KR20060010765A

KR20060010765A - 인터루킨-6 관련 질병의 치료방법

Info

Publication number: KR20060010765A
Application number: KR1020057020429A
Authority: KR
Inventors: 오사무 오쿠다; 노리아끼 요시다; 라빈더 나쓰 마이니
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2003-04-28
Filing date: 2004-04-28
Publication date: 2006-02-02
Also published as: JP2019011372A; EP2368577A2; CN1849135A; TWI400086B; US20190054167A1; KR101385822B1; AR044104A1; WO2004096273A1; RU2005136881A; US10744201B2; EP3903819A1; AU2004233700A1; CN105617387B; US20210170024A1; JP2024023876A; CN111068062A; US20150010554A1; RU2367471C2; NZ543073A; JP5777361B2

Abstract

인터루킨-6 길항제(IL-6 길항제) 및 면역억제제를 포함하는, 인터루킨-6(IL-6)관련 질병의 치료용 약제학적 조성물. IL-6 길항제는 바람직하기는 인터루킨-6 수용체(IL-6R)에 대한 항체이다.

Description

인터루킨-6 관련 질병의 치료방법{METHODS FOR TREATING INTERLEUKIN-6-RELATED DISEASES}

본 발명은 인터루킨-6 길항제(IL-6 길항제), 특히 인터루킨-6 수용체(IL-6)에 대한 항체(항-IL-6R-항체)와 면역억제제의 결합에 의한 그리고 고투여량으로 항-IL-6R-항체의 투여에 의한 인터루킨-6(IL-6) 관련 질병의 치료를 위한 방법에 관한 것이다.

IL-6는 B-세포 자극인자-2(BSF-2) 또는 인터페론 β2로 명명되는 시토킨이다. IL-6는 B 림프구 계대세포의 활성에 포함되는 미분화 인자로서 발견되었고(Hirano, T. et al. Nature, 324:73-76, 1986), 그 이후 IL-6가 여러 세포의 작용에 영향을 미치는 다기능 시토킨임이 설명되었다(Akira, S. et al., Adv. in Immunology, 54:1-78, 1993). IL-6가 T-림프구 계대세포의 돌연변이를 유도한다는 것이 보고되었다(Lotz, M. et al., J. Exp. Med., 167:1253-1258, 1988).

IL-6는 자신의 생리적 활성을 세포 상의 단백질의 2가지 형을 통해 전달한다. 하나는 약 80 kD의 분자량을 갖는 단백질에 결합된 리간드인 IL-6 수용체로, 여기에 IL-6가 결합한다(Taga, t. et al., J. Exp. Med., 166:967-981, 1987; Yamasaki, K. et al., Science, 241:825-828, 1987). IL-6 수용체는 세포막을 통해 투과하고 그리고 세포막에서 발현하는 막결합형 이외에, 또한 그것의 세포 밖의 영역으로 주로 구성된 가용성 IL-6 수용체로서 존재한다.

국제출원 WO 92/19759는 인간화 항-IL-6R 항체 및 키메릭 항-IL-6R 항체와 같은 항 IL-6R 항체의 여러 형을 기술한다. WO 98/11020은 류마티스성 관절염에 대한 약제 및 일차 성분이 항-IL-6R 항체와 같은 IL-6 길항제인 활액 세포 성장 억제제를 기술한다. WO 96/12503은 형질구 증가증, 초면역 글로불린 혈증, 빈혈, 신염, 악액질, 류마티스성 관절염, 목축업자 질병, 및 맥관증식신염과 같은 IL-6 산물에 기여하는 질병의 치료를 기술한다. WO 98/42377은 다발성 경화증, 포도막염, 만성 갑상선염, 지연과민증, 접촉피부염 및 아토피성 피부염과 같은 민감성 T 세포 관련 질병의 예방/보호제를 기술하고, 그것의 활성성분은 항-IL-6R 항체이다.

WO 98/42377은 전신성 에리테마토스의 치료제를 기술하고, 그것의 활성성분은 항-IL-6R 항체이다. WO 99/47170은 크론병의 치료제를 기술하고, 이것의 활성성분은 항-IL-6R 항체이다. WO 00/10607은 췌장염의 치료제를 기술하고, 이것의 활성성분은 항-IL-6R 항체이다. WO 02/3492는 건선의 치료제를 기술하고, 이것의 활성성분은 항-IL-6R 항체이다. 추가로, WO 02/080969는 연소성 특발성 위축증의 치료제를 기술하고, 이것의 활성성분은 항-IL-6R 항체이다.

발명의 요약

상기와 같이, 활성성분이 항-IL-6R 항체인 다양한 예방 또는 치료 약제가 알려져 있다. 그러나, IL-6 관련 질병의 치료에서 시너지 효과는 항-IL-6 항체와 메토트렉세이트(MTX)와 같은 면역억제제의 조합에 의해 얻어질 수 있고, 메토트렉세이트(MTX)와 같은 면역억제제는 항-IL-6R 항체에 의한 류마티스성 관절염의 치료 후 알러지 반응을 감소시키거나 또는 억제할 수 있고, 그리고 고투여량에서 항-IL-6R 항체는 항-IL-6R 항체에 의한 류마티스성 관절염의 치료 후 알러지 반응을 감소시키거나 또는 억제할 수 있다는 것은 알려지지 않았다.

그러므로, 본 발명은 인터루킨-6 길항제(IL-6 길항제)와 면역억제제를 포함하는, IL-6-관련 질병의 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 IL-6R-관련 질병의 치료를 위한 IL-6 길항제의 사용에 대한 효과 강화를 위해, 면역억제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 IL-6-길항제에 의한 IL-6관련 질병의 치료 후 알러지 반응의 예방 및 감소를 위한, 면역억제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, IL-6 길항제를 포함하는, 고투여량으로 투여하기 위한 IL-6 관련 질병용 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한, Il-관련 질병의 치료 후 알러지 반응의 예방 및 치료를 위한, 고투여량으로 IL-6 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

IL-6 길항제는 바람직하기는 항-IL-6R 항체이다. 항-IL-6R 항체는 바람직하기는 IL-R에 대한 모노크로날 항체이다. 바람직하기는, 항-IL-6R 항체는 인간 IL-6에 대한 모노크로날 항체이다. 또는, 바람직하기는, 항-IL-6R 항체는 마우스 IL-6에 대한 모노크로날 항체이다. 바람직하기는, 항-IL-6R 항체는 재조합형 항체이다. 바람직하기는, 인간 항-IL-6R 모노크로날 항체는, 예를 들면, PM-1 항체이다. 바람직하기는, 마우스 항-IL-6R 항체는, 예를 들면, MR16-1항체이다. 항체는 또한, 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 IL-6R에 대한 인간 항체일 수 있다. 특히 바람직한 항-IL-6R 항체는, 예를 들면, 인간화 PM-1-항체이다.

IL-6 항체, 특히 항-IL-6R 항체를 면역억제제와 조합할 때, IL-6 길항제, 특히 항-IL-6R 항체의 투여량은 예를 들면, 정맥 주입의 경우, 0.02~150mg/kg/4주이고 또는 그것에 대한 등가량으로 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량이고, 바람직하기는 0.5~30mg/kg/4주 또는 그것에 대한 등가량으로 항-IL-6R-항체 혈중 농도를 나타내는 투여량이고, 더욱 바람직하기는 2~8mg/kg/4주 또는 그것에 대한 등가량으로 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량이다.

IL-6 길항제, 특히 항-IL-6R 항체를 고투여량으로 투여할 때, IL-6- 길항제, 특히, 항-IL-6R 항체의 투여량은, 예를 들면, 정맥 주입의 경우, 4mg/kg/4주 이상 또는 그것에 대한 등가량으로 IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량이고, 바람직하기는 6~16mg/kg/4주 또는 그것에 대한 등가량으로 IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량이고, 더욱 바람직하기는 6~10mg/kg/4주 또는 그것에 대한 등가량으로 IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량이다.

MTX가 면역억제제로 사용될 때, MTX의 투여량은 예를 들면 1~100mg/kg/주 또는 그것에 대한 등가량으로 혈중 MTX 농도를 나타내는 투여량, 바람직하기는 4~50mg/kg/주 또는 그것에 대한 등가량으로 혈중 MTX 농도를 나타내는 투여량, 특히 바람직하기는 10~25mg/kg/주 또는 그것에 대한 등가량으로 혈중 MTX 농도를 나타내는 투여량이다.

혈중 약물(예를 들면, 항-IL-6R-항체 MTX)를 나타내는 투여량은 동등한 치료효과를 제공하는 투여량을 의미하고, 혈중 농도의 전이가 정맥 주사 및 피하주사와 같은 투여 방법에 따라 변할 때에도, 치료효과가 동등한 한, 혈중 약물(예를 들면, 항-IL-6R 항체 또는 MTX)를 나타내는 투여량으로 간주된다.

IL-6 관련 질병의 예는,

급성 만성 염증성 질환 및 자가면역질환: 신염, 맥관증식신염, 크론병, 궤양성 대장염, 췌장염, 연소성 특발성 위축증 또는 전신성 연소성 특발성 위축증, 맥관염, 가와사끼병, 류마티스성 관절염, 전신성 에리테마토스, 건선, 쇼그렌증후근, 성인 스틸병;

악성종양 질환: 다발성골수종, 캐츨맨즈병, 악성림프종, 직장암;

감염성 질환: HIV에 의한 감염, EBV에 의한 감염;

악액질: 악액질;

기타: 형질구 증가증, 초면역성 글로블린혈증, 빈혈 등을 포함하고, 및 바람직하기는 류마티스성 관절염 형질구증가증, 초면역성 글로불린혈증, 빈혈, 신염, 악액질, 다발성 골수종, 캐츨맨즈병, 맥관증식신염, 전신성 에리테마토스, 크론병, 췌장염, 건선, 연소성 특발성 위축증 또는 전신성 연소성 특발성 위측증을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구적 또는 비경구적으로 및 전신적 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 적주주입과 같은 정맥주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하주사, 좌약, 결장주사, 경구 장용약제 등이 선택될 수 있고, 투여방법은 환자의 연령 및 상태에 따라 적절히 선택될 수 있다. 실제 투여량의 상한 및 하한은 투여빈도에 의해 영향을 받고, 예를 들면, 1회량 당 투여량은 긴 투여 간격의 경우 증가하는 반면, 짧은 투여 간격의 경우 감소한다.

항-IL-6 수용체 항체의 바람직한 투여량 및 투여방법에 관하여, 예를 들면, 유리 항체가 혈중 존재하는 정도의 양이 효과적인 투여량이다. 특별한 예로서, 적주주입과 피하주사와 같은 정맥내 주사의 방법에 의해, 예를 들면, 2회/주, 1회/주, 1회/2주, 1회/4주, 1회/6주, 1회 8주의 투여 스케줄에 따라 하나를 여러번으로 나누어 투여하는 방법이 있다. 투여 스케줄은 질병 상태 및 혈중 실험자료의 변화를 관찰하면서 2회/주 또는 1회/주에서 1회/2주, 1회/3주, 1회/4주, 1회/6주 및 1회/8주의 투여 간격으로 늘어나는 것과 같이 조절될 수 있다.

MTX와 조합하여 투여될 때, 항-IL-6R-항체의 투여량은 통상적으로, 예를 들면, 류마티스성 관절염의 경우, 0.5mg/kg/주 초과의 투여량 또는 동등한 또는 더 많은 항-류미티스성 효과를 나타내는 투여량이다. 예를 들면, 정맥내 투여가 4주당 1회 실시될 때, 투여량은 0.02~150mg/kg, 바람직하기는 0.5~30mg/kg, 및 더욱 바람직하기는 2~8mg/kg이다.

