BRPI0803097A2 - método para redução do nìvel de impurezas na fermentação do ácido micofenólico - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA REDUçãO DO NìVEL DE IMPUREZAS NA FERMENTAçãO DO áCIDO MICOFENóLICO. A presente invenção refere-se a métodos para a redução de impurezas do ácido micofenólico durante a fermentação, por meio do controle do nível da fonte de carbono durante a fermentação do ácido rnicofenólico e para o isolamento e uso da impureza ácido homo-micofenólico como marcador padrão.

Description

MÉTODO PARA REDUÇÍO DO NIVEL DE IMPUREZAS NA FERMENTAÇÃO DO XIDO MICOFENGLICO

Referência Cruzada a Pedidos Afins Este pedido reivindica o benef icio dos pedidos provisórios U.S. Nos. de Série 60/923.079, depositado em 11 de abril de 2007, 60/998.341, depositado em 9 de outubro de 2007 e 61/019.036, depositado em 4 de janeiro de 2008, incorporados ao presente por referência.

Área da Invenção

A presente invenção refere-se a métodos para a redução de impurezas do ácido micofenólico durante a fermentação, especialmente MPA-IV (E-10-(4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3- oxo-1,3-diidro-isobenzofuran-5-il)-4,8-dimetil-ácido deca- 4,8-dien óico) e homo-MPA (E-8-(4-hidroxi-6-metoxi-7-metil- 3-oxo-1,3-diidro-isobenzofuran-5-il)-2,6-dimetil-ácido octo-6-enóico) . A invenção tambán se refere a homo-MPA isolado e ao seu uso como marcador e padrão de referência.

Antecedentes da Invenção (E) -6- (4-hidroxi-6-metoxi-7-íTietil-3-oxo-lH- isobenzofuran-5-il)-4-metil-ácidc hexa-4-en óico, ácido micofenólico ("MPA",do inglês MyccPhenolic Acid) , com a seguinte fórmula:

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Ácido Micofenólico ("MPA") é um antibiótico produzido por um processo biológico, isto é, fermentação feita por um microorganismo Penicillium. Existem várias espécies conhecidas de Penicillium, inclusive P. brevicompactum,P. scabrum, P. nagemi, P. roqueforti, P. patris-mei e P. viridicatum (Clutterbuck, P.W. e outros, 1932. "CLXXI. Studies in the biochemistry of microorganisms. XXIV. The metabolic products of the Penicillium brevi-compactum series", Biochem.J. 26:1442- 1458, e Frisvad, J.C e Filtenborg, 0., 1983.

"Classification of terverticillate Fenicil lia based on profiles of mycotoxins and other secondary metabolites", Appl.Environ.Microbiol. 46:1301-1310) em fermentação submersa e no estado sólido).

reações bioquímicas, certos materiais iniciais são convertidos em um produto final, c MPA.

Vários tipos de processos de fermentação são usados comumente pelos profissionais experientes na área. Por exemplo, "fermentação batelada", "fermentação batelada alimentada", ou "fermentação cont inua/quemostato".

0 MPA é um material inicial do micofenolato mofetil ("MMF", do inglês Mycophenolate MoFetil) , com a seguinte fórmula

que é o 2-morfolinoetil éster derivado do MPA aprovado para a profilaxia da rejeição em pacientes que recebem transplantes de órgãos alogênicos.

As patentes GB No. 1157099, EP No. 1 624070 Al e JP No. 59091891 descrevem processos de fermentação para a preparação do MPA, usando o aprimoramento de linhagens ou a otimização do meio para melhorar a produtividade de MPA.

A publicação WO No. 2006/038218 descreve, de acordo com seu resumo, "a fabricação de MPA por fermentação sob parâmetros ótimos de fermentação, usando uma nova linhagem de Penieillium arenieola".

Durante o processo de fermentação, após uma série de A publicação WO No. 2008/026883, cuja data de publicação é posterior à data de prioridade do presente pedido, descreve, de acordo com seu resumo, "método para produzir ácido micofenólico cultivando-se Penicillium brevi-compactum em uma solução de cultura que consiste em 3 a 9 g uréia, fonte de carbono e microelementos."

O J. Chem. Soe. 2:365-73, 1S82 relata uma impureza do MPA com a seguinte estrutura:

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conhecida como E-10-(4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-l,3- diidro-isobenzofuran-5-il)-4, 8-dimetil-ácido deca-4,8- dienóiço ("MPA-IV"), que é produzida durante o processo de fermentação para a preparação do MPA. Essa impureza compartilha semelhanças estruturais com o MPA, e pode ser esterificada com morfolino etanol quando da conversão do MPA em MMF, resultando na impureza homóloga do micofenolato mofetil, com a seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 4</formula>

A mistura produzida por uma reação química raramente constitui um composto único com pureza suficiente para atender aos padrões farmacêuticos. Portanto, os produtos de fermentação no caldo podem conter, alén do MPA, compostos ou impurezas adicionais. Essas impurezas, podem ser, por exemplo, intermediários da reação, tais como MPA-IV, produtos secundários da reação, produtos de reações colaterais, ou produtos de degradação. As impurezas no MPA, ou em qualquer ingrediente farmacêutico ativo ("API", do inglês Active Pharmaceutical Ingredient), tal como o MMF, são indesejáveis e, em casos extremos, podem até ser prejudiciais para um paciente que esteja sendo tratado com uma forma de dosagem que contenha o referido API.

A pureza de um API produzido em um processo de fabricação é critica para sua comercialização. A U.S. Food and Drug Administration ("FDA") exige que as impurezas dos processos de fabricação sejam mantidas abaixo de limites estabelecidos. Por exemplo, em sua diretriz ICH Q7A para fabricantes de APIs, a FDA especifica a qualidade das matérias primas que podem ser usadas, bem como as condições processuais aceitáveis, tais como temperatura, pressão, duração e proporções estequicmétricas, inclusive etapas de purificação, tais como cristalização, destilação, e extração 1 iquido-1iquido. Vide ICH Good Manufacturing Praetiee Guide for Aetive Pharmaceutieal Ingredients, Q7A, Current Step 4 Version (November 10, 2000).

Em certas etapas durante o processamento de um API como o MPA, esse ingrediente precisa ser analisado quanto à sua pureza; tipicamente, por cromatografia liquida de alta Eficiência ("HPLC", do inglês High Performance Liquid Chromatography) ou cromatografia de camada fina ("TLC", do inglês Thin Layer Chromatography), para que se possa determinar se ele é adequado para a continuação do processamento e, em última instância, para uso em um produto farmacêutico. O API não precisa ser absolutamente puro, pois a pureza absoluta é um ideal teórico impossível de ser alcançado. Mais exatamente, a FDA exige que um API seja tão isento de impurezas quanto for possível, de modo que seja tão seguro quanto possível para o uso clínico. Por exemplo, a FDA recomenda que as quantidades de algumas impurezas se limitem a menos que 0,1%. Vide ICH Good Manufacturing Practice Guide for Aetive Pharmaceutieal Ingredients, Q7A, Current Step 4 Version (November 10, 2000) .

Geralmente os produtos colaterais, subprodutos e reagentes adjuntos (coletivamente chamados de "impurezas") são identificados espectroscopicamente e/ou por outro método físico e, então, são associados a uma posição de pico, tal como em um cromatograma, ou uma marca em uma placa de TLC. Vide Strobel, H.A. e outros, Chemical Instrumentation: A Systematie Approaeh, 953, 3a ed. (Wiley & Sons, New York 1989). Uma vez que uma determinada impureza tenha sido associada a uma posição de pico, a impureza pode ser identificada em uma amostra por sua posição relativa no cromatograma, sendo a posição no cromatograma medida em minutos entre a injeção da amostra na coluna e a eluição da impureza através do detector. A posição relativa no cromatograma é conhecida como "tempo de retenção".

