CZ2000428A3 - Vodný aerosolový prostředek pro inhalaci - Google Patents

Abstract

Řešení se týká vodného aerosolového prostředku, který jako účinnou složku obsahuje biologicky účinné makromolekuly, prostředekje určen k rozprašování pomocí rozprašovačů bez hnacího plynu. Popsán je rovněž způsob přípravy aerosolu z popsaného aerosolového prostředku a použití příslušných roztoků pro tvorbu aerosolu s vhodnou velikostí kapiček pro inhalaci

Description

Vodný aerosolový prostředek pro inhalací

Oblast techniky

Vynález se týká vodného aerosolového prostředku, určeného pro podávání inhalací, zejména pro podávání bílkovin a dalších účinných makromolekul. Zejména jde o vysoce koncentrované vodné prostředky pro podávání insulinu při léčení cukrovky.

o Dosavadní stav techniky

Podávání účinných látek ve formě aerosolů, určených pro inhalaci je již dlouho známé. Tyto aerosoly neslouží pouze k léčení chorob dýchacích cest, například asthmatu, nýbrž se používají také v případě, že sliznice dýchacích cest nebo nosní sliznice má sloužit jako resorpční orgán. Často je možno dosáhnout tak vysoké koncentrace účinné látky v krevním oběhu, že je možno tímto způsobem léčit také onemocnění jiných oblastí organismu. Mimoto mohou být aerosolové prostředky, podávané inhalací, využity jako

2q očkovací látky.

Při výrobě aerosolů se užívá řada postupů. Je možno rozprašovat suspenze nebo roztoky účinných látek pomocí hnacích plynů nebo je možno rozptýlit mikronizovaný práškový materiál do vdechovaného vzduchu nebo je možno k vytvoření aerosolu použít ²5 rozprašovače.

V případě složitých molekul, například v případě interferonů, však může při rozprašování vodných roztoků snadno dojít k nežádoucímu snížení účinnosti v důsledku střihového namáhání a

3Q zahřátí. Vytvářejí se pravděpodobně agregáty bílkovin s nižší účinností, jak se uvádí v publikaci A.Y. lp a další, Stability of recombinant consensus interferon to air-jet and ultrasonic nebulisation, J. Pharm. Sci., 84:1210-1214 (1995). V této publikaci jsou také uvedeny příklady vzniku agregátů interferonů po jeho rozprášení pomocí trysky nebo pomocí ultrazvuku a tím i příklady ztráty biologické účinnosti interferonu. I v případě, že nedojde k úplnému rozrušení biologicky účinné makromolekuly, je popsané snížení účinnosti významné, protože je příčinou zvýšené spotřeby účinné látky, která může být velmi drahá a mimoto může dojít také k nepřesnému dávkování, které není reprodukovatelné pro každé použití rozprašovače. Toto snížení účinnosti molekul se složitou stavbou v průběhu tvorby aerosolu není omezeno pouze na interferony, nýbrž k němu dochází v menší nebo větší míře také v případě tvorby aerosolu z roztoku jiných bílkovin a biologicky účinných molekul, jak bylo popsáno například v publikaci Niven a další, Pharm. Res. 12:53-59 (1995).

Kromě technického vytvoření aerosolu s obsahem biologicky účinných molekul je ve druhém stupni ještě nezbytné, aby se biologicky účinná molekula vstřebávala v plicích. Plíce dospělého člověka nabízejí velkou vstřebávací plochu, existuje však také řada omezení pro vstřebávání biologicky účinných molekul v plicích. Po vdechnutí nosem nebo ústy se vzduch spolu s vdechnutým aerosolem dostává do průdušnice a pak do průdušek a menších průdušinek a do plicních alveoiů. Alveoly mají daleko větší plochu než průdušnice, průdušky a průdušinky dohromady. Jsou hlavní oblastí pro vstřebávání, a to nejen kyslíku, nýbrž i biologicky účinných makromolekul. Aby se molekuly dostaly ze vzduchu do krevního oběhu, musí překonal epithel alveoiů, endothel kapilár a intersticiální prostor s obsahem lymfy mezi těmito dvěma vrstvami buněk. K tomu může dojít pasivním nebo aktivním transportem. Buňky v těchto dvou vrstvách leží těsně na sobě, takže větší biologické makromolekuly, například bílkoviny, tímto prostorem pronikají dlaeko pomaleji než menší molekuly. Mimoto průnik endothelem alveoiů a endothelem kapilár probíhá v konkurenci s ostatními biologickými pochody, které mohou vést k rozrušení biologické molekuly. BHronchoalveolární kapalina obsahuje exoproteázy (např. podle Wall D.A. a Lanutti A.T., High levels of exopeptidase activity are present in rat and canine • · bronchoalveolar lavage fluid. Int. J. Pharm. 97:171-181 (1993)). Kapalina také obsahuje makrofágy, které mohou odstranit vdechnuté částice bílkoviny fagocytozou. Tyto makrofágy migrují k bázi bronchiálního stromu a tam jsou pomocí řasinek odstraněny z plic.

Mohou pak migrovat do lymfatických cest. Mimoto může být fysiologie alveolárních makrofágů ovlivněna bílkovinou v aerosolu, například mohou být makrofágy aktivovány působením interferonu. Migrace aktivovaných makrofágů představuje další mechanismus pro dosažení systemíckého účinku vdechnutých bílkovin. Ze složitosti těchto pochodů je zřejmé, že výsledky, které byly získány při použití jednoho typu bílkoviny je jen omezeně možno vztahovat na jiný typ bílkoviny. I malé rozdíly mezi jednotlivými interferony mohou například způsobit podstatné rozdíly v jejich možné degradaci v plicích (podle Bocci a další, Pulmonary catabolism of interferons: alveolar absorption of ¹²⁵l-labelled human interferon alpha is accompanied by partial loss of biological activity, Antiviral Research 4:211-220 (1984).

