CN118127118A - 一种用于体外评估免疫细胞抗肿瘤活性的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于体外评估免疫细胞抗肿瘤活性的方法及其应用。本发明先构建共培养模型：(1)从健康人外周血中分离外周血单核细胞，经预刺激和扩增培养，得到γδT细胞；(2)将肿瘤组织利用肿瘤组织解离试剂盒Tumor Dissociation Kit进行消化，然后将消化后的肿瘤细胞进行类器官培养，经筛选得到37μm～100μm的肿瘤类器官；(3)采用抗粘附试剂预包被Corning 96孔全白平底聚苯乙烯微孔板，然后将肿瘤类器官铺板，计数后再与γδT细胞混合形成共培养体系，得到所述共培养模型；最后再进一步将该共培养模型用于抗肿瘤活性的评估，评价γδT细胞对肿瘤的杀伤作用。

Description

一种用于体外评估免疫细胞抗肿瘤活性的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物学领域，特别涉及一种用于体外评估免疫细胞抗肿瘤活性的方法及其应用。

背景技术

类器官(Organoids)是一种基于3D体外细胞培养系统建立的，与体内的来源组织或器官高度相似的一种模型。这些3D体外培养系统可复制出已分化组织的复杂空间形态，并能够表现出细胞与细胞之间、细胞与其周围基质之间的相互作用和空间位置形态。而其本身又能做到与体内分化的组织器官具有相似的生理反应，与来源组织具有极高的相似性。

传统2D细胞培养模式的生理表征表达有限，无血管化也无免疫系统，虽然可高通量筛选，且操作非常容易，但无法模拟器官的发生和模拟人体发育与疾病模式；而动物模型虽然有生理性表征，有血管化和免疫系统，但无法高通量筛选，操作有限，且动物组织的复杂性会增加研究的困难度。相比之下，3D培养的类器官包含多种细胞类型，能够形成具有功能的“微器官”，能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态，因而在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景。

人T细胞根据TCR表达链不同，可分为αβT细胞和γδT细胞，人体的γδT细胞可以根据δ链的不同分为三个亚群，其中包括Vδ1、Vδ2和Vδ3。尽管γδT细胞仅占T淋巴细胞的一小部分(1-10％)，但它们具有多种免疫功能，例如可以防御病毒感染、炎症调节、免疫稳态、帮助B细胞产生抗体、抗肿瘤作用。γδT细胞识别抗原不需要MHC分子，因此可以通过同种异体回输治疗癌症病人，这是与αβT细胞不同之处。γδT细胞杀伤肿瘤的机制有分泌Th1细胞因子、穿孔素、颗粒酶等，募集和活化抗原提呈细胞，激活T细胞和B细胞等，因此γδT细胞在人体抗肿瘤免疫反应中具有重要作用。

目前肿瘤类器官有被运用到免疫细胞抗癌有效性的模型中，其中已公开的免疫细胞有NK细胞、αβT细胞、CAR T细胞等，并与肿瘤类器官进行共培养以探讨免疫细胞抗癌有效性。然而免疫细胞与肿瘤类器官共培养体系建立实操难度大，而且已有的研究没有利用肿瘤类器官研究γδT细胞的抗癌有效性，未能解决免疫细胞和肿瘤类器官共培养体系构建过程中的铺板均一化问题，且免疫细胞和肿瘤类器官共培养比例的计数方式和杀伤检测方式等技术问题还有待完善。因此，有必要提供一种更全面、准确、直观和简便的评估免疫细胞γδT细胞抗肿瘤活性的方法。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于评估抗肿瘤活性的免疫细胞和肿瘤类器官共培养模型的构建方法。

本发明的另一目的在于提供所述用于评估抗肿瘤活性的免疫细胞和肿瘤类器官共培养模型的构建方法构建得到的免疫细胞和肿瘤类器官共培养模型。

本发明的再一目的在于提供一种用于体外评估免疫细胞抗肿瘤活性的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种用于评估抗肿瘤活性的免疫细胞和肿瘤类器官共培养模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)从健康人外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)，然后经γδT细胞预刺激培养和扩增培养，得到γδT细胞；

(2)将肿瘤患者来源的肿瘤组织利用肿瘤组织解离试剂盒Tumor DissociationKit于37℃、180～220rpm(优选为200rpm)条件下消化20～60分钟，然后将消化后的肿瘤细胞过100μm细胞筛，并将肿瘤细胞离心收集后与基质胶混合均匀，加入类器官培养基进行类器官培养和传代培养，再采用37μm和100μm细胞筛对肿瘤类器官大小进行筛选，筛选得到37μm～100μm的人源化肿瘤类器官；

(3)采用抗粘附试剂预包被Corning 96孔全白平底聚苯乙烯微孔板(经TC处理，货号：3917)，然后将步骤(2)中得到的人源化肿瘤类器官进行铺板处理，计数后再与步骤(1)中得到的γδT细胞按效靶比(即γδT细胞与肿瘤类器官所含细胞个数之比)为1～10：1混合形成共培养体系，放入培养箱进行培养，得到所述用于评估抗肿瘤活性的免疫细胞和肿瘤类器官共培养模型。

步骤(1)中所述的外周血单核细胞(PBMC)的分离采用本领域的常规方法分离得到；优选为通过如下方法制备得到：

将健康人外周血用无血清RPMI 1640培养基等体积稀释后，加入到人淋巴细胞分离液(Ficoll)中，人淋巴细胞分离液(Ficoll)和稀释后的健康人外周血的体积比为2:5，离心，然后吸取中间白色絮状细胞层，再加入等体积的无血清RPMI 1640培养基，上下颠倒充分混匀后，再次离心弃上清，加入红细胞裂解液进行裂解，裂解后加入无血清RPMI 1640培养基终止反应，用40μm筛网过滤后离心弃上清，最后加入无血清RPMI 1640培养基重悬细胞，得到PBMC细胞。

步骤(1)中所述的γδT细胞预刺激培养所用的培养液为γδT细胞预刺激培养液，其配方如下：无血清RPMI 1640培养基(Gibco)，体积百分比10％的胎牛血清(FBS)，体积百分比1％的青链霉素双抗(Gibco)，1200UI/ml Human IL-2，50μM唑来膦酸。

步骤(1)中所述的扩增培养所用的培养液为γδT细胞培养液，其配方如下：无血清RPMI 1640培养基(Gibco)，体积百分比10％的胎牛血清(FBS)，体积百分比1％的青链霉素双抗(Gibco)，300UI/ml Human IL-2。

