KR101463296B1 - 보체 단백질 ｃ５를 표적으로 하는 항체의 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 보체 단백질 C5를 표적으로 하는 항체 및 조성물 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

보체 단백질 Ｃ５를 표적으로 하는 항체의 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR ANTIBODIES TARGETING COMPLEMENT PROTEIN C5}

1. 도입

본 발명은 보체 단백질 C5를 표적으로 하는 항체 및 그의 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다.

2. 배경기술

선천적 면역계의 일부인 보체의 통상적인 역할은 숙주 방어에 있다. 보체는 박테리아 감염에 대해 방어하고, 후천적 면역성과 선천적 면역성을 연결하며 면역 복합체 및 염증성 손상의 생성물을 처분한다.

방어 기능은 보체 활성화 과정 동안 생성된, 감염성 작용제에 대해 옵소닌작용을 수행하거나 염증을 촉진하거나 감수성 표적을 용해시키는 생물학적 활성 생성물에 의해 달성된다 ([Marzari et al., Eur J Immunol 32:2773-2782 (2002)]). 보체 시스템은 면역계에서 소정의 역할을 하는 약 25종 내지 30종의 혈장 단백질로 이루어진다. 보체 캐스케이드는 적어도 3가지 주요 경로에 의해 활성화된다. 고전적 경로는 전형적으로 면역-복합체에 의해 활성화되고, 대체적 경로는 미보호 세포 표면에 의해 활성화될 수 있으며, 만노스 결합 렉틴 (MBL) 경로는 세포 표면 탄수화물에 대한 MBL의 결합에 의해 개시된다 ([Trendelenburg, Swiss Med Wkly 137:413-417 (2007)]).

모든 3가지 경로가 C5 전환효소에 의한 C5의 절단을 야기한다. 이러한 절단의 결과는 강력한 염증성 분자인 C5a 단편 및 막 공격 복합체 (MAC)를 개시하는 C5b의 방출이다. 보체 생성물은 일단 방출되면 외래 표적과 자가 표적 사이를 구별하지 않으며, 치밀하게 조절되지 않는다면 제한되지 않는 보체 활성화와 관련이 있는 임상 상태에서 방관자 세포 및 조직의 과도한 손상을 흔히 야기한다 ([Marzari et al., 2002]).

C5는 18개 잔기의 신호 서열 및 성숙 N-말단 β쇄와 C-말단 α쇄 사이에 위치하는 Arg-풍부 링커 서열 (RPRR)로 이루어진 1676개 아미노산의 단일 프로(pro)-C5 펩티드로서 세포내 발현된다. 성숙 C5는 약 190 kDa의 분자량을 가지며, 디술피드 결합으로 연결된 2개의 폴리펩티드 쇄 (α, 115 kDa 및 β, 75 kDa)로 이루어진다. C5 전환효소는 C5를 알파 쇄의 잔기 74 및 75 사이에서 절단하여 74개 아미노산의 C5a 펩티드, 및 이후에 막 공격 복합체 (MAC)로 혼입될 C5b 단편을 방출한다.

황반 변성은 망막의 황반부라 공지된 눈 내층의 중심에서 박막화, 위축 및 일부 경우에는 출혈이 일어나는, 노인에서 주로 발견되는 의학적 상태이다. 이것은 미세한 대상물을 보거나 글을 읽거나 얼굴을 인식할 수 없게 하는, 중심시의 손실을 야기할 수 있다. 새로운 맥락막 혈관 형성의 발병기전은 명확하게 이해되지 않았지만, 염증, 허혈, 및 혈관신생 인자의 국소 생성과 같은 인자가 중요하다고 여겨진다.

고전적 또는 대체적 성분 경로와 관련이 있는 질환 및 장애, 특히 AMD를 치료하기 위해 현재 선택할 수 있는 치료법들이 있지만, 효과적이고 널리 허용되는 치료를 가능케 하는 특정 표적을 발견할 것이 여전히 요구된다.

3. 발명의 요약

본 발명은 단리된 보체 C5-결합 분자 (예를 들어, C5-결합 항체 또는 그의 항원 결합 단편), 이러한 분자를 포함하는 제약 조성물, 이러한 분자 및 조성물의 제조 방법, 및 그의 사용 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체는 적어도 1×10⁷ M^-1, 10⁸ M^-1, 10⁹ M^-1, 10¹⁰ M^-1 또는 10¹¹ M^-1의 친화도 상수 (K_A)를 갖는다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 C5 단백질에 특이적으로 결합하고 시험관내 용혈성 검정으로 측정할 때 약 20 pM 내지 약 200 pM의 IC₅₀ 범위로 대체적 완전 경로를 억제하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 C5 단백질에 특이적으로 결합하고 하기 표 1에 기재된 항체와 교차 경쟁하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 C5 단백질에서 하기 표 1에 기재된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 또는 인간화 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 중쇄 불변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체는 단일 쇄 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 Fab 단편이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 scFv이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 C5 및 시노몰구스 C5 둘 다에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG 이소형이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 아미노산이 각각의 인간 VH 또는 VL 배선(germline) 서열로부터의 항체 프레임워크로 치환된 프레임워크를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 49, 50, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 77, 78, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 120, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 209, 226, 235, 236, 237, 238, 239 또는 240에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 갖는 1개 이상의 상보성 결정 (CDR) 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열 1, 2, 3, 17, 18, 19, 33, 34, 35, 49, 61, 62, 63, 77, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 131, 133, 145, 146, 147, 159, 160, 161, 173, 174, 175, 195, 196, 197, 226, 235, 236 또는 237과 동일한 1개 이상의 중쇄 CDR 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열 4, 5, 6, 20, 21, 22, 36, 37, 38, 50, 64, 65, 66, 78, 89, 101, 120, 134, 135, 136, 148, 149, 150, 162, 163, 164, 176, 177, 178, 198, 199, 200, 209, 238, 239 또는 240과 동일한 1개 이상의 경쇄 CDR 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195 및 235로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1, 서열 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226 및 236으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2, 및 서열 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197 및 237로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 및 238로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1, 서열 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 및 239로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2, 및 서열 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 및 240으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 및 238로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1, 서열 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 및 239로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2, 및 서열 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 및 240으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277 또는 281에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 및 289에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 및 289에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열 9, 25, 41, 53, 69, 81, 97, 109, 115, 123, 139, 153, 167, 181, 189, 203, 212, 220, 229, 243, 249, 254, 258, 274, 278 또는 282에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 서열 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286 또는 290에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 C5 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286 또는 290에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 1종 이상의 C5-결합 분자 (예를 들어, C5 결합 항체 또는 그의 항원 결합 단편) 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277 또는 281에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 및 289에 적어도 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 적어도 99％의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (1) 본 발명의 항체의 중쇄를 코딩하는 재조합 DNA 절편, 및 (2) 본 발명의 항체의 경쇄를 코딩하는 제2 재조합 DNA 절편을 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공하고, 여기서 상기 DNA 절편은 제1 및 제2 프로모터에 각각 작동가능하게 연결되고, 상기 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄 각각을 코딩하는 재조합 DNA 절편을 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공하고, 여기서 상기 DNA 절편은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 상기 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 비-인간 포유동물 세포주이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.

본 발명은 본 발명의 C5 결합 분자 (예를 들어, C5 결합 항체 또는 그의 항원 결합 단편)를 사용한 치료 또는 진단 방법을 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 연령 관련 황반 변성의 치료가 필요한 대상체에게 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 연령 관련 황반 변성의 치료 방법을 제공한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 질환의 치료가 필요한 대상체에게 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 질환은 천식, 관절염, 자가면역 심장 질환, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 허혈-재관류 손상, 바라케-시몬스(Barraquer-Simons) 증후군, 혈액투석, 전신 루푸스, 홍반성 루푸스, 건선, 다발성 경화증, 이식, 알츠하이머병, 사구체신염 또는 MPGN II인, 상기 질환의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 발작성 야간 혈색소뇨증 (PNH)의 치료가 필요한 대상체에게 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 발작성 야간 혈색소뇨증 (PNH)의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 체외 순환과 관련이 있는 증상의 완화가 필요한 대상체에게 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 체외 순환과 관련이 있는 증상의 완화 방법을 추가로 제공한다.

3.1. 정의

달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 학술적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 단일 쇄를 포함한다. 천연 발생 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호연결된, 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (이하, VH라 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (이하, VL이라 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 초가변 영역으로 보다 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어지며, 이것들은 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지 다음의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 숙주 조직 또는 인자, 예를 들어 면역계의 각종 세포 (예컨대, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 '항체의 "항원 결합 부분"'은 주어진 항원 (예를 들어, C5)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 무손상 항체의 1종 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 무손상 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 용어 '항체의 "항원-결합 부분"' 내에 포함되는 결합 단편의 예는 Fab 단편 (VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편), F(ab)₂ 단편 (힌지 영역에서 디술피드 브릿지로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편), VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, VH 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체 (dAb) 단편 ([Ward et al., 1989 Nature 341:544-546]), 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.

추가로, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되긴 하지만, 이것들이 단일 단백질 쇄가 될 수 있게 하는 인공 펩티드 링커에 의해 재조합 방법을 이용하여 이것들을 연결시킬 수 있고, 이에 따라 VL 영역과 VH 영역이 쌍형성하여 1가 분자 (단일 쇄 Fv (scFv)라 공지됨, 예를 들어 문헌 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426] 및 [Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조)를 형성한다. 이러한 단일 쇄 항체는 항체의 1개 이상의 "항원 결합 부분"을 포함한다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상의 기술을 이용하여 수득되고, 상기 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.

항원 결합 부분은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv 내로 혼입될 수도 있다 (예를 들어, 문헌 [Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136] 참조). 항체의 항원 결합 부분은 피브로넥틴 유형 III (Fn3)과 같은 폴리펩티드를 기초로 하는 스캐폴드 내로 이식될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디를 기재하고 있는 미국 특허 제6,703,199호 참조).

항원 결합 부분은 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 항원 결합 영역 쌍을 형성하는 직렬식 Fv 절편 (VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함하는 단일 쇄 분자 내로 혼입될 수 있다 ([Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062] 및 미국 특허 제5,641,870호).

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "친화도"는 단일 항원성 부위에서 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 항원성 부위 내에서 항체 "아암"의 가변 영역은 수많은 부위에서 약한 비-공유 힘을 통해 항원과 상호작용하고, 상호작용이 많을수록 친화도가 더 강하다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "화합력"은 항체-항원 복합체의 전체 안정성 또는 강도에 관한 유용한 척도를 지칭한다. 이는 항체 에피토프 친화도, 항원과 항체 둘 다의 원자가, 및 상호작용 부분의 구조적 정렬의 3가지 주요 인자에 의해 제어된다. 궁극적으로, 이들 인자는 항체의 특이성, 즉, 특정 항체가 정확한 항원 에피토프에 결합하는 가능성을 규정한다.

용어 "아미노산"은 천연 발생 및 합성 아미노산, 및 또한 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩되는 것, 및 또한 이후에 변형된 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R기에 결합된 알파 탄소를 갖는 화합물을 지칭하고, 예를 들어 호모세린, 노르루이신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄이 있다. 이러한 유사체는 변형된 R기를 갖거나 (예를 들어, 노르루이신) 변형된 펩티드 주쇄를 갖지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합 특이성"은 오직 1종의 항원 결정자와만 반응하는 개개의 항체 결합 부위의 능력을 지칭한다. 항체의 결합 부위는 상기 분자의 Fab 부분에 위치하고, 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역으로 구축된다. 항체의 결합 친화도는 단일 항원성 결정자와 항체 상의 단일 결합 부위 사이의 반응 강도이다. 이것은 항원성 결정자와 항체의 결합 부위 사이에서 작용하는 인력 및 척력의 합이다.

2가지 물질 사이의 특이적 결합은 평형 상수 (K_A)가 적어도 1×10⁷ M^-1, 10⁸ M^-1, 10⁹ M^-1, 10¹⁰ M^-1 또는 10¹¹ M^-1인 결합을 의미한다. 어구 '항체 (예를 들어, C5-결합 항체)에 "특이적으로 (또는 선택적으로) 결합하는"'은 단백질 및 다른 생물학적 물질의 불균일 집단에서 동족 항원 (예를 들어, 인간 C5 또는 시노몰구스 C5)의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 상기한 바와 같은 평형 상수 (K_A) 이외에도, 본 발명의 C5-결합 항체는 또한 전형적으로 약 1×10^-2 s^-1, 1×10^-3 s^-1, 1×10^-4 s^-1, 1×10^-4 s^-1 또는 그보다 낮은 값의 해리 속도 상수 (Kd)를 가지며, 비-특이적 항원 (예를 들어, C3, C4, BSA)과의 결합에 대한 친화도보다 적어도 2배 더 높은 친화도로 C5에 결합한다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 서로 구별없이 사용된다.

용어 "키메라 항체"는 (a) 항원 결합 부위 (가변 영역)가 상이한 또는 변경된 클래스, 이펙터 기능 및/또는 종의 불변 영역, 또는 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 전혀 상이한 분자, 예를 들어 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 연결되도록 불변 영역 또는 그의 일부가 변경, 대체 또는 교환되거나, 또는 (b) 가변 영역 또는 그의 일부가 상이한 또는 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경, 대체 또는 교환된 항체 분자이다. 예를 들어, 마우스 항체는 그의 불변 영역을 인간 이뮤노글로불린으로부터의 불변 영역으로 대체함으로써 변형시킬 수 있다. 인간 불변 영역으로 대체함으로써, 키메라 항체는 원래의 마우스 항체에 비해 인간에서 감소된 항원성을 가지면서도 항원을 인식하는 그의 특이성은 보유할 수 있다.

용어 "보체 C5 단백질" 또는 "C5"는 서로 구별없이 사용되고, 다양한 종에서의 C5 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 인간 C5는 서열 296에 기재된 바와 같은 서열을 갖고, 시노몰구스 C5는 서열 297에 기재된 바와 같은 서열 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))을 갖는다 (표 1 참조). 인간 C5는 퀴델(Quidel)에서 구할 수 있다 (카탈로그 번호 A403). 시노몰구스 C5는 하기 실시예 섹션에 예시된 바와 같이 하여 제조할 수 있다.

용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열의 경우, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 동의성(degeneracy) 때문에, 수많은 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌이 특정되는 모든 위치에서, 상기 코돈은 코딩되는 폴리펩티드를 변경시키지 않으면서 상기 기재된 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이 중 하나인 "침묵 변이"이다. 또한, 폴리펩티드를 코딩하는 본원에서의 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 침묵 변이도 설명한다. 당업자는 핵산 내의 각각의 코돈 (통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 생성할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에 내포된다.

폴리펩티드 서열의 경우, "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는, 폴리펩티드 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자에 부가적인 것이고 이것들을 제외하지 않는다. 하기하는 8개의 군은 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌 (A), 글리신 (G), 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E), 3) 아스파라진 (N), 글루타민 (Q), 4) 아르기닌 (R), 라이신 (K), 5) 이소루이신 (I), 루이신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V), 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W), 7) 세린 (S), 트레오닌 (T), 및 8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins (1984)] 참조). 일부 실시양태에서, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 유의하게 영향을 미치거나 이를 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하는데 사용된다.

용어 "교차-차단", "교차-차단된" 및 "교차-차단성"은 본원에서 서로 구별없이 사용되며, 표준 경쟁 결합 검정에서 항체 또는 다른 결합제가 C5에 대한 다른 항체 또는 결합제의 결합을 저해하는 능력을 의미한다.

항체 또는 다른 결합제가 C5에 대한 또다른 항체 또는 결합 분자의 결합을 저해할 수 있는 능력 또는 정도, 및 그에 따라 이것이 본 발명에 따른 교차-차단이라 할 수 있는지의 여부는 표준 경쟁 결합 검정을 이용하여 결정할 수 있다. 적합한 검정 중 하나는 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용하여 상호작용의 정도를 측정할 수 있는 비아코어(Biacore) 기술 (예를 들어 BIAcore 3000 기기 (비아코어(Biacore), 스웨덴 웁살라)를 사용함)의 이용을 포함한다. 교차-차단을 측정하기 위한 또다른 검정은 ELISA-기재의 접근법을 이용한다.

용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정자를 의미한다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 기들로 이루어지고, 통상적으로 특정한 3차원 구조 특징 및 또한 특정한 전하 특징을 갖는다. 형태적 및 비-형태적 에피토프는, 형태적 에피토프에 대한 결합은 변성 용매의 존재하에 상실되지만 비-형태적 에피토프에 대한 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다.

본원에서 사용된 바와 같이, IgG 항체에 대한 용어 "고친화도"는 표적 항원에 대하여 K_D가 10^-8 M 이하, 10^-9 M 이하, 10^-10 M 이하, 또는 10^-11 M 이하인 항체를 지칭한다. 그러나, "고친화도" 결합은 다른 항체 이소형에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "고친화도" 결합은 K_D가 10^-7 M 이하 또는 10^-8 M 이하인 항체를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 프레임워크 영역과 CDR 영역 둘 다 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 추가로, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 상기 불변 영역 역시 이러한 인간 서열, 예를 들어 인간 배선 서열, 또는 인간 배선 서열의 돌연변이된 버전으로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.

용어 "인간 모노클로날 항체"는 프레임워크 영역과 CDR 영역 둘 다 인간 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진(transgene) 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.

"인간화" 항체는 비-인간 항체의 반응성은 보유하지만 인간에서의 면역원성은 덜한 항체이다. 이것은 예를 들어 비-인간 CDR 영역을 보유시키고 항체의 나머지 부분 (즉, 불변 영역 및 또한 가변 영역의 프레임워크 부분)을 그의 인간 대응물로 대체하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 ([Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984], [Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988], [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988], [Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991] 및 [Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994])을 참조한다. 인간 조작 기술의 다른 예는 미국 5,766,886에 개시된 엑소마(Xoma) 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 "동일성"(％)은 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 2개의 서열은, 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대한 상응하도록 비교하고 정렬하여 하기하는 서열 비교 알고리즘 중 하나를 이용하거나 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해 결정하는 경우, 2개의 서열이 명시된 백분율(％)의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 (즉, 명시된 영역에 걸쳐서 또는 명시되지 않은 경우에는 전체 서열에 걸쳐서 60％의 동일성, 임의로는 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 99％의 동일성)를 가질 경우에 "실질적으로 동일한" 것이다. 임의로, 동일성은 적어도 약 50개 뉴클레오티드 (또는 10개 아미노산) 길이의 영역에 걸쳐, 또는 더욱 바람직하게는 100개 내지 500개 또는 1000개 또는 그보다 많은 수의 뉴클레오티드 (또는 20개, 50개, 200개 또는 그보다 많은 수의 아미노산) 길이에 걸쳐 존재한다.

서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 시험 서열과 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우에는 하위서열 좌표를 지정하고 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수도 있고, 또는 대안적인 파라미터가 지정될 수도 있다. 이후, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터를 기초로 하여 참조 서열에 대한 시험 서열의 서열 동일성(％)을 계산한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "비교 윈도우"는 2개의 서열을 최적으로 정렬시킨 후에 인접 위치의 동일 수의 참조 서열과 서열을 비교할 수 있는, 20개 내지 600개, 일반적으로는 약 50개 내지 약 200개, 더욱 일반적으로는 약 100개 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택된 인접 위치의 수 중 임의의 하나의 절편에 대한 것을 포함한다. 비교를 위한 서열 정렬의 방법은 당업계에 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 문헌 [Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌 [Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988]의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 전산화 실행 (위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group) (미국 위스콘신주 메디슨 사이언스 드라이브 575)) 또는 수동 정렬 및 시각적 검사 (예를 들어, 문헌 [Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.

서열 동일성 및 서열 유사성 백분율(％) 결정에 적합한 알고리즘의 2가지 예는 문헌 [Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977] 및 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990] 각각에 기재된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가능하다. 이러한 알고리즘은 먼저 데이타베이스 서열 내 동일 길이의 워드(word)와 정렬되는 경우 약간의 양성 값의 역치 스코어 T에 매칭되거나 이를 충족시키는, 의문(query) 서열 내의 길이 W의 짧은 워드들을 확인함으로써 높은 스코어의 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 워드 스코어 역치를 지칭한다 ([Altschul et al., 상기 문헌]). 이러한 초기 이웃 워드 히트(hit)는 이것을 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 시작하기 위한 시드(seed)로 작용한다. 워드 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한은 각각의 서열을 따라 양방향으로 멀리까지 연장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M (매치 잔기의 쌍에 대한 보상 스코어, 항상 > 0) 및 N (미스매치 잔기에 대한 패널티 스코어, 항상 < 0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 누적 스코어 계산에 스코어링 매트릭스가 사용된다. 누적 정렬 스코어가 이의 최대 달성 값으로부터 X의 양만큼 하락한 경우, 1개 이상의 음의 값으로 스코어링된 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 스코어가 0 이하가 된 경우, 또는 어느 한쪽 서열의 끝에 도달한 경우에는 각 방향으로의 워드 히트의 연장이 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 워드길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M = 5, N = -4 및 양가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드길이 3, 및 기대값 (E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989] 참조) 정렬 (B) 50, 기대값 (E) 10, M = 5, N = -4, 및 양가닥의 비교를 사용한다.

BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성에 대한 통계학적 분석을 수행한다 (예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 발생할 확률을 나타내는, 최소의 합계 확률 (P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교시에 최소의 합계 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만일 경우에 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.

또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성(％)은, PAM120 가중 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 혼입된 이. 메이어스(E. Meyers) 및 더블유. 밀러(W. Miller)의 알고리즘 ([Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988])을 이용하여 결정할 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성(％)은 GCG 소프트웨어 패키지 (www.gcg.com에서 이용가능함) 내의 GAP 프로그램에 혼입된 니들만(Needleman) 및 분쉬(Wunsch) ([J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970]) 알고리즘을 이용하여, 블로섬(Blossom) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4, 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하여 결정할 수 있다.

상기 나타낸 서열 동일성(％) 외에, 2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 또다른 표시는 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드가 하기하는 바와 같이 제2 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드에 대해 생성된 항체와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 예를 들어 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우에 전형적으로 제2 폴리펩티드에 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일함을 보여주는 또다른 표시는 2개의 분자 또는 이것들의 상보체가 하기하는 바와 같이 엄격한 조건하에 서로에게 혼성화된다는 것이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일함을 보여주는 또다른 표시는 동일 프라이머가 서열 증폭에 사용될 수 있다는 것이다.

용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, C5와 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 C5 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, C5에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다. 추가로, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.

용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 클래스 (예를 들어, IgM, IgE, IgG, 예컨대 IgG1 또는 IgG4)를 지칭한다. 이소형은 또한 이러한 클래스 중 하나의 변형된 버전을 포함하며, 여기서는 Fc 기능을 변경시키는 변형, 예를 들어 이펙터 기능 또는 Fc 수용체에 대한 결합이 증진되거나 감소되도록 하는 변형이 가해질 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "K_결합" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도를 지칭하는 것이고, 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "K_해리" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "K_D"는 해리 상수를 지칭하기 위한 것이고, Ka에 대한 Kd의 비율 (즉 Kd/Ka)로부터 구하며 몰 농도 (M)로 표시된다. 항체에 대한 K_D 값은 당업계에 널리 확립된 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 항체의 K_D를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명을 이용하거나 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어^® 시스템을 이용하는 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.

용어 "핵산"은 본원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"와 서로 구별없이 사용되고, 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 주쇄 잔기 또는 연결부를 함유하고, 합성, 천연 발생 및 비-천연 발생이며, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNA)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

달리 언급하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 명시적으로 나타낸 서열 뿐만이 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 동의성 코돈 치환) 및 상보적 서열까지도 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 아래에서 상세하게 설명된 바와 같이, 동의성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3의 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시켜 달성될 수 있다 ([Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991], [Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985] 및 [Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994]).

용어 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA) 절편 사이의 기능적 관계를 지칭한다. 전형적으로, 이것은 전사되는 서열에 대한 전사 조절 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열이 적절한 숙주 세포 또는 다른 발현 시스템에서 코딩 서열의 전사를 자극하거나 조정하는 경우, 이것은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 전사되는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사되는 서열에 물리적으로 인접하여 위치한다 - 즉, 이것들은 시스-작용성(cis-acting)이다. 그러나, 일부 전사 조절 서열, 예컨대 인핸서는 이것이 전사를 증진시키는 코딩 서열에 물리적으로 인접하거나 근접하여 위치할 필요가 없다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "최적화된"은, 뉴클레오티드 서열이 생성 세포 또는 유기체, 일반적으로는 진핵 세포, 예를 들어 피치아(Pichia)의 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 코딩하도록 변경된 것을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 원래 코딩되는 아미노산 서열 ("모" 서열이라고도 공지됨)을 완전하게 또는 가능한 많이 보유하도록 조작된다. 본원에서의 최적화된 서열은 포유동물 세포에서 바람직한 코돈을 갖도록 조작되었다. 그러나, 다른 진핵 세포 또는 원핵 세포에서 이러한 서열의 최적화된 발현 역시 본원에서 고려된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열 역시 최적화된 것으로 지칭된다.

용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 서로 구별없이 사용되고, 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 천연 발생 아미노산 중합체 및 비-천연 발생 아미노산 중합체 뿐만이 아니라 1개 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체에도 적용된다. 달리 언급하지 않는 한, 특정 폴리펩티드 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체도 함축적으로 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉 또는 트랜스염색체(transchromosomal) 동물 (예를 들어 마우스), 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 단리된 항체, 재조합의 조합형 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체를 대상으로 하여 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물을 사용하는 경우에는 생체내 체세포 돌연변이유발)을 행할 수 있기 때문에, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련이 있지만 생체내에서 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.

용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정 해당 세포 뿐만이 아니라 이러한 세포의 자손까지도 지칭하고자 하는 것임을 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향에 의해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에 이러한 자손이 모 세포와 사실상 동일하지 않을 수 있지만, 이것은 여전히 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다.

용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 명시되는 경우를 제외하고는, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 본원에서 서로 구별없이 사용된다.

용어 "치료하는"은 질환, 상태 또는 장애의 증상을 완화시키거나 추가의 진행을 정지 또는 억제하면서 질환 (예를 들어, AMD)의 증상, 합병증 또는 생화학적 징후의 발병을 예방하거나 지연시키기 위한 조성물 또는 항체의 투여를 포함한다. 치료는 예방적 (질환 발병을 예방 또는 지연시키거나, 또는 그의 임상적 또는 준임상적 증상의 발현을 예방하기 위함)일 수도 있고, 또는 질환의 발현 후 증상의 치료적 저해 또는 완화일 수도 있다.

용어 "벡터"는 연결된 또다른 폴리뉴클레오티드를 수송할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 벡터의 한가지 유형은 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 추가의 DNA 절편은 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 이것이 도입되는 숙주 세포 내에서 자율 복제가 가능하다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점 및 에피솜 포유동물 벡터를 갖는 박테리아 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포로의 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 추가로, 특정 벡터는 이것들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "발현 벡터")라 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 흔히 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 서로 구별없이 사용될 수 있는데, 이는 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 형태의 벡터이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 보이는 발현 벡터의 이러한 다른 형태, 예를 들어 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함한다.

4. 도면의 간단한 설명
도 1은 선택된 항체의 가변-영역을 이것들의 가장 밀접하게 관련이 있는 인간 배선 서열과 정렬한 것을 보여준다.
도 2는 인간 C5를 인간 C5-결핍된 혈청에 적정하여 C5 활성을 결정하는 용혈성 검정을 보여준다.
도 3은 시노몰구스 혈청을 인간 C5-결핍된 혈청에 적정하여 대체적 경로 용혈성 검정에 최적인 시노몰구스 C5 농도를 결정하는 것을 보여준다.
도 4는 20％ 인간 혈청을 사용하여 실시한 고전적 경로 용혈성 검정의 예를 보여준다.
도 5는 인간 C5-결핍된 혈청에 100 pM의 정제된 인간 C5을 첨가하여 실시한 대체적 경로 용혈성 검정의 예를 보여준다.
도 6은 인간 C5-결핍된 혈청에 0.025％ 시노몰구스 혈청을 첨가하여 실시한 대체적 경로 용혈성 검정의 예를 보여준다.
도 7은 성숙 Fab를 사용하여 실시한 고전적 경로 용혈성 검정 (20％ 인간 혈청)을 이것들 각각의 모체와 비교한 예를 보여준다.
도 8은 성숙 Fab를 사용하여 실시한 고전적 경로 용혈성 검정 (5％ 시노몰구스 혈청)의 예를 보여준다.
도 9는 20％ 인간 C5-결핍된 혈청에 100 pM의 인간 C5를 첨가하여 실시한 대체적 경로 용혈성 검정에서 친화도 성숙 Fab 특징규명을 보여준다.
도 10은 20％ 인간 혈청을 사용하여 실시한 대체적 경로 용혈성 검정에서 친화도 성숙 Fab 특징규명을 보여준다.
도 11은 20％ 인간 C5-결핍된 혈청에 100 pM의 시노몰구스 C5를 첨가하여 실시한 대체적 경로 용혈성 검정에서 친화도 성숙 Fab 특징규명을 보여준다.
도 12는 20％ 인간 혈청을 사용한 고전적 경로 용혈성 검정에서 배선 IgG의 특징규명을 보여준다.
도 13은 5％ 시노몰구스 혈청을 사용한 고전적 경로 용혈성 검정에서 배선 IgG의 특징규명을 보여준다.
도 14는 100 pM의 인간 C5를 사용한 대체적 경로 용혈성 검정에서 배선 IgG의 특징규명을 보여준다.
도 15는 20％ 인간 혈청을 사용한 대체적 경로 용혈성 검정 및 C5a 생성 ELISA에서 최종 배선 IgG의 특징규명을 보여준다.
도 16은 20％ 인간 혈청 용혈성 검정의 상등액을 사용한 C5a ELISA에서 친화도 성숙 Fab의 특징규명을 보여준다.
도 17은 항체 7091 및 그의 유도체를 시험하는, 인간 C3, C4, C5 및 시노몰구스 C5에 대한 특이성 용액 ELISA를 보여준다.
도 18은 Fab를 사용한 혈청 안정성 검정 (50％ 혈청 존재하의 인간 C5에 대한 결합)을 보여준다.
도 19는 약간의 친화도 개선된 Fab의 에피토프 결합을 보여준다.
도 20은 알파 쇄 vs. 베타 쇄 결합제를 결정하기 위해서 실시한, 마우스-인간 키메라 C5 또는 인간 C5와의 항체 결합에 대한 ELISA를 보여준다. C5는 5G1.1에 의해 제시되어 5G1.1과의 경쟁을 결정하였다.
도 21은 5G1.1 포획으로 알파 쇄 vs. 베타 쇄 결합제를 시험하는 ELISA를 보여준다.
도 22는 알파 쇄 vs. 베타 쇄 결합제를 시험한 용혈성 검정의 결과를 보여준다.
도 23은 37℃에서 모 Fab의 써모라이신(thermolysin) 단백질분해 (0분, 30분, 60분 및 90분)를 보여준다.
도 24는 55℃에서 모 Fab의 써모라이신 단백질분해 (0분, 30분, 60분 및 90분)를 보여준다.
도 25는 37℃에서 성숙 Fab의 써모라이신 감수성을 보여준다.
도 26은 55℃에서 성숙 Fab의 써모라이신 감수성을 보여준다.
도 27은 MAC 침착 검정에서 대체적 경로의 Fab 억제의 예를 보여준다.

5. 발명의 상세한 설명

본 발명은 보체 C5 단백질 (예를 들어, 인간 C5, 시노몰구스 C5)에 특이적으로 결합하는 항체, 제약 조성물, 제조 방법, 및 이러한 항체 및 조성물의 사용 방법을 제공한다.

5.1. C5 항체

본 발명은 C5 (예를 들어, 인간 C5, 시노몰구스 C5)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 및 시노몰구스 C5 둘 다에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 실시예 (하기하는 섹션 6 참조)에서 기재된 바와 같이 하여 단리된 인간 모노클로날 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 서열 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277 또는 281의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는, C5 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C5)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 하기 표 1의 VH CDR 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR을 포함하는, C5 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C5)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 특히, 본 발명은 하기 표 1의 VH CDR 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그보다 많은 수의 VH CDR을 포함하는 (또는, 대안적으로는 이것으로 이루어진), C5 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C5)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

본 발명은 서열 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 또는 289의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는, C5 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C5)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 하기 표 1의 VL CDR 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR을 포함하는, C5 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C5)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 특히, 본 발명은 하기 표 1의 VL CDR 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개, 3개 또는 그보다 많은 수의 VL CDR을 포함하는 (또는, 대안적으로는 이것으로 이루어진), C5 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C5)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

본 발명의 다른 항체는 돌연변이되었지만 표 1에 기재된 서열에 도시된 CDR 영역과 CDR 영역에서 적어도 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％의 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이것은 표 1에 기재된 서열에 도시된 CDR 영역과 비교할 때 CDR 영역에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산만이 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 C5 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C5)에 특이적으로 결합하는 항체의 VH, VL, 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 이러한 핵산 서열은 포유동물 세포에서의 발현에 최적화될 수 있다 (예를 들어, 표 1은 항체 8109, 8110, 8111, 8113, 8114, 8112, 8125, 8126, 8127, 8128, 8129, 8130, 8131, 8132 및 8091의 중쇄 및 경쇄에 최적화된 핵산 서열을 보여줌).

본 발명의 다른 항체는 아미노산 또는 아미노산을 코딩하는 핵산이 돌연변이되었지만 표 1에 기재된 서열과 적어도 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％의 동일성을 갖는 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이것은 표 1에 기재된 서열에 도시된 가변 영역과 비교할 때 가변 영역에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산만이 돌연변이되고 실질적으로 동일한 치료 활성을 보유하는 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.

각각의 이들 항체는 C5에 결합할 수 있기 때문에, VH, VL, 전장 경쇄 및 전장 중쇄 서열 (아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)은 "혼합 및 매치"되어 본 발명의 다른 C5-결합 항체를 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매치"된 C5-결합 항체는 당업계 공지의 결합 검정 (예를 들어, ELISA, 및 실시예 섹션에 기재된 다른 검정)으로 시험할 수 있다. 이들 쇄가 혼합 및 매치되는 경우, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 서열 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277 및 281로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 및 289로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, C5 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C5)에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 (i) 서열 9, 25, 41, 53, 69, 81, 97, 109, 115, 123, 139, 153, 167, 181, 189, 203, 212, 220, 229, 243, 249, 254, 258, 274, 278 및 282로 이루어진 군으로부터 선택된, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄, 및 서열 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286 및 290으로 이루어진 군으로부터 선택된, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄를 갖는 단리된 모노클로날 항체, 또는 (ii) 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능적 단백질을 제공한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 표 1에 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 또는 이것들의 조합을 포함하는 C5-결합 항체를 제공한다. 상기 항체의 VH CDR1의 아미노산 서열은 서열 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195 및 235에 나타냈다. 상기 항체의 VH CDR2의 아미노산 서열은 서열 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226 및 236에 나타냈다. 상기 항체의 VH CDR3의 아미노산 서열은 서열 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197 및 237에 나타냈다. 상기 항체의 VL CDR1의 아미노산 서열은 서열 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 및 238에 나타냈다. 상기 항체의 VL CDR2의 아미노산 서열은 서열 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 및 239에 나타냈다. 상기 항체의 VL CDR3의 아미노산 서열은 서열 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 및 240에 나타냈다. CDR 영역은 카바트(Kabat) 시스템 ([Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242])을 이용하여 기재된다.

