CN107636139A - 癌细胞富集系统 - Google Patents

Abstract

本发明描述了用于繁殖细胞亚群的方法。该细胞亚群可以在特定的培养条件下生长，以促进该细胞亚群的生长和富集。该方法可用于确定生物标志物，并且指导癌症患者的治疗。

Description

癌细胞富集系统

交叉引用

本申请要求于2015年4月17提交的美国临时申请号62/149,268的权益，该美国临时申请通过引用以其全文并入本文。

背景技术

细胞富集系统可用于富集和分离不同的细胞群体。这些细胞可以包括例如癌细胞、循环肿瘤细胞、干细胞或免疫细胞。通过细胞富集系统分离和表征所诱导的不同细胞类型可用于理解肿瘤病因学、转移生物学、干细胞分化、免疫细胞增殖，并且为肿瘤进展提供生物标志物。

援引并入

本申请中引用的每个专利、出版物和非专利文献均通过引用以其全文并入本文，如同每一个均通过引用单独地并入。

发明内容

在一些实施方案中，本发明提供了一种细胞培养孵箱，其中该细胞培养孵箱(cellculture incubator)包括：a)封闭环境室；和b)控制单元，其中该控制单元可操作地连接至所述封闭环境室，其中该控制单元包括计算机程序产品，该计算机程序产品包括具有在其中编码的计算机可执行代码的计算机可读介质，该计算机可执行代码适合于编码：(i)氧气水平模块，其中该氧气水平模块被编码为调节所述封闭环境室的氧气水平，其中该氧气水平模块被编码为控制所述封闭环境室中的氧气的去除，从而在所述封闭环境室内产生低氧水平；(ii)压力模块，其中该压力模块被编码为调节所述封闭环境室的压力，其中该压力模块控制气体的添加，从而在所述封闭环境室中产生正压条件；(iii)温度模块，其中该温度模块被编码为调节所述封闭环境室的温度；以及iv)湿度模块，其中该湿度模块被编码为调节所述封闭环境室的湿度，其中所述氧气水平、压力、温度和湿度中的每一个均模拟细胞的体内微环境，其中所述细胞培养孵箱在接收到所指示的氧气水平、压力、温度和湿度中的每一个的输入约20分钟内达到所指示的氧气水平、压力、温度和湿度中的每一个。

附图说明

图1是代表性CTC簇的免疫荧光图像。

图2是用于富集目标细胞亚群的说明性工作流程。

图3描绘了使用本发明的方法富集并繁殖目标细胞亚群。

图4是将要与本发明的方法一起使用的说明性计算机系统。

图5描绘了来自前列腺癌细胞的CTC中生物标志物评估的结果。

图6示出了前列腺癌细胞的生物标志物测定的结果。

图7显示了针对神经生长因子信号传导途径的mRNA测序分析的结果。

图8显示了针对Aurora A信号传导途径的mRNA测序分析的结果。

图9显示了针对Kit受体信号传导途径的mRNA测序分析的结果。

图10是PDAC CTC中EPCAM表达的免疫荧光图像。

图11描绘了PDAC相比mCRPC CTC中的NANOG信号传导途径表达的结果。

图12描述了PDAC相比mCRPC CTC中的Wnt信号传导途径表达的结果。

图13显示了针对CTC的SNP和INDEL分析的结果。

图14显示了针对CTC的SNP和INDEL分析的结果。

图15描绘了本发明的系统的说明性用户界面。

图16描绘了本发明的系统的说明性用户界面。

图17描绘了本发明的系统的说明性用户界面。

图18描绘了本发明的系统的说明性用户界面。

图19显示了本发明的说明性细胞培养孵箱。

图20显示了本发明的细胞培养孵箱的门构造。

图21显示了本发明的细胞培养孵箱的门构造。

图22描绘了本发明的细胞培养孵箱的门加热器。

图23描绘了使用绿色荧光蛋白，提高的细胞转染效率。

具体实施方式

本发明的方法

本发明的方法可用于从生物样品中分离CTC和其他目标细胞亚群。本发明的方法可用于例如分离细胞群体、选择性分离细胞群体、维持细胞处于分化或未分化状态、强制分化细胞、富集细胞群体、扩大细胞群体(通过增殖或选择性富集)、调节细胞群体的功能、调节细胞群体的形态、调节表观遗传特征以及调节基因和蛋白质表达谱。本发明的方法可用于例如原代细胞、细胞系或微生物群落。

目标细胞亚群可以包括，例如CTC、癌症干细胞(CSC)、造血干细胞(HSC)、内皮祖细胞(EPC)、癌前细胞、干细胞、胎儿干细胞、未分化的干细胞、胎儿细胞、骨髓细胞、祖细胞、泡沫细胞、间充质细胞、上皮细胞、上皮祖细胞、内皮细胞、子宫内膜细胞、滋养层细胞、癌细胞、红细胞、白细胞、免疫系统细胞、结缔组织细胞、肝细胞、神经元、诱导多能干(IPS)细胞或它们的任意组合。

本发明的方法可用于例如维持培养中的神经元细胞、维持培养中的肝细胞和毒性筛选。本发明可用于将IPS细胞和干细胞分化成例如中胚层、外胚层和内胚层的细胞。本发明的方法可用于将细胞分化成神经元、心肌细胞、肝细胞、造血干细胞、成骨细胞、破骨细胞、上皮细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、脂肪细胞、免疫细胞、肥大细胞、红细胞、卵母细胞或精母细胞。

CTC可以由体内癌细胞和免疫细胞的异质簇组成，并且可以在体外表现出免疫调节和干细胞信号传导途径的差异表达。

图1显示了来自患有去势抗性前列腺癌(CRPC)的受试者的循环肿瘤细胞簇的免疫荧光(IF)。IF图像表明CTC可包含癌细胞和免疫细胞。DAPI染色(由椭圆形细胞染色指示)指示出细胞的细胞核。白细胞(WBC)抗体混合物可用于检测例如CTC簇中的CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD45和CD56(图1中的白色箭头)。细胞角蛋白抗体混合物可用于检测例如CTC簇中的CK4、CK5、CK6、CK8、CK10、CK13和CK18(在图1中的椭圆形细胞核之中和周围观察到的纤维状染色)。明亮的白色染色和椭圆形细胞核周围的纤维状染色指示前列腺特异性膜抗原(PSMA)和前列腺特异性抗原(PSA)蛋白。图例中的数字表示用于激发染色剂的波长(nm)。

图2描绘了可用于从异质细胞群体中获得富集的细胞群体的说明性工作流程。在本发明的方法中使用的细胞来源可以包括例如新鲜血液、白细胞(WBC)、经离心的血液的棕黄层、冷冻保存的肿瘤和活检物、用于白细胞去除术的样品、细针抽出物、新鲜的活检物、尿液或粪便物。在从受试者中获得样品之后，可以将样品准备用于细胞分离试剂盒中，以使例如血液样品分离成血浆、白细胞和血小板以及红细胞。可以在经离心的血液的白细胞和血小板部分中发现CTC。细胞分离步骤可能长约30分钟。在已经分离异质细胞群体之后，可以将细胞加至富集培养基以繁殖和富集活CTC集落。细胞与基底的粘附可能花费几个小时至大约一天。细胞培养过程中的增殖可以在粘附后约1至3天内观察到，之后可以针对感兴趣的标志物对细胞集落进行下一代测序(NGS)。下一代测序方法可以包括例如全基因组测序、全基因组重测序、全外显子组测序、全转录物组mRNA测序、ChIP测序和生物信息学。

图3描绘了从受试者中收集的异质细胞群体的粘附和增殖。首先，可将细胞加至可用诸如灌注有生长因子的水凝胶等物质包被的板上。约30分钟后，细胞粘附到板上。在接下来的两个小时内，细胞在板上扩散，并更换生长培养基，以允许除去任何剩余的白细胞(WBC)。将培养基替换为化学成分确知的培养基以促进CTC集落的生长。细胞可以在可通过改变氧气或压力水平而进行调节以模拟例如肿瘤微环境的环境中生长，以获得活CTC。在一些实施方案中，细胞在低氧条件下生长。

