BR122022017521B1 - Método para proteger uma planta de um patógeno - Google Patents

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Katie Thompson
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Abstract

a presente invenção está direcionada de forma geral a proteínas de fusão contendo uma sequência de direcionamento que direciona a proteína de fusão ao exosporium de um membro da família de bacillus cereus. a invenção também se refere aos membros da família de bacillus cereus recombinante que expressam tais proteínas de fusão e formulações contendo os membros da família de bacillus cereus recombinante expressando as proteínas de fusão. métodos para estimular o crescimento da planta, para proteger as plantas de patógenos, e para potencializar a resistência ao estresse em uma planta pela aplicação dos membros da família de bacillus cereus recombinantes ou as formulações para plantas ou meio de crescimento da planta também são descritos. a presente in-venção também se refere a métodos de imobilização de esporos de um membro da família de bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão nas plantas.

Description

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Pro visório N° de série 61/799,262, depositado em 15 de março de 2013, cujo pedido é incorporado neste documento a título de referência em sua to-talidade.
Campo da Invenção
[0002] A presente invenção geralmente diz respeito a proteínas de fusão contendo uma sequência de direcionamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo que direciona a proteína de fusão para o exósporo de um membro da família Bacillus cereus. A invenção também diz respeito a membros da família de Bacillus ce- reus recombinantes que expressão tais proteínas de fusão e fórmulas contendo os membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressão as proteínas de fusão. A invenção ainda diz respeito aos métodos para estimulação do crescimento de plantas, para proteção de plantas contra patógenos e para aumento da resistência ao estresse em plantas por aplicação dos membros da família Bacillus ce- reus recombinantes ou das fórmulas em plantas ou um meio de crescimento de plantas. A invenção também diz respeito aos métodos para imobilização de esporos de um membro da família Bacillus cereus re- combinante que expressa uma proteína de fusão em plantas ou em matéria vegetal.
Fundamentos Da Invenção
[0003] Dentro da zona de circunda as raízes da planta se encontra uma região chamada de rizosfera. Na rizosfera, as bactérias, fungos e outros organismos competem por nutrientes e pela ligação com as estruturas da raiz da planta. Tanto as bactérias ou fungos prejudiciais como benéficos podem ocupar a rizosfera. As bactérias, fungos e o sistema de raiz da planta podem todos ser influenciados pelas ações de peptídeos, enzimas e outras proteínas na rizosfera. O aumento do solo ou tratamento das plantas com certos destes peptídeos, enzimas ou outras proteínas teria efeitos benéficos nas populações gerais de bactérias e fungos benéficos do solo, criariam um ambiente geral de solo mais saudável para o crescimento das plantas, melhoraria o crescimento das plantas e forneceria a proteção de plantas contra determinados patóge- nos bacterianos e fúngicos. No entanto, tentativas anteriores para introduzir peptídeos, enzimas e outras proteínas no solo a fim de induzir tais efeitos benéficos em plantas foram frustradas pela baixa sobrevivências das enzimas, proteínas e peptídeos no solo. Adicionalmente, a prevalência de proteases naturalmente presentes no solo leva à degradação das proteínas no solo. O ambiente ao redor das raízes de uma planta (a rizosfera) é uma mistura única de bactérias, fungos, nutrientes e raízes que possui qualidades diferentes em relação ao solo nativo. A relação simbiótica entre estes organismos é única e poderia ser alterada para melhor com a inclusão de proteínas exógenas. A alta concentração de fungos e bactérias na rizosfera causa ainda mais degradação das proteínas devido a altos níveis anormais de proteases e outros elementos prejudiciais às proteínas no solo. Além disso, as enzimas e outras proteínas introduzidas no solo podem rapidamente se dissipar das raízes das plantas.
[0004] Sendo assim, existe uma necessidade na técnica para um método que entregue de forma eficiente os peptídeos, enzimas e outras proteínas às plantas (por exemplo, nos sistemas de raízes de plantas) e para estender o período de tempo durante o qual tais moléculas permanecem ativas. Além disso, existe uma necessidade na técnica para um método de direcionamento seletivo de tais peptídeos, enzimas e proteínas para a rizosfera e para as folhas e raízes de plantas em especial.
Resumo Da Invenção
[0005] Apresente invenção é direcionada a proteínas de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de planta, pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta ou pelo menos uma proteína ou peptídeo que liga uma planta. A proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de planta compreende um hormônio de peptídeo, um peptídeo não hormonal ou uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação de crescimento de planta. A proteína de fusão também compreende uma sequência de direcionamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo. A sequência de direcionamento, proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo pode ser: (a) uma sequência de direcionamento compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 43% de identidade com aminoácidos 20-35 da SEQ ID N°: 1, caracterizado pelo fato de que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 54%; (b) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID N°: 1; (c) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 de SEQ ID N°: 1; (d) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 1; (e) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoá- cidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 2; (f) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 de SEQ ID N°: 3; (g) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 de SEQ ID N°: 3; (h) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 3; (i) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 4; (j) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 de SEQ ID N°: 5; (k) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-38 de SEQ ID N°: 5; (l) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 5; (m) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 6; (n) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 de SEQ ID N°: 7; (o) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-28 de SEQ ID N°: 7; (p) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 7; (q) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 8; (r) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 de SEQ ID N°: 9; (s) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 de SEQ ID N°: 9; (t) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 9; (u) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoá- cidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 10: (v) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SED ID N°:11; (w) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID N°: 11; (x) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 11; (y) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 12; (z) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SEQ ID N°: 13; (aa) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID N°: 13; (ab) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°:13; (ac) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SED ID N°:14; (ad) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 de SED ID N°: 15: (ae) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 de SED ID N°: 15; (af) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°:15; (ag) uma proteína de exóporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°:16; (ah) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 de SED ID N°: 17; (ai) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 de SEQ ID N°: 17; (aj) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°:17; (ak) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°:18; (al) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SED ID N°: 19; (am) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID N°: 19 (an) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°:19; (ao) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°:20; (ap) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SED ID N°: 21; (aq) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID N°: 21; (ar) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°:21; (as) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SED ID N°:22; (at) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 de SED ID N°: 23; (au) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoáci- dos 9-24 de SEQ ID N°: 23; (av) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°:23; (aw) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SED ID N°:24; (ax) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 de SED ID N°: 25; (ay) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 de SEQ ID N°: 25; (az) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°:25; (ba) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°:26; (bb) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 de SED ID N°: 27; (bc) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 de SEQ ID N°: 27; (bd) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°:27; (be) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°:28; (bf) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SED ID N°: 29; (bg) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID N°: 29; (bh) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°:29; (bi) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°:30; (bj) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 de SED ID N°: 31; (bk) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 de SEQ ID N°: 31; (bl) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°:31; (bm) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°:32; (bn) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 de SED ID N°: 33; (bo) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°:33; (bp) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°:34; (bq) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-16 de SED ID N°: 35 (br) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°:35; (bs) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°:36; (bt) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-29 de SED ID N°:43; (bu) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-29 de SEQ ID N°: 43; (bv) uma sequência de direcionamento com-preendendo SEQ ID N°: 43; (bw) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 44; (bx) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 de SEQ ID N°: 45; (by) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 de SEQ ID N°: 45; (bz) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 45; (ca) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 46; (cb) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoáci- dos 1-43 de SEQ ID N°: 47: (cc) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 de SED ID N°: 47: (cd) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°: 47; (ce) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 48; (cf) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-32 de SEQ ID N°: 49; (cg) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoáci- dos 17-33 de SEQ ID N°: 49; (ch) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 49; (ci) uma proteína de exósporo compre-endendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 50; (cj) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SEQ ID N°: 51; (ck) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID N°: 51; (cl) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 51; (cm) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 52; (cn) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoáci- dos 1-33 de SEQ ID N°: 53; (co) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID N°: 53; (cp) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 53; (cq) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 54; (cr) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 de SEQ ID N°: 55; (cs) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoáci- dos 15-30 de SEQ ID N°: 55; (ct) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 55; (cu) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 56; (cv) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-130 de SEQ ID N°: 57; (cw) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 115-130 de SEQ ID N°: 57; (cx) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 57; (cy) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 58; (cz) um fragmento de proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 59; (da) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 60; (db) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 61; (dc) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 62; (dd) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 63; (de) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 64; (df) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 65; (dg) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 66; (dh) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 67; (di) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 68; (dj) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 69; (dk) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 70; (dl) uma proteína de exósporo compre-endendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 71; (dm) uma proteína de exósporo compre-endendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 72; (dn) uma proteína de exósporo compre-endendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 73; (do) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 74; (dp) uma proteína de exósporo com-preendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 75; (dq) uma proteína de exósporo compre-endendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 76; (dr) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 77; (ds) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 78; (dt) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 79; (du) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 80; (dv) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 81; (dw) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 82; (dx) uma proteína de exósporo compre-endendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 83:(dy) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 84; (dz) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-31 de SEQ ID N°: 1; (ea) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-33 de SEQ ID N°: 1; (eb) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-31 de SEQ ID N°: 1; (ec) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-23 de SEQ ID N°: 3; (ed) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-25 de SEQ ID N°: 3; ou (ef) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-23 de SEQ ID N°: 3.
[0006] A invenção relaciona-se também a proteínas de fusão que compreendem uma sequência de direcionamento, uma proteína do exósporo, ou fragmento da proteína do exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno. A sequência de direcionamento, uma proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo pode ser: (a) uma sequência de direcionamento consistindo de uma sequência de aminoácidos que consiste de 16 aminoácidos e tendo pelo menos 43% de identidade com aminoáci- dos 20-35 da SEQ ID N°: 1, caracterizado pelo fato de que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 54%; (b) uma sequência de direcionamento consistindo de aminoácidos 1-35 da SEQ ID N°: 1; (c) uma sequência de direcionamento consistindo de aminoácidos 20-35 de SEQ ID N°: 1; (d) uma sequência de direcionamento consistindo de SEQ ID N°: 1; (e) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 60; (f) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 de SEQ ID N°: 3; (g) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 de SEQ ID N°: 3; (h) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 3; (i) uma proteína de exós- poro compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 4; (j) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 de SEQ ID N°: 5; (k) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-38 de SEQ ID N°: 5; (l) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 5; (m) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 6; (n) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 de SEQ ID N°: 7; (o) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-28 de SEQ ID N°: 7; (p) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 7; (q) uma proteína de exós- poro compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 8; (r) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 de SEQ ID N°: 9; (s) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 de SEQ ID N°: 9; (t) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 9; (u) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 10: (v) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 133 de SED ID N°:11; (w) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID N°: 11; (x) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 11; (y) uma proteína de exós- poro compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 12; (z) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SEQ ID N°: 13; (aa) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID N°: 13; (ab) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°:13; (ac) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SED ID N°:14; (ad) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 de SED ID N°: 15: (ae) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 de SED ID N°: 15; (af) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°:15; (ag) uma proteína de exóporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°:16; (ah) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 de SED ID N°: 17; (ai) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 de SEQ ID N°: 17; (aj) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°:17; (ak) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°:18; (al) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SED ID N°: 19; (am) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID N°: 19 (an) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°:19; (ao) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°:20; (ap) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SED ID N°: 21; (aq) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID N°: 21; (ar) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°:21; (as) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SED ID N°:22; (at) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 de SED ID N°: 23; (au) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoáci- dos 9-24 de SEQ ID N°: 23; (av) uma sequência de direcionamento com-preendendo SEQ ID N°:23; (aw) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SED ID N°:24; (ax) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 de SED ID N°: 25; (ay) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 de SEQ ID N°: 25; (az) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°:25; (ba) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°:26; (bb) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 de SED ID N°: 27; (bc) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 de SEQ ID N°: 27; (bd) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°:27; (be) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°:28; (bf) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SED ID N°: 29; (bg) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID N°: 29; (bh) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°:29; (bi) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°:30; (bj) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 de SED ID N°: 31; (bk) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 924 de SEQ ID N°: 31; (bl) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°:31; (bm) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°:32; (bn) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 de SED ID N°: 33; (bo) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°:33; (bp) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°:34; (bq) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-16 de SED ID N°: 35 (br) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°:35; (bs) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°:36; (bt) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-29 de SED ID N°:43; (bu) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-29 de SEQ ID N°: 43; (bv) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 43; (bw) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 44; (bx) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 de SEQ ID N°: 45; (by) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 de SEQ ID N°: 45; (bz) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 45; (ca) uma proteína de exósporo compreen-dendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 46; (cb) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 de SEQ ID N°: 47: (cc) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 de SED ID N°: 47: (cd) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID N°: 47; (ce) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 48; (cf) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 132 de SEQ ID N°: 49; (cg) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 17-33 de SEQ ID N°: 49; (ch) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 49; (ci) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 50; (cj) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SEQ ID N°: 51; (ck) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID N°: 51; (cl) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 51; (cm) uma proteína de exósporo compreen-dendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 52; (cn) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SEQ ID N°: 53; (co) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID N°: 53; (cp) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 53; (cq) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 54; (cr) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 130 de SEQ ID N°: 55; (cs) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 de SEQ ID N°: 55; (ct) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 55; (cu) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 56; (cv) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-130 de SEQ ID N°: 57; (cw) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 115-130 de SEQ ID N°: 57; (cx) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 57; (cy) uma proteína de exósporo compre-endendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 58; (cz) um fragmento de proteína de exós- poro compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 59; (da) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 61; (db) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 62; (dc) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 63; (dd) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 64; (de) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 65; (df) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 66; (dg) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 67; (dh) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 68; (di) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 69; (dj) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID N°: 70; (dk) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 71; (dl) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 72; (dm) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 73; (dn) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 74; (do) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 75; (dp) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 76; (dq) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 77; (dr) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 78; (ds) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 79; (dt) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 80; (du) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 81; (dv) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 82; (dw) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 83; (dx) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 84; (dy) uma sequência de direcionamento consistindo de aminoácidos 22-31 de SEQ ID N°: 1; (dz) uma sequência de direcionamento consistindo de aminoácidos 22-33 de SEQ ID N°: 1; (ea) uma sequência de direcionamento consistindo de aminoácidos 20-31 de SEQ ID N°: 1; (eb) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-23 de SEQ ID N°: 3; (ec) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-25 de SEQ ID N°: 3; ou (ed) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-23 de SEQ ID N°: 3.
