KR20000005611A

KR20000005611A - 화합물및그의용도

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Publication number: KR20000005611A
Application number: KR1019990007632A
Authority: KR
Inventors: 로레인매리 에드미데스; 니겔아써 그리피쓰-스킨너; 데렉안쏘니 힐; 그라함쓰론톤 힐; 테렌스윌리엄 팩햄
Original assignee: 그레이엄 브레레톤; 더 웰컴 파운데이션 리미티드
Priority date: 1998-06-10
Filing date: 1999-03-09
Publication date: 2000-01-25
Also published as: AP9901481A0; CN1238454A; PE20000332A1; HRP990074A2; CA2265194C; AU2031999A; EP0963980B1; NO991151D0; HU9900592D0; PL331870A1; AP0102286A0; ATE218552T1; NO991151L; EP1170588A1; AP2001002286A0; NO20032753L; EA199900159A1; BR9900984A; KR100322354B1; TR199900520A3

Abstract

본 발명은 라모트리긴 시료 또는 라모트리긴을 함유한 제약 제형을 3-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-5-(4H)-온 및 N-[5-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-3-일]-2,3-디클로로벤즈아미드로부터 선택된 화합물에 대해 분석하는 것을 포함하는, 라모트리긴 시료 또는 라모트리긴을 함유하는 제약 제형의 순도 또는 분해 안정도의 시험 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 신규 화합물인 화합물 3의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

화합물 및 그의 용도 {Compound and Its Use}

본 발명은 라모트리긴 및 그의 제약 조성물을 분석하기 위한 참조용 마커로서 유용한 화합물에 관한 것이다.

신규 약품에 대한 판매 허가를 얻기 위해, 제약업자는 제품이 시장에 내놓기에 적합하다는 것을 보여주는 상세한 증거를 해당 감독 기관에 제출하여야 한다. 무엇보다도 활성물질이 사람에게 투여하기에 적합하다는 것과 시판하고자 하는 특정 조성물이 출시하는 시점에 불순물이 없고 적절한 저장 수명을 가진다는 것을 감독 기관에 납득시켜야 한다.

그러므로, 감독 기관에 제출되는 제출물들은 통상 (a) 제조시 약물에 불순물이 존재하지 않거나, 단지 무시할 정도로 존재하고, (b) 약물의 저장 안정성, 즉 저장 수명이 적당하다는 것을 보여주는 분석 데이터를 포함한다. 이들 데이터는 일반적으로 잠재적인 불순물 또는 잠재적인 분해 생성물의 적절한 순도의 시료인 외부 표준, 또는 참조용 마커에 대해 약물을 시험하여 얻는다.

제약 활성물질 및 이들을 함유하는 제약 제형에서 잠재적인 불순물로는 활성물질 합성 전구체의 잔류량, 활성물질의 합성시 발생하는 부산물, 잔류 용매, 활성물질의 이성질체, 활성물질의 합성 및 제약 제형의 제조시에 사용된 물질에 들어 있던 오염물, 및 확인되지 않은 외래 물질이 있다. 저장시 나타날 수 있는 다른 불순물로는 활성물질의 분해, 예컨대 산화 또는 가수분해로 인한 물질이 있다.

라모트리긴은 화학식 1의 3,5-디아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진이다.

이 화합물은 예를 들어, 유럽 특허 공개 제0021121호에 기재된 것과 같이 중추신경계 (CNS) 질환, 특히 간질의 치료에 유용한 공지의 화합물이다. 라모트리긴 자체 및 그의 제약 제형은 모두 비교적 불순물 없이 제조된다. 특히, 라모트리긴은 그의 제약 제형의 제조시 안정한 상태이다.

본 발명의 목적은 라모트리긴 및 그의 제약 제형을 분석하기 위한 참조용 마커를 제공하는 것이다.

본 발명에서는 2가지 화합물이 라모트리긴 또는 이를 함유하는 제약 제형의 분석에 참조용 마커로서 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 이 화합물들 중 하나는 라모트리긴의 잠재적인 분해 생성물이고 다른 것은 라모트리긴의 합성시 부반응으로부터 발생하는 잠재적인 오염물이다.

그러므로, 본 발명은 라모트리긴 시료 또는 라모트리긴을 함유한 제약 제형을 3-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-5-(4H)-온 및 N-[5-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-3-일]-2,3-디클로로벤즈아미드로부터 선택된 화합물의 존재에 대해 분석하는 것을 포함하는, 라모트리긴 시료 또는 라모트리긴을 함유한 제약 제형의 순도 또는 분해 안정도를 시험하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서, 상기 화합물은 참조용 마커로서 작용한다.

3-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-5-(4H)-온은 화학식 2의 화합물이다.

화학식 2의 화합물 (화합물 2)은 라모트리긴의 가수분해시 생성되는 잠재적인 분해 생성물이다. 그러므로 화학식 2의 화합물은 염기성 조건에서 라모트리긴을 가수분해하여 생성될 수 있다. 가수분해는 라모트리긴 및 염기를 물과 합한 다음, 생성되는 용액을 환류하에서 가열함으로써 적절히 수행된다. 염기는 강염기 (예, 알칼리 금속 수산화물)가 바람직하다. 염기성 수용액을 1시간 내지 48시간, 예컨대 10시간 내지 36시간, 바람직하게는 24시간 동안 환류에서 가열할 수 있다.