Bílkoviny a jiné biologické makromolekuly mohou tedy být zásadně podávány rozprašováním, toto rozprašování však zpravidla vede ke snížení účinnosti. Vynález si klade za úkol navrhnout způsob výroby inhalovatelných aerosolů tak, aby nedocházelo k podstatným ztrátám účinnosti biologických makromolekul.

V US 5 497 944 je popsána nová generace rozprašovačů. Podstatná výhoda těchto rozprašovačů spočívá v tom, že se v nich dosahuje rozprašování bez použití hnacích prostředků a zvláště bez použití fluorovaných a chlorovaných uhlovodíků.

Zlepšený typ těchto rozprašovačů byl popsán v patentové přihlášce PCT/EP 96/04351, WO 97/12687. Jde zvláště o provedení, které je znázorněno na obr. 6 (Respimat^R) a o příslušný popis tohoto O u provedení v textu přihlášky. Tento typ rozprašovače je možno s výhodou použít ke tvorbě inhalovatelného aerosolu biologicky účinných makromolekul. Zvláště vhodné je použití tohoto tápu rozprašovače k inhalačnímu podávání insulinu. Vzhledem ke své • · · · · 9 9 vhodné velikosti může mít nemocný tento rozprašovač vždy s sebou. Při použití tohoto typu rozprašovače dochází k rozprášení definovaného objemu roztoku účinné látky (s výhodou 15 mikrolitrů) při použití vysokého tlaku pomocí malé trysky za vzniku inhalovatelného aerosolu se středním průměrem částic 3 až 10 mikrometrů. Pro inhalační aplikaci insulinu jsou vhodné rozprašovače, které mohou rozprášit při jednom použití 10 až 50 mikrolitrů aerosolu na inhalovatelné kapičky.

Při přípravě aerosolů podle vynálezu má tedy velký význam použití rozprašovačů, popsaných ve svrchu uvedených dokumentech a určených k rozprašování roztoků s obsahem bílkovin nebo jiných biologicky účinných makromolekul.

Použitý typ rozprašovače (velikost přibližně 10 cm) v 15 podstatě sestává z horní části krytu, těla čerpadla, trysky, uzavíracího a napínacího prvku, krytu pružiny, pružiny a zásobníku, přičemž

- tělo čerpadla, upevněné v horní části krytu je na jednom svém konci opatřeno tělem trysky s tryskou nebo tryskovým ₂₀ uspořádáním,

- rozprašovač obsahuje dutý píst s tělem ventilu,

- dále obsahuje výstupní přírubu v horní části krytu, v níž je upevněn dutý píst,

- uzavírací a napínací prvek v horní části krytu,

- kryt přužiny s pružinou, uložený v horní části krytu pomocí otočného ložiska a

- spodní část krytu, nasazenou v axiálním směru na kryt 30 pružiny.

Dutý píst s tělesem ventilu odpovídá provedení podle WO 97/12687. Částečně vyčnívá do válce těla čerpadla a je v něm upraven axiálně posuvně. Toto provedení je znázorněno na obr. 1 až • · • · · 0 0 0 0 • · · 0 · ·· 0

0*00000 00 · 0 0 0 0 0 0 0 a zvláště na obr. 3 a popsáno v příslušných odstavcích přihlášky. Dutý píst s tělem ventilu vykonává při uvedení rozprašovače do činnosti pomocí pružiny na své vysokotlaké straně tlak až 60 MPa, s výhodou 10 až 60 MPa, jímž dojde k uvolnění příslušného množství roztoku účinné látky.

Tělo ventilu je s výhodou upraveno na konci dutého pístu, přivráceném k tělu trysky.

Tryska je v těle trysky s výhodou mikrostrukturována, tzn.

vyrobená mikrotechnikou. Tyto typy trysek jsou popsány ve WO 94/07607.

Tělo trysky je tvořeno například dvěma pevně spojenými deskami ze skla a/nebo křemíku, z nichž alespoň jedna obsahuje jeden nebo větší počet míkrostrukturovaných kanálků, spojujících

I o vstupní a výstupní stranu trysky. Na výstupní straně je upraven alespoň jeden okrouhlý nebo neokrouhlý otvor, jehož velikost je nejvýš 10 mikrometrů.

Paprsky kapaliny mohou z trysky vystupovat stejným směrem nebo mohou být vzájemně odchýleny. V případě těla trysky s alespoň dvěma otvory na výstupní straně mohou paprsky kapaliny vzájemně svírat úhel 20 až 160 °, s výhodou 60 až 150 °. Tímto způsobem se roztok dostává z trysky do okolního prostředí.

Uzavírací a napínací prvek obsahuje pružinu, s výhodou válcovou spirálovou tlačnou pružinu jako zásobník mechanické energie. Pružina působí na výstupní přírubu jako prvek, jehož pohyb je určován polohou uzavíracího členu. Možnost pohybu výstupní příruby je přesně omezena horní a dolní zarážkou. K napínání pružiny ₃Q dochází pomocí převodu, například šroubového převodu působením momentu otáčení, vznikajícího při otáčení horní části krytu proti krytu pružiny ve spodní části krytu.

Uzavírací člen s uzavíracími plochami je upraven jao prstenec na výstupní přírubě. Je tvořen například elastickým, radiálně tvárným prstencem z plastu nebo kovu. Prstenec je uložen v rovině, kolmé na ose rozprašování. Po stlačení pružiny se uzavírací plochy uzavíracího členu v dráze výstupní příruby posunou a brání uvolnění pružiny. Uzavírací člen je ovládán pomocí tlačítka, které je s ním spojeno. Tlačítko je možno posunout rovnoběžně s rovinou, v níž je prstenec uložen, s výhodou směrem dovnitř do rozprašovače, čímž dojde k deformaci prstence. Konstrukční podrobnosti jsou uvedeny v patentové přihlášce WO 97/20590.