항-IL-6R 항체 및 면역억제제는 동시에 또는 시간간격을 두고 투여된다.

면역억제제는 또한 항-류마티스성 약제, 부신피질 호르몬제 등을 포함할 수 있고, 예를들면, 하기 약물을 포함한다.

A.면역억제제, 항-류마티스성 약제, 부신피질 호르몬

면역억제제:

알킬화제

시클로포스파미드

대사작용 길항제

아자티오프린, 메토트렉사이드, 미조리빈

T-세포 활성 억제제

시크로포린, 타크롤리무스

항-류마티스성 약제:

히드록시클로로퀸, 술파살라진, 레플루노미드, 에타네르셉트,

인플릭시마브, 아달리넘마브, D-페니실라민, 경구용 금 화합물,

투약가능 금 화합물(근육내 주사), 미노실린, 소듐 골드 티오말레이트,

아우라노핀, D-페니실라민, 로벤자리트, 부실라민, 액타리트;

부신피질 호르몬제:

코티손, 히드로코티손

코티손 아세테이트, 히드로코티손, 히드로코티손 소듐 포스페이트,

히드로코티손 소듐 숙시네이트, 플루트로코티손 아세테이트

프레드니솔론, 프레드니솔론스

프레드니솔론, 프레드니솔론 소듐 숙시네이트

프레드니솔론 소듐 포스페이트, 할로프레돈 아세테이트

메틸 프레드니솔론스

메틸 프레드니솔론스, 메틸 프레드니솔론 아세테이트,

메틸 프레드니솔론 소듐 숙시네이트

트리암시놀론스

트리암시놀론, 트리암시놀론 아세테이트,

트리암시놀론 액티나이드

덱사메타손스

덱타메타손, 덱타메타손 아세테이트,

덱사메타손 소듐 포스페이트, 덱사메타손 팔미테이트

베타메타손스

베타메타손(베타메타손 소듐 포스페이트)

베타메타손, 베타메타손 소듐 포스페이트

파라메타손스

파라메타손 아세테이트

면역억제제의 투여량은, 예를 들면, MTX가 류마티스성 관절염을 위해 조합될 때, 예를 들면, 경구 투여시, 1~100mg/몸체/주, 바람직하기는 4~50mg/몸체/주, 더욱 바람직하기는 7.5~25mg/몸체/주이다.

또한, 항-IL-6R-항체의 고투여량은 알러지반응을 예방하거나 또는 감소시킬 수 있는 투여량을 의미하며, 이것은 IL-6R 관련 질병의 치료에 효과적인 최소 투여량과 같거나 또는 이상이다. 예를 들면, 류마티스성 관절염 치료에서, 정맥내 주적주입이 4주마다 투여될 때, 투여량은 4mg/kg이상, 바람직하기는 6~16mg/kg, 더욱 바람직하기는 6~10mg/kg을 포함한다.

상기 투여방법, 투여 간격 및 투여량은 바람직한 예의 실예이고, 유사한 치료적 효과를 나타내는 투여방법, 간격 및 투여량은 적절히 선택될 수 있다. 예를 들면, 여러 약제의 혈중 농도를 측정함에 의해 상기 바람직한 예의 것과 유사한 효과를 나타내는 투여방법, 간격, 및 투여량을 선택할 수 있다. 본 발명은 상기 예들의 것과 동등한 혈중 농도를 달성하는 투여방법, 간격 및 투여량을 포함한다.

발명을 실시하기 위한 방법

본 발명에 사용되는 IL-6 길항제는 IL-R 관련 질병에 대한 예방 또는 치료적 효과를 나타내는 한, 그 기원, 타입 및 형태와 관련없이 사용될 수 있다.

IL-6 길항제는 IL-6 생리적 활성을 억제하는 물질이다. IL-6 길항제는 바람직하기는 IL-6, IL-6R 또는 gp130에의 결합을 억제하는 효과를 갖는 물질이다. IL-6 길항제는 항-IL-6 항체, 항-IL-6, 항-gp130 항체, 변형 IL-6R 항체, 또는 IL-6 또는 IL-6R의 부분 펩티드를 포함할 뿐 아니라, 유사한 활성을 나타내는 저분자 물질을 포함한다.

본 발명에 사용되는 항-IL-6 항체는 선행 기술에 알려진 수단을 사용하는 모노크로날 또는 모노크로날 항체로서 얻어질 수 있다. 본 발명에 사용되는 항-IL-6 항체로서, 포유동물로부터 유래된 모노크로날 항체가 바람직하다. 포유동물로부터 유래된 모노크로날 항체는 혼성종양세포에서 생성된 것, 그리고 유전공학기술에 의해 항체 유전자를 함유하는 발현 벡터로 변형된 숙주세포에서 생성된 것을 포함한다. 이 항체는 세포에 IL-6 생리적 활성 신호를 블럭하기 위해 IL-6에 결합함에 의해, IL-6의 IL-6 수용체에의 결합을 억제한다.

이와 같은 항체에는 MH166(Matsuda, T. et al.,Eur. J. Immunol., 18:951-956, 1988) 및 SK2 (Sato, K. et al., The 21st Proceedings of the Japanese Society for Immunology, 21:166, 1991)를 포함한다.

항-IL-6 항체를 생산하는 혼성종양세포는 기본적으로, 다음과 같은 본 분야에 알려진 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 즉, 혼성종양세포는 표준면역법에 따라 민감화된 항원으로서 IL-6를 사용한 면역화를 실시하고, 생성된 면역화된 세포를 본 분야에 알려진 표준 세포 융합법에 의해 환자 세포에 융합하고, 및 표준 스크리닝법에 의해 모노크로날 항체를 생성하는 세포를 스크리닝함에 의해 제조될 수 있다.

특별히는, 항체 IL-6 항체는 다음과 같이 제조될 수 있다. 예를 들면, 항체를 얻기위해 민감화된 항원으로 사용되는 인간 IL-6는 Eur. J. Biochem., 168:543-550, 1987; J. Immunol., 140: 1534-1541, 1988; 또는 Agr. Biol. Chem., 54:2685-2688, 1990에 기재된 IL-6의 유전자 아미노산 서열을 이용하여 얻을 수 있다.

IL-6의 유전자 서열은 공지의 발현 벡터로 삽입되고, 이것은 적당한 숙주세포로 변형되고, 그 결과, 표적 IL-6 단백질은 공지의 방법에 의해 세포 또는 배양물 상등액으로부터 정제되고, 정제된 IL-6 단백질은 민감화된 항원으로 사용될 수 있다. 또한, 다른 단백질과의 IL-6 단백질의 융합 단백질은 민감화된 항원으로 사용될 수 있다.

본 발명에 사용되는 항-IL-6 수용체 항체는 공지의 수단을 이용하여 폴리크로날 또는 모노크로날 항체로서 얻어질 수 있다. 본 발명에 사용되는 항-IL-6 수용체 항체로서, 포유동물로부터 유래되는 모노크로날 항체가 바람직하다. 포유동물로부터 유래된 모노크로날 항체는 혼성종양세포에서 생성된 것, 유전공학기술에 의해 항체 유전자를 함유하는 발현벡터로 변형된 숙주세포에서 생성된 것을 포함한다. 이 항체는 IL-6 생리적 활성의 신호를 블럭하도록 IL-6 수용체가 세포에 결합함에 의해 IL-6가 IL-6 수용체에 결합하는 것을 막는다.

이와 같은 항체는 MR16-1 항체(Tamura, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11924-11928, 1993), PM-1 항체(Hirata, Y. et al., J. Immunol., 143:2900-2906, 1989), AUK-12-20 항체, AUK64-7 항체 또는 AUK146-15 항체(International Patent Application Publication No. WO 92-19759)를 포함한다. 이들 중에서, 특히 바람직한 항체는 PM-1 항체를 포함한다.

PM-1과 같은 PM-1 항체를 생성하는 혼성종양세포계는 부타페스트 조약을 근거로 국제 특허 유기물 수탁기관(AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.)에 1989년 7월 12일에 FERM BP-2998로서 국제적으로 기탁되어 있다. 래트-마우스 혼성종양세포 MR16-1과 같은 MR16-1 항체를 생성하는 혼성종양세포계는 부타페스트 조약을 근거로 국제 특허 유기물 수탁기관(AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.)에 1997년 3월 13일에 FERM BP-5875로서 국제적으로 기탁되어 있다.

항체 IL-6 수용체 모노크로날 항체를 생성하는 혼성종양세포는 기본적으로 다음과 같은 공지의 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 즉, 혼성종양세포는 표준 면역법에 따른 민감화된 항원으로서 IL-6 수용체를 사용한 면역화를 실시하고, 생성된 면역화된 세포를 공지의 표준 세포 융합법을 사용하여 부모세포에 융합시키고, 그리고 표준 스크리닝법에 의해 단일항체를 생성하는 세포를 스크리닝하는 것으로 제조될 수 있다.

특히, 항-IL-6-수용체는 다음과 같이 제조될 수 있다. 예를 들면, 항체를 얻기위한 민감화된 항체로서 사용되는 인간 IL-6 수용체는 각각 유럽특허출원공보 제 EP325474 및 JP-A-3-255795호에 기재된 IL-6-수용체 유전자/아미노산 서열을 사용하여 얻어질 수 있다.

IL-6-수용체 단백질은 세포 상에 발현된 것과 세포막으로부터 해리된 것(가용성 IL-6 수용체)(Yasukawa, K. et al., J. Biochem., 108:673-676)의 두 타입이다. 가용성 IL-6 수용체는 실질적으로 IL-6 수용체의 세포외 영역으로 이루어져 있고, 이것은 막횡단 영역 또는 막횡단 및 세포간 영역이 결핍된 IL-6 수용체에 결합하는 막과 다르다. 두 IL-6 수용체 단백질은 이들이 본 발명에서 사용되는 항-IL-6 수용체 항체의 생산을 위한 민감화된 항체로서 사용되는 동안 사용될 수 있다.

IL-6 수용체의 유전자 서열은 공지의 발현벡터에 삽입되고, 이것은 이후 적당한 숙주세포를 변형시키고, 표적 IL-6 수용체 단백질은 공지의 방법으로 세포 또는 배양 상등액으로부터 세정되고, 세정된 IL-6 수용체 단백질은 민감화된 항원으로 사용될 수 있다. 또한, IL-6 수용체를 발현하는 세포와 다른 단백질과의 IL-6 수용체의 융합 단백질이 민감화된 항원으로 사용될 수 있다.

플라즈마를 함유하는 E.coli, HB101-pIBIBSF2R과 같은 인간 IL-6 수용체를 암호화하는 cDNA를 포함하는 pIBIBSF2R는 부타페스트 조약을 근거로 국제 특허 유기물 수탁기관(AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.)에 1989년 1월 9일에 FERM BP-2232로서 국제적으로 기탁되어 있다.

본 발명에 사용되는 항-gp130 항체는 공지의 수단을 사용하여 폴리크로날 또는 모노크로날 항체로서 얻어질 수 있다. 본 발명에 사용되는 항-gp130 항체로서, 포유동물에서 유래된 모노크로날 항체가 바람직하다. 포유동물로부터 유래된 모노크로날 항체는 혼성종양세포에서 생성된 것, 유전공학기술에 의해 항체 유전자를 함유하는 발현 벡터로 변형된 숙주세포에서 생성된 것을 포함한다. 이 항체는 IL-6 생리적 활성의 세포로의 신호를 블럭하기 위해 gp130에 결합됨으로써, IL-6/IL-6 수용체 복합체가 gp130에 결합되는 것을 억제한다.

