KR20080019928A

KR20080019928A - 질소원으로 요소를 이용한 마이코페놀산 대량 생산 방법

Info

Publication number: KR20080019928A
Application number: KR1020060082477A
Authority: KR
Inventors: 노용택
Original assignee: 충청북도
Priority date: 2006-08-29
Filing date: 2006-08-29
Publication date: 2008-03-05
Also published as: WO2008026883A1

Abstract

본 발명은 질소원으로 요소를 이용한 마이코페놀산 대량 생산 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 배양 배지조성물이 증류수 1L 당 요소(urea)를 3 내지 9g 포함하고, 동화 가능한 탄소원, 질소원 및 미량원소를 함유하는 배지에서 Penicillium brevi-compactum 균주를 배양하는 것을 특징으로 하는 마이코페놀산 대량 생산방법에 관한 것이다.

마이코페놀산, Penicillium brevi-compactum, 요소

Description

질소원으로 요소를 이용한 마이코페놀산 대량 생산 방법{Process For Mass Production Of Mycophenolic Acid By Using Urea As Nitrogen Source}

도 1 은 마이코페놀산의 구조식을 보인다.

본 발명은 질소원으로 요소를 이용한 마이코페놀산(Mycophenolic acid; MPA)을 대량 생산하는 방법 및 마이코페놀산 대량 생산용 배지 조성물에 관한 것이다.

마이코페놀산은 Pencillium glaucum 의 발효 산물로써 1896년에 처음으로 보고 되었으며[E.L. Jones et al,;J. Invest. Dermatol. 65, 537 (1975)], 그 구조는 1952년에 결정되었다. 마이코페놀산은 처음에는 항세균, 항진균 작용이 있는 것으로 알려졌었으나 후에 항바이러스, 암조직 성장억제 작용, 면역거부반응 억제 작용이 있는 것으로 보고 되었다. 최근 마이코페놀산은 면역억제제로 동종 심장, 신장 이식자의 거부 반응 예방약으로 미국 FDA 승인을 받고 간 이식과 자가 면역성 또는 면역에 의한 염증성 질병인 용혈성 빈혈, 수포성 천포창, 염증성 장염, 중증 근무력증, 신장병증, 건선, 류머티스성 관절염 등에도 효과가 있는 것으로 알려져 있고 지속적으로 임상적인 응용이 연구되고 있다.

이러한 생체 내에서의 마이코페놀산의 다양한 활성은 선택적, 가역적, 비경쟁적으로 이노신 모노포스페이트 디하이드로지나제 (inosine monophosphate dehydrogenase; IMPDH)를 저해함으로써 퓨린(purine) 생합성의 de novo 경로를 차단하고, DNA합성을 억제함으로써 작용하는 것으로 보고 되었다(de novo 경로 : 아미노산에서 GMP를 생산하는 생합성 경로 중의 하나). IMPDH가 차단되면 세포내 구아노신 뉴클레오티드(guanosine nucleotides)의 결핍이 일어나는 반면, ATP는 영향을 받지 않는다. 또한 마이코페놀산은 T 림프구, B 림프구의 증식을 억제하고 B 림프구에 의한 체액성 면역 반응을 억제한다. 그러나 시토킨(IL-1과 IL-2)생성을 억제하지 않는다. 림프구가 다른 세포에 비해 GMP 합성에 있어 de novo 경로에 의존적이므로 마이코페놀산은 림프구에 더 선택적인 효과를 나타낸다.

상기 마이코페놀산의 이화학적 특성은 다음과 같다.

화학명은 6-(4-hydroxy-6-methoxy-7-methyl-3-oxo-5-isobenzofranyl)-4-methyl-4-hexenoic acid, 분자식은 C₁₇H₂₀O₆, 분자량 320.34이며 구조식은 다음 화학식 1과 같다

(화학식 1)

이처럼 중요한 마이코페놀산은 미생물 특히 진균을 이용한 발효 생산을 통해서만 생합성 되므로 마이코페놀산 생성균주의 산업적 보존, 배양 및 개량 기술의 개발이 절실히 요구되고 있다.

