KR20010022636A

KR20010022636A - 생물학적으로 활성인 거대분자를 함유하는 수성 에어로졸 제제 및 상응하는 에어로졸의 제조 방법

Info

Publication number: KR20010022636A
Application number: KR1020007001230A
Authority: KR
Inventors: 람체헤르베르트; 메드크리스토퍼존몬터규; 치렌베르크베른트; 라임홀츠랄프크리슈티안
Original assignee: 클래스 하인츠-게르트; 베링거 잉겔하임 파르마 카게
Priority date: 1997-08-04
Filing date: 1998-07-31
Publication date: 2001-03-26
Also published as: JP2001513492A; IL134115A; NZ503160A; MY132852A; US20030064032A1; ATE301987T1; BG104130A; DK1003478T3; RS49705B; EE200000065A; EE05053B1; EA200000190A1; EP1003478B1; BR9811827A; NO20000553D0; WO1999007340A1; EP1527771A3; SK1502000A3; HRP980425B1; CN1265583A

Abstract

본 발명은 추진제 가스를 사용하지 않고 흡입가능한 에어로졸을 제조하기 위한 생물학적으로 활성인 거대분자를 함유하는 수성 에어로졸 제제에 관한 것이다.

Description

생물학적으로 활성인 거대분자를 함유하는 수성 에어로졸 제제 및 상응하는 에어로졸의 제조 방법{Aqueous aerosol preparations containing biologically active macromolecules and method for producing the corresponding aerosols}

본 발명은 단백질 및 기타 생물학적으로 활성인 거대분자의 흡입 투여용 에어로졸을 제조하는 방법 및 이러한 에어로졸 제조용의 수성 제제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 당뇨병 치료를 위한 흡입 투여용 인슐린의 고 농축액의 수성 제제에 관한 것이다.

흡입가능한 에어로졸 형태로 약물을 투여하는 것은 오랫동안 공지되어 왔다. 이러한 종류의 에어로졸은 천식과 같은 호흡기 질환을 치료하는 것 뿐 아니라, 또한 폐 또는 비강 점막이 흡수 기관으로 작용하도록 의도되는 경우에도 사용되고 있다. 흔히, 활성 물질의 혈액 농도는 신체의 다른 부위의 질환을 치료하기에 충분히 높은 농도로 달성된다. 흡입가능한 에어로졸은 또한 백신으로 사용될 수 있다.

실제로, 다수의 방법이 에어로졸을 제조하는데 사용된다. 활성 물질의 현탁액 또는 용액이 추진제 가스의 도움으로 분무되거나, 미분화 분말 형태의 활성 물질이 공기 호흡시 유동화되거나, 또는 최종적으로 수성 용액이 분무기(nebulizer)로 오토마이징(atomization)된다.

그러나, 인터페론과 같은 복잡한 구조의 분자인 경우, 수용액의 분무화(nebulization)는 전단력 및 가열의 결과로 추정되는, 활성 물질의 활성에 있어서의 심각한 감소를 쉽게 초래할 수 있다. 활성이 거의 없는 단백질 응집체의 형성은 예를 들면, 이러한 과정에 일부 관여하는 것으로 생각된다. 문헌[참조: "Stability of recombinant consensus interferon to airjet and ultrasonic nebulization", J. Pharm. Sci. 84: 1210-1215 (1995), A. Y. Ip 및 연구자]에서는 초음파 또는 제트 분무화(jet nebulization)후 인터페론 응집체의 형성과 인터페론의 생물학적 활성의 동시 상실의 예를 기술하고 있다. 생분자(생물학적으로 활성인 거대분자)가 완전히 파괴되지 않는 경우에서조차, 본원에 기술된 활성의 상실은 중요한데, 왜냐하면 이러한 상실은 매우 비싼 생분자가 다량 소모되도록 하고 작동(actuation)당 활성 물질의 정확하지 않는 복용을 초래하기 때문이다. 에어로졸의 생산동안 복잡한 구조의 분자 활성에 있어서의 이러한 감소는 인터페론에 한정되는 것이 아니며, 다른 분자[참조예: Niven et al., Pharm. Res. 12: 53-59(1995)] 및 생분자를 에어로졸 형태로 제조하는 경우 더욱 크거나 더욱 적은 정도로 일어난다.

생분자를 함유하는 에어로졸의 산업적인 생산과는 달리, 생분자를 폐내로 흡수되도록 하는데는 제 2단계가 요구된다. 성인의 폐는 흡수를 위해 큰 표면적을 지니지만 또한 생분자의 폐 흡수에 대해 많은 장해물을 지닌다. 공기가 에어로졸과 함께 코 또는 입을 통해 호흡된 후, 이는 기관을 통과한 다음 더욱더 작은 기관지 및 기관지초를 통해 폐포로 이동한다. 폐포는 기관, 기관지 및 기관기초 모두 보다 더욱 큰 표면적을 지닌다. 이들은 산소뿐 아니라, 또한 생물학적으로 활성인 거대분자를 위한 주요 흡수 지대이다. 공기로부터 혈류로 이동하기 위해서는, 분자가 폐포 상피, 모세관 상피 및 세포의 이들 2개 층사이의 림프 함유 개재 공간(lymph-containing interstitial space)을 가로질러야 한다. 이러한 과정은 능동 또는 수동 수송 과정을 통해 이루어진다. 세포의 이들 2개 층내 세포는 서로 밀접하게 배열되어 있으므로, 대부분의 거대한 생물학적 거대분자(예: 단백질)는 더욱 작은 분자보다 더욱더 천천히 이 장벽을 가로지른다. 폐포 상피 및 모세관 상피를 가로지르는 과정은 생분자를 파괴시키는 다른 생물학적 과정과 경쟁시 더욱 우월하다. 기관지폐포성 유액은 엑소프로테아제를 함유한다[참조: Wall D.A. and Lanutti, A.T. "High levels of exopeptidase activity are present in rat and canine bronchoalveolar lavage fluid". Int. J. Pharm. 97: 171-181(1993)]. 이는 또한 식작용에 의해 단백질 입자를 제거하는 대식세포를 함유한다. 이들 대식세포는 기관지문리의 기저로 이주하여, 이곳에서 부터 점막섬모성 청정 메카니즘(mucociliary clearance mechanism)의 수단에 의해 폐를 떠난다. 이후 이들은 임파계로 이주할 수 있다. 더우기, 대식세포는 자체 생리학에 있어 에어로졸 형태의 단백질에 의해 영향받을 수 있는데, 예를 들어, 인터페론은 폐포 대식세포를 활성화시킬 수 있다. 활성화된 대식세포의 이주는 흡입된 단백질의 전신계적 효과를 증대시키는 다른 메카니즘이다. 이러한 과정의 복잡성은 한 유형의 단백질을 사용한 에어로졸 시험 결과가 다른 유형의 단백질에 한정된 정도로만 이전될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 인터페론들간의 작은 차이는 폐내 분해 메카니즘에 대한 자체의 감도에 있어 현저한 효과를 가질 수 있다[참조: Bocci et al. "Pulmonary catabolism of interferons: alveolar absorption of¹²⁵-I labelled human interferon alpha is accompanied by partial loss of biological activity" Antiviral Research 4: 211-220 (1984)].

