JPH05239048A

JPH05239048A - アルド−ス還元酵素阻害物質

Info

Publication number: JPH05239048A
Application number: JP4076140A
Authority: JP
Inventors: Tadashi Yoshida; 正吉田; Toshiyuki Kato; 利幸加藤; Yoshimi Kawamura; 義巳川村; Koichi Matsumoto; 浩一松本; Hiroshi Itazaki; 弘板崎
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1992-02-26
Filing date: 1992-02-26
Publication date: 1993-09-17
Anticipated expiration: 2015-07-24
Also published as: JP3068706B2; EP0557939A1; TW265340B; KR930017886A; US5284870A

Abstract

(57)【要約】【構成】ケトメラ（Chaetomella）属に属する Chaeto
mella circinoseta RF-3192 の発酵産生物から、アルド
−ス還元酵素阻害活性を持ち、式：【化１】［式中、R₁は (CH₂)₂COOH 、R₂はフェニルまたはｐ−ヒ
ドロキシフェニル、またはR₁とR₂が一緒になって、【化２】を表わす。］で示される化合物を得た。【効果】本発明化合物はアルド−ス還元酵素阻害活性
を有するので、糖尿病性神経障害、糖尿病性白内症、糖
尿病性角膜症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症などの糖
尿病性合併症の治療薬に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、式（Ｉ）：

【化３】［式中、R₁は (CH₂)₂COOH 、R₂はフェニルまたはｐ−ヒ
ドロキシフェニル、またはR₁とR₂が一緒になって、

【化４】を表わす。］で示されるアルド−ス還元酵素阻害物質、
該物質を産生する微生物、および該物質の製造法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来より糖尿病の発症が増加してきてお
り、同時にその合併症も極めて大きな問題となってい
る。糖尿病の合併症の原因としては、ポリオール（ソ
ルビトール）の蓄積、フリーラジカルによる過酸化、蛋
白のリジン残基のグリコシル化などが考えられる。ポリ
オール産生に関わるアルドース還元酵素（以下ＡＲと略
す）の阻害剤は糖尿病に起因する各種の糖尿病性合併
症、例えば、糖尿病性神経障害、糖尿病性白内障、糖尿
病性角膜症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症などの治療
薬となりうると考えられ、各社により開発研究が行なわ
れている。現在知られているＡＲ阻害剤としては例え
ば、Simard-Duquesne, N らのトルレスタット［下記化
合物（II）］（Tolrestat；Metabolism 34, 885-892, 1
985）や、WF-3681［下記化合物（III）］（特公平3-524
58）などが挙げられるが、本発明化合物と類似の構造を
持つＡＲ阻害物質は全く知られていない。

【化５】

【化６】

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】糖尿病性合併症の多発
する血管、抹梢神経、レンズ、網膜などに、ポリオ−ル
の代謝経路の律速酵素であるＡＲが存在していることが
明らかにされており、糖尿病におけるその重要性が認識
されだした。糖尿病のごとき高血糖状態では解糖系で代
謝される以上のグルコ−スが細胞内に存在し、ＡＲの基
質となるためポリオ−ル代謝経路におけるグルコ−スの
代謝が容易に促進させられる。それに伴い、ソルビト−
ルの異常蓄積をより一層助長することになる。このソル
ビト−ルは比較的安定な物質で、いったん産生されると
細胞外への移行はほとんど認められず、この産生と排泄
の平衡破綻がこの糖アルコ−ルの細胞内蓄積を招来す
る。その結果、細胞内浸透圧上昇を招き、細胞内への水
分貯留を来し、細胞機能を正常に維持することが不可能
になり、細胞障害を示すことになる。このＡＲ活性を阻
害すれば細胞内ソルビト−ルの異常蓄積は回避され、細
胞機能を正常に維持しうる可能性は大である。そこで、
本発明者らは、ＡＲ阻害作用を持った化合物の研究を行
なった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、以上の事
柄を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、不完全菌 Chaetomel
lacircinoseta RF-3192の培養液中にＡＲ阻害活性を有
する物質を見い出し、発酵、抽出、分離精製を行ない、
本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、式
（Ｉ）：

