CN113156009B - 高效液相色谱分析拉莫三嗪的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种高效液相色谱分析拉莫三嗪有关物质的方法,其采用反相高效液相色谱柱,以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填料,以甲醇为流动相A:用pH值4.2‑5.0的0.2‑0.8%三乙胺溶液为流动相B,采用梯度洗脱。本发明的方法能同时检测拉莫三嗪相关的工艺杂质和降解杂质,运行时间较短,基线相对平缓,主成分与各杂质分离度理想,具有较好的专属性、稳定性和精确度。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域,具体涉及一种用高效液相色谱评价药物质量的方法。
背景技术
拉莫三嗪是一种苯三嗪类广谱抗癫痫药,适用于12岁以上儿童及成人癫痫的一线治疗药物,1990年最先在爱尔兰上市,2007年在中国上市。
拉莫三嗪在合成和储存过程中会产生多种工艺杂质和降解杂质,具体见表1。
表1拉莫三嗪已知杂质
《欧洲药典》(EP8.0/EP9.0/EP10.3版)拉莫三嗪有关物质方法与《英国药典》(BP2017/BP2018/2021版)拉莫三嗪有关物质相同。不足之处:均采用两个不同的色谱系统分别测定相关的杂质,拉莫三嗪与相邻杂质能较好分离,但该方法梯度运行的基线有较大的波动,在梯度基线变化较大的地方有杂质出峰进而影响该杂质检测的准确性。《美国药典》(USP38/USP40/USP43)对拉莫三嗪原料药与片剂的有关物质采用不同的液相检测方面分别偏重于工艺杂质或降解杂质的检测,两个液相方法均不能同时有效检出拉莫三嗪相关的工艺杂质和降解杂质。黄诺哲等(HPLC法测定拉莫三嗪中的有关物质.药物分析杂志2020;40(03):495-501.)参考EP9.0药典中拉莫三嗪检测方法,把两个液相方法合并为一个液相方法,虽能同时检测杂质B、杂质C、杂质D,但对杂质G与某氧化降解杂质的分离度不理想,对工艺杂质2,3-二氯苯甲酰氰、2,3-二氯苯甲酰氯和可能的降解杂质E等未能有效检出,由于常用色谱柱的耐受PH值范围为2-10,该方法流动相调PH值至2,对常用色谱柱的损伤较大,且流动相中使用固态的磷酸二氢钾配置,容易在高有机相或低温环境中析晶堵塞液相系统。
陈司汉等(HPLC法测定拉莫三嗪片的含量,北方药学2014年第11卷第7期,P2页)和夏锦辉等(拉莫三嗪片有关物质测定方法研究,环渤海第一届暨天津市第十九届色谱学术报告会-仪器展览会文集,2010年9月)报导了对拉莫三嗪片有关物质的测定研究,根据这些检测方法,拉莫三嗪主峰与杂质B的分离度不理想,也没有实现有效地同时检测工艺杂质和降解杂质。
发明内容
本发明提出一种高效液相色谱分析拉莫三嗪有关物质的方法,其采用如下检测条件:
采用反相高效液相色谱柱,以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填料,以甲醇为流动相A:用磷酸调节pH值至4.2-5.0的0.2-0.8%的三乙胺溶液为流动相B,采用梯度洗脱,梯度洗脱程序如下表所列:
表2
在一个优选实施方式中,制备供试品溶液的稀释液是甲醇与0.1mol/L盐酸溶液按体积比20:80的混合溶液。
在一个优选实施方式中,系统适用性溶液的制备包括:取拉莫三嗪适量,加入氢氧化钠溶液,加热适宜时间后用盐酸溶液中和,加入杂质B对照品溶液,再用所述稀释液稀释至所需浓度。
在一个更优选的实施方式中,系统适用性溶液的制备包括:系统适用性溶液的制备包括:取拉莫三嗪适量,加适量6mol/L氢氧化钠溶液,置80-100℃加热0.5-3小时,用6mol/L盐酸溶液中和,再加入适量杂质B对照品溶液,用所述稀释液稀释至每1ml中含拉莫三嗪0.3-0.5mg、杂质B 0.03-0.05mg的混合溶液。