단백질 및 기타 생물학적 거대분자는 이론적으로는 분무될 수 있으나 일반적으로 이러한 분무화는 활성의 상실을 동반한다. 본 발명의 목적은 생물학적으로 활성인 거대분자, 특히 단백질을 활성의 어떠한 실질적인 손실없이 분무시킬 수 있는 흡입가능한 에어로졸을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

추진제가 포함되지 않은 분무기의 새로운 생산은 전문이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,497,944호에 기술되어 있다. 이 문헌에 기술된 분무기의 특수한 장점은 추진제 가스, 특히 플루오로클로로 탄화수소를 사용할 필요가 없다는 것이다.

본원에 기술된 분무기의 더욱 개발된 양태는 제PCT/ET96/04351호(=제 WO97/12687호)에 기술되어 있다. 본 발명에 관하여서는, 이 문헌에 기술된 도 6(Respimat^R)와 이 출원 명세서의 관련 부분을 참조한다. 상기 문헌에 기술된 분무기는 발명에 따른 생물학적으로 활성인 거대분자의 흡입가능한 에어로졸을 제조하는데 편리하게 사용될 수 있다. 특히, 상기 문헌에 기술된 분무기는 인슐린의 흡입용으로 사용될 수 있다. 편리한 크기로 인하여, 이 장치를 환자가 항상 소지할 수 있다. 기술된 분무기를 사용하여, 특정 용량(바람직하게는 약 15㎕)의 활성 물질 함유 용액을 작은 노즐을 통해 고압하에 분무함으로써 평균 입자 크기가 3 내지 10μ인 흡입가능한 에어로졸을 형성시킬 수 있다. 인슐린의 흡입을 위해, 적용당 10 내지 50㎕의 에어로졸 제제를 흡입가능한 소적으로 분무시킬 수 있는 분무기가 적합하다.

본 발명에 따른 에어로졸 제제에 있어 특히 중요한 특징은 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 거대분자를 함유하는 활성 물질의 용액의 추진제를 사용하지 않는 오토마이징을 위해 상기 언급한 특허 또는 특허원에 기술된 분무기를 사용하는 것이다.

필수적으로 상기 문헌에 기술된 통상적인 크기의 오토마이저[atomiser(약 10cm 크기의 분무기)]는

-하우징 상부(upper housing part)내에 고정된 펌프 하우징(pump housing) 및 노즐 또는 노즐이 정렬된 노즐 구성원의 한쪽 말단에서의 베어링(bearing),

-밸브 구성원이 있는 할로우 피스톤(hollow piston),

-할로우 피스톤을 고정시키며 하우징 상부에 위치하는 드라이브 플랜지(drive flange),

-하우징 상부에 위치하는 클램핑 메카니즘(clamping mechanism),

-스프링이 위치하며 하우징 상부에서 회전식 베어링에 의해 회전하면서 올라가는 스프링 하우징(spring housing),

-스프링 하우징상에 수직 방향으로 고정된 하우징 하부에 의해 특징화되는, 하우징 상부, 펌프 하우징, 노즐, 클램핑 메카니즘, 스프링 하우징, 스프링 및 저장 용기로 이루어진다.

제WO97/12687호의 밸브 구성원을 지닌 할로우 피스톤은 기술된 장치중 하나에 상응한다. 이 피스톤은 펌프 하우징의 실린더내로 부분적으로 투사되어 올라감으로써 실린더내에서 수직으로 이동한다(참조: 도 1 내지 4, 특히 도 3 및 명세서의 관련 부분). 밸브 구성원을 갖는 할로우 피스톤은 유액, 즉, 활성 물질의 적절한 용액상에서 스프링이 이완되는 시기에 고압면에 5 내지 60MPa(약 50 내지 600bar), 바람직하게는 10 내지 60MPa(약 100 내지 600bar)의 압력을 발휘한다.

밸브 구성원은 바람직하게는 노즐 구성원과 접하고 있는 할로우 피스톤의 말단에 설치된다.

노즐 구성원중 노즐은 바람직하게는 미세제작되는데, 즉 미세기술에 의해 제조된다. 미세제작된 노즐 구성원은 명세서 전문이 본원에 참조로 인용된 제WO94/07607호에 기술되어 있다.

