JPWO2019122388A5

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Publication number: JPWO2019122388A5
Application number: JP2020535113A
Authority: JP
Publication date: 2022-08-22

Claims

癌を治療するのに適切な作用物質を同定するための方法であって、以下を含む方法：
チューモロイド共培養物を1つまたは複数の候補作用物質と接触させる工程であって、該チューモロイド共培養物が免疫細胞および少なくとも1つのチューモロイドを含む、工程、
癌の治療についての候補作用物質の適合性を示す、該チューモロイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程、ならびに
該チューモロイド共培養物において1つまたは複数の該変化の有無が検出される場合に、候補作用物質を癌の治療に適切であると同定する工程。
(a)
チューモロイド培養培地において腫瘍上皮細胞を培養することにより、少なくとも1つのチューモロイドを調製する工程；
不純な免疫試料から免疫細胞を得て、インターロイキンを含む免疫細胞増殖培地において免疫細胞を培養することにより、免疫細胞を調製する工程；および
インビトロ培養において、少なくとも1つのチューモロイドを免疫細胞と混合することにより、チューモロイド共培養物を調製する工程
が前記方法に先行する、
(b)免疫細胞が、少なくとも1つのチューモロイドが由来する患者と抗原的に適合している、
(c)免疫細胞が共培養物に組み込まれている、
(d)チューモロイドがLgr5発現によって特徴づけられる、
(e)チューモロイドが、Wntアゴニストを含むチューモロイド培養培地中で腫瘍上皮細胞を培養することにより調製される、
(f)癌の治療についての適合性が、癌の治療についての有効性および／または癌の治療についての安全性を含む、
(g)1つまたは複数の変化が、1つまたは複数の癌バイオマーカーの変化である、
(h)1つまたは複数の変化が、細胞生存率の低減、細胞増殖の低減、細胞死の増加、細胞またはオルガノイドの大きさの変化、細胞運動性の変化、共培養された免疫細胞によるサイトカインおよび細胞傷害性分子の生産の変化、無傷／緻密な上皮細胞層の解離または破壊、ならびに1つまたは複数の遺伝子の発現の変化から選択される、
(i)検出が、細胞増殖アッセイ、生存率アッセイ、フローサイトメトリー解析、IFN-γについてのELISA、遺伝子発現の解析、および／または細胞イメージングを含む、
(j)1つまたは複数の変化が、細胞生存率、活性型カスパーゼ3の細胞内フローサイトメトリー染色（BD）、または死細胞の陽性染色における低減である、
(k)1つまたは複数の変化が、例えば明視野イメージングによって検出されるような細胞死の増加である、
(l)共培養物が、少なくとも5％、少なくとも6％、少なくとも7％、少なくとも8％、少なくとも9％、または少なくとも10％のコラーゲンを含み、好ましくは共培養物が約10％（v/v）のコラーゲンを含む、ならびに／あるいは
(m)少なくとも1つのチューモロイドからチューモロイド培養培地を除去することにより、チューモロイド共培養物を調製する工程が、前記方法に先行する、
請求項1記載の方法。
方法が、
チューモロイド共培養物の1つまたは複数の変化の有無を参照オルガノイドまたは参照チューモロイドと比較することを含み、かつ
参照オルガノイド共培養物または参照チューモロイド共培養物を1つまたは複数の候補作用物質と接触させる工程であって、該参照オルガノイド共培養物または参照チューモロイド共培養物が免疫細胞および少なくとも1つのオルガノイドもしくはチューモロイドを含む、工程、ならびに
癌の治療についての候補作用物質の適合性を示す、参照オルガノイド共培養物または参照チューモロイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程
をさらに含み、
任意で、
(a)変化の有無が、チューモロイド共培養物で検出されるが参照オルガノイド共培養物または参照チューモロイド共培養物では検出されない場合、候補作用物質が適切な作用物質として同定される、
(b)以下の工程の1つまたは複数が前記方法に先行する:
オルガノイド培養培地において正常上皮細胞を培養することにより、少なくとも1つのオルガノイドを調製する工程；
不純な免疫試料から免疫細胞を分離し、免疫細胞増殖培地において免疫細胞を培養することにより、免疫細胞を調製する工程；および／または
好ましくは、少なくとも1つのチューモロイドまたは少なくとも1つのオルガノイドからチューモロイド培養培地オルガノイド培養培地を除去し、引き続いて、オルガノイド共培養培地またはチューモロイド共培養培地において少なくとも1つの参照オルガノイドまたは少なくとも1つの参照チューモロイドを免疫細胞と混合することにより、参照オルガノイド共培養物または参照チューモロイド共培養物を調製する工程、
