JP2018511338A - がん細胞濃縮システム - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年4月17日に出願された米国仮出願第62/149,268号の利益を主張するものであり、この文献は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
細胞濃縮システムは、異なる細胞集団を濃縮して分離するために用いることができる。この細胞としては、例えばがん細胞、循環腫瘍細胞、幹細胞または免疫細胞が挙げられる。細胞濃縮システムを通じて誘起される異なる細胞タイプの分離および特性評価は、腫瘍の病因、転移の生物学、幹細胞分化、免疫細胞の増殖を理解するために、および腫瘍進行のバイオマーカーを提供するために用いることができる。
本出願において引用される各特許、刊行物および非特許文献は、各々が参照により個別に組み込まれたかのように、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
本発明の方法は、生物学的試料からCTCおよび他の標的細胞亜集団を分離するために用いることができる。本発明の方法は、例えば細胞集団を分離するために、細胞集団を選択的に分けるために、細胞を分化または未分化状態で維持するために、細胞を強制的に分化させるために、細胞集団を濃縮するために、(増殖または選択的濃縮を通じて)細胞集団を拡大するために、細胞集団の機能を調節するために、細胞集団の形態を調節するために、エピジェネティック特性を調節するために、ならびに遺伝子およびタンパク質の発現プロファイルを調節するために用いることができる。本発明の方法は、例えば初代細胞、細胞株または微生物群集において用いることができる。
本発明はさらに、細胞培養インキュベーターを提供する。細胞培養インキュベーターは、閉鎖環境チャンバーを含むことができる。細胞培養インキュベーターは、閉鎖環境チャンバーのガス組成、閉鎖環境チャンバーの気圧、閉鎖環境チャンバーの湿度、二酸化炭素レベル、酸素レベルおよび内部環境温度を維持するように設定することができる。細胞培養インキュベーターはコントロールユニットを含みことができ、このコントロールユニットはガス組成、気圧、湿度、二酸化炭素レベル、酸素レベルまたは内部環境温度のうちの少なくとも1つを維持するように設定することができる。コントロールユニットは、閉鎖環境チャンバーと動作可能に連結することができる。コントロールユニットは、ガス組成、気圧、湿度、二酸化炭素レベル、酸素レベルおよび内部環境温度のうちの少なくとも2つを維持するように設定することができる。コントロールユニットは、ガス組成、気圧、湿度、二酸化炭素レベル、酸素レベルおよび内部環境温度を維持するように設定することができる。細胞培養インキュベーターのコントロールユニットは、ユーザがコントロールすることができ、または細胞培養インキュベーター中のセンサに基づいて自動化することができる。コントロールユニットは、時間の関数としての動的なガス組成、気圧、湿度、二酸化炭素レベル、酸素レベルおよび内部環境温度を生み出すように設定することができる。コントロールユニットは、時間の関数としてのいくつかの異なるガス組成、気圧、湿度レベル、二酸化炭素レベル、酸素レベルおよび内部環境温度の間を循環するように設定することができ、これは確率論的または周期的であることができる。
対象は、例えば、高齢者、成人、思春期の若年者、思春期前の若年者、子供(child)、幼児(toddler)、小児(infant)であることができる。対象は非ヒト動物であることができ、例えば、対象はマウス、ラット、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコまたはヤギであることができる。対象は、患者であることができる。
本発明の方法は、例えば回収された標的細胞亜集団をシーケンシングする、イメージングするまたは特性評価するために用いることができる。さらなる方法はPCT/US14/13048中に見出すことができ、この文献はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
図5は、前立腺がんを有する患者の試料から得られたCTC試料を用いてがん関連タンパク質の発現レベルを測定した実験の結果を示す。本発明の方法に従ってCTCを成長させて培養することで、濃縮されたCTC集団を得た。前立腺がんに関連した様々なマーカーの遺伝子発現をqPCRを用いて評価した。CD45発現は、2名の対象、43−Bおよび45−Cについて免疫蛍光によって評価した。白色の矢印はCD45についての染色を指し示し、黒色の矢印はEPCAM(上皮細胞接着分子)/PSMAについての染色を指し示す。上のパネルはCD45染色のみを含有している。評価されたマーカーは、アンドロゲン受容体(AR)、アンドロゲン受容体スプライスバリアント7(AR−V7)、EPCAM、前立腺酸性ホスファターゼ(PAPS)、前立腺特異的抗原(KLK3/PSA)、前立腺特異的膜抗原(FOLH1/PSMA)、v−ets鳥類赤芽球症ウイルスE26癌遺伝子ホモログ(ERG)、前立腺がん抗原3(PCA3)、Nk3ホメオボックス1(NKX3−1)およびクロモグラニンAまたは副甲状腺分泌タンパク質1(CHGA)を包含した。
前立腺CTCコロニーが発現することができる免疫治療標的および幹細胞マーカーを同定するため、転移性CRPC(mCRPC)を有する患者30名超から10から20mLの末梢血を採取した。図2〜3中に記載されているように、対象試料のうちの8つが、本発明の方法を用いて培養した後にCTCコロニーを生じた。図6中に示すように試料のうちの4つをいくつかのマーカーのqPCR解析のために用いてLNCaP(前立腺腺癌)およびPC−3(前立腺腺癌)細胞株と比較したが、これらは図1について記載されているものと同じ染色パターンを含有している。