步骤(1)中所述的预刺激培养和扩增培养优选为采用24孔板进行培养，预刺激培养和扩增培养的总时间为11～13天，当γδT细胞中Vδ2的比例达到85％以上时可进行后续的γδT细胞抗肿瘤活性实验；其中，预刺激培养的接种密度为3.0×10⁶～4.0×10⁶cells/孔，扩增培养的接种密度为1.2×10⁶～4.0×10⁶cells/孔；更优选为通过如下方式实现：先进行预刺激培养(Day0)，接种密度为3.0×10⁶～4.0×10⁶cells/孔；然后第3天(Day3)换液一次，接种密度为3.0×10⁶～4.0×10⁶cells/孔；第3天(Day3)开始隔天换液一次，接种密度按照1.0×10⁶～2.0×10⁶cells/孔进行换液调整。

步骤(2)中所述的肿瘤为恶性肿瘤；优选为乳腺癌或肺癌。

步骤(2)中所述的Tumor Dissociation Kit为美天旎Tumor Dissociation Kit(human，货号130-095-929)。

步骤(2)中所述的消化所用的消化液优选为通过如下方法制备得到：将325μlTumor Dissociation Kit(美天旎，human，货号130-095-929)和4.7ml washing液混合均匀，得到消化液；其中，washing液配方如下：Advanced DMEM/F12培养基(Invitrogen，12634010)，Glutamax添加剂1×【将Glutamax 100×(Gibco，35050061)稀释至1×】，1MHepes缓冲溶液(Gibco，15630080)，青链霉素3×(终浓度300U/ml)(Gibco，15140122)，10μMY-27632(Rock Inhibitor)(Abmole，M1817)。

步骤(2)中所述的消化的时间优选为20～40分钟；更优选为30分钟左右(待消化至30分钟左右时，取少许上清液在显微镜下观察，若消化至2～10个细胞为一个细胞群(cluster)时，则终止消化)。

步骤(2)中所述的传代培养过程中，消化前先机械吹打进行消化，若无法机械消化则用37μm细胞筛过滤掉体积较小的类器官，将没过滤掉的体积较大的类器官进行TrypleExpress消化液消化，消化终止后将消化好的类器官与小于37μm的类器官一起进行种板。

步骤(2)中所述的100μm细胞筛优选为100μm Reversible Strainer细胞筛；更优选为Stemcell公司的100μm Reversible Strainer细胞筛(货号27270)。

步骤(2)中所述的37μm细胞筛优选为37μm Reversible Strainer细胞筛；更优选为Stemcell公司的37μm Reversible Strainer细胞筛(货号27215)。

步骤(2)中所述的类器官的培养优选为采用24孔平底板进行培养。

步骤(2)中所述的基质胶为Matrigel基质胶(Corning)。

步骤(2)中所述的基质胶的用量可以根据实际需要加入；优选为按每30μl基质胶配比3万个肿瘤细胞计算。

步骤(2)中所述的类器官培养基可采用常规类器官培养基；所述的类器官培养基的配方如下：Advanced DMEM/F12培养基(Invitrogen，12634010)，B27添加剂1×【将B27 50×((Gibco，17504-044)稀释至1×】，Glutamax添加剂1×【即将Glutamax 100×(Gibco，35050061)稀释至1×】，1M Hepes缓冲液(Gibco，15630080)，青链霉素1×(终浓度100U/ml)(Gibco，15140122)，5mM烟酰胺(Sigma，N0636)，1.25mM乙酰半胱氨酸(Sigma，A9165)，5μmY-27632(Rock inhibitor)(Abmole，M1817)，500nM A83-01(Tocris，2939)，500nM SB202190(Sigma，S7067)，5ng/ml成纤维细胞生长因子7(Peprotech，100-19-1)，20ng/ml成纤维细胞生长因子10(Peprotech，100-26-25)，5ng/ml表皮生长因子(Peprotech，AF-100-15)，100ng/ml Noggin(Novoprotein，CB89)，250ng/ml R-spondin-1(Novoprotein，CX83)，5nM Heregulinβ-1(Peprotech，100-03)，50μg/ml原代细胞抗生素Primocin(Invivogen，ant-pm-05)。

步骤(3)中所述的抗粘附试剂为抗粘附冲洗液；优选为Anti-adherence RinsingSolution抗粘附冲洗液(Stemcell)，用抗粘附试剂，预包被96孔全白平底聚苯乙烯微孔板，可以防止人源肿瘤类器官贴壁。

步骤(3)中，由于肿瘤类器官是由多个单细胞组成的球体，因此铺板采用新的计数方式：1.1ml细胞悬液中取100μl细胞悬液，加900μl Tryple Express消化成单细胞，进而推算出原体系里的肿瘤类器官所含的细胞数目。

步骤(3)中所述的效靶比优选为1:1、5:1或10:1；更优选为10：1。

步骤(3)中所述的培养为在37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养。

上述任一项所述的用于评估抗肿瘤活性的免疫细胞和肿瘤类器官共培养模型的构建方法构建得到的免疫细胞和肿瘤类器官共培养模型。

一种用于体外评估免疫细胞抗肿瘤活性的方法，除了包括上述步骤(1)～(3)外，还包括如下至少一个步骤：

(4)在步骤(3)中的共培养体系中加入检测肿瘤细胞死亡的示踪染料和荧光染料，然后在明场下和荧光通道下对共培养体系进行连续拍照，连续检测共培养体系里的肿瘤细胞死亡程度、γδT细胞和肿瘤类器官的相互作用，以及γδT细胞对肿瘤类器官的杀伤活性；

(5)在步骤(3)中的共培养体系中加入检测肿瘤细胞死亡的荧光染料，然后使用多功能酶标仪检测共培养体系的相对荧光值(检测细胞死亡程度)，计算和分析γδT细胞对肿瘤类器官的杀伤活性；

(6)检测步骤(3)中的共培养体系上清液中与细胞毒性相关的效应因子(杀伤生物标志物)的浓度水平，综合评估γδT细胞对肿瘤类器官的杀伤活性。

步骤(4)中所述的示踪染料优选为Celltracker红色CMTPX染料(Invitrogen，C34552)。

步骤(4)和(5)中所述的荧光染料优选为Promega Green dye，来自PromegaCellTox Green Cytotoxicty Assay(G8741)。

