CN106872430A - 半胱氨酸荧光检测试剂盒 - Google Patents

半胱氨酸荧光检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种半胱氨酸荧光检测试剂盒,涉及基于纳米氧化铜双酶活性的半胱氨酸荧光检测方法及其试剂盒，本发明利用纳米氧化铜的模拟半胱氨酸氧化酶和过氧化物酶特性，提供了一种快速、简便、超灵敏的半胱氨酸检测新方法。所构建的检测试剂盒荧光背景低，测定选择性和灵敏度高，半胱氨酸检测线性范围为0.625‑100 µmol/L，检测限为6.6 nmol/L。本发明可用于药物及血液样品中半胱氨酸的高灵敏测定。

Description

半胱氨酸荧光检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种基于纳米氧化铜双酶活性，作为模拟半胱氨酸氧化酶和模拟过氧化物酶，测定半胱氨酸的荧光分析方法和检测试剂盒，属于分析化学和纳米技术领域。
背景技术
半胱氨酸是生命体内一种重要的生理活性物质，它作为还原型谷胱甘肽的底物可以增加谷胱甘肽的生成量，从而保护细胞膜的稳定性，减轻心肌细胞在缺血再灌流中的损伤。此外，半胱氨酸还有刺激前T淋巴细胞分化为成熟的淋巴细胞的作用及增加人体对某些毒素的抵抗力。半胱氨酸用途广泛，可用作发酵助剂、抗氧剂和稳定剂等，用于化妆品、食品和药物中，它对于抑制维生素C 褐变极为有效，可作为稳定剂用于25% 抗坏血酸注射液中。因此，对半胱氨酸的研究包括定量分析引起了人们广泛的兴趣。目前，半胱氨酸的定量测定一般是利用其还原性及其与某些有机试剂发生反应后，用电化学、分光光度法、化学发光法、催化动力学分光光度法及荧光方法进行测定。
荧光，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的波长长的出射光；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。近年来由于荧光分析法具有灵敏度高，线性范围宽,分析成本低，设备操作简单以及提供信息量大等优点，已经在分析化学﹑环境科学﹑临床医学等领域吸引了人们的广泛关注。
由于纳米材料比表面积大﹑吸附性强﹑水溶性﹑高活性和高选择性等诸多优点，近年来纳米材料已广泛应用到荧光分析方法中。与纳米技术的结合无疑将为荧光分析法在各种实际分析方面开辟更为广阔的应用前景。
本发明基于纳米氧化铜双酶活性，作为模拟半胱氨酸氧化酶和模拟过氧化物酶，提供一种测定半胱氨酸的荧光分析方法和检测试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的是基于纳米氧化铜双酶活性，作为模拟半胱氨酸氧化酶和模拟过氧化物酶，提供一种测定半胱氨酸的荧光分析方法。
为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案：
本发明所述的测定半胱氨酸的荧光分析方法，其特征是是在EP管中分别加入半胱氨酸溶液、磷酸盐缓冲液、对苯二甲酸、纳米氧化铜，温浴反应后，测定荧光，反应产物最大激发波长和荧光波长分别为315 nm和421 nm，荧光强度与半胱氨酸浓度相关，以测定半胱氨酸。
所使用的纳米氧化铜由以下方法制备而得：取0.02 mol/L的醋酸铜溶液150 mL和0.5 mL冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾；快速加入0.04 g/mL的氢氧化钠溶液10 mL，加完后继续搅拌5分钟，得到黑色氧化铜沉淀；将反应得到的黑色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤三次，减压干燥，得到纳米氧化铜粉体。
所述的一种测定半胱氨酸的荧光分析方法，其特征是将0.5 mL浓度为20 mmol/L的对苯二甲酸，0.5 mL浓度为1.5 mmol/L的半胱氨酸和50 µL浓度为560 mg/L的纳米氧化铜加入到2.95 mL浓度为200 mmol/L 的pH为7的磷酸盐缓冲液中，混合摇匀后置于65 ℃温浴，10分钟后测定其在421 nm处的荧光强度，激发波长为315 nm。