각각의 이들 항체가 C5에 결합할 수 있고 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공되기 때문에, VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 "혼합 및 매치"될 수 있지만 (즉, 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합 및 매치될 수 있음), 각각의 항체는 VH CDR1, 2 및 3 및 VL CDR1, 2 및 3을 함유해야만 본 발명의 다른 C5-결합 분자를 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매치"된 C5-결합 항체는 당업계 공지의 결합 검정 및 실시예에 기재된 방법 (예를 들어, ELISA)으로 시험할 수 있다. VH CDR 서열이 혼합 및 매치되는 경우, 특정 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 및 매치되는 경우, 특정 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 당업자에게는, 1개 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본 발명의 모노클로날 항체에 대해 본원에 나타낸 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 신규한 VH 및 VL 서열이 생성될 수 있음이 매우 명확할 것이다.

따라서, 본 발명은 서열 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195 및 235로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226 및 236으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197 및 237로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 및 238로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 및 239로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 및 240으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다.

특정 실시양태에서, 서열 1의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 2의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 3의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 4의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 5의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 6의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또다른 특정 실시양태에서, 서열 17의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 18의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 19의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 20의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 21의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 22의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.

또다른 특정 실시양태에서, 서열 33의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 34의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 35의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 36의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 37의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 38의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또다른 특정 실시양태에서, 서열 17의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 49의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 19의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 20의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 21의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 50의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.

또다른 특정 실시양태에서, 서열 61의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 62의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 63의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 64의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 65의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 66의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또다른 특정 실시양태에서, 서열 61의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 77의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 63의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 64의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 65의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 78의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.

또다른 특정 실시양태에서, 서열 61의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 77의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 63의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 64의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 65의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 89의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또다른 특정 실시양태에서, 서열 61의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 62의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 63의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 64의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 65의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 89의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.

또다른 특정 실시양태에서, 서열 61의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 95의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 63의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 64의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 65의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 89의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또다른 특정 실시양태에서, 서열 17의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 49의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 19의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 20의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 21의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 101의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.

또다른 특정 실시양태에서, 서열 17의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 107의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 19의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 20의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 21의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 22의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또다른 특정 실시양태에서, 서열 17의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 107의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 19의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 20의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 21의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 101의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.

또다른 특정 실시양태에서, 서열 17의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 113의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 19의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 20의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 21의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 22의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또다른 특정 실시양태에서, 서열 17의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 113의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 19의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 20의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 21의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 101의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.

또다른 특정 실시양태에서, 서열 1의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 119의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 3의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 4의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 5의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 120의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또다른 특정 실시양태에서, 서열 131의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 132의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 133의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 134의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 135의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 136의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.

또다른 특정 실시양태에서, 서열 145의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 146의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 147의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 148의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 149의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 150의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또다른 특정 실시양태에서, 서열 159의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 160의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 161의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 162의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 163의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 164의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.

또다른 특정 실시양태에서, 서열 173의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 174의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 175의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 176의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 177의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 178의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또다른 특정 실시양태에서, 서열 195의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 196의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 197의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 198의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 199의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 200의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.

또다른 특정 실시양태에서, 서열 61의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 77의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 63의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 64의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 65의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 209의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또다른 특정 실시양태에서, 서열 17의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 49의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 19의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 20의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 21의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 22의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.

또다른 특정 실시양태에서, 서열 33의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 226의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 35의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 36의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 37의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 38의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또다른 특정 실시양태에서, 서열 235의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 236의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 237의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 238의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 239의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 240의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.

또다른 특정 실시양태에서, 서열 1의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 119의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 3의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 4의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 5의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 6의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또다른 특정 실시양태에서, 서열 1의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 2의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 3의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 4의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 5의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 120의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.

또다른 특정 실시양태에서, 서열 61의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 62의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 63의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 64의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 65의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 209의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또다른 특정 실시양태에서, 서열 61의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 95의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 63의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 64의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 65의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 209의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.

또다른 특정 실시양태에서, 서열 61의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 77의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 63의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 64의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 65의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 66의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또다른 특정 실시양태에서, 서열 61의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 77의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 63의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 64의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 65의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 78의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.

또다른 특정 실시양태에서, 서열 61의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 77의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 63의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 64의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 65의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 89의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또다른 특정 실시양태에서, 서열 17의 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열 107의 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열 19의 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열 20의 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열 21의 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열 22의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, C5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.

특정 실시양태에서, C5에 특이적으로 결합하는 항체는 표 1에 기재된 항체이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 인간 항체는 항체의 가변 영역 또는 전장 쇄가 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자를 사용한 시스템으로부터 수득된 경우에 특정 배선 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유도된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심 항원으로 면역화시키거나, 또는 파지에 디스플레이된 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원을 사용하여 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유도된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 이뮤노글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열에 가장 근접한 서열 (즉, 동일성(％)이 가장 큰 것)인 인간 배선 이뮤노글로불린 서열을 선별함으로써 확인할 수 있다. 특정 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유도된" 인간 항체는 배선 서열에 비해, 예를 들어 천연 발생 체세포 돌연변이, 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적인 도입으로 인한 아미노산 차이를 가질 수 있다. 그러나, VH 또는 VL 프레임워크 영역에서, 선별된 인간 항체는 전형적으로 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 적어도 90％이고, 다른 종의 배선 이뮤노글로불린 아미노산 서열 (예컨대, 뮤린(murine) 배선 서열)과 비교할 때 인간 항체를 인간의 것으로 확인시켜 주는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정한 경우, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 적어도 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 적어도 95％ 또는 심지어는 적어도 96％, 97％, 98％ 또는 99％일 수 있다. 전형적으로, 재조합 인간 항체는 VH 또는 VL 프레임워크 영역에서 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과는 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정한 경우, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어는 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.

상동성 항체

또다른 실시양태에서, 본 발명은 표 1에 기재된 서열에 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, C5 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C5)에 결합하고, 표 1에 기재된 항체의 원하는 기능적 특성을 보유하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.

예를 들어, 본 발명은 서열 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277 또는 281로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80％, 적어도 90％ 또는 적어도 95％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 또는 289로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80％, 적어도 90％ 또는 적어도 95％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, C5 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C5)에 특이적으로 결합하고, 용혈성 검정에서 적혈구 용해를 억제할 수 있는 단리된 모노클로날 항체 (또는 그의 기능적 항원 결합 단편)를 제공한다. 구체적인 예에서, 이러한 항체는 100 pM의 인간 C5로 재구성된 인간 C5-결핍된 혈청을 사용한 용혈성 검정에서의 IC₅₀ 값이 20 내지 200 pM이다.

다른 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 표 1에 기재된 서열에 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일할 수 있다. 다른 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 제외하고는 동일할 수 있다. 표 1에 기재된 것의 VH 및 VL 영역에 높은 (즉, 80％ 이상의) 동일성을 갖는 VH 및 VL 영역을 갖는 항체는, 서열 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277 또는 281, 및 서열 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 또는 289 각각을 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발) 및 이후 상기 코딩된 변경된 항체를 본원에 기재된 기능적 검정을 이용하여 보유된 기능에 대해 시험함으로써 수득될 수 있다.

다른 실시양태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 아미노산 서열은 표 1에 기재된 서열에 50％ 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일할 수 있다. 서열 9, 25, 41, 53, 69, 81, 97, 109, 115, 123, 139, 153, 167, 181, 189, 203, 212, 220, 229, 243, 249, 254, 258, 274, 278 및 282 중 임의의 것의 전장 중쇄, 및 서열 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286 및 290 중 임의의 것의 전장 경쇄 각각에 높은 (즉, 80％ 이상의) 동일성을 갖는 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 갖는 항체는, 이러한 폴리펩티드 각각을 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발) 및 이후 상기 코딩된 변경된 항체를 본원에 기재된 기능적 검정을 이용하여 보유된 기능에 대해 시험함으로써 수득될 수 있다.

다른 실시양태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열은 상기 기재된 서열에 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일할 수 있다.

다른 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄 뉴클레오티드 서열의 가변 영역은 상기 기재된 서열에 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 2개의 서열들 사이의 동일성(％)은 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭(gap)의 수와 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, 동일성(％) = 동일한 위치의 수/위치의 총 수×100). 2개 서열 사이의 서열 비교 및 동일성(％) 결정은 하기하는 비-제한적인 예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 이용하여 이루어질 수 있다.

추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열은 예를 들어 관련 서열들을 확인하기 위해 공공 데이타베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "의문 서열"로서 추가로 사용될 수도 있다. 예를 들어, 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al., 1990 J. Mol. Biol. 215:403-10]의 BLAST 프로그램 (버전 2.0)을 이용하여 수행할 수 있다.

보존적 변형을 갖는 항체

특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖고, 여기서 이들 CDR 서열 중 1개 이상은 본원에 기재된 항체 또는 그의 보존적 변형을 기초로 하는 특정 아미노산 서열을 갖고, 상기 항체는 본 발명의 C5-결합 항체의 원하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역의 CDR1 아미노산 서열은 서열 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195 및 235, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 중쇄 가변 영역의 CDR2 아미노산 서열은 서열 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226 및 236, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 중쇄 가변 영역의 CDR3 아미노산 서열은 서열 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197 및 237, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 경쇄 가변 영역의 CDR1 아미노산 서열은 서열 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 및 238, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 경쇄 가변 영역의 CDR2 아미노산 서열은 서열 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 및 239, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 경쇄 가변 영역의 CDR3 아미노산 서열은 서열 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 및 240, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 C5에 특이적으로 결합하고, 본원에 기재된 바와 같은 용혈성 검정에서 적혈구 용해를 억제한다.

다른 실시양태에서, 포유동물 세포에서의 발현에 대해 최적화된 본 발명의 항체는 전장 중쇄 서열 및 전장 경쇄 서열을 갖고, 여기서 이들 서열 중 1개 이상은 본원에 기재된 항체 또는 그의 보존적 변형을 기초로 하는 특정 아미노산 서열을 갖고, 상기 항체는 본 발명의 C5-결합 항체의 원하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄로 이루어지고 포유동물 세포에서의 발현에 대해 최적화된 단리된 모노클로날 항체를 제공하고, 여기서 전장 중쇄는 서열 9, 25, 41, 53, 69, 81, 97, 109, 115, 123, 139, 153, 167, 181, 189, 203, 212, 220, 229, 243, 249, 254, 258, 274, 278 및 282, 및 그의 보존적 변형의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 전장 경쇄는 서열 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286 및 290, 및 그의 보존적 변형의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 항체는 C5 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C5)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기재된 바와 같은 용혈성 검정에서 적혈구 용해를 억제한다. 특정 실시양태에서, 이러한 항체는 100 pM의 인간 C5로 재구성된 인간 C5-결핍된 혈청을 사용한 용혈성 검정에서의 IC₅₀ 값이 20 내지 200 pM이다.

동일한 에피토프에 결합하는 항체

본 발명은 표 1에 기재된 C5-결합 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 따라서, 추가의 항체는 C5 결합 검정에서 본 발명의 다른 항체와 교차-경쟁하는 (예를 들어, 본 발명의 다른 항체의 결합을 통계적으로 유의한 방식으로 경쟁적으로 억제하는) 능력을 기초로 하여 확인될 수 있다. C5 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C5)에 대한 본 발명의 항체의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 C5와의 결합에 대해 상기 항체와 경쟁할 수 있음을 입증하고, 이러한 항체는 비-제한적인 이론에 따라 C5 단백질상에서 이것이 경쟁하는 항체와 동일하거나 관련이 있는 (예를 들어, 구조적으로 유사하거나 공간적으로 근접한) 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체와 C5의 동일 에피토프에 결합하는 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 이러한 인간 모노클로날 항체는 본원에 기재된 바와 같이 제조 및 단리될 수 있다.

조작되고 변형된 항체

추가로, 본 발명의 항체는, 변형된 항체를 조작하기 위한 출발 물질로서 본원에 제시된 1종 이상의 VH 및/또는 VL 서열을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있고, 상기 변형된 항체는 출발 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 1개 또는 2개 모두의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL) 내에, 예를 들어 1개 이상의 CDR 영역 내에 및/또는 1개 이상의 프레임워크 영역 내에 존재하는 1개 이상의 잔기를 변형시켜 조작될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 항체는 불변 영역(들) 내의 잔기들을 변형시켜 조작되어, 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시킬 수 있다.

수행될 수 있는 가변 영역 조작의 유형 중 하나는 CDR 이식이다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로 인해, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 바깥쪽의 서열보다 개개의 항체들 사이에서 더 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열에 이식된, 특정 천연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특정 천연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327], [Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525], [Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033], 미국 특허 제5,225,539호 (Winter) 및 미국 특허 제5,530,101호, 동 제5,585,089호, 동 제5,693,762호 및 동 제6,180,370호 (Queen et al.) 참조).

따라서, 본 발명의 또다른 실시양태는 서열 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195 및 235로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열, 서열 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226 및 236으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열, 서열 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197 및 237로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 서열 각각을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 및 238로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열, 서열 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 및 239로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열, 및 서열 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 및 240으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 CDR3 서열 각각을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 따라서, 이러한 항체는 모노클로날 항체의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하지만, 이들 항체의 상이한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.

이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이타베이스 또는 간행된 문헌으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 "VBase" 인간 배선 서열 데이타베이스 (인터넷상에서 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용가능함), 및 또한 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242], [Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798] 및 [Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836] (이들 문헌 각각의 내용은 본원에 명백하게 참고로 포함됨)에서 찾을 수 있다.

본 발명의 항체에 사용하기 위한 프레임워크 서열의 예는 본 발명의 선택된 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열, 예를 들어 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 사용되는 컨센서스(consensus) 서열 및/또는 프레임워크 서열에 구조적으로 유사한 것이다. VH CDR1, 2 및 3 서열, 및 VL CDR1, 2 및 3 서열을 프레임워크 서열이 유래되는 배선 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역으로 이식시킬 수도 있고, 또는 CDR 서열을 배선 서열과 비교해서 1개 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역으로 이식시킬 수도 있다. 예를 들어, 특정 예에서는 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증진시키는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 미국 특허 제5,530,101호, 동 제5,585,089호, 동 제5,693,762호 및 동 제6,180,370호 (Queen et al.) 참조).

또다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜서 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선시키는 것이다 ("친화도 성숙"이라 공지됨). 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발을 수행하여 돌연변이(들)을 도입할 수 있고, 항체 결합에 대한 효과 또는 관심의 대상이 되는 다른 기능적 특성을 본원에 기재된 바와 같고 실시예에서 제공되는 바와 같은 시험관내 또는 생체내 검정으로 평가할 수 있다. 보존적 변형 (상기 논의된 바와 같음)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 추가로, 전형적으로는 CDR 영역 내의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기를 변경시킨다.

따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195 및 235를 갖는 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195 및 235와 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 VH CDR1 영역, 서열 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226 및 236으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226 및 236과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 영역, 서열 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197 및 237로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197 및 237과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 및 238로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 및 238과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1 영역, 서열 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 및 239로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 및 239와 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 영역, 및 서열 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 및 240으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 및 240과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3 영역으로 이루어진 단리된 C5-결합 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

대안적 프레임워크 또는 스캐폴드로의 항원-결합 도메인의 이식

생성되는 폴리펩티드가 C5에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 결합 영역을 포함하는 한은, 매우 다양한 항체/이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드를 사용할 수 있다. 이러한 프레임워크 또는 스캐폴드는 인간 이뮤노글로불린의 5가지 주요 이디오형(idiotype) 또는 그의 단편을 포함하고, 바람직하게는 인간화 측면을 갖는 다른 동물 종의 이뮤노글로불린을 포함한다. 이와 관련하여, 단일 중쇄 항체, 예컨대 낙타류에서 확인된 것들에 특별한 관심이 있다. 신규한 프레임워크, 스캐폴드 및 단편이 당업자에 의해 계속 발견되고 개발된다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CDR이 이식될 수 있는 비-이뮤노글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-이뮤노글로불린 기재의 항체를 생성하는 것에 관한 것이다. 공지된 또는 미래의 비-이뮤노글로불린 프레임워크 및 스캐폴드가 표적 C5 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C5)에 특이적인 결합 영역을 포함하는 한은 이것들이 사용될 수 있다. 공지된 비-이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는 피브로넥틴 (컴파운드 쎄라퓨틱스, 인크.(Compound Therapeutics, Inc.), 미국 매사추세츠주 왈탐), 안키린 (몰레큘라 파트너즈 아게(Molecular Partners AG), 스위스 취리히), 도메인 항체 (도만티스, 리미티드(Domantis, Ltd.), 미국 매사추세츠주 캠브릿지, 및 아블린크스 엔브이(Ablynx nv), 벨기에 즈뷔나아르드), 리포칼린 (피에리스 프로테오랩 아게(Pieris Proteolab AG), 독일 프라이싱), 작은 모듈형 면역-의약품 (트루비온 파카슈티칼즈 인크.(Trubion Pharmaceuticals Inc.), 미국 워싱턴주 시애틀), 맥시바디 (아비디아, 인크.(Avidia, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰), 프로테인 A (애피바디 아게(Affibody AG), 스웨덴) 및 애필린 (감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴) (스실 프로테인즈 게엠베하(Scil Proteins GmbH), 독일 할레)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

피브로넥틴 스캐폴드는 피브로넥틴 유형 III 도메인 (예를 들어, 피브로넥틴 유형 III의 10번째 모듈 (10 Fn3 도메인))을 기초로 한다. 피브로넥틴 유형 III 도메인은 단백질의 코어를 형성하도록 서로에 대해 패킹된 2개의 베타 시트 사이에 분포된 7개 또는 8개의 베타 가닥을 갖고, 베타 가닥들을 서로 연결하고 용매 노출된 루프 (CDR과 유사)를 추가로 함유한다. 베타 시트 샌드위치의 각 가장자리에는 이러한 루프가 적어도 3개 존재하고, 여기서 상기 가장자리는 베타 가닥의 방향에 수직인 단백질의 경계이다 (미국 6,818,418 참조). 이러한 피브로넥틴-기재의 스캐폴드는 이뮤노글로불린은 아니지만, 전반적인 폴드(fold)는 낙타 및 라마 IgG 내의 전체 항원 인식 단위를 포함하는 중쇄 가변 영역인 최소의 기능적 항체 단편의 것과 밀접한 관련이 있다. 이러한 구조로 인해, 비-이뮤노글로불린 항체는 항체의 것과 성질 및 친화도에서 유사한 항원 결합 특성을 모방한다. 이러한 스캐폴드는 생체내 항체의 친화도 성숙 과정과 유사한 시험관내 루프 무작위화 및 셔플링(shuffling) 전략에서 사용될 수 있다. 이러한 피브로넥틴-기재의 분자는 표준 클로닝 기술을 이용하여 분자의 루프 영역이 본 발명의 CDR로 대체될 수 있는 스캐폴드로 사용될 수 있다.

안키린 기술은 상이한 표적들에 대한 결합에 사용될 수 있는 가변 영역을 보유하도록 안키린 유래의 반복 모듈을 갖는 단백질을 스캐폴드로 사용하는 것을 기초로 한다. 안키린 반복 모듈은 2개의 역평행한 α-나선 및 β-턴(turn)으로 이루어진 33개 아미노산의 폴리펩티드이다. 가변 영역의 결합은 리보솜 디스플레이를 사용함으로써 대부분 최적화된다.

아비머는 천연 A-도메인 함유 단백질, 예컨대 LRP-1에서 유래된다. 이러한 도메인은 본래 단백질-단백질 상호작용을 위해 사용되고, 인간에서는 250종 초과의 단백질이 구조적으로 A-도메인을 기초로 한다. 아비머는 아미노산 링커를 통해 연결된 수많은 상이한 "A-도메인" 단량체들 (2개 내지 10개)로 이루어진다. 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제20040175756호, 동 제20050053973호, 동 제20050048512호 및 동 제20060008844호에 기재된 방법을 이용하여 표적 항원에 결합할 수 있는 아비머가 생성될 수 있다.

애피바디 친화도 리간드는 단백질 A의 IgG-결합 도메인 중 하나의 스캐폴드를 기초로 하는 3개의 나선 다발로 이루어진 작고 단순한 단백질이다. 단백질 A는 박테리아 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 표면 단백질이다. 이 스캐폴드 도메인은 58개의 아미노산으로 이루어지며, 이중 13개는 무작위화되어 다수의 리간드 변이체를 갖는 애피바디 라이브러리를 생성한다 (예를 들어, 미국 5,831,012 참조). 애피바디 분자는 항체를 모방하고, 항체의 분자량이 150 kDa인데 비해 분자량은 6 kDa이다. 애피바디 분자는 작은 크기에도 불구하고 이것의 결합 부위가 항체의 결합 부위와 유사하다.

안티칼린은 피에리스 프로테오랩 아게라는 회사가 개발한 제품이다. 이것은 화학적으로 감수성이 있거나 불용성인 화합물의 생리적인 수송 또는 저장에 일반적으로 포함되는 광범위한 군의 작고 강한 단백질인 리포칼린으로부터 유래된다. 여러가지 천연 리포칼린이 인간 조직 또는 체액에서 생성된다. 단백질 구조는 초가변 루프가 단단한 프레임워크의 최상부에 존재하는 이뮤노글로불린을 연상시킨다. 그러나, 항체 또는 이것의 재조합 단편과는 대조적으로, 리포칼린은 160개 내지 180개 아미노산 잔기의 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어져서 단일 이뮤노글로불린 도메인보다 단지 약간만 더 크다. 결합 포켓을 이루는, 4개 루프의 세트는 두드러진 구조적 유연성을 나타내고 다양한 측쇄를 허용한다. 따라서, 독점적인 방법에서는 상이한 형태의 규정된 표적 분자들을 높은 친화도 및 특이성으로 인식하도록 결합 부위를 재성형시킬 수 있다. 리포칼린 부류의 단백질 중 하나인, 피에리스 브라시카애(Pieris Brassicae)의 빌린(bilin)-결합 단백질 (BBP)이, 4개 루프 세트의 돌연변이유발에 의해 안티칼린을 개발하는데 사용되어 왔다. 안티칼린을 기재하는 특허 출원의 한 예는 PCT 공개 제WO 199916873호이다.

애필린 분자는 단백질 및 소분자에 대한 특이적 친화도를 위해 디자인된 작은 비-이뮤노글로불린 단백질이다. 신규 애필린 분자는 상이한 인간 유래의 스캐폴드 단백질을 각각 기초로 하는 2개의 라이브러리로부터 매우 신속하게 선별될 수 있다. 애필린 분자는 이뮤노글로불린 단백질과 어떠한 구조적 상동성도 나타내지 않는다. 현재, 2종의 애필린 스캐폴드가 사용되는데, 이중 하나는 감마 결정질의 인간 구조적 눈 수정체 단백질이고, 나머지 하나는 "유비퀴틴" 거대부류 단백질이다. 2종의 인간 스캐폴드 모두 매우 작고, 높은 온도 안정성을 나타내며, pH 변화 및 변성제에 거의 내성을 갖는다. 이러한 높은 안정성은 주로 단백질의 확장된 베타 시트 구조로 인한 것이다. 감마 결정질 유래의 단백질의 예는 WO 200104144에 기재되어 있고, "유비퀴틴-유사" 단백질의 예는 WO 2004106368에 기재되어 있다.

단백질 에피토프 모방체 (PEM)는 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 주요 2차 구조인 단백질의 베타-헤어핀 2차 구조를 모방하는 중간 크기의 시클릭 펩티드-유사 분자 (MW 1 내지 2 kDa)이다.

일부 실시양태에서, Fab는 Fc 영역을 변화시켜서 침묵 IgG1 포맷으로 전환된다. 예를 들어, 표 1의 항체 6525 내지 7910은 중쇄에 대한 아미노산 서열에서 "X"를 치환시켜

으로 하고, 경쇄에 대한 아미노산 서열에서 "X"를 CS (경쇄가 람다인 경우) 또는 C (경쇄가 카파인 경우)로 치환함으로써 침묵 IgG1 포맷으로 전환될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "침묵 IgG1"은 Fc-매개 이펙터 기능 (예를 들어, ADCC 및/또는 CDC)이 감소되도록 아미노산 서열이 변경된 IgG1 Fc 서열이다. 이러한 항체는 전형적으로 Fc 수용체 및/또는 C1q에 대한 결합이 감소될 것이다.

일부 다른 실시양태에서, Fab는 IgG2 포맷으로 전환된다. 예를 들어, 표 1의 항체 6525 내지 7910은 불변 서열

를 IgG2의 중쇄에 대한 불변 서열

로 치환하고 경쇄에 대한 아미노산 서열에서 "X"를 CS (경쇄가 람다인 경우) 또는 C (경쇄가 카파인 경우)로 치환함으로써 IgG2 포맷으로 전환될 수 있다.

인간 또는 인간화 항체

본 발명은 C5 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C5)에 특이적으로 결합하는 완전 인간 항체를 제공한다. 키메라 또는 인간화 항체와 비교할 때, 본 발명의 인간 C5-결합 항체는 인간 대상체에게 투여될 때 더욱 감소된 항원성을 갖는다.

인간 C5-결합 항체는 당업계 공지의 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 비-인간 항체를 조작된 인간 항체로 전환시키는데 이용되는 인간조작(humaneering) 기술이 있다. 미국 특허 공개 제20050008625호는 비-인간 항체와 비교할 때 동일한 결합 특징을 유지하거나 또는 보다 양호한 결합 특징을 제공하면서 항체에서 비-인간 항체 가변 영역을 인간 가변 영역으로 대체하는 생체내 방법을 기재한다. 상기 방법은 비-인간 참조 항체의 가변 영역을 에피토프에 따라 완전 인간 항체로 대체하는 것을 기초로 한다. 생성되는 인간 항체는 일반적으로 참조 비-인간 항체와 구조적으로 관련이 있지는 않지만, 참조 항체와 동일한 항원상의 동일한 에피토프에 결합한다. 간략하게 설명하면, 일련의 에피토프-유도된 상보성 대체 접근법은, 항원에 대한 참조 항체의 결합에 반응하는 리포터 시스템의 존재하에 제한된 양의 항원과의 결합에 대한 "경쟁자"와 시험 항체의 다양한 하이브리드 라이브러리 ("시험 항체") 사이의 세포내 경쟁을 확립함으로써 가능하게 된다. 경쟁자는 참조 항체 또는 그의 유도체, 예컨대 단일 쇄 Fv 단편일 수 있다. 경쟁자는 또한 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항원의 천연 또는 인공 리간드일 수 있다. 경쟁자의 유일한 요건은 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하고, 항원 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 것이다. 시험 항체는 비-인간 참조 항체로부터의 공통적인 1개의 항원 결합 V-영역, 및 다양한 공급원, 예를 들어 인간 항체의 레퍼토리 라이브러리로부터 무작위로 선택된 다른 V-영역을 갖는다. 참조 항체로부터의 공통적인 V-영역은 가이드로서 기능하여 시험 항체를 항원상의 동일한 에피토프에 동일한 배향으로 위치시켜서, 선택시에 참조 항체에 대해 가장 높은 항원 결합 충실도 쪽으로 편향되도록 한다.

많은 유형의 리포터 시스템이 시험 항체와 항원 사이의 원하는 상호작용을 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 항원에 결합할 때에만 단편 상보성에 의한 리포터 활성화가 일어나도록 상보성 리포터 단편을 항원 및 시험 항체 각각에 연결할 수 있다. 시험 항체- 및 항원-리포터 단편 융합체가 경쟁자와 공동 발현되는 경우, 리포터 활성화는 항원에 대한 시험 항체의 친화도에 비례하는, 경쟁자와 경쟁하는 시험 항체의 능력에 의존하게 된다. 사용될 수 있는 다른 리포터 시스템은 미국 특허 출원 제10/208,730호 (공개 제20030198971호)에 개시된 바와 같은 자가억제된 리포터 재활성화 시스템 (RAIR)의 재활성화제 또는 미국 특허 출원 제10/076,845호 (공개 제20030157579호)에 개시된 경쟁적 활성화 시스템을 포함한다.

일련의 에피토프 유도된 상보성 대체 시스템을 사용하여, 경쟁자, 항원 및 리포터 성분과 함께 단일 시험 항체를 발현하는 세포를 확인하는 선별을 수행한다. 이러한 세포에서, 각각의 시험 항체는 제한된 양의 항원과의 결합에 대해 경쟁자와 1:1로 경쟁한다. 리포터의 활성은 시험 항체에 결합된 항원의 양에 비례하고, 이는 다시 항원에 대한 시험 항체의 친화도 및 시험 항체의 안정성에 비례한다. 시험 항체는 처음에는 시험 항체로 발현될 때 참조 항체의 활성에 대한 이것들의 활성을 기초로 하여 선별된다. 제1 라운드의 선별 결과는 "하이브리드" 항체의 세트이고, 이것 각각은 참조 항체로부터의 동일한 비-인간 V-영역 및 라이브러리로부터의 인간 V-영역으로 이루어지고, 이것 각각은 항원상에서 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 제1 라운드에서 선별된 하이브리드 항체 중 하나 이상은 항원에 대한 친화도가 참조 항체와 유사하거나 그보다 더 높을 것이다.

제2의 V-영역 대체 단계에서, 제1 단계에서 선별된 인간 V-영역이 나머지 비-인간 참조 항체 V-영역을 동족 인간 V-영역의 다양한 라이브러리로 인간 대체하기 위한 선택의 가이드로서 사용된다. 제1 라운드에서 선별된 하이브리드 항체는 또한 제2 라운드의 선별을 위해 경쟁자로서 사용될 수도 있다. 제2 라운드의 선별 결과는 참조 항체와 구조적으로 상이하지만, 동일 항원과의 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 완전 인간 항체의 세트이다. 선별된 인간 항체 중 일부는 참조 항체와 동일한 항원상의 동일 에피토프에 결합한다. 이들 선별된 인간 항체 중 1종 이상은 참조 항체와 유사하거나 그보다 더 높은 친화도로 동일 에피토프에 결합한다.

상기 기재된 마우스 또는 키메라 C5-결합 항체 중 하나를 참조 항체로서 사용함으로써, 상기 방법은 동일한 결합 특이성 및 동일하거나 더 양호한 결합 친화도로 인간 C5에 결합하는 인간 항체를 생성하는데 쉽게 이용될 수 있다. 또한, 이러한 인간 C5-결합 항체는 또한 인간 항체를 통상적으로 생산하는 회사, 예를 들어 칼로바이오스, 인크.(KaloBios, Inc.) (미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)로부터 구입할 수 있다.

낙타류 항체

신세계 구성원, 예를 들어 라마 종 (라마 파코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama) 및 라마 비쿠그나(Lama vicugna))을 비롯한 낙타 및 단봉 낙타 (카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus) 및 칼레루스 드로마데리우스(Calelus dromaderius)) 부류의 구성원으로부터 얻은 항체 단백질을 인간 대상체에 대해 크기, 구조적 복합도 및 항원성에 관하여 특징규명하였다. 자연계에서 발견되는 바와 같이 이러한 부류의 포유동물로부터의 특정 IgG 항체에는 경쇄가 없어서, 다른 동물로부터의 항체의 경우에서의 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 전형적인 4쇄 4차 구조와 구조적으로 상이하다. PCT/EP93/02214 (1994년 3월 3일자로 공개된 WO 94/04678)를 참조한다.

VHH로서 확인된 작은 단일 가변 도메인인 낙타류 항체 영역은 "낙타류 나노바디(nanobody)"라고 공지된 저분자량 항체-유래 단백질을 생성시키는, 표적에 대해 고친화도를 갖는 작은 단백질을 얻도록 하는 유전자 조작으로 수득할 수 있다. 1998년 6월 2일자로 허여된 미국 특허 제5,759,808호를 참조하고, 또한 문헌 [Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261], [Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788], [Pleschberger, M. et al., 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448], [Cortez-Retamozo, V. et al., 2002 Int J Cancer 89: 456-62] 및 [Lauwereys, M. et al., 1998 EMBO J 17: 3512-3520]을 참조한다. 낙타류 항체 및 항체 단편의 조작된 라이브러리는 시판되고 있으며, 예를 들어 아블린크스 (벨기에 겐트)가 시판한다. 비-인간 기원의 다른 항체와 같이, 낙타류 항체의 아미노산 서열을 재조합 방식으로 변경시켜 인간 서열과 보다 근접하게 유사한 서열을 수득할 수 있으며, 즉, 나노바디를 "인간화"할 수 있다. 따라서, 인간에 대한 낙타류 항체의 천연적으로 낮은 항원성을 추가로 저하시킬 수 있다.

낙타류 나노바디는 분자량이 인간 IgG 분자의 대략 1/10이고, 상기 단백질은 단지 수 나노미터에 불과한 물리적 직경을 갖는다. 작은 크기가 갖는 결과 중 하나는 보다 큰 항체 단백질의 경우에는 기능적으로 보이지 않는 항원성 부위에 결합하는 낙타류 나노바디의 능력이고, 즉, 낙타류 나노바디는 고전적인 면역학적 기술을 이용하여 달리 알 수 없는 항원을 검출하는 시약으로서 및 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서, 작은 크기가 갖는 또다른 결과는, 낙타류 나노바디는 표적 단백질의 홈 또는 좁은 틈새 내의 특이적 부위에 결합한 결과로 억제할 수 있기 때문에 고전적인 항체의 기능보다 고전적인 저분자량 약물의 기능과 보다 밀접하게 유사한 능력으로 작용할 수 있다는 것이다.

이러한 저분자량 및 조밀한 크기로 인해, 극도로 열 안정적이고 극한 pH 및 단백질분해 소화에 대해서도 안정적이고 낮은 항원성을 갖는 낙타류 나노바디가 추가로 생성된다. 또다른 결과는 낙타류 나노바디가 순환 시스템으로부터 조직 내로 쉽게 이동하고 심지어는 혈액-뇌 장벽을 횡단하며, 신경 조직에 영향을 미치는 장애를 치료할 수 있다는 것이다. 나노바디는 또한 혈액 뇌 장벽을 횡단하는 약물 수송을 추가로 용이하게 할 수 있다. 2004년 8월 19일자로 공개된 미국 특허 출원 20040161738을 참조한다. 인간에 대한 낮은 항원성과 조합된 이러한 특징은 높은 치료 가능성을 나타낸다. 추가로, 이들 분자는 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 내에서 완전하게 발현될 수 있고, 박테리오파지와의 융합 단백질로서 발현되며, 기능적이다.

따라서, 본 발명의 특징은 C5에 고친화도를 갖는 낙타류 항체 또는 나노바디이다. 본원의 특정 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 낙타류 동물에서 천연적으로 생성되는데, 즉, 다른 항체에 대해 본원에 기재된 기술을 이용하여 C5 또는 그의 펩티드 단편으로 면역화시킨 후의 낙타류에 의해 생성된다. 대안적으로, C5-결합 낙타류 나노바디가 조작되며, 즉, 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 표적으로서 C5를 사용한 패닝 절차를 이용하여 적절하게 돌연변이시킨 낙타류 나노바디 단백질을 디스플레이하는 파지의 라이브러리로부터 선별하여 생성된다. 조작된 나노바디는 수여 대상체 내에서의 반감기가 45분 내지 2주가 되도록 유전자 조작함으로써 추가로 맞춤 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 예를 들어 PCT/EP93/02214에 기재된 바와 같이 본 발명의 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR 서열을 나노바디 또는 단일 도메인 항체 프레임워크 서열로 이식하여 수득된다.

