JP3068706B2 - アルド−ス還元酵素阻害物質 - Google Patents
アルド−ス還元酵素阻害物質Info
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、式(I):
【化3】 [式中、R1は (CH2)2COOH 、R2はフェニルまたはp−ヒ
ドロキシフェニル、またはR1とR2が一緒になって、
ドロキシフェニル、またはR1とR2が一緒になって、
【化4】 を表わす。]で示されるアルド−ス還元酵素阻害物質、
該物質を産生する微生物、および該物質の製造法に関す
る。
該物質を産生する微生物、および該物質の製造法に関す
る。
【0002】
【従来の技術】従来より糖尿病の発症が増加してきてお
り、同時にその合併症も極めて大きな問題となってい
る。 糖尿病の合併症の原因としては、ポリオール(ソ
ルビトール)の蓄積、フリーラジカルによる過酸化、蛋
白のリジン残基のグリコシル化などが考えられる。ポリ
オール産生に関わるアルドース還元酵素(以下ARと略
す)の阻害剤は糖尿病に起因する各種の糖尿病性合併
症、例えば、糖尿病性神経障害、糖尿病性白内障、糖尿
病性角膜症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症などの治療
薬となりうると考えられ、各社により開発研究が行なわ
れている。現在知られているAR阻害剤としては例え
ば、Simard-Duquesne, N らのトルレスタット[下記化
合物(II)](Tolrestat;Metabolism 34, 885-892, 1
985)や、WF-3681[下記化合物(III)](特公平3-524
58)などが挙げられるが、本発明化合物と類似の構造を
持つAR阻害物質は全く知られていない。
り、同時にその合併症も極めて大きな問題となってい
る。 糖尿病の合併症の原因としては、ポリオール(ソ
ルビトール)の蓄積、フリーラジカルによる過酸化、蛋
白のリジン残基のグリコシル化などが考えられる。ポリ
オール産生に関わるアルドース還元酵素(以下ARと略
す)の阻害剤は糖尿病に起因する各種の糖尿病性合併
症、例えば、糖尿病性神経障害、糖尿病性白内障、糖尿
病性角膜症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症などの治療
薬となりうると考えられ、各社により開発研究が行なわ
れている。現在知られているAR阻害剤としては例え
ば、Simard-Duquesne, N らのトルレスタット[下記化
合物(II)](Tolrestat;Metabolism 34, 885-892, 1
985)や、WF-3681[下記化合物(III)](特公平3-524
58)などが挙げられるが、本発明化合物と類似の構造を
持つAR阻害物質は全く知られていない。
【化5】
【化6】
【0003】
【発明が解決しようとする課題】糖尿病性合併症の多発
する血管、抹梢神経、レンズ、網膜などに、ポリオ−ル
の代謝経路の律速酵素であるARが存在していることが
明らかにされており、糖尿病におけるその重要性が認識
されだした。糖尿病のごとき高血糖状態では解糖系で代
謝される以上のグルコ−スが細胞内に存在し、ARの基
質となるためポリオ−ル代謝経路におけるグルコ−スの
代謝が容易に促進させられる。それに伴い、ソルビト−
ルの異常蓄積をより一層助長することになる。このソル
ビト−ルは比較的安定な物質で、いったん産生されると
細胞外への移行はほとんど認められず、この産生と排泄
の平衡破綻がこの糖アルコ−ルの細胞内蓄積を招来す
る。その結果、細胞内浸透圧上昇を招き、細胞内への水
分貯留を来し、細胞機能を正常に維持することが不可能
になり、細胞障害を示すことになる。このAR活性を阻
害すれば細胞内ソルビト−ルの異常蓄積は回避され、細
胞機能を正常に維持しうる可能性は大である。そこで、
本発明者らは、AR阻害作用を持った化合物の研究を行
なった。
する血管、抹梢神経、レンズ、網膜などに、ポリオ−ル
の代謝経路の律速酵素であるARが存在していることが
明らかにされており、糖尿病におけるその重要性が認識
されだした。糖尿病のごとき高血糖状態では解糖系で代
謝される以上のグルコ−スが細胞内に存在し、ARの基
質となるためポリオ−ル代謝経路におけるグルコ−スの
代謝が容易に促進させられる。それに伴い、ソルビト−
ルの異常蓄積をより一層助長することになる。このソル
ビト−ルは比較的安定な物質で、いったん産生されると
細胞外への移行はほとんど認められず、この産生と排泄
の平衡破綻がこの糖アルコ−ルの細胞内蓄積を招来す
る。その結果、細胞内浸透圧上昇を招き、細胞内への水
分貯留を来し、細胞機能を正常に維持することが不可能
になり、細胞障害を示すことになる。このAR活性を阻
害すれば細胞内ソルビト−ルの異常蓄積は回避され、細
胞機能を正常に維持しうる可能性は大である。そこで、
本発明者らは、AR阻害作用を持った化合物の研究を行
なった。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、以上の事
柄を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、不完全菌 Chaetomel
la circinoseta RF-3192の培養液中にAR阻害活性を
有する物質を見い出し、発酵、抽出、分離精製を行な
い、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、
式(I):
柄を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、不完全菌 Chaetomel
la circinoseta RF-3192の培養液中にAR阻害活性を
有する物質を見い出し、発酵、抽出、分離精製を行な
い、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、
式(I):
【化7】 [式中、R1は (CH2)2COOH 、R2はフェニルまたはp−ヒ
ドロキシフェニル、またはR1とR2が一緒になって、
ドロキシフェニル、またはR1とR2が一緒になって、
【化8】 を表わす。]で示される化合物またはその塩に関するも
のである。式(I)で示されるこの発明化合物は、下記
式で示される(Ia)〜(Ic)の互変異性型をとり得
るが、式(I)の型の化合物がより安定的に存在する。
しかし他の互変異性型化合物の存在を否定するものでは
ない。
のである。式(I)で示されるこの発明化合物は、下記
式で示される(Ia)〜(Ic)の互変異性型をとり得
るが、式(I)の型の化合物がより安定的に存在する。
しかし他の互変異性型化合物の存在を否定するものでは
ない。
【化9】
【0005】また本発明は、ケトメラ シルシノセタ
(Chaetomella circinoseta)種に属し本発明化合物を
産生する微生物を提供する。本発明のケトメラ シルシ
