CN103575718A - 用量子点荧光传感体系测定蛋白喷剂雾化效果的方法 - Google Patents

Abstract

本发明供一种用量子点荧光传感体系测定蛋白喷剂雾化效果的方法。该发明制备了具有良好荧光特性的量子点，通过与蛋白的偶联反应，制备了量子点标记的蛋白，将量子点标记的蛋白替代蛋白进行喷剂雾化实验，通过测定采样管中样品荧光强度，检测被雾化蛋白的浓度，从而测定蛋白喷剂雾化效果的方法。该体系由巯基乙酸修饰的双功能碲化镉量子点、pH7.4的磷酸盐缓冲液缓冲液构成，该方法包括了如下步骤：量子点合成、蛋白与量子点相偶联制备蛋白-量子点复合物、蛋白-量子点复合物纯化，蛋白-量子点复合物荧光体系测定蛋白喷剂雾化效果。该方法具有原理新颖、灵敏度高、合成方法简易、体系构成简单等优点，适用于测定蛋白喷剂雾化效果。

Description

用量子点荧光传感体系测定蛋白喷剂雾化效果的方法

技术领域

本发明是涉及一种用量子点荧光传感体系测定蛋白喷剂雾化效果的方法，属于分析化学领域。

背景技术

喷剂是一种适用于鼻腔给药形式的药物剂型，由于其具有起效快、使用方便、受环境影响小、简便易行等优点，是目前药剂学研究的一个重要方向。随着近几十年生物技术的迅猛发展，大量的蛋白类或多肽类药物已走向实用化，同期研究表明，相当大比例的蛋白或多肽药物可以通过鼻腔给药方式达到治疗目的，因此大量的蛋白或多肽类被研发为喷剂用于鼻腔给药。

由于蛋白质或多肽类药物与传统的小分子化学合成药物相比，具有分子量大，分子空间位阻显著、对机械剪切力等因素较敏感等，因此，研发蛋白类喷剂也有较大技术难度。目前，蛋白喷剂的制备方法需要根据具体药物蛋白的理化特性、生物功能来进行设计，引入抛射剂、凝胶因子、形成脂质体以及制备药物微球等新技术都已被应用于蛋白药物喷剂研发领域，因而开发一种基于蛋白的喷剂剂型，需要进行多种不同成剂方法的尝试。

对于蛋白喷剂效果的评价通常有两种方式，其一是通过直接测定实验动物的相关生理指标；其二是对喷剂的雾化效果进行测定。在这两种方法中，第一种方法多用于成剂方式已基本确定的后期评价验证，而第二种方式则贯穿了剂型研究前期和中期。

目前，对于雾化效果测定的方法多是基于两种原理，即理化特性和生物功能特性来进行设计。理化特性的方法多通过高压液相色谱(HPLC)、BCA(Bicinchonininc acid)吸光光度测定法，而生物功能特性的方法多利用基于免疫反应的ELISA法。在这三种方法中，ELISA法具有最好的检测灵敏度，但由于可识别蛋白的抗体无法完全保证其来源，且ELISA操作过程耗时较长，通常需要4-8hr，因而在雾化效果测定方面存在着一定局限性。HPLC和BCA操作简单，对设备试剂等无特殊要求，因而是目前应用较为广泛的雾化效果测定方法。在这两种方法中，HPLC是通过测定肽键在280nm处的光吸收进行，而BCA法通过测定蛋白在碱性条件下与BCA试剂的显色反应进行，二者相比较，BCA法在检测灵敏度上高于HPLC法，但从实际应用上，这两种方法的检测灵敏度较差，常常不能满足蛋白喷剂雾化效果测定的实际需要。