이와 같은 항체는 AM64 항체(JP-A-3-219894), 4B11 항체 및 2H4 항체(US 5571513), B-S12 항체 및 B-P8 항체(JP-A-8-291199)를 포함한다.

항-gp130 모노크로날 항체를 생산하는 혼성종양세포는 기본적으로 다음과 같은 공지의 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 즉, 혼성종양세포는 표준 면역화법에 따른 민감화된 항원으로서 gp130을 사용하여 면역화를 실시하고, 생성된 면역화된 세포를 표준 융합법에 의해 공지의 부모 세포에 융합시키고, 표준 스크리닝법으로 모노크로날 항체를 생성하는 세포를 스크리닝하여 제조될 수 있다.

특히, 모노크로날 항체는 다음가 같이 제조될 수 있다. 예를 들면, 항체를 얻기위한 민감화된 항원으로 사용되는 gp130은 유럽 특허출원공보 제 EP 411946호에 기재된 gp130 유전자/아미노산 서열을 사용하여 얻을 수 있다.

gp130의 유전자 서열은 공지의 발현벡터시스템으로 삽입되고, 이것은 적당한 숙주세포로 전이되고, 이어서 표적 gp130 단백질은 세포 또는 배양물 상등액으로부터 공지의 방법으로 세정되고, 세정된 gp130 단백질은 민감화된 항원으로 사용될 수 있다. 또한 gp130을 발현하는 세포 및 다른 단백질과 gp130 단백질과의 융합 단백질은 민감화된 항원으로 사용될 수 있다.

민감화된 항원으로 면역화된 포유동물은 특별히 제한되지 않지만, 세포 융합을 위해 사용되는 부모 세포와의 양립성을 고려하여 선택되는 것이 바람직하다. 일반적인 방법으로, 이것은 민감화된 항원을 동물에 복막내 또는 피하내 주입함에 의해 실시된다. 특별히, 민감성 항원은 PBS(인산염 완충된 살린) 또는 살린으로 적당히 희석되고 현택되고, 이것은 적절한 표준 보조액, 예를 들면 에멀젼화될 프로인트 완전보조액의 적절한 양과 혼합되고, 이어서 4~21일의 간격으로 수회 포유동물에 투여된다. 또한, 적절한 담체가 민감화된 항체로 면역화된 후 사용될 수 있다.

동물은 이런 방법으로 면역화되고 이것은 원하는 항체의 수준이 혈청에서 증가되는 것을 확실히 한다. 따라서, 면역화된 세포는 포유동물로부터 제거되고, 세포 융합되었다. 세포 융합되는 바람직한 면역화 세포는 비장세포를 포함한다.

상기 면역화 세포와 융합된 파트너 부모 세포로서 포유동물의 골수종 세포의 경우, 이미 공지된 세포계, 예를 들면, p3X63Ag8.653(Kearney, J.F. et al., J.Immunol., 123:1548-1550, 1979), P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology, 81:1-7, 1978), NS-1(Kohler, G, 및 Milstein, C., Eur.J.Immunol., 6:511-519, 1976), MOC-11(Margulies D.H. et al., nature, 276:269-270, 1978), SP2/0(Shulman, m. et al., Nature, 276:269-270, 1978), FO(de st. Groth, S,F, et al., J.Immunol, Methods, 35:1-21, 1980), S194(Trowbridge, I.S.J. Exp.Med., 148:311-323, 1978), R210(Galfre, G. et al., nature, 277:131-133, 1979)가 적절히 사용된다.

상기 면역화된 세포의 비장 세포와의 세포 융합은 기본적으로 공지의 방법, 예를 들면, 밀스턴법(Milstein's method: Kohler G. 및 Milstein C., Methods Enzymol., 73:3-46, 1981)에 따라 실시될 수 있다.

더욱 특별하기는, 상기 세포 융합은, 예를 들면 세포 융합 촉진제의 존재하에 표준 영양 배지에서 실시된다. 세포 융합 촉진제로서, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 디메틸술폭사이드와 같은 보조약제가 융합 효능을 증가시키기 위해 필요에 따라 추가로 첨가/사용될 수 있다.

비장 세포에 대한 면역화된 세포의 사용비는, 예를 들면 비장 세포에 대한 면역화된 세포의 1~10배가 바람직하다. 상기 세포 융합을 위해 사용되는 매질로서, RPMI 1640 배지, 비장 세포계의 성장에 적절한 MEM 매질, 및 이런 타입의 세포계에 사용되는 다른 표준 매질의 사용이 바람직하고, 추가로 야생 송아지 혈청(FCS)과 같은 혈청 보충물이 조합될 수 있다.

세포 융합을 위해, 표적 융합된 세포(혼성종양세포스)는 상기 매질에서 주어진 양의 비장 세포와 상기 면역화된 세포를 완전히 혼합하고, PEG 용액, 예를 들면 평균분자량이 약 1000 ~ 6000이고, 37℃에서 30~60%(w/v)의 표준농도에서 예열된 PEG 용액을 첨가하고, 그리고 혼합하여 형성된다. 이어서, 혼성종양세포의 성장에 바람직하지 않은 세포 융합제 등은 연속적으로 적절한 매질의 첨가 및 원심분리에 의한 상등액의 제거의 조작의 반복에 의해 제거될 수 있다.

혼성종양세포는 표준 선택 매질, 예를 들면, HAT 매질(히포크산틴, 아미놉테린 및 티미딘을 함유하는 매질)에서 배양함에 의해 선택된다. HAT 매질중의 배양은 통상적으로 수일 내지 수주, 표적 혼성종양세포(비-융합된 세포) 이외의 다른 세포들이 죽을 때까지 충분한 시간동안 계속된다. 그리고 나서, 표준 제한 희석법이 실시되고, 표적 항체를 생성하는 혼성종양세포가 스크리닝되고 클론된다.

또한, 항원으로 인간 이외의 동물을 면역화함에 의해 상기 혼성종양세포를 얻는 것 이외에, 원하는 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 대한 결합 활성을 갖는 원하는 인간 항체는 인간 림포구를 항원 단백질 또는 인비트로 항원을 발현하는 벡터로 민감화하고, 민감화된 B 림포구를 인간 비장 세포, 예를 들면 U266(JP-B-59878 참조)과 융합시킴으로써 얻을 수 있다. 더우기, 항원 또는 항원발현 세포는 상기 방법에 따른 원하는 인간 하체를 얻기 위해 인간 항체 유전자의 레퍼토리를 갖는 유전자도입 동물에 투여될 수 있다(국제특허출원공보 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735 참조).

이 방법으로 제조된 모노크로날 항체를 생성하는 혼성종양세포는 표준 배지에서 배양될 수 있고, 또한 장기간동안 액체질소에 저장될 수 있다.

혼성종양세포로부터 모노크로날 항체를 얻기 위해, 적용되는 것은 혼성종양세포가 표준법에 따라 배양되고 모노크로날 항체가 그것의 배양 상등액으로 얻어지는 방법이거나 또는, 혼성종양세포가 그것과 양립가능한 포유동물에 투여됨에 의해 증식되고 모노크로날 항체가 그것의 복수(ascites)로서 얻어지는 방법이다. 전자의 방법은 고순도로 항체를 얻기에 알맞고, 후자의 방법은 대규모로 항체를 생산하기에 알맞다.

예를 들면, 항-IL-6 수용체를 생산하는 혼성종양세포의 생산은 JP-A-3-139293에 기재된 방법으로 실시될 수 있다. 국제 특허 유기물 수탁기관(AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.)에 부다페스트 조약을 기준으로 1989년 7월 12일에 FERM BP-2998로 국제적으로 기탁된 PM-1 항체를 생산하는 혼성종양세포가 보수와 PM-1 항체를 얻기 위해 BALB/c 마우스에 복막내 주입되는 방법이 실시될 수 있다. 또한, 현재의 혼성종양세포가 적절한 매질, 예를 들면 RPMI 1640 매질, 혼성종양세포 SFM 매질(GIBCO-BRL사로부터 공급), 10% 야생 송아지 혈청 및 5% BM-Condimed H1을 함유하는 PRHM-II 매질(GIBCO-BRL사로부터 공급) 및 PM-1- 항체에서 배양되는 방법이 실시될 수 있다.

본 발명에서, 모노크로날 항체로서, 혼성종양세포로부터 항체 유전자를 클론닝하고, 유전자를 적당한 벡터에 삽입하고, 이것을 숙주세포에 도입하고, 유전공학기술을 사용함에 의해 생산된 재조합 타입 항체를 사용하는 것이 가능하다(예를 들면, Borrebaeck, C.A.K 및 Larrick, J.M., Therapeutic Monoclonal Antibodies, Published in the United Kingdom by Macmillan Publishers Ltd., 1990 참조).

특별히는, 항체의 가변(V) 영역을 암호화하는 mRNA는 표적 항체를 생산하는 세포, 즉 혼성종양세포로부터 분리된다. mRNA의 분리를 위해, 전체 RNA는 공지의 방법, 예를 들면, 구아니딘 초원심분리법(Chirgwin, J.M., et al, Biochemistry, 18:5294-5299, 1979), AGPC법(Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem., 162:156-159, 1987)으로 제조되고, 및 mRNA는 mRNA 정제키트(Pharmacia 로부터 공급)에 의해 제조된다. 또한, mRNA는 직접 QuickPrep mRNA 정제키트(Pharmacia로부터 공급)의 사용에 의해 제조될 수 있다.

항체 V 영역의 cDNA는 역전사효소를 사용하여 생성된 mRNA로부터 합성될 수 있다. cDNA의 합성은 AMV 역전사효소 제1-가닥 cDNA 합성 키트 등을 사용하여 실시될 수 있다. 또한, 5'-Ampli FINDER RACE 키트(Clontech사 공급) 및 PCR을 사용하는 5'-RACE 법(Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8998-9002, 1988; Belyacsky A. et al., Nucleic Acids Res., 17:2919-2932, 1989)이 cDNA를 합성하고 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 표적 DNA 단편은 생성된 PCR 산물로부터 정제될 수 있고, 벡터 DNA에 결찰될 수 있다. 또한 재조합 벡터는 이것에 의해 제조되고, 이것은 E.coli에 도입되고 클로니는 원하는 재조합 벡터를 제조하기 위해 선택된다. 표적 DNA의 염기서열은 공지의 방법, 예를 들면, 데옥시법으로 확인된다.

표적 항체의 V 영역을 암호화하는 DNA가 얻어진다면, 이것은 원하는 항체의 일정 영역(C 영역)을 암호화하는 DNA에 결찰되고, 그리고 나서 발현 벡터에 병합된다. 또는 항체의 V 영역을 암호화하는 DNA는 항체의 C 영역을 함유하는 발현 벡터에 병합될 수 있다.

본 발명에 사용되는 항체를 생산하기 위해, 항체 유전자는 하기와 같은 강화제 및 촉진제와 같은 발현 조절영역하에서 발현되도록 발현벡터에 병합된다. 다음, 숙주세포는 이 발현 벡터에 의해 변형되어 항체를 발현할 수 있다.

본 발명에서, 인공적으로 변형된 유전자 재조합 항체, 예를 들면, 키메릭항체, 인간화 항체 및 인간 항체가 인간의 알러지성 항원성을 감소시키는 목적을 위해 사용될 수 있다. 이 변형된 항체는 공지의 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

키메릭 항체는 상기와 같이 얻은 항체 V 영역을 암호화하는 DNA를 인간 항체 C 영역을 암호화하는 DNA에 결찰하고, 이것을 생산할 숙주에 도입되어질 발현벡터에 병합시켜 얻을 수 있다(유럽특허출원공보 제 EP 125023, 국제특허출원공보 제 WO 92/19759 참조). 이들 공지의 방법을 사용하여, 본 발명에 유용한 키메릭 항체를 얻을 수 있다.