O tempo de retenção pode variar ao redor de um valor médio, com base nas condições da instrumentação, bem como em muitos outros fatores. Para minimizar os efeitos que as referidas variações têm sobre a identificação precisa de uma impureza, os profissionais da área usam, com freqüência, o "tempo de retenção relativo" (RRT, do inglês Relative Retention Time) para identificar impurezas. Vide Strobel (supra), página 922. O RRT de uma impureza é calculado dividindo-se o tempo de retenção da impureza pelo tempo de retenção de um marcador de referência. O marcador de referência pode ser o API no qual está presente a impureza, ou pode ser um outro composto que, ou está presente, ou é adicionado à amostra. Um marcador de referência deve estar presente na amostra em uma quantidade que seja suficientemente grande para ser detectável, mas não em uma quantidade grande o bastante para saturar a coluna.

Os profissionais experientes na área de pesquisa e desenvolvimento na indústria de medicamentos entendem que um composto relativamente puro pode ser usado como um "padrão de referência". Um padrão de referência é semelhante a um marcador de referência, com a diferença de que ele pode ser usado não apenas para identificar a impureza, mas tambén para determinar a quantidade da impureza presente na amostra.

Um padrão de referência é um "padrão externo", quando uma solução de concentração conhecida do padrão de referência e uma mistura não conhecida são analisadas separadamente usando-se a mesma técnica. Vide Strobel (supra), página 924; Snyder, L.R. e outros. Introdvction to Modem Liquid Chromatography, 549, 2a. Ed. (John Wiley & Sons, New York 1979). A quantidade da impureza na amostra pode ser determinada comparando-se a magnitude da resposta do detector para o padrão de referência com a magnitude da resposta do detector para a impureza. Vide Patente US No. 6.333.198, incorporada ao presente por referência.

O padrão de referência também pode ser usado como um "padrão interno", isto é, um padrão que é adicionado diretamente à amostra em uma quantidade previamente determinada. Quando o padrão de referência é um padrão interno, usa-se um "fator de resposta" que compensa diferenças na sensibilidade do detector em relação à impureza e o padrão de referência, para determinar a quantidade da impureza na amostra. Vide Strobel (supra), página 894. Com essa finalidade, o padrão de referência é adicionado diretamente à mistura, e é conhecido como um "padrão interno". Vide Strobel (supra), página 925; Snyder (supra), página 552.

A técnica de "adição de padrão" tambén pode ser usada para determinar a quantidade da impureza. Essa técnica é usada nos casos em que a amostra cont ári uma quantidade detectável desconhecida do padrão de referência. Em uma "adição de padrão", no mínimo duas amostras são preparadas adicionando-se quantidades conhecidas e diferentes do padrão interno. Vide Strobel (supra), páginas 391-393; Snyder (supra), páginas 571-572. A proporção da resposta do detector devida ao padrão de referência presente na amostra pode ser determinada plotando-se a resposta do detector versus a quantidade do padrão de referência adicionada a cada uma das amostras, e extrapolando-se o plot para zero. Vide Strobel (supra), página 392, Figura 11.4. A resposta de um detector em HPLC (por exemplo, detectores UV ou detectores de índice refrativo) pode ser, e geralmente é diferente para cada composto eluído da coluna de HPLC. Os fatores de resposta, como são conhecidos, são responsáveis por essa diferença no sinal do detector em resposta aos diferentes compostos eluidos da coluna.

Como é do conhecimento dos profissionais experientes nessa área, a administração das impurezas do processo é muito mais efetiva quando se entendem suas estruturas químicas e caminhos sintéticos e se identificam os parâmetros que influenciam a quantidade de impurezas no produto final.

Portanto, seria benéfico o desenvolvimento de um método que reduza o nível de impurezas no MPA durante a fermentação. Al én disso, seriam benéficos o isolamento, a identificação e a quantificação dessas impurezas.

Sumário da Invenção

Em uma incorporação, a presente invenção abrange um processo para reduzir a formação de impurezas durante a fermentação do ácido micofenólico (MPA) , que consiste em controlar o nível da fonte de carbono durante a fermentação de MPA, sendo a fonte de carbono mantida em uma quantidade de cerca de 0,8% a cerca de 0,02% p/p.

Em outra incorporação, a presente invenção abrange um processo para a preparação de micofenolato mofetil (MMF) que consiste em preparar MPA de acordo com o processo da presente invenção e converté-io em MMF.

Em outra incorporação, a presente invenção abrange E- 8-(4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-l,3-diidro- isobenzofuran-5-il)-2,6-dimetil-ácido octo-6-enóico ("Homo- MPA") com a seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 9</formula>

Em ainda outra incorporação, a presente invenção abrange um processo para determinar a presença de Homo-MPA em uma amostra de MPA, por um procedimento que consiste em realizar HPLC ou TLC com o Homo-MPA como marcador de referência.

Em outra incorporação, a presente invenção abrange um processo para determinar a quantidade de Homo-MPA em uma amostra de MPA que contém Homo-MPA e MPA, por um procedimento que consiste em realizar HPLC usando Homo MPA como padrão de referência.

Em uma outra incorporação, a presente invenção abrange um método para a preparação do ácido micofenólico que consiste em: preparar um caldo de fermentação contendo um microorganismo produtor de ácido micofenólico; fermentar o ácido micofenólico ao mesmo tempo em que se alimenta com nutrientes o caldo de fermentação; controlar o nível de fonte de carbono no caldo de fermentação em uma quantidade de cerca de 0,02% a cerca de 0,8% p/p durante a etapa de fermentação do ácido micofenólico; colher e recuperar o ácido micof en ólico do caldo de fermentação.

Em ainda outra incorporação, a presente invenção abrange um composto isolado com a seguinte estrutura:

<formula>formula see original document page 10</formula>

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 mostra o decurso do tempo de produção de MPA e o nivel de MPA-IV e ácido homo-micof en ólico, e o pH durante o processo de fermentação batelada pela linhagem de Penicillium sp (número de acesso CCM 8364).

A Figura 2 mostra uma fermentação batelada de ácido micofen ólico por uma linhagem de Fenicilliuiri sp (número de acesso 8364) de acordo com GE 1.157.009.

A Figura 3 mostra uma fermentação batelada de ácido micofenólico por Penicillium brevicompactum.

A Figura 4 mostra c decurso do tempo de produção de MPA e o nivel de MPA-IV e do ácido homo-micof en ólico, e o pH durante o processo de fermentação batelada alimentada por uma linhagem de Penieillium sp. (número de acesso CCM 8364).

A Figura 5 mostra o decurso do tempo de produção de MPA e o nivel de MPA-IV e de ácido homo-micof en ólico, e o pH durante um processo aperfeiçoado de fermentação batelada alimentada, por uma linhagem de Penicillium sp (número de acesso CCM 8364.

A Figura 6 mostra uma tabela do nivel de glicose versus tempo para o processo aperfeiçoado de fermentação batelada alimentada, por uma linhagem de Penieillium sp (núnero de acesso CCM 8364).

A Figura 7 mostra um gráfico dos níveis de glicose e amônia através do tempo do processo aperfeiçoado de fermentação batelada alimentada, por uma linhagem de Penicillium sp (nímero de acesso CCM 8364.

A Figura 8 mostra uma fermentação batelada alimentada aperfeiçoada, por Penicillium brevicompactum.

A Figura 9 mostra um espectro de RNM 1H (Ressonância Nuclear Magnética "H)do ácido homo-micofen ólico.

A Figura 10 mostra um espectro de RNM 13C do ácido homo-micofen ólico.

Descrição Detalhada da Invenção

Tipicamente, a fermentação do ácido micofen ólico (MPA) inclui os seguintes estágios: 1) uma fase de Crescimento; 2) uma fase de Produção, e c) colheita.

A presente invenção refere-se a um processo de fermentação batelada em que, durante a fase de produção, conduz-se um processo de alimentação. Assim, existe um período de alimentação como parte da fase de produção.