上世纪末，随着纳米技术的迅猛发展，II-IV族纳米材料量子点(quantumdot，QD)独特材料逐渐被发现，使得量子点被广泛应用于在传感和成像领域。作为一种具有荧光特性的纳米材料，与常规的荧光化学小分子相比，其具有发光强度高、发光位置可调、抗漂白能力强、光谱峰狭窄、斯托克位移(Stock’s shift)大等技术优势，这使得QD在检测灵敏度、抗干扰能力等方面均优于小分子荧光化合物，成为近年来传感领域研究的一个重要方向。

针对目前蛋白喷剂雾化效果测定方法的局限性和QD技术高速发展的新趋势，本发明提出了将QD分子与蛋白相偶联，将偶联后的复合物用于喷剂雾化效果测定的新思路，其检测灵敏度较之BCA法、HPLC法有了明显提高，较之ELISA法具有简单、快速、成本低廉、使用不受限制的技术优势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用QD荧光传感体系测定蛋白喷剂雾化效果的方法；本发明在蛋白喷剂雾化效果评价的设计思想上进行了突破，设计了将QD与蛋白相偶联，制备量子点-蛋白复合物，通过测定采样收集到复合物的QD荧光信号来达到测定蛋白浓度，进而实现对蛋白喷剂雾化效果进行有效评价的荧光传感体系；在实际测定中，对采样获得的量子点-蛋白复合物，同时实用QD荧光传感法和蛋白浓度分析的标准方法BCA法进行平行分析，实验结果表明，利用本发明设计的荧光传感体系在对采样管收集的实际蛋白喷剂样品进行检测，其检测限达到0.81ug/mL，而使用经典BCA法的检测限为25ug/mL，此结果表明，使用本发明设计的传感体系对蛋白喷剂雾化效果的检出能力比BCA法超出30倍可实现对蛋白喷剂雾化效果的高灵敏检测。

本发明提供的用量子点荧光传感体系测定蛋白喷剂雾化效果的方法，该方法步骤如下：第一步，合成荧光CdTe量子点QD，称量CdCl₂溶解于蒸馏水后，加入NaCl，分别再加入巯基乙酸TGA，使得Cd²⁺与TGA的摩尔比为1：1.5～3.0，调整体系离子强度为0.001～0.150mM，使用0.1M的NaOH将溶液pH调节至10.5～11.6，通入N₂30～60min以除氧，然后快速注入新合成碲氢化钠NaHTe前驱体，使Cd²⁺：NaHTe摩尔比例为1：0.25～0.75，溶液于N₂保护下100℃回流4～8hr获得QD，对合成后溶液中存在的沉淀，通过0.45μm的滤膜抽滤去除后，TGA-CdTe QD通N₂保存；第二步，在牛血清白蛋白(BSA)上化学偶联QD分子，制备用于评价喷剂雾化效果的BSA-QD复合物，将不同条件下合成的QD浓度均调整为8×10^-5Mol/L，按BSA：QD：1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物(EDC)为2～10：1：5～100的比例分别与不同Cd²⁺：SH比例合成的QD进行偶联反应，反应后样品利用分子筛分离，除去未参与反应的QD和BSA，偶联反应的温度为16～26℃，反应时间20～480min；第三步，测定蛋白喷剂雾化效果，测定磷酸盐缓冲液PBS体系中QD-BSA的浓度-荧光光度的标准曲线；在采样管中加入0.4mL PBS，在发生管中加入4mL不同浓度的QD-BSA溶液，利用发生器进行蛋白喷剂发生，采样流速为0.05～0.85L/min，采样时间5～15min，采样结束后将采样管中样品吸出，测定荧光，根据标准曲线，计算出对应的蛋白浓度，所使用QD合成时Cd²⁺与TGA的摩尔比为1：1.5～3.0，激发波长350～420nm，扫描范围420～680nm，以波峰处对应发光强度作为采集信号，每个浓度平行测定3份，检测限按3倍空白标准偏差法计算。由于该领域研究内容的敏感性，尚未见类似方法报道，与经典的BCA蛋白浓度测定法相比，此体系检测灵敏限优于BCA法30倍。