참조용 마커로 사용되는 다른 하나의 화합물은 신규 화합물이다. 그러므로 본 발명은 화학식 3의 N-[5-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-3-일]-2,3-디클로로벤즈아미드를 제공한다.

화학식 3의 화합물 (화합물 3)은 피리딘 중에서 라모트리긴을 2,3-디클로로벤조일 클로라이드로 처리하여 직접 제조할 수 있다. 그러나, 이 화합물은 약물의 합성중에 일어날 수 있는 부반응으로부터 발생하는 잠재적인 오염물이기에 라모트리긴에 대한 참조용 마커로서 이용할 수 있다. 실제로 이 오염물의 농도는 박층 크로마토그래피 (TLC)에 의할 때 라모트리긴 조생성물 중에 0.5% 내로 제어된다. 이러한 품질의 조생성 약물을 재결정화하면 총 불순물이 2%를 넘지 않는 상용에 요구되는 순도에 부합하는 라모트리긴을 제조하게 된다.

라모트리긴의 합성은 참조예 1에서 설명된다. 이 합성에서 중간물 1.4인 2,3-디클로로벤조일 시아나이드는 오염물인 2,3-디클로로벤조산 무수물을 10% 이하로 함유할 수 있다. 참조예 1의 (d) 단계에 보이는 바와 같이, 2,3-디클로로벤조일 시아나이드를 황산 중의 아미노구아니딘 비카르보네이트 용액으로 처리하면, 부가물 (Z)-2-(2,3-디클로로페닐)-2-(구아니디노이미노)아세토니트릴 (중간물 1.5)이 생성된다. 그러면 무수물 오염물이 이 부가물과 반응하여 화합물 3의 직전 전구체인 (Z)-2-(2,3-디클로로페닐)-2-[N'-(2,3-디클로로벤조일)구아니디노이미노]아세토니트릴을 형성할 수 있다. 환류하 프로판-1-올 중에서 전구체를 고리화하면 화합물 3이 얻어진다.

그러므로, 본 발명은 또한

i) 35℃ 미만의 온도에서 2,3-디클로로벤조일 클로라이드 2 당량을 피리딘 중에 용해된 라모트리긴 1 당량과 반응시키는 단계 또는

ii) 환류하에서 프로판-1-올 중의 화학식 4의 화합물을 고리화하는 단계

를 포함하는, 화합물 3의 제조 방법을 제공한다.

단계 (ii)에서, 화학식 4의 화합물은 무기산 (예, 황산)의 존재하에서 화학식 5와 6의 화합물들을 함께 반응시켜 제조된다.

화학식 5의 화합물은 2,3-디클로로벤조일 시아나이드를 황산에 용해된 아미노구아니딘 비카르보네이트 용액으로 처리하여 제조된다.

화합물 2 및 3을 참조용 마커로 사용할 경우, 이들은 적절한 순도를 가진 형태라야 한다. 상기와 같이 제조된 화합물 2 및 3은 원하는 순도를 얻고자 할 경우 정제될 수 있다. 그러므로, 상기와 같이 화합물 3을 제조하기 위한 본 발명의 방법은 생성 화합물을 정제하는 추가 단계를 포함할 수 있다.

정제는 유기 합성에서 일상적으로 사용되는 통상적인 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 화합물을 C₁-C₆알칸올과 같은 유기 용매 중에서 가열하고, 여과하고 진공하에서 건조시킬 수 있다. 가열은 통상 용매의 환류 온도에서 수행된다. C₁-C₆알칸올은 프로판올이 바람직하다. 별법으로 화합물은 고온 C₁-C₆알칸올 용매, 바람직하게는 고온 프로판올로부터 재결정화될 수 있다.

화합물 2 및 3은 거의 순수한 형태로 최종 회수되는 것이 바람직하다. 이들 화합물의 최종 시료의 순도는 통상 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상이다. 필수적인 것은 아니나, 90% 이상의 순도가 바람직할 수 있다. 순도는 예를 들어 92% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상일 수 있다. 순도 99% 또는 99.5%가 더더욱 바람직하다.

라모트리긴 자체 (또한 약물질이라고도 함) 또는 이를 함유하는 제약 제형 (또한 약품이라고도 함)을 순도 또는 분해 안정도에 대해 분석할 수 있다. 예를 들어, 라모트리긴은 그의 제조 후에도 반드시 순수하여야 한다. 그러므로, 약물질은 통상 분해 생성물 (화합물 2)과 공정 불순물 (화합물 3) 모두에 대해 분석된다. 라모트리긴의 제약 제형은 활성물질이 약품의 제조시와 수년간의 저장 후에 모두 분해에 대해 안정한 상태로 있음을 확인하기 위해 분석할 필요가 있다. 통상적인 경구용 정제 및 분산성 정제를 포함하는, 제약 제형은 통상적으로 단지 화합물 2에 대해서만 분석된다.

