CN109182589A - 一种检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法 - Google Patents

一种检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，该方法包括对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA；采用特异引物Ba‑F/Ba‑R进行PCR反应；电泳检测，判断结果。本发明的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法克服了常规检测方法的不足，具有高特异性、反应稳定的优点，同时准确率高，易操作，用时短，全程检测只需4‑6h。

Description

一种检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术检测细菌领域，尤其涉及一种检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法。
背景技术
槟榔(Areca cathecu L.)，棕榈科槟榔属多年生常绿乔木，茎直立，乔木状，高10多米，最高可达30米，原产于热带太平洋地区、东南亚、南亚和东非部分地区，是我国重要的南药资源之一。中国槟榔主产区在海南和台湾，其中海南槟榔总产量位居世界第二位，且单位产量同样位居世界第二，达3336kg/hm2。槟榔是海南第一大经济作物，海南农民种植槟榔是脱贫致富的途径之一。
然而，随着槟榔种植面积的不断扩大，新的病害也不断出现。自1985年起，海南岛不少槟榔园先后发生不同程度的槟榔细菌性叶斑病，该病害严重影响槟榔的生长和产量。槟榔细菌性叶斑病是由须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderia andropogonis)侵染引起。该病可以侵染各龄槟榔叶，形成褐色坏死病斑，病斑周围有黄色晕圈，病斑不规则形，严重者导致整片叶片黄化干枯。带病种苗、田间病株及其残体是该病害的主要侵染来源，其通过雨水、流水和露水传播，从植株自然孔口和伤口入侵。雨量大、湿度高时，病害发展快，病情重。台风时雨水传播病菌，且植株伤口增多，利于病菌入侵，病害易流行。
目前的生产上，迫切需要能在早期诊断该病害的快速检测技术，但至今尚未见相关报道。因此，建立一套槟榔细菌性叶斑病病原菌快速、稳定的检测方法，是槟榔产区安全生产的重要保证。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，旨在解决常规检测方法耗时、准确度偏低的问题。
为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终获得了如下技术方案：
一种检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，该方法包括：
步骤一、对被检样品进行预处理，提取被检样品的总DNA；
步骤二、采用特异引物Ba-F/Ba-R进行PCR反应，其中上游引物Ba-F的序列如SEQID NO：1所示，下游引物Ba-R的序列如SEQ ID NO：1所示；
步骤三、电泳检测，按如下标准判断检测结果：有大小为513bp的特异亮带，表示结果为阳性；若无带，表示结果为阴性。
进一步优选地，如上所述的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，其中的PCR反应体系具体如下：2×TransTaq-T PCR SuperMix 10μl，上下游引物Ba-F和Ba-R各1μl，DNA模板1μl，无菌ddH2O 7μl，设置阳性对照反应时，用槟榔细菌性叶斑病菌基因组总DNA为模版；设置阴性对照反应时，用无菌ddH2O代替。
进一步优选地，如上所述的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，其中的上游引物Ba-F和下游引物Ba-R浓度均为10μmol/L。
进一步优选地，如上所述的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，其中的PCR反应条件具体如下：反应在Biometra 050-901PCR仪上进行，95℃预变性3min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延长40sec，进行40个循环；72℃延长10min。
进一步优选地，如上所述的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，其中PCR反应结束后，取5μL反应产物，2％琼脂糖凝胶电泳后Goldview染色观察结果。
本发明以须芒草伯克霍尔德氏菌基因组中的保守的16S ribosomal RNA的部分序列，比较分析该序列与槟榔细菌性条斑病菌、大肠杆菌等细菌16Sribosomal RNA中的差异位点，并考虑引物长度、GC含量、错配率、是否形成引物二聚体、3’端有无连续碱基等因素，设计了一对高特异性、反应稳定的引物，用于从槟榔叶片上特异性地检测须芒草伯克霍尔德氏菌。因此，本发明还提供了一种适用于检测不同发病程度的槟榔细菌性叶斑病的特异引物对，该引物对的上游引物Ba-F的序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物Ba-R的序列如SEQID NO：1所示。
另一方面，本发明还提供了上述特异引物对在检测田间不同发病程度的槟榔细菌性叶斑病中的应用。
最后一方面，本发明还提供了一种适用于检测田间不同发病程度的槟榔细菌性叶斑病的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下成分：2×TransTaq-T PCR SuperMix 10μl，上下游引物Ba-F和Ba-R各1μl，DNA模板1μl，无菌ddH2O 7μl；设置阳性对照反应时，用槟榔细菌性叶斑病菌基因组总DNA为模版；设置阴性对照反应时，用无菌ddH2O代替。
与现有技术相比，本发明检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法克服了常规检测方法的不足，具有高特异性、反应稳定的优点，同时准确率高，易操作，用时短，全程检测只需4-6h。
附图说明
图1是本发明实施例提供的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法流程图；
图2是本发明实施例提供的槟榔细菌性叶斑病菌检测引物的特异性分析结果；
图3是本发明实施例提供的槟榔细菌性叶斑病菌检测的田间应用检测结果。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。以下实施例仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明保护范围作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
实施例一：槟榔细菌性叶斑病菌的检测
检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法流程图如图1所示，具体检测步骤包括：
S101、对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA；具体操作是，将被检测槟榔样品用清水洗净擦干，在病健交界处切取组织块，再按照TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)说明书提取待检测槟榔样品的DNA。
S102、根据多种序列比对，设计特异引物Ba-F/Ba-R，序列如下：
Ba-F：5′-ACCTCGCGCTATAGGGGCG-3′；
Ba-R：5′-CATCGATGTTCCTCCGCATA-3′。
采用Ba-F和Ba-R引物做PCR反应；PCR反应具体如下：
20μL反应体系：2×TransTaq-T PCR SuperMix 10μl，上下游引物Ba-F和Ba-R各1μl，上下游引物引物浓度均为10μmol/L，DNA模板1μl，无菌ddH2O 7μl，设置阳性对照反应时，用槟榔细菌性叶斑病菌基因组总DNA为模版；设置阴性对照反应时，用无菌ddH2O代替；
反应在Biometra 050-901PCR仪上进行，95℃预变性3min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延长40sec，进行40个循环；72℃延长10min。
S103、电泳检测，判断结果。PCR反应结束后，取5μL反应产物，2％琼脂糖凝胶电泳后Goldview染色观察结果。判断标准：如果用Ba-F和Ba-R引物做PCR检测，有大小为513bp的特异亮带，表示结果为阳性，若无带，表示结果为阴性。
实施例二：检测方法的特异性、灵敏性和田间应用分析
PCR检测的特异性分析：
以须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderia andropogonis)，以及槟榔细菌性条斑病菌(Xanthomonas campestris pv.arecae)、槟榔炭疽病菌(Colletotrichumgloeoporioides)、槟榔茎基腐病(Ganoderna lucidum)、槟榔芽腐病菌(Phythophthorameadii)和槟榔茎泻血病菌(Thielaviopsis paradoxa)的DNA作为样品，以无菌ddH2O为阴性对照，测试引物Ba-F和Ba-R的特异性。
结果显示：经2％琼脂糖凝胶电泳检测各个PCR管的产物，仅模板是Burkholderiaandropogonis基因组DNA扩增出了大小为513bp的单一条带、表明为阳性，其余均无带、表明为阴性(见图2)，可见该PCR检测的特异性很高。
PCR检测的田间应用：
用上下游引物Ba-F和Ba-R进行PCR，对海南田间槟榔随机采集5个疑似样品进行检测。结果表明：5个样品中，从阳性对照(Positive control)、典型症状样品(Sample 1、Sample 4、Sample 8、Sample 12)和初发病症状样品(Sample 19)中均能检测出须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderia andropogonis)，在无症状健康的样品(Sample 2、Sample 3、Sample 4、Sample 5、Sample 6、Sample 7、Sample 9、Sample 10、Sample 11、Sample 13、Sample 14、Sample 15、Sample 16、Sample 17、Sample 18)和阴性对照(Negativecontrol)中检测不出该病菌(见图3)，表明该PCR检测方法可用于田间不同槟榔细菌性叶斑病发病程度的检测。
本发明的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法克服了常规检测方法的不足，具有高特异性、反应稳定的优点，易操作，用时短，只需4-6h。

