콜리 ECE94주로부터 플라스미드 pDG783를 제조하고, 당해 플라스미드로부터 카세트로서 취출함으로써, 취득할 수 있다.
마커 유전자로서 약제 내성 유전자를 사용하는 경우는, 당해 유전자를 플라스미드중의 purR 유전자의 적당한 부위에 삽입하여, 수득되는 플라스미드로 미생물을 형질 전환하여, 약제 내성을 갖는 형질 전환체를 선택하면, purR 유전자 파괴주가 수득된다. 염색체 위의 purR 유전자가 파괴된 것은, 서던블롯팅이나 PCR법에 의해, 염색체 위의 purR 유전자 또는 마커 유전자를 해석함으로써, 확인할 수 있다. 상기 스펙티노마이신 내성 유전자, 에리스로마이신 내성 유전자 또는 카나마이신 내성 유전자가 염색체 DNA에 편입된 것의 확인은, 이러한 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용한 PCR에 의해 실시할 수 있다.
또한, 푸린오페론의 발현은 프로모터 하류에 위치하는 터미네이터-안티터미네이터(terminator-antiterminator) 서열(이하, 어테뉴에이터(attenuator) 서열이라고 칭한다)로 제어되어 있는 것이 공지되어 있다[참조: Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287, Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1988, 263, 10894-10902, Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Bacteriol., 1989, 171, 2136-2141](도 1참조). 따라서, 어테뉴에이터 서열을 결손시킴으로써, 푸린오페론의 발현량을 상승시킬 수 있다. 어테뉴에이터 서열의 결손은 purR 파괴와 동일한 방법으로 실시할 수 있다.
또한, 푸린오페론 전사를 더욱 증대시키기 위해서는, 상기 방법을 조합해도 양호하며, 예를 들면, purR 유전자를 파괴하여, 추가로 어테뉴에이터 서열을 결손시킨 푸린오페론을 플라스미드로 증폭시키거나 또는, 이와 같은 푸린오페론을 염색체 위에서 멀티 카피화시켜도 양호하다.
또한, 푸린 생합성에 관여하는 효소의 활성 증강은, 푸린 생합성에 관여하는 효소의 조절을 해제하는 것, 예를 들면, 상기 효소의 피드백 저해를 해제하는 방법에 의해서도 실시할 수 있다[참조: WO99/03988].
또한, 푸린계 물질의 세포내로의 주입을 약화시킴으로써도, 푸린계 물질 생 산능을 강화할 수 있다. 예를 들면, 푸린뉴클레오시드의 세포내로의 주입은 푸린뉴클레오시드의 세포내로의 주입에 관여하는 반응을 차단함으로써 약화시킬 수 있다. 상기 푸린뉴클레오시드의 세포내로의 주입에 관여하는 반응은, 예를 들면 뉴클레오시드 퍼미아제(permease)에 촉매되는 반응이다.
또한, 푸린계 물질 생산능을 증강시키기 위해서 푸린계 물질을 분해하는 효소의 활성을 저하시켜도 양호하다. 이러한 효소로서, 예를 들면, 푸린뉴클레오시드포스포리라제를 들 수 있다.
PRPP로부터 푸린 생합성에 관여하는 효소군에 의해 생합성된 푸린뉴클레오티드는, 탈인산화되어 푸린뉴클레오시드를 만든다. 푸린뉴클레오시드를 효율적으로 축적시키기 위해서는, 푸린뉴클레오시드를 더욱 분해하여 히포크산틴 등으로 하는 푸린뉴클레오시드포스포리라제의 활성을 저하시키는 것이 바람직하다. 즉, 이노신을 비롯한 푸린뉴클레오시드를 기질로 하는 푸린뉴클레오시드포스포리라제를 약화, 또는 결손시키도록 개변하는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 바실러스속 세균으로 푸린뉴클레오시드포스포리라제를 암호화하는 deoD 유전자와 pupG 유전자를 파괴함으로써 달성할 수 있다. 본 발명의 바실러스속 세균은, 상기와 같은 deoD 유전자와 pupG 유전자를 단독, 또는 동시에 파괴하도록 개변된 것이라도 양호하다. deoD 유전자, pupG 유전자는, 예를 들면 바실러스속 유래의 유전자(deoD; Genbank Accession No. NC_000964(서열번호 55), pupG; Genbank Accession No.NC_000964(서열번호 53))를 이용할 수 있고, 상기 purR 유전자 파괴와 동일한 방법으로 유전자 파괴주를 취득할 수 있다.
또한, 푸린계 물질 생산능을 증강시키기 위해서, 이노신모노인산(IMP) 탈수소효소의 활성을 저하시켜도 양호하다. IMP 탈수소효소를 암호화하는 유전자로서는, guaB 유전자를 들 수 있다. guaB 유전자로서는, 예를 들면, GenBank Accession No.NC000964(15913..17376)로 등록되어 있는 염기 서열을 갖는 것을 들 수 있다(서열번호 61).
또한, 푸린계 물질 생산능을 증강시키는 방법으로서, 푸린계 물질을 배출하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 증폭시키는 것이 고려된다. 이러한 유전자가 증폭된 세균으로서는, 예를 들면, rhtA 호모로그 유전자를 증폭시킨 바실러스속 세균을 들 수 있다[참조: 일본 공개특허공보 2003-219876호].
또한, 본 발명에 사용하는 미생물은, 추가로 뉴클레오시다제나 뉴클레오티다제를 암호화하는 유전자를 결손시키면, 각각에 대응하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 축적시킬 수 있으며, 또한 이노신의 요구성을 부여하면, 이들의 생합성계 경로상의 전구체 및 이의 관련 물질을 축적시킬 수 있다.
(II) 산화적 펜토스 인산 경로의 효소 활성을 상승시키기 위한 개변
본 발명의 바실러스속 세균은, 상술과 같은 푸린계 물질 생산능을 갖는 균주를 산화적 펜토스 인산 경로의 효소 활성을 상승시키도록 개변함으로써 취득할 수 있다. 단, 개변의 순서는 상관없으며, 산화적 펜토스 인산 경로의 효소 활성을 상승시키도록 개변한 후에 푸린뉴클레오티드 생산능을 부여해도 양호하다.
여기에서「산화적 펜토스 인산 경로」란, 세포내에 주입된 글루코스가 글루 코스키나제에 의해 인산화되어 글루코스-6-인산이 생합성되고, 글루코스-6-인산은 산화적으로 리보스-5-인산으로 전환되는 경로를 의미한다. 산화적 펜토스-인산 경로의 효소란, 구체적으로는 글루코스-6-인산-탈수소효소(EC:1.1.49), 6-인산-글루콘산-탈수소효소(EC:1.1.1.44), 또는, 리보스-5-인산이소메라제(EC:5.3.1.6) 등의 효소를 의미하며, 본 발명의 바실러스속 세균은 이러한 효소중 글루코스-6-인산-탈수소효소와 리보스-5-인산이소메라제의 어느 하나의 효소의 활성이 상승하도록 개변된 것이라도 양호하다.
산화적 펜토스-인산 경로의 효소 활성은, 야생주 또는 비개변주의 활성보다도 상승하고 있는 것이 바람직하다. 효소 활성의 상승은, 이하와 같은 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들면, 글루코스-6-인산-탈수소효소의 효소 활성은 실시예 6의 (1)에 기재한 바와 같은 NADPH의 생성을 측정하는 방법으로 또는 리보스-5-인산이소메라제의 효소 활성은 실시예 6의 (2)에 기재한 바와 같은 리불로스 5-포스페이트의 생성을 측정하는 방법으로 측정할 수 있다.
산화적 펜토스 인산 경로의 효소 활성이 상승하도록 개변하기 위해서는, 예를 들면, 산화적 펜토스 인산 경로의 효소를 암호화하는 유전자를 증폭시키면 양호하다. 사용할 수 있는 유전자는 산화적 펜토스 인산 경로의 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자인 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 바실러스속 유래의 유전자를 들 수 있다.
바실러스·서브틸리스의 글루코스-6-인산-탈수소효소(글루코스-6-인산데하이드로게나제)는 서열번호 48에 나타내는 489개의 아미노산으로부터 구성되는 것을 들 수 있으며, 당해 단백질을 암호화하는 유전자, 바람직하게는 서열번호 47(zwf 유전자; Genbank Accession No.NC_000964)의 염기 서열을 갖는 유전자를 개변에 사용할 수 있다. 또한, zwf 유전자는 바실러스·서브틸리스 염색체 위의 212도에 존재한다.
또한, 리보스-5-인산이소메라제로서는, 서열번호 50에 나타내는 149개의 아미노산으로 구성되는 단백질을 들 수 있으며, 당해 단백질을 암호화하는 유전자, 바람직하게는 서열번호 49의 염기 서열을 갖는 유전자(ywlF 유전자; Genbank Accession No.NC_000964)를 개변에 사용할 수 있다. 또한, ywlF 유전자는 바실러스·서브틸리스 염색체 위 324도에, 세린하이드록시메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 glyA 유전자에 근접하여 존재한다. 또한, 리보스-5-인산이소메라제는 리보스-5-인산에피메라제라고 불리고 있는 것도 포함한다.
또한, 바실러스속 이외의 세균, 예를 들면 다른 미생물 또는 동식물 유래의 산화적 펜토스 인산 경로의 효소를 암호화하는 유전자도 사용할 수도 있다. 미생물 또는 동식물 유래의 산화적 펜토스 인산 경로의 효소를 암호화하는 유전자는, 이미 이의 염기 서열이 결정되어 있는 유전자, 또는 이러한 염기 서열과의 상동성 등에 기초하여 산화적 펜토스 인산 경로의 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 미생물, 동식물 등의 염색체로부터 단리하여, 염기 서열을 결정한 것 등을 사용할 수 있다. 또한, 염기 서열이 결정된 후에는, 이의 서열에 따라서 합성한 유전자를 사용할 수도 있다. 이들은 하이브리드화법이나 PCR법에 의해 프로모터 및 ORF 부분을 포함하는 영역을 증폭시킴으로써 취득할 수 있다. 서열 정보는 Genbank 등의 데이타 베이스를 이용할 수 있다.
바실러스속 세균에 있어서, 이들의 목적으로 하는 효소의 세포내의 활성을 상승시키기 위해서는, 동효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증강시킴으로써 달성된다. 동유전자의 발현량의 증강은 동유전자의 카피수를 높임으로써 달성된다. 예를 들면, 상기 효소를 암호화하는 유전자 단편을 바실러스속 세균에서 기능하는 벡터, 바람직하게는 멀티 카피형의 벡터와 연결하여 재조합 DNA를 제작하고, 이를 바실러스속 세균 숙주에 도입하여 형질 전환하면 양호하다.
도입하는 유전자는 바실러스속 세균 유래의 유전자 및 바실러스속 세균에서 기능하는 한, 에세리키아속 세균 등의 다른 생물 유래의 유전자의 어느 것이라도 사용할 수 있다.
목적으로 하는 유전자는, 예를 들면, 바실러스속 세균의 염색체 DNA를 주형으로 하는 PCR법(PCR: polymerase chain reaction; White, T. J. et al., Trends Genet., 1989, 5, 185-189)에 의해서, 취득할 수 있다. 염색체 DNA는 DNA 공급체인 세균으로부터, 예를 들면, 사이토, 미우라의 방법[참조: H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 1963, 72, 619-629, 생물공학실험서, 일본생물공학회편, 97 내지 98페이지, 바이후칸, 1992년] 등에 의해 제조할 수 있다. PCR용 프라이머는 바실러스속 세균의 공지의 유전자 서열에 기초하여, 또는 다른 세균 등에서 서열이 공지된 유전자간에 보존되어 있는 영역의 정보에 기초하여 제조할 수 있다.
바실러스속 세균에 목적 유전자를 도입하기 위한 자율 복제 가능한 벡터로서 는, 예를 들면, pUB110, pC194, pE194 등을 들 수 있다. 또한, 염색체 DNA에 목적 유전자를 편입하기 위한 벡터로서는, pHSG398[참조: 다카라슈조 가부시키가이샤 제조], pBluescript SK-(Stratagene) 등의 이.콜라이(E. coli)용 벡터 등을 들 수 있다.
목적 유전자와 바실러스속 세균에서 기능하는 마커를 탑재한 벡터를 연결하여 재조합 DNA를 제조하기 위해서는, 목적 유전자의 말단에 맞는 제한 효소로 벡터를 절단한다. 연결은 T4 DNA 리가제 등의 리가제를 사용하여 실시하는 것이 보통이다.
상기 바실러스속에서 기능하는 마커 유전자로서, 스펙티노마이신 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자 등의 약제 내성 유전자를 들 수 있다. 엔테로코커스·페칼리스(Enterococcus faecalis) 유래의 스펙티노마이신 내성 유전자는, 바실러스 제네틱 스톡 센터(BGSC)로부터 시판되고 있는 에세리키아·콜리 ECE101주로부터 플라스미드 pDG1726를 제조하고, 당해 플라스미드로부터 카세트로써 취출함으로써, 취득할 수 있다. 또한, 스타필로코커스·아우레우스(Staphylococcus aureus)의 에리스로마이신 내성 유전자는, 바실러스 제네틱 스톡 센터(BGSC)로부터 시판되고 있는 에세리키아·콜리 ECE91주로부터, 플라스미드 pDG646를 제조하여, 당해 플라스미드로부터 카세트로서 취출함으로써, 취득할 수 있다. 또한, 카나마이신 내성 유전자는, 스트렙토코커스·페칼리스(Streptococcus faecalis) 유래 카나마이신 내성 유전자는, 바실러스 제네틱 스톡 센터(BGSC)로부터 시판되고 있는 에세리키아·콜리 ECE94주로부터 플라스미드 pDG783를 제조하고, 당해 플라스미드로부터 카세트 로서 취출함으로써, 취득할 수 있다.
상기한 바와 같이 제조한 재조합 DNA를 바실러스속 세균에 도입하기 위해서는, 지금까지 보고되어 있는 형질 전환법에 따라서 실시하면 양호하다. 예를 들면, 증식 단계의 세포로부터 컴피텐트 세포(competent cell)을 제조하여 DNA를 도입하는 방법[참조: Dubnau, D., and Davidoff-Abelson, R., J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221], 또는, 숙주 세포를 재조합 DNA를 용이하게 주입하는 프로토플라스트 또는 스페로플라스트의 상태로 하여 재조합 DNA를 DNA 수용균에 도입하는 방법[참조: Chang, S. and Cohen, S. N., Molec. Gen. Genet., 1979, 168, 111-115]을 들 수 있다.
목적 유전자의 카피수를 높이는 것은, 동유전자를 바실러스속 세균의 염색체 DNA 위에 멀티 카피 존재시킴으로써도 달성할 수 있다. 바실러스속 세균의 염색체 DNA 위에 목적 유전자를 멀티 카피로 도입하기 위해서는, 염색체 DNA 위에 멀티 카피 존재하는 서열을 표적으로 이용하여 상동 재조합에 의해 실시한다. 염색체 DNA 위에 멀티 카피 존재하는 서열로서는, 트랜스포존, 반복 서열, 전이 인자의 말단부에 존재하는 역반복(inverted·repeat) 등을 이용할 수 있다.
목적 효소의 활성 증강은 상기의 유전자 증폭에 의한 것 이외에, 염색체 DNA 위 또는 플라스미드 위의 목적 유전자의 프로모터 등의 발현 조절 서열을 강력한 것으로 치환함으로써도 달성된다. 프로모터의 강도는, RNA 합성 개시의 빈도에 의해 정의된다. 프로모터 강도의 평가법 및 강력한 프로모터의 예는, Goldstein 등의 논문[참조: Prokaryotic Promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128] 등에 기재되어 있다. 또한, 국제공개 WO00/18935에 개시되어 있는 바와 같이, 목적 유전자의 프로모터 영역에 수 염기의 염기 치환을 도입하여, 보다 강력한 것으로 개변하는 것도 가능하다. 또한, 리보솜 결합 부위(RBS)와 개시 코돈 사이의 스페이서, 특히 개시 코돈의 바로 상류의 서열에 있어서의 수개의 뉴클레오티드의 치환이 mRNA의 해독 효율에 매우 영향을 미치는 것이 공지되어 있다. 이러한 발현 조절 서열의 개변은 목적 유전자의 카피수를 높이는 것과 조합해도 양호하다. 예를 들면, 바실러스에서 기능하는 프로모터로서는, veg 프로모터, spac 프로모터, xyl 프로모터 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 미생물에 있어서 활성을 상승시키는 산화적 펜토스 인산 경로의 효소는, 각각의 효소 활성이 손상되지 않은 한, 서열번호 48 또는 50의 서열에 있어서 1 또는 복수의 위치에서의 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 효소 단백이라도 양호하다. 여기에서, 「수개」란, 아미노산 잔기의 단백질의 입체 구조에 있어서의 위치나 종류에 따라서도 상이하지만, 구체적으로는 2 내지 30개, 바람직하게는 2 내지 20개, 보다 바람직하게는 2 내지 10개이다.
상기의 산화적 펜토스 인산 경로의 효소 단백의 변이는, 효소 활성이 유지되는 보존적 변이이다. 치환은 아미노산 서열중의 적어도 1잔기가 제거되고, 거기에 다른 잔기가 삽입되는 변화이다. 효소 단백의 원래의 아미노산을 치환하고, 보존적 치환으로 간주되는 아미노산으로서는, ala로부터 ser 또는 thr로의 치환, arg로부터 gln, his 또는 lys로의 치환, asn으로부터 glu, gln, lys, his 또는 asp로의 치환, asp로부터 asn, glu 또는 gln으로의 치환, cys로부터 ser 또는 ala로의 치환, gln으로부터 asn, glu, his, asp 또는 arg로의 치환, glu로부터 gly, asn, gln, lys 또는 asp로의 치환, gly로부터 pro로의 치환, his로부터 asn, lys, gln, arg 또는 tyr로의 치환, ile로부터 leu, met, val 또는 phe로의 치환, leu로부터 ile, met, val 또는 phe로의 치환, lys로부터 asn, glu, gln, his 또는 arg로의 치환, met로부터 ile, leu, val 또는 phe로의 치환, phe로부터 trp, try, met, ile 또는 leu로의 치환, ser로부터 thr 또는 ala로의 치환, thr로부터 ser 또는 ala로의 치환, trp로부터 phe 또는 tyr로의 치환, tyr로부터 his, phe 또는 trp로의 치환, 및 val로부터 met, ile 또는 leu로의 치환을 들 수 있다.
