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Die
Erfindung betrifft wässrige Aerosolzubereitungen für
die inhalative Applikation enthaltend therapeutisch wirksame Mikroorganismen
oder Teile von Mikroorganismen als Wirkstoff.
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Die
Anwendung von Arzneistoffen in Form inhalierfähiger Aerosole
ist seit langem bekannt. Solche Aerosole dienen nicht nur zur Behandlung
von Atemwegserkrankungen wie Asthma; sie werden auch verwendet, wenn
die Lunge oder die Nasenschleimhäute als Resorptionsorgan
dienen sollen. Häufig können so hohe Blutspiegel
des Wirkstoffes erzeugt werden, um auch Krankheiten in anderen Körperregionen
zu behandeln. Inhalierbare Aerosole können auch als Impfstoffe
dienen.
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Zur
Herstellung von Aerosolen werden in der Praxis mehrere Verfahren
angewendet. Entweder werden Suspensionen oder Lösungen
von Wirkstoffen, u. a. mit Hilfe von Treibgasen, versprüht
oder Wirkstoffe in Form mikronisierter Pulver in der Atemluft verwirbelt
oder schließlich wässrige Lösungen mit
Hilfe von Verneblern zerstäubt.
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Bei
komplizierter gebauten Molekülen, wie z. B. Interferonen,
kann die Verneblung wässriger Lösungen leicht
zu einer störenden Verminderung der Wirkstoffaktivität
führen, vermutlich durch Scherkräfte und Erwärmung.
Es wird vermutet, dass in diesem Prozess z. B. die Bildung minderaktiver
Proteinaggregate eine Rolle spielt. A.Y. Ip und Kollegen haben in
ihrem Artikel 'Stability of recombinant consensus interferon
to air-jet and ultrasonic nebulisation', J. Pharm. Sci. 84: 1210–1214
[1995], Beispiele für die Entstehung von Interferonaggregaten
nach Ultraschall oder Düsen-Verneblung mit damit einhergehendem
Verlust der biologischen Aktivität des Interferons beschrieben.
Auch wenn die Zerstörung des Biomoleküls nicht
vollständig ist, ist die hier beschriebene Aktivitätsverminderung
wichtig, weil sie einen größeren Verbrauch des
möglicherweise teuren Biomoleküles verursacht
und die Dosierung an aktivem Arzneimittel pro Hub ungenau werden
lässt. Diese Abnahme der Aktivität von kompliziert
gebauten Molekülen während der Aerosolerzeugung
ist nicht nur auf Interferone begrenzt, sie kommt in kleinerem oder
größerem Maß auch während der
Aerosolisierung anderer Proteine (siehe z. B. Niven et al,
Pharm Res. 12: 53–59 [1995]) und Biomoleküle,
insbesondere von derartigen Makromolekülen, vor.
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Es
ist weiterhin bekannt, Mukoviszidose-Patienten mit Sulfid-Brücken
spaltenden Enzymen zu behandeln, indem man diese Enzyme vernebelt.
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In
EP 1003478 sind wässrige
Aerosolzubereitungen mit biologisch aktiven Makromolekülen
für die treibgasfreie Erzeugung von inhalierbaren Aerosolen
beschrieben.
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Neben
der technischen Herstellung des Biomolekül enthaltenden
Aerosols ist ein zweiter Schritt notwendig, damit die Biomoleküle
in der Lunge absorbiert werden. Die Lunge des erwachsenen Menschen
bietet eine große Absorptionsfläche, aber sie
weist auch mehrere Hindernisse für die pulmonäre
Absorption von Biomolekülen auf. Nach Inspiration durch
die Nase oder den Mund geht Luft (mit dem von ihn getragenen Aerosol)
in die Trachea und dann über immer kleinere Bronchien und
Bronchiolen in die Alveoli. Die Alveoli haben eine viel größere
Fläche als Trachea, Bronchi und Bronchiolen zusammen. Sie
sind die Hauptabsorptionszone, nicht nur für Sauerstoff,
sondern auch für biologisch aktive Makromoleküle.
