CZ82099A3

CZ82099A3 - Způsob zjištění čistoty a stálosti vzorku lanotriginu

Info

Publication number: CZ82099A3
Application number: CZ1999820A
Authority: CZ
Inventors: Lorraine Mary Edmeades; Nigel Arthur Griffith-Skinner; Derek Anthony Hill; Graham Thronton Hill; Terence William Packham
Original assignee: The Wellcome Foundation Limited
Priority date: 1999-03-10
Filing date: 1999-03-10
Publication date: 2000-04-12

Abstract

Způsob zjištění čistoty a stálosti vzorku lamotriginu nebo fermaceutického prostředku s obsahem lamotriginu spočívá v tom, že se ve vzorku prokazuje přítomnostsloučeniny ze skupiny 3-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)-1,2,4-triazin-5-(4H)- onu, sloučeniny A a N-/5-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)-l,2,4- triazin-3-yl/-2,3-dichlorbenzamidu, sloučeniny B. Součást řešení tvoří také nová sloučeninaB a způsob výroby této látkyZpůsob zjištění čistoty a stálosti vzorku lamotriginu nebo fermaceutického prostředku s obsahem lamotriginu spočívá v tom, že se ve vzorku prokazuje přítomnostsloučeniny ze skupiny 3-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)-1,2,4-triazin-5-(4H)- onu, sloučeniny A a N-/5-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)-l,2,4- triazin-3-yl/-2,3-dichlorbenzamidu, sloučeniny B. Součást řešení tvoří také nová sloučeninaB a způsob výroby této látky

Description

Způsob zjištění čistoty a stálosti vzorku lamotriginu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu zjištění čistoty a stálosti vzorku lamotriginu při použití značících látek, vzorkem je zejména farmaceutický prostředek.

Dosavadní stav techniky

Aby bylo možno dosáhnout registrace nových účinných látek a povolení k jejich distribuci, musí výrobce takové látky prokázat, že jeho produkt je pro tento účel vhodný.

Musí být například zřejmé, že účinnou látku je možno podávat lidem a že prostředek s jejím obsahem je prostý nečistot a má dostatečnou skladovatelnost.

Úřadu, který provádí registraci a povoluje distribuci nových účinných látek je tedy nutno prokázat a) že prostředek neobsahuje nečistoty v okamžiku své výroby nebo je obsahuje pouze v zanedbatelné míře a b) že stálost sloučeniny při skladování je přijatelná. Tyto údaje se obvykle získávají zkouškami ve srovnání se zevním standardem nebo značící látkou, která je dostatečně čistým vzorkem potenciální nečistoty nebo potenciálního degradačního produktu.

Potenciální nečistoty v případě farmaceuticky účinných látek a farmaceutických prostředků, které je obsahují mohou být zejména zbytky synthetických prekursorů účinných látek, vedlejší produkty, vznikající při výrobě účinné látky, zbytky rozpouštědel, isomery účinné látky, nečistoty, které byly přítomny ve výchozích látkách pro výrobu účinné látky nebo při výrobě farmaceutického prostředku a také předem neidentifikované náhodné nečistoty. Další nečistoty, které se mohou objevit v průběhu skladování zahrnují zejména

degradační produkty účinné látky, které mohou vzniknout například v důsledku oxidace nebo hydrolýzy účinné látky.

Lamotrigin je 3,5-diamino-6-(2, 3-dichlorfenyl)-1,2,4triazin, který je možno vyjádřit vzorcem IV

Jde o známou sloučeninu, která se užívá k léčení poruch centrálního nervového systému CNS, zvláště epilepsie, jak je popsáno například v EP 21121. Lamotrigin jako takový i farmaceutické prostředky s jeho obsahem se vyrábějí tak, že po výrobě jsou poměrně prosté nečistot. Lamotrigin zůstává při výrobě farmaceutického prostředku obvykle stálý.

Nyní bylo zjištěno, že jako referenční značící látky pro analýzu lamotriginu nebo farmaceutických prostředků s jeho obsahem je možno užít 2 látky. Jedna z těchto látek je potenciální degradační produkt a druhá je potenciální nečistota, která může vzniknout vedlejšími reakcemi v průběhu výroby lamotriginu.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob zjištění čistoty a stálosti vzorku lamotriginu nebo farmaceutického prostředku s obsahem lamotriginu, tento způsob spočívá v tom, že se vzorek analyzuje na přítomnost 3-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)-1,2,4triazin-5-(4H)onu a N-/5-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)-1,2,4triazin-3-yl/-2,3-dichlorbenzamidu. Tyto látky se tedy užívají jako referenční značící látky.

• A •	• ·	• A A A A A A
•	A A	A A A A A A
•	AAA	A A A AAAAAA
•	A A	A A A A
• ·	AAAA

3-amino-β-(2,3-dichlorfenyl)-1,2,4-triazin-5-(4H)-on je sloučenina vzorce A ιυ

NH₂

Sloučenina vzorce A je potenciální degradační produkt lamotriginu, který vzniká hydrolýzou této látky. Zejména jde o hydrolýzu lamotriginu za bazických podmínek. Hydrolýza probíhá například při styku lamotriginu, baze a vody s následným zahřátím výsledného roztoku na teplotu varu pod zpětným chladičem. Použitou baží je s výhodou silná baze, například hydroxid alkalického kovu. Zvláště výhodnou látkou je hydroxid sodný. Bazický roztok ve vodě je možno zahřívat na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu 1 až 48 hodin, například 10 až 36 hodin a zvláště 24 hodin.