상기와 같은 산화적 펜토스 인산 경로의 효소 단백과 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는, 예를 들면 부위 특이적 변이법에 의해서, 특정한 부위의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하도록, 이들 효소를 암호화하는 염기 서열을 개변함으로써 수득된다. 또한, 상기와 같은 개변된 DNA는, 종래 공지되어 있는 변이 처리에 의해서도 취득될 수 있다. 변이 처리로서는, 변이 처리전의 DNA를 하이드록실아민 등으로 시험관내(in vitro) 처리하는 방법 및 변이처리 전의 DNA를 유지하는 미생물, 예를 들면 에세리키아속 세균을 자외선 조사 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 또는 아질산 등의 통상 변이 처리에 사용되고 있는 변이제에 의해서 처리하는 방법을 들 수 있다.
상기와 같은 변이를 갖는 DNA를, 적당한 세포로 발현시켜 발현 산물의 활성을 조사함으로써, 산화적 펜토스 인산 경로의 효소와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA가 수득된다. 또한, 변이를 갖는 산화적 펜토스 인산 경로의 효소를 암호화하는 DNA 또는 이를 유지하는 세포로부터, 예를 들면 서열 목록의 서열번호 47 또는 49에 기재된 염기 서열 또는 이의 일부를 갖는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 산화적 펜토스 인산 경로의 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA가 수득된다. 여기에서 말하는 「엄격한 조건」이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 이러한 조건을 명확히 수치화하는 것은 곤란하지만, 일례를 나타내면, 상동성이 높은 DNA끼리, 예를 들면 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA끼리가 하이브리드화하고, 그것보다 상동성이 낮은 DNA끼리가 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 서던-하이브리드화의 세정 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염농도로 하이브리드화하는 조건을 들 수 있다.
프로브로서 서열번호 47, 49의 염기 서열의 일부의 서열을 사용할 수도 있다. 이와 같은 프로브는, 서열번호 47, 49의 염기 서열에 기초하여 제작한 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여, 서열번호 47, 49의 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해서 제작할 수 있다. 프로브로서, 300bp 정도 길이의 DNA 단편을 사용하는 경우에는, 하이브리드화의 세정 조건은, 50℃, 2×SSC, 0.1% SDS를 들 수 있다.
산화적 펜토스 인산 경로의 효소와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA로서 구체적으로는, 서열번호 48, 50에 나타내는 아미노산 서열과, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80%, 특히 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 가지며, 산화적 펜토스 인산 경로의 효소 산물 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 들 수 있다.
<2> 푸린계 물질의 제조법
본 발명의 바실러스속 세균은 푸린계 물질을 효율적으로 생산한다. 따라서, 본 발명의 바실러스속 세균을 적합한 배지에서 배양함으로써, 배지중에 푸린뉴클레오시드 및 푸린뉴클레오티드 등의 푸린계 물질을 생성 축적시킬 수 있다.
본 발명에 사용하는 배지로서는, 탄소원, 질소원, 무기염류, 기타 필요에 따라 아미노산, 비타민 등의 유기 미량 영양소를 함유하는 통상의 영양 배지를 사용하여 상법에 의해 실시할 수 있다. 합성 배지 또는 천연 배지 중 어느 것이라도 사용 가능하다. 배지에 사용되는 탄소원 및 질소원은 배양하는 균주의 이용 가능한 것이면 양호하다.
탄소원으로서는 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 말토오스, 만노스, 갈락토스, 아라비노스, 크실로스, 트레할로스, 리보스, 전분 가수분해물, 당밀 등의 당류, 글리세롤이나 만니톨 등의 알콜류가 사용되며, 기타, 글루콘산, 아세트산, 시트르산, 말레산, 푸마르산, 석신산 등의 유기산 등도 단독 또는 다른 탄소원과 병용하여 사용된다.
질소원으로서는 암모니아, 황산암모늄, 탄산암모늄, 염화암모늄, 인산암모 늄, 아세트산암모늄 등의 암모늄염, 질산염 또는 대두 가수분해물 등의 유기 질소 등이 사용된다.
유기 미량 영양소로서는, 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산, 또는 이들을 함유하는 펩톤, 카사미노산, 효모엑기스, 대두 단백 분해물 등이 사용되며, 생육에 아미노산, 뉴클레오시드 등을 요구하는 영양 요구성 변이주를 사용하는 경우에는 요구되는 영양소를 보충하는 것이 필요하다.
무기염류로서는 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염, 망간염 등이 사용된다.
배양 조건은, 사용하는 바실러스속 세균의 종류에 의하지만, 예를 들면 바실러스·서브틸리스에서는 발효 온도 20 내지 50℃, pH를 4 내지 9로 제어하면서 통기 배양을 실시한다. 배양중에 pH가 저하되는 경우에는 암모니아 가스 등의 알칼리로 중화한다. 이렇게 하여 40시간 내지 3일간 정도 배양함으로써, 배양액 중에 푸린뉴클레오시드가 축적된다.
배양 종료후, 배양액 중에 축적된 이노신 등의 푸린계 물질을 채취하는 방법으로서는 공지의 방법에 따라서 실시하면 양호하다. 예를 들면, 침전법, 또는 이온교환크로마토그래피 등에 의해서 단리할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 이노신 또는 구아노신에, 푸린뉴클레오시드포스포리라제 및 포스포리보실트랜스퍼라제를 작용시킴으로써, 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산이 수득된다.
또한, 본 발명의 미생물을 사용하여 생산된 푸린뉴클레오시드에, 폴리인산, 페닐인산, 카르바밀인산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인산 공급체와, 뉴클레 오시드-5'-인산에스테르를 생성하는 능력을 갖는 미생물이나, 산성 포스파타제를 작용시킴으로써, 푸린뉴클레오티드(뉴클레오시드-5'-인산에스테르)를 생산하는 것도 가능하다. 뉴클레오시드-5'-인산에스테르를 생성하는 능력을 갖는 미생물은, 푸린뉴클레오시드를 푸린뉴클레오티드로 변환하는 능력을 갖는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 국제공개팜플렛 WO96/37603호에 기재된 미생물을 들 수 있다. 또한, 일본 공개특허공보 제(평)07-231793에 개시되어 있는 Escherichia blattae JCM 1650, Serratia ficaria ATCC 33105, Klebsiella phnticola IFO 14939(ATCC 33531), Klebsiella pneumoniae IFO 3318(ATCC 8724), Klebsiella terrigena IFO 14941(ATCC 33257), Morganella morganii IFO 3168, Enterobacter aerogenes IFO 12010, Enterobacter aerogenes IFO 13534(ATCC 13048), Chromobacterium fluviatile IAM 13652, Chromobacterium violaceum IFO 12614, Cedecea lapagei JCM 1684, Cedecea davisiae JCM 1685, Cedecea neteri JCM 5909 등을 사용할 수 있다.
산성 포스파타제(EC3.1.3.2)로서는, 예를 들면, 일본 공개특허공보 2002-000289호, US6,010,851, US6,015,697 및 WO01/18184에 개시되어 있는 것을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 뉴클레오시드에 대한 친화성이 상승된 산성 포스파타제[참조: 일본 공개특허공보 제(평)10-201481호]나 뉴클레오티다제 활성이 저하된 변이형 산성 포스파타제[참조; WO96/37603], 인산에스테르 가수분해 활성이 저하된 변이형 산성 포스파타제[참조: US6010851호] 등을 사용할 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다.
실시예 1
<푸린뉴클레오시드포스포리라제 결손주의 구축과 배양 평가>
(1) 푸린뉴클레오시드포스포리라제(pupG) 결손주의 구축
바실러스·서브틸리스(B. subtilis 168 Marburg주; ATCC 6051) 유래로, 푸린오페론 리프레서 유전자(purR), 석시닐-AMP 신타제 유전자(purA), 푸린뉴클레오시드포스포리라제 유전자(deoD)를 결손시킨 재조합체 KMBS16[참조: 일본 공개특허공보2004-242610호]에, pupG 유전자 결손을 도입한 균주의 제작을, 이하와 같이 하여 실시하였다.
(i) pupG의 5'측 영역의 클로닝
유전자 데이터 뱅크(Genbank Accession No.NC_000964)의 정보에 기초하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 20mer, 29mer의 PCR용 프라이머를 제작하였다.
ATTGCACGGCCGTTCGTCGG (서열번호 1)
cgcagatctCCGGATTTTCGATTTCGTCC (소문자의 염기는 BglII 부위를 포함하는 태그를 나타낸다, 서열번호 2)
비. 서브틸리스 168 Marburg주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))을 실시하여, pupG 유전자 해독 개시 코돈 상류의 약 610bp과 이의 하류 약 120bp을 포함하는 증폭 단편을 수득하였다.
PCR 증폭 단편은 페놀-클로로포름 추출, 에탄올 침전에 의해 정제하여, Perfectly Blunt Cloning Kit[참조: NOVAGEN 제조]를 사용하여, 부속의 pT7Blue 플라스미드에 클로닝하였다. 본 플라스미드의 멀티 클로닝 부위의 양 말단은 EcoRI와 HindIII이고, pupG 유전자 상류 영역이 EcoRI측에 있는 플라스미드 pKM48를 수득하였다.
(ii) pupG의 3'측 영역의 클로닝
유전자 데이터 뱅크(GenBank Accession NC_000964)의 정보에 기초하여, 이하의 염기 서열을 갖는, 각각 20mer, 29mer의 PCR용 프라이머를 제작하였다.
CAAAGATCTGTCCAGCCTGG (서열번호 3)
cgcctgcagTGCCTTTATCTAAAGCTTCC (소문자의 염기는 PstI 부위를 포함하는 태그를 나타낸다, 서열번호 4)
비. 서브틸리스 168 Marburg주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, pupG 유전자 해독 종지 코돈 상류의 약 340bp과 이의 하류 약 400bp을 포함하는 증폭 단편을 수득하였다.
pupG의 5'측 영역의 클로닝의 경우와 동일하게 하여, pT7Blue 플라스미드에 클로닝하여, pupG 유전자 하류 영역이 EcoRI측에 있는 플라스미드 pKM49를 수득하였다.
(iii) DpupG 단편의 클로닝
pKM49를 SpeI로 처리후, Klenow fragment에 의해 평활화하여, 추가로 PstI로 처리하여, 약 740bp의 DNA 단편을 잘라 내었다. 당해 단편을 pKM48을 BglII로 처리, Klenow fragment에 의해 평활화한 후, PstI로 처리한 플라스미드 단편과 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시켜 pKM75를 수득하였다. 당해 플라스미드는 pupG 구조 유전자 내에서 약 360bp이 결손된 pupG 결손 DNA를 포함하는 약 1470bp의 삽입체를 유지한다.
(iv) pupG 파괴용 플라스미드의 구축
pKM75을 SacI와 PstI로 처리하여 삽입체를 잘라내고, 당해 단편을 동효소로 처리한 염색체 재조합용 벡터 pJPM1[참조: Mueller et. al., J. Bacteriol., 1992, 174, 4361-4373]와 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시켜, pKM76를 수득하였다.
수득된 플라스미드 pKM76를 사용하여, Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한 KMBS16주의 컴피텐트 세포를 형질 전환하고, 2.5㎍/ml의 클로람페니콜을 포함하는 LB 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다(1회 재조합주).
수득된 1회 재조합주를 클로람페니콜 함유 LB 배지 10ml에 식균하고, 37℃에서 계대 배양을 수일 동안 실시하여, LB 한천 배지 위에서 클로람페니콜 감수성으로 된 콜로니를 스크리닝하였다. 수득된 클로람페니콜 감수성 콜로니로부터 염색체 DNA를 제조하고, 서열번호 5와 6의 프라이머를 사용하여 상기와 동일하게 하여 PCR를 실시하고, 염색체 위의 pupG 유전자가 내부가 결손된 pupG 유전자(ΔpupG)와 2회 재조합에 의해 치환된 균주(purR::spc purA::erm deoD::kan ΔpupG)를 동정하였다. 이렇게 하여 수득된 2회 재조합주 중의 1주를 KMBS93이라고 명명하였다.
GGTCTGAGCTTTGCGAACC (서열번호 5)
CGCCTGCAGTGCCTTTATCTAAAGCTTCC (서열번호 6)
(2) 바실러스·서브틸리스(B. subtilis 168 Marburg주; ATCC 6051) 유래로, 푸린오페론 리프레서 유전자(purR), 석시닐-AMP 신타제 유전자(purA)를 결손시킨 재조합체 KMBS13[참조: 일본 공개특허공보 2004-242610호]에, pupG 유전자 결손을 도입한 균주의 제작을, 이하와 같이 하여 실시하였다.
pKM76를 사용하여 Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한 KMBS13주의 컴피텐트 세포를 형질 전환하여, 2.5㎍/ml의 클로람페니콜을 포함하는 LB 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다(1회 재조합주).
수득된 1회 재조합주를 LB 배지 10ml에 식균하고, 37℃에서 계대 배양을 수일 동안 실시하여, 클로람페니콜 함유 LB 한천 배지 위에서 클로람페니콜 감수성으로 된 콜로니를 스크리닝하였다. 수득된 클로람페니콜 감수성 콜로니로부터 염색체 DNA를 제조하고, 서열번호 5와 6의 프라이머를 사용하여 상기와 동일하게 하여 PCR를 실시하여, 염색체 위의 pupG 유전자가 내부가 결손된 pupG 유전자(ΔpupG)와 2회 재조합에 의해 치환된 균주(purR::spc purA::erm ΔpupG)를 동정하였다. 이렇 게 하여 수득된 2회 재조합주 중의 1주를 KMBS113이라고 명명하였다.
(3) pupG 유전자 결손주의 푸린뉴클레오시드 생산
pupG 유전자 결손주(KMBS93주와 KMBS113) 및 대조군 주인 KMBS16를, PS 배지 플레이트(가용성 녹말 30g/L, 효모 추출물 5g/L, 폴리펩톤 5g/L, 한천 20g/L, KOH로 pH 7.0으로 조정) 위에 남김없이 도포하고, 34℃에서 밤새 배양하였다. 1/8 플레이트분의 균체를 500ml용의 판구 플라스크중의 발효 배지 20ml에 접종한 후, 탄산칼슘을 50g/L이 되도록 가하여, 34℃에서 진탕 배양하였다. 배양 개시후 100시간째에 샘플링하여, 배양액 중에 포함되는 이노신 및 히포크산틴량을 공지의 방법으로 측정하였다. 대조군 주인 KMBS16주에서는, 배양액 중에 다량의 히포크산틴이 검출되었지만, pupG 유전자 결손주인 KMBS93주와 KMBS113의 히포크산틴 축적은 대단히 낮은 양이고, HPLC의 피크로서 명확히 검출할 수 없었다(표 1). 또한, KMBS93주와 KMBS113의 이노신의 축적은 대조군 주인 KMBS16주의 이노신 축적보다도 높았다.
[발효 배지 조성]
글루코스 80g/L
KH2P04 1g/L
NH4Cl 32g/L
두농(豆濃)(T-N)* 1.35g/L
DL-메티오닌 O.3g/L
L-트립토판 0.02g/L
아데닌 0.1g/L
MgSO4 0.4g/L
FeS04 0.01g/L
MnS04 0.01g/L
GD113 0.01ml/L
(KOH로 pH 7.0으로 조정)
탄산칼슘 50g/L
*: 단백 가수분해물
비.서브틸리스 OD562 히포크산틴 g/L 이노신 g/L
KMBS16 8.84 2.27 1.65
KMBS93 7.02 ND*1 4.49
KMBS113 7.02 ND*1 5.43
*사용한 HPLC의 조건에서는, 피크로서 명확히 검출할 수 없었다.
실시예 2
(1) 변이형 guaB 유전자의 도입
상술의 바실러스·서브틸리스(B. subtilis 168 Marburg주; ATCC 6051) 유래로, 푸린오페론 리프레서 유전자(purR), 석시닐-AMP 신타제 유전자(purA), 푸린뉴클레오시드포스포리라제 유전자(pupG)를 결손시킨 재조합체 KMBS1113에, IMP 탈수소효소 유전자 guaB에서의 guaB(Al) 변이를 도입한 균주의 제작을 이하와 같이 하여 실시하였다. 또한, guaB (A1) 변이란 서열번호 62의 226 위치의 알라닌이 발린으로 치환된 리키(leaky) 변이 (IMP 데하이드로게나제 활성을 저하시키는 변이)이다.