산업 균주로 많이 사용되는 곰팡이는 진균류로 상동염색체를 갖고 있으며 대립유전자가 존재하고 유전자 개수나 크기가 원핵세포 미생물인 세균이나 방선균과 비교할 때 매우 크고 복잡하다. 또한 독특한 균사형태의 생장, 포자형성 등의 세포 분화 과정 및 이차대사산물의 생합성 등 복잡한 대사과정을 갖고 있어서 다루기가 어려운 미생물에 속하며, 각 기업체가 보유한 균주는 고유한 특성을 갖고 있어서 고유한 개량 프로토콜 작성과 개량 기술이 개발되어야 한다.

대한민국 특허출원 10-2002-7003830 에서는 마이코페놀산 및 이의 유도체의 제조방법에 대하여 기술되어 있다. 상기 발명에서는 마이코페놀산 생성균주로서 페니실륨 왁스마니 균주를 사용하였고, 구체적으로 균주의 배양 조건에 있어서 질소원, pH 및 배양 온도에 대한 설명이 있으나, 마이코페놀산 생성 균주에 따른 배양의 pH로써 6 내지 7로 기재되어 있고, 구체적인 생산조건의 최적화에 대하여는 기 재가 충분치 않아서 산업적으로 마이코페놀산을 대량 생산하는 경우 그 적용이 충분치 못한 문제가 있었다.

질소(nitrogen)는 세포 건조균체량의 10%에서 14% 정도를 차지한다. 가장 널리 사용되는 질소원은 암모니아나 암모늄염(NH₄Cl, (NH₄)SO₄, NH₄NO₃), 단백질, 펩타이드, 아미노산이다. 질소는 단백질과 핵산의 형태로 세포생장에 이용된다. Azotobacter sp. 나 cyanobacteria 와같은 일부 미생물은 공기 중의 질소를 고정하여 암모늄을 생성한다. 요소 역시 일부 생물체에 의해 질소원으로 이용된다. 효모추출물이나 펩톤과 같은 유기질소원은 암모늄염보다 값이 비싸다.

대부분의 산업용 미생물들은 무기 또는 유기 어느 쪽의 질소도 이용할 수가 있다. 무기질소는 암모니아가스, 암모늄염, 질산염 등의 형태로서 공급된다(Hunter, 1972). 암모니아는 pH 제어로 사용되어 왔으며, 또한 Saccharomyces cerivisiae를 사용한 인간의 혈청 알부민(serum albumin)의 상업적 생산을 위한 한정된 배지에서 중요한 질소원으로도 이용되어 왔다(Collins, 1990).

황산암모늄을 사용하면 암모늄이온은 미생물에 의해서 소비되어 황산이온이 남기 때문에 배양액은 산성화된다. 반면에 질산염을 사용하면, 이것이 소비되면서 알칼리 쪽으로 기울어지게 된다.

질산암모늄의 경우, 배양 초기에는 암모니아가 소비되고 질산염은 소비가 억제되기 때문에 배양액은 산성화되는데, 암모니아가 거의 소비되면 질산염 질소가 대신 소비되기 시작하여 배양액은 알칼리 쪽으로 기울어진다(Morton과 MacMillan, 1954). 이 경우의 예외로는 Gibberella fujikuroi 의 대사이다(Brow 등, 1961, 1964). 질산이온의 존재하에서는 이 균의 암모니아 동화작용(assimilation)은 pH 2.8~3.0에서 억제되며, pH가 상승해서 암모니아의 동화가 재개되기까지는 질산이온의 이용이 계속되게 된다

질산염을 암모늄이온으로 환원하는 질산염 환원효소(nitrate reductase)는 암모니아의 존재하에서 억제(repression)를 받는다(Brown 등, 1974). 그렇기 때문에 질소원으로서는 암모니아 또는 암모늄이온이 사용되는 경우가 많다. 어떤 곰팡이의 연구결과 암모늄이온은 일반적 및 특정한 아미노산 투과효소(permease)에 의한 아미노산 섭취를 억제한다고 한다(Whitaker, 1976). 또한, Aspergillus nidulans 에서는 암모니아는 알칼리성 및 중성 protease(단백질 분해효소)의 생성을 조절한다고 한다(Cohen, 1973). 따라서, 질소공급원이 혼합물인 경우는 개개의 질소화합물이 각각으로 대사조절에 관여하고 있기 때문에, 어떤 한 질소화합물이 동화되어 없어질 때까지 그 요소의 선택적인 동화가 있게 된다.