Druhá sloučenina, užitá jako referenční značící látka je nová. Součást podstaty vynálezu proto tvoří také tato látka, N-/5-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)-1,2,4-triazin-3-yl/2,3-dichlorbenzamid vzorce B:

(B)

NHCO

Cl

4 · 4 » · · · » 4 4 · • · 4 4 4 4 • 4

4· 4 4

Sloučeninu vzorce B je možno připravit přímo tak, že se na lamotrigin působí 2,3-dichlorbenzoylchloridem v pyridinu. Jde o potenciální nečistotu, která může vzniknout při vedlejším reakcích, k nimž může dojít při výrobě účinné látky. Pro praktické použití má být koncentrace této látky v surovém lamotriginu maximálně 0,5 % při stanovení chromatografií na tenké vrstvě TLC. Po překrystalování surové látky s touto čistotou je pak možno získat lamotrigin s obsahem nejvýš 2 % všech nečistot, který splňuje požadavky farmaceutického průmyslu.

Výroba lamotriginu bude popsána v referenčním příkladu 1. Meziprodukt pro tuto výrobu, 2,3-dichlorbenzoyl- kyanid (meziprodukt 1,4 při syntéze) může obsahovat jako nečistotu až 10 % anhydridu kyseliny 2,3-dichlorbenzoové. V případě, že se na tuto látku působí roztokem hydrogenuhliči- tanu aminoguanidinu v kyselině sírové podle stupně d) referenčního příkladu 1, vzniká adiční produkt, kterým je meziprodukt 1.5, (Z)-2-(2,3-díchlorfenyl)-2-(guanidinoimino)- acetonitrii.

Tato nečistota typu anhydridu pak může reagovat s adičním produktem, čímž vzniká (Z)-2-(2,3-dichlorfenyl)-2/N' -(2,3-dichlorbenzoyl)guanidinoimino/acetonitril,který je přímým prekursorem sloučeniny B. Cyklizací tohoto prekursoru v propan-l-olu při teplotě varu pod zpětným chladičem vzniká sloučenina B.

Součást podstaty vynálezu tvoří také způsob výroby sloučeniny B, tento postup spočívá v tom, že se

i) nechají reagovat 2 ekvivalenty 2,3-dichlorbenzoylchloridu s jedním ekvivalentem lamotriginu, rozpuštěného v pyridinu při teplotě nižší než 35 °C, nebo se ii) cyklizuje sloučenina vzorce I

v propan-l-olu při teplotě varu pod zpětným chladičem.

Ve stupni ii) se sloučenina vzorce I získá reakcí sloučenin vzorců II a III.

h₂n^n nh₂

Cl (ii) v přítomností anorganické kyseliny, například kyseliny sírové.

Sloučeninu vzorce II je možno získat tak, že se na 2,3-dichlorbenzoylkyaníd působí roztokem hydrogenuhličitanu aminoguanidinu v kyselině sírové.

V případě použití sloučenin A a B jako referenčních značících látek je nutno tyto látky použít s příslušnou • · · · · · · · · • · · · ♦ · ♦ ······ • · · · · · · £ ·· ···· ··· ···· ·· ·· čistotou. Je proto možno sloučeniny A a B, získané svrchu uvedeným způsobem v případě potřeby dále čistit k dosažení požadované úrovně čistoty. Do způsobu podle vynálezu pro výrobu sloučeniny B je tedy možno zařadit další čisticí stupeň.

Čištění je možno uskutečnit postupy, které jsou při organických syntézách běžné. Je například možno sloučeninu zahřívat v organickém rozpouštědle, například v alkanolu o 1 až 6 atomech uhlíku, roztok zfiltrovat a vysušit ve vakuu. Roztoky se obvykle zahřívají na teplotu varu rozpouštědla pod zpětným chladičem. Použitým alkanolem je s výhodou propanol. Je také možno nechat sloučeninu překrystalovat z horkého alkanolu o 1 až 6 atomech uhlíku, s výhodou z horkého propanolu.

Sloučeniny A a B se na konci postupu s výhodou izolují ve v podstatě čisté formě. Čistota výsledného vzorku těchto látek je typicky nejméně 80 %, například nejméně 85 % a zvláště nejméně 90 %. Čistota vyšší než 90 % je žádoucí, není však nezbytná. Čistota může být například nejméně 92 %, nejméně 95 % nebo nejméně 98 %. Ještě výhodnější je čistota 99 % nebo 99,5%.

Na čistotu nebo stálost proti degradaci je možno analyzovat lamotrigin jako takový nebo farmaceutickou lékovou formu, která lamotrigin obsahuje. Je například možno prokazovat čistotu lamotriginu přímo po jeho výrobě. V tomto případě se obvykle sloučenina analyzuje jak na přítomnost degradačního produktu A, tak na přítomnost nečistoty B. Farmaceutickou lékovou formu je rovněž nutno analyzovat k průkazu stálosti účinné látky proti degradaci, zejména po skladování po dobu několika let. Farmaceutické lékové formy, kterými jsou obvykle běžné tablety pro perorální podání nebo

Ί ·· ·* ··

• · · · · • 9 9·9 999

9 9 dispergovatelné tablety jsou v typických případech analyzovány pouze na přítomnost degradačního produktu A.

