TW200904982A - Method for reducing impurity level in mycophenolic acid fermentation - Google Patents

Description

200904982 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於降低黴酌·酸發酵過程中不純物（尤其係 MPA-IV (E-10-(4-羥基-6-曱氧基-7-甲基-3-氧代·1，3_二氫 _ 異本弁。夫σ南-5-基）-4,8-二甲基-癸- 4,8-二稀酸）及高MPA (Ε_ 8-(4-^基-6-曱氧基-7-甲基-3 -氧代-1，3-二鼠-異苯并σ夫!7南_ 5-基）-2,6-二甲基-辛-6-稀酸））之方法。本發明亦係關於經 分離高MPA及其作為參考標記及標準物之用途。 本申請案主張於2007年4月11日提出申請的美國臨時申 請案第60/923,079號、2007年10月9日提出申請的第 60/998,341號及2008年1月4曰提出申請的第61/019,036號之 權利，該等申請案以引用的方式併入本文中。 【先前技術】 下式之（E)-6-(4-羥基甲氧基-7-曱基_3_氧代-1H-異苯 并呋喃-5-基）-4-曱基·己基_4_稀酸（即黴酚酸（”MpA,,))

黴酚酸（"MPA”）

係 — MU過程（亦即由青Μ微生物所進行之發酵）產 生之抗生f e知在深層及固相發酵中有若干類青黴菌， 包括缸么 n '氤箄(P. brevic〇mpact叫、p，“abrum、p. 130604.doc 200904982 心gew/、婁格法爾特氏青黴菌（P royori/)、户· me/及鮮綠青徽菌（ρ· w.；rWC(^ww)(ciutterbuck, P.W.等人

XXIV· 丁he metabolic products of the ^revz·- cc?mmpac；iM/w series，” Biochem.J. 26:1442-1458 ;及 Frisvad， J.C·與 Filtenborg，〇· 1983 "Classification of terverticillate Penicillia based on profiles of mycotoxins and other secondary metabolites," Appl.Environ.Microbiol. 46:1301-1310)。 在發酵過程中’某些起始物質經一系列生化反應會轉化 成最終產品MPA。 彼等熟習此項技術者通常可使用數種發酵方法，例如 分批發酵”補料分批發酵”、或，，連續發酵/恒化器”。 MPA係具有下式之黴酚酸嗎乙酯（myc〇phen〇late mofetil)("MMF”）的起始物質

其係MPA的2-嗎啉乙酯衍生物’已證明其可在接受異源器 官移植之患者中預防排斥反應。 英國專利第1157〇99號、歐洲專利第1 624〇7〇 ^號、及 曰本專利第59091 891號揭示了製備MPA之發酵方法，其係 使用_株改進或培養基優化來改進MPa生產率。 130604.doc 200904982 根據其摘要’ WO公開案第2006/03821 8號揭示了 ”藉由

WO公開案第2008/026883號之公開曰期後於本申請案之 優先權曰，根據摘要，其揭示"藉由在包含3_9g尿素、碳 源、氮源、及微量元素之培養溶液中培養青黴菌短密青黴 菌以生產黴酚酸之方法”。 J. C/^m.心c. 2:365-73; 1982報導了一種具有以下結構 之MPA不純物。

已知其為E-10-(4-羥基-6-甲氧基_7_甲基_3_氧代_1>3_二氫_ 異笨并呋喃-5-基）-4,8-二甲基-癸_4,8-二烯酸（"MPA-IV")， 其係在製備MPA之發酵過程中所產生。該不純物與Mpa具 有類似結構且當將MPA轉化為MMF會被嗎啉基乙醇酯化， 此將產生具有下式之黴酚酸嗎乙酯的同系不純物：

化學反應之產物混合物極少係具有足夠純度而符合醫藥 130604.doc 200904982 標準之單一化合物。因此，除MPA外，培養基中發酵產物 可月b還含有額外化合物或不純物。該等不純物可能為（例 如）反應中間產物（例如MPA-IV)、反應副產物、副反應產 物、或降格產物。MPA、或其他活性醫藥組份（"Ap〗”）中之 不純物（例如MMF)非吾人所期望且在極端情形下，甚至可 能對接受含有該API之劑型治療之患者有害。 生產過程中所產生之API的純度對商業化至關重要。美 國食品與藥品管理局（F〇〇d and DrUg Administration ("FDA"))要求生產過程不純物保持低於設定限值。舉例而 言，在其API生產之ICH Q7A指南中，FDA詳細說明瞭可 使用之原材料的質量、及可接受之工藝條件，例如溫度、 壓力、時間、及化學計量比，還包括純化步驟，例如結 晶、蒸餾、及液-液萃取。參見ICH Good Manufacturing Practice Guide for Active Pharmaceutical Ingredients, Q7A，現行第4版（2000年1 1月i〇曰）。 在處理API過程中之特定階段⑽如mpa)，必須（典型地） 藉由高效液相層析法（"HPLC”）或薄層層析法（"TLC")進行 純度分析，以測定其是否適宜於繼續處理並最終用於醫藥 產物中。API不需絕對純淨，乃因為絕對純淨係一種不能 達到之理論理想狀況。更確切地說，FDA要求API盡可能 地不含不純物’因此可儘可能安全地用於臨床用途。舉例 而言’ FDA推薦若干不純物之量可限制在低於〇·丨◦/❶。參見 ICH Good Manufacturing Practice Guide for Active

Pharmaceutical Ingredients，Q7A，現行第 4版（2000年 11 月 130604.doc 200904982 ίο 曰）。 -般而言’副產品、副產物、及添加劑(統稱為”不純物": 可以光譜法及/或以另一物理方法進行識別，且隨後可獲 得峰位置（例如在層析圖中）、或TLC板上的點。參見 Strobel，H.A.等人，Chemical Instrumentati〇n: a

