JP6693865B2 - 植物の生育を刺激し、植物を保護し、および、植物上にバチルスの芽胞を固定するための融合タンパク質および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2013年3月15日に出願された米国仮特許出願第61/799,262号の利益を主張し、その全体が、参照により本明細書に援用される。
本明細書において、「1つの」(a、an、one)、「当該」(the)、および「上述の」(said)が用いられる場合、その意味は、他で示されない限り、「少なくとも1つ」または「1以上」である。
本発明は、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片、および、少なくとも1つの植物生育刺激タンパク質またはペプチドを含有する融合タンパク質に関するものであり、ここで、当該植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、ペプチドホルモン、非ホルモン性ペプチド、または、植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素を含有する。標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、上述の[0005]段落に記述される標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片のいずれかであっても良い。
リンカー無し:配列番号1−融合パートナータンパク質
アラニンリンカー:配列番号1−An−融合パートナータンパク質
グリシンリンカー:配列番号1−Gn−融合パートナータンパク質
混合アラニンおよびグリシンリンカー:配列番号1−(A/G)n−融合パートナータンパク質
ここで、An、Gn、および(A/G)nは、それぞれ、任意の数のアラニン、任意の数のグリシン、または、任意の数のアラニンとグリシンの混合物である。たとえば、nは、1〜25、好ましくは6〜10であっても良い。リンカーがアラニン残基とグリシン残基の混合物を含有する場合、グリシン残基とアラニン残基の任意の組み合わせを用いても良い。上述の構造において、「融合パートナータンパク質」とは、植物生育刺激タンパク質もしくはペプチド、病原体から植物を防御するタンパク質もしくはペプチド、植物におけるストレス耐性を増強するタンパク質もしくはペプチド、または、植物結合タンパク質もしくはペプチドを表す。
上述のように、本発明は、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片、および、植物生育刺激タンパク質またはペプチドを少なくとも1つ含有する融合タンパク質に関するものであり、ここで、当該植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、ペプチドホルモン、非ホルモン性ペプチド、または、植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素を含有する。
本発明は、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片、および、病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドを少なくとも1つ含有する融合タンパク質に関するものである。
ospora hayi、Cercospora hydrangea、Cercospora kikuchii、Cercospora lentis、Cercospora liquidambaris、Cercospora longipes、Cercospora longissima、Cercospora mamaonis、Cercospora mangiferae、Cercospora medicaginis、Cercospora melongenae、Cercospora minima、Cercospora minuta、Cercospora nicotianae、Cercospora odontoglossi、Cercospora papaya、Cercospora penniseti、Cercospora pisa−sativae、Cercospora platanicola、Cercospora puderii、Cercospora pulcherrima、Cercospora rhapidicola、Cercospora rosicola、Cercospora rubrotincta、Cercospora sojina、Cercospora solani、Cercospora solani−tuberosi、Cercospora sorghi、Cercospora theae、Cercospora tuberculans、Cercospora vexans、Cercospora vicosae、Cercospora zeae−maydis、Cercospora zebrina、Cercospora zonata、Cercosporella rubi、Cereal cyst nematode、Ceriporia spissa、Ceriporia xylostromatoides、Cerrena unicolor、Ceuthospora lauri、Choanephora、Choanephora cucurbitarum、Choanephora infundibulifera、Chondrostereum purpureum、Chrysomyxa ledi var. rhododendri、Chrysomyxa ledicola、Chrysomyxa 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cereale、Colletotrichum crassipes、Colletotrichum dematium、Colletotrichum dematium f. spinaciae、Colletotrichum derridis、Colletotrichum destructivum、Colletotrichum fragariae、Colletotrichum gossypii、Colletotrichum higginsianum、Colletotrichum kahawae、Colletotrichum lindemuthianum、Colletotrichum lini、Colletotrichum mangenotii、Colletotrichum musae、Colletotrichum nigrum、Colletotrichum orbiculare、Colletotrichum pisi、Colletotrichum sublineolum、Colletotrichum trichellum、Colletotrichum trifolii、Colletotrichum truncatum、Coniella castaneicola、Coniella diplodiella、Coniella fragariae、Coniothecium chomatosporum、Coniothyrium celtidis−australis、Coniothyrium henriquesii、Coniothyrium rosarum、Coniothyrium wernsdorffiae、Coprinopsis psychromorbida、Cordana johnstonii、Cordana musae、Coriolopsis floccose、Coriolopsis gallica、Corticium invisum、Corticium penicillatum、Corticium theae、Coryneopsis rubi、Corynespora cassiicola、Coryneum rhododendri、Crinipellis sarmentosa、Cronartium ribicola、Cryphonectriaceae、Cryptocline 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pseudotsugae、Diaporthaceae、Diaporthe、Diaporthe arctii、Diaporthe citri、Diaporthe dulcamarae、Diaporthe eres、Diaporthe helianthi、Diaporthe lagunensis、Diaporthe lokoyae、Diaporthe melonis、Diaporthe orthoceras、Diaporthe perniciosa、Diaporthe phaseolorum、Diaporthe phaseolorum var. caulivora、Diaporthe phaseolorum var. phaseolorum、Diaporthe phaseolorum var. sojae、Diaporthe rudis、Diaporthe tanakae、Diaporthe toxica、Dibotryon morbosum、Dicarpella dryina、Didymella bryoniae、Didymella fabae、Didymella lycopersici、Didymosphaeria arachidicola、Didymosphaeria taiwanensis、Dilophospora alopecuri、Dimeriella sacchari、Diplocarpon earlianum、Diplocarpon mali、Diplocarpon mespili、Diplocarpon rosae、Diplodia laelio−cattleyae、Diplodia manihoti、Diplodia paraphysaria、Diplodia theae−sinensis、Discosia artocreas、Guignardia fulvida、Discostroma corticola、Distocercospora、Distocercospora livistonae、Ditylenchus、Ditylenchus africanus、Ditylenchus angustus、Ditylenchus destructor、Ditylenchus dipsaci、Dolichodorus heterocephalus、Dothideomycetes、Dothiorella aromatic、Dothiorella dominicana、Dothiorella gregaria、Dothiorella ulmi、Drechslera avenacea、Drechslera campanulata、Dre
chslera dematioidea、Drechslera gigantea、Drechslera glycines、Drechslera musae−sapientium、Drechslera teres f. maculate、Drechslera wirreganensis、Durandiella pseudotsugae、Eballistra lineata、Eballistra oryzae、Eballistraceae、Echinodontium tinctorium、Ectendomeliola、Elsinoe ampelina、Elsinoe australis、Elsinoe batatas、Elsinoe brasiliensis、Elsinoe fawcettii、Elsinoe leucospila、Elsinoe mangiferae、Elsinoe piri、Elsinoe randii、Elsinoe rosarum、Elsinoe sacchari、Elsinoe theae、Elsinoe veneta、Endomeliola、Endothia radicalis、Endothiella gyrosa、Entoleuca mammata、Entorrhizomycetes、Entyloma ageratinae、Entyloma dahlia、Entyloma ellisii、Epicoccum nigrum、Ergot、Erwinia、Erwinia chrysanthemi、Erwinia psidii、Erysiphaceae、 Erysiphales、Erysiphe、Erysiphe alphitoides、Erysiphe betae、Erysiphe brunneopunctata、Erysiphe cichoracearum、Erysiphe cruciferarum、Erysiphe flexuosa、Erysiphe graminis f. sp. avenae、Erysiphe graminis f.sp. tritici、Erysiphe heraclei、Erysiphe pisi、Eutypella parasitica、Eutypella scoparia、Exobasidium 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oxysporum f.sp. pisi、Fusarium oxysporum f.sp. radicis−lycopersici、Fusarium pallidoroseum、Fusarium proliferatum、Fusarium redolens、Fusarium sacchari、Fusarium solani f.sp. pisi、Fusarium sporotrichioides、Fusarium subglutinans、Fusarium sulphureum、Fuscoporia torulosa、Fusicladium pisicola、Fusicoccum aesculi、Fusicoccum amygdali、Gaeumannomyces graminis var tritici、Gaeumannomyces graminis var. avenae、Gaeumannomyces graminis var. graminis、Galactomyces candidum、Ganoderma brownii、Ganoderma lobatum、Ganoderma orbiforme、Ganoderma philippii、Ganoderma tornatum、Ganoderma zonatum、Geastrumia polystigmatis、Georgefischeriaceae、Georgefischeriales、Geosmithia morbida、Geotrichum、Geotrichum candidum、Geotrichum candidum var. citri−aurantii、Geotrichum klebahnii、Gibberella、Gibberella acuminata、Gibberella avenacea、Gibberella baccata、Gibberella cyanogena、Gibberella fujikuroi、Gibberella fujikuroi var. subglutinans、Gibberella intricans、Gibberella pulicaris、Gibberella stilboides、Gibberella xylarioides、Gibberella zeae、Gibellina cerealis、Gilbertella persicaria、Gjaerumiaceae、Gliocladium vermoeseni、Globodera pallida、Globodera rostochiensis、Globodera tabacum、Gloeocercospora sorghi、Gloeocystidiellum porosum、Gloeophyllum mexicanum、Gloeophyllum trabeum、Gloeoporus dichrous、Gloeosporium cattleyae、Gloeosporium theae−sinensis、Glomerella cingulate、Glomerella glycines、Glomerella graminicola、Glomerella tucumanensis、Gnomonia caryae、Gnomonia comari、Gnomonia dispora、Gnomonia iliau、Gnomonia leptostyla、Gnomonia nerviseda、Gnomonia rubi、Golovinomyces cichoracearum var. latisporus、Granulobasidium vellereum、Graphiola phoenicis、Graphium rigidum、Graphium rubrum、Graphyllium pentamerum、Grovesinia pyramidalis、Guignardia bidwellii f. muscadinii、Guignardia camelliae、Guignardia citricarpa、Guignardia mangiferae、Guignardia musae、Guignardia philoprina、Gummosis、Gymnoconia nitens、Gymnopus dryophilus、Gymnosporangium clavipes、Gymnosporangium sabinae、Gymnosporangium globosum、Gymnosporangium juniperi−virginianae、Gymnosporangium kernianum、Gymnosporangium nelsonii、Gymnosporangium yamadae、Haematonectria haematococca、Hansenula subpelliculosa、Hapalosphaeria deformans、Haplobasidion musae、Haustorium、Helicobasidium compactum、Helicobasidium longisporum、Helicobasidium purpureum、Helicoma muelleri、Helicotylenchus、Helicotylenchus dihystera、Helicotylenchus multicinctus、Helminthosporium cookei、Helminthosporium papulosum、Helminthosporium solani、Helotiales、Hemicriconemoides kanayaensis、Hemicriconemoides mangiferae、Hemicycliophora arenaria、Hemlock woolly adelgid、Hendersonia creberrima、Hendersonia theicola、Hericium coralloides、Heterobasidion annosum、Heterodera、Heterodera amygdali、Heterodera arenaria、Heterodera aucklandica、Heterodera avenae、Heterodera bergeniae、Heterodera bifenestra、Heterodera cacti、Heterodera cajani、Heterodera canadensis、Heterodera cardiolata、Heterodera carotae、Heterodera ciceri、Heterodera cruciferae、Heterodera delvii、Heterodera elachista、Heterodera filipjevi、Heterodera gambiensis、Heterodera goettingiana、Heterodera hordecalis、Heterodera humuli、Heterodera latipons、Heterodera medicaginis、Heterodera oryzae、Heterodera oryzicola、Heterodera rosii、Heterodera sacch
ari、Heterodera schachtii、Heterodera tabacum、Heterodera trifolii、Heteroderidae、Hexagonia hydnoides、Hirschmanniella oryzae、Hoplalaimus galeatus、Hoplolaimidae、Hoplolaimus columbus、Hoplolaimus indicus、Hoplolaimus magnistylus、Hoplolaimus pararobustus、Hoplolaimus seinhorsti、Hoplolaimus uniformis、Huanglongbing、Hyaloperonospora、Hyaloperonospora arabidopsidis、Hyaloperonospora brassicae、Hyaloperonospora parasitica、Hymenula affinis、Hyphodermella corrugata、Hyphodontia aspera、Hyphodontia sambuci、Hypochnus、Hypoxylon tinctor、Idriella lunata、Inonotus arizonicus、Inonotus cuticularis、Inonotus dryophilus、Inonotus hispidus、Inonotus ludovicianus、Inonotus munzii、Inonotus tamaricis、Irenopsis、Irpex destruens、Irpex lacteus、Isariopsis clavispora、Johncouchia mangiferae、Kabatiella caulivora、Kabatiella lini、Karnal bunt、Khuskia oryzae、Kretzschmaria deusta、Kretzschmaria zonata、Kuehneola uredinis、Kutilakesa pironii、Labrella coryli、Laeticorticium roseum、Laetiporus baudonii、Lagenocystis radicicola、Laricifomes officinalis、Lasiodiplodia theobromae、Leandria momordicae、Leifsonia xyli xyli、Lentinus tigrinus、Lenzites betulina、Lenzites elegans、Lepteutypa cupressi、Leptodontidium elatius var. elatius、Leptographium microsporum、Leptosphaeria acuta、Leptosphaeria cannabina、Leptosphaeria coniothyrium、Leptosphaeria libanotis、Leptosphaeria lindquistii、Leptosphaeria maculans、Leptosphaeria musarum、Leptosphaeria pratensis、Leptosphaeria sacchari、Leptosphaeria woroninii、Leptosphaerulina crassiasca、Leptosphaerulina trifolii、Leptothyrium nervisedum、Leptotrochila medicaginis、Leucocytospora leucostoma、Leucostoma auerswaldii、Leucostoma kunzei、Leucostoma persoonii、Leveillula compositarum f. helianthi、Leveillula leguminosarum f. lentis、Leveillula taurica、Ligniera pilorum、Limacinula tenuis、Linochora graminis、Longidorus africanus、Longidorus maximus、Longidorus