Vzorek látky nebo lékové formy může být analyzován jedním nebo větším počtem běžných analytických postupů. Může jít například o vysokotlakou kapalinovou chromatografii HPLC nebo chromatografii na tenké vrstvě TLC. Získané výsledky se srovnávají s výsledky, které byly získány při analýze v podstatě čistého referenčního vzorku sloučeniny A nebo B. Na základě získaných výsledků je pak možno stanovit přesný obsah každé z uvedených látek ve vzorku.

Čistota vzorku lamotriginu může tedy být určena následujícím způsobem:

i) vzorek lamotriginu se rozpustí v rozpouštědle za vzniku roztoku lamotriginu, ii) vzorek 3-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)-1,2,4-triazin5-(4H)-onu nebo N-(5-amino-6-(2,3-dichlorf enyl)-1,2,4-t.riazin -3-yl/-2,3-dichiorbenzamidu se rozpustí v rozpouštědle za vzniku standardního roztoku značící látky iii) roztok vzorku i standardní roztok se podrobí chromatografii na tenké vrstvě a iv) stanoví se intenzita jakékoliv sekundární skvrny v chromatogramu roztoku vzorku, odpovídající hodnotě Rf referenční značící látky a intenzita této skvrny se srovnáná se skvrnou pro referenční značící látku v chromatogramu standardního roztoku.

V případě stanovení stálosti farmaceutického prostředku s obsahem lamotriginu proti degradaci se postupuje tak, že se

i) rozpustí vzorek lékové formy v rozpouštědle za vzniku roztoku vzorku,

φ φ • φ

• Φ φφφφ ii) rozpustí se vzorek 3-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)1,2,4-triazin-5-(4H)-onu v rozpouštědle za vzniku standardního roztoku referenční značící látky, iii) roztok vzorku i standardní roztok se analyzují chromatografii na tenké vrstvě a iv) stanoví se intenzita jakékoliv sekundární skvrny v chromatogramu roztoku vzorku, která odpovídá skvrně pro referenční značící látku a srovná se s intenzitou skvrny pro referenční látku v chromatogramu standardního roztoku.

V dalším provedení spočívá způsob zjištění stálosti farmaceutické lékové formy s obsahem lamotriginu proti degradaci v tom, že se

i) rozpustí vzorek lékové formy v rozpouštědle za vzniku jednoho nebo většího počtu roztoků vzorku, ii) rozpustí se vzorek referenční látky v rozpouštědle za vzniku standardního roztoku, iii) vzorek lékové formy a standardní roztok se vstříknou do sloupce HPLC a iv) stanoví se hlavní oblasti vrcholů pro každý roztok a z nich se vypočítá obsah referenční značící látky, 3-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)-1,2,4-triazin-5-(4H)-onu pro každý roztok.

Při tomto provedení může být zapotřebí promýt sloupec

HPLC před stupněm iii), aby bylo možno stanovit dělicí faktor mezi lamotriginem a pomocnými látkami, přítomnými v lékové formě. V tomto případě bude postup obsahovat ještě další přídatný stupeň iia)rozpuštění lamotriginu a standardních pomocných látek v rozpouštědle a vstříknutí roztoku do systému HPLC ke φ · φφφ • · · φ

• φ stanovení dělícího faktoru mezi lamotriginem a pomocnou látkou, kterou může být například sodná sůl sacharinu.

Součást podstaty vynálezu tvoří také použití obou svrchu uvedených látek A a B jako referenčních značících látek pro stanovení čistoty a stálostí vzorku lamotriginu nebo farmaceutické lékové formy s jeho obsahem.

Obvykle je lamotrigin poměrně čistý a při skladování poměrně stálý. Analytické zkoušky, prováděné s touto látkou nebo s farmaceutickou lékovou formou s obsahem této látky tedy slouží především k potvrzení, že sloučeniny A a/nebo B nejsou přítomny nebo jsou přítomny pouze pod hranicí stanovitelnosti běžných analytických technik (přibližně 0,3 % hmotnostních v případě TLC a 0,06 % hmotnostních při HPLC).

Místo rozboru vzorku referenční značící látky při každé analýze je také možno postupovat tak, že se místo této analýzy užije při rozboru vzorku účinné látky nebo lékové formy parametr, známý jako referenční faktor R. Jde o předem stanovený poměr výsledků, získaných při analýze vzorků sloučeniny A nebo B při použití daného analytického postupu k. odpovídajícímu výsledku, získanému při analýze čistého lamotriginu v ekvivalentní koncentraci. Tímto číselným výsledkem může být například hodnota plochy pod křivkou vrcholu při HPLC. Při známých analytických výsledcích pro čistý lamotrigin a pro zkušební vzorek farmaceutické lékové formy s jeho obsahem je tedy možno použít tento známý faktor pro sloučeniny A nebo B k vypočítání množství těchto referenčních značících látek ve vzorku.

Výpočet může být ilustrován s ohledem na výsledky analýzy HPLC následujícím způsobem.

% hmotnostní sloučeniny A nebo B Ar x Ws

99 • · · • · « « • * · ·· 9999

9 9

99 9 ve vzorku relativně k lamotriginu As x R kde:

Ar = plocha pod hlavním, vrcholem sloučeniny při HPLC

As = plocha pod hlavním vrcholem lamotriginu ve stan dardním roztoku při HPLC

R = referenční faktor pro uvedenou látku

Ws = hmotnost standardu v mg.