이중특이적 분자 및 다가 항체

또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 C5-결합 항체 또는 그의 단편을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 영역은 유도체화되거나 또다른 기능적 분자, 예를 들어 또다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 또다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)에 연결되어 2개 이상의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 실제로 유도체화되거나 1개 초과의 다른 기능적 분자에 연결되어 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있고, 이러한 다중특이적 분자 역시 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "이중특이적 분자"에 포함된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 1개 이상의 다른 결합 분자, 예를 들어 또다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비-공유 회합 등에 의함)될 수 있어서 이중특이적 분자가 생성된다.

따라서, 본 발명은 적어도 C5에 대한 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 예를 들어, 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프와 상이한, C5의 또다른 에피토프이다.

추가로, 본 발명에서 이중특이적 분자가 다중특이적인 경우, 상기 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프에 대한 것 이외의 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 결합 특이체로서 1종 이상의 항체 또는 그의 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일 쇄 Fv를 포함한다. 미국 특허 제4,946,778호 (Ladner et al.)에 기재된 바와 같이, 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 그의 임의의 최소 단편, 예를 들어 Fv 또는 단일 쇄 구축물일 수 있다.

디아바디는 VH 및 VL 도메인이 동일한 쇄상에서 이들 2개 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커에 연결된, 단일 폴리펩티드 쇄로 발현된 2가의 이중-특이적 분자이다. VH 및 VL 도메인은 또다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성함으로써, 2개의 항원 결합 부위를 생성한다 (예를 들어, 문헌 [Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448], [Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123] 참조). 디아바디는 동일 세포 내에서 구조 VHA-VLB와 VHB-VLA (VH-VL 형태) 또는 VLA-VHB와 VLB-VHA (VL-VH 형태)의 2개의 폴리펩티드 쇄를 발현하여 생성될 수 있다. 이것들 대부분은 박테리아 내에서 가용성 형태로 발현될 수 있다. 단일 쇄 디아바디 (scDb)는 대략 15개 아미노산 잔기의 링커로 2개의 디아바디-형성 폴리펩티드 쇄를 연결하여 생성된다 (문헌 [Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30], [Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36] 참조). scDb는 박테리아 내에서 가용성 활성 단량체 형태로 발현될 수 있다 (문헌 [Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30], [Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36], [Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105], [Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21] 참조). 디아바디를 Fc와 융합시켜 "디-디아바디"를 생성시킬 수 있다 (문헌 [Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65] 참조).

본 발명의 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.

본 발명의 이중특이적 분자는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 구성성분 결합 특이체를 접합시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각 결합 특이체를 별도로 생성시킨 후에 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이체가 단백질 또는 펩티드인 경우에는, 공유 접합을 위해 각종 커플링제 또는 가교제를 사용할 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC) (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686], [Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조)를 포함한다. 다른 방법은 문헌 [Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132], [Brennan et al., 1985 Science 229:81-83] 및 [Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것들을 포함한다. 접합제는 SATA 및 술포-SMCC (둘 다 피어스 케미컬 컴퍼니(Pierce Chemical Co.) (미국 일리노이주 록포드)가 시판함)이다.

결합 특이체가 항체인 경우, 이것들을 2개 중쇄의 C-말단 힌지 영역을 술피드릴 결합시켜 접합시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 이전에 홀수의 술피드릴 잔기, 예를 들어 1개의 술피드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.

대안적으로, 2가지 결합 특이체 모두가 동일 벡터 내에서 코딩될 수 있고, 동일 숙주 세포 내에서 발현 및 조립될 수 있다. 이 방법은 이중특이적 분자가 mAb×mAb, mAb×Fab, Fab×F(ab')2 또는 리간드×Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일 쇄 항체 및 결합 결정자를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정자를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 2개 이상의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호, 미국 특허 제5,455,030호, 미국 특허 제4,881,175호, 미국 특허 제5,132,405호, 미국 특허 제5,091,513호, 미국 특허 제5,476,786호, 미국 특허 제5,013,653호, 미국 특허 제5,258,498호 및 미국 특허 제5,482,858호에 기재되어 있다.

이중특이적 분자가 그의 특이적 표적에 결합하는 것은, 예를 들어 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA), 방사선면역검정 (REA), FACS 분석, 생물학적 검정 (예를 들어, 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯팅 검정으로 확인할 수 있다. 이들 검정 각각은 일반적으로 특별히 관심이 있는 단백질-항체 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예컨대, 항체)을 이용함으로써 상기 복합체의 존재를 검출한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 C5에 결합하는 본 발명의 항체의 2개 이상의 동일하거나 상이한 항원 결합 부분을 포함하는 다가 화합물을 제공한다. 항원 결합 부분들은 단백질 융합 또는 공유 또는 비-공유 연결을 통해 함께 연결될 수 있다. 대안적으로, 연결 방법은 이중특이적 분자에 대해 기재된 바 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 본 발명의 항체의 불변 영역, 예를 들어 Fc 또는 힌지 영역에 결합하는 항체와 가교시켜서 4가 화합물을 수득할 수 있다.

삼량체화 도메인은 예를 들어 특허 EP 1 012 280B1(Borean)에 기재되어 있다. 오량체화 모듈은 예를 들어 PCT/EP97/05897에 기재되어 있다.

반감기가 연장된 항체

본 발명은 생체내 반감기가 연장된, C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

예를 들어, 신장 여과, 간에서의 대사, 단백질분해 효소 (프로테아제)에 의한 분화 및 면역원성 반응 (예를 들어, 항체에 의한 단백질 중화, 및 대식세포 및 수상돌기 세포에 의한 흡수)과 같은 많은 인자가 단백질의 생체내 반감기에 영향을 미칠 수 있다. 다양한 전략을 이용하여 본 발명의 항체의 반감기를 연장시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), reCODE PEG, 항체 스캐폴드, 폴리시알산 (PSA), 히드록시에틸 전분 (HES), 알부민-결합 리간드, 및 탄수화물 쉴드로의 화학적 연결에 의해; 혈청 단백질, 예컨대 알부민, IgG, FcRn 및 트랜스페린에 결합하는 단백질과의 유전자 융합에 의해; 혈청 단백질, 예컨대 나노바디, Fab, DARPin, 아비머, 애피바디 및 안티칼린에 결합하는 다른 결합 잔기와의 (유전적 또는 화학적) 커플링에 의해; rPEG, 알부민, 알부민의 도메인, 알부민-결합 단백질 및 Fc와의 유전자 융합에 의해; 또는 나노담체(nancarrier), 서방형 제제 또는 의료 장치로의 혼입에 의해 이루어진다.

항체의 생체내 혈청 순환을 연장시키기 위해서, 불활성 중합체 분자, 예컨대 고분자량 PEG를 다관능성 링커를 사용하거나 사용하지 않고 항체 또는 그의 단편에 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 PEG의 부위 특이적 접합을 통해 또는 라이신 잔기에 존재하는 엡실론-아미노기를 통해 부착시킬 수 있다. 항체를 PEG화(pegylation)시키기 위해서는, 이러한 항체 또는 그의 단편을 전형적으로 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건하에 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성의 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화시키는데 사용되었던 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노 (C1-C10)알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함한다. 특정 실시양태에서, PEG화되는 항체는 글리코실화되지 않은 항체이다. 생물학적 활성을 최소로 손실시키는 선형 또는 분지형 중합체 유도체화가 이용될 것이다. 항체에 대한 PEG 분자의 적당한 접합을 확인하기 위해서 접합 정도를 SDS-PAGE 및 질량 분광법으로 면밀히 모니터링할 수 있다. 미반응 PEG는 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 접합체로부터 분리될 수 있다. PEG-유도체화 항체는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 본원에 기재된 면역검정을 이용하여 결합 활성 및 또한 생체내 효능에 대해 시험될 수 있다. 단백질을 PEG화하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용할 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa et al.)를 참조한다.

다른 변형된 PEG화 기술은, 화학적으로 명시된 측쇄를 tRNA 신테타제 및 tRNA를 포함하는 재구축 시스템을 통해 생합성 단백질에 혼입하는, 직교 지시된 조작 기술의 화학적 재구축 (ReCODE PEG)을 포함한다. 상기 기술은 이. 콜라이, 효모 및 포유동물 세포에서 30개 초과의 새로운 아미노산을 생합성 단백질에 혼입할 수 있게 한다. tRNA는 앰버(amber) 코돈이 위치한 임의의 부위에 비-천연 아미노산을 혼입시켜서, 정지 코돈의 앰버가 화학적으로 명시된 아미노산의 혼입을 신호하는 코돈으로 전환되게 한다.

또한, 재조합 PEG화 기술 (rPEG)은 혈청 반감기 연장을 위해 사용될 수도 있다. 이 기술은 300개 내지 600개 아미노산의 비구조화 단백질 테일을 기존의 제약 단백질에 유전적으로 융합시키는 것을 포함한다. 이러한 비구조화 단백질 쇄의 겉보기 분자량은 그의 실제 분자량보다 약 15배 더 높기 때문에, 상기 단백질의 혈청 반감기는 크게 증가된다. 화학적 접합 및 재정제를 필요로 하는 통상적인 PEG화와는 달리, 제조 공정이 크게 간소화되고 생성물은 균일하다.

폴리시알화는 활성 수명을 연장시키고 치료 펩티드 및 단백질의 안정성을 개선시키기 위해서 천연 중합체 폴리시알산 (PSA)을 사용하는 또다른 기술이다. PSA는 시알산의 중합체 (당)이다. 단백질 및 치료 펩티드 약물 전달을 위해 사용되는 경우, 폴리시알산은 접합체에 보호 미세환경을 제공한다. 이것은 순환계 내 치료 단백질의 활성 수명을 증가시키고, 이것이 면역계에 의해 인식되지 않도록 방지한다. PSA 중합체는 인간 신체에서 천연적으로 발견된다. 특정 박테리아는 수백만년에 걸쳐서 자신의 벽을 이것으로 코팅하도록 진화하였다. 이후, 이러한 천연 폴리시알화 박테리아는 분자 모방에 의해 신체의 방어 시스템을 이겨낼 수 있었다. 자연계의 궁극적인 도피(stealth) 기술인 PSA는 이러한 박테리아로부터 대량으로 소정의 물리적 특징을 갖는 것으로서 쉽게 생산될 수 있다. 박테리아 PSA는 인간 신체 내의 PSA와 화학적으로 동일하기 때문에 단백질에 커플링될 때조차도 완전하게 비-면역원성이다.

또다른 기술은 항체에 연결된 히드록시에틸 전분 ("HES") 유도체의 사용을 포함한다. HES는 찰옥수수 전분에서 유래된 변형된 천연 중합체이며, 신체의 효소에 의해 대사될 수 있다. HES 용액은 일반적으로 부족한 혈액 부피를 채우고 혈액의 유동성을 개선시키기 위해 투여된다. 항체의 HES화(hesylation)은 상기 분자의 안정성을 증가시키고 또한 신장 청소율을 감소시켜서 순환 반감기의 연장을 가능하게 하여 생물학적 활성을 증가시킨다. 여러가지 파리미터, 예컨대 HES의 분자량을 변경시킴으로써, 광범위한 범위의 HES 항체 접합체가 맞춤 제조될 수 있다.

증가된 생체내 반감기를 갖는 항체는 또한 1개 이상의 아미노산 변형 (즉, 치환, 삽입 또는 결실)을 IgG 불변 도메인, 또는 그의 FcRn 결합 단편 (바람직하게는 Fc 또는 힌지 Fc 도메인 단편)에 도입하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 국제 공개 제WO 98/23289호, 국제 공개 제WO 97/34631호 및 미국 특허 제6,277,375호를 참조한다.

추가로, 항체는 항체 또는 항체 단편을 생체내에서 보다 안정적이게 하고 보다 긴 생체내 반감기를 갖게 하도록 알부민에 접합시킬 수 있다. 상기 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 국제 공개 제WO 93/15199호, 동 제WO 93/15200호 및 동 제WO 01/77137호, 및 유럽 특허 제EP 413,622호를 참조한다.

반감기를 증가시키는 전략은 나노바디, 피브로넥틴-기재의 결합제, 및 생체내 반감기를 증가시키고자 하는 기타 항체 또는 단백질에 특히 유용하다.

항체 접합체

본 발명은 이종 단백질 또는 폴리펩티드 (또는 그의 단편, 바람직하게는 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개 또는 적어도 100개 아미노산의 폴리펩티드)에 재조합 방식으로 융합되거나 화학적으로 접합 (공유 접합 및 비-공유 접합 둘 다를 포함함)되어 융합 단백질을 생성하는, C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 제공한다. 특히, 본 발명은 본원에 기재된 항체의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, F(ab)2 단편, VH 도메인, VH CDR, VL 도메인 또는 VL CDR) 및 이종 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 항체 또는 항체 단편에 융합 또는 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,336,603호, 동 제5,622,929호, 동 제5,359,046호, 동 제5,349,053호, 동 제5,447,851호 및 동 제5,112,946호, 유럽 특허 제EP 307,434호 및 동 제EP 367,166호, 국제 공개 제WO 96/04388호 및 동 제WO 91/06570호, [Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539], [Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600] 및 [Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341]을 참조한다.

추가의 융합 단백질은 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링 (통칭하여, "DNA 셔플링"이라 지칭함)의 기술을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 활성 변경 (예를 들어, 더 높은 친화도 및 더 낮은 해리 속도를 갖는 항체 또는 그의 단편)에 사용될 수 있다. 일반적으로, 미국 특허 제5,605,793호, 동 제5,811,238호, 동 제5,830,721호, 동 제5,834,252호 및 동 5,837,458호, [Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33], [Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82], [Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76] 및 [Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313] (각각의 이들 특허 및 간행물은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)를 참조한다. 항체 또는 그의 단편, 또는 코딩된 항체 또는 그의 단편은 재조합 전에 오류-유발(error-prone) PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 기타 방법에 의한 무작위 돌연변이유발의 실시로 변경될 수 있다. C5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 1종 이상의 이종 분자의 1종 이상의 성분, 모티프, 절편, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.

추가로, 항체 또는 그의 단편을 마커 서열, 예컨대 정제를 용이하게 하는 펩티드와 융합시킬 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드, 예컨대 특히 pQE 벡터 (퀴아젠, 인크.(QIAGEN, Inc.), 미국 91311 캘리포니아주 채스트워쓰 에톤 애비뉴 9259)에서 제공되는 태그이며, 많은 것들이 시판된다. 예를 들어 문헌 [Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824]에 기재된 바와 같이, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그는 인플루엔자 혈구응집소 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 혈구응집소 ("HA") 태그 ([Wilson et al., 1984, Cell 37:767]), 및 "플래그(flag)" 태그를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 진단제 또는 검출가능한 작용제에 접합된다. 이러한 항체는 특정 요법의 효능을 결정하는 것과 같은 임상 시험 절차의 일부로서 질환 또는 장애의 발병, 발생, 진행 및/또는 중증도를 모니터링하거나 예측하는데 유용할 수 있다. 이러한 진단 및 검출은 항체를 검출가능한 물질, 예를 들어 (이에 제한되지 않음) 다양한 효소, 예컨대 (이에 제한되지 않음) 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제; 보결 분자단, 예컨대 (이에 제한되지 않음) 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴; 형광 물질, 예컨대 (이에 제한되지 않음) 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린; 형광 물질, 예컨대 (이에 제한되지 않음) 루미놀; 생체발광 물질, 예컨대 (이에 제한되지 않음) 루시퍼라제, 루시페린 및 애쿠오린; 방사능 물질, 예컨대 (이에 제한되지 않음) 요오드 (131I, 125I, 123I 및 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중수소 (3H), 인듐 (115In, 113In, 112In 및 111In), 테크네튬 (99Tc), 탈륨 (201Ti), 갈륨 (68Ga, 67Ga), 팔라듐 (103Pd), 몰리브덴 (99Mo), 크세논 (133Xe), 불소 (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn 및 117Tin, 및 양전자 방출 금속 (다양한 양전자 방출 단층촬영술을 이용함), 및 비-방사능 상자성 금속 이온에 커플링시켜 달성될 수 있다.

본 발명은 치료 잔기에 접합된 항체 또는 그의 단편의 사용을 추가로 포함한다. 항체 또는 그의 단편은 치료 잔기, 예컨대 세포독소, 예를 들어 세포증식 억제제 또는 세포파괴제, 치료제 또는 방사능 금속 이온, 예를 들어 알파-방출자에 접합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해로운 임의의 작용제를 포함한다.

추가로, 항체 또는 그의 단편은 주어진 생물학적 반응을 변형시키는 치료 잔기 또는 약물 잔기에 접합될 수 있다. 치료 잔기 또는 약물 잔기는 고전적인 화학적 치료제로 제한되는 것으로 간주되지 않는다. 예를 들어, 약물 잔기는 원하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어 독소, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소 또는 디프테리아 독소, 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 세포자멸제, 항-혈관신생제, 또는 생물학적 반응 개질제, 예를 들어 림포카인을 포함할 수 있다.

추가로, 항체는 치료 잔기, 예컨대 방사능 금속 이온, 예컨대 알파-방출자, 예컨대 213Bi, 또는 방사선금속 이온, 예컨대 (이에 제한되지 않음) 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm을 폴리펩티드에 접합시키는데 유용한 마크로시클릭 킬레이터에 접합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 마크로시클릭 킬레이터는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산 (DOTA)이고, 이것은 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있다. 이러한 링커 분자는 당업계에 일반적으로 공지되어 있고, 문헌 [Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90], [Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7] 및 [Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50] (이들 문헌 각각은 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.

치료 잔기를 항체에 접합시키는 기술은 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)], [Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)], [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)], ["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)] 및 [Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58]을 참조한다.

항체는 또한 면역검정 또는 표적 항원의 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착될 수도 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

5.2. 본 발명의 항체의 생성 방법

5.2.1. 항체를 코딩하는 핵산

본 발명은 상기 기재된 C5-결합 항체 쇄의 절편 또는 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는, 실질적으로 정제된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산의 일부는 서열 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277 또는 281에 기재된 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 서열 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 또는 289에 기재된 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는 표 1에서 확인된 것들이다. 본 발명의 일부 다른 핵산 분자는 표 1에서 확인된 것들의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 65％, 80％, 95％ 또는 99％ 동일함) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 적절한 발현 벡터로부터 발현되는 경우, 이러한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 C5 항원 결합 능력을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명에서는 상기 기재한 C5-결합 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터의 적어도 1개의 CDR 영역 및 일반적으로는 모든 3개의 CDR 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 다른 폴리뉴클레오티드는 상기 기재한 C5-결합 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역 서열을 모두 또는 실질적으로 모두 코딩한다. 코드의 동의성으로 인해, 다양한 핵산 서열이 각각의 이뮤노글로불린 아미노산 서열을 코딩할 것이다.

본 발명의 핵산 분자는 항체의 가변 영역 및 불변 영역을 둘 다 코딩할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열의 일부는 서열 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277 또는 281에 기재된 성숙 중쇄 가변 영역 서열과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80％, 90％ 또는 99％ 동일함) 성숙 중쇄 가변 영역 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 다른 핵산 서열은 서열 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 또는 289에 기재된 성숙 경쇄 가변 영역 서열과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80％, 90％ 또는 99％ 동일함) 성숙 경쇄 가변 영역 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다.

폴리뉴클레오티드 서열은 C5-결합 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 기존의 서열 (예를 들어, 하기 실시예에 기재된 바와 같은 서열)의 드 노보(de novo) 고체-상 DNA 합성 또는 PCR 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 핵산의 직접적인 화학적 합성은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90]의 포스포트리에스테르 방법, 문헌 [Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979]의 포스포디에스테르 방법, 문헌 [Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981]의 디에틸포스포르아미다이트 방법, 및 미국 특허 제4,458,066호의 고체 지지체 방법으로 달성될 수 있다. PCR에 의해 폴리뉴클레오티드 서열로 돌연변이를 도입하는 것은, 예를 들어 문헌 [PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992], [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990], [Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991] 및 [Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991]에 기재된 바와 같이 하여 수행될 수 있다.

또한, 본 발명에서는 상기 기재된 C5-결합 항체를 생성하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 제공된다. C5-결합 항체 쇄 또는 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해 다양한 발현 벡터를 사용할 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서 항체를 생성하기 위해 바이러스-기재 및 비-바이러스 발현 벡터 둘 다 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 및 시스템은 플라스미드, 에피솜 벡터 (전형적으로, 단백질 또는 RNA 발현을 위한 발현 카세트를 가짐), 및 인간 인공 염색체 (예를 들어, 문헌 [Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997] 참조)를 포함한다. 예를 들어, 포유동물 (예를 들어, 인간) 세포에서 C5-결합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 발현시키는데 유용한 비-바이러스 벡터는 pThioHis A, B 및 C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B 및 C (인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 샌디에고), MPSV 벡터, 및 다른 단백질 발현과 관련하여 당업계에 공지된 수많은 다른 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스를 기초로 하는 벡터, SV40, 유두종 바이러스, HBP 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스를 기초로 하는 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스 (SFV)를 기초로 하는 벡터를 포함한다. 문헌 [Brent et al., 상기 문헌], [Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995] 및 [Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992]을 참조한다.

발현 벡터의 선택은 벡터가 발현되는 의도된 숙주 세포에 따라 달라진다. 전형적으로, 발현 벡터는 C5-결합 항체 쇄 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 다른 조절 서열 (예를 들어, 인핸서)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도가능 프로모터는 유도 조건하인 경우 이외에는 삽입된 서열의 발현을 저해하기 위해 사용된다. 유도가능 프로모터는 예를 들어 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열 충격 프로모터를 포함한다. 형질전환된 유기체의 배양물은, 발현 생성물이 숙주 세포에 의해 보다 양호하게 허용되는 서열을 코딩하는 집단으로 편향되지 않으면서 비-유도 조건하에서 증식될 수 있다. 프로모터에 추가하여, C5-결합 항체 쇄 또는 단편의 효율적인 발현을 위해 다른 조절 요소가 또한 요구되거나 요망될 수 있다. 이들 요소는 전형적으로 ATG 개시 코돈 및 인접한 리보솜 결합 부위 또는 다른 서열을 포함한다. 또한, 발현 효율은 사용하는 세포 시스템에 적절한 인핸서를 포함시켜 증진될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994] 및 [Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987] 참조). 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서가 포유동물 숙주 세포에서의 발현 증가를 위해 사용될 수 있다.

발현 벡터는 또한 삽입된 C5-결합 항체 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 융합 단백질을 형성하는 분비 신호 서열 위치를 제공할 수도 있다. 보다 흔히, 삽입된 C5-결합 항체 서열을 신호 서열에 연결시킨 후에 벡터에 포함시킨다. C5-결합 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 서열을 수용하는데 사용되는 벡터는 때때로 또한 불변 영역 또는 그의 일부를 코딩한다. 이러한 벡터는 불변 영역과의 융합 단백질로서의 가변 영역의 발현을 허용함으로써 무손상 항체 또는 그의 단편을 생성할 수 있다. 전형적으로, 이러한 불변 영역은 인간의 것이다.

C5-결합 항체 쇄를 보유하고 발현하는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 이. 콜라이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현시키는데 유용한 원핵 숙주 중 하나이다. 사용하기 적합한 다른 미생물 숙주는 바실러스, 예를 들어 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 장내박테리아, 예를 들어 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이들 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 상용가능한 발현 제어 서열 (예를 들어, 복제 기점)을 함유하는 발현 벡터를 또한 제조할 수 있다. 또한, 임의의 수의 다양한 공지된 프로모터, 예를 들어 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 전형적으로 임의로는 오퍼레이터 서열과 함께 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시하고 종료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다. 본 발명의 C5-결합 폴리펩티드를 발현시키기 위해 다른 미생물, 예를 들어 효모가 또한 사용될 수 있다. 바큘로바이러스 벡터와 조합된 곤충 세포가 또한 사용될 수 있다.

일부 바람직한 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포가 본 발명의 C5-결합 폴리펩티드를 발현시키고 제조하는데 사용된다. 예를 들어, 이것들은 내인성 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 (예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은 1D6.C9 골수종 하이브리도마 클론) 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유동물 세포주 (예를 들어, 하기 예시된 SP2/0 골수종 세포)일 수 있다. 이것들은 임의의 정상적인 사망할 동물 또는 인간 세포, 또는 정상적이거나 비정상적인 불멸 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마를 포함하여 무손상 이뮤노글로불린을 분비할 수 있는 수많은 적합한 숙주 세포주가 개발된 바 있다. 포유동물 조직 세포 배양을 이용하여 폴리펩티드를 발현시키는 것은 예를 들어 문헌 [Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987]에서 일반적으로 논의된다. 포유동물 숙주 세포를 위한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터 및 인핸서 (예를 들어, 문헌 [Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986] 참조), 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 이러한 발현 벡터는 통상적으로 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형-특이적, 단계-특이적 및/또는 조정가능하거나 조절가능한 것일 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도가능 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라사이클린-유도가능 CMV 프로모터 (예컨대, 인간 극초기 CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 및 당업계에 공지된 프로모터-인핸서 조합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

관심 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하는 방법은 세포 숙주의 유형에 따라 달라진다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염은 통상적으로 원핵 세포에 대해 사용되고, 인산칼슘 처리 또는 전기천공은 다른 세포 숙주에 대해 사용될 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Sambrook, et al., 상기 문헌] 참조). 다른 방법은 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포좀-매개 형질전환, 주입 및 미세주입, 발리스트(ballistic) 방법, 비로좀, 면역리포좀, 다중양이온:핵산 접합체, 네이키드(naked) DNA, 인공 비리온, 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22에 대한 융합 ([Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997]), DNA 흡수 증진제, 및 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질의 장기간 고수율 생성을 위해, 종종 안정적인 발현을 원할 것이다. 예를 들어, C5-결합 항체 쇄 또는 결합 단편을 안정적으로 발현하는 세포주는, 바이러스 복제 기점 또는 내인성 발현 요소 및 선별가능한 마커 유전자를 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조할 수 있다. 벡터의 도입 후에 세포를 1일 내지 2일 동안 영양강화 배지에서 성장시킨 후, 선별 배지로 전환할 수 있다. 선별가능한 마커의 목적은 선별에 대한 내성을 부여하기 위한 것이고, 이것의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포가 선별 배지에서 성장하게 한다. 안정적으로 형질감염된 내성 세포는 세포 유형에 적절한 조직 배양 기술을 이용하여 증식될 수 있다.

5.2.2. 본 발명의 모노클로날 항체의 생성

모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법, 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 비롯한 다양한 기술로 생성할 수 있다. 모노클로날 항체를 생성하는 많은 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질전환을 이용할 수 있다.

하이브리도마를 제조하기 위한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마를 생성하는 것은 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위해 면역화된 비장세포를 단리하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차 또한 공지되어 있다.

본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열을 기초로 하여 제조할 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA를 관심 뮤린 하이브리도마로부터 얻고 이것을 조작하여 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하게 할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해서, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 (Cabilly et al.) 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해서, 뮤린 CDR 영역을 당업계에 공지된 방법을 이용하여 인간 프레임워크 내로 삽입할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5225539호 (Winter) 및 미국 특허 제5530101호, 동 제5585089호, 동 제5693762호 및 동 제6180370호 (Queen et al.)를 참조한다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. C5에 대한 이러한 인간 모노클로날 항체는 마우스 면역계가 아닌 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스염색체 마우스는 본원에서 HuMAb 마우스 및 KM 마우스라고 각각 지칭되는 마우스를 포함하고, 본원에서는 이것들을 통칭하여 "인간 Ig 마우스"라고 지칭한다.

HuMAb 마우스^® (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.))는 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화 돌연변이와 함께 재배열되지 않는 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니좌(miniloci)를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859] 참조). 따라서, 상기 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 발현 감소를 나타내고, 면역화에 대한 반응시에 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에서 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 일어나서 고친화도 인간 IgGκ 모노클로날을 생성한다 ([Lonberg, N. et al., 1994 상기 문헌], 문헌 [Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]에서 검토됨, [Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93] 및 [Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546]). HuMAb 마우스의 제조 및 사용, 및 이러한 마우스에 의해 보유되는 게놈 변형은 하기 문헌에 추가로 기재되어 있다: [Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295], [Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656], [Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724], [Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123], [Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830], [Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920], [Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591] 및 [Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851] (상기 모든 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 구체적으로 참고로 포함됨). 추가로, 미국 특허 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 제5,789,650호, 동 제5,877,397호, 동 제5,661,016호, 동 제5,814,318호, 동 제5,874,299호 및 동 제5,770,429호 (Lonberg and Kay (상기 문헌 모두)), 미국 특허 제5,545,807호 (Surani et al.), PCT 공개 제WO 92103918호, 동 제WO 93/12227호, 동 제WO 94/25585호, 동 제WO 97113852호, 동 제WO 98/24884호 및 동 제WO 99/45962호 (Lonberg and Kay (상기 문헌 모두)), 및 PCT 공개 제WO 01/14424호 (Korman et al.)를 참조한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 트랜스진 및 트랜스염색체상에 인간 이뮤노글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예를 들어 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스염색체를 보유하는 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스"라 지칭되며, PCT 공개 WO 02/43478 (Ishida et al.)에 상세하게 기재되어 있다.

추가로, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스제닉 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명의 C5-결합 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(Xenomouse) (압제닉스, 인크.(Abgenix, Inc.))라고 지칭되는 대안적인 트랜스제닉 시스템을 사용할 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 제5,939,598호, 동 제6,075,181호, 동 제6,114,598호, 동 제6,150,584호 및 동 제6,162,963호 (Kucherlapati et al.)에 기재되어 있다.

추가로, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스염색체 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명의 C5-결합 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"라고 지칭되는, 인간 중쇄 트랜스염색체 및 인간 경쇄 트랜스염색체 둘 다를 보유하는 마우스를 사용할 수 있고, 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 추가로, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스염색체를 보유하는 암소가 당업계에 기재된 바 있고 ([Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894]), 본 발명의 C5-결합 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 이용하여 제조할 수도 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 당업계에서 확립되어 있거나 하기 실시예에서 기재된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,223,409호, 동 제5,403,484호 및 동 제5,571,698호 (Ladner et al.), 미국 특허 제5,427,908호 및 동 제5,580,717호 (Dower et al.), 미국 특허 제5,969,108호 및 동 제6,172,197호 (McCafferty et al.), 및 미국 특허 제5,885,793호, 동 제6,521,404호, 동 제6,544,731호, 동 제6,555,313호, 동 제6,582,915호 및 동 제6,593,081호 (Griffiths et al.)를 참조한다.

본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 면역 세포를 재구축한 SCID 마우스를 사용하여 제조할 수도 있는데, 이로써 면역화시에 인간 항체 반응이 발생할 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 제5,476,996호 및 동 제5,698,767호 (Wilson et al.)에 기재되어 있다.

5.2.3. 프레임워크 또는 Fc 조작

본 발명의 조작된 항체는 예를 들어 항체의 특성을 개선시키기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 대해 변형이 이루어진 것을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "역돌연변이"시키는 것이다. 더욱 구체적으로는, 체세포 돌연변이가 일어난 항체는 이러한 항체가 유래된 배선 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인할 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 이것의 배선 형태로 되돌리기 위해, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발에 의해 체세포 돌연변이를 배선 서열로 "역돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "역돌연변이" 항체 역시 본 발명에 포함된다.

또다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내 또는 심지어는 1개 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시켜서 T 세포-에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 포함한다. 이러한 접근법은 "탈면역화(deimmunization)"라고도 지칭되고, 미국 특허 공개 제20030153043호 (Carr et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 추가하여 또는 이러한 변형에 대한 대안으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존적 세포성 세포독성을 변경시키는 변형을 Fc 영역 내에 포함하도록 조작될 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체를 화학적으로 변형시킬 수도 있고 (예를 들어, 1개 이상의 화학적 잔기를 항체에 부착시킬 수 있음), 이것의 글리코실화를 변경시켜 항체의 하나 이상의 기능적 특성이 다시 변경되도록 변형시킬 수도 있다. 각각의 이러한 실시양태는 하기에서 추가로 상세하게 기재된다. Fc 영역 내 잔기의 번호매김은 카바트의 EU 지수의 번호매김이다.

한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역을 변형시켜서 힌지 영역 내의 시스테인 잔기 수를 변경, 예를 들어 증가 또는 감소시킨다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,677,425호 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다.

또다른 실시양태에서, 항체의 Fc 힌지 영역을 돌연변이시켜서 항체의 생물학적 반감기를 감소시킨다. 더욱 구체적으로, 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내로 도입하여 항체가 미감작(native) Fc-힌지 도메인 스타필로코실(Staphylococcyl) 단백질 A (SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖도록 한다. 이러한 접근법은 미국 특허 제6,165,745호 (Ward et al.)에 보다 상세하게 기재되어 있다.

또다른 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기가 증가되도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 제6,277,375호 (Ward)에 기재된 바와 같이, 돌연변이 T252L, T254S, T256F 중 1종 이상이 도입될 수 있다. 대안적으로, 미국 특허 제5,869,046호 및 동 제6,121,022호 (Presta et al.)에 기재된 바와 같이, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해서 항체를 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경시켜서 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개 루프로부터의 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 할 수 있다.

다른 실시양태에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체시켜 항체의 이펙터 기능을 변경시킴으로써 변경된다. 예를 들어, 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체하여 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하게 할 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,624,821호 및 동 제5,648,260호 (Winter et al. (상기 문헌 둘 다))에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

또다른 실시양태에서, 아미노산 잔기 중에서 선택된 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체시켜서 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 저하되거나 파괴된 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 갖도록 할 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제6,194,551호 (Idusogie et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

또다른 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜서 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 94/29351 (Bodmer et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

또다른 실시양태에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력이 증가되고/되거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도가 증가되도록 변형된다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 00/42072 (Presta)에 추가로 상세하게 설명되어 있다. 추가로, 인간 IgG1에서 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 결합 부위가 맵핑되었고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재된 바 있다 (문헌 [Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604] 참조).

또다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 탈글리코실화 항체가 생성될 수 있다 (즉, 항체에 글리코실화가 결핍됨). 글리코실화는 예를 들어 "항원"에 대한 항체의 친화도가 증가되도록 변형시킬 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내의 1개 이상의 글리코실화 부위를 변경시켜 달성될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 이 부위에서 글리코실화가 일어나지 않도록 하는 1개 이상의 아미노산 치환이 일어날 수 있다. 이러한 탈글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,714,350호 및 동 제6,350,861호 (Co et al.)에 더욱 상세하게 기재되어 있다.

추가로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체, 예컨대 푸코실 잔기 수가 감소된 저푸코실화 항체 또는 이분화 GlcNac 구조가 증가된 항체가 생성될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴이 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시켜서 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기재되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hang et al.)는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다. PCT 공개 WO 03/035835 (Presta)는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소된 변이체 CHO 세포주, Lecl3 세포를 기재하고, 이로 인해 상기 숙주 세포 내에서 발현된 항체에서 저푸코실화가 일어난다 (또한, 문헌 [Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공개 WO 99/54342 (Umana et al.)는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하며, 이와 같이 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 이분화 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 ADCC 활성을 증가시킨다 (또한 문헌 [Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조).

5.2.4. 변경된 항체의 조작 방법

상기 논의된 바와 같이, 본원에서 제시된 VH 및 VL 서열 또는 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 C5-결합 항체를 사용하여, 전장 중쇄 및/또는 경쇄 서열, VH 및/또는 VL 서열, 또는 그에 부착된 불변 영역(들)을 변형시켜서 새로운 C5-결합 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명의 C5-결합 항체의 구조적 특징을 이용하여 본 발명의 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 인간 C5에 대한 결합 및 또한 C5의 하나 이상의 기능적 특성의 억제 (예를 들어, 용혈성 검정에서 적혈구 용해의 억제) 특성을 보유하는, 구조적으로 관련이 있는 C5-결합 항체를 생성한다.