【化７】［式中、R₁は (CH₂)₂COOH 、R₂はフェニルまたはｐ−ヒ
ドロキシフェニル、またはR₁とR₂が一緒になって、

【化８】を表わす。］で示される化合物またはその塩に関するも
のである。式Ｉで示されるこの発明化合物は、下記式で
示される（Ｉａ）〜（Ｉｃ）の互変異性型をとり得る
が、式（Ｉ）の型の化合物がより安定的に存在する。し
かし他の互変異性型化合物の存在を否定するものではな
い。

【化９】

【０００５】また本発明は、ケトメラシルシノセタ
（Chaetomella circinoseta）種に属し本発明化合物を
産生する微生物を提供する。本発明のケトメラシルシ
ノセタ（Chaetomella circinoseta）種に属するＲＦ−
３１９２株は以下のような性状を有していた。ＲＦ−３１９２株の菌学的諸性状本菌株をコ−ンミ−ル寒天上で培養するとコロニ−は平
坦で薄く、半透明から白色を示し、暗褐色から黒褐色の
分生子果（pycnidia）を寒天表面に形成する。分生子果
は楕円形で、一本の縦溝（raphe）を有しており、長さ
は３２０〜４８０μｍである。剛毛（setae）には隔壁
があり、色は茶色で分枝はせず、頂端がコイル状に巻い
ていて大きさは３００〜５６０×１０〜１５μｍのもの
と、棍棒状で大きさは６０〜１００×５〜１０μｍの２
種類の剛毛が観察される。前者は主として分生子果の両
極部で、また後者は中央部で観察される。分生子柄は透
明、繊維状で不規則に分枝し、隔壁を有し、頂側性の分
生胞子を着生する。分生胞子は透明、単胞子、ソ−セ−
ジ型であり、大きさは７.５〜１０.５×１.５〜２.０μ
ｍである。

【０００６】上述した諸性状をBrian C. Sutton著、 ”T
he Coelomycetes” （B. C. Sutton, The Coelomycete
s, Commonwealth Mycological Institute, KEW, Surre
y, England (1980)）のケトメラ（Chaetomella）属につ
いての記載と比較した結果、ＲＦ−３１９２株はケトメ
ラシルシノセタスト−ク（Chaetomella circinoset
a Stork）に属すると結論し、本菌株をChaetomella cir
cinoseta RF-3192と命名した。本菌株は、茨城県つくば
市東１−１−３（郵便番号３０５）にある工業技術院微
生物工業研究所に、平成４年（１９９２年）２月３日よ
りブダペスト条約に基づき「Chaetomella circinoseta
RF-3192」微工研条寄第３７２４号（ＦＥＲＭＢＰ−
３７２４）として寄託されている。

【０００７】さらに本発明は、ケトメラ（Chaetomell
a）属に属する本発明微生物を培養し、該培養培地から
本発明化合物を採取することを特徴とする本発明化合物
の製造法を提供する。以下に、本発明化合物の一般的製
造法を記載する。ケトメラ（Chaetomella）属に属する
菌株、例えば上記のChaetomella circinoseta RF-3192
を、通常の発酵生産に用いる培地組成、培地条件で培養
する。培地は原則として、炭素源、窒素源、無機塩など
を含む。必要に応じて、ビタミン類、先駆物質などを加
えてもよい。炭素源としては、例えば、グルコ−ス、ポ
テトスタ−チ、デキストリン、グリセリン、糖類、有機
酸などが単独でまたは混合物として用いられる。窒素源
としては、例えば大豆粉、コ−ンスチ−プリカ−、肉エ
キス、酵母エキス、綿実粉、ペプトン、小麦胚芽、硫酸
アンモニウム、硝酸アンモニウムなどが単独または、混
合物として用いられる。無機塩としては、例えば、炭酸
カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグ
ネシウム、硫酸銅、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化コバ
ルト、各種リン酸塩などが挙げられ、必要に応じて培地
に添加する。培養温度は約２２〜３７℃で行なうとよ
く、特に２６〜３０℃が好ましい。培養時間は発酵の規
模に大きく左右されるが、約４日〜６日が大量生産を行
なう場合に要する培養時間である。培養中に激しい発泡
が起こる場合には、培養前または培養中に例えば、植物
油、ラ−ド、ポリプロピレングリコ−ルなどの消泡剤を
適宜添加するとよい。培養終了後、培養物から本発明化
合物を分離採取するには、通常の発酵生産物を分離採取
する方法を適宜用いる。例えば濾過、遠心分離、各種イ
オン交換樹脂やその他の活性吸着剤による吸脱着やクロ
マトグラフィ−、各種有機溶媒による抽出などを適当に
組み合わせるとよい。