SystEMATIC Approach，953，第3版（·” &

York 1989)。一旦具體不純物與峰位置聯繫起纟，則藉由 其在層析圖中之相對位置可識別樣品中之該不純物，其中 層析圖中之位置係以在管柱中注射樣品與經由檢測器溶離 該不純物之間之分鐘數來量測。層析圖中之相對位置 ”滯留時間’’。 滯留時間可基於儀器條件及許多其他因素而變化約一平 均值。為減輕該等變化對精確識別不純物之影響，從業者 通常使用”相對滯留時間"（，，RRT”）來識別不純物。見I文 所述文獻Strobee 922 K。不純物之RRT可藉由不純物之 滞遠時間除以參考標記之滞留時間來計算。參考標記可為 不純物所在之API，或可為存於樣品或添加至樣品中之另 -化合物。參考標記存於樣品中之量應足夠大至可檢測， 但其量不應大至使管柱飽和。 彼等熟習藥物生產研究及開發技術者應瞭解相對純淨之 化口物可用作”參考標準物"。參考標準物類似於參考標 ^己但其不僅可用於識別存於樣品中之不純物，亦可定量 不純物之量。 田使用相同技術分別分析已知濃度之參考標準物溶液與 130604.doc •10- 200904982 未知混合物時，參考標準物係”外標”。見上文所述文獻 Strobel ^ 924 I ; Snyder, L.R. f Λ , INTRODUCTI〇N τ〇 MODERN LIQUID CHR〇MAT〇GRAPHY5 549 , f m(j〇hn 〇 ，NeW Υ°Α 1 979) °可藉由比較參考標準物之檢測 器響應與不純物之響應來測定樣品中不純物之量。參見美 國專利巾請㈣6,333，198號，以引料方式併人本文中。 參考標準物亦可用作”内標"，亦即可以預定量直接添加 至樣品中之標準物。當參考標準物係内標時"響應因子" 可補償檢測器對不純物與該參考標準物之敏感性差 可用於對樣品中不純物進行定i ~ 、 ^ 订疋里見上文所述文獻Strobel 第_頁。為達成此目的，將參考標準物直接添加至混合 物中，此即稱為，，内標"。見上文所述文獻如㈣第奶 頁；Snyder 第 552 頁。 標準物添加”之技術亦可用以對不純物進行定量。當樣 品含有未知的可檢測量之參考標準物時，可使㈣技術。 在”標準物添加"中，藉由添加已知且不同量之内標製備至 f兩個樣品。見上文所述文獻Str()be丨第391_393頁； 第571-572頁。由呈現於樣品中參考標準物引起之檢測器 響應的比例可藉由將檢測器響應對添加至各樣品中參考標 準物之量作圖並將圖外推至零點來測定。見上文所述文獻 Strobe 392 ’圖！ i ·4。Ηριχ中檢測器（例如㈣檢測器或 折射率檢測器）對自HPLC管柱溶離之各化合物之響應可能 且通常係不同的。已知響應因子可體現檢測器對自管柱溶 離之不同化合物之響應信號的該種差異。 130604.doc 200904982 、如彼等熟習此項技術者所知，藉由理解其化學結構與合 成路線、及識別影響終產物中不純物之量的參數可極大地 加強對工藝不純物之控制。 因此，開發一種可降低發酵過程中MPA中不純物含量的 方法將係有益的。分離、識別及定量該等不純物亦將係有 益的。 【發明内容】 ，.、 在一實施例中，本發明涵蓋一種在黴酚酸（MPA)發酵過 程中降低不純物形成之方法，其包括：控制MPA發酵過程 中之碳源含量’其中維持該碳源量在約〇.8%_約〇 〇2% w/w ° 在另一實施例中，本發明涵蓋一種製備黴酚酸嗎乙酯 (MMF)之方法’其包括根據本發明之方法製備MpA並將其 轉化為MMF。 在另一實施例中’本發明涵蓋具有下式之經分離E-8-(4-羥基-6-曱氧基-7-甲基-3-氧代_丨，3_二氫_異苯并呋喃_5_基）_ 2,6-二曱基-辛-6-烯酸（"高MPA，，）：

在又一實施例中，本發明涵蓋一種藉由包括以下之方法 在MPA樣品中測定存在tfj MPA之方法：以高MPA作為參考 標記實施HPLC或TLC ° 130604.doc -12- 200904982 在另實施例中，本發明涵蓋一種藉由包括以下之方 在包含高MPA及MPA的MPA樣品中測定高MPA之量的去 法：以高MPA作為參考標準物實施Ηριχ。 里、方 在另一實施例中，本發明涵蓋一種製備黴酚酸之方法 其包括：製備含有可產生㈣酸微生物的發酵液；發酵，齡 酚酸同％向該發酵液補加營養素；在黴酚酸發酵階段中將 發酵液之碳源含量控制於約0.02。/。-約〇.8% w/w;自該於、 液收穫並回收黴酚酸。 z x酵 在又一實施例中，纟發明涵蓋—種具有以下結構 八 離化合物： 77

通常，黴酚酸（MPA)之發赌為人、， X發酵包含以下階段：1)生長期 2)生產期及3)收穫。 本發明係關於一 程中進行補料過程 在補料期間中， 種補料分批發酵方法，其中在生產期過 ，因此補料期成為生產期之一部分。 控制/維持碳源含量，因此產生實質上 低含量之副產物或不純物 尤其指10-(4-羥基-6-甲氧基、 7 -甲基-3-氧代-13 -二氮笑五上 乳吳本开呋喃基）-4,8-二曱基-癸、 4,8·二烯酸（"MPA-IV”）及/咨 ρ ， ’ 羥基-6-曱氧基-7_甲基、 130604.doc •13- 200904982 3-乳代-二氫-異苯并咳喃_5_基）_26_二甲基·辛冬稀酸 (，，向MPA，，）。因此，與完全不維持碳源、含量（實例μ)或雖 維持但未達到如此低含量之發酵方法中不純物產量相較 下’本發明方法可視為一種可降低該等不純物產量的方 法0 不純物（包含發酵階段所產生之副產物）含量因會影響後 續純化步驟之功效而對生產方法之總體經濟情況產生重大