步骤(4)中，可先通过对γδT细胞进行示踪染料染色，随后将γδT细胞与肿瘤类器官共培养，在共培养体系加入Promega Green Dye试剂将死亡细胞染成绿色，通过荧光成像和明场成像可以连续检测γδT细胞与肿瘤类器官的相互作用。

步骤(6)中所述的检测优选为采用CBA多因子试剂盒(Biolegend，LEGENDplex，Mixand match)进行检测。

步骤(6)中所述的效应因子包括IFN-γ，Granzyme B，Perforin和TNF-α中的至少一种。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.由于肿瘤类器官具有与患者肿瘤组织高度相似的肿瘤特异性，因此本发明方法在不需要构建动物模型的前提下，仅采用肿瘤类器官与免疫细胞共培养，实现了准确评估免疫细胞抗癌的有效性，相比传统动物模型提高了操作的简便性，相比2D细胞培养模型提高了模型生理表征的表达。

2.本发明提供了一种实验研究方法，包括将γδT细胞与人源化乳腺癌或肺癌肿瘤类器官共培养，形成共培养体系，随后通过对肿瘤细胞死亡后释放的荧光信号值连续监测；此外，利用共培养体系在显微镜明场和荧光下的图片进行连续分析，同时对共培养体系上清液中与细胞毒性相关的效应因子表达水平进行检测，从而全方位对γδT细胞杀伤乳腺癌或肺癌相关肿瘤类器官的抗肿瘤活性进行系统性分析和评估。

3.本发明通过在共培养体系中加入细胞死亡检测荧光试剂和示踪染料，显微镜下明场和荧光通道下观测免疫细胞(健康人γδT细胞)和肿瘤类器官的相互作用，以及肿瘤类器官被杀伤后的细胞形态变化，并通过多功能酶标仪检测细胞死亡染料释放的相对荧光值，以及检测共培养体系上清液中的杀伤性相关生物标志物，可更为直观、准确和全面地评估免疫细胞γδT对肿瘤类器官的杀伤情况，因此，本发明提供了一种相比个人定制化精准医疗，普适性更广的免疫细胞γδT抗癌有效性评估技术手段。

4.本发明在人源化肿瘤类器官培养过程中，癌组织消化采用新的消化方式，采用Tumor Dissociation Kit(美天旎)在37℃振荡器里200rpm消化至30分钟后，取细胞悬液于显微镜下观察细胞团块以判断消化程度，相较于常规的胶原酶溶液消化方法，更有利于后续肿瘤类器官的培养。

5.本发明在共培养体系构建过程中，采用37μm Reversible Strainer细胞筛和100μmReversible Strainer细胞筛对肿瘤类器官大小进行筛选，筛选37μm～100μm之间大小相似的肿瘤类器官并进行铺板，从而减少组内孔间的差异。

6.本发明在共培养体系构建过程中，先用抗粘附试剂预包被96孔全白平底聚苯乙烯微孔板，防止人源肿瘤类器官贴壁。

7.本发明构建的γδT细胞与人源化肿瘤类器官共培养模型适用于免疫细胞抗肿瘤活性的评价，可用于评价免疫细胞γδT直接抗癌有效性，或用于评估γδT细胞介导的直接抗肿瘤活性以及间接抗肿瘤能力。

8.运用本发明方法提供的平台，可简单、直观的评价γδT细胞对肿瘤的杀伤作用，其效果能够接近人体里内的真实反应，对于临床的免疫细胞治疗具有重大价值。

附图说明

图1为扩增培养11天时γδT细胞流式图。

图2为明场下乳腺癌类器官培养的连续生长情况图；其中，A为明场下观察到的两例乳腺癌类器官生长情况(BC10和BC13，其中BC13展示第一代和传代后第二代生长情况)；B为对应的乳腺癌类器官HE和免疫组化图。

图3为明场下肺癌类器官培养的连续生长情况图；其中，A为明场下观察到的两例肺癌类器官生长情况(LC5和LC7，其中LC5展示第一代和传代后第二代生长情况)；B为对应的肺癌类器官HE和免疫组化图。

图4为γδT细胞与乳腺癌类器官共培养杀伤体系明场和荧光通道下的连续拍照观察结果图。

图5为γδT细胞与乳腺癌类器官共培养杀伤体系Green Dye相对荧光值连续检测结果图。

图6为γδT细胞与乳腺癌类器官共培养杀伤体系上清液杀伤生物标志物检测结果图。

图7为γδT细胞与肺癌类器官共培养杀伤体系明场连续拍照观察结果图。

图8为γδT细胞与肺癌类器官共培养杀伤体系Green Dye相对荧光值的连续检测与上清液杀伤生物标志物检测结果图。

图9为利用三种不同的96孔板进行肺癌肿瘤类器官与γδT细胞共培养的实验结果图。

图10为明场下观察肿瘤类器官与γδT细胞共培养实验中所用的板子是否使用抗粘附试剂的效果示意图；其中，A为未用抗粘附试剂；B为使用了抗粘附试剂。

图11为明场下观察肿瘤类器官与γδT细胞共培养实验中是否用37μm和100μmReversible Strainer细胞筛的效果示意图；其中，A为未使用37μm和100μm ReversibleStrainer细胞筛；B为已使用37μm和100μm Reversible Strainer细胞筛。

图12明场下观察组采用不同消化方式下肿瘤组织的消化情况图；其中，A为采用2mg/ml collagenaseⅣ；B为采用Tumor Dissociation Kit(美天旎)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。

在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的±5％，更典型的是所述值的±4％，更典型的是所述值的±3％，更典型的是所述值的±2％，甚至更典型的是所述值的±1％，甚至更典型的是所述值的±0.5％。

在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1～6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。

本发明所述的“抗癌活性”是指免疫细胞直接对癌细胞的杀伤效力。

实施例1外周血单核细胞(PBMC)的分离

1.将健康志愿者的血液倒入50ml离心管里，用无血清RPMI 1640培养基等体积稀释外周血，上下颠倒充分混匀；

2.取4ml人淋巴细胞分离液(Ficoll)加入到15ml尖底离心管中，沿试管壁取10ml稀释的外周血缓慢的平铺于淋巴细胞分离液的表面(4ml Ficoll+10ml等比稀释后的血液)，起初先将离心管倾斜，后逐渐将离心管直立，25℃，600g，离心25minutes(min)，升降速档位为升6降2；

3.离心后，用无菌巴氏吸管将中间白色絮状细胞层吸取至另一无菌离心管中，吸走白膜层后转移到50ml离心管中，加入等倍体积的无血清RPMI 1640培养基，上下颠倒充分混匀后，分管，离心1500rpm，离心时间15min，升降速档位调为升9降9；