Um aus der Luft in die Blutbahn zu gelangen, müssen Moleküle
das alveoläre Epithel, das kapilläre Endothel
und den lymphe-enthaltenden interstitiellen Raum zwischen diesen
zwei Zell-Schichten durchqueren. Dies kann über aktive
oder passive Transportprozesse stattfinden. Die Zellen in diesen
zwei Zellschichten liegen dicht beieinander, so dass die meisten großen
biologischen Makromoleküle (wie z. B. Proteine) diese Sperre
viel langsamer durchqueren als kleinere Moleküle. Der Prozess
der Durchquerung des alveolären Epithels und des kapillären
Endothels läuft in Konkurrenz mit anderen biologischen
Prozessen die zur Zerstörung des Biomoleküls führen.
Die bronchoalveoläre Flüssigkeit enthält
Exoproteasen [siehe z. B. Wall D.A. und Lanutti, A.T. 'High
levels of exopeptidase activity are present in rat and canine bronchoalveolar
lavage fluid'. Int. J. Pharm. 97: 171–181 (1993)].
Sie enthält auch Macrophagen, welche inhalierte Protein-Teilchen
mittels Phagozytose eliminieren. Diese Macrophagen migrieren zur
Basis des bronchialen Baumes, von wo aus sie mittels des mucoziliaren
Clearance Mechanismus aus der Lunge geraten. Sie können
dann in die Lymphbahn migrieren. Weiter können die Macrophagen
vom aerosolisierten Protein in ihrer Physiologie beeinflusst werden,
z. B. können Interferone alveolare Macrophagen aktivieren.
Die Migration von aktivierten Macrophagen stellt einen weiteren
Mechanismus für die Verbreitung der systemischen Wirkung
eines inhalierten Proteins dar. Die Komplexität dieses
Prozesses bedeutet, dass Ergebnisse von Aerosol-Versuchen mit einem
Protein Typ auf einen anderen Protein Typ nur begrenzt übertragbar sind.
Kleine Unterschiede zwischen Interferonen können zum Beispiel
einen deutlichen Einfluss auf Ihre Susceptibilität gegenüber
den Degradationsmechanismen in der Lunge haben [siehe Bocci
et al 'Pulmonary catabolism of interferons: alveolar absorption
of 125-I labelled human interferon alpha is accompanied by partial loss
of biological activity' Antiviral Research 4: 211–220 (1984)].
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Mikroorganismen,
die eine Form von biologischen Makromolekülen darstellen,
können zwar prinzipiell vernebelt werden, aber diese Verneblung
findet in der Regel mit einem Aktivitätsverlust statt.
Als Mikroorganismen werden in diesem Zusammenhang alle einzelligen
Kleinstlebewesen mit einer Größe von ≤ 200 μm definiert.
Zu den Mikroorganismen gehören insbesondere Bakterien und
Pilze.
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Es
ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, wässrige Aerosolzubereitungen
zur Verfügung zu stellen, welche therapeutisch wirksame
Mikroorganismen oder Teile von Mikroorganismen, insbesondere Bakterien,
Pilze oder Teile hiervon als Wirkstoff enthalten und zur Inhalation
verwendet werden können.
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Überraschenderweise
wurde gefunden, dass flüssige Zubereitungen von therapeutisch
wirksamen Mikroorganismen oder Teilen von Mikroorganismen als Wirkstoff
ohne nennenswerte Aktivitätsverluste vernebelt werden können.
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Vorzugsweise
handelt es sich hierbei um treibgasfreie Vernebler, die eine vorherbestimmte
Menge einer Aerosolzubereitung unter hohem Druck zwischen 100 und
500 bar durch mindestens eine Düse mit einem hydraulischen
Durchmesser von 1 bis 12 Mikrometer versprühen, so dass
inhalierbare Tröpfchen mit einer mittleren Teilchengröße
kleiner als 10 Mikrometer entstehen.
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Außerdem
können auch hochkonzentrierte Lösungen von therapeutisch
wirksamen Mikroorganismen oder Teilen von Mikroorganismen vernebelt
werden. Der Gebrauch hochkonzentrierter Lösungen ermöglicht die
Verwendung eines Gerätes mit vielen Einzeldosen in einem
kleinen Reservoir.