예를 들면, PM-1 키메릭 항체의 L과 H 사슬의 V 영역을 암호화하는 DNA를 함유하는 플라즈미드는 각각 pPM-k3와 pPM-h1으로 명명되고, 이들 플라즈미드를 갖는 E.coli는 부다페스트 조약에 따라 1991년 2월 12일에 각각 NCIMB 40366 및 NCIMB 40362로서 National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria Limited(23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland, United Kingdom)에 국제적으로 기탁되어 있다.

인간화 항체는 또한 재조절된 인간항체로 불리우며, 이것은 인간 이외의 포유동물, 즉 마우스의 항체의 보체적 결정 영역(CDR)이 인간 항체의 보체적 결정영역에 이식된 것이고, 그의 일반적인 유전 재조합법이 알려져 있다(유럽특허출원 공보 제 EP125023, 국제특허출원공보 제 WO 92/19759).

특별히, 마우스 항체의 CDR을 인간 항체의 골격 영역(FR)에 링크하기 위해 고안된 DNA 서열은 터미날에서 오버래핑 부분을 갖도록 제조된 여러 올리고뉴클레오티드로부터 PCR에 의해 합성된다. 생성된 DNA는 인간 항체 C 영역을 암호화하는 DNA에 결찰되고, 그리고 나서 발현벡터에 병합되고, 이것은 인간화 항체를 생성하기 위해 숙주에 도입된다(유럽 특허출원 공보 제 EP 239400, 국제특허출원공보 WO 92/19759 참조).

CDR을 통해 결찰된 인간 항체의 FR로서, 이들은 보체적 결정영역이 양호한 항원 결합부위를 형성하도록 선택된다. 항체 가변 영역의 골격 영역에서 아미노산은 조절된 인간 항체의 보체적 결정영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 필요에 따라 치환될 수 있다(Sato, K. et al., Cancer Res., 53:851-856, 1993).

인간 항체 C 영역은 키메릭 항체 및 인간화 항체를 위해 사용된다. 인간 항체 C 영역은 Cγ를 포함하고, 그리고 예를 들면 Cγ1, Cγ2, Cγ3, 또는 Cγ4가 사용될 수 있다. 인간 항체 C 영역은 항체 또는 그것의 생산의 안정성을 개선하기 위해 변형될 수 있다.

키메릭 항체는 인간 이외의 포유동물로부터 유래된 항체의 가변영역 및 인간 항체로부터 유래된 C 영역으로 이루어진다. 인간화 항체는 인간 이외의 포유동물로부터 유래된 항체의 보체적 결정 영역과 골격영역 및 인간 항체로부터 유래된 C 영역으로 이루어진다. 그러므로, 이들은 인체에서 항원성을 감소시키고 그러므로 본 발명에 사용된 항체로서 유용하다.

본 발명에 사용되는 인간화 항체의 바람직한 특별한 예는 인간화 PM-1 항체를 포함한다(국제특허출원공보 제 WO 92-19759 참조).

또한, 인간 항체를 얻기 위한 방법으로, 인간 항체 라이브러리를 사용한 패닝(panning)에 의해 인간 항체를 얻기 위한 기술이 상기 방법 이외에 알려져 있다. 예를 들면, 인간 항체의 가변영역은 파아지 디스플레이법에 의한 단일가닥항체(ScFv)로서 파아지의 표면에 발현될 수 있고, 항원에 결합된 파아지가 선택될 수 있다. 선택된 파아지의 유전자가 분석될 때, 항원에 결합된 인간 항체의 가변 영역을 암호화하는 DNA 서열이 결정될 수 있다. 항원에 결합된 ScFv의 DNA 서열이 논증되면, 서열은 인간 항체를 얻기위한 적절한 발현 벡터에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법은 이미 잘 알려져 있고, WO 92101047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 95 01438 및 WO 95/15388를 인용할 수 있다.

상기와 같이 구성된 항체 유전자는 공지의 방법으로 발현되고 얻을 수 있다. 포유동물 세포의 경우, 항체 유전자는 일반적으로 유용한 촉진제, 발현되어질 항체 유전자, 및 폴리 A 시그날 3' 하류방향이 기능적으로 결합하는 DNA에 의해, 또는 그들을 함유하는 벡터에 의해 결합된다. 예를 들면, 촉진제/강화제는 인간 거대세포바이러스 직접 초기 촉진제/강화제를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 사용된 항체의 발현을 위해 사용될 수 있는 다른 촉진제/강화제로서, 레트로바이러스의 바이러스성 촉진제/강화제, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 시미안 바이러스 40(SV40), 및 포유동물 세포 인간 신장인자 1α(HEF1α)로부터 유래된 촉진제/강화제가 사용될 수 있다.

예를 들면, 발현은 SV40 촉진제/강화제를 사용하는 경우는 Mulligan et al의 방법(Mulligan, R. C. et al., Nature, 2777:108-114, 1979), 또는 HEF1α 촉진제/강화제의 경우에는 Mizushima et al법(Mizushima, S 및 Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18:5322, 1990)에 의해 실시될 수 있다.

E. coli의 경우, 유전자는 통상적으로 유용한 촉진제, 항원 분비용 신호 서열 및 발현되어질 항체 유전자를 기능적으로 결합함으로써 발현될 수 있다. 예를 들면, 촉진제는 lacZ 촉진제 및 araB 촉진제를 포함할 수 있다. Ward et al 법(Ward, E.S. et al., Nature, 341:544-546, 1989; Ward, E.S. et al., FASEB J., 6:242-2427, 1992)와 Better et al법(Better, M. et al., Science, 240:1041-1043, 1988)은 각각 lacZ 촉진제와 araB 촉진제를 이용한 경우에 사용될 수 있다.

항체의 분비를 위한 신호 서열로서, pelB 신호서열(Lei, S.P. et al., Bacteriol., 169:4379-4383, 1987)은 E.coli의 외질에서의 생산의 경우에 사용될 수 있다. 외질에서 생산되는 항체는 분리되고, 이어서 항체 구조물의 적절한 재접힘에 의해 사용된다(예를 들면, WO 96/30394 참조).

SV40, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 보바인 파필로마 바이러스(BPV)로 부터 유도된 것들이 복제 기원으로서 사용될 수 있다. 이에 더하여, 숙주세포 시스템에서 유전자 사본 수의 증폭을 위해, 발현 벡터는 아미노글리코시드 포스포트란스퍼라제(APH) 유전자, 티미딘 키나아제(TK)유전자, E.coli 크산틴 구아닌 포스포리보실 트란스퍼라제(Ecogpt) 유전자, 디히드로플레이트 리덕타제(dhfr) 유전자 등이 선택 마커로서 포함될 수 있다.

본 발명에 사용되는 항체의 생산을 위해, 광학 생산 시스템이 사용될 수 있다.항체를 제조하기 위한 인비트로 및 인비보 생산 시스템이 있다. 인비트로 생산 시스템은 진핵세포를 사용하는 생산 시스템과 원핵세포를 사용하는 생산시스템을 포함한다.

진핵세포를 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 또는 균류세포를 사용하는 생산 시스템이 있다. 동물세포의 경우, (1)포유동물 세포, 예를 들면, CHO, COS, 골수종, BHK(어린 햄스터 신장), HeLa, Vero 등, (2)파충류 세포, 예를 들면, 제노푸스(Xenopus)의 난모세포, 또는 (3) 곤충세포, 예를 들면sf9, sf21, Tn5 등이 알려져 있다. 균류 세포로서, 이스트, 예를 들면 효모균속, 예를 들면 맥주효모균속, 및 사상균, 예를 들면 아르페르길루스속, 예를 들면 흑색국균이 알려져 있다.

원핵세포를 사용하는 경우는, 세균성 세포를 이용한 생산 시스템이 있다. 세균성 세포로서, E. coli 및 고초균이 알려져 있다.

항체는 표적 항체를 변형에 의해 이들 세포에 도입시키고 변형된 세포를 인비트로에서 배양함으로써 얻을 수 있다. 배양은 공지의 방법에 따라 실시된다. 예를 들면, DMEM, MEM, RPMI 1640 및 IMDM이 매질로서 사용될 수 있고, 야생 송아지 혈청(FCS)과 같은 혈청 보충물이 또한 조합될 수 있다. 항체는 항체 유전자가 동물의 복강으로 도입되는 세포를 이동시킴으로 인비보에서 생성될 수 있다.

한편, 인비보 생산 시스템은 동물세포를 사용한 생산 시스템과 식물세포를 사용한 생산 시스템을 포함한다. 동물 세포를 사용한 경우, 포유동물과 곤충을 사용한 생산 시스템이 있다.

포유동물로서, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소 등이 사용될 수 있다(Vicki Glaser, Spectrun Biotechnology Applications, 1993). 또한, 곤충으로서, 누에가 사용될 수 있다. 식물이 사용되는 경우, 예를 들면 담배가 사용될 수 있다.

항체 유전자는 이들 동물 또는 식물에 도입되고, 항체가 동물 또는 식물의 몸체에서 생산되고, 그리고 수집된다. 예를 들면, 항체 유전자는 염소 β카제인과 같은 우유에서 고유적으로 생산되는 단백질을 암호화하는 유전자의 중류에 삽입함으로써 융합 유전자로 제조된다. 항체 유전자에 삽입된 융합 유전자를 함유하는 DNA 단편은 염소 배아에 삽입되고, 이것은 암컷 염소에 이송된다. 원하는 항체는 그것의 배 또는 자손을 수용하는 염소로부터 태어난 유전자전이 염소의 우유로부터 얻어진다(Ebert, K.M. et al., Bio/Technology, 12:699-702, 1994).

누에를 사용하는 경우, 누에는 표적 항체 유전자가 삽입된 바쿨로바이러스로 감염되고, 원하는 항체는 이들 누에의 체액으로부터 얻어진다(Maeda, S, et al., Nature, 315:592-594, 1985). 더우기, 담배를 사용하는 경우, 표적 항체 유전자가 식물 발현 벡터, 예를 들면, pMON 530에 삽입되고, 이 벡터는 아그로박테륨속 종기와 같은 세균에 삽입된다. 니코디아나 타바쿰과 같은, 담배는 이들 세균에 감염되고, 그리고 원하는 항체가 이들 담배의 잎으로부터 얻어진다(Julian, K.C., ma, et al., Eur. J. Immunol., 24:131-138, 1994).

항체가 상기와 같이 인비트로 또는 인비보 생산 시스템에서 생산될 때, 항체 중쇄(H 사슬) 또는 경쇄(L 사슬)을 암호화하는 DNA가 발현 벡터에 개별적으로 병합될 수 있고, 이것은 숙주를 동시에 변형하거나, 또는 H 사슬 및 L 사슬을 암호화하는 DNA가 단일 발현벡터에 병합되고, 이것은 숙주를 변형시킬 수 있다(국제특허출원공보 제 WO 94-11523 참조).

본 발명에 사용된 항체는 항체가 적당하게 사용될 수 있는 한, 항체의 단편 또는 그것의 변형일 수 있다. 예를 들면, 항체의 단편은 Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일 사슬 Fv(scFv)를 포함하고, 여기서 H 및 L 사슬의 Fv는 적절한 링커에 의해 링크된다.