Pro sloučeninu A je uvedený faktor 0,79 při prováděn

HPLC.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Referenční příklad 1: příprava lamotriginu

Lamotrigin je možno připravit v několika stupních podle následujícího reakčního schématu:

ΦΦ φφ φ • φ · φ · · φφφ φ

ΦΦΦ· φ φφφ φ φφ φφφφ φφφ φφ φφ φφ φ φ φφφφ φ φφφφ φ φ φφφ φφφ • φ φ φφφφ φφ φφ

Stupeň a; příprava meziproduktu 1.2

Roztok 1 mol sloučeniny 1.1, terč.butylalkoholu, vody a 2 mol hydroxidu sodného se míchá a v průběhu 3 hodin se k němu přidá při teplotě 50 až 60 °C roztok peroxidu vodíku s koncentrací 35 % hmotnostních (4 mol). Směs se 30 minut míchá při teplotě 55 až 60 °C, pak se terč.butylalkohol

oddestiluje a vodný roztok se promyje toluenem. Vodný roztok se pak okyselí na pH 1 až 2 a produkt se odfiltruje a promyje se vodou. Vlhká pevná látka se přímo užije v následujícím stupni postupu nebo se suší při teplotě 80 až 90 °C na bílou pevnou látku. Výtěžek je 75 %.

Stupně b) a c): příprava meziproduktu 1.4

Roztok 1 mol sloučeniny 1.2 v toluenu se míchá a destilací se odstraní voda. Pak se roztok zchladí, přidá se 0,005 mol pyridinu a pak se ještě pomalu přidá 1,1 mol thionylchloridu. Roztok se jednu hodinu zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem a pak se odpaří ve vakuu, čímž se získá surový produkt 1.3. Přidá se 1,2 mol jodidu draselného a pak ještě 1,2 mol kyanidu měďného a jakékoliv zbývající rozpouštědlo se oddestiluje při vnitřní teplotě reakční směsi 140 až 144 °C. Tato teplota se udržuje 18 až 24 hodin, pak se reakční směs zchladí, zředí se toluenem a zfiltruje k odstranění anorganických solí. Roztok se odpaří do sucha ve vakuu při teplotě 60 až 70 °C a zbývající olej se nechá krystalizovat z petroletheru, čímž se získá meziprodukt 1.4 jako žlutá pevná látka ve výtěžku 77 %.

Stupeň d): příprava meziproduktu 1.5

1,75 mol hydrogenuhličitanu aminoguanidinu se rozpustí v roztoku kyseliny sírové s koncentrací 9,3 až 10,0 M. Pak se k suspenzi za míchání přidá 1 mol 2,3-dichlorbenzoyl kyanidu při teplotě 20 až 30 °C v průběhu 42 až 48 hodin. Surový produkt se odfiltruje a promyje se vodou. Pevný podíl se přidá k roztoku hydroxidu sodného při teplotě nižší než 35 °C, pak se produkt odfiltruje, promyje se vodou a suší při teplotě 80 až 90 °C, čímž se ve výtěžku 66 % získá meziprodukt 1.5 jako žlutá pevná látka.

• ·

Stupeň e): příprava surového lamotriginu

Roztok meziproduktu 1.5 v propan-l-olu se míchá 90 až

120 minut při teplotě varu pod zpětným chladičem, pak se zchladí na 15 až 25 °C a surový lamotrigin se odfiltruje, čímž se ve výtěžku 90 % získá světle hnědá pevná látka. Surový lamotrigin se pak čistí překrystalováním z propan-l-olu v přítomnosti aktivního uhlí a produkt se suší při teplotě 80 až 90 °C za získání čistého lamotriginu.

Příklad 1

Příprava 3-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)-1,2,4-triazin5(4H)-onu, sloučeniny Ά

614,4 g, 2,4 mol lamotriginu a 242,4 g pevného hydroxidu sodného se smísí se 60 litry vody a směs se vaří za míchání pod zpětným chladičem celkem 24 hodin. Výsledný roztok se zchladí na 15 až 20 °C a ph se upraví kyselinou chlorovodíkovou na 5,5 až 6,0. Výsledný pevný podíl se odfiltruje a suší 24 hodin nejprve při teplotě 40, pak při teplotě 50 a nakonec při teplotě 70 °C. Čistota produktu byla 82 % při stanovení HPLC, která byla prováděna za těchto podmínek.:

Sloupec: Spherisorb 50 DS

Eluční činidlo: Voda (600) :acetonitril (400):0,5M kyselina sírová (15)

Rychlost průtoku: 2,0 ml/min.

Vzorek: 50 mg ve 100 ml

Objem: 5 nebo 10 mikrolitrů

Detekce: 270 nm

Vzorek 583 g produktu s čistotou 82 % byl smísen s 15 litry propanolu a roztok byl 0,5 hodin vařen pod zpětným chladičem. Po extrakci a sušení byla sloučenina A získána s ··(*·· čistotou 96,2 % při stanovení pomocí HPLC za svrchu uvedených podmínek.

Další čisticí stupeň byl proveden tak, že vzorek produktu s čistotou 96,2 % byl vařen 1 hodinu v 5 litrech propanolu za míchání. Pak byl pevný podíl odfiltrován a sušen při teplotě 40 °C v vakuu, čímž bylo ve výtěžku 74,7 % získáno 460,7 g výsledného produktu. Tento produkt měl čistotu 99,1 % při stanovení HPLC.

Získaný produkt měl následující fyzikální vlastnosti:

Molekulový vzorec: C₉H₆C1₂N₄O molekulová hmotnost 257,08 Elementární analýza:

Vypočteno: C 42,06 H 2,35 N 21,80 %

Nalezeno: C 42,02 H 2,25 N 21,23 %

TLC při použití silikagelu a směsi chloroformu, methanolu, ledové kyseliny octové a butan-l-olu v poměru 80:10:10:5.