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Gegenstand
der Erfindung sind ferner Aerosolzubereitungen in Form von wässrigen
Lösungen, die als Wirkstoff therapeutisch wirksame Mikroorganismen
oder Teile von Mikroorganismen, insbesondere therapeutisch wirksame
Bakterien, Pilze oder Teile von Bakterien oder Pilzen, in einer
Menge zwischen 3 mg/ml und 100 mg/ml, enthalten. Besonders bevorzugt
sind die Mikroorganismen der Gattung Bacillus, Staphylococcus, Pseudomonas,
Escherichia, Salmonella, Candida oder Aspergillus bzw. eine Mischung
dieser Gattungen. Ganz besonders bevorzugt werden Mikroorganismen
der Spezies Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella abony, Candida albicans,
Aspergillus niger, bzw. eine Mischung dieser Spezies.
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Überraschenderweise
hat sich gezeigt, dass auch höher viskose Lösungen
von therapeutisch wirksamen Mikroorganismen oder Teile von Mikroorganismen
zu inhalierbaren Tröpfchen geeigneter Tröpfchengröße versprüht
werden können.
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Dies
ermöglicht die Applikation größerer Wirkstoffmengen
pro Anwendung und erhöht damit die therapeutische Wirksamkeit
von therapeutisch wirksamen Mikroorganismen oder Teile von Mikroorganismen
bei der inhalativen Therapie.
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Für
das erfindungsgemäße Aerosol können therapeutisch
wirksame Mikroorganismen oder Teile von Mikroorganismen enthaltende
wässrige Aerosolzubereitungen bis zu einer Grenzviskosität
von 1600 × 10–6 Pascal
eingesetzt werden.
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Bevorzugt
sind höhere viskose Lösungen von therapeutisch
wirksamen Mikroorganismen oder Teile von Mikroorganismen, die eine
Grenzviskosität bis zu 1100 × 10–6 Pascal
aufweisen. Die angegebenen Grenzviskositäten wurden mit
einem Oswald Viskosimeter nach literaturbekannter Methode bestimmt.
Zum Vergleich: Die Grenzviskosität von Wasser liegt bei
900 × 10–6 Pascal.
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Die
wässrige Aerosolzubereitung kann außerdem einen
oder mehrere Hilfsstoffe aus der Gruppe der oberflächenaktiven
Stoffe, Emulgatoren, Stabilisatoren, Permeationsverbesserer und/oder
Konservierungsstoffe sowie eine Aminosäure zur Verbesserung
der Löslichkeit/Stabilität des Wirkstoffes, vorzugsweise
Prolin, enthalten.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist die Verwendung der wässrigen
Aerosolzubereitung zur Behandlung von Atemwegserkrankungen, insbesondere
zur Behandlung der chronisch obstruktive Lungererkrankung (COPD)
oder zur Immunbehandlung von Menschen und Tieren.
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Als
Vernebler können alle handelsüblichen Geräte
mit oder ohne Treibgas verwendet werden.
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Eine
neue Generation von treibgasfreien Verneblern ist in dem
US-Patent 5,497,944 und
WO 97/12687 beschrieben,
auf die hiermit inhaltlich Bezug genommen wird. Eine bevorzugte
Düsenanordnung für die Verneblung der erfindungsgemäßen
wässrigen Aerosolzubereitungen biologisch aktiver Makromoleküle
ist in
8 der US-Patentschrift dargestellt.
Der besondere Vorteil der dort beschriebenen Vernebler ist, dass
auf die Verwendung von Treibgasen verzichtet wird.
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Eine
weiterentwickelte Ausführungsform der dort beschriebenen
Vernebler ist in der
PCT/EP96/04351 =
WO 97/12687 offenbart.
In Bezug auf die vorliegende Erfindung wird ausdrücklich
auf die dort beschriebene
6 sowie
auf die dazugehörigen Beschreibungsteile der Anmeldung
verwiesen. Der dort beschriebene Vernebler kann vorteilhaft zur
Erzeugung der beanspruchten inhalierbaren Aerosole biologisch aktiver
Makromoleküle eingesetzt werden. Bei den dort beschriebenen
Verneblern werden wirkstoffhaltige Lösungen definierter Volumina
unter Anwendung hoher Drucke durch kleine Düsen versprüht,
so dass inhalierbare Aerosole mit einer mittleren Teilchengröße
zwischen 3 und 10 Mikrometer entstehen.