任意で、該不純な免疫試料は腫瘍試料、正常結腸組織、および／または末梢血である、
(c)正常上皮細胞が腫瘍上皮細胞と共に自家性である、
(d)参照オルガノイド共培養物または参照チューモロイド共培養物が対照として使用され、好ましくはそれが陰性対照として使用される、
(e)（I）チューモロイド共培養培地および／または（II）参照オルガノイド共培養培地または参照チューモロイド共培養培地が、
好ましくはコラーゲンまたは任意の動物由来もしくは合成基底膜マトリックスから選択される、細胞外マトリックス
を含み、任意で、コラーゲンがラット尾コラーゲンIである、
(f)（I）チューモロイド共培養培地および／または（II）参照オルガノイド共培養培地または参照チューモロイド共培養培地が、2％～10％のMatrigel（登録商標）濃度について、0.15 mg/（ml Matrigel（登録商標））～0.95 mg/（ml Matrigel（登録商標））のタンパク質濃度を有する、ならびに／あるいは
(g)チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物もしくは参照チューモロイド共培養物の両方が特定の患者に由来する、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記請求項のいずれか一項記載のチューモロイド共培養培地および／またはオルガノイド共培養培地。
(a)チューモロイド共培養物および／または参照オルガノイド共培養物および／または参照チューモロイド共培養物の免疫細胞が、少なくとも40 μm/日、60 μm/日、80 μm/日、100 μm/日、120 μm/日、または140 μm/日の運動性を有する、
(b)チューモロイド共培養物および／または参照オルガノイド共培養物および／または参照チューモロイド共培養物中の免疫細胞の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、または少なくとも50％が、80時間で少なくとも200 μm、少なくとも250 μm、少なくとも300 μm、少なくとも350 μm、または少なくとも400 μmの距離を移動できる、
(c)免疫細胞が、少なくとも4時間、8時間、12時間、24時間、48時間、または72時間活性なままである、ならびに／あるいは
(d)1つまたは複数の候補作用物質が、癌の治療について既知の適合性を有し、前記方法が、特定の患者において該1つまたは複数の候補作用物質を癌の治療について適切な作用物質として同定することをさらに含む、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。
特定の患者において癌の治療について適切であると同定された候補作用物質で患者を治療することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
1つまたは複数の候補作用物質が、
(a)次の治療薬クラスの1つまたは複数から選択される：免疫治療薬、腫瘍特異的ペプチド、チェックポイント阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、代謝アゴニスト、代謝アンタゴニスト、植物アルカロイド、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、放射線治療薬、化学治療薬、抗体、光増感剤、移植幹細胞、ワクチン、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、チロシンキナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、挿入剤、標的療法剤、低分子薬物、ホルモン、ステロイド、細胞治療薬、ウイルスベクター、および核酸治療薬、
(b)次の治療薬クラスの1つまたは複数から選択される：腫瘍特異的ペプチド、チェックポイント阻害剤、キメラ抗原受容体（CAR）-T細胞治療薬、治療的TCRトランスジェニックT細胞、および新生抗原、
(c)免疫治療薬であり、任意で、免疫治療薬が、キメラ抗原受容体（CAR）-T細胞治療薬、治療的TCRトランスジェニックT細胞、または新生抗原である、
(d)癌の治療について未知の適合性を有し、前記方法が、該1つまたは複数の候補作用物質のサブセットを癌の治療について適切な作用物質として同定することをさらに含む、ならびに／あるいは
(e)第1の癌の治療について既知の適合性を有し、かつ第2の癌の治療について未知の適合性を有し、前記方法が、該1つまたは複数の候補作用物質のサブセットを第2の癌の治療について適切な作用物質として同定することをさらに含む、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。