【０００８】以下に上記製造法で得られた化合物ＲＦ−
３１９２Ｂ，Ｃ，Ａの化学的性状および構造式を示す。ＲＦ−３１９２Ｂ 1)性状：酸性、オレンジ色の結晶 2)融点：＞230℃（分解） 3)ＩＲ，λ_max ^KBr cm^-1：3304, 1701, 1646, 1608, 157
4, 1378, 1248, 1219, 1204, 1165, 860, 851 4)ＵＶ，ν_max (E^1% _1cm) nm： in MeOH：218sh(840), 265(350), 316(560), 410(170) in 0.01N HCl-90% MeOH：218(690), 265(330), 317(52
0), 410(179) in 0.01N NaOH-90% MeOH：240(580), 292(500), 318(44
0), 230sh(150), 460(120) 5)元素分析：C₂₁H₁₆O₇＋0.2 CH₃COOC₂H₅として理論値；C：65.79, H：4.46 実測値；C：65.41, H：4.45 6)ＳＩＭＳ：m/z 381 [M+H]⁺ ＨＲ−ＳＩＭＳ：C₂₁H₁₆O₇＋H として計算値；381.0974 実測値；m/z 381.0976 7)¹Ｈ−ＮＭＲ (d₆-DMSO) ppm：1.80〜2.15 (2H, m),
2.24〜2.35 (2H, m), 5.790 (1H, s), 6.255 (2H, s),
7.52〜7.62 (5H, m), 8.186 (1H, OH, br), 10.393 (1
H, OH, br), 12.177 (1H, OH, brs), 13.808 (1H, OH,
s) 8)¹³Ｃ−ＮＭＲ (d₆-DMSO) ppm：27.75 t, 31.64 t, 9
7.67 d, 103.89 d, 105.19 d, 107.35 s, 115.58 s, 12
3.94 s, 127.60 dx2, 129.35 dx2, 129.86 d, 130.54
s, 131.67 s, 152.56 s, 162.08 s, 163.62 s, 170.82
s, 173.45 s, 190.36 s 9)構造式

【化１０】また、ＲＦ−３１９２Ｂは下記式に示す（ＩＢａ）〜
（ＩＢｃ）の互変異性体の構造をとり得るが、式（Ｉ
Ｂ）の型の化合物が安定的に存在する。

【化１１】

【０００９】ＲＦ−３１９２Ｃ 1)性状：酸性，ラディッシュオレンジ色の結晶 2)融点：＞150℃（分解) 3)ＩＲ，λ_max ^KBr cm^-1：3394, 1653, 1608, 1470, 141
6, 1383, 1359, 1319, 1280, 1233, 1215, 1169, 1123,
1100, 1044, 1018, 985, 842, 766 4)ＵＶ，ν_max (E^1% _1cm) nm： in MeOH；220 sh(820), 273(500), 347(480), 440 sh(1
30) in 0.01N HCl-90% MeOH；218(700), 273(460), 347(44
0), 440(130) in 0.01N NaOH-90% MeOH (非可逆シフト)；238 sh(66
0), 265 sh(500), 297 sh(440), 318(460), 358 sh(34
0), 395 sh(190), 490 sh(50) 5)元素分析：C₂₀H₁₂O₈＋CH₃OHとして理論値；C：61.17, H：3.91 実測値；C：61.73, H：3.65 6)ＳＩＭＳ：m/z 381 [M+H]⁺ ＨＲ−ＳＩＭＳ：C₂₀H₁₂O₈＋H として計算値；381.0610 実測値；m/z 381.0612 7)¹Ｈ−ＮＭＲ (d₆-DMSO) ppm：3.231 (1H, d, J=16.
8), 3.408 (1H, d, J=16.8), 5.839(1H, s), 6.364(1H,
d, J=2.2), 6.459 (1H, d, J=2.2), 7.099 (1H, J=2.
0), 7.506(1H, d, J=2.0), 10.712 (1H, OH, s), 11.33
9 (1H, OH, s), 12.568(1H, OH, s), 13.857(1H, OH,
s) 8)¹³Ｃ−ＮＭＲ (d₆-DMSO) ppm：49.60 t, 99.29 d, 10
5.10 d, 105.38 d, 107.90 s, 109.44 d, 109.50 s, 11
2.61 s, 122.05 s, 130.82 s, 135.10 s, 146.57s, 16
2.88 s, 164.36 s, 165.20 s, 171.99 s, 190.26 s, 19
9.09 s 9)構造式