Hlavní skvrna při Rf = 0,38

Stopy při Rf = 0,82

Spektrum v infračerveném světle v KBr má maxima při

3301, 3127, 1655, 1556, 1484, 1413, 1290, 1200, 1056, 812, 785, 748, 737 a 719 cm'¹' ’Ή NMR:ppm v d₆-dmso (22mg/ml)300 MHz:12,43 (lH,bs),

2,5 (q, dmso-d₅) , 0(s,TMS).

Hmotové spektrum: m/z: 256 (M⁺) , 258 a 260 (izotopové ionty), 221, 186, 171, 85 (fragmenty iontů jak je uvedeno níže) :

Cl nh₂ _?_221

171 '85 ·

Příklad 2

Příprava N-/5-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)-1,2,4-triazin-3-yl/-2,3-dichlorbenzamidu, sloučeniny B.

512,00 g, 2,00 mol lamotriginu se rozpustí ve 3 litrech pyridinu a při teplotě nižší než 35 °C se přidá 873,00 g 2,3-dichlorbenzoylchloridu s čistotou 96 %, což je ekvivalent 838,10 g, 4,00 mol čisté látky. Při přidávání se směs míchá za nepřístupu vody. Chlorid kyseliny se přidá ve dvou stejných podílech. Druhý podíl se přidá 30 minut po začátku reakce a směs se pak míchá při teplotě nižší než 35 °C ještě dalších 30 minut.

Výsledná směs se odpaří téměř do sucha a pak se roztírá s 1300 ml chloroformu celkem 10 minut za stálého míchání. Výsledný pevný podíl s odfiltruje, promyje se 3x50 ml chloroformu a suší při teplotě místnosti až do hmotnosti 308 g, výtěžek je 36 %, vztaženo na sloučeninu B. Vzorek 50,0 g surového produktu se vaří s 500 ml methanolu pod zpětným chladičem za míchání 1 hodinu a výsledná horká směs se zfiltruje, čímž se získá 37,0 g sloučeniny B ve velmi čisté formě.

Takto získaný výsledný produkt má následující fyzikální vlastnosti:

Molekulový vzorec: C₁₆H₉C1₄N₅O molekulová hmotnost 429,09 Spektrum v infračerveném světle v KC1 má maxima při 3468, 3300, 3202, 3385, 3277, 1687, 1625, 1559, 1414, 1387, 1538,

1459, 1253, 1157, 1136, 1116, 790, 775, 741 a 724 cm’¹.

^XH NMR: ppm v d_g-dmso(39 mg/ml) 300 MHz: 10,85(IH,bs), 7,8(lH,bs), 7,l(lH,bs), 7,77 (IH,d,J=7Hz), 7,73(IH,d,J=7Hz), 7,5(4H,m), 4,08(bs), 3,32(bs, voda), 3,18(s),

2,50(q,dmso-d₅) , 2,31(s,methansulfonát), 0,00(s,TMS).

Hmotová spektroskopie:

Chemická ionizace (Cl): m/z 428 (M+l)⁺,

430, 432 a 434 (izotopové ionty),

Bombardování elektrony (El) m/z 428 (M+l)⁺, 392, 199, 185, 173, 145 (fragmenty iontů, jak je uvedeno níže)

Příklad 3

Zkouška na lamotrigin a na sloučeninu A v dispergovatelných tabletách pomocí HPLC.

Příprava standardního roztoku a roztoků pro určení distribuce v systému.

Standardní roztok byl připraven tak, že byl přenesen referenční roztok přibližně 100 mg přesně naváženého lamotriginu do volumetrické baňky s objemem 500 ml. Pak bylo přidáno 200 ml methanolu k rozpuštění pevné látky a pak byla za mí25 cháni přidána ještě 0,5 M kyselina chlorovodíková v množství

100 ml. Výsledný roztok byl ponechán zchladnout na teplotu místnosti a pak byl zředěn vodou na požadovaný objem.

Roztok pro zjištění distribuce byl připraven tak, že bylo uložena 100 mg standardu lamotriginu a 20 mg standardu • · · · · · · · ···· • · · · ····· • » · · · · · ······ • · · · · · · ·· ···· ··· ··· ·· ·· sodné soli sacharínu do volumetrické baňky s objemem 500 ml a materiál byl zředěn vodou na požadovaný objem.

Příprava roztoků vzorků 5 Roztok Sl

Podle údajů z následující tabulky 1 byl roztok Sl připraven přenesením určeného množství tablet do volumetrické baňky. Pak byl přidán objem 0,5 M kyseliny chlorovodíkové, uvedený v tabulce a roztok byl míchán až do rozpuštění tablet

10	a až dc	, okamžiku,	kdy se přestal vyvíjet	plyn.
		Pak byl přidán uvedený objem methanolu	a :	roztok byl
	uložen	na 10 minut	do ultrazvukové lázně	. Pak	byl	roztok po-
	nechán	při teplotě	místnosti k dosažení	rovnovážného stavu,
	načež byl zředěn vodou na požadovaný objem.
15		Tabulka 1
	Obsah	Počet	Ob j em	Ob j em	Obj em
	látky	tablet	baňky	0,5M	HC1	methanolu
	mg		ml	ml		ml
	5	10	250	50		100
20	25	8	200	40		80
	50	5	250	50		100
	100	5	500	100		200
	200	5	1000	200		400
25		Roztok S2
		a) tablety	s obsahem 5 mg
		Roztok Sl,	připravený svrchu uvedeným	způsobem se

zfiltruje přes filtrační papír Whatman č.l. Prvních 10 ml se odloží. Čirý filtrát slouží jako vzorek.

b) tablety s obsahem 25 mg, 50 mg, 100 mg a 200 mg

.................