所述的一种测定半胱氨酸的荧光分析方法，其特征是半胱氨酸检测线性范围为0.625-100 µmol/L，检测限为6.6 nmol/L。
本发明所述的测定药品半胱氨酸的荧光分析方法，其特征是取0.06 g药品加入到50 mL蒸馏水中超声溶解，用蒸馏水稀释80倍得到样品溶液；将0.5 mL样品溶液，0.5 mL浓度为20 mmol/L对苯二甲酸和50 µL 浓度为560 mg/L的纳米氧化铜加入到2.95 mL 浓度为200 mmol/L, pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，混合后置于65 ℃水浴中反应10分钟；反应产物用荧光分光光度计测定421 nm处的荧光强度，激发波长为315 nm，根据半胱氨酸的标准曲线计算药品中半胱氨酸含量。
本发明所述的测定血浆半胱氨酸的荧光分析方法，其特征是血浆经超滤得到血浆样品，将0.5 mL浓度为20 mmol/L的对苯二甲酸，0.5 mL血浆样品和50 µL浓度为560 mg/L的纳米氧化铜加入到2.95 mL浓度为200 mmol/L 的pH为7的磷酸盐缓冲液中，混合摇匀后置于65 ℃温浴，10分钟后测定其在421 nm处的荧光强度，激发波长为315 nm，根据半胱氨酸标准曲线计算血浆中半胱氨酸含量。
所使用的纳米氧化铜由以下方法制备而得：取0.02 mol/L的醋酸铜溶液150 mL和0.5 mL冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾；快速加入0.04 g/mL的氢氧化钠溶液10 mL，加完后继续搅拌5分钟，得到黑色氧化铜沉淀；将反应得到的黑色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤三次，减压干燥，得到纳米氧化铜粉体。
本发明优选条件为：
所述的测定半胱氨酸的荧光分析方法，其特征是反应体系的pH 值为7.0。
所述的测定半胱氨酸的荧光分析方法，其特征是反应温度为65℃。
所述的测定半胱氨酸的荧光分析方法，其特征是反应时间为10分钟。
所述的测定半胱氨酸的荧光分析方法，其特征是反应体系的纳米氧化铜浓度为7mg/L。
所述的测定半胱氨酸的荧光分析方法，其特征是反应体系的对苯二甲酸浓度为2.5 mmol/L。
所述的测定半胱氨酸的荧光分析方法，其特征是有以下步骤组成：在EP管中分别加入不同浓度的半胱氨酸，磷酸盐缓冲液、对苯二甲酸、纳米氧化铜，混合液温浴后将反应产物放入荧光分光光度计中检测荧光强度。
所述的测定半胱氨酸的荧光分析方法，其特征是所加入的半胱氨酸的体积为0.5mL；加入的磷酸盐缓冲液体积为2.95 mL，浓度为200 mmol/L，pH为7.0；加入的对苯二甲酸体积为0.5 mL，浓度为20 mmol/L；加入的纳米氧化铜体积为50 µL，浓度为560 mg/L。混合液在65 ℃下温浴10分钟后，测定其在421 nm处的荧光强度（激发波长为315 nm）。
本发明的另一个目的在于提供一种基于纳米氧化铜的半胱氨酸荧光检测试剂盒。试剂盒中包括a液，b液，c液和标准贮备液；a液为纳米氧化铜溶液，b液为磷酸盐缓冲液，c液为对苯二甲酸溶液，标准贮备液为半胱氨酸溶液。
本发明所述的一种半胱氨酸荧光检测试剂盒，其特征是a液浓度为560 mg/L；b液浓度为200 mmol/L、pH=7的磷酸盐缓冲液；c液浓度为20 mmol/L的对苯二甲酸水溶液；标准贮备液为浓度为1 mmol/L的半胱氨酸水溶液。
所述的一种半胱氨酸荧光检测试剂盒的使用方法为：将标准贮备液用双蒸水稀释为0.005、0.05、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L的系列标准溶液，在0.5 mL系列标准溶液中加入50 μL a液，2.95 mL b液和0.5 mL c液，充分混匀后置于65 °C水浴反应10分钟，以315 nm为激发波长，测定在421 nm处的荧光强度值，绘制半胱氨酸标准曲线或计算回归方程；在0.5 mL样品溶液中加入50 μL a液，2.95 mL b液和0.5 mL c液，充分混匀后置于65 °C水浴反应10分钟，以315 nm为激发波长，测定在421 nm处的荧光强度值，根据标准曲线进行定量；半胱氨酸检测线性范围为0.625-100 µmol/L，检测限为6.6 nmol/L。