[0007] A presente invenção relaciona-se também a proteínas de fusão que compreendem uma sequência de direcionamento, uma proteína do exósporo, ou um fragmento da proteína do exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno. A proteína ou peptídeo que protege a planta de um patógeno pode compreender uma harpina, uma α-elastina, uma β-elastina, uma sistemina, uma fenilalanina amonia-liase, uma elicitina, uma defensina, uma criptogeina, uma proteína flagelina, uma bacteriocina, uma liso- zima, um peptídeo de lisozima, uma sideróforo, um peptídeo ativo não ribossomal, uma conalbumina, uma albumina, uma lactoferrina, um pep- tídeo de lactoferrina, ou TasA. Alternativamente, a proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno possui atividade inseticida, atividade helminticida, suprime insetos ou predação por vermes, ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, a proteína que protege uma planta contra um patógeno compreende uma enzima. A sequência de direcionamento, proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo pode ser quaisquer das sequências de direcionamento, proteínas de exósporo ou fragmentos de protéina de exósporo listadas cima no parágrafo [0005].
[0008] A presente invenção é também direcionada a proteínas de fusão que compreendem pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de exósporo. A proteína de exósporo pode ser uma proteína de exósporo que compreende uma sequência de aminoá- cidos tendo pelo menos 85% de identidade com quaisquer uma das SED ID NOs: 71, 75, 80, 81, 82, 83 e 84.
[0009] A presente invenção também se relaciona a um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa quaisquer umas das proteínas de fusão.
[0010] A invenção é também direcionada à fórmulas compreen dendo quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombinan- tes e um transportador agrícola aceitável.
[0011] A presente invenção também diz respeito a um método para estimulação de crescimento de plantas. O método compreende introduzir em um meio de crescimento de planta quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas, ou quaisquer das fórmulas que compreendem membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas. Alter-nativamente, o método compreende aplicar em uma planta, uma semente de planta, ou em uma área que circunda uma planta ou semente de planta, quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombi- nantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas, ou quaisquer das fórmulas que compreendem membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de planta. A proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas é fisicamente ligado ao exósporo do membro da família Bacillus recombinante.
[0012] A presente invenção também diz respeito a um método para estimulação de crescimento de plantas. O método compreende a introdução de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão em um meio de crescimento de plantas ou aplicação de um membro da família Bacillus recombinante que expressa uma proteína de fusão em uma planta, uma semente de planta ou uma área ao redor de uma planta ou semente de planta. A proteína de fusão compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de planta e uma sequência de direcionamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo. A sequência de direcionamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo pode ser quaisquer um dos listados acima no parágrafo [0005]. A proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas é fisicamente ligado ao exósporo do membro da família Bacillus recombinante.
[0013] A invenção adicionalmente diz respeito a um método para proteção de uma planta contra um patógeno ou aumento da resistência ao estresse em uma planta. O método compreende introduzir em um meio de crescimento de planta quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege a planta contra um patógeno ou pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta, ou quaisquer das fórmulas que compreendem quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno ou pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta. Alternativamente, o método compreende aplicar em uma planta, uma semente de planta, ou em uma área ao redor de uma planta, quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno ou pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta, ou quaisquer das fórmulas compreendendo quaisquer dos membros da família Bacillus ce- reus recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno ou pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta. A proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno ou a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta é fisicamente ligado ao exósporo do membro da família Bacillus cereus recombinante.
[0014] A presente invenção também é direcionada a um método para a imobilização de um esporo de membro da família Bacillus cereus recombinante em uma planta. O método compreende introduzir em um meio de crescimento de planta quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam pelo menos uma proteína ou peptídeo de ligação em planta, ou quaisquer das fórmulas que compreendem quaisquer dos membros da família Bacillus cereus re- combinantes que expressam pelo menos uma proteína ou peptídeo de ligação em plantas. Alternativamente, o método compreende aplicar em uma planta, uma semente de planta, ou em uma área que circunda uma planta ou semente de planta, quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam pelo menos uma proteína ou peptídeo de ligação em plantas, ou quaisquer das fórmulas que compreendem quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombi- nantes que expressam pelo menos uma proteína ou peptídeo de ligação em plantas. A proteína ou peptídeo de ligação em plantas é fisicamente ligado ao exósporo do membro da família Bacillus cereus recombinante.
[0015] Outros objetos e características serão em parte aparente e em parte indicados doravante.
Breve Descrição Das Figuras
[0016] A Figura 1 mostra um alinhamento de sequência de amino- ácidos da porção amino-terminal da cepa Sterne de Bacillus anthracis- BclA e com a região correspondente de várias proteínas de exósporo de membros da família de Bacillus cereus.
[0017] A Figura 2 mostra resultados exemplificativos de microsco- pia fluorescente para a expressão das proteínas de fusão contendo várias proteínas de exósporo ligadas a um relator de mCherry no exós- poro.
Definições
[0018] Quando os artigos "um", "uma", "um", "o ou a", e "referido" são usados neste documento, significam "pelo menos um" ou "um ou mais" exceto se indicados de outra forma.
[0019] Os termos "compreendendo", "incluindo" e "tendo" estão destinado a ser inclusivos e significam que pode existir elementos adicionais que não sejam os elementos listados.
[0020] O termo "peptídeo bioativo" se refere a qualquer peptídeo que exerce uma atividade biológica. "Peptídeo bioativos" podem ser gerados, por exemplo, através de clivagem de uma proteína, pró-proteína ou pré-proteína por uma protease ou peptidase.
[0021] Uma "enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação de crescimento de plantas" inclui qualquer enzima que cataliza etapas em um caminho de síntese biológica para um composto que estimula o crescimento de plantas ou altera a estrutura de plantas, ou qualquer enzima que cataliza a conversão de um derivativo inativo ou menos ativo de um composto que estimula o crescimento de plantas ou altera a estrutura da planta para uma forma ativa ou mais ativa do composto. Tais compostos incluem, por exemplo, porém não se limitam a, pequenas moléculas de hormônios vegetais tais como au- xinas ou citoquininas, peptídeos bioativos e pequenas moléculas de estimulação de crescimento de plantas sintetizadas por bactérias ou fungos na rizosfera (por exemplo, 2,3-butanediol).
[0022] O termo "proteína de fusão" conforme usado neste docu mento se refere a uma proteína possuindo uma sequência de polipeptí- deo que compreende sequências derivadas de duas ou mais proteínas separadas. Uma proteína de fusão pode ser gerada por unir uma molécula de ácido nucleico que codifica todo ou parte de um primeiro polipep- tídeo com uma molécula de ácido nucleico que codifica todo ou parte de um segundo polipeptídeo para criar uma sequência de ácido nucleico que, quando expressa, resulta em polipeptídeo único tendo propriedades funcionais derivadas de cada uma das proteínas originais.
[0023] O termo "imobilização de um esporo de membro da família Bacillus cereus recombinante em uma planta" se refere a ligação de um esporo de membro da família Bacillus cereus em uma planta, por exemplo, em uma raiz de uma planta ou em uma porção aérea de uma planta tal como uma folha, caule, folha ou fruto, de forma que o esporo seja mantido na estrutura da raiz da planta ou porção aérea ao invés de se dissipar no meio de crescimento da planta ou no ambiente circundante das porções aéreas da planta.
[0024] Um "meio de crescimento de plantas" inclui qualquer mate rial que é capaz de suportar o crescimento de uma planta.
[0025] Uma "proteína ou peptídeo potencializador de sistema imune de planta" conforme usado neste documento inclui qualquer proteína ou peptídeo que possui um efeito benéfico no sistema imune de uma planta.
[0026] O termo "proteína ou peptídeo de estimulação de cresci mento de plantas" conforme usado neste documento pode incluir qualquer proteína ou peptídeo que aumenta o crescimento da planta em uma planta exposta à proteína ou peptídeo.
[0027] Uma "proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno" conforme usado neste documento inclui qualquer proteína ou peptídeo que torna a planta exposta a proteína ou peptídeo menos susceptível à infecção com um patógeno.
[0028] Uma "proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta" conforme usado neste documento inclui qualquer proteína ou peptídeo que torna uma planta exposta a proteína ou peptídeo mais resistente ao estresse.
[0029] O termo "proteína ou peptídeo de ligação de planta" se re fere a qualquer proteína ou peptídeo que seja capaz de ligar-se especi-ficamente ou não-especificamente a qualquer parte de uma planta (por exemplo, uma raiz de uma planta ou uma parte aérea de uma planta, como uma folha, um caule, uma flor ou uma fruta) ou um material de origem vegetal.
[0030] O termo "sequência de direcionamento" conforme usado neste documento se refere a uma sequência de polipeptídeo que, quando presente como parte de um polipeptídeo maior ou uma proteína, resulta na localização do polipeptídeo maior ou da proteína em um local subcelular específico. As sequências de direcionamento descritas neste documento resultam na localização de proteínas para o exósporo de um membro da família Bacillus cereus.
Descrição Da Invenção
[0031] A presente invenção diz respeito a proteínas de fusão con tendo uma sequência de direcionamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo que direciona a proteína de fusão para o exósporo de um membro da família Bacillus cereus e: (a) pelo menos uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas; (b) pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno; (c) pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse de uma planta; ou (d) pelo menos uma proteína ou peptídeo de ligação de planta. Quando expresso em bactérias de membro da família de Bacillus cereus, estas proteínas de fusão são direcionadas a camada de exósporo do esporo e são fisicamente orientadas de forma que a proteína ou peptídeo esteja visível no lado de fora do esporo.
[0032] Este sistema de exibição de exósporo de Bacillus (BEMD) pode ser usado para entregar peptídeo, enzimas e outras proteínas para plantas (por exemplo, para folhas, frutos, flores, caules e raízes de plantas) ou para um meio de crescimento de planta tal como um solo. O peptídeos, enzimas e proteínas entregues no solo ou em outro meio de crescimento de plantas nesta maneira persiste e exibe uma atividade no solo para períodos de tempo estendidos. Introdução de bactérias de membro da família Bacillus cereus recombinantes que expressam as proteínas de fusão descritas neste documento no solo ou a rizosfera de uma planta que leva a um aumento benéfico do crescimento da planta em muitas condições de solo diferentes. O uso do BEMD para criar estas enzimas permite que elas continuem a exercer seus resultados benéficos para a planta e rizosfera ao longo dos primeiros meses de vida de uma planta.
Sequências De Direcionamento, Proteínas De Exósporo E Fragmentos De Proteína De Exósporo
[0033] Para facilitar a referência, as SEQ ID NOs. para peptídeos e sequências de proteínas mencionadas neste documento são listadas na Tabela 1 abaixo. Tabela 1: Sequências de Peptídeos e Proteínas
[0034] Bacillus é um gênero da bactéria em forma de bastonete. A família da bactéria Bacillus cereus inclui as espécies Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseu- domycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, e Bacillus wei- henstephensis. Sob condições ambientais estressantes, a bactéria da família Bacillus cereus passa por esporulação e forma endosporos ovais que podem permanecer dormentes por períodos de tempo prolongados. A camada mais externa dos endosporos é conhecida como exósporo e compreende uma camada basal circundada por uma tecido externo de projeções semelhantes a capilares. Os filamentos no tecido semelhante a capilares são predominantemente formados pela glicoproteína BcIA semelhante ao colágeno, enquanto que a camada basal é composta por inúmeras proteínas diferentes. Outra proteína relacionado ao colágeno, BcIB, também está presente no exósporo e exposta aos endosporos dos membros da família de Bacillus cereus. BcIA, o maior constituinte do tecido superficial tem mostrado estar ligado ao exósporo com seu amino-terminal (N-terminal) posicionado na camada basal e seu car- boxi-terminal (C-terminal) se estendendo para fora do esporo.
[0035] Descobriu-se previamente que determinadas sequências das regiões de N-terminal de BclA e BclB poderiam ser usadas para direcionar um peptídeo ou proteína para o exósporo de um endospóro de Bacillus cereus (vide Pedidos de Patentes U.S. N° 2010/0233124 e 2011/0281316, e Thompson et al., Targeting of the BclA and BclB proteins to the Bacillus anthracis spore surface, Molecular Microbiology 70(2):421-34 (2008), o conteúdo inteiro de cada um sendo incorporado neste documento por referência). Descobriu-se também que a proteína BetA/BAS3290 do Bacillus anthracis está localizada no exósporo.