Roztok SI se zfiltruje přes filtrační papír Whatman č.l. Prvních 10 ml filtrátu se odloží. Pak se 10,0 ml filtrátu přenese do volumetrické baňky s objemem 50 ml a zředí na příslušný objem směsí 0,5 M kyseliny chlorovodíkové, vody a methanolu v objemovém poměru 20:20:40.

Chromatografický postup

Při chromatografii vzorku byl postup prováděn za následujících podmínek:

Sloupec: 125x4,6 mm vnitřní průměr. Nerezová ocel, náplň Spherisorb 5 mikrometrů ODS 1 nebo ekvivalent.

Mobilní fáze: směs vody, methanolu, acetonitrilu, ledové kyseliny octové a n-oktylaminu v objemovém poměru 700:100:100:20:0,5.

Teplota: postup se provádí při teplotě místnosti

Rychlost průtoku: 2,0 ml/min.

Vlnová délka: 275nm

Vstřikovaný objem: 20 mikrolitrů.

Poznámky:

a) sloupce byly ponechány před použitím do rovnovážného stavu při promývání methanolem při malé rychlostí průtoku po dobu 30 minut,

b) specifičnost postupu je ovlivněna poměrem vody k methanolu a acetonitrilu,

c) snížením obsahu methanolu a acetonitrilu v mobilní fázi je možno zvýšit rozdělení lamotriginu a sodné soli sacharinu, současně se zvýší doba retence všech složek,

99 99 • · · ♦ · · • · · · · • · ♦ · · · · ♦

d) malé změny v koncentraci kyseliny vzhledem k poměru methanolu k acetonitrilu a malé změny v koncentraci acetylaminu nemají podstatný vliv na průběh chromatografie,

e) po použití byl sloupec promyt nejprve směsí methanolu a vody v poměru 1,9 a pak čistým methanolem.

Provedení chromatografie

Jakmile bylo dosaženo stálé úrovně základní linie, byl vstřiknut roztok pro stanovení dělicí schopnosti a vypočítán faktor dělení lamotriginu a sodné soli sacharinu. Byl také vypočítán teoretický faktor pro symetrii a počet teoretických desek pro lamotrigin při použití obecného postupu evropského lékopisu pro tyto výpočty. Byly získány následující hodnoty:

Rozdělení 10

Faktor symetrie 1,2

Počet teoretických desek 1400

Po tomto stanovení byl do sloupce vstřiknut standardní roztok a roztok vzorku S2.

Výpočty

Z plochy pod hlavním vrcholem pro standardní roztok byl vypočítán faktor R pro lamotrigin následujícím způsobem:

R = Ws x P As x 100 kde:

Ws ~ hmotnost standardu lamotriginu v mg

P = čistota referenčního standardu lamotriginu v %

As = plocha pod vrcholem pro lamotrigin při vstřiknutí standardního roztoku

Průměrná hodnota tohoto faktoru MR byla použita k výpočtu obsahu lamotriginu ve vzorku následujícím způsobem:

Obsah lamotriginu mg/tableta = Au x MR x DFu DFs χ N

Obsah lamotriginu = Au x MR x DFu x 100 5 (% udaného množství) DFs χ N x L kde:

Au = plocha pod vrcholem pro lamotrigin po vstřiknutí roztoku vzorku S2,

N = počet zkoumaných tablet,

DFs = faktor zředění pro standardní roztok (500)

DFu = faktor zředění pro roztok vzorku (250 pro tablety 5 mg, 1000 pro tablety 25 mg, 1250 pro tablety 50 mg, 2500 pro tablety 100 mg a 5000 pro tablety 200 mg),

L = uváděné množství látky

Hmotnostní poměr obsahu sloučeniny A k obsahu lamotriginu = Ai x Ws

As x 0,79 kde

Aí = plocha pod vrcholem pro sloučeninu A po vstřiknutí roztoku vzorku S2,

Ws = hmotnost referenčního standardu lamotriginu mg As = plocha pod vrcholem lamotriginu po vstřiknutí standardního roztoku, . 0,79 = relativní faktor pro sloučeninu A.

Podobným způsobem byla vypočítána v % hmotnostních množství jakýchkoliv dalších sekundárních složek při předpokládaném relativním faktoru 1,0. Tímto způsobem byly získány výsledky, uvedené v následující tabulce 2.

·· 99 » · ♦ · > 9 9 9

999 999

Tabulka 2

Složka	Doba retence	Relativní doba	Relativní
	min.	retence min.	faktor RRF
Sloučenina A	5,5	3,9	0,79
Lamotrigin	1,4	1,0	1,0
Borůvková	2,5	1,8	-
příchuť
Sodná sůl	3,2	2,3	-
sacharinu

Příklad 4

Stanovení sloučenin A a B v lamotriginu při velikosti částic 125 mikrometrů pomocí TLC

Pokus 1 - sloučenina B

Byly připraveny následující standardní a zkušební roztoky ve směsi stejných objemů methanolu a

2-methoxyethanolu.