本发明的技术方案具体步骤如下：
（一）纳米氧化铜的制备：
取醋酸铜溶液和冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾，快速加入氢氧化钠溶液，加完后，继续搅拌后，得到黑色氧化铜。将反应得到的黑色氧化铜立即离心，用无水乙醇洗涤，减压干燥，即得纳米氧化铜粉体。
纳米氧化铜具体制备步骤如下：
（1）取0.02 mol/L的醋酸铜溶液150 mL和0.5 mL冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾；
（2）快速加入0.04 g/mL的氢氧化钠溶液10 mL,加完后继续搅拌5分钟，得到褐色氧化铜沉淀；
（3）将反应得到的黑色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤三次，减压干燥，即得纳米氧化铜粉体。
（二）半胱氨酸荧光分析方法
将0.5 mL浓度为20 mmol/L的对苯二甲酸，0.5 mL半胱氨酸和50 µL浓度为560 mg/L的纳米氧化铜加入到2.95 mL浓度为200 mmol/L、pH=7的磷酸盐缓冲液中，混合摇匀后置于65℃温浴，10分钟后测定在421 nm处的荧光强度，激发波长为315 nm。
为了实现上述试剂盒的目的，本发明采用以下技术方案：
（三）试剂盒组成
a液包括上述技术方案（一）制备的纳米氧化铜加入超纯水超声分散所形成的溶液，其浓度为560 mg/L；b液包括浓度为200 mmol/L、pH=7的磷酸盐缓冲液；c液包括浓度为20mmol/L的对苯二甲酸水溶液；标准贮备液包括浓度为1 mmol/L的半胱氨酸水溶液。
（四）试剂盒使用方法
将技术方案（三）的标准贮备液用双蒸水稀释为0.005、0.05、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L的系列标准溶液，在0.5 mL系列标准溶液中加入50 μL技术方案（三）的a液，2.95 mL技术方案（三）的b液和0.5 mL技术方案（三）的c液，充分混匀后置于65 °C水浴反应10分钟，以315nm为激发波长，测定在421 nm处的荧光强度值，绘制半胱氨酸标准曲线或计算回归方程。在0.5 mL样品溶液中加入50 μL技术方案（三）的a液，2.95 mL技术方案（三）的b液和0.5 mL技术方案（三）的c液，充分混匀后置于65 °C水浴反应10分钟，以315 nm为激发波长，测定在421 nm处的荧光强度值，根据标准曲线进行定量。
本发明的优点：
（1））本发明基于纳米氧化铜双酶活性，作为模拟半胱氨酸氧化酶和模拟过氧化物酶，用于半胱氨酸的检测。
（2）本发明所使用的纳米氧化铜制备过程简单快速。
（3）本发明的检测速度快，可以在20分钟内完成样品的预处理和检测
（4）本发明所构建的试剂盒与检测方法特异性好、灵敏度高，测定半胱氨酸的线性范围为0.625-100 µmol/L，检测限为6.6 nmol/L。可用于药物及血液等样品中半胱氨酸的测定。
附图说明
图1为纳米氧化铜-半胱氨酸-对苯二甲酸体系荧光光谱图。
图2为pH值对纳米氧化铜-半胱氨酸-对苯二甲酸体系荧光的影响图。
图3为纳米氧化铜浓度对纳米氧化铜-半胱氨酸-对苯二甲酸体系荧光的影响图。
图4为对苯二甲酸浓度对纳米氧化铜-半胱氨酸-对苯二甲酸体系荧光的影响图。
图5为纳米氧化铜-半胱氨酸-对苯二甲酸体系测定半胱氨酸的标准曲线图。
具体实施方式
本发明的一个方面在于提供一种基于纳米氧化铜的半胱氨酸荧光检测方法。以下结合附图及若干实施例对本发明检测方法的技术方案作进一步的说明。
实例1：