本发明可以使用基底来从样品中捕获目标细胞亚群。可将异质细胞群体加至例如涂有能够促进目标细胞群体生长和富集的基底的培养皿。目标细胞亚群可以以比其他细胞(例如白细胞)更高的亲和力粘附于基底。可以将未粘附于基底上的细胞用培养基洗掉或者保存在培养物中。一旦粘附，细胞可以在基底上扩散并开始分裂。

基底可以包含例如1、2、3、4或5层。两个基底层之间的距离可以为约0.001至约20mm、约1至约10mm或约1至约5mm，并且每层可以为约0.001、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约12、约15、约17或约20mm。

可以将细胞涂布在由例如塑料、玻璃、明胶、聚丙烯酰胺或其任意组合制成的材料上。用于涂布细胞的器皿可以是例如显微镜载玻片、培养板、培养皿、皮氏培养皿(Petridishes)、显微镜盖玻片、封闭环境室、密封培养皿或多孔培养皿。

基底的结合表面层可以是与捕获的细胞接触的基底部分。在一些情况下，该结合表面层是邻近基底层或者通过一个或多个中间层与基层隔开的唯一层。

基底的结合表面层可包含例如细胞单层、细胞裂解物、与细胞外基质(ECM)相关的生物材料、明胶或其任意组合。

与ECM相关的生物材料可以包括例如I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、网硬蛋白、波形蛋白、吸湿性分子、糖胺聚糖(glycosaminoglycanse)、蛋白聚糖、roteoglycans、糖萼、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸或聚-L-鸟氨酸。所述明胶可以来自动物来源，例如该明胶可以来自猪或牛。

用于基底的单层细胞可以是例如哺乳动物细胞、内皮细胞、血管细胞、静脉细胞、毛细管细胞、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人肺微血管内皮细胞(HLMVEC)、人角质形成细胞、人间充质干细胞、人骨髓基质细胞和人星形胶质细胞。该细胞系可以从原代来源或从永生化细胞系获得。可以用紫外线或X射线源照射单层细胞来引起细胞衰老。该单层也可以含有一种或多种不同细胞类型的混合物。不同的细胞类型可以共培养在一起。共培养的一个非限制性实例是与转基因小鼠胚胎成纤维细胞共培养的原代人内皮细胞的组合，它们混合形成单层。

基底的结合表面层可以含有例如细胞内组分的混合物。可用于获得细胞内组分的混合物的一种方法是裂解细胞并收集细胞溶质组分和细胞骨架组分。裂解的细胞可以是原代的或永生化的。裂解的细胞可以来自单一培养物或共培养物。

基底的结合表面层可含有与细胞外基质(ECM)相关的生物材料或结合部分，诸如透明质酸水凝胶。例如，可以将明胶直接与细胞、结合部分、与ECM相关的生物材料或其任意组合混合，来制备用于基底的结合表面层。例如，该结合表面层可以包含与胶原蛋白混合的明胶。

基底可具有一个或多个中间层。基底的中间层可以是一个或多个细胞单层。该单层的细胞可以具有不同的来源。例如，可以通过在基层上生长小鼠胚胎成纤维细胞的汇合单层并随后在汇合的小鼠胚胎成纤维细胞的顶部生长另一层细胞(例如，结合表面层)来制备基底的中间层。

可以在基质中使用饲养层来生长和富集目标细胞亚群。饲养层可以邻近基层并且可以与基底的结合表面层分开。该饲养层可以是饲养细胞单层。该单层的细胞可以具有不同的来源。例如，可以通过在基层上生长单层人内皮细胞或小鼠胚胎成纤维细胞来制备饲养层。

可以通过使细胞在基层或中间层的顶部上的单层中生长来完成基底各层的接合。也可以通过用净正电荷、净负电荷或净中性电荷的表面预处理表面来完成层的接合。可以通过化学部分、连接体、蛋白质片段、核苷酸片段或其任意组合来辅助该接合过程。

基底的构造和组成可以为特定目标细胞亚群的富集而定制。基底的组成可基于例如患者类型、癌症类型、癌症阶段、患者病史以及患者肿瘤的基因组分析和蛋白质组学分析而变化。

用于生长细胞的富集培养基可以用已经从细胞培养物、血浆或其任意组合中收集的培养基进行补充或制备。该富集培养基可以是例如涂布(Plating)培养基、R型长期生长培养基、DF型长期生长培养基、D型长期生长培养基和MEF富集培养基或它们的任意组合。该富集培养基可以含有例如主营养源、动物血清、离子、元素、钙、谷氨酸、镁、锌、铁、钾、钠、氨基酸、维生素、葡萄糖、生长因子、激素、组织提取物、蛋白质、小分子或它们的任意组合。

可在富集培养基中使用的氨基酸的非限制性实例包括必需氨基酸，苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、赖氨酸和组氨酸、精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或它们的任意组合。

可在富集培养基中使用的生长因子的非限制性实例包括表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、干细胞因子(SCF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、睾酮、雌激素、促甲状腺激素(TSH)、促卵泡激素、促黄体激素、类花生酸、褪黑素、甲状腺素、加压素(vasopressin)、催产素或它们的任意组合。

激素的非限制性实例包括肽激素、胰岛素、甾类激素、氢化可的松、黄体酮、睾酮、雌激素、二氢睾酮或它们的任意组合。

组织提取物的非限制性实例包括垂体提取物。小分子添加剂的非限制性实例包括丙酮酸钠、内皮素-1、转铁蛋白、胆固醇或它们的任意组合。

可在富集培养基中使用的其他组分的非限制性实例包括哌啶酸、γ-氨基丁酸(GABA)、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、谷胱甘肽、人甲胎蛋白、牛甲胎蛋白、人全铁转铁蛋白(holotransferrin)或它们的任意组合。

可在富集培养基中使用的盐的非限制性实例包括氯化钙、氯化镁、碳酸氢钠、硫酸镁、氯化钠、柠檬酸盐、磷酸钾、磷酸钠或它们的任意组合。

在一些实施方案中，所述富集培养基包含哌啶酸、GABA、bFGF、TGFβ-1、人胰岛素、人全铁转铁蛋白、人血清白蛋白和还原型谷胱甘肽。

可在富集培养基中使用的氨基酸、生长因子、激素、组织提取物、盐或任何其他组分的浓度可以为例如约0.001nM、约0.005nM、约0.01nM、约0.015nM、约0.02nM、约0.25nM、约0.03nM、约0.035nM、约0.04nM、约0.045nM、约0.05nM、约0.055nM、约0.06nM、约0.065nM、约0.07nM、约0.075nM、约0.08nM、约0.085nM、约0.09nM、约0.1nM、约0.015nM、约0.2nM、约0.25nM、约0.3nM、约0.35nM、约0.4nM、约0.45nM、约0.5nM、约0.55nM、约0.6nM、约0.65nM、约0.7nM、约0.75nM、约0.8nM、约0.85nM、约0.9nM、约0.95nM、约0.001μM、约0.005μM、约0.01μM、约0.015μM、约0.02μM、约0.025μM、约0.03μM、约0.035μM、约0.04μM、约0.045μM、约0.05μM、约0.055μM、约0.06μM、约0.065μM、约0.07μM、约0.075μM、约0.08μM、约0.085μM、约0.09μM、约0.085μM、约0.09μM、约0.085μM、约0.09μM、约0.085μM、约0.09μM、约0.085μM、约0.09μM、约0.085μM、约0.09μM、约0.085μM、约0.09μM、约0.095μM、约0.1μM、约0.15μM、约0.2μM、约0.25μM、约0.3μM、约0.35μM、约0.4μM、约0.45μM、约0.5μM、约0.55μM、约0.6μM、约0.65μM、约0.7μM、约0.75μM、约0.8μM、约0.85μM、约0.9μM、约0.95μM、约0.001mM、约0.005nM、约0.01mM、约0.015mM、约0.02mM、约0.025mM、约0.03mM、约0.035mM、约0.04mM、约0.045mM、约0.05mM、约0.055mM、约0.06mM、约0.065mM、约0.07mM、约0.075mM、约0.08mM、约0.085mM、约0.09mM、约0.095mM、约0.1mM、约0.15mM、约0.2mM、约0.25mM、约0.3mM、约0.35mM、约0.4mM、约0.45mM、约0.5mM、约0.55mM、约0.6mM、约0.65mM、约0.7mM、约0.75mM、约0.8mM、约0.85mM、约0.9mM、约0.95mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、约190mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM、约500mM、约600mM、约700mM、约800nM、约900mM和约1M。