sylphus、Lopharia crassa、Lophodermium、Lophodermium aucupariae、Lophodermium schweinitzii、Lophodermium seditiosum、Macrophoma mangiferae、Macrophoma theicola、Macrophomina phaseolina、Macrosporium cocos、Magnaporthe、Magnaporthe grisea、Magnaporthe salvinii、Mamianiella coryli、Marasmiellus cocophilus、Marasmiellus inoderma、Marasmiellus scandens、Marasmiellus stenophyllus、Marasmius crinis−equi、Marasmius sacchari、Marasmius semiustus、Marasmius stenophyllus、Marasmius tenuissimus、Massarina walkeri、Mauginiella scaettae、Melampsora、Melampsora lini var. lini、Melampsora medusae、Melampsora occidentalis、Melanconis carthusiana、Melanconium juglandinum、Meliola、Meliola mangiferae、Meliolaceae、Meloidogyne acronea、Meloidogyne arenaria、Meloidogyne artiellia、Meloidogyne brevicauda、Meloidogyne chitwoodi、Meloidogyne enterolobii、Meloidogyne fruglia、Meloidogyne gajuscus、Meloidogyne incognita、Meloidogyne javanica、Meloidogyne naasi、Meloidogyne partityla、Meloidogyne thamesi、Meripilus giganteus、Merlinius brevidens、Meruliopsis ambigua、Mesocriconema xenoplax、Microascus brevicaulis、Microbotryum violaceum、Microdochium bolleyi、Microdochium dimerum、Microdochium panattonianum、Microdochium phragmitis、Microsphaera、Microsphaera coryli、Microsphaera diffusa、Microsphaera ellisii、Microsphaera euphorbiae、Microsphaera hommae、Microsphaera penicillata、Microsphaera penicillata var. vaccinii、Microsphaera vaccinii、Microsphaera verruculosa、Microstroma juglandis、Moesziomyces bullatus、Monilinia azaleae、Monilinia fructicola、Monilinia fructigena、Monilinia laxa、Monilinia mali、Moniliophthora perniciosa、Moniliophthora roreri、Monilochaetes infuscans、Monochaetia coryli、Monochaetia mali、Monographella albescens、Monographella cucumerina、Monographella nivalis var. neglecta、Monographella nivalis var. nivalis、Mononegavirales、Monosporascus cannonballus、Monosporascus eutypoides、Monostichella coryli、Mucor circinelloides、Mucor hiemalis、Mucor hiemalis f. silvaticus、Mucor mucedo、Mucor paronychius、Mucor piriformis、Mucor racemosus、Mycena citricolor、Mycena maculate、Mycocentrospora acerina、Mycoleptodiscus terrestris、Mycosphaerella angulata、Mycosphaerella arachidis、Mycosphaerella areola、Mycosphaerella berkeleyi、Mycosphaerella bolleana、Mycosphaerella brassicicola、Mycosphaerella caricae、Mycosphaerella caryigena、Mycosphaerella cerasella、Mycosphaerella citri、Mycosphaerella coffeicola、Mycosphaerella confusa、Mycosphaerella cruenta、Mycosphaerella dendroides、Mycosphaerella eumusae、Mycosphaerella fragariae、Mycosphaerella gossypina、Mycosphaerella graminicola、Mycosphaerella henningsii、Mycosphaerella horii、Mycosphaerella juglandis、Mycosphaerella lageniformis、Mycosphaerella linicola、Mycosphaerella louisianae、Mycosphaerella musae、Mycosphaerella musicola、Mycosphaerella palmicola、Mycosphaerella pinodes、Mycosphaerella pistaciarum、Mycosphaerella pistacina、Mycosphaerella platanifolia、Mycosphaerella polymorpha、Mycosphaerella pomi、Mycosphaerella punctiformis、Mycosphaerella pyri、Didymella rabiei、Mycosphaerella recutita、Mycosphaerella rosicola、Mycosphaerella rubi、Mycosphaerella stigmina−platani、Mycosphaerella striatiformans、Mycovellosiella concors、Mycovellosiella fulva、Mycovellosiella koepkei、Mycovellosiella vaginae、Myriogenospora aciculispora、Myrothecium roridum、Myrothecium verrucaria、Nacobbus aberrans、Nacobbus dorsalis、Naevala perexigua、Naoh
idemyces vaccinii、Nectria、Nectria cinnabarina、Nectria coccinea、Nectria ditissima、ectria foliicola、Nectria mammoidea var. rubi、Nectria mauritiicola、Nectria peziza、Nectria pseudotrichia、Nectria radicicola、Nectria ramulariae、Nectriella pironii、Nemania diffusa、Nemania serpens var. serpens、Nematospora coryli、Neocosmospora vasinfecta、Neodeightonia phoenicum、Neoerysiphe、Neofabraea malicorticis、Neofabraea perennans、Neofusicoccum mangiferae、Neonectria galligena、Oidiopsis gossypii、Oidium(属)、Oidium arachidis、Oidium caricae−papayae、Oidium indicum、Oidium mangiferae、Oidium manihotis、Oidium tingitaninum、Olpidium brassicae、Omphalia tralucida、Oncobasidium theobromae、Onnia tomentosa、Ophiobolus anguillides、Ophiobolus cannabinus、Ophioirenina、Ophiostoma ulmi、Ophiostoma wageneri、Ovulariopsis papayae、Ovulinia azaleae、Ovulitis azaleae、Oxyporus corticola、Oxyporus latemarginatus、Oxyporus populinus、Oxyporus similis、Ozonium texanum var. parasiticum、Paecilomyces fulvus、Paralongidorus maximus、Paratrichodorus christiei、Paratrichodorus minor、Paratylenchus curvitatus、Paratylenchus elachistus、Paratylenchus hamatus、Paratylenchus macrophallus、Paratylenchus microdorus、Paratylenchus projectus、Paratylenchus tenuicaudatus、Pathovar、Pauahia、Peach latent mosaic viroid、Pectobacterium carotovorum、Peltaster fructicola、Penicillium aurantiogriseum、Penicillium digitatum、Penicillium expansum、Penicillium funiculosum、Penicillium glabrum、Penicillium italicum、Penicillium purpurogenum、Penicillium ulaiense、Peniophora、Peniophora albobadia、Peniophora cinerea、Peniophora quercina、Peniophora sacrata、Perenniporia fraxinea、Perenniporia fraxinophila、Perenniporia medulla−panis、Perenniporia subacida、Periconia circinata、Periconiella cocoes、Peridermium californicum、Peronosclerospora miscanthi、Peronosclerospora sacchari、Peronosclerospora sorghi、Peronospora、Peronospora anemones、Peronospora antirrhini、Peronospora arborescens、Peronospora conglomerata、Peronospora destructor、Peronospora dianthi、Peronospora dianthicola、Peronospora farinosa、Peronospora farinosa f.sp. betae、Peronospora hyoscyami f.sp. tabacina、Peronospora manshurica、Peronospora potentillae、Peronospora sparsa、Peronospora trifoliorum、Peronospora valerianellae、Peronospora viciae、Pestalosphaeria concentrica、Pestalotia longiseta、Pestalotia longisetula、Pestalotia rhododendri、Pestalotiopsis、Pestalotiopsis adusta、Pestalotiopsis arachidis、Pestalotiopsis disseminata、Pestalotiopsis guepini、Pestalotiopsis leprogena、Pestalotiopsis longiseta、Pestalotiopsis mangiferae、Pestalotiopsis palmarum、Pestalotiopsis sydowiana、Pestalotiopsis theae、Pestalotiopsis versicolor、Phacidiopycnis padwickii、Phacidium infestans、Phaeochoropsis mucosa、Phaeocytostroma iliau、Phaeocytostroma sacchari、Phaeoisariopsis bataticola、Phaeolus schweinitzii、Phaeoramularia angolensis、Phaeoramularia dissiliens、Phaeoramularia heterospora、Phaeoramularia manihotis、Phaeoseptoria musae、Phaeosphaerella mangiferae、Phaeosphaerella theae、Phaeosphaeria avenaria f.sp. avenaria、Phaeosphaeria avenaria f.sp. triticae、Phaeosphaeria herpotrichoides、Phaeosphaeria microscopica、Phaeosphaeria nodorum、Phaeosphaeriopsis obtusispora、Phaeotrichoconis crotalariae、Phakopsora gossypii、Phakopsora pachyrhizi、Phanerochaete allantospora、Phanerochaete arizonica、Phanerochaete avellanea、Phanerochaete burtii、Phanerochaete carnosa、Phanerochaete chrysorhizon、Phanerochaete radicata、Phanerochaete salmonicolor、Phanerochaete tuberculata、Phanerochaete velutina、Phellinus ferreus、Phellinus gilvus、Phellinus igniarius、Phellinus pini、Phellinus pomaceus、Phellinus weirii、Phialophora asteris、Phialophora cinerescens、Phialophora gregata、Phialophora tracheiphila、Phloeospora multimaculans、Pholiota variicystis、Phoma、Phoma caricae−papayae、Phoma clematidina、Phoma costaricensis、Phoma cucurbitacearum、Phoma destructiva、Phoma draconis、Phoma eupyrena、Phoma exigua、Phoma exigua var. exigua、Phoma exigua var. foveata、Phoma exigua var. linicola、Phoma glomerata、Phoma glycinicola、Phoma herbarum、Phoma insidiosa、Phoma medicaginis、Phoma microspora、Phoma nebulosa、Phoma oncidii−sphacelati、Phoma pinodella、Phoma scabra、Phoma sclerotioides、Phoma strasseri、Phoma tracheiphila、Phomopsis arnoldiae、Phomopsis asparagi、Phomopsis asparagicola、Phomopsis azadirachtae、Phomopsis cannabina、Phomopsis caricae−papayae、Phomopsis coffeae、Phomopsis elaeagni、Phomopsis ganjae、Phomopsis javanica、Phomopsis lokoyae、Phomopsis mangiferae、Phomopsis obscurans、Phomopsis perseae、Phomopsis prunorum、Phomopsis scabra、Phomopsis sclerotioides、Phomopsis tanakae、Phomopsis theae、Photoassimilate、Phragmidium、Phragmidium mucronatum、Phragmidium rosae−pimpinellifoliae、Phragmidium rubi−idaei、Phragmidium violaceum、Phyllachora cannabis、Phyllachora graminis var. graminis、Phyllachora gratissima、Phyllachora musicola、Phyllachora pomigena、Phyllachora sacchari、Phyllactinia、Phyllactinia angulata、Phyllactinia guttata、Phyllody、Phyllosticta、Phyllosticta alliariaefoliae、Phyllosticta anacardiacearum、Phyllosticta arachidis−hypogaeae、Phyllosticta batatas、Phyllosticta capitalensis、Phyllosticta caricae−papayae、Phyllosticta carpogena、Phyllosticta circumscissa、Phyllosticta coffeicola、Phyllosticta concentrica、Phyllosticta co
ryli、Phyllosticta cucurbitacearum、Phyllosticta cyclaminella、Phyllosticta erratica、Phyllosticta hawaiiensis、Phyllosticta lentisci、Phyllosticta manihotis、Phyllosticta micropuncta、Phyllosticta mortonii、Phyllosticta nicotianae、Phyllosticta palmetto、Phyllosticta penicillariae、Phyllosticta perseae、Phyllosticta platani、Phyllosticta pseudocapsici、Phyllosticta sojaecola、Phyllosticta solitaria、Phyllosticta theae、Phyllosticta theicola、Phymatotrichopsis omnivora、Physalospora abdita、Physalospora disrupta、Physalospora perseae、Physarum cinereum、Physoderma alfalfae、Physoderma leproides、Physoderma trifolii、Physopella ampelopsidis、Phytophthora、Phytophthora alni、Phytophthora boehmeriae、Phytophthora cactorum、Phytophthora cajani、Phytophthora cambivora、Phytophthora capsici、Phytophthora cinnamomi、Phytophthora citricola、Phytophthora citrophthora、Phytophthora cryptogea、Phytophthora drechsleri、Phytophthora erythroseptica、Phytophthora fragariae、Phytophthora fragariae var. rubi、Phytophthora gallica、Phytophthora hibernalis、Phytophthora infestans、Phytophthora inflata、Phytophthora iranica、Phytophthora katsurae、Phytophthora kernoviae、Phytophthora lateralis、Phytophthora medicaginis、Phytophthora megakarya、Phytophthora megasperma、Phytophthora nicotianae、Phytophthora palmivora、Phytophthora phaseoli、Phytophthora plurivora、Phytophthora ramorum、Phytophthora sojae、Phytophthora syringae、Phytophthora tentaculata、Phytoplasma、Pichia membranifaciens、Pichia subpelliculosa、Pileolaria terebinthi、Pilidiella quercicola、Plasmodiophora brassicae、Plasmopara、Plasmopara halstedii、Plasmopara helianthi f. helianthi、Plasmopara lactucae−radicis、Plasmopara nivea、Plasmopara obducens、Plasmopara penniseti、Plasmopara pygmaea、Plasmopara viticola、Platychora ulmi、Plenodomus destruens、Plenodomus meliloti、Pleochaeta、Pleosphaerulina sojicola、Pleospora alfalfae、Pleospora betae、Pleospora herbarum、Pleospora lycopersici、Pleospora tarda、Pleospora theae、Pleurotus dryinus、Podosphaera、Podosphaera clandestina var. clandestine、Podosphaera fusca、Podosphaera leucotricha、Podosphaera macularis、Podosphaera pannosa、Podosphaera tridactyla、Podosphaera tridactyla var. tridactyla、Podosphaera xanthii、Polymyxa graminis、Polyscytalum pustulans、Polystigma fulvum、Poria hypobrunnea、Postia tephroleuca、Potato cyst nematode、Pratylenchus alleni、Pratylenchus brachyurus、Pratylenchus coffeae、Pratylenchus