많은 미생물들에 의한 항생물질 생산은 배양배지에서의 질소원의 농도와 그 형태에 따라 영향을 받는 것으로 보고되었다(Aharonowitz, 1980). 항생물질 생산은 질소원(예 ; NH₄ ⁺, NO₃ ^-, 어떤 아미노산)이 빠르게 이용되면 억제될 수 있다. 항생물질생산은 대부분의 질소원이 소비되고 난 후에야, 배양액 내에서 증가하기 시작한다. 진탕 플라스크 배지실험에서 약산의 염(예 ; ammonium succinate)을 질소원으로 사용하면, 암모늄 클로라이드(ammonium chloride)나 황산염을 질소원으로 사용 하였을 때 염소이온이나 황산이온 때문에 생기는 강한 pH 변화를 막을 수 있다. 이렇게 하면 완충배지에서 인산을 더 낮은 농도에서 이용할 수 있게 한다. 높은 인산염 농도는 많은 2차 대사산물의 생산을 억제한다.

지베렐린(Gibberellin) 생산에서 배지의 질소원은 서로 다른 지베렐린(gibberellin) 생산과 각각의 형태의 상대적 비율에 영향을 미치는 것으로 나타났다(Jefferys, 1970).그 외에 여러 가지 공정의 특징이 질소원의 선택에 영향을 준다. Rhodes(1963)는 그리세오풀빈(griseofulvin) 생산에서의 최적질소농도는 종균(seed)이라든지 발효조의 종류에 따라서 약간 차이가 난다고 발표하였다.

복합질소원 중 어떤 것들은 미생물이 활용할 수 없고, 하류부문공정과 폐수처리에서 문제를 야기할지도 모르기 때문에, 이것도 기질을 최종적으로 선택하는데 중요한 인자가 될 수 있다. 따라서, 마이코페놀산을 산업적으로 대량생산하기 위하여 배지의 생산 조건을 최적화할 필요가 있다. 본 발명자는 질소원 중에서 질소원인 요소(urea)가 마이코페놀산 생성에 가장 우수한 질소원인 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 곰팡이를 이용한 발효를 통하여 마이코페놀산을 산업적으로 대량 생산하기 위한 발효배지 조성물 및 이를 이용한 마이코페놀산 대량 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 마이코 페놀산 대량 생성용 발효배지 조성물을 제공한다. 증류수 1L 당 포도당 100 -120 g, 요소 3 내지 9 g, K₂HPO₄ 4 내지 6g, MgSO₄ㅇ7H₂O 0.5 내지 2 g, 효모추출물 0.5 내지 2 g, 미량원소 저장용액(FeSO₄ㅇ7H₂O 0.1g, CuSO₄ㅇ5H₂O 0.015g, ZnSO₄ㅇ7H₂O 0.1g, MnSO₄ㅇ4H₂O 0.01g, (NH₄)₆Mo₇O₂₄ㅇ4H₂O 0.001g을 5N-HCl 1ml가 첨가된 증류수 100ml에 녹인 것) 1 내지 3 ml 이다. 상기 조성의 하한값 이하에서는 영양원의 부족으로 마이코페놀산 생산을 효과적으로 달성하기 어려우며, 상기 조성의 상한값 이상은 영양원의 과다에 따른 저해, 삼투압 증가에 따른 수분 부족 및 경제적으로 비용이 과다하게 들어가게 된다.