특별히, 항체는 파페인, 펩신과 같은 효소로 처리되어 항체 단편을 발생시키거나 항체 단편을 암호화하는 유전자를 구성하고, 이것은 발현 벡터에 도입되고, 적절한 숙주세포에서 발현된다(예를 들면, Co, M.S. et al., J. Immunol., 152:2968-2976, 1994; Better, M. & Horwitz, A.E., Methods in Enzymology, 178476-496, 1989; Plueckthun, A. & Skerra, A., Method in Enzymology, 178:476-496, 1989; Lamoyi, E., Methods in Enzymology, 121:652-663, 1989; Rousseaux, J. et al., Method in Enxymology, 121:663-66, 1989; Bird, R.E. et al., TIBTECH, 9:132-137, 1991 참조).

H 사슬 V 영역을 L 사슬 V 영역에 결찰함에 의해, ScFv가 얻어진다. 이 ScFv에서, H 사슬 V 영역과 L 사슬 V 영역은 링커를 통해, 바람직하기는 펩티드 링커를 통해 링크된다(Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988). scFv에서의 H 사슬 V 영역과 L 사슬 V 영역은 상기 항체에 관하여 기재된 것들 중 어느 것으로부터 유도될 수 있다. V 영역에 링크하는 펩티드 링커로서 사용되는 것은, 예를 들면 12~19 아미노산 잔기로 일어진 주어진 단일 사슬 펩티드이다.

scFv를 암호화하는 DNA는 상기 항체의 H 사슬 또는 H 사슬 V 영역과 L 사슬 또는 L 사슬 V 영역을 암호화하는 DNA 중에서 원하는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 단백질을 증폭하고, 이것은 PCR법에 의해 양쪽 말단이 정의된 프라이머를 사용하여 주형으로서 사용되고, 그리고 나서 펩티드 링커 부분과 H 및 L 사슬에 연결되도록 정해진 한쌍의 프라이머와 결합된 양쪽 말단을 암호화하는 DNA를 증폭하여 얻어진다.

또한, 일단 scFv를 암호화하는 DNA가 제조되면, 그들을 함유하는 발현 벡터, 그리고 발현벡터로 변형된 숙주가 표준방법에 따라 얻어질 수 있고, scFv는 표준방법에 따라 숙주를 이용하여 얻어질 수 있다.

이들 항체 단편에 관하여, 이들의 유전자는 상기와 같은 숙주에 의해 얻어지고, 발현되고 그리고 생산될 수 있다. 본 발명에서 언급된 "항체"는 이들 항체 단편들을 포함한다.

항체의 변이에 관하여, 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 여러가지 분자들에 결합된 항체를 사용하는 것이 가능하다. 본 발명에 언급된 "항체"는 이들 항체 변이를 포함한다. 이와 같은 항체 변이를 얻기 위해, 이들은 얻어진 항체에 주어진 화학적 변이에 의해 얻어질 수 있다. 이들 방법은 이미 본 분야에 확립되어 있다.

상기와 같이 생산되고 발현된 항체는 숙주는 세포와 숙주 내외에서 분리될 수 있고, 정제되어 균질화된다. 본 발명에 사용되는 항체의 분리 및 정제는 친화성 크로마토그래피에 의해 실시될 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 사용되는 칼럼은, 예를 들면, 단백질 A 칼럼과 단백질 G 칼럼을 포함한다. 단백질 A 칼럼에 사용되는 운반체는 Hyper D, PORPS, Sepharose F.F 등을 포함한다. 통상의 단백질에 사용되는 다른 분리/정제 방법이 사용될 수 있고, 방법은 전혀 제한되지 않는다.

예를 들면, 본 발명에 사용되는 항체는 상기 친화성 크로마토그래피, 필터, 초여과법, 염석, 투석 등과 다른 크로마트그래피를 적절히 선택하고 조합하여 분리 및 정제될 수 있다. 크로마토그래피의 예는 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과법 등을 포함한다. 이와 같은 크로마토그래피는 HPLC(고성능 크로마토그래피)에 적용될 수 있다. 또한 역상 HPLC가 사용될 수 있다.

상기에서 얻은 항체의 농도 측정은 흡광도 측정 또는 ELISA에 의해 실시될 수 있다. 즉, 흡광도를 측정하는 경우, 항체는 PBS(-)로 알맞게 희석되고 280nm에서 흡광도가 측정되고, 농도는 1.35OD 로서 1mg/㎖에 의해 산출된다. ELISA에 의한 경우, 측정은 다음과 같이 실시된다. 즉, 0.1M 중탄산염 완충액(pH 9.6)으로 1㎍/㎖로 희석된 염소 항-인간 IgG(TAG사 공급)의 100㎍/㎖가 96-웰 플레이트(Nunc 공급)에 첨가되고, 4℃에서 밤새도록 배양되어 항체를 불멸화한다. 블로킹 후, 본 발명에 사용되는 적절히 희석된 항체 또는 항체를 함유하는 샘플, 또는 표준으로서 인간 IgG(Cappel 공급)을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양한다.

세척 후, 5000배 희석된 알칼리성 포스파타제 라벨된 항-인간 IgG(Bio Source 공급) 100㎕가 첨가되고 실온에서 1시간 동안 배양된다. 세척 후, 기질 용액이 첨가되고 배양되고, 이어서, 마이크로플레이트 리더 모델 3550(Bio-Rad 공급)을 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하여 표적 항체의 농도를 산출한다.

본 발명에 사용되는 변형된 IL-6는 IL-6 수용체에 대한 결합능을 갖는 물질이고 IL-6의 생리적 활성을 전송하지 않는다. 즉, 비록 변형된 IL-6가 IL-6와 경쟁적으로 IL=6 수용체에 결합하지만, IL-6의 생리적 활성을 전송하지 않기 때문에, 이것은 IL-6에 의한 신호 전달을 블럭한다.

변형된 IL-6는 Il-6의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기를 치환함에 의한 변종의 도입에 의해 제조된다. 변형된 IL-6의 근원인 IL-6는 어느 기원으로부터도 얻을 수 있지만, 그것의 항원성을 고려하여 인간 IL-6가 바람직하다.

특히, IL-6의 변형은 공지의 분자 모델 프로그램, 예를 들면 WHATIF(Vriend et al., Mol. Graphics, 8:52-56, 1990)를 이용한 IL-6 아미노산 서열의 2차구조를 예상하고, 전체 단백질에서 치환되어질 아미노산 잔기의 효과를 평가함에 의해 실시된다. 치환되어질 적절한 아미노산 잔기를 결정한 후, 변형된 IL-6를 암호화하는 유전자가 아미노산이 주형으로서 인간 IL-6 유전자를 암호화하는 염기 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 치환되도록 종래의 PCR법에 의해 변종이 도입됨으로써 얻어진다. 치환되어질 적당한 아미노산 잔기를 결정한 후, 변형된 IL-6를 암호화하는 유전자는, 주형으로서 인간 IL-6 유전자를 암호화하는 염기서열을 함유하는 벡터를 이용하여 아미노산을 치환하도록 하는 종래의 PCR 방법에 의해 변종을 도입함으로써 얻어진다. 변형된 IL-6는 이것을 필요에 따른 적당한 벡터에 병합시키고 재조합 항체의 발현, 생산 및 정제를 위한 상기 방법을 실시함으로써 얻어질 수 있다.

변형된 IL-6의 특이적 예는 Brakenhoff et al., J. Biol. Chem., 269:86-93, 1994 및 Savino et al., EMBO J., 13:1357-1367, 1994, WO 96/18648 및 WO 96/17869에 기재되어 있다.

본 발명에서 사용되는 IL-6의 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체의 부분 펩티드는 각각, IL-6 수용체 또는 IL-6에 대한 결합능을 갖고, IL-6의 생리적 활성을 전이하지 않는 물질이다. 즉, IL-6의 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체의 부분 펩티드는 특히 각각 IL-6 수용체 또는 IL-6에 결합하거나 또는 캡쳐링함으로써 IL-6가 IL-6 수용체에 결합하는 것을 억제한다. 따라서, 이들은 IL-6의 생리적 활성을 전달하지 않기 때문에 IL-6에 의한 신호 형질도입을 막는다.

IL-6의 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체의 부분 펩티드는 IL-6 또는 IL-6 수용체의 아미노산 서열에서 IL-6의 IL-6 수용체로의 결합에 포함되는 부분 또는 전체 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이다. 이와 같은 펩티드는 통상적으로 10~80, 바람직하기는 20~50, 더욱 바람직하기는 20~40개의 아미노산 잔기로 이루어진다. IL-6의 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체의 부분 펩티드는 IL-6 또는 IL-6 수용체의 아미노산 서열에서 IL-6 또는 IL-6 수용체에 결합에 포함되는 영역을 전하고, 공지의 방법, 예를 들면 유전공학기술 또는 펩티드 합성법에 의해 그것의 부분 또는 전체 아미노산을 합성함에 의해 제조될 수 있다.

유전공학기술에 의해 IL-6의 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체의 부분 펩티드를 제조하기 위해, 원하는 펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 발현벡터에 삽입하고 그리고 상기 재조합 항체의 발현, 생산 및 정제법에 의해 얻을 수 있다.

IL-6의 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체의 부분 펩티드를 펩티드 합성법으로 제조하기 위해, 펩티드 합성에 통상적으로 사용되는 방법, 예를 들면 고체상 합성법 또는 액체상 합성법을 사용하는 것이 가능하다.

특히, 합성은 Zoku Iyakuhin, Kaihatu Vol. 14 Peptide Gosei에 따라 실시될 수 있다(Ed., Yajima, H., Hirokawa Shoten, 1991). 사용되는 고체상 합성법으로서, 예를 들면, 펩티드 사슬이 합성되는 펩티드의 C 터미날에 대응하는 아미노산이 유기 용매에 불용성인 지지체에 결합되고, 그리고 선택적으로 하나의 아미노산이, α-아미노기와 부사슬 작용기가 적절한 보호기 및 α-아미노기의 보호기가 수지에 결합된 아미노산 또는 펩티드에서 제거되는 반응에 의해 보호되는 아미노산의 C에서 N 터미날의 방향으로 실제적으로 압축되는 반응을 반복함에 의해 연장된다. 고체상 합성법은 사용되는 보호기의 타입에 따라 Boc법 또는 Fmoc 법으로 광범위하게 분류된다.

표적 펩티드가 이 방법으로 합성된 후, 지지체로부터 펩티드 사슬의 탈보호반응 및 분열반응이 실시된다. 펩티드 사슬의 분열반응에서, 불소화수소 또는 트리플루오로메탄 술포네이트 및 TFA는 통상적으로 각각 Boc법과 Fmoc법에 사용된다. Boc법에서, 상기 보호된 펩티드 수지는 아니솔의 존재하에 불소화수소로 처리된다. 그리고 나서, 보호기의 제거 및 지지체로부터의 분열이 펩티드를 회수하기 위해 실시된다. 이것은 냉동건조되어 조 펩티드가 생성된다. 한편, Fmoc법에서, 예를 들면 TFA에서 탈보호 반응과 지지체로부터 펩티드 사슬의 분열 반응은 상기와 동일한 취급에 의해 실시될 수 있다.

생성된 조 펩티드는 HPLC에 적용함으로써 분리 및 정제될 수 있다. 용출은 통상적으로 단백질의 정제에 사용되는 물-아세토니트릴 용매를 사용한 광학 조건하에서 실시될 수 있다. 생성 크로마토그래피의 프로필에서 피크에 대응하는 분획을 수집하고 냉동건조시킨다. 이 방법으로 정제된 펩티드 부분은 매스 스펙트럼, 아미노산 조성물 분석법 또는 아미노산 서열 분석법에 의한 분자량의 분석에 의해 동정될 수 있다.