4.弃去上清后，每管加入适量红细胞裂解液(天根，RT122-02)重悬细胞，常温裂解5分钟，加入5倍体积的无血清RPMI 1640培养基终止反应，用40μm筛网过滤后，分管，1500rpm离心7min，升降速档位调为升9降9；

5.弃去上清后，每管加入适量无血清RPMI 1640培养基重悬细胞(比如5ml)，1500rpm离心5min，升降速档位调为升9降9，获得PBMC细胞。

实施例2γδT细胞体外扩增培养

1.配制γδT细胞预刺激培养液(以配制50ml培养液为例)：无血清RPMI 1640培养基(Gibco)，10％(v/v)胎牛血清(FBS，购自AusGeneX，即5ml FBS)，1％(v/v)青链霉素双抗(Gibco)，1200UI/ml Human IL-2(北京四环生物制药)(现配现用)，50μM唑来膦酸(Sigma)；

2.将实施例1中获得的PBMC细胞离心、弃去上清后，用γδT细胞预刺激培养液将管底的细胞各重悬至1ml，充分缓慢混匀后，适当稀释后用血细胞计数板进行细胞计数；

3.根据day0:3.0×10⁶～4.0×10⁶cells/孔的密度计算种板的孔数，将细胞种在24孔板内；

4.配制γδT细胞培养液(以配制50ml培养液为例)：无血清RPMI 1640培养基(Gibco)，10％(v/v)FBS(AusGeneX)(即5ml FBS)，1％(v/v)青链霉素双抗(Gibco)，300UI/ml Human IL-2(北京四环生物制药)(现配现用)；

5.然后往上述接种了细胞的24孔板内加入配制好的γδT细胞预刺激培养液进行相应稀释，并加入1200UI/ml human IL-2(终浓度)，种24孔板，每孔1ml体积，种板结束后将板子进行适当混匀，使细胞在孔内分布均匀，并放入37℃培养箱里进行后续培养；

6.Day3换液一次，接种密度为3.0～4.0×10⁶cells/孔，Day3开始隔天换液一次，Day5，Day7，Day9，Day11按照1.0～2.0×10⁶cells/孔的密度进行换液调整，所用的培养液是γδT细胞培养液，换液离心条件为：Day3、转速600～800rpm，离心时间5min，后续的天数换液离心条件为：转速800～1000rpm，离心时间5min；

7.在培养到Day11天左右进行Vδ2比例检测(采用流式细胞法检测)，当比例达到85％以上时可进行后续的γδT细胞抗肿瘤活性实验；

8.实验结果：如图1所示，Day11进行Vδ2比例检测，发现比例可达94.2％，说明γδT细胞经上述培养体系进行体外扩增后，纯度高，可用于后续γδT细胞抗肿瘤活性实验。

实施例3乳腺癌/肺癌类器官培养

1.将来自于广州暨南大学附属第一医院的乳腺癌和肺癌患者的癌组织分别装入含有3ml组织保存液Tissue Storage Solution(美天旎)和100μl青链霉素双抗的离心管中，然后放入4℃样本运输箱转移到实验室后随即进行下一步处理(所有试验已通过暨南大学附属第一医院伦理委员会的批准，并获得参与者的知情同意)；

2.配制washing液，配方为：Advanced DMEM/F12培养基(Invitrogen，12634010)，Glutamax添加剂1×【即将Glutamax 100×(Gibco，35050061)稀释至1×)】，1M Hepes缓冲溶液(Gibco，15630080)，青链霉素3×(Gibco，15140122，10000U/ml)(终浓度为300U/ml)，10μM Y-27632(Rock Inhibitor)(Abmole，M1817)；

3.准备两个10cm直径的无菌培养皿，在中间滴加1ml washing液，将癌组织分别置于washing液里，无菌培养皿盖上做好标记，并进行拍照和记录；

4.用手术刀和镊子切除非上皮组织，尽可能保留癌组织，用眼科剪将癌组织分别剪成1～2mm³大小，用一次性细胞刮刀cell scraper将培养皿里的组织集中在一起，并加适量washing液和PBS液(Solarbio)冲洗培养皿，将所有组织转移到15ml离心管里；

5.离心管组织悬液静置后分层，除去上清液，将下层组织进行消化；

6.取已配好的325μl Tumor Dissociation Kit(美天旎，human，货号130-095-929)，加入4.7ml washing液，混匀获得消化液；然后根据组织大小加适量消化液，将离心管放入37℃振荡器里震荡，200rpm，消化20～40分钟；

7.等待消化至30分钟左右，取少许上清液在显微镜下观察，若消化至2～10个细胞为一个cluster(细胞群)时，终止消化，总消化时间不超过1小时；

8.终止消化时，加1倍体积以上的washing液终止消化，然后用一次性吸管吹打均匀(注意：要在终止消化后吹打)；

9.过100μm Reversible Strainer细胞筛(Stemcell)，过不了的组织块用10ml注射器泵头进行研磨；

10.过滤后的液体离心350g，5min，将筛子反过来用washing液冲洗，离心350g，5min，获得组织块，组织块进行冻存(冻存液配方为FBS：二甲基亚砜(DMSO)＝9:1，v/v)；

11.离心后去上清，加适量washing液重悬细胞沉淀至1ml，进行细胞计数；

12.将提前分装好的300μl Matrigel基质胶(Corning)放置于冰上融化，配制乳腺癌/肺癌肿瘤类器官培养液并提前恢复至室温；其中乳腺癌/肺癌肿瘤类器官培养液配方为：Advanced DMEM/F12培养基(Invitrogen，12634010)，B27添加剂1×【将B27 50×((Gibco，17504-044)稀释至1×】，Glutamax添加剂1×【即将Glutamax 100×(Gibco，35050061)稀释至1×】，Hepes(1M)缓冲液(Gibco，15630080)，青链霉素1×(Gibco，15140122，10000U/ml)(终浓度为100U/ml)，5mM烟酰胺(Sigma，N0636)，1.25mM乙酰半胱氨酸(Sigma，A9165)，5μmY-27632(Rock inhibitor)(Abmole，M1817)，500nM A83-01(Tocris，2939)，500nM SB 202190(Sigma，S7067)，5ng/ml成纤维细胞生长因子7(Peprotech，100-19-1)，20ng/ml成纤维细胞生长因子10(Peprotech，100-26-25)，5ng/ml表皮生长因子(Peprotech，AF-100-15)，100ng/ml Noggin(Novoprotein，CB89)，250ng/ml R-spondin-1(Novoprotein，CX83)，5nM Heregulinβ-1(Peprotech，100-03)，50μg/ml原代细胞抗生素Primocin(Invivogen，ant-pm-05)；