纳米氧化铜制备：取0.02 mol/L的醋酸铜溶液150 mL和0.5 mL冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾；快速加入0.04 g/mL的氢氧化钠溶液10 mL，加完后继续搅拌5分钟，得到黑色氧化铜沉淀；将反应得到的黑色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤三次，减压干燥，得到纳米氧化铜粉体。
实例2：
将0.5 mL浓度为20 mmol/L的对苯二甲酸，0.5 mL浓度为1.5 mmol/L的半胱氨酸和50µL浓度为560 mg/L的实例1制得的纳米氧化铜加入到2.95 mL浓度为200 mmol/L 的pH为7的磷酸盐缓冲液中，混合摇匀后置于65 ℃温浴，10分钟后测定其在421 nm处的荧光强度（激发波长为315 nm）。如图1所示，纳米氧化铜可显著增强荧光信号强度。
实例3：
将0.5 mL浓度为20 mmol/L的对苯二甲酸，0.5 mL浓度为1.5 mmol/L的半胱氨酸和50µL浓度为560 mg/L的实例1制得的纳米氧化铜加入到2.95 mL浓度为200 mmol/L 的不同pH值的磷酸盐缓冲液中（pH 4-10），混合摇匀后置于65 ℃温浴，10分钟后测定其在421 nm处的荧光强度（激发波长为315 nm）。如图2所示，荧光强度随pH值增大而增大并在pH为6.0-7.0时达到峰值，继续增大pH荧光强度减小。
实例4：
将0.5 mL浓度为20 mmol/L的对苯二甲酸，0.5 mL浓度为1.5 mmol/L的半胱氨酸和50µL不同浓度的实例1制得的纳米氧化铜（0.01-1100 mg/L）加入到2.95 mL浓度为200 mmol/L 的pH为7的磷酸盐缓冲液中，混合摇匀后置于65 ℃温浴，10分钟后测定其在421 nm处的荧光强度（激发波长为315 nm）。如图3所示，荧光强度随混合液中纳米氧化铜浓度增大而增大并在浓度为7 mg/L后达到平台。
实例5：
将0.5 mL不同浓度的对苯二甲酸（0.01-40 mmol/L），0.5 mL浓度为1.5 mmol/L的半胱氨酸和50 µL浓度为560 mg/L的实例1制得的纳米氧化铜加入到2.95 mL浓度为200 mmol/L的pH为7的磷酸盐缓冲液中，混合摇匀后置于65 ℃温浴，10分钟后测定其在421 nm处的荧光强度（激发波长为315 nm）。如图4所示，荧光强度随混合液中对苯二甲酸浓度增大而增大，在终浓度为2.5 mmol/L时，荧光强度达到平台。
实例6：
将0.5 mL浓度为20 mmol/L的对苯二甲酸，0.5 mL不同浓度的半胱氨酸和50 µL浓度为560 mg/L的实例1制得的纳米氧化铜加入到2.95 mL浓度为200 mmol/L 的pH为7的磷酸盐缓冲液中，混合摇匀后置于65 ℃温浴，10分钟后测定其在421 nm处的荧光强度（激发波长为315 nm）。以荧光强度对半胱氨酸浓度作图得到标准曲线。如图5所示，荧光强度与半胱氨酸浓度在0.625~100 µmol/L范围内呈线性关系，检测限为6.6 nmol/L。
实例7：
将0.5 mL浓度为20 mmol/L的对苯二甲酸，0.5 mL浓度为0.6 mmol/L的半胱氨酸和50µL浓度为560 mg/L的实例1制得的纳米氧化铜加入到2.95 mL浓度为200 mmol/L 的pH为7的磷酸盐缓冲液中，混合摇匀后置于65 ℃温浴，10分钟后测定其在421 nm处的荧光强度（激发波长为315 nm）。重复8次，其检测结果的相对标准偏差为1.1%。
实例8：