Durante o período de alimentação o nível da fonte de carbono é controlado/mantido, levando assim a um nível substancialmente baixo de produtos secundários ou impurezas; especificamente, E-10-(4-hidroxi-6-metoxi-7- metil-3-oxo-l,3-diidro-isobenzofuran-5-il)-4,8-dimetil- ácido deca-4, 8-dien cicc ("ΜΡΑ-IV") e/ou E-8- (4-hidroxi-6- metoxi-7-meti1-3-oxo-1,3-diidro-isobenzofuran-5-il)-2,6- dimetil-ácido octo-6-en óico ("homo-MPA"). Portanto, o método da presente invenção pode ser considerado como um método que reduz a quantidade dessas impurezas em comparação com as suas quantidades produzidas nos processos de fermentação em que o nível da fonte de carbono não é absolutamente mantido (exemplo de 1 a 3), ou é mantido, mas não em um nível tão baixo.

O nível de impurezas, inclusive subprodutos produzidos na etapa de fermentação, causa um importante impacto na economia geral do processo de produção ao influenciar a eficiência das etapas de produção subseqüentes. Alán disso, a eliminação dessas impurezas do caldo de fermentação freqüentemente exige métodos sofisticados de purificação, devido à semelhança de suas estruturas. A realização desses métodos de purificação também é dispendiosa e de baixo rendimento durante o processamento. Assim, o desenvolvimento de um método para redução das impurezas durante a fermentação do ácido micofenólico pode proporcionar crescentes benefícios econômicos.

Além disso, como o ácido micofenólico e o micofenolato mofetil são medicamentos de dosagem alta, o nível de impurezas permitido em MPA/MMF será mais rigorosamente controlado. Vide Anexo 1 da diretriz ICH Q3A(R), emitida em 02/2002.

O método para reduzir o nível de MPA-IV e ácido homc- micofenólico na preparação do ácido micofenólico conforme a presente invenção consiste em controlar o nível da fonte de carbono durante a fermentação do MPA, sendo a fonte de carbono mantida em uma quantidade de cerca de 0,02% a 0,8% p/p, preferivelmente de cerca de 0,05% a cerca de 0,5% p/p.

Quando usado no presente, o termo "p/p" (peso/peso) representa uma maneira de expressar a concentração da fonte de carbono (em unidades de grama/grama do caldo de fermentação) no caldo aquoso de fermentação, conforme medição por um equipamento de análise química (por exemplo, um analisador químico BioProfileS 100 da Nova Biomedical, USA).

Preferivelmente, o nível da fonte, de carbono é controlado/mantido durante o período de alimentação do processo de fermentação. Antes desse período, a fonte de carbono deve ser de cerca de 1% a cerca de 5% p/p; mais preferivelmente, de cerca de 2% a cerca de 3% p/p. Preferivelmente, a fonte de carbono é carboidrato ou uma combinação de carboidratos. Mais preferivelmente, a fonte de carbono é amido ou melado; ainda mais preferivelmente, glicose, sucrose, maltose, glicerol. A fonte de carbono mais preferível é glicose.

A manutenção desse nível de fonte de carbono é feita, tipicamente, colhendo-se uma amostra do caldo de fermentação para medir o nível da fonte de carbono e determinar se a alimentação deve continuar. A amostra colhida do caldo de fermentação pode ser centrifugada a 3000 rpm por 10 segundos, filtrada e a quantidade da fonte de carbono é medida usando-se um analisador bioquímico BioProfile© lOOPlus (por meio de eletrodo enzimáticc amperométrico). Alternativamente, o nível da fonte de carbono pode ser monitorado on-line, usando-se por exemplo, espectroscopia infravermelha ou quase-infravermelha.

O processo da presente invenção resulta em níveis reduzidos de MPA-IV e homo-MPA no caldo de fermentação, bem como no produto final de MPA. Preferivelmente, a quantidade de MPA-IV e homo-MPA no caldo de fermentação obtido é de menos que cerca de 0,5% da área por HPLC; mais preferivelmente, menos que cerca de 0,3% da área por HPLC; ainda mais preferivelmente, menos que cerca de 0,2% da área por HPLC e, o mais preferivelmente, menos que cerca de 0,15% da área por HPLC. A quantidade dessas impurezas é calculada dividindo-se a área sob o pico de cada uma das impurezas pela área sob o pico de MPA. Assim, a quantidade de cada impureza é expressa como porcentagem da área em relação à quantidade de MPA.

Preferivelmente, o caldo de fermentação contendo MPA contém de cerca de 0,001% a cerca de 0,5%; preferivelmente de cerca de 0,01% a cerca de 0,5%; mais preferivelmente, de cerca de 0,05 a cerca de 0,2% e, o mais preferivelmente, de cerca de 0,05 a cerca de 0,15% da área por HPLC de MPA-IV e/ou homo-MPA.

Uma redução adicional do nível de impurezas, especificamente de MPA-IV e homo-MPA pode ser conseguida interrompendo-se a alimentação durante as últimas 20 a 96 horas da etapa de produção do ácido micofenólico (isto é, antes da colheita). Preferivelmente, o período de alimentação termina de cerca de 24 a 96 horas, mais preferivelmente, de cerca de 24 horas a cerca de 48 horas antes da colheita.

Essa operação melhora ainda mais a pureza do ácido micofenólico obtido no caldo de fermentação, especificamente com referência a homo-MPA e MPA-IV, em comparação com a pureza obtida quando o período de alimentação é interrompido imediatamente antes da colheita, conforme se verifica nos exemplos 5 e 6 versus exemplos de 1 a 3.

Um outro benefício do controle do nível da fonte de carbono é o aumento da taxa de produção de MPA - níveis mais baixos de fonte de carbono resultam em taxas mais altas de produção de MPA, como se verifica ao comparar a taxa final de produtividade do ácido micofenólico no exemplo 1 com os exemplos 4 e 5 para Penicillium sp. (a taxa de produção de MPA é de 30 yg/g/h em relação a 33-39 yg/g/h, respectivamente) e o exemplo 3 com o exemplo 6 para Penicillium brevicompactum ( a taxa de produção de MPA é de 6,4 yg/g/h, em comparação com 7,8 yg/g/h, respectivamente).

Quando usado no presente, o termo "yg/g/h" refere-se à "taxa" de produção de MPA: yg de MPA produzido por 1 grama de caldo de fermentação em uma hora. A taxa de produção de MPA pode ser calculada como segue: título final (yg/g) dividido pelo tempo de fermentação (horas).

Outro benefício obtido quando se mant ári baixo o nível de fonte de carbono é a maximiza ção do rendimento do produto. O rendimento é expresso como o título final medido por HPLC.

Em uma incorporação preferencial da presente invenção, o meio de fermentação contém um nível inicial de uma fonte de carbono no período de crescimento, que é de cerca de 1% a cerca de 5% p/p do meio de fermentação (o meio de fermentação inclui o caldo total, inclusive líquidos, sólidos, células microbianas). Esse nível é então reduzido pelos microorganismos e é mantido em cerca de 0,02% a cerca de 0,8% p/p durante o período de produção, preferivelmente em cerca de 0,05% a cerca de 0,5% p/p.

O meio de fermentação contém também uma fonte de nitrogênio. Freferivelmente, a fonte de nitrogênio também é alimentada por batelada.

O meio de fermentação pode conter nutrientes adicionais para ajudar a melhorar a produtividade. Esses outros nutrientes incluem sais minerais, fatores de crescimento microbiano, uma fonte de fósforo e um tampão.

As fontes de sais minerais (por exemplo, sais de amônio, cálcio, ferro, zinco, cobre, magnésio, manganês, sódio ou potássio) incluem sulfato de magnésio, diclcreto de manganês, sulfato de ferro, cloreto de zinco, sulfato de cobre II, sulfato de amônio, diidrogênio fosfato de potássio, cloreto de sódio e carbonato de cálcio. Pode-se usar uma combinação dessas fontes. Preferivelmente, a fonte é sulfato de magnésio.