13.用24孔板进行有支架类器官培养，每孔需要3万个细胞，300μl基质胶一般种10孔，总共需要3×10⁵cells，根据所需的细胞数量取适量细胞悬液进行离心，350g，5min；

14.离心后，加适量上述配制的肿瘤类器官培养液重悬细胞沉淀(3×10⁵cells)至100μl，加入到300μl基质胶中，混匀，获得基质胶细胞混合液；

15.将过夜在培养箱里预热的24孔板取出，准备种板，每孔种40μl基质胶细胞混合液，滴在24孔板的孔正中央形成圆弧状，不要贴孔壁，也不要产生气泡，使得每孔基质胶占比75％(体积比)，注意全程在冰上操作；

16.种板结束后将板子(24孔板)正着放入37℃培养箱一分钟；

17.将板子倒置放置30min，等待基质胶凝固；

18.30min后每孔加入500μl上述配制的肿瘤类器官培养基，加培养液时枪头不要对准基质胶，防止基质胶被吹破；

19.板子做好标记，放入培养箱(37℃，5％CO₂)进行后续的类器官培养，定期进行拍照观测类器官生长情况，Day3每孔加500μl上述配制的肿瘤类器官培养基，后续换液隔天每孔吸取500μl旧培养液丢弃，并加入500μl新的肿瘤类器官培养基；

20.将乳腺癌和肺癌类器官培养过程中定期于明场下进行拍照，观察类器官生长情况；

21.实验结果：明场下两例乳腺癌类器官培养的连续生长情况(BC10和BC13)及其对应的HE和免疫组化结果如图2所示，肺癌类器官培养的连续生长情况(LC5和LC7)及其HE和免疫组化结果如图3所示。可以发现，在此肺癌/乳腺癌类器官培养体系下，肿瘤类器官可成功培养，除此之外，肿瘤类器官可成功传代和冻存，其对应的HE和免疫组化结果也表明了肿瘤的异质性，与来源组织具有极高的相似性，因此可以说明，在本发明肺癌/乳腺癌肿瘤类器官培养体系下的前处理方式、培养基和培养方式均可以成功培养肺癌/乳腺癌肿瘤类器官。

实施例4乳腺癌/肺癌肿瘤类器官传代

1.本实施例中的后续操作全程都在冰上，离心机提前预冷为4℃，washing液(同实施例3)提前预冷；

2.将实施例3中培养类器官板里的培养液吸出丢弃；

3.每孔加500μl预冷的washing液，用枪头机械性吹打每孔的基质胶，将孔内内容物转移到15ml离心管里，离心管置于冰上；

4.将离心管离心1300rpm，5min，4℃；

5.离心后去上清，加3ml预冷的washing液，用枪头上下吹打30次，取1滴溶液于镜下观察吹打程度是否达到理想消化程度，若无，则选择Tryple Express酶(Gibco，12605010)进行下一步消化；

6.将第5步的类器官溶液用37μm Reversible Strainer(Stemcell，27215)过滤，过筛后的悬液里为单细胞和较小的类器官团块，这部分细胞不需要消化，收集到15ml离心管；然后将细胞筛反过来，加washing液清洗，清洗下来的就是37μm以上体积较大的类器官团块，收集到另一37μm离心管，分别离心1300rpm，5min，4℃；

7.离心后去上清，较大团块的悬液对应的沉淀，加1ml Tryple Express酶(Gibco，12605010)，吹打重悬细胞沉淀，转移到一个干净的孔内，放入37℃培养箱进行消化，密切观察消化程度；

8.3～5min观察孔内消化情况，若未消化到2～10个细胞为1个cluster的程度，则再继续消化，总消化时间不超过15min；

9.若已经达到理想消化程度，则将孔内内容物转移到15ml离心管，用枪头对着离心管底部轻微吹打；

10.加1倍体积以上的washing液终止消化，混合第6步里离心后含有单细胞和较小类器官团块的沉淀，离心1300rpm，5min，4℃，去上清；

11.离心后，加适量肿瘤类器官培养基(同实施例3)重悬细胞沉淀至100μl，加入含有300μl的基质胶里，混匀，获得基质胶细胞混合液；

12.将过夜在培养箱里预热的24孔板取出，准备种板，每孔种40μl基质胶细胞混合液，滴在24孔板的孔正中央形成圆弧状，不要贴孔壁，也不要产生气泡，使得每孔基质胶占比75％，注意全程在冰上操作；

13.种板结束后将板子正着放入37℃培养箱一分钟；

14.将板子倒置放置30min，等待基质胶凝固；

15.30min后每孔加入500μl肿瘤类器官培养基，加培养液时枪头不要对准基质胶，防止基质胶被吹破；

16.板子做好标记，放入培养箱(37℃，5％CO₂)进行后续的类器官培养，定期进行拍照观测类器官生长情况，Day3每孔加500μl肿瘤类器官培养基，后续换液隔天每孔吸取500μl旧培养液丢弃，并加入500μl新的肿瘤类器官培养基。

实施例5乳腺癌/肺癌类器官的冻存

1.本实施例中的后续操作全程都在冰上，离心机提前预冷为4℃，washing液(同实施例3)提前预冷；

2.将实施例4中培养类器官板里的培养液吸出丢弃；

3.每孔加500μl预冷的washing液，用枪头机械性吹打每孔的基质胶，将孔内内容物转移到15ml离心管里，离心管置于冰上；

4.将离心管离心1300rpm，5min，4℃；

5.离心后去上清，加入适量冻存液(FBS：DMSO＝9:1，v/v)，重悬细胞沉淀转移到冻存管里，做好标记，放入程序冻存盒并放入-80℃，第二天将冻存管转入液氮。

实施例6乳腺癌/肺癌类器官与γδT细胞共培养实验

(一)类器官铺板

1.按实施例4中的方法将乳腺癌、肺癌类器官在进行传代后的第三天再进行铺板处理；

2.96孔全白平底聚苯乙烯微孔板(经TC处理，货号：3917)提前每孔用200μlAnti-adherence Rinsing Solution(Stemcell，07010)润洗，目的是防止后续类器官铺板后贴壁；然后将96孔板放入37℃培养箱静置一晚上，第二天用等体积PBS溶液润洗孔内，确保将孔内液体吸干并丢弃孔内液体；