Claims (8)

1.一种检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，其特征在于，该方法包括：
步骤一、对被检样品进行预处理，提取被检样品的总DNA；
步骤二、采用特异引物Ba-F/Ba-R进行PCR反应，其中上游引物Ba-F的序列如SEQ IDNO：1所示，下游引物Ba-R的序列如SEQ ID NO：1所示；
步骤三、电泳检测，按如下标准判断检测结果：有大小为513bp的特异亮带，表示结果为阳性；若无带，表示结果为阴性。
2.根据权利要求1所述的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，其特征在于，所述的PCR反应体系具体如下：2×TransTaq-T PCR SuperMix 10μl，上下游引物Ba-F和Ba-R各1μl，DNA模板1μl，无菌ddH2O 7μl，设置阳性对照反应时，用槟榔细菌性叶斑病菌基因组总DNA为模版；设置阴性对照反应时，用无菌ddH2O代替。
3.根据权利要求2所述的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，其特征在于，所述的上游引物Ba-F和下游引物Ba-R浓度均为10μmol/L。
4.根据权利要求1所述的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，其特征在于，所述的PCR反应条件具体如下：反应在Biometra 050-901 PCR仪上进行，95℃预变性3min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延长40sec，进行40个循环；72℃延长10min。
5.根据权利要求1所述的检测槟榔细菌性叶斑病菌的方法，其特征在于，PCR反应结束后，取5μL反应产物，2％琼脂糖凝胶电泳后Goldview染色观察结果。
6.一种适用于检测不同发病程度的槟榔细菌性叶斑病的特异引物对，其特征在于，该引物对的上游引物Ba-F的序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物Ba-R的序列如SEQ ID NO：1所示。
7.权利要求6所述的特异引物对在检测田间不同发病程度的槟榔细菌性叶斑病中的应用。
8.一种适用于检测田间不同发病程度的槟榔细菌性叶斑病的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下成分：2×TransTaq-T PCR SuperMix 10μl，上下游引物Ba-F和Ba-R各1μl，DNA模板1μl，无菌ddH2O 7μl；设置阳性对照反应时，用槟榔细菌性叶斑病菌基因组总DNA为模版；设置阴性对照反应时，用无菌ddH2O代替。
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