분석하기 위한 약 물질 또는 약품의 시험 시료는 하나 이상의 통상적인 분석 기술에 의해 분석될 수 있다. 분석 기술로는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 박층 크로마토그래피 (TLC)가 있다. 얻은 결과를 화합물 2 또는 3으로 된 거의 순수한 참조용 시료를 시험하여 얻은 결과와 비교한다. 그러면 시험 시료 중 화합물(들)의 함량을 산정할 수 있다.

하나의 양태에서, 라모트리긴 시료의 순도를 시험하기 위한 본 발명의 방법은

i) 라모트리긴 시료를 용매에 용해시켜 시료 용액을 제조하는 단계,

ii) 3-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-5-(4H)-온 또는 N-[5-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-3-일]-2,3-디클로로벤즈아미드 시료를 용매에 용해시켜 참조용 마커 표준 용액을 제조하는 단계,

iii) 시료 용액 및 표준 용액을 박층 크로마토그래피하여 각각에 대한 TLC 크로마토그램을 얻는 단계, 및

iv) 표준 용액의 크로마토그램에서 참조용 마커로 인한 반점에 비추어 시료 용액의 크로마토그램에서 Rf 값이 참조용 마커에 해당하는 부수적 반점의 강도를 산정하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 라모트리긴을 포함하는 제약 제형의 분해 안정도를 시험하기 위한 본 발명의 방법은

i) 라모트리긴 함유 제약 제형의 시료를 용매에 용해시켜 시료 용액을 제조하는 단계,

ii) 3-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-5-(4H)-온을 용매에 용해시켜 참조용 마커 표준 용액을 제조하는 단계,

iv) 표준 용액의 크로마토그램에서 참조용 마커로 인한 반점에 비추어 시료용액의 크로마토그램에서 Rf 값이 참조용 마커에 해당하는 부수적 반점의 강도를 산정하는 단계를 포함한다.

추가 양태에서, 라모트리긴을 함유하는 제약 제형의 분해 안정도를 시험하기 위한 본 발명의 방법은

i) 라모트리긴 함유 제약 제형의 시료를 용매에 용해시켜 1개 이상의 시료 용액을 제조하는 단계,

ii) 라모트리긴 표준물을 용매에 용해시켜 표준 용액을 제조하는 단계,

iii) 시료 및 표준 용액을 HPLC 칼럼에 주입하는 단계 및

iv) 각 용액의 주피크 면적을 측정하고 이로부터 시료 용액(들)에서 참조용 마커인 3-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-5-(4H)-온의 함량을 계산하는 단계를 포함한다.

상기 추가 양태에서, 제약 제형에 존재하는 라모트리긴 및 임의의 제약 제형 부형제간의 분리 계수를 측정하기 위해, 단계 (iii)에 앞서 시스템 적합성 용액을 HPLC 칼럼에서 전개시키는 것이 필요할 수 있다. 이 경우, 이 방법은 (iia) 라모트리긴 및 제약 부형제 표준물질을 용매에 용해시켜 HPLC 시스템 적합성 용액을 제조하고, 시스템 적합성 용액을 HPLC 칼럼 상에 주입하여 라모트리긴 및 제형 부형제 간의 분해 인자를 측정하는 추가 단계를 포함한다. 제형 부형제는 예를 들어 사카린 나트륨일 수 있다.

또한 본 발명은 라모트리긴 시료 또는 이를 함유하는 제약 제형 시료의 순도 또는 분해 안정도 분석시의 참조용 마커로서 3-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-5-(4H)-온 및 N-[5-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-3-일]-2,3-디클로로벤즈아미드로부터 선택된 화합물의 용도를 제공한다.

실제 라모트리긴은 비교적 순수하고 저장시 상당히 안정하다. 그러므로, 약물질 자체 또는 이를 함유하는 제약 제형에 대한 분석 시험은 주로 화합물 2 및(또는) 3이 존재하지 않거나 단지 문제의 분석 기술에 대한 검출 한계 (TLC의 경우 약 0.3% w/w 및 HPLC의 경우 0.06% w/w) 미만의 수준으로 존재함을 확인하는 데 적당하다.

참조용 마커의 시료를 매번 별도로 분석하는 것의 별법으로서, 약물질 또는 약품 시료를 분석하여 얻은 데이터를 평가하는 것이 바람직한데, 응답 계수 (R)로서 공지된 파라메터를 사용할 수 있다. 응답 계수는 주어진 분석 기술을 사용하여 화합물 2 또는 3의 시료를 시험하여 얻은 숫자상의 결과 대 동등 농도의 순수한 라모트리긴을 시험하여 얻은 해당 숫자상 결과의 앞서 측정된 비이다. 문제의 숫자상의 결과는 예를 들어, HPLC 피크 면적 반응값일 수 있다. 따라서, 순수한 라모트리긴 및 라모트리긴을 함유한 제약 제형의 시험 시료에 대해 적절한 분석 결과가 주어지면 화합물 2 또는 3에 대한 기지의 응답 계수를 사용하여 시험 시료 중 특정 참조용 마커의 양을 계산할 수 있다.

계산은 아래와 같은 HPLC 분석 결과를 참조로 하여 설명할 수 있다.

시험 시료 중 라모트리긴에 대한 화합물 A 또는 B의 %(w/w) = (Ar x Ws)/(As x R)

상기 식에서,

Ar은 HPLC 시험 용액에 함유된 화합물의 주피크 면적이고,

As는 HPLC 표준 용액에 함유된 라모트리긴 단독의 주피크 면적이고,

R은 화합물의 응답 계수이고,

Ws는 취한 표준물 중량 (㎎)이다.