用于本发明的检测器可以采用二极管阵列检测器或紫外检测器中,检测波长为210-275nm,优选地为230nm。流速范围为0.6ml/min~1.2ml/min,优选0.8ml/min。
本发明中,色谱柱柱温为35-45℃,优选40℃。
根据本发明检测有关物质的方法能检出杂质B、C、D、E和可能存在的工艺杂质(2,3-二氯苯甲酰氯、2,3-二氯苯甲酰氰、缩合物),对氧化降解杂质分离较好,检出杂质数目为15个,方法运行时间较短,基线相对平缓。主成分与特定杂质、工艺杂质及降解杂质分离均较好,方法专属性较好。本发明方法研究出校正因子法定量杂质B、杂质C、杂质E,有效节约了从国外购买杂质的费用。
本发明的方法不仅可以用于拉莫三嗪原料药合成过程中的杂质监测的分析检测,还可以用于拉莫三嗪原料药以及各种制剂(比如拉莫三嗪片、拉莫三嗪缓释片、拉莫三嗪分散片、拉莫三嗪干混悬剂、拉莫三嗪胶囊剂、拉莫三嗪软胶囊剂等剂型)的有关物质检测与监测。
附图说明
图1是根据本发明方法对拉莫三嗪相关杂质混合对照品溶液检测的色谱图,图中,①.杂质B;②.拉莫三嗪;③.杂质C;④.杂质E;⑤.缩合物;⑥.杂质D;⑦.2,3-二氯苯甲酰氰。。
图2是根据本发明方法对拉莫三嗪氧化降解样品进行系统适应性测试的色谱图。
图3是本发明条件下拉莫三嗪的线性关系图。
图4是本发明条件下杂质B的线性关系图。
图5是本发明条件下杂质C的线性关系图。
图6是本发明条件下杂质E的线性关系图。
图7是本发明条件下破坏降解试验专属性色谱图,图中,A.酸破坏;B.碱破坏;C.氧化破坏;D.高温破坏;E.高温破坏;F.光破坏;①.杂质B;②.拉莫三嗪;③.杂质C;④.杂质E。
具体实施方式
色谱条件
在本发明的典型实施例中,色谱条件为:
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶柱,4.6×250mm,5μm;
流动相A:甲醇;
流动相B:用磷酸调节pH值至4.5的0.5%三乙胺溶液;
流速:0.8ml/min;
波长:波长,230nm;
柱温:40℃;
进样量:20μl;
梯度程序:表2.
供试品与对照品溶液的制备
为制备供试品溶液和对照品溶液,本发明的实施例使用的稀释液是甲醇—0.1mol/L盐酸溶液(20:80)混合溶液。试验显示,使用该稀释液稀释的样品,室温下放置24小时也稳定。
为制备供试品溶液,取拉莫三嗪制剂粉末适量(约相当于拉莫三嗪20mg),精密称定,加入稀释液适量,使其溶解并稀释成每1ml中约含拉莫三嗪0.4mg的溶液,摇匀,滤过,取续滤液。
对照溶液精密量取供试品溶液适量,加稀释液定量稀释制成每1ml中约含拉莫三嗪0.8μg的溶液。
杂质B对照品溶液取杂质B对照品适量,加稀释液溶解并稀释成每1ml中约含杂质B0.1mg的溶液。
系统适用性溶液取拉莫三嗪适量,加适量6mol/L氢氧化钠溶液,置90℃加热约1小时,用6mol/L盐酸溶液进行中和,再加入适量杂质B对照品溶液,用稀释液稀释至每1ml中约含拉莫三嗪0.4mg、杂质B 0.04mg的混合溶液。该系统适应性溶液制备方法可以产生杂质C,解决国内难以获得杂质C的不足。
系统适应性
以上述方法获得各试液,取20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,杂质B峰相对保留时间约为0.8,与拉莫三嗪峰分离度应达到1.5,相对保留时间1.0~2.0之间的主要降解峰(杂质C)的相对保留时间约为1.7。
精密量取供试品溶液及对照溶液各20μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰,杂质B(相对保留时间约0.8)按校正后的峰面积计算(乘以校正因子2.7),不得大于对照溶液主峰面积(0.2%),杂质C(相对保留时间约1.7)按校正后的峰面积计算(乘以校正因子1.4),不得大于对照溶液主峰面积的2.5倍(0.5%),杂质E(相对保留时间约2.4)按校正后的峰面积计算(乘以校正因子2.1),不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.10%),其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积(0.2%),各杂质峰面积的和按校正后的峰面积计算不得大于对照溶液主峰面积的3.75倍(0.75%)。