노즐 구성원은 예를 들면, 서로 단단히 부착된 유리 및/또는 규소의 2개 판, (여기서, 이들 판중 하나 이상은 노즐의 내측을 외측에 연결하는 하나 이상의 미세제작된 채널을 갖는다)으로 이루어져 있다. 노즐의 외측에는 10 마이크론이하의 하나 이상의 환형 또는 비환형 개구부(opening)가 제공된다.

노즐 구성원내 노즐의 유동 방향은 서로 평행하거나 서로에 대해 경사져 있다. 외측에 2개 이상의 노즐 개구부를 갖는 노즐 구성원의 경우에, 유동 방향은 서로 20 내지 160°, 바람직하게는 60 내지 150°의 각으로 경사져 있을 수 있다. 유동 방향은 노즐 개구부의 근처에서 만난다.

클램핑 메카니즘은 기계 에너지의 저장소로서 스프링, 바람직하게는 실린더형의 나선 압착 스프링을 포함한다. 이 스프링은 점핑 구성원(jumping member)으로서 드라이브 플랜지상에서 작용하며, 이의 운동은 로킹 구성원(locking member)의 위치에 의해 결정된다. 드라이브 플랜지의 경로는 상부 및 하부 스톱(stop)에 의해 정교하게 결합되어 있다. 스프링은 바람직하게는 힘-전달 기어(force-transmitting gear), 즉 나선 트러스트 캠(helical thrust cam)을 통해, 하우징 상부가 하우징 하부내의 스프링 하우징에 대해 역 방향으로 회전함으로써 생성되는 외부 토크(external torque)에 의해서 신장된다. 이 경우, 하우징 상부 및 드라이브 플랜지는 단일 또는 다수 속도의 웨지 기어(wedge gear)를 포함한다.

연동의(engaging) 로킹 표면을 갖는 로킹 구성원은 드라이브 플랜지 주변에 고리 배열로 배열되어 있다. 이것은 예를 들면, 고유의 라다칼 탄성 변형성을 갖는 플라스틱 또는 금속 고리로 이루어진다. 고리는 분무기 축에 대해 우측 각도에서 평면으로 배열되어 있다. 스프링의 신장 후, 로킹 구성원의 로킹 표면은 드라이브 플랜지의 경로내로 미끄러져서 스프링이 늘어나는 것을 방지한다. 로킹 구성원은 버튼에 의해 작동된다. 작동 버튼은 로킹 구성원에 연결되어 있거나 결합되어 있다. 로킹 메카니즘을 작동시키기 위하여, 작동 버튼을 고리의 수평면과 평행하게, 바람직하게는 분무기내로 누르면, 변형가능한 고리가 고리의 평면에서 변형된다. 로킹 값의 세부사항은 제WO 97/20590호에 기술되어 있다.

하우징 하부는 스프링 하우징에 걸쳐 수직으로 밀어져서 베어링, 주축의 드라이브 및 유액용 저장 용기를 덮는다.

분무기가 개방되면, 하우징 상부는 하우징 하부에 대해 반대로 회전하는 반면, 하우징 하부는 스프링 하우징을 수용한다. 스프링은 압착되어 나선 트러스트 캠 및 로킹 메카니즘에 의해 자동적으로 엇갈린다. 회전각은 바람직하게는 360°의 정 분수, 즉 180°이다. 스프링이 엇갈리게 됨과 동시에, 하우징 상부내 드라이브 구성원은 제공된 거리로 이동하고, 할로우 피스톤이 펌프 하우징내 실린더내부에서 역으로 밀쳐지며, 이 결과 저장 용기로부터 유액의 일부가 노즐 정면의 고압 챔버내로 흡수된다.

바람직하게는, 오토마이징될 유액을 함유하는 다수의 교환가능한 저장 용기가 분무기내로 삽입되어 사용될 수 있다. 저장 용기는 본 발명에 따른 에어로졸 수성 제제를 함유한다.

분무 과정은 작동 버튼을 약하게 누름으로써 시작된다. 이후, 로킹 메카니즘이 드라이브 구성원을 위한 길을 연다. 엇갈린 스프링은 피스톤을 펌프 하우징의 실린더내로 민다. 유액은 분무 형태로 분무기 노즐을 떠난다.

구조의 다른 세부사항은 본원에 전문이 참조로 인용된 PCT 특허원 제WO 97/12683호 및 제WO 97/20590호에 기술되어 있다.

오토마이저(분무기) 성분은 이러한 목적에 적합한 물질로 제조된다. 오토마이저의 하우징 및 작동이 허용되는 한, 다른 부분은 바람직하게는 예를 들면, 사출 성형에 의해 플라스틱으로 제조된다. 의학 목적을 위해, 생리학적으로 허용되는 물질이 사용된다.

제WO 97/12687호에 기술된 오토마이저는 예를 들면, 의약 에어로졸제를 추진제 없이 제조하는데 사용된다. 평균 소적 크기가 약 5㎛인 흡입가능한 에어로졸제가 이에 의해 제조될 수 있다.

도 4a/b는 제WO97/12687호의 도6a/b와 동일하며, 본 발명에 따른 수성 에어로졸 제제가 유리하게 흡입되는 분무기(Respimat^R)를 나타낸다.

도 4a는 스프링이 엇갈려 있는 오토마이저의 종단면을 나타내며, 도 4b는 스프링이 이완되어 있는 오토마이저의 종단면을 나타낸다.

하우징 상부(51)는 말단에 분무기 노즐용 홀더(53)가 있는 펌프 하우징(52)을 포함한다. 홀더내에는 노즐 구성원(54) 및 필터(55)가 위치한다. 클램핑 메카니즘의 드라이브 플랜지(56)에 보관된 할로우 피스톤(57)은 펌프 하우징의 실린더내로 부분적으로 투사된다. 이의 끝에서, 할로우 피스톤은 밸브 구성원(58)을 동반한다. 할로우 피스톤은 밀봉재(59)에 의해 밀봉된다. 하우징 상부내에서 스프링이 이완되는 경우 드라이브 플랜지가 정지하는 스톱(60)이 존재한다. 드라이브 플랜지 위에는 스프링이 엇갈리는 경우 플랜지가 정지하는 스톱(61)이 존재한다. 스프링이 엇갈린 후, 로킹 구성원(62)은 하우징 상부내 스톱(61) 및 지지체(63)사이에서 움직인다. 작동 버튼(64)은 로킹 구성원에 연결된다. 마우스 피스(mouse piece)(65)내 하우징 상부 끝은 제거가능한 보호 커버(66)에 의해 밀폐된다.