본 발명의 또 다른 면에서는, 상기한 발효배지 조성물을 이용한 마이코페놀산 대량생산방법을 제공한다. 마이코페놀산은 하기 화학식 3의 마이코페놀산 및 이의 유도체이다.

(화학식 3)

상기에서 R₁ 은 메틸 또는 하이드록시메틸이고, R₂는 하이드록시기 또는 아미노기이다.

보다 상세하게는 배양 조건 중 배양액에 질소원으로 요소 3g/L 내지 9g/L, 동화 가능한 탄소원, 질소원 및 미량원소를 함유하는 배지에서 Penicillium brevi-compactum 균주를 배양하는 것을 특징으로 하는 마이코페놀산의 대량 생산방법에 관한 것이다.

본 발명에 따라 생산되어진 마이코페놀산은 공지의 방법을 통하여 유도체화 되어질 수 있다(참고문헌 한국특허출원번호 특1987-0014353호). 임상적으로 사용되는 마이코페놀산의 순도는 95% 이상이며 용해성은 에탄올에는 잘 녹지만 물에는 녹지 않는 성질을 갖고 있다.

마이코페놀산이 실제 경구용으로 사용될 경우에는 흡수를 위하여 마이코페놀레이트 모페틸(Mycophenolate Mofetil; 이하 MPM이라 한다)로 간단히 에스테르화시켜 사용된다.

MPM은 전구약물(prodrug)으로서 복용 후 체내에서 신속히 흡수되어 활성형인 마이코페놀산으로 전환된다. MPM은 미국의 Syntex사에서 1987년 면역억제제로 개발되어 물질특허를 취득하였고 스위스의 Roche사에 판권이 양도되어 Cellcept란 상품명으로 판매되고 있다.

상기 MPM의 이화학적 특성은 다음과 같다.

화학명은 2-morpholinoethyl(E)-6-(1,3-dihydro-4-hydroxy-6-methoxy-7- methyl-3-oxo-5-isobenzofranyl)-4-methyl-4-hexenoic acid, 분자식은 C₂₃H₃₁NO₇, 분자량은 433.50이며 구조식은 다음과 화학식 2와 같다.

(화학식 2)

MPM은 주로 장, 콩팥 및 간 이식에 있어서 다기능성 면역억제제로 사용되고 있으나, 최근에는 이중 사슬 DNA에 대한 항체 생성으로 야기되는 전신성 홍반성 루푸스가 치료 후에도 6개월내 임상적 재발이 빈번한데 부신피질 호르몬제를 투여로 예방은 하지만 부작용이 있는 반면 MPM이 부신피질 호르몬제과 관련된 부작용 없이 임상적 재발을 예방할 수 있다는 보고가 있었다(한국과학기술정보연구원(KISTI, 해외과학기술동향, 2003.6.2. 의학). 이 처럼 이중 사슬 DNA에 대한 항체 농도의 상승 후에 MPM을 투여하여 환자들을 괴롭히지 않으면서 항이중 사슬 DNA 농도와 B 세포 활성도를 감소시키고, 전신성 홍반성 루푸스 환자의 임상적 재발의 발생을 예방할 수 있다는 최근 보고는 지속적인 임상 실험을 통하여 마이코페놀산의 다기능성 치료제로서의 가치가 폭발적으로 증가될 전망이 있음을 시사하고 있는 것이다.

본 발명에서는 마이코페놀산 생성균주로서 Penicillium brevi-compactum 균 주를 사용하는데, 바람직하게는 수탁기관에 기탁된 균주인 Penicillium brevi-compactum ATCC46514을 사용한다.

이하 본 발명을 보다 구체적으로 이해할 수 있도록 실시예를 들어 설명한다. 그러나 다음의 실시예로써 본 발명의 취지를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 질소원으로 요소를 포함한 배양배지에서 마이코페놀산(MPA) 대량 생산 배지조성

포도당(탄소원)의 농도는 12%로 하고 배양 시간을 7일로 하여 실험하였다. 비교분석은 pH, PMV, MPA 활성(HPLC분석)를 통해 분석하였다. 사용된 배지 기본조성은 이미 기존에 알려진 생산 배지인 (표 1)를 이용하였고, 배양 조건은 250ml 배플 플라스크에서 7일간 23℃, 150rpm에서 배양되었다.