影響。而i，由於其結構相似性，通常需要複雜純化方法 方可自發酵液中消除該等不純物。該等純化方法在下游處 理過程中實施起來花費昂貴且所提供產率較低。因此，開 發一種降低黴酚酸發酵過程中不純物之方法可提供日益增 加之經濟效益。 此外，由於黴酚酸與黴酚酸嗎乙酯為高劑量藥物，因此 MPA/MMF中所允許之不純物含量將受到更嚴格控制。參 見發表於02/2002之ICH Q3A(R)指南附錄！。 如本發明所述，降低黴酚酸製法中之MPA_IV與高黴酚 酸含量之方法包括：控制MPA發酵過程中之碳源含量，其 中將該碳源量維持於約0.02%-約0.8% w/w，較佳地於約 0.05%-約 0.5% w/vy。 本文所用術語"w/w"代表一種以化學分析設備所量測之 液體發酵液中碳源濃度（以克/克發酵液為單位）的表述方 法。 較佳地’在發酵過程之補料期間控制/維護碳源含量。 在該期間之前，碳源可能為約1%-約5% w/w，更佳約2%_ 130604.doc 14 200904982 約 3% w/w。 其碳源為糖或糖類組合物。更佳地，碳源為殿粉 5 至更佳地’為葡萄糖、簾糖、麥芽糖、甘油。 最佳地’碳源為葡萄糖。 通吊猎由取樣發酵液來量測碳源含量以確定是否繼續補 料以維持該碳源含量。取自發酵液之樣品可以3_ rpm離

〜卿、過溏並使用BioPr〇filel_lus生化分析儀C經由電 流計酶電極）量測碳源量。或者，可使用（例如）紅外線或近 紅外線光譜測定法在線監測碳源含量。 本發明之方法可在發酵液及在最終Mp A產物中得到低含 里之MPA-IV&@MPA。較佳地，以HPLC量測所得發酵液 中MPA-IV與高MPA之量低於約〇 5面積％，更佳地，以 HPLC量測低於約〇·3面積％，甚至更佳地，以帆〇量測低 於約0.2面積％ ’且最佳地，以Ηριχ量測低於約〇15面積 %。藉由以各不純物之峰下面積除以MpA之峰下面積計算 該等不純物之量。因此，各不純物之量表述為相對於MpA 之量的面積％。 較佳地，包含MPA之發酵液含有以HPLC量測約〇〇〇1%_ 約0.5%、較佳約〇.〇1_約0 5%、更佳約〇 〇5_約〇 2%、且最 佳約0.05-約0.15面積％之MPA-IV及/或高MPA。 進一步降低不純物含量（尤其MPA-IV及高MPA)可藉由在 黴酚酸生產階段之最後20-96小時期間（亦即在收穫前）停止 補料來達成。較佳地’在收穫之前約24-96小時、更佳在 約24小時-約48小時時結束補料期。 130604.doc 15 200904982 如實例5及6與實例K3相比較所例示，與補料期恰好在 收穫之則知止所得之純度相比較，該操作可進一步改進發 酵液中所得黴酚酸之純度（尤其係相對高1^1>八與河1>八_1乂）。 控制碳源含量之另一益處係可提高ΜΡΑ之生產迷率-更 低含量之碳源可產生更高的ΜρΑ生產速率，如對於青黴菌 屬而言，比較實例丨與實例4_5中黴酚酸之終產率所例示 (ΜΡΑ生產速率分別為3〇叫⑽比33_39 ^/g/h)，及對於短 狁青黴菌而言，比較實例3與實例6所例示（MPA生產速率分 別為 6.4 pg/g/h 比 7.8 pg/g/h)。 本文所用術語’Vg/g/h"意指MPA生產"速率"：1小時内每 1 g發酵液所產生之pg MPA。MpA生產速率可按下式計 算：終效價（pg /g)除以發酵時間（小時）。 維持低含量碳源之另一益處係可最大化產品產率。產率 表述為以HPLC量測之最終效價。 在本發明之一較佳實施例中，在生長期内，發酵培養基 含有佔發酵培養基之約1%-約5% w/w之起始含量碳源（發酵 培養基包含完整培養基，包括液體、固體、微生物細 胞）。隨後微生物會降低該含量並在生產期間將其維持於 約 0.02%-約 0.8% w/w，較佳地於約 0 05%_約 〇 5% w/w。 發酵培養基亦含有氮源。較佳地，氮源亦係補料分批式 加入。 發酵培養基可包含額外營養素以幫助改進生產率。該等 其他營養素包括礦物鹽、微生物生長因子、攝源及緩衝 劑。 130604.doc • 16- 200904982 礦物鹽源（例如銨、鈣、鐵、鋅、銅、鎂、鈉或鉀鹽）包 括硫酸錢、一氣化猛、硫酸亞鐵、氣化辞、硫酸銅（II)、 硫酸敍、構酸一虱鉀、氯化納及碳酸:ί弓。可使用該等來源 物之組合。較佳來源為硫酸鎮。 有機或無機氮之實例包括硝酸鹽、尿素、敍鹽、胺基 酸、植物粉及玉米漿。該等氮源之具體實例進一步揭示於 WO 2008/026883中，其以引用方式併入本文中。較佳地， 可使用甘胺酸及玉米漿。 微生物生長因子之實例包括酵母提取物及維他命類。有 機或無機磷之實例包括磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫 鉀及磷酸氫鈉。 在一實施例中’可結合使用至少一種氮源、至少一種磷 源、至少一種礦物鹽及至少一種碳源。較佳地可結合使用 甘胺酸、玉米襞、填酸二氫鉀、甲硫胺酸、硫酸鎂、及馬 鈴薯澱粉。 更佳地’發酵培養基含有約1—5%葡萄糖、〇 1〇/。_約3〇/0 w/w甘胺酸、約〇.1%_約3% w/w玉米漿、約〇〇1%_約〇5% W/W磷酸二氫鉀、約〇_1%_約1% w/w甲硫胺酸及約〇1%_約 1% w/w硫酸鎂。 較佳地，以約5%_約20重量％之黴酚酸生產菌株培養物 接種於上述發酵培養基中。較佳地，該菌株為以下種類之 一的青徽菌屬真菌菌株：短密青黴菌、户、尸 ⑽ymz·、婁格法爾特青黴菌、p 及鮮綠青黴菌 物’更佳地為青黴菌屬菌株（登錄號cCM 8364_Czech 130604.doc 200904982

Collection of Micr〇〇raQ«： ^ ,, organisms (CCM)於 Masaryk 大學，

Brno, Czech Republic)或其衍生菌。 較佳地隨後將培養物進并,'日人 、3阳士 W遲仃合、通風並維持溫度於約2 1 °C -約 29°C。 隨後在收穫後自發酵液分離所得之層八。例如可根據本 文揭示之方法藉由在發酵結束時提高阳值獲得驗性發酵 液並過濾、所得培養基來進行分離。織酸化所得溶液及過