압착 스프링(68)이 있는 스프링 하우징(67)은 하우징 상부에 있는 스냅-핏 러그(snap-fit lug) 및 회전 베어링에 의해 회전하면서 위치한다. 하우징 하부(70)는 스프링 하우징위에서 밀쳐진다. 스프링 하우징 내부에는 분무될 유액(72)용의 교환가능한 저장 용기(71)가 위치한다. 이 저장 용기는 할로우 피스톤이 저장 용기로 투사되어 이의 끝이 유액(활성 물질 용액 공급물)내로 침지되어 있는 스톱퍼(73)로 밀폐되어 있다.

기계 계수기용 스핀들(74)은 스프링 하우징의 외부 표면에 위치한다. 하우징 상부와 접하고 있는 스핀들 끝에 드라이브 피니온(drive pinion)(75)이 위치한다. 슬라이더(76)은 스핀들 상단에 위치한다.

상기 기술한 분무기는 본 발명에 따른 에어로졸 제제를 분무하여 흡입용으로 적합한 에어로졸을 제조하는데 적합하다.

분무기 효능은 단백질 용액을 분무하며 스프레이 연무를 "트랩(trap)"으로 칭하는 시험관 시스템을 사용하여 시험할 수 있다(참조: 도 1). 에어로졸 저장기(a)내 단백질의 활성은 단백질의 생물학적 효능에 대한 검정 또는 면역검정에 의해 트랩화된 액체(b)내 활성과 비교한다. 이 실험은 분무 과정에 의한 단백질의 파괴도 평가를 가능하게 한다. 에어로졸 질의 제 2의 매개변수는 소위 흡입가능한 비이며, 이는 측정된 중간 에어로-역학적 직경(measured median aero-dynamic diameter: MMAD)이 5.8㎛ 미만인 연무 소적의 비로 정의한다. 흡입가능한 비는 "앤더슨 임펙터(Andersen Impactor)"로 측정할 수 있다. 우수한 단백질 흡수를 위해, 활성의 어떠한 실질적인 손상 없이 분무가 이루어질 뿐 아니라, 우수한 흡입가능한 비(약 60%)를 생성시키는 것이 중요하다. MMAD가 5.8㎛ 미만인 에어로졸은 폐포에 도달하기에 매우 적합하며, 여기서, 흡수되는 변화는 매우 크다. 분무 장치의 효능은 또한 생체내 시스템에서 시험할 수 있으며, 이 경우, 폐 프로테아제에 대한 민감성과 같은 인자가 중요해진다. 생체내 시험 시스템의 예로서, 단백질 함유 연무를 기관지를 통해 개에게 투여할 수 있다. 혈액 샘플을 적합한 시간 간격으로 취하여 혈장내 단백질 농도를 면역학적 방법 또는 생물학적 방법으로 측정한다.

특히 도 6a/b(현재 4a/b)에 기술된 바와 같은 적합한 분무기가 상기 언급한 미국 특허 제5,497,944호 및 제WO 97/12687호에 기술되어 있다. 본 발명에 따른 생물학적으로 활성인 거대 분자의 수성 에어로졸 제제를 분무하기 위한 바람직한 노즐 배열은 미국 특허의 도 8에 나타나 있다.

놀랍게도, 평균 입자 크기가 10㎛ 미만인 흡입가능한 소적을 제조하기 위해 1 내지 12㎛의 수 직경을 갖는 하나 이상의 노즐을 통해 100 내지 500bar의 고압하에서 예정된 양, 즉 15㎕의 에어로졸 제제를 분무하는 상기의 추진제가 없는 분무기가 단백질 및 기타 거대분자의 액체 에어로졸 제제를 분무하는데 적합한 것으로 밝혀졌는데, 그 이유는 이것이 어떠한 활성의 손상없이 광범위한 단백질을 분무할 수 있기 때문이다. 상기 미국 특허의 도 8에 나타난 노즐 배열이 바람직하다. 특히 놀라운 것은 활성이 현저하게 손상되면서 분무되는 인터페론을 분무하는 이러한 유형의 분무기의 능력이다. 시험관 시험뿐 아니라 생체내 시험에서도 분무화후 인터페론 오메가의 특히 높은 활성은 또한 놀라운 것이다.

청구된 방법의 다른 장점은 생물학적으로 활성인 거대 분자의 고 농축 용액조차 활성의 어떠한 실질적인 상실없이 분무할 수 있는 이의 놀라운 능력이다. 고 농축된 용액의 사용으로 자켓 주머니 또는 핸드백에 항상 안전하게 지니고 다닐 수 있도록 충분히 작은 장치를 사용하는 것이 가능하다. 도 4에 기술된 분무기는 이러한 요구를 만족시키며, 생물학적으로 활성인 분자의 고 농축 용액을 분무시키는데 사용될 수 있다.