【化１２】また、ＲＦ−３１９２Ｃは下記に示す（ＩＣａ）〜（Ｉ
Ｃｄ）および（ＩＣ^’）の互変異性体の構造をとり得る
が、（ＩＣ）およびその対称体である（ＩＣ^’ ）の型
の化合物が安定的に存在する。

【化１３】

【００１０】ＲＦ−３１９２Ａ 1)ＳＩＭＳ：m/z 397 [M+1]⁺ ＨＲ−ＳＩＭＳ：C₂₁H₁₆O₈＋H として計算値；397.0923 実測値；m/z 397.0928 2)¹³Ｃ−ＮＭＲ (d₆-Acetone) ppm：28.28 t, 33.01 t,
98.65 d, 104.85 d, 105.55 d, 109.29 s, 115.92 s,
123.38 s, 130.75 dx2, 117.06 dx2, 165.41 s,124,58
s, 132.17 s, 152.92 s, 160.03 s, 162.72 s, 172.12
s, 173.77 s, 191.67 s 3)構造式

【化１４】また、ＲＦ−３１９２Ａは下記に示す（ＩＡａ）〜（Ｉ
Ａｃ）の互変異性体の構造をとり得るが、（ＩＡ）の型
の化合物が安定的に存在する。

【化１８】

【００１１】本発明は、さらに、本発明化合物を含有す
るアルド−ス還元酵素阻害剤を提供する。本発明のアル
ド−ス還元酵素阻害剤を投与するときは、性別、年齢、
症状により変化するが、１日に１〜１０００ｍｇを投与
する。投与経路は、経口、非経口のどちらでも可能であ
るが、経口投与で用いるのが好ましい。さらに、経口投
与の際に用いられる剤形には、エリキシル剤、カプセル
剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、散剤、錠剤、および
シロップ剤などが挙げられるが、好ましくは錠剤として
用いるのがよい。ここで用いられる錠剤は、通常の錠剤
の製法により製することができる。すなわち、本発明化
合物をそのまま、または賦形剤、結合剤、もしくはその
他の適当な添加剤を加えて均等に混和したものを、直接
圧縮成型するか、顆粒状とした後、滑沢剤などを加え、
圧縮成型する。この顆粒を製するには、上記の混和物を
圧縮した後、顆粒状に粉砕するか、または適当な湿潤剤
を加えて粒状とし、乾燥する。また、必要に応じて着色
剤、矯味剤などを加えてもよく、さらに白糖または適当
なコ−ティング剤で剤皮を施すこともできる。

【００１２】以下に実施例で本発明を詳細に説明する。

【実施例】

１．培養工程馬鈴薯澱粉２.０％、サッカロース２.０％、酵母エキス
０.５％よりなる培地８００ｍｌを入れた２Ｌ容マイヤ
ーフラスコに、２８℃で１０日間培養したChaetomella
circinoseta RF-3192の斜面培養物を接種する。接種し
たフラスコは、振幅７０ｍｍ、回転数１８０ｒｐｍのシ
ェーカー上、２８℃で３日間振盪培養する。この培養液
８００ｍｌを、上記と同一組成を有する培地２０Ｌを入
れた３０Ｌ容ジャーファメンターに接種する。接種した
培地を１５０ｒｐｍで撹拌中、２８℃で２３時間培養す
る。次いで，この培養液１２Ｌを，可溶性澱粉２.０
％、サッカロース２.０％、酵母エキス０.５％よりなる
培地３００Ｌを含む５００Ｌ容タンク中に接種し，撹拌
回転数３５０ｒｐｍ、通気量毎分３００Ｌで２８℃で４
日間培養する。