濾此時之酸性液體’並將濾出液重懸於水中並調節pH至鹼 性pH值。 隨後可將經分離MPA轉化為MMF。例如可根據閣述於 WO 2005/105771之方法進行轉化。 較佳地’以HPLC量測所得MPA中MpA_IV與高MpA之量 低於約0.5面積％，更佳地，以HpLC量測低於約〇 3面積 % ’甚至更佳地，以HPLC量測低於約〇2面積％，且最佳 地’以HPLC量測低於約〇,15面積％。藉由以各不純物之峰 下面積除以MPA之峰下面積計算該等不純物之量。因此， 各不純物之量表述為相對於MPA之量的面積％。 在另-實施例中，本發明涵蓋下式之經分離e_8_(4_羥 基-6-甲氧基 2,6-二甲基-辛-6-稀酸（”高MPA):，，

130604.doc -18- 200904982 較佳地，經分離高MPA為固體，更佳地，其為結晶。 本文所用關於高MPA之術語”經分離”對應於與發酵液物 理分開的高MPA。舉例而言，可藉由萃取及過濾進行分 離。 較佳地’自MPA中分開本發明之經分離高MPA，藉此提 供含MPA之量低於重量比約5%、較佳地低於約2%、且甚 至更佳地低於約1%之組合物。較佳地，該高MPA組合物 包含重量比約5%-約〇·〇5%、更佳地約2%-約0,1%、最佳地 約 1°/。-約 0.1%之 MPA。 藉由HPLC量測高MPA中MPA之含量。 本發明之經分離高MPA可藉由選自由以下組成之群的數 據來表徵：4 NMR (400 MHz，CDC13) δ (ppm) : 1,15、 1.35、1.42、1,63、1_77、1.98、2.15、2.43、3.39、3.77、 5.19、5.20、及 7.68 ; 13C NMR (100 MHz、CDC13) δ (ppm) : 11.5、16.0、16.8、22.6、25.2、33.0、39.1、 39.4、61.0、70.0、106.4、116.7、122.2、122.5、135.5、 143.9、153.7、163.7、172.9、及 182.3，及其之組合。 本發明之經分離高MPA亦可由描述於圖6中之1H NMR譜 來表徵。本發明之經分離高MPA可進一步由描述於圖7中 之13C NMR譜來表徵。 雨MPA係在製備MPA之發酵過程中所形成之副產物。例 如’其可藉由包括以下之方法自發酵液十分離：a)自包括 黴酚酸與高MPA之發酵液提供濃縮物，b)藉由管柱層析純 化該濃縮物，及c)回收經純化之高黴酚酸。 130604.doc 19 200904982 較佳地，藉由自包含樹脂（例如矽膠、改性矽膠、吸收 樹脂或離子交換樹脂）之管柱上溶離高MPA來進行管柱層 析純化。更佳地，樹脂為碎膠。 可藉由使用有機溶劑混合物來進行純化，例如極性與非 極性溶劑混合物，較佳地極性溶劑為甲醇或乙醇且非極性 溶劑為乙醚或二氯曱烷。更佳地溶離液為二氣甲烷與曱醇 之混合物。最佳地，該溶離液為梯度溶離液，其中曱醇之 量自0增加至約5% v/v。 隨後藉由TLC(苯：乙酸，9:1 v/v)測試溶離溶離份是否存 在高MPA，且然後選擇含有高MPA之溶離份。藉由蒸發溶 劑自所選溶離份回收高MP A。 較佳地，所回收經純化的高MP A可進一步藉由逆相層析 法、更佳地藉由製備型HPLC，然後藉由自選自以下組成 之群的溶劑中結晶進行純化：甲醇與水之混合物、乙腈與 水之混合物、THF與水之混合物。更佳地，該溶劑係甲醇 與水或乙腈與水之混合物。 隨後可使用經分離高MPA(藉由將其用作參考標記及標 準物）來測試MPA之純度。 在一實施例中，本發明涵蓋一種藉由包括以下之方法在 MPA樣品中測定存在高MPA之方法：以高MPA作為參考標 記實施HPLC或TLC。 較佳地，該方法包括（a)藉由HPLC或TLC量測對應於參 考標記樣品中之高MP A的相對滯留時間或因子（分別稱為 RRT、或RRF) ; (b)藉由HPLC或TLC測定對應於包含高 130604.doc -20- 200904982 MPA及MPA的樣品中高MPA的相對滯留時間；及（c)藉由 比較步驟（a)中所量測高MPA之相對滯留時間或因子（RRT 或RRF)與步驟（b)之RRT或RRF來識別樣品中之高MPA。 在另一實施例中，本發明涵蓋一種藉由包括以下之方法 在包含高MPA及MPA的MPA樣品中測定高MPA之量的方 法：以高MPA作為參考標準物實施HPLC。 較佳地，以上方法包括：（a)藉由HPLC量測對應於包含 已知量高MP A的參考標準物中之高MPA的峰下面積；（b) 藉由HPLC量測對應於包含高MPA及MPA之樣品中高MPA 的峰下面積；及（c)藉由比較步驟（a)與步驟（b)之面積測定 樣品中高MPA之量。 自其結構可看出，高MPA係黴酚酸之相近類似物。因 此，由於兩種酸（MPA與高MPA)均含有末端羧基，在將 MP A轉化為MMF時其皆可為嗎啉乙醇酯化。因此，下式之 高MPA的相應嗎琳乙醇酉旨

係MMF API中之潛在不純物。 因此，在測試MPA純度後可藉由選擇一批含有低含量高 MPA之MPA來製備高MPA之酯含量降低的MMF。 130604.doc -21 - 200904982 依據某些較佳具體實施例闡述本發明後，熟諳此項技術 者可根據本說明書之闡述而易於理解其它具體實施例。本 發明藉由參考以下詳細闡述降低黴酚酸發酵之不純物含量 之方法的實例予以進一步定義。彼等熟諳此項技術者應瞭 解可對材料及方法二者實施多種修改，此並不背離本發明 之範疇。 實例