예를 들어, 이러한 유형의 장치는 흡입에 의해 인슐린을 사용하여 당뇨병을 치료하는데 특히 적합하다. 바람직하게는, 인슐린의 농도가 20 내지 90mg/ml인 고 농축 수용액이 사용되며, 인슐린 33 내지 60mg/ml를 함유하는 용액이 바람직하고 인슐린 33 내지 40mg/ml을 함유하는 용액이 특히 바람직하다. 분무기내에서 유용한 저장기의 크기에 따라, 25mg/ml 이상, 바람직하게는 30mg/ml 이상 농도의 인슐린을 함유하는 용액이 상기 기술한 장치와 같은 손에 가지고 다닐 수 있는 장치로 치료학적 유효량의 인슐린을 흡입시키기에 적합하다. 흡입에 의한 인슐린의 투여로 활성 물질이 신속하게 작용하도록 함으로써 환자가 예를 들면, 식사 시간직전에 요구되는 양으로 자신을 치료할 수 있다. 예를 들어, 소 규모의 Respimat^R는 환자가 항상 이 장치를 지닐 수 있도록 한다.

Respimat^R(제WO 97/12687호의 도 6)는 환자가 다수의 퍼프(puff)에 의해 이들에게 요구되는 인슐린의 용량을 측정하여 흡입할 수 있도록 하는 일정 용량의 투여량 챔버를 갖는다. 퍼프 수와는 달리, 인슐린의 계량은 저장 용기(72)내 인슐린 용액의 농도로 측정한다. 이 농도는 예를 들면, 25 내지 90mg/ml일 수 있고, 약 30mg/ml 이상의 더욱 고도로 농축된 용액이 바람직하다.

고 농축된 안정한 인슐린 용액을 제조하는 방법은 본원에서 참조로 인용한 WO 출원 제83/00288호(PCT/DK82/00068) 및 제83/03054호(PCT/DK83/00024)에 기술되어 있다.

상기 기술한 장치에 의해 투여되는 인슐린을 함유하는 본 발명에 따른 에어로졸 제제는 1600.10^-6Pa s(파스칼 초)이상의 역학적 점도를 초과하지 않도록 함으로써 제조된 스프레이중 흡입가능한 비율이 허용되는 수준 이하로 떨어지지 않도록 한다. 1200.10^-6이하 및 가장 바람직하게는 1100.10Pa s의 제한된 점도 수를 갖는 인슐린 용액이 바람직하다. 경우에 따라, 용매로서 물 대신에 용매 혼합물을 사용하여 의약 용액의 점도를 감소시키는 것이 가능하다. 이것은 예를 들면, 에탄올을 가함으로써 수행할 수 있다. 수성 제형중 에탄올의 양은 50% 이하, 예를 들면, 30%의 양이 바람직하다.

본 발명의 추가의 목적은 청구된 방법에서 사용하기에 적합한 에어로졸 제제를 제안하는 것이다.

본 발명은 활성 물질로서 생물학적으로 활성인 거대분자, 특히 단백질 또는 펩타이드를 3mg/ml 내지 150mg/ml 또는 25mg/ml 내지 100mg/ml의 양으로 함유하는 수용액 형태의 에어로졸 제제에 관한 것이다.

놀랍게도, 심지어 점도가 더욱 높은 거대분자의 용액도 본 발명에 따라 청구된 방법을 사용하여 적합한 크기의 흡입가능한 소적으로 분무할 수 있음이 밝혀졌다. 이는 적용당 활성 물질의 보다 많은 양을 투여할 수 있게 함으로써 흡입 치료요법에 있어 거대분자의 치료학적 효능을 증진시킨다.

본 발명의 방법에 따라서, 거대분자(예: 알부민)를 함유하는, 점도가 1600.10^-6Pa s(25℃에서 측정) 이하인 수성 에어로졸 제제를 사용할 수 있다. 1500.10^-6Pa s 점도에서도 32%의 흡입가능한 비가 여전히 수득된다.

점도가 1100.10^-6Pa s이하인 거대분자의 고 점도 용액이 바람직하다. 이러한 용액을 사용하여, 약 60%의 활성 물질을 함유하는 흡입가능한 비의 소적이 수득된다. 제공되는 제한된 점도수는 문헌에 공지된 방법을 사용하여 오츠발트 점도계(Ostwald viscosimeter)로 측정한다. 비교용으로서, 물의 점도는 894.10^-6Pa s(25℃에서 측정시)이다.

본 발명에 따른 방법의 장점을 나열하기 위하여, 하기에 인터페론 오메가 용액을 사용한 시험관내 및 생체내 시험을 기술한다.

Respimat^R및 인터페론 오메가를 사용한 시험관내 시험

Respimat 장치(a)의 저장기를 5mg/ml의 인터페론 오메가 용액(50mM 삼나트륨 시트레이트, 150mM NaCl, pH 5.5중에서 제형화 됨)으로 충전시킨다. 이 장치를 활성화시키고 약 12.9㎕(1개 퍼프) 용량을 28 l/분의 공기 흐름으로 분무한다. 분무된 용액을 트랩(도 1)으로 잡는다. 인터페론 오메가를 저장기 용액 및 트랩내에 포획된 용액속에서 ELISA를 사용하는 면역학적 방법, 및 생물학적으로는 뇌심근염 바이러스로 감염된 A549 세포 파괴의 억제에 의해 측정한다. 인터페론의 면역학적 측정은 비교적 단순하다. 분무된 단백질을 사용한 공포된 시험은 많은 경우에 면역학적 측정으로 국한되어 있다. 그러나, 이들은 단백질 파괴를 정량하는 매우 민감하고 치료학적으로 관련된 방법이므로, 추가의 생물학적 측정이 매우 중요하다. 분자는 항체에 결합시 어떠한 변화없이도 자체의 생물학적 특성을 상실할 수 있기 때문에, 이들이 항상 물리화학적 방법 또는 면역학적 방법에서와 동일한 결과를 제공하는 것은 아니다.