crenatus、Pratylenchus dulscus、Pratylenchus fallax、Pratylenchus flakkensis、Pratylenchus goodeyi、Pratylenchus hexincisus、Pratylenchus loosi、Pratylenchus minutus、Pratylenchus mulchandi、Pratylenchus musicola、Pratylenchus neglectus、Pratylenchus penetrans、Pratylenchus pratensis、Pratylenchus reniformia、Pratylenchus scribneri、Pratylenchus thornei、Pratylenchus vulnus、Pratylenchus zeae、Pseudocercospora、Pseudocercospora arecacearum、Pseudocercospora cannabina、Pseudocercospora fuligena、Pseudocercospora gunnerae、Pseudocercospora kaki、Pseudocercospora mali、Pseudocercospora pandoreae、Pseudocercospora puderi、Pseudocercospora purpurea、Pseudocercospora rhapisicola、Pseudocercospora subsessilis、Pseudocercospora theae、Pseudocercospora vitis、Pseudocercosporella capsellae、Pseudocochliobolus eragrostidis、Pseudoepicoccum cocos、Pseudomonas amygdali、Pseudomonas asplenii、Pseudomonas avellanae、Pseudomonas caricapapayae、Pseudomonas cichorii、Pseudomonas coronafaciens、Pseudomonas corrugate、Pseudomonas ficuserectae、Pseudomonas flavescens、Pseudomonas fuscovaginae、Pseudomonas helianthi、Pseudomonas marginalis、Pseudomonas meliae、Pseudomonas oryzihabitans、Pseudomonas palleroniana、Pseudomonas papaveris、Pseudomonas salomonii、Pseudomonas savastanoi、Pseudomonas syringae、Pseudomonas tomato、Pseudomonas tremae、Pseudomonas turbinellae、Pseudomonas viridiflava、Pseudoperonospora cannabina、Pseudoperonospora cubensis、Pseudoperonospora humuli、Pseudopezicula tetraspora、Pseudopezicula tracheiphila、Pseudopeziza jonesii、Pseudopeziza medicaginis、Pseudopeziza trifolii、Pseudoseptoria donacis、Puccinia、Puccinia angustata、Puccinia arachidis、Puccinia aristidae、Puccinia asparagi、Puccinia cacabata、Puccinia campanulae、Puccinia carthami、Puccinia coronate、Puccinia coronata var. hordei、Puccinia dioicae、Puccinia erianthi、Puccinia extensicola var. hieraciata、Puccinia helianthi、Puccinia hordei、Puccinia jaceae var. solstitialis、Puccinia kuehnii、Puccinia mariae−wilsoniae、Puccinia melanocephala、Puccinia menthae、Puccinia pelargonii−zonalis、Puccinia pittieriana、Puccinia poarum、Puccinia psidii、Puccinia purpurea、Puccinia recondita、Puccinia schedonnardii、Puccinia sessilis、Puccinia striiformis f. sp. hordei、Puccinia striiformis var. striiformis、Puccinia subnitens、Puccinia substriata var. indica、Puccinia verruca、Puccinia xanthii、Pucciniaceae、Pucciniastrum、Pucciniastrum americanum、Pucciniastrum arcticum、Pucciniastrum coryli、Pucciniastrum epilobii、Pucciniastrum hydrangeae、Punctodera chalcoensis、Pycnoporus cinnabarinus、Pycnoporus sanguineus、Pycnostysanus azaleae、Pyrenochaeta lycopersici、Pyrenochaeta terrestris、Pyrenopeziza brassicae、Pyrenophora、Pyrenophora avenae、Pyrenophora chaetomioides、Pyrenophora graminea、Pyrenophora seminiperda、Pyrenophora teres、Pyrenophora teres f. maculata、Pyrenophora teres f. teres、Pyre
nophora tritici−repentis、Pythiaceae、Pythiales、Pythium、Pythium acanthicum、Pythium aphanidermatum、Pythium aristosporum、Pythium arrhenomanes、Pythium buismaniae、Pythium debaryanum、Pythium deliense、Pythium dissotocum、Pythium graminicola、Pythium heterothallicum、Pythium hypogynum、Pythium irregulare、Pythium iwayamae、Pythium mastophorum、Pythium middletonii、Pythium myriotylum、Pythium okanoganense、Pythium paddicum、Pythium paroecandrum、Pythium perniciosum、Pythium rostratum、Pythium scleroteichum、Pythium spinosum、Pythium splendens、Pythium sulcatum、Pythium sylvaticum、Pythium tardicrescens、Pythium tracheiphilum、Pythium ultimum、Pythium ultimum var. ultimum、Pythium vexans、Pythium violae、Pythium volutum、Quinisulcius acutus、Quinisulcius capitatus、Radopholous similis、Radopholus similis、Ralstonia solanacearum、Ramichloridium musae、Ramularia、Ramularia beticola、Ramularia brunnea、Ramularia coryli、Ramularia cyclaminicola、Ramularia macrospora、Ramularia menthicola、Ramularia necator、Ramularia primulae、Ramularia spinaciae、Ramularia subtilis、Ramularia tenella、Ramulispora sorghi、Ramulispora sorghicola、Resinicium bicolor、Rhabdocline pseudotsugae、Rhabdocline weirii Rhabdoviridae、Rhinocladium corticola、Rhizoctonia、Rhizoctonia leguminicola、Rhizoctonia rubi、Rhizoctonia solani、Rhizomorpha subcorticalis、Rhizophydium graminis、Rhizopus arrhizus、Rhizopus circinans、Rhizopus microsporus var. microspores、Rhizopus oryzae、Rhodococcus fascians、Rhynchosporium、Rhynchosporium secalis、Rhytidhysteron rufulum、Rhytisma acerinum、Rhytisma vitis、Rigidoporus lineatus、Rigidoporus microporus、Rigidoporus ulmarius、Rigidoporus vinctus、Rosellinia arcuata、Rosellinia bunodes、Rosellinia necatrix、Rosellinia pepo、Rosellinia subiculata、Rotylenchulus、Rotylenchulus parvus、Rotylenchulus reniformis、Rotylenchus brachyurus、Rotylenchus robustus、Saccharicola taiwanensis、Saccharomyces florentinus、Saccharomyces kluyveri、Sarocladium oryzae、Sawadaea、Sawadaea tulasnei、Schiffnerula cannabis、Schizoparme straminea、Schizophyllum commune、Schizopora flavipora、Schizothyrium pomi、Scleroderris canker、Sclerophthora macrospora、Sclerophthora rayssiae、Sclerospora graminicola、Sclerospora mischanthi、Sclerotinia borealis、Sclerotinia minor、Sclerotinia ricini、Sclerotinia sclerotiorum、Sclerotinia spermophila、Sclerotinia trifoliorum、Sclerotium、Sclerotium cinnamomi、Sclerotium delphinii、Scutellonema brachyurum、Scutellonema cavenessi、Scytinostroma galactinum、Seimatosporium mariae、Seimatosporium rhododendri、Selenophoma linicola、Septobasidium、Septobasidium bogoriense、Septobasidium pilosum、Septobasidium pseudopedicellatum、Septobasidium theae、Septocyta ruborum、Septogloeum potentillae、Septoria、Septoria aciculosa、Septoria ampelina、Septoria azalea、Septoria bataticola、Septoria campanulae、Septoria cannabis、Septoria caryae、Septoria citri、Septoria cucurbitacearum、Septoria darrowii、Septoria dianthi、Septoria eumusae、Septoria fragariae、Septoria fragariaecola、Septoria glycines、Septoria helianthi、Septoria humuli、Septoria hydrangeae、Septoria lactucae、Septoria liquidambaris、Septoria lycopersici、Septoria lycopersici var. malagutii、Septoria menthae、Septoria ostryae、Septoria passerinii、Septoria pisi、Septoria pistaciae、Septoria platanifolia、Septoria rhododendri、Septoria secalis、Septoria selenophomoides、Setosphaeria rostrata、Setosphaeria turcica、Sirosporium diffusum、Sparassis、Sphaceloma、Sphaceloma arachidis、Sphaceloma coryli、Sphaceloma menthae、Sphaceloma perseae、Sphaceloma poinsettiae、Sphaceloma pyrinum、Sphaceloma randii、Sphaceloma sacchari、Sphaceloma theae、Sphacelotheca reiliana、Sphaerella platanifolia、Sphaeropsis tumefaciens、Sphaerotheca、Sphaerotheca castagnei、Sphaerotheca fuliginea、Sphaerulina oryzina、Sphaerulina rehmiana、Sphaerulina rubi、Sphenospora kevorkianii、Spiniger meineckellus、Spiroplasma、Spongipellis unicolor、Sporisorium cruentum、Sporisorium ehrenbergi、Sporisorium scitamineum、Sporisorium sorghi、Sporonema phacidioides、Stagonospora avenae f.sp. triticae、Stagonospora meliloti、Stagonospora recedens、Stagonospora sacchari、Stagonospora tainanensis、Steccherinum ochraceum、Stegocintractia junci、Stegophora ulmea、Stemphylium alfalfa、Stemphylium bolickii、Stemphylium cannabinum、Stemphylium globuliferum、Stemphylium lycopersici、Stemphylium sarciniforme、Stemphylium solani、Stemphylium vesicarium、Stenella anthuriicola、Stereum、Stereum hirsutum、Stereum rameale、Stereum sanguinolentum、Stigmatomycosis、Stigmella platani−racemosae、Stigmina carpophila、Stigmina liquidambaris、Stigmina palmivora、Stigmina platani、Stigmina platani−racemosae、Subanguina radicicola、Subanguina wevelli、Sydowia polyspora、Sydowiella depressula、Sydowiellaceae、Synchytrium endobioticum、Synchytrium fragariae、Synchytrium liquidambaris、Taiwanofungus camphoratus、Tapesia acuformis、Tapesia yallundae、Taphrina aurea、Taphrina bullata、Taphrina caerulescens、Taphrina coryli、Taphrina deformans、Taphrina entomospora、Taphrina johansonii、Taphrina potentillae、Taphrina ulmi、Taphrina wiesneri、Thanatephorus cucumeris、Thielaviopsis、Thielaviopsis basicola、Thyrostroma compactum、Tilletia barclayana、Tilletia caries、Tilletia controversa、Tilletia laevis、Tilletia tritici、Tilletia walkeri、Tilletiariaceae、Tobacco necrosis virus、To
gniniaceae、Trachysphaera fructigena、Trametes gibbosa、Trametes hirsute、Trametes nivosa、Trametes pubescens、Tranzschelia discolor f.sp. persica、Tranzschelia pruni−spinosae var. discolor、Trichaptum biforme、Trichoderma harzianum、Trichoderma koningii、Trichoderma viride、Trichothecium roseum、Tripospermum acerinum、Truncatella、Truncatella laurocerasi、Tubercularia lateritia、Tubercularia ulmea、Tubeufia pezizula、Tunstallia aculeata、Tylenchorhynchus、Tylenchorhynchus brevilineatus、Tylenchorhynchus claytoni、Tylenchorhynchus dubius、Tylenchorhynchus maximus、Tylenchorhynchus nudus、Tylenchorhynchus phaseoli、Tylenchorhynchus vulgaris、Tylenchorhynchus zeae、Tylenchulus semipenetrans、Typhula idahoensis、Typhula incarnate、Typhula ishikariensis、Typhula ishikariensis var. canadensis、Typhula variabilis、Typhulochaeta、Tyromyces calkinsii、Tyromyces chioneus、Tyromyces galactinus、Ulocladium atrum、Ulocladium consortiale、Uncinula、Uncinula macrospora、Uncinula necator、Uredo behnickiana、Uredo kriegeriana、Uredo musae、Uredo nigropuncta、Uredo rangelii、Urocystis、Urocystis agropyri、Urocystis brassicae、Urocystis occulta、Uromyces、Uromyces apiosporus、Uromyces beticola、Uromyces ciceris−arietini、Uromyces dianthi、Uromyces euphorbiae、Uromyces graminis、Uromyces inconspicuus、Uromyces lineolatus subsp. nearcticus、Uromyces medicaginis、Uromyces musae、Uromyces oblongus、Uromyces pisi−sativi、Uromyces proeminens var. poinsettiae、Uromyces trifolii−repentis var. fallens、Uromyces viciae−fabae var. viciae−fabae、Urophlyctis leproides、Urophlyctis trifolii、Urophora cardui、Ustilaginales、Ustilaginoidea virens、Ustilaginomycetes、Ustilago、Ustilago avenae、Ustilago hordei、Ustilago maydis、Ustilago nigra、Ustilago nuda、Ustilago scitaminea、Ustilago tritici、Valsa abietis、Valsa ambiens、Valsa auerswaldii、Valsa ceratosperma、Valsa kunzei、Valsa nivea、Valsa sordida、Valsaria insitiva、Venturia carpophila、Venturia inaequalis、Venturia pirina、Venturia pyrina、Veronaea musae、Verticillium、Verticillium albo−atrum、Verticillium albo−atrum var. menthae、Verticillium dahliae、Verticillium longisporum、Verticillium theobromae、Villosiclava virens、Virescence、Waitea circinata、Wuestneiopsis Georgiana、Xanthomonas ampelina、Xanthomonas axonopodis、Xanthomonas campestris、Xanthomonas campestris pv. campestris、Xanthomonas oryzae、Xeromphalina fraxinophila、Xiphinema americanum、Xiphinema bakeri、Xiphinema brevicolle、Xiphinema diversicaudatum、Xiphinema insigne、Xiphinema rivesi、Xiphinema vuittenezi、Xylaria mali、Xylaria polymorpha、Xylella fastidiosa、Xylophilus、Xylophilus ampelinus、Zopfia rhizophila、Zygosaccharomyces bailii、および、Zygosaccharomyces florentinus、が挙げられる。
本発明はまた、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片、および、植物におけるストレス耐性を増強させる少なくとも1つのタンパク質またはペプチドを含有する融合タンパク質に関するものである。
本発明はまた、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質、および、少なくとも植物結合タンパク質またはペプチドを含有する融合タンパク質に関するものである。植物結合タンパク質またはペプチドは、植物の任意の部分(たとえば、植物の根、または、たとえば葉、幹、花または実等の空中部分)または植物物質に特異的に、または非特異的に結合することができる任意のタンパク質またはペプチドであっても良い。ゆえに、たとえば、植物結合タンパク質またはペプチドは、根結合タンパク質もしくはペプチド、または、葉結合タンパク質もしくはペプチドであっても良い。