可以调节本发明方法中的培养条件来模拟在特定微环境中发现的氧气和压力水平，以促进对所需细胞群体的收集。该微环境可以是例如肿瘤微环境、骨转移环境、脉管系统环境或脑微环境。在培养条件下或在细胞孵箱中使用的氧气水平可以在孵箱中为例如约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％或约25％的氧气。在一些实施方案中，细胞可以在低氧条件下生长。

可以调节本发明方法中的培养条件来模拟在肿瘤微环境中发现的压力，以促进例如CTC的收集、肿瘤活检物的维持或肿瘤活检物的扩充。在培养条件下使用的压力可以是以下PSI表(PSIG)读数，例如约0.5PSIG、约0.6PSIG、约0.7PSIG、约0.8PSIG、约0.9PSIG、约1PSIG、约1.1PSIG、约1.2PSIG、约1.3PSIG、约1.4PSIG、约1.5PSIG、约1.6PSIG、约1.7PSIG、约1.8PSIG、约1.9PSIG、约2PSIG、约2.5PSIG、约3PSIG、约3.5PSIG、约4PSIG、约5PSIG、约6PSIG、约7PSIG、约8PSIG、约9PSIG、约10PSIG、约15PSIG、约20PSIG、约25PSIG、约30PSIG、约35PSIG、约40PSIG、约45PSIG、约50PSIG或约55PSIG。

在培养条件下使用的压力可以为例如约3.45kPa、约4.14kPa、约4.83kPa、约5.52kPa、约6.21kPa、约6.89kPa、约7.58kPa、约8.27kPa、约8.96kPa、约9.65kPa、约10.3kPa、约11kPa、约11.7kPa、约12.4kPa、约13.1kPa、约13.8kPa、约17.2kPa、约20.7kPa、约24.1kPa、约27.6kPa、约31kPa、约34.4kPa、约41.4kPa、约48.3kPa、约55.2kPa、约62.1kPa、约68.9kPa、约103kPa、约138kPa、约172kPa、约207kPa、约241kPa、约276kPa、约310kPa、约345kPa或约379kPa。

在本发明方法中使用的富集培养基的pH可以是例如约2、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.55、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5、约5.5、约6、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约10.5或约11pH单位。

可以通过例如至少0.001帕斯卡-秒(Pa.s)、至少0.001Pa.s、至少0.0009Pa.s、至少0.0008Pa.s、至少0.0007Pa.s、至少0.0006Pa.s、至少0.0005Pa.s、至少0.0004Pa.s、至少0.0003Pa.s、至少0.0002Pa.s、至少0.0001Pa.s、至少0.00005Pa.s或至少0.00001Pa.s来调节富集培养基的粘度，其取决于所培养的细胞类型。

富集培养基的氧溶解度可以为例如约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％。

本发明的方法可以进一步包括用特定的介质组合物涂覆用于细胞粘附的表面，以促进细胞和细胞蛋白质与该表面的结合。该表面可以是例如细胞培养板、具有多个孔的细胞培养板、培养皿、载玻片、盖玻片或玻璃皿。用于涂覆细胞粘附表面的介质可以包括例如3-(氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺、(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷、[3-(2-氨基乙基氨基)丙基]三甲氧基硅烷、三甲氧基[3-(甲基氨基)丙基]硅烷、3-氨丙基(二乙氧基)甲基硅烷或戊二醛。

表面涂层可以进一步包含促进细胞结合的细胞外基质(ECM)混合物。该混合物可以包括例如胶原蛋白、基膜蛋白、IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、波形蛋白、肿瘤衍生的细胞外基质蛋白或惰性自组装肽系统。使用的组分可以是动物或人来源的。可以使用例如氢氧化钾(KOH)、L-甘氨酸、DMEM粉末、氢氧化钠(NaOH)或PBS将ECM混合物稀释至pH为约4至约10。该ECM混合物可以进一步补充有例如人血浆或动物来源的血清。该动物来源的血清可以是例如牛血清或胎牛血清。

细胞可以在富集培养基中或在细胞培养孵箱中培养约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约18小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约2周、约3周、约4周、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约1年、约1.5年、约2年、约2.5年或约3年。

可以使用含有关于在特定类型的癌症中普遍存在的遗传突变的信息的数据库，将使用本发明衍生的目标亚群的遗传谱或生物标志物表达与已知突变进行比较。可用于比较的数据库的非限制性实例包括COSMIC、cBio Portal、人类基因突变数据库(HGMD TM)、GWAS中心和通用突变数据库(Universal Mutation Database)。

细胞培养孵箱

本发明进一步提供了一种细胞培养孵箱。该细胞培养孵箱可包括封闭环境室。该细胞培养孵箱可以被配置成维持该封闭环境室的气体组成，该封闭环境室的气压，该封闭环境室的湿度、二氧化碳水平、氧气水平和内部环境温度。该细胞培养孵箱可包括控制单元，其中该控制单元可以被配置成维持气体组成、气压、湿度、二氧化碳水平、氧气水平或内部环境温度中的至少一个。该控制单元可以可操作地连接至该封闭环境室。该控制单元可以被配置成维持气体组成、气压、湿度、二氧化碳水平、氧气水平和内部环境温度中的至少两个。该控制单元可以被配置成维持气体组成、气压、湿度、二氧化碳水平、氧气水平和内部环境温度。该细胞培养孵箱的控制单元可以是用户控制的或基于该细胞培养孵箱中的传感器而自动化的。该控制单元可以被配置成产生随时间改变的动态气体组成、气压、湿度、二氧化碳水平、氧气水平和内部环境温度。该控制单元可以被配置成随着时间在几种不同的气体组成、气压、湿度水平、二氧化碳水平、氧气水平和内部环境温度之间循环，并且可以是随机的或周期性的。

气体组成、气压、湿度、二氧化碳水平、氧气水平和内部环境温度中的至少一个可以被配置用于目标原代细胞亚群与非目标原代细胞亚群相比的选择性增殖。目标细胞亚群的该选择性增殖可以由以下得到证实：例如，与非目标原代细胞亚群的增殖速率相比，目标原代细胞亚群的增殖速率提高两倍。气体组成、气压、湿度、二氧化碳水平、氧气水平和内部环境温度中的至少一个可以被配置用于目标原代细胞亚群与非目标原代细胞亚群相比的选择性粘附。目标原代细胞亚群的该选择性粘附可以由以下得到证实：与非目标原代细胞亚群的粘附相比，目标原代细胞亚群的粘附提高两倍。气体组成、气压、湿度、二氧化碳水平、氧气水平和内部环境温度中的至少一个可以被配置用于促进目标原代细胞与非目标原代细胞亚群的集落形成相比的选择性集落形成。该选择性集落形成可以由以下得到证实：与非目标原代细胞亚群的集落形成相比，目标原代细胞亚群的集落形成提高两倍。该集落形成可以是二维或三维集落形成。

细胞培养孵箱中的气体组成可包括约0.1％至约21％的氧气水平。在一些实施方案中，细胞培养孵箱维持封闭环境室的氧气水平为不超过约5％。在一些实施方案中，细胞培养孵箱维持封闭环境室的氧气水平为不超过约2％。在一些实施方案中，细胞培养孵箱维持封闭环境室的氧气水平为不超过约1％。

细胞培养孵箱可以维持封闭环境室的用户控制或自动化的气压为约1PSIG(6.89kPa)或更高。在一些实施方案中，细胞培养孵箱维持封闭环境室的用户控制的气压为约2PSIG(13.8kPa)或更高。在一些实施方案中，细胞培养孵箱维持封闭环境室的用户控制的气压为约5PSIG(34.5kPa)。细胞培养孵箱可以通过控制入口气体压力来维持封闭环境室的气压。