[0036] Em especial, os aminoácidos 20-35 de BclA da cepe Sterne de Bacillus anthacis foram encontrados como sendo suficientes para di-recionar para o exósporo. Um alinhamento de sequência de aminoáci- dos 1-41 de BcIA (SEQ ID N°: 1) com as regiões N-terminal correspondentes de várias outras proteínas de exósporo da família Bacillus cereus e proteínas da família Bacillus cereus tendo relatado sequências são mostradas na Figura 1. Conforme pode ser visto na Figura 1, existe uma região de alta homologia entre todas as proteínas da região correspondente aos aminoácidos 20-41 de BcIA. Contudo, nestas sequências, os aminoácidos correspondem aos aminoácidos 36-41 de BclA que contém estrutura secundária e não são necessários para a localização da proteína de fusão ao exósporo. A região de sequência de direcionamento conservada de BclA aminoácidos 20-35 de SEQ ID N°: 1) é mostrado em negrito na Figura 1 e corresponde a sequência de direcionamento mínima necessária para a localização no exósporo. Uma região mais altamente conservada que transpõe aminoácidos 23-35 de BclA dentro da sequência de direcionamento é sublinhada nas sequências na Figura 1, é a sequência de reconhecimento para ExsFA/BxpB/ExsFB e homólogos, que direciona e monta as proteínas descritas na superfície do exósporo. As sequências de aminoácidos de SED ID N°s. 3, 5, e 7 na Figura 1 são os aminoácidos 1-33 de cepa Sterne de Bacillus anthracis BetA/BAS3290, uma metionina seguida por aminoácidos 2-43 de cepa Sterne de Bacillus anthracis BAS4623, e aminoácidos 1-34 de cepas Sterne de Bacillus anthracis, respectivamente. (Para BAS4623, descobriu-se que substituir a valina presente na posição 1 na proteína nativa com uma metionina resultou numa expressão melhor.)) Conforme pode ser visto a partir da Figura 1, cada uma destas sequências contém uma região conservada correspondendo aos aminoácidos 20-35 de BclA (SEQ ID N°: 1; mostrada em negrito) e uma região mais altamente con-servada correspondendo aos aminácidos 20-35 de BclA (sublinhados).
[0037] Proteínas adicionais de membros da família de Bacillus ce- reus também contém a região de direcionamento conservada. Em especial, na Figura 1, SED ID N°: 9 são aminoácidos de 1-30 de cepa Sterne de Bacillus anthracis BAS1882, SEQ ID N°: 11 são aminoácidos de 1-39 de produto de gene KBAB4 2280 de Bacillus weihenstephensis, SEQ ID N°: 13 são aminoácidos de 1-39 de produto de gene KBAB4 3572 de Bacillus weihenstephensis, SEQ ID N°: 15 são aminoácidos de 1-49 de peptídeo líder de exósporo VD200 de Bacillus cereus, SEQ ID N°: 17 são aminoácidos de 1-33 de peptídeo líder de exósporo VD166 de Bacillus cereus, SEQ ID N°: 19 são aminoácidos de 1-39 de proteína hipotética VD200 de Bacillus cereus IKG_04663, SEQ ID N°: 21 são aminoácidos de 1-39 de proteína β-propulsora KBAB4 YVTN de Bacillus weihenstephensis, SEQ ID N°: 23 são aminoácidos 1-30 de proteína hipotética de Bacillus weihenstephensis bcerkbab4_2363, SEQ ID N°: 25 são aminoácidos de 1-30 de proteína hipotética de Bacillus weihenstephensis KBAB4 bcerkbab4_2131, SEQ ID N°: 27 são aminoáci- dos de 1-36 deBacillus weihenstephensis KBAB4 repetição de tripla hélice contendo colágeno, SEQ ID N°: 29 são aminoácidos de 1-39 de Bacillus mycoides 2048 proteína hipotética bmyco0001_21660, SEQ ID N°: 31 são aminoácidos de 1-30 de Bacillus mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_22540, SEQ ID N°: 33 são aminoácidos de 1-21 de Bacillus mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_21510, SEQ ID N°: 35 são aminoácidos de 1-22 de Bacillus thuringiensis 35646 proteína de repetição de tripla hélice com colágeno, SEQ ID N°: 43 são aminoácidos de 1-35 de Bacillus cereus proteína hipotética WP_69652, SEQ ID N°: 45 são aminoácidos de 1-41 de Bacillus cereus líder de exósporo WP016117717, SEQ ID N°: 47 são aminoácidos de 1-49 de Bacillus cereus peptídeo de exósporo WP002105192, SEQ ID N°: 49 são aminoácidos de 1-38 de Bacillus cereus proteína hipotética WP87353, SEQ ID N°: 51 são aminoácidos de 1-39 de Bacillus cereus peptídeo de exósporo 02112369, SEQ ID N°: 53 são aminoácidos de 139 de Bacillus cereus proteína de exósporo WP016099770, SEQ ID N°: 55 são aminoácidos de 1-36 de Bacillus thuringiensisproteína hipotética YP006612525, e SEQ ID N°: 57 são aminoácidos de 1-136 de Bacillus mycoides proteína hipotética TIGR03720. Conforme mostrado na Figura 1, cada uma das regiões de N-terminal destas proteínas contém uma região que é conservada com aminoácidos 20-35 de BclA (SEQ ID N°: 1; e uma região mais altamente conservada correspondendo aos ami- nácidos 25-35 de BclA.
[0038] Nas proteínas de fusão da presente invenção, qualquer parte de BclA que inclui aminoácidos de 20-35 pode ser usada como sequência de direcionamento na presente invenção. Além disso, proteínas de exósporo de comprimento total ou fragmentos de proteínas de exósporo podem ser usados para direcionamento às proteínas de fusão para o exósporo. Sendo assim, BclA de comprimento total ou um fragmento de BclA que inclui aminoácidos de 20-35 podem ser usados para direcionamento ao exósporo. Por exemplo, BclA de comprimento total (SEQ ID N°: 2) ou um fragmento de tamanho médio de BclA que não possui carboxi-terminal tal como SEQ ID N°: 59 (aminoácidos de 1-196 ou BclA) podem ser usados para direcionar as proteínas de fusão ao exósporo. Fragmentos de tamanho médio tal como o fragmento de SEQ ID N°: 59 possui menos de estrutura secundária do que o BclA de comprimento total e descobriu-se que pode ser adequado para uso como uma sequência de direcionamento. A sequência de direcionamento também podem compreender partes muito menores de BclA que incluem aminoácidos de 20-35, tal como a SEQ ID N°: 1 (aminoácidos 1-41 de BclA), aminoácidos de 1-35 de SEQ ID N°: 1, aminoácidos 20-35 de SEQ ID N°: 1, ou SEQ ID N°: 60 (um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos de 20-35 de BclA) Fragmentos ainda menores de BclA que incluem apenas alguns aminoácidos de 20-35 também exibem a capacidade de direcionar proteínas de fusão ao exósporo. Por exemplo, a sequência de direcionamento podem compreender aminoácidos de 2231 de SEQ ID N°: 1, aminoácidos de 22-33 de SEQ ID N°: 1, ou aminoácidos de 20-31 deSEQ ID N°: 1.
[0039] Alternativamente, qualquer parte de BetA/BAS3290, BAS4623, BclB, BAS1882, o produto de gene de KBAB4 2280, o produto de gene de BAB4 3572, peptídeo líder de exósporo VD200 de B. cereus, peptídeo líder de exósporo VD166 de B. cereus, proteína hipotética VD200 de B. cereus IKG_04663, B. weihenstephensis KBAB4 YVTN proteína β-propulsora, B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2363, B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2131, B. weihenstephensis KBAB4 repetição de tripla hélice contendo colágeno, B. mycoides 2048 protéina hipotética bmyco0001_21660, B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_22540, B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_21510, B. thuringiensis 35646 proteína de repetição de tripla hélice contendo colágeno, B. cereus proteína hipotética WP_69652, B. cereus líder de exósporo WP016117717, B. cereus peptídeo de exós- poro WP002105192, B. cereus proetína hipotética WP87353, B. cereus peptíde de exósporo 02112369, B. cereus proteína de exósporo WP016099770, B. thuringiensis proteína hipotética YP006612525, ou B. mycoides proteína hipotética TIGR03720 que inclui aminoácidos que correspondem aos aminoácidos de 20-35 de BclA podem servir como a sequência de direcionamento. Conforme pode ser visto pela Figura 1, aminoácidos de 12-27 de BetA/BAS3290, aminoácidos de 23-38 de BAS4623, aminoácidos de de 13-28 de BclB, aminoácidos de 9-24 de BAS1882, aminoácidos de 18-33 de produto de gene KBAB4 2280, ami- noácidos de 18-33 de produto de gene KBAB4 3572, aminoácidos de aminoácidos de 28-43 de B. cereus VD200 peptíde líder de exósporo, aminoácidos de 12-27 de B. cereus VD166 peptíde líder de exósporo, aminoácidos de 18-33 of B. cereus VD200 proteína hipotética IKG_04663, aminoácidos de 18-33 B. weihenstephensis KBAB4 YVTN proteína β-propulsora, aminoácidos de 9-24 de B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2363, aminoácidos de 9-24 de B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2131, aminoácidos de 15-30 de B. weihenstephensis KBAB4 repetição de tripla hélice contendo colágeno, aminoácidos de 18-33 of B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyco0001_21660, aminoácidos de 9-24 de B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_22540, aminoácidos de 1-15 of B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_21510, ami- noácidos de 1-16 of B. thuringiensis 35646 proteína de repetição de tripla hélice contendo colágeno, aminoácidos de 14-29 de B. cereus proteína hipotética WP_69652, aminoácidos de 20-35 de B. cereus líder de exósporo WP016117717, aminoácidos de 28-43 de B. cereus peptí- deo de exósporo WP002105192, aminoácidos de 17-32 de B. cereus proteína hipotética WP87353, aminoácidos de 18-33 de B. cereus pep- tídeo de exósporo 02112369, aminoácidos de 18-33 de B. cereus proteína de exósporo WP016099770, aminoácidos de 15-30 de B. thurin- giensis proteína hipotética YP006612525, e aminoácidos de 115-130 de B. mycoides proteína hipotética TIGR03720 correspondendo aos aminoácidos de 20-35 de BclA. Sendo assim, qualquer parte destas proteínas que inclui os aminoácidos correspondentes listados acima pode servir como uma sequência de direcionamento.
[0040] Além disso, qualquer sequência de aminoácidos compreen dendo aminoácidos de 20-35 de BclA, ou qualquer dos aminoácidos correspondentes listados acima podem servir como a sequência de di-recionamento.
[0041] Portanto, a sequência de direcionamento podem compreen der aminoácidos de 1-35 de SEQ ID N°: 1, aminoácidos 20-35 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 60, aminoácidos de 22-31 de SEQ ID N°: 1, aminoácidos de 22-33 de SEQ ID N°: 1, ou aminoácidos de 20-31 deSEQ ID N°: 1. Alternativamente, a sequência de direcionamento consiste em aminoácidos de 1-35 da SEQ ID N°: 1, aminoácidos 20-35 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 1, ou SEQ ID N°: 60. Alternativamente, a sequência de direcionamento pode consistir de aminoácidos de 22-31 de SEQ ID N°: 1, aminoácidos de 22-33 de SEQ ID N°: 1, ou aminoácidos de 20-31 deSEQ ID N°: 1. Alternativamente, a proteína de exósporo podem compreender BclA de comprimento total (SEQ ID N°: 2) ou o fragmento de proteína de exósporo pode compreender um fragmento de tamanho médio de BclA que não contém carboxi-terminal, tal como SEQ ID N°: 59 (aminoácidos de 1-196 de BclA). Alternativamente, o fragmento de proteína de exósporo pode consistir de SEQ ID N°: 59.
[0042] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-27 de SEQ ID N°: 3, aminoácidos de 12-27 de SEQ ID N°: 3, ou SEQ ID N°: 3, ou a proteína de exósporo pode compreender BetA/BAS3290 de comprimento total (SEQ ID N°: 4). Descobriu-se também que um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos de 12-27 de BetA/BAS3290 pode ser usado como uma sequência de direcionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID N°: 61. A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 14-23 de SEQ ID N°: 3, aminoácidos de 1425 de SEQ ID N°: 3, ou aminoácidos de 12-23 deSEQ ID N°: 3.
[0043] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-38 de SEQ ID N°: 5, aminoácidos de 23-38 de SEQ ID N°: 5, ou SEQ ID N°: 5, ou a proteína de exósporo pode compreender BAS4623 de comprimento total (SEQ ID N°: 6).
[0044] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-28 da SEQ ID N°: 7, aminoácidos de 13-28 de SEQ ID N°: 7, ou SEQ ID N°: 7, ou a proteína de exósporo pode compreender BclB de comprimento total (SEQ ID N°:8).
[0045] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-24 de SEQ ID N°: 9, aminoácidos de 9-24 de SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 9, ou a proteína de exósporo pode compreender BAS1882 de comprimento total (SEQ ID N°: 10). Um resíduo de metio- nina ligado aos aminoácidos 9-24 de BAS1882 também pode ser usado como uma sequência de direcionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID N°: 69.