本発明はさらに、少なくとも1つの対象のタンパク質またはペプチド、および、配列番号71、75、80、81、82、83、および84のいずれか1つと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質を含有するエキソスポリウムタンパク質、を含有する融合タンパク質に関するものである。あるいは、当該エキソスポリウムタンパク質は、配列番号71、75、80、81、82、83、および84のいずれか1つと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の同一性を有するアミノ酸配列を含有しても良い。
本発明はまた、融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーに関するものである。当該融合タンパク質は、上述の任意の融合タンパク質であっても良い。
多くのBacillus cereusファミリーのメンバーの株が、固有の有益な特性を有している。たとえば、一部の株は、植物生育刺激効果を有している。本明細書に記述される任意の融合タンパク質を、そのような株で発現しても良い。
本明細書に記述される任意の組換えBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて、融合タンパク質は、融合タンパク質の標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウム断片に固有のプロモーターの制御下で発現されても良い。たとえば、融合タンパク質が、B.anthracis sterne BclA由来の標的化配列(たとえば、配列番号1のアミノ酸20〜35、配列番号1のアミノ酸1〜35、配列番号1または配列番号60)を含有する場合、または、融合タンパク質が、全長BclA(配列番号2)または全長BclAの断片(配列番号59)を含有する場合、当該融合タンパク質は、B.anthracis sterneのゲノムにおいて、BclA遺伝子と通常関連するプロモーター(たとえば、配列番号85のプロモーター)の制御下で発現されても良い。
本発明はまた、前述の項で検討された任意の組換えBacillus cereusファミリーのメンバーおよび農学的に受容可能な担体を含有する製剤に関する。
本発明はまた、植物の生育を刺激する方法に関するものである。植物の生育を刺激する方法には、上述の組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのいずれか、または、上述の製剤のいずれかを植物生育環境へと導入することが含まれる。あるいは、上述の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または上述の製剤のいずれかを、植物、植物の種子、または、植物もしくは植物種子の周辺域へと適用しても良い。そのような方法において、植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、組換えBacillusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている。
本発明はさらに、病原体から植物を防御する方法に関するものである。当該方法には、上述の任意の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または上述の任意の製剤を植物生育環境中へと導入することが含まれる。あるいは、当該方法には、上述の任意の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または上述の任意の製剤を、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周辺域へと適用することが含まれる。これら方法において、病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている。
本発明はさらに、植物におけるストレス耐性を増強させる方法に関するものである。当該方法には、上述の任意の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または上述の任意の製剤を植物生育環境中へと導入することが含まれる。あるいは、当該方法には、上述の任意の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または上述の任意の製剤を、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周辺域へと適用することが含まれる。これら方法において、植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質またはペプチドは、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている。
本発明はまた、植物に組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの芽胞を固定する方法を目的とするものである。これら方法には、上述の任意の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または上述の任意の製剤を植物生育環境中へと導入することが含まれる。あるいは、当該方法には、上述の任意の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または上述の任意の製剤を、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周辺域へと適用することが含まれる。植物結合タンパク質またはペプチドは、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている。
上述の任意の方法において、植物生育環境は、植物の生育をサポートすることができる物質である。植物生育環境は、土壌、水、水性溶液、砂、砂利、多糖、マルチ、堆肥、ピートモス、わら、丸太、粘土、大豆ミール、酵母抽出物、またはそれらの組み合わせを含有しても良い。たとえば、植物生育環境は、土壌、堆肥、ピートモス、またはそれらの組み合わせを含有する。
上述の任意の方法において、組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または製剤を、植物生育環境へと導入してもよく、または、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周辺域へと適用しても良い。
上述の任意の方法にはさらに、植物生育環境中に少なくとも1つの農薬を導入すること、または、植物もしくは種子に少なくとも1つの農薬を適用することを含有しても良い。農薬は、製剤に含有される上述の任意のもの、またはそれらの組み合わせであっても良い。
上述の方法は、様々な植物で実施することができる。たとえば、植物は、双子葉植物、単子葉植物、または裸子植物であっても良い。
aceae、Sarraceniaceae(食虫植物)、Saururaceae(アメリカハンゲショウ)、Saxifragaceae(ユキノシタ)、Schisandraceae(マツブサ)、Scrophulariaceae(ゴマノハグサ)、Scyphostegiaceae、Scytopetalaceae、Simaroubaceae(カシア)、Simmondsiaceae(ホホバ)、Solanaceae(ジャガイモ)、Sonneratiaceae(ハマザクロ)、Sphaerosepalaceae、Sphenocleaceae(spenoclea)、Stackhousiaceae(stackhousia)、Stachyuraceae、Staphyleaceae(ミツバウツギ)、Sterculiaceae(カカオ)、Stylidiaceae、Styracaceae(エゴノキ)、Surianaceae(suriana)、Symplocaceae(ハマノキ)、Tamaricaceae(ギョリュウ)、Tepuianthaceae、Tetracentraceae、Tetrameristaceae、Theaceae(茶)、Theligonaceae、Theophrastaceae(テオフラスタ)、Thymelaeaceae(西洋オニシバリ)、Ticodendraceae、Tiliaceae(シナノキ)、Tovariaceae、Trapaceae(ヒシ)、Tremandraceae、Trigoniaceae、Trimeniaceae、Trochodendraceae、Tropaeolaceae(キンレンカ)、Turneraceae(ツルネラ)、Ulmaceae(エルム)、Urticaceae(イラクサ)、Valerianaceae(カノコソウ)、Verbenaceae(バーベナ)、Violaceae(スミレ)、Viscaceae(Christmas mistletoe)、Vitaceae(ブドウ)、Vochysiaceae、Winteraceae(シキミモドキ)、Xanthophyllaceae、および、Zygophyllaceae(メキシコハマビシ)からなる群から選択される科由来のものであっても良い。
Bacillus subtilisのリパーゼおよびエンドグルカナーゼ遺伝子は、以下の表3に示されるプライマーを用いたポリメラーゼ鎖反応(PCR)を介して増幅した。
エンドグルカナーゼを発現するBEMD芽胞は、上述の実施例1と同じ方法で作製した。トウモロコシは、標準的なローム表土で満たした、10cmの深さのポット中で、3.8cmの深さで植えた。芽胞、対照、および、エンドグルカナーゼを発現するBEMDは、50mlの水で1x104/mlの濃度に希釈され、種まきの際に各植物に適用された。水のみの対照もまた含まれた。T5ランプ、54ワットを用いた最適な光の下、植物を生育させ、15.5〜25.5℃の間に制御された温度条件下で、1日当たり11時間、光に曝した。1週間の試験期間中、3日ごとに植物に十分に水を与えた。1週間の最後に、各植物の高さを測定し、測定値を、対照のBacillus thuringiensisの芽胞に対して標準化した。
エンドグルカナーゼを発現するBEMD芽胞は、上述の実施例1と同じ方法で作製した。E.coliプロテアーゼPtrBを発現するBEMD芽胞は、上述の実施例1と類似した方法および以下のプライマーを用いて作製した:
ggatccatgctaccaaaagcc (フォワード、配列番号41)、および、
ggatccttagtccgcaggcgtagc (リバース、配列番号42)
エンドグルカナーゼを発現するBEMD芽胞は、上述の実施例1と同じ方法で作製した。ペレニアルライグラスは、標準的なローム表土で満たした、10cmの深さのポット中で、6.4mmの深さで植えた。芽胞、両方の対照、および、エンドグルカナーゼを発現するBEMDは、50mlの水で1x104/mlの濃度に希釈され、種まきの際に各植物に適用された。水のみの対照もまた含まれている。T5ランプ、54ワットを用いた最適な光の下、植物を生育させ、15.5〜25.5℃の間に制御された温度条件下で、1日当たり11時間、光に曝した。2週間の試験期間中、3日ごとに植物に十分に水を与えた。2週間の最後に、各植物の高さを測定し、測定値を、対照の水のみの植物に対して標準化した。
また、植物ホルモンの合成に関与する酵素を提示させるために、BEMD系を用いても良い。たとえば、植物ホルモンのインドール−3−酢酸は、植物における強力な生育刺激物質である。インドール−3−酢酸は、酵素のトリプトファンモノオキシゲナーゼおよびインドール−3−アセトアミド加水分解酵素により、トリプトファンからin vivoで合成される。インドール−3−酢酸および他のオーキシンホルモンもまた、酵素のニトリラーゼ、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール−3−アセトアルデヒド脱水素酵素、インドール−3−ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アミンオキシダーゼ、トリプトファンデカルボキシラーゼ、およびトリプトファン側鎖オキシダーゼにより、トリプトファンおよび/またはインドールからin vivoで合成されることができる。
植物上で直接または間接的に作用することができる生物活性型のペプチドに、植物生育環境中で利用可能なタンパク質を酵素的に開裂することができるプロテアーゼおよびペプチダーゼを、BEMD系で発現させても良い。例としては、植物の生育を直接刺激することができる活性型ペプチドへの、植物生育環境中に添加された大豆食品、酵母抽出物、または他のタンパク質が豊富な食品の酵素開裂が挙げられる。タンパク質食品の酵素的開裂により生成された生物活性型ペプチドとしては、強力な植物根発育刺激物質であるRHPPおよびRKN 16D10が挙げられる。さらに、BEMDで発現されたプロテアーゼおよびペプチダーゼにより、その生物活性型へと、プロタンパク質またはプレプロプロテインを活性型に開裂しても良い。不活性型プロタンパク質またはプレプロプロテインを植物生育環境中に添加し、BEMDプロテアーゼにより徐々に開裂させ、生物活性型タンパク質を持続放出させても良い。
E.coliプロテアーゼPtrBを発現するBEMD芽胞を、実施例3に記述されるように作製した。大豆種子を、標準的なローム表土で満たした、10cmの深さのポット中で、2.54cmの深さで植えた。芽胞、両方の対照、および、プロテアーゼを発現するBEMDは、50mlの水で1x104/mlの濃度に希釈され、種まきの際に各植物に適用された。水のみの対照もまた含まれた。25mg/ポットの大豆食品を、植え付けの際に水に加えた。T5ランプ、54ワットを用いた最適な光の下、植物を生育させ、15.5〜25.5℃の間に制御された温度条件下で、1日当たり13時間、光に曝した。1週間の試験期間中、3日ごとに植物に十分に水を与えた。2週間の最後に、各植物の高さを測定し、測定値を、対照の水のみの植物に対して標準化した。
また、BEMD系を用いて、植物の生育促進に直接関与するタンパク質またはペプチドを提示させても良い。たとえば、植物生育を刺激する植物ペプチドホルモンまたは非ホルモン性ペプチドを、BEMD系中で発現させても良い。たとえば、植物受容体に直接結合し、活性化させる非ホルモン性ペプチドを、BEMD系中で発現させ、植物および標的植物の根の受容体に直接作用させても良い。そのようなペプチドホルモンおよび非ホルモン性ペプチドとしては、フィトスルホカイン、カルカルバ(calcalva)3(CLV3)、システミン、RKN 16D10、Hg−Syv46、eNOD40、NODファミリータンパク質、ZmlGF、SCR/SP11ファミリータンパク質およびペプチダーゼ、RHPP、POLARIS、ならびにKTIが挙げられる。これらペプチドおよび関連ペプチドを、BEMD系中で発現させ、植物生育環境に送達または、葉に直接適用させ、植物の生育を刺激しても良い。
配列番号60の標的化配列に結合されたPOLARISまたはKTIペプチドをコードする遺伝子を合成することにより、植物ペプチドであるPOLARISおよび大豆ペプチドKTIを発現するBEMD芽胞を作製した。次いで、遺伝子をBacillus thuringiensisに導入し、芽胞を、実施例1に記述されるように作製した。大豆種子を、標準的なローム表土で満たした、10cmの深さのポット中で、2.54cmの深さで植えた。POLARISまたはKTIを発現するBEMD芽胞は、50mlの水で1x104/mlの濃度に希釈され、種まきの際に各植物に適用された。水のみの対照もまた含まれた。純粋なPOLARISおよびKTIペプチドもまた、0.05mg/ポットで、大豆に対するその効果を検証した。T5ランプ、54ワットを用いた最適な光の下、植物を生育させ、15.5〜25.5℃の間に制御された温度条件下で、1日当たり13時間、光に曝した。2週間の試験期間中、3日ごとに植物に十分に水を与えた。2週間の最後に、各植物の高さを測定し、根を測定し、測定値を、対照の水のみの植物に対して標準化した。
また、BEMD系を用いて、土壌または他の植物生育環境中に存在する細菌、真菌、または植物の栄養源を有益に分解または改変する酵素を提示しても良い。そのような酵素は、土壌または他の植物生育環境中に存在する産物を、植物、ならびに/または、根圏の有益な細菌および/もしくは真菌が容易に取り込める形態へと分解する。そのような酵素としては、たとえば、炭水化物複合体を分解するグルコシド加水分解酵素、セルロースを分解するセルラーゼ;脂質(油、脂肪、およびワックスを含む)を分解するリパーゼ;リグニンおよびフミン酸を分解するリグニンオキシダーゼ;ポリペプチドを分解するプロテアーゼ;膜を分解するホスホリパーゼ;窒素を戻すアミダーゼおよびニトロゲナーゼ;デンプンを処理するアミラーゼ;ヌクレオチドを戻すヌクレアーゼ;ペクチンを分解するぺクチナーゼ;硫黄を戻すスルファターゼ、ならびに、キシランおよびアラビノキシランを分解するキシラナーゼが挙げられる。得られた産物(単糖、アミノ酸、脂肪酸、および他の栄養を含む)は、植物による直接取り込み、ならびに/または、有益細菌および/もしくは真菌の植物の根圏における増殖、成長のための刺激のために容易に利用可能である。
Bacillus subtilisホスファターゼA4(PhoA4)を発現するBEMD芽胞は、配列番号60の標的化配列に連結されたPhoA4をコードする遺伝子を合成することにより作製した。この遺伝子を、次いで、Bacillus thuringiensisに導入し、芽胞を、実施例1のように作製した。トウモロコシを、標準的なローム表土で満たした、10cmの深さのポット中で、2.54cmの深さで植えた。PhoA4を発現するBEMD芽胞は、50mlの水で1x104/mlの濃度に希釈され、種まきの際に各植物に適用された。水のみの対照もまた含まれた。ホスファターゼは、液体中で、0.5mg/ポットの比率でポットに添加された。T5ランプ、54ワットを用いた最適な光の下、植物を生育させ、15.5〜25.5℃の間に制御された温度条件下で、1日当たり13時間、光に曝した。2週間の試験期間中、3日ごとに植物に十分に水を与えた。2週間の最後に、各植物の高さを測定し、測定値を、対照の水のみの植物に対して標準化した。
また、BEMD系を用いて、植物生育促進化合物である2,3−ブランジオールの合成に関与する酵素を提示しても良い。in vivoにおいて、2,3−ブタンジオールは、根圏中の有益細菌および有益真菌により、アセトイン、ジアセチル、アセト乳酸、またはピルビン酸から、酵素のアセト乳酸合成酵素、α−アセト乳酸デカルボキシラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ジアセチル還元酵素、ブタンジオール脱水素酵素、およびアセトイン還元酵素により合成される。
また、BEMD系を用いて、1以上の病原体から植物を防御するプロテアーゼを提示させても良い。たとえば、ある細菌性病原体は、細菌のラクトンホモセリンまたは関連シグナル伝達分子の分泌を介して、個々のメンバー間で相互交流を行うことができる。ゆえに、細菌性ラクトンホモセリンシグナル伝達分子に特異的なプロテアーゼは、毒素の分泌および病原性因子の上方制御を行うために細菌にとって必須な工程である、細菌間の相互交流を阻害することにより、そのような細菌性病原体から植物を防御することができる。細菌性ラクトンホモセリンシグナル伝達分子に特異的な適切なプロテアーゼとしては、エンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼが挙げられる。
また、BEMD系を用いて、1以上の病原体から植物を防御することに役立つ抗細菌性活性および/または抗真菌活性を示す酵素を提示させても良い。たとえば、バクテリオシン、リゾチーム(たとえば、LysM)、シデロフォア、コンアルブミン、アルブミン、ラクトフェリン(たとえば、LfcinB)、またはTasA等の抗菌性タンパク質およびペプチドはすべて、BEMD系中で発現させ、植物の細菌性病原体および真菌性病原体にその効果を発揮させても良い。バクテリオシン、アルブミン、コンアルブミン、リゾチーム、およびラクトフェリンは、その標的に直接抗菌活性を発揮し、一方で、シデロフォアは、病原体が病原性を発揮するのに必要な必須栄養素に結合する。たとえば、ラクトフェリンのペプチドLfcinBは、BEMD系の表面上で発現された際、植物生育環境中のラクトフェリンペプチドに感受性のある細菌細胞を溶解する。これらタンパク質およびペプチドは、限定された微生物に対し特異的に作用し、および、植物生育環境中の全ての微生物に影響を与えることなく、病原体群を選択的に標的とすることができる。
2つの抗菌性ペプチド(LfcinB(ウシラクトフェリン由来)およびLysM(ニワトリリゾチーム由来))のいずれかをコードする遺伝子を、BclAプロモーター(配列番号85)の制御下で、BclA標的化配列(配列番号60)に連結させ、合成した。当該遺伝子を、Bacillus thuringiensis BT013Aへと導入し、脳心臓滲出培養液中で形質転換されたBacillusを一晩培養して増殖させ、30℃で普通寒天プレート上に置き、3日間増殖させることにより、芽胞を形成させた。プレートから芽胞を洗い流し、PBSで3回洗浄した。Staphylococcus epidermidis培養物を、TSB液体培地において37℃で一晩、増殖させた。次いで、一晩培養させたものを沈殿させ、PBSで洗浄し、Abs595=0.2でPBS中に再懸濁した。LysMまたはLfcinBペプチドを発現する1x104のBEMDを、S.epidermidisと共に、37℃で3時間、PBS中で振とうさせながらインキュベートした。S.epidermidisの対照試料は、未処置のままとした(BEMD芽胞無し)。3時間のインキュベートの後、S.epidermidisの希釈プレートを作製し、37℃で一晩インキュベートした。S.epidermidisの培養物を、翌日に計数し、殺傷割合を定量した。以下の表11にあるように、殺傷活性の値を記録した。BEMD発現ペプチドは、有意に多くのS.epidermidis細胞を殺傷した。これは、根圏、種子、または他の植物物質上の細菌の殺傷にそのまま当てはめられる。ある種の細菌に特異的なペプチドを選択することにより、植物近傍の微生物群を有益なものに変えることができ、または、重要な病原体を選択的に標的とすることもできる。
また、BEMD系を用いて1以上の病原体から植物を防御する酵素を提示させても良い。たとえば、酵母およびカビ細胞壁は、たとえばβ−1,3−グルカナーゼ、β−1,4−グルカナーゼ、β−1,6−グルカナーゼ、キトシナーゼ、キチナーゼ、キトシナーゼ様タンパク質、およびリチカーゼ等の酵素により分解される。細菌細胞壁は、プロテイナーゼ、プロテアーゼ、ムタノリシン、スタホリシン、およびリゾチームから選択される酵素により分解される。これら細胞壁分解酵素の各々を根圏の病原性微生物の選択阻害のためにBEMD系上で発現させ、および植物生育環境へと添加しても良い。
抗真菌性酵素のβ−1,3−グルカナーゼ(Bacillus subtilis由来)をコードする遺伝子を、BclAプロモーター(配列番号85)の制御下で、BclA標的化配列(配列番号60)に連結させ、合成した。当該遺伝子を、Bacillus thuringiensis BT013Aへと導入し、脳心臓滲出培養液中で形質転換されたBacillusを一晩培養して増殖させ、30℃で普通寒天プレート上に置き、3日間増殖させることにより、芽胞を形成させた。プレートから芽胞を洗い流し、PBSで3回洗浄した。Saccharomyces cerevisiae培養物を、YZ液体培地において37℃で一晩、増殖させた。次いで、一晩培養させたものを沈殿させ、PBSで洗浄し、Abs595=0.2でPBS中に再懸濁した。β−1,3−グルカナーゼを発現する1x104のBEMDを、Saccharomycesと共に、37℃で1時間、PBS中で振とうさせながらインキュベートした。Saccharomycesの対照試料は、未処置のままとした(BEMD芽胞無し)。3時間のインキュベートの後、Saccharomycesの希釈プレートを作製し、37℃で一晩インキュベートした。Saccharomycesの培養物を、翌日に計数し、殺傷パーセントを定量した。以下の表12に、β−1,3−グルカナーゼを発現するBEMD芽胞の殺傷活性の値を示す。BEMD発現酵素は、有意に多くのSaccharomyces細胞を殺傷した。これは、根圏、種子、または他の植物物質上の真菌微生物の殺傷にそのまま当てはめられる。ある種の真菌に特異的なペプチドを選択することにより、植物近傍の微生物群を有益なものに変えることができ、または、重要な病原体を選択的に標的とすることもできる。
