CN111965149B

CN111965149B - 一种基于金纳米簇光诱导类氧化物酶活性测定总抗氧化能力的方法

Info

Publication number: CN111965149B
Application number: CN202010750721.XA
Authority: CN
Inventors: 逯一中; 倪朋娟; 王波; 陈传霞; 姜媛媛; 张成会
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2020-07-30
Filing date: 2020-07-30
Publication date: 2022-12-09
Anticipated expiration: 2040-07-30
Also published as: CN111965149A

Abstract

本发明公开了一种基于金纳米簇光诱导类氧化物酶活性测定总抗氧化能力（TAC）的方法，以硫胺素作为过氧化物酶底物，加入金纳米簇和待测样品，基于金纳米簇在中性条件下可催化硫胺素氧化实现了总抗氧化能力的荧光测定；若待测样品中存在抗氧化剂，则体系的荧光强度降低。该方法基于光诱导纳米酶在中性条件下实现TAC的荧光检测。该方法操作更为简单、环保，测定结果更为准确，更有利于实际样品中TAC的测定。

Description

一种基于金纳米簇光诱导类氧化物酶活性测定总抗氧化能力的方法

技术领域

本发明属于抗氧化剂检测技术领域，具体涉及一种基于金纳米簇光诱导类氧化物酶活性测定总抗氧化能力的方法。

背景技术

抗氧化剂可通过清除生物体系中过量的活性氧物种，对保护细胞和器官免受氧化应激起到关键作用。许多抗氧化剂被添加到食品、药物和化妆品中，它们的剂量与抗氧化能力密切相关。目前常用总抗氧化能力（TAC）评估抗氧化能力。

纳米酶与天然酶相比具有高稳定性和低成本等优势，在TAC检测领域表现出较大的潜力。但目前报道的大多基于具有类过氧化物酶活性的纳米酶催化过氧化氢氧化显色底物，而抗氧化剂可抑制该显色反应从而利用紫外-可见吸收光谱可实现TAC的测定（Anal.Chem. 2019, 91, 15267-15274）。然而，该催化显色反应需要过氧化氢的参与，且其反应终止需要额外加入酸。而具有类氧化物酶催化活性的光诱导纳米酶无需加入过氧化氢，可直接催化氧气氧化过氧化物酶底物，操作简单、绿色环保。此外，它们还可通过关闭光源终止催化反应，使检测结果更为准确。尽管利用光诱导纳米酶检测抗氧化剂的方法已有报道，但其只考察了谷胱甘肽这一种抗氧化剂的检测性能，没有将该方法用于TAC的检测，且该方法是在酸性条件下检测的（Anal. Chem. 2019, 91, 8170-8175）。

发明内容

针对上述问题，我们以硫胺素（TH）作为过氧化物酶底物，利用具有光诱导类氧化物酶活性的金纳米簇在中性条件下实现了TAC的荧光测定。检测机理如下：金纳米簇在光照条件下具有类氧化物酶活性，可催化氧气氧化TH，生成具有荧光硫色素；而抗氧化剂的加入可抑制该催化反应，从而使检测体系荧光强度降低。基于体系荧光强度随抗氧化剂浓度的变化，可实现抗氧化剂的检测。进一步将该体系用于饮料的TAC测定。

本发明是通过以下技术方案实现的：

以TH作为过氧化物酶底物，加入金纳米簇和待测样品，在中性条件下实现了TAC的荧光测定；待测样品中如果没有抗氧化剂，则检测体系荧光强度不变化；如果待测样品中有抗氧化剂，检测体系荧光强度降低。

一种基于金纳米簇光诱导类氧化物酶活性测定总抗氧化能力的方法，包括以下步骤：

（1）制备金纳米簇；

（2）抗氧化剂的测定：向1.5 mL离心管中依次添加490 μL磷酸盐缓冲液（10 mM，pH= 7.4），10 μL不同浓度的抗氧化剂，100 μL 金纳米簇，10 μL硫胺素和390 μL水，混合均匀后，将离心管置于300 W Xe灯光照2 min后，测试荧光光谱，激发波长为370 nm；利用∆F（抗氧化剂加入前后体系荧光强度的差值）与抗氧化剂的浓度进行线性拟合，得到抗氧化剂的线性范围；