질소원의 첨가 농도는 각 질소화합물의 질소 함량을 감안하여 NH₄NO₃ 5.2g/L(1.82g/L as N)를 기준으로 대강 비슷하게 무기질소원은 5g/L씩 첨가하였고, 유기질소원은 10g/L씩 첨가하였다.

<표 1> 마이코페놀산 생산배지의 기본 조성

성 분	함량 (g/L)
포도당	120
NH4NO3 (대조구)	5.2
K2HPO4	5
MgSO4ㅇ7H2O	1
효모 추출물	1
미량원소	2ml

※ 포도당은 별도로 멸균되어서 배지조성물에 첨가되었다.

살균하면 pH 상승을 일으키는 요소(urea)의 경우는 살균전후의 pH를 측정하였더니 살균전 pH6.05였던 것이, 살균후 pH6.63으로 상승하여 예상했던 것처럼 많이 올라가지 않은 것이 확인되었다. 이는 배지 조건이 다른 배지와 달리 산성에 가까워 요소의 분해가 덜 일어난 것으로 추정된다.

표 2를 보면 대조구인 NH₄NO₃를 기준으로 보다 높은 생산성을 보이는 것으로는 무기질소원에서 요소(urea)가 있었는데 플라스크 규모에서 1,000mg/L의 생산성을 보인 요소의 경우는 매우 획기적인 무기질소원의 발견이라고 할 수 있다. P. brevicompactum은 우레아제(urase) 효소를 갖고 있어서 요소를 분해하여 NH₄ ⁺를 만들어 이용하는데 분해속도가 느려서 저절로 NH₄ ⁺에 의한 대사저해(catabolite repression)을 해제해 주는 것으로 생각된다. 이런 점에서 질산(nitrate)염과 요소(urea)을 적당히 배합하여 사용하면 지금의 NH₄NO₃보다 좋은 결과가 예상된다. 또 다른 요인으로는 요소(urea)는 자화 과정에서 NH₄ ⁺나 NO₃ ^-처럼 배양의 pH의 급격한 변화를 일으키지 않아서 산성 pH에 의한 생장 저해를 방지할 수 있는 배지 요소로도 생각된다.

P. brevicompactum의 경우 무기질소원 NH₄ ⁺와 NO₃ ^-에 이용성이 좋아서 (NH₄)₂SO₄나NH₄Cl도 생산성이 나쁘지는 않아야 하는데 KNO₃의 경우 MPA가 그래도 생합성되었지만 (NH₄)₂SO₄와NH₄Cl가 MPA 생합성을 거의 하지 못한 것은 초기에 NH₄ ⁺이 이용되면서 급강하된 pH에 의하여 생육이 심하게 저해를 받은 것으로 판단된다. 배양이 종료된 7일후에도 배양액 pH값이 2.0 이하이고 PMV가 낮은 것을 보면 그 원인을 알 수 있다. 따라서 이러한 강산의 암모늄염을 이용할 경우에는 CaCO₃같은 완충제를 사용하는 방안도 고려해야 할 것이다.

<표 2> 페니실리움 브레비콤팍툼 ATCC46514에 의한 무기 및 유기 질소안에서 생장 및 마이코페놀산 생산

질 소 원	pH	PMV (%)	MPA(mg/L)	비고
NH4NO3	5.81	23	205	대조구
KNO3	4.27	20	165
(NH4)2SO4	1.96	14	68
NH4Cl	1.85	12	51
요소	5.96	30	1,008

※ 첨가된 무기질소원의 농도는 5g/L 이다.