细胞培养孵箱可以包括用户界面。该用户界面可以被配置为允许用户控制气体组成、氧气水平、二氧化碳水平、湿度、气压或内部环境温度。该用户界面可以被配置成将气体组成的显示提供给用户。该用户界面可以被配置成将封闭环境室的氧气水平、二氧化碳水平、湿度、气压和内部环境温度的显示提供给用户。细胞培养孵箱可以被配置成维持封闭环境室的内部湿度。封闭环境室可以包括搁架(shelf)、压力传感器、氧气传感器、二氧化碳传感器、温度传感器或除氧催化剂。封闭环境室中的搁架可以由例如不锈钢、银、金或铜制成。在一些实施方案中，封闭环境室的搁架是铜架。

细胞培养孵箱可以可操作地连接至气体罐。该气体罐可以包括CO₂罐、氮气罐、氧气罐、包含一种或多种气体的限定混合物的气体罐，或它们的任意组合。细胞培养孵箱可以经由加压泵或压力传感器(例如，压力表)可操作地连接至气体罐。该加压泵或压力传感器可以维持气体从气体罐向细胞培养孵箱的封闭环境室的受控流动。气体从一个或多个罐的受控流动可以具有设定的入口压力，所述一个或多个罐的设定的入口压力被配置成维持封闭环境室的所需的内部气体组成或内部气压。封闭环境室可以在封闭环境室的门上具有真空密封。封闭环境室可以用可膨胀的密封件密封。

孵箱可以包括加压门。在一些实施方案中，孵箱包括外部加压门和内部加压门。该外部加压门和/或内部加压门可以是例如双壁门。该双壁门可具有真空密封的闩锁。外部加压门可包括位于门上的集成压力传感器。孵箱可包括门入口。该门入口可以提供进入封闭环境室的入口。该门入口开口的尺寸可以小于加压门。该门入口可以包括橡胶垫片。该橡胶垫片可以创建加压密封。细胞培养孵箱可以包括集成压力传感器。该集成压力传感器可以是歧管压力传感器。该集成压力传感器可以是水基或硅基压力传感器。孵箱可以包括灭菌单元。该灭菌单元可以是基于UV的灭菌单元。该基于UV的灭菌单元可以被配置成向孵箱的封闭环境室的整个空间提供紫外线。孵箱可包括CO₂传感器。该CO₂传感器可以被配置成当与封闭环境室的限定的CO₂水平偏差+/-0.5％时，提供可检测的警报。孵箱可包括封闭环境室。孵箱可以包括水湿度托盘。该水湿度托盘可以促进封闭环境室的无菌性。该水湿度托盘可以直接拴系在湿度传感器或调节器上。孵箱可以包括空气夹套。该空气夹套可以维持最佳的温度和适当的气体调节。该空气夹套可以是物理上不同的隔室。该空气夹套可以容纳电气控制器和电路板。孵箱可包括用于调节孵箱内的氧气水平的除氧催化剂和传感器。

孵箱可包括加热元件或温度控制。该加热元件或温度控制可以包括基于静音风扇的加热元件。该基于静音风扇的加热元件可以将恒定的加热空气流分配到空气夹套隔室中。随后被动加热可以使内室以均匀分布和恒定的方式升温。孵箱可以包括被配置成提供限定的气体组成和内部气压的加压泵和调节器。基于马达的泵可以分配限定的气体混合物，以维持腔室压力和气体组成水平(例如，1％氧气、5％CO₂、94％N₂)。孵箱可以包括用户界面。用户可以使用该用户界面来设置气体水平和压力。该用户界面可以集成到传感器和泵中以供直接控制。加压泵和调节器可以包括气体入口。该气体入口可以允许任何气体流入封闭环境室中。例如，该气体入口可以连接到氧气罐。该气体入口可以连接到CO₂罐。该气体入口可以连接到氮气罐。在一些实施方案中，孵箱包括连接到氧气罐的气体入口、连接到CO₂罐的气体入口以及连接到氮气罐的气体入口。该气体入口可以连接到含有定制的气体混合物的罐。在一些实施方案中，用户可以控制气体经过任何气体入口的流动。任一个气体入口可以连接到流量计。该流量计可以调节入口气体压力。细胞培养孵箱可以包括湿度控制单元/传感器。该湿度控制单元/传感器可以直接连接到水湿度托盘。

细胞培养孵箱的封闭环境室可以包括灭菌单元，该灭菌单元可以是UV灭菌单元。封闭环境室可以包括加压门。封闭环境室可以包括这样的传感器：当检测到封闭环境室的氧气水平与用户所需的氧气水平相差超过约±0.5％时，该传感器提供可检测的警报。封闭环境室可以包括这样的传感器：当检测到封闭环境室的气压与用户所需的气压相差超过约±0.5％时，该传感器提供可检测的警报。封闭环境室可以包括显示封闭环境室的气压水平的用户显示器。在一些实施方案中，封闭环境室包括显示封闭环境室的O₂水平的用户显示器。在一些实施方案中，封闭环境室包括显示封闭环境室的CO₂水平的用户显示器。在一些实施方案中，封闭环境室包括显示封闭环境室的温度水平的用户显示器。

用户可以对细胞培养孵箱进行编程，以模拟例如生理、肿瘤微环境、低氧、高压、低压或超生理条件。细胞培养孵箱可以配置成在约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约21分钟、约22分钟、约23分钟、约24分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟或约1小时内校准到由用户设定的条件。在一些实施方案中，细胞培养孵箱可以在短于约20分钟内达到由用户设定的所需条件。在一些实施方案中，细胞培养孵箱可以在约20分钟内达到由用户设定的所需条件。在一些实施方案中，细胞培养孵箱可以在20分钟内达到由用户设定的所需条件。

在一些实施方案中，封闭环境室占据不超过6立方英尺的空间。在一些实施方案中，封闭环境室占据不超过3.5立方英尺的空间。在一些实施方案中，封闭环境室占据不超过2立方英尺的空间。在一些实施方案中，封闭环境室占据不超过1.5立方英尺的空间。在一些实施方案中，封闭环境室占据不超过1立方英尺的空间。在一些实施方案中，封闭环境室占据小于1立方英尺的空间。

在一些实施方案中，细胞培养板包括1、6、12、24、48、96、384、1056、1536或3456个孔。

本发明的方法可以使用细胞培养孵箱来培养目标细胞群体。图19提供了可在本发明的系统中使用的细胞培养孵箱的说明性实例。1901是孵箱的门，可以将其打开来把细胞培养物放置在孵箱中。1902是控制单元，其可用于使用包括例如温度、湿度、氧气水平、二氧化碳水平、孵育时间、氮气水平和腔室压力的参数来对细胞培养孵箱进行编程。1903是USB端口，其可用于向细胞培养孵箱输入数据或从细胞培养孵箱中提取数据。

图20是细胞培养孵箱的前面的示意图。图20描绘了门、可以使用门把手闩锁紧密配合的围绕门边缘的橡胶垫圈、挡缘、开门和关门按钮、触摸屏、旋转致动器或马达以及孵箱的腔室。图21显示了关闭(2101)和打开(2102)的细胞培养孵箱门。图22描绘了可在本发明的系统中使用的门加热器。图中显示了可用于将细胞培养孵箱加热至所需温度的前板、加热元件、Poron隔热层、背板、云母垫圈、铜板、精密空心轴和桨叶。