本发明中磷酸盐(PBS)缓冲液配制步骤如下：称取27.8g NaH₂PO₄溶于1000mL为A液，称取53.65g Na₂HPO₄·7H₂O溶于1000mL为B液，取19mL A液与81mL B液混合后，稀释到1000mL。

本发明中测定BSA-QD浓度-荧光光度标准曲线的步骤如下：将BSA-QD溶解于PBS中，配成系列浓度，测定荧光信号，获得标准曲线，激发波长350～420nm，扫描范围420～680nm，以波峰处对应发光强度作为采集信号，每个浓度平行测定3份。

本发明的有益效果是：

1、对蛋白喷剂雾化效果的测定，通常采用两种方法，即基于蛋白理化性质的HPLC法和BCA法，以及基于蛋白生物特性的ELISA法，在这两种方法中，前者简单，但检测灵敏度较差，后者虽具有较好的灵敏度，但步骤多、耗时长、所需费用较高，且抗体来源无法保障，，因此这两种原理的方法在测定蛋白喷剂雾化效果均有较明显的技术缺陷，本发明在蛋白喷剂雾化效果测定方面进行了突破，构建了一个基于QD发光的传感体系用于测定蛋白喷剂雾化效果，其原理在于先将蛋白与具有良好发光特性的QD分子相偶联，制备出带有QD标记的QD-蛋白复合物，将QD-蛋白复合物用于喷剂喷剂发生，通过测定QD分子的荧光信号，获得蛋白浓度信息，从而达到测定蛋白喷剂雾化效果的目的；

2、本发明报道的用测定QD发光信号来测定蛋白喷剂的测定方法，有很高的检测灵敏度，以BSA为模型蛋白，其对BSA的检测限达到了0.81ug/mL，优于经典BCA蛋白测定法30倍；

3、由于直接使用蛋白进行喷剂雾化效果测定，避免使用荧光乳胶微球带来的偏差；

4、本发明中QD与蛋白偶联方法反应简单，仅一步反应，反应温和，不会影响蛋白的生物活性，因此具有更好的实用性。

总而言之，该方法具有原理新颖、灵敏度高、偶联方法简单、对蛋白活性无影响等技术优点。

附图说明

图1QD-BSA复合物浓度与荧光强度响应关系图

图中：X轴为QD-BSA复合物浓度，浓度单位为ug/mL；Y轴为荧光强度。

图2QD-BSA复合物浓度与荧光强度响应关系图

图中：X轴为QD-BSA复合物浓度，浓度单位为ug/mL；Y轴为荧光强度。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1：用量子点荧光传感体系测定BSA蛋白喷剂雾化效果

NaHTe前驱体合成：10mL圆底烧瓶通过小针头和橡胶管与密封水相连，将0.2g NaBH₄和0.16g Te粉加入至该密封的烧瓶中，通入N₂后于冰浴下注射3.0mL除氧处理的蒸馏水，反应6hr后，所得澄清液为下一步量子点合成的Te源；

双功能TGA-CdTe量子点合成：称量0.23g CdCl₂溶解于100mL蒸馏水后，加入NaCl，再加入TGA，调整Cd²⁺与TGA之间的摩尔比为1：2.0，使用0.1M的NaOH将溶液pH调节至11.2，通入N₂30min以除氧，然后快速注入新合成碲氢化钠NaHTe前驱体，使Cd²⁺：NaHTe摩尔比例为1：0.5，溶液于N₂保护下100℃回流4hr获得QD，当有沉淀出现，通过0.45μm的滤膜抽滤后，通N₂保存。

称取27.8g NaH₂PO₄溶于1000mL为A液，称取53.65g Na₂HPO₄·7H₂O溶于1000mL为B液，取19mL A液与81mL B液混合后，稀释到1000mL，配制PBS缓冲液。