<실시예 2> 마이코페놀산 생성을 위한 최적 요소 농도 결정

무기질소원 1차 실험에서는 기존에 알려진 무기질소원 NH₄NO₃의 농도 5.2g/L가 질소량으로는 1.82g 질소/L 에 해당 되므로 그것을 기준으로 각 무기질소원의 농도가 서로 비슷한 5g/L에서 그 효과를 본 것이다. 요소(Urea) 5g/L가 첨가될 경우 대조구에 비하여 약 3.3배의 생산성 향상 효과를 얻었는데 최적농도를 확인하기 위하여 표 3과 같이 다시 2차실험을 실시하였다.

표 3에서 보는 바와 같이 요소(urea) 농도 3-9g/L 범위에서 MPA의 생산성이 모두 대조구인 NH₄NO₃에 비하여 2-3배 범위에서 높았다. 따라서 요소(urea)는 실험으로 확인된 3-9g/L 범위내에서는 획기적인 MPA 생산 증대 효과를 갖고 있는 무기질소원으로 확인되었으며, 가장 최적의 농도는 5g/L라고 할 수 있다.

<표3> 페니실리움 브레비콤팍툼 ATCC46514의 생장 및 마이코페놀산 생성에 대한 요소 농도의 효과

질소원	pH	PMV (%)	MPA(mg/L)	비고
NH4NO3 5.2g/L	5.43	21	205	대조구
Urea 3g/L	5.47	21	418
Urea 5g/L	5.89	28	1,020
Urea 7g/L	6.65	25	812
Urea 9g/L	7.95	21	768

본 발명에 따라 Penicillium brevi-compactum을 이용한 마이코페놀산 생산방법에 있어서, 질소원으로 요소를 이용할 경우, 마이코페놀산을 고효율적으로 생산할 수 있어서, 산업적으로 매우 유용하다.

Claims

곰팡이 균주를 이용하여 하기 화학식 3의 마이코페놀산 및 이의 유도체를 생산하는 방법에 있어서,

(화학식 3)

(여기에서 R₁은 메틸 또는 하이드록시메틸이고, R₂는 하이드록시기 또는 아미노기이다.)

상기 균주로 Penicillium brevi-compactum을 이용하고, 통상의 동화 가능한 탄소원 및 미량원소를 함유하는 배양액조성에 있어서, 무기질소원으로 3g/L 내지 9g/L의 요소(urea)을 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코페놀산 대량 생산방법.
제 1 항 에 있어서 상기 요소(urea)의 농도가 4 내지 6 g/L 인 것을 특징으로 하는 마이코페놀산 대량 생산방법.
제 1 항에 있어서, 상기 배양액 조성이 증류수 1L 당 포도당 100 -120 g, 요소 3 내지 9 g, K₂HPO₄ 4 내지 6g MgSO₄ㅇ7H₂O 0.5 내지 2 g, 효모추출물 0.5 내지 2 g, 미량원소 저장용액(FeSO₄ㅇ7H₂O 0.1g, CuSO₄ㅇ5H₂O 0.015g, ZnSO₄ㅇ7H₂O 0.1g, MnSO₄ㅇ4H₂O 0.01g, (NH₄)₆Mo₇O₂₄ㅇ4H₂O 0.001g을 5N-HCl 1ml가 첨가된 증류수 100ml에 녹인 것) 1 내지 3 ml인 것을 특징으로 하는 마이코페놀산 대량 생산방법.
증류수 1L 당 포도당 100 -120 g, 요소 3 내지 9 g, K₂HPO₄ 4 내지 6g MgSO₄ㅇ7H₂O 0.5 내지 2 g, 효모추출물 0.5 내지 2 g, 미량원소 저장용액(FeSO₄ㅇ7H₂O 0.1g, CuSO₄ㅇ5H₂O 0.015g, ZnSO₄ㅇ7H₂O 0.1g, MnSO₄ㅇ4H₂O 0.01g, (NH₄)₆Mo₇O₂₄ㅇ4H₂O 0.001g을 5N-HCl 1ml가 첨가된 증류수 100ml에 녹인 것) 1 내지 3 ml인 마이코페놀산 생산 배지 조성물.