IL-6 및 IL-6 수용체의 특정 예는 JP-A-2-188600, 7-324097, 및 8-311098, 및 미국특허 5210075호에 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그들의 투여경로에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체와 첨가제를 함유하는 것일 수 있다. 이와 같은 담체 및 첨가제의 예는 물, 약제학적으로 허용가능한 유기용매, 콜라겐, 폴리비닐알콜, 폴리비닐-피롤리돈, 카르복시비닐 중합체, 소듐 카브복시메틸셀룰로스, 소듐 폴리아크릴레이트, 소듐 아르기네이트, 수용성 덱스트린, 소듐 카르복시메틸 전분, 펙틴, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 크산틴 검, 아라비아 검, 카제인, 젤라틴, 아가로스, 디글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴 알콜, 스테아르산, 인간 혈청알부민(HSA), 만니톨, 솔비톨, 락토스, 약제학적 첨가제로서 허용가능한 계며 활성제 등을 포함한다. 사용되는 첨가제는 상기로부터 또는 그들의 제제에 따라 조합으로 적절히 선택될 수 있지만, 제한되는 것은 아니다.

실시예

본 발명은 특별히는 실시예 및 참조예에 의해 아래 기재되지만, 본 발명의 범위가 이것으로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1:

MRA는 시토킨 인터로킨-6(IL-6)의 기능을 억제하는 IgGl 서브-클라스의 재조합 인간화 항-인간 인터로킨-6 수용체 모노크로날 항체이다. 일본 및 유럽에서의 초기 연구에서, MRA는 류마티스성 관절염의 치료에 대한 약속을 나타내었고 내성이 있었다.

이것은 류마티스성 관절염의 치료를 위한 단독으로 주어진 그리고 메토트렉세이트와의 조합물로의 MRA의 최적의 투여량을 결정하기 위한 MRA의 큰, II상(Phase) 시도였다. 단일치료법으로서 그리고 메토트렉세이트와의 조합물 모두에서, MRAm의 반복 정맥내 투여량의 잠재적 효능을, 특정 기간동안 메토트렉사이트로의 치료에도 불구하고 활성 류마티스성 관절염을 앓는 환자에게서 평가하고 그리고 메토트렉세이트 단독치료와 비교하였다. MRA의 효능, 안정성 및 내성을 평가하였다.

방법:

주제: 류마티즘학 미국 대학 1987 질병 분류(ACR)를 기준으로 진단되고 적어도 6개월간 지속된 류마티스성 관절염 환자를 등록시켰다. 환자들은 활성 질환을 가져아 하고 과민성의 경우 적어도 주당 12.5mg 또는 주당 10mg의 투여량에서 적어도 6개월 동안 주어진 MTX에 대한 불충분한 반응을 하거나 또는 질병이 확대되었다.

연구 고안: 중앙 무작위추출법에 의한 이중맹검의, 무작위의 평행군 연구

투여량 및 투약; 7개 그룹: 0mg/kg(위약) + MTX, 2mg/kg MRA + MTX, 4mg/kg MRA + MTX, 8mg/kg MRA + MTX, 2mg/kg MRA + MTX 위약, 4mg/kg MRA + MTX위약, 및 8mg/kg MRA + MTX 위약. MRA 또는 위약 투여는 정맥내 주입에 의해 4-주 간격으로 제공된다. MTX 또는 MTX 위약 투여는 경구적으로, 주1회 10~25mg/주로 제공된다.

연구방법: 지정된 투여량을 정맥내 주입에 의해 4주 간격으로 총 4회 투여하고, 효능과 안정성을 최대 16주까지 2-주 간격으로 평가하고, 20주 동안 추적관찰하였다. 효능에 관한 일차 종점은 16주(최종 투약 후 4주)에 ACR20의 비율이었다. 두번째 종점은 16주(최종 투약 후 4주)에 ACR50 및 ACR 70의 비율을 포함한다.

ACR 개선 기준: 다음 7개의 항목 중 부종 관절의 수와 통증 관절의 수가 20% 이상 개선되고, 20% 이상의 개선은 남은 5개 항목중 3개에서 관찰된 경우를 ACR 기준에서 20% 이상의 개선으로 결정하였다. 또한, 50% 및 70% 개선 경우는 상기 20% 개선된 부분이 각각 50%와 70%까지 개선된 환자의 경우를 나타낸다.

(1)부종 관절의 수

(2)연성 관절의 수

(3) 환자에 의해 측정된 통증

(4)환자에 의한 질병 활성의 포괄적 평가

(5)의사에 의한 포괄적 질병활성

(6)환자에 의한 신체적 기능의 평가

(7)CRP 또는 ESR

통계적으로 중요한 높은 ACR20 개선율은 대조군과 비교한 MRA 단독 2mg/kg 군을 제외한 모든 군에서 발견되었다. MRA 8mg/kg + MTX 군, ACR 50 및 70 개선율은 각각, 53.1% 와 36.7%였고, 이것은 각각 28.6%와 16.3%인 대조군의 개선율보다 통계적으로 상당히 높았다.

MRA 단독 군에서, 통계적으로 중요한 투여량 의존성은 ACR 20 개선율에서 관찰되었다. 또한, ACR50 및 ACR70 개선율의 경우, 통계적으로 중요한 투여량 의존반응은 MRA 단독 및 MTX-조합 군에서 관찰되었다.

부종관절 수의 감소(표 2)

평균 부종 관절수는 기준에서 모든 처리군에 걸쳐 유사하다.

7개의 모든 처리군에서 노출의 지속의 증가와 함께 기준으로부터 평균 부종 관절의 누적적 감소가 있었다. MRA 8mg/kg의 군에서 부종 관절수의 평균 감소는 MTX 군(p=0.010)에서의 감소와 비교하여 상당히 중요하다. 16주에서, MRA 8mg/kg 군과 MTX 군산의 평균 차이는 -2.31(-4.07, -0.55)였다. MRA 단일 치료군 사이의 통계적으로 중요한 선형 투여량-관계가 있었다. MRA 8mg/kg + MTX 군에서 부종 관절 수의 평균 감소는 MTX 군(p<0.001)에서의 감소와 비교하여 통계적으로 중요하였다. MTA 8mg/kg + MTX 군과 MTX군 사이의 평균 차이(95% CI)는 -3.62(-5.39, -1.84)였다. MRA 조합 치료군 사이에 통계적으로 중요한 선형 투여량-관계가 있었다(p=0.004).

359명의 등록 환자 중에서, 안정평가조, 완전분석조 및 PPS(프로코콜 조 당)는 각각 359, 354 및 307이었다. 전체 359명 환자가 등록하였고, 299명이 연구를 마쳤으며 60명이 포기하였다. 포기 환자 중, 33은 불리한 사상 때문이었고, 한명은 다른 질병과의 합병 때문이었으며, 7명은 불리한 사상 때문이고, 7명은 금지된 부수물의 용도를 갖는 약물의 사용 때문이고, 5명은 통지된 승낙 때문이고, 1명은 정기적 진찰의 실패 때문이고, 22명은 효능부족(다수의 원인을 포함)때문이었다.

인과관계를 무시할 수 없는 여러 불리한 사상 중에서, 5 가지의 감염이 보고되었다. 즉, 2mg/kg MRA 군에서 발종양과 골수염 환자 1명, 흉부감염 및 늑막염 환자 1명, 8mg/kg MRA + MTX 군에서 패혈증 환자 1명, 8mg/kg MRA + MTX 군에서 관절 감염 1명이 관찰되었다. 그들 이외에, 과민성의 5 케이스가 불리한 관계를 무시할 수 없는 여러 불리한 사상으로서 보고되었고, 2mg/kg MRA군에서 4명의 과민성 환자와 4mg/kg MRA 군에서 1명의 과민성 환자가 보고되었다. 민감성을 갖는 이들 사상 모두는 3 또는 4회 MRA 투여 후 MTX와 병합이 일어나지 않았다.

간 기능에 대한 실험자료 값에 관하여, 비록 ALT와 AST 수준의 평가가 MRA 사용의 결과로서 평가되었지만, 이와 같은 평가는 다른 류마티스성 관절염 환자에서 관찰되는 것과 동등하다. 지방질(총 콜레스테롤, HDL 콜레스테롤 및 트리글리세리드)에 관한 실험 자료의 증가가 MRA 군에서 관찰되었다. 그러나, 동맥경화유발 인자의 전체적 변화는 없었다.

약간의 일시적인 호중구 수의 감소가 몇몇 환자에게서 발생하였다. 질병 활성에 대한 파라미터의 임상적으로 중요한 변화, 즉 CRP 및 ESR의 감소 및 헤모글로빈의상승이 투여량 의존 방법에서 관찰되었다.

주입반응

주입반응은 연구 약물 투여 24시간 내에 발생하는 불리한 사상으로 정의되었다. 각 치료 군에서 주입반응을 경험한 환자의 수는 MRA에 대한 가능한 역 복용량-반응을 제안하였다.

항- MRA 항체

항-MRA 항체의 전개를 조사하였다. 8mg/kg 처리군에서는 전혀 발생하지 않았다(단일 치료법 또는 MTX와의 조합법). 2 또는 4 mg/kg 치료 군에서, 사건의 수는 MRA 단일치료법보다 MTX와 조합된 군에서 적었다.

결과

분명한 투여량-반응이 MRA 단일치료법에 대하여 및 메토트렉세이트와 조합된 MRA에 관하여 관찰되었다. 류마티스성 관절염 환자의 치료를 위한 MRA의 효능은 MRA 단일치료법과 메토트렉세이트와 조합된 MRA의 경우 모두에서 확인되었다. 또한, MRA의 안전성은 MRA 단일치료법과 메토트렉세이트와 조합된 MRA의 경우 모두에서 확인되었다.

참조예 1. 인간 수용성 IL-6 수용체의 제조

수용성 IL-6 수용체를 플라즈미드, Yamasaki et al의 방법(Yamasaki, K. et al., Science, 241:825-828, 1988)에 따라 얻은 IL-6 수용체 암호화 cDNA를 함유하는 pBSF2R.236를 사용하여 PCR 법에 따라 제조하였다. 플라즈미드, pBSF2R.236을 제한효소, Sph1으로 소화시켜 IL-6 수용체 cDNA를 얻었고, 이것을 mp18(Amersham사 공급)에 삽입시켰다. 정지 코돈을 IL-6 수용체의 cDAN에 도입하기 위해 고안된 합성 올리고프라이머를 사용하여 인비트로 돌연변이 생성 시스템에 의해 PCR 법에서 변종을 IL-6 수용체 cDNA에 도입하였다(Amersham 공급). 이 방법은 정지코돈을 아미노산의 위치 345에 도입하여 가용성 IL-6 수용체를 암호화하는 cDNA를 제공한다.

가용성 IL-6 수용체 cDNA를, cDNA가 CHO 세포에서 발현되도록 플라즈미드 pSVL344를 제공하기 위해 플라즈미드 pSV에 결찰시켰다. HindIII-SalI로 소화된 가용성 IL-6 수용체 cDNA를 dhfr의 cDNA를 함유하는 플라즈미드 pECEdhfr에 삽입시켜 CHO 발현 벡터 플라즈미드 pECEdhfr344를 얻었다.

인산칼슘 침전법( Chen, C. et al., Mol. Cell Biol., 7:2745-2751, 1987)에 따라, 플라즈미드 pECEdhfr344 10㎍을 dhfr-CHO 세포계 DXB-11(Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216-4220, 1980)으로 트란스펙트시켰다. 트란스펙트된 CHO 세포를 3주 동안 글루타민 1 mM, 투석된 FCS 10%, 페니실린 100U/㎖ 및 뉴클레오시드가 없는 스트렙토마이신 100㎍/㎖를 함유하는 αMEM 선택 매질에서 배양하였다.