细胞培养孵箱的高度、宽度、深度或长度可以是例如约6英寸(in)、约6.5英寸、约7英寸、约7.5英寸、约8英寸、约8.5英寸、约9英寸、约9.5英寸、约10英寸、约10.5英寸、约11英寸、约11.5英寸、约12英寸、约12.1英寸、约12.2英寸、约12.3英寸、约12.4英寸、约12.5英寸、约12.6英寸、约12.7英寸、约12.8英寸、约12.9英寸、约13英寸、约13.1英寸、约13.2英寸、约13.3英寸、约13.4英寸、约13.5英寸、约13.6英寸、约13.7英寸、约13.8英寸、约13.9英寸、约14英寸、约14.5英寸、约15英寸、约15.5英寸、约16英寸、约16.5英寸、约17英寸、约17.5英寸、约18英寸、约18.5英寸、约19英寸、约19.5英寸、约20英寸、约20.5英寸、约21英寸、约21.5英寸、约22英寸、约22.5英寸、约23英寸、约23.5英寸、约24英寸、约24.5英寸、约25英寸、约25.5英寸、约26英寸、约26.5英寸、约27英寸、约27.5英寸、约28英寸、约28.5英寸、约29英寸、约29.5英寸、约30英寸、约30.5英寸、约31英寸、约31.5英寸、约32英寸、约32.5英寸、约33英寸、约33.5英寸、约34英寸、约34.5英寸、约35英寸、约35.5英寸、约36英寸、约36.5英寸、约37英寸、约37.5英寸、约38英寸、约38.5英寸、约39英寸、约39.5英寸、约40英寸、约40.5英寸、约41英寸、约41.5英寸、约42英寸、约42.5英寸、约43英寸、约43.5英寸、约44英寸、约44.5英寸、约45英寸、约45.5英寸、约46英寸、约46.5英寸、约47英寸、约47.5英寸、约48英寸、约48.5英寸、约49英寸、约49.5英寸、约50英寸、约50.5英寸、约51英寸、约51.5英寸、约52英寸、约52.5英寸、约53英寸、约53.5英寸、约54英寸、约54.5英寸、约55英寸、约55.5英寸、约56英寸、约56.5英寸、约57英寸、约57.5英寸、约58英寸、约58.5英寸、约59英寸、约59.5英寸、约60英寸或它们的任意组合。

在一些实施方案中，细胞培养孵箱的高度为12英寸。在一些实施方案中，细胞培养孵箱的宽度为13.5英寸。在一些实施方案中，细胞培养孵箱的深度为13.1英寸。

封闭环境室的容量可以是例如约100英寸³、约110英寸³、约120英寸³、约130英寸³、约140英寸³、约150英寸³、约160英寸³、约170英寸³、约180英寸³、约190英寸³、约200英寸³、约205英寸³、约210英寸³、约211英寸³、约212英寸³、约213英寸³、约214英寸³、约215英寸³、约216英寸³、约217英寸³、约218英寸³、约219英寸³、约220英寸³、约221英寸³、约222英寸³、约223英寸³、约224英寸³、约225英寸³、约226英寸³、约227英寸³、约228英寸³、约229英寸³、约230英寸³、约240英寸³、约250英寸³、约260英寸³、约270英寸³、约280英寸³、约290英寸³、约300英寸³、约310英寸³、约320英寸³、约330英寸³、约340英寸³、约340英寸³、约350英寸³、约360英寸³、约370英寸³、约380英寸³、约390英寸³、约400英寸³、约420英寸³、约440英寸³、约460英寸³、约480英寸³或约500英寸³。在一些实施方案中，封闭环境室的容量为约220英寸³。在一些实施方案中，封闭环境室的容量为约221英寸³。在一些实施方案中，封闭环境室的容量为约222英寸³。在一些实施方案中，封闭环境室的容量为约223英寸³。在一些实施方案中，封闭环境室的容量为约224英寸³。在一些实施方案中，封闭环境室的容量为224英寸³。

可用于制造细胞培养孵箱的材料包括例如不锈钢、玻璃、铜、银、金、塑料、毯胎(blanket batting)、硬板隔热材料或它们的任意组合。封闭环境室可以由例如铜或不锈钢制成。在一些实施方案中，封闭环境室由铜制成。

细胞培养孵箱可以维持在所需的湿度水平。该湿度水平可以是例如约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约90.5％、约91％、约91.5％、约92％、约92.5％、约93％、约93.5％、约94％、约94.5％、约95％、约95.5％、约96％、约96.5％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％或约99.9％。

细胞培养孵箱中的CO₂水平可以是例如约10％、约9.5％、约9％、约8.5％、约8％、约7.5％、约7％、约6.9％、约6.8％、约6.7％、约6.6％、约6.5％、约6.4％、约6.3％、约6.2％、约6.1％、约6％、约5.9％、约5.8％、约5.7％、约5.6％、约5.5％、约5.4％、约5.3％、约5.2％、约5.1％、约5％、约4.9％、约4.8％、约4.7％、约4.6％、约4.5％、约4.4％、约4.3％、约4.2％、约4.1％、约4％、约3.9％、约3.8％、约3.7％、约3.6％、约3.5％、约3.4％、约3.3％、约3.2％、约3.1％、约3％、约2.9％、约2.8％、约2.7％、约2.6％、约2.5％、约2.4％、约2.3％、约2.2％、约2.1％、约2％、约1.9％、约1.8％、约1.7％、约1.6％、约1.5％、约1.4％、约1.3％、约1.2％、约1.1％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％。

细胞培养孵箱可以与本文所述的培养条件组合使用，例如用来分离特定的细胞群体、诱导细胞变化、将外源物质引入细胞中、确定生物标志物表达以及作为患者的诊断工具。

本发明的方法可用于增加例如细胞中的转染和转导效率。例如，转导可用于将病毒载体引入到细胞中。病毒核酸递送系统可以使用重组病毒来递送核酸以用于基因治疗。可用于递送核酸的病毒的非限制性实例包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、腺相关病毒、水泡性口炎病毒、呼肠孤病毒、牛痘、痘病毒和麻疹病毒。

可以与本发明的方法一起使用的转染方法包括例如脂质转染、电穿孔、磷酸钙转染、化学转染、聚合物转染、基因枪、磁转染或声穿孔(sonoporation)。该转染可以是稳定或瞬时转染。该转染可用于转染DNA质粒、RNA、siRNA、shRNA或任何核酸。该质粒可以编码例如绿色荧光蛋白(GFP)、选择性标记物和其他感兴趣的蛋白质。该选择性标记物可以提供对例如G418、潮霉素B、嘌呤霉素和杀稻瘟菌素的抗性。与本发明的方法一起使用的转染方法可以进一步将编码CRISPR-Cas9系统的载体系统引入到细胞中。

本发明的方法可以将转染或转导效率提高例如约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约12倍、约14倍、约16倍、约18倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍或约100倍。

治疗用途

受试者可以是例如老年者、成年者、青少年、少年、儿童、幼儿、婴儿。受试者可以是非人类动物，例如，受试者可以是小鼠、大鼠、牛、马、驴、猪、绵羊、狗、猫或山羊。受试者可以是患者。

本发明的方法可用于治疗或诊断例如受试者中的癌症。本发明的方法可用于确定癌症的治疗剂、生物标志物、基因突变、表观遗传标志物或治疗靶标。本发明的方法也可用于开发在癌症中发现的基因突变的文库或数据库。本发明的方法可用于个性化用药。本发明的方法可用于确定治疗剂对特定细胞类型的作用。

例如，本发明的方法可用于富集特定的细胞群体或诱导特定基因(例如生物标志物或表观遗传标志物)的表达。例如，本发明的方法可用于影响干细胞或体细胞的效能。例如，本发明的方法可用于测试干细胞从例如全能干细胞转变为例如多能、寡能或单能干细胞的能力。

基因表达的变化可影响例如细胞数量、细胞形态、细胞生长、细胞运动性、细胞侵入或细胞粘附。

可以对培养的细胞进行基因组分析、蛋白质组分析和代谢分析，以便例如鉴定可用于开发癌症疗法、药物开发、癌症疫苗、癌症筛选、诊断、个性化抗体开发、造血干细胞移植、器官移植或心血管疾病治疗的生物标志物。