[0046] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-33 de SEQ ID N°:11, aminoácidos de 18-33 de SEQ ID N°: 11, ou SEQ ID N°: 11, ou a proteína de exósporo podem compreender B. weihenstephensis KBAB4 2280 produto de gene de comprimento total (SEQ ID N°: 12). Um resíduo de metionina ligado aos ami- noácidos de 18-33 de B. weihenstephensisKBAB4 2280 produto de gene também pode ser usado como uma sequência de direcionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID N°: 62.
[0047] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-33 de SEQ ID N°: 13, aminoácidos de 18-33 de SEQ ID N°: 13, ou SEQ ID N°:13, ou a proteína de exósporo podem compreender B. weihenstephensis KBAB4 3572 produto de gene de comprimento total (SEQ ID N°:14). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos de 18-33 de B. weihenstephensisKBAB4 3572 produto de gene também pode ser usado como uma sequência de direcionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID N°: 63.
[0048] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-43 da SEQ ID N°: 15, aminoácidos de 28-43 da SEQ ID N°: 15, ou SEQ ID N°:15, ou a proteína de exósporo pode compreender B. cereus VD200 peptídeo líder de exósporo de comprimento total (SEQ ID N°:16).
[0049] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-27 de SEQ ID N°: 17, aminoácidos de 12-27 de SEQ ID N°: 17, ou SEQ ID N°:17, ou a proteína de exósporo pode compreender B. cereus VD166 peptídeo líder de exósporo de comprimento total (SEQ ID N°:18). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos de 12-27 de B. cereus VD166 peptídeo líder de exósporo também pode ser usado como uma sequência de direcionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID N°: 64.
[0050] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-33 de SEQ ID N°: 19, aminoácidos de 18-33 de SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°:19, a proteína de exósporo pode compreender B. cereus VD200 proteína hipotética IKG_04663 de comprimento total (SEQ ID N°:20).
[0051] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-33 da SEQ ID N°: 21, aminoácidos de 18-33 de SEQ ID N°: 21, ou SEQ ID N°:21, ou a proteína de exósporo pode compreenderB. weihenstephensis KBAB4 YVTN proteína β-pro- pulsora de comprimento total (SEQ ID N°:22). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos de 18-33 de B. weihenstephensisKBAB4 YVTN proteína b-propulsora também pode ser usado como uma sequência de direcionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID N°: 65.
[0052] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-24 de SEQ ID N°: 23, aminoácidos de 9-24 de SEQ ID N°: 23, ou SEQ ID N°:23, ou a proteína de exósporo pode compreender B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2363 de comprimento total (SEQ ID N°:24). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos de 9-24 de B. weihenstephensisKBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2363 também pode ser usado como uma sequência de di-recionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode com-preender SEQ ID N°: 66.
[0053] A sequência de direcionamento pode compreender aminoá- cidos de 1-24 de SEQ ID N°: 25, aminoácidos de 9-24 de SEQ ID N°: 25, ou SEQ ID N°:25, ou a proteína de exósporo pode compreender B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2131 de comprimento total (SEQ ID N°:26). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos de 9-24 de B. weihenstephensisKBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2131 também pode ser usado como uma sequência de di-recionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode com-preender SEQ ID N°: 67.
[0054] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-30 da SEQ ID N°: 27, aminoácidos de 15-30 de SEQ ID N°: 27, ou SEQ ID N°:27, ou a proteína de exósporo pode compreender B. weihenstephensis KBAB4 repetição de tripla hélice contendo colágeno de comprimento total (SEQ ID N°:28).
[0055] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-33 de SEQ ID N°: 29, aminoácidos de 18-33 de SEQ ID N°: 29, ou SEQ ID N°:29, ou a proteína de exósporo pode compreen- derB. mycoides 2048 proteína hipotética bmyco0001_21660 de comprimento total (SEQ ID N°:30).
[0056] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-24 de SEQ ID N°: 31, aminoácidos de 9-24 de SEQ ID N°: 31, ou SEQ ID N°:31, ou a proteína de exósporo pode compreen- derB. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_22540 de comprimento total (SEQ ID N°:32). Um resíduo de metionina ligado aos amino- ácidos de 9-24 B. mycoides2048 proteína hipotética bmyc0001_22540 pode também ser usada como uma sequência de direcionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID N°: 68.
[0057] Alternativamente, a sequência de direcionamento compre ende aminoácidos de 1-15 da SEQ ID N°: 33, ou SEQ ID N°:33, ou a proteína de exósporo compreendeB. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_21510 de comprimento total (SEQ ID N°:34).
[0058] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-16 de SEQ ID N°: 35, SEQ ID N°:35, ou a proteína de exósporo pode compreender B. thuringiensis 35646 proteína de repetição de tripla hélice contendo colágeno de comprimento total (SEQ ID N°:36).
[0059] A sequência de direcionamento pode compreender aminoá- cidos de 1-29 de SEQ ID N°:43, aminoácidos de 14-29 de SEQ ID N°: 43, ou SEQ ID N°: 43, ou a proteína de exósporo pode compreender B. cereus proteína hipotética WP_69652 de comprimento total (SEQ ID N°: 44).
[0060] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-35 da SEQ ID N°: 45, aminoácidos 2035 de SEQ ID N°: 45, ou SEQ ID N°: 45, ou a proteína de exósporo pode compreender B. cereus líder de exósporo WP016117717 de comprimento total (SEQ ID N°: 46). Um resíduo de metionina ligado aos ami- noácidos de 20-35 de B. cereus líder de exósporo WP016117717 também pode ser usado como uma sequência de direcionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID N°: 70.
[0061] A sequência de direcionamento pode compreender aminoá- cidos de 1-43 de SEQ ID N°: 47, aminoácidos de 28-43 da SEQ ID N°: 47, ou SEQ ID N°: 47, ou a proteína de exósporo pode compreender B. cereus peptídeo de exósporo WP002105192 (SEQ ID N°: 48).
[0062] A sequência de direcionamento pode compreender aminoá- cidos de 1-32 de SEQ ID N°: 49, aminoácidos de 17-32 de SEQ ID N°: 49, ou SEQ ID N°: 49, ou a proteína de exósporo pode compreender B. cereus proteína hipotética WP87353 de comprimento total (SEQ ID N°: 50).
[0063] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-33 da SEQ ID N°: 51, aminoácidos de 18-33 de SEQ ID N°: 51, ou SEQ ID N°: 51, ou a proteína de exósporo pode compreender B. cereus peptídeo de exósporo 02112369 (SEQ ID N°: 52).
[0064] A sequência de direcionamento pode compreender aminoá- cidos de 1-33 de SEQ ID N°: 53, aminoácidos de 18-33 de SEQ ID N°: 53, ou SEQ ID N°: 53, ou a proteína de exósporo pode compreender B. cereus peptídeo de exósporo WP016099770 (SEQ ID N°: 54).
[0065] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-30 da SEQ ID N°: 55, aminoácidos de 15-30 de SEQ ID N°: 55, ou SEQ ID N°: 55, ou a proteína de exósporo pode compreender B. thuringiensis proteína hipotética YP006612525 de comprimento total (SEQ ID N°: 56).
[0066] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-130 de SEQ ID N°: 57, aminoácidos de 115-130 de SEQ ID N°: 57, ou SEQ ID N°: 57, ou a proteína de exósporo pode com- preenderB. mycoidesproteína hipotética TIGR03720 de comprimento total (SEQ ID N°: 58).
[0067] Além disso, pode ver prontamente através do alinhamento da sequência na Figura 1 que, enquanto os aminoácidos de 20-35 de BclA são conservados e os aminoácidos de 25-35 são mais conservados, algum grau de variação pode ocorrer nesta região sem afetar a capacidade da sequência de direcionamento para direcionar uma proteína ao exósporo. A Figura 1 lista o percentual de identidade de cada um dos aminoácidos correspondentes de cada sequência aos aminoá- cidos de 20-35 de BclA ("de 20-35% de identidade") e aos aminoácidos de 25-35 de BclA ("de 25-35% de identidade"). Sendo assim, por exemplo, conforme comparado aos aminoácidos de 20-35 de BclA, os ami- noácidos correspondentes de BetA/BAS3290 são cerca de 81,3% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS4623 são cerca de 50,0% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BclB são cerca de 43,8% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS1882 são cerca de 62,5% idênticos, os aminoácidos correspondentes de KBAB4 2280 produto de gene são cerca de 81,3 idênticos e os aminoácidos correspondentes de KBAB4 3572 produto de gene são cerca de 81,3% idênticos. As identidades das sequências sobre esta região para as se-quências restantes são listadas na Figura 1.
[0068] Com respeito aos aminoácidos de 25-35 de BclA, os ami- noácidos correspondentes de BetA/BAS3290 são cerca de 90,9% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS4623 são cerca de 72,7% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BclB são cerca de 54,5% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS1882 são cerca de 72,7% idênticos, os aminoácidos correspondentes de KBAB4 2280 produto de gene são cerca de 90,9% idênticos e os aminoácidos correspondentes de KBAB4 3572 produto de gene são cerca de 81,8% idênticos. As identidades das sequências sobre esta região para as sequências restantes são listadas na Figura 1.
[0069] Além disso, a sequência de direcionamento pode compre ender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 43% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 54%. Alternativamente, a sequência de direcionamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 43% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 54%.
[0070] A sequência de direcionamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 63%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 50% de identidade com amino- ácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoáci- dos 25-35 é de pelo menos 63%.
[0071] A sequência de direcionamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 72%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 50% de identidade com amino- ácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoáci- dos 25-35 é de pelo menos 72%.
[0072] A sequência de direcionamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 56% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 63%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 56% de identidade com amino- ácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoáci- dos 25-35 é de pelo menos 63%.
[0073] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de amino tendo pelo menos 62% de iden-tidade com aminoácidos 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 72%. A sequência de direcionamento também pode consistir em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 62% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 da SEQ ID N°:1 é de pelo menos 72%.
[0074] A sequência de direcionamento pode compreender uma se quência de aminoácidos tendo pelo menos 68% de identidade com ami- noácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoá- cidos 25-35 é de pelo menos 81%. Alternativamente, a sequência de direcionamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 68% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com ami-noácidos 25-35 é de pelo menos 81%.
[0075] A sequência de escolha pode compreender uma sequência de amino tendo pelo menos 75% de identidade com aminoácidos 2035 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 72%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 75% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 da SEQ ID N°:1 é de pelo menos 72%.
[0076] A sequência de escolha também pode compreender uma sequência de amino tendo pelo menos 75% de identidade com aminoá- cidos 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 81%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 amino- ácidos e tendo pelo menos 75% de identidade com aminoácidos de 2035 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 da SEQ ID N°:1 é de pelo menos 81%.
[0077] A sequência de direcionamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 81% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°:1, em que a identidade com aminoácidos de 25-35 é de pelo menos aproximadamente 81%. Alter-nativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 81% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°:1, em que a identidade com aminoácidos de 25-35 é de pelo menos aproximadamente 81%.
[0078] Além disso, a sequência de direcionamento pode compre ender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 81% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 90%. Alternativamente, a se-quência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consis-tindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 81% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com ami- noácidos 25-35 é de pelo menos 90%.
[0079] A pessoa versada na técnica reconhecerá que as variantes das sequências acima também podem ser usadas como sequências de direcionamento, desde que a sequência de direcionamento compreenda aminoácidos de 20-35 de BclA, os aminoácidos correspondentes de BetA/BAS3290, BAS4263, BclB, BAS1882, o KBAB4 2280 produto de gene, ou o KBAB 3572 produto de gene, ou uma sequência compreendendo qualquer das identidades de sequências observadas acima para aminoácidos de 20-35 e 25-35 de BclA estejam presentes.
[0080] Descobriu-se também que determinadas proteínas de exós- poro da família de Bacillus cereus que não contém regiões tendo homo- logia aos aminoácidos de 25-35 de BclA também podem ser usadas para direcionar um peptídeo ou proteína ao exósporo de um membro da família de Bacillus cereus. Em especial, as proteínas de fusão podem compreender uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID N°: 71 (B. mycoides InhA), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID N°: 72 (B. anthracis Sterne BAS1141 (ExsY)), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID N°: 73 (B. anthracis Sterne BAS1144 (BxpB/ExsFA)), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID N°: 74 (B. anthracis Sterne BAS1145 (CotY)), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID N°: 75 (B. anthracis Sterne BAS1140), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID N°: 76 (B. anthracis H9401 ExsFB), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID N°: 77 (B. thuringiensis HD74 InhA1), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID N°: 78 (B. cereus ATCC 10876 ExsJ), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID N°: 79 (B. cereus ExsH), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID N°: 80 (B. anthracis Ames YjcA), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID N°: 81 (B. anthracis YjcB), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID N°: 82 (B. anthracis Sterne BclC), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID N°: 83 (Bacillus thuringiensis serovar konkukian str. 9727 fosfatase ácida), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID N°: 84 (B. thuringiensis HD74 InhA2). Inclusão de uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID N°: 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, ou 84 nas proteínas de fusão descritas neste documento resultarão no direcionamento ao exósporo de um membro da família de B. cereus.