取拉莫三嗪、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E(EP杂质D)、缩合物、2,3-二氯苯甲酰氰各适量,以甲醇溶解,用稀释剂稀释成每1ml约含拉莫三嗪0.4mg、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、缩合物、2,3-二氯苯甲酰氰各约含1μg的混合液。按照上述色谱条件分析,各成分的分离情况列于表3,测试图谱见图1。
表3.混合液中各组分分离情况
编号 | 成分 | 保留时间(分钟) | 分离度 |
1 | 杂质B | 13.132 | - |
2 | 拉莫三嗪 | 16.137 | 6.8 |
3 | 杂质C | 27.731 | 18.4 |
4 | 杂质E(EP杂质D) | 39.314 | 21.5 |
5 | 缩合物 | 46.606 | 27.1 |
6 | 杂质D | 48.963 | 11.1 |
7 | 2,3-二氯苯甲酰氰 | 50.362 | 6.5 |
在本发明的操作条件下,2,3-二氯苯甲酰氯遇水可降解为2,3-二氯苯甲酸,在色谱检测中,两者表现为同一保留时间色谱峰,故作为同一物质进行控制。
由表3可知,各组分间分离度均大于1.5,专属性良好。
为了获得拉莫三嗪与降解杂质分离情况,采用拉莫三嗪片氧化降解样品考察拉莫三嗪与相邻杂质的分离情况。氧化降解样品的制备方法为:称取拉莫三嗪片(规格:50mg,批号:180402)片粉适量,精密称定,加1ml 30%过氧化氢水溶液,90℃水浴1小时,放至室温,以稀释液溶解并稀释成每1ml约含拉莫三嗪0.4mg的溶液,滤过,取续滤液作氧化降解样品供试溶液。
取氧化降解样品溶液,按照上述方法进行检测,拉莫三嗪与相邻杂质分离较好,各降解杂质间分离度较好,检出杂质个数为15个,测试图谱见图2。
检测限与定量限
取拉莫三嗪对照品(批号:100775-200401)、杂质B对照品(批号:510086-201401)、杂质C对照品(批号:F2L329)、杂质E对照品(批号:L2011011)适量,精密称定,加甲醇溶解并稀释成适当浓度的对照品储备液,精密移取对照品储备液适量,再用稀释液稀释成适当浓度的对照品溶液,按前述方法进样。按信噪比法计算,信噪比约为3:1时浓度为检测限浓度,信噪比约为10:1时浓度为定量限浓度,结果见表4。
表4.有关物质方法定量限、检测限试验结果
线性关系试验
取拉莫三嗪对照品适量,精密称定,加甲醇溶解并稀释成适当浓度的对照品储备液,精密移取对照品储备液适量,加稀释液稀释成一系列浓度的对照品溶液,照前述方法进样,以拉莫三嗪主峰峰面积为纵坐标(Y),拉莫三嗪对照品溶液浓度为横坐标(X),以峰面积Y对浓度X(μg/ml)进行线性回归,线性方程、相关系数见图3。
另取杂质B对照品、杂质C对照品、杂质E对照品同法进行线性试验。线性相关图见图4至图6。
结果表明,本品拉莫三嗪峰面积(Y)与浓度(X)在0.25~5.08μg/ml范围内呈良好的线性相关,线性方程为:Y=1.5309X-0.0013(r=0.9996);杂质B峰面积(Y)与浓度(X)在0.31~6.24μg/ml范围之内呈良好的线性关系,线性方程为Y=0.5741X+0.0246(r=0.9990);杂质C峰面积(Y)与浓度(X)在0.51~5.13μg/ml范围之内呈良好的线性关系,线性方程为Y=1.0182X+0.0557(r=0.9993)。杂质E线性范围为0.08μg/ml~0.82μg/ml,线性方程Y=48400X-686.34(相关系数r=0.9992)。