본 발명의 화합물 2에 있어서, HPLC 응답 계수는 0.79이다.

본 발명은 아래의 실시예에서 더 설명될 것이다.

<참조예 1>

라모트리긴의 제조

단계 a: 화합물 1.2의 제조

화합물 1.1 (1 몰), t-부틸 알콜, 물 및 수산화나트륨 (2 몰)로 된 용액을 교반하고 과산화수소 용액 (35%w/w, 4몰)을 3시간 동안 50 내지 60℃에서 첨가하였다. 55 내지 60℃에서 30분간 교반한 후, t-부틸 알콜을 증류 제거하고 수용액을 톨루엔으로 세척하였다. 수용액을 pH 1-2까지 산성화시키고, 생성물을 여과하고 물로 세척하였다. 젖어있는 고체를 다음 단계의 공정에 바로 사용하거나 80 - 90℃에서 건조시켜 75% 수율로 백색 고체를 얻었다.

단계 b 및 c: 화합물 1.4의 제조

톨루엔 중의 화합물 1.2 (1 몰)로 된 용액을 교반하고 증류 건조시켰다. 그 다음 이를 냉각시키고 피리딘 (0.005 몰)을 첨가하고, 티오닐 클로라이드 (1.1 몰)를 서서히 첨가하였다. 이 용액을 1시간 동안 환류하에서 가열한 다음, 진공에서 농축시켜 조생성 화합물 1.3을 얻었다. 요오드화칼륨 (1.2 몰)에 이어 시안화제1구리 (1.2 몰)를 첨가하고, 내부 온도가 140 내지 144℃로 될 때까지 잔류하는 모든 용매를 증류 제거하였다. 이 온도를 18 내지 24시간 동안 유지한 다음, 반응 혼합물을 냉각시키고, 톨루엔으로 희석하고 여과하여 무기염을 제거하였다. 용액을 60 내지 70℃의 진공에서 증발시켜 건조하고, 잔류 오일을 석유 에테르로부터 결정화시켜 77% 수율로 노란색 고체로 된 화합물 1.4를 얻었다.

단계 d: 화합물 1.5의 제조

아미노구아니딘 비카르보네이트 (1.75 몰)을 9.3 내지 10.0 M 황산 용액에 용해시켰다. 아세토니트릴 중의 2,3-디클로로벤조일 시아나이드 (1 몰)로 된 용액을 첨가하고 이 현탁액을 42 내지 48시간 동안 20 내지 30℃에서 교반하였다. 조생성물을 여과하고 물로 세척하였다. 고체를 35℃ 미만에서 수산화나트륨 용액에 첨가한 다음, 생성물을 여과하고, 물로 세척하고 80 내지 90℃에서 건조시켜 66% 수율로 노란색 고체로 된 화합물 1.5를 얻었다.

단계 e: 조라모트리긴의 제조

프로판-1-올 중의 화합물 1.5로 된 용액을 90 내지 120분간 환류하에서 교반하고, 15 내지 25℃로 냉각시키고 조라모트리긴을 여과하여 90% 수율 (건조 상태를기준)로 옅은 갈색 고체를 얻었다. 조생성 라모트리긴을 목탄을 사용하고 용액을 15 내지 25℃로 냉각시켜 프로판-1-올로부터 재결정화함으로써 정제하였다. 고체를 여과하고, 프로판-1-올로 세척하고 80 내지 90℃로 건조시켜 순수한 라모트리긴을 얻었다.

<실시예 1>

3-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-5-(4H)-온 (화합물 2)의 제조

라모트리긴 (614.4 g, 2.4 몰) 및 고상 수산화나트륨 (242.4 g)을 물 (60 ℓ)과 합하고 24시간 동안 교반하면서 환류시켰다. 생성되는 용액을 15 내지 20℃로 냉각시키고 염산을 사용하여 pH를 5.5 내지 6.0으로 조정하였다. 생성되는 고체를 여과하고, 먼저 40℃, 그 다음 50℃, 끝으로 70℃에서 24시간 동안 건조시켰다. 생성물의 순도는 HPLC에 의해 82%로 측정되었다. HPLC의 조건은 다음과 같다.

칼럼: 스페리소르브 (Spherisorb) 50 DS

용리액: 물 (600): 아세토니트릴 (400): 0.5M 황산 (15)

유속: 2.0 ㎖/분

시료: 100 ㎖ 중에 50 ㎎

주입량: 5 또는 10 ㎕

검출: 270 nm

82% 순도의 생성물 시료 (583 g)를 프로판올 (15 ℓ)과 합하고 0.5시간 동안환류시켰다. 추출하고 건조시키자 상기 조건에서 HPLC로 측정한 경우 96.2% 순도인 화합물 2가 얻어졌다.

프로판올 (5 리터) 중 순도 96.2%의 생성물 시료를 1시간 동안 교반하면서 환류시켜 추가 정제 단계를 수행하였다. 고체를 여과하고 40℃ 진공에서 건조시켜 표제 화합물 (460.7 g, 74.7% 수율)을 얻었다. HPLC로 측정한 경우, 최종 생성물의 순도는 99.1%였다.