また、BEMD系を用いて、植物免疫システム増強ペプチドおよびタンパク質を提示しても良い。これらタンパク質は、植物免疫システムを刺激して植物病原体から植物自身を防御するよう、BEMD芽胞の外側に発現され、および、植物生育環境中に送達されても良い。例示的なタンパク質およびペプチドとしては、ハーピン、α−エラスチン、β−エラスチン、システミン、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ、エリシチン、ディフェンシン、クリプトゲイン、ならびに、フラジェリンタンパク質およびペプチドが挙げられる。これらタンパク質およびペプチドに植物を曝すことにより、植物において、多くの植物病原体に対する抵抗性が刺激される。
また、根および葉に結合するタンパク質ならびにペプチドをBEMD系に導入し、BEMD芽胞が植物の根系または葉に固定されるようにしても良い。BEMD芽胞上にそのような根、または葉に結合するリガンドを提示することにより、植物の根系、または根系の下部構造、または葉、または葉の下部構造に芽胞が向かい、他の提示されている生物学的分子および酵素が有効であるために最適な位置でBEMD芽胞が維持されることが可能となる。
植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質、ペプチド、および酵素をBEMD系に導入し、根、葉、または植物生育環境への添加を介して標的植物への送達を行っても良い。ストレスを受けている間、植物はストレス関連化合物(アミノシクロプロパン−1−カルボン酸(ACC)、活性酸素種、その他等)を放出し、それにより、植物の生育が負の影響を受ける。BEMD系を用いて、そのようなストレス関連化合物を分解する酵素(たとえば、アミノシクロプロパン−1−カルボン酸デアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、オキシダーゼ、カタラーゼ、および、活性酸素種に作用する他の酵素等)を提示しても良い。そのような酵素により、これらストレス関連化合物の量が減少し、植物が生育を継続することが出来、さらには、ストレス条件下で力強く育つことができる。
防御酵素のカタラーゼ(Bacillus cereus由来)をコードする遺伝子を、BetAプロモーター(配列番号86)の制御下で、BetA標的化配列(配列番号61)に連結させ、合成した。当該遺伝子を、Bacillus thuringiensis BT013Aへと導入した。脳心臓滲出培養液中で形質転換されたBacillusおよび野生型株を一晩培養して増殖させ、30℃で普通寒天プレート上に置き、3日間増殖させることにより、芽胞を形成させた。プレートから芽胞を洗い流し、PBSで3回洗浄した。3滴の過酸化水素を各芽胞のペレットに添加した。酵素のカタラーゼは、過酸化水素を水とO2ガスに転換する。対照の芽胞は泡立たないが、BEMD−カタラーゼ芽胞はすぐに発泡し、芽胞の表面上に酵素活性があることを示す。ストレスの間、植物により産生されるフリーラジカルに作用するよう、他の防御酵素を同様の方法で提示させ、植物に送達しても良い。
環境ストレスから植物を防御するタンパク質、ペプチド、および酵素をBEMD系に導入し、根、葉、または植物生育環境への添加を介して標的植物への送達を行っても良い。氷結されている間、植物は氷の影響によりダメージを受ける。BEMD系を用いて、そのような影響から植物を防御するペプチド、タンパク質または酵素を提示させても良い。たとえば、BEMD系を用いて、コリン脱水素酵素(霜から植物または種子を防御する防御産物を産生することにより作用する)を提示しても良い。また、これら酵素の基質(たとえば、コリンおよび/またはコリン誘導体)を植物生育環境に添加しても良い。そのような基質を添加することにより、BEMD発現酵素により植物環境中に産生された防御物質(ベタインおよび関連化学物質)の量を増やすことができる。ベタイン誘導体は、低温ストレスから種子を防御することが知られている。
BEMD系は、本明細書に記述される標的化配列の1以上を用いた幅広いタンパク質、ペプチドおよび酵素を提示することができる。これら標的化配列の一部は、エキソスポリウムに対し高い親和性を有しているため融合タンパク質の発現に有益であるが、融合タンパク質の発現レベルは低いため、BEMD系上で用いることには制限がある。そのような融合タンパク質および配列に対しては、天然プロモーターの代わりに、別の高発現芽胞形成プロモーターを用いても良い。
最も健康で、最も耐性のあるジャガイモ(Solanum tuberosum)、黄色夏カボチャ(Cucurbita pepo)、トマト(Solanum lycopersicum)、および、pole bean(Phaseolus coccineus)植物の根圏から土壌試料を採取し、滅菌水で希釈して、普通寒天プレートに撒いた。高成長率を示し、継代および増殖することができた細菌単離株をさらなる実験に選択した。選択された株を、最小培地(KH2PO4 3g、Na2HPO4 6g、NH4Cl 1g、NaCl 0.50g、MgSO47H2O 0.15g、CaCl22H2O 0.013g、および、グルコース1g/L 乾重量)中で増殖させた。選択された株を一晩培養した(30℃)ものをスピンダウンし、培地を棄て、等量の滅菌水に再懸濁した。1回の処置当たり10のレタス種子を、大きな残渣をふるいにかけて取り除いた表土に、1cmの深さで植えた(Columbia,MO)。種子は、植え付け時に、水に再懸濁した細菌0.5μlを10mlのH2Oに混合したものとともに、4cmのポットに接種した。10mlのH2Oは、細菌が3in3(7.62cm3)の土壌に細菌が送達されるのに十分であり、ならびに、種子の適切な発芽のために土壌を満たすのに十分であった。植物は65〜75°F(18〜24℃)の温度で、11時間の光照射/日とともに生育させ、5mlの水を3日毎に与えた。1週間後、植物の高さと葉の直径、ならびに、植物の全体的な健康を記録した。根圏単離物の最初のスクリーニングによって、4つの植物の根圏から、200を超える異なる種の細菌および真菌が得られた。一部の細菌種を表14に示す。同定された株は、その正規の細菌名で示されている。他の株は、不明 番号により示されている。対照に近い結果となった接種物(+/−2%)は、表に含めなかった。
Gas、Kansasに近い農場から土壌試料を集め、滅菌水で希釈し、普通寒天培地に撒いた。高成長率を示し、継代および増殖することができた細菌単離株をさらなる実験に選択した。選択された株を、最小培地(KH2PO4 3g、Na2HPO4 6g、NH4Cl 1g、NaCl 0.50g、MgSO47H2O 0.15g、CaCl22H20 0.013g、および、グルコース1g/L 乾重量)中で増殖させた。選択された株を一晩培養した(30℃)ものをスピンダウンし、培地を棄て、等量の滅菌水に再懸濁した。トウモロコシの種子を市販の種子ポリマー(水単独と混合したもの(トータルで1.6μl/種子)、または、選択細菌株(トータルで1.6μl/種子)を含有するもの)でコートした。コートされた種子は、(3インチ)7.62cm直径のポットに、大きな残渣をふるいにかけて取り除いた表土(Columbia、MO)に1インチ(2.54cm)の深さで植えた。植物は18〜24℃(65〜75°F)の温度で、11時間の光照射/日とともに生育させ、50mlの水を3日毎に与えた。2週間後、植物の高さと葉の直径、ならびに、植物の全体的な健康を記録した。発芽アッセイおよび3日目の根の長さを測定するために、種子を上述のようにコートし、ペーパータオル毎に10個の種子で等しく撒いた。ペーパータオルは10mlの水で湿らせ、くるくると巻き、小さなプラスチック袋内に置き、30℃でインキュベートするか、または、発芽加熱マット上に27〜30℃(80〜85°F)で置いた。根の測定は、3日後に記録した。根圏単離物の最初のスクリーニングによって、根圏から100を超える異なる種の細菌および真菌が得られた。一部の細菌種を表16に示す。同定された株は、その正規の細菌名で示されている。
選択された株を、最小培地(KH2PO4 3g、Na2HPO4 6g、NH4Cl 1g、NaCl 0.50g、MgSO47H2O 0.15g、CaCl22H2O 0.013g、および、グルコース1g/L 乾重量)中で増殖させた。選択された株を一晩培養した(30℃)ものをスピンダウンし、培地を棄て、等量の滅菌水に再懸濁した。10個のZebaコートされたアルファルファの種子は、大きな残渣をふるいにかけて取り除いた表土(Columbia、MO)に0.6cmの深さで各処置に対して植えた。種子は、植え付け時に、水に再懸濁した細菌0.5μlを10mlのH2Oに混合したものとともに接種した。10mlのH2Oは、細菌が3in3(7.62cm3)の土壌に細菌が送達されるのに十分であり、ならびに、種子の適切な発芽のために土壌を満たすのに十分であった。植物は65〜75°F(18〜24℃)の温度で、11時間の光照射/日とともに生育させ、5mlの水を3日毎に与えた。アルファルファを1週間育て、記載された条件下での発芽および植物の最初の伸長を分析した。同定された株は、その正規の細菌名で示され、最終的な高さのデータを表18に示す。
選択された株を、最小培地(KH2PO4 3g、Na2HPO4 6g、NH4Cl 1g、NaCl 0.50g、MgSO47H2O 0.15g、CaCl22H2O 0.013g、および、グルコース1g/L 乾重量)中で増殖させた。選択された株を一晩培養した(30℃)ものをスピンダウンし、培地を棄て、等量の滅菌水に再懸濁した。10個のキュウリの種子を、大きな残渣をふるいにかけて取り除いた表土(Columbia、MO)に1cmの深さで各処置に対して植えた。種子は、植え付け時に、水に再懸濁した細菌0.5μlを10mlのH2Oに混合したものとともに接種した。10mlのH2Oは、細菌が3in3(7.62cm3)の土壌に細菌が送達されるのに十分であり、ならびに、種子の適切な発芽のために土壌を満たすのに十分であった。植物は65〜75°F(18〜24℃)の温度で、11時間の光照射/日とともに生育させ、5mlの水を3日毎に与えた。キュウリを2週間育て、記載された条件下での発芽および植物の最初の伸長を分析した。同定された株は、その正規の細菌名で示され、最終的な高さのデータを表19に示す。
選択された株を、最小培地(KH2PO4 3g、Na2HPO4 6g、NH4Cl 1g、NaCl 0.50g、MgSO47H2O 0.15g、CaCl22H2O 0.013g、および、グルコース1g/L 乾重量)中で増殖させた。選択された株を一晩培養した(30℃)ものをスピンダウンし、培地を棄て、等量の滅菌水に再懸濁した。10個の黄色カボチャの種子を、大きな残渣をふるいにかけて取り除いた表土(Columbia、MO)に1cmの深さで各処置に対して植えた。種子は、植え付け時に、水に再懸濁した細菌0.5μlを10mlのH2Oに混合したものとともに接種した。10mlのH2Oは、細菌が3in3(7.62cm3)の土壌に細菌が送達されるのに十分であり、ならびに、種子の適切な発芽のために土壌を満たすのに十分であった。植物は65〜75°F(18〜24℃)の温度で、11時間の光照射/日とともに生育させ、5mlの水を3日毎に与えた。カボチャを2週間育て、記載された条件下での発芽および植物の最初の伸長を分析した。同定された株は、その正規の細菌名で示され、最終的な高さおよび最終的な葉の直径(2つの葉の長さによる)のデータを表20に示す。
選択された株を、最小培地(KH2PO4 3g、Na2HPO4 6g、NH4Cl 1g、NaCl 0.50g、MgSO47H2O 0.15g、CaCl22H2O 0.013g、および、グルコース1g/L 乾重量)中で増殖させた。選択された株を一晩培養した(30℃)ものをスピンダウンし、培地を棄て、等量の滅菌水に再懸濁した。30個のライグラスの種子を、大きな残渣をふるいにかけて取り除いた表土(Columbia、MO)に0.3cmの深さで各処置に対して植えた。種子は、植え付け時に、水に再懸濁した細菌0.5μlを10mlのH2Oに混合したものとともに接種した。10mlのH2Oは、細菌が3in3(7.62cm3)の土壌に細菌が送達されるのに十分であり、ならびに、種子の適切な発芽のために土壌を満たすのに十分であった。植物は65〜75°F(18〜24℃)の温度で、11時間の光照射/日とともに生育させ、5mlの水を3日毎に与えた。ライグラスを1.5週間育て、記載された条件下での発芽および植物の最初の伸長を分析した。同定された株は、その正規の細菌名で示され、最終的な高さのデータを表21に示す。
選択された株を、最小培地(KH2PO4 3g、Na2HPO4 6g、NH4Cl 1g、NaCl 0.50g、MgSO47H2O 0.15g、CaCl22H2O 0.013g、および、グルコース1g/L 乾重量)中で増殖させた。選択された株を一晩培養した(30℃)ものをスピンダウンし、培地を棄て、等量の滅菌水に再懸濁した。10個のトウモロコシ種子を、大きな残渣をふるいにかけて取り除いた表土(Columbia、MO)に2.5cmの深さで各処置に対して植えた。種子は、植え付け時に、水に再懸濁した細菌0.5μlを10mlのH2Oに混合したものとともに接種した。10mlのH2Oは、細菌が3in3(7.62cm3)の土壌に細菌が送達されるのに十分であり、ならびに、種子の適切な発芽のために土壌を満たすのに十分であった。植物は65〜75°F(18〜24℃)の温度で、11時間の光照射/日とともに生育させ、5mlの水を3日毎に与えた。トウモロコシを2週間育て、記載された条件下での発芽および植物の最初の伸長を分析した。同定された株は、その正規の細菌名で示され、最終的な高さのデータを表22に示す。
選択された株を、最小培地(KH2PO4 3g、Na2HPO4 6g、NH4Cl 1g、NaCl 0.50g、MgSO47H2O 0.15g、CaCl22H2O 0.013g、および、グルコース1g/L 乾重量)中で増殖させた。選択された株を一晩培養した(30℃)ものをスピンダウンし、培地を棄て、等量の滅菌水に再懸濁した。10個の大豆種子を、大きな残渣をふるいにかけて取り除いた表土(Columbia、MO)に2.5cmの深さで各処置に対して植えた。種子は、植え付け時に、水に再懸濁した細菌0.5μlを10mlのH2Oに混合したものとともに接種した。2つの細菌株を検証する際、0.5μlの各再懸濁された細菌は、10mlのH2Oと混合された。10mlのH2Oは、細菌が3in3(7.62cm3)の土壌に細菌が送達されるのに十分であり、ならびに、種子の適切な発芽のために土壌を満たすのに十分であった。植物は65〜75°F(18〜24℃)の温度で、11時間の光照射/日とともに生育させ、5mlの水を3日毎に与えた。大豆を2週間育て、記載された条件下での発芽および植物の最初の伸長を分析した。同定された株は、その正規の細菌名で示され、最終的な高さのデータを表23に示す。本発明の細菌株とBradyrhizobium sp.またはRhizobium sp.のメンバーと共に接種することにより、各接種単独と比較し、植物の生育が増加した。
Bacillus mycoides株BT155、Bacillus mycoides株EE118、Bacillus mycoides株EE141、Bacillus mycoides株BT46−3、Bacillus cereusファミリーのメンバー株EE349、Bacillus thuringiensis株BT013A、および、Bacillus megaterium株EE281を、Luria Bertani液体培地中、37℃で増殖させ、一晩培養したものをスピンダウンし、培地を棄て、等量の滅菌水に再懸濁した。20個のトウモロコシ種子を、大きな残渣をふるいにかけて取り除いた表土(Columbia、MO)に2.5cmの深さで各処置に対して植えた。種子は、植え付け時に、水に再懸濁した細菌0.5μlを50mlのH2Oに混合したものとともに接種した。50mlのH2Oは、細菌が29in3(442.5cm3)の土壌に細菌が送達されるのに十分であり、ならびに、種子の適切な発芽のために土壌を満たすのに十分であった。植物は65〜72°Fの温度で、13時間の光照射/日とともに生育させ、5mlの水を3日毎に与えた。苗木を2週間育て、記載された条件下での発芽および植物の最初の伸長を分析した。同定された株は、その正規の細菌名で示され、最終的な高さのデータを表24に示す。
全ての検証した植物生育促進細菌は、記述される条件下、2週間でトウモロコシの高さに有益な効果をもたらした。Bacillus cereusファミリーのメンバーであるEE128株は、この試験で最も高い効果を有しており、トウモロコシの高さにおいて14%を超えるブースト効果があった。
有益な農業的効果をもたらすために本明細書に記述される標的化配列のいずれかを用いて、広範なタンパク質、ペプチド、酵素を提示するためにBEMD系を用いてもよい。追加の有益な効果は、内在的に有益な特性を有する発現宿主(たとえば、Bacillus cereusファミリーのメンバー)を選択することにより得ることができる。Bacillus cereusファミリーのメンバーの多くの株が、植物生育促進の効果を有している。さらに、多くのBacillus cereusファミリーのメンバー株が、直接的な殺真菌活性、殺虫活性、殺線虫活性、または他の防御的活性を介した防御効果を有している。BEMD系の発現宿主として、そのような株を用いることにより、最終芽胞産物は、農業における複数の有益な効果を有する。
BclAのアミノ酸20〜35(配列番号1のアミノ酸20〜35)と高度な相同性を有する様々な標的化配列を、Bacillus cereusファミリーのメンバーの表面上に酵素、タンパク質、およびペプチドを提示するために用いても良い。いくつかの標的化配列を、Bacillus subtilisリパーゼに連結された標的化配列を含有する融合タンパク質を作製することにより比較した。融合構築物は、標的化配列に対し天然型であるプロモーターを用いて合成し、複製プラスミドpMK4にクローニングし、および、Bacillus thuringiensis BT013Aへと導入した。クロラムフェニコール10μg/mlを含有する普通寒天プレート上で3日間、30℃でインキュベートすることにより、株は芽胞形成した。芽胞を集め、洗浄し、1x108/mlの比率でPBS中に再懸濁した。各融合構築物の芽胞に対し、1x105個の芽胞を、400μlのdH2Oに懸濁した。反応物を、所望される反応温度(40℃)にまで、反応成分と共に加熱した。200μlのワーキング緩衝液を添加した(溶液A:溶液Bが9:1)。溶液Aは、50mMのTris(pH10)および13.6mMのデオキシコール酸であり、溶液Bは、イソプロパノールに溶解した3mg/mlのp−ニトロフェニルパルミチン酸である。反応物を40℃で10分間インキュベートし、氷上に置き、芽胞を取り除くために遠心し、420nmの吸光度を測定した。結果を以下の図26に示す。活性は、Bacillus subtilisリパーゼに融合された配列番号1のアミノ酸1〜35を含有する対照融合タンパク質に対して標準化された。
様々なエキソスポリウムタンパク質を、Bacillus cereusファミリーのメンバーの表面上に酵素、タンパク質およびペプチドを提示するために用いることができる。いくつかのエキソスポリウムタンパク質を、Bacillus subtilisリパーゼに連結されたエキソスポリウムタンパク質を含有する融合タンパク質を実施例34に記述されるように作製することにより比較した。融合構築物は、以下の表27に示されるエキソスポリウムタンパク質に対して天然型であるプロモーターを用いて合成され、複製プラスミドのpMK4にクローニングされ、および、Bacillus thuringiensis BT013Aへと導入された。様々なエキソスポリウムタンパク質‐Bacillus subtilis168リパーゼ融合物を提示する芽胞を、脳心臓滲出液体培地中で形質転換された細菌を、10μg/mlのクロラムフェニコールの選択圧と共に増殖させ、普通寒天プレート上に置き、および、30℃で3日間インキュベートすることにより作製した。3日後、芽胞をプレートから洗い流し、遠心により精製し、および、1x108CFU/mlでPBSに再懸濁した。
Bacillus subtilis EE148ホスファターゼA4(PhoA4)を発現するBEMD芽胞は、様々な標的化配列および、PhoA4に連結されたその天然型プロモーターの制御下にあるエキソスポリウムタンパク質をコードする遺伝子を遺伝子合成することにより作製した。合成された遺伝子をpMK4にクローニングし、Bacillus thuringiensis BT013Aに導入した。様々なエキソスポリウムタンパク質‐Bacillus subtilis EE148 PhoA4融合物を提示する芽胞は、脳心臓滲出液体培地中で形質転換された細菌を、10μg/mlのクロラムフェニコールの選択圧と共に増殖させ、普通寒天プレートに置き、3日間、30℃でインキュベートすることにより作製した。3日後、芽胞をプレートから洗い流し、遠心により精製し、PBS中に1x108CFU/mlで再懸濁した。
融合タンパク質を発現しているBEMD芽胞を、様々な種子処置との適合性に関して検証した。BEMD芽胞は、Bacillus subtilis EE148 PhoA4由来のホスファターゼ(PhoA4)またはPOLARISペプチドに連結された配列番号1のアミノ酸1〜35の標的化配列を含有する融合タンパク質を発現させた。合成された遺伝子をpMK4にクローニングし、Bacillus thuringiensis BT013Aに導入した。様々なエキソスポリウムタンパク質‐Bacillus subtilis EE148 PhoA4またはPOLARIS融合物を提示する芽胞は、脳心臓滲出液体培地中で形質転換された細菌を、10μg/mlのクロラムフェニコールの選択圧と共に増殖させ、普通寒天プレートに置き、3日間、30℃でインキュベートすることにより作製した。3日後、芽胞をプレートから洗い流し、遠心により精製し、PBS中に1x108CFU/mlで再懸濁した。
BEMD芽胞提示系を用いて、農場または温室の生育中の植物の、何らかのストレスを緩和することができる酵素を送達しても良い。これを行うために、土壌中の活性酸素種に対して選択的に作用する酵素を選択した。活性酸素種は、植物におけるストレスの重要なマーカーである。
上述の実施例23に示されているように、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片のの天然型プロモーターを置き換えることにより、Bacillus cereusファミリーの芽胞のエキソスポリウムで発現される融合タンパク質のレベルに大きな影響を与えることができる。たとえば、天然型であるBclAプロモーターをBclBプロモーターに置き換えることにより、Bacillus cereusファミリーのメンバーの芽胞の表面上の融合タンパク質のレベルは大きく減少する。あるいは、天然型であるBclBプロモーターをBclAプロモーターと置き換えることにより、エキソスポリウム上の融合タンパク質のレベルは劇的に増加する。
Claims (44)
- 融合タンパク質を発現している組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーを植物生育環境へと導入すること、または、融合タンパク質を発現している組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーを植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周辺域へと適用することを含む、植物の生育を刺激する方法であって、