ノセタ(Chaetomella circinoseta)種に属するRF−
3192株は以下のような性状を有していた。RF−3192株の菌学的諸性状 本菌株をコ−ンミ−ル寒天上で培養するとコロニ−は平
坦で薄く、半透明から白色を示し、暗褐色から黒褐色の
分生子果(pycnidia)を寒天表面に形成する。分生子果
は楕円形で、一本の縦溝(raphe)を有しており、長さ
は320〜480μmである。剛毛(setae)には隔壁
があり、色は茶色で分枝はせず、頂端がコイル状に巻い
ていて大きさは300〜560×10〜15μmのもの
と、棍棒状で大きさは60〜100×5〜10μmの2
種類の剛毛が観察される。前者は主として分生子果の両
極部で、また後者は中央部で観察される。分生子柄は透
明、繊維状で不規則に分枝し、隔壁を有し、頂側性の分
生胞子を着生する。分生胞子は透明、単胞子、ソ−セ−
ジ型であり、大きさは7.5〜10.5×1.5〜2.0μ
mである。
(Chaetomella circinoseta)種に属し本発明化合物を
産生する微生物を提供する。本発明のケトメラ シルシ
ノセタ(Chaetomella circinoseta)種に属するRF−
3192株は以下のような性状を有していた。RF−3192株の菌学的諸性状 本菌株をコ−ンミ−ル寒天上で培養するとコロニ−は平
坦で薄く、半透明から白色を示し、暗褐色から黒褐色の
分生子果(pycnidia)を寒天表面に形成する。分生子果
は楕円形で、一本の縦溝(raphe)を有しており、長さ
は320〜480μmである。剛毛(setae)には隔壁
があり、色は茶色で分枝はせず、頂端がコイル状に巻い
ていて大きさは300〜560×10〜15μmのもの
と、棍棒状で大きさは60〜100×5〜10μmの2
種類の剛毛が観察される。前者は主として分生子果の両
極部で、また後者は中央部で観察される。分生子柄は透
明、繊維状で不規則に分枝し、隔壁を有し、頂側性の分
生胞子を着生する。分生胞子は透明、単胞子、ソ−セ−
ジ型であり、大きさは7.5〜10.5×1.5〜2.0μ
mである。
【0006】上述した諸性状をBrian C. Sutton著、 ”T
he Coelomycetes” (B. C. Sutton, The Coelomycete
s, Commonwealth Mycological Institute, KEW, Surre
y, England (1980))のケトメラ(Chaetomella)属につ
いての記載と比較した結果、RF−3192株はケトメ
ラ シルシノセタ スト−ク(Chaetomella circinoset
a Stork)に属すると結論し、本菌株をChaetomella cir
cinoseta RF-3192と命名した。本菌株は、茨城県つくば
市東1−1−3(郵便番号305)にある工業技術院微
生物工業研究所に、平成4年(1992年)2月3日よ
りブダペスト条約に基づき「Chaetomella circinoseta
RF-3192」微工研条寄第3724号(FER M BP−
3724)として寄託されている。
he Coelomycetes” (B. C. Sutton, The Coelomycete
s, Commonwealth Mycological Institute, KEW, Surre
y, England (1980))のケトメラ(Chaetomella)属につ
いての記載と比較した結果、RF−3192株はケトメ
ラ シルシノセタ スト−ク(Chaetomella circinoset
a Stork)に属すると結論し、本菌株をChaetomella cir
cinoseta RF-3192と命名した。本菌株は、茨城県つくば
市東1−1−3(郵便番号305)にある工業技術院微
生物工業研究所に、平成4年(1992年)2月3日よ
りブダペスト条約に基づき「Chaetomella circinoseta
RF-3192」微工研条寄第3724号(FER M BP−
3724)として寄託されている。
【0007】さらに本発明は、ケトメラ(Chaetomell
a)属に属する本発明微生物を培養し、該培養培地から
本発明化合物を採取することを特徴とする本発明化合物
の製造法を提供する。以下に、本発明化合物の一般的製
造法を記載する。ケトメラ(Chaetomella)属に属する
菌株、例えば上記のChaetomella circinoseta RF-3192
を、通常の発酵生産に用いる培地組成、培地条件で培養
する。培地は原則として、炭素源、窒素源、無機塩など
を含む。必要に応じて、ビタミン類、先駆物質などを加
えてもよい。炭素源としては、例えば、グルコ−ス、ポ
テトスタ−チ、デキストリン、グリセリン、糖類、有機
酸などが単独でまたは混合物として用いられる。窒素源
としては、例えば大豆粉、コ−ンスチ−プリカ−、肉エ
キス、酵母エキス、綿実粉、ペプトン、小麦胚芽、硫酸
アンモニウム、硝酸アンモニウムなどが単独または、混
合物として用いられる。無機塩としては、例えば、炭酸
カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグ
ネシウム、硫酸銅、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化コバ
ルト、各種リン酸塩などが挙げられ、必要に応じて培地
に添加する。培養温度は約22〜37℃で行なうとよ
く、特に26〜30℃が好ましい。培養時間は発酵の規
模に大きく左右されるが、約4日〜6日が大量生産を行
なう場合に要する培養時間である。培養中に激しい発泡
が起こる場合には、培養前または培養中に例えば、植物
油、ラ−ド、ポリプロピレングリコ−ルなどの消泡剤を
適宜添加するとよい。培養終了後、培養物から本発明化
合物を分離採取するには、通常の発酵生産物を分離採取
する方法を適宜用いる。例えば濾過、遠心分離、各種イ
オン交換樹脂やその他の活性吸着剤による吸脱着やクロ
マトグラフィ−、各種有機溶媒による抽出などを適当に
組み合わせるとよい。
a)属に属する本発明微生物を培養し、該培養培地から
本発明化合物を採取することを特徴とする本発明化合物
の製造法を提供する。以下に、本発明化合物の一般的製
造法を記載する。ケトメラ(Chaetomella)属に属する
菌株、例えば上記のChaetomella circinoseta RF-3192
を、通常の発酵生産に用いる培地組成、培地条件で培養
する。培地は原則として、炭素源、窒素源、無機塩など
を含む。必要に応じて、ビタミン類、先駆物質などを加
えてもよい。炭素源としては、例えば、グルコ−ス、ポ
テトスタ−チ、デキストリン、グリセリン、糖類、有機
酸などが単独でまたは混合物として用いられる。窒素源
としては、例えば大豆粉、コ−ンスチ−プリカ−、肉エ
キス、酵母エキス、綿実粉、ペプトン、小麦胚芽、硫酸
アンモニウム、硝酸アンモニウムなどが単独または、混
合物として用いられる。無機塩としては、例えば、炭酸
カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグ
ネシウム、硫酸銅、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化コバ
ルト、各種リン酸塩などが挙げられ、必要に応じて培地
に添加する。培養温度は約22〜37℃で行なうとよ
く、特に26〜30℃が好ましい。培養時間は発酵の規
模に大きく左右されるが、約4日〜6日が大量生産を行
なう場合に要する培養時間である。培養中に激しい発泡
が起こる場合には、培養前または培養中に例えば、植物
油、ラ−ド、ポリプロピレングリコ−ルなどの消泡剤を
適宜添加するとよい。培養終了後、培養物から本発明化
合物を分離採取するには、通常の発酵生産物を分離採取
する方法を適宜用いる。例えば濾過、遠心分離、各種イ
オン交換樹脂やその他の活性吸着剤による吸脱着やクロ
マトグラフィ−、各種有機溶媒による抽出などを適当に
組み合わせるとよい。
【0008】以下に上記製造法で得られた化合物RF−
3192B,C,Aの化学的性状および構造式を示す。RF−3192B 1)性状:酸性、オレンジ色の結晶 2)融点:>230℃(分解) 3)IR,λmax KBr cm-1:3304, 1701, 1646, 1608, 157
4, 1378, 1248, 1219, 1204, 1165, 860, 851 4)UV,νmax (E1% 1cm) nm: in MeOH:218sh(840), 265(350), 316(560), 410(170) in 0.01N HCl-90% MeOH:218(690), 265(330), 317(52
0), 410(179) in 0.01N NaOH-90% MeOH:240(580), 292(500), 318(44
0), 230sh(150), 460(120) 5)元素分析:C21H16O7+0.2 CH3COOC2H5として 理論値;C:65.79, H:4.46 実測値;C:65.41, H:4.45 6)SIMS :m/z 381 [M+H]+ HR−SIMS:C21H16O7+H として 計算値;381.0974 実測値;m/z 381.0976 7)1H−NMR (d6-DMSO) ppm:1.80〜2.15 (2H, m),
2.24〜2.35 (2H, m), 5.790 (1H, s), 6.255 (2H, s),
7.52〜7.62 (5H, m), 8.186 (1H, OH, br), 10.393 (1
H, OH, br), 12.177 (1H, OH, brs), 13.808 (1H, OH,
s) 8)13C−NMR (d6-DMSO) ppm:27.75 t, 31.64 t, 9
7.67 d, 103.89 d, 105.19 d, 107.35 s, 115.58 s, 12
3.94 s, 127.60 dx2, 129.35 dx2, 129.86 d, 130.54
s, 131.67 s, 152.56 s, 162.08 s, 163.62 s, 170.82
s, 173.45 s, 190.36 s 9)構造式
3192B,C,Aの化学的性状および構造式を示す。RF−3192B 1)性状:酸性、オレンジ色の結晶 2)融点:>230℃(分解) 3)IR,λmax KBr cm-1:3304, 1701, 1646, 1608, 157
4, 1378, 1248, 1219, 1204, 1165, 860, 851 4)UV,νmax (E1% 1cm) nm: in MeOH:218sh(840), 265(350), 316(560), 410(170) in 0.01N HCl-90% MeOH:218(690), 265(330), 317(52
0), 410(179) in 0.01N NaOH-90% MeOH:240(580), 292(500), 318(44
0), 230sh(150), 460(120) 5)元素分析:C21H16O7+0.2 CH3COOC2H5として 理論値;C:65.79, H:4.46 実測値;C:65.41, H:4.45 6)SIMS :m/z 381 [M+H]+ HR−SIMS:C21H16O7+H として 計算値;381.0974 実測値;m/z 381.0976 7)1H−NMR (d6-DMSO) ppm:1.80〜2.15 (2H, m),
2.24〜2.35 (2H, m), 5.790 (1H, s), 6.255 (2H, s),
7.52〜7.62 (5H, m), 8.186 (1H, OH, br), 10.393 (1
H, OH, br), 12.177 (1H, OH, brs), 13.808 (1H, OH,
s) 8)13C−NMR (d6-DMSO) ppm:27.75 t, 31.64 t, 9
7.67 d, 103.89 d, 105.19 d, 107.35 s, 115.58 s, 12
3.94 s, 127.60 dx2, 129.35 dx2, 129.86 d, 130.54
s, 131.67 s, 152.56 s, 162.08 s, 163.62 s, 170.82
s, 173.45 s, 190.36 s 9)構造式
【化10】 また、RF−3192Bは下記式に示す(IBa)〜
(IBc)の互変異性体の構造をとり得るが、式(I
B)の型の化合物が安定的に存在する。
(IBc)の互変異性体の構造をとり得るが、式(I
B)の型の化合物が安定的に存在する。
【化11】
【0009】RF−3192C 1)性状:酸性,ラディッシュオレンジ色の結晶 2)融点:>150℃(分解) 3)IR,λmax KBr cm-1:3394, 1653, 1608, 1470, 141
6, 1383, 1359, 1319, 1280, 1233, 1215, 1169, 1123,
1100, 1044, 1018, 985, 842, 766 4)UV,νmax (E1% 1cm) nm: in MeOH;220 sh(820), 273(500), 347(480), 440 sh(1
30) in 0.01N HCl-90% MeOH;218(700), 273(460), 347(44
0), 440(130) in 0.01N NaOH-90% MeOH (非可逆シフト);238 sh(66
0), 265 sh(500), 297 sh(440), 318(460), 358 sh(34
0), 395 sh(190), 490 sh(50) 5)元素分析:C20H12O8+CH3OHとして 理論値;C:61.17, H:3.91 実測値;C:61.73, H:3.65 6)SIMS:m/z 381 [M+H]+ HR−SIMS:C20H12O8+H として 計算値;381.0610 実測値;m/z 381.0612 7)1H−NMR (d6-DMSO) ppm:3.231 (1H, d, J=16.