癌が
(a)上皮癌である、
(b)胃腸癌である
(c)結腸直腸癌である、および／あるいは
(d)ステージII、グレードII、またはT2 N1 M0の1つまたはそれより下の癌を含む、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。
(a)腫瘍上皮細胞および／または正常上皮細胞が、癌患者からの試料から得られ、任意で、試料が組織生検である、
(b)腫瘍上皮細胞および正常上皮細胞が同一の癌患者から、任意で(I)同一の試料から得られる、および／または(II) 試料が組織生検であり、
任意で、組織生検が、結腸直腸癌患者の切除された結腸および／もしくは直腸から、結腸直腸癌もしくは卵巣癌患者の腹水から、ならびに／または腎臓癌患者の尿から採取される、
(c)腫瘍上皮細胞および／または正常上皮細胞が、肺細胞、肝細胞、乳房細胞、皮膚細胞、腸細胞、陰窩細胞、直腸細胞、膵臓細胞、内分泌細胞、外分泌細胞、管細胞、腎細胞、副腎細胞、甲状腺細胞、下垂体細胞、副甲状腺細胞、前立腺細胞、胃細胞、食道細胞、卵巣細胞、卵管細胞、または膣細胞からなる群より選択される、
(d)腫瘍上皮細胞および／または正常上皮細胞が、腸細胞、例えば結腸直腸細胞である、
(e)腫瘍上皮細胞および／または正常上皮細胞が上皮幹細胞であり、好ましくはLgr5発現によって特徴づけられる、
(f)免疫細胞が、上皮内リンパ球（IEL）、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、末梢血単核細胞（PBMC）、末梢血リンパ球（PBL）、T細胞、および細胞傷害性Tリンパ球（CTL）、αβT細胞、γδT細胞、B細胞、NK細胞、および単核食細胞からなる群より選択される1つまたは複数の細胞型を含む、
(g)免疫細胞が、癌患者からの試料から得られる、
(h)免疫細胞が、末梢血試料および／または組織生検から得られ、
任意で、
(I)末梢血リンパ球（PBL）および／もしくはT細胞が末梢血試料から得られる、かつ／または
(II)腫瘍浸潤リンパ球（TIL）および／もしくは上皮内リンパ球（IEL）が、それぞれ腫瘍もしくは正常組織生検から得られる、
(i)免疫細胞が、腫瘍上皮細胞および／または正常上皮細胞と同一の患者から得られる、
(j)免疫細胞がチューモロイドおよび／またはオルガノイドと同種異系であり、任意で免疫細胞ならびにチューモロイドおよび／またはオルガノイドが、異なる患者または健常対照の末梢血または組織生検のいずれかに由来する、
(k)免疫細胞が、チューモロイドおよび／またはオルガノイドとHLA適合している、ならびに／または
(l)免疫細胞が、免疫細胞増殖培地中で少なくとも4時間、8時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、144時間、168時間、192時間、216時間、および240時間持続する、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。
(a)少なくとも1つのチューモロイドおよび／または少なくとも1つのオルガノイドが自家細胞を含むか、またはそれからなる、
(b)少なくとも1つのチューモロイドおよび／または少なくとも1つのオルガノイドが、免疫細胞と混合する前に、1つまたは複数の遺伝子型、表現型、および／またはエピジェネティックマーカーを共有する集団へ分けられる、
(c)遺伝子型、表現型、および／またはエピジェネティックマーカーが、（i）少なくとも1つのチューモロイドおよび／または少なくとも1つのオルガノイドと（ii）免疫細胞との間の相互作用に寄与する、
(d)集団がHLAハプロタイプの有無を共有し、任意でHLAハプロタイプがHLA-A2である、
(e)少なくとも1つのチューモロイドまたは少なくとも1つのオルガノイドが哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞を含むか、またはそれからなる、
(f)少なくとも1つのチューモロイド共培養物または少なくとも1つのオルガノイド共培養物が、免疫細胞増殖培地中または免疫細胞増殖培地およびオルガノイド培養培地もしくはチューモロイド培養培地（それぞれ）の50：50（v/v）の混合物中で培養される、ならびに／あるいは
(g)チューモロイド共培養物がチューモロイド共培養培地中で、または参照オルガノイド共培養物もしくは参照チューモロイド共培養物がオルガノイド共培養培地中で、少なくとも4時間、8時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、144時間、168時間、192時間、216時間、および240時間持続する、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。