Exemplos de nitrogênio orgânico e inorgânico incluem nitrato, uréia, sais de amônio, aminoácidos, farinhas vegetais e milhocina. Exemplos específicos dessas fontes de nitrogênio são adicionalmente descritos em W02008/026883, incorporado ao presente por referência. Preferivelmente, usam-se glicina e milhocina.

Exemplos de fatores de crescimento microbiano incluem extrato de levedura e vitaminas. Exemplos de fósforo orgânico e inorgânico incluem diidrogênio fosfato de potássio, diidrogênio fosfato de sódio, hidrogênio fosfato de potássio e hidrogênio fosfato de sódio.

Em uma incorporação, usa-se uma combinação de, no mínimo, uma fonte de nitrogênio, no mínimo uma fonte de fósforo, no mínimo um sal mineral e no mínimo uma fonte de carbono. Preferivelmente, usa-se uma combinação de glicina, milhocina, diidrogênio fosfato de potássio, metionina, sulfato de magnésio e amido de batata.

Mais preferivelmente, o meio de fermentação cont én aproximadamente de 1 a 5% de glicose, aproximadamente de 0,1 a cerca de 3% p/p de glicina, aproximadamente de 0,1% a 3% p/p de milhocina, aproximadamente de 0,01% a 0,5% p/p de diidrogênio fosfato de potássio, aproximadamente de 0,1% a 1% p/p de metionina e aproximadamente de 0,1% a 1% p/p de sulfato de magnésio.

Preferivelmente, o meio de fermentação acima é inoculado com aproximadamente de 5% a 20%, por peso, de uma cultura vegetativa da linhagem produtora de ácido micofenólico. Preferivelmente, a linhagem é uma linhagem fúngica de Penicillium sp de uma das seguintes espécies: P. brevicompcactum, P. scabrum, P. nagemi, P. ròqueforti, P. patris-mei e P. vi ridicatum, ou uma linhagem derivada dessas; mais preferivelmente a linhagem Penicillium sp. (número de acesso CCM 8364 - (Czech Collection of Microorganisms (CCM) (Coleção Tcheca de Microorganismos), Masaryk University, Brno, República Tcheca), ou uma linhagem derivada da mesma.

Preferivelmente, a cultura é então misturada e areada, e a temperatura é mantida entre cerca de 21°C e cerca de 29 °C.

O MPA obtido é então isolado do caldo de fermentação após a colheita. 0 isolamento pode ser feito, por exemplo, de acordo com o processo descrito no presente, obtendo-se um caldo de fermentação alcalino aumentando-se o pH no final da fermentação e filtrando-se o caldo obtido. Subseqüentemente, acidifica-se o liquido obtido e filtra-se o liquido que agora é acidico, e suspende-se novamente o filtrado em água, ajustando-se o pH para pH alcalino.

O MPA isolado pode então ser convertido em MMF. A conversão pode ser feita, por exemplo, de acordo com o processo descrito em WO 2005/105771.

Preferivelmente, a quantidade de MPA-IV e homo-MPA contida no MPA obtido é de menos que cerca de 0,5% da área por HPLC; mais preferivelmente, menos que cerca de 0,3% da área por HPLC; ainda mais preferivelmente, menos que cerca de 0,2% da área por HPLC e, o mais preferivelmente, menos que cerca de 0,15% da área por HPLC. A quantidade dessas impurezas é calculada dividindo-se a área sob o pico de cada uma das impurezas pela área sob o pico de MPA. Desse modo, a quantidade de cada impureza é expressa como porcentagem da área em relação à quantidade de MPA.

Em outra incorporação, a presente invenção abrange E- 8-(4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-l,3-diidro- isobenzofuran-5-il)-2,6-dimetil-ácido-octo-6-en óico ("homo- MPA") isolado, com a seguinte fórmula:

Preferivelmente, o homo-MPA isolado é sólido; mais preferivelmente, é cristalino.

Quando usado no presente, o termo "isolado" em referência a homo-MPA corresponde a homo-MPA que está fisicamente separado do caldo de fermentação. Por exemplo, a separação pode ser feita por extrações e filtra ções.

Preferivelmente, o homo-MPA isolado da presente invenção é separado do MPA, provendo desse modo uma composição de homo-ΜΡA contendo menos que cerca de 5%, preferivelmente menos que cerca de 2% e ainda mais preferivelmente, menos que cerca de 1%, por peso, de MPA. Preferivelmente, a composição de homo-MPA cont en de cerca de 5% a cerca de 0,05%, mais preferivelmente, de cerca de 2% a cerca de 0, 1% e, o mais preferivelmente, de cerca de 1% a cerca de 0,1%, por peso, de MPA.

O conteúdo de MPA no homo-MPA é medido por HPLC.

O homo-MPA isolado da presente invenção pode ser caracterizado por dados selecionados em um grupo que consiste de: RNM 1H (400MHz, CDCl3) δ (ppm) : 1,15, 1,35, 1,42, 1,63, 1,77, 1,98, 2, 15, 2,43, 3,39, 3,77, 5,19, 5,20, e 7,68; RNM13C (100MHz, CDCl3) δ (ppm): 11,5, 16,0, 16,8, 22,6, 25, 2, 33,0, 39, 1, 39, 4, 61, 0, 70,0106,4, 116, 7, 122, 2, 122,5, 135,5143,9, 153, 7, 163,7, 172,9, e 182,3, e combinações dos mesmos

O homo-MPA isolado da presente invenção também pode ser caracterizado por um espectro de RNMiH conforme mostra a Figura 6. O homo-MPA isolado da presente invenção pode ser adicionalmente caracterizado por um espectro de RNMi3C conforme mostra a Figura 7.

Homo-MPA é um subproduto formado durante o processo de fermentação para a preparação de MPA. Pode ser isolado do caldo de fermentação, por exemplo, por um processo que consiste em: a) provimento de um concentrado do caldo de fermentação que consiste de ácido micofenólico e homo-MPA; b) purificação do concentrado por cromatografia de coluna, e c) recuperação do ácido homo-micofenólico purificado.

Preferivelmente,a purificação por cromatografia de coluna é feita eluindo-se o homo-MPA de uma coluna que consiste de uma resina, por exemplo gel de silica, gel de sílica modificado, resina absorvente ou resina trocadora de ions. Mais preferivelmente, a resina é gel de silica.

A purificação é feita usando-se uma mistura de solventes orgânicos, tal como uma mistura de solventes polares e apolares. Preferivelmente, o solvente polar é metanol ou etanol e o solvente apoiar é éter ou diclorometano. Mais preferivelmente, o eluente é uma mistura de diclorometano e metanol. Mais preferivelmente, o eluente é um eluente gradiente, em que a quantidade de metanol é aumentada de 0 a cerca de 5%, por volume.

As frações eluidas são então testadas quanto à presença de homo-MPA por TLC (benzeno:ácido acético, 9:1 por volume), e em seguida selecionam-se as frações que contêm homo-MPA. A recuperação de homo-MPA das frações selecionadas é feita evaporando-se o solvente.

Preferivelmente, o homo-MPA purificado recuperado pode ser adicionalmente purificado por cromatografia de fase inversa, mais preferivelmente por HPLC preparatória, seguida por cristalização a partir de um solvente selecionado em um grupo que consiste de: uma mistura de metanol e água; uma mistura de acetonitrilo e água; uma mistura de THF e água. Mais preferivelmente, c solvente é uma mistura de metanol e água, ou de acetonitrilo e água.

O homo-MPA isolado pode então ser usado como um marcador e padrão de referência para testar a pureza do MPA.

Em uma incorporação, a presente invenção abrange um processo para a determinação da presença de homo-MPA em uma amostra de MPA, processo esse que consiste na condução de HPLC ou TLC com o homo-MPA como marcador de referência.