図7〜9は、対象試料から得られたCTCコロニーの間での特定のシグナル伝達経路の差次的発現を決定するためのmRNAシーケンシング解析の結果を表示している。CTCコロニーは、図2〜3中に記載されている方法を用いて得た。細胞のRNA配列を特定の遺伝子にマッピングし、試料コレクションを横断して遺伝子のカウントを正規化した。ノンパラメトリックな濃縮アルゴリズムを用いて統計的検定を実施し、各試料における相対的な高発現に関連した経路を検出した。偽陽性率は、大きな経路コレクションを横断して算出した。図7〜9中に見られるように、各前立腺試料RNAプロファイルについて、濃縮検定結果をX軸上に偽陽性率として表した。異なる経路における遺伝子発現の濃縮は試料中で異なった。前立腺CTCコロニーの濃縮を示す経路としては、神経増殖因子受容体シグナル伝達(図7)、Aurora Aシグナル伝達(図8)およびKit受容体シグナル伝達(図9)が挙げられた。
膵臓CTCコロニーにおけるEPCAM発現を決定するため、膵管腺癌(PDAC)を有する6名の患者をプロファイルした。アフェレーシスされた血液試料を回収して培養することで、CTCコロニーを生じた。図10に示すように、細胞をサイトケラチン19(CK19;左上パネル、および右パネル中の円形の染色)およびEPCAM(左下パネル中の細胞周囲の点状の染色、および右パネル中に白色矢印により指し示される周辺の染色)について染色した。CTCの培養のために用いられたコラーゲン系基材への細胞の結合は、EPCAM発現の増加を導いた。
COSMIC(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer)データベースから決定された膵臓がんにおいて見出される変異について、6つの膵臓CTCコロニー試料を解析した。PDAC腫瘍についてのCOSMICデータベース中では、KRASの変異率は69%、p53は51%、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤2A(CDKN2A)は23%、SMAD4は21%、AT−リッチ相互作用ドメイン含有タンパク質1A(ARID1A)は6%、ベータ−カテニン(CTNNB1)は2%である。培養後に得られたCTCコロニーの場合、2/6のコロニーがKRASの変異を表し、1/6のコロニーがp53、CDK2NAおよびCTNNB1の変異を表した。
異なる腫瘍から得られたCTC間に差次的発現があるかを決定するため、PDAC CTCをmCRPC CTCと比較した。膵臓CTCは、NANOG、Wnt、インスリン様増殖因子1(IGFR1)、FOXP1およびARシグナル伝達経路において遺伝子発現の増加を呈した。細胞のRNA配列を特定の遺伝子にマッピングし、試料コレクションを横断して遺伝子のカウントを正規化した。ノンパラメトリックな濃縮アルゴリズムを用いて統計的検定を実施し、各試料における相対的な高発現に関連した経路を検出した。偽陽性率は、大きな経路コレクションを横断して算出した。図11および12中に見られるように、各前立腺試料RNAプロファイルについて、濃縮検定結果をX軸上に偽陽性率として表した。異なる経路における遺伝子発現の濃縮は試料中で異なった。前立腺がんCTCと比べて膵臓CTCコロニーにおいて濃縮を示す経路としては、NANOGシグナル伝達経路(図11)およびWntシグナル伝達経路(図12)が挙げられた。樹状細胞、肺細胞およびT細胞が対照として用いられ、残りの試料は対象から得られたCTCであった。
CTC画分が全血液細胞対照より多くの遺伝的変異を表すかを決定するため、ステージ4のPDACを有する6名の患者について一塩基多型(SNP)および挿入/欠失(INDEL)を解析した。図13は、SNPおよびINDEL解析の結果を表現しており、総イベント数(左パネル)およびイベントを有する遺伝子の総数(右パネル)のいずれの点においてもCTC試料は全血液細胞対照と比較してより多くの遺伝的変異を明らかにすることが可能であったことを指し示す。
図15は、本発明のシステムの初期設定においてユーザが見るグラフィカルインターフェースを表現している。左上のコーナーにおいて、ユーザは自分のユーザ識別コードを入力する。右上のコーナーにおいて、ユーザは所望のオプションを選ぶ。左下コーナーの4分の1区は、所望の操作の進行を指し示す。右下のコーナーは、ユーザがシステム用の自分のパスワードを入力することを可能にする。図16は、本発明のシステムにログインするとシステムが表示することができる追加のユーザインタフェースを表現している。図16のユーザインタフェースは、例えば最小持続時間の間、ハードウェアの接続が確かめられるまで、およびユーザが開始ボタンを押すまで表示されるように設定することができる。
細胞タンパク質の共有結合のための表面を調製するため、ガラススライドを、スライドを0.1M塩酸(HCl)と共に2時間から一晩、室温でインキュベートすることにより調製した。次いで、ガラススライドを0.1M NaOHと共に2時間から一晩、室温でインキュベートした。スライドを次いで0.5〜5%(3−アミノプロピル)トリメトキシシランと共に2時間から一晩、室温でインキュベートした。次いで、スライドを0.5〜5%グルタルアルデヒド(PBS中で希釈)と共に2時間から一晩、室温でインキュベートした。ガラススライドを次いで水で一晩すすぎ、UV光下で1時間滅菌し、次いで室温で乾燥保存した。
エレクトロポレーションを用いて、DU145(ヒト前立腺がん)細胞にGFPプラスミドをトランスフェクトした。5×106細胞/mLを、50ng DNAプラスミド/μLの細胞再懸濁液を使用して、1260Vで20msを2回のプロトコールを用いてエレクトロポレーションした。トランスフェクション後、細胞を別々の35mm細胞培養プレートに分けた。1つのプレートを標準的なCO2インキュベーターの中に入れ、他のプレートを本発明のインキュベーターの中に入れた。第二のプレートのインキュベーターは、1% O2および2PSIGにセットした。48時間後、細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いてGFP発現についてイメージングした。図23中に示されるデータは、低酸素および高圧でインキュベートされた細胞(下段パネル)は、明るい細胞の数がより多いことによって表現されているように、標準的条件でインキュベートされた細胞(上段パネル)よりも高いトランスフェクション効率を示したことを指し示す。
次の非限定的な実施形態は、本発明の具体例を提供するものであるが、本発明の範囲を限定するものではない。