3.配制1mg/ml dispase溶液：用washing液溶解dispase粉末(Sigma-Aldrich，D4693)；在肿瘤类器官板内每孔加入1mg/ml dispase溶液，枪头机械吹打后，放入37℃培养箱里孵育消化40min，加入dispase的目的在于彻底消化基质胶，避免该成分对后续共培养实验造成影响；

4.消化结束后，加入1倍体积以上的washing液(同实施例3)终止消化，机械吹打10次后，转移到离心管里，加适量PBS溶液清洗每孔并液体转移到离心管内；

5.将液体过滤100μm Reversible Strainer细胞筛(Stemcell，27270)，将小于100μm的类器官悬液再过筛37μm Reversible Strainer(Stemcell，27215)；然后将筛子反过来，用washing液冲洗，获得37μm～100μm大小的类器官，此部分类器官用于后续与γδT细胞进行共培养实验；

6.用washing液冲洗100μm Reversible Strainer细胞筛(Stemcell，27270)的反面，获得大于100μm的类器官；此部分大于100μm的类器官溶液与第5步里小于37μm的单细胞或类器官团块溶液，离心后冻存或继续种板培养；

7.第5步中获得的含有37μm～100μm的类器官悬液进行离心，4℃、1300rpm离心5min，离心后去上清，加适量γδT细胞(实施例2制备)培养液重悬至1.1ml进行计数；

8.取100μl类器官悬液，加900μl Tryple Express酶(Gibco，12605010)，放入37℃培养箱消化为单细胞，取10μl进行计数，从而推算原体系1.1ml里有多少细胞；

9.本次实验中，共培养板子含有肿瘤的孔数为12孔，所需肿瘤细胞为15000cells/孔，预留多两孔作为消耗损失，共需要15000×14＝21×10⁴cells，由于共培养每孔总体系为200μl，其中一半为肿瘤类器官悬液，故需要12×100＝2100μlγδT细胞培养液重悬相应细胞量的肿瘤类器官。

(二)γδT细胞染Celltracker：

1.将一支未拆封的50μg示踪染料Celltracker红色CMTPX染料(Invitrogen，C34552)平衡至室温；

2.加7.2854μl DMSO配制为10mM储存溶液；

3.取1μl储存溶液加9μl Advanced DMEM/F12培养基配制为1mM临时储存液；

4.用Advanced DMEM/F12培养基稀释1mM临时储存液至0.5μM工作溶液，工作溶液现配现用，用完即扔，储存溶液于-20℃避光保存；

5.预热工作溶液至37℃，重悬实施例2中制备的γδT细胞至1×10⁷cells/ml，于37℃染色45min；

6.用PBS溶液清洗两次γδT细胞，每次离心1000rpm，5min，并调整密度为3×10⁶cells/ml；

7.由于检测细胞死亡的荧光染料Promega Green dye(来自Promega CellToxGreen Cytotoxicty Assay(G8741))工作浓度为1:1000(v/v)，于是本次实验按照表1进行加样：

表1

8.将加好样的共培养板子放进培养箱(37℃，5％CO₂)培养，定期明场和荧光通道下拍照观察γδT细胞与肿瘤类器官的相互作用，并用多功能酶标仪检测Green Dye的相对荧光值；

9.到实验终点的时候，将共培养板子进行离心(500g，5min)，吸取每组上清液于EP管内放入-80℃冰箱冷冻保存，作为待测样本，后续用CBA多因子试剂盒(Biolegend，LEGENDplex，Mix and match)进行检测。

(三)共培养体系上清液用CBA多因子试剂盒检测杀伤生物标志物

1.CBA多因子试剂盒(Biolegend，LEGENDplex，Mix and match)使用前需平衡至室温，试剂盒的组分有：①冻干的标准品；②冻干的基质；③捕获微球；④检测抗体；⑤PE标记的链霉亲和素；⑥检测缓冲液；⑦洗液；⑧仪器校准微球；

2.按照说明书要求，冰上解冻待测样本；

3.试剂盒平衡至室温后，取出捕获微球，在涡旋仪上以最大速度震荡1分钟以上；

4.加250μl检测缓冲液到冻干的标准品瓶中，颠倒多次使其充分混匀，静置10分钟，将溶解的标准品转移到EP管中(实验剩余的标准品需要分装保存于-80度冰箱，一个月内用)，标记为C7；

5.拿7个新的EP管，分别标记为C6/C5/C4/C3/C2/C1/C0，每个管中加75μl检测缓冲液；

6.从C7中取25μl到C6中，吹打混匀，依次进行4倍梯度稀释，到C1为止(C0为检测缓冲液，标准品的浓度为0pg/ml)；

7.在试剂盒配套的V-bottom板子中检测的所有孔加25μl检测缓冲液；

8.标准品孔中加入对应的25μl标准品；

9.样品孔中加入对应的25μl样品；

10.捕获微球在加之前，再涡旋震荡30秒，每孔加25μl；

11.贴好封口膜，震荡仪800rpm/min，室温避光震荡孵育2小时；

12.大离心机250g，上述V-bottom板子离心5分钟；

13.离心后，立即将板子反过来，轻轻甩去液体，在干净的纸巾上轻轻扣一下，离心后孔的底部可见蓝色的微球沉淀；

14.每孔加入200μl 1×的洗液，孵育1分钟；

15.大离心机250g，板子离心5分钟；

16.离心后，立即将板子反过来，轻轻甩去液体，在干净的纸巾上轻轻扣一下，加25μl检测抗体到各孔，贴好封口膜；

17.震荡仪800rpm/min，室温避光震荡孵育1小时；

18.加25μl带有PE标记的检测抗体到各孔，贴好封口膜；

19.震荡仪800rpm/min，室温避光震荡孵育30分钟；

20.大离心机250g，板子离心5分钟；

21.轻轻甩去液体，在干净的纸巾上轻轻的扣一下；

22.每孔加入200μl 1×的洗液，孵育1分钟；

23.大离心机250g，板子离心5分钟，轻轻甩去液体，在干净的纸巾上轻轻的扣一下；

24.每孔加入150μl 1×的洗液，用枪重悬微球转到流式管/EP管，准备上机，进行流式分析，统计相关的杀伤生物标志物，如IFN-γ，Granzyme B，Perforin，TNF-α；实验设置三次重复；