【００１３】２．分離・精製工程 (1)上記工程で得られた発酵液２７７Ｌを、５Ｎ水酸化
ナトリウムでｐＨ９.０に調節し濾過する。濾液は６Ｎ
塩酸でｐＨ４.０に調節し、酢酸エチル１２６Ｌで抽出
する。抽出液８５Ｌを水１５Ｌで洗浄後、減圧留去し残
査４５ｇを得る。この残査を酢酸エチル２Ｌに溶解し、
ｐＨ８.０に調節した水４００ｍｌで２回抽出する。酢
酸エチル分画はそのまま減圧留去し粗物質（crude-1）
１４.３６ｇを得る。一方、水分画は２Ｎ塩酸でｐＨ４.
０に調節し、酢酸エチル８００ｍｌで２回抽出した後、
減圧留去し粗物質（crude-2）１９.３８ｇを得る。

【００１４】(2) 下記の方法で活性成分ＲＦ−３１９
２Ａ、Ｂ、Ｃの分離精製を行った。 a)ＲＦ−３１９２Ｃの分離精製上記(1)で得られた粗物質（crude-1）１４.３６ｇを酢
酸エチルと０.５Ｎ炭酸水素ナトリウムで分配抽出す
る。酢酸エチル層を分取し、溶媒を減圧留去して粗抽出
物１３.４４ｇを得た。この粗抽出物をヘキサンで洗浄
し、残渣７.７５ｇをカラムクロマトグラフィ−（カラ
ム；SiO₂ 60 (40〜63μm)，150g (メルク社製)，溶媒；
アセトン：ジクロロメタン＝４：６）にかけ、得られた
ＲＦ−３１９２Ｃの粗精製物１.８１ｇをさらにカラム
クロマトグラフィ−（カラム，溶媒は同上）で分離精製
し、ＲＦ−３１９２Ｃの精製物１６０ｍｇを得た。得ら
れた精製物をジクロロエタンで結晶化し、ＲＦ−３１９
２Ｃのラディッシュオレンジ色の結晶１１７ｍｇを得
た。

【００１５】b)ＲＦ−３１９２Ｂの分離精製上記a)の分配抽出で得られた０.５Ｎ炭酸水素ナトリウ
ム層を２Ｎ塩酸でｐＨ２に調整した後、酢酸エチルで抽
出し、粗抽出物１.１７５ｇを得た。得られた粗抽出物
をカラム（MCI GEL CHP-20P (75〜150μm)，300ml (三
菱化成社製)）にのせ、（アセトニトリル：テトラヒド
ロフラン（ＴＨＦ）＝１：１）：０.１％トリフロロ酢
酸（ＴＦＡ）＝３：７→８：２でグラジエント溶出を行
なって分離し、ＲＦ−３１９２Ｂの粗精製物６７１ｍｇ
を得た。この粗精製物をカラムクロマトグラフィ−（カ
ラム；LiCroprep RP-18 (25〜75μm)，20φ×500mm (メ
ルク社製)，溶媒；メタノ−ル：０.１％ＴＦＡ＝１：
１）で分離精製し、得られた４６ｍｇのＲＦ−３１９２
Ｂ精製物をさらにカラムクロマトグラフィ−（カラム；
LiCroprep RP-18 (25〜75μm)，20φ×500mm (メルク社
製)，溶媒；（アセトニトリル：ＴＨＦ＝１：１）：
０．１％ＴＦＡ＝３：７）で分離精製してＲＦ−３１９
２Ｂ精製物３７ｍｇを得た。この精製物を酢酸エチルで
結晶化した後エ−テルで洗浄し、ＲＦ−３１９２Ｂのオ
レンジ色の結晶３０ｍｇを得た。