（3）TAC测定：直接用水将饮料稀释到抗氧化剂的线性范围内进行测试。TAC以每升含抗氧化剂的毫摩尔当量表示。

优选地，所述的抗氧化剂为L-抗坏血酸（AA）、谷胱甘肽（GSH）或L-半胱氨酸（Cys）。

优选地，步骤（2）中所述的金纳米簇的浓度为0.1 mM，磷酸盐缓冲液的浓度为10mM、pH 为 7.4，硫胺素的浓度为60 mM。

优选地，所述的抗氧化剂为L-抗坏血酸时，加入的浓度为3-250 μM；所述的抗氧化剂为谷胱甘肽时，浓度为1-500μM；所述的抗氧化剂为L-半胱氨酸时，浓度为1-250μM。

优选地，步骤（2）中所述的Xe灯的波长λ≥420nm。

优选地，步骤（1）中金纳米簇的制备方法为：将15 mL水加入到圆底烧瓶中，接着向烧瓶中加入0.75 g的牛血清蛋白，溶解后将烧瓶置于37℃油浴锅内；在搅拌的情况下加入15 mL的10 mM氯金酸；2 min后加入1.5 mL 1 M的 NaOH并在37 ℃继续搅拌12 h，得到金纳米簇。最终将所得到的的金纳米簇透析24 h，将其稀释至0.1 mM，置于4 ℃冰箱备用。利用透射电子显微镜、紫外-可见吸收光谱、荧光激发和发射光谱表征所制备的金纳米簇。

有益效果

（1）该方法采用光诱导纳米酶，无需使用过氧化氢，更加环保，操作更为简单。（2）该方法可通过关闭光源终止催化反应，使检测结果更为准确。（3）该方法可在中性条件下实现TAC的测定，更有利于实际样品检测。

附图说明

图1 （A）金纳米簇的透射电子显微镜图；（B）金纳米簇的紫外-可见吸收光谱及荧光激发（Ex）和发射（Em）光谱；

图2 （A）向金纳米簇-TH体系加入不同浓度AA后的荧光光谱图，从上到下AA的浓度依次为0、3、8、10、20、30、40、50、80、100、150、200、250 μM；（B）∆F与AA浓度间的关系；（C）∆F与AA浓度间的线性关系关系；（D）检测体系抗干扰能力测试；

图3（A）向金纳米簇-TH体系加入不同浓度GSH时的荧光光谱图，从上到下GSH的浓度依次为0、1、3、5、7、10、20、30、40、50、70、100、200、300、400、500 μM；（B）∆F与GSH浓度间的关系。插图为∆F与GSH浓度间的线性关系关系；（C）金纳米簇体系加入不同浓度Cys时的荧光光谱图，从上到下Cys的浓度依次为0、1、3、5、10、15、20、25、30、40、50、100、150、200、250 μM；（D）∆F与Cys浓度间的关系。插图为∆F与Cys浓度间的线性关系关系；

图4 三种饮料TAC含量的测定。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

（1）金纳米簇的制备及表征：将15 mL水加入到圆底烧瓶中，接着向烧瓶中加入0.75 g的牛血清蛋白，溶解后将烧瓶置于37 ℃油浴锅内；在搅拌的情况下加入15 mL氯金酸（10 mM）；2 min后加入1.5 mL NaOH（1 M）并在37 ℃继续搅拌12 h；最终将所得到的的金纳米簇透析24 h，将其稀释至0.1 mM，置于4 ℃冰箱备用。利用透射电子显微镜、紫外-可见吸收光谱、荧光激发和发射光谱表征所制备的金纳米簇。从图1（A）金纳米簇透射电子显微镜表征结果可看出其粒径大小为1.5 nm。图1（B）金纳米簇在275 nm处有较强的紫外-可见吸收峰，而没有金纳米颗粒的特征性的表面等离子共振峰，表面形成的是纳米团簇而不是纳米颗粒。在385 nm激发时，金纳米簇在660 nm处有发射峰，这与之前报道的一致。上述实验结果表明我们成功制备了金纳米簇。