(i) 비. 서브틸리스 168 Marburg 유래주의 야생형 guaB 유전자 중앙에 카나마이신 내성 유전자가 삽입된 균주의 제작
guaB 유전자 상류 영역의 증폭에서는, 유전자 데이터 뱅크(GenBank Accession NC_000964 및 VO1547)의 정보에 기초하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 34mer, 50mer의 PCR용 프라이머를 제작하였다.
cgcggatccGGCTTAACGTTCGACGATGTGCTGC (소문자의 염기는 BamHI 부위를 포함하는 태그-서열번호 7)
gctttgcccattctatagatatattGAGTCATTGTATCGCCAGTTACACC (소문자의 염기는 pDG783(BGSC) 위에 클로닝되어 있는 카나마이신 내성 유전자(kan)의 프로모터 상류 영역의 서열, 서열번호 8)
비. 서브틸리스 168 Marburg주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 1분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, guaB 유전자 5'측 영역의 증폭 단편(약 710bp)을 수득하였다.
guaB 유전자 3'측 영역의 증폭에서는, 유전자 데이터 뱅크(GenBank Accession NC_000964 및 VO1547)의 정보에 기초하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 50mer, 34mer의 PCR용 프라이머를 제작하였다.
cctagatttagatgtctaaaaagctGTGATTGTTATCGATACAGCTCACG (서열번호 9: 소문자의 염기는 pDG783(BGSC) 위에 클로닝되어 있는 카나마이신 내성 유전자(kan)의 구조 유전자 하류 영역의 서열)
cgcgaattcGTAATCTGTACGTCATGCGGATGGC (소문자의 염기는 EcoRI 부위를 포함하는 태그, 서열번호 10)
비. 서브틸리스 168 Marburg주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 1분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, guaB 유전자 3'측 영역의 증폭 단편(약 730bp)을 수득하였다.
kan 유전자의 3'측 영역의 PCR법에 의한 증폭에서는, 유전자 데이터 뱅크(GenBank Accession No.VO1277 및 NC_000964)의 정보에 기초하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 50mer의 PCR용 프라이머를 제작하였다.
ggtgtaactggcgatacaatgactcAATATATCTATAGAATGGGCAAAGC (소문자의 염기는 guaB 상류 영역의 서열로 서열번호 8의 3' 말단 영역과 상보하도록 디자인되어 있다, 서열번호 11)
cgtgagctgtatcgataacaatcacAGCTTTTTAGACATCTAAATCTAGG (소문자의 염기는 guaB 하류 영역의 서열로 서열번호 9의 3' 말단 영역과 상보하도록 디자인되어 있다, 서열번호 12)
카나마이신 내성 유전자(kan)가 탑재되어 있는 플라스미드, 예를 들면 pDG783 등의 플라스미드 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 1분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 하고, kan 유전자를 포함하는 약 1150bp의 증폭 단편을 수득하였다.
kan 유전자를 삽입한 guaB 영역의 재조합 PCR법에 의한 증폭에서는, 상기한바와 같이 하여 증폭한 3종의 DNA 단편을 MicroSpin Column S-400[참조: Amersham Pharmacia Biotech 제조]로 정제후, 적량을 혼합한 것을 주형으로 하고, 서열번호 7 및 10을 사용하여, PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, kan 유전자를 삽입한 guaB 영역의 증폭 단편을 수득하였다.
취득한 kan 유전자를 삽입한 guaB 영역(guaB::kan)의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동후, 목적으로 하는 단편을 겔로부터 추출하였다. 이렇게 하여 정제한 DNA 단편을 사용하여, Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한 비. 서브틸리스 표준주의 컴피텐트 세포를 형질 전환하고, 2.5㎍/ml의 카나마이신과 20㎍/ml의 구아닌을 포함하는 LB 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다. 이러한 콜로니로부터 염색체 DNA를 제조하여, 서열번호 7 및 10을 사용한 PCR법에 의해, 염색체 위의 guaB 영역이, 내부가 카나마이신 내성 유전자로 치환된 guaB 영역(guaB::kan)과 2회 재조합에 의해 치환된 균주를 동정하였다. 이렇게 하여 수득된 재조합주는 구아닌 요구주로 되어 있고, 이 중의 1주를 KMBS193라고 명명하였다.
(ii) 비. 서브틸리스 168 Marburg 유래주의 guaB 변이(Al)가 삽입된 균주의 제작
guaB 유전자 5'측 영역의 증폭에서는, 유전자 데이터 뱅크(GenBank Accession NC_000964)의 정보에 기초하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 25mer, 46mer의 PCR용 프라이머를 제작하였다.
CATAAAATGTACGCATAGGCCATTC (서열번호 13)
TTGTATCGCCAGTTACACCAACTaCCGCGCCAACGATCAGGCGGCC (소문자의 염기는 변이점을 나타내고 있다, 서열번호 14)
비. 서브틸리스 168 Marburg주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 1분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, guaB 유전자 5' 말단 영역 및 5'측 영역의 증폭 단편(약 1210bp)을 수득하였다.
다음에 guaB 유전자 3'측 영역을 증폭시켰다. 유전자 데이터 뱅크(GenBank Accession NC_000964)의 정보에 기초하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 46mer, 26mer의 PCR용 프라이머를 제작하였다.
GGCCGCCTGATCGTTGGCGCGGtAGTTGGTGTAACTGGCGATACAA (소문자의 염기는 변이점을 나타내고 있다, 서열번호 14 프라이머와 상보한다, 서열번호 15)
CCTTGATCAATTGCTTCCAATAACAG (서열번호 16)
비. 서브틸리스 168 Marburg주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 1분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 96O0(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, guaB 유전자 3' 말단 영역 및 하류 영역의 증폭 단편(약 1220bp)을 수득하였다.
guaB 변이(Al)를 도입한 guaB 영역의 재조합 PCR법에 의한 증폭에서는, 상기와 같이 하여 증폭된 2종의 DNA 단편을, 아가로스 전기영동후, 목적으로 하는 DNA 단편을 정제하였다. 양 DNA 단편의 적량을 혼합한 것을 주형으로 하고, 서열번호 13 및 16을 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 96O0(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, guaB 변이(Al)가 도입된 guaB 영역의 증폭 단편을 수득하였다.
취득한 guaB 변이(Al)가 도입된 guaB 영역(guaB(Al))의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동후, 목적으로 하는 단편을 겔로부터 추출하였다. 이렇게 하여 정제한 DNA 단편을 사용하여, Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한 KMBS193의 컴피텐트 세포를 형질 전환하여, 최소 배지 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다. 이러한 콜로니로부터 염색체 DNA를 제조하고, 서열번호 13 및 16을 사용한 PCR법에 의해, 염색체 위의 guaB::kan 영역이, guaB(Al) 변이를 포함하는 guaB 영역과 2회 재조합에 의해 치환된 균주를 동정하였다. 이렇게 하여 수득된 재조합주는 구아닌 비요구주로 되어 있고, 이 중의 1주를 YMBS9라고 명명하였다.
(iii) 이노신 생산균 KMBS113에 guaB 변이(Al)가 도입된 균주의 제작
KMBS193(guaB::kan)의 염색체 DNA를 제조하고, 이를 사용하여 Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한, KMBS113주의 컴피텐트 세포를 형질 전환하고, 2.5㎍/ml의 카나마이신과 20㎍/ml의 구아닌을 포함하는 LB 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다. 이러한 균주는 구아닌 요구로 되어 있고, 이 중의 1주를 YMBS6(purR::spc purA::erm ΔpupG guaB::kan trpC2)라고 명명하였다.
다음에, YMBS9(guaB(Al))의 염색체 DNA를 제조하고, 이를 사용하여 Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한, YMBS6주의 컴피텐트 세포를 형질 전환하여, 20㎍/ml의 아데닌을 포함하는 최소 배지 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다. 이러한 균주는 구아닌 리키 요구로 되어 있고, 이 중의 1주를 YMBS2(purR::spc purA::erm guaB(Al) ΔpupG trpC2)라고 명명하였다.
(2) guaB 변이를 도입한 이노신 생산 균주의 푸린계 핵산 생산
guaB 변이(Al) 도입한 이노신 생산 균주(YMBS2주) 및 대조군 주인 KMBS113를, PS 배지 플레이트(가용성 녹말 30g/L, 효모 추출물 5g/L, 폴리펩톤 5g/L, 한천 20g/L, KOH로 pH 7.0으로 조정) 위에 남김없이 도포하고, 34℃에서 밤새 배양하였다. 1/8 플레이트분의 균체를 500ml용의 판구 플라스크중의 발효 배지 20ml에 접종한 후, 탄산칼슘을 50g/L가 되도록 가하여, 34℃에서 진탕 배양하였다. 배양 개시후 96시간째에 샘플링하여, 배양액 중에 포함되는 이노신 및 히포크산틴량을 공지의 방법으로 측정하였다.
[발효 배지 조성]
글루코스 60g/L
KH2PO4 1g/L
NH4Cl 32g/L
두농(T-N)* 1.35g/L
DL-메티오닌 0.3g/L
L-트립토판 0.02g/L
아데닌 0.1g/L
MgS04 0.4g/L
FeS04 0.01g/L
MnSO4 0.01g/L
GD113 0.01ml/L
(KOH로 pH 7.0으로 조정)
탄산칼슘 50g/L
* 단백 가수분해물
비.서브틸리스 OD610 이노신 g/L 크산토신 g/L
KMBS113 17.4 3.1 0.06
YMBS2 6.43 3.7 0.05
실시예 3
<푸린오페론 증폭주의 제작>
(1) <Ppur 파괴주의 제작>
바실러스·서브틸리스(B. subtilis 168 Marburg주; ATCC 6051) 유래로, 푸린오페론 프로모터(Ppur)를 파괴한 균주의 제작을, 이하와 같이 하여 실시하였다.
(i) Ppur 상류 영역의 PCR법에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(Genbank Accession NC_000964 및 VO1277)의 정보에 기초하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 34mer, 50mer의 PCR용 프라이머를 제작하였다.
cgcggatccTTATTTAGCGGCCGGCATCAGTACG (서열번호 17; 소문자의 염기는 BamHI 부위를 포함하는 태그)
cgtttgttgaactaatgggtgctttATGGATAATGTCAACGATATTATCG (서열번호 18; 소문자의 염기는 pC194 위에 클로닝되어 있는 클로람페니콜 내성 유전자(cat)의 프로모터 상류 영역의 서열)
비. 서브틸리스 168 Marburg주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 1분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, Ppur-35 서열과 상류의 약 730bp을 포함하는 증폭 단편을 수득하였다.
(ii) Ppur 하류 영역의 PCR법에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(Genbank Accession NC_000964 및 VO1277)의 정보에 기초하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 50mer, 34mer의 PCR용 프라이머를 제작하였다.
acagctccagatccatatccttcttCCTCATATAATCTTGGGAATATGGC (서열번호 19; 소문자의 염기는 pC194 위에 클로닝되어 있는 클로람페니콜 내성 유전자(cat)의 구조 유전자 하류 영역의 서열)
cgcggatccTCTCTCATCCAGCTTACGGGCAAGG (서열번호 20; 소문자의 염기는 BamHI 부위를 포함하는 태그)
비. 서브틸리스 168 Marburg주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 1분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, purE 유전자 해독 개시 코돈 상류의 약 230bp과 이의 하류 약 440bp을 포함하는 증폭 단편을 수득하였다.
(iii) cat 유전자의 PCR법에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(Genbank Accession No.VO1277 및 NC_000964)의 정보에 기초하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 50mer의 PCR용 프라이머를 제작하였다.
cgataatatcgttgacattatccatAAAGCACCCATTAGTTCAACAAACG (서열번호 21; 소문자의 염기는 Ppur 상류 영역의 서열로 서열번호 18의 3' 말단 영역과 상보하도록 디자인되어 있다)
gccatattcccaagattatatgaggAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT (서열번호 22; 소문자의 염기는 purE 유전자 해독 개시 코돈 상류 영역의 서열로 서열번호 19의 3' 말단 영역과 상보하도록 디자인되어 있다).
클로람페니콜 내성 유전자(cat)가 탑재되어 있는 플라스미드, 예를 들면 pC194 등의 플라스미드 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, cat 유전자를 포함하는 약 980bp의 증폭 단편을 수득하였다.
(iv) cat 유전자를 삽입한 Ppur 영역의 재조합 PCR법에 의한 증폭
(i) 내지 (iii)에서 증폭한 DNA 단편을 MicroSpin Column S-400[참조: Amersham Pharmacia Biotech 제조]로 정제후, 적량을 혼합한 것을 주형으로 하고, 서열번호 17 및 20을 사용하여, PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, cat 유전자를 삽입한 Ppur 영역의 증폭 단편을 수득하였다.
(v) Ppur를 파괴한 균주의 제작
(iv)에서 취득한 cat 유전자를 삽입한 Ppur 영역(Ppur::cat)의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동후, 목적으로 하는 단편을 겔로부터 추출하였다. 이렇게 하여 정제한 DNA 단편을 사용하여, Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한 비. 서브틸리스 표준주의 컴피텐트 세포를 형질 전환하고, 2.5㎍/ml의 클로람페니콜을 포함하는 LB 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다. 이러한 콜로니로부터 염색체 DNA를 제조하여, (iv)에 나타낸 PCR법에 의해, 염색체 위의 Ppur 영역이, 내부에 클로람페니콜 내성 유전자가 삽입된 Ppur 영역(Ppur::cat)과 2회 재조합에 의해 치환된 균주를 동정하였다. 이렇게 하여 수득된 재조합주는 아데닌 요구주로 되어 있고, 이 중의 1주를 KMBS198라고 명명하였다.
(2) <푸린오페론 프로모터 변이주의 제작>
바실러스·서브틸리스(B. subtilis 168 Marburg주; ATCC 6051) 유래로, Ppur의 -10 서열을 컨센서스 서열 TATAAT(Ppur1), 또는 TATGAT(Ppur3), TAAAAT(Ppur5)이 되도록 개변한 균주의 제작을, 이하와 같이 하여 실시하였다.
(i) -10 서열 개변을 포함하는 Ppur 상류 영역의 PCR법에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(Genbank Accession No.NC_000964)의 정보에 기초하여, 이하의 염기 서열을 갖는 서열번호 42에 나타낸 25mer의 PCR용 프라이머, 3종의 개변형 Ppur 서열을 포함하는, 38mer의 개변용 프라이머를 제작하였다.
AATAGATATAAAGAGGTGAGTCTGC (서열번호 42)
<Ppur1 개변용>
TTTTGATTTCATGTTTattataACAACGGACATGGATA (서열번호 23; 소문자의 염기는 Ppur1 서열을 나타낸다)
<Ppur3 개변용>
TTTTGATTTCATGTTTatcataACAACGGACATGGATA (서열번호 24; 소문자의 염기는 Ppur3 서열을 나타낸다)
<Ppur5 개변용>
TTTTGATTTCATGTTTattttaACAACGGACATGGATA (서열번호 25; 소문자의 염기는 Ppur5 서열을 나타낸다)
비. 서브틸리스 168 Marburg주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 1분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, Ppur과 이의 상류 서열(약 1060bp)을 포함하는 증폭 단편을 수득하였다.
(ii) -10 서열 개변을 포함하는 Ppur 하류 영역의 PCR법에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(Genbank Accession No.NC_000964)의 정보에 기초하여, 이하의 염기 서열을 갖는 서열번호 26에 나타낸 25mer의 PCR용 프라이머, 3종의 개변형 Ppur 서열을 포함하는, 38mer의 개변용 프라이머를 제작하였다.
GGGTAATAAGCAGCAGCTCACTTCC (서열번호 26)
<Ppur1 개변용>
TATCCATGTCCGTTGTtataatAAACATGAAATCAAAA (서열번호 27; 소문자의 염기는 Ppur1 서열을 나타내고 있고, 서열번호 23으로 나타낸 프라이머와 상보한다)
<Ppur3 개변용>
TATCCATGTCCGTTGTtatgatAAACATGAAATCAAAA (서열번호 28; 소문자의 염기는 Ppur3 서열을 나타내고 있고, 서열번호 24로 나타낸 프라이머와 상보한다)
<Ppur5 개변용>
TATCCATGTCCGTTGTtaaaatAAACATGAAATCAAAA (서열번호 29; 소문자의 염기는 Ppur5 서열을 나타내고 있고, 서열번호 25로 나타낸 프라이머와 상보한다)
비. 서브틸리스 168 Marburg주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 1분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, Ppur -10 서열과 이의 하류 서열(약 1070bp)을 포함하는 증폭 단편을 수득하였다.
(iii) -10 서열 개변을 포함하는 Ppur 영역의 PCR법에 의한 증폭
(i) 및 (ii)에서 증폭된 DNA 단편을 MicroSpin Column S-400[참조: Amersham Pharmacia Biotech 제조]로 정제후, 적량을 혼합한 것을 주형으로 하고, 서열번호 42 및 26을 사용하여, PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, -10 서열이 Ppur1, Ppur3, 또는 Ppur5로 개변된 Ppur 영역의 증폭 단편을 수득하였다.
(iv) -10 서열이 Ppur1, Ppur3, 또는 Ppur5로 개변된 균주의 제작
(iii)에서 취득한 -10 서열 개변을 포함하는 Ppur 영역(Ppur1, Ppur3 또는 Ppur5)의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동후, 목적으로 하는 단편을 겔로부터 추출하였다. 이렇게 하여 정제한 DNA 단편을 사용하여, Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한 KMBS198주의 컴피텐트 세포를 형질 전환하여, 최소 배지 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다. 이러한 콜로니로부터 염색체 DNA를 제조하여, (iii)에 나타낸 PCR법에 의해, 염색체 위의 Ppur::cat 영역이, Ppur1, Ppur3 또는 Ppur5와 2회 재조합에 의해 치환된 균주를 동정하였다. 이렇게 하여 수득된 재조합주는 아데닌 비요구주로 되어 있고, 이 중의 1주를 각각 KMBS210, KMBS211, KMBS222라고 명명하였다.
(3) 푸린오페론의 어테뉴에이터 서열 결손주의 제작
바실러스·서브틸리스(B. subtilis 168 Marburg주; ATCC 6051) 유래로, Ppur 하류에 위치하는 어테뉴에이터 서열을 결손시킨 균주의 제작을, 이하와 같이 하여 실시하였다. 도 1에 결손된 서열을 나타내었다.
(i) 부분 결손된 어테뉴에이터 서열과 이의 상류 영역의 PCR법에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(Genbank Accession No.NC_000964)의 정보에 기초하여, 서열번호 17에 나타낸 PCR용 프라이머와, 이하의 염기 서열을 갖는 서열번호 30에 나타낸 52mer의 프라이머를 제작하였다.
GCTTTTGTTTTCAGAAAATAAAAAATAcgATATATCCATGTCAGTTTTATCG (서열번호 30; 소문자의 염기는 어테뉴에이터 서열의 부분 서열(75bp) 결손에 의해 새롭게 만들어진 정크션)
비. 서브틸리스 168 Marburg주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 53℃, 1분; 72℃, 1분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, 부분 결손된 어테뉴에이터 서열과 이의 상류 서열(약 840bp)을 포함하는 증폭 단편을 수득하였다.