Preferivelmente, o processo consiste em: (a) medição por HPLC ou TLC do tempo ou fator de retenção relativo (mencionados como RRT ou RRF, respectivamente) correspondente ao homo-MPA em uma amostra de marcador de referência; (b) determinação, por HPLC ou TLC, do tempo de retenção relativo correspondente a homo-MPA em uma amostra que consiste de homo-MPA e MPA, e (c) identificação do homo-MPA na amostra, comparando-se o tempo ou fator de retenção relativo (RRT ou RRF) do homo-MPA conforme medição na etapa (a) com o RRT ou RRF da etapa (b)

Em outra incorporação, a presente invenção abrange um processo para determinar a quantidade de homo-MPA em uma amostra de MPA contendo homo-MPA e MPA, que consiste em conduzir HPLC com homo-MPA como padrão de referência.

Preferivelmente, o processo acima consiste em: (a) medir por HPLC a área sob um pico corresponde ao homo-MPA em um padrão de referência que consiste de uma quantidade conhecida de homo-MPA; (b) medir por HPLC a área sob um pico correspondente a homo-MPA em uma amostra que consiste de homo-MPA e MPA, e (c) determinar a quantidade de homo- MPA na amostra comparando-se a área da etapa (a) com a área da etapa (b).

Como se pode notar pela sua estrutura, o homo-MPA é um homólogo muito próximo do ácido micof en ólico. Portanto, como ambos os ácidos (MPA e homo-MPA) têm grupes carboxi terminais, ambos podem ser esterificadcs com morfolino etanol, quando da conversão do MPA em MFF. O respectivo morfolino etanol éster de homo-MPA com a seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 20</formula>

é, assim, uma impureza em potencial no API MMF.

Consequentemente, a preparação de MMF com um η ivel reduzido do éster de homo-MPA pode ser realizada após testar-se a pureza do MPA, selecionando-se um lote de MPA que contenha baixos níveis de homo-MPA. A invenção tendo sido descrita com referência a certas incorporações preferenciais, outras incorporações ficarão evidentes para o profissional experiente nessa área, com base na especificação. A invenção é adicionalmente definida por referência aos exemplos seguintes, que descrevem em detalhes o método para a redução do nivel de impurezas na fermentação do ácido micofenólico. Ficará evidente para os profissionais experientes nessa área que muitas modificações, tanto dos materiais como dos métodos, podem ser praticadas sem ultrapassar o escopo da invenção.

Exemplos

Método de HPLC

Coluna: Gel de Silica, fase inversa C8 (250*4,6 mm, 5 ym)

Eluente A: 0,005 M ácido fosfórico, pH 2,5

Eluente B: acetonitrilo

Eluição gradiente, t(min)/B%: 0/30, 5/30, 10/37, 13/40, 23/60, 30/60, 35/100, 35,5/100, 45/30

Velocidade do fluxo: 1,5 ml/min

Temperatura da coluna: 45°C

Organizador da amostra: 10°C

Detector: comprimento de onda a 250 nm Volume da injeção: 10 µl

Duração: 45 min

Diluente: acetonitrilo:água (9:1) para caldo de fermentação

Tempos de retenção: MPA 11,8 min

Homo-MPA 21,7 min

Limite de detecção: 0,004%

Limite de quantificação: 0,01%

Preparação da amostra: 0 caldo de fermentação foi extraído com acetonitrilo: água (9:1)por 15 minutos em um banho ultra-sônico, e filtrado em filtro com porosidade de 0,45 ym. A concentração é de aproximadamente 400 µg/ml.

Fatores relativos de resposta a MPA (a 250 nm):

Homo-MPA 0,8 65 Outras impurezas: 1,00

Espectroscopia de RNM Instrumento: Varian UNITY Inova-400 a 399, 87 MHz para 1H, e a 100, 55 MHz para 13C (CDC13, 30°C).

Exemplo 1: Fermentação Batelada de Á:ido Micofen ólico

Um meio contendo 8% p/p de amido de batata, 12% p/p de maltose, 1,5% p/p de glicina, 0,3% p/p de diidrogênio fosfato de potássio, 0,05% p/p de metionina e 0,1% p/p de sulfato de magnésio foi inoculado por 10% cultura vegetativa de uma linhagem de peniciIlium produtora de ácido micofen ólico (Penicillium sp, com o número de acesso CCM 8364). A cultura foi misturada e areada e a temperatura foi mantida em 25±2°C por 10 dias. A partir do segundo dia, a concentração de ácido micofen ólico, o nível de MPA-IV e ácido homo-micofen ólico e o pH foram medidos (por HPLC e eletrodo potenciométrico, respectivamente) . Como resultado do excesso de nutrientes no meio da batelada, o nível de MPA-IV e de ácido homo-micofen ólico subiu acima de 10% e ficou acima de 1% (relativamente ao nível de MPA) até o 8o dia, e então continuou em cerca de 0,5% no final da fermentação. A produtividade final (título medido por HPLC) foi de 7,5 g/l de MPA e a taxa média de produção de MPA foi de 30 pg/g/h. No final da fermentação o pH subiu para acima de 6,0. Vide Figura 1.

Exemplo 2: Exemplo Comparativo: Fermentação Batelada de Acido Micofenólico de acordo com GB 1.157.099

5 litros de um meio contendo: 100 g/l glicose, 3,72 g/l nitrato de amônio, 5,0 g/l hidrogênio fosfato de potássio, 1 g/l sulfato de magnésio e 2,0 ml/l concentrado de microelementos, foram inoculados com esporos do organismo Penicillium sp (linhagem No. CCM 8364) em um fermentador. A cultura foi mantida em uma temperatura de 25°C, com uma taxa de agitação de 712 rpm, e com um fluxo de ar de h volume/volume/minuto. Após 93 horas, foram acrescentados 65 ml de solução de glicose a 80% (peso/volume). As concentrações de ácido micof en ólico, MPA- IV e ácido homo-micofenólico foram medidas durante 117 a 215 horas. 0 nivel de MPA-IV e ácido homo-micofenólico subiu para acima de 4% após 8 dias e então caiu para cerca de 4 % e 2% respectivamente, após 215 horas (9 dias). O titulo final de MPA foi 1,3 g/l (vide Figura 2).

Exemplo 3: Fermentação Batelada de Arido Micofenólico

4,5 litros de um meio contendo 8% w/w amido de batata, 12% w/w maltose, 1,5% p/p glicina, 0,3% p/p diidrogênio fosfato de potássio, 0,05% p/p metionina e 0,1% p/p sulfato de magnésio foram inoculados por 10% cultura vegetativa do organismo Penicillium brevicompactum ATCC 16024. A cultura foi misturada a uma taxa de agitação de 700 a 1000 rpm e foi areada com um fluxo de ar de 0,4 a 0,7 volume/volume/minuto e a temperatura foi mantida em 25±2°C por 12 dias. A partir do segundo dia, a concentração de ácido micofen ólico e o nivel de MPA-IV e de ácido homo- micofen ólico foram medidos por HPLC. Os níveis de MPA-IV e ácido homo-micofen ólico baixaram de cerca de 10% e 3% da área relativamente ao pico principal (de M PA) conforme medição por HPLC, respectivamente, e alcançaram 1% (relativamente ao nível de M PA) no 9° dia, e então permaneceram aproximadamente os mesmos até o final da fermentação. A produtividade final (título medido por HPLC) foi de 1,8 g/l de MPA e a taxa média de produção de MPA foi de 6,4 ug/g/h (vide Figura 3).