Spodní část krytu se nasouvá axiálně přes kryt pružiny a je v ní uložen pohon vřetena a zásobník pro kapalinu.

Při uvedení rozprašovače do činnosti se otáčí horní část 15 krytu proti dolní části krytu, v níž je uložen kryt pružiny. Tím dojde ke stlačení pružiny a jejímu uzavření ve stlačené poloze. Úhel otáčení je s výhodou celý podíl 360 °, například 180 °. Současně dochází k posunu výstupní příruby v horní části krytu a dutý píst je zatažen do válce krytu čerpadla, čímž se nasaje určité množství kapaliny ze zásobního do prostoru před tryskou, který je při rozprašování vystaven vysokému tlaku.

Do rozprašovače je popřípadě možno zasunovat různé zásobníky s kapalinami, určenými k rozprášení, zejména jde o vodný ₂₅ aerosolový prostředek podle vynálezu.

Rozprašování se zahájí lehkým stlačením tlačítka, čímž dojde k uvolnění pružiny, která posune píst do válce krytu čerpadla. Tím dojde k výstupu kapaliny z trysky rozprašovače v rozprášené formě. Další konstrukční podrobnosti jsou uvedeny v PCT patentových přihláškách WO 97/12683 a WO 97/20590.

Stavební prvky rozprašovače jsou vyrobeny z materiálů, vhodných pro příslušnou funkci. Kryt rozprašovače a popřípadě další části jsou s výhodou vyrobeny z plastu, například odléváním • · vstřikováním. Pro farmaceutické účely je nutno užít fysiologicky neškodné materiály.

Rozprašovač, popsaný v patentové přihlášce WO 97/12687 je možno použít pro tvorbu aerosolů pro léčebné účely bez použití hnacích plynů. Při použití tohoto rozprašovače je možno dosáhnout středního průměru kapiček aerosolu přibližně 5 mikrometrů.

Na obr. 4a a 4b, které jsou totožné s obr. 6a a 6b patentové přihlášky WO 97/12687 je znázorněn rozprašovač Respimat^R, s jehož pomocí může být vodný aerosolový prostředek podle vynálezu aplikován inhalací.

Na obr. 4a je znázorněn podélný řez rozprašovačem při stlačené pružině, na obr. 4b je znázorněn v podélném řezu tentýž rozprašovač s uvolněnou pružinou.

V horní části 51 krytu je uložen kryt 52 čerpadla, na jehož konci je upevněn přídržný prvek 53 pro rozprašovací trysku, v němž je uloženo tělo 54 trysky a filtr 55.. Dutý píst 57. upevněný ve výstupní přírubě 56 uzavíracího a napínacího prvku částečně vyčnívá do válce krytu 52 čerpadla. Na svém konci nese dutý píst 57 tělo ventilu 58. Dutý píst 57 je mimoto opatřen těsněním 59. Uvnitř horní části 51 krytu je upravena zarážka 60 na níž leží výstupní příruba 56 při uvolněné pružině. Na výstupní přírubě 56 je upravena druhá zarážka 61, na níž leží výstupní příruba 56 při stlačené pružině. Po stlačení pružiny se uzavírací člen 62 posune mezi druhou zarážkou 61 a opěrným výstupkem 63 v horní části 51 krytu. Tlačítko 64 je spojeno s uzavíracím členem 62. Horní část 51 krytu končí náústkem 65 a je uzavřena ochranným krytem 66.

Kryt 67 pružiny s tlačnou pružinou 68 je pomocí západky 69 a otočného ložiska otočně uložen v horní části 51 krytu. Přes kryt 67 pružiny je nasazena spodní část 70 krytu. V krytu 67 pružiny je uložen výměnný zásobník 71 pro rozprašovanou kapalinu 72, který je uzavřen uzávěrem 73. jímž vyčnívá dutý píst 57 do zásobníku 71 pro kapalinu a je svým koncem ponořen do roztoku účinné látky v zásobníku 71 .

V plášti krytu 67 pružiny je uloženo vřeteno 74 pro mechanické počitadlo. Na konci vřetena, přivráceném k horní části 51 krytu je uložen hnací pastorek 75. s jezdcem 76.

Popsaný rozprašovač je vhodný pro použití k podávání vodného aerosolového prostředku podle vynálezu pomocí inhalace po jeho rozprášení.

¹⁰

Účinnost rozprašovače je možnou podrobit zkouškám in vitro tak, že se rozpráší roztok s obsahem bílkoviny a rozprášený materiál se zachytí v komůrce (obr. 1). Účinnost roztoku v zásobníku rozprašovače (a) se pak srovnává s účinností zachyceného materiálu (b) například imunologicky nebo zkouškou na biologickou účinnost bílkoviny. Tímto pokusem je možno prokázat stupeň rozrušení bílkoviny při rozprašování. Dalším parametrem kvality aerosolu je tak zvaný inhalovatelný podíl, za který se považuje podíl kapiček aerosolu s měrným středním aerodynamickým průměrem (MMAD)

2q menším než 5 mikrometrů. Tento inhalovatelný podíl je možno měřit pomocí Andersenova Impaktoru. Pro dobré vstřebávání bílkoviny je důležité nejen dosáhnout rozprášení bez podstatnějších ztrát účinnosti, nýbrž také vytvořit aerosol s dostatečným inhalovatelným podílem (alespoň 60 %). Aerosoly, které mají hodnotu MMAD nižší než 5,8 mikrometrů se podstatně lépe dostávají až do alveolů, kde je jejich šance na vstřebání podstatně vyšší. Účinnost rozprašovače je možno měřit také zkouškami in vivo, při nichž se mohou projevit ještě další faktory, například odolnost proti působení plicních proteáz. Jako příklad systému in vivo pro tyto zkoušky je možno uvést podávání rozprášeného materiálu s obsahem bílkoviny psům pomocí

O v tracheálního tubusu. Ve vhodných časových intervalech se pak odebírají krevní vzorky a koncentrace bílkoviny v plasmě se prokazuje imunologickými nebo biologickými metodami.