Roztok 1;roztok vzorku 5,0 % hmotnostních Roztok 2:roztok referenčního vzorku lamotriginu s koncentrací 5,0 % hmotnostních

Roztok 3rroztok sloučeniny B 0,02 % hmotnostních Roztok 4: 1,0 ml roztoku 2, zředěno na 250 ml Roztok 5: 10,0 ml roztoku 4,zředěno 10,0 ml roztoku 3 Roztok 6: 7,5 ml roztoku 5, zředěno na 10,0 ml Roztok 7: 5,0 ml roztoku 5, zředěno na 10,0 ml

Roztok 8; 2,5 ml roztoku 5, zředěno na 10,0 ml Při provádění TLC byly užity tyto podmínky: deska: deska s rozměrem 20 x 20 cm, opatřená povlakem

0,25 ml silikagelu 60 F₂₅₄

AA A A ·· AA ·Α • · · » A A

A AAAA • A «ΑΑ AAA

A A A

Mobilní fáze: ethylacetát, ledová kyselina octová a methanol v objemovém poměru 85:10:5.

Velikost nanesené skvrny: 10 mikrolitrů roztoku

Délka dráhy: 10 cm

Deska TLC byla ponechána na vzduchu až do uschnutí a pak byla pozorována v ultrafialovém světle při vlnové délce 254 nm. Zkouška nebyla považována za platnou, pokud nebylo možno na chromatogramu, získaném s roztokem 5 odlišit 2 jednotlivé skvrny a současně byly odlišitelné odpovídající skvrny na chromatogramu roztoku 8.

Byla stanovena intenzita jakékoliv sekundární skvrny, odpovídající svou hodnotou Rf sloučenině B z chromatogramu roztoku 1 proti skvrnám sloučenině B v chromatogramech roztoků 5,6,7 a 8 (ekvivalentní 0,2, 0,15, 0,1 a 0,05 % hmotnostních).

Intenzita jakékoliv sekundární skvrny v chromatogramu roztoku 1 byla rovněž hodnocena proti skvrnám pro lamotrigin na chromatogramech roztoků 5,6,7 a 8 (ekvivalentní 0,2, 0,15, 0,1 a 0,05 % hmotnostních).

Hodnoty Rf byly pro lamotrigin: 0,20 sloučeninu B: 0,60

Pokus 2 - sloučenina A

Byly připraveny následující zkušební a standardní roztoky ve směsi stejného objemu methanolu a 2-methoxyethanolu.

Roztok 1: roztok 1 z pokusu 1

Roztok 2: roztok sloučeniny A 0,05 % hmotnostních

Bylo užito následujících podmínek při TLC:

9 999 • · deska: deska s rozměrem 20x20 cm, opatřená povlakem 0,25 mm silikagelu F₂₅₄ .

Mobilní fáze: směs chloroformu, methanolu, ledové kyseliny octové a butan-l-olu v objemovém poměru 80:10:10:5.

Množství roztoku: 10 mikrolitrů roztoku 1 a 2 mikrolitrů roztoku 2.

Délka dráhy: 15 cm

Plotny byly ponechány na vzduchu až do uschnutí a pak byly pozorovány v ultrafialovém světle při 254 nm. Intenzita jakékoliv sekundární skvrny, odpovídající hodnotě Rf na chromatogramu roztoku 1 byla stanovena proti skvrnám pro sloučeninu A v roztoku 2 (ekvivalentní 0,1 a 0,2 % hmotnostních).

Hodnoty Rf byly pro lamotrigin 0,25

Sloučenina A: 0,37

Příklad 5: stanovení sloučeniny A v tabletách s obsahem 100 mg lamotriginu pomocí TLC.

Příprava standardních roztoků a roztoků vzorku

Standardní roztok byl připraven přesným navážením 10 mg sloučeniny A do volumetrické baňky s objemem 100 ml. Sloučenina pak byla rozpuštěna v methanolu a roztok byl doplněn methanolem na požadovaný objem.

Roztok vzorku byl připraven tak, že množství rozdr25 cené tablety, odpovídající 500 mg lamotriginu, bylo přeneseno do volumetrické baňky s objemem 50 ml. Práškový materiál byl dispergován v 15 ml 0,1 M kyseliny chlorovodíkové a bylo přidáno 30 ml směsi methanolu a 2-methoxyethanolu v objemovém poměru 15:15. Baňka byla uložena na 10 minut do ultrazvukové lázně. Pak byl roztok ponechán zchladnout při teplotě

9

9 99 9

9

99 místnosti a zředěn na požadovaný objem směsí methanolu a 2-methoxyethanolu. Pak byl po promíchání roztok zfiltrován přes filtrační papír Whatman č.l. Čirý filtrát byl použit jako roztok vzorku.

Provedení pokusu

Bylo užito následujících podmínek pro TLC:

Deska: deska s rozměrem 20x20 cm, opatřená povlakem

0,25 mm silikagelu 60 F₂₅₄.

Mobilní fáze: směs chloroformu, methanolu, ledové kyseliny octové a butan-l-olu v objemovém poměru 80:100:10:5 Množství roztoku: 10 mikrolitrů zkoumaného roztoku, 3 a 5 mikrolitrů standardního roztoku Délka dráhy: 15 cm

Plotna byla ponechána na vzduchu do uschnutí a pak byla pozorována v ultrafialovém světle při 254 nm.