[0081] Além do mais, proteínas de exósporo tendo um alto grau de identidade de sequência com qualquer das proteínas de exósporo de comprimento total ou os fragmentos de proteínas de exósporo descritos acima também podem ser usados para direcionar um peptídeo ou proteína ao exósporo de um membro da família de Bacillus cereus. Sendo assim, a proteína de fusão pode compreender uma proteína de exós- poro que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com quaisquer uma das SED ID N°s:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 e 84. Alternativamente, a proteína de fusão pode compreender uma proteína de exósporo tendo pelo menos 90%, em pelo menos 95%, em pelo menos 98%, em pelo menos 99%, ou 100% de identidade com quaisquer umas das SEQ ID N°s: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 e 84.
[0082] Alternativamente, a proteína de fusão pode compreender um fragmento de proteína de exósporo consistindo de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID N°: 59. Alternativamente, a proteína de fusão pode compreender um fragmento de proteína de exósporo consistindo de uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade com a SEQ ID N°: 59.
[0083] Em qualquer uma das sequências de direcionamento, as proteínas de exósporo ou fragmentos de proteínas de exósporo descritas neste documento, a sequência de direcionamento, proteína de exós- poro, ou fragmento de proteína de exósporo podem compreender a sequência de aminoácidos GXT em seu carbóxi terminal, em que X é qualquer aminoácido.
[0084] Em quaisquer das sequências de direcionamento, proteínas de exósporo e fragmentos de proteínas de exósporo descritos neste do-cumento, a sequência de direcionamento, proteína de exósporo, ou fra-gmento de proteína de exósporo podem compreender uma resíduo de alanina na posição da sequência de direcionamento que corresponde ao aminoácido 20 da SEQ ID N°: 1.
Proteínas De Fusão
[0085] A presente invenção diz respeito às proteínas de fusão compreendendo uma sequência de direcionamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo de simulação de crescimento de plantas, caracte-rizado pelo fato que a proteína ou peptídeo de simulação de crescimento de plantas compreende um peptídeo hormonal, um peptídeo não hormonal, um uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação de crescimento de plantas. A sequência de direcionamento, proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo pode ser quaisquer das sequências de direcionamento, proteínas de exósporo ou fragmentos de proteínas de exósporo descritas cima no parágrafo [0005].
[0086] A presente invenção relaciona-se também a proteínas de fusão que compreendem uma sequência de direcionamento, proteína do exósporo, ou fragmento da proteína do exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta. A sequência de direcionamento, proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo pode ser quaisquer das sequências de direcionamento, proteínas de exósporo ou fragmentos de proteínas de exósporo descritas cima no parágrafo [0005].
[0087] Adicionalmente, a presente invenção relaciona-se a proteí nas de fusão que compreendem uma sequência de direcionamento, proteína do exósporo, ou fragmento da proteína do exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo de ligação em plantas. A sequência de direcionamento, proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo pode ser quaisquer das sequências de direcionamento, proteínas de exósporo ou fragmentos de proteínas de exósporo descritas cima no parágrafo [0005].
[0088] A presente invenção relaciona-se também às proteínas de fusão que compreendem uma sequência de direcionamento, uma proteína do exósporo, ou fragmento da proteína do exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno. A sequência de direcionamento, proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo pode ser quaisquer das sequências de direciona-mento, proteínas de exósporo ou fragmentos de proteínas de exósporo descritas cima no parágrafo [0006].
[0089] A presente invenção relaciona-se também a proteínas de fusão que compreendem uma sequência de direcionamento, uma proteína do exósporo, ou um fragmento da proteína do exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno. A proteína ou peptídeo que protege a planta de um patógeno pode compreender uma harpina, uma α-elastina, uma β-elastina, uma sistemina, uma fenilalanina amonia-liase, uma elicitina, uma defensina, uma criptogeina, uma proteína flagelina, uma bacteriocina, uma liso- zima, um peptídeo de lisozima, uma sideróforo, um peptídeo ativo não ribossomal, uma conalbumina, uma albumina, uma lactoferrina, um pep- tídeo de lactoferrina, ou TasA. Alternativamente, a proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno possui atividade inseticida, atividade helminticida, suprime insetos ou predação por vermes, ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, a proteína que protege uma planta contra um patógeno compreende uma enzima. A sequência de direcionamento, proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo pode ser quaisquer das sequências de direcionamento, proteínas de exósporo ou fragmentos de proteínas de exósporo descritas cima no parágrafo [0005].
[0090] A proteína de fusão pode ser feita usando clonagem padrão e métodos de biologia molecular conhecidos na técnica. Por exemplo, um gene que codifica uma proteína ou peptídeo (por ex., um gene que codifica uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas) pode ser amplificado por reação em cadeira de polimerase (PCR) e ligado ao DNA que codifica para qualquer uma das sequências de direcionamento descritas acima para formar uma molécula de DNA que codifica a proteína de fusão. A molécula de DNA que codifica a proteína de fusão pode ser clonada em qualquer vetor adequado, por exemplo, um vetor de plasmídeo. A adequabilidade do vetor compreende um sítio de clonagem múltipla no qual a molécula de DNA que codifica a proteína de fusão pode ser facilmente inserida. O vetor também contém de forma adequada um marcador selecionável, tal como um gene de resistência a antibióticos, tal como bactérias transformadas, transfectadas ou reproduzidas com o vetor podem ser prontamente identificadas e isoladas. Onde o vetor é um plasmídeo, a adequabilidade do plasmídeo também compreende uma origem de replicação. O DNA que codifica a proteína de fusão é adequada sob o controle de um promotor de esporulação que provocará a expressão da proteína de fusão ao exósporo de um endosporo de membro da família de B. cereus (por ex., um promotor de bclA nativo de um membro da família de B. cereus). Alternativamente, o DNA que codifica a proteína de fusão pode ser in-tegrado ao DNA cromossômico de um hospedeiro de um membro da família B. cereus.
[0091] A proteína de fusão também pode compreender sequências de polipeptídeo adicional que não são parte da sequência de direciona-mento, proteína de exósporo, fragmento de proteína de exósporo, ou proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas, a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno, a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta ou a proteína ou peptídeo de ligação em plantas. Por exemplo, a proteína de fusão pode incluir marcadores para facilitar a purificação ou visualização da proteína de fusão (por ex., um marcador de polihistidina ou uma proteína fluorescente tal como GFP ou YFP) ou a visualização de esporos de membro da família de Bacillus cereus que expressam a proteína de fusão.
[0092] A expressão das proteínas de fusão no exósporo usando as sequências de direcionamento, proteínas de exósporo e fragmentos de proteínas de exósporo descritas neste documento é aumentada devido à falta de estrutura secundária no amino-terminal destas sequências, que permite o dobramento nativo das proteínas de fusão e retenção de atividade. O dobramento adequado pode ser ainda aumentado pela in-clusão de um ligador de aminoácidos pequeno entre a sequência de direcionamento, proteína de exósporo, fragmento de proteína de exós- poro e a proteína parceira de fusão.
[0093] Sendo assim, quaisquer umas das proteínas de fusão des critas neste documento podem compreender um ligador de aminoácidos entre a sequência de direcionamento, a proteína de exósporo ou o fra-gmento de proteína de exósporo e a proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas, a proteína ou peptídeo que protege a planta contra um patógeno, a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta ou a proteína ou peptídeo de ligação em plantas.
[0094] O ligador pode compreender um ligador de polialanina ou um ligador de poliglicina.. Um ligador compreendendo uma mistura de resíduos de alanina e glicina pode também ser usado. Por exemplo, onde a sequência de direcionamento compreender SEQ ID N°: 1,uma proteína de fusão pode possuir uma das seguintes estruturas: Sem ligador: SEQ ID N°: 1 - Proteína Parceira de Fusão Ligador de Alanina: SEQ ID N°: 1-An-Proteína Parceira de Fusão Ligador de Glicina: SEQ ID N°: 1-Gn-Proteina Parceira de Fusão Ligador Misto de Alanina e Glicina: SEQ ID N°: 1 - (A/G)n - Proteína Parceira de Fusão onde An, Gn, e (A/G)n são quaisquer números de alaninas, quaisquer números de glicinas, ou quaisquer números de uma mistura de alaninas e glicinas, respectivamente. Por exemplo, n pode ser 1 a 25, e é prefe-rencialmente 6 a 10. Onde o ligador compreende uma mistura de resíduos de alanina e glicina, qualquer combinação de resíduos de glicina e alanina pode ser usada. Nas estruturas acima, "Proteína Parceira de Fusão" representa a proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas, a proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno, a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta ou a proteína ou peptídeo de ligação em plantas.
[0095] Alternativamente ou em adição, o ligador pode compreen der um sítio de reconhecimento de protease. A inclusão de um sítio de reconhecimento de protease permite a remoção direcionada, após ex-posição a uma protease que reconhece o sítio de reconhecimento de protease, da proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas, a proteína ou peptídeo que protege a planta contra um pató- geno, a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta ou a proteína ou peptídeo de ligação em plantas.
Proteínas Ou Peptídeos De Estimulação De Crescimento Em Plantas
[0096] Conforme observado acima, a presente invenção diz res peito às proteínas de fusão compreendendo uma sequência de direcio-namento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo de simulação de crescimento de plantas, caracterizado pelo fato que a proteína ou pep- tídeo de simulação de crescimento de plantas compreende um peptídeo hormonal, um peptídeo não hormonal, um uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação de crescimento de plantas.
[0097] Por exemplo, onde a proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento em plantas compreender uma peptídeo hormonal, o peptídeo hormonal pode compreender uma fitosulfosina (por ex., fitosul- fosina-α), clavata 3 (CLV3), sistemina, ZmlGF, ou um SCR/SP11.
[0098] Onde a proteína ou peptídeo de estimulação de cresci mento de plantas compreender um peptídeo não hormonal, o peptídeo não hormonal pode compreender uma RKN 16D10, Hg-Syv46, um pep- tídeo eNOD40, melittina, mastoparano, Mas7, RHPP, POLARIS, ou inibidor de kuniz tripsina (KTI).
[0099] A proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de planta compreende uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação de crescimento de planta. Uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação de crescimento de plantas pode ser qualquer enzima que cataliza etapas em um caminho de síntese biológica para um composto que estimula o crescimento de plantas ou altera a estrutura de plantas, ou qualquer enzima que cataliza a conversão de um derivativo inativo ou menos ativo de um composto que estimula o crescimento de plantas ou altera a estrutura da planta para uma forma ativa ou mais ativa do composto.
[00100] O composto de estimulação de crescimento de plantas pode compreender um composto produzido por bactérias ou fungos na rizosfera, por exemplo, 2,3-butanediol.
[00101] Alternativamente, o composto de estimulação de crescimento em plantas pode compreender um hormônio de crescimento de plantas, por ex., uma citoquinina ou um derivativo de citoquinina, etileno, uma auxina ou um derivativo de auxina, uma ácido giberélico ou um derivativo de ácido giberélico, ácido abscísico ou um derivativo de ácido abcísico, ou um áicdo jasmônico ou um derivativo de ácido jasmônico.
[00102] Onde o composto de estimulação de crescimento em plantas compreender uma citoquinina ou derivativo de citoquinina, a citoqui- nina ou derivativo de citoquinina pode compreender cinetina, cis-zea- tina, trans-zeatina, 6-benzilaminopurina, dihidroxizeatina, N6-(D2-iso- pentenil) adenina, ribosilzeatina, N6-(D2-isopentenil) adenosina, 2-me- tiltio-cis-ribosilzeatina, cis-ribosilzeatina, trans-ribosilzeatina, 2-metiltio- trans-ribosilzeatina, ribosilzeatina-5-monosfosfato, N6-metilaminopu- rina, N6-dimetilaminopurine, 2’-deoxyzeatina ribosídeo, 4-hidroxi-3-me- til-trans-2-butenilaminopurina, orto-topolina, meta-topolina, benzylade- nina, orto-metiltopolina, meta-metiltopolina, ou uma combinaçao dos mesmos.
[00103] Onde o composto de estimulação de crescimento em plantas compreender uma auxina ou um derivativo de auxina, a auxina ou derivativo de auxina podem compreender uma auxina ativa, uma auxina inativa, uma auxina conjugada, uma auxina de ocorrência natural ou uma auxina sintética ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, a auxina ou derivativo de auxina podem compreender indole-3-ácido acétivo, indole-3-ácido pírúvico, indole-3-acetaldoxima, indole-3-aceta- mida, indole-3-acetonitrila, indole-3-etanol, indole-3-iyruvato, indole-3- acetaldoxima, indole-3-ácido butírico, um acido fenilacético, 4-cloroin- dole-3-ácido acético, uma auxina conjugada a glicose, ou uma combinação dos mesmos.
[00104] A enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação de crescimento de plantas pode compreender uma redutase acetoína, uma hidrolase indol-3-acetamida, um monooxi- genase de triptofano, uma sintetase de acetolactato, uma descarboxi- lase acetolactato-α, uma piruvato descarboxilase, uma redutase de dia- cetilo, uma desidrogenase butanodiol, um aminotransferase (por exemplo, aminotransferase triptofano), um descarboxilase de triptofano, uma oxidase de amina, um descarboxilase indol-3-piruvato, uma desidroge- nase indol-3-acetaldeído, uma oxidase de cadeia lateral de triptofano, uma hidrolase de nitrilo, uma nitrilase, uma peptidase, uma protease, uma isopentenyltransferase fosfato de adenosina, uma fosfatase, uma cinase de adenosina, um fosforribosiltransferase de adenina, CYP735A, uma fosfo 5'ribonucleotide, um nucleosidase adenosina, uma isomerase de cis-trans zeatina, zeatina um O-glicosiltransferase, um β- glucosidase, uma hidroxilase-cis, cis um CK-hidroxilase, uma CK N-glicosil- transferase, um fosfo 2,5-ribonucleótido, um nucleosidase adenosina, um nucleósido de purina fosforilase, um redutase zeatina, uma redutase de hidroxilamina, um 2-oxoglutarato dioxigenase, um giberélico 2B / 3B hidrolase, uma giberelina 3-oxidase, uma giberelina 20-oxidase, uma chitosinase, quitinase, um β-1,3-glucanase, um β-1,4-glucanase, um β- 1,6- glucanase, uma desaminase de ácido aminociclopropano-1-carbo- xílico, ou uma enzima envolvida na produção de um fator nod (por exemplo, Noda, nodB, ou nodi).