선택된 CHO세포를 제한 희석법으로 스크리닝하고, CHO 세포의 모노크로날을 얻었다. 이 CHO 클론을 20nM~200nM의 농도에서 메토트렉세이트로 증폭하여 인간 가용성 IL-6 수용체를 생산하는 CHO 세포계 5E27을 얻었다. CHO 세포계 5E27은 5% FBS를 함유하는 Iscove의 변형 둘베코 배지(IMDM, Gibco 공급)에서 배양하였다. 배양 상등액을 수집하고, 배양 상등액 중의 가용성 IL-6 수용체의 농도를 ELISA로 측정하였다. 그 결과, 가용성 IL-6 수용체가 배양 상등액 중에 존재한다는 것을 확인하였다.

참조예 2. 항-인간 IL-6 항체의 제조

BALB/c 마우스를 프로인트 완전 보조액과 함께 재조합 IL-6(Hirano, T. et al., Immunol. Lett., 17:41, 1988)로 면역화하고, 면역화를 항-IL-6 항체가 혈청에서 검출될 때까지 매주 계속하였다. 면역화된 세포를 국소적 림프 노드에서 제거하고 폴리에틸렌글리콜 1500을 사용하여 골수종 세포계, P3U1과 융합시켰다. 혼성종양세포를 HAT 매질을 사용하여 Oi et al의 방법(Selective Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., San Francisco, 351, 1980)에 따라 선택하고, 항-인간 IL-6 항체를 생산하는 혼성종양세포를 확립하였다.

항-인간 IL-6 항체를 생산하는 혼성종양세포에 관하여 IL-6 결합 조사를 다음돠 같이 실시하였다. 즉, 가요성 폴리비닐 96-웰 마이크로플레이트(Dynatech Laboratories, Inc., Alexandra, VA사 공급)를 4℃에서 밤새도록 0.1M 카보네이트-하이드로겐 카보네이트 완충액(pH 9.6)에서 염소 항-마우스 Ig(10㎕/㎖; Cooper Biomedical Inc., Malvern, PA사 공급)로 코팅하였다. 그리고 나서, 플레이트를 송아지 혈청 알부민(BSA)1%를 함유하는 PBS 100㎕로 실온에서 2시간 동안 처리하였다.

이것을 PBS로 세척하고, 이어서 혼성종양세포 배양물 상등액 100㎕을 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 밤새도록 배양하였다. 플레이트를 세척하고, 그리고 나서 ¹²⁵I 라벨된 재조합 IL-6를 각 웰에 2000 cpm/0.5ng/웰이 되도록 첨가하고, 플레이트를 세척하고, 이어서 각 웰의 방사능을 감마 카운터(Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA)로 측정하였다. 결과적으로, 216 혼성종양세포 클론 중 32개는 IL-6 결합 조사에서 양성이었다. 이들 클론 중, 최종적으로 안정한 MH166.BSF2를 얻었다. 혼성종양세포에 의해 생성된 항-IL-6 항체 MH166은 OgG1κ의 서브타입이었다.

그리고 나서, 혼성종양세포의 성장에 관하여 MH166 항체의 중성화활성을 IL-6 의존 마우스 혼성종양세포 클론 MH60.BSF2를 사용하여 조사하였다. MH60.BSF2 세포를 1×10⁴/200㎕/웰에 나누고, MH166 항체를 함유하는 샘플을 여기에 첨가한 후 48시간 동안 배양하고, ³H 티아민 0.5μCi/웰(New England Nuclear, Boston, MA)을 첨가하였다.

추가 6시간의 배양 후, 세포를 글라스필터지에 놓고, 자동 수확기(Labo Mash Science Co., Tokyo, Japan)을 사용하여 처리하였다. 토끼 항-IL-6 항체를 대조군으로 사용하였다.

그 결과, MH166 항체는 투여량 의존 방법으로 IL-6에 의해 유래된 MH60.BSF2 세포의 3H 티아민 섭취를 억제한다. 이것은 MH166 항체가 IL-6의 활성을 중화시킨다는 것을 설명한다.

참조예 3. 항-인간 IL-6 수용체 항체의 제조

Hyrano et al 법(Hirano, Y. et al., J. Immunol., 143:2900-2906, 1989)으로 제조된 항-IL-6 수용체 MT18을 IL-6 수용체를 세정하기 위한 첨부 제제화(Yamadaki, K. et al., Science, 241:825-828, 1988)에 따라 CNBr에 의해 활성화된 Sepharose 4B(Pharmacia Fine Chemicals; Piscataway, NJ 공급)에 결합시켰다. 인간 골수종 세포계, U266 세포를 디지토닌(Wako Chemicals 공급) 1%, 에탄올아민(pH 7.8) 10mM 및 NaCl(디지토닌 완충액) 1.5M을 함유하는 p-para-아미노페닐메탄 술포닐플루오라이드 하이드로클로라이드(Wako Chemicals 공급) 1mM로 용매화시키고, 세파로스 4B 비드에 연결된 MT18 항체와 혼합하였다. 그 이후, 비드들을 디지토닌 완충액으로 6회 세척하고 면역화를 위한 부분 세정된 IL-6 수용체가 되게 하였다.

BALB/c 마우스를 3×10⁹ U266 세포로부터 얻은 상기 부분적으로 정제된 IL-6 수용체로 매 10일 마다 4회 면역화하고, 이어서 혼성종양세포를 표준방법으로 제조하였다. IL-6 수용체에 대한 결합 능력을 하기 방법에 의한 성장 양성 웰로부터 혼성종양세포 배양물 상등액 중에서 시험하였다. 5×10⁷에서 U266 세포를 35S-메티오닌(2.5mCi)으로 라벨화하고, 상기 디지토닌 완충액으로 용매화하였다. 용매화된 U266 세포를 세파로스 4B 비드에 결합된 MT18 항체 0.04㎖ 부피와 혼합하고, 이어서 디지토닌 완충액으로 6회 세척하고, 그리고 나서 35 S-메티오닌 라벨된 IL-6 수용체를 디지토닌 완충액(pH 3.4) 0.25㎖로 용출시키고, 그리고 1M Tris(pH 7.4) 0.025㎖로 중화하였다.

혼성종양세포 배양물 현탁액(0.05㎖)를 단백질 G 세파로스(Pharmacia 공급) 0.01㎖와 혼합하였다. 세척 후, 세파로스를 상기 제조된 35S-메티오닌 라벨된 IL-6 수용체 0.005㎖로 배양시켰다. 면역침전물을 SDS-PAGE로 분석하고, IL-6 수용체와 반응한 혼성종양세포 배양물 상등액을 조사하였다. 결과적으로, 반응 양성 혼성종양세포 클론, PM-1(FREM BP-2998)이 확립되었다. 혼성종양세포에 의해 생성된 항체, PM-1은 IgGκ의 서브타입을 갖는다.

혼성종양세포 PM-1에 의해 생성된 항체의 억제활성은 인간 골수종 세포계, U266을 이용하여 IL-6의 인간 IL-6 수용체에 대한 결합에 관하여 조사하였다. 인간 재조합 IL-6를 Bolton-Hunter 시약(New England Nuclear, Boston, MA)에 의해 E.coli로부터 제조하였다(Hirano, T. et al., J. Exp. Med., 166:967-981, 1987).

4×10⁵에서 U266 세포를 혼성종양세포 PM-1 배양 상등액 70%(v/v) 및 ¹²⁵I-라벨된 IL-6 14000cpm으로 배양하였다. 샘플(70㎕)을 400㎕ 미세제거 폴리에틸렌 튜브에서 FCS 300㎕ 상에 적층하고, 원심분리하고 세포 중의 방사능을 측정하였다.

결과적으로, 혼성종양세포 PM-1-에 의해 생산된 항체는 IL-6가 IL-6 수용체에 결합하는 것을 억제하는 것을 설명되었다.

참조예 4. 항-마우스 IL-6 수용체 항체의 제조

마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로날 항체를 Saito, T. et al., J. Immunol., 147:168-173, 1991에 기재된 방법에 의해 제조하였다.

마우스 가용성 IL-6 수용체를 생산하는 CHO 세포는 10% FCS를 함유하는 IMDM 매질에서 배양하고, 마우스 가용성 IL-6 수용체를, 항-마우스 IL-6 수용체 항체 RS12(상기 Saito, T. et al.참조)가 아피겔(Affigel) 10 겔(Biorad 공급)에 고정된 친화성칼럼을 사용하여 배양 상등액으로부터 정제하였다.

생성된 마우스 가용성 IL-6 수용체(50㎍)을 프로인트 완전 보조액과 혼합하고, 이것을 위스터 래트의 복강에 주입하였다. 2주 후, 추가의 면역화를 프로인트 완전 보조액으로 시작하였다. 45일 째에, 래트의 척수 세포를 제거하고, 2×10⁸ 세포를 50% PEG1500(Boehringer Mannheim)을 이용한 표준법으로 1×10⁷ 마우스 골수종 P3U1 세포와 융합시키고, HAT 매질에서 혼성종양세포를 스크리닝하였다.

혼성종양세포 배양 상등액을 토끼 항-래트 IgG 항체(Cappel 공급)로 코팅된 플레이트에 첨가하고, 이어서 마우스 가용성 IL-6 수용체를 반응시켰다. 그리고 나서, 마우스 가용성 IL-6 수용체에 대한 항체를 생성하는 혼성종양세포를 토끼 항-마우스 IL-6 수용체 항체 및 알칼리성 포스파타아제 라벨된 양 항-토끼 IgG를 사용하는 ELISA법에 의해 스크리닝하였다. 항체의 생산이 확실시되는 혼성종양세포 클론을 2회 서브클론하고, 단일 혼성종양세포 클론을 얻었다. 이 클론을 MR16-1로 명명하였다.

이 혼성종양세포에 의해 생성된 항체의 중성화 활성을 MH60.BSF2 세포(Matsuda, Y. et al., J. Immunol., 18:951-956, 1988)를 이용한 3H 티미딘의 섭취에 의해 마우스 IL-6의 신호 변환에 대해 시험하였다. MH60.BSF2 세포가 96-웰 플레이트에서 1×104 세포/200㎕/웰이 되도록 제조하였다. 이 플레이트에, 마우스 IL-6 10pg/㎖ 및 MR16-1 항체 또는 RS12항체 12.3~1000ng/㎖을 첨가하였고, 그리고 나서 37℃에서 44 시간 동안 5% CO2 에서 배양하고, 이어서 3H 티미딘 1μCi/웰을 첨가하였다. 4시간 후, ³H 티미딘의 흡수를 측정하였다. 결과적으로, MR16-1 항체는 MH60.BSF2 세포의 ³H 티미딘 흡수를 억제하였다.

따라서, 혼성종양세포 MR16-1(FERM BP-5875)에 의해 생산된 항체는 IL-6가 IL_6 수용체에 결합하는 것을 막는다고 설명된다.