可以在本发明的方法中分析的癌症的非限制性实例包括：急性淋巴母细胞白血病、急性髓样白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤如小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤、原发灶不明癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促结缔组织增生性小园细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因肉瘤、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠道间质瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌如非小细胞和小细胞肺癌、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨的恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、原发灶隐匿转移性鳞状颈癌、口癌、多发性内分泌肿瘤综合征、骨髓增生异常综合征、髓样白血病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、胰腺癌胰岛细胞、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、梅克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤(妊娠)、原发部位不明癌症、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和维尔母斯瘤。

细胞表面标志物分子如EPCAM、CD133、EGFR、HER2或CD20可用于鉴定细胞群体。在一些实施方案中，细胞表面标志物的组合或细胞表面标志物标记(signature)可用于鉴定细胞群体。在一些实施方案中，细胞表面标志物和/或细胞表面标志物标记可用于医学诊断。

可以使用本发明的方法评估的表观遗传标志物包括例如DNA甲基化、胞嘧啶甲基化、羟甲基化、组蛋白甲基化、赖氨酸乙酰化、赖氨酸甲基化、精氨酸甲基化、丝氨酸磷酸化、苏氨酸磷酸化、蛋白质磷酸化、蛋白质泛素化、蛋白质苏素化、5-甲基胞嘧啶的存在、组蛋白H3乙酰化或组蛋白H4乙酰化。

可用于确定是否存在生物标志物的方法包括例如qPCR、RT-PCR、免疫荧光、免疫组织化学、Western印迹法、高通量测序、ELISA或mRNA测序。

目标细胞亚群可以用于个性化用药。例如，CTC和CSC可用于化学敏感性试验，由此可对培养的CTC测试化疗方案。可以完成化疗药物对CTC(包括例如细胞活力和细胞分裂)的效果的评估，以确定给定药物的功效。

随着治疗进展，通过连续监测受试者的CTC群体，本发明的方法可用于监测受试者对给定癌症疗法的响应。可以定期、在治疗之前、期间和之后分析血液样品，以评估CTC活力。

本发明的方法可用于监测目前处于缓解期的受试者，以研究癌症复发的可能性。可以定期对受试者的血液进行针对CTC的连续检测，从而确定癌症复发的潜在性或可能性。在一些情况下，连续检测可导致早期检测到复发。连续检测也可以用于长期的纵向研究。

本发明的方法可用于在临床试验期间收集关于患者的数据以供患者分层。例如，在患者的CTC中发现的特定生物标志物的存在可用于将患者划入适当的临床试验组中，或者可用作其他临床试验组的排除标准。

本文所述的发明可以提供可供医疗专业人员使用来治疗患者的数据。对患者的治疗可以包括诊断、预后或治疗诊断。诊断可包括确定患者的状况。诊断可以在一个时间点进行或持续进行。例如，患者可以被诊断出癌症。在另一个实例中，可以例行筛查处于缓解期的癌症患者，以确定是否已发生癌症复发。预后可以包括确定患者的疾病的后果、恢复的几率或疾病将会如何进展。例如，鉴定特定类型的CTC可以提供信息，可基于该信息进行预后。治疗诊断可包括确定疗法治疗。例如，患者的癌症疗法治疗可以包括化疗、放疗、药物治疗、不治疗或其任意组合。例如，可以通过连续血液检验来监测患者，以在受试者进行治疗之前、期间和之后测量CTC群体。对疗法的正面响应将会导致降低的CTC活力以及较低的分裂速率。

计算机系统

本发明的方法可用于例如对收集的目标细胞亚群进行测序、成像或表征。其他方法可见于PCT/US14/13048，其全文通过引用并入本文。

本发明提供了一种计算机系统，其被配置成实现本公开的方法。该系统可以包括计算机服务器(“服务器”)，其被编程为实现本文所述的方法。图4描绘了适合于使用户能够检测、分析和处理细胞图像并对细胞进行测序的系统400。系统400包括中央计算机服务器401，其被编程为实现本文所述的示例性方法。服务器401包括中央处理单元(CPU，也称为“处理器”)405，其可以是单核处理器、多核处理器或用于并行处理的多个处理器。服务器401还包括存储器410(例如随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)；电子存储单元415(例如，硬盘)；通信接口420(例如，网络适配器)，其用于与一个或多个其他系统进行通信；以及外围设备425，其可包括高速缓冲存储器、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器410、存储单元415、接口420和外围设备425都通过通信总线(实线)如主板与处理器405通信。存储单元415可以是用于存储数据的数据存储单元。服务器401在通信接口420的辅助下可操作地连接到计算机网络(“网络”)430。网络430可以是因特网、内联网和/或外联网，与因特网通信的内联网和/或外联网，电信或数据网络。在某些情况下，网络430在服务器401的帮助下可以实现对等网络，这可以使耦合到服务器401的设备能够作为客户端或服务器发挥作用。显微镜和显微操作器可以是外围设备425或远程计算机系统440。

存储单元415可以存储文件，如单独的图像，定时图像，关于单个细胞、细胞集落的数据，或与本发明相关的数据的任何方面。数据存储单元415可以与关于细胞在虚拟网格中的位置的数据相耦合。

服务器可通过网络430与一个或多个远程计算机系统进行通信。该一个或多个远程计算机系统可以是，例如，个人计算机、膝上型计算机、平板计算机、电话、智能电话或个人数字助理。

在一些情况下，系统400包括一台服务器401。在其他情况下，该系统包括多个服务器，它们通过内联网、外联网和/或因特网与彼此通信。

服务器401可以适合于存储细胞概况信息，诸如，例如，细胞大小、形态、形状、迁移能力、增殖能力、动力学性质和/或潜在相关性的其他信息。这样的信息可以存储在存储单元415或服务器401上，并且这样的数据可以通过网络传输。

本文所述的方法可以通过存储在服务器401的电子存储位置(例如，存储器410或电子存储单元415)上的机器(例如，计算机处理器)计算机可读介质(或软件)来实现。在使用期间，代码可以由处理器405执行。在某些情况下，代码可以从存储单元415中检索到并存储到存储器410上，以易于被处理器405访问。在一些情况下，可以排除电子存储单元415，而机器可执行指令被存储在存储器410上。或者，代码可以在第二计算机系统440上执行。

本文提供的系统和方法的各方面，如服务器401，可以在编程中得以体现。该技术的各个方面可以被认为是“产品”或“制造品”，其形式通常是携带在或体现于一种类型的机器可读介质(例如，计算机可读介质)中的机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据。机器可执行代码可以存储在电子存储单元如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。“储存”型介质可以包括计算机、处理器等或其相关模块的任何或所有有形存储器，例如，各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以在任何时间为软件编程提供非临时性存储。软件的全部或部分有时可以通过因特网或其他各种电信网络进行通信。这样的通信，例如，能够将软件从一台计算机或处理器加载到另一台计算机或处理器，例如，从管理服务器或主计算机加载到应用程序服务器的计算机平台。因此，可以承载软件元素的另一种类型的介质包括例如通过在本地设备之间的物理接口、通过有线和光学陆上线路网络以及经由各种空中链路使用的光波、电波和电磁波。携带这类波的物理元件如有线或无线链路、光链路等也可以被视为是承载软件的介质。如本文所用，除非限制于非临时性的有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”等术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。

因此，机器可读介质如计算机可执行代码可以采取多种形式，包括但不限于：有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质可以包括，例如光盘或磁盘，例如任何计算机等中的任何存储装置，其可用于实现所述系统。有形传输介质可包括：同轴电缆、铜线和光纤(包括含有处于计算机系统内的总线的导线)。载波传输介质可采取电或电磁信号或者声波或光波(例如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的那些)的形式。因此，计算机可读介质的常见形式包括，例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD、DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片、纸带(paper tame)、具有孔图案的任何其他物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或匣盒、载波传输数据或指令、电缆或传输这类载波的链路，或计算机可从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些形式的计算机可读介质中的许多种可以参与将一个或多个指令的一个或多个序列携带至处理器以供执行。