생성물은 아래의 물성을 가졌다.

분자식: C₉H₆Cl₂N₄O, 분자량: 257.08

원소 분석

C H N

이론치 42.06% 2.35% 21.80%

실측치 42.02% 2.25% 21.23%

TLC (클로로포름:메탄올:빙초산:부탄올-1-올 80:10:10:5를 사용하는 실리카 겔)

- Rf = 0.38에서 주된 반점이 나타남,

- Rf = 0.82에서 미량 성분의 반점이 나타남.

적외선 (KBr): ν_max(cm^-1): 3301, 3127, 1655, 1556, 1484, 1413, 1290, 1200, 1056, 812, 785, 748, 737, 719.

¹H nmr: δ/d₆-dmso에서의 ppm (22 ㎎/㎖)/300MHz: 12.43 (1H, bs); 7.71, 7.68 (1H, m); 7.40 (2H, m); 6.99 (2H, bs); 3.3 (bs (물)); 2.5 (q (dmso-d₅)); 0 (s, TMS).

질량 분광법: m/z: 256 (M⁺), 258 및 260 (관련 동위원소 이온), 221, 186, 171, 85 (아래에 나타낸 절편 이온).

<실시예 2>

N-[5-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-3-일]-2,3-디클로로벤즈아미드 (화합물 3)의 제조

라모트리긴 (512.00 g, 2.00 몰)을 피리딘 (3 리터)에 용해시키고 2,3-디클로로벤조일 클로라이드 (873.00 g, 순도 96%, 838.10 g과 등량, 4.00 몰)를 35℃ 미만의 무수 조건하에서 교반하면서 첨가하였다. 산 염화물을 등량의 2분획으로 나누어 첨가하였다. 반응을 시작한지 30분 후에 산 염화물의 두번째 분획을 첨가하고 35℃ 미만에서 30분 더 교반하였다.

생성 혼합물을 거의 건조되도록 농축시킨 다음 10분간 교반하면서 클로로포름 (1300 ㎖)으로 미분화하였다. 생성 고체를 여과하고 클로로포름 (3 x 50 ㎖)으로 세척하고 실온에서 중량 308 g, 36% (화합물 3을 기준)로 건조시켰다. 조생성 시료 (50.0 g)를 메탄올 (500 ㎖)과 함께 1시간 동안 교반하면서 환류 온도에서 가열하고 생성되는 고온 혼합물을 여과하여 아주 순수한 형태의 화합물 3 (37.0 g)을 얻었다.

생성물은 아래의 물성을 가졌다.

분자식: C₁₆H₉Cl₄N₅O, 분자량: 429.09

적외선 (KCl): ν_max(cm^-1): 3468, 3300, 3202, 3385, 3277, 1687, 1625, 1559, 1414, 1387, 1538, 1459, 1253, 1157, 1136, 1116, 790, 775, 741, 724.

¹H nmr: δ/d₆-dmso에서의 ppm (39 ㎎/㎖)/300MHz: 10.85 (1H, bs); 7.8 (1H, bs); 7.1 (1H, bs); 7.77 (1H, d, J = 7Hz); 7.73 (1H, d, J = 7Hz); 7.5 (4H, m); 4.08 (bs); 3.32 (bs, 물); 3.18 (s); 2.50 (quintet, dmso-d₅); 2.31 (s, 메탄 술포네이트); 0.00 (s, TMS).

질량 분광법:

화학적 이온화 (Cl): m/z: 428 (M + 1)⁺; 430, 432 및 434 (관련 동위원소 이온).

전자 충격 (EI): m/z: 428 (m + 1)⁺; 392, 199, 185, 173, 145 (아래에 나타낸 것과 같은 절편 이온).

<실시예 3>

HPLC에 의한 약품 (분산성 정제) 중의 라모트리긴 및 화합물 2에 대한 분석

표준용액 및 시스템 적합성 용액의 제조

라모트리긴 표준물 (정확하게 정량된 약 100 ㎎)을 500 ㎖ 부피의 플라스크에 옮겨서 표준 용액을 제조하였다. 메탄올 (200 ㎖)를 첨가하여 고체를 용해시키고, 염산 (100 ㎖, 0.5 M)과 혼합하였다. 생성 용액을 실온으로 냉각시키고 일정 부피의 물로 희석하였다.

라모트리긴 표준물 (100 ㎎) 및 사카린 나트륨 표준물 (20 ㎎)을 500 ㎖ 부피의 플라스크에 옮기고 일정 부피의 물로 희석하여 시스템 적합성 용액을 제조하였다.

시료 용액의 제조

S1 용액

아래의 표 1에 주어진 정보에 따라, 특정 부피의 플라스크에 특정 개수의 정제를 옮겨서 S1 용액을 제조하였다. 특정 부피의 염산 (0.5 M)을 첨가하고, 정제가 붕해되고 거품의 발생이 중단될 때까지 용액에 소용돌이류를 일으켰다.

특정 부피의 메탄올을 첨가하고 용액을 10분간 초음파조에 두었다. 그 다음이 용액이 실온과 평형을 이루게 한 후 물을 사용하여 일정 부피로 희석하였다.