HpLC方法

管柱：逆相矽膠C8 (250*4.6 mm，5 μιη) 溶離液A : 0.005 Μ磷酸’ pH 2.5 溶離液B :乙腈 梯度溶離，t(分鐘）/B% : 0/30、5/30、10/37、13/40、 23/60、30/60、35/100、35.5/100、45/30 流速：1.5 ml/分鐘 管柱溫度：45°C 樣品組織器：l〇°C 檢測器：波長為250 nm 注射體積：10 μΐ 持續時間：45分鐘 稀釋劑：乙腈：水（9:1)，對於發酵液 滯留時間：MPA 11.8分鐘 高MPA 21.7分鐘 檢測限值：0.004% 定量限值：0.01% 130604.doc -22- 200904982 樣品製備：在超聲波水浴中以乙腈：水（9:1)萃取發酵液15 分鐘’並以〇·45 μιη多孔濾紙過濾。濃度為約400 pg/ml。 MPA相對響應因子（於25〇 ηιη處）： 高 MPA 0.865 其他不純物 i.oo NMR光譜測定法 儀器：VarianUNITY lnova_400，對於丨Η於 399,87 MHz，且 對於 13C於 100.5 5 MHz (CDC13, 3 0°C )。 實例1 :黴酚酸分批發酵 以生產黴酚酸之青黴菌株（登錄號為CCM 8364之章黴窗 sp.)的1 0%營養培養物接種包含以下之培養基：8% w/w馬 鈴薯殿粉、12% w/w麥芽糖、1.5% w/w甘胺酸、0.3% w/w 礙酸二氫鉀、0.05% w/w曱硫胺酸及0.1% w/w硫酸鎂。混 合該培養物並通風並將溫度維持在25±2.c達1〇天。從第2 天開始，量測黴酚酸濃度、MPA_IV與高黴酚酸含量及 值（分別藉由HPLC及電位電極）。分批培養基中營養素過量 之結果係，到第8天時MPA-IV與高黴酚酸之含量上升丨〇% 且超過1相對％(指MPA含量），且隨後在發酵結束時保持約 0.5%。終產率（藉由HPLC量測之效價）為7_5 gn MPA且平 均MPA生產速率為30 pg/g/h。發酵結束進pH值升高至超過 6 ♦ 0。參見圖1。 實例2 :比較實例：根據GB 1157,〇99之黴酚酸分批發酵 將發酵罐中生物體青黴菌屬（菌株號第CCM 8364號）的孢 子接種於包含以下的5公升培養基中：1〇〇 g/i葡萄糖、3 72 \30604.doc 23- 200904982 g/l硝酸銨、5·〇 g/i磷酸氫鉀、1 g/l硫酸鎂及2.0 ml/l微量元 素濃縮物。以712 r.p.m之攪拌速率及在％體積/體積/分鐘 之空氣流下維持培養物溫度為25 °C。93小時後，添加65 ml 80% (w/v)葡萄糖溶液。在117-215小時間量測黴酚酸、 MPA-IV及高黴酚酸之濃度。8天後MPA-IV與高黴酚酸之 含量上升至超過4%且隨後在215小時（9天）後分別降至約 40/〇及2。/〇。最終MPA之效價為1.3 g/l(參見圖2)。 實例3 :黴酚酸分批發酵 將生物體短密青黴菌ATCC 16024之10%營養培養物接種 於包含以下的4.5公升培養基：8% w/w馬鈐薯澱粉、12% w/w麥芽糖、1 · 5 % w/w甘胺酸、0.3 % w/w碟酸二氫鉀、 0-05% w/w 曱硫胺酸及 〇·ι〇/0 w/w 硫酸鎂。以 700-1000 r.p.m 之攪拌速率混合該培養物並以0,4-0,7體積/體積/分鐘之空 氣流通風且維持溫度於25±2。(：達12天。從第2天開始，藉 由HPLC量測黴酚酸濃度、MPA-IV與高黴酚酸含量。藉由 HPLC量測之MPA-IV及高黴酚酸含量分別自相對（於MPA 的）主峰面積。/。約1 〇%及3%降低且在第9天達到約i相對 %(指MPA含量）且隨後約保持相同含量直至發酵結束。終 產率（藉由HPLC量測效價）為1.8 g/l MPA且平均MPA生產 速率為6.4 pg/g/h(參見圖3)。 實例4:擻酚酸之補料分批發酵（控制碳源含量並在發酵結 束時停止補料） 以生產黴酚酸之青黴菌菌株（登錄號為CCM 8364之青黴 菌屬）的10%營養培養物接種包含以下之培養基：3% w/w 130604.doc •24· 200904982 葡萄糖、1 ·5% w/时胺酸、Q 5%咖玉米漿、Q.2% 士麟 酸二氫鉀、G.1% w/w甲硫胺酸及Qi% w/w硫酸錢。混合該 培養物並通風並將溫度維持在25±2t達1〇天。藉由補充碳 源將發酵中之葡萄糖含量維持在Q G2_q篇範圍内。亦 實施CSL(自第4天開始〇.〇5·〇 2%/天）與甘胺酸（自第4天開 始0.1-0.3%/天）之分批式補料。從第2天開始，量測黴酚酸 濃度、MPA-IV與高黴酚酸含量及ρΗ值（分別藉由HpLC& 電位電極）。藉由補料控制碳源含量之結果係，ΜρΑ_ιν與 尚黴酚酸含量持續降低直至發酵結束且藉由HPLC量測之 取終含量達到約〇.5面積％。終產率/效價為9 9 g/1 MpA且 平均MPA生產速率為39 pg/g/h。發酵結束時pH值並未顯著 升南（參見圖4)。 實例5:改進的黴酚酸補料分批發酵（控制碳源含量並在收 穫前2448 h時停止補料） 以生產黴酚酸之青黴菌菌株（登錄號為CCM 8364之青黴 菌屬）的10%營養培養物接種包含以下之培養基：3% w/w 葡萄糖、1.5〇/〇 W/W甘胺酸、〇.5% w/w玉米漿、〇 2% w/w磷 酸二氫鉀、0.1% w/w甲硫胺酸及〇.1〇/〇 w/w硫酸鎂。混合該 培養物並通風並將溫度維持在天。藉由補充碳 源將發酵中之葡萄糖含量維持在0·02_0.8。/〇範圍内。亦進行 CSL(自第4天開始〇·〇5-〇·2%/天）與甘胺酸（自第4天開始〇卜 0.3%/天）之分批式補料。在第1〇天停止補充營養素。從第 2天開始，量測黴酚酸濃度、MPA-IV與高黴酚酸含量及ρΗ 值（分別藉由HPLC及電位電極）。藉由補料並在發酵最後 130604.doc -25- 200904982 24-48小時間停止供料來控制碳源含量之結果係MPA-IV與 咼黴酚酸含量持續降低直至發酵結束且藉由HpLC量測之 最終含量小於約〇.15面積％。終產率為1〇 〇 g/1 MpA且平均 MPA生產速率為33 ug/g/h。發酵結束時pH值升高至超過 6.5。（參見圖5) 實例6:改進的黴酚酸補料分批發酵（控制碳源含量並在收 穫前24_48 h時停止補料） 將生物體紐密青黴菌ATCC 16024之10。/。營養培養物接種 於包含以下的4.5公升培養基：3% w/w葡萄糖、2 〇% w/w 甘胺酸、0.5% w/w玉米漿（CSL)、〇 2% w/w磷酸二氫鉀、 0.05% w/w甲硫胺酸及〇.1% w/w硫酸鎂。以7〇〇_i〇〇〇 r p m 之攪拌速率混合該培養物並以〇 4_〇 7體積/體積/分鐘之空 氣流通風且維持溫度於25±2t達12天。藉由補充葡萄糖將 發酵中之葡萄糖含量維持在0·02_0·8% w/w範圍内。在第1〇 天停止補充葡萄糖。亦進行CSL(自第4天至第9天，〇1_ 0.15-%/天）與甘胺酸（自第4天至第9天，〇1_〇 2%/天）之分 批式補料。從第2天開始，藉由HPLC量測黴酚酸濃度、 MPA-IV與高黴酚酸含量。在第1〇天停止補充營養素。藉 由補料並在發酵最後4 8小時間停止供料來控制碳源含量之 結果係Μ P A -1V與高黴酚酸含量先升高且隨後持續降低直 至發酵結束且藉由HPLC量測之最終含量小於約〇 3面積 。/〇。終產率為2.2 g/1 MPA且平均MpA生產速率為7·8 ug/g/h(參見圖 8)。 實例7 :結果概述 130604.doc -26- 200904982 =期間’藉由败量測徽紛酸發酵中 :=終產率。自實例“所得之該等結果展示於二 並中⑷、2及3中’以標準發酵程序（亦即分批發酵， 料八：：制碳源含量)實施黴酚酸發酵。在實例4，藉由補 二發酵實施黴紛酸發酵，其中控制碳源含量並在發酵 :: 補料。在實例5及6中，藉由改進補料分批發酵 :施㈣酸發酵，丨中控制碳源含量並在收穫 、