杂质B和C校正因子的获得
1.相对保留时间确定
分别称取拉莫三嗪对照品(批号:10775-201401)、杂质B对照品(批号:510086-201401)、杂质C对照品(批号:F2L329)适量,精密称定,加甲醇溶解并稀释成适当浓度的对照品储备液;分别精密移取对照品储备液适量,加稀释液稀释成每1ml约含杂质B、杂质C和拉莫三嗪均为0.5μg的混合液。用表5中的色谱柱按照上述条件进行检测,统计杂质B、杂质C相对拉莫三嗪的保留时间在不同色谱柱上的变化情况,其结果如表6所列。
表5.色谱柱情况表
色谱柱 | 品牌 | 填料批号 | 序列号 | 规格 |
1# | Welch | / | / | 250×4.6mm,5μm |
2# | thermo | / | / | 250×4.6mm,5μm |
3# | Agela | / | / | 250×4.6mm,5μm |
4# | Kromasil | 0000146155 | E194132 | 250×4.6mm,5μm |
5# | Kromasil | 0000136152 | E168862 | 250×4.6mm,5μm |
6# | Kromasil | 0000136152 | E168860 | 250×4.6mm,5μm |
表6.不同品牌色谱柱杂质B、杂质C相对拉莫三嗪的保留时间结果
采用不同品牌色谱柱,杂质B相对拉莫三嗪主峰保留时间(RRT)较稳定,均为0.8;杂质C相对拉莫三嗪主峰保留时间(RRT)在1.5~1.7之间变化,其中Agela色谱柱和Kromasil色谱柱的RRT均为1.7。考虑到不同色谱柱对杂质C的相对保留时间影响较明显,采用同一品牌色谱柱测定杂质C的RRT。下面对同一品牌(Kromasil)不同批次填料及不同序列号的色谱柱进行试验,结果见下表7。
表7.同一品牌色谱柱杂质B、杂质C相对于拉莫三嗪保留时间结果
采用上述不同批次填料及不同序列号的Kromasil色谱柱,对杂质B和杂质C进行相对保留时间试验,结果杂质B和杂质C的相对保留时间都较稳定,分别相对拉莫三嗪主峰保留时间(RRT)为0.8、1.7。
2.校正因子的计算
分别称取拉莫三嗪对照品、杂质B对照品、杂质C对照品适量,精密称定,加甲醇溶解并稀释成适当浓度的对照品储备液;分别精密移取对照品储备液适量,加稀释液稀释成一系列浓度的混合对照品溶液,取3根不同色谱柱用前述方法检测,表8给出杂质B、杂质C和拉莫三嗪在不同色谱柱中的线性实验数据,表9给出计算得到杂质B、杂质C的校正因子。
表8.不同色谱柱杂质B、杂质C和拉莫三嗪线性情况表
表9.杂质B、杂质C和拉莫三嗪的线性斜率和校正因子情况表
校正因子(F)计算公式:
按照上述计算公式,杂质B的平均校正因子,FB=2.7,杂质C的平均校正因子为FC=1.4。
杂质E校正因子的获得
1.相对保留时间
取拉莫三嗪和杂质E对照品适量,加甲醇溶解,以稀释剂稀释成每1ml约含拉莫三嗪0.4mg、杂质E(EP杂质D)1μg的混合液,按照前述色谱条件进样分析,其结果见表10。
表10.杂质E相对保留时间结果
2.校正因子
取拉莫三嗪对照品适量,加甲醇溶解,以稀释剂稀释成一系列浓度;另取杂质E对照品适量,加甲醇溶解,以稀释剂稀释成一系列浓度。按照前述色谱条件进样分析,分别以进样浓度作为横坐标,峰面积作为纵坐标进行线性回归,以线性方程斜率比计算杂质E(EP杂质D)相对于拉莫三嗪的校正因子,其结果如下。
校正因子(f)计算公式:
其中:Kα—拉莫三嗪线性方程的斜率
KE—杂质E线性方程的斜率
表11.杂质E校正因子结果
根据拉莫三嗪和杂质E的线性方程斜率及上述校正因子计算公式计算,杂质E相对于拉莫三嗪的校正因子为2.1。
专属性试验结果