(ii) 부분 결손된 어테뉴에이터 서열과 이의 하류 영역의 PCR법에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(Genbank Accession No.NC_000964)의 정보에 기초하여, 서열번호 26에 나타낸 PCR용 프라이머와, 이하의 염기 서열을 갖는 서열번호 31에 나타낸 52mer의 프라이머를 제작하였다.
CGATAAAACTGACATGGATATATcgTATTTTTTATTTTCTGAAAACAAAAGC (서열번호 31; 소문자의 염기는 어테뉴에이터 서열의 부분 서열(75bp)의 결손에 의해 새롭게 만들어진 정크션으로, 당해 프라이머는 서열번호 30에 나타낸 프라이머와 상보한다).
비. 서브틸리스 168 Marburg주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 53℃, 1분; 72℃, 1분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 96O0(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, 부분 결손된 어테뉴에이터 서열과 이의 하류 서열(약 850bp)을 포함하는 증폭 단편을 수득하였다.
(iii) 어테뉴에이터 서열 부분 결손을 포함하는 Ppur 영역의 PCR법에 의한 증폭
(i) 및 (ii)에서 증폭된 DNA 단편을 MicroSpin Column S-400[참조: Amersham Pharmacia Biotech 제조]로 정제후, 적량을 혼합한 것을 주형으로 하고, 서열번호 17 및 26을 사용하여, PCR(94℃, 30초; 53℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, 어테뉴에이터 서열 부분 결손을 포함하는 Ppur 영역의 증폭 단편을 수득하였다.
(iv) 어테뉴에이터 서열이 부분 결손된 균주의 제작
(iii)에서 취득한 어테뉴에이터 서열 부분 결손을 포함하는 Ppur 영역(Ppur-Δatt)의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동후, 목적으로 하는 단편을 겔로부터 추출하였다. 이렇게 하여 정제한 DNA 단편을 사용하여, Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한 KMBS198주의 컴피텐트 세포를 형질 전환하여, 최소 배지 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다. 이러한 콜로니로부터 염색체 DNA를 제조하고, (iii)에 나타낸 PCR법에 의해, 염색체 위의 Ppur::cat 영역이, Ppur-Δatt와 2회 재조합에 의해 치환된 균주를 동정하였다. 이렇게 하여 수득된 재조합주는 아데닌 비요구주로 되어 있고, 이 중의 1주를 KMBS252라고 명명하였다.
(4) 바실러스·서브틸리스(B. subtilis 168 Marburg주; ATCC 6051) 유래로, Ppur의-10 서열이 컨센서스 배열 TATAAT(Ppur1)가 되도록 개변되고, 어테뉴에이터 서열을 부분 결손시킨 균주의 제작을, 이하와 같이 하여 실시하였다.
(i) -10 서열 개변(Ppur1)을 포함하는 Ppur 상류 영역의 PCR법에 의한 증폭
(3)에서 제작한 어테뉴에이터 서열을 부분 결손시킨 균주, 예를 들면 KMBS252의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 유전자 데이터 뱅크(Genbank Accession No.NC_000964)의 정보에 기초하여 제작한, 서열번호 42 및 서열번호 23에 나타낸 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 1분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, Ppur1를 포함하는 Ppur 상류 영역의 증폭 단편(약 1060bp)을 수득하였다.
(ii) Ppur1 및 부분 결손된 어테뉴에이터 영역과 이의 하류 영역의 PCR법에 의한 증폭
(3)에서 제작한 어테뉴에이터 서열을 부분 결손시킨 균주, 예를 들면 KMBS252의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 유전자 데이터 뱅크(Genbank Accession No. NC_00964)의 정보에 기초하여 제작한, 서열번호 26 및 서열번호 27에 나타낸 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 1분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, Ppur1 및 부분 결손된 어테뉴에이터 서열과 이의 하류 영역의 증폭 단편(약 990bp)을 수득하였다.
(iii) Ppur1 및 어테뉴에이터 서열의 부분 결손을 포함하는 Ppur 영역의 PCR법에 의한 증폭
(i) 및 (ii)에서 증폭된 DNA 단편을 MicroSpin Column S-400[참조: Amersham Pharmacia Biotech 제조]로 정제후, 적량을 혼합한 것을 주형으로 하고, 서열번호 42 및 26을 사용하여, PCR(94℃, 30초; 55℃, 2분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, Ppur1 및 어테뉴에이터 서열의 부분 결손을 포함하는 Ppur 영역의 증폭 단편을 수득하였다.
(iv) -10 서열이 Ppur1가 되도록 개변되고, 어테뉴에이터 서열을 부분 결손시킨 균주의 제작
(iii)에서 취득한 Ppur1 및 어테뉴에이터 서열의 부분 결손을 포함하는 Ppur 영역(Ppur1-Δatt)의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동후, 목적으로 하는 단편을 겔로부터 추출하였다. 이렇게 하여 정제한 DNA 단편을 사용하여, Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol, 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한 KMBS198주의 컴피텐트 세포를 형질 전환하여, 최소 배지 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다. 이러한 콜로니로부터 염색체 DNA를 제조하여, (iii)에 나타낸 PCR법에 의해, 염색체 위의 Ppur::cat 영역이, Ppur1-Δatt와 2회 재조합에 의해 치환된 균주를 동정하였다. 이렇게 하여 수득된 재조합주는 아데닌 비요구주로 되어 있고, 이 중의 1주를 KMBS261라고 명명하였다.
(5) 푸린오페론 전사 활성 측정용 플라스미드의 구축
유전자 데이터 뱅크(Genbank Accession No.NC_000964)의 정보에 기초하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 29mer의 PCR용 프라이머를 제작하였다.
cgcaagcttTATTTTCTGAAAACAAAAGC (서열번호 32; 소문자의 염기는 HindIII 부위를 포함하는 태그)
cgcggatccTTTCTCTTCTCTCATCCAGC (서열번호 33; 소문자의 염기는 BamHI 부위를 포함하는 태그).
비. 서브틸리스 168 Marburg주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, purE 구조 유전자의 일부(445bp), 및 이의 상류의 SD 서열을 포함하는 영역(40bp)의 증폭 단편을 수득하였다.
PCR 증폭 단편은, MinElute PCR 정제 키트(QIAGEN)에 의해 클린업하고, HindIII와 BamHI로 제한 처리하였다. 정제한 DNA 단편을 사용하여, 동효소로 처리한 pMutin4[참조: Vagner, V., et. al., Microbiology, 1998, 144, 3097-3104]의 lacZ의 상류에, T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시켜 pKM191를 수득하였다. pKM191은 purE 구조 유전자의 일부(445bp), 및 SD 서열을 함유하는 이의 상류 영역(40bp)을 함유한다.
(6) 푸린오페론 전사 활성 측정용 균주의 제작
푸린오페론 전사 활성 측정용 균주의 구축을 이하와 같이 하여 실시하였다. (i) Ppur 파괴를 도입한 균주의 제작
KMBS198(Ppur::cat)의 염색체 DNA를 제조하고, 이를 사용하여 Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한, purR 결손(purR::spc)을 갖는 KMBS4주[참조: 일본 공개특허공보 2004-242610호]를 형질 전환하고, 2.5㎍/ml의 클로람페니콜을 포함하는 LB 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다. 이렇게 하여 수득된 재조합주는 purR 결손, 아데닌 요구주로 되어 있고, 이 중의 1주를 KMBS278라고 명명하였다.
(ii) purR 결손 및 개변형 Ppur 영역을 갖는 균주의 제작
KMBS210, KMBS211, KMBS222, KMBS252, KMBS261주의 염색체 DNA를 제조하고, 이를 사용하여, Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한, KMBS278주의 컴피텐트 세포를 형질 전환하여, 최소 배지 한천 플레이트 위에서 생육하고, LB 한천 플레이트 위에서 스펙티노마이신 내성인 콜로니를 취득하였다. 이러한 콜로니로부터 염색체 DNA를 제조하여, (1) (iv)에 나타낸 PCR법에 의해, 염색체 위의 Ppur::cat가 개변형 Ppur 영역과 2회 재조합에 의해 치환된 균주를 동정하였다. 이 중의 1주를 각각 KMBS283, KMBS284, KMBS285, KMBS286, KMBS287라고 명명하였다.
(iii) pKM191를 도입한 균주의 제작
푸린오페론 전사 활성 측정용 플라스미드 pKM191를 사용하여, Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한, 비. 서브틸리스 168 Marburg주, KMBS4, KMBS283, KMBS284, KMBS285, KMBS286, KMBS287의 컴피텐트 세포를 형질 전환하고, 2.5㎍/ml의 클로람페니콜을 포함하는 LB 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다. 이렇게 하여 수득된 콜로니는, pKM191의 lacZ 유전자를 함유하는 purE 유전자가 야생형 purE 유전자로 치환된 1회 재조합주이고, Ppur에 의해 lacZ가 발현되어 80㎍/ml의 X-Gal를 포함하는 LB 한천 플레이트 위에서 블루 콜로니가 된다. 이 중의 1주를 각각 KMBS292, KMBS295, KMBS296, KMBS297, KMBS298, KMBS299, KMBS300라고 명명하였다.
(7) 푸린오페론 전사 활성 측정
(6) (iii)에서 제작한 균주를 사용하여, lacZ에 의한 Ppur 전사 활성 측정을 실시하였다. 즉, 대조군 주는 168 Marburg주의 백그라운드를 갖는 KMBS292, 또는 푸린오페론 리프레서 PurR 유전자 결손의 백그라운드를 갖는 KMBS295이다. 다른 주는 purR 결손의 백그라운드로, -10 서열을 개변한 균주(KMBS296, KMBS297, KMBS298), 어테뉴에이터 서열이 부분 결손된 균주(KMBS299), -10 서열의 컨센서스 서열화(Ppur1)와 어테뉴에이터 서열의 부분 결손이 동시에 도입된 균주(KMBS300)이다.
이러한 6주를 구아닌(20mg/L)을 포함하는 LB 배지(20ml)중, 37℃에서 대수 증식 후기(0D600=1.1-1.4)까지 배양하고, 적량의 배양액을 샘플링하여 β-갈락토시다제(galacosidase) 활성 측정을 실시하였다. β-갈락토시다제 활성 측정은, Fouet 등[참조: Fouet, A. and Sonenshein, A. L. J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844]의 방법에 따랐다. 결과를 도 2에 도시하였다. 168M주와 비교하여, ΔpurR 주에서는 활성이 약 4.5배로 증가하였다. 또한, -10 서열을 Ppur1이 되도록 개변함으로써, 약 3배로 증가하였다. 또한, 어테뉴에이터 서열의 부분 결손에 의해, 활성은 약 15배가 되고, 쌍방의 변이를 갖는 주에서는 26.5배까지 활성이 증가하였다.
실시예 4
<개변형 Ppur 영역 도입주의 구축과 평가>
(1) 바실러스·서브틸리스(B. subtilis 168 Marburg주; ATCC 6051) 유래로, 푸린오페론 리프레서 유전자(purR), 석시닐-AMP 신타제 유전자(purA), 푸린뉴클레오시드포스포리라제 유전자(pupG)를 결손시키고, IMP 탈수소효소 유전자(guaB)에 구아닌 리키 요구 변이 guaB(Al)를 도입한 재조합체 YMBS2을 사용하여, 푸린오페론 프로모터를 개변, 어테뉴에이터 서열을 부분 결손시킨 균주의 제작을 이하와 같이 하여 실시하였다.
비. 서브틸리스 168 Marburg주의 염색체 DNA를 제조하고, 이를 사용하여 Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한, KMBS113주(purR:spc purA::erm ΔpupG trpC2)의 컴피텐트 세포를 형질 전환하고, 최소 배지 한천 플레이트 위에서 생육하고(즉 아데닌 비요구), LB 한천 플레이트 위에서 스펙티노마이신 내성인 콜로니를 취득하였다. 이러한 콜로니로부터 염색체 DNA를 제조하여, 실시예 1 (1) (iv)에 나타낸 PCR법에 의해, ΔpupG인 균주를 동정하였다. 이 중의 1주를 KMBS180(purR::spc ΔpupG trpC2)라고 명명하였다.
다음에, KMBS198주의 염색체 DNA를 제조하고, 이를 사용하여, Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한, KMBS180주의 컴피텐트 세포를 형질 전환하고, 2.5㎍/ml의 클로람페니콜을 포함하는 LB 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다. 이러한 콜로니로부터 염색체 DNA를 제조하여, 실시예 3 (1) (iv)에 나타낸 PCR법에 의해, 염색체 위의 Ppur 영역이, Ppur::cat와 2회 재조합에 의해 치환된 균주를 동정하였다. 이러한 균주는 아데닌 요구로 되어 있고, 이 중의 1주를 KMBS216(Ppur::cat purR::spc ΔpupG trpC2)라고 명명하였다.
다음에, KMBS252(Ppur-Δatt)의 염색체 DNA를 제조하고, 이를 사용하여 Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한, KMBS216주의 컴피텐트 세포를 형질 전환하여, 최소 배지 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다. 이러한 콜로니로부터 염색체 DNA를 제조하고, 실시예 3 (1) (iv)에 나타낸 PCR법에 의해, 염색체 위의 Ppur::cat가 Ppur-Δatt 영역과 2회 재조합에 의해 치환된 균주를 동정하였다. 이러한 균주는 아데닌 비요구로 되어 있고, 이 중의 1주를 KMBS264(Ppur-Δatt purR::spc ΔpupG trpC2)라고 명명하였다. Ppur1-Δatt가 도입된 균주 KMBS261에 관해서도, 동일한 순서에 따라서 취득하였다.
다음에, KMBS9(purA::erm trpC2; 일본 공개특허공보 2004-242610호)의 염색체 DNA를 제조하고, 이를 사용하여 Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한, KMBS264주 또는 KMBS261주의 컴피텐트 세포를 형질 전환하고, 0.5㎍/ml의 에리스로마이신을 포함하는 LB 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다. 이러한 균주는 아데닌 비요구로 되어 있고, 이 중의 1주를 KMBS265(Ppur-Δatt purR::spc purA::erm ΔpupG trpC2)와 KMBS267(Ppur1-Δatt purR::spc purA::erm ΔpupG trpC2)라고 명명하였다.
다음에, KMBS193(guaB::kan)의 염색체 DNA를 제조하고, 이를 사용하여 Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한, KMBS265주 또는 KMBS267주의 컴피텐트 세포를 형질 전환하고, 2.5㎍/ml의 카나마이신과 20㎍/ml의 구아닌을 포함하는 LB 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다. 이러한 균주는 구아닌 요구로 되어 있고, 이 중의 1주를 KMBS27O(Ppur-Δatt purR::spc purA::erm guaB::kan ΔpupG trpC2)와 KMBS271(Ppur1-Δatt purR::spc purA::erm guaB::kan ΔpupG trpC2)라고 명명하였다.
마지막으로, YMBS2(guaB(A1))의 염색체 DNA를 제조하고, 이를 사용하여 Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한, KMBS27O주 또는 KMBS271주의 컴피텐트 세포를 형질 전환하여, 20㎍/ml의 아데닌을 포함하는 최소 배지 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다. 이러한 균주는 구아닌 리키 요구로 되어 있고, 이 중의 1주를 KMBS279(Ppur-Δatt purR::spc purA::erm guaB(A1) ΔpupG trpC2)와 KMBS28O(Ppur1-Δatt purR::spc purA::erm guaB(Al) ΔpupG trpC2)라고 명명하였다.
(2) 개변형 Ppur 영역을 갖는 균주의 푸린뉴클레오시드 생산의 확인
개변형 Ppur 영역을 갖는 균주(KMBS279주와 KMBS280) 및 대조군 주인 YMBS2를, PS 배지 플레이트(가용성 녹말 30g/L, 효모 추출물 5g/L, 폴리펩톤 5g/L, 한천 2Og/L, KOH로 pH 7.0으로 조정) 위에 남김없이 도포하고, 34℃에서 밤새 배양하였다. 1/8 플레이트분의 균체를 500ml용의 판구 플라스크중의 발효 배지 20ml에 접종한 후, 탄산칼슘을 50g/L이 되도록 가하여, 34℃에서 진탕 배양하였다. 배양 개시후 96시간째에 샘플링하여 배양액 중에 포함되는 이노신 및 히포크산틴량을 공지의 방법으로 측정하였다.
[발효 배지 조성]
글루코스 60g/L
KH2PO4 1g/L
NH4Cl 32g/L
두농(T-N)* 1.35g/L
DL-메티오닌 0.3g/L
L-트립토판 0.02g/L
아데닌 0.1g/L
구아닌 0.05g/L
MgS04 0.4g/L
FeSO4 0.01g/L
MnS04 0.01g/L
GD113 0.01ml/L
(KOH로 pH 7.0으로 조정)
탄산칼슘 50g/L
*: 단백 가수분해물
Figure 112006017203159-PAT00001
실시예 5
<PRPP 신세타제 활성 증강주의 제작>
(1) 바실러스·서브틸리스(B. subtilis 168 Marburg주; ATCC 6051) 유래로, 푸린오페론 리프레서 유전자(purR), 석시닐-AMP 신타제 유전자(purA), 푸린뉴클레오시드포스포리라제 유전자(pupG)를 결손하고, IMP 탈수소효소 유전자(guaB)에 guaB 변이(Al)가 도입되고, 푸린오페론 프로모터 영역을 개변한 재조합체 KMBS280을 사용하여, PRPP 신세타제 유전자(prs)의 SD 서열을 개변한 균주의 제작을, 이하와 같이 하여 실시하였다.
(i) SD 서열 개변을 포함하는 SD 서열 상류 영역의 PCR법에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(Genbank Accession No. NC_000964)의 정보에 기초하여, 이하의 염기 서열을 갖는 서열번호 34에 나타낸 34mer의 PCR용 프라이머, 3종의 개변형 Ppur 서열을 포함하는, 46mer의 개변용 프라이머를 제작하였다.