예를 들어, 본 발명의 항체의 1개 이상의 CDR 영역 또는 그의 돌연변이는 공지의 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합 방식으로 조합되어, 상기 논의된 바와 같이 재조합 방식으로 조작된 본 발명의 추가의 C5-결합 항체를 생성할 수 있다. 다른 유형의 변형은 상기 섹션에 기재된 것들을 포함한다. 조작 방법을 위한 출발 물질은 본원에서 제공되는 1종 이상의 VH 및/또는 VL 서열, 또는 그의 1종 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성하기 위해, 본원에서 제공되는 1종 이상의 VH 및/또는 VL 서열 또는 그의 1종 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조할 (즉, 단백질로서 발현시킬) 필요는 없다. 오히려, 서열(들) 내에 함유된 정보를 출발 물질로서 사용하여 원래의 서열(들)로부터 유래된 "제2 세대" 서열(들)을 생성한 후에 이러한 "제2 세대" 서열(들)을 단백질로서 제조 및 발현시킨다.

따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195 및 235로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226 및 236으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열 및/또는 서열 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197 및 237로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 항체 서열, 및 서열 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 및 238로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 및 239으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열 및/또는 서열 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 및 240으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 항체 서열로 이루어진 C5-결합 항체를 제조하고, 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜서 1종 이상의 변경된 항체 서열을 생성하고, 상기 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 방법을 제공한다.

따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 9, 25, 41, 53, 69, 81, 97, 109, 115, 123, 139, 153, 167, 181, 189, 203, 212, 220, 229, 243, 249, 254, 258, 274, 278 및 282의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 전장 중쇄 항체 서열, 및 서열 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286 및 290의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 전장 경쇄 항체 서열로 이루어지고 포유동물 세포에서의 발현에 대해 최적화된 C5-결합 항체를 제조하고, 전장 중쇄 항체 서열 및/또는 전장 경쇄 항체 서열 내에서 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜서 1종 이상의 변경된 항체 서열을 생성하고, 상기 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 방법을 제공한다.

변경된 항체 서열은 또한 고정된 CDR3 서열 또는 미국 20050255552에 기재된 바와 같은 최소 필수 결합 결정자, 및 CDR1 및 CDR2 서열에서의 다양성을 갖는 항체 라이브러리를 스크리닝하여 제조될 수 있다. 스크리닝은 항체 라이브러리로부터의 항체를 스크리닝하기에 적절한 임의의 스크리닝 기술, 예를 들어 파지 디스플레이 기술에 따라 수행될 수 있다.

표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 변경된 항체 서열을 제조하고 발현시키킬 수 있다. 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩되는 항체는 본원에 기재된 C5-결합 항체의 기능적 특성 중 하나, 일부 또는 모두를 보유하는 것이며, 기능적 특성은 인간 및/또는 시노몰구스 C5에 대한 특이적 결합을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 상기 항체는 용혈성 검정에서 적혈구 용해를 억제한다.

변경된 항체의 기능적 특성은 당업계에 이용가능하고/하거나 본원에 기재된 표준 검정, 예를 들어 실시예에 기재된 것 (예를 들어, ELISA)을 이용하여 평가할 수 있다.

본 발명의 항체의 조작 방법의 특정 실시양태에서, 돌연변이는 C5-결합 항체 코딩 서열의 전체 또는 일부를 따라 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성되는 변형된 C5-결합 항체는 결합 활성 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 02/092780 (Short)은 포화 돌연변이유발, 합성 라이게이션 조립, 또는 이것들의 조합을 이용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하는 방법을 기재한다. 대안적으로, PCT 공개 WO 03/074679 (Lazar et al.)는 항체의 물리화학적 특성을 최적화하는 전산 스크리닝 방법을 이용한 방법을 기재한다.

5.3. 본 발명의 항체의 특징규명

본 발명의 항체는 다양한 기능적 검정에 의해 특징규명될 수 있다. 예를 들어, 이것들은 용혈성 검정에서 적혈구 용해를 억제하는 능력, C5 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 C5)에 대한 친화도, 에피토프 결합, 단백질분해에 대한 내성 및 보체 캐스케이드의 차단 능력, 예를 들어 MAC 형성 억제 능력을 특징으로 할 수 있다.

다양한 방법을 이용하여 보체 경로 분자의 존재 및 보체 시스템의 활성화를 결정할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6,087,120호 및 [Newell et al., J Lab Clin Med, 100:437-44, 1982]). 예를 들어, 보체 활성은 (i) 적혈구의 보체-매개 용해 (용혈)의 억제 측정, (ii) C3 또는 C5의 절단을 억제하는 능력 측정, 및 (iii) 대체적 경로 매개 용혈의 억제 측정을 통해 모니터링할 수 있다.

가장 흔히 사용되는 2가지 기술은 용혈성 검정 (예를 들어, 문헌 [Baatrup et al., Ann Rheum Dis, 51:892-7, 1992] 참조) 및 면역학적 검정 (예를 들어, 문헌 [Auda et al., Rheumatol Int, 10:185-9, 1990] 참조)이다. 용혈 기술은 전체 서열의 기능적 능력 (고전적 또는 대체 경로)을 측정한다. 면역학적 기술은 특정 보체 성분 또는 분열 생성물의 단백질 농도를 측정한다. 본 발명의 방법에서 보체 활성화를 검출하거나 보체 성분의 활성을 측정하는데 이용될 수 있는 기타 검정은, 예를 들어 T 세포 증식 검정 ([Chain et al., J Immunol Methods, 99:221-8, 1987]), 및 지연형 과민증 (DTH) 검정 ([Forstrom et al., 1983, Nature 303:627-629], [Halliday et al., 1982, in Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test, Academic, New York pp. 1-26], [Koppi et al., 1982, Cell. Immunol. 66:394-406] 및 미국 특허 제5,843,449호)을 포함한다.

용혈 기술에서는, 모든 보체 성분이 존재해야 하고 기능적이어야 한다. 따라서, 용혈 기술은 보체 시스템의 기능적 완전성 및 결핍 둘 다를 스크리닝할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Dijk et al., J Immunol Methods 36: 29-39, 1980], [Minh et al., Clin Lab Haematol. 5:23-34 1983] 및 [Tanaka et al., J Immunol 86: 161-170, 1986] 참조). 고전적 경로의 기능적 능력을 측정하기 위해, 헤모리신 (양 적혈구에 대한 토끼 IgG)으로 피복된 양 적혈구 또는 토끼 항-닭 항체로 감작화된 닭 적혈구를 표적 세포 (감작 세포)로서 사용한다. 이들 Ag-Ab 복합체는 고전적 경로를 활성화시키고, 성분들이 기능적이고 적절한 농도로 존재하는 경우에는 표적 세포를 용해시킨다. 대체적 경로의 기능적 능력을 결정하기 위해, 토끼 적혈구를 표적 세포로서 사용한다 (예를 들어, 미국 특허 제6,087,120호 참조).

MAC (막 공격 복합체) 형성을 억제하는 항체의 능력을 시험하기 위해, MAC 침착 검정을 수행할 수 있다. 간략하게 설명하면, 자이모산을 사용하여 대체적 경로를 활성화시킬 수 있고, IgM을 사용하여 고전적 경로를 활성화시킬 수 있다. Fab를 인간 혈청과 사전 인큐베이션하고, 자이모산 또는 IgM으로 코팅된 플레이트에 첨가한다. MAC 침착의 억제율(％)은, 기준선 (EDTA 처리된 인간 혈청) 및 양성 대조군 (인간 혈청)과 비교하여 각 샘플에 대해 계산될 수 있다.

C5에 결합하는 항체의 능력은 관심 항체를 직접 표지하여 검출할 수도 있고, 또는 항체를 표지하지 않고 결합을 당업계 공지의 다양한 샌드위치 검정 포맷을 이용하여 간접적으로 검출할 수도 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 C5-결합 항체는 C5 폴리펩티드에 대한 참조 C5-결합 항체의 결합을 차단하거나 이것과 경쟁한다. 이것들은 상기한 완전 인간 C5-결합 항체일 수 있다. 이것들은 또한 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 기타 마우스, 키메라 또는 인간화 C5-결합 항체일 수 있다. 참조 항체 결합을 차단하거나 이것과 경쟁하는 능력은 시험 중인 C5-결합 항체가 참조 항체에 의해 규정된 것과 동일하거나 유사한 에피토프, 또는 참조 C5-결합 항체에 의해 결합되는 에피토프에 충분하게 근접한 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. 이러한 항체는 특히 참조 항체에 대해 확인된 유리한 특성을 공유할 가능성이 있다. 참조 항체를 차단하거나 이것과 경쟁하는 능력은 예를 들어 경쟁 결합 검정으로 결정할 수 있다. 경쟁 결합 검정에서, 시험 중인 항체는 공통의 항원, 예컨대 C5 폴리펩티드에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 능력에 대해 조사된다. 과량의 시험 항체가 참조 항체의 결합을 실질적으로 억제한다면, 시험 항체는 항원과의 특이적 결합에 대해 참조 항체와 경쟁한다. 실질적인 억제는 시험 항체가 참조 항체의 특이적 결합을 일반적으로 적어도 10％, 25％, 50％, 75％ 또는 90％ 감소시킨다는 것을 의미한다.

C5 단백질과의 결합에 대한 C5-결합 항체와 참조 C5-결합 항체의 경쟁을 평가하는데 사용될 수 있는 공지된 경쟁 결합 검정이 많이 있다. 이것들은 예를 들어 고체 상 직접 또는 간접 방사선면역검정 (RIA), 고체 상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (문헌 [Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983] 참조), 고체 상 직접 바이오틴-아비딘 EIA (문헌 [Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986] 참조), 고체 상 직접 표지된 검정, 고체 상 직접 표지된 샌드위치 검정 (문헌 [Harlow ＆ Lane, 상기 문헌] 참조), I-125 표지를 사용하는 고체 상 직접 표지 RIA (문헌 [Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988] 참조), 고체 상 직접 바이오틴-아비딘 EIA (문헌 [Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990] 참조), 및 직접 표지된 RIA (문헌 [Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990] 참조)를 포함한다. 전형적으로, 이러한 검정은 고체 표면에 결합된 정제된 항원, 또는 미표지 시험 C5-결합 항체 및 표지된 참조 항체 중 하나를 보유하는 세포의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 항체의 존재하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정하여 측정된다. 통상적으로, 시험 항체는 과량으로 존재한다. 경쟁 검정 (경쟁 항체)으로 확인된 항체는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 참조 항체가 결합하는 에피토프에 입체 장애를 일으키기에 충분히 근접하게 위치한 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.

선택된 C5-결합 모노클로날 항체가 특유의 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해서, 각각의 항체를 시판 시약 (예를 들어, 피어스 (미국 일리노이주 록포드)의 시약)을 사용하여 바이오티닐화시킬 수 있다. 미표지 모노클로날 항체 및 바이오티닐화 모노클로날 항체를 사용한 경쟁 연구는 C5 폴리펩티드 코팅된 ELISA 플레이트를 사용하여 수행할 수 있다. 바이오티닐화 mAb 결합은 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 프로브로 검출할 수 있다. 정제된 C5-결합 항체의 이소형을 결정하기 위해서, 이소형 ELISA를 수행할 수 있다. 예를 들어, 미량역가 플레이트의 웰을 1 ㎍/mL의 항-인간 IgG로 4℃에서 밤새 코팅할 수 있다. 1％ BSA로 차단한 후, 상기 플레이트를 1 ㎍/mL 이하의 모노클로날 C5-결합 항체 또는 정제된 이소형 대조군과 주위 온도에서 1시간 내지 2시간 동안 반응시킨다. 이어서, 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타제-접합된 프로브와 반응시킬 수 있다. 이어서, 플레이트를 발색시키고 분석하여 정제된 항체의 이소형을 결정할 수 있다.

C5 폴리펩티드를 발현하는 살아있는 세포에 대한 모노클로날 C5-결합 항체의 결합을 입증하기 위해, 유동 세포계측을 이용할 수 있다. 간략하게 설명하면, C5를 발현하는 세포주 (표준 성장 조건하에 성장시킴)를 0.1％ BSA 및 10％ 태아 송아지 혈청을 함유하는 PBS 중 다양한 농도의 C5-결합 항체와 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 세척 후, 세포를 1차 항체 염색과 동일한 조건하에 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG 항체와 반응시킨다. 샘플은 단일 세포에 대해 게이팅되는, 광 및 측면 산란 특성을 이용한 FACScan 기기로 분석할 수 있다. 유동 세포계측 검정에 추가하여 또는 그 대신에 형광 현미경을 사용한 대안적인 검정이 이용될 수 있다. 세포를 상기한 바와 같이 정확하게 염색하고 형광 현미경으로 검사할 수 있다. 상기 방법은 개개의 세포의 가시화를 허용하지만, 항원의 밀도에 따라 감도를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 C5-결합 항체는 웨스턴 블롯팅에 의해 C5 폴리펩티드 또는 항원 단편과의 반응성에 대해 추가로 시험될 수 있다. 간략하게 설명하면, 정제된 C5 폴리펩티드 또는 융합 단백질, 또는 C5를 발현하는 세포로부터의 세포 추출물을 제조하여 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 실시할 수 있다. 전기영동 후에, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 10％ 태아 송아지 혈청으로 차단하고, 시험할 모노클로날 항체로 프로빙한다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제를 사용하여 검출할 수 있고, BCIP/NBT 기질 정제 (시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chem. Co.), 미국 미주리주 세인트 루이스)로 발색시킬 수 있다.

기능적 검정의 예는 또한 아래 실시예 섹션에 기재된다.

5.4. 예방적 및 치료적 용도

본 발명은 보체 활성 증가와 관련이 있는 질환 또는 장애의 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하여 보체 활성 증가와 관련이 있는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 연령 관련 황반 변성 (AMD)의 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하여 연령 관련 황반 변성 (AMD)을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 항체는 특히 건성 AMD의 습성 AMD로의 진행 예방, 지도형 위축의 저속화 및/또는 진행 예방, 및 건성 AMD 진행으로 인한 시력 손실의 개선에 사용될 수 있다. 또한, 이것은 습성 AMD 환자의 치료를 위해 항-VEGF 요법과 조합하여 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 보체 관련 질환 또는 장애의 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하여 보체 관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 공지된 보체 관련 질환 또는 장애의 예는 다음을 포함한다: 신경계 장애, 다발성 경화증, 졸중, 길랑 바레 증후군, 외상성 뇌 손상, 파킨슨병, 부적절하거나 바람직하지 못한 보체 활성화 장애, 혈액투석 합병증, 초급성 동종이식 거부, 이종이식 거부, IL-2 요법 동안 인터루킨-2 유도된 독성, 염증 장애, 자가면역 질환의 염증, 크론병, 성인 호흡 곤란 증후군, 화상 또는 동상을 포함하는 열 손상, 허혈후 재관류 상태, 심근 경색, 풍선 혈관성형술, 심폐 우회술 또는 신장 우회술에서의 펌프 후 증후군, 혈액투석, 신장 허혈, 피부선 재구축 후의 장간막 동맥 재관류, 감염성 질환 또는 패혈증, 면역 복합체 장애 및 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), SLE 신염, 증식성 신염, 용혈성 빈혈 및 중증 근무력증. 또한, 기타 공지된 보체 관련 질환은 폐 질환 및 장애, 예컨대 호흡곤란, 객혈, ARDS, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 기종, 폐 색전증 및 경색, 폐렴, 섬유형성 분진 질환, 불활성 분진 및 광물 (예를 들어, 규소, 석탄 분진, 베릴륨 및 석면), 폐 섬유증, 유기 먼지병, 화학적 손상 (자극제 기체 및 화학물질, 예를 들어 염소, 포스겐, 이산화황, 황화수소, 이산화질소, 암모니아 및 염산으로 인함), 연기흡입 손상, 열 손상 (예를 들어, 화상, 동상), 천식, 알레르기, 기관지 수축, 과민성 폐렴, 기생충 질환, 굿파스튜어 증후군, 폐 혈관염, 및 면역 복합체 관련 염증이다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 보체 관련 질환 또는 장애의 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하여 보체 관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 질환 또는 장애는 천식, 관절염 (예를 들어, 류마티스성 관절염), 자가면역 심장 질환, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 허혈-재관류 손상, 바라케-시몬스 증후군, 혈액투석, 전신 루푸스, 홍반성 루푸스, 건선, 다발성 경화증, 이식, 중추신경계 질환, 예컨대 알츠하이머병 및 다른 신경변성 상태, aHUS, 사구체신염, 수포성 유천포창 또는 MPGN II이다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 사구체신염의 치료가 필요한 대상체에게 본 발명의 항체를 포함하는 유효량의 조성물을 투여하여 사구체신염을 치료하는 방법을 제공한다. 사구체신염의 증상은 단백뇨; 사구체 여과율 (GFR)의 감소; 혈청 전해질 변화, 예컨대 질소혈증 (요독증, 과도한 혈액 우레아 질소-BUN) 및 염 저류 (고혈압 및 부종을 야기하는 수분 저류를 유도함); 혈뇨 및 비정상적인 소변 침전물, 예컨대 적혈구 원주; 저알부민혈증; 고지혈증; 및 지질뇨증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 발작성 야간 혈색소뇨증 (PNH)의 치료가 필요한 대상체에게 본 발명의 항체를 포함하는 유효량의 조성물을 투여하여 발작성 야간 혈색소뇨증 (PNH)을 치료하는 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 체외 순환과 관련이 있는 면역 및 지혈 시스템의 기능이상 감소가 필요한 대상체에게 본 발명의 항체를 포함하는 유효량의 조성물을 투여하여 체외 순환과 관련이 있는 면역 및 지혈 시스템의 기능이상을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 환자의 혈관으로부터의 환자의 혈액을 보체 활성화, 혈소판 활성화, 백혈구 활성화, 또는 혈소판-백혈구 부착 중 하나 이상을 야기할 수 있는 물질을 포함하는 관강 표면을 갖는 도관을 통해 다시 환자의 혈관으로 순환시키는 것을 수반하는 임의의 절차에 사용될 수 있다. 이러한 절차는 모든 형태의 ECC, 및 또한 인공 또는 외래 장기, 조직 또는 혈관을 환자의 혈액 회로로 도입하는 것을 수반하는 절차를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 치료제로 치료할 대상체에게는 황반 변성과 관련이 있는 상태를 치료하는 것으로 공지된 방법, 예를 들어 미국 특허 제6,218,368호에 기재된 바와 같은 항생체 처치를 이용하여 다른 치료제를 투여할 수도 있다. 다른 치료법에서는, 시클로스포린과 같은 면역억제제가 면역 반응을 억제할 수 있는 작용제이다. 이들 작용제는 세포독성 약물, 코르티코스테로이드, 비-스테로이드성 항-염증 약물 (NSAID), 특이적 T-림프구 면역억제제, 및 항체 또는 그의 단편을 포함한다 (문헌 [Physicians' Desk Reference, 53rd edition, Medical Economics Company Inc., Montvale, N.J. (1999)] 참조). 면역억제제 처치는 전형적으로 1주, 1개월, 3개월, 6개월 또는 1년의 기간 동안 간격을 두고 지속된다. 일부 환자에서는, 환자의 나머지 일생 동안 치료제를 투여한다.

본 발명의 치료제가 또다른 작용제와 함께 투여되는 경우, 이들 2가지 물질은 임의의 순서로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 항체는 제2 작용제 (예를 들어, 베르테포르핀)를 사용한 요법도 수행 중인 대상체에게 투여된다. 다른 측면에서, 결합 분자는 외과 치료와 관련하여 투여된다.

C5-결합 항체를 사용한 조합 치료에 적합한 작용제는 보체 성분의 활성을 조정할 수 있는 것으로 당업계에 공지된 작용제를 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 제5,808,109호 참조). 보체-매개 활성을 저하시키는 다른 작용제가 보고된 바 있다. 이러한 작용제는 다음을 포함한다: 아미노산 ([Takada, Y. et al., Immunology 1978, 34, 509]), 포스포네이트 에스테르 ([Becker, L. Biochem. Biophy. Acta 1967, 147, 289]), 폴리음이온 물질 ([Conrow, R. B. et al., J. Med. Chem. 1980, 23, 242]), 술포닐 플루오라이드 ([Hansch, C.; Yoshimoto, M. J. Med. Chem. 1974, 17, 1160] 및 상기 문헌에서 인용된 참조문헌), 폴리뉴클레오티드 ([DeClercq, P. F. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975, 67, 255]), 피마르산 ([Glovsky, M. M. et al., J. Immunol. 1969, 102, 1]), 포르핀 ([Lapidus, M. and Tomasco, J. Immunopharmacol. 1981, 3, 137]), 여러가지 항-염증제 ([Burge, J. J. et al., J. Immunol. 1978, 120, 1625]), 페놀 ([Muller-Eberhard, H. J. 1978, in Molecular Basis of Biological Degradative Processes, Berlin, R. D. et al., eds. Academic Press, New York, p. 65]), 및 벤즈아미딘 ([Vogt, W. et al., Immunology 1979, 36, 138]). 이들 작용제 중 일부는 프로테아제 및 에스테라제의 일반적 억제를 통해 기능한다. 기타 작용제는 보체 경로 중 어떠한 특정 중간 단계에도 특이적이지 않지만, 대신에 보체 활성화의 하나 초과의 단계를 억제한다. 후자 화합물의 예는 C1, C4 및 C5 사용을 차단하는 벤즈아미딘을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Vogt et al., Immunol. 1979, 36, 138] 참조).

보체 성분의 활성을 억제할 수 있는 것으로 당업계에 공지된 추가의 작용제는 스타키보트리스(Stachybotrys)로부터의 진균 대사물질인 K-76을 포함한다 ([Corey et al., J. Amer. Chem. Soc. 104: 5551, 1982]). K-76 및 K-76 COOH 둘 다 주로 C5 단계에서 보체를 억제하고 ([Hong et al., J. Immunol. 122: 2418, 1979], [Miyazaki et al., Microbiol. Immunol. 24: 1091, 1980]), 정상적인 인간 보체로부터의 화학주성 인자의 생성을 방지 ([Bumpers et al., Lab. Clinc. Med. 102: 421, 1983])하는 것으로 나타났다. 고 농도의 K-76 또는 K-76 COOH에서는, 이들 각각의 이전 중간체와 C2, C3, C6, C7 및 C9의 반응이 일부 억제되는 것으로 나타난다. K-76 또는 K-76 COOH는 또한 보체의 C3b 불활성화 시스템을 억제하는 것으로 보고된 바 있다 ([Hong et al., J. Immunol. 127: 104-108, 1981]). 본 발명의 방법을 실시하는데 적합한 기타 작용제는 그리세오풀빈 ([Weinberg, in Principles of Medicinal Chemistry, 2d Ed., Foye, W. O., ed., Lea ＆ Febiger, Philadelphia, Pa., p. 813, 1981]), 이소판나린 ([Djura et al., Aust. J. Chem. 36: 1057, 1983), 및 시포노딕티온 코랄리-파굼(Siphonodictyon coralli-phagum)의 대사물질 ([Sullivan et al., Tetrahedron 37: 979, 1981])을 포함한다.

조합 요법은 부가적일 수도 있고 상승작용적 결과 (예를 들어, 보체 경로 활성의 감소가 2종의 작용제의 조합 사용에 대해 예상된 것보다 더 큼)를 야기할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 C5-결합 항체 및 항-혈관신생제, 예컨대 항-VEGF 작용제를 사용하여 AMD 또는 상기한 바와 같은 또다른 보체 관련 질환을 예방 및/또는 치료하는 조합 요법을 제공한다.

5.5. 진단 용도

한 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액, 혈청, 세포, 조직)에서 또는 질환 또는 장애를 앓고 있거나 또는 AMD와 관련이 있는 장애가 발생할 위험이 있는 개체로부터 C5 단백질 및/또는 핵산 발현 및 또한 C5 단백질 기능을 결정하는 진단 검정을 포함한다.

진단 검정, 예컨대 경쟁적 검정은 표지된 유사체 ("추적자")가 시험 샘플 분석물질과 공통의 결합 파트너에 존재하는 제한된 수의 결합 부위에 대해 경쟁하는 능력에 따라 달라진다. 일반적으로 경쟁 전 또는 경쟁 후에 결합 파트너를 불용화시킨 후에 결합 파트너에 결합된 추적자 및 분석물질을 미결합 추적자 및 분석물질로부터 분리한다. 이러한 분리는 경사분리 (결합 파트너가 사전에 불용화된 경우) 또는 원심분리 (결합 파트너가 경쟁 반응 후에 불용화된 경우)에 의해 달성된다. 시험 샘플 분석물질의 양은 마커 물질의 양으로 결정되는 바와 같은 결합된 추적자의 양에 반비례한다. 공지된 양의 분석물질을 이용한 용량-반응 곡선을 작성하고, 이것을 시험 결과와 비교하여 시험 샘플에 존재하는 분석물질의 양을 정량적으로 결정한다. 이러한 검정은, 측정가능한 마커로서 효소가 사용되는 경우에 ELISA 시스템이라 지칭된다. 이러한 형태의 검정에서는, 항체와 C5-결합 항체 사이의 경쟁적 결합으로 인해 결합된 C5 단백질, 바람직하게는 본 발명의 C5 에피토프가 생성되는데, 이는 혈청 샘플 중의 항체, 가장 특히 혈청 샘플 중의 중화 항체의 척도가 된다.

상기 검정의 유의한 이점은 중화 항체 (즉, C5 단백질, 구체적으로는 에피토프의 결합을 방해하는 항체)를 직접 측정한다는 점이다. 특히 ELISA 시험 형태의 이러한 검정은 임상 환경 및 통상적인 혈액 스크리닝에 상당한 정도로 적용되고 있다.

면역학적 기술은 다양한 보체 성분 (예를 들어, C3, C4, C5)의 상이한 에피토프에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하여 예를 들어 보체 성분의 분열 생성물을 검출한다 (예를 들어, 문헌 [Hugli et al., Immunoassays Clinical Laboratory Techniques 443-460, 1980], [Gorski et al., J Immunol Meth 47: 61-73, 1981], [Linder et al., J Immunol Meth 47: 49-59, 1981] 및 [Burger et al., J Immunol 141: 553-558, 1988] 참조). 이어서, 항체가 공지된 농도의 표지된 분열 생성물과 경쟁하여 분열 생성물과 결합하는 정도를 측정할 수 있다. 다양한 검정, 예를 들어 방사선면역검정, ELISA 및 방사상 확산 검정이 보체 분열 생성물의 검출에 이용가능하다.

면역학적 기술은 보체 활성화를 검출할 수 있는 높은 감도를 제공하는데, 이는 이러한 기술로 황반 변성 관련 장애가 있거나 없는 시험 대상체 및 대조군 대상체로부터의 혈액 중 분열 생성물의 형성을 측정할 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 일부 방법에서, 안구 장애와 관련이 있는 장애의 진단은, 시험 대상체로부터의 혈액 혈장 중 보체 성분의 가용성 분열 생성물의 정량화를 통해 비정상적인 보체 활성화를 측정함으로써 이루어진다. 이러한 측정은 예를 들어 문헌 [Chenoweth et al., N Engl J Med 304: 497-502, 1981] 및 [Bhakdi et al., Biochim Biophys Acta 737: 343-372, 1983]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 바람직하게는, 오직 생체내 형성된 보체 활성화만이 측정된다. 이것은 보체 시스템의 억제제를 함유하는 매질에 해당 대상체로부터의 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈청)을 수집한 후에 상기 샘플에서의 보체 활성화를 측정 (예를 들어, 분열 생성물의 정량화)하여 달성할 수 있다.

안구 질환 또는 장애와 관련된 장애를 갖는 환자의 임상적 진단 또는 모니터링시에, 정상 대상체로부터의 상응하는 생물학적 샘플에서의 수준과 비교해서 보체 단백질이 검출된다는 것은 환자가 황반 변성과 관련이 있는 장애를 갖는다는 지표이다.

생체내 진단 또는 영상화가 US2006/0067935에 기재되어 있다. 간략하게 설명하면, 이들 방법은 일반적으로 환자에게 비-침습 방법에 의해 검출가능한 마커 또는 표지에 작동가능하게 부착된 C5 결합 분자의 진단 유효량을 투여 또는 도입하는 것을 포함한다. 항체-마커 접합체를 안구에 국소화하고 안구 내에서 보체 단백질과 결합하기에 충분한 시간을 제공한다. 이어서, 환자를 검출 장치에 노출시켜서 검출가능한 마커를 확인함으로써 환자의 안구 내에서 C5 결합 분자의 위치에 관한 영상이 형성된다. C5 결합 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 존재는 항체-마커가 안구의 성분과 결합하는지 여부를 결정하여 검출된다. AMD 질환이 없는 정상 개체와 비교해서 선택된 보체 단백질 또는 단백질 조합물의 수준 증가가 검출된 것은, 황반 변성과 관련이 있는 장애에 대한 소인 및/또는 상기 장애 발병의 지표이다. 본 발명의 이러한 측면은 또한 안구 영상화 방법 및 복합 혈관신생 진단 및 치료 방법에 사용하기에 바람직하다.

본 발명은 또한 진단 검정, 예후 검정, 약리유전학 및 임상 시험 모니터링을 예후 (예측) 목적으로 사용함으로써 개체를 예방적으로 치료하는 예측 의학 분야에 관한 것이다.

본 발명은 또한 개체가 보체 경로 활성의 조절이상과 관련이 있는 장애가 발병할 위험에 있는지의 여부를 결정하기 위한 예후 (또는 예측) 검정을 제공한다. 예를 들어, C5 유전자 내의 돌연변이를 생물학적 샘플에서 검정할 수 있다. 이러한 검정을 예후 또는 예측 목적으로 사용함으로써, C5 단백질, 핵산 발현 또는 활성을 특징으로 하거나 이와 관련이 있는 장애의 발병 전에 개체를 예방적으로 치료할 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 개체에서 C5 핵산 발현 또는 C5 단백질 활성을 결정함으로써 상기 개체에게 적절한 치료제 또는 예방제를 선별하는 방법을 제공한다 (본원에서 "약리유전학"이라 지칭됨). 약리유전학은 개체의 유전자형 (예를 들어, 개체가 특정 작용제에 대해 반응하는 능력을 결정하기 위해 조사한 개체의 유전자형)을 기초로 하여 개체를 치료적 또는 예방적 처치하기 위한 작용제 (예를 들어, 약물)을 선택할 수 있게 한다.

본 발명의 또다른 측면은 임상 시험에서 C5 단백질의 발현 또는 활성에 대한 작용제 (예를 들어, 약물)의 영향을 모니터링하는 것에 관한 것이다.

5.6. 제약 조성물

본 발명은 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된 C5-결합 항체 (무손상 또는 결합 단편)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 보체-관련 질환 (예를 들어, AMD)을 치료 또는 예방하기에 적합한 1종 이상의 다른 치료제를 추가로 함유할 수 있다. 제약상 담체는 조성물을 향상시키거나 안정화시키거나, 또는 조성물의 제조를 용이하게 한다. 제약상 허용되는 담체는 생리적으로 상용가능한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항-박테리아제 및 항-진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.

본 발명의 제약 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여할 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라진다. 투여가 정맥내, 근육내, 복막내 또는 피하이거나, 표적 부위에 근접하게 투여되는 것이 바람직하다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 안구 안으로 유리체내 투여될 수 있도록 제제화된다. 제약상 허용되는 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합해야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.

조성물은 멸균되고 유체여야 한다. 적당한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액제의 경우에는 필요한 입도의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직하다. 주사가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물 중에 포함시켜 유도될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 당업계에 공지되고 통상적으로 실시되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000] 및 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다. 제약 조성물은 바람직하게는 GMP 조건하에 제조된다. 전형적으로, C5-결합 항체의 치료 유효 용량 또는 효능 용량이 본 발명의 제약 조성물에 사용된다. C5-결합 항체는 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 제약상 허용되는 투여 형태로 제제화된다. 투약법은 원하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스를 투여할 수도 있고, 여러 분할 용량을 시간에 걸쳐 투여할 수도 있으며, 또는 치료적 상황의 요건에 의해 나타나는 바에 따라 용량을 비례적으로 감소시키거나 증가시킬 수도 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 치료할 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하고, 각 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 원하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다.

본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성이 아니면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양이 달성되도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 다양한 약력학 인자, 예를 들어 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정 화합물의 배출 속도, 처치 기간, 사용된 특정 조성물과 조합되어 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 의학적 병력 및 기타 인자에 따라 달라진다.

전문의 또는 수의사는 제약 조성물 중에 사용되는 본 발명의 항체의 투여를 원하는 치료 효과 달성에 필요한 것보다 더 낮은 수준에서 시작할 수 있고, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 알레르기성 염증성 장애의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리적 상태, 환자가 인간인지 동물인지의 여부, 투여되는 다른 약제, 및 처치가 예방적인지 또는 치료적인지의 여부를 비롯한 많은 상이한 인자에 따라 달라진다. 치료 투여량은 안전성 및 효능이 최적화되도록 적정할 필요가 있다. 항체를 전신 투여하는 경우, 투여량 범위는 숙주 체중 1 kg 당 약 0.0001 내지 100 mg, 더욱 일반적으로는 0.01 내지 15 mg의 범위이다. 예시적인 치료법은 2주 당 1회, 또는 1개월 당 1회, 또는 3개월 내지 6개월마다 1회의 전신 투여를 수반한다. 항체를 유리체내 투여하는 경우, 투여량은 약 0.0001 내지 약 10 mg의 범위이다. 예시적인 치료법은 2주 당 1회, 또는 1개월 당 1회, 또는 3개월 내지 6개월마다 1회의 전신 투여를 수반한다.

항체는 일반적으로 여러회 투여된다. 단일 투여량 사이의 간격은 매주, 매월 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 C5-결합 항체의 혈액 수준을 측정하여 나타나는 바에 따라 불규칙할 수도 있다. 전신 투여의 일부 방법에서, 투여량은 1 내지 1000 ㎍/mL, 일부 방법에서는 25 내지 500 ㎍/mL의 혈장 항체 농도가 달성되도록 조정된다. 대안적으로, 빈도를 덜하게 하여 투여하는 것이 요구되는 경우에는 항체를 지속 방출 제제로서 투여할 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라서 달라진다. 일반적으로, 인간화 항체는 키메라 항체 및 비-인간 항체보다 더 긴 반감기를 보인다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 치료적인지의 여부에 따라서 달라질 수 있다. 예방적 용도에서는 상대적으로 낮은 투여량을 장기간에 걸쳐 상대적으로 드문 간격으로 투여한다. 일부 환자는 그들의 나머지 일생 동안 계속 치료를 받는다. 치료 용도에서는, 때때로 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 완화를 보일 때까지 상대적으로 짧은 간격의 상대적으로 높은 투여량이 요구된다. 그 후, 환자에게 예방적 요법제를 투여할 수 있다.

6. 실시예

하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 발명의 다른 변형은 당업자에게 매우 명백할 것이고, 첨부하는 특허청구범위에 포함된다.