8), 3.408 (1H, d, J=16.8), 5.839(1H, s), 6.364(1H,
d, J=2.2), 6.459 (1H, d, J=2.2), 7.099 (1H, J=2.
0), 7.506(1H, d, J=2.0), 10.712 (1H, OH, s), 11.33
9 (1H, OH, s), 12.568(1H, OH, s), 13.857(1H, OH,
s) 8)13C−NMR (d6-DMSO) ppm:49.60 t, 99.29 d, 10
5.10 d, 105.38 d, 107.90 s, 109.44 d, 109.50 s, 11
2.61 s, 122.05 s, 130.82 s, 135.10 s, 146.57s, 16
2.88 s, 164.36 s, 165.20 s, 171.99 s, 190.26 s, 19
9.09 s 9)構造式
6, 1383, 1359, 1319, 1280, 1233, 1215, 1169, 1123,
1100, 1044, 1018, 985, 842, 766 4)UV,νmax (E1% 1cm) nm: in MeOH;220 sh(820), 273(500), 347(480), 440 sh(1
30) in 0.01N HCl-90% MeOH;218(700), 273(460), 347(44
0), 440(130) in 0.01N NaOH-90% MeOH (非可逆シフト);238 sh(66
0), 265 sh(500), 297 sh(440), 318(460), 358 sh(34
0), 395 sh(190), 490 sh(50) 5)元素分析:C20H12O8+CH3OHとして 理論値;C:61.17, H:3.91 実測値;C:61.73, H:3.65 6)SIMS:m/z 381 [M+H]+ HR−SIMS:C20H12O8+H として 計算値;381.0610 実測値;m/z 381.0612 7)1H−NMR (d6-DMSO) ppm:3.231 (1H, d, J=16.
8), 3.408 (1H, d, J=16.8), 5.839(1H, s), 6.364(1H,
d, J=2.2), 6.459 (1H, d, J=2.2), 7.099 (1H, J=2.
0), 7.506(1H, d, J=2.0), 10.712 (1H, OH, s), 11.33
9 (1H, OH, s), 12.568(1H, OH, s), 13.857(1H, OH,
s) 8)13C−NMR (d6-DMSO) ppm:49.60 t, 99.29 d, 10
5.10 d, 105.38 d, 107.90 s, 109.44 d, 109.50 s, 11
2.61 s, 122.05 s, 130.82 s, 135.10 s, 146.57s, 16
2.88 s, 164.36 s, 165.20 s, 171.99 s, 190.26 s, 19
9.09 s 9)構造式
【化12】 また、RF−3192Cは下記に示す(ICa)〜(I
Cd)および(IC’)の互変異性体の構造をとり得る
が、(IC)およびその対掌体である(IC’ )の型
の化合物が安定的に存在する。
Cd)および(IC’)の互変異性体の構造をとり得る
が、(IC)およびその対掌体である(IC’ )の型
の化合物が安定的に存在する。
【化13】
【0010】RF−3192A 1)SIMS:m/z 397 [M+1]+ HR−SIMS:C21H16O8+H として 計算値;397.0923 実測値;m/z 397.0928 2)13C−NMR (d6-Acetone) ppm:28.28 t, 33.01 t,
98.65 d, 104.85 d, 105.55 d, 109.29 s, 115.92 s,
123.38 s, 130.75 dx2, 117.06 dx2, 165.41 s,124.58
s, 132.17 s, 152.92 s, 160.03 s, 162.72 s, 172.12
s, 173.77 s, 191.67 s 3)構造式
98.65 d, 104.85 d, 105.55 d, 109.29 s, 115.92 s,
123.38 s, 130.75 dx2, 117.06 dx2, 165.41 s,124.58
s, 132.17 s, 152.92 s, 160.03 s, 162.72 s, 172.12
s, 173.77 s, 191.67 s 3)構造式
【化14】 また、RF−3192Aは下記に示す(IAa)〜(I
Ac)の互変異性体の構造をとり得るが、(IA)の型
の化合物が安定的に存在する。
Ac)の互変異性体の構造をとり得るが、(IA)の型
の化合物が安定的に存在する。
【化15】
【0011】本発明は、さらに、本発明化合物を含有す
るアルド−ス還元酵素阻害剤を提供する。本発明のアル
ド−ス還元酵素阻害剤を投与するときは、性別、年齢、
症状により変化するが、1日に1〜1000mgを投与
する。投与経路は、経口、非経口のどちらでも可能であ
るが、経口投与で用いるのが好ましい。さらに、経口投
与の際に用いられる剤形には、エリキシル剤、カプセル
剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、散剤、錠剤、および
シロップ剤などが挙げられるが、好ましくは錠剤として
用いるのがよい。ここで用いられる錠剤は、通常の錠剤
の製法により製することができる。すなわち、本発明化
合物をそのまま、または賦形剤、結合剤、もしくはその
他の適当な添加剤を加えて均等に混和したものを、直接
圧縮成型するか、顆粒状とした後、滑沢剤などを加え、
圧縮成型する。この顆粒を製するには、上記の混和物を
圧縮した後、顆粒状に粉砕するか、または適当な湿潤剤