정제 강도	정제의 개수	플라스크의 용적 (㎖)	0.5 M의 염산 부피 (㎖)	메탄올 부피 (㎖)
5 ㎎	10	250	50	100
25 ㎎	8	200	40	80
50 ㎎	5	250	50	100
100 ㎎	5	500	100	200
200 ㎎	5	1000	200	400

S2 용액

a) 5 ㎎ 정제

상기와 같이 제조한 S1 용액을 와트만 (Whatman) No.1 여과지를 통해 여과하였다. 여액 중 최초의 10 ㎖는 버렸다. 맑은 여액이 시료 용액이다.

b) 25 ㎎, 50 ㎎, 100 ㎎ 및 200 ㎎ 정제

와트만 No.1 여과지를 통해 S1 용액을 여과하였다. 여액 중 최초의 10 ㎖는 버렸다. 여액 (10.0 ㎖)를 50 ㎖ 삼각 플라스크에 옮기고 염산 (0.5 M):물:메탄올 (20:20:40 v/v)로 된 혼합물을 사용하여 일정 부피로 희석하였다.

크로마토그래피 과정

다음의 조건을 사용하였다.

칼럼: 스페리소르브 5 ㎛ ODS 1 또는 확인된 등가물로 채운 125 x 4.6 mm (내경) 스테인리스 스틸

이동상: 물/메탄올/아세토니트릴/빙초산/n-옥틸아민 (700/100/100/20/0.5 v.v)

온도: 실온

유속: 2.0 ㎖/분

파장: 275 nm

주입 부피: 20 ㎕

비고:

(a) 사용하기 전에 약 30분간 낮은 유속으로 메탄올을 펌핑하여 칼럼을 조정하였다.

(b) 물 대 메탄올:아세토니트릴의 비가 특이성에 영향을 끼쳤다.

(c) 이동상의 메탄올:아세토니트릴 함량을 감소시키면 라모트리긴과 사카린나트륨의 분리도가 향상되고, 모든 성분들의 유지 시간도 증가된다.

(d) 산 농도, 메탄올 대 아세토니트릴의 비, 및 아세틸아민 농도의 사소한 변화는 크로마토그래피 특이성에 뚜렷한 영향을 주지 않았다.

(e) 사용 후, 칼럼을 메탄올:물 (1.9)에 이어 메탄올로 세척하였다.

주입 방법

베이스라인이 안정해졌을 때, 시스템 적합성 용액을 주입하였고 라모트리긴과 사카린 나트륨 간의 분해 인자를 계산하였다. 시스템 적합성 파라메터를 계산하기 위한 유럽 약전의 일반적인 방법을 사용하여 라모트리긴의 대칭 계수 및 이론적인 플레이트 수도 계산하였다.

아래의 값을 얻었다.

분해도 10

대칭 계수 1.2

이론상의 플레이트 수 1400

그 다음, 표준 용액 및 시료 용액 S2를 칼럼 상에 주입하였다.

계산

표준 용액의 주피크 면적으로부터 라모트리긴에 대한 응답 계수 (R)를 아래와 같이 계산하였다.

R = (Ws x P)/(As x 100)

상기 식에서,

Ws는 취한 라모트리긴 표준물의 중량 (㎎)이고,

P는 라모트리긴 표준물의 순도 (%)이고,

As는 표준 용액 주입시 라모트리긴 피크의 면적이다.

평균 응답 계수 (MR)를 사용하여 아래와 같이 시료의 라모트리긴 함량을 계산하였다.

라모트리긴 함량 (㎎/정제) = (Au x MR x DFu) / (DFs x N)

라모트리긴 함량 (라벨 표시치의 %) = (Au x MR x DFu x 100) / (DFs x N x L)

상기 식에서,

Au는 시료 용액 S2 주입시 라모트리긴 피크의 면적이고,

N은 시험된 정제의 개수이고,

DFs는 표준 용액 (500)의 희석 계수이고,

DFu는 시료 용액에 대한 희석 계수 (5 ㎎ 정제: 250, 25 ㎎ 정제: 1000, 50㎎ 정제: 1250, 100 ㎎ 정제: 2500 및 200 ㎎ 정제: 5000)이고,

L은 라벨에 표시된 수치이다.

화합물 2의 체류 시간에서 용출하는 모든 부수적 성분의 함량을 아래와 같이 라모트리긴 표준물에 대해서 계산하였다.

라모트리긴에 대한 화합물 2의 함량 (w/w) = (Ai x Ws) / (As x 0.79)

상기 식에서,

Ai는 시료 용액 S2 주입시 화합물 2에 대한 피크의 면적이고,

Ws는 취한 라모트리긴 표준물의 중량 (㎎)이고,

As는 표준 용액 주입시 라모트리긴 피크의 면적이고,

0.79는 화합물 A에 대한 상대 응답 계수이다.

마찬가지로, 상대 응답 계수를 1.0으로 가정하여 라모트리긴에 관련된 다른 모든 부수적 성분의 농도를 중량% 기준으로 계산하였다.

아래 표 2의 결과를 얻었다.