Figure 112006017203159-PAT00002
비. 서브틸리스 168 Marburg주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 1.5분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, prs 개시 코돈 상류 서열(약 1040bp)과 하류 서열(10bp)을 포함하는 증폭 단편을 수득하였다.
(ii) SD 서열 개변을 포함하는 SD 서열 하류 영역의 PCR법에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(Genbank Accession No.NC_000964)의 정보에 기초하여, 이하의 염기 서열을 갖는 서열번호 38에 나타낸 34mer의 PCR용 프라이머, 3종의 개변형 SD 서열을 포함하는, 46mer의 개변용 프라이머를 제작하였다.
Figure 112006017203159-PAT00003
비. 서브틸리스 168 Marburg주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 1.5분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 960O(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, prs 개시 코돈 상류 서열(36bp)과 하류 서열(약 960bp)을 포함하는 증폭 단편을 수득하였다.
(iii) 개변형 SD 서열을 포함하는 영역의 PCR법에 의한 증폭
(i) 및 (ii)에서 증폭된 DNA 단편을 MicroSpin Column S-400[참조: Amersham Pharmacia Biotech 제조]로 정제후, 적량을 혼합한 것을 주형으로 하고, 서열번호 34 및 38을 사용하여, PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2.5분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, SD 서열이 개변 SD 서열 1, 2 또는 3(SD1, SD2, SD3)로 개변된 DNA의 증폭 단편을 수득하였다.
(iv) 개변형 SD 서열을 포함하는 영역의 클로닝
개변형 SD 서열(SD1, SD2, SD3)을 포함하는 영역의 DNA 단편을 클린업하여, BamHI로 처리한 DNA 단편을 동효소로 처리하여, 송아지 장 포스파타제(Calf intestinal phosphatase)에 의해 탈인산화된 염색체 재조합용 벡터 pJPM1[참조: Mueller et. al., J. Bacteriol., 1992, 174, 4361-4373]와 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시켜 pKM196(SD1), pKM197(SD2), pKM198(SD3)를 수득하였다.
(v) 개변형 SD 서열을 도입한 이노신 생산 균주의 제작
수득된 플라스미드 pKM196(SD1), pKM197(SD2), 또는 pKM198(SD3)을 사용하여, Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한 KMBS280주의 컴피텐트 세포를 형질 전환하고, 2.5㎍/ml의 클로람페니콜을 포함하는 LB 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다(1회 재조합주).
수득된 1회 재조합주를 LB 배지 10ml에 식균하여 37℃에서 계대 배양을 수일 동안 실시하고, LB 한천 배지 위에서 클로람페니콜 감수성이 된 콜로니를 스크리닝하였다. 수득된 클로람페니콜 감수성 콜로니로부터 염색체 DNA를 제조하여, 서열번호 34와 38의 프라이머를 사용하여 상기와 동일하게 하여 PCR를 실시하고, DNA 서열을 해석함으로써, 염색체 위의 prs 유전자의 SD 서열이 개변형 SD 서열과 2회 재조합에 의해 치환된 균주를 동정하였다. 이렇게 하여 수득된 2회 재조합주 중의 1주를 KMBS310(SD1), KMBS318(SD2), KMBS322(SD3)라고 명명하였다.
(2) 개변형 SD 서열을 도입한 이노신 생산 균주의 푸린뉴클레오시드 생산
개변형 SD 서열 SD1, SD2 또는 SD3을 도입한 이노신 생산 균주(KMBS310주, KMBS318주와 KMBS322주) 및 대조군 주인 KMBS280를 PS 배지 플레이트(가용성 녹말 30g/L, 효모 추출물 5g/L, 폴리펩톤 5g/L, 한천 2Og/L, KOH로 pH 7.0으로 조정) 위에 남김없이 도포하고, 34℃에서 밤새 배양하였다. 1/8 플레이트분의 균체를 500ml용의 판구 플라스크중의 발효 배지 20ml에 접종한 후, 탄산칼슘을 50g/L이 되도록 가하여, 34℃에서 진탕 배양하였다. 배양 개시후 120시간째에 샘플링하여, 배양액 중에 포함되는 이노신 및 히포크산틴량을 공지의 방법으로 측정하였다.
[발효 배지 조성]
글루코스 60g/L
KH2PO4 1g/L
NH4Cl 32g/L
두농(T-N)* 1.35g/L
DL-메티오닌 O.3g/L
L-트립토판 0.02g/L
아데닌 0.1g/L
구아노신 0.075g/L
MgS04 0.4g/L
FeS04 0.01g/L
MnSO4 0.01g/L
GD113 0.01ml/L
(KOH로 pH 7.0으로 조정)
탄산칼슘 50g/L
*: 단백 가수분해물
Figure 112006017203159-PAT00004
실시예 6
산화적 펜토스-인산 경로의 효소 활성을 상승시킨 균주의 구축
(1) 글루코스-6-인산-데하이드로게나제 활성 증폭주의 구축
바실러스·서브틸리스(B. subtilis 168 Marburg주; ATCC 6051) 유래로, 푸린오페론 리프레서 유전자(purR), 석시닐-AMP 신타제 유전자(purA), 푸린뉴클레오시드포스포리라제 유전자(pupG와 deoD)를 결손하고, IMP 탈수소효소 유전자(guaB)에 guaB 변이(Al)가 도입되고, 푸린오페론 프로모터 영역 및 PRPP 신세타제 유전자(prs)의 SD 서열을 개변한 재조합체를 사용하여, 산화적 펜토스-인산 경로의 글루코스 6-인산-데하이드로게나제를 암호화하는 유전자 zwf를 탑재한 플라스미드를 도입한 균주의 제작을, 이하와 같이 하여 실시하였다.
(i) zwf 구조 유전자 및 이의 상류 영역의 PCR에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(Genbank Accession No.NC_O00964 CAB14317. glucose-6-phospha...[gi:2634820])의 정보에 기초하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 29mer의 PCR용 프라이머를 제작하였다.
cgcggatccGCCTCTGAAAAGAACAATCC (서열번호 43; 소문자의 염기는 BamHI 부위를 포함하는 태그)
cgcggatccAAGCTCTTAAGCTTTGGGGG (서열번호 44; 소문자의 염기는 BamHI 부위를 포함하는 태그).
비. 서브틸리스 168 Marburg주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 960O[참조: 파킨엘마사 제조]를 하여, zwf 구조 유전자 및 이의 상류 영역(약 160bp)을 포함하는 증폭 단편을 수득한다.
(ii) zwf 구조 유전자 및 이의 상류 영역의 클로닝
zwf 구조 유전자 및 이의 상류 영역의 DNA 단편을 클린업하여, BamHI로 처리한 DNA 단편을 동효소로 처리하여, 송아지 장 포스파타제에 의해 탈인산화된 이.콜라이-바실러스의 셔틀 벡터 pHY30OPLK[참조: 야쿠르트사 제조]와 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시켜 zwf 유전자 증폭용 플라스미드를 취득하였다.
(iii) zwf 유전자 증폭용 플라스미드를 도입한 이노신 생산 균주의 제작
수득된 플라스미드 또는 pHY30OPLK인 벡터를 사용하여, Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한, KMBS321주의 컴피텐트 세포를 형질 전환하고, 12.5㎍/ml의 테트라사이클린을 포함하는 LB 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다. zwf를 탑재한 플라스미드가 도입된 균주 내의 1개를 TABS125라고 명명하고, PHY300PLK가 도입된 균주 중의 1개를 TABS100이라고 명명한다. 글루코스-6-인산-데하이드로게나제가 상승된 것의 확인은 이하와 같은 방법으로 실시하였다.
글루코스-6-포스페이트 1-데하이드로게나제(zwf 유전자 산물) 활성 측정법
반응 용액
50mM Tris-HCl(pH 7.6)
10mM MgSO4·7H2O
0.3mM NADP
4mM 글루코스 6-포스페이트
효소 용액
상기의 반응 용액(1ml)을 제조하고, 37℃에서 반응을 개시하였다. 생성되는 NADPH의 농도 변화를 340nm의 흡수를 측정하였다.
(iv) zwf를 탑재한 플라스미드를 도입한 이노신 생산 균주의 푸린계 핵산 생산
TABS125 또는 TABS100 주를 12.5㎍/ml의 테트라사이클린을 포함하는 PS 배지 플레이트(가용성 녹말 30g/L, 효모 추출물 5g/L, 폴리펩톤 5g/L, 한천 20g/L, KOH로 pH 7.0으로 조정) 위에 남김없이 도포하고, 34℃에서 밤새 배양하였다. 1/8 플레이트분의 균체를 500ml용의 판구 플라스크중의 발효 배지 20ml에 접종한 후, 탄산칼슘을 50g/L가 되도록 가하여, 34℃에서 진탕 배양하였다. 배양 개시 후 120시간째에 샘플링하여, 배양액 중에 포함되는 이노신 및 히포크산틴량을 공지의 방법으로 측정하였다. 이러한 방법으로 푸린뉴클레오시드 생산능이 향상된 균주를 취득한다.
[발효 배지 조성예]
글루코스 60g/L
KH2P04 1g/L
NH4Cl 32g/L
두농(T-N)* 1.35g/LD
효모 추출물 1g/L
DL-메티오닌 0.3g/L
L-트립토판 0.02g/L
아데닌 0.1g/L
구아노신 0.075g/L
MgS04 0.4g/L
FeS04 0.01g/L
MnS04 0.01g/L
GD113 0.01ml/L
(KOH로 pH 7.O로 조정)
탄산칼슘 50g/L
*: 단백 가수분해물
비.서브틸리스 주 OD610 이노신(%)*1
TABS100 8.4 18.73
8.7 19.24
TABS125 9.1 21.64
9.0 21.99
*1 소비된 글루코스에 대한 생산된 이노신의 비율 (g/g)
(2) 리보스 5-인산이소메라제 활성 증강주의 구축
바실러스·서브틸리스(B. subtilis 168 Marburg주; ATCC 6051) 유래로, 푸린오페론 리프레서 유전자(purR), 석시닐-AMP 신타제 유전자(purA), 푸린뉴클레오시드포스포리라제 유전자(pupG와 deoD)를 결손하고, IMP 탈수소효소 유전자(guaB)에 guaB 변이(Al)가 도입되고, 푸린오페론 프로모터 영역 및 PRPP 신세타제 유전자(prs)의 SD 서열을 개변한 재조합체를 사용하여, 산화적 펜토스-인산 경로 유전자 ywlF를 탑재한 플라스미드를 도입한 균주의 제작을, 이하와 같이 하여 실시하였다.
(i) ywlF 구조 유전자 및 이의 상류 영역의 PCR에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(Genbank Accession No.NC_000964 CAB15709.[gi:2636217])의 정보에 기초하여, 이하의 염기 서열을 갖는, 각각 34mer의 PCR용 프라이머를 제작하였다.
cgcgaattcGTAGATAAGTTGTCAGAAAATCTGC (서열번호 45; 소문자의 염기는 EcoRI 부위를 포함하는 태그)
cgcgaattcTGTTTCAACTCATTCATTAAACAGC (서열번호 46; 소문자의 염기는 EcoRI 부위를 포함하는 태그)
비. 서브틸리스 168 Marburg주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 1분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 96O0(참조: 파킨엘마사 제조))를 실시하여, ywlF 구조 유전자 및 이의 상류 영역(약 160bp)을 포함하는 증폭 단편을 수득한다.
(ii) ywlF 구조 유전자 및 이의 상류 영역의 클로닝
ywlF 구조 유전자 및 이의 상류 영역의 DNA 단편을 클린업하여, EcoRI로 처리한 DNA 단편을 동효소로 처리하여, 송아지 장 포스파타제(Calf intestinal phosphatase)에 의해 탈인산화된 이.콜라이-바실러스의 셔틀 벡터 pHY30OPLK[참조: 야쿠르트사 제조]와 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시켜 ywlF 유전자 증폭용 플라스미드를 취득하였다.
(iii) ywlF 유전자 증폭용 플라스미드를 도입한 이노신 생산 균주의 제작
수득된 플라스미드, 또는 pHY30OPLK를 사용하여, KMBS 321주의 컴피텐트 세포를 형질 전환하고, 12.5㎍/ml의 테트라사이클린을 포함하는 LB 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 취득하였다. yw1F를 탑재한 플라스미드가 도입된 균주 내의 1개를 TABS102라고 명명한다. 또한, 대조의 pHY300PLK가 도입된 균주 중의 1개를 TBS100이라고 명명한다.
또한, KMBS321주는 하기와 같이 작제된 주이다.
KMBS16(purR::spc purA::erm deo::kan; US2004-0166575A)에서 Fouet와 Sonenshein의 방법[J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844)에 의해 조제된 게놈 DNA를 사용하여 비.서브틸리스 168 Marburg 주의 컴피턴트 셀을 형질전환하고 5 ㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 플레이트 위헤서 생육된 콜로니를 취득한다. 이와 같이 수득된 몇 개의 콜로니 중에서 스펙티노마이신 내성 또는 에리스로마이신 내성이 되지 않은 콜로니를 선택하여 이들 내의 1주를 KMBS5 (deoD::kan)라고 명명한다.
KMBS5 (deoD::kan)에서 Fouet와 Sonenshein의 방법[J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844)에 의해 조제된 게놈 DNA를 사용하여 상기 KMBS 310주의 컴피턴트 셀을 형질전환하고 5 ㎍/ml의 카나마이신, 20㎍/ml의 구아닌을 함유하는 LB 한천 플레이트 위헤서 생육된 콜로니를 취득한다. 이와 같이 수득된 몇 개의 콜로니를 선택하여 야생형 deoD 유전자가 deoD::kan으로 선택되었으며 또한 KMBS310 유래의 전체 변이가 야생형 서열로 치환되지 않은 것을 확인할 수 있는 형질전환체 내의 1주를 KMBS321 이라고 명명한다.
리보스 5-인산이소메라제 활성이 상승된 것의 확인은, 이하와 같은 방법으로 실시하였다.
리보스 5-포스페이트 이소메라제(ywlF 유전자 산물) 활성 측정법
반응 용액
50mM HEPES(pH 7.5)
O.1M NaCl
10mM 리보스 5-포스페이트
효소 용액
상기의 반응 용액(1ml)을 제조하여, 37℃에서 반응을 개시하였다. 생성되는 리불로스 5-포스페이트의 농도 변화를 290nm의 흡수를 측정하였다.
(iv) ywlF를 탑재한 플라스미드를 도입한 이노신 생산 균주의 푸린계 핵산 생산
TABS100 또는 TABS102 주를, 12.5㎍/ml의 테트라사이클린을 포함하는 PS 배지 플레이트(가용성 녹말 30g/L, 효모 추출물 5g/L, 폴리펩톤 5g/L, 한천 20g/L, KOH로 pH 7.0으로 조정) 위에 남김없이 도포하여, 34℃에서 밤새 배양하였다. 1/8 플레이트분의 균체를, 500ml용의 판구 플라스크중의 발효 배지 20ml에 접종한 후, 탄산칼슘을 50g/L이 되도록 가하여, 34℃에서 진탕 배양하였다. 배양 개시후 120시간째에 샘플링하여, 배양액중에 포함되는 이노신 및 히포크산틴량을 공지의 방법으로 측정하였다 (표 6). 리보스-5-인산이소메라제 활성 증강주는 비개변주와 비교하여 이노신 생산능이 향상된다.
[발효 배지 조성예]
글루코스 60g/L
KH2PO4 1g/L
NH4Cl 32g/L
두농(T-N)* 1.35g/L
효모 추출물 1g/L
DL-메티오닌 0.3g/L
L-트립토판 0.02g/L
아데닌 0.1g/L
구아노신 O.075g/L
MgSO4 0.4g/L
FeS04 0.01g/L
MnSO4 0.01g/L
GD113 0.01m1/L
(KOH로 pH 7.0으로 조정)
탄산칼슘 50g/L
*: 단백 가수분해물
비.서브틸리스 주 OD610 잔류 글루코스 g/L 이노신 g/L 이노신 (%)*1
TABS100 8.4 0 5.77 18.73
TABS102 9.8 1.3 5.96 20.21
*1 소비된 글루코스에 대한 생산된 이노신의 비율 (g/g)
본 발명의 바실러스속 세균을 사용함으로써, 푸린뉴클레오시드 및/또는 푸린뉴클레오티드와 같은 푸린계 물질의 생산 효율을 향상시킬 수 있다.