Claims

인터루킨 6 길항제(IL-6 길항제) 및 면역억제제를 포함하는 IL-6 관련 질병의 치료를 위한 약제학적 조성물.
IL-6 관련 질병의 치료를 위한 IL-6 길항제의 사용에 대한 효과를 강화하기 위한, 면역억제제를 포함하는 약제학적 조성물.
IL-6 관련 질병의 IL-6 길항제로의 치료 시에 알러지 반응을 감소 또는 예방하기 위한, 면역억제제를 포함하는 약제학적 조성물.
IL-6 길항제를 포함하는, 고투여량으로 투여하기 위한 치료적 약제.
IL-6 관련 질병의 치료 시에 알러지 반응을 감소 또는 예방하기 위한, Il-6 길항제의 고투여량을 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 길항제가 항-인터루킨-6 수용체 항체(IL-6 항체)인 약제학적 조성물.
제6항에 있어서, 상기 IL-6R 항체가 IL-6R에 대한 모노크로날 항체인 약제학 적 조성물.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 항-IL-6R 항체가 인간 IL-6R에 대한 모노크로날 항체인 약제학적 조성물.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 항-IL-6R 항체가 마우스 IL-6R에 대한 모노크로날 항체인 약제학적 조성물.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-6R 항체가 재조합 항체인 약제학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 인간 항-IL-6R 모노크로날 항체가 PM-1 항체인 약제학적 조성물.
제9항에 있어서, 상기 마우스 IL-6 모노크로날 항체가 MR-16-1 항체인 약제학적 조성물.
제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-6R 항체가 IL-6R에 대한 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간형 항체인 약제학적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 IL-6R에 대한 인간화 항체가 인간화 PM-1 항체인 약제학적 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 관련 질병은 류마티스성관절염, 형질구증가증, 초면역성 글로불린혈증, 빈혈, 신염, 악액질, 다발성 골수종, 캐츨맨즈병, 맥관증식신염, 전신성 루프스 에리테마토스, 크론병, 궤양성 대장염, 췌장염, 건선, 연소성 특발성 위축증 또는 전신성 연소성 특발성 위축증, 맥관염 및 가와사키병인 약제학적 조성물.
제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 면역억제제를 포함하는 상기 약제학적 조성물 또는 항체와 면역억제제를 포함하는 상기 약제학적 조성물이고, 여기서 항-IL-6R 항체의 투여량은 0.02~150 mg/kg/4주 또는 이것과 동등한 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량인 약제학적 조성물.
제16항에 있어서, 항-IL-6R 항체의 투여량은 0.5~30 mg/kg/4주 또는 이것과 동등한 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량인 약제학적 조성물.
제17항에 있어서, 항-IL-6R 항체의 투여량은 2~8 mg/kg/4주 또는 이것과 동등한 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량인 약제학적 조성물.
제4항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항-IL-6R 항체를 포함하는, 고투여량 투여를 위한 IL-6 관련 질병의 치료를 위한 상기 치료적 약제, 또는 항-IL-6R 항체의 고투여량을 포함하는 상기 약제학적 조성물이고, 항-IL-6R 항체의 투여량은 4 mg/kg/4주 이상 또는 이것과 동등한 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량인 약제학적 조성물.
제19항에 있어서, 항-IL-6R 항체의 투여량은 6~16 mg/kg/4주 또는 이것과 동등한 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량인 약제학적 조성물.
제20항에 있어서, 항-IL-6R 항체의 투여량은 6~10 mg/kg/4주 또는 이것과 동등한 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량인 약제학적 조성물.
제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역억제제가 메토트렉세이트(MTX)인 약제학적 조성물.
제22항에 있어서, 상기 MTX의 투여량은 1~100 mg/몸체/주 인 약제학적 조성물.
제23항에 있어서, 상기 MTX의 투여량은 4~50 mg/몸체/주 인 약제학적 조성물.
제24항에 있어서, 상기 MTX의 투여량은 7.5~25 mg/몸체/주 인 약제학적 조성물.
제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-6 항체 및 상기 면역억제제를 동시 투여하기 위한 약제학적 조성물.
제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-6 항체와 상기 면역억제제를 시간간격을 두고 투여하기 위한 약제학적 조성물.
IL-6 관련 질병의 치료용 약제학적 조성물의 생산을 위한 인터루킨-6 길항제(IL-6 길항제) 및 면역억제제의 용도.
IL-6 관련 질병의 치료를 위한 IL-6 길항제의 사용에 대한 효과 강화를 위한, 면역 억제제를 포함하는 약제학적 조성물의 생산을 위한 IL-6 길항제의 용도.
IL-6 관련 질병의 IL-6 길항제로의 치료 시의 알러지 반응을 감소 또는 예방하기 위한, 면역 억제제를 포함하는 약제학적 조성물의 생산을 위한 IL-6 길항제의 용도.
IL-6 길항제를 포함하는, 고투여량으로 투여하기 위한 IL-6 관련 질병의 치료용 약제학적 조성물의 생산을 위한 IL-6 길항제의 용도.
IL-6 관련 질병의 치료 시에 알러지 반응의 감소 또는 예방을 위한 고투여량의 항-IL-6R 항체를 포함하는 약제학적 조성물의 생산을 위한 IL-6 길항제의 용도.
제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 길항제는 항-인터루킨-6 수용체 항체(IL-6R 항체)인 용도.
제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6R 항체가 IL-6R에 대한 모노크로날 항체인 용도.
제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-6R 항체가 인간 IL-6R에 대한 모노크로날 항체인 용도.
제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-6R 항체가 마우스 IL-6R에 대한 모노크로날 항체인 용도.
제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-6R 항체가 재조합 항체인 용도.
제35항에 있어서, 상기 인간 항-IL-6R 모노크로날 항체가 PM-1 항체인 용도.
제36항에 있어서, 상기 마우스 항 IL-6R 모노크로날 항체가 MR16-1 항체인 용도.
제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-6R 항체가 IL-6에 대한 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간형 항체인 용도.
제40항에 있어서, 상기 IL-6R에 대한 인간화 항체가 인간화 PM-1 항체인 용도.
제21항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 관련 질병은 류마티스성 관절염, 형질구증가증, 초면역성 글로불린혈증, 빈혈, 신염, 악액질, 다발성 골수종, 캐츨맨스병, 맥관증식신염, 전신성 루프스 에리테마토스, 크론병, 췌장염, 건선, 연소성 특발성 위축증 또는 전신성 연소성 특발성 위축증인 용도.
제28항 내지 제30항 및 제33항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역억제제를 포함하는 약제학적 조성물 또는 상기 항-IL-6 항체와 면역억제제를 포함하는 약제학적 조성물을 생산하기 위한 용도이고, 항-IL-6R 항체의 투여량은 0.02~150 mg/kg/4주 또는 이것과 동등한 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량인 용도.
제43항에 있어서, 항-IL-6R 항체의 투여량은 0.5~30 mg/kg/4주 또는 이것과 동등한 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량인 용도.
제44항에 있어서, 항-IL-6R 항체의 투여량은 2~8 mg/kg/4주 또는 이것과 동등한 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량인 용도.
제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 항-IL-6R 항체를 포함하는, 고투여량으로 투여하기 위한 IL-6 관련 질병의 치료용 치료적 약제, 또는 항-IL-6R 항체의 고투여량을 포함하는 상기 약제학적 조성물의 생산을 위한 용도이고, 항-IL-6R 항체의 투여량은 4 mg/kg/4주 이상 또는 이것과 동등한 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량인 용도.
제46항에 있어서, 항-IL-6R 항체의 투여량은 6~16 mg/kg/4주 또는 이것과 동등한 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량인 용도.
제47항에 있어서, 항-IL-6R 항체의 투여량은 6~10 mg/kg/4주 또는 이것과 동등한 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량인 용도.
제28항 내지 제30 및 제33항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역억제제가 메토트렉세이트(MTX)인 용도.
제49항에 있어서, 상기 MTX의 투여량은 1~100 mg/몸체/주 인 용도.
제50항에 있어서, 상기 MTX의 투여량은 4~50 mg/몸체/주 인 용도.
제51항에 있어서, 상기 MTX의 투여량은 7.5~25 mg/몸체/주 인 용도.
제28항 내지 제30항 및 제34항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-6 항체 및 상기 면역억제제를 동시 투여하기 위한 용도.
제28항 내지 제30항 및 제34항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-6 항체와 상기 면역억제제를 시간간격을 두고 투여하기 위한 용도.
IL-6 관련 질병의 치료방법에서 그러한 치료를 요구하는 환자에게 IL-6 길항제 및 면역억제제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
IL-6 관련 질병의 치료를 요구하는 환자에게 면역억제제와 IL-6 길항제를 투 여하는 것을 포함하는, IL-6 관련 질병의 치료를 위한 IL-6 길항제의 사용에 대한 효과 강화방법.
IL-6 관련 질병의 치료를 요구하는 환자에게 면역억제제와 IL-6 길항제를 투여하는 것을 포함하는, IL-6 관련 질병의 IL-6 길항제로의 치료 시에 알러지 반응의 감소 또는 예방방법.
IL-6 길항제의 고투여량으로 투여에 의해 IL-6 관련 질병의 치료하는 방법에서 이와 같은 치료를 요구하는 환자에게 IL-6 길항제 항-IL-6 항체를 고투여량으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
IL-6 관련 질병의 치료 시에 알러지 반응의 감소 또는 예방방법으로, 이와 같은 치료를 요구하는 환자에게 IL-6 길항제를 고투여량으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 길항제는 항-IL-6R 항체인 방법.
제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-6R 항체는 인간 IL-6R 에 대한 모노크로날 항체인 방법.
제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-6R 항체는 마우스 IL-6R에 대한 모노크로날 항체인 방법.
제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-6R 항체는 재조합 항체인 방법.
제61항에 있어서, 상기 인간 항-IL-6R 모노크로날 항체는 PM-1 항체인 방법
제62항에 있어서, 상기 마우스 항-IL-6R 모노크로날 항체는 MR16-1 항체인 방법.
제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-6R 항체는 IL-6R에 대한 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간형 항체인 방법.
제66항에 있어서, 상기 IL-6에 대한 인간화 항체는 인간화 PM-1 항체인 방법.
제55항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 관련 질병은 류마티스성관절염, 형질구증가증, 초면역성 글로불린혈증, 빈혈, 신염, 악액질, 다발성 골수종, 캐츨맨스병, 맥관증식신염, 전신성 루프스 에리테마토스, 크론병, 췌장염, 건선, 연소성 특발성 위축증 또는 전신성 연소성 특발성 위축증인 방법.
제55항 내지 제57항 및 제60항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 면역억제제, 또는 항-IL-6R 항체와 면역억제제가 투여되는 치료방법으로, 항-IL-6R 항체의 투여량은 0.02~150 mg/kg/4주 또는 이것과 동등한 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량인 방법.
제69항에 있어서, 항-IL-6R 항체의 투여량은 0.5~30 mg/kg/4주 또는 이것과 동등한 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량인 방법.
제70항에 있어서, 항-IL-6R 항체의 투여량은 2~8 mg/kg/4주 또는 이것과 동등한 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량인 방법.
제58항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, IL-6 관련 질병의 치료방법 또는 항 IL-6R 항체의 고투여량을 투여하는 것을 포함하는, 고투여량의 항-IL-6R 항체를 투여하는 치료방법이고, 항 IL-6 항체의 투여량은 4 mg/kg/4주 이상 또는 이것과 동등한 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량인 방법.
제72항에 있어서, 항-IL-6R 항체의 투여량은 6~16 mg/kg/4주 또는 이것과 동 등한 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량인 방법.
제73항에 있어서, 항-IL-6R 항체의 투여량은 6~10 mg/kg/4주 또는 이것과 동등한 항-IL-6R 항체 혈중 농도를 나타내는 투여량인 방법.
제55항 내지 제57 및 제60항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역억제제가 메토트렉세이트(MTX)인 방법.
제75항에 있어서, 상기 MTX의 투여량은 1~100 mg/몸체/주 인 방법.
제76항에 있어서, 상기 MTX의 투여량은 4~50 mg/몸체/주 인 방법.
제77항에 있어서, 상기 MTX의 투여량은 7.5~25 mg/몸체/주 인 방법.
제55항 내지 제57항 및 제60항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-6 항체 및 상기 면역억제제를 동시 투여하기 위한 방법.
제55항 내지 제57항 및 제60항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-6 항체와 상기 면역억제제를 시간간격을 두고 투여하기 위한 방법.