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Von
besonderer Bedeutung ist die Verwendung der in dem oben beschriebenen
Patent bzw. der Patentanmeldung beschriebenen Vorrichtung zum treibgasfreien
Zerstäuben der erfindungsgemäßen Aerosolzubereitung.
Im Wesentlichen besteht der Zerstäuber (Vernebler) aus
dem Gehäuseoberteil, einem Pumpengehäuse, einer
Düse, einem Sperrspannwerk, einem Federgehäuse,
einer Feder und einem Vorratsbehälter, gekennzeichnet durch
- – ein Pumpengehäuse, das
im Gehäuseoberteil befestigt ist, und das an seinem einen
Ende einen Düsenkörper mit der Düse trägt,
- – einen Hohlkolben mit Ventilkörper,
- – einen Abtriebsflansch, in dem der Hohlkolben befestigt
ist, und der sich im Gehäuseoberteil befindet,
- – ein Sperrspannwerk, das sich im Gehäuseoberteil
befindet,
- – ein Federgehäuse mit der darin befindlichen
Feder, das am Gehäuseoberteil mittels eines Drehlagers drehbar
gelagert ist,
- – ein Gehäuseunterteil, das auf das Federgehäuse
in axialer Richtung aufgesteckt ist.
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Der
Hohlkolben mit Ventilkörper (
WO 97/12687 ) entspricht einer der
oben genannten Vorrichtungen. Er ragt teilweise in den Zylinder
des Pumpengehäuses hinein und ist im Zylinder axial verschiebbar
angeordnet. Der Hohlkolben mit Ventilkörper übt
auf seiner Hochruckseite zum Zeitpunkt des Auslösens der
Feder einen Druck von 5 bis 60 MPa (etwa 50 bis 600 bar), bevorzugt
10 bis 60 MPa (etwa 100 bis 600 bar) auf das Fluid aus.
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Die
Düse im Düsenkörper ist bevorzugt mikrostrukturiert,
d. h. durch Mikrotechnik hergestellt. Mikrostrukturierte Düsenkörper
sind beispielsweise in
WO-94/07607 offenbart;
auf diese Schrift wird hiermit inhaltlich Bezug genommen.
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Der
Düsenkörper besteht z. B. aus zwei fest miteinander
verbundenen Platten aus Glas und/oder Silizium, von denen wenigstens
eine Platte einen oder mehrere mikrostrukturierte Kanäle
aufweist, die die Düseneinlassseite mit der Düsenauslassseite
verbinden. Auf der Düsenauslassseite ist mindestens eine
runde oder nicht-runde Öffnung von kleiner oder gleich
10 μm angebracht.
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Die
Strahlrichtungen der Düsen im Düsenkörper
können parallel zueinander verlaufen oder gegeneinander
geneigt sein. Bei einem Düsenkörper mit mindestens
zwei Düsenöffnungen auf der Auslassseite können die
Strahlrichtungen um einen Winkel von 20 Grad bis 160 Grad gegeneinander
geneigt sein, bevorzugt um einem Winkel von 60 bis 150 Grad. Die
Strahlrichtungen treffen sich in der Umgebung der Düsenöffnungen.
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Der
Ventilkörper ist bevorzugt an dem Ende des Hohlkolbens
angebracht, das dem Düsenkörper zugewandt ist.
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Das
Sperrspannwerk enthält eine Feder, bevorzugt eine zylindrische
schraubenförmige Druckfeder als Speicher für die
mechanische Energie. Die Feder wirkt auf den Abriebsflansch als
Sprungstück, dessen Bewegung durch die Position eines Sperrglieds
bestimmt wird. Der Weg des Abriebsflansches wird durch einen oberen
und einen unteren Anschlag präzise begrenzt. Die Feder
wird bevorzugt über ein kraftübersetzendes Getriebe,
z. B. ein Schraubschubgetriebe, durch ein äußeres
Drehmoment gespannt, das beim Drehen des Gehäuseoberteils
gegen das Federgehäuse im Gehäuseunterteil erzeugt
wird. In diesem Fall enthalten das Gehäuseoberteil und
der Abtriebsflansch ein ein- oder mehrgängiges Keilgetriebe.