Exemplo 4: Fermentação Batelada-Alimentada de Ácido Micofenólico

(O nível da fonte de carbono foi controlado e a alimentação foi interrompida no final da fermentação)

Um meio contendo 3% p/p glicose, 1,5% p/p glicina, 0,5% p/p milhocina, 0,2% p/p diidrogênio fosfato de potássio, 0,1% p/p metionina e 0,1% p/p sulfato de magnésio foi inoculado por 10% cultura vegetativa de uma linhagem de penicíllium produtora de ácido micofenólico (Penicillium sp com o número de acesso CCM 8364). A cultura foi misturada e areada e a temperatura foi mantida em 25±2°C por 10 dias. O nível de glicose da fermentação foi mantido na faixa de 0,02 a 0,8% p/p por alimentação da fonte de carbono. Aplicou-se tambén a alimentação por batelada de milhocina (CSL, do inglês Corn Steep Liquor) (0,5 a 0,2%/dia a partir do 4o dia) e glicina (0,1 a 0,3% por dia a partir do 4°dia). A partir do segundo dia, a concentração de ácido micofenólico, o nível de MPA-IV e ácido homo-micof en ólico, bem como o pH foram medidos (por HPLC e eletrodo potenciométrico, respectivamente). Como resultado do controle do nível da fonte de carbono por meio da alimentação, os níveis de MPA-IV e ácidc homo-micof en ólico baixaram continuamente até o final da fermentação, tendo alcançado cerca de 0,5% da área por HPLC no nível final. A produtividade/título final foi de 9,9 g/l de MPA e a taxa média de produção do MPA foi de 39 pg/g/h. No final da fermentação o pH não se elevou significativamente. (Vide Figura 4).

Exemplo 5: Fermentação Batelada Alimentada Aperfeiçoada de

Ácido Micofenólico (O nível da fonte de carbono foi controlado e a alimentação foi interrompida 24 a 48 horas antes da colheita)

Um meio contendo 3% p/p glicose, 1,5% p/p glicina, 0,5% p/p milhocina, 0,2% p/p diidrogênio fosfato de potássio, 0,1% p/p metionina e 0,1% p/p sulfato de magnésio foi inoculado por 10% cultura vegetativa de uma linhagem de penicillium produtora de ácido micofenólico (Penicíllium sp. com No. de acesso CCM 8364). A cultura foi misturada e areada e a temperatura foi mantida em 25±2°C por 13 dias. O nível de glicose da fermentação foi mantido na faixa de 0,02 a 0,8% p/p por alimentação da fonte de carbono. A alimentação batelada de CSL (0,05 a 0,2%/dia a partir do 4o dia) também foi aplicada. A alimentação de nutrientes foi interrompida no 10° dia. A partir do segundo dia, a concentração do ácido micof en ólico, o nivel de MPA-IV e de ácido homo-micofenólico, bem como o pH foram medidos (por HPLC e eletrodo potenciom étrico, respectivamente). Como resultado do controle do nivel da fonte de carbono por meio da alimentação e interrupção do fornecimento durante as últimas 24 a 48 horas da fermentação, os níveis de MPA-IV e ácido homo-micofenólico baixaram continuamente até o final da fermentação e alcançaram um nível final de menos que cerca de 0,15% da área por HPLC. A produtividade final foi de 10,0 g/l de MPA e a taxa média de produção de MPA foi de 33 μg/g/h. No final da fermentação o pH elevou-se acima de 6,5. (Vide Figura 5).

Exemplo 6:' Fermentação Batelada Alimentada Aperfeiçoada de

Ácido Micofen ólico (0 nível da fonte de carbono foi controlado e a alimentação foi interrompida de 24 a 48 horas antes da colheita)

4,5 litros de um meio contendo 3% p/p glicose, 2,0% p/p glicina, 0,5% p/p milhocina (CSL), 0,2 diidrogênio fosfato de potássio, 0,05% p/p metionina e 0,1% p/p sulfato de magnésio foram inoculados por 10% cultura vegetativa do organismo Penicillium brevicompactum, ATCC 16024. A cultura foi misturada com uma taxa de agitação de 700 a 1000 rpm e areada com um fluxo de ar de 0,4 a 0,7 volume/volume/minuto, e a temperatura foi mantida em 25±2°C por 12 dias. O nível de glicose da fermentação foi mantido na faixa de 0,02 a 0,8% p/p por meio da alimentação de glicose. A alimentação de glicose foi interrompida no 10° dia. A alimentação por batelada de CSL (0,1 a 0,15%/dia a partir do 4o dia até o 9o dia) e glicina (0,1 a 0,2%/dia desde o 4o dia até o9° dia tambán foi aplicada. A partir do segundo dia, a concentração de ácido micofen ólico e os níveis de MPA-IV e ácido homo-micof en ólico foram medidos por HPLC. A alimentação de nutrientes foi interrompida no 10° dia. Como resultado do controle do nível da fonte de carbono por meio da alimentação e da interrupão do fornecimento durante as últimas 48 horas da fermentação, os níveis de MPA-IV e ácido homo-micofenólico subiram e depois baixaram continuamente até o fina da fermentação, tendo atingido um nível final de menos que cerca de 0,3% da área por HPLC. A produtividade final foi de 2,2 g/l de MPA e a taxa média de produção de MPA foi de 7,8 yg/g/h. (Vide Figura 8) .

Exemplo 7: Sumário dos Resultados

Durante a fermentação, o nível de impurezas na fermentação do ácido micofen ólico foi medido por HPLC e a produtividade final também foi medida. Esses resultados obtidos a partir dos exemplos de 1 a 6 foram apresentados na Tabela 1. Nos exemplos 1, 2 e 3, a fermentação do ácido micofenólico foi realizada conforme o procedimento padrão para fermentação, isto é, fermentação batelada, em que o nível da fonte de carbono não foi controlado. No exemplo 4, a fermentação de ácido micofenólico foi realizada por fermentação batelada alimentada, em que o nível da fonte de carbono foi controlado e a alimentação foi interrrompida no final da fermentação. Nos exemplos 5 e 6, a fermentação foi realizada por fermentação batelada alimentada aperfeiçoada, em que o nível da fonte de carbono foi controlado e a alimentação foi interrompida de 24 a 48 horas antes da colheita.

Tabela 1 - Comparação dos Resultados Obtidos

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Os resultados da Tabela 1 demonstram que o nível de

impurezas no ácido micofenólico foi reduzido consideravelmente durante a fermentação das duas linhagens, Penicillium CCM 8364 e P. Brevibacterium ATCC 16024, quando a fermentação foi conduzida como fermentação batelada alimentada e fermentação batelada alimentada aperfeiçoada, em que o nível da fonte de carbono foi controlado, (exemplos de 4 a 6), em comparação com o uso dos procedimentos padrões da fermentação batelada, em que o nível da fonte de carbono não foi controlado (exemplos de 1 a 3). Alen disso, a produtividade final e a taxa de produção de ácido micofenólico aumentaram quando a fermentação do ácido micofenólico foi conduzida por fermentação batelada aperfeiçoada (exemplos de 4 a 6) em comparação com o uso do procedimento padrão de fermentação (exemplos de 1 a 3).

Exemplo 8: Produção de Micofenolato Mofetil a partir do Ácido Micofenólico, de acordo com a Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 2005/105771

Uma mistura de ácido micofenólico (192 g, 0,6 mol) e 4-(2-hidroxietil)-morfolina (440 ml, 6 equivalentes molares) é agitada a 150-155°C por 4 horas na presença de diidrato cloreto de estanho(II) (20,4 g, 0,15 equivalentes molares) sob atmosfera de nitrogênio. Após a conclusão da reação, permite-se que a mistura de reação resfrie até temperatura ambiente. O líquido escuro obtido é despejado em isobutil acetato (4,0 1). A solução é extraída com solução aquosa de bicarbonato de sódio a 2% (1,2 1, depois 2 x 0,4 1). Após o primeiro acréscimo de bicarbonato de sódio, o sistema bifásico que se forma é tratado com carvão (40 g) e filtrado (uma emulsão é retirada por filtragem) A solução é extraída com água (1 litro). Após separação das fases a fase orgânica é lavada com água (1 litro) e evaporada até secagem a 40-50°C sob vácuo. Ao material sólido são acrescentados acetona (400 ml) e isopropanol (3,8 l)ea mistura é aquecida até 40-50°C (o material se dissolve). A solução é resfriada até -5°C durante 6 horas e é agitada nessa temperatura por 10 a 12 horas. Após filtração, os cristais são lavados com uma mistura (2:19) de acetona:isopropanol (420 ml). O composto bruto é secado a vácuo a 60°C. O rendimento foi de 169-195 g (65-75%). Perfil de impurezas por HPLC: MPA = 0,1%. Análise: 99,85%

Exemplo 9: Preparação de Árido Micofenòlico Concentrado, de acordo com o Pedido Publicado de Patente US No.