실시예 1: 시노몰구스 C5 및 인간 C5 의 생성

1. 시노몰구스 C5 의 생성

시노몰구스 C5를 MOR07086 인간 IgG1을 사용한 친화도 크로마토그래피를 통해 시노몰구스 혈청으로부터 성공적으로 정제하였다. 시노몰구스 C5를 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯팅, 질량 분광법 및 용혈성 검정으로 품질 시험하였다. 정제된 시노몰구스 C5의 품질은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에서 높은 것으로 나타났다. C3 오염이 없는 것은 SDS 및 웨스턴 블롯팅으로 확인되었다. 또한, 시노몰구스 C5 서열을 질량 분광 분석으로 확인하였고, 정제된 시노몰구스 C5의 활성은 용혈성 검정으로 시험하였다. 용혈성 검정에서, 신규 제제는 인간 C5와 동등하게 강력하였다 (예를 들어, 샘플 6 (친화도 성숙 패닝에 사용되었음. 20％ 인간 C5-결핍된 혈청의 보체 활성을 정제된 인간 C5와 유사한 활성을 갖도록 재구축함)).

2. 인간 및 시노몰구스 바이오티닐화 및 비- 바이오티닐화 C5 단백질의 품질 조사

정제된 인간 C5의 생물활성을 특징규명하고, 대체적 경로 용혈성 활성으로 확인하였다. C5를 C5-결핍된 인간 혈청 중에 다양한 농도로 스파이크하여 EC₅₀을 구하였다. 0.02 내지 0.1 nM 범위의 EC₅₀ 값을 허용가능한 것으로 간주하였다.

모든 정제된 인간 C5 단백질 제품은 사용 전에 이것들의 생물활성을 용혈성 검정으로 시험하였다. 동일한 품질 조사를 시노몰구스 혈청으로부터 정제한 후의 시노몰구스 C5에 대해 행하였다. 인간 및 시노몰구스 C5의 바이오티닐화 후, 상기 물질의 생물활성을 또한 용혈성 검정으로 시험하여, 바이오티닐화로 인한 활성 손실이 있었는지의 여부를 분석하였다.

실시예 2: HuCAL 골드( GOLD ) ^® 라이브러리로부터의 C5 -특이적 항체의 생성

항체 변이체 단백질의 공급원으로서 시판되는 파지 디스플레이 라이브러리, MorphoSys HuCAL 골드^® 라이브러리를 사용하여 높은 결합 친화도를 갖는 클론을 선별함으로써 C5 항체를 생성하였다.

HuCAL 골드^® 라이브러리는 모든 6개 CDR이 적절한 돌연변이에 의해 다양화되고, Fab를 파지 표면에 연결하기 위해 CysDisplay™ 기술 (WO 01/05950, Loehning et al., 2001)을 이용하는 Fab 라이브러리 [Knappik et al., 2000]이다.

1. 라이브러리로부터의 C5 특이적 항체의 패닝에 의한 선별

C5에 대한 항체의 선별을 위해, 2가지 상이한 패닝 전략을 적용하였다. 6개의 상이한 풀로 하기 전략의 3회 라운드를 각각 실시하였다: (a) 항원 (인간 및 시노몰구스 C5)을 맥시소르프(Maxisorp) 96웰 미량역가 플레이트 (넌크(Nunc), 독일 비스바덴)에 직접 코팅시킨 고체 상 패닝, 또는 (b) 파지-항원 복합체가 각각의 패닝 풀마다 스트렙타비딘 자성 비드 (다이나비즈(Dynabeads) M-280, 다이날(Dynal))에 포획된, 바이오티닐화된 인간 및 시노몰구스 C5를 사용한 용액 패닝.

HuCAL 골드^® 라이브러리를 34 ㎍/mL 클로르암페니콜 및 1％ 글루코스를 함유하는 2×YT 배지 (2×YT-CG) 중에서 증폭시켰다. OD600nm 0.5 (진탕 없이 37℃에서 30분, 250 rpm의 진탕하에 37℃에서 30분)에서 VCSM13 헬퍼 파지로 감염시킨 후, 세포를 회전시키고 (4120 g, 5분, 4℃), 2×YT/34 ㎍/mL 클로르암페니콜/50 ㎍/mL 카나마이신/0.25 mM IPTG 중에 재현탁시켜 22℃에서 밤새 성장시켰다. 상기 상등액으로부터 파지를 PEG-침전시켜 PBS/20％ 글리세롤 중에 재현탁하고, -80℃에서 저장하였다. 2회의 패닝 라운드 사이의 파지 증폭은 다음과 같이 수행하였다: 중간-log 단계의 이. 콜라이 TG1 세포를 용출된 파지로 감염시키고, 1％ 글루코스 및 34 ㎍/mL 클로르암페니콜이 보충된 LB 한천 (LB-CG 플레이트)에 플레이팅하였다. 30℃에서 밤새 인큐베이션한 후, TG1 콜로니를 한천 플레이트로부터 긁어내고, OD600nm 0.5에 도달할 때까지 2×YT-CG에 접종해 두었다. VCSM13 헬퍼 파지를 상기한 바와 같이 감염을 위해 첨가하였다.

모든 패닝 전략에서 유도된 354개의 클론을 서열분석하였고, 원하는 프로파일 (인간 및 시노몰구스 C5에 결합하고, 카운터 표적 C3 및 C4에는 결합하지 않음)을 갖는 64개의 독특한 클론이 생성되었다.

고체 상 패닝에서 유도된 45개의 클론 및 용액 패닝에서 유도된 19개의 클론을 단백질 발현 및 정제를 위해 선택하였다. 고체 상 패닝으로부터의 4종의 Fab (MOR06525, MOR06756, MOR06757 및 MOR06763) 및 용액 패닝으로부터의 6종의 Fab (MOR07086, MOR07087, MOR07091, MOR07092, MOR07093 및 MOR07094)를 친화도 성숙시켰다.

직접 코팅된 단백질에서의 C5 에 대한 고체 상 패닝

첫번째 패닝 변형법은 고체 상 패닝 교대 인간 C5 (제1 및 제3 라운드의 선별) 및 시노몰구스 C5 (제2 라운드의 선별)였다.

맥시소르프 플레이트 (F96 넌크-이뮤노플레이트(Nunc-Immunoplate))의 3개 웰을 각각 4℃에서 밤새 50 nM C5 200 ㎕로 코팅하였다. 코팅된 웰을 PBS 400 ㎕로 2회 세척하고, 5％ MPBS 350 ㎕로 2시간 동안 실온에서 미량역가 플레이트 진탕기에서 차단하였다. 각각의 패닝마다 약 10¹³개의 HuCAL 골드^® 파지-항체를 동일 부피의 PBST/5％ 분유로 2시간 동안 실온에서 차단하였다. 코팅된 웰을 차단 절차 후에 PBS 400 ㎕로 2회 세척하였다. 사전 차단된 HuCAL 골드^® 파지-항체 200 ㎕를 각 코팅된 웰에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 진탕기에서 인큐베이션하였다. PBS/0.05％ 트윈(Tween) 350 ㎕의 5회 첨가로 세척을 수행한 후에 PBS로 5회 더 세척하였다. 일부 패닝 조건의 경우에는 보다 엄격한 세척 절차를 적용하였다.

플레이트로부터의 파지의 용출은 웰 1개 당 10 mM Tris/HCl (pH 8) 중 20 mM DTT 200 ㎕를 10분 동안 사용하여 수행되었다. DTT 파지 용출액을 OD600이 0.6 내지 0.8이 될 때까지 37℃에서 2YT 배지 중에 성장시킨 이. 콜라이 TG1 15 mL에 첨가하고, 50 mL 플라스틱 튜브에서 45분 동안 37℃에서 파지 감염을 위해 진탕 없이 인큐베이션시켰다. 5분 동안 4120×g에서 원심분리한 후, 박테리아 펠렛을 2×YT 배지 600 ㎕ 중에 각각 재현탁하고 3×YT-CG 한천 플레이트에 플레이팅하여 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 콜로니를 플레이트에서 긁어내어, 상기한 바와 같이 파지를 구조하고 증폭시켰다.

고체 상 패닝의 제2 및 제3 라운드를 제1 라운드의 프로토콜에 따라 수행하였다. 제2 선별 라운드에서 일부 패닝 조건의 경우에는 제1 라운드의 결과를 시노몰구스 C5의 선별에 사용하여, 시노몰구스 교차-반응성 항체가 풍부하게 하였다.

일부 패닝 조건의 경우에는 3회 라운드의 선별 내에서 세척 엄격도를 증가시키고 항원 농도를 감소시켜서 고친화도 항체를 생성하였다.

HuCAL 골드^® 파지미드 라이브러리를 사용하여 인간 C5에 대한 특이적 Fab 항체 단편을 선별하였다. 첫번째 전략은 직접 코팅된 인간 C5 단백질에 대한 고체 상 패닝이었다 (패닝 절차는 상기 기재됨).

제3 패닝 라운드 후, 풍부해진 파지 풀을 pMORPH^®23 라이브러리 벡터 (파지 표면에서의 효율적인 항체 디스플레이를 허용함)로부터 가용성 Fab의 주변세포질 발현을 매개하는 pMORPH^®x9_Fab_MH 발현 벡터로 서브클로닝하였다. 단일 클론을 골라내고, 이들 단일 클론으로부터 가용성 Fab를 발현시켰다.

전부 합하여 6624개 클론을 박테리아 용해물로부터의 Fab를 맥시소르프 미량역가 플레이트에 고정된 인간 C5에 직접 결합시켜 수행된 1차 스크리닝으로 분석하였다. 인간 C5에 대한 1차 스크리닝으로부터 백그라운드보다 >5배의 신호를 갖는 1660개 히트를 수득하였다. 2차 스크리닝으로 384개의 히트를 추가로 분석하여 인간 C5에 대한 결합을 확인하고 카운터 표적 인간 C3 및 C4와의 결합에 대해 스크리닝하였다.

많은 1차 히트가 인간 C5에 대해 확인될 수 있었고, 인간 C3 및 C4에는 교차-반응성을 나타내지 않았지만 오직 6종의 Fab만이 시노몰구스 C5에 약한 교차-반응성이 있었다.

첫번째 결과로서 새로운 고체 상 패닝을 인간 및 시노몰구스 C5에 대해 교대로 수행하였다. 대등하게, 정제된 시노몰구스 C5 배치(batch)의 품질 조사는 시노몰구스 C5 배치 내 다량의 시노몰구스 C3을 밝혀냈다. 이러한 결과를 고려하여, 시노몰구스 교차-반응성 항체를 스크리닝하기 위한 새로운 방법을 적용하였다. C5-결합 폴리클로날 항체를 사용하여 시노몰구스 C5를 시노몰구스 혈청으로부터 포획하였다 (실시예 3, 섹션 3 참조). 이 방법으로, 처음의 1차 히트를 시노몰구스 C5에 대해 다시 스크리닝하였고, 시노몰구스 C5와의 결합에 대해 56개의 클론을 확인하였다.

교대 고체 상 패닝의 경우, 가장 성공적인 12회의 인간 고체 상 패닝의 제1 라운드 결과를 시노몰구스 C5에 대한 선별에 이용하였다 (단백질 배치는 시노몰구스 C3으로 오염됨. 패닝 동안 알려지지 않음). 376개의 클론이 인간 C5와의 결합에 대한 2차 스크리닝에서 확인되었고, 361개의 클론이 시노몰구스 혈청으로부터 포획된 시노몰구스 C5와의 결합에 대해 확인되었다.

바이오티닐화 C5 단백질에서의 용액 패닝

두번째 패닝 변형법은 생물학적 활성 (용혈성 검정에서) 바이오티닐화된 인간 C5 및 바이오티닐화된 시노몰구스 C5에 대한 용액 패닝이였다.

이러한 패닝을 위해, 스트렙타비딘 자성 비드 (다이나비즈 M-280, 다이날) 200 ㎕을 PBS로 1회 세척하고, 케미블로커(Chemiblocker)로 2시간 동안 실온에서 차단하였다. 또한, PBS 희석된 파지 300 ㎕를 케미블로커로 1시간 내지 2시간 동안 실온에서 회전기에서 차단하였다. 차단된 파지를 차단된 스트렙타비딘 자성 비드 50 ㎕에 30분 동안 2회 사전-흡착시켰다. 파지 상등액을 새로운 차단된 2 mL 반응 튜브로 옮기고, 바이오티닐화 인간 C5를 첨가하여 1시간 동안 실온에서 회전기에서 인큐베이션하였다. 차단된 스트렙타비딘 자성 비드 100 ㎕를 각 패닝 풀에 첨가하여 회전기에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 상기 비드를 대략 2.5분 동안 입자 분리기 (다이날 MPC-E)로 수집하고, 용액을 조심스럽게 제거하였다.

이어서, 비드를 회전기를 사용하여 PBS/0.05％ 트윈 중에 7회 세척한 후, PBS로 3회 더 세척하였다. 다이나비즈로부터의 파지 용출은 10 mM Tris/HCl (pH 8) 중 20 mM DTT 200 ㎕를 각 튜브에 첨가하고 10분 동안 인큐베이션하여 수행하였다. 자성 입자 분리기로 다이나비즈를 제거하고, 상등액을 OD600nm 0.6 내지 0.8로 성장시킨 이. 콜라이 TG-1 배양물 15 mL에 첨가하였다. 이어서, 비드를 PBS 200 ㎕로 1회 세척하고, 추가로 제거된 파지와 함께 PBS를 이. 콜라이 TG-1 배양물 15 mL에 첨가하였다. 파지 감염을 위해서, 상기 배양물을 50 mL 플라스틱 튜브에서 45분 동안 37℃에서 진탕 없이 인큐베이션하였다. 4120×g로 5분 동안 원심분리한 후, 박테리아 펠렛을 각각 2×YT 배지 600 ㎕ 중에 재현탁하여 3×YT-CG 한천 플레이트에 플레이팅하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 상기 플레이트로부터 콜로니를 긁어내고, 파지를 상기한 바와 같이 구제하고 증폭시켰다. 제2 및 제3 라운드의 선별을 제1 라운드의 선별과 동일한 방식으로 수행하였다.

추가의 패닝 전략은 인간 C5 및 교대 인간 및 시노몰구스 C5 (단백질 배치는 시노몰구스 C3으로 오염됨. 패닝 동안 알려지지 않음)를 사용한 용액 패닝이었다. 따라서, 상기 단백질을 바이오티닐화하고, 바이오티닐화 절차 후에 보유된 생물기능성을 용혈성 생물검정으로 확인하였다.

파지-항원 복합체를 항원의 바이오틴 잔기를 통해 스트렙타비딘 자성 비드에 포획하였다. 세척 후에 단지 특이적 결합된 파지만을 용출시켰다 (상기한 패닝 절차).

제1 스크리닝은 직접 코팅된 단백질 (실시예 3, 섹션 1 참조)에 수행하였고, 오직 80개의 클론만이 인간 C5에 대해 확인될 수 있었다. 패닝 동안에 항원이 용액 중에 유지된다는 사실 때문에 새로운 스크리닝 방법을 개발하였다. 용액 ELISA에서, Fab를 뉴트르아비딘(NeutrAvidin) 플레이트에서 바이오티닐화된 항원과 함께 인큐베이션하였다. 이 용액을 스크리닝 절차에 사용하여, 유의하게 더 많은 양의 인간 및 시노몰구스 C5 특이적 클론을 선별할 수 있었다. 이러한 결과는, 용액 패닝 유래의 많은 Fab가 용액 중에서만 또는 포획된 경우 (예를 들어 폴리클로날 C5-결합 항체를 통함)에만 C5를 인식한다는 것을 확인시켜 주었다.

2. 선별된 Fab 단편의 서브클로닝 및 발현

가용성 Fab의 신속한 발현을 용이하게 하기 위해서, 선택된 HuCAL 골드^® 파지의 Fab-코딩 삽입물을 XbaI 및 EcoRI을 통해 이. 콜라이 발현 벡터 pMORPH^®x9_MH에 서브클로닝하였다. Fab 단편은 C-말단 Myc 태그 및 제2 C-말단으로서의 6× His-태그를 보유한다 ([Chen et al., Gene 139:73-75 (1994)]). 발현 플라스미드로 이. 콜라이 TG1 F- 세포를 형질전환시킨 후, 클로르암페니콜-내성 단일 클론을 2×YT-CG 배지 60 ㎕를 미리 충전해 둔 멸균 384웰 미량역가 플레이트의 웰로 골라내고, 30℃에서 밤새 성장시켰다. 각각의 이. 콜라이 TG-1 철야 배양물 5 ㎕를, 웰마다 34 ㎍/mL 클로르암페니콜이 보충된 2×YT 배지 40 ㎕를 미리 충전해 둔 신선한 멸균 96웰 미량역가 플레이트로 옮겼다. 상기 미량역가 플레이트를 배양물이 OD600nm 약 0.5를 갖고 약간 혼탁해질 때까지 (약 2시간 내지 4시간) 마이크로플레이트 진탕기에서 400 rpm으로 진탕시키며 30℃에서 인큐베이션하였다. 이들 발현 플레이트에, 34 ㎍/mL 클로르암페니콜 및 3 mM IPTG (이소프로필-ß-D-티오갈락토피라노시드)가 보충된 2×YT 배지 10 ㎕를 웰마다 첨가하였다 (최종 농도 0.5 mM IPTG). 상기 미량역가 플레이트를 기체-투과성 테이프로 밀봉하고, 400 rpm으로 진탕시키면서 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 발현 플레이트의 각 웰에 2.5 mg/mL 리소자임, 4 mM EDTA 및 10 U/㎕ 벤조나제를 함유하는 BEL 완충제 15 ㎕를 첨가하고, 미량역가 플레이트 진탕기 (400 rpm)에서 1시간 동안 22℃에서 인큐베이션한 후에 적어도 2시간 동안 -80℃에서 임의의 냉동 단계를 수행하였다. BEL 추출물을 친화도 성숙 후의 ELISA 또는 Fab SET 스크리닝에 의한 결합 분석에 사용하였다.

TG-1 세포에서 pMORPH^®x9_Fab_MH에 의해 코딩되는 Fab 단편의 발현을 34 ㎍/mL 클로르암페니콜이 보충된 2×YT 배지 750 mL를 사용한 진탕기 플라스크 배양으로 수행하였다. OD600nm가 0.5에 이를 때까지 배양물을 30℃에서 진탕시켰다. 20시간 동안 30℃에서 0.75 mM IPTG를 첨가함으로써 발현을 유도하였다. 리소자임을 사용하여 세포를 파괴하고, Fab 단편을 Ni-NTA 크로마토그래피 (퀴아젠(Qiagen), 독일 힐덴)로 단리하였다. PD10 컬럼을 사용하여 1×둘베코(Dulbecco's) PBS (pH 7.2)로의 완충제 교환을 수행하였다. 샘플을 멸균 여과 (0.2 ㎛, 밀리포어(Millipore))하였다. 샘플의 순도를 SDS-PAGE (15％ 크리테리온 겔(Criterion Gel), 바이오라드(BioRad))로 변성 환원 조건하에 결정하고 크기 배제 크로마토그래피 (HP-SEC)로 천연 조건하에 결정하였다. 단백질 농도는 UV-분광광도법으로 결정하였다 ([Krebs et al., J. Immunol. Methods 254:67-84 (2001)]).

Fab 수준에 대해, 전반적인 발현 속도 및 SEC (크기 배제 크로마토그래피)에서의 단량체 분획의 백분율(％)은 확인된 항체 단편 대부분에게 허용가능한 내지 양호한 범위였다. 64개의 모 Fab가 발현되었고, 61개의 Fab를 정제할 수 있었다. 60개의 친화도 성숙 Fab를 mg 규모로 정제하였다. 대부분의 Fab는 양호하게 발현되었고, 응집 경향은 없었다.

실시예 3: HuCAL 골드 ^® 라이브러리로부터의 C5 -특이적 항체의 확인

하기하는 4가지 상이한 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA) 방법은 특이적 항원 및 카운터 항원에 대한 C5-결합 항체의 스크리닝을 기재한다 (박테리아 BEL 용해물 또는 정제된 Fab로 사용됨).

1. 직접 코팅된 단백질에서의 스크리닝

맥시소르프 (넌크, 미국 뉴욕주 로체스터) 384웰 플레이트를 웰 1개 당 PBS (pH 7.4) 중 2.5 ㎍/mL의 항원 (인간 C5 및 카운터 단백질 인간 C3 및 C4) 20 ㎕로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 대등하게, 플레이트를 웰 1개 당 PBS (pH 7.4) 중에 희석한 5 ㎍/mL의 양 항-인간 IgG (Fd 단편 특이적) (더 바인딩 사이트(The Binding Site), 영국 버밍햄) 20 ㎕로 코팅하여 Fab 발현 수준을 체크하였다.

상기 플레이트를 5％ 분유를 함유하는 PBS/0.05％ 트윈 20 (PBST)으로 1시간 내지 2시간 동안 실온에서 차단하였다. 웰을 PBST로 세척한 후, BEL-추출물, 정제된 HuCAL 골드^® Fab 또는 대조군 Fab (PBS 중에 희석한 것)를 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. Fab 결합을 검출하기 위해서, 퍼옥시다제와 커플링된 항-HIS6 항체를 적용하였다 (로쉐(Roche)).

POD-접합체를 검출하기 위해서, 형광성 기질 콴타블루(QuantaBlu) (피어스)를 제조업체의 지시에 따라 사용하였다. 모든 인큐베이션 단계 사이에 미량역가 플레이트의 웰을 PBST로 3회 세척하고, 2차 항체와의 최종 인큐베이션 후에는 PBST로 5회 세척하였다. 형광은 테칸 제니오스 프로(Tecan GENios Pro) 플레이트 판독기에서 측정하였다.

2. 바이오티닐화된 단백질을 사용한 용액 스크리닝

바이오티닐화된 보체 단백질을 사용한 용액 패닝 후 HuCAL 골드^® Fab의 스크리닝에 하기하는 ELISA 방법을 이용하였다.

뉴트르아비딘 플레이트를 PBS 중에 희석한 1× 케미블로커 (케미콘(Chemicon))로 밤새 4℃에서 차단하였다. 이들 플레이트를 인간 C5 및 카운터 표적 C3 및 C4에 대한 결합의 스크리닝에 사용하였다. 대등하게, 맥시소르프 384웰 플레이트 (넌크, 미국 뉴욕주 로체스터)를 웰 1개 당 PBS (pH 7.4) 중에 희석한 5 ㎍/mL의 양 항-인간 IgG (Fd 단편 특이적) (더 바인딩 사이트, 영국 버밍햄) 20 ㎕로 코팅하였다. 이들 플레이트를 사용하여 Fab 발현 수준 및 비-특이적 바이오틴 결합을 체크하였다. 다음 날, 코팅된 맥시소르프 플레이트를 PBST로 2회 세척하고, TBS 중 3％ BSA로 1시간 내지 2시간 동안 실온에서 차단시켰다. Fab 또는 정제된 HuCAL 골드^® Fab를 함유하는 주변세포질 BEL 추출물을 상기 차단된 뉴트르아비딘 및 맥시소르프 플레이트 둘 다에 첨가하였다.

이후, 바이오티닐화된 인간 C5 (특이적 결합을 검출하기 위함) 및 대등하게는 바이오티닐화된 인간 C3 및 C4 (원치않는 결합을 검출하기 위함)를 웰 1개 당 20 ㎕로 하여 상기 뉴트르아비딘 플레이트의 웰에 첨가하였다. 바이오티닐화된 항원을 HuCAL 골드^® Fab와 1시간 내지 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 바이오티닐화된 관련없는 항원 트랜스페린을 상기 맥시소르프 플레이트에 첨가하여 바이오틴 결합 Fab에 대해 체크하였다 (HuCAL^®-Fab 단편의 경우에는 항-Fd 항체를 통해 이전에 포획됨).

하기하는 2차 항체를 적용하여 검출하였다: 알칼리성 포스파타제 (AP)-접합된 스트렙타비딘-AP 어피니퓨어(AffiniPure) F(ab')2 단편 (염소 항-인간)은 상기 맥시소르프 발현 플레이트에 첨가하고, 항-HIS6 퍼옥시다제 접합된 마우스 항체 (로쉐)는 뉴트르아비딘 플레이트에 첨가하고, 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제, 자이메드(ZYMED)는 바이오티닐화된 트랜스페린을 함유하는 맥시소르프 플레이트에 첨가하였다.

AP-접합체의 검출을 위해서는 형광성 기질 아토포스(AttoPhos) (로쉐 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics), 독일 만하임)를, POD-접합체의 검출을 위해서는 형광성 기질 콴타블루 (피어스)를 제조업체의 지시에 따라 사용하였다. 형광은 테칸 제니오스 프로 플레이트 판독기에서 측정하였다.

이 방법을 이용함으로써, 용액 중의 인간 C5를 인식하는 항-인간 C5 Fab를 스크리닝하고 표적 항원의 바이오틴 잔기에 결합하는 항체를 제외시키는 것이 가능하였다.

3. 시노몰구스 C5 에 대한 교차-반응성의 결정

폴리클로날 C5-결합 항체 (유에스 바이올로지칼(US Biological) 카탈로그 번호 C7850-24)를 사용하여 시노몰구스 혈청으로부터 시노몰구스 C5를 포획하였다.

384웰 맥시소르프 플레이트를 웰 1개 당 PBS 중 5 ㎍/mL 폴리클로날 C5-결합 항체 20 ㎕로 코팅하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 다음 날, 상기 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 웰 1개 당 희석제 (4％ BSA/0.1％ 트윈 20/0.1％ Triton-X 100/PBS) 100 ㎕를 사용하여 2시간 동안 실온에서 차단시켰다. 시노몰구스 혈청을 희석제 (4％ BSA/0.1％ 트윈20/0.1％ Triton-X 100/PBS) 중에 1:20으로 희석 (시노몰구스 C5의 대략적인 농도: 4 ㎍/mL)하고, 2×PBST 세척된 맥시소르프 플레이트에 웰 1개 당 20 ㎕씩 첨가하였다. 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, Fab 단편을 함유하는 BEL 용해물 또는 정제된 Fab를 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 검출 항체 항-HIS6-POD (로쉐 #1965085)를 첨가하였다. POD 기질, BM 블루(Blue) (가용성) (로쉐 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science))를 첨가하고, 상기 반응을 1 M H₂SO₄로 정지시켰다. BMG 판독기 장치를 사용하여 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.

실시예 4: 친화도 성숙

1. 선택된 C5 -결합 Fab 의 친화도 성숙 라이브러리의 구축

선택된 항체 단편의 친화도 및 생물학적 활성을 증가시키기 위해, L-CDR3 및 H-CDR2 영역을 트리뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발을 이용한 카세트 돌연변이유발 (예를 들어, 문헌 [Virnekas et al., Nucleic Acids Res. 22:5600-5607 (1994)] 참조)로 대등하게 최적화하면서 프레임워크 영역은 변하지 않게 유지하였다. 친화도 성숙을 위한 클로닝 전에, 모든 모 Fab 단편을 상응하는 발현 벡터 (pMORPH^®x9_MH)로부터 CysDisplay™ 벡터 pMORPH^®25로 XbaI/EcoRI를 통해 이동시켰다. pMORPH^®25는 HuCAL 골드^® 디스플레이 벡터 pMORPH^®23으로부터 H-CDR2 최적화를 위한 라이브러리 클로닝을 방해하는 1개의 BssHII 부위의 제거에 의해 생성되었다. 모 Fab의 L-CDR3을 최적화하기 위해, 결합제 경쇄 (405 bp)의 L-CDR3, 프레임워크 4 및 불변 영역을 BpiI/SphI으로 제거하고, 프레임워크 4 및 불변 도메인과 함께 다양화된 L-CDR3의 레퍼토리로 대체하였다.

10종의 모 C5-결합 Fab를 상이한 선별 기준에 따라 7개의 풀로 나누었고, 동일 프레임워크를 갖는 Fab만을 함께 모았다: (1) MOR07086, (2) MOR06525 + 6756 (동일 프레임워크), (3) MOR06757, (4) MOR06763, (5) MOR07087, (6) MOR07091 + 7092 (동일 프레임워크), (7) MOR07093 + 7094 (동일 프레임워크).

대략 1.5 ㎍의 단일 Fab 벡터 단편 및 Fab 풀을 다양화된 L-CDR3을 보유하는 3배 내지 5배 몰 과량의 삽입 단편과 라이게이션시켰다. 제2 라이브러리 세트에서는, H-CDR2 (XhoI/BssHII)를 다양화하면서 연결 프레임워크 영역은 변하지 않게 유지시켰다. 클로닝 효율을 모니터링하기 위해, 모 H-CDR2를 다양화된 H-CDR2 카세트의 클로닝 이전에 가공물(dummy)로 대체하였다.

상이한 라이브러리의 라이게이션 혼합물을 2×10⁷개 내지 2×10⁸개의 독립적인 콜로니로부터 수득된 이. 콜라이 TOP10 F' 세포 (인비트로겐)에 전기천공시켰다. 라이브러리를 증폭시켰다. 품질 조사를 위해, 라이브러리마다 여러 개의 단일 클론을 무작위로 골라 프라이머 CFR84 (VL) 및 OCAL_Seq_Hp (VH)로 서열분석하였다.

상기한 바와 같이, 7개의 성숙 하위 풀을 생성하고, 이후의 선별 과정 동안 분리된 채로 유지시켰다.

14종의 상이한 친화도 성숙 라이브러리 (각 리드 또는 풀에 대해 1개의 LCDR3 및 1개의 HCDR3 라이브러리)를 표준 클로닝 절차 및 다양화된 클론의 전기-감응성 이. 콜라이 TOP10F' 세포 (인비트로겐)로의 형질전환으로 생성하였다. 라이브러리 크기는 양호하였고, 2×10⁷개 내지 5×10⁸개의 범위였다. 무작위로 골라낸 클론의 서열분석은 100％의 다양성을 보여주었다. 모 결합제는 발견되지 않았지만 모든 각 모 입력 결합제의 유도체가 발견되었다. 최종적으로, 모든 14종 라이브러리의 파지를 별도로 제조하였다.

2. 친화도 성숙을 위한 항체-파지의 제조

HuCAL^® 성숙 라이브러리를 34 ㎍/mL 클로르암페니콜 및 1％ 글루코스를 함유하는 2×YT 배지 (2×YT-CG) 중에서 증폭시켰다. OD600nm 0.5 (진탕 없이 37℃에서 30분, 250 rpm의 진탕하에 37℃에서 30분)에서 VCSM13 헬퍼 파지로 감염시킨 후, 세포를 회전시키고 (4120×g, 5분, 4℃), 2×YT/34 ㎍/mL 클로르암페니콜/50 ㎍/mL 카나마이신/0.25 mM IPTG 중에 재현탁시켜 22℃에서 밤새 성장시켰다. 상기 상등액으로부터 파지를 2회 PEG-침전시켜 PBS 중에 재현탁하고, 하기하는 성숙 패닝에 사용하였다.

3. 바이오티닐화 C5 단백질에서의 표준 용액 성숙 패닝

상기한 바와 같이, 생성된 친화도 성숙 라이브러리에서 구조된 약 10¹²개 파지로 매우 엄격한 조건하에서 패닝을 수행하여 친화도 개선된 C5 특이적 Fab를 선별하였다.

각각의 파지 풀을 사용한 용액 패닝은 바이오티닐화된 인간 C5 또는 교대 바이오티닐화된 인간 및 시노몰구스 C5 단백질을 사용하여 수행하였다. 패닝 엄격도를 증가시키고 개선된 해리 속도(off-rate)에 대해 선별하기 위해서, 항원 농도를 감소시키고 연장된 세척 기간을 적용하였다 (세척 조건은 표 3에 기재됨).

미리 차단된 파지 (2× 케미블로커를 함유하는 1:2 혼합물을 1시간 동안 실온에서 인큐베이션함)를 낮은 농도의 바이오티닐화 C5 단백질과 함께 1시간 내지 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 패닝 전략은 상기 기재된 표준 용액 패닝과 유사하였다. 파지 항원 복합체를 C5의 바이오틴 잔기를 통해 사전 차단된 스트렙타비딘 자성 비드에 30분 동안 실온에서 포획시켰다. 이어서, 비드를 통상의 패닝과 비교하여 보다 엄격하게 세척하였다. 파지의 용출 및 증폭을 상기한 바와 같이 하여 수행하였다.

제2 및 제3 라운드의 선별은 제1 라운드와 동일한 방식이지만 더 엄격한 세척 조건 및 더 낮은 항원 농도로 수행되었다. 각각의 항체 리드 또는 풀마다 여러 회의 상이한 패닝을 수행하였다. 각각의 패닝 전략에는 상이한 엄격도 조건을 적용하였다. 패닝 전략은 표 4에 요약되어 있다.

성숙 패닝 후에, 풍부한 파지미드 풀을 pMORPH^®x9_MH 발현 벡터로 서브클론하였다.

4. 최적화된 VL (L- CDR3 )과 최적화된 VH (H- CDR2 )의 교차-조합

친화도 및 효력의 추가 개선을 위해, 동일 모 클론에서 유래된 성숙 항체로부터의 독립적으로 최적화된 중쇄 및 경쇄를 조합하였다 (예를 들어, 문헌 [Rauchenberger et al., J. Biol. Chem. 278:38194-38205 (2003)], [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)] 및 [Schier et al., J. Mol. Biol. 263:551-567 (1996)] 참조). 교차-클로닝이라 불리는 이러한 절차를 동일 모 클론에서 유래된 결합제에 적용하였다.

5. 친화도 스크리닝 및 성숙 패닝 결과

모든 패닝에서 유도된 총 2640개의 클론을 인간 C5에 대한 개선된 친화도에 대해 박테리아 용해물로서 스크리닝하였다. 예비 친화도를 용액 평형 적정 (SET)으로 추정하였다. 이것들의 추정된 친화도를 기초로 하여, 각각의 모 Fab 또는 Fab 풀로부터 유래된 클론을 서열분석하였다. 표 5는 서열분석된 클론의 수 및 수득된 고유 서열의 수를 각 패닝 조건마다 보여준다.

6. 단백질 생성을 위한 친화도 최적화된 Fab 의 서열 분석 및 선별

모든 10종의 모 Fab의 유도체를 회수함으로써 매우 우수한 다양성이 유지되었다. 188개의 HCDR2 개선된 클론에 대한 중쇄 (VH) 가변 영역 및 150개의 개선된 LCDR3 클론에 대한 경쇄 (VL) 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 87개의 고유한 HCDR2 서열 및 52개의 고유한 LCDR3 서열을 성숙 CDR 내 서열 다양성의 상세한 분석을 위해 선별하였다. CDR 내에 가능한 글리코실화 부위를 함유하는 Fab는 추가의 특징규명에서 제외시켰다.

VH 및 VL 서열 분석 및 친화도 데이타는 모든 10종의 모 Fab가 친화도-개선된 후계자를 생성했음을 보여주었다. 모 Fab MOR06525, MOR06757, MOR06763, MOR07087 및 MOR07094는 오직 HCDR2 개선된 클론만을 생성했고, 모 MOR06756 및 MOR07093은 오직 LCDR3 개선된 클론만을 생성했다. MOR07086, MOR07091 및 MOR07092는 VH 및 VL 둘 다에 대한 성숙 클론을 가졌다. 이것은 후에 VH 및 VL 성숙 쇄의 교차-클로닝을 허용했다. 모든 데이타로부터, 성숙 CDR에 최상의 친화도 및 최고의 다양성을 갖는 60개 클론을 Fab 발현을 위해 선별하였다. 선별된 VH 및 VL 아미노산, 및 또한 뉴클레오티드 서열은 표 1에 기재되어 있다.