将0.5 mL浓度为20 mmol/L的对苯二甲酸，50 µL浓度为560 mg/L的实例1制得的纳米氧化铜和0.5 mL不同物质（10 mmol/L 的尿酸或10 mmol/L的柠檬酸或10 mmol/L的草酸或10 mmol/L的谷胱甘肽或10 mmol/L的精氨酸或10 mmol/L的天门冬氨酸或10 mmol/L的甘氨酸或10 mmol/L的组氨酸或10 mmol/L异亮氨酸或10 mmol/L的亮氨酸或10 mmol/L的甲硫氨酸或10 mmol/L苯丙氨酸或10 mmol/L的脯氨酸或10 mmol/L的色氨酸或10 mmol/L的苏氨酸或10 mmol/L的丙氨酸或100 mmol/L的氯化钠或100 mmol/L的葡萄糖或100 mmol/L的麦芽糖或100 mmol/L的乳糖或5mmol/L的果糖或0.01 mmol/L的抗坏血酸）代替L-半胱氨酸加入到2.95 mL浓度为200 mmol/L 的pH为7的磷酸盐缓冲液中，混合摇匀后置于65 ℃温浴，10分钟后测定其在421 nm处的荧光强度（激发波长为315 nm）。与0.8 mmol/L的L-半胱氨酸产生的信号相比，上述干扰物质所产生的信号可忽略不计。
实例9：
半胱氨酸药物的测定：取0.06 g药品加入到50 mL蒸馏水中超声溶解，用蒸馏水稀释80倍得到样品溶液，将0.5 mL浓度为20 mmol/L的对苯二甲酸，0.5 mL药物样品溶液和50 µL浓度为560 mg/L的实例1制得的纳米氧化铜加入到2.95 mL浓度为200 mmol/L 的pH为7的磷酸盐缓冲液中，混合摇匀后置于65 ℃温浴，10分钟后测定其在421 nm处的荧光强度（激发波长为315 nm）。经实施例6所得半胱氨酸标准曲线计算得出药品样品中半胱氨酸含量，此数值与理论值和中国药典中的碘-硫代硫酸钠反滴定法得到的数据一致。样品回收率99.1～115.0%，相对标准偏差0.4-1.3%。
实例10：
血浆中半胱氨酸的测定：血浆经超滤得到血浆样品，将0.5 mL浓度为20 mmol/L的对苯二甲酸，0.5 mL血浆样品和50 µL浓度为560 mg/L的实例1制得的纳米氧化铜加入到2.95mL浓度为200 mmol/L 的pH为7的磷酸盐缓冲液中，混合摇匀后置于65 ℃温浴，10分钟后测定其在421 nm处的荧光强度（激发波长为315 nm）。经实施例6所得半胱氨酸标准曲线计算得出血浆中半胱氨酸含量。
本发明的另一个目的在于提供一种基于纳米氧化铜的半胱氨酸荧光检测试剂盒。试剂盒中包括提供纳米氧化铜溶液（a液），磷酸盐缓冲液（b液），对苯二甲酸溶液（c液），半胱氨酸溶液（标准贮备液）。
实例11：
试剂盒的制备：a液将实例1制备的纳米氧化铜加入超纯水超声分散所形成的溶液，其浓度为560 mg/L；b液为浓度为200 mmol/L、pH=7的磷酸盐缓冲液；c液为浓度为20 mmol/L的对苯二甲酸水溶液；标准贮备液为浓度为1 mmol/L的半胱氨酸水溶液。
实例12：
试剂盒使用方法：将实例11的标准贮备液用双蒸水稀释为0.005、0.05、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L的系列标准溶液，在0.5 mL系列标准溶液中加入50 μL实例11的a液，2.95 mL实例11的b液和0.5 mL实例11的c液，充分混匀后置于65 °C水浴反应10分钟，以315 nm为激发波长，测定在421 nm处的荧光强度值，绘制半胱氨酸标准曲线或计算回归方程。在0.5 mL样品溶液中加入50 μL实例11的a液，2.95 mL实例11的b液和0.5 mL实例11的c液，充分混匀后置于65 °C水浴反应10分钟，以315 nm为激发波长，测定在421 nm处的荧光强度值，根据标准曲线进行定量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种测定半胱氨酸的荧光分析方法，其特征是是在EP管中分别加入半胱氨酸溶液、磷酸盐缓冲液、对苯二甲酸、纳米氧化铜，温浴反应后，测定荧光，反应产物最大激发波长和荧光波长分别为315 nm和421 nm，荧光强度与半胱氨酸浓度相关，以测定半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种测定半胱氨酸的荧光分析方法，其特征是所使用的纳米氧化铜由以下方法制备而得：取0.02 mol/L的醋酸铜溶液150 mL和0.5 mL冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾；快速加入0.04 g/mL的氢氧化钠溶液10 mL，加完后继续搅拌5分钟，得到黑色氧化铜沉淀；将反应得到的黑色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤三次，减压干燥，得到纳米氧化铜粉体。