を加えて粒状とし、乾燥する。また、必要に応じて着色
剤、矯味剤などを加えてもよく、さらに白糖または適当
なコ−ティング剤で剤皮を施すこともできる。
るアルド−ス還元酵素阻害剤を提供する。本発明のアル
ド−ス還元酵素阻害剤を投与するときは、性別、年齢、
症状により変化するが、1日に1〜1000mgを投与
する。投与経路は、経口、非経口のどちらでも可能であ
るが、経口投与で用いるのが好ましい。さらに、経口投
与の際に用いられる剤形には、エリキシル剤、カプセル
剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、散剤、錠剤、および
シロップ剤などが挙げられるが、好ましくは錠剤として
用いるのがよい。ここで用いられる錠剤は、通常の錠剤
の製法により製することができる。すなわち、本発明化
合物をそのまま、または賦形剤、結合剤、もしくはその
他の適当な添加剤を加えて均等に混和したものを、直接
圧縮成型するか、顆粒状とした後、滑沢剤などを加え、
圧縮成型する。この顆粒を製するには、上記の混和物を
圧縮した後、顆粒状に粉砕するか、または適当な湿潤剤
を加えて粒状とし、乾燥する。また、必要に応じて着色
剤、矯味剤などを加えてもよく、さらに白糖または適当
なコ−ティング剤で剤皮を施すこともできる。
【0012】以下に実施例で本発明を詳細に説明する。
1.培養工程 馬鈴薯澱粉2.0%、サッカロース2.0%、酵母エキス
0.5%よりなる培地800mlを入れた2L容マイヤ
ーフラスコに、28℃で10日間培養したChaetomella
circinoseta RF-3192の斜面培養物を接種する。接種し
たフラスコは、振幅70mm、回転数180rpmのシ
ェーカー上、28℃で3日間振盪培養する。この培養液
800mlを、上記と同一組成を有する培地20Lを入
れた30L容ジャーファメンターに接種する。接種した
培地を150rpmで撹拌中、28℃で23時間培養す
る。次いで,この培養液12Lを,可溶性澱粉2.0
%、サッカロース2.0%、酵母エキス0.5%よりなる
培地300Lを含む500L容タンク中に接種し,撹拌
回転数350rpm、通気量毎分300Lで28℃で4
日間培養する。
0.5%よりなる培地800mlを入れた2L容マイヤ
ーフラスコに、28℃で10日間培養したChaetomella
circinoseta RF-3192の斜面培養物を接種する。接種し
たフラスコは、振幅70mm、回転数180rpmのシ
ェーカー上、28℃で3日間振盪培養する。この培養液
800mlを、上記と同一組成を有する培地20Lを入
れた30L容ジャーファメンターに接種する。接種した
培地を150rpmで撹拌中、28℃で23時間培養す
る。次いで,この培養液12Lを,可溶性澱粉2.0
%、サッカロース2.0%、酵母エキス0.5%よりなる
培地300Lを含む500L容タンク中に接種し,撹拌
回転数350rpm、通気量毎分300Lで28℃で4
日間培養する。
【0013】2.分離・精製工程 (1)上記工程で得られた発酵液277Lを、5N水酸化
ナトリウムでpH9.0に調節し濾過する。濾液は6N
塩酸でpH4.0に調節し、酢酸エチル126Lで抽出
する。抽出液85Lを水15Lで洗浄後、減圧留去し残
査45gを得る。この残査を酢酸エチル2Lに溶解し、
pH8.0に調節した水400mlで2回抽出する。酢
酸エチル分画はそのまま減圧留去し粗物質(crude-1)
14.36gを得る。一方、水分画は2N塩酸でpH4.
0に調節し、酢酸エチル800mlで2回抽出した後、
減圧留去し粗物質(crude-2)19.38gを得る。
ナトリウムでpH9.0に調節し濾過する。濾液は6N
塩酸でpH4.0に調節し、酢酸エチル126Lで抽出
する。抽出液85Lを水15Lで洗浄後、減圧留去し残
査45gを得る。この残査を酢酸エチル2Lに溶解し、
pH8.0に調節した水400mlで2回抽出する。酢
酸エチル分画はそのまま減圧留去し粗物質(crude-1)
14.36gを得る。一方、水分画は2N塩酸でpH4.
0に調節し、酢酸エチル800mlで2回抽出した後、
減圧留去し粗物質(crude-2)19.38gを得る。
【0014】(2) 下記の方法で 活性成分 RF−319
2A、B、Cの分離精製を行った。 a)RF−3192Cの分離精製 上記(1)で得られた粗物質(crude-1)14.36gを酢
酸エチルと0.5N炭酸水素ナトリウムで分配抽出す
る。酢酸エチル層を分取し、溶媒を減圧留去して粗抽出
物13.44gを得た。この粗抽出物をヘキサンで洗浄
し、残渣7.75gをカラムクロマトグラフィ−(カラ
ム;SiO2 60 (40〜63μm),150g (メルク社製),溶媒;
アセトン:ジクロロメタン=4:6)にかけ、得られた
RF−3192Cの粗精製物1.81gをさらにカラム
クロマトグラフィ−(カラム,溶媒は同上)で分離精製
し、RF−3192Cの精製物160mgを得た。得ら
れた精製物をジクロロエタンで結晶化し、RF−319
2Cのラディッシュオレンジ色の結晶117mgを得
た。
2A、B、Cの分離精製を行った。 a)RF−3192Cの分離精製 上記(1)で得られた粗物質(crude-1)14.36gを酢
酸エチルと0.5N炭酸水素ナトリウムで分配抽出す
る。酢酸エチル層を分取し、溶媒を減圧留去して粗抽出
物13.44gを得た。この粗抽出物をヘキサンで洗浄
し、残渣7.75gをカラムクロマトグラフィ−(カラ
ム;SiO2 60 (40〜63μm),150g (メルク社製),溶媒;
アセトン:ジクロロメタン=4:6)にかけ、得られた
RF−3192Cの粗精製物1.81gをさらにカラム
クロマトグラフィ−(カラム,溶媒は同上)で分離精製
し、RF−3192Cの精製物160mgを得た。得ら
れた精製物をジクロロエタンで結晶化し、RF−319
2Cのラディッシュオレンジ色の結晶117mgを得
た。