用PBS将QD浓度稀释为8×10^-5Mol/L，按BSA：QD：EDC＝5：1：100的比例分别与QD进行偶联反应，偶联反应的温度为16～26℃，反应时间20～480min，反应后样品利用分子筛分离，除去未参与反应的QD和BSA，获得QD-BSA复合物。

将BSA-QD溶解于PBS中，配成系列浓度，测定荧光信号，激发波长350～420nm，扫描范围420～680nm，以波峰处对应发光强度作为采集信号，每个浓度平行测定3份，获得BSA-QD复合物浓度与荧光光度之间的标准曲线。

在采样管中加入0.4mL PBS，在发生管中加入4mL不同浓度的QD-BSA溶液，利用发生器进行蛋白喷剂发生，采样流速为0.05L/min，采样时间5～15min，采样结束后将采样管中样品吸出，测定荧光，根据标准曲线，计算出对应的蛋白浓度，激发波长380nm，扫描范围420～680nm，以波峰处对应发光强度作为采集信号，每个浓度平行测定3份，检测限按3倍空白标准偏差法计算，检测限为3.5ug/mL。

Claims (3)

1.一种用量子点荧光传感体系测定蛋白喷剂雾化效果的方法，其特征是该方法步骤如下：第一步，合成荧光CdTe量子点QD，称量CdCl₂溶解于蒸馏水后，加入NaCl，分别再加入巯基乙酸TGA，使得Cd²⁺与TGA的摩尔比为1：1.5～3.0，调整体系离子强度为0.001～0.150mM，使用0.1M的NaOH将溶液pH调节至10.5～11.6，通入N₂30～60min以除氧，然后快速注入新合成碲氢化钠NaHTe前驱体，使Cd²⁺：NaHTe摩尔比例为1：0.25～0.75，溶液于N₂保护下100℃回流4～8hr获得QD，对合成后溶液中存在的沉淀，通过0.45μm的滤膜抽滤去除后，TGA-CdTe QD通N₂保存；第二步，在牛血清白蛋白BSA上化学偶联QD分子，制备用于评价气溶胶释放效果的BSA-QD复合物，将不同条件下合成的QD浓度均调整为8×10^-5Mol/L，按BSA：QD：1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物EDC为2～10：1：5～100的比例分别与不同Cd²⁺：SH比例合成的QD进行偶联反应，反应后样品利用分子筛分离，除去未参与反应的QD和BSA，偶联反应的温度为16～26℃，反应时间20～480min；第三步，测定蛋白喷剂雾化效果，测定磷酸盐缓冲液PBS体系中QD-BSA的浓度-荧光光度的标准曲线；在采样管中加入0.4mL PBS，在发生管中加入4mL不同浓度的QD-BSA溶液，利用发生器进行蛋白气溶胶发生，采样流速为0.05～0.85L/min，采样时间5～15min，采样结束后将采样管中样品吸出，测定荧光，根据标准曲线，计算出对应的蛋白浓度，所使用QD合成时Cd²⁺与TGA的摩尔比为1：1.5～3.0，激发波长350～420nm，扫描范围420～680nm，以波峰处对应发光强度作为采集信号，每个浓度平行测定3份，检测限按3倍空白标准偏差法计算。

2.如权利要求1所述的用量子点荧光传感体系测定蛋白喷剂雾化效果的方法，其特征在于所述的磷酸盐缓冲液配制步骤如下：称取27.8g NaH₂PO₄溶于1000mL为A液，称取53.65g Na₂HPO₄·7H₂O溶于1000mL为B液，取19mL A液与81mL B液混合后，稀释到1000mL。

3.如权利要求1所述的用量子点荧光传感体系测定蛋白喷剂雾化效果的方法，其特征在于所述的测定BSA-QD浓度-荧光光度的标准曲线步骤如下：将BSA-QD溶解于PBS中，配成系列浓度，测定荧光信号，做出标准曲线，激发波长350～420nm，扫描范围420～680nm，以波峰处对应发光强度作为采集信号，每个浓度平行测定3份。

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