3.根据权利要求2所述的一种测定半胱氨酸的荧光分析方法，其特征是将0.5 mL浓度为20 mmol/L的对苯二甲酸，0.5 mL浓度为1.5 mmol/L的半胱氨酸和50 µL浓度为560 mg/L的纳米氧化铜加入到2.95 mL浓度为200 mmol/L 的pH为7的磷酸盐缓冲液中，混合摇匀后置于65 ℃温浴，10分钟后测定其在421 nm处的荧光强度，激发波长为315 nm。
4.根据权利要求1或2所述的一种测定半胱氨酸的荧光分析方法，其特征是半胱氨酸检测线性范围为0.625-100 µmol/L，检测限为6.6 nmol/L。
5.一种测定药品半胱氨酸的荧光分析方法，其特征是取0.06 g药品加入到50 mL蒸馏水中超声溶解，用蒸馏水稀释80倍得到样品溶液；将0.5 mL样品溶液，0.5 mL浓度为20mmol/L对苯二甲酸和50 µL 浓度为560 mg/L的纳米氧化铜加入到2.95 mL 浓度为200mmol/L, pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，混合后置于65 ℃水浴中反应10分钟；反应产物用荧光分光光度计测定421 nm处的荧光强度，激发波长为315 nm，根据半胱氨酸的标准曲线计算药品中半胱氨酸含量。
6.一种测定血浆半胱氨酸的荧光分析方法，其特征是血浆经超滤得到血浆样品，将0.5mL浓度为20 mmol/L的对苯二甲酸，0.5 mL血浆样品和50 µL浓度为560 mg/L的纳米氧化铜加入到2.95 mL浓度为200 mmol/L 的pH为7的磷酸盐缓冲液中，混合摇匀后置于65 ℃温浴，10分钟后测定其在421 nm处的荧光强度，激发波长为315 nm，根据半胱氨酸标准曲线计算血浆中半胱氨酸含量。
7.根据权利要求5或6所述的荧光分析方法，其特征是所使用的纳米氧化铜由以下方法制备而得：取0.02 mol/L的醋酸铜溶液150 mL和0.5 mL冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾；快速加入0.04 g/mL的氢氧化钠溶液10 mL，加完后继续搅拌5分钟，得到黑色氧化铜沉淀；将反应得到的黑色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤三次，减压干燥，得到纳米氧化铜粉体。
8.一种半胱氨酸荧光检测试剂盒，其特征是试剂盒中包括a液，b液，c液和标准贮备液；a液为纳米氧化铜溶液，b液为磷酸盐缓冲液，c液为对苯二甲酸溶液，标准贮备液为半胱氨酸溶液。
9.根据权利要求8所述的一种半胱氨酸荧光检测试剂盒，其特征是a液浓度为560 mg/L；b液浓度为200 mmol/L、pH=7的磷酸盐缓冲液；c液浓度为20 mmol/L的对苯二甲酸水溶液；标准贮备液为浓度为1 mmol/L的半胱氨酸水溶液。
10.权利要求8或9所述的一种半胱氨酸荧光检测试剂盒的使用方法为：将标准贮备液用双蒸水稀释为0.005、0.05、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L的系列标准溶液，在0.5 mL系列标准溶液中加入50 μL a液，2.95 mL b液和0.5 mL c液，充分混匀后置于65 °C水浴反应10分钟，以315 nm为激发波长，测定在421 nm处的荧光强度值，绘制半胱氨酸标准曲线或计算回归方程；在0.5 mL样品溶液中加入50 μL a液，2.95 mL b液和0.5 mL c液，充分混匀后置于65 °C水浴反应10分钟，以315 nm为激发波长，测定在421 nm处的荧光强度值，根据标准曲线进行定量；半胱氨酸检测线性范围为0.625-100 µmol/L，检测限为6.6 nmol/L。
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