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Das
Sperrglied mit einrückenden Sperrflächen ist ringförmig
um den Abtriebsflansch angeordnet. Es besteht z. B. aus einem in
sich radial elastisch verformbaren Ring aus Kunststoff oder aus
Metall. Der Ring ist in einer Ebene senkrecht zur Zerstäuberachse
angeordnet. Nach dem Spannen der Feder schieben sich die Sperrflächen
des Sperrgliedes in den Weg des Abtriebsflansches und verhindern
das Entspannen der Feder. Das Sperrglied wird mittels einer Taste
ausgelöst. Die Auslösetaste ist mit dem Sperrglied
verbunden oder gekoppelt. Zum Auslösen des Sperrspannwerkes
wird die Auslösetaste parallel zur Ringebene, und zwar
bevorzugt in den Zerstäuber hinein, verschoben; dabei wird
der verformbare Ring in der Ringebene verformt.
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Das
Gehäuseunterteil wird in axialer Richtung über
das Federgehäuse geschoben und verdeckt die Lagerung, den
Antrieb der Spindel und den Vorratsbehälter für
das Fluid.
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Beim
Betätigen des Zerstäubers wird das Gehäuseoberteil
gegen das Gehäuseunterteil gedreht, wobei das Gehäuseunterteil
das Federgehäuse mitnimmt. Dabei wird die Feder über
das Schraubschubgetriebe zusammengedrückt und gespannt,
und das Sperrwerk rastet selbsttätig ein. Der Drehwinkel
ist bevorzugt ein ganzzahliger Bruchteil von 360 Grad, z. B. 180
Grad. Gleichzeitig mit dem Spannen der Feder wird das Abtriebsteil
im Gehäuseoberteil um einen vorgegebenen Weg verschoben,
der Hohlkolben wird innerhalb des Zylinders im Pumpengehäuse
zurückgezogen, wodurch eine Teilmenge des Fluids aus dem
Vorratsbehälter in den Hochdruckraum vor der Düse
eingesaugt wird.
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In
den Zerstäuber können gegebenenfalls nacheinander
mehrere das zu zerstäubende Fluid enthaltende austauschbare
Vorratsbehälter eingeschoben und benutzt werden. Der Vorratsbehälter
enthält die erfindungsgemäß wässerige
Aerosolzubereitung.
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Die
Effektivität eines Verneblungsgerätes kann in
einem in vitro System getestet werden, wobei eine Proteinlösung
vernebelt wird und das Aerosol aufgefangen und analysiert wird.
Die Aktivität des Proteins in der Vernebelungslösung
(a) wird mit der Aktivität im analysierten Aerosol (b)
verglichen, z. B. mit Hilfe eines Immunoassays oder mit Hilfe eines
Assays für die biologische Wirksamkeit des Proteins. Dieser
Versuch erlaubt eine Beurteilung des Grades der Zerstörung
des Proteins durch die Verneblung.
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Ein
zweiter Parameter zur Beurteilung der Aerosolqualität ist
der so genannte inhalierbare Anteil, der hier als Anteil der Nebeltröpfchen
mit einem Massen-medianen aerodynamischen Durchmesser (MMAD) von weniger
als 5.8 μm definiert ist. Der MMAD kann z. B. mittels eines
"Andersen Cascade Impactor" gemessen werden. Für eine effiziente
Proteinabsorption ist es wichtig, nicht nur eine Verneblung ohne
wesentlichen Aktivitätsverlust zu erreichen, sondern ein
Aerosol mit einem guten (ca. 60%) inhalierbaren Anteil zu generieren. Aerosole
mit einem MMAD von weniger als 5.8 μm sind deutlich besser
geeignet die Alveoli zu erreichen, wo aufgrund der sehr großen Resorptionsoberfläche
ihre Chancen absorbiert zu werden deutlich größer
sind. Die Effektivität eines Verneblungsgerätes
kann auch in einem in vivo System getestet werden, wobei in diesem
Fall Faktoren wie Susceptibilität gegenüber Lungenproteasen
im Spiel sind. Als Beispiel eines in vivo Testsystems kann einem
Hund ein Protein-enthaltender Nebel über einen Trachealtubus
verabreicht werden. Blutproben werden in passenden Zeitabständen
genommen und danach wird der Proteinspiegel im Plasma mit immunologischen
oder biologischen Methoden gemessen.