【００１６】ＲＦ−３１９２Ｂは次の操作によっても得
ることができる。まず、上記(1)で得られた粗物質（cru
de-2）１９.３８ｇをカラム（MCI GEL CHP-20P (75〜15
0μm)，300ml (三菱化成社製)）にのせ、（アセトニト
リル：ＴＨＦ＝１：１）：０.１％ＴＦＡ＝３：７→
８：２でグラジエント溶出を行なって分離し、粗物質
（crude A）４.０３ｇとＲＦ−３１９２Ｂの粗精製物９
２６ｍｇを得た。ＲＦ−３１９２Ｂ粗精製物をカラムク
ロマトグラフィ−（カラム；LiCroprep RP-18 (25〜75
μm)，20φ×500mm (メルク社製)，溶媒；（アセトニト
リル：ＴＨＦ＝１：１）：０．１％ＴＦＡ＝３：７）で
分離精製し、得られた１７２ｍｇのＲＦ−３１９２Ｂ精
製物をさらにカラムクロマトグラフィ−（カラム；LiCr
oprep RP-18 (25〜75μm)，20φ×500mm (メルク社
製)，溶媒；メタノ−ル：０.１％ＴＦＡ＝１：１）で分
離精製してＲＦ−３１９２Ｂ精製物４６ｍｇを得た。こ
の精製物を酢酸エチルで結晶化した後エ−テルで洗浄
し、ＲＦ−３１９２Ｂのオレンジ色の結晶４０ｍｇを得
た。

【００１７】c)ＲＦ−３１９２Ａの分離精製上記で粗物質（crude-2）から得られた粗物質（crude
A）４.０３ｇをカラムクロマトグラフィ−（カラム；MC
I GEL CHP-20P (75〜150μm)，300ml (三菱化成社製)，
溶媒；（アセトニトリル：ＴＨＦ＝１：１）：０.１％
ＴＦＡ＝３：７）で分離精製し、ＲＦ−３１９２Ａの粗
精製物１.０８８ｇを得た。この粗精製物をカラムクロ
マトグラフィ−（カラム；LiCroprep RP-18 (25〜75μ
m)，20φ×500mm (メルク社製)，溶媒；アセトニトリ
ル：０.１％ＴＦＡ＝２０：８０）で分離精製し、ＲＦ
−３１９２Ａの精製物４５ｍｇを得た。この精製物をさ
らにカラムクロマトグラフィ−（カラム；LiCroprep RP
-18 (25〜75μm)，20φ×500mm (メルク社製)，溶媒；
メタノ−ル：０.１％ＴＦＡ＝４０：６０）で精製し、
得られた精製物３９ｍｇをもういちどカラムクロマトグ
ラフィ−（カラム；LiCroprep RP-18 (25〜75μm)，20
φ×500mm (メルク社製)，溶媒；アセトニトリル：０.
１％ＴＦＡ＝２０：８０にかけ、精製物１０ｍｇを得
た。しかしこの精製物も完全にピュアなものではなかっ
たので、これをさらにＨＰＬＣ（カラム；COSMOSIL 5C1
8，20φ×150mm (ナカライテスク)，溶媒；アセトニト
リル：０.１％ＴＦＡ＝２０：８０）で精製してＲＦ−
３１９２Ａのオレンジ色非結晶粉末６.７ｍｇを得た。

【００１８】３．構造決定上記で単離精製されたＲＦ−３１９２Ａ，Ｂ，Ｃの構造
を決定した。ＲＦ−３１９２Ｂはアセトンより再結晶し
た結晶の、ＲＦ−３１９２Ｃはメタノ−ルからの結晶
の、Ｘ線解析により構造を確定した。この構造は元素分
析、質量分析、ＮＭＲでも支持し確認された。ＲＦ−３
１９２Ａにおいては、¹Ｈ−ＮＭＲでＲＦ−３１９２Ｂ
の７.５２〜７.６２ｐｐｍ（５Ｈ，ｍ）のフェニル基由
来のシグナルが無く、代わりに７.０５１（２Ｈ，ｄ，
Ｊ＝８.６）、７.５８９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.６）にＡ
Ｂ型カルテットがある。相違部分はＲＦ−３１９２Ｂで
はフェニル基に由来すると考えられ、ＲＦ−３１９２Ａ
ではｐ−ハイドロキシフェニル基と推定される。以上の
ことから、ＲＦ−３１９２Ａの構造を推定し、ＨＲ−Ｓ
ＩＭＳでこの構造を支持する分子式が示された。なお、
ＲＦ−３１９２Ａ，Ｂ，Ｃは全てラセミ体として存在す
る。