【0015】b)RF−3192Bの分離精製 上記a)の分配抽出で得られた0.5N炭酸水素ナトリウ
ム層を2N塩酸でpH2に調整した後、酢酸エチルで抽
出し、粗抽出物1.175gを得た。得られた粗抽出物
をカラム(MCI GEL CHP-20P (75〜150μm),300ml (三
菱化成社製))にのせ、(アセトニトリル:テトラヒド
ロフラン(THF)=1:1):0.1%トリフロロ酢
酸(TFA)=3:7→8:2でグラジエント溶出を行
なって分離し、RF−3192Bの粗精製物671mg
を得た。この粗精製物をカラムクロマトグラフィ−(カ
ラム;LiCroprep RP-18 (25〜75μm),20φ×500mm (メ
ルク社製),溶媒;メタノ−ル:0.1%TFA=1:
1)で分離精製し、得られた46mgのRF−3192
B精製物をさらにカラムクロマトグラフィ−(カラム;
LiCroprep RP-18 (25〜75μm),20φ×500mm (メルク社
製),溶媒;(アセトニトリル:THF=1:1):
0.1%TFA=3:7)で分離精製してRF−319
2B精製物37mgを得た。この精製物を酢酸エチルで
結晶化した後エ−テルで洗浄し、RF−3192Bのオ
レンジ色の結晶30mgを得た。
ム層を2N塩酸でpH2に調整した後、酢酸エチルで抽
出し、粗抽出物1.175gを得た。得られた粗抽出物
をカラム(MCI GEL CHP-20P (75〜150μm),300ml (三
菱化成社製))にのせ、(アセトニトリル:テトラヒド
ロフラン(THF)=1:1):0.1%トリフロロ酢
酸(TFA)=3:7→8:2でグラジエント溶出を行
なって分離し、RF−3192Bの粗精製物671mg
を得た。この粗精製物をカラムクロマトグラフィ−(カ
ラム;LiCroprep RP-18 (25〜75μm),20φ×500mm (メ
ルク社製),溶媒;メタノ−ル:0.1%TFA=1:
1)で分離精製し、得られた46mgのRF−3192
B精製物をさらにカラムクロマトグラフィ−(カラム;
LiCroprep RP-18 (25〜75μm),20φ×500mm (メルク社
製),溶媒;(アセトニトリル:THF=1:1):
0.1%TFA=3:7)で分離精製してRF−319
2B精製物37mgを得た。この精製物を酢酸エチルで
結晶化した後エ−テルで洗浄し、RF−3192Bのオ
レンジ色の結晶30mgを得た。
【0016】RF−3192Bは次の操作によっても得
ることができる。まず、上記(1)で得られた粗物質(cru
de-2)19.38gをカラム(MCI GEL CHP-20P (75〜15
0μm),300ml (三菱化成社製))にのせ、(アセトニト
リル:THF=1:1):0.1%TFA=3:7→
8:2でグラジエント溶出を行なって分離し、粗物質
(crude A)4.03gとRF−3192Bの粗精製物9
26mgを得た。RF−3192B粗精製物をカラムク
ロマトグラフィ−(カラム;LiCroprep RP-18 (25〜75
μm),20φ×500mm (メルク社製),溶媒;(アセトニト
リル:THF=1:1):0.1%TFA=3:7)で
分離精製し、得られた172mgのRF−3192B精
製物をさらにカラムクロマトグラフィ−(カラム;LiCr
oprep RP-18 (25〜75μm),20φ×500mm (メルク社
製),溶媒;メタノ−ル:0.1%TFA=1:1)で分
離精製してRF−3192B精製物46mgを得た。こ
の精製物を酢酸エチルで結晶化した後エ−テルで洗浄
し、RF−3192Bのオレンジ色の結晶40mgを得
た。
ることができる。まず、上記(1)で得られた粗物質(cru
de-2)19.38gをカラム(MCI GEL CHP-20P (75〜15
0μm),300ml (三菱化成社製))にのせ、(アセトニト
リル:THF=1:1):0.1%TFA=3:7→
8:2でグラジエント溶出を行なって分離し、粗物質
(crude A)4.03gとRF−3192Bの粗精製物9
26mgを得た。RF−3192B粗精製物をカラムク
ロマトグラフィ−(カラム;LiCroprep RP-18 (25〜75
μm),20φ×500mm (メルク社製),溶媒;(アセトニト
リル:THF=1:1):0.1%TFA=3:7)で
分離精製し、得られた172mgのRF−3192B精
製物をさらにカラムクロマトグラフィ−(カラム;LiCr
oprep RP-18 (25〜75μm),20φ×500mm (メルク社
製),溶媒;メタノ−ル:0.1%TFA=1:1)で分
離精製してRF−3192B精製物46mgを得た。こ
の精製物を酢酸エチルで結晶化した後エ−テルで洗浄
し、RF−3192Bのオレンジ色の結晶40mgを得
た。
【0017】c)RF−3192Aの分離精製 上記で粗物質(crude-2)から得られた粗物質(crude
A)4.03gをカラムクロマトグラフィ−(カラム;MC
I GEL CHP-20P (75〜150μm),300ml (三菱化成社製),
溶媒;(アセトニトリル:THF=1:1):0.1%
TFA=3:7)で分離精製し、RF−3192Aの粗
精製物1.088gを得た。この粗精製物をカラムクロ
マトグラフィ−(カラム;LiCroprep RP-18 (25〜75μ
m),20φ×500mm (メルク社製),溶媒;アセトニトリ
ル:0.1%TFA=20:80)で分離精製し、RF
−3192Aの精製物45mgを得た。この精製物をさ
らにカラムクロマトグラフィ−(カラム;LiCroprep RP
-18 (25〜75μm),20φ×500mm (メルク社製),溶媒;
メタノ−ル:0.1%TFA=40:60)で精製し、
得られた精製物39mgをもういちどカラムクロマトグ
ラフィ−(カラム;LiCroprep RP-18 (25〜75μm),20
φ×500mm (メルク社製),溶媒;アセトニトリル:0.