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Um
Vorteile des erfindungsgemäßen Aerosols zu illustrieren,
werden die folgenden in vitro Versuche beschrieben.
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In vitro Versuche mit dem Soft Inhaler
Respimat®
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Das
Reservoir eines Respimat Gerätes (a) wurde jeweils mit
einer Suspension verschiedener Mikroorganismen in 50 mM Trinatriumcitrat,
150 mM NaCl, pH 5.5 befüllt. Folgende Mikroorganismen fanden
Anwendung:
- 1.) Bacillus subtilis ATCC 6633
- 2.) Staphylococcus aureus ATCC 6538
- 3.) Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
- 4.) Escherichia coli ATCC 8739
- 5.) Salmonella abony NCTC 6017
- 6.) Candida albicans ATCC 10231
- 7.) Aspergillus niger ATCC 16404
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Diese
Stämme sind bei der American Tissue Culture Collection
hinterlegt.
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Mehrere
Hübe, die insgesamt einem Volumen von ca. 0,5 ml Lösung
entsprachen, wurden am Respimat® ausgelöst.
Das entstehende Aerosol wurde in einen abgedichteten 1000 ml Schüttelkolben
mit 100 ml einer physiologischen Pufferlösung und 0,1%
Tween 80 aufgefangen. Danach wurde der Kolben an seiner Öffnung
vollständig verschlossen und das Aerosol wird von der Pufferlösung
im Kolben mit Hilfe von sanftem Schütteln aufgenommen.
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Die
abgegebene Aerosolmenge wurde durch Wiegen des Respimat® Inhalators
bestimmt. Die anschliessenden mikrobiologischen Untersuchungen wurden
entsprechend den Vorgaben von Ph. Eur. 3, 2000 (2.6.12) und USP
24 durchgeführt:
20 ml der Pufferlösung aus
dem Schüttelkolben sowie ein Aliquot von 0,1 ml der im
Reservoir des Respimat® Inhalers
wurden getrennt voneinander durch Membranfilter gefiltert. Als Kontrollansatz
werden 0,1 ml der entsprechenden Suspension der o. g. Mikroorganismen
in 20 ml Pufferlösung gefiltert.
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Die
Membranfilter durch die die Suspensionen der Bakterien gefiltert
wurden wurden im Anschluss an die Filtration auf Agarplatten aufgelegt
und für 5 Tage bei 33°C inkubiert. Die Membranfilter
durch die die Suspensionen der Hefen und Pilze gefiltert wurden
wurden im Anschluss an die Filtration auf Agarplatten aufgelegt und
für 5 Tage bei 25°C inkubiert. Insgesamt werden
mit jedem Mikroorganismus drei Versuche durchgeführt.
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Tab.
1, Tab. 3 und Tab. 5 zeigen die Ergebnisse der drei Versuche. Vergleichend
sind die koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/ml) aus
dem Aerosol, dem Reservoir und der Kontrollgruppe dargestellt. Die Überlebensrate
und die Abtötungsrate in Prozent wurden für das
aufgefangene Aerosol im Bezug auf die Reservoirsuspension berechnet.
-
Tab.