2005/0250952

O caldo fermentado (220 kg) é ajustado em pH 8,0 aproximadamente. O caldo fermentado é filtrado por membranas plásticas de microfiltração (por exemplo, MFK-617 e HFM-180, da KOCH). Acrescenta-se água continuamente, para diluição durante a filtração. O caldo filtrado é ajustado em pH de cerca de 4,0 e a suspensão cristalina é concentrada até aproximadamente 70 litros. O pH da suspensão acídica concentrada é então ajustado em pH alcalino de 7,5 a 11,0.

Essa suspensão alcalina é usada para a purificação do ácido micofenólico, como no exemplo seguinte. Exemplo 10: Purificação de Ácido Micofen ólico, de acordo com o Pedido Publicado de Patente US No. 2005/0250952

Uma suspensão concentrada de ácido micofenólico de 140 kg (produzida a partir de 620 kg de caldo fermentado) é ajustada com 800 ml de solução concentrada de hidróxido de amônio em um pH de 8,3 a 8,5. A solução alcalina é purificada com 80 litros de acetato etilico. O acetato etilico é misturado à solução alcalina, agitado por 30 minutos, e as fases são separadas.

À fase aquosa obtida (150 kg), acrescentam-se 40 litros de acetato etilico. O pH é ajustado em 5,9, agitando-se por 30 minutos, e as fases são separadas.

As fases de acetato etilico das duas extrações acidicas são combinadas e concentradas até aproximadamente 200 g/l de concentração a, no máximo, 70°C, sob pressão reduzida. A solução concentrada de acetato etilico é aquecida até 60 - 65°C, resfriada até -IO0C a uma taxa de resfriamento de aproximadamente 3cC/hora, e permite-se que cristalize por 18 horas a -10°C. Os cristais são filtrados e lavados com acetato etilico resfriado. Os cristais são secados a, no máximo, 70°C sob pressão reduzida. Massa de cristais: 1250 g. Análise: 99,0%.

Os cristais são recristalizados do acetato etilico após tratamento com carvão.

Exemplo 11: Isolamento do Árido Homo-Micofen ólico

Concentrados da produção de ácido micofenólico (10g) foram purificados por cromatograf ia de coluna em gel de silica, usando-se diclorometano polarizado por etapas com metanol (0 a 5% volume/volume) . As frações foram monitoradas por TLC em gel de silica (benzeno:ácido acético, 9:1 volume/volume). Frações contendo ácido horao- micofenólico (a 1,5% de metanol) foram combinadas e evaporadas até secagem (3g). Finalmente, a purificação de ácido homo-micofenólico foi realizada por RP-HPLC preparatória (coluna C-18 e eluição isocrática com metanol aquoso 76%, volume/volume, 9 ml/min). 0 ácido homo- micofenólico purificado foi eluido a 36,6-39,5 min. Obteve- se ácido homo-micofenólico cristalino branco por cristalização a partir de metanol/água (vide Figuras 9 e 10).

Exemplo 12: Purificação de Á:ido Micofen ólico

A 14 m3 de caldo fermentado colhido, acrescentou-se o mesmo volume de água potável, seguido por 168 litros (1,2%) de solução de amônia concentrada. Acrescentou-se um auxiliar de filtragem (perlite) em 1% da massa do caldo fermentado auxiliar, e o pH foi ajustado entre 8,0 e 8,5, adicionando-se solução concentrada de ácido fosfórico 85% (aproximadamente 100 litros). 0 caldo tratado foi mantido em temperatura ambiente, sem agitação, por pelo menos 6 horas. A filtração foi realizada em filtro de tambor a vácuo durante lavagem com água potável. Coletou-se um filtrado de 42 irr. C rendimento da filtração do caldo fermentado foi de aproximadamente 90%.

0 pH do caldo fermentado filtrado foi ajustado em 4,0- 4,5 acrescentando-se uma solução de ácido sulfúrico a 20% (aproximadamente 300 litros). Após pelo menos 3 horas, os cristais brutos precipitados foram filtrados e concentrados sobre membrana de microfiltração (MFK, da KOCH). Os 42 m3 de caldo fermentado filtrado com pH. ajustado foram concentrados até 1/4 0 do volume (aproximadamente 1,0 a 1,2 m3). 0 tempo de filtração foi de aproximadamente 60 horas. A solução concentrada foi diluída com cerca de 2 m3 de água acídica, e a solução foi novamente concentrada até 1,0 - 1,2 m3. Após remoção da solução concentrada, o equipamento foi lavado com 0,3 a 0,5 rrr de água potável acidica. O rendimento da precipitação e concentração foi de aproximadamente 80%.

0 1,0 a 1,2 m3 de concentrado e o 0,3 a 0,5 m3 de água acidica de lavagem foram combinados; acrescentou-se de 0,5 a 0,6 vezes o volume de acetato etílico (aproximadamente 0,8 m3) , e o pH foi ajustado entre 9,0 e 9,2 com solução concentrada de amônia. A extração foi conduzida por 30 minutos, e o pH foi ajustado entre 9,0 e 9,2. As fases foram separadas.

À fase aquosa adicionou-se novamente 0,5-0,6 vezes o volume de acetato etilico (aproximadamente 0,8 irr) (calculado conforme o volume do concentrado acidico combinado) e o pH foi ajustado entre 9,0 e 9,2 com solução concentrada de amônia / solução de ácido sulfúrico a 20%. A extração foi conduzida por 30 minutos, e o pH foi ajustado entre 9,0 e 9,2. As fases foram então separadas.

À fase aquosa acrescentou-se 0,5-0,6 vezes o volume de acetato etilico (calculado conforme o volume do concentrado acidico combinado) e o pH foi ajustado em 5,8-6,1 com solução de ácido sulfúrico a 20%. Conduziu-se a extração por 30 minutos e o pH foi ajustado entre 5,8 e 6,1. As fases foram separadas.

À fase aquosa acrescentou-se 0,25-0,3 vezes o volume de acetato etilico (calculado de acordo com o volume do concentrado acidico) e o pH foi ajustado em 6,3-6,5 com solução concentrada de amônia. A extração foi conduzida por 30 minutos e o pH foi ajustado entre 6,3 e 6,5. As fases foram então separadas.

A terceira e quarta fases de acetato etilico foram combinadas e evaporadas até aproximadamente 20 g/l (com base no resíduo de evaporação das fases combinadas) a um máximo de 70°C, sob pressão reduzida. O volume final da evaporação foi de cerca de 150 litros. O rendimento da extração e evaporação foi de aproximadamente 90%.

O concentrado de acetato etílico (aproximadamente 150 litros) foi resfriado até entre -IO0C e -17°C (taxa de resfriamento de aproximadamente 3°C por hora), e cristalizado a essa temperatura por pelo menos 2 horas. Os cristais foram lavados com 45 litros de acetato etilico resfriado e secados a um máximo de 70°C sob pressão reduzida. A massa dos cristais foi de aproximadamente 25 kg. O rendimento da cristalização foi de aproximadamente 87%.

Claims (38)

1. UM PROCESSO PARA REDUZIR A FORMAÇÃO DE IMPUREZAS DURANTE A FERMENTAÇÃO DE ÁTIDO MICOFENÓLICO (MPA) , caracterizado por: o processo consistir em controlar o nível da fonte de carbono durante a fermentação do MPA, sendo a fonte de carbono mantida em uma quantidade de cerca de 0,02% a cerca de 0,8% p/p.

2. O PROCESSO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: o nível da fonte de carbono ser mantido em uma quantidade de cerca de 0,05% a cerca de 0,5% p/p.

3. O PROCESSO de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por: as impurezas serem selecionadas no grupo que consiste de: MPA-IV com a seguinte fórmula: <formula>formula see original document page 33</formula> homo-MPA com a seguinte formula: <formula>formula see original document page 33</formula> e combinacoes dos mesmos.