1%TFA=20:80)にかけ、精製物10mgを得
た。しかしこの精製物も完全にピュアなものではなかっ
たので、これをさらにHPLC(カラム;COSMOSIL 5C1
8,20φ×150mm (ナカライテスク),溶媒;アセトニト
リル:0.1%TFA=20:80)で精製してRF−
3192Aのオレンジ色非結晶粉末6.7mgを得た。
A)4.03gをカラムクロマトグラフィ−(カラム;MC
I GEL CHP-20P (75〜150μm),300ml (三菱化成社製),
溶媒;(アセトニトリル:THF=1:1):0.1%
TFA=3:7)で分離精製し、RF−3192Aの粗
精製物1.088gを得た。この粗精製物をカラムクロ
マトグラフィ−(カラム;LiCroprep RP-18 (25〜75μ
m),20φ×500mm (メルク社製),溶媒;アセトニトリ
ル:0.1%TFA=20:80)で分離精製し、RF
−3192Aの精製物45mgを得た。この精製物をさ
らにカラムクロマトグラフィ−(カラム;LiCroprep RP
-18 (25〜75μm),20φ×500mm (メルク社製),溶媒;
メタノ−ル:0.1%TFA=40:60)で精製し、
得られた精製物39mgをもういちどカラムクロマトグ
ラフィ−(カラム;LiCroprep RP-18 (25〜75μm),20
φ×500mm (メルク社製),溶媒;アセトニトリル:0.
1%TFA=20:80)にかけ、精製物10mgを得
た。しかしこの精製物も完全にピュアなものではなかっ
たので、これをさらにHPLC(カラム;COSMOSIL 5C1
8,20φ×150mm (ナカライテスク),溶媒;アセトニト
リル:0.1%TFA=20:80)で精製してRF−
3192Aのオレンジ色非結晶粉末6.7mgを得た。
【0018】3.構造決定 上記で単離精製されたRF−3192A,B,Cの構造
を決定した。RF−3192Bはアセトンより再結晶し
た結晶の、RF−3192Cはメタノ−ルからの結晶
の、X線解析により構造を確定した。この構造は元素分
析、質量分析、NMRでも支持し確認された。RF−3
192Aにおいては、1H−NMRでRF−3192B
の7.52〜7.62ppm(5H,m)のフェニル基由
来のシグナルが無く、代わりに7.051(2H,d,
J=8.6)、7.589(2H,d,J=8.6)にA
B型カルテットがある。相違部分はRF−3192Bで
はフェニル基に由来すると考えられ、RF−3192A
ではp−ハイドロキシフェニル基と推定される。以上の
ことから、RF−3192Aの構造を推定し、HR−S
IMSでこの構造を支持する分子式が示された。なお、
RF−3192A,B,Cは全てラセミ体として存在す
る。
を決定した。RF−3192Bはアセトンより再結晶し
た結晶の、RF−3192Cはメタノ−ルからの結晶
の、X線解析により構造を確定した。この構造は元素分
析、質量分析、NMRでも支持し確認された。RF−3
192Aにおいては、1H−NMRでRF−3192B
の7.52〜7.62ppm(5H,m)のフェニル基由
来のシグナルが無く、代わりに7.051(2H,d,
J=8.6)、7.589(2H,d,J=8.6)にA
B型カルテットがある。相違部分はRF−3192Bで
はフェニル基に由来すると考えられ、RF−3192A
ではp−ハイドロキシフェニル基と推定される。以上の
ことから、RF−3192Aの構造を推定し、HR−S
IMSでこの構造を支持する分子式が示された。なお、
RF−3192A,B,Cは全てラセミ体として存在す
る。
【0019】4.アルドーズ還元酵素阻害活性 (1) アルドース還元酵素阻害作用アッセイシステム: 酵素源としてラットレンズのホモジネートを、基質とし
てグリセルアルデヒドを、補酵素としてNADPHを用
い、Abram N. Brubaker et al., J. Med. Chem. 29, 10
94-1099, (1986)に従って本発明化合物のアルド−ス還
元酵素阻害活性を測定した。実験法10mM D,L−
グリセロアルデヒド、0.4M Li2SO4、および阻害
物質(RF−3192A,B,C,または標品)を含む
リン酸緩衝液に酵素源としてのラットレンズホモジネ−
トトリホスホピリジンヌクレオチド(還元型)を0.1
mMになるように加えた。340nmでの最初の1分間
の吸光度変化を測定し、酵素反応に対する阻害を測定し
た。酵素源としてのラットレンズホモジネートは、阻害
物質を含まない状態での最初の1分間の吸光度変化が、
0.200 ABS Unit/min.になる量を用いた。ラット
レンズホモジネ−ト調製法ラットの眼球20個よりレン
ズを取り出し,これを5mMメルカプトエタノ−ル4m
l中、ガラス−テフロンホモジェナ−トを用いてホモジ
ナイズし、これを4℃で10,000rpmで20分間
遠心,遠心上清を酵素源として用いた.
てグリセルアルデヒドを、補酵素としてNADPHを用
い、Abram N. Brubaker et al., J. Med. Chem. 29, 10
94-1099, (1986)に従って本発明化合物のアルド−ス還
元酵素阻害活性を測定した。実験法10mM D,L−
グリセロアルデヒド、0.4M Li2SO4、および阻害
物質(RF−3192A,B,C,または標品)を含む
リン酸緩衝液に酵素源としてのラットレンズホモジネ−
トトリホスホピリジンヌクレオチド(還元型)を0.1
mMになるように加えた。340nmでの最初の1分間
の吸光度変化を測定し、酵素反応に対する阻害を測定し
た。酵素源としてのラットレンズホモジネートは、阻害
物質を含まない状態での最初の1分間の吸光度変化が、
0.200 ABS Unit/min.になる量を用いた。ラット
レンズホモジネ−ト調製法ラットの眼球20個よりレン
ズを取り出し,これを5mMメルカプトエタノ−ル4m
l中、ガラス−テフロンホモジェナ−トを用いてホモジ
ナイズし、これを4℃で10,000rpmで20分間
遠心,遠心上清を酵素源として用いた.