チューモロイドまたはオルガノイドがインターロイキンを含む培地中にあり、任意でインターロイキンがIL-2、IL-7、およびIL-15からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項に記載されるようなチューモロイドまたはオルガノイド。
前記請求項のいずれか一項記載の方法に従って調製されたチューモロイドまたはオルガノイドの集団。
前記請求項のいずれか一項に記載されるようなチューモロイド共培養物および／または参照オルガノイド共培養物。
(a)オルガノイド培養培地が、基本培地（Advanced DMEM/F12培地、Gibcoなど）、Wntリガンド（Wnt-3aなど）、Wntアゴニスト（Rスポンジン 1～4のいずれか1つなど）、BMP阻害剤（ノギンなど）、EGF、およびTGF-β阻害剤（A83-01、Tocrisなど）の1つまたは複数（または好ましくはすべて）を含み、任意でp38 MAPK阻害剤、ガストリン、ニコチンアミド、プロスタグランジンE、N-アセチルシステイン、B27、および／または抗菌剤（プリモシンなど）の1つまたは複数（またはすべて）をさらに含む、
(b)チューモロイド培養培地が、基本培地（Advanced DMEM/F12培地、Gibcoなど）、Wntアゴニスト（Rスポンジン 1～4のいずれか1つなど）、BMP阻害剤（ノギンなど）、EGF、およびTGF-β阻害剤（A83-01、Tocrisなど）の1つまたは複数（または好ましくはすべて）を含み、任意でp38 MAPK阻害剤、ガストリン、ニコチンアミド、プロスタグランジンE、N-アセチルシステイン、B27、および／または抗菌剤（プリモシンなど）の1つまたは複数（またはすべて）をさらに含み、任意でチューモロイド培養培地がWntリガンド（Wnt-3aなど）をさらに含む、
(c)免疫細胞増殖培地がIL-2を、任意で2000～6000 IU/mLの濃度で含み、任意でIL-7および／またはIL-15をさらに含む、
(d)免疫細胞増殖培地がRPMI培地（例えば、RPMI 1640、Gibco）をさらに含み、任意でペニシリン／ストレプトマイシンおよび／または血清（例えば、5％ヒトAB血清、Sigma-Aldrich）が補充されている、ならびに／あるいは
(e)チューモロイド共培養培地および／またはオルガノイド共培養培地がIL-2を、任意で100～200 IU/mLの濃度で含む、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。
上皮癌の治療に使用する場合の有効性および／または安全性について、CAR-T免疫療法、TCRトランスジェニックT細胞、新生抗原、またはチェックポイント阻害剤を試験する方法であって、
チューモロイド培養培地中で腫瘍上皮細胞を増殖させてチューモロイドを形成させ、インターロイキンを含むチューモロイド共培養培地中で免疫細胞とともに該チューモロイドを培養してチューモロイド共培養物を形成させる工程、
オルガノイド培養培地中で正常上皮細胞を増殖させてオルガノイドを形成させ、インターロイキンを含むオルガノイド共培養培地中で免疫細胞とともに該オルガノイドを培養して参照オルガノイド共培養物を形成させる工程、
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物をCAR-T免疫療法、TCRトランスジェニックT細胞、新生抗原、またはチェックポイント阻害剤と接触させる工程、
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程であって、1つまたは複数の変化の有無がCAR-T免疫療法、TCRトランスジェニックT細胞、新生抗原、またはチェックポイント阻害剤の有効性および／または安全性を示す、工程、ならびに
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物を比較する工程
を含み、
任意で、同一の患者から腫瘍上皮細胞、正常上皮細胞、および免疫細胞を提供する工程をさらに含む、
方法。
上皮癌の治療に使用する場合の有効性および／または安全性について候補化合物を試験する方法であって、
チューモロイド培養培地中で腫瘍上皮細胞を増殖させてチューモロイドを形成させ、インターロイキンを含むチューモロイド共培養培地中で免疫細胞とともに該チューモロイドを培養してチューモロイド共培養物を形成させる工程、
オルガノイド培養培地中で正常上皮細胞を増殖させてオルガノイドを形成させ、インターロイキンを含むオルガノイド共培養培地中で免疫細胞とともに該オルガノイドを培養して参照オルガノイド共培養物を形成させる工程、
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物を候補化合物と接触させる工程、
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程であって、1つまたは複数の変化の有無が候補化合物の有効性および／または安全性を示す、工程、ならびに