ここで、前記融合タンパク質は、
少なくとも一つの植物生育刺激タンパク質またはペプチド、および
標的化配列、エキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片、ここで、これらは、組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーのエキソスポリウムへと融合タンパク質を向かわせる、
を含有するものであり、
前記植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、組換えバチルス・セレウスファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加され、酵素を含むものである、
方法。 - (i)組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーを含む種子コーティング製剤でコーティングされた植物種子であって、前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーは融合タンパク質を発現し、前記融合タンパク質は、
少なくとも一つの植物生育刺激タンパク質またはペプチド、および
標的化配列、エキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片、ここで、これらは組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーのエキソスポリウムへと融合タンパク質を向かわせる、
を含有するものであり、
前記植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、組換えバチルス・セレウスファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加され、酵素および(ii)農学的に受容可能な担体を含むものである、
植物種子。 - 融合タンパク質を発現する組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーであって、前記融合タンパク質は、
少なくとも一つの植物生育刺激タンパク質またはペプチド、および
標的化配列、エキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片、ここで、これらは組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーのエキソスポリウムへと融合タンパク質を向かわせる、
を含有し、
組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーには、植物生育促進細菌株が含まれ、
前記植物生育促進細菌株は、バチルス・マイコイデス(Bacillus mycoides) BT155(NRRL No.B−50921)、バチルス・マイコイデス(Bacillus mycoides) EE118(NRRL No.B−50918)、バチルス・マイコイデス(Bacillus mycoides) EE141(NRRL No.B−50916)、バチルス・マイコイデス(Bacillus mycoides) BT46−3(NRRL No.B−50922)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーであるEE128(NRRL No.B−50917)、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis) BT013A(NRRL No.B−50924)、または、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーであるEE349(NRRL No.B−50928)を含み、
前記植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、組換えバチルス・セレウスファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加され、酵素を含むものである、
組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバー。 - 融合タンパク質が:
(a)配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列を含有する標的化配列であって、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は少なくとも90%である、前記標的化配列;
(b)配列番号1のアミノ酸1〜35を含有する標的化配列;
(c)配列番号1のアミノ酸20〜35を含有する標的化配列;
(d)配列番号1を含有する標的化配列;
(e)配列番号2と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(f)配列番号3のアミノ酸1〜27を含有する標的化配列;
(g)配列番号3のアミノ酸12〜27を含有する標的化配列;
(h)配列番号3を含有する標的化配列;
(i)配列番号4と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(j)配列番号5のアミノ酸1〜38を含有する標的化配列;
(k)配列番号5のアミノ酸23〜38を含有する標的化配列;
(l)配列番号5を含有する標的化配列;
(m)配列番号6と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(n)配列番号7のアミノ酸1〜28を含有する標的化配列;
(o)配列番号7のアミノ酸13〜28を含有する標的化配列;
(p)配列番号7を含有する標的化配列;
(q)配列番号8と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(r)配列番号9のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
(s)配列番号9のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
(t)配列番号9を含有する標的化配列;
(u)配列番号10と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(v)配列番号11のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
(w)配列番号11のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
(x)配列番号11を含有する標的化配列;
(y)配列番号12と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(z)配列番号13のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
(aa)配列番号13のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
(ab)配列番号13を含有する標的化配列;
(ac)配列番号14と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(ad)配列番号15のアミノ酸1〜43を含有する標的化配列;
(ae)配列番号15のアミノ酸28〜43を含有する標的化配列;
(af)配列番号15を含有する標的化配列;
(ag)配列番号16と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(ah)配列番号17のアミノ酸1〜27を含有する標的化配列;
(ai)配列番号17のアミノ酸12〜27を含有する標的化配列;
(aj)配列番号17を含有する標的化配列;
(ak)配列番号18と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(al)配列番号19のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
(am)配列番号19のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
(an)配列番号19を含有する標的化配列;
(ao)配列番号20と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(ap)配列番号21のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
(aq)配列番号21のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
(ar)配列番号21を含有する標的化配列;
(as)配列番号22と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(at)配列番号23のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
(au)配列番号23のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
(av)配列番号23を含有する標的化配列;
(aw)配列番号24と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(ax)配列番号25のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
(ay)配列番号25のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
(az)配列番号25を含有する標的化配列;
(ba)配列番号26と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(bb)配列番号27のアミノ酸1〜30を含有する標的化配列;
(bc)配列番号27のアミノ酸15〜30を含有する標的化配列;
(bd)配列番号27を含有する標的化配列;
(be)配列番号28と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(bf)配列番号29のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
(bg)配列番号29のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
(bh)配列番号29を含有する標的化配列;
(bi)配列番号30と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(bj)配列番号31のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
(bk)配列番号31のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
(bl)配列番号31を含有する標的化配列;
(bm)配列番号32と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(bn)配列番号33のアミノ酸1〜15を含有する標的化配列;
(bo)配列番号33を含有する標的化配列;
(bp)配列番号34と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(bq)配列番号35のアミノ酸1〜16を含有する標的化配列;
(br)配列番号35を含有する標的化配列;
(bs)配列番号36と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(bt)配列番号43のアミノ酸1〜29を含有する標的化配列;
(bu)配列番号43のアミノ酸14〜29を含有する標的化配列;
(bv)配列番号43を含有する標的化配列;
(bw)配列番号44と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(bx)配列番号45のアミノ酸1〜35を含有する標的化配列;
(by)配列番号45のアミノ酸20〜35を含有する標的化配列;
(bz)配列番号45を含有する標的化配列;
(ca)配列番号46と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(cb)配列番号47のアミノ酸1〜43を含有する標的化配列;
(cc)配列番号47のアミノ酸28〜43を含有する標的化配列;
(cd)配列番号47を含有する標的化配列;
(ce)配列番号48と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(cf)配列番号49のアミノ酸1〜32を含有する標的化配列;
(cg)配列番号49のアミノ酸17〜32を含有する標的化配列;
(ch)配列番号49を含有する標的化配列;
(ci)配列番号50と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(cj)配列番号51のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
(ck)配列番号51のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
(cl)配列番号51を含有する標的化配列;
(cm)配列番号52と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(cn)配列番号53のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
(co)配列番号53のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
(cp)配列番号53を含有する標的化配列;
(cq)配列番号54と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(cr)配列番号55のアミノ酸1〜30を含有する標的化配列;
(cs)配列番号55のアミノ酸15〜30を含有する標的化配列;
(ct)配列番号55を含有する標的化配列;
(cu)配列番号56と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(cv)配列番号57のアミノ酸1〜130を含有する標的化配列;
(cw)配列番号57のアミノ酸115〜130を含有する標的化配列;
(cx)配列番号57を含有する標的化配列;
(cy)配列番号58と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(cz)配列番号59と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質断片;
(da)配列番号60を含有する標的化配列;
(db)配列番号61を含有する標的化配列;
(dc)配列番号62を含有する標的化配列;
(dd)配列番号63を含有する標的化配列;
(de)配列番号64を含有する標的化配列;
(df)配列番号65を含有する標的化配列;
(dg)配列番号66を含有する標的化配列;
(dh)配列番号67を含有する標的化配列;
(di)配列番号68を含有する標的化配列;
(dj)配列番号69を含有する標的化配列;
(dk)配列番号70を含有する標的化配列;
(dl)配列番号71と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dm)配列番号72と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dn)配列番号73と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(do)配列番号74と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dp)配列番号75と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dq)配列番号76と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dr)配列番号77と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(ds)配列番号78と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dt)配列番号79と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(du)配列番号80と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dv)配列番号81と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dw)配列番号82と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dx)配列番号83と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dy)配列番号84と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dz)配列番号1のアミノ酸22〜31を含有する標的化配列;
(ea)配列番号1のアミノ酸22〜33を含有する標的化配列;
(eb)配列番号1のアミノ酸20〜31を含有する標的化配列;
(ec)配列番号3のアミノ酸14〜23を含有する標的化配列;
(ed)配列番号3のアミノ酸14〜25を含有する標的化配列;または、
(ee)配列番号3のアミノ酸12〜23を含有する標的化配列、
を含有する、
請求項1に記載の方法。 - 融合タンパク質が:
(a)配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列を含有する標的化配列であって、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は少なくとも90%である、前記標的化配列;
(b)配列番号1のアミノ酸1〜35を含有する標的化配列;
(c)配列番号1のアミノ酸20〜35を含有する標的化配列;
(d)配列番号1を含有する標的化配列;
(e)配列番号2と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(f)配列番号3のアミノ酸1〜27を含有する標的化配列;
(g)配列番号3のアミノ酸12〜27を含有する標的化配列;
(h)配列番号3を含有する標的化配列;
(i)配列番号4と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(j)配列番号5のアミノ酸1〜38を含有する標的化配列;
(k)配列番号5のアミノ酸23〜38を含有する標的化配列;
(l)配列番号5を含有する標的化配列;
(m)配列番号6と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(n)配列番号7のアミノ酸1〜28を含有する標的化配列;
(o)配列番号7のアミノ酸13〜28を含有する標的化配列;
(p)配列番号7を含有する標的化配列;
(q)配列番号8と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(r)配列番号9のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
(s)配列番号9のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
(t)配列番号9を含有する標的化配列;
(u)配列番号10と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(v)配列番号11のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
(w)配列番号11のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
(x)配列番号11を含有する標的化配列;
(y)配列番号12と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(z)配列番号13のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
(aa)配列番号13のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
(ab)配列番号13を含有する標的化配列;
(ac)配列番号14と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(ad)配列番号15のアミノ酸1〜43を含有する標的化配列;
(ae)配列番号15のアミノ酸28〜43を含有する標的化配列;
(af)配列番号15を含有する標的化配列;
(ag)配列番号16と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(ah)配列番号17のアミノ酸1〜27を含有する標的化配列;
(ai)配列番号17のアミノ酸12〜27を含有する標的化配列;
(aj)配列番号17を含有する標的化配列;
(ak)配列番号18と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(al)配列番号19のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
(am)配列番号19のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
(an)配列番号19を含有する標的化配列;
(ao)配列番号20と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(ap)配列番号21のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
(aq)配列番号21のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
(ar)配列番号21を含有する標的化配列;
(as)配列番号22と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(at)配列番号23のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
(au)配列番号23のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
(av)配列番号23を含有する標的化配列;
(aw)配列番号24と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(ax)配列番号25のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
(ay)配列番号25のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
(az)配列番号25を含有する標的化配列;
(ba)配列番号26と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(bb)配列番号27のアミノ酸1〜30を含有する標的化配列;
(bc)配列番号27のアミノ酸15〜30を含有する標的化配列;
(bd)配列番号27を含有する標的化配列;
(be)配列番号28と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(bf)配列番号29のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
(bg)配列番号29のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