·· · ·4 · • · · · · * ♦ • · · · · · • · · · ····· • · · · · ···· ··· ·* ·

Vhodné rozprašovače byly popsány v US patentovém spisu č. 5 497 944 a v patentové řpihlášce WO 97/12687, zejména na obr. 6a a 6b (obr. 4a a 4b v této přihlášce). Výhodné uspořádání trysky pro rozprašování vodného aerosolového prostředku s obsahem biologicky účinných makromolekul podle vynálezu je zobrazeno na obr. 8 uvedeného US patentového spisu.

Neočekávaně bylo zjištěno, že svrchu popsaný rozprašovač bez hnacího plynu, schopný rozprašovat předem určené množství například 15 mikrolitrů aerosolového prostředku pod vysokým tlakem 10 až 50 MPa alespoň jednou tryskou s hydraulickým průměrem 1 až 12 mikrometrů tak, že vznikají inhalovatelné kapičky se středním průměrem částic menším než 10 mikrometrů je velmi vhodný pro rozprašování kapalných aerosolových prostředků s obsahem bílkovin nebo jiných makromolekul, přičemž širokou škálu bílkovin je možno rozprašovat bez podstatnější ztráty jejich účinnosti. Jak již bylo uvedeno, výhodné je zejména uspořádání trysky,, zobrazené na obr. 8 uvedeného US patentového spisu.

Zvláště překvapující je v případě tohoto typu rozprašovače možnost rozprašovat interferony které je jinak možno rozprášit pouze při podstatné ztrátě jejich účinnosti. Mimoto je překvapující zejména vysoká účinnost interferonu omega po rozprášení tímto způsobem, a to nejen in vitro, nýbrž také in vivo.

2^ Další výhodou uvedeného postupu je překvapující skutečnost, že je možno rozprašovat také vysoce koncentrované roztoky biologicky účinných makromolekul bez podstatných ztrát jejich účinnosti. Při použití vysoce koncentrovaných roztoků je možno použít rozprašovače, které jsou dostatečně malé pro pohodlné stálé nošení ₃θ v kapse nebo v kabelce. Rozprašovač, znázorněný na obr. 4 splňuje tyto požadavky a umožňuje rozprašování vysoce koncentrovaných roztoků biologicky účinných molekul.

• · · · · · · « · · · · · · · ·· ······· · · · • · 4 · · · · ·« · ·· ·♦

Uvedené rozprašovače jsou zvláště vhodné například pro inhalační podání insulinu diabetikům. K tomuto účelu se s výhodou používají vysoce koncentrované roztoky, obsahující insulin v množství 20 až 90 mg/ml, s výhodou 30 až 60 mg/ml a zvláště 33 až 40 mg/ml.

Podle velikosti zásobníku rozprašovače je možno použít insulinový roztok, obsahující více než 25 mg/ml, s výhodou více než 30 mg/ml této látky, aby bylo inhalací možno podat účinnou dávku insulinu. Inhalační podání insulinu umožňuje rychlý nástup účinku, takže si nemocný sám může aplikovat potřebnou dávku krátce před jídlem.

Malá velikost rozprašovače, zejména typu Respimat^R umožňuje, aby nemocný měl rozprašovač stále u sebe.

Respimat^R je opatřen komorou trysky se stálým objemem, která umožňuje nemocnému stanovit a inhalovat potřebnou dávku insulinu počtem stlačení tlačítka. . Kromě počtu stlačení tlačítka je dávka insulinu závislá na koncentraci roztoku insulinu v zásobníku rozprašovače. Tato koncentrace se může pohybovat například v rozmezí 25 až 90 mg/ml, s výhodou se užívá vyšší koncentrace než přibližně 30 mg/ml.

Způsoby výroby vysoce koncentrovaných stálých roztoků insulinu byly popsány například v mezinárodních patentových přihláškách WO 83/00288 (PCT/DK 82/00068) a WO 83/03054 (PCT/DK 83/00024).

__ Aerosolové prostředky podle vynálezu s obsahem insulinu, které mohou být aplikovány s použitím popsaného rozprašovače, by měly mít dynamickou viskositu nejvýš 1600 . 10'⁶ Pa . s, tak aby inhalovatelný podíl vzniklého aerosolu neklesl pod přijatelnou hodnotu. Výhodné jsou roztoky insulinu, které mají hraniční viskositu až 1200 . 10'⁸ a zvláště až 1100 . 10 ⁶ Pa.s. V případě potřeby je

O v možno místo vody použít směs rozpouštědel k dosažení poklesu viskosity roztoku účinné látky. Je například možno přidávat ethanol. Podíl ethanolu ve vodném prostředku může být až 50 %, výhodné je množství ethanolu 30 %.

9 9

9999

99

9 9 9 ·9 9 • 9 9 9

9 9 9

99

S výhodou má tedy aerosolový prostředek viskositu nejvýš 1600 . 10‘⁶ Pa.s., přičemž zvláště výhodné je rozmezí viskosity prostředku 900 až 1100 . 10'⁶ Pa.s.

Vynález si dále klade za úkol navrhnout vhodný aerosolový prostředek pro použití ve svrchu uvedeném způsobu.