실시예 5: IgG 전환

1. 인간 IgG2 포맷으로의 전환

전장 이뮤노글로불린 (Ig)을 발현시키기 위해, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 도메인 단편을 pMORPH^®x9_MH Fab 발현 벡터로부터 인간 IgG2에 대한 pMORPH^®2_h_Ig 벡터 시리즈로 서브클로닝하였다. 제한 효소 MfeI 및 BlpI을 사용하여 VH 도메인 단편을 pMORPH^®2_h_IgG2로 서브클로닝하였다. VL 도메인 단편을 pMORPH^®2_h_Igκ로 서브클로닝하는 것은 EcoRV 및 BsiWI 부위를 통해 수행하였고, pMORPH^®2_h_Igλ2로의 서브클로닝은 EcoRV 및 HpaI을 사용하여 수행하였다.

모든 10종의 모 Fab (MOR06525, 6756, 6757, 6763, 7086, 7087, MOR07091, 7092, 7093 및 7094)가 인간 IgG2로 전환되었다. IgG 역시 발현되었다.

2. 인간 IgG1AA 포맷으로의 전환

전장 이뮤노글로불린을 발현시키기 위해, Fab 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 도메인 단편을 Fab 발현 벡터로부터 IgG1 발현 벡터로 서브클로닝하였다. 제한 효소 MfeI 및 BlpI을 사용하여 VH 도메인 단편을 pMORPH^®2_h_IgG1AA (위치 234 및 235의 루이신이 알라닌으로 돌연변이되어 FcRγ 결합을 없애고 이펙터 기능을 감쇠시킴)로 서브클로닝하였다. 제한 효소 EcoRV 및 HpaI을 사용하여 VL 도메인 단편을 pMORPH^®2_h_Igλ2로 서브클로닝하였다.

원하는 프로파일을 갖는 하기하는 성숙 Fab를 인간 IgG1AA 포맷으로 서브클로닝하였다: MOR07832, 7834, 7872, 7876, 7829, 7871, 7865, 7873, 7830, 7878, 7910. 세포를 경쇄 및 중쇄 구축물의 조합물로 형질감염시켜서 IgG 수준에서의 교차-클로닝을 달성하였다. 예를 들어, MOR08114는 MOR07829로부터의 배선 중쇄 및 MOR07871로부터의 배선 경쇄의 생성물이었다. 표 6은 가장 적절한 교차-클로닝된 배선 IgG를 요약한다.

3. 인간 IgG 의 일시적 발현 및 정제

진핵 HKB11 및 HEK293 세포를 동몰비의 IgG 중쇄 및 경쇄 발현 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 세포 배양 상등액을 형질감염 후 제3일 또는 제7일에 수확하고, 표준 단백질 A 친화도 크로마토그래피 (rProteinA FF 또는 MabSelect SURE, 지이 헬쓰케어(GE Healthcare))를 실시하였다. 달리 언급하지 않는다면, 1× 둘베코 PBS (pH 7.2, 인비트로겐)로의 완충제 교환을 수행하였고, 샘플은 멸균 여과 (0.2 ㎛)된 것이었다. IgG의 순도를 SDS-PAGE로 변성된 환원 및 비-환원 조건하에 분석하거나, 또는 아질런트(Agilent) 바이오애널라이저(BioAnalyzer)를 사용하고 HP-SEC로 천연 상태로 분석하였다.

실시예 6: 배선화

IgG 구축물을 퀵채인지(QuickChange)^® 부위-지정 돌연변이유발 키트 (스트라타진(Stratagene))를 사용한 부위-지정 돌연변이유발로 배선화하였다. MOR08111 Vλ2의 N-말단 DI을 ES로 변화시켜서 인간 배선 서열과 매치시키고 또한 말단 Q를 피하였다 (N-말단 Q는 피로글루타민을 형성할 수 있음). MOR08110 Vλ3, MOR08113 Vλ3 및 MOR08114 Vλ3의 N-말단 DI을 인간 λ3 유전자에서 가장 공통적으로 발견되는 서열인 SY로 배선화하였다. MOR08111 VH2의 N-말단 QVQ를 EVT로 배선화하여 λ2 유전자와 매치시키고 말단 Q를 피하였다. MOR08109 VH5, MOR08110 VH5, MOR08113 VH5 및 MOR08114 VH5에서의 N-말단 Q 역시 E로 돌연변이시켰다.

MOR08109 Vλ3에 대한 프레임워크 서열을 합성하여 인간 λ3j 유전자와 매치시키고, NheI 및 HpaI 제한 부위를 사용하여 발현 벡터에 클로닝하였다. 항체 가변 도메인과 이것들 각각의 가장 밀접하게 관련된 인간 배선 서열의 서열 정렬을 도 1에 나타냈다.

실시예 7: 친화도 결정

1. 표면 플라즈몬 공명 ( 비아코어 )을 이용한, 항-인간 C5 항체의 Kon / Koff 및 K _D 결정

비아코어 칩에 Fab를 고정하는데 사용된 항-Fab 항체가 인간 C5에 대한 각 Fab의 결합 친화도에 상이하게 영향을 미쳐서 Fab를 서로 비교하기가 어려운 것으로 결정되었다. IgG 항체에 대한 비아코어 분석을 수행하였다.

CM4 칩을 표준 EDC-NHS 아민 커플링 화학을 이용하여 10 mM 아세테이트 완충제 (pH 4.5) 중 50 ㎍/mL 염소 항-인간 Fc 항체 (500 내지 2000 RU)로 코팅하였다. 각각의 항-인간 C5 IgG를 HBS-EP 완충제 중에서 10 ㎕/분의 일정 유속으로 리간드 밀도가 약 20 RU가 되게 하는 접촉 시간 동안 상기 칩에 포획시켰다. 항-인간 C5 IgG를 포획한 후, 0.156 nM 내지 2.5 nM 범위의 상이한 농도의 인간 또는 시노몰구스 C5를 주입하였다. 각각의 주기를 인산을 사용한 2개의 재생성 단계로 종료하였다. 모든 운행 조건은 1× HBS-EP 완충제 중에서 25℃에서 수행하였다. 생성된 신호는 2벌 실험을 수행하고 참조 유동 세포로부터 굴절 지수 값을 감하고 결합 단계를 분석물질 없이 수행하여 조정하였다. 데이타는 10 Hz에서 수집하였고, 비아코어 T100 평가 소프트웨어 버전 1.1 (지이)로 분석하였다. 이 프로그램은 각각의 상호작용에 대한 속도 상수 및 친화도 상수를 결정하기 위한 전반적 핏팅 분석 방법을 이용한다.

항체의 특이성을 결정하였다. 바람직하게는, 인간 및 시노몰구스 C5와의 결합에 대한 Kon 및 Koff 값은 다음과 같았다: Kon > 1×10⁵, Koff < 1×10^-4. 이러한 측정은 배선 IgG에 대한 비아코어로 수행하였고, 수득된 데이타를 표 7에 기재하였다.

2. 정제된 Fab 또는 Fab 박테리아 용해물에 대한 용액 평형 적정 ( SET )을 이용한 피코몰 친화도의 결정 (메조 스케일 디스커버리( Meso Scale Discovery ) ( MSD ))

용액 평형 적정 (SET)에 의한 K_D 결정을 위해, Fab 단백질의 단량체 분획물 (90％ 이상의 단량체 함유율. 분석용 SEC로 분석함. 수퍼덱스75(Superdex75), 아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia))을 사용하였다. 용액 중 친화도 결정은 기본적으로 문헌 [Friguet et al., J. Immunol Methods 77:305-319 (1985)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. SET 방법의 감도 및 정확도를 개선하기 위해, 고전적 ELISA에서 ECL 기재의 기술로 바꾸었다 ([Haenel et al., Anal Biochem 339:182-184 (2005)]).

1 mg/mL 염소-항-인간 (Fab)₂ 단편 특이적 항체 (디아노바(Dianova))를 ECL 술포-태그™ NHS-에스테르 (메조 스케일 디스커버리, 미국 메릴랜드주 가이터스부르크)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 표지하였다. 실험은 폴리프로필렌 미량역가 플레이트에서 검정 완충제로서 0.5％ BSA 및 0.02％ 트윈 20을 함유하는 PBS (pH 7.4)를 사용하여 수행하였다. 미표지 항원을 K_D보다 적어도 10배 더 높은 농도로 출발하여 2ⁿ 계열로 희석하였다. 항원이 없는 웰을 사용하여 Bmax 값을 결정하였고, 항원도 없고 Fab도 없는 웰을 사용하여 백그라운드를 결정하였다. 예를 들어 10 pM Fab (최종 부피 60 ㎕ 중의 최종 농도)의 첨가 후에, 상기 혼합물을 밤새 실온에서 인큐베이션하였다. 적용된 Fab 농도는 예상되는 K_D와 유사하거나 그보다 낮은 값이었다.

스트렙타비딘 MSD 플레이트를 0.2 ㎍/mL 바이오티닐화된 인간 C5 (30 ㎕/웰)로 코팅하고, PBS 중 5％ BSA로 차단하였다. 이후, 평형화된 샘플을 이들 플레이트 (웰 1개 당 30 ㎕)로 옮겨 20분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 30 ㎕/웰의 ECL 술포-태그 표지된 검출 항체 (염소 항-인간 (Fab)2)를 최종 희석률 1:1500으로 하여 상기 MSD 플레이트에 첨가하고, 에펜도르프(Eppendorf) 진탕기 (700 rpm)에서 30분 동안 인큐베이션하였다.

세척하고 30 ㎕/웰 MSD 판독 완충제 T를 계면활성제와 함께 첨가한 후, 전기화학발광 신호를 섹터 이메이저(Sector Imager) 6000 (메조 스케일 디스커버리, 미국 메릴랜드주 가이터스부르크)로 검출하였다.

데이타를 맞춤형 핏팅 모델을 적용시킨 XLfit (IDBS) 소프트웨어로 평가하였다. 데이타 평가, 즉 Fab 분자의 K_D 결정을 위해서, 하기하는 핏팅 모델을 사용하였다 (문헌 [Abraham et al., 16]의 모델. 문헌 [et al., 200515]에 따라 변형시킴):

(cFab: 적용된 Fab 농도, x: 적용된 전체 가용성 항원 농도 (결합 부위), sqrt: 제곱근). 상기한 검정 조건을 이용하여, 친화도-최적화된 C5-결합 Fab에 대한 (단량체성) 친화도를 용액 중에서 결정하였다.

모 Fab

C5-결합 항체를 추가로 특징규명하기 위해, 인간 C5에 대한 모 Fab의 친화도를 결정하였다. 특징규명이 용혈성 검정에서의 효능에 초점을 맞추었기 때문에, 친화도 결정은 오직 가장 적절한 Fab에 대해서만 수행되었다. 1가 친화도의 신뢰성있는 결정을 위해, 정량적 크기 배제 크로마토그래피에서 ≥ 90％ 단량체 분획을 나타낸 Fab 배치만을 측정에 사용하였다.

친화도 성숙에 사용된 10종의 모 Fab의 친화도를 표 8에 요약하였다. 친화도는 72 pM 내지 3.7 nM의 범위였다.

성숙 Fab

인간 C5에 대한 정제된 Fab의 1가 친화도를 SET로 결정하였다. 친화도는 낮은 pM 범위였고, 최상의 친화도는 MOR07086, 7091, 7092 및 7093의 유도체에서 얻어졌다. 이후, 시노몰구스 C5에 대한 이들 유도체의 친화도 결정은 중간 내지 낮은 pM 범위의 친화도를 보여주었다.

친화도 성숙 과정은 매우 성공적이었고, 현저하게 개선된 친화도를 갖는 결합제 레퍼토리를 생성하였다. 표 9는 최상으로 개선된 결합제의 인간 및 시노몰구스 C5에 대한 친화도를 요약한다. 특정 Fab는 인간 C5에 대해 ≤ 30 pM의 K_D 및 시노몰구스 C5에 대해 ≤ 150 pM의 K_D를 갖는다.

3. 용액 평형 적정 ( SET )을 이용한 IgG 분자의 K _D 결정

인간 및 시노몰구스 C5에 대한 배선 IgG (인간 IgG1AA 포맷)의 친화도를 하기하는 바와 같이 SET로 결정하였다. 2개의 독립적인 측정치 사이의 유사한 데이타 세트는 인간 C5에 대한 리드 IgG의 친화도가 참조 IgG 5G1.1 (미국 특허 제6,355,245호 참조)보다 더 높다는 것을 보여주었다. 최종 IgG는 인간 C5에 대해 1 내지 14 pM 범위의 친화도를 가졌고, 시노몰구스 C5에 대해 3 내지 29 pM 범위의 친화도를 가졌다.

용액 평형 적정 (SET)에 의한 K_D 결정을 위해, IgG 단백질의 단량체 분획물을 사용하였다 (90％ 이상의 단량체 함유율. 분석용 SEC MALS로 분석함. 토소(Tosoh) TSK겔(TSKgel) G3000SWXL, 와이아트 트레오스 미니DAWN(Wyatt Treos miniDAWN)). 용액 중 친화도 결정은 기본적으로 문헌 [Friguet et al., J. Immunol Methods 77:305-319 (1985)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. SET 방법의 감도 및 정확도를 개선하기 위해, 고전적 ELISA에서 ECL 기재의 기술로 바꾸었다 ([Haenel et al., Anal Biochem 339:182-184 (2005)]).

1 mg/mL 염소-항-인간 (Fab)₂ 단편 특이적 항체 (디아노바)를 ECL 술포-태그™ NHS-에스테르 (메조 스케일 디스커버리, 미국 메릴랜드주 가이터스부르크)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 표지하였다. 실험은 폴리프로필렌 미량역가 플레이트에서 검정 완충제로서 0.5％ BSA 및 0.02％ 트윈 20을 함유하는 PBS (pH 7.4)를 사용하여 수행하였다. 미표지 항원을 K_D보다 적어도 10배 더 높은 농도로 출발하여 2ⁿ 또는 1.75ⁿ 계열로 희석하였다. 항원이 없는 웰을 사용하여 Bmax 값을 결정하였고, 항원도 없고 IgG도 없는 웰을 사용하여 백그라운드를 결정하였다. 예를 들어 10 pM IgG (최종 부피 60 ㎕ 중의 최종 농도)의 첨가 후에, 상기 혼합물을 밤새 실온에서 인큐베이션하였다. 적용된 IgG 농도는 예상되는 K_D와 유사하거나 그보다 낮은 값이었다.

스트렙타비딘 MSD 플레이트를 0.2 ㎍/mL 바이오티닐화된 인간 C5 (30 ㎕/웰)로 코팅하고, PBS 중 5％ BSA로 차단하였다. 이후, 평형화된 샘플을 이들 플레이트 (웰 1개 당 30 ㎕)로 옮겨 20분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 30 ㎕/웰의 ECL 술포-태그 표지된 검출 항체 (염소 항-인간 (Fab)₂)를 최종 희석률 1:1500으로 하여 상기 MSD 플레이트에 첨가하고, 에펜도르프 진탕기 (700 rpm)에서 30분 동안 인큐베이션하였다.

세척하고 30 ㎕/웰 MSD 판독 완충제 T를 계면활성제와 함께 첨가한 후, 전기화학발광 신호를 섹터 이메이저 6000 (메조 스케일 디스커버리, 미국 메릴랜드주 가이터스부르크)로 검출하였다.

데이타를 맞춤형 핏팅 모델을 적용시킨 XLfit (IDBS) 소프트웨어로 평가하였다. 데이타 평가, 즉 IgG 분자의 K_D 결정을 위해서, IgG를 위한 하기 핏팅 모델을 사용하였다 (문헌 [Piehler et al., 199717]에 따라 변형시킴):

(cIgG = 적용된 IgG 농도, 완전 분자 (결합 부위가 아님), x: 적용된 전체 가용성 항원 농도 (결합 부위), sqrt: 제곱근).

실시예 8: 용혈성 검정에 의한 특징규명

용혈성 검정은 보체 활성화를 시험하는 기본적인 기능 검정으로, 항-인간 C5 mAb 및 Fab 분자가 보체 경로에 의한 적혈구 (RBC)의 용해를 차단하는 능력을 평가하는데 이용되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [Evans et al., Mol. Immunol 32: 1183-1195 (1995)], [Thomas et al., Mol Immunol 33:1389-1401 (1996)], [Rinder et al., J Clin Invest 96:1564-1572 (1995)] 참조). 간략하게 설명하면, 고전적 경로 검정의 경우, 감작화된 적혈구를 혈청 중에 존재하는 보체 단백질에 의한 용해의 표적으로 사용하였다. 이 검정은 고친화도 항-인간 C5 mAb의 특징규명 및 스크리닝에 흥미롭다.

1. 고전적 경로

원하는 수의 닭 적혈구를 차가운 젤라틴 베로날 완충제 (GVB++)로 4회 세척하여 5×10⁷개 세포/mL로 재현탁시켰다. 상기 세포를 감작화하기 위해서, 토끼 항-chRBC IgG를 RBC 세포 현탁액에 1 ㎍/mL IgG의 최종 농도로 첨가하였다. 15분 동안 빙상에서 인큐베이션한 후, 감작화된 chRBC를 원심분리하여 GVB++로 2회 세척하고 8.33×10⁷개 세포/mL로 희석하였다.

둥근 바닥 96웰 플레이트를 용혈성 검정에 사용하였다. 항체를 GVB++ 완충제 중에 희석하고, 웰에 첨가하였다 (C5-결합 Ab의 필요한 농도를 계산할 때, 샘플이 혈청 첨가시에 2배 희석될 것을 감안하였음). 40％ 인간 혈청 (GVB++ 중에 희석된 것) 50 ㎕를 항체 희석액 50 ㎕에 첨가하여, 최종 혈청 검정 농도가 20％가 되게 하였다.

대조군 및 블랭크 웰을 하기하는 바와 같이 제조하였다: 대조군 웰 - i) 0％ 용해 대조군 → 100 ㎕ GVB++, ii) 100％ 용해 대조군 → 100 ㎕ 0.1％ NP-40, iii) 20％ 혈청 대조군 → 100 ㎕ 20％ 혈청 (0％ Ab 대조군). 블랭크 웰 - i) 20％ 혈청 블랭크 → 100 ㎕ 20％ 혈청, ii) GVB++ 블랭크 → 100 ㎕ GVB++, iii) NP-40 블랭크→ 100 ㎕ 0.1％ NP-40.

웰 1개 당 2.5×10⁶개 (30 ㎕)의 감작화된 chRBC를 모든 샘플 및 대조군 웰에 첨가하였다. 블랭크 웰에는 세포 대신 PBS를 첨가하였다. 검정 플레이트를 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하여 원심분리 (2,000 rpm, 5분)하고, 상등액 85 ㎕를 새로운 평평-바닥 96웰 플레이트로 옮겼다. 상기 새로운 플레이트를 원심분리 (2,000 rpm, 3분)하여 임의의 버블을 없앴다. 헤모글로빈 방출을 415 nm에서의 흡광도 판독으로 결정하였다. 용혈률(％)은 하기하는 계산 알고리즘을 이용하여 대조군 및 블랭크 웰에 대해 계산하였다:

용혈률(％) = 100 × (OD_샘플 - OD_{음성 대조군})/(OD_{양성 대조군} - OD_{음성 대조군})

(여기서,

OD_샘플 = [평균 OD_샘플] - [평균 OD_{20％ 혈청 블랭크}]

OD_{음성 대조군} = [평균 OD_{0 ％ 용해}] - [평균 OD_{GVB ++ 블랭크}]

OD_{양성 대조군} = [평균 OD_{100％ 용해}] - [평균 OD_{NP -40 블랭크}]).

이러한 절차를 이용하여, 적혈구 용해를 억제할 수 있는 항-인간-C5 항체를 확인할 수 있었다. 시노몰구스 C5에 대한 교차-반응성을 스크리닝하기 위해서, 고전적 경로를 5％ 시노몰구스 혈청을 사용하여 수행하였다.

2. 대체적 경로

대체적 경로에 대한 용혈성 검정은 고전적 경로의 용혈성 검정과 유사한 방식으로 행해졌다. 대체적 경로에서는 토끼로부터의 RBC 세포를 사용하였고, 상기 세포를 감작화시킬 필요가 없었다. 토끼 RBC는 이것들이 보체 대체적 경로에 의해 야기되는 용해에 감수성이 있다는 점에서 닭 RBC와 상이하다.

대체적 경로의 C5 전환효소는 Mg++ 의존성이고 고전적 경로의 C5 전환효소는 Ca++ 의존성이기 때문에, 작동 완충제는 10 mM EGTA 및 5 mM Mg++가 보충된 GVB++였다.

대체적 경로의 용혈성 검정은 다음을 사용하여 운행되었다: i) 20％ 인간 혈청, ii) 20％ 인간 C5-결핍된 혈청에 첨가된 100 pM의 인간 C5, iii) 20％ 인간 C5-결핍된 혈청에 첨가된 0.025％ 시노몰구스 혈청, iv) 20％ 인간 C5-결핍된 혈청에 첨가된 100 pM의 시노몰구스 C5, v) 10％ 시노몰구스 혈청. 이러한 세팅을 사용하여 대체적 보체 경로에 의해 유도되는 적혈구 용해를 매우 효과적으로 억제할 수 있는, 인간 및 시노몰구스 C5 단백질에 대한 고친화도 항체를 스크리닝하였다.

3. 모 Fab 를 사용한 용혈성 검정

용혈성 검정을 기본적인 생물-기능 검정으로 이용하여 항-인간 C5 mAb가 적혈구의 보체 매개 용해를 차단하는 능력을 평가하였다. C5 전환효소는 C5를 C5a 펩티드 및 C5b 단편 (이후, 세포 용해를 유도하는 막 공격 복합체 (MAC)로 혼입됨)으로 절단한다. 고전적 경로의 C5 전환효소는 C3bC4bC2a 복합체에 의해 형성되며, C3bC3bBb 복합체에 의해 형성되는 대체적 경로의 C5 전환효소와 상이한 구조를 갖는다. HuCAL 골드^® 생성된 항체는 고전적 경로와 대체적 경로 둘 다에서 억제성이어야 하지만, 주로 대체적 경로 (인자 H, 인자 B 및 인자 H-관련 유전자)가 AMD와 관련이 있기 때문에 대체적 경로에 초점을 맞추었다.

고전적 및 대체적 경로 검정은 20％ 인간 혈청 (약 80 nM C5)을 사용하여 수행되었다. 대체적 경로 검정의 감도를 증가시키기 위해, 새로운 검정 포맷을 개발하였다. 10 내지 100 pM의 정제된 인간 C5 또는 0.025％ 시노몰구스 혈청 (약 100 pM의 시노몰구스 C5)을 인간 C5-결핍된 혈청 (그러나, 모든 다른 혈청 및 보체 성분은 함유함)에 첨가하였다.

도 2는 인간 C5-결핍된 혈청에 10 내지 100 pM 사이의 정제된 인간 C5를 첨가한 경우에 상당한 용혈이 관찰될 수 있음을 보여준다. 시노몰구스 혈청을 인간 C5-결핍된 혈청에 첨가하여 교차-반응성을 시험하였다. 도 3은 인간 C5 결핍된 혈청에 0.025％ 시노몰구스 혈청 (약 100 pM C5)을 첨가하면 용혈성 활성이 복구된다는 것을 보여준다.

고전적 경로

첫번째 Fab 선별은 고전적 경로 (20％ 인간 혈청)에서 행해졌다. 61개의 정제된 모 Fab의 대략 절반은 고전적 경로의 약한 내지 강력한 억제제였다. 최상의 억제 Fab의 IC₅₀ 값은 35 내지 900 nM 사이였다.

검정을 수행하여 적당한 결과 (도 4에 나타냄)가 나왔다. 대조군 및 블랭크 웰에 대한 용혈률(％)을 계산하였다. 세포 용해의 Fab 억제를 20％ 인간 혈청으로 야기된 최대 용해율 (= 100％)과 비교하였다. 무관한 인간 Fab (암탉 난 백색 리소자임 결합제 MOR03207)를 음성 대조군으로 사용하고, 항-인간 C5 IgG 모노클로날 항체 (퀴델)를 양성 대조군으로 사용하였다. 도 4는 최상의 억제 Fab를 사용한 예를 보여준다.

대체적 경로

고전적 경로에서 억제 활성을 나타낸 Fab를 대체적 경로에서 추가로 평가하였다. 용혈성 검정은 인간 C5-결핍된 혈청에 100 pM의 정제된 인간 C5 또는 0.025％ 시노몰구스 혈청을 첨가한 것을 사용하여 행해졌다. 인간 대체적 검정에 대한 IC₅₀ 값은 0.1 내지 90 nM 사이였다 (가장 적절한 Fab를 사용한 검정의 예는 도 5에 나타냄).

고전적 경로의 양성 대조군 (항-인간 C5 항체, 퀴델)은 대체적 경로에서는 억제성이 아니었다. 따라서, 항-보체 인자 P 항체 (퀴델)가 양성 대조군으로서 사용되었다. 도 5에 나타난 바와 같이, MOR07086은 최상의 억제 활성을 가졌고, NVS 데이타는 참조 항체 5G1.1의 경우보다 더 우수한 효력을 밝혀냈다.

시노몰구스 교차-반응성을 시험하기 위해서, 대체적 경로의 용혈성 검정을 인간 C5-결핍된 혈청에 0.025％ 시노몰구스 혈청을 첨가한 것을 사용하여 수행하였다. 5G1.1은 시노몰구스 C5를 인식하지 않기 때문에, 5G1.1과의 비교는 가능하지 않았다. 항-인자 P 항체를 양성 대조군으로서 사용하였다. 검정 결과는 최상의 억제 Fab의 경우에 IC₅₀ 값이 0.1 내지 400 nM임을 밝혀냈다. 다시, MOR07086이 최상의 효력을 나타냈다 (도 6에 나타냄).

고전적 경로와 대체적 경로 둘 다에서 Fab의 일관적인 억제 활성이 주목되었다. 하기 표 11은 가장 적절한 22종의 Fab에 대한 용혈성 검정의 결과를 요약한다. 상이한 실험 사이의 신뢰성있는 비교를 위해서, 20％ 인간 혈청에 의해 야기된 용해를 100％로 표준화하였다.

^* MH로서 순수하지 않음

^** pMx9_FS

4. 성숙 Fab 를 사용한 용혈성 검정

고전적 경로

(1) 20％ 인간 혈청을 사용한 고전적 경로

성숙 Fab를 20％ 인간 혈청을 사용한 고전적 경로에서 시험하였다. MOR07086, 7091, 7092 및 7093의 유도체는 최고의 효력 (낮은 nM 범위의 IC₅₀ 값)을 나타냈다. MOR07091, 7092 및 7093의 자손은 크게 개선된 효력을 나타냈다. 도 7은 MOR07086, 7091, 7092 및 7093의 유도체를 사용한 용혈성 검정의 예를 보여준다.

(2) 5％ 시노몰구스 혈청을 사용한 고전적 경로

보체 경로의 검정을 또한 5％ 시노몰구스 혈청의 존재하에 운행하여 교차-반응성을 시험하였다. MOR07086, 7091, 7092 및 7093의 유도체는 적혈구 용해를 매우 효과적으로 억제할 수 있었다. 음성 대조군 MOR03207 (항-리소자임 Fab)은 보체 경로에 영향을 미치지 않았다. 이러한 검정의 결과를 도 8에 나타냈다.

대체적 경로

(1) 100 pM의 인간 C5를 사용한 대체적 경로

성숙 Fab를 100 pM의 인간 C5를 사용한 대체적 경로 용혈성 검정에서 시험하였다. MOR06525, 6757, 6763 및 7087의 일부 유도체는 이것들의 모체에 비해 개선된 효력을 나타냈다. MOR07086-, 7091-, 7092-, 7093- 및 7094-유래의 Fab는 최고의 효력 (낮은 nM 범위의 IC₅₀ 값)을 나타냈다. MOR07091, 7092, 7093 및 7094의 자손은 크게 개선된 효력을 나타냈고, 이것들 중 많은 것이 참조 항체 5G1.1보다 더 강력하였다. 도 9는 친화도 성숙 Fab 및 5G1.1에 대한 용혈성 검정 결과의 예를 보여준다.

(2) 20％ 인간 혈청을 사용한 대체적 경로

성숙 Fab를 20％ 인간 혈청을 사용한 대체적 경로 용혈성 검정에서 시험하였다. MOR07086-, 7091-, 7092- 및 7093-유래의 Fab는 최고의 억제 활성을 나타냈다. 이러한 Fab 중 많은 것들이 5G1.1보다 더 우수한 억제 활성을 가졌다. 도 10은 친화도 성숙 Fab 및 참조 항체 5G1.1에 대한 용혈성 검정 결과의 예를 보여준다.

(3) 100 pM의 시노몰구스 C5를 사용한 대체적 경로

성숙 Fab를 20％ 인간 C5-결핍된 혈청에 100 pM의 시노몰구스 C5를 첨가한 것을 사용한 대체적 경로 용혈성 검정으로 시험하였다. MOR07091-, 7092- 및 7093-유래의 Fab는 최상의 억제 활성을 나타냈고, 5G1.1은 시노몰구스 C5와 교차반응하지 않았다. 도 11은 친화도 성숙 Fab에 대한 용혈성 검정 결과의 예를 보여준다.

5. 배선 IgG (인간 IgG1AA 포맷)를 사용한 용혈성 검정

고전적 경로

(1) 20％ 인간 혈청을 사용한 고전적 경로

20％ 인간 혈청을 사용한 고전적 경로 검정을 MOR로 수행하였다. 최종 배선 인간 IgGAA - MOR08109, 8110, 8113, 8114 -의 IC₅₀ 값은 참조 IgG 5G1.1보다 우수하거나 그와 유사하였다 (도 12 참조).

(2) 5％ 시노몰구스 혈청을 사용한 고전적 경로

5G1.1은 시노몰구스 C5를 인식하지 않기 때문에, 5％ 시노몰구스 혈청을 사용한 고전적 경로에서 상기 참조 항체와의 비교는 적용가능하지 않았다. MOR08111을 제외한 최종 배선 IgG는 시노몰구스 혈청에 의해 유도된 적혈구 용해를 완전하게 억제할 수 있었다. 데이타는 도 13에 나타냈다.

대체적 경로

(1) 100 pM의 인간 C5를 사용한 대체적 경로

배선 IgG를 100 pM의 인간 C5를 사용한 대체적 경로 용혈성 검정으로 시험하였다. 모든 항체가 IC₅₀ 값 28 내지 128 pM 사이의 강력한 억제 활성 (MOR08111 제외. 도 14 참조)을 나타냈고, 모두가 5G1.1과 동일하거나 그보다 우수하였다. 도 14는 IgG에 대한 용혈성 검정 결과의 예를 보여준다.

(2) 20％ 인간 혈청을 사용한 대체적 경로 및 C5a 생성 ELISA

배선 IgG를 또한 20％ 인간 혈청을 사용한 대체적 경로 용혈성 검정으로 시험하였다. 시험한 대다수의 항체가 80 nM 미만의 IC₅₀ 값을 갖는 완전한 억제를 달성했다. 참조 항체 5G1.1은 본 검정에서 용혈을 완전하게 억제하지 않았다. 도 15는 IgG에 대한 용혈성 검정 결과의 예를 보여준다. 최종 IgG에 의한 C5a 생성의 억제는 5G1.1과 유사하였다 (낮은 nM 범위의 IC₅₀ 값).

(3) 100 pM의 시노몰구스 C5를 사용한 대체적 경로

20％ 인간 C5-결핍된 혈청 중에서의 대체적 경로의 용혈성 검정을 100 pM의 시노몰구스 C5로 재구성하였다. 시노몰구스 C5에 대힌 배선 최종 후보의 효력은 인간 C5에 대한 값의 5배 이내였다 (낮은 pM 범위의 IC₅₀ 값).

(4) 10％ 시노몰구스 혈청을 사용한 대체적 경로

10％ 시노몰구스 혈청 ([C5] 약 40 nM)을 사용한 대체적 경로의 용혈성 검정에서, 배선 후보의 효력은 인간 혈청에서의 효력과 유사하였다 (성공 기준은 인간 C5를 사용한 기능적 검정에 대한 값보다 5배 이하로 더 약한 효력을 갖는 것이었음).

실시예 9: C5a 생성 ELISA

용혈성 검정에서 억제성이었던 항체가 또한 C5가 C5a 및 C5b로 절단되는 것을 억제하는지를 확인하기 위해 용혈 동안의 C5a 생성을 측정하는 C5a-des-Arg ELISA를 개발하였다.

맥시소르프 플레이트를 코팅 완충제 (pH 9.5 내지 9.8의 비카르보네이트) 중 웰 1개 당 100 ㎕의 마우스 항-인간 C5a-des-Arg (유에스 바이올로직스(US Biologics))를 1 ㎍/mL로 사용하여 코팅하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척한 후에 상기 플레이트를 300 ㎕/웰 희석제 (신블록(Synblock), AbD 세로테크(Serotec))로 2시간 동안 실온에서 차단시켰다. 상기 차단 용액을 흡인한 후, 100 ㎕의 샘플 또는 표준물 (희석제로 희석함)을 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 표준물은 다음과 같이 제조하였다: 출발은 20 ng/mL 표준물 (rC5a-des-Arg)이었고, 7-점 곡선을 위한 1:4 계열 희석물을 제조하였다. 용혈성 검정의 샘플을 희석제 중에 1:5로 희석하였다 (용혈성 검정 상등액은 C5a ELISA에서 사용할 때까지 -80℃에 저장해야 함). 사이마다 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. 희석제 중에 희석한 0.4 ㎍/mL의 검출 항체 (바이오틴-염소 항-인간 C5a, 알앤디 시스템즈(R＆D Systems))를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후에 HRP 희석제 (폴리-HRP 희석제) 중에 1:5000으로 희석한 Strep-HRP (폴리-HRP 스트렙타비딘)를 100 ㎕/웰로 30분 동안 첨가하였다. PBST로 4회 세척한 후, 100 ㎕/웰의 TMB 기질 (울트라(Ultra) TMB 기질 용액)을 5분 내지 10분 동안 첨가하였다. 반응을 50 ㎕/웰의 정지 용액 (2 N H₂SO₄)으로 정지시켰다. 흡광도를 판독 (A450 내지 A570)하고, 데이타를 소프트맥스 프로(SoftMax Pro)로 분석하였다.

용혈 동안의 C5a 생성에 대해 성숙 Fab를 시험하여, 억제 활성이 C5가 C5a 및 C5b로 절단되는 것을 차단하였기 때문임을 확인하였다. 20％ 인간 혈청 중에서의 용혈성 검정으로부터의 상등액을 사용하여 C5a 형성을 정량하였다.

시험한 모든 Fab는 C5a 수준을 기준선 아래로 떨어뜨렸다. 도 16은 C5a ELISA 결과의 예를 보여준다.

실시예 10: 인간 C3 , C4 , C5 및 시노몰구스 C5 에 대한 특이성 ELISA

모든 정제된 Fab를 인간 C3, C4 및 C5와의 결합에 대해 용액 ELISA (상기한 방법)로 분석하였다. Fab를 뉴트르아비딘 플레이트에서 바이오티닐화된 항원과 함께 인큐베이션하고, 히스티딘 태그를 통해 검출하였다.

개선된 결합은 거의 모든 성숙 Fab에서 이들 각각의 모체과 비교하여 관찰되었다. 최대 100 nM Fab에서 카운터 표적 인간 C4 및 C3에 대한 결합은 검출되지 않았다. 이러한 결과는 특이성에 대한 성공 기준을 보여준다: 인간 및 시노몰구스 C5에 결합함, 및 인간 보체 단백질 C3 및 C4와 결합하지 않음. 모 Fab MOR07091의 유도체에 대한 예는 도 17에 나타냈다.