(bh)配列番号29を含有する標的化配列;
(bi)配列番号30と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(bj)配列番号31のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
(bk)配列番号31のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
(bl)配列番号31を含有する標的化配列;
(bm)配列番号32と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(bn)配列番号33のアミノ酸1〜15を含有する標的化配列;
(bo)配列番号33を含有する標的化配列;
(bp)配列番号34と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(bq)配列番号35のアミノ酸1〜16を含有する標的化配列;
(br)配列番号35を含有する標的化配列;
(bs)配列番号36と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(bt)配列番号43のアミノ酸1〜29を含有する標的化配列;
(bu)配列番号43のアミノ酸14〜29を含有する標的化配列;
(bv)配列番号43を含有する標的化配列;
(bw)配列番号44と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(bx)配列番号45のアミノ酸1〜35を含有する標的化配列;
(by)配列番号45のアミノ酸20〜35を含有する標的化配列;
(bz)配列番号45を含有する標的化配列;
(ca)配列番号46と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(cb)配列番号47のアミノ酸1〜43を含有する標的化配列;
(cc)配列番号47のアミノ酸28〜43を含有する標的化配列;
(cd)配列番号47を含有する標的化配列;
(ce)配列番号48と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(cf)配列番号49のアミノ酸1〜32を含有する標的化配列;
(cg)配列番号49のアミノ酸17〜32を含有する標的化配列;
(ch)配列番号49を含有する標的化配列;
(ci)配列番号50と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(cj)配列番号51のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
(ck)配列番号51のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
(cl)配列番号51を含有する標的化配列;
(cm)配列番号52と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(cn)配列番号53のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
(co)配列番号53のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
(cp)配列番号53を含有する標的化配列;
(cq)配列番号54と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(cr)配列番号55のアミノ酸1〜30を含有する標的化配列;
(cs)配列番号55のアミノ酸15〜30を含有する標的化配列;
(ct)配列番号55を含有する標的化配列;
(cu)配列番号56と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(cv)配列番号57のアミノ酸1〜130を含有する標的化配列;
(cw)配列番号57のアミノ酸115〜130を含有する標的化配列;
(cx)配列番号57を含有する標的化配列;
(cy)配列番号58と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(cz)配列番号59と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質断片;
(da)配列番号60を含有する標的化配列;
(db)配列番号61を含有する標的化配列;
(dc)配列番号62を含有する標的化配列;
(dd)配列番号63を含有する標的化配列;
(de)配列番号64を含有する標的化配列;
(df)配列番号65を含有する標的化配列;
(dg)配列番号66を含有する標的化配列;
(dh)配列番号67を含有する標的化配列;
(di)配列番号68を含有する標的化配列;
(dj)配列番号69を含有する標的化配列;
(dk)配列番号70を含有する標的化配列;
(dl)配列番号71と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dm)配列番号72と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dn)配列番号73と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(do)配列番号74と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dp)配列番号75と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dq)配列番号76と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dr)配列番号77と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(ds)配列番号78と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dt)配列番号79と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(du)配列番号80と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dv)配列番号81と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dw)配列番号82と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dx)配列番号83と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dy)配列番号84と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
(dz)配列番号1のアミノ酸22〜31を含有する標的化配列;
(ea)配列番号1のアミノ酸22〜33を含有する標的化配列;
(eb)配列番号1のアミノ酸20〜31を含有する標的化配列;
(ec)配列番号3のアミノ酸14〜23を含有する標的化配列;
(ed)配列番号3のアミノ酸14〜25を含有する標的化配列;または、
(ee)配列番号3のアミノ酸12〜23を含有する標的化配列、
を含有する、
請求項2に記載の植物種子。 - 前記標的化配列が、
(a)16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列であって、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも90%である、前記アミノ酸配列;
(b)配列番号1のアミノ酸1〜35;
(c)配列番号1のアミノ酸20〜35;
(d)配列番号1;または、
(e)配列番号60、
からなる、請求項4に記載の方法。 - 前記標的化配列が、
(a)16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列であって、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも90%である、前記アミノ酸配列;
(b)配列番号1のアミノ酸1〜35;
(c)配列番号1のアミノ酸20〜35;
(d)配列番号1;または、
(e)配列番号60、
からなる、請求項5に記載の植物種子。 - 融合タンパク質が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、または、84と少なくとも98%、少なくとも99%または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含有する、請求項4に記載の方法。
- 融合タンパク質が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、または、84と少なくとも98%、少なくとも99%または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含有する、請求項5に記載の植物種子。
- 前記植物生育刺激タンパク質またはペプチドが、植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素;細菌、真菌もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素、を含有する、請求項1、4、6および8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物生育刺激タンパク質またはペプチドが、植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素;細菌、真菌もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素、を含有する、請求項2、5、7および9のいずれか1項に記載の植物種子。
- 前記融合タンパク質がさらに、前記標的化配列、前記エキソスポリウムタンパク質、または、前記エキソスポリウムタンパク質断片と、前記植物生育刺激タンパク質もしくはペプチド、との間にアミノ酸リンカーを含有し、
任意に、前記リンカーが、ポリアラニンリンカー、ポリグリシンリンカー、または、アラニン残基とグリシン残基の両方の混合物;および/またはプロテアーゼ認識部位を含有する、
請求項1、4、6、8および10のいずれか1項に記載の方法。 - 前記融合タンパク質がさらに、前記標的化配列、前記エキソスポリウムタンパク質、または、前記エキソスポリウムタンパク質断片と、前記植物生育刺激タンパク質もしくはペプチド、との間にアミノ酸リンカーを含有し、
任意に、前記リンカーが、ポリアラニンリンカー、ポリグリシンリンカー、または、アラニン残基とグリシン残基の両方の混合物;および/またはプロテアーゼ認識部位を含有する、
請求項2、5、7、9および11のいずれか1項に記載の植物種子。 - 前記植物生育刺激タンパク質またはペプチドが、植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素を含有し、前記植物生育刺激化合物が、根圏で細菌または真菌により産生される化合物または植物成長ホルモンを含有する、
請求項11または13に記載の植物種子。 - 前記植物生育刺激タンパク質またはペプチドが、植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素を含有し、および、前記植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素が、アセトイン還元酵素、インドール−3−アセトアミド加水分解酵素、トリプトファンモノオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素、αアセト乳酸デカルボキシラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ジアセチル還元酵素、ブタンジオール脱水素酵素、アミノトランスフェラーゼ、トリプトファンデカルボキシラーゼ、アミンオキシダーゼ、インドール−3−ピルビン酸デカルボキシラーゼ、インドール−3−アセトアルデヒド脱水素酵素、トリプトファン側鎖オキシダーゼ、ニトリル加水分解酵素、ニトリラーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、アデノシンホスフェートイソペンテニルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ、アデノシンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、CYP735A、5’リボヌクレオチドホスホヒドロラーゼ、アデノシンヌクレオシダーゼ、ゼアチン シス−トランスイソメラーゼ、ゼアチン O−グルコシルトランスフェラーゼ、β−グルコシダーゼ、シス−ヒドロキシラーゼ、CKシス−ヒドロキシラーゼ、CK N−グルコシルトランスフェラーゼ、2,5−リボヌクレオチドホスホヒドロラーゼ、アデノシンヌクレオシダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ゼアチン還元酵素、ヒドロキシルアミン還元酵素、2−オキソグルタレートジオキシゲナーゼ、ジべレリン2B/3B加水分解酵素、ジベレリン3−オキシダーゼ、ジベレリン20−オキシダーゼ、キトシナーゼ、キチナーゼ、β−1,3−グルカナーゼ、β−1,4−グルカナーゼ、β−1,6−グルカナーゼ、アミノシクロプロパン−1−カルボン酸デアミナーゼ、または、ノッド因子の産生に関与する酵素(任意にnodA、nodB、またはnodIを含有する)、を含有する、請求項14に記載の植物種子。
- 前記植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素が、タンパク質、ペプチド、プロタンパク質、またはプレプロタンパク質を開裂して生物活性型ペプチドを生成するプロテアーゼまたはペプチダーゼを含有し:
任意に、前記プロテアーゼまたはペプチダーゼが、サブチリシン、酸プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、サーモリシン、パパイン、ペプシン、トリプシン、プロナーゼ、カルボキシラーゼ、セリンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼを含有する;
任意に、前記生物活性型ペプチドが、RKN 16D10またはRHPPを含有する;および/または
任意に、前記プロテアーゼまたはペプチダーゼが、タンパク質に富んだ食品(任意に、大豆食品または酵母抽出物である)中のタンパク質を開裂する、
請求項15に記載の植物種子。 - 前記酵素が、細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素を含有する、請求項10に記載の方法。
- 前記酵素が、細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素を含有する、請求項11に記載の植物種子。
- 前記細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素が、セルラーゼ、リパーゼ、リグニンオキシダーゼ、プロテアーゼ、グリコシド加水分解酵素、ホスファターゼ、ニトロゲナーゼ、ヌクレアーゼ、アミダーゼ、硝酸還元酵素、亜硝酸還元酵素、アミラーゼ、アンモニアオキシダーゼ、リグニナーゼ、グルコシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ぺクチナーゼ、グルカナーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、またはキシラナーゼを含有する、請求項17に記載の方法。
- 前記細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素が、セルラーゼ、リパーゼ、リグニンオキシダーゼ、プロテアーゼ、グリコシド加水分解酵素、ホスファターゼ、ニトロゲナーゼ、ヌクレアーゼ、アミダーゼ、硝酸還元酵素、亜硝酸還元酵素、アミラーゼ、アンモニアオキシダーゼ、リグニナーゼ、グルコシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ぺクチナーゼ、グルカナーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、またはキシラナーゼを含有する、請求項18に記載の植物種子。
- 前記細菌、真菌もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素が:
セルラーゼを含有し、前記セルラーゼが、エンドセルラーゼ、エキソセルラーゼ、またはβ−グルコシダーゼを含有する;
リパーゼを含有し、前記リパーゼが、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)リパーゼ、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)リパーゼ、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)リパーゼ、または、バチルス・クラウシィ(Bacillus clausii)リパーゼを含有する;
リグニンオキシダーゼを含有し、前記リグニンオキシダーゼが、リグニンペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、グリオキサルオキシダーゼ、リグニナーゼ、およびマンガンペルオキシダーゼを含有する;
プロテアーゼを含有し、前記プロテアーゼが、サブチリシン、酸プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、プロテイナーゼ、ペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、サーモリシン、パパイン、ペプシン、トリプシン、プロナーゼ、カルボキシラーゼ、セリンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼを含有する;
ホスファターゼを含有し、および、前記ホスファターゼがリン酸モノエステル加水分解酵素、ホスホモノエステラーゼ、リン酸ジエステル加水分解酵素、ホスホジエステラーゼ、三リン酸モノエステル加水分解酵素、無水ホスホリル加水分解酵素、ピロホスファターゼ、フィターゼ、トリメタホスファターゼ、またはトリホスファターゼを含有する;または
ニトロゲナーゼを含有し、および、前記ニトロゲナーゼが、Nifファミリーのニトロゲナーゼを含有する、
請求項19に記載の方法。 - 前記細菌、真菌もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素が:
セルラーゼを含有し、前記セルラーゼが、エンドセルラーゼ、エキソセルラーゼ、またはβ−グルコシダーゼを含有する;
リパーゼを含有し、前記リパーゼが、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)リパーゼ、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)リパーゼ、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)リパーゼ、または、バチルス・クラウシィ(Bacillus clausii)リパーゼを含有する;または
リグニンオキシダーゼを含有し、前記リグニンオキシダーゼが、リグニンペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、グリオキサルオキシダーゼ、リグニナーゼ、およびマンガンペルオキシダーゼを含有する、
請求項20に記載の植物種子。 - 前記プロテアーゼが、サブチリシン、酸プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、プロテイナーゼ、ペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、サーモリシン、パパイン、ペプシン、トリプシン、プロナーゼ、カルボキシラーゼ、セリンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼを含有する;
前記ホスファターゼがリン酸モノエステル加水分解酵素、ホスホモノエステラーゼ、リン酸ジエステル加水分解酵素、ホスホジエステラーゼ、三リン酸モノエステル加水分解酵素、無水ホスホリル加水分解酵素、ピロホスファターゼ、フィターゼ、トリメタホスファターゼ、またはトリホスファターゼを含有する;
前記ニトロゲナーゼが、Nifファミリーのニトロゲナーゼを含有する;または
前記グルコシダーゼが、β−グルコシダーゼを含有する、
請求項20に記載の植物種子。 - 前記セルラーゼが、エンドセルラーゼを含有し、および前記エンドセルラーゼがエンドグルカナーゼ(任意に、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)エンドグルカナーゼ、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)エンドグルカナーゼ、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)エンドグルカナーゼ、または、バチルス・クラウシィ(Bacillus clausii)エンドグルカナーゼを含有する)を含有する;
前記セルラーゼがエキソセルラーゼを含有し、および、前記エキソセルラーゼが、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)エキソセルラーゼを含有する;
前記セルラーゼが、β−グルコシダーゼを含有し、および、前記β−グルコシダーゼが、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)β−グルコシダーゼ、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)β−グルコシダーゼ、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)β−グルコシダーゼ、または、バチルス・クラウシィ(Bacillus clausii)β−グルコシダーゼを含有する;
前記ホスファターゼがホスホモノエステラーゼを含有し、および、前記ホスホモノエステラーゼが、PhoA4を含有する;または
前記ホスファターゼがフィターゼを含有し、および、前記フィターゼが、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)EE148フィターゼ、または、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)BT013Aフィターゼを含有する、
請求項21に記載の方法。 - 前記セルラーゼが、エンドセルラーゼを含有し、および前記エンドセルラーゼがエンドグルカナーゼ(任意に、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)エンドグルカナーゼ、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)エンドグルカナーゼ、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)エンドグルカナーゼ、または、バチルス・クラウシィ(Bacillus clausii)エンドグルカナーゼを含有する)を含有する;
前記セルラーゼがエキソセルラーゼを含有し、および、前記エキソセルラーゼが、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)エキソセルラーゼを含有する;
前記セルラーゼが、β−グルコシダーゼを含有し、および、前記β−グルコシダーゼが、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)β−グルコシダーゼ、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)β−グルコシダーゼ、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)β−グルコシダーゼ、または、バチルス・クラウシィ(Bacillus clausii)β−グルコシダーゼを含有する;
前記ホスファターゼがホスホモノエステラーゼを含有し、および、前記ホスホモノエステラーゼが、PhoA4を含有する;または
前記ホスファターゼがフィターゼを含有し、および、前記フィターゼが、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)EE148フィターゼ、または、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)BT013Aフィターゼを含有する、
請求項22に記載の植物種子。 - 植物結合タンパク質またはペプチド、および
標的化配列、エキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片、ここで、これらは、組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーのエキソスポリウムへと融合タンパク質を向かわせる、
を含有する少なくとも1つの融合タンパク質を共発現する、請求項3に記載の組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーであって、
前記植物結合タンパク質またはペプチドは、任意にアドヘシン(任意にリカドヘシン(rhicadhesin))、フラジェリン、オムプチン、レクチン、エクスパンシン、バイオフィルム構造タンパク質(任意にTasAまたはYuaB)、線毛タンパク質、カーラスタンパク質、インチミン、インベーシン、アグルチニン、および、非線毛タンパク質を含有する、
組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバー。 - 前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーには、バチルス・アントラキス(Bacillus anthracis)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バチルス・マイコイデス(Bacillus mycoides)、バチルス・シュードマイコイデス(Bacillus pseudomycoides)、バチルス・サマニィ(Bacillus samanii)、バチルス・ガエモケンシス(Bacillus gaemokensis)、バチルス・ウェイヘンステフェンシス(Bacillus weihenstephensis)、またはそれらの組み合わせが含まれる、請求項1、4、6、8、10、12、17、19、21、および24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーには、バチルス・アントラキス(Bacillus anthracis)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バチルス・マイコイデス(Bacillus mycoides)、バチルス・シュードマイコイデス(Bacillus pseudomycoides)、バチルス・サマニィ(Bacillus samanii)、バチルス・ガエモケンシス(Bacillus gaemokensis)、バチルス・ウェイヘンステフェンシス(Bacillus weihenstephensis)、またはそれらの組み合わせが含まれる、請求項2、5、7、9、11、13〜16、18、20、22、23、および25のいずれか1項に記載の植物種子。
- 前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーには、植物生育促進細菌株が含まれ、任意に、前記植物生育促進細菌株は:殺虫性毒素(任意にCry毒素)を産生する、殺真菌性化合物(任意にβ−1,3−グルカナーゼ、キトシナーゼ、リチカーゼ、またはそれらの組み合わせ)を産生する、殺線虫性化合物(任意にCry毒素)を産生する、殺菌性化合物を産生する、1以上の抗生物質に対して抵抗性である、1以上の遊離複製プラスミドを含有する、植物の根に結合する、植物の根にコロニー形成する、バイオフィルムを形成する、栄養素を可溶化する、有機酸を分泌する、またはそれらの組み合わせである、
請求項1、4、6、8、10、12、17、19、21、および24のいずれか1項に記載の方法。 - 前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーには、植物生育促進細菌株が含まれ、任意に、前記植物生育促進細菌株は:殺虫性毒素(任意にCry毒素)を産生する、殺真菌性化合物(任意にβ−1,3−グルカナーゼ、キトシナーゼ、リチカーゼ、またはそれらの組み合わせ)を産生する、殺線虫性化合物(任意にCry毒素)を産生する、殺菌性化合物を産生する、1以上の抗生物質に対して抵抗性である、1以上の遊離複製プラスミドを含有する、植物の根に結合する、植物の根にコロニー形成する、バイオフィルムを形成する、栄養素を可溶化する、有機酸を分泌する、またはそれらの組み合わせである、
請求項2、5、7、9、11、13〜16、18、20、22、23、25、および28のいずれか1項に記載の植物種子。 - 組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーには、バチルス・マイコイデス(Bacillus mycoides) BT155(NRRL No.B−50921)、バチルス・マイコイデス(Bacillus mycoides) EE118(NRRL No.B−50918)、バチルス・マイコイデス(Bacillus mycoides) EE141(NRRL No.B−50916)、バチルス・マイコイデス(Bacillus mycoides) BT46−3(NRRL No.B−50922)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーであるEE128(NRRL No.B−50917)、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis) BT013A(NRRL No.B−50924)、または、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーであるEE349(NRRL No.B−50928)が含まれる、請求項1、4、6、8、10、12、17、19、21、および24のいずれか1項に記載の方法。
- 組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーには、バチルス・マイコイデス(Bacillus mycoides) BT155(NRRL No.B−50921)、バチルス・マイコイデス(Bacillus mycoides) EE118(NRRL No.B−50918)、バチルス・マイコイデス(Bacillus mycoides) EE141(NRRL No.B−50916)、バチルス・マイコイデス(Bacillus mycoides) BT46−3(NRRL No.B−50922)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーであるEE128(NRRL No.B−50917)、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis) BT013A(NRRL No.B−50924)、または、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーであるEE349(NRRL No.B−50928)が含まれる、請求項2、5、7、9、11、13〜16、18、20、22、23、および25のいずれか1項に記載の植物種子。
- 前記融合タンパク質は、配列番号60の標的化配列を含有する、請求項32に記載の植物種子。
- 前記植物生育刺激タンパク質もしくはペプチドは、植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素を含有し、前記植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素は、キトサナーゼを含有し;または、前記植物生育刺激タンパク質もしくはペプチドは、細菌、真菌もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素を含有し、前記細菌、真菌もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素は、ホスファターゼ(任意にPhoA)またはエンドグルカナーゼを含有する、請求項33に記載の植物種子。
- 前記融合タンパク質は、前記融合タンパク質の標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片に対して天然型である芽胞形成プロモーターおよび/または高発現芽胞形成プロモーターの制御下で発現され、任意に:
前記高発現芽胞形成プロモーターには、シグマ−K芽胞形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列が含まれるか、または前記シグマ−K芽胞形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列(複数含む)は、配列番号85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、または103の相当するヌクレオチドと100%の同一性を有する;および/または
前記芽胞形成プロモーターは、配列番号85〜103のいずれか1つの核酸配列と少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する核酸配列を含有する、
請求項1、4、6、8、10、12、17、19、21、24、27、29、および31のいずれか1項に記載の方法。 - 前記融合タンパク質は、前記融合タンパク質の標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片に対して天然型である芽胞形成プロモーターおよび/または高発現芽胞形成プロモーターの制御下で発現され、任意に:
前記高発現芽胞形成プロモーターには、シグマ−K芽胞形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列が含まれるか、または前記シグマ−K芽胞形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列(複数含む)は、配列番号85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、または103の相当するヌクレオチドと100%の同一性を有する;および/または
前記芽胞形成プロモーターは、配列番号85〜103のいずれか1つの核酸配列と少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する核酸配列を含有する、
請求項2、5、7、9、11、13〜16、18、20、22、23、25、28、30、および32〜34のいずれか1項に記載の植物種子。 - 前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーの存在下で生育された植物は、前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーの非存在下での同一の環境中での植物の生育と比較し、生育の増強を示す、請求項1、4、6、8、10、12、17、19、21、24、27、29、31、および35のいずれか1項に記載の植物生育を刺激する方法。
- 前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーを含有する植物生育環境中で生育された植物は、前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーを含有しない前記植物生育環境と同一の環境中での植物の生育と比較し、生育の増強を示す;
前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーを適用された植物は、前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーを適用されずに同一の環境中での植物の生育と比較し、生育の増強を示す;
前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーを適用された種子から生育した植物は、前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーを適用されなかった種子から生育した植物の同一の環境中での植物の生育と比較し、生育の増強を示す;または
前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーを適用された地域で生育した植物は、前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーを適用されなかった地域で生育した植物の同一の環境中での植物の生育と比較し、生育の増強を示す、
請求項37に記載の方法。 - 植物生育環境へ導入する前に、または、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周辺域に適用する前に、前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーを不活性化すること、任意に、不活性化は加熱処置;ガンマ線照射;x線照射;UV−A照射;UV−B照射;グルタルアルデヒド(gluteraldehyde)、ホルムアルデヒド、過酸化水素、酢酸、漂白、またはそれらの組み合わせを用いた処置、または、それらの組み合わせによる、をさらに含む、請求項1、4、6、8、10、12、17、19、21、24、27、29、31、35、および37〜38のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物生育環境は、土壌、水、水性溶液、砂、砂利、多糖、マルチ、堆肥、ピートモス、わら、丸太、粘土、大豆ミール、酵母抽出物、またはそれらの組み合わせを含有する;および/または
前記植物生育環境は、酵素に対する基質が補充され、任意に、前記基質は、トリプトファン、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸(任意にアデノシン−3−リン酸)、インドール、トリメタホスフェート、フェロドキシン、アセトイン、ジアセチル、ピルビン酸、アセト乳酸、ペクチン、セルロース、メチルセルロース、デンプン、キチン、ペクチン、タンパク質食品、セルロース誘導体、リン酸、アセトイン、キトサン、インドール−3−酢酸の不活性型誘導体、ジベレリン酸の不活性型誘導体、キシラン、アラビノキシラン、脂肪、ワックス、油、フィチン酸、リグニン、フミン酸、コリン、コリン誘導体、プロリン、ポリプロリン、プロリン富化タンパク質、プロリン富化食、フェニルアラニン、またはコリスミ酸、またはそれらの組み合わせを含有する、
請求項1、4、6、8、10、12、17、19、21、24、27、29、31、35、および37〜39のいずれか1項に記載の方法。 - 植え付けの前に、前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバー、または、前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーを含有する製剤を用いて種子をコーティングすることを含有する、請求項1、4、6、8、10、12、17、19、21、24、27、29、31、35、および37〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 植物の空中部分に前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーまたは製剤を適用することを含む、請求項1、4、6、8、10、12、17、19、21、24、27、29、31、35、および37〜41のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物生育環境に前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーを導入することには、前記環境に前記組換えバチルス・セレウス(Bacillus cereus)ファミリーのメンバーを含有する液体製剤または固形製剤を適用することを含む、請求項1、4、6、8、10、12、17、19、21、24、27、29、31、35、および37〜42のいずれか1項に記載の方法。
- 植物生育環境中に少なくとも1つの農薬を導入すること、または、植物もしくは種子に少なくとも1つの農薬を適用することをさらに含有し、前記農薬は、肥料、微量栄養素肥料物質、殺虫剤、除草剤、防かび剤、軟体動物駆除剤、殺藻剤、植物生育改善物質、細菌接種剤、真菌接種剤、またはそれらの組み合わせを含有する;
前記肥料が、液体肥料を含有する;
前記微量栄養素肥料物質がホウ酸、ホウ酸塩、ホウ素フリット、硫酸銅、銅フリット、銅キレート、四ホウ酸ナトリウム十水和物、硫酸鉄、酸化鉄、硫酸鉄アンモニウム、鉄フリット、鉄キレート、硫酸マンガン、酸化マンガン、マンガンキレート、塩化マンガン、マンガンフリット、モリブデン酸ナトリウム、モリブデン酸、硫酸亜鉛、酸化亜鉛、炭酸亜鉛、亜鉛フリット、リン酸亜鉛、亜鉛キレート、もしくはそれらの組み合わせを含有する;
前記殺虫剤が有機リン酸塩、カルバミン酸塩、ピレスロイド、ダニ駆除剤、フタル酸アルキル、ホウ酸、ホウ酸塩、フッ化物、硫黄、ハロ芳香族置換尿素、炭化水素エステル、生物ベースの殺虫剤、もしくはそれらの組み合わせを含有する;
前記除草剤がクロロフェノキシ化合物、ニトロフェノール化合物、ニトロクレゾール化合物、ジピリジル化合物、アセトアミド、脂肪酸、アニリド、ベンズアミド、安息香酸、安息香酸誘導体、アニス酸、アニス酸誘導体、ベンゾニトリル、ベンゾチアジアジノン二酸化物、チオカルバミド酸塩、カルバミン酸塩、カルバニレート、クロロピリジニル、シクロヘキセノン誘導体、ジニトロアミノベンゼン誘導体、フルオロジニトロトルイジン化合物、イソキサゾリジノン、ニコチン酸、イソプロピルアミン、イソプロピルアミン誘導体、オキサジアゾリノン、リン酸塩、フタル酸塩、ピコリン酸化合物、トリアジン、トリアゾール、ウラシル、尿素誘導体、エンドサル、塩素酸ナトリウム、もしくはそれらの組み合わせを含有する;
前記防かび剤が、置換ベンゼン、チオカルバマート、エチレンビスジチオカルバマート、チオフタリドアミド、銅化合物、有機水銀化合物、有機スズ化合物、カドミウム化合物、アニラジン、ベノミル、シクロへキサミド、ドジン、エトリジアゾール、イプロジオン、メトラキシル、チアミメホン、トリホリン、もしくはそれらの組み合わせを含有する;
前記真菌接種剤は、グロメラセア(Glomeraceae)科の真菌接種剤、クラロイドグロメラセア(Claroidoglomeraceae)科の真菌接種剤、ギガスポラセア(Gigasporaceae)科の真菌接種剤、アカウロスポラセア(Acaulosporaceae)科の真菌接種剤、サッキュロスポラセア(Sacculosporaceae)科の真菌接種剤、エンテロホスポラセア(Entrophosporaceae)科の真菌接種剤、パシドスポラセア(Pacidsporaceae)科の真菌接種剤、ダイバーシスポラセア(Diversisporaceae)科の真菌接種剤、パラグロメラセア(Paraglomeraceae)科の真菌接種剤、アカエオスポラセア(Archaeosporaceae)科の真菌接種剤、ゲオシフォナセア(Geosiphonaceae)科の真菌接種剤、アンビスポラセア(Ambisporaceae)科の真菌接種剤、スクテロスポラセア(Scutellosporaceae)科の真菌接種剤、デンティスクルタタセア(Dentiscultataceae)科の真菌接種剤、ラコセトラセア(Racocetraceae)科の真菌接種剤、バシディオマイコタ科(phylum Basidiomycota)の真菌接種剤、phylum Ascomycota科の真菌接種剤、ジゴマイコタ科(phylum Zygomycota)の真菌接種剤、もしくはそれらの組み合わせを含有する;
前記細菌接種剤は、リゾビウム(Rhizobium)属の細菌接種剤、ブラジリゾビウム(Bradyrhizobium)属の細菌接種剤、メソリゾビウム(Mesorhizobium)属の細菌接種剤、アゾリゾビウム(Azorhizobium)属の細菌接種剤、アロリゾビウム(Allorhizobium)属の細菌接種剤、シノリゾビウム(Sinorhizobium)属の細菌接種剤、クルイベラ(Kluyvera)属の細菌接種剤、アゾトバクター(Azotobacter)属の細菌接種剤、シュードモナス(Pseudomonas)属の細菌接種剤、アゾスピリリウム(Azospirillium)属の細菌接種剤、バチルス(Bacillus)属の細菌接種剤、ストレプトマイセス(Streptomyces)属の細菌接種剤、パニバチルス(Paenibacillus)属の細菌接種剤、パラコッカス(Paracoccus)属の細菌接種剤、エンテロバクター(Enterobacter)属の細菌接種剤、アルカリゲネス(Alcaligenes)属の細菌接種剤、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属の細菌接種剤、トリコデルマ(Trichoderma)属の細菌接種剤、グリオクラジウム(Gliocladium)属の細菌接種剤、グロムス(Glomus)属の細菌接種剤、クレブシエラ(Klebsiella)属の細菌接種剤、もしくはそれらの組み合わせを含有する;および/または
前記肥料が、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、重硫酸アンモニウム、ポリ硫化アンモニウム、チオ硫化アンモニウム、アンモニア水、無水アンモニア、ポリリン酸アンモニウム、硫酸アルミニウム、硝酸カルシウム、カルシウム硝酸アンモニウム、硫酸カルシウム、か焼マグネサイト、方解石質石灰岩、酸化カルシウム、硝酸カルシウム、ドロマイト質石灰石、消石灰、炭酸カルシウム、リン酸2アンモニウム、リン酸1アンモニウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、硝酸カリウム、塩化カリウム、硫酸カリウムマグネシウム、硫酸カリウム、硝酸ナトリウム、苦灰質石灰岩、マグネシア、尿素、尿素−ホルムアルデヒド、尿素硝酸アンモニウム、硫黄被覆尿素、ポリマー被覆尿素、イソブチリデンジウレア、K2SO4−2MgSO4、カイナイト、シルビナイト、キーゼル石、Epsom塩、元素状硫黄、泥灰土、粉末牡蠣、魚粉、油かす、魚肥料、血粉、リン鉱石、過リン酸肥料、スラグ、骨粉、木灰、肥料、バットグアノ、ピートモス、堆肥、生砂、綿実粉、羽毛粉、蟹粉、魚乳濁液、フミン酸、またはそれらの組み合わせを含有する、
請求項1、4、6、8、10、12、17、19、21、24、27、29、31、35、および37〜43のいずれか1項に記載の方法。
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RU2752927C1 (ru) * | 2020-12-15 | 2021-08-11 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Горский государственный аграрный университет" | Способ биологизированной технологии возделывания картофеля |
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