<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance <130> OP-C6032 <150> JP 2005-067560 <151> 2005-03-10 <150> JP 2005-280186 <151> 2005-09-27 <160> 62 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 1 attgcacggc cgttcgtcgg 20 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 2 cgcagatctc cggattttcg atttcgtcc 29 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 3 caaagatctg tccagcctgg 20 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 4 cgcctgcagt gcctttatct aaagcttcc 29 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 5 ggtctgagct ttgcgaacc 19 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 6 cgcctgcagt gcctttatct aaagcttcc 29 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 7 cgcggatccg 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Artificial sequence <220> <223> primer <400> 15 ggccgcctga tcgttggcgc ggtagttggt gtaactggcg atacaa 46 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 16 ccttgatcaa ttgcttccaa taacag 26 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 17 cgcggatcct tatttagcgg ccggcatcag tacg 34 <210> 18 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 18 cgtttgttgaactaatgggt gctttatgga taatgtcaac gatattatcg 50 <210> 19 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 19 acagctccag atccatatcc ttcttcctca tataatcttg ggaatatggc 50 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 20 cgcggatcct ctctcatcca gcttacgggc aagg 34 <210> 21 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 21 cgataatatc gttgacatta tccataaagc acccattagt tcaacaaacg 50 <210> 22 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 22 gccatattcc caagattata tgaggaagaa ggatatggat ctggagctgt 50 <210> 23 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 23 ttttgatttc atgtttatta taacaacgga catggata 38 <210> 24 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 24 ttttgatttc atgtttatca taacaacgga catggata 38 <210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 25 ttttgatttc atgtttattt taacaacgga catggata 38 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 26 gggtaataag cagcagctca cttcc 25 <210> 27 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 27 tatccatgtc cgttgttata ataaacatga aatcaaaa 38 <210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 28 tatccatgtc cgttgttatg ataaacatga aatcaaaa 38 <210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 29 tatccatgtc cgttgttaaa ataaacatga aatcaaaa 38 <210> 30 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 30 gcttttgttt tcagaaaata aaaaatacga tatatccatg tcagttttat cg 52 <210> 31 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 31 cgataaaact gacatggata tatcgtattt tttattttct gaaaacaaaa gc 52 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 32 cgcaagcttt attttctgaa aacaaaagc 29 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 33 cgcggatcct ttctcttctc tcatccagc 29 <210> 34 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 34 cgcggatcca acatacacaa agagaagcga aagc 34 <210> 35 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 35 gattagacat ggataaacct ccttatttag gattattttt tatgaa 46 <210> 36 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 36 gattagacat ggataaacct cctaatttag gattattttt tatgaa 46 <210> 37 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 37 gattagacat ggataaacct ccgtatttag gattattttt tatgaa 46 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 38 cgcggatccg gtttagctga acagatagct gactgattgc 40 <210> 39 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 39 ttcataaaaa ataatcctaa ataaggaggt ttatccatgt ctaatc 46 <210> 40 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 40 ttcataaaaa ataatcctaa attaggaggt ttatccatgt ctaatc 46 <210> 41 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 41 ttcataaaaa ataatcctaa atacggaggt ttatccatgt ctaatc 46 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 42 aatagatata aagaggtgag tctgc 25 <210> 43 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 43 cgcggatccg cctctgaaaa gaacaatcc 29 <210> 44 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 44 cgcggatcca agctcttaag ctttggggg 29 <210> 45 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 45 cgcgaattcg tagataagtt gtcagaaaat ctgc 34 <210> 46 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 46 cgcgaattct gtttcaactc attcattaaa cagc 34 <210> 47 <211> 1470 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(1470) <223> <400> 47 gtg aaa aca aac caa caa cca aaa gca gta att gtc ata ttc ggt gca 48 Met Lys Thr Asn Gln Gln Pro Lys Ala Val Ile Val Ile Phe Gly Ala 1 5 10 15 act gga gat tta gca aaa cga aaa ttg tat ccg tct att cac cgt tta 96 Thr Gly Asp Leu Ala Lys Arg Lys Leu Tyr Pro Ser Ile His Arg Leu 20 25 30 tat caa aac gga caa atc gga gaa gag ttt gca gtg gta gga gtt gga 144 Tyr Gln Asn Gly Gln Ile Gly Glu Glu Phe Ala Val Val Gly Val Gly 35 40 45 aga aga cct tgg tct aat gag gat ctt cgc caa act gtt aaa aca tcc 192 Arg Arg Pro Trp Ser Asn Glu Asp Leu Arg Gln Thr Val Lys Thr Ser 50 55 60 att tcc tca tct gca gat aag cat ata gat gat ttc acg tct cat ttt 240 Ile Ser Ser Ser Ala Asp Lys His Ile Asp Asp Phe Thr Ser His Phe 65 70 75 80 tac tat cac ccg ttt gac gtg aca aac cct ggt tct tat caa gag cta 288 Tyr Tyr His Pro Phe Asp Val Thr Asn Pro Gly Ser Tyr Gln Glu Leu 85 90 95 aac gta ttg ctt aac cag ctg gaa gat aca tat caa att cct aac aac 336 Asn Val Leu Leu Asn Gln Leu Glu Asp Thr Tyr Gln Ile Pro Asn Asn 100 105 110 aga atg ttc tac ttg gca atg gct cct gaa ttc ttc gga acg att gca 384 Arg Met Phe Tyr Leu Ala Met Ala Pro Glu Phe Phe Gly Thr Ile Ala 115 120 125 aaa aca tta aaa tca gag ggt gta aca gct aca acc ggc tgg tcc cgc 432 Lys Thr Leu Lys Ser Glu Gly Val Thr Ala Thr Thr Gly Trp Ser Arg 130 135 140 ctt gtc atc gaa aaa ccg ttc ggc cat gat ctg cca agc gca cag gca 480 Leu Val Ile Glu Lys Pro Phe Gly His Asp Leu Pro Ser Ala Gln Ala 145 150 155 160 ttg aat aaa gaa atc cgc gaa gca ttt acg gaa gat caa att tac aga 528 Leu Asn Lys Glu Ile Arg Glu Ala Phe Thr Glu Asp Gln Ile Tyr Arg 165 170 175 atc gac cat tat cta ggc aaa caa atg gtt cag aac att gaa gtg att 576 Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Gln Met Val Gln Asn Ile Glu Val Ile 180 185 190 cga ttt gcc aat gcg att ttc gaa ccg ctt tgg aca aac cgc tac att 624 Arg Phe Ala Asn Ala Ile Phe Glu Pro Leu Trp Thr Asn Arg Tyr Ile 195 200 205 tca aac att caa atc aca tct agc gaa tca cta ggc gtt gaa gac cgc 672 Ser Asn Ile Gln Ile Thr Ser Ser Glu Ser Leu Gly Val Glu Asp Arg 210 215 220 gca aga tat tac gaa aaa tca ggc gcc ctt cgc gac atg gtg caa aac 720 Ala Arg Tyr Tyr Glu Lys Ser Gly Ala Leu Arg Asp Met Val Gln Asn 225 230 235 240 cat att atg cag atg gtt gcc ctt ctt gca atg gag ccg cct atc aaa 768 His Ile Met Gln Met Val Ala Leu Leu Ala Met Glu Pro Pro Ile Lys 245 250 255 ttg aac aca gaa gaa atc cgc agc gag aaa gtg aag gtg ctg aga gca 816 Leu Asn Thr Glu Glu Ile Arg Ser Glu Lys Val Lys Val Leu Arg Ala 260 265 270 ctg cgt cct att gca aaa gac gaa gtg gat gaa tac ttt gtg cgc gga 864 Leu Arg Pro Ile Ala Lys Asp Glu Val Asp Glu Tyr Phe Val Arg Gly 275 280 285 caa tat cat gct ggt gaa att gac ggt gta ccg gtt cct gct tat aca 912 Gln Tyr His Ala Gly Glu Ile Asp Gly Val Pro Val Pro Ala Tyr Thr 290 295 300 gat gaa gat aat gtc gct cct gac tcc aat aca gaa acc ttt gtt gcc 960 Asp Glu Asp Asn Val Ala Pro Asp Ser Asn Thr Glu Thr Phe Val Ala 305 310 315 320 ggc aag ctc ttg atc gac aac ttc aga tgg gct ggt gtt cca ttc tac 1008 Gly Lys Leu Leu Ile Asp Asn Phe Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr 325 330 335 atc aga acc gga aaa cga atg aga gaa aag tcc aca aaa att gtc gtt 1056 Ile Arg Thr Gly Lys Arg Met Arg Glu Lys Ser Thr Lys Ile Val Val 340 345 350 caa ttt aag gac att ccg atg aac ctg tac tac ggt aat gaa aac aac 1104 Gln Phe Lys Asp Ile Pro Met Asn Leu Tyr Tyr Gly Asn Glu Asn Asn 355 360 365 atg aat ccg aac ttg ctt gtc att cat att cag cct gac gaa ggc att 1152 Met Asn Pro Asn Leu Leu Val Ile His Ile Gln Pro Asp Glu Gly Ile 370 375 380 acg ctt tac tta aat gct aaa aag ctt ggc gga gca gca cac gca cag 1200 Thr Leu Tyr Leu Asn Ala Lys Lys Leu Gly Gly Ala Ala His Ala Gln 385 390 395 400 cca atc aaa ctc gat tat tgc agc aat tgc aat gac gag ttg aac acc 1248 Pro Ile Lys Leu Asp Tyr Cys Ser Asn Cys Asn Asp Glu Leu Asn Thr 405 410 415 cct gaa gca tat gaa aaa cta att cac gac tgt ctt ctt ggc gat gca 1296 Pro Glu Ala Tyr Glu Lys Leu Ile His Asp Cys Leu Leu Gly Asp Ala 420 425 430 aca aac ttt gca cac tgg gat gaa gtt gcc ctt tct tgg agc ttt gtc 1344 Thr Asn Phe Ala His Trp Asp Glu Val Ala Leu Ser Trp Ser Phe Val 435 440 445 gac tct att tct gaa aca tgg gca gca aac aaa acc tta tct cct aac 1392 Asp Ser Ile Ser Glu Thr Trp Ala Ala Asn Lys Thr Leu Ser Pro Asn 450 455 460 tac gaa tca ggc tca atg gga ccg aaa gaa tct gat gat ctt ttg gtg 1440 Tyr Glu Ser Gly Ser Met Gly Pro Lys Glu Ser Asp Asp Leu Leu Val 465 470 475 480 aaa gac ggc tta cac tgg tgg aac ata taa 1470 Lys Asp Gly Leu His Trp Trp Asn Ile 485 <210> 48 <211> 489 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 48 Met Lys Thr Asn Gln Gln Pro Lys Ala Val Ile Val Ile Phe Gly Ala 1 5 10 15 Thr Gly Asp Leu Ala Lys Arg Lys Leu Tyr Pro Ser Ile His Arg Leu 20 25 30 Tyr Gln Asn Gly Gln Ile Gly Glu Glu Phe Ala Val Val Gly Val Gly 35 40 45 Arg Arg Pro Trp Ser Asn Glu Asp Leu Arg Gln Thr Val Lys Thr Ser 50 55 60 Ile Ser Ser Ser Ala Asp Lys His Ile Asp Asp Phe Thr Ser His Phe 65 70 75 80 Tyr Tyr His Pro Phe Asp Val Thr Asn Pro Gly Ser Tyr Gln Glu Leu 85 90 95 Asn Val Leu Leu Asn Gln Leu Glu Asp Thr Tyr Gln Ile Pro Asn Asn 100 105 110 Arg Met Phe Tyr Leu Ala Met Ala Pro Glu Phe Phe Gly Thr Ile Ala 115 120 125 Lys Thr Leu Lys Ser Glu Gly Val Thr Ala Thr Thr Gly Trp Ser Arg 130 135 140 Leu Val Ile Glu Lys Pro Phe Gly His Asp Leu Pro Ser Ala Gln Ala 145 150 155 160 Leu Asn Lys Glu Ile Arg Glu Ala Phe Thr Glu Asp Gln Ile Tyr Arg 165 170 175 Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Gln Met Val Gln Asn Ile Glu Val Ile 180 185 190 Arg Phe Ala Asn Ala Ile Phe Glu Pro Leu Trp Thr Asn Arg Tyr Ile 195 200 205 Ser Asn Ile Gln Ile Thr Ser Ser Glu Ser Leu Gly Val Glu Asp Arg 210 215 220 Ala Arg Tyr Tyr Glu Lys Ser Gly Ala Leu Arg Asp Met Val Gln Asn 225 230 235 240 His Ile Met Gln Met Val Ala Leu Leu Ala Met Glu Pro Pro Ile Lys 245 250 255 Leu Asn Thr Glu Glu Ile Arg Ser Glu Lys Val Lys Val Leu Arg Ala 260 265 270 Leu Arg Pro Ile Ala Lys Asp Glu Val Asp Glu Tyr Phe Val Arg Gly 275 280 285 Gln Tyr His Ala Gly Glu Ile Asp Gly Val Pro Val Pro Ala Tyr Thr 290 295 300 Asp Glu Asp Asn Val Ala Pro Asp Ser Asn Thr Glu Thr Phe Val Ala 305 310 315 320 Gly Lys Leu Leu Ile Asp Asn Phe Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr 325 330 335 Ile Arg Thr Gly Lys Arg Met Arg Glu Lys Ser Thr Lys Ile Val Val 340 345 350 Gln Phe Lys Asp Ile Pro Met Asn Leu Tyr Tyr Gly Asn Glu Asn Asn 355 360 365 Met Asn Pro Asn Leu Leu Val Ile His Ile Gln Pro Asp Glu Gly Ile 370 375 380 Thr Leu Tyr Leu Asn Ala Lys Lys Leu Gly Gly Ala Ala His Ala Gln 385 390 395 400 Pro Ile Lys Leu Asp Tyr Cys Ser Asn Cys Asn Asp Glu Leu Asn Thr 405 410 415 Pro Glu Ala Tyr Glu Lys Leu Ile His Asp Cys Leu Leu Gly Asp Ala 420 425 430 Thr Asn Phe Ala His Trp Asp Glu Val Ala Leu Ser Trp Ser Phe Val 435 440 445 Asp Ser Ile Ser Glu Thr Trp Ala Ala Asn Lys Thr Leu Ser Pro Asn 450 455 460 Tyr Glu Ser Gly Ser Met Gly Pro Lys Glu Ser Asp Asp Leu Leu Val 465 470 475 480 Lys Asp Gly Leu His Trp Trp Asn Ile 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gaa cgg gtg atc 336 Arg Glu His Asn Asp Thr Asn Ile Leu Ala Met Gly Glu Arg Val Ile 100 105 110 gga cct ggt ttg gct cgg gaa atc gca aaa atc tgg ctg act act gag 384 Gly Pro Gly Leu Ala Arg Glu Ile Ala Lys Ile Trp Leu Thr Thr Glu 115 120 125 ttt acc ggg gga aga cac caa acg cgt att gga aaa atc tcc gat tat 432 Phe Thr Gly Gly Arg His Gln Thr Arg Ile Gly Lys Ile Ser Asp Tyr 130 135 140 gaa gag aaa aac ctg tag 450 Glu Glu Lys Asn Leu 145 <210> 50 <211> 149 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 50 Met Lys Val Ala Ile Ala Ser Asp His Gly Gly Val His Ile Arg Asn 1 5 10 15 Glu Ile Lys Glu Leu Met Asp Glu Leu Gln Ile Glu Tyr Ile Asp Met 20 25 30 Gly Cys Asp Cys Gly Ser Gly Ser Val Asp Tyr Pro Asp Tyr Ala Phe 35 40 45 Pro Val Ala Glu Lys Val Val Ser Gly Glu Val Asp Arg Gly Ile Leu 50 55 60 Ile Cys Gly Thr Gly Ile Gly Met Ser Ile Ser Ala Asn Lys Val Lys 65 70 75 80 Gly Ile Arg Cys Ala Leu Ala His Asp Thr Phe Ser Ala Lys Ala Thr 85 90 95 Arg Glu His Asn Asp Thr Asn Ile Leu Ala Met Gly Glu Arg Val 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gaa gag ttt gtg cag aca ctt gga cag tcg ctg gca aat cct gag cgt 288 Glu Glu Phe Val Gln Thr Leu Gly Gln Ser Leu Ala Asn Pro Glu Arg 85 90 95 atc ctt ccg ggc ggt tat gta tat tta acg gat atc tta gga aag cca 336 Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Val Tyr Leu Thr Asp Ile Leu Gly Lys Pro 100 105 110 tct gta ctc tcc aag gta ggg aag ctg ttt gct tcc gtg ttt gca gag 384 Ser Val Leu Ser Lys Val Gly Lys Leu Phe Ala Ser Val Phe Ala Glu 115 120 125 cgc gaa att gat gtt gtc atg acc gtt gcc acg aaa ggc atc cct ctt 432 Arg Glu Ile Asp Val Val Met Thr Val Ala Thr Lys Gly Ile Pro Leu 130 135 140 gcg tac gca gct gca agc tat ttg aat gtg cct gtt gtg atc gtt cgt 480 Ala Tyr Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Asn Val Pro Val Val Ile Val Arg 145 150 155 160 aaa gac aat aag gta aca gag ggc tcc aca gtc agc att aat tac gtt 528 Lys Asp Asn Lys Val Thr Glu Gly Ser Thr Val Ser Ile Asn Tyr Val 165 170 175 tca ggc tcc tca aac cgc att caa aca atg tca ctt gcg aaa aga agc 576 Ser Gly Ser Ser Asn Arg Ile Gln Thr Met Ser Leu Ala Lys Arg Ser 180 185 190 atg aaa acg ggt tca aac gta ctc att att gat gac ttt atg aaa gca 624 Met Lys Thr Gly Ser Asn Val Leu Ile Ile Asp Asp Phe Met Lys Ala 195 200 205 ggc ggc acc att aat ggt atg att aac ctg ttg gat gag ttt aac gca 672 Gly Gly Thr Ile Asn Gly Met Ile Asn Leu Leu Asp Glu Phe Asn Ala 210 215 220 aat gtg gcg gga atc ggc gtc tta gtt gaa gcc gaa gga gta gat gaa 720 Asn Val Ala Gly Ile Gly Val Leu Val Glu Ala Glu Gly Val Asp Glu 225 230 235 240 cgt ctt gtt gac gaa tat atg tca ctt ctt act ctt tca acc atc aac 768 Arg Leu Val Asp Glu Tyr Met Ser Leu Leu Thr Leu Ser Thr Ile Asn 245 250 255 atg aaa gag aag tcc att gaa att cag aat ggc aat ttt ctg cgt ttt 816 Met Lys Glu Lys Ser Ile Glu Ile Gln Asn Gly Asn Phe Leu Arg Phe 260 265 270 ttt aaa gac aat ctt tta aag aat gga gag aca gaa tca tga 858 Phe Lys Asp Asn Leu Leu Lys Asn Gly Glu Thr Glu Ser 275 280 285 <210> 52 <211> 285 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 52 Met Lys Phe Arg Arg Ser Gly Arg Leu Val Asp Leu Thr Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Thr His Pro His Glu Leu Ile Pro Leu Thr Phe Phe Ser Glu Arg 20 25 30 Tyr Glu Ser Ala Lys Ser Ser Ile Ser Glu Asp Leu Thr Ile Ile Lys 35 40 45 Gln Thr Phe Glu Gln Gln Gly Ile Gly Thr Leu Leu Thr Val Pro Gly 50 55 60 Ala Ala Gly Gly Val Lys Tyr Ile Pro Lys Met Lys Gln Ala Glu Ala 65 70 75 80 Glu Glu Phe Val Gln Thr Leu Gly Gln Ser Leu Ala Asn Pro Glu Arg 85 90 95 Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Val Tyr Leu Thr Asp Ile Leu Gly Lys Pro 100 105 110 Ser Val Leu Ser Lys Val Gly Lys Leu Phe Ala Ser Val Phe Ala Glu 115 120 125 Arg Glu Ile Asp Val Val Met Thr Val Ala Thr Lys Gly Ile Pro Leu 130 135 140 Ala Tyr Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Asn Val Pro Val Val Ile Val Arg 145 150 155 160 Lys Asp Asn Lys Val Thr Glu Gly Ser Thr Val Ser Ile Asn Tyr Val 165 170 175 Ser Gly Ser Ser Asn Arg Ile Gln Thr Met Ser Leu Ala Lys Arg Ser 180 185 190 Met Lys Thr Gly Ser Asn Val Leu Ile Ile Asp Asp Phe Met Lys Ala 195 200 205 Gly Gly Thr Ile Asn Gly Met Ile Asn Leu Leu Asp Glu Phe Asn Ala 210 215 220 Asn Val Ala Gly Ile Gly Val Leu Val Glu Ala Glu Gly Val Asp Glu 225 230 235 240 Arg Leu Val Asp Glu Tyr Met Ser Leu Leu Thr Leu Ser Thr Ile Asn 245 250 255 Met Lys Glu Lys Ser Ile Glu Ile Gln Asn Gly Asn Phe Leu Arg Phe 260 265 270 Phe Lys Asp Asn Leu Leu Lys Asn Gly Glu Thr Glu Ser 275 280 285 <210> 53 <211> 816 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(816) <223> <400> 53 ttg aag gac aga att gaa cgc gca gcc gct ttt att aaa caa aac ctg 48 Met Lys Asp Arg Ile Glu Arg Ala Ala Ala Phe Ile Lys Gln Asn Leu 1 5 10 15 ccg gaa tct cca aag atc ggc ctt att tta ggc tca ggt ctt ggc att 96 Pro Glu Ser Pro Lys Ile Gly Leu Ile Leu Gly Ser Gly Leu Gly Ile 20 25 30 ttg gcg gac gaa atc gaa aat ccg gtc aag ctg aaa tat gaa gat ata 144 Leu Ala Asp Glu Ile Glu Asn Pro Val Lys Leu Lys Tyr Glu Asp Ile 35 40 45 cct gaa ttc ccg gta tct act gtt gaa ggg cat gcc gga cag ctt gtg 192 Pro Glu Phe Pro Val Ser Thr Val Glu Gly His Ala Gly Gln Leu Val 50 55 60 ctt ggc act ctt gaa gga gtt tcc gtc att gca atg cag ggc cgc ttt 240 Leu Gly Thr Leu Glu Gly Val Ser Val Ile Ala Met Gln Gly Arg Phe 65 70 75 80 cat ttt tat gaa ggc tac tca atg gag aaa gtc aca ttc cct gta cgc 288 His Phe Tyr Glu Gly Tyr Ser Met Glu Lys Val Thr Phe Pro Val Arg 85 90 95 gtg atg aaa gcg ctc ggt gtg gaa gcg ttg atc gtg aca aat gcc gca 336 Val Met Lys Ala Leu Gly Val Glu Ala Leu Ile Val Thr Asn Ala Ala 100 105 110 ggc ggt gtc aac act gaa ttc cgt gcg gga gat tta atg att att acc 384 Gly Gly Val Asn Thr Glu Phe Arg Ala Gly Asp Leu Met Ile Ile Thr 115 120 125 gat cat atc aac ttt atg gga aca aac ccg tta atc ggg cca aac gaa 432 Asp His Ile Asn Phe Met Gly Thr Asn Pro Leu Ile Gly Pro Asn Glu 130 135 140 gca gat ttc ggc gcc aga ttt cca gat atg tct tca gcc tat gac aaa 480 Ala Asp Phe Gly Ala Arg Phe Pro Asp Met Ser Ser Ala Tyr Asp Lys 145 150 155 160 gat ctg tcc agc ctg gct gaa aag att gcg aaa gac ctt aat atc cca 528 Asp Leu Ser Ser Leu Ala Glu Lys Ile Ala Lys Asp Leu Asn Ile Pro 165 170 175 att caa aaa ggc gtg tac act gct gtg aca gga cct tct tac gaa aca 576 Ile Gln Lys Gly Val Tyr Thr Ala Val Thr Gly Pro Ser Tyr Glu Thr 180 185 190 ccg gca gaa gtc cgt ttc tta aga acg atg ggc tct gat gca gtc ggc 624 Pro Ala Glu Val Arg Phe Leu Arg Thr Met Gly Ser Asp Ala Val Gly 195 200 205 atg tct act gtt ccg gaa gtc att gta gcg aat cat gcg gga atg cgg 672 Met Ser Thr Val Pro Glu Val Ile Val Ala Asn His Ala Gly Met Arg 210 215 220 gtt ctt ggc att tcc tgc atc tct aac gcg gca gcc gga att ctg gat 720 Val Leu Gly Ile Ser Cys Ile Ser Asn Ala Ala Ala Gly Ile Leu Asp 225 230 235 240 cag cct tta agt cac gat gaa gtt atg gaa gtg acc gaa aaa gta aaa 768 Gln Pro Leu Ser His Asp Glu Val Met Glu Val Thr Glu Lys Val Lys 245 250 255 gct gga ttc tta aag ctt gtt aaa gcg atc gtc gct cag tac gaa taa 816 Ala Gly Phe Leu Lys Leu Val Lys Ala Ile Val Ala Gln Tyr Glu 260 265 270 <210> 54 <211> 271 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 54 Met Lys Asp Arg Ile Glu Arg Ala Ala Ala Phe Ile Lys Gln Asn Leu 1 5 10 15 Pro Glu Ser Pro Lys Ile Gly Leu Ile Leu Gly Ser Gly Leu Gly Ile 20 25 30 Leu Ala Asp Glu Ile Glu Asn Pro Val Lys Leu Lys Tyr Glu Asp Ile 35 40 45 Pro Glu Phe Pro Val Ser Thr Val Glu Gly His Ala Gly Gln Leu Val 50 55 60 Leu Gly Thr Leu Glu Gly Val Ser Val Ile Ala Met Gln Gly Arg Phe 65 70 75 80 His Phe Tyr Glu Gly Tyr Ser Met Glu Lys Val Thr Phe Pro Val Arg 85 90 95 Val Met Lys Ala Leu Gly Val Glu Ala Leu Ile Val Thr Asn Ala Ala 100 105 110 Gly Gly Val Asn Thr Glu Phe Arg Ala Gly Asp Leu Met Ile Ile Thr 115 120 125 Asp His Ile Asn Phe Met Gly Thr Asn Pro Leu Ile Gly Pro Asn Glu 130 135 140 Ala Asp Phe Gly Ala Arg Phe Pro Asp Met Ser Ser Ala Tyr Asp Lys 145 150 155 160 Asp Leu Ser Ser Leu Ala Glu Lys Ile Ala Lys Asp Leu Asn Ile Pro 165 170 175 Ile Gln Lys Gly Val Tyr Thr Ala Val Thr Gly Pro Ser Tyr Glu Thr 180 185 190 Pro Ala Glu Val Arg Phe Leu Arg Thr Met Gly Ser Asp Ala Val Gly 195 200 205 Met Ser Thr Val Pro Glu Val Ile Val Ala Asn His Ala Gly Met Arg 210 215 220 Val Leu Gly Ile Ser Cys Ile Ser Asn Ala Ala Ala Gly Ile Leu Asp 225 230 235 240 Gln Pro Leu Ser His Asp Glu Val Met Glu Val Thr Glu Lys Val Lys 245 250 255 Ala Gly Phe Leu Lys Leu Val Lys Ala Ile Val Ala Gln Tyr Glu 260 265 270 <210> 55 <211> 702 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(702) <223> <400> 55 atg agt gta cat ata ggt gct gaa aaa gga caa att gcg gat act gtg 48 Met Ser Val His Ile Gly Ala Glu Lys Gly Gln Ile Ala Asp Thr Val 1 5 10 15 ctt ttg ccg gga gat cct ctc aga gca aaa ttt att gca gaa acg tat 96 Leu Leu Pro Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys Phe Ile Ala Glu Thr Tyr 20 25 30 ctt gaa aat gta gaa tgc tac aat gaa gtc aga ggc atg tat gga ttt 144 Leu Glu Asn Val Glu Cys Tyr Asn Glu Val Arg Gly Met Tyr Gly Phe 35 40 45 acg ggt aca tat aaa ggt aaa aaa atc tca gta caa ggc acg gga atg 192 Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Lys Lys Ile Ser Val Gln Gly Thr Gly Met 50 55 60 gga gtt ccg tct att tca att tat gtg aat gaa tta att caa agc tac 240 Gly Val Pro Ser Ile Ser Ile Tyr Val Asn Glu Leu Ile Gln Ser Tyr 65 70 75 80 gat gtg caa aat cta ata aga gtc ggt tcc tgc ggc gct att cgt aaa 288 Asp Val Gln Asn Leu Ile Arg Val Gly Ser Cys Gly Ala Ile Arg Lys 85 90 95 gat gtc aaa gtg cga gac gtc att ttg gcg atg acc tcc tca act gat 336 Asp Val Lys Val Arg Asp Val Ile Leu Ala Met Thr Ser Ser Thr Asp 100 105 110 tca caa atg aac aga gtt gct ttc gga agc gtt gat ttt gcg cct tgc 384 Ser Gln Met Asn Arg Val Ala Phe Gly Ser Val Asp Phe Ala Pro Cys 115 120 125 gca gat ttc gag ctt tta aaa aat gcc tat gat gcc gca aag gat aaa 432 Ala Asp Phe Glu Leu Leu Lys Asn Ala Tyr Asp Ala Ala Lys Asp Lys 130 135 140 ggt gtg ccg gtg act gta gga agc gta ttt aca gct gac cag ttc tac 480 Gly Val Pro Val Thr Val Gly Ser Val Phe Thr Ala Asp Gln Phe Tyr 145 150 155 160 aat gac gat tcg caa att gaa aaa ctt gca aaa tac ggt gtg ctt ggc 528 Asn Asp Asp Ser Gln Ile Glu Lys Leu Ala Lys Tyr Gly Val Leu Gly 165 170 175 gtt gaa atg gaa aca act gca ttg tat aca tta gca gcg aag cac gga 576 Val Glu Met Glu Thr Thr Ala Leu Tyr Thr Leu Ala Ala Lys His Gly 180 185 190 aga aaa gcc ctg tca att ctc acc gtg agt gat cac gta tta aca gga 624 Arg Lys Ala Leu Ser Ile Leu Thr Val Ser Asp His Val Leu Thr Gly 195 200 205 gaa gaa acg aca gcg gaa gag cgt caa acg aca ttt cat gat atg ata 672 Glu Glu Thr Thr Ala Glu Glu Arg Gln Thr Thr Phe His Asp Met Ile 210 215 220 gaa gtg gct tta cat tcc gta tca caa taa 702 Glu Val Ala Leu His Ser Val Ser Gln 225 230 <210> 56 <211> 233 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 56 Met Ser Val His Ile Gly Ala Glu Lys Gly Gln Ile Ala Asp Thr Val 1 5 10 15 Leu Leu Pro Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys Phe Ile Ala Glu Thr Tyr 20 25 30 Leu Glu Asn Val Glu Cys Tyr Asn Glu Val Arg Gly Met Tyr Gly Phe 35 40 45 Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Lys Lys Ile Ser Val Gln Gly Thr Gly Met 50 55 60 Gly Val Pro Ser Ile Ser Ile Tyr Val Asn Glu Leu Ile Gln Ser Tyr 65 70 75 80 Asp Val Gln Asn Leu Ile Arg Val Gly Ser Cys Gly Ala Ile Arg Lys 85 90 95 Asp Val Lys Val Arg Asp Val Ile Leu Ala Met Thr Ser Ser Thr Asp 100 105 110 Ser Gln Met Asn Arg Val Ala Phe Gly Ser Val Asp Phe Ala Pro Cys 115 120 125 Ala Asp Phe Glu Leu Leu Lys Asn Ala Tyr Asp Ala Ala Lys Asp Lys 130 135 140 Gly Val Pro Val Thr Val Gly Ser Val Phe Thr Ala Asp Gln Phe Tyr 145 150 155 160 Asn Asp Asp Ser Gln Ile Glu Lys Leu Ala Lys Tyr Gly Val Leu Gly 165 170 175 Val Glu Met Glu Thr Thr Ala Leu Tyr Thr Leu Ala Ala Lys His Gly 180 185 190 Arg Lys Ala Leu Ser Ile Leu Thr Val Ser Asp His Val Leu Thr Gly 195 200 205 Glu Glu Thr Thr Ala Glu Glu Arg Gln Thr Thr Phe His Asp Met Ile 210 215 220 Glu Val Ala Leu His Ser Val Ser Gln 225 230 <210> 57 <211> 954 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(954) <223> <400> 57 atg tct aat caa tac gga gat aag aat tta aag att ttt tct ttg aat 48 Met Ser Asn Gln Tyr Gly Asp Lys Asn Leu Lys Ile Phe Ser Leu Asn 1 5 10 15 tcg aat cca gag ctt gca aaa gaa atc gca gat ata gtt gga gtt caa 96 Ser Asn Pro Glu Leu Ala Lys Glu Ile Ala Asp Ile Val Gly Val Gln 20 25 30 tta ggg aaa tgt tct gtc aca aga ttt agt gac ggg gaa gtc caa att 144 Leu Gly Lys Cys Ser Val Thr Arg Phe Ser Asp Gly Glu Val Gln Ile 35 40 45 aat atc gaa gaa agt att cgc gga tgt gat tgt tac atc atc cag tct 192 Asn Ile Glu Glu Ser Ile Arg Gly Cys Asp Cys Tyr Ile Ile Gln Ser 50 55 60 aca agt gac ccc gtt aac gag cat att atg gaa ctg ctg att atg gta 240 Thr Ser Asp Pro Val Asn Glu His Ile Met Glu Leu Leu Ile Met Val 65 70 75 80 gat gcg tta aaa cgc gct tct gca aaa acg att aac att gtt att cct 288 Asp Ala Leu Lys Arg Ala Ser Ala Lys Thr Ile Asn Ile Val Ile Pro 85 90 95 tat tac ggt tat gcg cgt caa gac aga aaa gca aga tcc cgt gag cca 336 Tyr Tyr Gly Tyr Ala Arg Gln Asp Arg Lys Ala Arg Ser Arg Glu Pro 100 105 110 atc aca gct aaa ctt ttc gct aac ctg ctt gaa aca gcc ggt gcg act 384 Ile Thr Ala Lys Leu Phe Ala Asn Leu Leu Glu Thr Ala Gly Ala Thr 115 120 125 cgt gtg att gca ctt gac ctg cat gcg ccg caa att caa gga ttc ttt 432 Arg Val Ile Ala Leu Asp Leu His Ala Pro Gln Ile Gln Gly Phe Phe 130 135 140 gat ata ccg att gac cac tta atg ggt gtt ccg att tta gga gaa tat 480 Asp Ile Pro Ile Asp His Leu Met Gly Val Pro Ile Leu Gly Glu Tyr 145 150 155 160 ttt gaa ggc aaa aat ctt gaa gat atc gtc att gtt tca cca gac cat 528 Phe Glu Gly Lys Asn Leu Glu Asp Ile Val Ile Val Ser Pro Asp His 165 170 175 ggc ggt gtg aca cgt gcc cgc aaa ctg gct gac cga cta aaa gcg cca 576 Gly Gly Val Thr Arg Ala Arg Lys Leu Ala Asp Arg Leu Lys Ala Pro 180 185 190 att gcg att atc gat aaa cgc cgt ccg cgt cca aac gtg gcg gaa gtc 624 Ile Ala Ile Ile Asp Lys Arg Arg Pro Arg Pro Asn Val Ala Glu Val 195 200 205 atg aat att gta ggt aac atc gaa ggg aag act gct atc ctc atc gat 672 Met Asn Ile Val Gly Asn Ile Glu Gly Lys Thr Ala Ile Leu Ile Asp 210 215 