【００１９】４．アルドーズ還元酵素活性 (1) アルドース還元酵素阻害作用アッセイシステム：酵
素源としてラットレンズのホモジネートを、基質として
グリセルアルデヒドを、補酵素としてＮＡＤＰＨを用
い、Abram N. Brubaker et al., J. Med. Chem. 29, 10
94-1099, (1986)に従って本発明化合物のアルド−ス還
元酵素阻害活性を測定した。実験法１０ｍＭＤ，Ｌ−グリセロアルデヒド、０.４ＭＬｉ₂
ＳＯ₄、および阻害物質（ＲＦ−３１９２Ａ，Ｂ，Ｃ，
または標品）を含むリン酸緩衝液に酵素源としてのラッ
トレンズホモジネ−トトリホスホピリジンヌクレオチド
（還元型）を０.１ｍＭになるように加えた。３４０ｎ
ｍでの最初の１分間の吸光度変化を測定し、酵素反応に
対する阻害を測定した。酵素源としてのラットレンズホ
モジネートは、阻害物質を含まない状態での最初の１分
間の吸光度変化が、０.２００ＡＢＳ Unit/min.になる
量を用いた。ラットレンズホモジネ−ト調製法ラットの眼球２０個よりレンズを取り出し，これを５ｍ
Ｍメルカプトエタノ−ル４ｍｌ中、ガラス−テフロンホ
モジェナ−トを用いてホモジナイズし、これを４℃で１
０,０００ｒｐｍで２０分間遠心，遠心上清を酵素源と
して用いた．

【００２０】(2) 阻害活性: 標品としてイタリア，アイ
ルランドで市販されているトルレスッタト(Tolrestat)
を用いた。測定結果を表１に示す。

【表１】

【００２１】

【発明の効果】上記実施例で詳述したように、本発明化
合物はアルド−ス還元酵素阻害活性を有するので、糖尿
病性神経障害、糖尿病性白内症、糖尿病性角膜症、糖尿
病性網膜症、糖尿病性腎症などの糖尿病性合併症の有用
な治療薬となりうると考えられる。

【化１５】

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年２月２２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００４

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、以上の事
柄を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、不完全菌 Chaetomel
la circinoseta RF-3192の培養液中にＡＲ阻害活性を
有する物質を見い出し、発酵、抽出、分離精製を行な
い、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、
式（Ｉ）：

【化８】を表わす。］で示される化合物またはその塩に関するも
のである。式（Ｉ）で示されるこの発明化合物は、下記
式で示される（Ｉａ）〜（Ｉｃ）の互変異性型をとり得
るが、式（Ｉ）の型の化合物がより安定的に存在する。
しかし他の互変異性型化合物の存在を否定するものでは
ない。

【化９】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００９

【補正方法】変更

【補正内容】

【化１２】また、ＲＦ−３１９２Ｃは下記に示す（ＩＣａ）〜（Ｉ
Ｃｄ）および（ＩＣ^’）の互変異性体の構造をとり得る
が、（ＩＣ）およびその対掌体である（ＩＣ^’ ）の型
の化合物が安定的に存在する。

【化１３】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１０】ＲＦ−３１９２Ａ 1)ＳＩＭＳ：m/z 397 [M+1]⁺ ＨＲ−ＳＩＭＳ：C₂₁H₁₆O₈＋H として計算値；397.0923 実測値；m/z 397.0928 2)¹³Ｃ−ＮＭＲ (d₆-Acetone) ppm：28.28 t, 33.01 t,
98.65 d, 104.85 d, 105.55 d, 109.29 s, 115.92 s,
123.38 s, 130.75 dx2, 117.06 dx2, 165.41 s,124.58
s, 132.17 s, 152.92 s, 160.03 s, 162.72 s, 172.12
s, 173.77 s, 191.67 s 3)構造式