试验得出:在本色谱系统中,空白辅料不干扰主成分峰、特定杂质峰的检测;拉莫三嗪峰与杂质B和杂质C分离较好;杂质E与相邻杂质分离度均大于1.5;拉莫三嗪片在6mol/L盐酸溶液、6mol/L氢氧化钠溶液、30%双氧水条件下进行降解试验,降解产物物料平衡系数较好,杂质均能检出,且杂质峰与主成分峰分离较好,主要降解杂质间分离较好;高温试验(60℃、30天)、高湿试验(RH75.3%、30天)、光照试验(4500lx±500lx,30天)条件下,拉莫三嗪片(裸片)较稳定,未产生降解杂质。说明本方法专属性较好,适用于本品有关物质检测。(见图7)
耐用性试验
分别称取拉莫三嗪对照品(批号:100775-200401)、杂质B对照品(批号:510086-201401)、杂质C对照品(批号:F2L329)适量,精密称定,加甲醇溶解并稀释成适当浓度的对照品储备液;精密分别移取对照品储备液适量,加稀释液稀释成适当浓度的混合液,略微调整色谱条件(流动相比例、柱温、流速、盐浓度、pH值、色谱柱),考察拉莫三嗪、杂质B、杂质C的分离情况及相对保留时间改变情况,结果见表12。
表12.耐用性试验结果
上表中所述的初始条件为:流动相甲醇-0.5%三乙胺缓冲溶液(磷酸调pH4.5)(34:66),流速:0.8min/min,柱温:40℃,色谱柱:Kromasil C18250×4.6mm,5μm。
试验结论:有关物质方法在微调流速、更改色谱柱条件下,杂质B相对拉莫三嗪保留时间约为0.8,杂质C相对于拉莫三嗪的保留时间约为1.7;变化柱温对杂质B相对保留时间基本无影响,对杂质C的相对保留时间影响较明显,本方法对柱温较敏感,其他条件耐用性均较好。
精密度试验结果
1.进样精密度:
(1)拉莫三嗪片供试品溶液:连续进样6次,保留时间和峰面积RSD分别是0.17%和0.05%;
(2)对照溶液:连续进样6次,保留时间和峰面积RSD分别是0.02%和1.74%;
(3)杂质B:连续进样6次,保留时间和峰面积RSD分别是0.06%和0.43%;
(4)杂质C:连续进样6次,保留时间和峰面积RSD分别是0.02%和0.52%;
(5)杂质E:连续进样6次,杂质E保留时间和峰面积RSD分别为0.04%和0.56%。
2.重复性
(1)6份供试品溶液均加杂质B(0.2%)和杂质C(0.5%),杂质B和杂质C含量RSD分别为1.92%和1.82%,未检出其他杂质。
(2)杂质B:6份限度浓度溶液(0.2%),含量RSD为1.92%。
(3)杂质C:6份限度浓度溶液(0.5%),含量RSD为1.82%。
3.中间精密度:
(1)6份供试品溶液均加杂质B(0.2%)和杂质C(0.5%),杂质B和杂质C含量RSD分别为1.61%和1.38%,未检出其他杂质。
(2)杂质B:6份限度浓度溶液(0.2%),含量RSD为1.61%;12份限度浓度溶液(0.2%),含量RSD为1.96%。
(3)杂质C:6份限度浓度溶液(0.5%),含量RSD为1.38%;12份限度浓度溶液(0.5%),含量RSD为1.83%。
(4)杂质E:以杂质E限度浓度(0.4μg/ml)加样回收的形式考察,6份供试品溶液,杂质E回收率范围为99.57%~107.11%,于0.1%杂质限度的回收率范围(90%~108%)内,平均回收率为102.45%;回收率RSD为2.50%,小于0.1%杂质限度的重复性RSD要求(小于3%)。
准确度试验
取杂质B对照品(批号:510086-201401)、杂质C对照品(批号:F2L329)适量,精密称定,加适量甲醇溶解并稀释成适当浓度的对照品储备液。
精密移取杂质B、杂质C对照品储备液适量,加入稀释液稀释成每1ml约含杂质B0.8μg,杂质C约2μg的对照品混合溶液,作为杂质对照品溶液。
称取9份拉莫三嗪片细粉(约相当于拉莫三嗪20mg),置50ml量瓶中,加适量稀释液溶解,再分别加对照品储备液1m、2ml、3ml(相当于杂质对照品溶液浓度的50%、100%、150%),加入稀释液稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液。