Podstatu vynálezu tedy tvoří také aerosolové prostředky ve formě vodného roztoku, které jako účinnou složku obsahují biologicky účinné makromolekuly, zvláště bílkoviny nebo peptidy v množství 3 mg/ml až 100 mg/ml, s výhodou 25 mg/ml až 100 mg/ml.

Neočekávaně bylo zjištěno, že způsobem podle vynálezu je možno rozprašovat také roztoky makromolekul s vysokou viskositou na inhalovatelné kapičky vhodné velikosti. Tím se umožní aplikace většího množství účinné látky při jednom podání a rovněž se zvyšuje I o therapeutická účinnost makromoiekuí při podání inhalací.

Při provádění způsobu podle vynálezu je možno použít vodné aerosolové prostředky s obsahem makromolekul, například albuminu až do viskosity 1600 . 10'⁶ Pa.s, měřeno při 25 °C. Při viskositě 1500 . 10'⁶ Pa.s je možno ještě dosáhnout inhalovatelného podílu prostředku 32 %.

Výhodné jsou roztoky makromolekul s vyšší viskositou, dosahující až 1100 . 10'⁶ Pa.s. Při použití takových roztoků je možno dosáhnout inhalovatelného podílu kapek s obsahem účinné látky až 60 %. Uváděna hraniční viskosita byla měřena Ostwaldovým viskosimetrem běžným způsobem. Pro srovnání je možno uvést, že viskosita vody je 894 . 10'⁶ Pa.s při teplotě 25 °C.

Aby bylo možno lépe osvětlit výhody způsobu podle on vynálezu, budou dále uvedeny výsledky pokusů s roztokem interferonu omega in vitro a in vivo.

• 9

9 • · 1 • · <

I · · 4

9 99

Pokusy in vitro s roztokem interferonů omega a rozprašovačem Respimat^R

Zásobník (a) rozprašovače Respimat byl naplněn roztokem 5 interferonů omega s obsahem této látky 5 mg/ml v roztoku v 50 mM citronanu sodného a 150 mM NaCI o pH 5,5. Při uvedení rozprašovače do činnosti byl rozprášen v proudu vzduchu přibližně 28 l/min objem 12,9 mikrolitrů roztoku na jednostlačení tlačítka. Rozprášený roztok byl zachycen do komůrky, znázorněné na obr. 1. Interferon omega byl stanoven v roztoku v zásobníku a v zachyceném rozprášeném roztoku imunologicky zkouškou ELISA a biologicky zábranou rozrušení buněk A549, infikovaných virem encephalomyokarditidy. Imunologické stanovení interferonů je poměrně jednoduché. Dosud zveřejněné pokusy s rozprašováním bílkovin jsou v řadě případů omezeny na imunologické měření. Doplnění biologickými zkouškami je však velmi důležité, protože jde o citlivou a pro léčení relevantní metodu kvantitativního stanovení rozrušení bílkoviny. Těmito postupy se vždy nezískají stejné výsledky jako fysikálněchemickými nebo imunologickými metodami, protože molekula může ztratit svou biologickou účinnost, aniž by ztratila schopnost své vazby na protilátku.

Ve třech pokusech v komůrce prokázáno v případě roztoku (b) 84, 77 a 98 % imunologicky identifikovatelného interferonů, vztaženo na množství ve výchozím roztoku. Při biologických měřeních týchž vzorků roztoků byly získány hodnoty 54, 47 a 81 % biologicky identifikovatelného interferonů v komůrce. Tyto vysoké podíly prokazují, že při rozprašování rozprašovačem Respimat dochází k rozrušení poměrně malého podílu účinnosti interferonů. Materiál, rozprášený rozprašovačem Respimat, jak bylo svrchu popsáno, byl veden také do Andersenova Impaktoru v proudu vzduchu 28 l/min a byl měřen podíl částic se středním průměrem menším než 5,8 mikrometrů (inhalovatelný podíl), který v tomto případě odpovídal 70 % (imunologické měření). Bílkoviny, například interferony, jsou často • · · 0 • * · « • 0 0 0

0 0 0

00 zpracovávány na farmaceutické prostředky spolu s lidským sérovým albuminem pro další ochranu citlivých interferonů. Proto byl podroben zkouškám také prostředek, který kromě svrchu uvedených složek obsahoval ještě 0,5 % sérového albuminu. Ve třech pokusech bylo získáno zpět 83, 83 a 79 % imunologicky identifikovatelného interferonů, vztaženo na původní roztok (b). Při biologickém měření týchž roztoků byly získány hodnoty 60, 54 a 66 % biologicky aktivního interferonů. Inhalovatelný podíl byl 67 % (imunologické měření). Při dalším pokusu byl do zásobníku rozprašovače Respimat uložen koncentrovaný roztok interferonů omega s obsahem této látky 53 mg/ml a pak byl pomocí rozprašovače převeden na aerosol. Ve čtařech pokusech bylo získáno zpět 100, 60, 68 a 72 % imunologicky identifikovatelného interferonů z roztoku (b). Při biologickém měření byly získány odpovídající hodnoty 95, 98, 61 a 83 % v materiálu z komůrky. Tyto vysoké hodnoty prokazují, že při použití rozprašovače Respimat je možno rozprašovat také koncentrované roztoky bílkovin, aniž by přitom došlo k příliš vysokým ztrátám účinnosti například v případě citlivého interferonů.

Pokusy s Respimatem a interferonem omega in vivo

Interferon omega byl podán psům nitrožilně a inhalací v oddělených pokusech vždy na tomtéž psu. Pak byla imunologicky a biologicky měřena koncentrace interferonů v krevním oběhu v časových intervalech. Mimoto bylo v krevním oběhu stanoveno množství neopterinu. Neopterin je markér pro aktivaci imunitního systému. Je uvolňován makrofágy po jejich podráždění interferonem (Fuchs a další, Neopterin, biochemistry and clinical use as a markér for cellular immune reactions, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 101: 1 až 6, 1993). Měřením koncentrace neopterinu se prokazuje účinnost interferonů.