【化１５】

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１７】c)ＲＦ−３１９２Ａの分離精製上記で粗物質（crude-2）から得られた粗物質（crude
A）４.０３ｇをカラムクロマトグラフィ−（カラム；MC
I GEL CHP-20P (75〜150μm)，300ml (三菱化成社製)，
溶媒；（アセトニトリル：ＴＨＦ＝１：１）：０.１％
ＴＦＡ＝３：７）で分離精製し、ＲＦ−３１９２Ａの粗
精製物１.０８８ｇを得た。この粗精製物をカラムクロ
マトグラフィ−（カラム；LiCroprep RP-18 (25〜75μ
m)，20φ×500mm (メルク社製)，溶媒；アセトニトリ
ル：０.１％ＴＦＡ＝２０：８０）で分離精製し、ＲＦ
−３１９２Ａの精製物４５ｍｇを得た。この精製物をさ
らにカラムクロマトグラフィ−（カラム；LiCroprep RP
-18 (25〜75μm)，20φ×500mm (メルク社製)，溶媒；
メタノ−ル：０.１％ＴＦＡ＝４０：６０）で精製し、
得られた精製物３９ｍｇをもういちどカラムクロマトグ
ラフィ−（カラム；LiCroprep RP-18 (25〜75μm)，20
φ×500mm (メルク社製)，溶媒；アセトニトリル：０.
１％ＴＦＡ＝２０：８０）にかけ、精製物１０ｍｇを得
た。しかしこの精製物も完全にピュアなものではなかっ
たので、これをさらにＨＰＬＣ（カラム；COSMOSIL 5C1
8，20φ×150mm (ナカライテスク)，溶媒；アセトニト
リル：０.１％ＴＦＡ＝２０：８０）で精製してＲＦ−
３１９２Ａのオレンジ色非結晶粉末６.７ｍｇを得た。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１９】４．アルドーズ還元酵素阻害活性 (1) アルドース還元酵素阻害作用アッセイシステム：酵
素源としてラットレンズのホモジネートを、基質として
グリセルアルデヒドを、補酵素としてＮＡＤＰＨを用
い、Abram N. Brubaker et al., J. Med. Chem. 29, 10
94-1099, (1986)に従って本発明化合物のアルド−ス還
元酵素阻害活性を測定した。実験法１０ｍＭＤ，Ｌ−グリセロアルデヒド、０.４ＭＬｉ₂
ＳＯ₄、および阻害物質（ＲＦ−３１９２Ａ，Ｂ，Ｃ，
または標品）を含むリン酸緩衝液に酵素源としてのラッ
トレンズホモジネ−トトリホスホピリジンヌクレオチド
（還元型）を０.１ｍＭになるように加えた。３４０ｎ
ｍでの最初の１分間の吸光度変化を測定し、酵素反応に
対する阻害を測定した。酵素源としてのラットレンズホ
モジネートは、阻害物質を含まない状態での最初の１分
間の吸光度変化が、０.２００ＡＢＳ Unit/min.になる
量を用いた。ラットレンズホモジネ−ト調製法ラットの眼球２０個よりレンズを取り出し，これを５ｍ
Ｍメルカプトエタノ−ル４ｍｌ中、ガラス−テフロンホ
モジェナ−トを用いてホモジナイズし、これを４℃で１
０,０００ｒｐｍで２０分間遠心，遠心上清を酵素源と
して用いた．

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２０

【補正方法】変更

【補正内容】

【表１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 17/04 8931−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） 7804−4Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（Ｉ）：【化１】［式中、R₁は (CH₂)₂COOH 、R₂はフェニルまたはｐ−ヒ
ドロキシフェニル、またはR₁とR₂が一緒になって、【化２】を表わす。］で示される化合物またはその塩。
【請求項２】ケトメラシルシノセタ（Chaetomella
circinoseta）種に属し、請求項１記載の化合物を産生
する微生物。
【請求項３】ケトメラシルシノセタＲＦ−３１９
２（Chaetomella circinoseta RF-3192）（FERM BP-372
4）である請求項２に記載の微生物。
【請求項４】ケトメラ（Chaetomella）属に属し、請
求項１記載の化合物を産生する微生物を培養し、該培養
培地から該化合物を採取することを特徴とする該化合物
の製造法。
【請求項５】請求項１記載の化合物を有効成分として
含有するアルド−ス還元酵素阻害剤。