【0020】(2) 阻害活性: 標品としてイタリア,アイ
ルランドで市販されている トルレスッタト(Tolrestat)
を用いた。測定結果を表1に示す。
ルランドで市販されている トルレスッタト(Tolrestat)
を用いた。測定結果を表1に示す。
【表1】
【0021】
【発明の効果】上記実施例で詳述したように、本発明化
合物はアルド−ス還元酵素阻害活性を有するので、糖尿
病性神経障害、糖尿病性白内症、糖尿病性角膜症、糖尿
病性網膜症、糖尿病性腎症などの糖尿病性合併症の有用
な治療薬となりうると考えられる。
合物はアルド−ス還元酵素阻害活性を有するので、糖尿
病性神経障害、糖尿病性白内症、糖尿病性角膜症、糖尿
病性網膜症、糖尿病性腎症などの糖尿病性合併症の有用
な治療薬となりうると考えられる。
【化15】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI A61P 27/12 A61P 27/12 C07D 307/77 C07D 307/77 C12P 17/04 C12P 17/04 //(C12P 17/04 C12R 1:01) (72)発明者 板崎 弘 兵庫県宝塚市清荒神3−9−4 (56)参考文献 Tetrahedron Let t.,27(18),p.2015−2018 (1986) Chem.Pharm.Bull., 35(6),p.2594−2597(1987) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C07D 307/92 A61K 31/343 C07D 307/77 C12P 17/04 CA(STN) REGISTRY(STN) BIOSIS(DIALOG)
Claims (5)
- 【請求項1】 式(I): 【化1】 [式中、R1は (CH2)2COOH 、R2はフェニルまたはp−ヒ
ドロキシフェニル、またはR1とR2が一緒になって、 【化2】 を表わす。]で示される化合物またはその塩。 - 【請求項2】 ケトメラ シルシノセタ(Chaetomella
circinoseta)種に属し、請求項1記載の化合物を産生
する微生物。 - 【請求項3】 ケトメラ シルシノセタ RF−319
2(Chaetomella circinoseta RF-3192)(FERM BP-372
4)である請求項2に記載の微生物。 - 【請求項4】 ケトメラ(Chaetomella)属に属し、請
求項1記載の化合物を産生する微生物を培養し、該培養
培地から該化合物を採取することを特徴とする該化合物
の製造法。 - 【請求項5】 請求項1記載の化合物を有効成分として
含有するアルド−ス還元酵素阻害剤。
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US08/015,356 US5284870A (en) | 1992-02-26 | 1993-02-09 | Aldose reductase inhibitor |
TW082101173A TW265340B (ja) | 1992-02-26 | 1993-02-19 | |
EP93102793A EP0557939A1 (en) | 1992-02-26 | 1993-02-23 | Aldose reductase inhibitor |
KR1019930002588A KR930017886A (ko) | 1992-02-26 | 1993-02-24 | 알도오스 환원효소 저해물질 |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4076140A JP3068706B2 (ja) | 1992-02-26 | 1992-02-26 | アルド−ス還元酵素阻害物質 |
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JPH05239048A JPH05239048A (ja) | 1993-09-17 |
JP3068706B2 true JP3068706B2 (ja) | 2000-07-24 |
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---|---|---|---|
JP4076140A Expired - Lifetime JP3068706B2 (ja) | 1992-02-26 | 1992-02-26 | アルド−ス還元酵素阻害物質 |
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---|---|
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EP (1) | EP0557939A1 (ja) |
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KR (1) | KR930017886A (ja) |
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Cited By (1)
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---|---|---|---|---|
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DE10203557A1 (de) * | 2002-01-29 | 2003-08-07 | Aventis Pharma Gmbh | Drechsleranol-Derivate, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
US9308206B2 (en) | 2004-08-23 | 2016-04-12 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Compositions and methods for treating colon cancer |
US20100022625A1 (en) * | 2006-06-29 | 2010-01-28 | Srivastava Satish K | Structural-based inhibitors of the glutathione binding site in aldose reductase, methods of screening therefor and methods of use |
US20060062822A1 (en) * | 2004-09-21 | 2006-03-23 | Medtronic Vascular, Inc. | Medical devices to treat or inhibit restenosis |
DK2034850T3 (en) * | 2006-06-06 | 2017-07-17 | Dsm Ip Assets Bv | NEW STARTER MEDIUM FOR CHEESE PRODUCTION |
CN104447649B (zh) * | 2014-10-29 | 2016-08-17 | 辽宁大学 | 甲基萘并[1,2-b]呋喃酰胺类化合物及其药学上可接受的盐及其制备方法和应用 |
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---|---|---|---|---|
JPS5916884A (ja) * | 1982-07-19 | 1984-01-28 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | 新規フラン化合物 |
US5028537A (en) * | 1984-03-26 | 1991-07-02 | Merck & Co. Inc. | Novel antifungal substances and process for their production |
ES2080068T3 (es) * | 1988-02-13 | 1996-02-01 | Suntory Ltd | Derivados de 2-piranona y su procedimiento de preparacion. |
-
1992
- 1992-02-26 JP JP4076140A patent/JP3068706B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-02-09 US US08/015,356 patent/US5284870A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-02-19 TW TW082101173A patent/TW265340B/zh active
- 1993-02-23 EP EP93102793A patent/EP0557939A1/en not_active Ceased
- 1993-02-24 KR KR1019930002588A patent/KR930017886A/ko not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Chem.Pharm.Bull.,35(6),p.2594−2597(1987) |
Tetrahedron Lett.,27(18),p.2015−2018(1986) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013106697A (ja) * | 2011-11-18 | 2013-06-06 | Ya Man Ltd | ヘアーアイロン |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR930017886A (ko) | 1993-09-20 |
EP0557939A1 (en) | 1993-09-01 |
TW265340B (ja) | 1995-12-11 |
JPH05239048A (ja) | 1993-09-17 |
US5284870A (en) | 1994-02-08 |
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