실시예 11: 혈청 안정성 검정

C5-결합 항체가 보유한 인간 C5에 대한 결합 활성을 50％ 인간 혈청을 사용한 결합 검정으로 하기하는 바와 같이 하여 결정하였다.

항체 (Fab 포맷)를 최대 8시간 동안 37℃에서 100％ 인간 C5-결핍된 혈청 또는 PBST/0.5％ BSA (양성 대조군)와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션에는 차단된 폴리프로필렌 플레이트의 웰을 사용하여, 오랜 인큐베이션 시간에 걸쳐 항체가 표면에 결합하지 않도록 하였다. 샘플을 상이한 시점에 수집하여 -20℃에 저장하였다.

샘플을 뉴트르아비딘 플레이트에서 용액 ELISA로 시험하여 인간 C5에 대한 결합 능력을 체크하였다. 1× 케미블로커-PBST로 밤새 차단시킨 뉴트르아비딘 플레이트에 상이한 수집된 샘플의 계열 희석물 20 ㎕를 첨가하였다. 샘플의 첫번째 희석률은 1:2 (최종 혈청 농도 50％)였고, 이후에는 1:3 희석률 단계로 진행하였다. 1시간 동안 인큐베이션한 후, 상기 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 바이오티닐화된 인간 C5 20 ㎕를 2.5 ㎍/mL의 농도로 적용하였다. 1시간 후에 플레이트를 PBST (0.05％ 트윈)로 다시 5회 세척하고, Fab에 대한 항-HIS6-POD 검출 항체를 첨가하였다.

기질 (콴타 블루(Quanta Blue) 또는 아토포스)의 형광을 5분 내지 10분 후에 측정하고, 보유된 결합 활성을 각각의 최대 신호 (PBST/0.5％ BSA와 함께 인큐베이션된 항체)와 비교하여 계산하였다.

C5-결합 항체의 경우에 "반드시 충족되어야 하는" 기준 중 하나는 i) 10％ 혈청을 사용한 기능적 검정 및 ii) 50％ 혈청을 사용한 결합 검정에서 인간 혈청 중에서 75％ 내지 80％의 결합 활성을 보유하는 것이다. 용혈성 검정이 20％ 혈청의 존재하에 수행되었기 때문에, 50％ 혈청을 사용한 결합 검정에서 결합 활성을 보유한다는 것만을 보여줄 필요가 있었다.

따라서, 성숙 최종 Fab를 100％ 인간 C5-결핍된 혈청과 함께 37℃에서 8시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 상이한 시점에 수집하여 용액 ELISA로 인간 C5와의 결합에 대하여 시험하였다. ELISA에 사용된 Fab + 혈청 샘플을 50％ 혈청 + 10 nM Fab의 농도로 희석하였다.

도 18은 Fab 포맷의 최종 C5-결합 최종 항체의 결과를 예시한다. PBS 중에서 인큐베이션한 경우와 비교하여 50％ 혈청 중에 37℃에서 8시간의 인큐베이션 시간 후에 70％ 내지 93％의 결합 활성이 보유되었다.

실시예 12: 에피토프 비닝(binning)에 의한 특징규명

본 절차를 이용하여, 항-인간 C5 Fab를 C5 단백질의 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합하는 상이한 에피토프 빈의 군으로 나누었다.

각각의 바이오티닐화된 항-인간 C5 항체와 100배 과량의 각 미표지 항-인간 C5 항체의 경쟁을 ELISA (포획 방식)로 시험하였다. 이것을 각 항체의 최고 신호 (경쟁하지 않는 바이오티닐화 Fab)와 비교하였다.

384웰 흑색 맥시소르프 플레이트에 밤새 4℃에서 미리 코팅시켜 둔 폴리클로날 항-인간 C5 IgG (유에스 바이올로지칼)를 통해 인간 C5를 포획하였다. 다음 날, 상기 플레이트를 PBST로 2회 세척하고, 2시간 동안 3％ BSA-PBST로 차단하였다. PBST로 3회 세척한 후, 인간 C5 20 ㎕를 첨가하고 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 PBST로 3회 세척한 후에 Fab를 첨가하였다.

20 ㎕의 미표지 Fab (200 ㎍/mL 또는 400 ㎍/mL) (100배 과량)를 상기 맥시소르프 플레이트의 웰에 첨가한 후에 20 ng/mL 또는 40 ng/mL의 바이오티닐화 Fab를 첨가하였다. 바이오티닐화 Fab 및 미표지 Fab를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, Strep-AP 자이맥스(Zymax) 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제, 자이메드 (코드: 43-8322, 제품 번호: 50799648)를 첨가하여 플레이트에 바이오티닐화 Fab가 C5를 통해 결합하는 것을 검출하였다. 아토포스 기질 (로쉐)을 상기 플레이트에 첨가하고, 5분 내지 10분 후에 형광을 판독하였다.

모 Fab

C5를 (폴리클로날 항체를 통해) 포획하였고, 미표지 FabY를 바이오티닐화 FabX에 과량으로 적용하였다. 인간 C5에 대한 바이오티닐화 FabX의 결합을 검출하였다. 6개 군의 Fab를 정할 수 있었다: 군 1: MOR06952, 6961, 군 2: MOR06525, 6756, 6757, 6763, 군 3: MOR07087, 군 4: MOR06764, 6776, 7081, 군 5: MOR07089, 군 6: MOR07082, 7083, 7084, 7086, 7088, 7090, 7091, 7092, 7093, 7095.

Fab를 또한 상이한 방법을 이용하여 상이한 에피토프 결합 군으로 나누었다: FabX를 고정시킨 후에 바이오티닐화 C5와 함께 사전 인큐베이션한 FabY를 첨가하였다. 하기 군의 Fab를 정할 수 있었다: 군 1: MOR06952, 6961, 군 2: MOR06525, 6757, 7083, 군 3: MOR07087, 군 4: MOR06763, 군 5: MOR07081, 군 6: MOR07082, 7083, 7084, 7086, 7088, 7091, 7092, 7093 (7089는 7084와 경쟁함). 2가지 상이한 방법으로 결과를 도출할 때, 유사한 결과가 얻어질 수 있었다.

성숙 Fab

Fab 특징규명을 완성하기 위해서, 바이오티닐화 Fab와 미표지 Fab (100배 과량으로 적용됨)의 경쟁을 용액 ELISA로 측정하였다. 결과를 최고 신호 (경쟁하지 않는 바이오티닐화 Fab)와 비교하였다.

도 19에 나타난 바와 같이, 바이오티닐화 Fab는 동일한 미표지 Fab와 경쟁하고, 모든 Fab는 동일하거나 중첩되는 에피토프와의 결합에 대해 경쟁한다. 이러한 결과는 모 Fab에 대한 에피토프 비닝 데이타와 상관관계가 있다.

실시예 13: C5 알파 vs . 베타 쇄 결합제의 스크리닝 및 경쟁 검정

하기하는 바와 같이 2가지 ELISA 실험 및 용혈성 검정을 수행하여, Fab가 알파 또는 베타 쇄 결합제인지 여부를 시험하였다.

첫번째 실험에서, Fab를 플레이트에 코팅하고, 정제된 C5 또는 키메라 C5 제제 (인간 알파, 마우스 베타 쇄)의 상등액을 첨가하였다. 다음 단계로서, 5G1.1을 적용하고, 항-인간 IgG로 검출하였다.

두번째 실험에서, 5G1.1를 플레이트에 코팅하고, 정제된 C5 또는 키메라 C5 제제 (인간 알파, 마우스 베타 쇄)의 상등액을 첨가한 후에 Fab를 항-Myc 항체로 검출하였다.

참조 IgG 5G1.1은 알파 쇄를 인식하며, 이것을 이용하여 MorhpSys 생성된 Fab가 5G1.1과 결합에 대해 경쟁하는지 여부를 결정하였다. 용혈성 검정에서는, 키메라 C5 제제로부터의 상등액을 인간 C5-결핍된 혈청에 첨가하고, Fab를 용혈 억제에 대해 시험하였다.

모 Fab

도 20은 Fab를 플레이트에 코팅하고 C5 또는 키메라 C5 제제 (인간 알파 쇄 및 마우스 베타 쇄)의 상등액을 첨가한 후에 5G1.1을 첨가한 ELISA 실험의 결과를 보여준다. 도 21은 정제된 C5 및 키메라 C5로부터의 상등액이 5G1.1에 의해 포획된 ELISA 실험 결과를 보여준다.

MOR06525, 6756, 6763은 베타 쇄 결합제이다 (C5에는 결합하지만 키메라 C5에는 결합하지 않음). 대부분의 MOR070XX Fab (용액 패닝에서 유래됨)는 알파 쇄 결합제이다 (C5 및 키메라 C5에 결합함). MOR06952 및 6961은 5G1.1과 경쟁하기 때문에 이것들은 C5 및 키메라 C5 둘 다에 음성이고, 따라서 가장 가능하게는 5G1.1과 마찬가지로 알파 쇄 결합제이다. MOR06757은 MOR06952 및 6961처럼 거동하는데, 즉, 이것은 가능하게는 알파 쇄 결합제이다. 그러나, MOR06757은 C5-결핍된 혈청에 스파이크된 키메라 C5 상등액의 용혈을 억제하지 않지만, 모든 다른 알파 쇄 결합제는 억제한다 (도 22 참조).

용혈성 검정에서, 키메라 C5 제제의 상등액을 인간 C5-결핍된 혈청에 첨가하였고, Fab를 용혈 억제에 대해 시험하였다. MOR06525, 6756, 6757 및 6763은 키메라 C5 사용시의 용혈을 억제하지 못했고, 따라서 베타 쇄 결합제일 수 있다. MOR06952, 6961, 7081, 7082, 7083, 7084, 7086, 7087, 7088, 7089, 7090, 7091, 7092, 7093, 7094, 7095는 용혈을 억제했기 때문에 알파 쇄 결합제일 수 있다.

실시예 14: 단백질분해에 대한 내성

Fab의 구조적 강도를 조사하기 위해, 써모라이신에 의한 단백질분해에 대한 Fab의 내성 실험을 수행하였다 (써모라이신 박테리아 프로테아제, 칼바이오켐(Calbiochem)). Fab를 37℃ 또는 55℃ (써모라이신 활성은 55℃에서 최적임)에서 써모라이신 (Fab:써모라이신 = 3:1 (w/w), 반응 부피 8 ㎕)과 함께 인큐베이션하였다. 0.5 M EDTA 4 ㎕ 및 4× LDS 샘플 완충제 (인비트로겐) 4 ㎕의 첨가로 반응을 정지시키고, 정지된 샘플을 4％ 내지 12％ SDS-PAGE에서 비-환원 조건하에 운행하였다. 쿠마시(Coomassie) 염색으로 가시화되는 Fab 밴드가 사라지는 것을 모니터링하여 Fab의 단백질분해를 분석하였다.

모 Fab

모 Fab를 37℃ 및 55℃에서 써모라이신 단백질분해에 대한 내성에 대하여 시험하였다. 인간화 IL-1β 항체의 Fab를 대조군으로서 사용하였다. 대부분의 시험된 Fab는 37℃에서 최대 90분 동안 써모라이신에 의한 분해에 내성이 있었다. Fab의 구조적 강도를 추가로 차별화하기 위해, 55℃의 더 높은 온도에서 단백질분해를 수행하였다. 시험한 Fab 중 많은 것들이 55℃에서 신속하게 분해되었지만 (>90％ Fab가 30분 이내에 분해됨), 일부 Fab는 90분 후에도 단백질분해에 여전히 내성이 있었다 (예를 들어, 7094). 내성 Fab는 보다 강한 구조를 가져서 이것들이 보다 우수한 생체내 약력학 특성을 나타낼 수 있는 것으로 시사되었다. 이러한 실험의 결과는 도 23 및 도 24에 나타냈다.

성숙 Fab

용혈성 검정에서 가장 높은 효력을 갖는 Fab를 써모라이신에 대한 감수성에 대해 37℃ 및 55℃에서 시험하였다. 도 25 및 도 26에는, MOR07086, 7091, 7092 및 7093의 유도체를 사용한 실험을 나타냈다.

이러한 실험의 결과는 모 MOR07091, 7092 및 7093의 유도체는 단백질분해에 대한 감수성이 덜한 반면, MOR07086 유도체는 단백질분해에 대한 감수성이 더 높음을 밝혀냈다.

실시예 15: MAC 침착 검정

최종 보체 캐스케이드가 MAC의 형성으로 종결되기 때문에, MAC 형성의 억제는 보체 캐스케이드를 차단하는 항체 능력에 대한 추가의 힌트였다. 이론적 해석은 세포 및 세포 거동에 독립적인 추가의 셋업을 갖는 것이었다.

특히 대체적 경로의 면역 검정에서 사용되는 자이모산 (시그마)은 효모 세포벽으로부터의 불용성 탄수화물이며, 이것으로 코팅하여 대체적 경로를 활성화시켰고, IgM (시그마)으로 코팅하여 고전적 경로를 활성화시켜서 MAC (막 공격 복합체) 침착을 결정하였다. Fab를 인간 혈청 (AP의 경우에는 6％, CP의 경우에는 2％)과 함께 사전 인큐베이션하고, 플레이트에 첨가하였다. 각각의 샘플에 대하여 MAC 침착의 억제율(％)을 기준선 (EDTA 처치된 인간 혈청) 및 양성 대조군 (인간 혈청)에 대해 계산하였고, 이것을 이용하여 XLFit로 IC₅₀ 곡선을 생성하였다.