实施例

实施例1：与前列腺癌相关的标志物的鉴定

图5显示了使用从前列腺癌患者样品中获得的CTC样品测定癌症相关蛋白的表达水平的实验结果。根据本发明的方法生长和培养CTC以获得富集的CTC群体。使用qPCR评估与前列腺癌相关的各种标志物的基因表达。通过免疫荧光评估两名受试者(43-B和45-C)的CD45表达。白色箭头指示CD45染色，黑色箭头指示EPCAM(上皮细胞粘附分子)/PSMA染色。上图只包含CD45染色。所评估的标志物包括雄激素受体(AR)、雄激素受体剪接变体7(AR-V7)、EPCAM、前列腺酸性磷酸酶(PAPS)、前列腺特异性抗原(KLK3/PSA)、前列腺特异性膜抗原(FOLH1/PSMA)、v-ets禽类骨髓成红细胞增多症病毒E26癌基因同源物(ERG)、前列腺癌抗原3(PCA3)、Nk3同源框1(NKX3-1)和嗜铬粒蛋白A或甲状旁腺分泌蛋白1(CHGA)。

结果表明，PAPS在所有前列腺肿瘤样品中均有表达。其他前列腺癌标志物的表达在样品之间不同，表明CTC集落在受试者之间可能具有遗传多样性。

实施例2：与前列腺癌相关的标志物的鉴定

为了鉴定可由前列腺CTC集落表达的免疫治疗靶标和干细胞标志物，从超过30名患有转移性CRPC(mCRPC)的受试者中收集10至20mL外周血。如图2-3所述，在使用本发明的方法培养后有8个受试者样品产生CTC集落。如图6所示，四个样品用于几种标志物的qPCR分析，并与LNCaP(前列腺腺癌)和PC-3(前列腺腺腺癌)细胞系进行比较，其含有针对图1所述的相同染色图案。

如图1所示，用DAPI、WBC、细胞角蛋白和PSMA/PSA染色显示代表性的免疫荧光图像。结果表明，有若干患者样品和细胞系表达了免疫治疗靶标程序性死亡配体1(CD274/PD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和干细胞标志物八聚体结合转录因子4(PUSF1/Oct4)、SRY(性别决定区Y)-盒2(SOX2)、1型角蛋白18(KRT18)和1型角蛋白14(KRT14)，并且Oct4、SOX2和PD-L1上调。

实施例3：前列腺癌CTC集落的RNA测序

图7-9显示了mRNA测序分析的结果，以确定在从受试者样品中获得的CTC集落之间的特定信号传导途径的差异表达。使用如图2-3中所述的方法获得CTC集落。将细胞的RNA序列定位到特定基因，并将基因计数在样品集合中归一化。使用非参数富集算法，进行统计学检验，以检测每个样品中与相对较高的表达相关的途径。在大量途径中计算错误发现率。如图7-9所见，富集测试结果被表示为每个前列腺样品RNA谱在x轴上的错误发现率。不同途径中的基因表达的富集在样品间是不同的。显示在前列腺CTC集落中富集的途径包括神经生长因子受体信号传导(图7)、Aurora A信号传导(图8)和Kit受体信号传导(图9)。

实施例4：胰腺CTC集落的EPCAM表达

为了确定胰腺CTC集落中的EPCAM表达，对6名胰腺导管腺癌(PDAC)患者进行概况分析。收集并培养单采的(Apheresed)血液样品以产生CTC集落。如图10所示，对细胞进行细胞角蛋白19(CK19；左上图，和右图中的圆形染色)和EPCAM(左下图中的细胞周围的点状染色，右图中的白色箭头所示的外周染色)的染色。细胞与用于培养CTC的基于胶原的基底结合导致EPCAM表达增加。

实施例5：由胰腺CTC集落呈现的突变

针对根据COSMIC(癌症中的体细胞突变目录)数据库确定的胰腺癌中发现的突变，对6个胰腺CTC集落样品进行分析。在PDAC肿瘤的COSMIC数据库中，KRAS的突变率为69％，p53为51％，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)为23％，SMAD4为21％，含有富含AT的相互作用域的蛋白1A(ARID1A)为6％，β-连环蛋白(CTNNB1)为2％。对于培养后获得的CTC集落，2/6的集落在KRAS中显示突变，并且1/6的集落在p53、CDK2NA和CTNNB1中显示突变。

实施例6：胰腺和mCRPC CTC集落中的基因表达

为了确定在从不同肿瘤中获得的CTC之间是否存在差异表达，将PDAC CTC与mCRPCCTC进行比较。胰腺CTC在NANOG、Wnt、胰岛素样生长因子1(IGFR1)、FOXP1和AR信号传导途径中表现出增加的基因表达。将细胞的RNA序列定位到特定基因，并将基因计数在样品集合中归一化。使用非参数富集算法，进行统计学检验，以检测每个样品中与相对较高的表达相关的途径。在大量途径中计算错误发现率。如图11和12所见，富集测试结果被表示为每个前列腺样品RNA谱在x轴上的错误发现率。不同途径中的基因表达的富集在样品间是不同的。显示在胰腺CTC集落中相比在前列腺癌CTC中富集的途径包括NANOG信号传导途径(图11)和Wnt信号传导途径(图12)。使用树突状细胞、肺和T细胞作为对照，并且其余样品是从受试者中获得的CTC。

实施例7：SNP/INDEL变异分析

为了确定CTC部分是否显示出比全血细胞对照更多的遗传变异，对6名患有4期PDAC的患者进行单核苷酸多态性(SNP)和插入/缺失(INDEL)分析。图13描绘了SNP和INDEL分析的结果，并且表明就总事件(左图)和具有事件的基因总数(右图)而言，与全血细胞对照相比，CTC样品能够揭示更多的遗传变异。

使用靶向测序方法，评估了患者样品的238个与PDAC相关的基因。图14图示了测序分析的结果，并且显示与特定基因的全血细胞对照相比，CTC(左侧)显示出约20-30倍的SNP和INDEL。图表顶部的数字表示从中获得样品的患者。

实施例8：用于本发明系统中的显示器的用户界面

图15描绘了在初始化本发明系统时由用户看到的图形界面。在左上角，用户输入他/她的用户识别码。在右上角，用户选择所需的选项。左下角的象限表示所需操作的进展。右下角允许用户输入他/她的系统密码。图16描绘了在登录到系统中时可由本发明系统显示的另外的用户界面。图16的用户界面可以被配置为显示例如最小持续时间，直到硬件连接得到验证，并且直到用户点击开始按钮。

图17是显示培养室中的氧气水平(％)、腔室压力(PSI)、温度(℃)和二氧化碳水平(％)的状态的屏幕。该屏幕进一步显示了相对湿度和剩余的实验时间。用户可进一步使用屏幕底部的图标输入警报设置和时间设置。在该情况下，氧气水平为20.0％，腔室压力为3.7PSIG，温度为34.2℃，二氧化碳水平为6.3％。相对湿度为90％，并且剩余实验时间为2小时38分20秒。

图18显示了在选择特定参数时，用户可以触摸箭头并将参数减小或增大到所需的值。用户可以点击箭头来以小增量更改该值，或者按住箭头以更大的增量更改该值。一旦用户已经达到所需的值，用户触摸该值，并且所需的值得到确认。

实施例9：用于细胞粘附的涂覆方法

为了准备用于细胞蛋白质的共价结合的表面，如下准备载玻片：在室温下将载玻片与0.1M盐酸(HCl)一起孵育两小时至过夜。然后，在室温下将载玻片与0.1M NaOH一起孵育两小时至过夜。然后，在室温下将载玻片与0.5-5％(3-氨丙基)三甲氧基硅烷一起孵育两小时至过夜。然后，在室温下将载玻片与0.5-5％戊二醛(在PBS中稀释)一起孵育2小时至过夜。然后将载玻片用水冲洗过夜，在紫外线下灭菌一小时，随后在室温下干燥储存。

然后，采用含有细胞外基质(ECM)蛋白的混合物进一步处理载玻片，以促进细胞结合。该ECM混合物含有约0.1至约3mg/mL胶原蛋白、约0.1至约10μg/mL纤连蛋白和约0.1至约10μg/mL基膜混合物。根据细胞应用，用pH 10的甘氨酸缓冲液或pH 7的DMEM缓冲液稀释该ECM混合物。