220 gac att att gat act gca ggt acg att aca ctt gct gct aat gcg ctc 720 Asp Ile Ile Asp Thr Ala Gly Thr Ile Thr Leu Ala Ala Asn Ala Leu 225 230 235 240 gtt gaa aac gga gcg aaa gaa gta tat gca tgc tgt aca cac cct gta 768 Val Glu Asn Gly Ala Lys Glu Val Tyr Ala Cys Cys Thr His Pro Val 245 250 255 cta tca ggc cct gcg gtt gaa cgg att aat aat tca aca att aaa gag 816 Leu Ser Gly Pro Ala Val Glu Arg Ile Asn Asn Ser Thr Ile Lys Glu 260 265 270 ctt gtt gtg aca aac agc atc aag ctt cct gaa gaa aag aaa att gaa 864 Leu Val Val Thr Asn Ser Ile Lys Leu Pro Glu Glu Lys Lys Ile Glu 275 280 285 cgc ttt aag cag ctt tca gtc gga ccg ctt ctg gcc gaa gcg att att 912 Arg Phe Lys Gln Leu Ser Val Gly Pro Leu Leu Ala Glu Ala Ile Ile 290 295 300 cgc gtt cat gag cag caa tca gtc agc tat ctg ttc agc taa 954 Arg Val His Glu Gln Gln Ser Val Ser Tyr Leu Phe Ser 305 310 315 <210> 58 <211> 317 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 58 Met Ser Asn Gln Tyr Gly Asp Lys Asn Leu Lys Ile Phe Ser Leu Asn 1 5 10 15 Ser Asn Pro Glu Leu Ala Lys Glu Ile Ala Asp Ile Val Gly Val Gln 20 25 30 Leu Gly Lys Cys Ser Val Thr Arg Phe Ser Asp Gly Glu Val Gln Ile 35 40 45 Asn Ile Glu Glu Ser Ile Arg Gly Cys Asp Cys Tyr Ile Ile Gln Ser 50 55 60 Thr Ser Asp Pro Val Asn Glu His Ile Met Glu Leu Leu Ile Met Val 65 70 75 80 Asp Ala Leu Lys Arg Ala Ser Ala Lys Thr Ile Asn Ile Val Ile Pro 85 90 95 Tyr Tyr Gly Tyr Ala Arg Gln Asp Arg Lys Ala Arg Ser Arg Glu Pro 100 105 110 Ile Thr Ala Lys Leu Phe Ala Asn Leu Leu Glu Thr Ala Gly Ala Thr 115 120 125 Arg Val Ile Ala Leu Asp Leu His Ala Pro Gln Ile Gln Gly Phe Phe 130 135 140 Asp Ile Pro Ile Asp His Leu Met Gly Val Pro Ile Leu Gly Glu Tyr 145 150 155 160 Phe Glu Gly Lys Asn Leu Glu Asp Ile Val Ile Val Ser Pro Asp His 165 170 175 Gly Gly Val Thr Arg Ala Arg Lys Leu Ala Asp Arg Leu Lys Ala Pro 180 185 190 Ile Ala Ile Ile Asp Lys Arg Arg Pro Arg Pro Asn Val Ala Glu Val 195 200 205 Met Asn Ile Val Gly Asn Ile Glu Gly Lys Thr Ala Ile Leu Ile Asp 210 215 220 Asp Ile Ile Asp Thr Ala Gly Thr Ile Thr Leu Ala Ala Asn Ala Leu 225 230 235 240 Val Glu Asn Gly Ala Lys Glu Val Tyr Ala Cys Cys Thr His Pro Val 245 250 255 Leu Ser Gly Pro Ala Val Glu Arg Ile Asn Asn Ser Thr Ile Lys Glu 260 265 270 Leu Val Val Thr Asn Ser Ile Lys Leu Pro Glu Glu Lys Lys Ile Glu 275 280 285 Arg Phe Lys Gln Leu Ser Val Gly Pro Leu Leu Ala Glu Ala Ile Ile 290 295 300 Arg Val His Glu Gln Gln Ser Val Ser Tyr Leu Phe Ser 305 310 315 <210> 59 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 59 gaagttgatg atcaaaa 17 <210> 60 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 60 acatattgtt gacgataat 19 <210> 61 <211> 1467 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(1464) <223> <400> 61 atg tgg gaa agt aaa ttt tca aaa gaa ggc tta acg ttc gac gat gtg 48 Met Trp Glu Ser Lys Phe Ser Lys Glu Gly Leu Thr Phe Asp Asp Val 1 5 10 15 ctg ctt gta cca gca aag tct gag gta ctt ccg cgt gat gtg gat tta 96 Leu Leu Val Pro Ala Lys Ser Glu Val Leu Pro Arg Asp Val Asp Leu 20 25 30 tct gta gaa ctt aca aaa acg tta aag cta aat att cct gtc atc agc 144 Ser Val Glu Leu Thr Lys Thr Leu Lys Leu Asn Ile Pro Val Ile Ser 35 40 45 gca ggt atg gac act gta aca gaa tca gca atg gca att gca atg gca 192 Ala Gly Met Asp Thr Val Thr Glu Ser Ala Met Ala Ile Ala Met Ala 50 55 60 aga cag ggc ggc ttg ggc atc att cac aaa aat atg tcc att gaa cag 240 Arg Gln Gly Gly Leu Gly Ile Ile His Lys Asn Met Ser Ile Glu Gln 65 70 75 80 cag gct gaa caa gtt gat aaa gta aag cgt tct gag cgc ggc gtt atc 288 Gln Ala Glu Gln Val Asp Lys Val Lys Arg Ser Glu Arg Gly Val Ile 85 90 95 aca aat ccc ttc ttt tta act cct gat cac caa gta ttt gat gcg gag 336 Thr Asn Pro Phe Phe Leu Thr Pro Asp His Gln Val Phe Asp Ala Glu 100 105 110 cat ttg atg ggg aaa tac aga att tcc ggt gtt ccg att gta aat aac 384 His Leu Met Gly Lys Tyr Arg Ile Ser Gly Val Pro Ile Val Asn Asn 115 120 125 gaa gaa gac cag aag ctt gtt gga att att aca aac cgt gac ctt cgt 432 Glu Glu Asp Gln Lys Leu Val Gly Ile Ile Thr Asn Arg Asp Leu Arg 130 135 140 ttt att tct gac tac tca atg aaa atc agc gac gtc atg acg aaa gaa 480 Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Met Lys Ile Ser Asp Val Met Thr Lys Glu 145 150 155 160 gag cta gtt act gca tct gta gga act act ctg gat gaa gct gaa aag 528 Glu Leu Val Thr Ala Ser Val Gly Thr Thr Leu Asp Glu Ala Glu Lys 165 170 175 att ttg cag aaa cat aaa att gaa aag ctt cct ctc gta gat gac cag 576 Ile Leu Gln Lys His Lys Ile Glu Lys Leu Pro Leu Val Asp Asp Gln 180 185 190 aat aaa tta aaa ggt ctt atc aca att aaa gac att gaa aaa gtc att 624 Asn Lys Leu Lys Gly Leu Ile Thr Ile Lys Asp Ile Glu Lys Val Ile 195 200 205 gag ttc ccg aac tca tct aaa gac att cac ggc cgc ctg atc gtt ggc 672 Glu Phe Pro Asn Ser Ser Lys Asp Ile His Gly Arg Leu Ile Val Gly 210 215 220 gcg gca gtt ggt gta act ggc gat aca atg act cgc gtc aaa aag ctt 720 Ala Ala Val Gly Val Thr Gly Asp Thr Met Thr Arg Val Lys Lys Leu 225 230 235 240 gtt gaa gcc aat gtt gat gtg att gtt atc gat aca gct cac gga cac 768 Val Glu Ala Asn Val Asp Val Ile Val Ile Asp Thr Ala His Gly His 245 250 255 tct caa ggc gtt tta aac aca gtc aca aaa atc cgt gaa acg tat ccc 816 Ser Gln Gly Val Leu Asn Thr Val Thr Lys Ile Arg Glu Thr Tyr Pro 260 265 270 gaa tta aac att att gct gga aac gtg gca aca gct gaa gcg aca aga 864 Glu Leu Asn Ile Ile Ala Gly Asn Val Ala Thr Ala Glu Ala Thr Arg 275 280 285 gcg ctt atc gaa gct gga gca gac gtt gtc aaa gtt gga ata ggg cct 912 Ala Leu Ile Glu Ala Gly Ala Asp Val Val Lys Val Gly Ile Gly Pro 290 295 300 ggt tca att tgt act aca cgt gtt gta gcc ggc gtg ggt gtt ccg caa 960 Gly Ser Ile Cys Thr Thr Arg Val Val Ala Gly Val Gly Val Pro Gln 305 310 315 320 att aca gca att tat gat tgt gcg act gaa gca aga aaa cac ggc aaa 1008 Ile Thr Ala Ile Tyr Asp Cys Ala Thr Glu Ala Arg Lys His Gly Lys 325 330 335 aca atc atc gcc gac ggt ggg att aaa ttc tct ggc gat atc act aaa 1056 Thr Ile Ile Ala Asp Gly Gly Ile Lys Phe Ser Gly Asp Ile Thr Lys 340 345 350 gca ttg gca gcc ggc gga cat gct gtt atg ctc gga agc ttg ctt gca 1104 Ala Leu Ala Ala Gly Gly His Ala Val Met Leu Gly Ser Leu Leu Ala 355 360 365 ggc aca tca gaa agc cct ggt gaa act gaa atc tac caa ggc aga aga 1152 Gly Thr Ser Glu Ser Pro Gly Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Gly Arg Arg 370 375 380 ttt aag gta tac cgc ggc atg gga tca gtt gct gca atg gaa aaa gga 1200 Phe Lys Val Tyr Arg Gly Met Gly Ser Val Ala Ala Met Glu Lys Gly 385 390 395 400 agt aaa gac cgt tac ttc caa gaa gaa aac aaa aaa ttt gtt cct gaa 1248 Ser Lys Asp Arg Tyr Phe Gln Glu Glu Asn Lys Lys Phe Val Pro Glu 405 410 415 gga att gaa gga cgc aca cct tac aaa ggg cca gtt gaa gaa acc gtt 1296 Gly Ile Glu Gly Arg Thr Pro Tyr Lys Gly Pro Val Glu Glu Thr Val 420 425 430 tat cag cta gtc gga ggc ctt cgt tct ggt atg ggg tat tgc ggg tcc 1344 Tyr Gln Leu Val Gly Gly Leu Arg Ser Gly Met Gly Tyr Cys Gly Ser 435 440 445 aaa gat ctg cgt gcg cta aga gaa gaa gct cag ttc att cgc atg act 1392 Lys Asp Leu Arg Ala Leu Arg Glu Glu Ala Gln Phe Ile Arg Met Thr 450 455 460 ggc gca gga ctt cgc gaa agc cat ccg cat gac gta cag att aca aaa 1440 Gly Ala Gly Leu Arg Glu Ser His Pro His Asp Val Gln Ile Thr Lys 465 470 475 480 gaa tca cct aac tat aca att tca taa 1467 Glu Ser Pro Asn Tyr Thr Ile Ser 485 <210> 62 <211> 488 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 62 Met Trp Glu Ser Lys Phe Ser Lys Glu Gly Leu Thr Phe Asp Asp Val 1 5 10 15 Leu Leu Val Pro Ala Lys Ser Glu Val Leu Pro Arg Asp Val Asp Leu 20 25 30 Ser Val Glu Leu Thr Lys Thr Leu Lys Leu Asn Ile Pro Val Ile Ser 35 40 45 Ala Gly Met Asp Thr Val Thr Glu Ser Ala Met Ala Ile Ala Met Ala 50 55 60 Arg Gln Gly Gly Leu Gly Ile Ile His Lys Asn Met Ser Ile Glu Gln 65 70 75 80 Gln Ala Glu Gln Val Asp Lys Val Lys Arg Ser Glu Arg Gly Val Ile 85 90 95 Thr Asn Pro Phe Phe Leu Thr Pro Asp His Gln Val Phe Asp Ala Glu 100 105 110 His Leu Met Gly Lys Tyr Arg Ile Ser Gly Val Pro Ile Val Asn Asn 115 120 125 Glu Glu Asp Gln Lys Leu Val Gly Ile Ile Thr Asn Arg Asp Leu Arg 130 135 140 Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Met Lys Ile Ser Asp Val Met Thr Lys Glu 145 150 155 160 Glu Leu Val Thr Ala Ser Val Gly Thr Thr Leu Asp Glu Ala Glu Lys 165 170 175 Ile Leu Gln Lys His Lys Ile Glu Lys Leu Pro Leu Val Asp Asp Gln 180 185 190 Asn Lys Leu Lys Gly Leu Ile Thr Ile Lys Asp Ile Glu Lys Val Ile 195 200 205 Glu Phe Pro Asn Ser Ser Lys Asp Ile His Gly Arg Leu Ile Val Gly 210 215 220 Ala Ala Val Gly Val Thr Gly Asp Thr Met Thr Arg Val Lys Lys Leu 225 230 235 240 Val Glu Ala Asn Val Asp Val Ile Val Ile Asp Thr Ala His Gly His 245 250 255 Ser Gln Gly Val Leu Asn Thr Val Thr Lys Ile Arg Glu Thr Tyr Pro 260 265 270 Glu Leu Asn Ile Ile Ala Gly Asn Val Ala Thr Ala Glu Ala Thr Arg 275 280 285 Ala Leu Ile Glu Ala Gly Ala Asp Val Val Lys Val Gly Ile Gly Pro 290 295 300 Gly Ser Ile Cys Thr Thr Arg Val Val Ala Gly Val Gly Val Pro Gln 305 310 315 320 Ile Thr Ala Ile Tyr Asp Cys Ala Thr Glu Ala Arg Lys His Gly Lys 325 330 335 Thr Ile Ile Ala Asp Gly Gly Ile Lys Phe Ser Gly Asp Ile Thr Lys 340 345 350 Ala Leu Ala Ala Gly Gly His Ala Val Met Leu Gly Ser Leu Leu Ala 355 360 365 Gly Thr Ser Glu Ser Pro Gly Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Gly Arg Arg 370 375 380 Phe Lys Val Tyr Arg Gly Met Gly Ser Val Ala Ala Met Glu Lys Gly 385 390 395 400 Ser Lys Asp Arg Tyr Phe Gln Glu Glu Asn Lys Lys Phe Val Pro Glu 405 410 415 Gly Ile Glu Gly Arg Thr Pro Tyr Lys Gly Pro Val Glu Glu Thr Val 420 425 430 Tyr Gln Leu Val Gly Gly Leu Arg Ser Gly Met Gly Tyr Cys Gly Ser 435 440 445 Lys Asp Leu Arg Ala Leu Arg Glu Glu Ala Gln Phe Ile Arg Met Thr 450 455 460 Gly Ala Gly Leu Arg Glu Ser His Pro His Asp Val Gln Ile Thr Lys 465 470 475 480 Glu Ser Pro Asn Tyr Thr Ile Ser 485

Claims (19)

  1. 푸린계 물질 생산능을 가지며, 산화적 펜토스 인산 경로의 효소의 활성이 상승되도록 개변됨을 특징으로 하는 바실러스(Bacillus) 속 세균.
  2. 제1항에 있어서, 푸린계 물질이 이노신, 크산토신, 구아노신 및 아데노신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 푸린뉴클레오시드인 바실러스속 세균.
  3. 제1항에 있어서, 푸린계 물질이 이노신산, 크산틸산, 구아닐산 및 아데닐산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 푸린뉴클레오티드인 바실러스속 세균.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 산화적 펜토스 인산 경로의 효소가 글루코스-6-인산-탈수소효소, 또는 리보스 5-인산이소메라제인 바실러스속 세균.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 효소를 암호화하는 유전자의 카피수를 높이는 것, 또는 당해 유전자의 발현 조절 서열을 개변함으로써 산화적 펜토스 인산 경로의 효소 활성이 증강된 바실러스속 세균.
  6. 제5항에 있어서, 효소가 글루코스-6-인산-탈수소효소이고, 당해 글루코스-6- 인산-탈수소효소를 암호화하는 유전자가 하기 (A) 또는 (B)에 나타내는 단백질을 암호화하는 유전자인 바실러스속 세균.
    (A) 서열번호 48에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는
    (B) 서열번호 48에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 글루코스-6-인산-탈수소효소 활성을 갖는 단백질.
  7. 제5항에 있어서, 효소가 리보스 5-인산이소메라제이고, 당해 리보스 5-인산이소메라제를 암호화하는 유전자가 하기 (E) 또는 (F)에 나타내는 단백질을 암호화하는 유전자인 바실러스속 세균.
    (E) 서열번호 50에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는
    (F) 서열번호 50에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 리보스 5-인산이소메라제 활성을 갖는 단백질.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 수개가 2 내지 20개인 바실러스속 세균.
  9. 제5항에 있어서, 효소가 글루코스-6-인산-탈수소효소이고, 당해 글루코스-6-인산-탈수소효소를 암호화하는 유전자가 하기 (a) 또는 (b)에 나타내는 DNA인 바실러스속 세균.
    (a) 서열번호 47에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는
    (b) 서열번호 47에 기재된 염기 서열 또는 동 염기 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 DNA로서, 글루코스-6-인산-탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  10. 제5항에 있어서, 효소가 리보스 5-인산이소메라제이고, 당해 리보스 5-인산이소메라제를 암호화하는 유전자가 하기 (e) 또는 (f)에 나타내는 DNA인 바실러스속 세균.
    (e) 서열번호 49에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는
    (f) 서열번호 49에 기재된 염기 서열 또는 동 염기 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 DNA로서, 리보스 5-인산이소메라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 추가로 포스포리보실피로인산 신세타제 활성이 상승되도록 개변됨을 특징으로 하는 바실러스속 세균.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 추가로 푸린오페론의 발현량이 상승되도록 개변됨을 특징으로 하는 바실러스속 세균.
  13. 제12항에 있어서, 푸린오페론의 리프레서를 암호화하는 유전자인 purR 유전 자가 파괴된 것, 또는, 푸린오페론의 어테뉴에이터(attenuator) 영역의 일부가 제거됨으로써 푸린오페론의 발현량이 상승됨을 특징으로 하는 바실러스속 세균.
  14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 추가로 푸린뉴클레오시드포스포리라제 활성이 저하되도록 개변됨을 특징으로 하는 바실러스속 세균.
  15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 따르는 바실러스속 세균을 배지에 배양하여, 푸린계 물질을 축적시키고 푸린계 물질을 회수함을 특징으로 하는 푸린계 물질의 제조법.
  16. 제15항에 있어서, 푸린계 물질이 푸린뉴클레오시드 또는 푸린뉴클레오티드인 제조법.
  17. 제16항에 있어서, 푸린계 물질이 이노신, 크산토신, 구아노신 및 아데노신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 푸린뉴클레오시드인 제조법.
  18. 제16항에 있어서, 푸린계 물질이 이노신산, 크산틸산, 구아닐산 및 아데닐산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 푸린뉴클레오티드인 제조법.
  19. 제17항에 따르는 방법에 의해 푸린뉴클레오시드를 제조하고, 당해 푸린뉴클 레오시드에 폴리인산, 페닐인산 및 카르바밀인산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인산 공급체와, 뉴클레오시드-5'-인산에스테르를 생성하는 능력을 갖는 미생물 또는 산성 포스파타제를 작용시켜 푸린뉴클레오티드를 생성시키고, 당해 푸린뉴클레오티드를 채취함을 특징으로 하는 푸린뉴클레오티드의 제조법.
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