[00105] Onde a enzima compreender uma protease ou peptidase, a protease ou peptidase pode ser uma protease ou peptidase que cliva proteínas, peptídeos, pró-proteínas ou pré-proteínas para criar um pep- tídeo ativo. O peptídeo bioativo pode ser qualquer peptídeo que exerce uma atividade biológica.
[00106] Exemplos de peptídeos bioativos incluem RKN 16D10 e RHPP.
[00107] A protease ou peptidase que cliva proteínas, peptídeos, pró-proteínas o pré-proteínas para criar um péptido bioativo pode compreender subtilisina, uma protease ácida, uma protease alcalina, uma proteinase, uma endopeptidase, uma exopeptidase, termolisina, papaina, pepsina, tripsina, a pronase, a carboxilase, uma serina protease, uma protease glutâmico, uma protease de aspartato, uma protease de cisteína, treonina uma protease, ou uma metaloprotease.
[00108] A protease ou peptidase pode clivar proteínas em um meio rico em proteínas (por exemplo, meio de soja ou extrato de levedura).
Proteínas Ou Peptídeos Que Protegem Plantas Contra Patógenos
[00109] A presente invenção relaciona-se às proteínas de fusão que compreendem uma sequência de direcionamento, uma proteína do exósporo, ou fragmento da proteína do exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno.
[00110] A proteína ou peptídeo que protege a planta contra um pa- tógeno pode compreender uma proteína ou peptídeo que estimula uma resposta imune da planta. Por exemplo, a proteína ou peptídeo que estimula uma resposta imune de planta pode compreender uma proteína ou peptídeo potencializador de sistema imune de plantas. A proteína ou peptídeo potencializador de sistema imune de planta pode ser qualquer proteína ou peptídeo que possui um efeito benéfico no sistema imune de uma planta. Proteínas ou peptídeos potencializadoras de sistema imune de plantas incluem harpinas, α-elastinas, β-elastinas, sisteminas, fenilalanina, amonia-liase, elicitinas, defensinas, criptogeínas, proteínas flagelinas e peptídeos flagelinos (por exemplo, fl22).
[00111] Alternativamente, a proteína ou peptídeo que protege uma planta contra uma patógeno pode ser uma proteína ou peptídeo que possui atividade antibacteriana, atividade antifúngica ou tanto atividade antibacteriana como antifúngica. Exemplos de tais proteínas e pepti- deos incluem bacteriocinas, lisozimas, peptideos de lisozima (por exemplo, LysM), sideróforos, péptidos ativos não-ribossomais, conalbumins, albuminas, lactoferrinas lactoferrina, peptídeos (por exemplo, LfcinB ), e tasa.
[00112] A proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno pode possuir uma proteína ou peptídeo que possui atividade inseticida, atividade helminticida, suprime insetos ou predação por vermes, ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, a proteína ou pep- tídeo que protege uma planta contra um patógeno pode compreender uma toxina bacteriana inseticida (por ex., uma proteína inseticida VIP), uma endotoxina, um Toxina Cry (por ex., toxina Cry de Bacillus thurin- giensis), uma proteína ou peptídeo inibidor de protease (por ex., um inibidor de tripsina ou uma inibidor de protease arrowhead), uma protease de cisteína ou quitinase. Onde a toxina Cry for uma toxina Cry de Bacillus thuringiensis, a toxina cry pode ser uma proteína Cry5B ou uma proteína Cry21A. Cry5B e Cry21A podem ter anto atividade inseticida como nematicida.
[00113] Aproteína que protege uma planta contra um patógeno pode compreendee uma enzima. Enzima adequadas incluem protease e lactonases. As proteases e lactonases podem ser específicas para uma molécula de sinalização bacteriana (por ex., uma molécula de sinalização de homoserina de lactona bacteriana).
[00114] Onde a enzima for uma lactonase, a lactonase pode compreender 1,4 - lactonase, lactonase 2 - pirona -4,6 -dicarboxilato de di- metilo, 3 - enol - lactonase oxoadipate, actinomicina lactonase, deoxyli- monate anel-A - lactonase, gluconolactonase L- rhamnono - 1,4 - lactonase, limonina - anel-D - lactonase, esteróide - lactonase, triacetato - lactonase, ou xylono - 1,4 - lactonase.
[00115] A enzima também pode ser uma enzima que é específica para um componente celular de uma bactéria ou fungo. Por exemplo, a enzima pode compreender uma β - 1,3 - glucanase, um β - 1,4 - gluca- nase, um β -1,6 - glucanase, um chitosinase, quitinase, uma enzima chi- tosinase -like, um liticase, uma peptidase, uma proteinase, uma protease ( por exemplo, uma protease alcalina, uma protease ácida, neutra ou uma protease ), uma mutanolisina, um stapholysin, ou uma lisozima.
[00116] Para quaisquer das proteínas de fusão supracitadas compreendendo uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno, o patógeno pode ser um patógeno bacteriano ou fúng- gico. Por exemplo, o patógeno pode compreender uma proteobactéria classe α, um proteobactéria - classe β, uma proteobactéria classe Y, ou uma combinação dos mesmos. Em especial, patógenos bacterianos incluem Agrobacterium tumefaciens, Pantoea stewartii, Erwinia caro- tovora, Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae, Pseudomonas aeruginosa, Xanthomonas campestris, e combinações dos mesmos.
[00117] Outros patógenos bacterianos e fúngicos incluem Acarospo- rina microspora, Aceria guerreronis, Achlya conspicua, Achlya klebsi- ana, Achlysiella williamsi, Acholeplasmataceae, Acidovorax avenae, Acremonium strictum, Acrocalymma medicaginis, Acrodontium simplex, Acrophialophora fusispora, Acrosporium tingitaninum, Aecidium, Aeci- dium aechmantherae, Aecidium amaryllidis, Aecidium breyniae, Aeci- dium campanulastri, Aecidium cannabis, Aecidium cantensis, Aecidium caspicum, Aecidium foeniculi, Agrobacterium tumefaciens, Albonectria rigidiuscula, Albugo bliti, Albugo candida, Albugo ipomoeae-panduratae, Albugo laibachii, Albugo occidentalis, Albugo tragopogonis, Alternaria, Alternaria alternata, Alternaria brassicae, Alternaria brassicicola, Alternaria carthami, Alternaria cinerariae, Alternaria citri, Alternaria dauci, Alternaria dianthi, Alternaria dianthicola, Alternaria euphorbiicola, Alternaria helianthi, Alternaria helianthicola, Alternaria japonica, Alternaria leucanthemi, Alternaria limicola, Alternaria linicola, Alternaria mali, Alternaria padwickii, Alternaria panax, Alternaria radicina, Alternaria ra- phani, Alternaria saponariae, Alternaria senecionis, Alternaria solani, Alternaria tenuissima, Alternaria triticina, Alternaria zinniae, Amazonia, Amphobotrys ricini, Anguillosporella vermiformis, Anguina (genus), An- guina agrostis, Anguina amsinckiae, Anguina australis, Anguina balsamophila, Anguina funesta, Anguina graminis, Anguina spermophaga, Anguina tritici, Anisogramma anomala, Anthostomella pullulans, Antro- dia albida, Antrodia serialiformis, Antrodia serialis, Aphanomyces clado- gamus, Aphanomyces cochlioides, Aphanomyces euteiches, Aphano- myces euteiches f.sp. pisi, Aphanomyces raphani, Aphelenchoides, Aphelenchoides arachidis, Aphelenchoides besseyi, Aphelenchoides fragariae, Aphelenchoides parietinus, Aphelenchoides ritzemabosi, Aphelenchus avenae, Apiognomonia errabunda, Apiognomonia veneta, Apiospora montagnei, Appendiculella, Armillaria, Armillaria affinis, Armil- laria apalosclera, Armillaria camerunensis, Armillaria duplicate, Armilla- ria fellea, Armillaria fumosa, Armillaria fuscipes, Armillaria griseomellea, Armillaria heimii, Armillaria mellea, Armillaria melleorubens, Armillaria montagnei, Armillaria omnituens, Armillaria pallidula, Armillaria paulen- sis, Armillaria pelliculata, Armillaria procera, Armillaria puiggarii, Armilla- ria singular, Armillaria socialis, Armillaria solidipes, Armillaria tabescens, Armillaria tigrensis, Armillaria umbrinobrunnea, Armillaria viridiflava, Ar- millaria yungensis, Arthrocladiella, Arthuriomyces peckianus, Ascochyta asparagine, Ascochyta bohemica, Ascochyta caricae, Ascochyta doro- nici, Ascochyta fabae f.sp. lentis, Ascochyta graminea, Ascochyta hor- dei, Ascochyta humuli, Ascochyta pisi, Ascochyta prasadii, Ascochyta sorghi, Ascochyta spinaciae, Ascochyta tarda, Ascochyta tritici, Ascospora ruborum, Ashbya gossypii, Aspergillus aculeatus, Aspergillus fischerianus, Aspergillus niger, Asperisporium caricae, Asperisporium minutulum, Asteridiella, Asteridiella perseae, Asteroma caryae, Aste- roma coryli, Asteroma inconspicuum, Athelia arachnoidea, Athelia rolfsii, Aurantiporus fissilis, Belonolaimus, Belonolaimus gracilis, Belonolaimus longicaudatus, Beniowskia sphaeroidea, Bionectria ochroleuca, Bipolaris, Bipolaris cactivora, Bipolaris cookie, Bipolaris incurvata, Bipolaris sacchari, Biscogniauxia capnodes var. capnodes, Biscogniauxia margi- nata, Biscogniauxia nummularia, Bjerkandera adusta, Blakeslea tris- pora, Blumeria graminis, Botryodiplodia oncidii, Botryodiplodia ulmicola, Botryosphaeria cocogena, Botryosphaeria corticola, Botryosphaeria dis- rupta, Botryosphaeria dothidea, Botryosphaeria marconii, Botryosphae- ria obtuse, Botryosphaeria quercuum, Botryosphaeria rhodina, Botryos- phaeria ribis, Botryosphaeria stevensii, Botryosporium pulchrum, Bo- tryotinia, Botryotinia fuckeliana, Botrytis anthophila, Botrytis cinerea, Bo- trytis fabae, Bremia lactucae, Brenneria salicis, Briosia ampelophaga, Bulbomicrosphaera, Burkholderia andropogonis, Burkholderia caryophylli, Burkholderia glumae, Cadophora malorum, Caespitotheca, Calonectria indusiata, Calonectria kyotensis, Calonectria quinquesep- tata, Calvatia versispora, Camarosporium pistaciae, Camarotella acro- comiae, Camarotella costaricensis, Candidatus Liberibacter, Capitoros- trum cocoes, Capnodium footii, Capnodium mangiferum, Capnodium ra- mosum, Capnodium theae, Caulimoviridae, Cephaleuros virescens, Cephalosporium gramineum, Ceratobasidium cereal, Ceratobasidium cornigerum, Ceratobasidium noxium, Ceratobasidium ramicola, Cerato- basidium setariae, Ceratobasidium stevensii, Ceratocystis adiposa, Ce- ratocystis coerulescens, Ceratocystis fimbriata, Ceratocystis moniliformis, Ceratocystis paradoxa, Ceratocystis pilifera, Ceratocystis pluri- annulata, Ceratorhiza hydrophila, Ceratospermopsis, Cercoseptoria ocellata, Cercospora, Cercospora angreci, Cercospora apii, Cercospora apii f.sp. clerodendri, Cercospora apiicola, Cercospora arachidicola, Cercospora asparagi, Cercospora atrofiliformis, Cercospora beticola, Cercospora brachypus, Cercospora brassicicola, Cercospora brunkii, Cercospora cannabis, Cercospora cantuariensis, Cercospora capsici, Cercospora carotae, Cercospora corylina, Cercospora fragariae, Cer- cospora fuchsiae, Cercospora fusca, Cercospora fusimaculans, Cercos- pora gerberae, Cercospora halstedii, Cercospora handelii, Cercospora hayi, Cercospora hydrangea, Cercospora kikuchii, Cercospora lentis, Cercospora liquidambaris, Cercospora longipes, Cercospora longis- sima, Cercospora mamaonis, Cercospora mangiferae, Cercospora me- dicaginis, Cercospora melongenae, Cercospora minima, Cercospora minuta, Cercospora nicotianae, Cercospora odontoglossi, Cercospora papaya, Cercospora penniseti, Cercospora