3회의 실험에서, 출발 용액을 기준으로 하여, 84%, 77% 및 98%의 면역학적으로 확인가능한 인터페론이 트랩 용액(b)에서 발견되었다. 동일한 용액을 사용한 생물학적 측정은 트랩된 용액내 생물학적으로 확인가능한 인터페론의 54%, 47% 및 81%의 회수 결과를 제공한다. 이러한 매우 높은 퍼센트는 Respimat 장치를 사용한 분무화가 비교적 소량의 인터페론 활성만을 파괴함을 나타낸다. 상기 기술된 Respimat 장치로부터의 분무 연무는 공기 흐름(28 l/분)에 의해 앤더슨 충격기(Andersen impactor)를 통과시킨다. 크기가 5.8㎛ 미만인 입자의 비('흡입가능한 비')를 측정한다. 흡입가능한 비는 70%(면역학적 측정시)에 상응한다. 인터페론과 같은 단백질은 종종 사람 혈청 알부민과 함께 제형화되어 민감한 인터페론에 대해 추가로 보호한다. 추가의 사람 혈청 알부민(0.5%)을 포함하는 것 외에는 상기와 같은 제형을 또한 시험한다. 3회의 시험에서, 출발 용액을 기준으로 83%, 83% 및 79%의 면역학적으로 확인가능한 인터페론이 트랩 용액(b)에서 발견되었다. 동일한 용액을 사용한 생물학적 측정으로 트랩된 용액에서 생물학적으로 활성인 인터페론 60%, 54% 및 66%가 수득되었다. 흡입가능한 비(면역학적 측정시)는 67%이다. 다른 세트의 시험에서, 인터페론 오메가 농축 용액을 Respimat 장치의 저장기에 53mg/ml의 농도로 붓고 분무한다. 4회의 시험에서, 출발 용액을 기준으로 100%, 60%, 68% 및 72%의 면역학적으로 확인가능한 인터페론이 트랩 용액(b)에서 발견되었다. 동일한 용액을 사용한 생물학적 측정에서는 트랩된 용액에서 생물학적으로 확인가능한 인터페론의 95%, 98%, 61% 및 83%가 회수된다. 이러한 높은 회수율은 Respimat 장치가 인터페론 활성의 과도한 상실없이 단백질 농축 용액을 분무하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.

Respimat^R및 인터페론 오메가를 사용한 생체내 시험

인터페론 오메가를 흡입 및 정맥내 경로로 동일한 개에게 별개 실험으로 투여한다. 인터페론의 혈액 농도를 상이한 시간에 면역학적으로 및 생물학적으로 측정한다. 또한, 혈액중 네오프테린 농도를 측정한다. 네오프테린은 면역 활성화용 마커이며, 인터페론 자극후 대식세포에 의해 방출된다[참조: Fuchs et al. 'Neopterin, biochemistry and clinical use as a marker for cellular immune reactions' Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 101: 1-6 (1993)]. 네오프테린 농도의 측정으로 인터페론 활성을 적량할 수 있다.

개에 대한 인터페론의 투여는 먼저 기본적으로 진정시킨 후 펜토바르비탈 마취하에 수행한다. 이 동물에 삽관한 후 동맥 확장(용량 조절된 호흡: 분당 용량 4 l/분, 속도 10회 호흡/분)을 수행한다. 총 20회 퍼프를 Respimat 장치에 의해 수송한다. 각각의 퍼프를 들숨 시작시 제공한다. 호흡후 이 상태에서 날숨전까지 5초의 시간간격이 존재한다. 인터페론 오메가를 다음 투여하기 전에 동물을 조정없이 2회의 호흡 주기동안 호흡하도록 한다. 인터페론을 투여하기 전 및 인터페론을 투여한 후 14일째까지 다양한 시간에 혈청 및 헤파린 혈장용 혈액을 채취한다. 인터페론 오메가를 ELISA를 사용한 면역학적 방법 및 뇌심근염 바이러스로 감염된 A549 세포의 파괴 억제에 의한 생물학적 방법에 의해 헤파린 혈장중에서 측정한다. 혈청 네오프테린을 면역학으로 측정한다. 도 2는 Respimat 장치로부터 인터페론 오메가의 20 퍼프후 면역학적 방법(도 2a) 및 생물학적 방법(도 2b)에 의해 측정한 인터페론 오메가 농도를 나타낸다. 놀랍게도, 흡입 투여후, 매우 높은 혈청 네오프테린 수준이 측정되었다. 시험관내 수행한 시험에서 Reapimat 장치의 1회 퍼프후 수송된 용액의 양은 평균 12.8 mg/퍼프에 상응한다. 연속해서, 약 1.28mg의 인터페론이 5mg/ml의 용액을 사용한 Respimat의 20 퍼프에 의해 수송될 것임을 예측할 수 있다. 이러한 양의 투여후 네오프테린 측정시 인터페론 0.32mg의 정맥내 투여후 네오프테린 측정보다 더욱 높고 더욱 지속적인 농도가 수득된다. 도 3은 이 결과를 나타낸다. 높은 네오프테린 농도는 Respimat에 의한 인터페론의 투여가 우수한 생물학적 활성을 가져올 수 있음을 입증한다.

생물학적으로 활성인 거대분자를 분무하기 위한 Respimat 장치의 장점은 제 2 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 인터페론에만 제한되는 것이 아니다.

Respimat^R및 망간 슈퍼옥사이드 디스뮤타제를 사용한 시험관내 시험

시험 물질을 분무시키기 위한 장치 및 연관된 트랩을 도 1에 나타낸다. 이 실험에서, Respimat 장치의 저장기(a)에 인산염 완충된 염수(PBS)중 망간 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(MnSOD) 3.3mg/ml를 충전시킨다. 이 장치를 작동시키고 약 13㎕(1회 퍼프) 용량을 28 l/분의 공기 흐름으로 분무시킨다. 분무된 정확한 양을 비중계적으로 측정한다(3회 연속 시험에서의 측정치: 12.8, 13.7 및 14.3mg). 분무된 용액을 트랩(b)에서 포획한다. 이 트랩은 20ml의 PBS를 함유한다. 또한, 5% 소 혈청 알부민 2ml를 가하여 트랩내 단백질을 안정화시킨다. MnSOD를 저장 용액 및 트랩내 포획된 용액중에서 ELISA를 사용하여 면역학적으로 및 크산틴/크산틴 옥시다제 반응후 슈퍼옥사이드 양의 감소에 의해 효소적으로 측정한다. 3회의 시험에서, 분무된 용액의 면역학적으로 확인가능한 MnSOD 78%, 89% 및 83%가 트랩된 용액(b)중에서 측정된다. 분무화후 효소 활성에 있어서 측정가능한 감소는 없다. 흡입가능한 비(면역학적 측정시)는 61%이다.