实施例10：使用本发明的方法的转染效率

采用电穿孔，用GFP质粒转染DU145(人前列腺癌)细胞。使用1260V、20ms的方案，将5×10⁶个细胞/mL用50ng DNA质粒/μL细胞重悬液电穿孔两次。转染后，将细胞分入单独的35mm细胞培养板。将一块板置于标准CO₂孵箱中，而将另一块板置于本发明的孵箱中。第二块板的孵箱设定为1％O₂和2PSIG。48小时后，将细胞固定并使用荧光显微镜对GFP表达进行成像。图23中所示的数据表明，在低氧和高压下孵育的细胞显示出比在标准条件(上图)下孵育的那些细胞具有更高的转染效率(下图)，如大量明亮细胞所示。

实施方案

以下非限制性实施方案提供了本发明的说明性实例，但不限制本发明的范围。

实施方案1。一种细胞培养孵箱，其中所述细胞培养孵箱包括：a)封闭环境室；和b)控制单元，其中所述控制单元可操作地连接至所述封闭环境室，其中所述控制单元包括计算机程序产品，该计算机程序产品包括具有在其中编码的计算机可执行代码的计算机可读介质，该计算机可执行代码适合于编码：(i)氧气水平模块，其中所述氧气水平模块被编码为调节所述封闭环境室的氧气水平，其中所述氧气水平模块被编码为控制所述封闭环境室中的氧气的去除，从而在所述封闭环境室内产生低氧水平；(ii)压力模块，其中所述压力模块被编码为调节所述封闭环境室的压力，其中所述压力模块控制气体的添加，从而在所述封闭环境室中产生正压条件；(iii)温度模块，其中所述温度模块被编码为调节所述封闭环境室的温度；以及(iv)湿度模块，其中所述湿度模块被编码为调节所述封闭环境室的湿度，其中所述氧气水平、压力、温度和湿度中的每一个均模拟细胞的体内微环境，其中所述细胞培养孵箱在接收到所指示的氧气水平、压力、温度和湿度中的每一个的输入约20分钟内达到所指示的氧气水平、压力、温度和湿度中的每一个。

实施方案2。根据实施方案1所述的细胞培养孵箱，其中所述体内微环境是肿瘤微环境。

实施方案3。根据实施方案1-2中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞是干细胞。

实施方案4。根据实施方案1-2中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞是癌细胞。

实施方案5。根据实施方案1-2中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞是循环肿瘤细胞。

实施方案6。根据实施方案1-2中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞是免疫细胞。

实施方案7。根据实施方案1-6中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞是从生物样品中获得的。

实施方案8。根据实施方案7所述的细胞培养孵箱，其中所述生物样品是血液。

实施方案9。根据实施方案7所述的细胞培养孵箱，其中所述生物样品是肿瘤。

实施方案10。根据实施方案7所述的细胞培养孵箱，其中所述生物样品是唾液。

实施方案11。根据实施方案7所述的细胞培养孵箱，其中所述生物样品是组织。

实施方案12。根据实施方案1-11中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述控制单元是用户控制的。

实施方案13。根据实施方案1-11中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述控制单元是自动化的。

实施方案14。根据实施方案1-13中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述氧气模块被编码为维持低氧水平。

实施方案15。根据实施方案1-14中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述压力模块被编码为维持正压条件。

实施方案16。根据实施方案1-15中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述氧气水平模块被编码为使所述封闭环境室中的氧气水平维持在约0.1％至约21％。

实施方案17。根据实施方案1-16中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述氧气水平模块被编码为使所述封闭环境室中的氧气水平维持在约2％。

实施方案18。根据实施方案1-17中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述氧气水平模块被编码为使所述封闭环境室中的氧气水平维持在约0.1％。

实施方案19。根据实施方案1-18中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述压力模块被编码为使所述封闭环境室中的压力维持在约1PSIG至约5PSIG。

实施方案20。根据实施方案1-19中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述湿度模块被编码为使所述封闭环境室中的湿度维持在约85％。

实施方案21。根据实施方案1-20中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述控制单元还包括计算机程序产品，该计算机程序产品包括具有在其中编码的计算机可执行代码的计算机可读介质，该计算机可执行代码适合于编码二氧化碳模块，其中所述二氧化碳模块被编码为调节所述封闭环境室的二氧化碳水平。

实施方案22。根据实施方案1-21中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞培养孵箱还包括由所述氧气水平模块控制的气体入口。

实施方案23。根据实施方案1-22中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞培养孵箱还包括由所述压力模块控制的气体入口。

实施方案24。根据实施方案1-23中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞培养孵箱还包括由所述湿度模块控制的水湿度托盘。

实施方案25。根据实施方案1-24中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞培养孵箱还包括由所述温度模块控制的加热元件。

实施方案26。根据实施方案1-25中任一项所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞培养孵箱被配置成接收细胞培养板。

Claims (26)

1.一种细胞培养孵箱，其中所述细胞培养孵箱包括：

a)封闭环境室；和

b)控制单元，其中所述控制单元可操作地连接至所述封闭环境室，其中所述控制单元包括计算机程序产品，该计算机程序产品包括具有在其中编码有计算机可执行代码的计算机可读介质，该计算机可执行代码适合于编码：

(i)氧气水平模块，其中所述氧气水平模块被编码为调节所述封闭环境室的氧气水平，其中所述氧气水平模块被编码为控制所述封闭环境室中的氧气的去除，从而在所述封闭环境室内产生低氧水平；

(ii)压力模块，其中所述压力模块被编码为调节所述封闭环境室的压力，其中所述压力模块控制气体的添加，从而在所述封闭环境室中产生正压条件；

(iii)温度模块，其中所述温度模块被编码为调节所述封闭环境室的温度；以及

(iv)湿度模块，其中所述湿度模块被编码为调节所述封闭环境室的湿度，

其中所述氧气水平、压力、温度和湿度中的每一个均模拟细胞的体内微环境，其中所述细胞培养孵箱在接收到所指示的氧气水平、压力、温度和湿度中的每一个的输入约20分钟内达到所指示的氧气水平、压力、温度和湿度中的每一个。

2.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述体内微环境是肿瘤微环境。

3.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞是干细胞。

4.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞是癌细胞。

5.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞是循环肿瘤细胞。

6.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞是免疫细胞。

7.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞是从生物样品中获得的。

8.根据权利要求7所述的细胞培养孵箱，其中所述生物样品是血液。

9.根据权利要求7所述的细胞培养孵箱，其中所述生物样品是肿瘤。

10.根据权利要求7所述的细胞培养孵箱，其中所述生物样品是唾液。

11.根据权利要求7所述的细胞培养孵箱，其中所述生物样品是组织。

12.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述控制单元是用户控制的。

13.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述控制单元是自动化的。

14.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述氧气模块被编码为在所述封闭环境室中维持低氧水平。

15.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述压力模块被编码为在所述环境室中维持正压条件。

16.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述氧气水平模块被编码为使所述封闭环境室中的氧气水平维持在约0.1％至约21％。

17.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述氧气水平模块被编码为使所述封闭环境室中的氧气水平维持在约2％。

18.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述氧气水平模块被编码为使所述封闭环境室中的氧气水平维持在约0.1％。

19.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述压力模块被编码为使所述封闭环境室中的压力维持在约1PSIG至约5PSIG。

20.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述湿度模块被编码为使湿度维持在约85％。

21.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述控制单元还包括计算机程序产品，该计算机程序产品包括具有在其中编码有计算机可执行代码的计算机可读介质，该计算机可执行代码适合于编码二氧化碳模块，其中所述二氧化碳模块被编码为调节所述封闭环境室的二氧化碳水平。

22.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞培养孵箱还包括由所述氧气水平模块控制的气体入口。

23.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞培养孵箱还包括由所述压力模块控制的气体入口。

24.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞培养孵箱还包括由所述湿度模块控制的水湿度托盘。

25.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞培养孵箱还包括由所述温度模块控制的加热元件。

26.根据权利要求1所述的细胞培养孵箱，其中所述细胞培养孵箱被配置成接收细胞培养板。