Interferon byl psům podán v pentobarbitalové narkose po předchozí sedativní premedikaci. Zvíře bylo intubováno a bylo

ΦΦΦΦ φ φφ φ φ φ φφφ φ φ φ φφ φφφ φφ φ φ φ φ φ φ · φ φ φ φφ zavedeno řízené dýchání (minutový objem 4 litry/min, frekvence 10 dechů/min). Bylo podáno celkem 20 dávek z Respimatu. Každá dávka byla podána na počátku vdechu. Po vdechu následuvala před výdechem pausa 5 sekund Před dalším podáním interferonu omega byly ponechány dva vdechy a výdechy bez jeho aplikace. Krevní vzorky pro získání sera a heparinisované plasmy byly odebírány v různých časových intervalech až do 14 dnů po aplikaci interferonu. Interferon omega byl stanoven v heparinisované plasmě imunologicky zkouškou ELISA a biologicky zábranou rozrušení buněk A549, infikovaných virem encephalomyokarditidy. Neopterin byl v seru stanoven imunologicky. Na obr. 2 je uvedeno imunologické (obr. 2a) a biologické (obr. 2b) měření koncentrace interferonu omega po podání 20 dávek z rozprašovače Respimat. Je překvapující, že i po inhalačním podání byly naměřeny v krevním séru velmi vysoké koncentrace neopterinu. Při pokusech in vitro odpovídalo množství uvolněné látky na jedno stlačení tlačítka Respimatu 12,8 mg. Bylo by tedy možno očekávat, že při použití roztoku s obsahem interferonu 5 mg/ml bude při 20 stlačeních tlačítka podáno přibližně 12,8 mg interferonu. Měření neopterinu po podání uvedeného množství však prokazuje daleko vyšší a déletrvající koncentrace neopterinu v krevním oběhu, než po podání 0,32 mg interferonu nitrožilně. Na obr. 3 je tento výsledek znázorněn. Vysoké koncentrace neopterinu prokazují, že při podávání interferonu inhalací při použití Respimatu je možno dosáhnout dobré biologické účinnosti.

Výhody použití Respimatu při rozprašování roztoků biologicky účinných makromolekul není omezeno pouze na interferony, jak je možno prokázat dalším pokusem.

Pokusy in vitro při použití Respimatu a dismutázy oxidu manganičitého

K pokusu byl použit rozprašovač z obr. 1 s příslušnou komůrkou pro zachycení rozprášeného materiálu. Zásobník (a) • · 4

4 • l 4 · » 4 »·«· 4

4 4

4» 4

44

4 4 4

4 4 4

4 4 4

4 4 4

44

Respimatu byl naplněn roztokem dismutázy oxidu manganičitého (MnSOD) s obsahem této látky 3,3 mg/ml ve fysiologckém roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem (PBS). Při aktivaci rozprašovače byl rozprášen v proudu vzduchu 28 l/min. objem 13 mikrolitrů na jedno stlačení tlačítka. Přesné rozprášené množství bylo stanoveno gravimetricky (měření ve 3 po sobě následujících pokusech: 12,8, 13,7 a 14,3 mg). Rozprášený roztok byl zachycen v komůrce (b). Obsah komůrky byl 20 ml PBS. Mimoto byly přidány 2 ml sérového albuminu skotu ke stabilizaci bílkovin v komůrce.

Stanovení MnSOD bylo provedeno v roztoku ze zásobníku i z komůrky imunologicky zkouškou ELISA a enzymaticky redukcí oxidu po reakci xanthinu a xanthinoxidázy. Ve třech pokusech bylo naměřeno 78, 89 a 83 % imunologicky identifikovatelné MnSOD v rozprášeném roztoku v komůrce (b). Po rozprášení nebylo možno prokázat žádný měřitelný pokles enzymatické účinnosti. Inhalovatelný podíl (imunologické měření) byl 61 %.

V následujícím příkladu bude popsána příprava aerosolového prostředku podle vynálezu, obsahujícího jako svou účinnou složku insulin.

Příprava roztoku insulinu a plnění rozprašovače

175 mg krystalického insulinu (sodná sůl) skotu (odpovídá

4462,6 mezinárodních jednotek I.E. podle údaje výrobce) se rozpustí ve 3,5 ml sterilní čištěné vody (Seralpur^R). Pak se přidá ze opatrného míchání ještě 8,5 mikrolitrů m.kresolu (odpovídá 8,65 mg) a 7,53 mg fenolu v roztoku ve 100 mikrolitrech sterilní čištěné vody. K tomuto roztoku se přidá 365 mikrolitrů roztoku, obsahujícího chlorid zinečnatý v množství 5 mg/ml (odpovídá 0,5 % zinku, vztaženo na použité množství insulinu) a pH se upraví na 7,4 přidáním 0,2 N NaOH. Směs se doplní na objem 5 ml sterilní čištěnou vodou a zfiitruje přes filtr s otvory 0,22 mikrometrů. Pak se 4,5 ml výsledného prostředku uloží do • 9 « 99 · 99 99 « · 99 9 9 9 9 9·· • 9 9*9» 999·

9 9 9 1 99·· 9 · 9 9 ·

9 9 9 9 9999

9999 999 99 9 ♦· 99 zásobníku rozprašovače Respimat. Zásobník se uzavře a vloží se do rozprašovače.

Takto připravený aerosolový prostředek má koncentraci insulinu přibližně 35 mg/ml, přičemž viskosita tohoto roztoku je přibližně 1020 . 10'⁶ Pa.s.