pisa-sativae, Cercospora pla- tanicola, Cercospora puderii, Cercospora pulcherrima, Cercospora rha- pidicola, Cercospora rosicola, Cercospora rubrotincta, Cercospora so- jina, Cercospora solani, Cercospora solani-tuberosi, Cercospora sorghi, Cercospora theae, Cercospora tuberculans, Cercospora vexans, Cer- cospora vicosae, Cercospora zeae-maydis, Cercospora zebrina, Cer- cospora zonata, Cercosporella rubi, Cereal cyst nematode, Ceriporia spissa, Ceriporia xylostromatoides, Cerrena unicolor, Ceuthospora lauri, Choanephora, Choanephora cucurbitarum, Choanephora infundibuli- fera, Chondrostereum purpureum, Chrysomyxa ledi var. rhododendri, Chrysomyxa ledicola, Chrysomyxa piperiana, Chrysomyxa roanensis, Cladosporium, Cladosporium arthropodii, Cladosporium caryigenum, Cladosporium cladosporioides, Cladosporium cladosporioides f.sp. pisi- cola, Cladosporium cucumerinum, Cladosporium herbarum, Cladospo- rium musae, Cladosporium oncobae, Clavibacter michiganensis, Clavi- ceps fusiformis, Claviceps purpurea, Claviceps sorghi, Claviceps zizan- iae, Climacodon pulcherrimus, Climacodon septentrionalis, Clitocybe parasitica, Clonostachys rosea f. rosea, Clypeoporthe iliau, Cochliobolus, Cochliobolus carbonum, Cochliobolus cymbopogonis, Co- chliobolus hawaiiensis, Cochliobolus heterostrophus, Cochliobolus luna- tus, Cochliobolus miyabeanus, Cochliobolus ravenelii, Cochliobolus sa- tivus, Cochliobolus setariae, Cochliobolus spicifer, Cochliobolus stenos- pilus, Cochliobolus tuberculatus, Cochliobolus victoriae, Coleosporium helianthi, Coleosporium ipomoeae, Coleosporium madiae, Coleospo- rium pacificum, Coleosporium tussilaginis, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum arachidis, Colletotrichum capsici, Colletotrichum cereale, Colletotrichum crassipes, Colletotrichum dematium, Colletotrichum de- matium f. spinaciae, Colletotrichum derridis, Colletotrichum destructi- vum, Colletotrichum fragariae, Colletotrichum gossypii, Colletotrichum higginsianum, Colletotrichum kahawae, Colletotrichum lindemuthianum, Colletotrichum lini, Colletotrichum mangenotii, Colletotrichum musae, Colletotrichum nigrum, Colletotrichum orbiculare, Colletotrichum pisi, Colletotrichum sublineolum, Colletotrichum trichellum, Colletotrichum tri- folii, Colletotrichum truncatum, Coniella castaneicola, Coniella diplodi- ella, Coniella fragariae, Coniothecium chomatosporum, Coniothyrium celtidis-australis, Coniothyrium henriquesii, Coniothyrium rosarum, Co- niothyrium wernsdorffiae, Coprinopsis psychromorbida, Cordana johns- tonii, Cordana musae, Coriolopsis floccose, Coriolopsis gallica, Corti- cium invisum, Corticium penicillatum, Corticium theae, Coryneopsis rubi, Corynespora cassiicola, Coryneum rhododendri, Crinipellis sarmentosa, Cronartium ribicola, Cryphonectriaceae, Cryptocline cyclaminis, Crypto- meliola, Cryptoporus volvatus, Cryptosporella umbrina, Cryptosporio- psis tarraconensis, Cryptosporium minimum, Curvularia caricae-papa- yae, Curvularia penniseti, Curvularia senegalensis, Curvularia trifolii, Cylindrocarpon candidum, Cylindrocarpon ianthothele var. ianthothele, Cylindrocarpon magnusianum, Cylindrocarpon musae, Cylindrocladiella camelliae, Cylindrocladiella parva, Cylindrocladium clavatum, Cylindro- cladium lanceolatum, Cylindrocladium peruvianum, Cylindrocladium pteridis, Cylindrosporium cannabinum, Cylindrosporium juglandis, Cylin- drosporium rubi, Cymadothea trifolii, Cytospora, Cytospora palmarum, Cytospora personata, Cytospora platani, Cytospora sacchari, Cytospora sacculus, Cytospora terebinthi, Cytosporina ludibunda, Dactuliophora elongata, Daedaleopsis confragosa, Dasineura urticae, Datronia scutel- lata, Davidiella carinthiaca, Davidiella dianthi, Davidiella tassiana, Deightoniella papuana, Deightoniella torulosa, Dendrophoma marconii, Dendrophora erumpens, Denticularia mangiferae, Dermea pseudotsu- gae, Diaporthaceae, Diaporthe, Diaporthe arctii, Diaporthe citri, Dia- porthe dulcamarae, Diaporthe eres, Diaporthe helianthi, Diaporthe la- gunensis, Diaporthe lokoyae, Diaporthe melonis, Diaporthe orthoceras, Diaporthe perniciosa, Diaporthe phaseolorum, Diaporthe phaseolorum var. caulivora, Diaporthe phaseolorum var. phaseolorum, Diaporthe phaseolorum var. sementes de sojae, Diaporthe rudis, Diaporthe tana- kae, Diaporthe toxica, Dibotryon morbosum, Dicarpella dryina, Di- dymella bryoniae, Didymella fabae, Didymella lycopersici, Didymospha- eria arachidicola, Didymosphaeria taiwanensis, Dilophospora alopecuri, Dimeriella sacchari, Diplocarpon earlianum, Diplocarpon mali, Diplocar- pon mespili, Diplocarpon rosae, Diplodia laelio-cattleyae, Diplodia mani- hoti, Diplodia paraphysaria, Diplodia theae-sinensis, Discosia artocreas, Guignardia fulvida, Discostroma corticola, Distocercospora, Distocer- cospora livistonae, Ditylenchus, Ditylenchus africanus, Ditylenchus an- gustus, Ditylenchus destructor, Ditylenchus dipsaci, Dolichodorus hete- rocephalus, Dothideomycetes, Dothiorella aromatic, Dothiorella dominicana, Dothiorella gregaria, Dothiorella ulmi, Drechslera avenacea, Drechslera campanulata, Drechslera dematioidea, Drechslera gigantea, Drechslera glycines, Drechslera musae-sapientium, Drechslera teres f. maculate, Drechslera wirreganensis, Durandiella pseudotsugae, Eballis- tra lineata, Eballistra oryzae, Eballistraceae, Echinodontium tinctorium, Ectendomeliola, Elsinoê ampelina, Elsinoê australis, Elsinoê batatas, Elsinoê brasiliensis, Elsinoê fawcettii, Elsinoê leucospila, Elsinoê man- giferae, Elsinoê piri, Elsinoê randii, Elsinoê rosarum, Elsinoê sacchari, Elsinoê theae, Elsinoê veneta, Endomeliola, Endothia radicalis, Endothi- ella gyrosa, Entoleuca mammata, Entorrhizomycetes, Entyloma agera- tinae, Entyloma dahlia, Entyloma ellisii, Epicoccum nigrum, Ergot, Erwinia, Erwinia chrysanthemi, Erwinia psidii, Erysiphaceae, Erysiphales, Erysiphe, Erysiphe alphitoides, Erysiphe betae, Erysiphe brunneopunc- tata, Erysiphe cichoracearum, Erysiphe cruciferarum, Erysiphe flexuosa, Erysiphe graminis f. sp. avenae, Erysiphe graminis f.sp. tritici, Erysiphe heraclei, Erysiphe pisi, Eutypella parasitica, Eutypella scoparia, Exobasidium burtii, Exobasidium reticulatum, Exobasidium vaccinii var. japoni- cum, Exobasidium vaccinii-uliginosi, Exobasidium vexans, Exophi- ala,Flavescence dorée, Fomes fasciatus, Fomes lamaênsis, Fomes me- liae, Fomitopsis cajanderi, Fomitopsis palustris, Fomitopsis rosea, Fomi- topsis spraguei, Fomitopsis supina, Forma specialis, Frommeella tor- mentillae, Fusarium, Fusarium affine, Fusarium arthrosporioides, Fusarium circinatum, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium incarnatum, Fusarium solani, Fusarium merismoides, Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, Fusarium oxysporum f.sp. asparagi, Fusarium oxysporum f.sp. batatas, Fusarium oxysporum f.sp. betae, Fusarium oxysporum f.sp. cannabis, Fusarium oxysporum f.sp. citri, Fusarium oxysporum f.sp. coffea, Fusarium oxysporum f.sp. cubense, Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis, Fusarium oxysporum f.sp. dianthi, Fusarium oxysporum f.sp. lentis, Fusarium oxysporum f.sp. lini, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Fusarium oxysporum f.sp. medicaginis, Fusarium oxysporum f.sp. pisi, Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, Fusarium pallidoroseum, Fusarium proliferatum, Fusarium redolens, Fusarium sacchari, Fusarium solani f.sp. pisi, Fusarium sporotrichioides, Fusarium subglutinans, Fusarium sulphureum, Fusco- poria torulosa, Fusicladium pisicola, Fusicoccum aesculi, Fusicoccum amygdali, Gaeumannomyces graminis var tritici, Gaeumannomyces gra- minis var. avenae, Gaeumannomyces graminis var. graminis, Galac- tomyces candidum, Ganoderma brownii, Ganoderma lobatum, Gano- derma orbiforme, Ganoderma philippii, Ganoderma tornatum, Gano- derma zonatum, Geastrumia polystigmatis, Georgefischeriaceae, Geor- gefischeriales, Geosmithia morbida, Geotrichum, Geotrichum candidum, Geotrichum candidum var. citri-aurantii, Geotrichum klebahnii, Gibbere- lla, Gibberella acuminata, Gibberella avenacea, Gibberella baccata, Gibberella cyanogena, Gibberella fujikuroi, Gibberella fujikuroi var. sub- glutinans, Gibberella intricans, Gibberella pulicaris, Gibberella stilboides, Gibberella xylarioides, Gibberella zeae, Gibellina cerealis, Gilbertella persicaria, Gjaerumiaceae, Gliocladium vermoeseni, Globodera pallida, Globodera rostochiensis, Globodera tabacum, Gloeocercospora sorghi, Gloeocystidiellum porosum, Gloeophyllum mexicanum, Gloeophyllum trabeum, Gloeoporus dichrous, Gloeosporium cattleyae, Gloeosporium theae-sinensis, Glomerella cingulate, Glomerella glycines, Glomerella graminicola, Glomerella tucumanensis, Gnomonia caryae, Gnomonia comari, Gnomonia dispora, Gnomonia iliau, Gnomonia leptostyla, Gno- monia nerviseda, Gnomonia rubi, Golovinomyces cichoracearum var. la- tisporus, Granulobasidium vellereum, Graphiola phoenicis, Graphium ri- gidum, Graphium rubrum, Graphyllium pentamerum, Grovesinia pyrami- dalis, Guignardia bidwellii f. muscadinii, Guignardia camelliae, Guignar- dia citricarpa, Guignardia mangiferae, Guignardia musae, Guignardia philoprina, Gummosis, Gymnoconia nitens, Gymnopus dryophilus, Gymnosporangium clavipes, Gymnosporangium sabinae, Gymnospo- rangium globosum, Gymnosporangium juniperi-virginianae, Gymnospo- rangium kernianum, Gymnosporangium nelsonii, Gymnosporangium ya- madae, Haematonectria haematococca, Hansenula subpelliculosa, Ha- palosphaeria deformans, Haplobasidion musae, Haustorium, Helicobasidium compactum, Helicobasidium longisporum, Helicobasidium purpureum, Helicoma muelleri, Helicotylenchus, Helicotylenchus dihys- tera, Helicotylenchus multicinctus, Helminthosporium cookei, Helmintho- sporium papulosum, Helminthosporium solani, Helotiales, Hemicricone- moides kanayaensis, Hemicriconemoides mangiferae, Hemicycliophora arenaria, Hemlock woolly adelgid, Hendersonia creberrima, Henderso- nia theicola, Hericium coralloides, Heterobasidion annosum, Heterodera, Heterodera amygdali, Heterodera arenaria, Heterodera aucklan- dica, Heterodera avenae, Heterodera bergeniae, Heterodera bifenestra, Heterodera cacti, Heterodera cajani, Heterodera canadensis, Heterodera cardiolata, Heterodera carotae, Heterodera ciceri, Heterodera cru- ciferae, Heterodera delvii, Heterodera elachista, Heterodera filipjevi, Heterodera gambiensis, Heterodera goettingiana, Heterodera hordecalis, Heterodera humuli, Heterodera latipons, Heterodera medicaginis, Heterodera oryzae, Heterodera oryzicola, Heterodera rosii, Heterodera sac- chari, Heterodera schachtii, Heterodera tabacum, Heterodera trifolii, He- teroderidae, Hexagonia hydnoides, Hirschmanniella oryzae, Hoplalai- mus galeatus, Hoplolaimidae, Hoplolaimus columbus, Hoplolaimus indi- cus, Hoplolaimus magnistylus, Hoplolaimus pararobustus, Hoplolaimus seinhorsti, Hoplolaimus uniformis, Huanglongbing, Hyaloperonospora, Hyaloperonospora arabidopsidis, Hyaloperonospora brassicae, Hyalo- peronospora