Intenzita jakékoliv skvrny odlišné od hlavní skvrny v chromatogramu vzorku byla hodnocena proti skvrně, identifikované v chromatogramu standardního roztoku při použití 3 mikrolitrů tohoto roztoku, což odpovídá 0,3 % hmotnostních nečistoty. Součet intenzit všech sekundárních skvrn nepřevyšoval množství na chromatogramu pro 5 mikrolitrů standardního roztoku, což odpovídá celkovému množství 0,3 % hmotnostní nečistot.

Hodnoty Rf byly pro lamotrigin 0,20 pro sloučeninu A 0,34.

Vynález byl popsán v souvislosti s řadou výhodných provedení. Je však zřejmé, že by bylo možno uskutečnit řadu změn a modifikací, které by mohl snadno provést každý

Φ

Φ · φ φ • φ φ φ φ φ φ φφφ • φ φ φφ φφφφ φφ φ φ * φ φφφ φ odborník a které by rovněž spadaly do rozsahu vynálezu, takže vynález nemůže být na popsaná provedení omezen.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob zjištění čistoty a stálosti vzorku lamotriginu nebo farmaceutického prostředku s obsahem lamotriginu, vyznačující se tím, že se ve vzorku stanoví pří5 tomnost sloučeniny ze skupiny 3-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)

-1,2,4-triazin-5-(4H)-onu a N-/5-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)1,2,4-triazin-3-yl/2,3-dichlorbenzamidu.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se při stanovení čistoty vzorku lamotriginu

í) rozpustí vzorek lamotriginu v rozpouštědle k získání roztoku vzorku, ii) rozpustí se vzorek 3-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)-1,2,4triazin-5-(4H)-onu nebo N-(5-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)-1,2,4

25 -triazin-3-yl)-2,3-dichlorbenzamidu v rozpouštědle k získání standardního referenčního roztoku značící látky, iii) vzorek i standardní roztok se podrobí chromatografii na tenké vrstvě a iv) stanoví se intenzita jakékoliv sekundární skvrny v chro20 matogramu pro roztok vzorku, odpovídající hodnotou Rf referenční značící látce a hodnotí se proti skvrně pro referenční značící látku v chromatogramu standardního roztoku.

·· ·· · ·· • · · · · · 9 9 • 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

99 9999 999 9999

9 9 9 ·

9 9 9 ·

999 999

9 9
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se při stanovení čistoty a stálosti farmaceutické ho prostředku s obsahem lamotriginu postupuje tak, že se

i) rozpustí vzorek farmaceutického prostředku v rozpouštědl

5 za vzniku roztoku vzorku, ii) rozpustí se vzorek 3-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)-1,2,4triazin-5-(4H)-onu v rozpouštědle za vzniku standardního roztoku referenční značící látky, iii) roztok vzorku i roztok standardu se podrobí chromato10 grafii na tenké vrstvě a iv) stanoví se intenzita jakékoliv sekundární skvrny v chro matogramu roztoku vzorku, odpovídající hodnotě Rf referenční značící látky a hodnotí se proti skvrně referenční značící látky v chromatogramu standardního roztoku.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se při zkoušce na stálost farmaceutického prostředku s obsahem lamotriginu proti degradaci postupuje tak, že se i) rozpustí vzorek farmaceutického prostředku v rozpouštědle za vzniku jednoho nebo většího poctu roztoku vzorku, ii) rozpustí se vzorek referenčního standardu lamotriginu v rozpouštědle k získání standardního roztoku, iii) roztok vzorku a roztok standardního roztoku se vstříknou do sloupce pro HPLC a iv) stanoví se plochy pod hlavním vrcholem pro každý roztok a z těchto ploch se vypočítá obsah referenční značící látky, 3-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)-1,2,4-triazin-5-(4H)-onu pro každé zředění vzorku.
5. . N-/5-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)-1,2,4-triazin-3-yl/2,3dichlorbenzamid vzorce B (B)
6. Vzorek sloučeniny z nároku 5 ve v podstatě čisté formě.
7. Vzorek sloučeniny z nároku 6 s čistotou 90 % nebo vyšší.

·· 44

4 4 4 4

4 4 4

4 · 4

4 4«

44 4444

44 4 ·4 «

4 4 • 4 44
8. Způsob výroby sloučeniny podle nároku 5, vyznačující se t i m, že se

i) nechají reagovat 2 ekvivalenty 2,3-dichlorbenzoylchloridu s jedním ekvivalentem lamotriginu, rozpuštěného v pyridinu při teplotě nižší než 35 °C, nebo se ii) cyklizuje sloučenina obecného vzorce I:

v propan 1-olu za varu pod zpětným chladičem (')
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se ve stupni ii) cyklizuje sloučenina vzorce I, získaná reakcí sloučenin vzorce II a III:

2C (II) (lil) v přítomnosti anorganické kyseliny.

·· ·· · ·· ·· ·· ···· ·· · · ···· • · · · ·«··· 4 4 4 4 4 4 9 444 444

4 4 4 9 9 9 4

49 4444 949 4444 ·· «·
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že se sloučenina vzorce II připraví tak, že se na 2,3-dichlorbenzoylkyanid působí roztokem hydrogenuhličitanů aminoguanidinu v kyselině sírové.
11. Použití sloučeniny ze skupiny 3-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)-1,2,4-triazin-5-(4H)-onu a N-/5-amino-6-(2,3-dichlorfenyl)-1,2,4-triazin-3-yl/~2,3-dichlorbenzamidu jako referenční značící látky při zjišťování čistoty a stálosti vzorku lamotriginu nebo vzorku farmaceutického prostředku s obsahem lamotriginu proti degradaci.