Claims (26)
- a)閉鎖環境チャンバー;および
b)コントロールユニット
を含む細胞培養インキュベーターであって、
前記コントロールユニットは閉鎖環境チャンバーと動作可能に連結されており、前記コントロールユニットはその中にエンコードされたコンピュータ実行可能コードを持つコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラムプロダクトを含み、前記コンピュータ実行可能コードは:
(i)閉鎖環境チャンバーの酸素レベルを制御するようにエンコードされ、閉鎖環境チャンバー中の酸素の除去をコントロールして閉鎖環境チャンバー内に低い酸素レベルを生成するようにエンコードされた酸素レベルモジュール;
(ii)閉鎖環境チャンバーの圧力を制御するようにエンコードされ、閉鎖環境チャンバー中に陽圧条件を生成するようにガスの追加をコントロールする圧力モジュール;
(iii)閉鎖環境チャンバーの温度を制御するようにエンコードされた温度モジュール;および
(iv)閉鎖環境チャンバーの湿度を制御するようにエンコードされた湿度モジュール
をエンコードするのに適合しており、
前記酸素レベル、圧力、温度および湿度の各々は細胞のインビボ微小環境を模倣しており、指示された酸素レベル、圧力、温度および湿度の各々の入力を受けて約20分以内に指示された酸素レベル、圧力、温度および湿度の各々に達する、前記細胞培養インキュベーター。 - インビボ微小環境が腫瘍微小環境である、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- 細胞が幹細胞である、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- 細胞ががん細胞である、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- 細胞が循環腫瘍細胞である、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- 細胞が免疫細胞である、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- 細胞が生物学的試料から得られる、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- 生物学的試料が血液である、請求項7の細胞培養インキュベーター。
- 生物学的試料が腫瘍である、請求項7の細胞培養インキュベーター。
- 生物学的試料が唾液である、請求項7の細胞培養インキュベーター。
- 生物学的試料が組織である、請求項7の細胞培養インキュベーター。
- コントロールユニットがユーザによりコントロールされる、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- コントロールユニットが自動化されている、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- 酸素モジュールが閉鎖環境チャンバー中で低い酸素レベルを維持するようにエンコードされている、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- 圧力モジュールが環境チャンバー中で陽圧条件を維持するようにエンコードされている、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- 酸素レベルモジュールが閉鎖環境チャンバー中の酸素レベルを約0.1%から約21%で維持するようにエンコードされている、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- 酸素レベルモジュールが閉鎖環境チャンバー中の酸素レベルを約2%で維持するようにエンコードされている、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- 酸素レベルモジュールが閉鎖環境チャンバー中の酸素レベルを約0.1%で維持するようにエンコードされている、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- 圧力モジュールが閉鎖環境チャンバー中の圧力を約1PSIGから約5PSIGで維持するようにエンコードされている、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- 湿度モジュールが湿度を約85%で維持するようにエンコードされている、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- コントロールユニットがその中にエンコードされたコンピュータ実行可能コードを持つコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラムプロダクトをさらに含み、前記コンピュータ実行可能コードは二酸化炭素モジュールをエンコードするのに適合しており、前記二酸化炭素モジュールは閉鎖環境チャンバーの二酸化炭素レベルを制御するようにエンコードされている、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- 酸素レベルモジュールによりコントロールされるガス入口をさらに含む、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- 圧力モジュールによりコントロールされるガス入口をさらに含む、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- 湿度モジュールによりコントロールされる水分湿度トレイをさらに含む、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- 温度モジュールによりコントロールされる加熱エレメントをさらに含む、請求項1の細胞培養インキュベーター。
- 細胞培養インキュベーターが細胞培養プレートを受け入れるように構成される、請求項1の細胞培養インキュベーター。
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