Pokus in vivo s Respimatem a koncentrovaným roztokem insulinu

Insulin byl aplikován psovi v pentobarbitalové narkose po předchozí sedativní premedikaci. Zvíře bylo intubováno a bylo zavedeno řízené dýchání stejně jako svrchu. Celkem bylo podáno 6 dávek insulinu z Respimatu. Každá dávka byla podána na počátku vdechu, po vdechu před výdechem byla ponechána pausa 5 sekund a před další dávkou byly ponechány dva vdechy a výdechy bez aplikace insulinu. Krev byla odebrána 1 hodinu před aplikací, při aplikaci a pak v různých intervalech do 8 hodin po aplikaci. Koncentrace glukosy byla stanovena podle Trasch, Koller a Trischler, Klein. Chem. 30:969, 1984 při použití přístroje Refletron (Boehringer Mannheim). Zcela neočekávaně bylo možno prokázat také v případě podání tohoto vysoce koncentrovaného roztoku insulinu dobrou biologickou účinnost (pokles koncentrace glukosy po inhalačním podání. Výsledek je graficky znázorněn na obr. 5.

Vodné aerosolové prostředky podle vynálezu mohou v případě potřeby obsahovat kromě účinné látky a vody další rozpouštědla, například ethanol. Množství ethanolu je v závislosti na rozpustnosti účinné látky omezeno tím, že při příliš vysoké koncentraci účinné látky může dojít k jejímu vysrážení z roztoku. Ke stabilizaco roztoku je možno přidávat farmakologicky přijatelná konservační činidla, jako ethanol, fenol, kresol nebo paraben, farmakologicky přijatelné kyseliny, baze nebo pufry k úpravě pH nebo smáčedla. Mimoto je možno přidávat ke stabilizaci roztoku nebo ke zlepšení kvality aerosolu chelatační látky na bázi kovů, například

EDTA. Ke zlepšení rozpustnosti a/nebo stability účinné látky v aerosolovém prostředku je mimoto možno přidávat aminokyseliny, například kyselinu asparagovou, glutamovou (asparagin, glutamin)ma zvláště prolin.

Kromě interferonů, dismutázy oxidu manganičitého a insulinu je možno do prostředku podle vynálezu zařadit následující výhodné účinné látky:

antimediátorové oligonukleotidy, orexin, erythropoetin, faktor alfa nekrosy nádorů, faktor beta nekrosy nádorů,

G-CSF (faktor, stimulující kolonie granulocytů),

GM-CSF (faktor, stimulující kolonie granulocytů - makrofágů), annexin, kalcitonin, leptin, parathormon, fragmenty parathormonu, interleukiny, např. interleukin 2, interleukin 10, interleukin 12, rozpustný ICAM (molekuly intracelulární adhese), somatostatin, somatotropin, tPA (aktivátor tkáňového plasminogenu),

TNK-tPA, antigeny, spojené s nádory (jako peptidy, proteiny nebo DNA), látky, antagonisující peptid bradykinin, urodilatin,

GHRH (hormon, uvolňující růstový hormon),

CRF (faktor, uvolňující kortikotropin),

EMAP II, heparin, rozpustné receptory interleukinu, jako receptor slL-1, očkovací látky, například vakcina proti hepatitidě nebo vakcina proti spalničkám, antimediátorové polynukleotidy, faktory pro transkripci.

Claims (25)

1. Vodný aerosolový prostředek pro inhalační aplikaci, v y z n a<ýu j i c í se t í m, že obsahuje v množství 25 až 100 mg/mi účinnou

5 látku ze skupiny:

antimediátorové oligonukleotidy, orexin, erythropoetin, faktor alfa nekrosy nádorů,

10 faktor beta nekrosy nádorů,

G-CSF (faktor, stimulující kolonie granulocytů),

GM-CSF (faktor, stimulující kolonie granulocytů - makrofágů), annexin, kalcitonin,

15 leptin, parathormon, fragmenty parathormonu, interleukiny, např. interleukin

2, interleukin 10, interleukin 12, rozpustný ICAM (molekuly intracelulární adhese),

20 somatostatin, somatotropin, tPA (aktivátor tkáňového plasminogenu),

TNK-tPA, antigeny, spojené s nádory (jako peptidy, proteiny nebo DNA),

25 látky, antagonisující peptid bradykinin, urodilatin,

GHRH (faktor, uvolňující růstový hormon),

CRF (faktor, uvolňující kortikotropin),

EMAP II,

30 heparin, rozpustné receptory interleukinu, jako receptor slL-1, očkovací látky, například vakcina proti hepatitidě nebo vakcina proti spalničkám, antimediátorové polynukleotidy, faktory pro transkripci, přičemž koncentrace G-CSF (faktoru, stimulujícího kolonie granulocytů) je odlišná od 25 mg/ml.

5 2. Vodný aerosolový prostředek podle nároku 1,vyznačuj ίο í s e t í m, že jako účinnou látku obsahuje insulin.

3. Vodný aerosolový prostředek podle nároku 2, vyznačující se t í m, že jako účinnou látku obsahuje insulin v množství

10 vyšším než 30 mg/ml.

4. Vodný aerosolový prostředek podle nároku 1,vyznačující se t í m, že jako účinnou složku obsahuje dismutázu oxidu manganičitého.

5. Vodný aerosolový prostředek podle nároku 1,vyznačující se t I m, že jako účinnou složku obsahuje interferon.

6. Vodný aerosolový prostředek podle nároku 1,vyznačují20 c I s e t I m, že jako účinnou složku obsahuje interferon omega.

7. Vodný aerosolový prostředek podle některého z nároků 1 až

6, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden pomocný prostředek ze skupiny povrchově aktivních látek, jako jsou smáčedla,

25 amulgátory, stabilizátory, látky, zlepšující průnik a/nebo konservační prostředky.