하기 실시예는 활성 물질로서 인슐린을 함유하는 본 발명에 따른 에어로졸 제제의 제조를 기술한다.

인슐린 용액의 제조 및 분무기 충전

소로부터의 결정화된 인슐린(나트륨 염) 175mg(제조업자의 정보에 따르면 4462.6 I.U.에 상응)을 3.5ml의 멸균 정제수(Seralpur^R수)에 용해한다. 다음 100㎕의 멸균 정제수에 용해된 8.5㎕의 m-크레졸(8.65mg에 상응) 및 7.53mg의 페놀을 온화하게 교반하면서 가한다. 이 용액에 5mg/ml ZnCl₂용액 365㎕(사용된 인슐린의 양을 기준으로 하여 아연 0.5중량%의 비에 상응)을 가하고 pH를 0.2N NaOH를 사용하여 pH 7.4로 조절한다. 혼합물 용량을 멸균 정제수를 사용하여 5ml로 만들고 멸균 밀리포어 여과기(공극 크기 0.22㎛)를 통해 여과한다. 4.5ml의 에어로졸 제제를 분무기(Respimat)의 저장 용기(72, 도 4)에 이전시킨다. 이 용기를 캡으로 밀봉하고 장치에 용기를 장전한다.

이렇게 제조된 에어로졸 제제는 인슐린 농도가 약 35mg/ml이며, 용액의 점도는 약 1020.10^-6Pa s이다.

Respimat^R및 인슐린 고 농축 용액을 사용한 시험관내 시험

개에게 먼저 기본 진정제를 투여한 후 펜토바르비탈로 마취된 개에게 인슐린을 투여한다. 이 동물에 삽관한 후 앞서와 같이 동맥 확장을 수행한다. 인슐린 용액의 총 6회 퍼프를 Respimat 장치로부터 수송한다. 각각의 퍼프를 들숨 시작시 투여한다. 들숨 및 날숨 상태 사이에 5초의 시간간격이 존재한다. 인슐린을 다음 투여하기 전에, 조정없이 2회의 호흡 주기를 그대로 둔다. 투여하기 1시간 전, 투여와 동시 및 8시간에 걸쳐 다양한 시간에 혈액을 채취한다. 혈액 글루코즈 농도를 베링거 만하임(Boehring Mannheim)에서 제조한 Refletron^R장치를 사용하여 문헌의 방법[참조: Trasch, Koller and Tritscher의 Klein. Chem. 30; 969(1984)]으로 신선한 혈액중에서 측정한다. 놀랍게도, 인슐린 고 농축 용액을 사용하는 경우에서 조차, 우수한 생물학적 활성이 수득되었다(흡입에 의한 인슐린 투여후 혈액 글루코즈 농도의 강하). 도 5에 이 결과를 나타낸다.

경우에 따라, 본 발명에 따른 수성 에어로졸 제제는 활성 물질 및 물 이외에 에탄올과 같은 다른 용매를 함유할 수 있다. 에탄올의 양은, 활성 물질이 과도하게 높은 농도에서 에어로졸 제제로부터 침전될 수 있다는 사실에 의해, 활성 물질의 용해 특성의 함수로써 제한된다. 약제학적으로 허용되는 방부제와 같은 용액 안정화용 첨가제, 예를 들어, 에탄올, 페놀, 크레졸 또는 파라벤, 약제학적으로 허용되는 산, pH 조절용 기재 또는 완충액, 또는 계면활성제가 또한 가능하다. 또한, 용액을 안정화시키고 에어로졸의 양을 증진시키기 위해, EDTA와 같은 금속 킬레이트제를 가하는 것도 가능하다. 에어로졸 제제중에서 활성 물질의 용해도 및/또는 안정성을 증진시키기 위하여, 아스파르트산, 글루탐산 및 특히 프롤렌과 같은 아미노산을 가할 수 있다.

인터페론, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 및 인슐린외에, 본 발명에 따른 약제학적 제제중에서 바람직한 활성 물질은 다음과 같다:

안티센스 올리고뉴클레오타이드

오렉신

에리트로포에틴

종양 괴사 인자-α

종양 괴사 인자-β

G-CSF(과립구 콜로니 자극 인자)

GM-CSF(과립구-대식세포 콜로니 자극 인자)

아넥신

칼시토닌

렙틴

파라티린

파라티린 단편

인터루킨 2, 인터루킨 10 및 인터루킨 12와 같은 인터루킨

가용성 ICAM(세포간 부착 분자)

소마토스타틴

소마토트로핀

tPA(조직 플라스미노겐 활성인자)

TNK-tPA

종양-연관된 항원(펩타이드, 단백질 또는 DNA로서)

펩타이드 브래디키닌 길항제

우로딜라틴

GHRH(성장 호르몬 방출 호르몬)

CRF(코르티코트로핀 방출 인자)