称取拉莫三嗪片细粉(约相当于拉莫三嗪20mg),置50ml量瓶中,加适量稀释液溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液备用,作为拉莫三嗪样品溶液,照前述方法进样,测得的值作为本试验的本底量。
分别精密量取上述9份供试品溶液、杂质对照品溶液、拉莫三嗪样品溶液,照前述方法检测,按外标法以峰面积计算各供试品溶液中杂质B、杂质C的含量,考察本品的回收率,结果见表13和表14。
表13.杂质B回收率试验结果
表14.杂质C回收率实验结果
结论:9份供试品溶液,杂质B回收率范围94.28%~104.75%,平均回收率为99.44%,回收率RSD为4.31%;杂质C回收率范围93.79%~102.48%,平均回收率为97.80%,回收率RSD为3.35%,杂质B、杂质C符合该限度回收率范围要求,方法回收率较好。
拉莫三嗪片有关物质的检测
取三批拉莫三嗪片(批号:181208、181209、181210),照前述方法检测,结果见表15.
表5拉莫三嗪片中有关物质的检测结果(%,校正因子法)
结论:本发明方法能有效检出相当于主药测试量0.01%限度的杂质C,本发明方法灵敏度高。
本发明确定的色谱方法经验证,其专属性强,能有效分离和检测样品中可能的工艺杂质和降解杂质,采用相对保留时间和校正因子来定量相关杂质,有效减少了需要从国外购买杂质对照品的时间与成本。该色谱方法可用于拉莫三嗪原料药和制剂的有关物质质量控制。
Claims (7)
1.一种高效液相色谱法分析拉莫三嗪有关物质的方法,其特征在于,所述拉莫三嗪有关物质为杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、缩合物和2,3-二氯苯甲酰氰;
所述杂质B的结构式为、杂质C的结构式为、杂质D的结构式为、杂质E的结构式为、缩合物的结构式为、2,3-二氯苯甲酰氰的结构式为;
所述高效液相色谱法包括如下检测条件:
色谱柱为kromasil C18色谱柱,4.6×250mm,5μm;
流动相:以甲醇为流动相A,用磷酸调节pH值至4.5的0.5%三乙胺溶液为流动相B;采用梯度洗脱,梯度洗脱程序如下表所列:
;
制备供试品溶液的稀释液是甲醇与0.1mol/L盐酸溶液按体积比20:80的混合溶液;
采用二极管阵列检测器、紫外检测器中的一种,检测波长为210-275nm;
色谱柱柱温为35-45℃;
流速范围为0.6ml/min~1.2ml/min。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,系统适用性溶液的制备包括:取拉莫三嗪适量,加入氢氧化钠溶液,加热适宜时间后用盐酸溶液中和,加入杂质B对照品溶液适量,再用所述稀释液稀释至所需浓度。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,系统适用性溶液的制备包括:取拉莫三嗪适量,加适量6mol/L氢氧化钠溶液,置80-100℃加热0.5-3小时,用6mol/L盐酸溶液中和,再加入适量杂质B对照品溶液,用所述稀释液稀释至每1ml中含拉莫三嗪0.3-0.5mg、杂质B0.03-0.05mg的混合溶液。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,检测波长为230nm。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,色谱柱柱温为40℃。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,流速为0.8ml/min。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,其中相对保留时间0.8的杂质B的校正因子为2.7,相对保留时间1.7的杂质C的校正因子为1.4,相对保留时间2.4的杂质E的校正因子为2.1。
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