8. Vodný aerosolový prostředek podle některého z nároků 1 až

7, vyznačující se tím, že obsahuje aminokyselinu.

9. Vodný aerosolový prostředek podle nároku 8, vyznačující se t I m, že obsahuje prolin nebo kyselinu asparagovou nebo glutamovou pro zlepšení rozpustnosti nebo stability účinné látky.

4 4 4 4 · · · · · · · • · · · · · · · 4 · • · · 4 ······· · · · • · 4 4 4 4 4 4 4

44·· 444 44 4 44 ·4

10. Vodný aerosolový prostředek podle některého z nároků 1 až

9, v y z n a č u j í c í se t í m, že má při teplotě 25 °C viskositu nejvýš 1600 . 10 '⁶ Pa.s.

5

11. Vodný aerosolový prostředek podle některého z nároků 1 až

10, v y z n a č u j í c í se t í m, že má při teplotě 25 °C viskositu v rozmezí 900 . 10 ’⁶ až 1100 . 10’⁶ Pa.s.

• · 9 9

9 · 9 ·

9 9 9 · • 9 · · 9

9 9 9 9

12. Vodný aerosolový prostředek pro inhalační aplikaci, v y z n a/u j í c í se t í m, že při teplotě 25 °C má viskositu v rozmezí

900.10^-6 až 1100 .10^-6 Pa.s a obsahuje v množství 25 až 100 mg/ml účinnou látku ze skupiny:

5 antimediátorové oligonukleotidy, orexin, erythropoetin, faktor alfa nekrosy nádorů, faktor beta nekrosy nádorů,

10 G-CSF (faktor, stimulující kolonie granulocytů),

GM-CSF (faktor, stimulující kolonie granulocytů - makrofágů), annexin, kalcitonin, leptin,

15 parathormon, fragmenty parathormonu, interleukiny, např. interleukin 2, interleukin 10, interleukin 12, rozpustný ICAM (molekuly intracelulární adhese), somatostatin,

20 somatotropin, tPA (aktivátor tkáňového plasminogenu),

TNK-tPA, antigeny, spojené s nádory (jako peptidy, proteiny nebo DNA), látky, antagonisující peptid bradykinin,

25 urodilatin,

GHRH (faktor, uvolňující růstový hormon),

CRF (faktor, uvolňující kortikotropin),

EMAP II, heparin,

30 rozpustné receptory interleukinu, jako receptor slL-1, očkovací látky, například vakcina proti hepatitidě nebo vakcina proti spalničkám, antimediátorové polynukleotidy, faktory pro transkripci, • « přičemž koncentrace G-CSF (faktoru, stimulujícího kolonie granulocytů) je odlišná od 25 mg/ml.

13. Vodný aerosolový prostředek podle nároku 12, v y z n a č u j í5 c í se t í m, že má při teplotě 25 °C viskositu v rozmezí 950 . 10'⁶ až 1300 . 10’⁶.

14. Vodný aerosolový prostředek podle nároku 12 nebo 13, v y z načující se tím, že jako účinnou látku obsahuje insulin.

15. Vodný aerosolový prostředek podle nároku 12 nebo 13, vyznačující se t í m, že jako účinnou látku obsahuje dismutázu oxidu manganičitého.

15

16. Vodný aerosolový prostředek podle nároku 12 nebo 13, v y z načující se tím, že jako účinnou látku obsahuje interferon.

17. Vodný aerosolový prostředek podle nároku 12 nebo 13, m y z načující se tím, že jako účinnou látku obsahuje interferon

20 omega.

18. Způsob výroby aerosolu pro inhalační aplikaci aerosolového prostředku podle některého z nároků 1 až 17, vyznačující se t í m, že se v rozprašovači bez hnacího plynu odměří v měřicí komoře

25 účinné množství účinné látky jako jednotlivá dávka aerosolového prostředku a toto množství se rozpráší pod tlakem v rozmezí 10 až 50 MPa alespoň jednou tryskou s hydraulickým průměrem 1 až 12 mikrometrů v průběhu 1 až 2 sekund na kapičky se středním průměrem menším než 10 mikrometrů.

19. Způsob podle nároku 18, v y z n a č u j í c í se t í m, že množství roztoku projednotlivou dávku je 10 až 20 mikrolitrů.

·· • · · · · · · · · · · • · · · · · · φ φ · • φ · · φφφφφφφ « · · • · · · · φφφφ φφφφφφφ φφ · φφ ··

20. Způsob podle nároku 19, v y z n a č u j í c í se t í m, že rozprašovač má dvě trysky, směrované tak, že se oba paprsky setkají a dojde k rozprášení aerosolového prostředku.

5

21. Způsob rozprašování insulinu k léčení cukrovky inhalací aerosolu insulinu, vyznačující se t í m, že se rozpráší na inhalovatelné kapičky 10 až 50 mikrolitrů roztoku, obsahujícího insulin v množství 20 až 90 mg/ml při jednorázovém použití rozprašovače.

10

22. Způsob podle nároku 21, vy z n a č u j í c í se t í m, že se inhaluje 10 až 20 mikrolitrů roztoku, obsahujícího insulin v množství 25 až 60 mg/ml.

23. Použití roztoku s obsahem insulinu vyšším než 30 mg/ml k

15 inhalačnímu léčení cukrovky tvorbou aerosolu se středním průměrem kapiček nižším než 10 mikrometrů.

24. Použití roztoku s obsahem insulinu 25 až 60 mg/ml k inhalačnímu léčení cukrovky tvorbou aerosolu se středním průměrem

20 kapiček nižším než 10 mikrometrů.

25. Použití roztoku podle nároku 23 nebo 23, při němž se aerosol vytvoří z 10 až 50 mikrolitrů, s výhodou z 10 až 20 mikrolitrů roztoku při použití rozprašovače bez hnacího plynu.