25.实验结果：

图4为γδT细胞与乳腺癌类器官在效靶比为10：1的共培养体系中明场和荧光通道连续时间拍照结果。由图4的明场照片可以发现，随着时间推移，乳腺癌类器官被共培养的γδT细胞围绕，荧光通道照片显示γδT细胞被染上红色示踪染料，死亡细胞被染上绿色荧光(Green Dye)，可以看到随着时间迁移，标记着红色示踪染料的γδT细胞逐渐迁移并围绕乳腺癌肿瘤类器官，而越来越多的死亡细胞被染上绿色荧光的现象也表明此共培养体系下γδT细胞有效杀伤肿瘤类器官。

图5为γδT细胞与乳腺癌类器官的不同效靶比的共培养体系中Green Dye的相对荧光值在不同时间点的变化图。由图5可以发现，随着时间推移，各效靶比的相对荧光值不断升高(相对荧光值针对的是Green Dye)；共培养24h时，效靶比5:1和10：1与control组(0:1)相比具有更高的相对荧光值，具有统计学意义。

图6为通过CBA方法检测γδT细胞与乳腺癌类器官在不同效靶比的共培养体系中终点时间的上清液的相关杀伤生物标志物(IFN-γ，Granzyme B，Perforin，TNF-α)的浓度变化图。由图6可以发现，共培养24h时，不同效靶比的共培养体系上清液中所含的相关杀伤生物标志物均有不同程度的增加，如IFN-γ在共培养效靶比为1:1、5:1和10:1的情况下均有不同程度的增加，Granzyme B和Perforin在共培养效靶比为5：1和10:1的情况下均显著提升，而不同效靶比的共培养上清液中所含的TNF-α无明显变化。

综合图4、图5和图6可以说明，共培养24h后，效靶比为1:1、5:1和10:1的γδT细胞能有效杀伤乳腺癌肿瘤类器官。

图7为γδT细胞与肺癌类器官在效靶比为10:1的共培养体系中共培养4h和16h拍照结果。从图7的明场照片可以看出，随着时间推移，γδT细胞逐渐迁移并围绕肺癌类器官。

图8为γδT细胞与肺癌类器官的共培养体系中Green Dye的相对荧光值在不同时间点的变化，以及通过CBA方法检测该共培养体系在终点时间的上清液的相关杀伤生物标志物(IFN-γ，Granzyme B，Perforin，TNF-α)的浓度变化。从图8可以看出，随着时间推移，效靶比为10:1的共培养体系的相对荧光值与对照组相比逐渐增加(相对荧光值针对的是Green Dye)，而此共培养体系中的上清液的相关杀伤生物标志物如IFN-γ、Granzyme B和Peforin与对照组相比增加显著，TNF-α变化不明显。

结合图7和图8可以看出，共培养24h后，效靶比为10:1的γδT细胞能有效杀伤肺癌肿瘤类器官。

对比例1

方法同实施例6，区别在于肺癌肿瘤类器官与γδT细胞共培养过程中采用的96孔平板不同，设计三组实验：分别用BD96孔U型板(U Bottom Plate)(货号353077)、96孔透明圆底超低吸附微孔板(Ultra-low Attachement Plate)(货号7007)和/>96孔全白平底聚苯乙烯微孔板(Flat Bottom Plate)(经TC处理，货号：3917)完成共培养实验。其中，三种板均经过Anti-adherence Rinsing solution(Stemcell)进行处理，效靶比为E：T＝10:1。种板结束后，放入培养箱进行后续培养(37℃，5％CO2)。固定时间点于显微镜下进行明场拍照，观察共培养体系在不同板子里的分布和聚集情况。实验设置三次重复。

结果如图9所示，由图9的实验结果可以看出，用BD96孔U型板(U Bottom Plate)进行共培养实验，受重力影响，肺癌肿瘤类器官与γδT细胞集中在孔底中间，但无法清晰直观地观察γδT细胞对肿瘤类器官的相互作用；用96孔透明圆底超低吸附微孔板(Ultra-low Attachement Plate)做共培养实验，发现肿瘤类器官集中在孔底中央，虽然集中程度不如U型板的效果，另外γδT细胞均匀分布在孔的四周围，但这将导致γδT细胞无法均匀作用于肿瘤类器官，也影响观察效果；而本发明方法采用/>96孔全白平底聚苯乙烯微孔板(Flat Bottom Plate)做共培养实验，可以看到肿瘤类器官和γδT细胞均匀分布在孔的各个区域，且随着共培养实验推移，γδT细胞逐渐迁徙到肿瘤类器官周围，进行相互作用。因此，在肿瘤类器官与γδT细胞的共培养实验中，运用/>96孔全白平底聚苯乙烯微孔板有利于细胞的相互作用，达到最佳肿瘤类器官与γδT共培养效果，也达到更好的观察效果。

对比例2

方法同实施例6，区别在于免疫细胞与乳腺癌类器官共培养体系构建过程中，不加入抗粘附试剂Anti-adherence Rinsing Solution(Stemcell)预包被96孔全白平底聚苯乙烯微孔板(经TC处理，货号：3917)，取而代之的是每孔加入同等体积的PBS缓冲液；其中，效靶比为E：T＝10:1。实验设置三次重复。

结果如图10所示：由图10可以看到，乳腺癌肿瘤类器官与γδT细胞共培养实验中所用的板子在未使用抗粘附试剂时将发生肿瘤类器官的贴壁，贴壁使得乳腺癌肿瘤类器官成为贴壁细胞(图10A)；而在使用了抗粘附试剂后将很好地避免了肿瘤类器官的贴壁现象，保持了其3D体外生长模式(图10B)。

对比例3

方法同实施例6，区别在于免疫细胞与肺癌类器官共培养体系构建过程中，不使用37μmReversible Strainer细胞筛和100μm Reversible Strainer细胞筛对肿瘤类器官大小进行筛选；其中，效靶比为E：T＝10:1。实验设置三次重复。

结果如图11所示，由图11可以看到，在肺癌肿瘤类器官与γδT细胞共培养实验中，若不使用37μm和100μm Reversible Strainer进行过筛铺板，所获得的肺癌肿瘤类器官体积大小相差甚大，增加组内孔间的差异，增加实际检测结果的误差(图11A)；而本发明在使用37μm和100μm Reversible Strainer进行过筛铺板后，筛选37μm～100μm之间大小相似的肿瘤类器官并进行铺板，所获得的肿瘤类器官体积相差不大，有效减少了组内孔间与组间的差异(图11B)。