모 Fab

모 Fab는 다양한 농도로 사용되었고, 최대 억제 (적용가능한 경우에는 또한 IC₅₀ 값)를 결정하였다 (도 27에 나타낸 예). 대부분의 Fab는 MAC 침착을 완전하게 억제하였고, 이는 C5 절단의 차단을 나타낸다. Fab의 효력 및 랭킹은 용혈성 검정의 데이타와 유사하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> Compositions and methods for antibodies targeting complement protein C5 <130> 52633-US-P <140> 61/086,355 <141> 2008-08-05 <160> 297 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Gly Ile Gly Pro Phe Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Asp Thr Pro Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Ser Gly Asp Ser Ile Pro Asn Tyr Tyr Val Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 5 Asp Asp Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 6 Gln Ser Phe Asp Ser Ser Leu Asn Ala Glu Val 1 5 10 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Gly Pro Phe Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Thr Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 8 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ser Ile Pro Asn Tyr Tyr Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Ser Ser Leu Asn Ala 85 90 95 Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 9 <211> 446 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Gly Pro Phe Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Thr Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 10 <211> 214 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 10 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ser Ile Pro Asn Tyr Tyr Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Ser Ser Leu Asn Ala 85 90 95 Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 11 <211> 348 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 11 gaggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cctccggagg cactttttct tcttatgcca tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcggt atcggtccgt tttttggcac tgcgaattac 180 gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtgatact 300 ccttattttg attattgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctca 348 <210> 12 <211> 324 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 12 tcctatgaac tcacacagcc cctgagcgtg agcgtggccc tgggccagac cgcccggatc 60 acctgctccg gcgacagcat ccccaactac tacgtgtact ggtaccagca gaagcccggc 120 caggcccccg tgctggtgat ctacgacgac agcaaccggc ccagcggcat ccccgagcgg 180 ttcagcggca gcaacagcgg caacaccgcc accctgacca tttccagagc acaggcaggc 240 gacgaggccg actactactg ccagagcttc gacagcagcc tgaacgccga ggtgttcggc 300 ggagggacca agttaaccgt ccta 324 <210> 13 <211> 1338 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 13 gaggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cctccggagg cactttttct tcttatgcca tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcggt atcggtccgt tttttggcac tgcgaattac 180 gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtgatact 300 ccttattttg attattgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctcagc ctccaccaag 360 ggtccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 660 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaagcag cggggggacc gtcagtcttc 720 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 900 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1080 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320 tccctgtctc cgggtaaa 1338 <210> 14 <211> 642 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 14 tcctatgaac tcacacagcc cctgagcgtg agcgtggccc tgggccagac cgcccggatc 60 acctgctccg gcgacagcat ccccaactac tacgtgtact ggtaccagca gaagcccggc 120 caggcccccg tgctggtgat ctacgacgac agcaaccggc ccagcggcat ccccgagcgg 180 ttcagcggca gcaacagcgg caacaccgcc accctgacca tttccagagc acaggcaggc 240 gacgaggccg actactactg ccagagcttc gacagcagcc tgaacgccga ggtgttcggc 300 ggagggacca agttaaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 360 ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 420 ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 480 gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 540 agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 600 gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt ca 642 <210> 15 <211> 1338 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 15 gaggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc ccggtagcag cgtcaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcgg caccttcagc agctacgcca tcagctgggt gcggcaggcc 120 ccaggccagg gcctggagtg gatgggcggc atcggcccat tcttcggcac cgccaactac 180 gcccagaagt tccagggcag ggtcaccatc accgccgacg agagcaccag caccgcctac 240 atggagctgt ccagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacacc 300 ccctacttcg actactgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgagcagcgc tagcaccaag 360 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tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60 agctgcaaag gttccggata ttcctttact aattatattt cttgggtgcg ccagatgcct 120 gggaagggtc tcgagtggat gggcattatt gatcctgatg attcttatac tgagtattct 180 ccttcttttc agggtcaggt caccattagc gcggataaaa gcattagcac cgcgtatctt 240 caatggagca gcctgaaagc gagcgatacg gccatgtatt attgcgcgcg ttatgagtat 300 ggtggttttg atatttgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctca 348 <210> 28 <211> 318 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 28 agttacgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60 tcgtgtagcg gcgataatat tggtaattct tatgttcatt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggcgccag ttcttgtgat ttataaggat aatgatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg cggtacttat gatattgagt cttatgtgtt tggcggcggc 300 acgaagttaa ccgtccta 318 <210> 29 <211> 1338 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 29 gaggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60 agctgcaaag gttccggata ttcctttact aattatattt cttgggtgcg ccagatgcct 120 gggaagggtc tcgagtggat gggcattatt gatcctgatg attcttatac tgagtattct 180 ccttcttttc agggtcaggt caccattagc gcggataaaa gcattagcac cgcgtatctt 240 caatggagca gcctgaaagc gagcgatacg gccatgtatt attgcgcgcg ttatgagtat 300 ggtggttttg atatttgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctcagc ctccaccaag 360 ggtccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 660 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaagcag cggggggacc gtcagtcttc 720 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 900 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga 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cccagaccta catctgcaac 600 gtgaaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag tggagcccaa gagctgcgac 660 aagacccaca cctgcccccc ctgcccagcc cccgaagctg caggcggccc ttccgtgttc 720 ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg atgatcagca ggacccccga ggtgacctgc 780 gtggtggtgg acgtgagcca cgaggaccca gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc agagaggagc agtacaacag cacctacagg 900 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaaaga atacaagtgc 960 aaggtctcca acaaggccct gcctgccccc atcgaaaaga ccatcagcaa ggccaagggc 1020 cagccacggg agccccaggt gtacaccctg cccccttctc gggaggagat gaccaagaac 1080 caggtgtccc tgacctgtct ggtgaagggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140 gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ccccagtgct ggacagcgac 1200 ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1260 gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg 1320 agcctgtcac ccggcaag 1338 <210> 32 <211> 636 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 32 agctacgagc tgacccagcc ccccagcgtg agcgtggccc 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gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 900 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1080 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320 tccctgtctc cgggtaaa 1338 <210> 58 <211> 636 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 58 agttacgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60 tcgtgtagcg gcgataatat tggtaattct tatgttcatt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggcgccag ttcttgtgat ttataaggat aatgatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg cgctacttgg ggttctgagg atcaggtgtt tggcggcggc 300 acgaagttaa ccgtcctagg tcagcccaag gctgccccct cggtcactct gttcccgccc 360 tcctctgagg agcttcaagc caacaaggcc acactggtgt gtctcataag tgacttctac 420 ccgggagccg tgacagtggc ctggaaggca gatagcagcc ccgtcaaggc gggagtggag 480 accaccacac cctccaaaca aagcaacaac aagtacgcgg ccagcagcta tctgagcctg 540 acgcctgagc agtggaagtc ccacagaagc tacagctgcc aggtcacgca tgaagggagc 600 accgtggaga agacagtggc ccctacagaa tgttca 636 <210> 59 <211> 1338 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 59 gaggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaaaaagc ccggtgagag cctgaagatc 60 agctgcaagg gcagcggcta cagcttcacc aactacatca gctgggtgcg gcagatgccc 120 ggcaagggcc tggagtggat gggcatcatc gaccccgacg acagctacac caggtacagc 180 cccagcttcc agggccaggt gaccatcagc gccgacaaga gcatcagcac cgcctacctg 240 cagtggagca gcctgaaggc cagcgacacc gccatgtact actgcgccag atacgagtac 300 ggcggcttcg acatctgggg ccagggcacc ctggtgaccg tcagctcagc tagcaccaag 360 ggccccagcg tgttccccct ggcccccagc agcaagagca cctccggcgg cacagccgcc 420 ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgtcctg gaacagcgga 480 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agagcagcgg cctgtacagc 540 ctgtccagcg tggtgacagt gcccagcagc agcctgggca cccagaccta catctgcaac 600 gtgaaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag tggagcccaa gagctgcgac 660 aagacccaca cctgcccccc ctgcccagcc cccgaagctg caggcggccc ttccgtgttc 720 ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg atgatcagca ggacccccga ggtgacctgc 780 gtggtggtgg acgtgagcca cgaggaccca gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc agagaggagc agtacaacag cacctacagg 900 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaaaga atacaagtgc 960 aaggtctcca acaaggccct gcctgccccc atcgaaaaga ccatcagcaa ggccaagggc 1020 cagccacggg agccccaggt gtacaccctg cccccttctc gggaggagat gaccaagaac 1080 caggtgtccc tgacctgtct ggtgaagggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140 gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ccccagtgct ggacagcgac 1200 ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1260 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cctgaaaatt 60 agctgcaaag gttccggata ttcctttact tcttattata ttggttgggt gcgccagatg 120 cctgggaagg gtctcgagtg gatgggcatt attgatccta ctgattctca gactgcttat 180 tctccttctt ttcagggtca ggtgaccatt agcgcggata aaagcattag caccgcgtat 240 cttcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat acggccatgt attattgcgc gcgttatatg 300 atgcgtggtt ttgatcattg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a 351 <210> 72 <211> 321 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 72 agttacgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60 tcgtgtagcg gcgattctct tggtgattat tatgcttatt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggcgccag ttcttgtgat ttataaggat aataatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg ccagacttgg gatactggtg agtctggtgt gtttggcggc 300 ggcacgaagt taaccgtcct a 321 <210> 73 <211> 1341 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 73 gaggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60 agctgcaaag gttccggata ttcctttact tcttattata ttggttgggt gcgccagatg 120 cctgggaagg 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cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct 600 gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag cccaaatctt 660 gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agcagcgggg ggaccgtcag 720 tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca 780 catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg 840 acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt 900 accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca 960 agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca 1020 aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca 1080 agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg 1140 agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact 1200 ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg 1260 ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga 1320 gcctctccct gtctccgggt aaa 1343 <210> 100 <211> 1341 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 100 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caagaccaag cccagagagg agcagtacaa cagcacctac 900 agggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agaatacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaggc cctgcctgcc cccatcgaaa agaccatcag caaggccaag 1020 ggccagccac gggagcccca ggtgtacacc ctgccccctt ctcgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccccccagt gctggacagc 1200 gacggcagct tcttcctgta cagcaagctg accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 1260 aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 1320 ctgagcctgt cacccggcaa g 1341 <210> 101 <211> 10 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 101 Ser Thr Trp Asp Ile Glu Pro Thr Tyr Val 1 5 10 <210> 102 <211> 107 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 102 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asn Ser Tyr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu 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tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg ctctacttgg gatattgagc ctacttatgt gtttggcggc 300 ggcacgaagt taaccgtcct aggtcagccc aaggctgccc cctcggtcac tctgttcccg 360 ccctcctctg aggagcttca agccaacaag gccacactgg tgtgtctcat aagtgacttc 420 tacccgggag ccgtgacagt ggcctggaag gcagatagca gccccgtcaa ggcgggagtg 480 gagaccacca caccctccaa acaaagcaac aacaagtacg cggccagcag ctatctgagc 540 ctgacgcctg agcagtggaa gtcccacaga agctacagct gccaggtcac gcatgaaggg 600 agcaccgtgg agaagacagt ggcccctaca gaatgttca 639 <210> 106 <211> 639 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 106 agctacgagc tgacccagcc ccccagcgtg agcgtggccc caggccagac cgccaggatc 60 agctgcagcg gcgacaatat cggcaacagc tacgtgcact ggtatcagca gaagcccggc 120 caggcccccg tgctggtgat ctacaaggac aacgacaggc ccagcggcat ccccgagagg 180 ttcagcggca gcaactccgg caacaccgcc accctgacaa tcagcggcac ccaggccgag 240 gacgaggccg actactactg ctctacttgg gatattgagc ctacttatgt gttcggcgga 300 gggaccaagc tgaccgtgct gggccagcct aaggctgccc ccagcgtgac 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agggtcaggt caccattagc gcggataaaa gcattagcac cgcgtatctt 240 caatggagca gcctgaaagc gagcgatacg gccatgtatt attgcgcgcg ttatgagtat 300 ggtggttttg atatttgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctcagc ctccaccaag 360 ggtccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 660 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaagcag cggggggacc gtcagtcttc 720 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 900 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020 cagccccgag aaccacaggt 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Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 180 185 190 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 195 200 205 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Xaa 210 215 <210> 141 <211> 351 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 141 caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60 agctgcaaag gttccggata ttcctttact tcttattgga tttcttgggt gcgccagatg 120 cctgggaagg gtctcgagtg gatgggcatt atcgatccgg atgatagcaa gaccaattat 180 tctccgagct ttcagggcca ggtgaccatt agcgcggata aaagcattag caccgcgtat 240 cttcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat acggccatgt attattgcgc gcgtcgttct 300 tattatccta tggattattg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a 351 <210> 142 <211> 336 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 142 gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60 tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttgtt ggtgtttata attttgtgtc ttggtaccag 120 cagcatcccg ggaaggcgcc gaaacttatg atttattatg ttgataatcg tccctcaggc 180 gtgagcaacc gttttagcgg atccaaaagc ggcaacaccg cgagcctgac cattagcggc 240 ctgcaagcgg aagacgaagc ggattattat tgccagtctt ttgatggttt tggtattgat 300 atggtgtttg gcggcggcac gaagttaacc gttctt 336 <210> 143 <211> 658 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (658)..(658) <223> n can be TGC, GAATTC, or TGCGAATTC <400> 143 caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60 agctgcaaag gttccggata ttcctttact tcttattgga tttcttgggt gcgccagatg 120 cctgggaagg gtctcgagtg gatgggcatt atcgatccgg atgatagcaa gaccaattat 180 tctccgagct ttcagggcca ggtgaccatt agcgcggata aaagcattag caccgcgtat 240 cttcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat acggccatgt attattgcgc gcgtcgttct 300 tattatccta tggattattg gggccaaggc accctggtga cggttagctc agcgtcgacc 360 aaaggtccaa gcgtgtttcc gctggctccg agcagcaaaa gcaccagcgg cggcacggct 420 gccctgggct gcctggttaa agattatttc ccggaaccag tcaccgtgag ctggaacagc 480 ggggcgctga ccagcggcgt gcataccttt ccggcggtgc tgcaaagcag cggcctgtat 540 agcctgagca gcgttgtgac cgtgccgagc agcagcttag gcactcagac ctatatttgc 600 aacgtgaacc ataaaccgag caacaccaaa gtggataaaa aagtggaacc gaaaagcn 658 <210> 144 <211> 649 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (649)..(649) <223> n can be TGCAGC or GCC <400> 144 gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60 tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttgtt ggtgtttata attttgtgtc ttggtaccag 120 cagcatcccg ggaaggcgcc gaaacttatg atttattatg ttgataatcg tccctcaggc 180 gtgagcaacc gttttagcgg atccaaaagc ggcaacaccg cgagcctgac cattagcggc 240 ctgcaagcgg aagacgaagc ggattattat tgccagtctt ttgatggttt tggtattgat 300 atggtgtttg gcggcggcac gaagttaacc gttcttggcc agccgaaagc cgcaccgagt 360 gtgacgctgt ttccgccgag cagcgaagaa ttgcaggcga acaaagcgac cctggtgtgc 420 ctgattagcg acttttatcc gggagccgtg acagtggcct ggaaggcaga tagcagcccc 480 gtcaaggcgg gagtggagac caccacaccc tccaaacaaa gcaacaacaa gtacgcggcc 540 agcagctatc tgagcctgac gcctgagcag tggaagtccc acagaagcta cagctgccag 600 gtcacgcatg aggggagcac cgtggaaaaa accgttgcgc cgactgagn 649 <210> 145 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 145 Ser Tyr Trp Ile Ala 1 5 <210> 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Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Lys Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 152 <211> 111 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 152 Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asn Val Asn Ser Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asp Gly 85 90 95 Gln Asp Asn Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 153 <211> 220 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (220)..(220) <223> X can be C, EF, or CEF <400> 153 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp 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A <400> 154 Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asn Val Asn Ser Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asp Gly 85 90 95 Gln Asp Asn Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 130 135 140 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 145 150 155 160 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 165 170 175 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 180 185 190 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 195 200 205 Lys Thr 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gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60 tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt ggttataatt atgtgtcttg gtaccagcag 120 catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tataatgtta attctcgtcc ctcaggcgtg 180 agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg 240 caagcggaag acgaagcgga ttattattgc cagtcttatg atgatggtca ggataatgag 300 gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccagc cgaaagccgc accgagtgtg 360 acgctgtttc cgccgagcag cgaagaattg caggcgaaca aagcgaccct ggtgtgcctg 420 attagcgact tttatccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 480 aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 540 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 600 acgcatgagg ggagcaccgt ggaaaaaacc gttgcgccga ctgagn 646 <210> 159 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 159 Ser Tyr Ala Met His 1 5 <210> 160 <211> 17 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 160 Ala Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 161 <211> 7 <212> PRT 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cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgct atctcttctt ctggtagctc tacctattat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtgagtct 300 tggtttcttg atctttgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctca 348 <210> 170 <211> 321 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 170 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca gtctatttct aattggctgg cttggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatctt gcttcttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cggtttatta ttgccagcag tattatgatt tttctgatac ctttggccag 300 ggtacgaaag ttgaaattaa a 321 <210> 171 <211> 655 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (655)..(655) <223> n can be TGC, TAATTC, or TGCGAATTC <400> 171 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt tacctttact tcttatgcta tgcattgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgct atctcttctt ctggtagctc tacctattat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtgagtct 300 tggtttcttg atctttgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctcagc gtcgaccaaa 360 ggtccaagcg tgtttccgct ggctccgagc agcaaaagca ccagcggcgg cacggctgcc 420 ctgggctgcc tggttaaaga ttatttcccg gaaccagtca ccgtgagctg gaacagcggg 480 gcgctgacca gcggcgtgca tacctttccg gcggtgctgc aaagcagcgg cctgtatagc 540 ctgagcagcg ttgtgaccgt gccgagcagc agcttaggca ctcagaccta tatttgcaac 600 gtgaaccata aaccgagcaa caccaaagtg gataaaaaag tggaaccgaa aagcn 655 <210> 172 <211> 640 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (640)..(640) <223> n can be TGC or GCC <400> 172 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca gtctatttct aattggctgg cttggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatctt gcttcttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cggtttatta ttgccagcag tattatgatt tttctgatac ctttggccag 300 ggtacgaaag ttgaaattaa acgtacggtg gctgctccga gcgtgtttat ttttccgccg 360 agcgatgaac aactgaaaag cggcacggcg agcgtggtgt gcctgctgaa caacttttat 420 ccgcgtgaag cgaaagttca gtggaaagta gacaacgcgc tgcaaagcgg caacagccag 480 gaaagcgtga ccgaacagga tagcaaagat agcacctatt ctctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaaag cggattatga aaaacataaa gtgtatgcgt gcgaagtgac ccatcaaggt 600 ctgagcagcc cggtgactaa atcttttaat cgtggcgagn 640 <210> 173 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 173 Asn Tyr Gly Met His 1 5 <210> 174 <211> 16 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 174 Val Ser Tyr Ala Gly Ser Phe Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 175 <211> 12 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 175 Ser Trp Leu Phe Gly Tyr Pro Asp Ile Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 176 <211> 14 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 176 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 177 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 177 Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 178 <211> 9 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 178 Ser Ser Tyr Asp Lys Phe Gln Thr Val 1 5 <210> 179 <211> 120 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 179 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ser Tyr Ala Gly Ser Phe Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ser Trp Leu Phe Gly Tyr Pro Asp Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 180 <211> 109 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 180 Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys 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gccgtgtatt attgcgcgcg ttcttggctt 300 tttggttatc ctgatatttt tgattattgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360 <210> 184 <211> 327 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 184 gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60 tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt ggttataatt atgtgtcttg gtaccagcag 120 catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatgatgtta ataatcgtcc ctcaggcgtg 180 agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg 240 caagcggaag acgaagcgga ttattattgc tcttcttatg ataagtttca gactgtgttt 300 ggcggcggca cgaagttaac cgttctt 327 <210> 185 <211> 667 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (667)..(667) <223> n can be TGC, TAATTC, or TGCGAATTC <400> 185 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taccttttct aattatggta tgcattgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgtt tcttatgctg gtagctttac caattatgcg 180 gatagcgtga aaggccgttt taccatttca cgtgataatt cgaaaaacac cctgtatctg 240 caaatgaaca gcctgcgtgc ggaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg ttcttggctt 300 tttggttatc ctgatatttt tgattattgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360 gcgtcgacca aaggtccaag cgtgtttccg ctggctccga gcagcaaaag caccagcggc 420 ggcacggctg ccctgggctg cctggttaaa gattatttcc cggaaccagt caccgtgagc 480 tggaacagcg gggcgctgac cagcggcgtg catacctttc cggcggtgct gcaaagcagc 540 ggcctgtata gcctgagcag cgttgtgacc gtgccgagca gcagcttagg cactcagacc 600 tatatttgca acgtgaacca taaaccgagc aacaccaaag tggataaaaa agtggaaccg 660 aaaagcn 667 <210> 186 <211> 640 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (640)..(640) <223> n can be TGCAGC or GCC <400> 186 gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60 tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt ggttataatt atgtgtcttg gtaccagcag 120 catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatgatgtta ataatcgtcc ctcaggcgtg 180 agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg 240 caagcggaag acgaagcgga ttattattgc tcttcttatg ataagtttca gactgtgttt 300 ggcggcggca cgaagttaac cgttcttggc cagccgaaag ccgcaccgag tgtgacgctg 360 tttccgccga gcagcgaaga attgcaggcg aacaaagcga ccctggtgtg cctgattagc 420 gacttttatc cgggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg 480 ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctat 540 ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat 600 gaggggagca ccgtggaaaa aaccgttgcg ccgactgagn 640 <210> 187 <211> 116 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 187 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Gly Pro Phe Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Thr Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 188 <211> 108 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 188 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Pro Asn Tyr Tyr Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Ser Ser Leu Asn Ala 85 90 95 Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 189 <211> 219 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (219)..(219) <223> X can be C, EF, or CEF <400> 189 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Gly Pro Phe Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser 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gcgccaagcc 120 cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcggt atcggtccgt tttttggcac tgcgaattac 180 gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtgatact 300 ccttattttg attattgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctca 348 <210> 192 <211> 324 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 192 gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60 tcgtgtagcg gcgattctat tcctaattat tatgtttatt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat tctaatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg ccagtctttt gattcttctc ttaatgctga ggtgtttggc 300 ggcggcacga agttaaccgt tctt 324 <210> 193 <211> 655 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (655)..(655) <223> n can be TGC, GAATTC, or TGCGAATTC <400> 193 caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cctccggagg cactttttct tcttatgcca tttcttgggt gcgccaagcc 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<212> PRT <213> homo sapiens <400> 199 Gly Thr Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 200 <211> 9 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 200 Gln Gln Leu Asp Ser Phe Pro Ala Thr 1 5 <210> 201 <211> 128 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 201 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Glu Ile Trp His Val His Gln Pro Tyr Lys Ser Gly Val 100 105 110 Tyr Gly Ala Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 202 <211> 107 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 202 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Ser Phe Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 203 <211> 231 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (231)..(231) <223> X can be C, EF, or CEF <400> 203 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Glu Ile Trp His Val His Gln Pro Tyr Lys Ser Gly Val 100 105 110 Tyr Gly Ala Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 130 135 140 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 145 150 155 160 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 165 170 175 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 180 185 190 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 195 200 205 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 210 215 220 Lys Val Glu Pro Lys Ser Xaa 225 230 <210> 204 <211> 214 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (214)..(214) <223> X can be C or A <400> 204 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Ser Phe Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Xaa 210 <210> 205 <211> 384 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 205 caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cctccggagg cactttttct tcttattata tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcggt atcattccga tttttggcac tgcgaattac 180 gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtggtgag 300 atttggcatg ttcatcagcc ttataagtct ggtgtttatg gtgctgctta ttggggccaa 360 ggcaccctgg tgacggttag ctca 384 <210> 206 <211> 321 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 206 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca gggtatttct aattggctga attggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatggt acttcttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cgacttatta ttgccagcag cttgattctt ttcctgctac ctttggccag 300 ggtacgaaag ttgaaattaa a 321 <210> 207 <211> 691 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (691)..(691) <223> n can be TGC, GAATTC, or TGCGAATTC <400> 207 caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cctccggagg cactttttct tcttattata tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcggt atcattccga tttttggcac tgcgaattac 180 gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtggtgag 300 atttggcatg ttcatcagcc ttataagtct ggtgtttatg gtgctgctta ttggggccaa 360 ggcaccctgg tgacggttag ctcagcgtcg accaaaggtc caagcgtgtt tccgctggct 420 ccgagcagca aaagcaccag cggcggcacg gctgccctgg gctgcctggt taaagattat 480 ttcccggaac cagtcaccgt gagctggaac agcggggcgc tgaccagcgg cgtgcatacc 540 tttccggcgg tgctgcaaag cagcggcctg tatagcctga gcagcgttgt gaccgtgccg 600 agcagcagct taggcactca gacctatatt tgcaacgtga accataaacc gagcaacacc 660 aaagtggata aaaaagtgga accgaaaagc n 691 <210> 208 <211> 640 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (640)..(640) <223> n can be TGC or GCC <400> 208 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca gggtatttct aattggctga attggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatggt acttcttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cgacttatta ttgccagcag cttgattctt ttcctgctac ctttggccag 300 ggtacgaaag ttgaaattaa acgtacggtg gctgctccga gcgtgtttat ttttccgccg 360 agcgatgaac aactgaaaag cggcacggcg agcgtggtgt gcctgctgaa caacttttat 420 ccgcgtgaag cgaaagttca gtggaaagta gacaacgcgc tgcaaagcgg caacagccag 480 gaaagcgtga ccgaacagga tagcaaagat agcacctatt ctctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaaag cggattatga aaaacataaa gtgtatgcgt gcgaagtgac ccatcaaggt 600 ctgagcagcc cggtgactaa atcttttaat cgtggcgagn 640 <210> 209 <211> 11 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 209 Gln Ser Trp Thr Asp Ser Pro Asn Thr Leu Val 1 5 10 <210> 210 <211> 117 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 210 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser His Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Met Met Arg Gly Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 211 <211> 108 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 211 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Leu Gly Asp Tyr Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Thr Asp Ser Pro Asn Thr 85 90 95 Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 212 <211> 220 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (220)..(220) <223> X can be C, EF, or CEF <400> 212 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser His Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Met Met Arg Gly Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Xaa 210 215 220 <210> 213 <211> 213 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (213)..(213) <223> X can be CS or A <400> 213 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Leu Gly Asp Tyr Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Thr Asp Ser Pro Asn Thr 85 90 95 Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val 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<211> 658 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (658)..(658) <223> n can be TGC, GAATTC, or TGCGAATTC <400> 216 caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60 agctgcaaag gttccggata ttcctttact tcttattata ttggttgggt gcgccagatg 120 cctgggaagg gtctcgagtg gatgggcatt atcgatccgt ctgatagcca taccacttat 180 tctccgagct ttcagggcca ggtgaccatt agcgcggata aaagcattag caccgcgtat 240 cttcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat acggccatgt attattgcgc gcgttatatg 300 atgcgtggtt ttgatcattg gggccaaggc accctggtga cggttagctc agcgtcgacc 360 aaaggtccaa gcgtgtttcc gctggctccg agcagcaaaa gcaccagcgg cggcacggct 420 gccctgggct gcctggttaa agattatttc ccggaaccag tcaccgtgag ctggaacagc 480 ggggcgctga ccagcggcgt gcataccttt ccggcggtgc tgcaaagcag cggcctgtat 540 agcctgagca gcgttgtgac cgtgccgagc agcagcttag gcactcagac ctatatttgc 600 aacgtgaacc ataaaccgag caacaccaaa gtggataaaa aagtggaacc gaaaagcn 658 <210> 217 <211> 637 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (637)..(637) <223> n can be TGCAGC or GCC <400> 217 gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60 tcgtgtagcg gcgattctct tggtgattat tatgcttatt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggcgccag ttcttgtgat ttataaggat aataatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg ccagtcttgg actgattctc ctaatactct tgtgtttggc 300 ggcggcacga agttaaccgt tcttggccag ccgaaagccg caccgagtgt gacgctgttt 360 ccgccgagca gcgaagaatt gcaggcgaac aaagcgaccc tggtgtgcct gattagcgac 420 ttttatccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 480 gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 540 agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgag 600 gggagcaccg tggaaaaaac cgttgcgccg actgagn 637 <210> 218 <211> 116 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 218 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 35 40 45 Ile Ile Asp Pro Asp Asp Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 50 55 60 Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Glu Tyr Gly Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 219 <211> 106 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 219 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asn Ser Tyr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Tyr Asp Ile Glu Ser Tyr Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 220 <211> 219 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (219)..(219) <223> X can be C, EF, or CEF <400> 220 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 35 40 45 Ile Ile Asp Pro Asp Asp Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 50 55 60 Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Glu Tyr Gly Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 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tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg cggtacttat gatattgagt cttatgtgtt tggcggcggc 300 acgaagttaa ccgttctt 318 <210> 224 <211> 655 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (655)..(655) <223> n can be TGC, GAATTC, or TGCGAATTC <400> 224 caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60 agctgcaaag gttccggata ttcctttact aattatattt cttgggtgcg ccagatgcct 120 gggaagggtc tcgagtggat gggcattatc gatccggatg atagctatac ccgttattct 180 ccgagctttc agggacaggt gaccattagc gcggataaaa gcattagcac cgcgtatctt 240 caatggagca gcctgaaagc gagcgatacg gccatgtatt attgcgcgcg ttatgagtat 300 ggtggttttg atatttgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctcagc gtcgaccaaa 360 ggtccaagcg tgtttccgct ggctccgagc agcaaaagca ccagcggcgg cacggctgcc 420 ctgggctgcc tggttaaaga ttatttcccg gaaccagtca ccgtgagctg gaacagcggg 480 gcgctgacca gcggcgtgca tacctttccg gcggtgctgc aaagcagcgg cctgtatagc 540 ctgagcagcg ttgtgaccgt gccgagcagc agcttaggca ctcagaccta tatttgcaac 600 gtgaaccata aaccgagcaa caccaaagtg gataaaaaag tggaaccgaa aagcn 655 <210> 225 <211> 631 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (631)..(631) <223> n can be TGCAGC or GCC <400> 225 gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60 tcgtgtagcg gcgataatat tggtaattct tatgttcatt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggcgccag ttcttgtgat ttataaggat aatgatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg cggtacttat gatattgagt cttatgtgtt tggcggcggc 300 acgaagttaa ccgttcttgg ccagccgaaa gccgcaccga gtgtgacgct gtttccgccg 360 agcagcgaag aattgcaggc gaacaaagcg accctggtgt gcctgattag cgacttttat 420 ccgggagccg tgacagtggc ctggaaggca gatagcagcc ccgtcaaggc gggagtggag 480 accaccacac cctccaaaca aagcaacaac aagtacgcgg ccagcagcta tctgagcctg 540 acgcctgagc agtggaagtc ccacagaagc tacagctgcc aggtcacgca tgaggggagc 600 accgtggaaa aaaccgttgc gccgactgag n 631 <210> 226 <211> 16 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 226 His Ile Phe Ser Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser 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gtgcatacct ttccggcggt gctgcaaagc 540 agcggcctgt atagcctgag cagcgttgtg accgtgccga gcagcagctt aggcactcag 600 acctatattt gcaacgtgaa ccataaaccg agcaacacca aagtggataa aaaagtggaa 660 ccgaaaagcn 670 <210> 248 <211> 637 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (637)..(637) <223> n can be TGCAGC or GCC <400> 248 gatatcgtgc tgacccagcc gccttcagtg agtggcgcac caggtcagcg tgtgaccatc 60 tcgtgtagcg gcagcagcag caacattggt tctaattatg tgtcttggta ccagcagttg 120 cccgggacgg cgccgaaact tctgatttat cgtaatgata agcgtccctc aggcgtgccg 180 gatcgtttta gcggatccaa aagcggcacc agcgcgagcc ttgcgattac gggcctgcaa 240 agcgaagacg aagcggatta ttattgccag tctgctgatt cttcttctat ggtgtttggc 300 ggcggcacga agttaaccgt tcttggccag ccgaaagccg caccgagtgt gacgctgttt 360 ccgccgagca gcgaagaatt gcaggcgaac aaagcgaccc tggtgtgcct gattagcgac 420 ttttatccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 480 gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 540 agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca 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aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 540 agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgag 600 gggagcaccg tggaaaaaac cgttgcgccg actgagn 637 <210> 253 <211> 117 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 253 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asp Pro Thr Asp Ser Gln Thr Ala Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Met Met Arg Gly Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 254 <211> 220 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (220)..(220) <223> X can be C, EF, or CEF <400> 254 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly 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tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60 agctgcaaag gttccggata ttcctttact tcttattata ttggttgggt gcgccagatg 120 cctgggaagg gtctcgagtg gatgggcatt attgatccta ctgattctca gactgcttat 180 tctccttctt ttcagggtca ggtgaccatt agcgcggata aaagcattag caccgcgtat 240 cttcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat acggccatgt attattgcgc gcgttatatg 300 atgcgtggtt ttgatcattg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a 351 <210> 256 <211> 658 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (658)..(658) <223> n can be TGC, GAATTC, or TGCGAATTC <400> 256 caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60 agctgcaaag gttccggata ttcctttact tcttattata ttggttgggt gcgccagatg 120 cctgggaagg gtctcgagtg gatgggcatt attgatccta ctgattctca gactgcttat 180 tctccttctt ttcagggtca ggtgaccatt agcgcggata aaagcattag caccgcgtat 240 cttcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat acggccatgt attattgcgc gcgttatatg 300 atgcgtggtt ttgatcattg gggccaaggc accctggtga cggttagctc agcgtcgacc 360 aaaggtccaa gcgtgtttcc gctggctccg agcagcaaaa gcaccagcgg cggcacggct 420 gccctgggct gcctggttaa agattatttc ccggaaccag tcaccgtgag ctggaacagc 480 ggggcgctga ccagcggcgt gcataccttt ccggcggtgc tgcaaagcag cggcctgtat 540 agcctgagca gcgttgtgac cgtgccgagc agcagcttag gcactcagac ctatatttgc 600 aacgtgaacc ataaaccgag caacaccaaa gtggataaaa aagtggaacc gaaaagcn 658 <210> 257 <211> 117 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 257 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Thr Val Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Met Met Arg Gly Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 258 <211> 220 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (220)..(220) <223> X can be C, EF, or CEF <400> 258 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Thr Val Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Met Met Arg Gly Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 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gcagcctgaa agcgagcgat acggccatgt attattgcgc gcgttatatg 300 atgcgtggtt ttgatcattg gggccaaggc accctggtga cggttagctc agcgtcgacc 360 aaaggtccaa gcgtgtttcc gctggctccg agcagcaaaa gcaccagcgg cggcacggct 420 gccctgggct gcctggttaa agattatttc ccggaaccag tcaccgtgag ctggaacagc 480 ggggcgctga ccagcggcgt gcataccttt ccggcggtgc tgcaaagcag cggcctgtat 540 agcctgagca gcgttgtgac cgtgccgagc agcagcttag gcactcagac ctatatttgc 600 aacgtgaacc ataaaccgag caacaccaaa gtggataaaa aagtggaacc gaaaagcn 658 <210> 261 <211> 107 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 261 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Leu Gly Asp Tyr Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp Thr Gly Glu Ser Gly 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly 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tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg ccaggcttgg actgattctc ctactggtct tgtgtttggc 300 ggcggcacga agttaaccgt tcttggccag ccgaaagccg caccgagtgt gacgctgttt 360 ccgccgagca gcgaagaatt gcaggcgaac aaagcgaccc tggtgtgcct gattagcgac 420 ttttatccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 480 gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 540 agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgag 600 gggagcaccg tggaaaaaac cgttgcgccg actgagn 637 <210> 273 <211> 116 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 273 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 35 40 45 Ile Ile Asp Pro Asp Asp Ser Tyr Thr Glu Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 50 55 60 Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Glu Tyr Gly Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 274 <211> 219 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (219)..(219) <223> X can be C, EF, or CEF <400> 274 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 35 40 45 Ile Ile Asp Pro Asp Asp Ser Tyr Thr Glu Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 50 55 60 Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Glu Tyr Gly Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 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tcgagtggat gggcattatt gatcctgatg attcttatac tgagtattct 180 ccttcttttc agggtcaggt caccattagc gcggataaaa gcattagcac cgcgtatctt 240 caatggagca gcctgaaagc gagcgatacg gccatgtatt attgcgcgcg ttatgagtat 300 ggtggttttg atatttgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctcagc gtcgaccaaa 360 ggtccaagcg tgtttccgct ggctccgagc agcaaaagca ccagcggcgg cacggctgcc 420 ctgggctgcc tggttaaaga ttatttcccg gaaccagtca ccgtgagctg gaacagcggg 480 gcgctgacca gcggcgtgca tacctttccg gcggtgctgc aaagcagcgg cctgtatagc 540 ctgagcagcg ttgtgaccgt gccgagcagc agcttaggca ctcagaccta tatttgcaac 600 gtgaaccata aaccgagcaa caccaaagtg gataaaaaag tggaaccgaa aagcn 655 <210> 277 <211> 116 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 277 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 35 40 45 Ile Ile Asp Pro Gln Asp Ser Tyr Thr Glu Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 50 55 60 Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp 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tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60 agctgcaaag gttccggata ttcctttact aattatattt cttgggtgcg ccagatgcct 120 gggaagggtc tcgagtggat gggcattatt gatcctcagg attcttatac tgagtattct 180 ccttcttttc agggtcaggt caccattagc gcggataaaa gcattagcac cgcgtatctt 240 caatggagca gcctgaaagc gagcgatacg gccatgtatt attgcgcgcg ttatgagtat 300 ggtggttttg atatttgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctcagc gtcgaccaaa 360 ggtccaagcg tgtttccgct ggctccgagc agcaaaagca ccagcggcgg cacggctgcc 420 ctgggctgcc tggttaaaga ttatttcccg gaaccagtca ccgtgagctg gaacagcggg 480 gcgctgacca gcggcgtgca tacctttccg gcggtgctgc aaagcagcgg cctgtatagc 540 ctgagcagcg ttgtgaccgt gccgagcagc agcttaggca ctcagaccta tatttgcaac 600 gtgaaccata aaccgagcaa caccaaagtg gataaaaaag tggaaccgaa aagcn 655 <210> 281 <211> 116 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 281 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys 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DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (634)..(634) <223> n can be TGCAGC or GCC <400> 292 gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60 tcgtgtagcg gcgataatat tggtaattct tatgttcatt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggcgccag ttcttgtgat ttataaggat aatgatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg ctctacttgg gatattgagc ctacttatgt gtttggcggc 300 ggcacgaagt taaccgttct tggccagccg aaagccgcac cgagtgtgac gctgtttccg 360 ccgagcagcg aagaattgca ggcgaacaaa gcgaccctgg tgtgcctgat tagcgacttt 420 tatccgggag ccgtgacagt ggcctggaag gcagatagca gccccgtcaa ggcgggagtg 480 gagaccacca caccctccaa acaaagcaac aacaagtacg cggccagcag ctatctgagc 540 ctgacgcctg agcagtggaa gtcccacaga agctacagct gccaggtcac gcatgagggg 600 agcaccgtgg aaaaaaccgt tgcgccgact gagn 634 <210> 293 <211> 228 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 293 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val 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<212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (103)..(103) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 294 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Xaa 100 <210> 295 <211> 326 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 295 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 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Ile Pro 355 360 365 Tyr Pro Ile Lys Val Gln Val Lys Asp Ser Leu Asp Gln Leu Val Gly 370 375 380 Gly Val Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp Val Asn Gln Glu 385 390 395 400 Thr Ser Asp Leu Asp Pro Ser Lys Ser Val Thr Arg Val Asp Asp Gly 405 410 415 Val Ala Ser Phe Val Leu Asn Leu Pro Ser Gly Val Thr Val Leu Glu 420 425 430 Phe Asn Val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Glu Glu Asn Gln Ala 435 440 445 Arg Glu Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gln Ser Tyr 450 455 460 Leu Tyr Ile Asp Trp Thr Asp Asn His Lys Ala Leu Leu Val Gly Glu 465 470 475 480 His Leu Asn Ile Ile Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile 485 490 495 Thr His Tyr Asn Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Ile His Phe 500 505 510 Gly Thr Arg Glu Lys Phe Ser Asp Ala Ser Tyr Gln Ser Ile Asn Ile 515 520 525 Pro Val Thr Gln Asn Met Val Pro Ser Ser Arg Leu Leu Val Tyr Tyr 530 535 540 Ile Val Thr Gly Glu Gln Thr Ala Glu Leu Val Ser Asp Ser Val Trp 545 550 555 560 Leu Asn Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gln Leu Gln Val His 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Lys 770 775 780 Gln Leu Gln Phe Ala Leu Pro Asp Ser Leu Thr Thr Trp Glu Ile Gln 785 790 795 800 Gly Val Gly Ile Ser Asn Thr Gly Ile Cys Val Ala Asp Thr Val Lys 805 810 815 Ala Lys Val Phe Lys Asp Val Phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr Ser 820 825 830 Val Val Arg Gly Glu Gln Ile Gln Leu Lys Gly Thr Val Tyr Asn Tyr 835 840 845 Arg Thr Ser Gly Met Gln Phe Cys Val Lys Met Ser Ala Val Glu Gly 850 855 860 Ile Cys Thr Ser Glu Ser Pro Val Ile Asp His Gln Gly Thr Lys Ser 865 870 875 880 Ser Lys Cys Val Arg Gln Lys Val Glu Gly Ser Ser Ser His Leu Val 885 890 895 Thr Phe Thr Val Leu Pro Leu Glu Ile Gly Leu His Asn Ile Asn Phe 900 905 910 Ser Leu Glu Thr Trp Phe Gly Lys Glu Ile Leu Val Lys Thr Leu Arg 915 920 925 Val Val Pro Glu Gly Val Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Val Thr Leu 930 935 940 Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro 945 950 955 960 Tyr Arg Ile Pro Leu Asp Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile 965 970 975 Leu Ser Val Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu 980 985 990 Ser Gln Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala 995 1000 1005 Glu Ala Glu Leu Met Ser Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His 1010 1015 1020 Tyr Leu Glu Thr Gly Asn His Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro 1025 1030 1035 Leu Ile Glu Lys Gln Lys Leu Lys Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met 1040 1045 1050 Leu Ser Ile Met Ser Tyr Arg Asn Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser Val 1055 1060 1065 Trp Lys Gly Gly Ser Ala Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Ala Leu 1070 1075 1080 Arg Val Leu Gly Gln Val Asn Lys Tyr Val Glu Gln Asn Gln Asn 1085 1090 1095 Ser Ile Cys Asn Ser Leu Leu Trp Leu Val Glu Asn Tyr Gln Leu 1100 1105 1110 Asp Asn Gly Ser Phe Lys Glu Asn Ser Gln Tyr Gln Pro Ile Lys 1115 1120 1125 Leu Gln Gly Thr Leu Pro Val Glu Ala Arg Glu Asn Ser Leu Tyr 1130 1135 1140 Leu Thr Ala Phe Thr Val Ile Gly Ile Arg Lys Ala Phe Asp Ile 1145 1150 1155 Cys Pro Leu Val Lys Ile Asp Thr Ala Leu Ile Lys Ala Asp Asn 1160 1165 1170 Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ala Gln Ser Thr Phe Thr Leu 1175 1180 1185 Ala Ile Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp Lys Thr His Pro 1190 1195 1200 Gln Phe Arg Ser Ile Val Ser Ala Leu Lys Arg Glu Ala Leu Val 1205 1210 1215 Lys Gly Asn Pro Pro Ile Tyr Arg Phe Trp Lys Asp Asn Leu Gln 1220 1225 1230 His Lys Asp Ser Ser Val Pro Asn Thr Gly Thr Ala Arg Met Val 1235 1240 1245 Glu Thr Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp 1250 1255 1260 Ile Asn Tyr Val Asn Pro Val Ile Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gln 1265 1270 1275 Arg Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Thr Gln Asp Thr Ile Asn Ala 1280 1285 1290 Ile Glu Gly Leu Thr Glu Tyr Ser Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg 1295 1300 1305 Leu Ser Met Asp Ile Asp Val Ser Tyr Lys His Lys Gly Ala Leu 1310 1315 1320 His Asn Tyr Lys Met Thr Asp Lys Asn Phe Leu Gly Arg Pro Val 1325 1330 1335 Glu Val Leu Leu Asn Asp Asp Leu Ile Val Ser Thr Gly Phe Gly 1340 1345 1350 Ser Gly Leu Ala Thr Val His Val Thr Thr Val Val His Lys Thr 1355 1360 1365 Ser Thr Ser Glu Glu Val Cys Ser Phe Tyr Leu Lys Ile Asp Thr 1370 1375 1380 Gln Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr Arg Gly Tyr Gly Asn Ser Asp 1385 1390 1395 Tyr Lys Arg Ile Val Ala Cys Ala Ser Tyr Lys Pro Ser Arg Glu 1400 1405 1410 Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ser His Ala Val Met Asp Ile Ser Leu 1415 1420 1425 Pro Thr Gly Ile Ser Ala Asn Glu Glu Asp Leu Lys Ala Leu Val 1430 1435 1440 Glu Gly Val Asp Gln Leu Phe Thr Asp Tyr Gln Ile Lys Asp Gly 1445 1450 1455 His Val Ile Leu Gln Leu Asn Ser Ile Pro Ser Ser Asp Phe Leu 1460 1465 1470 Cys Val Arg Phe Arg Ile Phe Glu Leu Phe Glu Val Gly Phe Leu 1475 1480 1485 Ser Pro Ala Thr Phe Thr Val Tyr Glu Tyr His Arg Pro Asp Lys 1490 1495 1500 Gln Cys Thr Met Phe Tyr Ser Thr Ser Asn Ile Lys Ile Gln Lys 1505 1510 1515 Val Cys Glu Gly Ala Ala Cys Lys Cys Val Glu Ala Asp Cys Gly 1520 1525 1530 Gln Met Gln Glu Glu Leu Asp Leu Thr Ile Ser Ala Glu Thr Arg 1535 1540 1545 Lys Gln Thr Ala Cys Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Ala Tyr Lys Val 1550 1555 1560 Ser Ile Thr Ser Ile Thr Val Glu Asn Val Phe Val Lys Tyr Lys 1565 1570 1575 Ala Thr Leu Leu Asp Ile Tyr Lys Thr Gly Glu Ala Val Ala Glu 1580 1585 1590 Lys Asp Ser Glu Ile Thr Phe Ile Lys Lys Val Thr Cys Thr Asn 1595 1600 1605 Ala Glu Leu Val Lys Gly Arg Gln Tyr Leu Ile Met Gly Lys Glu 1610 1615 1620 Ala Leu Gln Ile Lys Tyr Asn Phe Ser Phe Arg Tyr Ile Tyr Pro 1625 1630 1635 Leu Asp Ser Leu Thr Trp Ile Glu Tyr Trp Pro Arg Asp Thr Thr 1640 1645 1650 Cys Ser Ser Cys Gln Ala Phe Leu Ala Asn Leu Asp Glu Phe Ala 1655 1660 1665 Glu Asp Ile Phe Leu Asn Gly Cys 1670 1675 <210> 297 <211> 1676 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 297 Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cys Phe Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr 1 5 10 15 Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg 20 25 30 Val Gly Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu 35 40 45 Ala Phe Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe 50 55 60 Ser Tyr Ser Ser Gly His Val His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gln 65 70 75 80 Asn Ser Ala Val Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln 85 90 95 Asn Gln Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser 100 105 110 Lys Ser Lys Lys Ile Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile 115 120 125 His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Val Arg 130 135 140 Val Tyr Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val 145 150 155 160 Leu Thr Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Ile Asp Met Val Glu Glu 165 170 175 Ile Asp His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser 180 185 190 Asn Pro Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Gln Ala Lys Tyr Lys Glu Asp 195 200 205 Phe Ser Thr Thr Gly Thr Ala Phe Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu 210 215 220 Pro His Phe Ser Val Ser Val Glu Pro Glu Ser Asn Phe Ile Gly Tyr 225 230 235 240 Lys Asn Phe Lys Asn Phe Glu Ile Thr Ile Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr 245 250 255 Asn Lys Val Val Thr Glu Ala Asp Val Tyr Ile Thr Phe Gly Ile Arg 260 265 270 Glu Asp Leu Lys Asp Asp Gln Lys Glu Met Met Gln Thr Ala Met Gln 275 280 285 Asn Thr Met Leu Ile Asn Gly Ile Ala Gln Val Thr Phe Asp Ser Glu 290 295 300 Thr Ala Val Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn 305 310 315 320 Lys Tyr Leu Tyr Ile Ala Val Thr Val Ile Glu Ser Thr Gly Gly Phe 325 330 335 Ser Glu Glu Ala Glu Ile Pro Gly Ile Lys Tyr Val Leu Ser Pro Tyr 340 345 350 Lys Leu Asn Leu Val Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Pro 355 360 365 Tyr Ser Ile Lys Val Gln Val Lys Asp Ala Leu Asp Gln Leu Val Gly 370 375 380 Gly Val Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp Val Asn Gln Glu 385 390 395 400 Thr Ser Asp Leu Glu Pro Arg Lys Ser Val Thr Arg Val Asp Asp Gly 405 410 415 Val Ala Ser Phe Val Val Asn Leu Pro Ser Gly Val Thr Val Leu Glu 420 425 430 Phe Asn Val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Asp Glu Asn Gln Ala 435 440 445 Arg Glu Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gln Ser Tyr 450 455 460 Leu Tyr Ile Asp Trp Thr Asp Asn His Lys Ala Leu Leu Val Gly Glu 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Ile Ile Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile 485 490 495 Thr His Tyr Asn Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Ile His Phe 500 505 510 Gly Thr Arg Glu Lys Leu Ser Asp Ala Ser Tyr Gln Ser Ile Asn Ile 515 520 525 Pro Val Thr Gln Asn Met Val Pro Ser Ser Arg Leu Leu Val Tyr Tyr 530 535 540 Ile Val Thr Gly Glu Gln Thr Ala Glu Leu Val Ser Asp Ser Val Trp 545 550 555 560 Leu Asn Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gln Leu Gln Val His Leu Ser 565 570 575 Pro Asp Ala Asp Thr Tyr Ser Pro Gly Gln Thr Val Ser Leu Asn Met 580 585 590 Val Thr Gly Met Asp Ser Trp Val Ala Leu Thr Ala Val Asp Ser Ala 595 600 605 Val Tyr Gly Val Gln Arg Arg Ala Lys Lys Pro Leu Glu Arg Val Phe 610 615 620 Gln Phe Leu Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Leu 625 630 635 640 Asn Asn Ala Asn Val Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu Thr Asn 645 650 655 Ala Asn Ala Asp Asp Ser Gln Glu Asn Asp Glu Pro Cys Lys Glu Ile 660 665 670 Ile Arg Pro Arg Arg Met Leu Gln Glu Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala 675 680 685 Lys Tyr Lys His Leu Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Val Arg 690 695 700 Ile Asn His Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Val 705 710 715 720 Gly Pro Arg Cys Val Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala 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930 935 940 Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro 945 950 955 960 Tyr Arg Ile Pro Leu Asp Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile 965 970 975 Leu Ser Val Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu 980 985 990 Ser Arg Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala 995 1000 1005 Glu Ala Glu Leu Met Ser Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His 1010 1015 1020 Tyr Leu Glu Thr Gly Asn His Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro 1025 1030 1035 Leu Ile Glu Lys Arg Asn Leu Glu Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met 1040 1045 1050 Val Ser Ile Met Ser Tyr Arg Asn Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser Val 1055 1060 1065 Trp Lys Gly Gly Ser Ala Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Ala Leu 1070 1075 1080 Arg Val Leu Gly Gln Val His Lys Tyr Val Glu Gln Asn Gln Asn 1085 1090 1095 Ser Ile Cys Asn Ser Leu Leu Trp Leu Val Glu Asn Tyr Gln Leu 1100 1105 1110 Asp Asn Gly Ser Phe Lys Glu Asn Ser Gln Tyr Gln Pro Ile Lys 1115 1120 1125 Leu Gln Gly Thr Leu Pro Val Glu Ala Arg Glu Asn Ser Leu Tyr 1130 1135 1140 Leu Thr Ala Phe Thr Val Ile Gly Ile Arg Lys Ala Phe Asp Ile 1145 1150 1155 Cys Pro Leu Val Lys Ile Asn Thr Ala Leu Ile Lys Ala Asp Thr 1160 1165 1170 Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ala Gln Ser Thr Phe Thr Leu 1175 1180 1185 Ala Ile Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp Lys Thr His Pro 1190 1195 1200 Gln Phe Arg Ser Ile Val Ser Ala Leu Lys Arg Glu Ala Leu Val 1205 1210 1215 Lys Gly Asn Pro Pro Ile Tyr Arg Phe Trp Lys Asp Ser Leu Gln 1220 1225 1230 His Lys Asp Ser Ser Val Pro Asn Thr Gly Thr Ala Arg Met Val 1235 1240 1245 Glu Thr Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp 1250 1255 1260 Ile Asn Tyr Val Asn Pro Ile Ile Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gln 1265 1270 1275 Arg Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Thr Gln Asp Thr Ile Asn Ala 1280 1285 1290 Ile Glu Gly Leu Thr Glu Tyr Ser Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg 1295 1300 1305 Leu Asn Met Asp Ile Asp Val Ala Tyr Lys His Lys Gly Pro Leu 1310 1315 1320 His Asn Tyr Lys Met Thr Asp Lys Asn Phe Leu Gly Arg Pro Val 1325 1330 1335 Glu Val Leu Leu Asn Asp Asp Leu Val Val Ser Thr Gly Phe Gly 1340 1345 1350 Ser Gly Leu Ala Thr Val His Val Thr Thr Val Val His Lys Thr 1355 1360 1365 Ser Thr Ser Glu Glu Val Cys Ser Phe Tyr Leu Lys Ile Asp Thr 1370 1375 1380 Gln Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr Arg Gly Tyr Gly Asn Ser Asp 1385 1390 1395 Tyr Lys Arg Ile Val Ala Cys Ala Ser Tyr Lys Pro Ser Lys Glu 1400 1405 1410 Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ser His Ala Val Met Asp Ile Ser Leu 1415 1420 1425 Pro Thr Gly Ile Asn Ala Asn Glu Glu Asp Leu Lys Ala Leu Val 1430 1435 1440 Glu Gly Val Asp Gln Leu Phe Thr Asp Tyr Gln Ile Lys Asp Gly 1445 1450 1455 His Val Ile Leu Gln Leu Asn Ser Ile Pro Ser Ser Asp Phe Leu 1460 1465 1470 Cys Val Arg Phe Arg Ile Phe Glu Leu Phe Glu Val Gly Phe Leu 1475 1480 1485 Ser Pro Ala Thr Phe Thr Val Tyr Glu Tyr His Arg Pro Asp Lys 1490 1495 1500 Gln Cys Thr Met Phe Tyr Ser Thr Ser Asn Ile Lys Ile Gln Lys 1505 1510 1515 Val Cys Glu Gly Ala Thr Cys Lys Cys Ile Glu Ala Asp Cys Gly 1520 1525 1530 Gln Met Gln Lys Glu Leu Asp Leu Thr Ile Ser Ala Glu 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Claims (39)

1. (i) 서열 1의 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 2의 서열을 갖는 중쇄 CDR2 및 서열 3의 서열을 갖는 중쇄 CDR3; 및
   (ii) 서열 4의 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 5의 서열을 갖는 경쇄 CDR2 및 서열 6의 서열을 갖는 경쇄 CDR3
   을 포함하는, 10^-10 M 이하의 K_D로 인간 C5 단백질에 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
2. 제1항에 있어서, 6개의 CDR 영역을 보존하면서, 서열 7 또는 187의 아미노산 서열에 80％, 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 8 또는 188의 아미노산 서열에 80％, 90％, 95％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 7 또는 187의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 8 또는 188의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 6개의 CDR 영역을 보존하면서, 서열 9 또는 189의 아미노산 서열에 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄; 및 서열 10 또는 190의 아미노산 서열에 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
5. 제4항에 있어서, 서열 9 또는 189의 아미노산 서열을 갖는 중쇄; 및 서열 10 또는 190의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 100 pM의 인간 C5로 재구성된 인간 C5-결핍된 혈청을 사용한 시험관내 용혈성 검정으로 측정할 때 대체적 보체 경로를 20 내지 200 pM의 IC₅₀으로 억제하는 항체.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, IgG 이소형인 항체.
9. 제1항 또는 제2항에서 청구된 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 연령 관련 황반 변성을 치료하기 위한 제약 조성물.
10. 제1항 또는 제2항에서 청구된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
11. 제10항에 있어서, 6개의 CDR 영역을 보존하면서, 서열 7에 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 8에 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
12. 제11항에 있어서, 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열 11의 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열 12의 서열을 갖는 것인 핵산.
13. 제10항에서 청구된 핵산을 포함하는 벡터.
14. 제1항 또는 제2항에서 청구된 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 재조합 DNA 절편을 포함하고, 여기서 상기 DNA 절편들은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있으며, 상기 DNA 절편들이 발현될 수 있는 것인 단리된 숙주 세포.
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