時停止補料。 J

表1 :自 實例1至6所得結果 之比較 實例No. 發酵 青黴菌CCA/幻料 分批 ~~ 一 分批 補料分批 遇料分批 中間體不純物含量 (120-230 h) [%| 最終不純物 含量[%] 1-13 0- 4.5 1- 4 1-4 0.5 終產率 7.5 2-4 0.5

短密青黴菌jrcCMOM 分批 改進補料分批 <0.15 1.3 ---- 9.9 ~~~ _ 10 1.4-3 0.1-1 0.9-1.2 0.2-0.3 12.2 表1之結果表明’當藉由補料分批發酵及改進補料分批 發酵（其中控制碳源含量（實例4_6))實施時，與使用標準分 批^酵程序（其中不控制碳源含量（實例1-3))相比較，黴紛 奴中不純物含量在兩菌株（青黴菌ccM 8364及短密青黴菌 ATCC16024)發酵過程中明顯降低。此外，當藉由補料分 130604.doc -27- 200904982 批發酵及改進補料分批發酵（實例4_6)實施黴酚酸發酵時， 與使用標準發酵程序（實例1 -3)相比較，黴酚酸之終產率與 生產速率得到提高。 實例8:根據國際專利申請公開案第w〇 20〇5/1〇5771號， 自黴酚睃生產黴酚酸嗎乙酯 在氮氣氣氛下，將黴酚酸（192 g，0.6莫耳）與4-(2-羥乙 基）-嗎琳（440 ml，6莫耳等效量）之混合物在氣化錫（丨丨）二 水合物（20_4 g，0.15莫耳等效量）存在下於i5〇-155°C授拌4 小時。反應完成後’使該反應混合物冷卻至室溫。將所得 黑色液體傾倒至乙酸異丁酯（4.0 1)中。以2%水性碳酸氫鈉 洛液（1 · 2 1 ’隨後2 X 0.4 1)萃取該溶液。第一次添加碳酸氫 納溶液後，以活性炭（40 g)處理所形成之兩相系統並過濾 (慮除礼液）。以水（1 1)卒取該溶液。相分離後，以水（1 1) 洗滌有機相並在真空中於40-50。(：下蒸發至乾。向固相物 中添加丙酮（400 ml)及異丙醇（3.8 1)並將混合物加熱至40-45 C (物質溶解）。在6小時内將該溶液冷卻至_5°c並在該溫 度下攪拌達10-12小時。過濾後，以2:19之丙酮/異丙醇混 合物（420 ml)洗滌晶體。在真空中於60。(：下乾燥該粗製化 合物。產率為169-195 g (65-75%)。HPLC不純物特徵曲 線：MPA=0.1%。分析：99.85%。 實例9:根據公開美國專利申請案第2〇〇5〇250952號濃黴紛 酸之製備： 將發酵液（220 kg)調節至大約pH 8.0。藉由微量過渡塑 料膜（例如KOCH生產之MFK-617及HFM-180)過濾該發酵 130604.doc •28· 200904982 液。在過濾過程中持續添加水以稀釋。將經過濾培養基調 節至大約pH 4.0 ,並將晶體懸浮液濃縮至大約7〇公升。隨 後將濃縮酸性懸浮液之pH值調節至7 5_〗丨〇之鹼性pH。 如以下實例所示，使用該驗性懸浮液純化黴酚酸。 實例10 .根據公開美國專利申請案第20050250952號黴酚 酸之純化： 以800 ml濃氫氧化銨溶液將14〇 kg濃黴酚酸懸浮液（自 620 kg發酵液製備）之#調節為83_85。以⑼公升乙酸乙 西曰、、’屯化邊鹼性溶液。將乙酸乙酯混入該鹼性溶液中，攪拌 30分鐘並分離各相。 向所得（147 kg)水相中添加8〇公升乙酸乙酯。以硫酸將 PH調節至5.8，攪拌3〇分鐘並分離各相。 向所知·〇50 kg)水相中添加4〇公升乙酸乙酯。將pH調節 至5·9 ’授拌30分鐘並分離各相。 〇併兩次酸性萃取之乙酸乙酯相並在減壓下以最高7〇。〇 濃縮至農度大約為2〇〇 g/卜將濃乙酸乙酯溶液加熱至6〇_ 65 C，以大約3 c /小時之冷卻速率冷卻至_丨〇〇c，並在_i 〇 C下釔晶18小時。過濾晶體並以冷乙酸乙酯覆蓋洗滌。在 減壓下以最高7CTC乾燥該晶體。晶體質量：125〇 g。分 析：99.0%。 以活性厌處理後自乙酸乙酯重結晶該晶體。 實例U:高黴酚酸之分離》 藉由官柱層析在矽膠上使用以甲醇（〇_5% v/v)逐步極化 之一氣甲烷純化來自黴酚酸（1〇 g)製法之濃縮物。藉由 130604.doc -29· 200904982 TLC在石夕膠（苯：乙酸，9:1 v/v)上監測溶離份。收集含有高 黴酚酸之溶離份（1.5%曱醇）並蒗發s鈐 …赞至乾（3 g)。最後，藉由 製備性RP-HPLC(c·i8管柱及以76%含水甲醇（v/v)9 等梯度溶離）純化高黴盼酸。以36.6_39 5分鐘溶離純化之 高徽盼酸。自甲醇/水中結晶獲得白色晶狀高黴紛酸(參見 圖9及10)。 實例12 :黴酚酸之純化