对比例4

方法同实施例3，区别在于，肿瘤类器官培养过程中，将Tumor Dissociation kit(美天旎)更换为传统消化方式(参考文献：Bhatia S,Kramer M,Russo S,et al.Patient-derived triple-negative breast cancer organoids provide robust model systemsthat recapitulate tumor intrinsic characteristics[J].Cancer Res,2022,82(7):1174-1192.)对原代癌组织进行消化，即在原代肿瘤组织加入终浓度为2mg/ml的胶原酶Ⅳ(collagenaseⅣ)，于37℃环境下轻微震荡45～90分钟。类器官培养过程中定期于明场下进行拍照，观察类器官生长情况，其与步骤与实施例3相同。设置三次重复。

结果如图12所示，图12展示的是乳腺癌类器官培养前处理流程示意图。由图12可以看到，采用常规培养类器官的传统消化方式对原代乳腺癌组织进行消化，明场下观察发现消化程度不容易控制，组织容易消化过度，导致产生过多的单细胞，不利于后续乳腺癌肿瘤类器官的培养(图12A)；而本发明采用新的消化方式，即用Tumor Dissociation kit(美天旎)在振荡器里以37℃、200rpm震荡消化30min左右，取细胞悬液于显微镜下观察细胞团块以判断消化程度，可获得良好的消化效果，消化产生的更多是细胞团块，而不是单细胞，有利于后续肿瘤类器官的培养(图12B)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于评估抗肿瘤活性的免疫细胞和肿瘤类器官共培养模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)从健康人外周血中分离外周血单核细胞，然后经γδT细胞预刺激培养和扩增培养，得到γδT细胞；

(2)将肿瘤患者来源的肿瘤组织利用肿瘤组织解离试剂盒Tumor Dissociation Kit于37℃、180～220rpm条件下消化20～60分钟，然后将消化后的肿瘤细胞过100μm细胞筛，并将肿瘤细胞离心收集后与基质胶混合均匀，加入类器官培养基进行类器官培养和传代培养，再采用37μm和100μm细胞筛对肿瘤类器官大小进行筛选，筛选得到37μm～100μm的人源化肿瘤类器官；

(3)采用抗粘附试剂预包被Corning 96孔全白平底聚苯乙烯微孔板，然后将步骤(2)中得到的人源化肿瘤类器官进行铺板处理，计数后再与步骤(1)中得到的γδT细胞按效靶比为1～10：1混合形成共培养体系，放入培养箱进行培养，得到所述用于评估抗肿瘤活性的免疫细胞和肿瘤类器官共培养模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的效靶比为1:1、5:1或10：1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的γδT细胞预刺激培养所用的培养液为γδT细胞预刺激培养液，其配方如下：无血清RPMI 1640培养基，体积百分比10％的胎牛血清，体积百分比1％的青链霉素双抗，1200UI/ml Human IL-2，50μM唑来膦酸；

步骤(1)中所述的扩增培养所用的培养液为γδT细胞培养液，其配方如下：无血清RPMI1640培养基，体积百分比10％的胎牛血清，体积百分比1％的青链霉素双抗，300UI/mlHuman IL-2；

步骤(2)中所述的消化所用的消化液通过如下方法制备得到：将325μl TumorDissociation Kit和4.7ml washing液混合均匀，得到消化液；其中，washing液配方如下：Advanced DMEM/F12培养基，Glutamax添加剂1×，1M Hepes缓冲溶液，青链霉素3×，10μMY-27632；

步骤(2)中所述的类器官培养基的配方如下：Advanced DMEM/F12培养基，B27添加剂1×，Glutamax添加剂1×，1M Hepes缓冲液，青链霉素1×，5mM烟酰胺，1.25mM乙酰半胱氨酸，5μm Y-27632，500nM A83-01，500nM SB 202190，5ng/ml成纤维细胞生长因子7，20ng/ml成纤维细胞生长因子10，5ng/ml表皮生长因子，100ng/ml Noggin，250ng/ml R-spondin-1，5nM Heregulinβ-1，50μg/ml原代细胞抗生素Primocin。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的预刺激培养和扩增培养为采用24孔板进行培养，预刺激培养和扩增培养的总时间为11～13天；其中，预刺激培养的接种密度为3.0×10⁶～4.0×10⁶cells/孔，扩增培养的接种密度为1.0×10⁶～4.0×10⁶cells/孔。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的100μm细胞筛为100μm Reversible Strainer细胞筛；

步骤(2)中所述的37μm细胞筛为37μm Reversible Strainer细胞筛；

步骤(2)中所述的基质胶为Matrigel基质胶；

步骤(3)中所述的抗粘附试剂为Anti-adherence Rinsing Solution。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的肿瘤为恶性肿瘤；

步骤(2)中所述的消化的时间为20～40分钟；

步骤(3)中所述的培养为在37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的肿瘤为乳腺癌或肺癌；

步骤(2)中所述的消化的时间为30分钟。

8.权利要求1～7任一项所述的用于评估抗肿瘤活性的免疫细胞和肿瘤类器官共培养模型的构建方法构建得到的免疫细胞和肿瘤类器官共培养模型。

9.一种用于体外评估免疫细胞抗肿瘤活性的方法，其特征在于：包括权利要求1～7任一项中所述的步骤(1)～(3)，以及如下至少一个步骤：

(4)在步骤(3)中的共培养体系中加入检测肿瘤细胞死亡的示踪染料和荧光染料，然后在明场下和荧光通道下对共培养体系进行连续拍照，连续检测共培养体系里的肿瘤细胞死亡程度、γδT细胞和肿瘤类器官的相互作用，以及γδT细胞对肿瘤类器官的杀伤活性；

(5)在步骤(3)中的共培养体系中加入检测肿瘤细胞死亡的荧光染料，然后使用多功能酶标仪检测共培养体系的相对荧光值，计算和分析γδT细胞对肿瘤类器官的杀伤活性；

(6)检测步骤(3)中的共培养体系上清液中与细胞毒性相关的效应因子的浓度水平，综合评估γδT细胞对肿瘤类器官的杀伤活性。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的示踪染料为Celltracker红色CMTPX染料；

步骤(4)和(5)中所述的荧光染料为Promega Green dye；

步骤(6)中所述的检测为采用CBA多因子试剂盒进行检测；

步骤(6)中所述的效应因子包括IFN-γ，Granzyme B，Perforin和TNF-α中的至少一种。