성분	체류 시간 (분)	상대 체류 시간	상대 응답 계수 (RRF)
화합물 2	5.5	3.9	0.79
라모트리긴	1.4	1.0	1.0
향료 (blackcurrant)	2.5	1.8	-
사카린 나트륨	3.2	2.3	-

<실시예 4>

TLC에 의한 약물질 (라모트리긴, 입경 125 ㎛) 중의 화합물 2 및 3의 함량 측정

시험 1 - 화합물 3

메탄올과 2-메톡시에탄올의 등부피 혼합물을 써서 아래의 표준 용액 및 시험 용액을 제조하였다.

용액 1: 시료 용액 5.0%w/v

용액 2: 라모트리긴 참조용 시료 용액 5.0%w/v

용액 3: 화합물 3 용액 0.02%w/v

용액 4: 용액 2 1.0 ㎖를 250 ㎖로 희석한 것

용액 5: 용액 3 10.0 ㎖를 써서 용액 4 10.0 ㎖를 희석한 것

용액 6: 용액 5 7.5 ㎖를 10.0 ㎖로 희석한 것

용액 7: 용액 5 5.0 ㎖를 10.0 ㎖로 희석한 것

용액 8: 용액 5 2.5 ㎖를 10.0 ㎖로 희석한 것

다음의 TLC 조작 조건을 사용하였다.

플레이트: 0.25 mm의 실리카 겔 60 F₂₅₄층으로 코팅된 20 x 20 cm 플레이트

이동상: 에틸 아세테이트/빙초산/메탄올 (85:10:5 v/v)

반점 점적량: 각 용액 10 ㎕

전개 길이: 10 cm

TLC 플레이트를 자연 건조시킨 다음 254 nm에서 자외선으로 관찰하였다. 용액 5를 사용하여 얻은 크로마토그램에서 2개의 반점들이 명백하게 분리되면서 용액 8의 크로마토그램에서 해당하는 반점들이 모두 검출되어야만 시험이 유효한 것이다.

용액 5, 6, 7 및 8 (각각 0.2, 0.15, 0.1 및 0.05 %w/w와 등량)의 크로마토그램에서 얻은 화합물 3에 기인하는 반점들에 대비하여 용액 1의 크로마토그램에서 얻은, Rf 값이 화합물 3에 해당하는 모든 부수적 반점들의 강도를 산정하였다.

용액 5, 6, 7 및 8 (각각 0.2, 0.15, 0.1 및 0.05 %와 등량)의 크로마토그램에서 얻은 라모트리긴에 기인하는 반점들에 대비하여 용액 1의 크로마토그램에서 얻은 모든 부수적 반점들의 강도를 산정하였다.

다음의 Rf 값을 얻었다.

라모트리긴: 0.20

화합물 3: 0.60

시험 2 - 화합물 2

메탄올과 2-메톡시에탄올의 등부피 혼합물을 써서 아래의 시험 및 표준 용액을 제조하였다.

용액 1: 상기 시험 1로부터의 용액 1

용액 2: 화합물 2의 0.05%w/v 용액

다음의 TLC 조작 조건을 사용하였다.

이동상: 클로로포름/메탄올/빙초산/부탄-1-올 (80:10:10:5 v/v)

반점 점적량: 용액 1 10 ㎕ 및 용액 2 2 ㎕

전개 길이: 15 cm

플레이트를 자연 건조시킨 다음, 254 nm의 자외선하에서 관찰하였다. 용액 2 (0.1 및 0.2 중량%와 등량)에서의 화합물 2에 기인하는 반점들에 대비하여 용액1의 크로마토그램에서 Rf 값이 상응하는 모든 부수적 반점의 강도를 산정하였다.

다음의 Rf 값을 얻었다.

라모트리긴: 0.25

화합물 2: 0.37

<실시예 5>

TLC에 의한 약품 (100 ㎎ 라모트리긴 정제) 중의 화합물 2의 측정

표준 용액 및 시료 용액의 제조

100 ㎖ 삼각 플라스크에 약 10 ㎎의 화합물 2를 정확하게 정량하여 넣어서 표준 용액을 제조하였다. 화합물을 메탄올에 용해시키고 메탄올을 사용하여 일정 부피로 희석하였다.

50 ㎖ 삼각 플라스크에 라모트리긴 500 ㎎과 동등한 양의 분말 정제를 옮겨서 시료 용액을 제조하였다. 분말을 염산 (0.1 M) 15 ㎖에 분산시키고 메탄올:2-메톡시에탄올 (15/15 v/v, 30 ㎖)의 혼합물을 첨가하였다. 플라스크를 10분간 초음파조에 두었다. 그 다음, 용액을 실온으로 냉각시키고 메탄올:2-메톡시에탄올 용매 혼합물을 사용하여 일정 부피로 희석하였다. 이 용액을 잘 혼합하고 여과지 (와트만 No.1)를 통해 여과하였다. 맑은 여액을 시험 용액으로 사용하였다.

시험 방법

아래의 TLC 조작 조건을 사용하였다.

이동상: 클로로포름/메탄올/빙초산/부탄-1-올 (80:10:10:5 v/v)

반점 점적량: 시험 용액 10 ㎕, 표준 용액 3 ㎕ 및 5 ㎕

전개 길이: 15 cm

플레이트를 자연 건조시키고 254 nm의 자외선에서 관찰하였다.