向14 m3收穫的發酵液中添加相同體積之飲用水，隨後 添加168公升（1.2%)濃氨溶液。添加起始發酵液之工質量％ 之助濾劑（珍珠岩）並添加85%濃磷酸溶液（大約丨〇〇公升）將 pH調至8.0-8.5之間。經處理之培養基於不攪拌下保持於 環境溫度下達至少6小時。在飲用水覆蓋洗滌過程中於真 空鼓式過濾器中過濾。收集42 m3濾出液。發酵液過濾後 之產率為約90%。 藉由添加20%硫酸溶液（大約3〇〇公升）將經過濾發酵液之 PH值調節至4_〇_4.5。至少3小時後，過濾沈澱的粗製晶體 並在微量濾膜（KOCH生產之MFK-617)上濃縮。將已調節 pH值的42 m3過濾發酵液濃縮至1/4〇體積（大約1 2 m )。過濾時間為大約60小時。以大約2 m3酸性水稀釋兮 濃溶液’並將溶液再次濃縮至^04.2 m3。移除濃縮溶液 後，以0.3-0.5 m3酸性飲用水洗滌設備。沈澱及濃縮之產 率為大約80%。 δ货孩m滬湘物興^扣山^ 酸性洗滌水，添加 〇.5-0.6倍體積之乙酸乙酯（大約〇 8 m3)並以濃氨溶液調節 130604.doc -30· 200904982 pH值至9.0-9.2之間。蓋& 八妒 卒取30刀鐘，並將pH值調節至9.0- ΐ〗之間 。隨後 分離各相 。 再-人向水相中添加〇 5_〇 6倍體積之乙酸乙酯（大約〇 8 m )(根據口併的酸性濃縮物體積計算）並以濃氨溶液μ% 硫酸溶液將pH值調節至介於9.〇·92之間。實施萃取達別分 鐘並將pH值調節至介於9()·92之間。隨後分離各相。 向水相中添加0.5-0.6倍體積之乙酸乙酯（根據合併的酸 、性濃縮物體積計算）並以2〇%硫酸溶液將pH值調節至5 8_ 6.1。實施萃取達3〇分鐘並將阳值調節至介於5 8_6丨之 間。隨後分離各相。 向水相中添加0.25-0.3倍體積之乙酸乙酯（根據合併的酸 I1生/辰縮物體積汁算）並以濃氨溶液將pH值調節至6 3-6.5。 實施萃取達30分鐘並將pH值調節至介於6.3_6.5之間。隨後 分離各相。 合併第三及第四乙酸乙酯相並在減壓下以最高7〇£>c蒸發 至大約200 g/Ι(基於合併相之蒸發殘留物）。蒸發之最終體 積為大約I 50公升。萃取及蒸發之產率為大約9〇0/〇。 將乙酸乙酯濃縮物（大約15 0公升）冷卻至-1 〇 °c至_丨7。匚 (冷卻速度為大約3。(： /小時），並於該溫度下結晶至少2小 時。以45公升冷卻乙酸乙酯洗滌晶體並在減壓下以最高7〇 °C乾燥。晶體質量為大約25 kg。結晶產率為大約87%。 【圖式簡單說明】 圖1展示在青黴菌屬菌株（登錄號CCM 8364)之分批發酵 過程中MPA產量、MPA-IV與高黴酚酸含量及PH隨時間之 130604.doc -31 - 200904982 變化過程。 圖2展示根據GB 1,157,099，藉由青黴菌屬菌株（登錄號 CCM 8364)之黴酚酸分批發酵。 圖3展示藉由短密青黴菌之黴酚酸分批發酵。 圖4展示在青黴菌屬菌株（登錄號CCM 8364)之補料分批 發酵過程中MPA產量、MPA-IV與高黴酚酸含量及pH隨時 間之變化過程。 圖5展示在青黴菌屬菌株（登錄號CCM 8364)之改進補料 分批發酵過程中MPA產量、MPA-IV與高黴酚酸含量及pH 隨時間之變化過程。 圖6展示青黴菌屬菌株（登錄號CCM 8364)之改進補料分 批發酵過程中葡萄糖含量隨時間的變化表。 圖7展示青黴菌屬菌株（登錄號CCM 8364)之改進補料分 批發酵過程中葡萄糖與氨含量隨時間之變化圖。 圖8展示短密青黴菌之改進補料分批發酵。 圖9展示高黴酚酸之1H NMR譜。 ·> 圖1 0展示高黴酚酸之13C NMR譜。 130604.doc •32-

Claims (1)