4. O PROCESSO de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por: o nível da fonte de carbono ser mantido durante a fase de produção do processo de fermentação.

5. O PROCESSO de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por: a fonte de carbono ser um carboidrato.

6. O PROCESSO de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por: a fonte de carbono ser amido ou melado.

7. O PROCESSO de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por: a fonte de carbono ser, no mínimo, um dentre glicose, sucrose, maltose, ou glicerol.

8. O PROCESSO de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por: A fonte de carbono ser glicose.

9. O PROCESSO de. acordo com qualquer das reivindicações de 3 a 8, caracterizado por: a quantidade de MPA-IV no caldo de fermentação obtido ser de menos que cerca de 0,5% da área por HPLC.

10. O PROCESSO de acordo com qualquer das reivindicações de 3 a 8, caracterizado por: A quantidade de homo-MPA no caldo de fermentação obtido ser de menos que cerca de 0,5% da área por HPLC.

11. O PROCESSO de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por o processo consistir ainda em interromper o controle da fonte de carbono antes da colheita.

12. O PROCESSO de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por: o controle da fonte de carbono ser interrompido por interrupção da alimentação da fonte de carbono durante as últimas 20 a 96 horas da etapa de produção.

13. O PROCESSO de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por: o processo consistir de um meio de fermentação contendo um nível inicial de uma fonte de carbono (período de crescimento) que corresponde a aproximadamente de 1% a 5% p/p do meio de fermentação.

14. O PROCESSO de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por: o processo consistir de um caldo de fermentação ao qual se acrescenta pelo menos um dentre: um sal mineral, uma fonte de nitrogênio, um fator de crescimento microbiano, uma fonte de fósforo, ou um tampão

15. O PROCESSO de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por: o sal mineral ser, no mínimo, um entre sulfato de magnésio, dicloreto de manganês, sulfato ferroso, cloreto de zinco, sulfato de cobre II, sulfato de amônio, diidrogênio fosfato de potássio, cloreto de sódio ou carbonato de cálcio.

16. O PROCESSO de acordo com qualquer das reivindicações -14 ou 15, caracterizado por: a fonte de nitrogênio ser uma fonte de nitrogênio orgânico ou inorgânico assimilável.

17. O PROCESSO de acordo com qualquer das reivindicações de 14 a 16, caracterizado por: a fonte de nitrogênio ser um nitrato, uréia, um sal de amônio, milhocina, ou um aminoácido.

18. O PROCESSO de acordo com qualquer das reivindicações de 14 a 17, caracterizado por: o fator de crescimento microbiano ser, no mínimo, um dentre extrato de levedura ou vitaminas.

19. O PROCESSO de acordo com qualquer das reivindicações de 14 a 18, caracterizado por: a fonte de fósforo ser diidrogênio fosfato de pot ássio.

20. O PROCESSO de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por: a fermentação do ácido micofenólico ser realizada por um microorganismo produtor de ácido micofenólico selecionado no grupo que consiste de P. brevicompectum, P. scabrum, F. nagemi, P. roqueforti, P. patris-mei e F. viridicatum, ou um derivado dos mesmos.

21. O PROCESSO de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por: o microorganismo produtor de ácido micofenólico ser uma linhagem de Penicillium sp. (número de acesso CCM 8364), ou um derivado da mesma.

22. O PROCESSO de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por: o processo consistir ainda em isolar o MPA do caldo de fermenta ção.

23. O PROCESSO de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por: o processo consistir ainda na alimentação batelada da fonte de nitrogênio.

24. O PROCESSO de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por: a fonte de nitrogênio ser glicina e/ou milhocina para o caldo de fermentação.

25. UM PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE MMF COM UM NÍVEL REDUZIDO DE IMPUREZAS, caracterizado por: o processo consistir em preparar MPA de acordo com o processo da reivindicação 1 e convertê-lo em MMF.

26. E-8-(4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-1,3-diidro- isobenzofuran-5-il)-2,6-dimetil-ácido octo-6-en óico ("HOMO- MPA") ISOLADO,caracterizado por: ter a seguinte fórmula: <formula>formula see original document page 37</formula>

27. 0 HOMO-MPA ISOLADO de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por: o homo-MPA isolado ser um sólido.

28. 0 H0M0-MPA ISOLADO de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por: o homo-MPA isolado ser cristalino.

29. O ÁCIDO HOMO-MICOFEN OLICO ISOLADO de acordo com qualquer das reivindicações de 26 a 28, caracterizado por: dados selecionados em um grupo que consiste de: RNM 1H (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 1.15, 1.35, 1.42, 1.63, 1.77, -1.98, 2.15, 2.43, 3.39, 3.77, 5.19, 5.20, e 7.68; RNM 13C (100MHz, CDCl3) δ (ppm): 11.5, 16.0, 16.8, 22.6, 25.2, -33.0, 39.1, 39.4, 61.0, 70.0106.4, 116.7, 122.2, 122.5, -135.5143.9, 153.7, 163.7, 172.9, e 182.3, e combinações dos mesmos.

30. O ÁCIDO HOMO-MICOFEN OLICO ISOLADO de acordo com qualquer das reivindicações de 26 a 29, caracterizado por: dados selecionados em um grupo que consiste de: um espectro de RNM 1H conforme mostra a Figura 6, um espectro de RNM 13C conforme mostra a Figura 7, e uma combinação dos mesmos.

31. O HOMO-MPA de acordo com qualquer das reivindicações de 26 a 30, caracterizado por: o homo-MPA ser uma composição que cont em MPA em uma quantidade de menos que cerca de 5%, por peso.

32. A COMPOSIÇÃO de acordo com a reivindicação 31, caracterizada por: a composição de homo-MPA conter de cerca de 5% a cerca de 0,05% de MPA, por peso.

33. UM PROCESSO PARA DETERMINAR A PRESENÇA DE HOMO-MPA EM UMA AMOSTRA DE MPA, caracterizado por: O PROCESSO consistir na realização de HPLC ou TLC de uma amostra de MPA utilizando-se o homo-MPA como marcador de referência.

34. O PROCESSO de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por: o processo consistir em: (a) medir por HPLC ou TLC o tempo ou fator de retenção relativo correspondente ao homo- MPA em uma amostra de marcador de referência; (b) determinar por HPLC ou TLC o tempo de retenção relativo correspondente a homo-MPA em uma amostra contendo homo-MPA e MPA, e (c) identificar o homo-MPA na amostra comparando- se o tempo ou fator de retenção relativo do homo-MPa conforme a medição da etapa (a) ao RRT ou RRF da etapa (b).

35. UM PROCESSO PARA DETERMINAR A QUANTIDADE DE HOMO-MPA EM UMA AMOSTRA DE MPA CONTENDO HOMO-MPA E MPA, caracterizado por: o processo consistir na realização de HPLC utilizando- se homo-MPA como padrão de referência.

36. O PROCESSO de acordo com a reivindica ção 35, caracterizado por: o processo consistir em: (a) medir por HPLC a área sob um pico correspondente ao homo-MPA em um padrão de referência que consiste de uma quantidade conhecida de homo-MPA; (b) medir por HPLC a área sob um pico correspondente a homo-MPA em uma amostra contendo homo-MPA e MPA, e (c) determinar a quantidade de homo-MPA na amostra comparando-se a área da etapa (a) com a área da etapa (b).

37. UM MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE Jfc IDO MICOFENÓLICO caracterizado por: o método consistir em: preparar um caldo de fermentação contendo um microorganismo produtor de ácido micofen ólico; fermentar o ácido micofenólico ao mesmo tempo em que se alimenta com nutrientes o caldo de fermentação; controlar o nivel da fonte de carbono no caldo de fermentação, mantendo-o em uma quantidade de cerca de 0,02% a cerca de 0,8% p/p durante a etapa de fermentação do ácido micofenólico; colher e recuperar o ácido micofenólico do caldo de fermentação.

38. Um composto isolado caracterizado por: o composto ter a seguinte estrutura: