KR102222761B1

KR102222761B1 - 마이크로스트로마 파일로플라눔(Microstroma phylloplanum)AmE-3 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102222761B1
Application number: KR1020180080166A
Authority: KR
Inventors: 이지영; 김석원; 김차영; 정재철
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2018-07-10
Filing date: 2018-07-10
Publication date: 2021-03-03
Also published as: KR20200006431A

Abstract

본 발명은 마이크로스트로마 파일로플라눔 (Microstroma phylloplanum) AmE-3 균주 및 이를 포함하는 식물생장촉진용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 균주를 포함함으로써 식물에서 IAA (indole-3-actic acid) 생산이 증대되고, 작물의 발아, 발근, 식물생장 촉진 강화로 조기 수확, 출하 사이클 단축, 수확량 증가의 효과가 있는 환경친화적이고 인체친화적인 식물생장촉진용 조성물에 관한 것이다.

Description

마이크로스트로마 파일로플라눔(Microstroma phylloplanum)AmE-3 균주 및 이의 용도{Microstroma phylloplanum AmE-3 and use thereof}

본 발명은 마이크로스트로마 파일로플라눔(Microstroma phylloplanum)AmE-3 균주 및 이의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로는 식물 생장 촉진에 효과가 있는 균주 및 이를 포함하는 미생물 제제, 식물생장 촉진 방법에 관한 것이다.

내생균은 식물과 다양한 메커니즘으로 공생관계를 유지하며, 식물과 함께 지속적인 안정 관계를 수립한다고 보고되었다. 이러한 협력을 위해 식물은 내생균을 위해 영양분과 주거지를 제공해주며, 내생균은 식물의 생장을 촉진시키거나 식물을 병원균으로부터 보호함으로써 상보적인 관계를 형성한다. 식물의 생장과 관련하여 내생균은 기주식물의 생리활성 물질, 예를 들면, 지베렐린이나 IAA (Indole-3-Acetic Acid), abscisic acid, cytokinin과 같은 식물호르몬을 생산하여 식물 생장을 촉진시키거나 혹은 에틸렌, ACC deaminase, acetoin, 2, 3-butanediol과 같은 생장조절 물질들을 생산한다. 또한 토양으로부터 질소 고정이나 인산 가용화 같은 작용으로 영양분을 흡수하도록 도와 식물 생장을 촉진시키는 역할을 한다. 병원균에 대해서는 생물학적 방제제로서 역할을 하며 식물을 보호하고 병원균에 직접적인 항균작용을 하거나 바이오 엑티브한 이차대사물질을 생산을 통해 ISR (Induced Systemic Resistance)을 유도한다고 보고되었다.

그리고 환경적인 오염에 의한 식물독소 (Phytotoxic) 효과를 극복하도록 식물환경복원 (Phytoremediation)을 증가시킴으로써 기주식물을 돕거나, 환경을 정화시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이외에 약용식물에서는 몇몇의 내생균 (Taxus brevifolia, T. celebica, T. mairei, T. chinensis var. mairei, T. wallachiana) 에서 항암 효과가 있는 것으로 알려진 택솔 (taxol)과 같은 2차 대사물질을 생산하기도 한다는 보고가 되고 있다. 이와 같이 식물 내 미생물은 의학적, 산업적 가치가 크며 안정적인 농업과 환경을 위한 작물생장의 친환경적 생물 비료로서 관심을 받고 있다. 따라서 본 발명에서는 아로니아 식물로부터 내생균 마이크로스트로마 파일로플라눔 (Microstroma phylloplanum) AmE-3을 분리하였고 본 균주의 IAA 생성능 및 작물 생장 촉진능을 조사하여 마이크로스트로마 파일로플라눔의 농업적 활용도를 평가한 후 완성하였다.

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1) Shivas, R. G., Rodrigues de Miranda, L., Cryptococcus phylloplanus and Cryptococcus hinnuleus, two new yeast species , International journal of general and molecular microbiology, 1983, v.49, no.2, pp.153-158. 2) 한상민, 이상엽, 김하근, 이종수, 대둔산과 칠갑산 나뭇잎에서 야생효모들의 분리 및 특성, The Korean journal of mycology, 2017, v.45, no.1, pp.31-42.

따라서 본 발명의 목적은 신규 균주인 마이크로스트로마 파일로플라눔 (Microstroma phylloplanum) AmE-3를 식물체 또는 식물재배 토양에 살포하거나 전처리 등에 처리함으로써 식물 생장촉진, 발아 및 발근촉진, 식물면역강화 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명의 목적은 식물생장 촉진에 대한 우수한 효과를 지니는 마이크로스트로마 파일로플라눔 (Microstroma phylloplanum) AmE-3 균주 및 이의 배양물 생산방법, 이를 이용한 식물재배 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 마이크로스트로마 파일로플라눔 (Microstroma phylloplanum) AmE-3 균주 및 이의 배양물을 포함하는 식물 생장 촉직용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 생장 촉진에 대한 활성을 가지는, 마이크로스트로마 파일로플라눔 (Microstroma phylloplanum) AmE-3 균주(KCTC13521BP)를 제공한다.

또한 본 발명에서 상기 균주는 IAA (indole-3-actic acid)를 생산하여 식물 생장을 촉진시키며, 서열번호 1의 28S rRNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제을 제공한다.

또 다른 예로, 본 발명은 상기 미생물 제제를 토양, 식물 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물생장 촉진 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 작물의 생육 발아 및 발근, 식물생장을 촉진하고 과일의 색깔이 선명해지고 과실의 당도가 증가하는 효과가 있을 수 있다. 또한 천연 성분의 사용으로 연쇄 농업 장해를 경감시키며, 조기 수확으로 출하 사이클을 단축시킴으로써 수확량이 증가하는 효과가 있다.

또한, 본 발명을 통하여 친환경 생물비료 및 친환경 농자채 첨가제로의 활용가치가 높은 균주이다.

도 1은 마이크로스트로마 파일로플라눔 AmE-3균주의 IAA (indole-3-acetic acid) 생성능을 나타내는 것이다.
도 2는 마이크로스트로마 파일로플라눔 AmE-3 균주와 담배(N. benthamiana) 공동배양시 담배의 생장변화를 나타내는 것이다.
도 3은 마이크로스트로마 파일로플라눔 AmE-3 균주와 토마토(Micro-tom) 공동배양시 토마토의 생장변화를 나타내는 것이다.
도 4는 마이크로스트로마 파일로플라눔 AmE-3 균주와 담배(N. benthamiana)와 공동배양 후 작물의 생중량 (fresh weight)을 나타낸다.
도 5는 마이크로스트로마 파일로플라눔 AmE-3 균주와 토마토(Micro-tom)와 공동배양 후 작물의 생중량 (fresh weight)을 나타낸다.
도 6은 마이크로스트로마 파일로플라눔 AmE-3 균주와 담배(N. benthamiana)와 공동배양 후 작물의 엽록소 함량 (chlorophyll contents)을 나타낸다.
도 7은 마이크로스트로마 파일로플라눔 AmE-3 균주와 토마토(Micro-tom)와 공동배양 후 작물의 엽록소 함량 (chlorophyll contents)을 나타낸다.
도 8은 마이크로스트로마 파일로플라눔 AmE-3 균주와 담배(N. benthamiana) 공동배양 후 작물의 잎의 개수를 나타낸다.
도 9는 마이크로스트로마 파일로플라눔 AmE-3 균주와 토마토(Micro-tom)와 공동배양 후 작물의 잎의 개수를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 IAA 생산을 증가시켜 식물 생장 촉진 성능을 갖는 마이크로스트로마 파일로플라눔 (Microstroma phylloplanum) AmE-3 균주를 제공한다.

본 발명의 마이크로스트로마 파일로플라눔 (Microstroma phylloplanum) AmE-3 균주는 한국생명공학연구원 유전자은행에 2018년 5월 3일자로 기탁하였다. 본 발명의 마이크로스트로마 파일로플라눔 (Microstroma phylloplanum) AmE-3 균주의 기탁번호는 KCTC 13521BP이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 미생물 제제에서, 상기 식물 또는 작물은 나무 또는 농작물일 수 있고, 바람직하게는 오이, 고추, 가지, 감자, 무, 부추, 파, 파프리카, 참외, 메론, 포도, 딸기, 토마토, 벼, 밀, 보리, 호박, 잔디, 담배, 장미 및 인삼으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물이며, 보다 바람직하게는 오이, 고추, 가지, 감자, 무, 포도, 딸기, 토마토, 벼, 밀, 보리, 호박, 잔디, 담배, 장미 및 인삼으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물이고, 가장 바람직하게는 오이, 고추, 가지, 감자, 무, 포도, 딸기, 토마토 및 담배로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물이나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 통상의 기술자에게는 명백한 것이다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

<실시예 1> 균 분리 및 배양

아로니아 식물 잎 조직의 겉 표면을 살균하기 위해서 70% ethanol에 1분 침지 후 멸균수로 헹구고 1% NaOCl에 20분 침지시킨 후 멸균수로 5번 헹궈낸다. 2-3 cm 길이로 잎 조직을 MSBM 배지에서 배양 2주 후 배지 밖으로 나온 미생물들을 LB, PDA, TSA배지에서 순수분리 하였다. 분리된 총 7개의 균주들은 마크로젠 (Daejeon, Korea) 28S ribosomal RNA 시컨싱 서비스를 통하여 동정을 실시하였다. 얻어진 28S rRNA 유전자 염기서열을 NCBI (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD. USA)의 BLAST program 을 이용하여 유연관계를 분석하였다.

<실시예 2> 균주의 IAA ( indole -3-acetic acid) 생성능

Potato dextrose broth (PDB) 배지에서 배양 (30 ℃)한 균주의 OD600을 1.0으로 보정하고 IAA의 전구물질인 L-tryptophan을 3mM 첨가한 PDB배지에 10%씩 접종하였다. 암배양 24시간 후 1mL을 원심분리하여 (8000xg, 20min)상등액 0.5 mL을 salkowski용액 (H₂SO₄, 150ml, H₂O 250 ml, 0.5M FeCl₃.6H₂O 7.5 mL) 2ml에 혼합하여 상온에서 30분 반응시킨 다음 UV-spectrophotometer를 이용하여 530㎚의 파장에서 흡광도를 측정한 후, 측정한 값을 IAA standard (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 비교하여 분리균주에 대한 IAA의 농도를 계산하였다.

실험 결과는 도 1에서 나타난 바와 같이 마이크로스트로마 파일로플라눔 AmE-3균주는 IAA의 전구체인 L-tryptophan을 식물 생장호르몬 형태인 IAA로 전환시켜주는 능력을 지니고 있음을 확인하였다.

<실시예 3> 작물(담배, 토마토) 배양시 작물의 생장변화

담배와 토마토 종자는 70% EtOH 1분, 1% sodium hypochloride에 20분 표면 살균 후 1/2 MS media (1/2 MS salt, 0.05% MES, 1% Sucrose, 1.5% agar)에 치상한 후 광 16시간, 암 8시간 조건의 식물생장상에서 9일 배양한다. 크기가 비슷한 seedling을 선택하여 새로운 1/2 MS media 에 식물의 seedling을 일렬로 배열하고 뿌리끝으로부터 4cm 떨어진 위치에 마이크로스트로마 파일로플라눔 AmE-3 균주를 일직선으로streaking 한다. 담배는 공동 배양 7일 후, 토마토는 공동배양 10일 후 식물의 생장을 관찰한다.

실험 결과는 도 2의 담배식물 및 도 3의 토마토의 생장 모습 변화에서 볼 수 있는 바와 같이, 마이크로스트로마 파일로플라눔 AmE-3 균주와 공동배양한 담배 및 토마토 작물의 생장이 현저히 증가됨을 확인하였다.

또한 균주와 작물(담배, 토마토) 공동배양 후 작물의 생중량 (fresh weight)을 측정한 결과, 마이크로스트로마 파일로플라눔 AmE-3 균주와 공동배양한 담배 및 토마토 작물의 생중량이 증가한 것을 확인하였다. 담배식물은 비교군에 비해 4배 증가하였고(도 4 참조), 토마토는 비교군에 비해 약 3배의 생중량이 증가함을 관찰하였다. (도 5 참조)

<실시예 4> 마이크로스트로마 파일로플라눔 AmE -3 균주와 작물(담배, 토마토) 공동배양 후 작물의 엽록소 함량 (chlorophyll contents)

도 4 및 5의 결과에서 나온 식물의 각 seedling을 95% EtOH에 30min정도 담근 후 엽록소가 완전히 빠져나오면 10,000xg에서 5분정도 원심분리 후 상등액만 분리한다. Chlorophyll a 와 b 함량은 UV-spectrophotometer 663 과 646 nm 각각에서 측정하여 total chlorophyll 함량을 계산한다.

계산 결과, 엽록소 함량이 비교군에 비해 마이크로스트로마 파일로플라눔 AmE-3 균주와 공동배양 한 작물에서 담배 약 2.7배, 토마토 약 5배가 증가되었다. (도 6 및 도 7 참조)

또한, 마이크로스트로마 파일로플라눔 AmE-3 균주와 작물(담배, 토마토) 공동배양 후 작물의 잎의 개수를 관찰한 결과, 비교군에 비해 마이크로스트로마 파일로플라눔 AmE-3 균주와 공동배양 한 작물에서 잎의 개수가 담배 약 1.5배, 토마토 약 1.5배가 증가된 것을 확인하였다.(도 8 및 도 9 참조)

한국생명공학연구원

KCTC13521BP

20180503

<110> KRIBB <120> Microstroma phylloplanum AmE-3 and use thereof <130> M18-5269 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1343 <212> RNA <213> Microstroma phylloplanum AmE-3 <400> 1 ccctagtaac ggcgagtgaa gcgggaagag ctcaaatttg aaagctggta ccttcggtgc 60 ccgcgttgta atctcgagaa gtgttttccg tgctggacca tgtacaagtt ccttggaata 120 ggacgtcata gagggtgaaa atcccgtact tgacatggac gcccagtgct ttgtgataca 180 ctctccacga gtcgagttgt ttgggaatgc agctcaaaat gggtggtaaa ttccatctaa 240 agctaaatat tggggagaga ccgatagcga acaagtaccg tgagggaaag atgaaaagca 300 ctttggaaag agagttaaac agtacgtgaa attgtcgaaa gggaagcgct tgaagttaga 360 catgcctatt aggattcagc cttgcttttg cttggtgtat ttcctggtaa gcaggccagc 420 atcagttttg tctgtcggat aagggtagaa ggaatgtggc ccctcggggt gttatagcct 480 tttactggat acggcggatg ggactgagga ccgcagtgcg cctttatggc gggccttttg 540 gcaccttcgc acttaggatg ctggcgtaat ggctttaagc gacccgtctt gaaacacgga 600 ccgaggagtc taacatgtct gcgagtcttt gggtggcaaa cccataggcg caatgaaagt 660 gaatgcaggt gggatcctta cggagcacca tcgaccgatc cggatcttct gtgatggatt 720 tgagtaagag catatatgtt gggacccgaa agatggtgaa ctatgcctga atagggcgaa 780 gccagaggaa actctggtgg aggctcgtag cggttctgac gtgcaaatcg atcgtcgaat 840 ttgggtatag gggcgaaaga ctaatcgaac catctagtag ctggttcctg ccgaagtttc 900 cctcaggata gcagaaactc gcatcagttt tatgaggtaa agcgaatgat tagaggcctt 960 ggggatgcaa catccttaac ctattctcaa actttaaata tgtaagaagc ccttgttact 1020 taagtgaacg tgggcatgcg aatgagagtt tctagtgggc catttttggt aagcagaact 1080 ggcgatgcgg gatgaaccga aagtggggtt aaggtgccgg aatatacgct catcagacac 1140 cacaaaaggt gttgattcat ctagacagca ggacggtggc catggaagtc ggaacccgct 1200 aaggagtgtg taacaactca cctgccgaat gaatcagccc tgaaaattca tggcgcttaa 1260 gcgtattacc cataccccac cgtcagcgtt agagcgacgc gttgacgagt aggcaggcgt 1320 ggaggtttgt gtagaagcct agg 1343

Claims

마이크로스트로마 파일로플라눔 (Microstroma phylloplanum) AmE-3 균주 (KCTC13521BP)
제1항에 있어서, 상기 균주는 식물 생장을 촉진하는 것을 특징으로 하는 균주
제1항에 있어서, 상기 균주는 IAA (indole-3-acetic acid)를 생산하여 식물 생장을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 균주
제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 28S rRNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 균주
제1항에 따른 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제
제5항에 있어서, 상기 균주는 IAA(Indole-3-acetic acid)을 생산하여 식물 생장을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 미생물 제제
제5항의 미생물 제제를 토양, 식물 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물생장 촉진 방법