2, Tab. 4 und Tab. 6 zeigen die Ergebnisse für die durch
Wiegen bestimmte abgegebene Aerosolmenge. Tab. 1 Ergebnisse des ersten Versuchs.
| | Aerosol | Reservoir | Kontrollgruppe | Überlebensrate | Abtötungsrate |
| | [KBE/ml] | [KBE/ml] | [KBE/ml] | [%] | [%] |
| Staphylococcus
aureus | 86 | 88 | 92 | 97.7 | 2.3 |
| Bacillus
subtilis | 60 | 62 | 64 | 96.8 | 3.2 |
| Pseudomonas
aeruginosa | 78 | 84 | 90 | 92.9 | 7.1 |
| Escherichia
coli | 80 | 82 | 86 | 97.6 | 2.4 |
| Salmonella
abony | 64 | 68 | 70 | 94.1 | 5.9 |
| Candida
albicans | 6 | 70 | 74 | 8.6 | 91.4 |
| Aspergillus
niger | 0 | 42 | 50 | 0.0 | 100.0 |
Tab. 2 Bestimmung der abgegebenen Aerosolmenge
für den ersten Versuch
| | Aerosolmenge
[g] |
| Staphylococcus
aureus | 0.52 |
| Bacillus
subtilis | 0.54 |
| Pseudomonas
aeruginosa | 0.50 |
| Escherichia
coli | 0.49 |
| Salmonella
abony | 0.51 |
| Candida
albicans | 0.50 |
| Aspergillus
niger | 0.53 |
Tab. 3 Ergebnisse des zweiten Versuchs
| | Aerosol | Reservoir | Kontrollgruppe | Überlebensrate | Abtötungsrate |
| | [KBE/ml] | [KBE/ml] | [KBE/ml] | [%] | [%] |
| Staphylococcus
aureus | 78 | 84 | 88 | 92.9 | 7.1 |
| Bacillus
subtilis | 64 | 70 | 72 | 91.4 | 8.6 |
| Pseudomonas
aeruginosa | 76 | 84 | 82 | 90.5 | 9.5 |
| Escherichia
coli | 70 | 74 | 80 | 94.6 | 5.4 |
| Salmonella
abony | 64 | 77 | 74 | 83.1 | 16.9 |
| Candida
albicans | 0 | 62 | 68 | 0.0 | 100.0 |
| Aspergillus
niger | 0 | 42 | 51 | 0.0 | 100.0 |
Tab. 4 Bestimmung der abgegebenen Aerosolmenge
für den zweiten Versuch
| | Aerosolmenge
[g] |
| Staphylococcus
aureus | 0.55 |
| Bacillus
subtilis | 0.50 |
| Pseudomonas
aeruginosa | 0.46 |
| Escherichia
coli | 0.52 |
| Salmonella
abony | 0.50 |
| Candida
albicans | 0.48 |
| Aspergillus
niger | 0.55 |
Tab. 5 Ergebnisse des dritten Versuchs
| | Aerosol | Reservoir | Kontrollgruppe | Überlebensrate | Abtötungsrate |
| | [KBE/ml] | [KBE/ml] | [KBE/ml] | [%] | [%] |
| Staphylococcus
aureus | 74 | 78 | 84 | 94.9 | 5.1 |
| Bacillus
subtilis | 58 | 66 | 70 | 87.9 | 12.1 |
| Pseudomonas
aeruginosa | 68 | 74 | 80 | 91.9 | 8.1 |
| Escherichia
coli | 80 | 86 | 84 | 93.0 | 7.0 |
| Salmonella
abony | 57 | 68 | 72 | 83.8 | 16.2 |
| Candida
albicans | 0 | 64 | 71 | 0.0 | 100.0 |
| Aspergillus
niger | 0 | 38 | 48 | 0.0 | 100.0 |
Tab. 6 Bestimmung der abgegebenen Aerosolmenge
für den zweiten Versuch
| | Aerosolmenge
[g] |
| | [g] |
| Staphylococcus
aureus | 0.51 |
| Bacillus
subtilis | 0.54 |
| Pseudomonas
aeruginosa | 0.53 |
| Escherichia
coli | 0.50 |
| Salmonella
abony | 0.51 |
| Candida
albicans | 0.53 |
| Aspergillus
niger | 0.49 |
Tab. 7 Statistik der Überlebensrate über
alle drei Versuche
| | Mean | SD | Min. | Max. | N |
| | [%] | [%] | [%] | [%] | |
| Staphylococcus
aureus | 95.2 | 2.4 | 92.9 | 97.7 | 3 |
| Bacillus
subtilis | 92.0 | 4.5 | 87.9 | 96.8 | 3 |
| Pseudomonas
aeruginosa | 91.7 | 1.2 | 90.5 | 92.9 | 3 |
| Escherichia
coli | 95.1 | 2.3 | 93.0 | 97.6 | 3 |
| Salmonella
abony | 87.0 | 6.2 | 83.1 | 94.1 | 3 |
| Candida
albicans | 2.9 | 4.9 | 0.0 | 8.6 | 3 |
| Aspergillus
niger | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 3 |
Tab. 8 Statistik der Abtötungsrate über
alle drei Versuche
| | Mean | SD | Min. | Max. | N |
| | [%] | [%] | [%] | [%] | |
| Staphylococcus
aureus | 4.8 | 2.4 | 2.3 | 7.1 | 3 |
| Bacillus
subtilis | 8.0 | 4.5 | 3.2 | 12.1 | 3 |
| Pseudomonas
aeruginosa | 8.3 | 1.2 | 7.1 | 9.5 | 3 |
| Escherichia
coli | 4.9 | 2.3 | 2.4 | 7.0 | 3 |
| Salmonella
abony | 13.0 | 6.2 | 5.9 | 16.9 | 3 |
| Candida
albicans | 97.1 | 4.9 | 91.4 | 100.0 | 3 |
| Aspergillus
niger | 100.0 | 0.0 | 100.0 | 100.0 | 3 |
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Tab.
7 zeigt die statistischen Daten der Überlebensrate. Für
Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli und Salmonella abony wurden mehr als 87% überlebende
Mikroorganismen gefunden. Das bedeutet, dass zwischen 87 und 95
Prozent der Mikroorganismen, welche vernebelt wurden, nach der Vernebelung
und der Aufarbeitung des Aerosols noch in der Lage waren sich zu
teilen und zu wachsen. Dies ist ein Zeichen dafür, dass
die Mikroorganismen die Vernebelung überlebt haben.
-
Die
Raten von Candida albicans und Aspergillus niger sind unterhalb
3%. Tab. 8 zeigt die entsprechende Abtötungsrate. Das bedeutet,
dass zwischen 97 und 100 Prozent dieser Mikroorganismen, welche
vernebelt wurden, nach der Vernebelung und der Aufarbeitung des
Aerosols nicht mehr in der Lage waren sich zu teilen und zu wachsen.
Dies ist ein Zeichen dafür, dass die Mikroorganismen die
Vernebelung entweder nicht überlebt haben oder aufgrund
ihrer Größe durch die Filtermechanismen im Respimat® Inhaler zurückgehalten wurden.
-
Die
Ergebnisse der o. g. Versuche zeigen, dass Bakterien in aller Regel
nach ihrer Verwendung und Vernebelung im Respimat® Inhaler
keinen Aktivitätsverlust zeigen.
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Sehr
große Mikroorganismen wie z. B. Hefen und Pilze (Candida
albicans, Aspergillus niger) werden offensichtlich aufgrund ihrer
Größe im Respimat zurückgehalten. Sie
können die Filter des Respimat® Inhalers nicht
passieren.
-
Aufgrund
der hohen Variabilität bei biologischen Untersuchungen
kann davon ausgegangen werden, dass Bakterien bei ihrer Vernebelung
im Respimat® Inhaler praktisch
nicht abgetötet oder durch Filtration zurückgehalten
werden. Die Aerosolisierung von Bakteriensuspensionen im Respimat® Inhaler hat keinen Effekt auf
die Vitalität der Mikroorganismen. Somit können
effizient Bakterien oder Bakterienbestandteile für kurative Zwecke
in die menschliche Lunge transportiert werden.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - EP 1003478 [0006]
- - US 5497944 [0021]
- - WO 97/12687 [0021, 0022, 0024]
- - EP 96/04351 [0022]
- - WO 94/07607 [0025]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - 'Stability
of recombinant consensus interferon to air-jet and ultrasonic nebulisation',
J. Pharm. Sci. 84: 1210–1214 [1995] [0004]
- - Niven et al, Pharm Res. 12: 53–59 [1995] [0004]
- - Wall D.A. und Lanutti, A.T. 'High levels of exopeptidase activity
are present in rat and canine bronchoalveolar lavage fluid'. Int.
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