표준 용액 (불순물 0.3%w/w에 해당) 3 ㎕를 사용하여 얻은 반점에 대비하여 시료 용액의 크로마토그램에서 얻은 주 반점 외의 모든 반점의 강도를 산정하였다. 모든 2차 반점들을 합한 강도는 표준 용액 (불순물 0.3%w/w에 해당) 5 ㎕를 점적한 경우보다 크지 않았다.

아래의 Rf 값을 얻었다.

라모트리긴: 0.20

화합물 2: 0.34

본 명세서 및 첨부된 특허 청구 범위에서 "함유하다"와 "포함하다" 및 "함유하는"과 "포함하는" 등의 단어들은 문맥상 달리 요구되지 않는 한 포괄적으로 이해되어야 한다. 즉, 이들 단어들의 사용은 구체적으로 인용되지 않은 요소(들)을 포함하는 것을 뜻할 수 있다.

본 발명은 단지 예를 들어 설명하였고, 첨부된 특허 청구 범위의 범위 및 취지에 속하고 본 명세서를 기초로 당업계의 숙련자들에게는 명백할, 본 발명에 대한 변경도 또한 본 발명에 포함되는 것으로 인식된다.

본 발명에 따른 참조용 마커를 사용하여 라모트리긴 또는 이를 함유하는 제약 제형의 순도 및 분해 안정도를 분석한 데이터는 상기 약물질과 약품의 인허가시에 필요한 자료를 작성하는 데 아주 유용하다.

Claims

라모트리긴 시료 또는 라모트리긴을 함유한 제약 제형을 3-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-5-(4H)-온 및 N-[5-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-3-일]-2,3-디클로로벤즈아미드로부터 선택된 화합물에 대해 분석하는 것을 포함하는, 라모트리긴 시료 또는 라모트리긴을 함유하는 제약 제형의 순도 또는 분해 안정도의 시험 방법.
제1항에 있어서,

i) 라모트리긴 시료를 용매에 용해시켜 시료 용액을 제조하는 단계,

ii) 3-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-5-(4H)-온 또는 N-[5-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-3-일]-2,3-디클로로벤즈아미드 시료를 용매에 용해시켜 참조용 마커 표준 용액을 제조하는 단계,

iii) 시료 용액 및 표준 용액을 박층 크로마토그래피하여 각각에 대한 TLC 크로마토그램을 얻는 단계, 및

iv) 표준 용액의 크로마토그램에서 참조용 마커로 인한 반점에 비추어 시료 용액의 크로마토그램에서 Rf 값이 참조용 마커에 해당하는 부수적 반점의 강도를 산정하는 단계

를 포함하는 라모트리긴 시료의 순도 시험 방법.
제1항에 있어서,

i) 라모트리긴 함유 제약 제형의 시료를 용매에 용해시켜 시료 용액을 제조하는 단계,

ii) 3-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-5-(4H)-온을 용매에 용해시켜 참조용 마커 표준 용액을 제조하는 단계,

iii) 시료 용액 및 표준 용액을 박층 크로마토그래피하여 각각에 대한 TLC 크로마토그램을 얻는 단계, 및

iv) 표준 용액의 크로마토그램에서 참조용 마커로 인한 반점에 비추어 시료 용액의 크로마토그램에서 Rf 값이 참조용 마커에 해당하는 부수적 반점의 강도를 산정하는 단계

를 포함하는, 라모트리긴 함유 제약 제형의 분해 안정도 시험 방법.
제1항에 있어서,

i) 라모트리긴 함유 제약 제형의 시료를 용매에 용해시켜 1개 이상의 시료 용액을 제조하는 단계,

ii) 라모트리긴 표준물을 용매에 용해시켜 표준 용액을 제조하는 단계,

iii) 시료 및 표준 용액을 HPLC 칼럼에 주입하는 단계 및

iv) 각 용액의 주피크 면적을 측정하고 이로부터 시료 용액(들)에서 참조용 마커인 3-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-5-(4H)-온의 함량을 계산하는 단계

를 포함하는, 라모트리긴 함유 제약 제형의 분해 안정도 시험 방법.
화학식 3의 N-[5-아미노-6-(2,3-디클로로페닐)-1,2,4-트리아진-3-일]-2,3-디클로로벤즈아미드인 화합물.

<화학식 3>
거의 순수한 형태인 제5항에 따른 화합물의 시료.
제6항에 있어서, 순도가 90% 이상인 시료.
i) 35℃ 미만의 온도에서 2,3-디클로로벤조일 클로라이드 2 당량을 피리딘 에 용해된 라모트리긴 1 당량과 반응시키는 단계 또는

ii) 환류하 프로판-1-올 중에서 화학식 4의 화합물을 고리화하는 단계

를 포함하는, 제5항에 따른 화합물의 제조 방법.

<화학식 4>
제8항에 있어서, ii) 단계에서 화학식 4의 화합물은 무기산의 존재하에서 화학식 5 및 6의 화합물을 함께 반응시켜 제조한 것인 방법.

<화학식 5>

<화학식 6>
제9항에 있어서, 화학식 5의 화합물은 2,3-디클로로벤조일 시아나이드를 황산 중의 아미노구아니딘 비카르보네이트 용액으로 처리하여 제조한 것인 방법.