1. 200904982 十、申請專利範圍： 1. 一種在黴酚酸（MPA)發酵過程中降低不純物形成之方 法，其包括：控制MPA發酵過程中之碳源含量，其中將 該碳源之量保持為約〇 〇2%_約〇 8% w/w。 2·如明求項1之方法，纟中將該碳源之量保持為約O N%·約 0.5 % w/w 〇

   3.如請求項1之方法， 群：下式之MPA-IV 其中該不純物係選自 由以下組成之

   下式之高MPA :

   及其組合。 碳源含量。 5 ·如請求項 6. 如請求 中该碳源為碳水化合物。 7. 如請求：之方法，其中該碳源為澱粉或糖蜜。 尺項5之方法，其中哕 糖或甘i i 、 μ厌振為葡萄糖、蔗糖、麥 由中之至少一種。 夺 8 · 如請灰ts。 項7之方法，苴中兮 八亥娀源為葡萄糖。 130604.doc 200904982 9. 10. 11. • 12. Ο 13. 14. 15. U 16. 17. 18. 19. 20. 用求項3之方法，其中由HPLC量測所得發酵液中ΜρΑ_ IV 3 s:為小於約〇_5面積％。 月求項3之方法，其中由HPLC量測所得發酵液中高 MPA含量為小於約0,5面積％。 门 如凊求項1之方法，其進一步包括在收穫之前停止控制 該碳源。 $ 如哨求項11之方法，其中藉由在生產階段之最後2〇_96小 時期間停止補充該碳源來停止控制該碳源。 如清求項1之方法，其所包括的發酵培養基含有佔該發 酵培養基約1%_約5% w/w的起始碳源含量（生長期）。 如請求項1之方法’其包括一種發酵液，其中向該發酵 液中添加礦物鹽、氮源、微生物生長因子、磷源、或緩 衝劑之至少一種。 5 如請求項14之方法，其中該礦物鹽為硫酸鎂、二氯化 錳、硫酸亞鐵、氯化鋅、硫酸銅（11)、硫醆銨、磷酸二 氫鉀、氣化鈉或碳酸鈣之至少一種。 如請求項Μ之方法，其中該氮源為可同化的有機或益機 氮源。 ’ 如請求項14之方法，其中該氮源為硝酸鹽、尿素、銨 鹽、玉米漿或胺基酸。 ’其中該微生物生長因子為酵母提取 物、或維他命之至少一種。 如請求項1 5之方法，其中該磷源為磷酸二氫钟。 如請求項1之方法，其中黴酚酸之發酵係藉由選自以下 130604.doc 200904982 組成之群的可產生黴酚酸之微生物：短密青黴菌（p brevicompactum)、尸· scabrum、P. 、婁格法爾特 氏青徽菌（尸_ 、尸· pair/s-we/及鮮綠青徽菌（p Wrz_山或其衍生菌。 21. 如請求項20之方法’其中可產生黴酚酸之微生物為青黴 菌屬菌株（登錄號CCM 8364)或其衍生菌。 22. 如請求項！之方法’其進一步包括自該發酵液分離 MPA。 23 .如請求項！之方法’其進一步包括分批補充該氮源。 24·如請求項23之方法’其中該氮源為添加至該發酵液中之 甘胺酸及/或玉米漿。 25. —種製備具有低含量不純物MMF之方法，其包括根據請 求項1之方法製備MPA並將其轉化為MMF。 26. 一種具有下式之分離之E_8_(4_羥基_6_曱氧基_7_曱基_3_ 氧代-1,3-二氫-異笨并呋喃_5_基）_2,6_二曱基-辛-6-烯酸 (’’高 MPA”）：

   27·如請求項26之分離之高MPA，其中其為固體。 28.如請求項27之分離之高MpA，其中其為結晶。 29·如請求項26之分離之高MpA，其特徵在於選自以下所組 成群中之數據：1Η NMR (400 MHz, CDC13) δ (ppm)： 130604.doc 200904982 !·15 ^ 1.35 ' 1.42 χ 1.63 , 1>77 ^ 1.98 ' 2.15 ^ 2.43 > 3.39、3·77、5.19、5 2〇、及 7 68 ; % nmr (ι〇〇 μ出、 CDC13) δ (PPm) : U.5、16 〇、16 8、22 6、25 2、33 〇、 39.1、39.4、61.0、7〇·〇、106.4、116.7、122.2、122.5、 135.5、143.9、153.7、163.7、172.9、及 182.3，及其組 合。 3〇.如請求項26之分離之高ΜΡΑ，其特徵在於選自以下所組 成群中之數據：如圖6所描示之iH NMR光譜，如圖7所 示之I3C NMR光譜及其組合。 31.如請求項26之分離之高MPA，其中其河？八包量低於約5 重量％的高MPA組合物。 32·如請求項31之分離之高MpA，其中該組合物含有 約5重$ % -約0.0 5重量％之MP A。 33. 一種測定MPA樣品中之高MPA之存在的方法，其包括以 尚MPA作為參考標記，由MPA樣品進行HpLC4TLC。 34. L 如μ求項33之方法，其包括（a)藉由HpLC或τιχ，對應 於參考標記樣品中之高MPA，量測相對滯留時間或因 子，（b)藉由HPLC或TLC，對應於包含高MpA& MpA的 樣品中之高MPA，測定相對滯留時間；及（c)比較步驟（a) 中所畺測之泫向MPA之相對滯留時間或因子與步驟（b)之 RRT或RRF來鑑別該樣品中之高mp a。 35. —種測定包含高MPA及MPA之MpA樣品中高MpA含量的 方法其包括採用尚MPA作為參考標準物進行HpLC之 方法來達成。 130604.doc 200904982 θ农項35之方法’其包括(a)藉由HPLC，對應於包含 已知量高跑的參考標準物t之高MPA，量測波啥下面 一（b)藉由HPLC ’ f子應於包含高MpA及MpA之樣品中 之问MPA，量測波峰下面積；及⑷藉由比較該步驟⑷之 面積與該步驟⑻之面積，決定該樣品中高MpA含量。 3 7. -種製備黴盼酸之方法，其包括··製備含有可產生黴盼 &之微生物的發酵液；發酵黴賴，同時向該發酵液補 加營養素；在該黴酚酸發酵階段中將該發酵液中山 含量控制於約0.02%-約〇.8% w/w之量. 之奴源 並回收該黴紛酸。 發酵液收穫 3 8 · —種 具有以下結構的經分離化合物： V C

   cr 130604.doc