（2）抗氧化剂的测定：向1.5 mL离心管中依次添加490 μL磷酸盐缓冲液（10 mM，pH= 7.4），10 μL不同浓度的抗氧化剂（如AA、GSH、Cys），100 μL 金纳米簇（0.1 mM），10 μL硫胺素（60 mM）和390 μL水，混合均匀后，将离心管置于300 W Xe灯（λ≥420nm）光照2 min后，测试荧光光谱，激发波长为370 nm。利用∆F与抗氧化剂的浓度进行线性拟合，得到AA的线性范围为：3-50 μM，检出限为0.4 μM。GSH的线性范围为：1-40 μM，检出限为0.96 μM。Cys的线性范围为：1-20 μM，检出限为0.6 μM。我们测定了常见的离子和生物分子对检测体系的影响，研究表明这些物质加入后对体系荧光强度不会产生影响，证明该方法选择性较好。图2为（A）向金纳米簇-TH体系加入不同浓度AA后的荧光光谱图，从上到下AA的浓度依次为0、3、8、10、20、30、40、50、80、100、150、200、250 μM。（B）∆F与AA浓度间的关系。（C）∆F与AA浓度间的线性关系关系。（D）检测体系抗干扰能力测试。

图3为（A）向金纳米簇-TH体系加入不同浓度GSH时的荧光光谱图，从上到下GSH的浓度依次为0、1、3、5、7、10、20、30、40、50、70、100、200、300、400、500 μM。（B）∆F与GSH浓度间的关系。插图为∆F与GSH浓度间的线性关系关系。（C）金纳米簇-TH体系加入不同浓度Cys时的荧光光谱图，从上到下Cys的浓度依次为0、1、3、5、10、15、20、25、30、40、50、100、150、200、250 μM。（D）∆F与Cys浓度间的关系。插图为∆F与Cys浓度间的线性关系关系。

（3）TAC测定：我们测定了3种饮料的TAC。直接用水将饮料稀释到AA的线性范围内进行测试。TAC以每升含AA的毫摩尔当量表示。具体测试方法如同AA的检测。图4 三种饮料TAC含量的测定含量图。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种基于金纳米簇光诱导类氧化物酶活性测定TAC的方法，其特征在于，以硫胺素作为过氧化物酶底物，加入金纳米簇和待测样品，可在中性条件下实现TAC的荧光测定，TAC为总抗氧化能力；金纳米簇催化硫胺素氧化生成荧光的硫色素，若待测样品中有抗氧化剂，则检测体系荧光强度降低；待测样品中有抗氧化剂，测试抗氧化剂的含量，包括以下步骤：

（1）制备金纳米簇；

（2）抗氧化剂的测定：向1.5 mL离心管中依次添加490 μL磷酸盐缓冲液，10 μL不同浓度的抗氧化剂，100 μL 金纳米簇，10 μL硫胺素和390 μL水，混合均匀后，将离心管置于300W Xe灯λ≥420nm光照2 min后，测试荧光光谱，激发波长为370 nm；利用∆F与抗氧化剂的浓度进行线性拟合，得到抗氧化剂的线性范围；∆F为抗氧化剂加入前后体系荧光强度的差值；

（3）TAC测定：直接用水将饮料稀释到抗氧化剂的线性范围内进行测试。

2.根据权利要求1所述的一种基于金纳米簇光诱导类氧化物酶活性测定TAC的方法，其特征在于，所述的抗氧化剂为L-抗坏血酸、谷胱甘肽或L-半胱氨酸。

3.根据权利要求1所述的一种基于金纳米簇光诱导类氧化物酶活性测定TAC的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的金纳米簇的浓度为0.1 mM，磷酸盐缓冲液的浓度为10 mM、pH为 7.4，硫胺素的浓度为60 mM。

4.根据权利要求2所述的一种基于金纳米簇光诱导类氧化物酶活性测定TAC的方法，其特征在于，所述的抗氧化剂为L-抗坏血酸时，加入的浓度为3-250 μM；所述的抗氧化剂为谷胱甘肽时，浓度为1-500μM；所述的抗氧化剂为L-半胱氨酸时，浓度为1-250 μM。

5.根据权利要求1所述的一种基于金纳米簇光诱导类氧化物酶活性测定TAC的方法，其特征在于，步骤（1）中金纳米簇的制备方法为：将15 mL水加入到圆底烧瓶中，接着向烧瓶中加入0.75 g的牛血清蛋白，溶解后将烧瓶置于37 ℃油浴锅内；在搅拌的情况下加入15 mL的10 mM氯金酸；2 min后加入1.5 mL，1 M的 NaOH并在37 ℃继续搅拌12 h，得到金纳米簇。