EMAP II

헤파린

sIL-1 수용체와 같은 가용성 인터루킨 수용체

간염 백신 또는 홍역 백신과 같은 백신

안티센스 폴리뉴클레오타이드

전사 인자

Claims

활성 물질을 3mg/ml 내지 150mg/ml, 바람직하게는 25 내지 100mg/ml의 농도로 함유함을 특징으로 하는, 활성 물질로서 생물학적으로 활성인 거대분자를 흡입 투여하기 위한 수성 에어로졸 제제.
제1항에 있어서, 활성 물질이 생물학적으로 활성인 단백질임을 특징으로 하는 수성 에어로졸 제제.
제1항에 있어서, 활성 물질로서 인슐린이 사용됨을 특징으로 하는 수성 에어로졸 제제.
제3항에 있어서, 활성 물질로서 농도가 25mg/ml 이상, 바람직하게는 30mg/ml 이상인 인슐린이 사용됨을 특징으로 하는 수성 에어로졸 제제.
제1항에 있어서, 활성 물질로서 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 오렉신, 에리트로포에틴, 종양 괴사 인자-α, 종양 괴사 인자-β, G-CSF(과립구 콜로니 자극 인자), GM-CSF(과립구-대식세포 콜로니 자극 인자), 아넥신, 칼시토닌, 렙틴, 파라티린, 파라티린 단편, 인터루킨 2, 인터루킨 10 및 인터루킨 12와 같은 인터루킨, 가용성 ICAM(세포간 부착 분자), 소마토스타틴, 소마토트로핀, tPA(조직 플라스미노겐 활성인자), TNK-tPA, 펩타이드, 단백질 또는 DNA로서의 종양-연관된 항원, 펩타이드 브래디키닌 길항제, 우로딜라틴, GHRH(성장 호르몬 방출 호르몬), CRF(코르티코트로핀 방출 인자), EMAP II, 헤파린, sIL-1 수용체와 같은 가용성 인터루킨 수용체, 간염 백신 또는 홍역 백신과 같은 백신, 안티센스 폴리뉴클레오타이드 및 전사 인자중에서 선택된 화합물이 사용됨을 특징으로 하는 수성 에어로졸 제제.
제1항에 있어서, 활성 물질로서 슈퍼옥사이드 디스뮤타제가 사용됨을 특징으로 하는 수성 에어로졸 제제.
제1항에 있어서, 활성 물질로서 인터페론이 사용됨을 특징으로 하는 수성 에어로졸 제제.
제1항에 있어서, 활성 물질로서 인터페론 오메가가 사용됨을 특징으로 하는 수성 에어로졸 제제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제, 유화제, 안정화제, 침투 증진제 및/또는 방부제와 같은 표면 활성 물질을 포함하는 그룹중에서 선택된 하나 이상의 부형제를 함유함을 특징으로 하는 수성 에어로졸 제제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산을 함유함을 특징으로 하는 수성 에어로졸 제제.
제9항에 있어서, 활성 물질의 가용성 또는 안정성을 증진시키기 위한 프롤린, 아스파르트산 또는 글루탐산을 함유함을 특징으로 하는 수성 에어로졸 제제.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 점도가 1600.10^-6Pa s이하임을 특징으로 하는 수성 에어로졸 제제.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 점도가 900.10^-6내지 1100.10^-6Pa s임을 특징으로 하는 수성 에어로졸 제제.
점도가 900.10^-6내지 1600.10^-6Pa s임을 특징으로 하는, 활성 물질로서 생물학적으로 활성인 거대분자를 흡입 투여하기 위한 수성 에어로졸 제제.
제12항에 있어서, 점도가 950 내지 1300.10^-6Pa s임을 특징으로 하는 수성 에어로졸 제제.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제3항 또는 제5항에서 정의한 활성 물질을 함유함을 특징으로 하는 수성 에어로졸 제제.
추진제가 포함되지 않은 분무기내에서, 치료학적 활성량의 단일 투여량의 에어로졸 제제가 측정 챔버내에서 측정되고 수력 직경이 1 내지 12㎛인 하나 이상의 노즐을 통해 100 내지 500bar의 고압하에 분무됨으로써 1 내지 2초내에 평균 입자 크기가 10㎛ 미만인 흡입가능한 소적을 형성시킴을 특징으로 하는, 활성 물질로서 생물학적으로 활성인 거대분자, 특히 펩타이드 또는 단백질을 함유하는 에어로졸 제제로부터 상기 활성 물질을 흡입 투여하기 위한 에어로졸의 제조 방법.
제17항에 있어서, 단일 투여량의 유효량이 10 내지 20㎕임을 특징으로 하는 방법.
제17항에 있어서, 분무기가, 에어로졸 제제가 분무되는 방식으로 2개의 분출구가 만나도록 방향지어진 2개의 노즐을 가짐을 특징으로 하는 방법.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 수성 에어로졸 제제가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 에어로졸 제제중의 활성 물질이 인슐린임을 특징으로 하는 방법.
25mg/ml 내지 60mg/ml의 인슐린을 함유하는 10 내지 50㎕의 용액이 단일 적용시 분무기로 분무되어 흡입가능한 소적을 형성함을 특징으로 하는, 당뇨병을 치료하기 위한 인슐린의 흡입 투여 방법.
제22항에 있어서, 30 내지 40mg/ml의 인슐린을 함유하는 10 내지 20㎕의 용액이 흡입됨을 특징으로 하는 방법.
평균 입자 크기가 10㎛ 미만인 에어로졸을 제조하기 위한 인슐린 30mg/ml 이상을 함유하는, 흡입에 의해 당뇨병을 치료하기 위한 용액의 용도.
평균 입자 크기가 10㎛ 미만인 에어로졸을 제조하기 위한 인슐린 25 내지 60mg/ml를 함유하는, 흡입에 의해 당뇨병을 치료하기 위한 용액의 용도.
제2항에 있어서, 추진제가 포함되지 않은 분무기를 사용하여 10 내지 50㎕, 바람직하게는 10 내지 20㎕의 용액으로부터 에어로졸을 제조함을 특징으로 하는 용액의 용도.