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物を比較する工程
を含み、
任意で、同一の患者から腫瘍上皮細胞、正常上皮細胞、および免疫細胞を提供する工程をさらに含む、
方法。
オルガノイド-免疫細胞共培養物を調製するための方法であって、以下を含む方法：
任意で、オルガノイド培養培地中で細胞外マトリックスと接触させて上皮細胞を培養し、オルガノイドを得る工程；
オルガノイドから細胞外マトリックスおよびオルガノイド培養培地を除去する工程；
インターロイキンを補充した免疫細胞培養培地中にオルガノイドを再懸濁する工程；
免疫細胞、インターロイキンを補充した免疫細胞培養培地、および免疫細胞懸濁液中の濃度が少なくとも5～10％であるコラーゲンを含む免疫細胞懸濁液を調製する工程；ならびに
免疫細胞を含む免疫細胞懸濁液を、再懸濁したオルガノイドと混合する工程。
チューモロイド-免疫細胞共培養物を調製するための方法であって、以下を含む方法：
任意で、チューモロイド培養培地中で細胞外マトリックスと接触させて腫瘍上皮細胞を培養し、チューモロイドを得る工程；
チューモロイドから細胞外マトリックスおよびチューモロイド培養培地を除去する工程；
インターロイキンを補充した免疫細胞培養培地中にチューモロイドを再懸濁する工程；
免疫細胞、インターロイキンを補充した免疫細胞培養培地、および免疫細胞懸濁液中の濃度が少なくとも5～10％であるコラーゲンを含む免疫細胞懸濁液を調製する工程；ならびに
免疫細胞を含む免疫細胞懸濁液を、再懸濁したチューモロイドと混合する工程。
(a)コラーゲンがラット尾コラーゲンである、
(b)免疫細胞培地がRPMI1640（Gibco）である、
(c)免疫細胞がT細胞である、
(d)上皮細胞および免疫細胞が同一の対象から、任意で同一の試料から得られる、ならびに／または
(e)上皮細胞および免疫細胞がヒト細胞である、
請求項17または18記載の方法。
前記請求項のいずれか一項記載の方法により得られるオルガノイド-免疫細胞共培養物またはチューモロイド-免疫細胞共培養物。
治療剤を試験するための方法であって、以下を含む方法：
オルガノイド共培養物を1つまたは複数の候補作用物質と接触させる工程であって、オルガノイド共培養物が免疫細胞および少なくとも1つのオルガノイドを含む、工程、
治療有効性を示す、オルガノイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程、ならびに
オルガノイド共培養物において1つまたは複数の該変化の有無が検出される場合に、候補作用物質を治療剤と同定する工程。
治療剤が免疫疾患の治療に適切であって、任意で免疫疾患が肺および／または腸の組織に影響を与え、例えば免疫疾患が過敏性腸疾患（IBD）、潰瘍性大腸炎（UC）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、および喘息からなる群より選択される、請求項21記載の方法。
前記請求項のいずれか一項に記載されるようなチューモロイド共培養物または参照オルガノイド共培養物。
(a)
チューモロイド培養培地において腫瘍上皮細胞を培養することにより、少なくとも1つのチューモロイドを調製する工程；
不純な免疫試料から免疫細胞を得て、インターロイキンを含む免疫細胞増殖培地において免疫細胞を培養することにより、免疫細胞を調製する工程；および／または
インビトロ培養において、少なくとも1つのチューモロイドを免疫細胞と混合することにより、チューモロイド共培養物を調製する工程
が前記方法に先行する、
(b)免疫細胞が、少なくとも1つのチューモロイドが由来する患者と抗原的に適合している、
(c)チューモロイドおよび／またはオルガノイドがLgr5発現によって特徴づけられる、
(d)免疫細胞が共培養物に組み込まれている、
(e)チューモロイドが、Wntアゴニストを含むチューモロイド培養培地中で腫瘍上皮細胞を培養することにより調製される、ならびに／あるいは
(f)オルガノイドが、Wntアゴニストを含むオルガノイド培養培地中で正常上皮細胞を培養することにより調製される、
前記請求項のいずれか一項記載の方法、チューモロイド共培養培地、オルガノイド共培養培地、オルガノイド-免疫細胞共培養物、および／またはチューモロイド-免疫細胞共培養物。
本明細書に実質的に記載されている、方法、チューモロイド共培養培地、オルガノイド共培養培地、オルガノイド-免疫細胞共培養物、および／またはチューモロイド-免疫細胞共培養物。
疾患、障害、および／もしくは病状を診断する、治療する、予防する、または疾患、障害、および／もしくは病状に対する療法の有効性および／もしくは安全性を評価する方法に使用するための、前記請求項のいずれか一項記載のチューモロイド共培養培地、オルガノイド共培養培地、オルガノイド-免疫細胞共培養物、および／またはチューモロイド-免疫細胞共培養物。