parasitica, Hymenula affinis, Hyphodermella corrugata, Hyphodontia aspera, Hyphodontia sambuci, Hypochnus, Hypoxylon tin- ctor, Idriella lunata, Inonotus arizonicus, Inonotus cuticularis, Inonotus dryophilus, Inonotus hispidus, Inonotus ludovicianus, Inonotus munzii, Inonotus tamaricis, Irenopsis, Irpex destruens, Irpex lacteus, Isariopsis clavispora, Johncouchia mangiferae, Kabatiella caulivora, Kabatiella lini, Karnal bunt, Khuskia oryzae, Kretzschmaria deusta, Kretzschmaria zo- nata, Kuehneola uredinis, Kutilakesa pironii, Labrella coryli, Laeticorti- cium roseum, Laetiporus baudonii, Lagenocystis radicicola, Laricifomes officinalis, Lasiodiplodia theobromae, Leandria momordicae, Leifsonia xyli xyli, Lentinus tigrinus, Lenzites betulina, Lenzites elegans, Lepteu- typa cupressi, Leptodontidium elatius var. elatius, Leptographium mi- crosporum, Leptosphaeria acuta, Leptosphaeria cannabina, Leptospha- eria coniothyrium, Leptosphaeria libanotis, Leptosphaeria lindquistii, Leptosphaeria maculans, Leptosphaeria musarum, Leptosphaeria pra- tensis, Leptosphaeria sacchari, Leptosphaeria woroninii, Leptosphaeru- lina crassiasca, Leptosphaerulina trifolii, Leptothyrium nervisedum, Lep- totrochila medicaginis, Leucocytospora leucostoma, Leucostoma au- erswaldii, Leucostoma kunzei, Leucostoma persoonii, Leveillula compo- sitarum f. helianthi, Leveillula leguminosarum f. lentis, Leveillula taurica, Ligniera pilorum, Limacinula tenuis, Linochora graminis, Longidorus afri-canus, Longidorus maximus, Longidorus sylphus, Lopharia crassa, Lophodermium, Lophodermium aucupariae, Lophodermium schweini- tzii, Lophodermium seditiosum, Macrophoma mangiferae, Macrophoma theicola, Macrophomina phaseolina, Macrosporium cocos, Magna- porthe, Magnaporthe grisea, Magnaporthe salvinii, Mamianiella coryli, Marasmiellus cocophilus, Marasmiellus inoderma, Marasmiellus scan- dens, Marasmiellus stenophyllus, Marasmius crinis-equi, Marasmius sacchari, Marasmius semiustus, Marasmius stenophyllus, Marasmius tenuissimus, Massarina walkeri, Mauginiella scaettae, Melampsora, Me- lampsora lini var. lini, Melampsora medusae, Melampsora occidentalis, Melanconis carthusiana, Melanconium juglandinum, Meliola, Meliola mangiferae, Meliolaceae, Meloidogyne acronea, Meloidogyne arenaria, Meloidogyne artiellia, Meloidogyne brevicauda, Meloidogyne chitwoodi, Meloidogyne enterolobii, Meloidogyne fruglia, Meloidogyne gajuscus, Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica, Meloidogyne naasi, Me- loidogyne partityla, Meloidogyne thamesi, Meripilus giganteus, Merlinius brevidens, Meruliopsis ambigua, Mesocriconema xenoplax, Microascus brevicaulis, Microbotryum violaceum, Microdochium bolleyi, Microdo- chium dimerum, Microdochium panattonianum, Microdochium phragmitis, Microsphaera, Microsphaera coryli, Microsphaera diffusa, Microsphaera ellisii, Microsphaera euphorbiae, Microsphaera hommae, Microsphaera penicillata, Microsphaera penicillata var. vaccinii, Micros- phaera vaccinii, Microsphaera verruculosa, Microstroma juglandis, Moesziomyces bullatus, Monilinia azaleae, Monilinia fructicola, Monilinia fructigena, Monilinia laxa, Monilinia mali, Moniliophthora perniciosa, Mo- niliophthora roreri, Monilochaetes infuscans, Monochaetia coryli, Mono- chaetia mali, Monographella albescens, Monographella cucumerina, Monographella nivalis var. neglecta, Monographella nivalis var. nivalis, Mononegavirales, Monosporascus cannonballus, Monosporascus eu- typoides, Monostichella coryli, Mucor circinelloides, Mucor hiemalis, Mu- cor hiemalis f. silvaticus, Mucor mucedo, Mucor paronychius, Mucor piriformis, Mucor racemosus, Mycena citricolor, Mycena maculate, Myco- centrospora acerina, Mycoleptodiscus terrestris, Mycosphaerella angu- lata, Mycosphaerella arachidis, Mycosphaerella areola, Mycosphaerella berkeleyi, Mycosphaerella bolleana, Mycosphaerella brassicicola, Mycosphaerella caricae, Mycosphaerella caryigena, Mycosphaerella ce- rasella, Mycosphaerella citri, Mycosphaerella coffeicola, Mycosphaere- lla confusa, Mycosphaerella cruenta, Mycosphaerella dendroides, Mycosphaerella eumusae, Mycosphaerella fragariae, Mycosphaerella gossypina, Mycosphaerella graminicola, Mycosphaerella henningsii, Mycosphaerella horii, Mycosphaerella juglandis, Mycosphaerella lageni- formis, Mycosphaerella linicola, Mycosphaerella louisianae, Mycospha- erella musae, Mycosphaerella musicola, Mycosphaerella palmicola, Mycosphaerella pinodes, Mycosphaerella pistaciarum, Mycosphaerella pistacina, Mycosphaerella platanifolia, Mycosphaerella polymorpha, Mycosphaerella pomi, Mycosphaerella punctiformis, Mycosphaerella pyri, Didymella rabiei, Mycosphaerella recutita, Mycosphaerella rosicola, Mycosphaerella rubi, Mycosphaerella stigmina-platani, Mycosphaerella striatiformans, Mycovellosiella concors, Mycovellosiella fulva, Mycovellosiella koepkei, Mycovellosiella vaginae, Myriogenospora aci- culispora, Myrothecium roridum, Myrothecium verrucaria, Nacobbus aberrans, Nacobbus dorsalis, Naevala perexigua, Naohidemyces vac- cinii, Nectria, Nectria cinnabarina, Nectria coccinea, Nectria ditissima, ectria foliicola, Nectria mammoidea var. rubi, Nectria mauritiicola, Nec- tria peziza, Nectria pseudotrichia, Nectria radicicola, Nectria ramulariae, Nectriella pironii, Nemania diffusa, Nemania serpens var. serpens, Ne- matospora coryli, Neocosmospora vasinfecta, Neodeightonia phoeni- cum, Neoerysiphe, Neofabraea malicorticis, Neofabraea perennans, Ne- ofusicoccum mangiferae, Neonectria galligena, Oidiopsis gossypii, Oi- dium (genus), Oidium arachidis, Oidium caricae-papayae, Oidium indi- cum, Oidium mangiferae, Oidium manihotis, Oidium tingitaninum, Olpi- dium brassicae, Omphalia tralucida, Oncobasidium theobromae, Onnia tomentosa, Ophiobolus anguillides, Ophiobolus cannabinus, Ophioire- nina, Ophiostoma ulmi, Ophiostoma wageneri, Ovulariopsis papayae, Ovulinia azaleae, Ovulitis azaleae, Oxyporus corticola, Oxyporus late- marginatus, Oxyporus populinus, Oxyporus similis, Ozonium texanum var. parasiticum, Paecilomyces fulvus, Paralongidorus maximus, Para- trichodorus christiei, Paratrichodorus minor, Paratylenchus curvitatus, Paratylenchus elachistus, Paratylenchus hamatus, Paratylenchus macrophallus, Paratylenchus microdorus, Paratylenchus projectus, Pa- ratylenchus tenuicaudatus, Pathovar, Pauahia, Peach latent mosaic vi- roid, Pectobacterium carotovorum, Peltaster fructicola, Penicillium au- rantiogriseum, Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Penicillium funiculosum, Penicillium glabrum, Penicillium italicum, Penicillium pur- purogenum, Penicillium ulaiense, Peniophora, Peniophora albobadia, Peniophora cinerea, Peniophora quercina, Peniophora sacrata, Peren- niporia fraxinea, Perenniporia fraxinophila, Perenniporia medulla-panis, Perenniporia subacida, Periconia circinata, Periconiella cocoes, Perider- mium californicum, Peronosclerospora miscanthi, Peronosclerospora sacchari, Peronosclerospora sorghi, Peronospora, Peronospora anemones, Peronospora antirrhini, Peronospora arborescens, Peronospora conglomerata, Peronospora destructor, Peronospora dianthi, Peronos- pora dianthicola, Peronospora farinosa, Peronospora farinosa f.sp. be- tae, Peronospora hyoscyami f.sp. tabacina, Peronospora manshurica, Peronospora potentillae, Peronospora sparsa, Peronospora trifoliorum, Peronospora valerianellae, Peronospora viciae, Pestalosphaeria con- centrica, Pestalotia longiseta, Pestalotia longisetula, Pestalotia rhodode- ndri, Pestalotiopsis, Pestalotiopsis adusta, Pestalotiopsis arachidis, Pes- talotiopsis disseminata, Pestalotiopsis guepini, Pestalotiopsis lepro- gena, Pestalotiopsis longiseta, Pestalotiopsis mangiferae, Pestalotio- psis palmarum, Pestalotiopsis sydowiana, Pestalotiopsis theae, Pesta- lotiopsis versicolor, Phacidiopycnis padwickii, Phacidium infestans, Phaeochoropsis mucosa, Phaeocytostroma iliau, Phaeocytostroma sac- chari, Phaeoisariopsis bataticola, Phaeolus schweinitzii, Phaeoramula- ria angolensis, Phaeoramularia dissiliens, Phaeoramularia heterospora, Phaeoramularia manihotis, Phaeoseptoria musae, Phaeosphaerella mangiferae, Phaeosphaerella theae, Phaeosphaeria avenaria f.sp. avenaria, Phaeosphaeria avenaria f.sp. triticae, Phaeosphaeria herpotri- choides, Phaeosphaeria microscopica, Phaeosphaeria nodorum, Phaeosphaeriopsis obtusispora, Phaeotrichoconis crotalariae, Phakop- sora gossypii, Phakopsora pachyrhizi, Phanerochaete allantospora, Phanerochaete arizonica, Phanerochaete avellanea, Phanerochaete burtii, Phanerochaete carnosa, Phanerochaete chrysorhizon, Phanero- chaete radicata, Phanerochaete salmonicolor, Phanerochaete tubercu- lata, Phanerochaete velutina, Phellinus ferreus, Phellinus gilvus, Phelli- nus igniarius, Phellinus pini, Phellinus pomaceus, Phellinus weirii, Phia- lophora asteris, Phialophora cinerescens, Phialophora gregata, Phia- lophora tracheiphila, Phloeospora multimaculans, Pholiota variicystis, Phoma, Phoma caricae-papayae, Phoma clematidina, Phoma costaricensis, Phoma cucurbitacearum, Phoma destructiva, Phoma dra-conis, Phoma eupyrena, Phoma exigua, Phoma exigua var. exigua, Phoma exigua var. foveata, Phoma exigua var. linicola, Phoma glome- rata, Phoma glycinicola, Phoma herbarum, Phoma insidiosa, Phoma medicaginis, Phoma microspora, Phoma nebulosa, Phoma oncidii-spha- celati, Phoma pinodella, Phoma scabra, Phoma sclerotioides, Phoma strasseri, Phoma tracheiphila, Phomopsis arnoldiae, Phomopsis aspa- ragi, Phomopsis asparagicola, Phomopsis azadirachtae, Phomopsis cannabina, Phomopsis caricae-papayae, Phomopsis coffeae, Phomopsis elaeagni, Phomopsis ganjae, Phomopsis javanica, Phomopsis lokoyae, Phomopsis mangiferae, Phomopsis obscurans, Phomopsis perseae, Phomopsis prunorum, Phomopsis scabra, Phomopsis scleroti- oides, Phomopsis tanakae, Phomopsis theae, Photoassimilate, Phrag- midium, Phragmidium mucronatum, Phragmidium rosae-pimpinellifo- liae, Phragmidium rubi-idaei, Phragmidium violaceum, Phyllachora cannabis, Phyllachora graminis var. graminis, Phyllachora gratissima, Phyl- lachora musicola, Phyllachora pomigena, Phyllachora sacchari, Phyllac- tinia, Phyllactinia angulata, Phyllactinia guttata, Phyllody, Phyllosticta, Phyllosticta alliariaefoliae, Phyllosticta anacardiacearum, Phyllosticta arachidis-hypogaeae, Phyllosticta batatas, Phyllosticta capitalensis, Phyllosticta caricae-papayae, Phyllosticta carpogena, Phyllosticta cir- cumscissa, Phyllosticta coffeicola, Phyllosticta concentrica, Phyllosticta coryli, Phyllosticta cucurbitacearum, Phyllosticta cyclaminella, Phyllosti- cta erratica, Phyllosticta hawaiiensis, Phyllosticta lentisci, Phyllosticta manihotis, Phyllosticta micropuncta, Phyllosticta mortonii, Phyllosticta nicotianae, Phyllosticta palmetto, Phyllosticta penicillariae, Phyllosticta perseae, Phyllosticta platani, Phyllosticta pseudocapsici, Phyllosticta sementes de sojaecola, Phyllosticta solitaria, Phyllosticta theae, Phyllosti- cta theicola, Phymatotrichopsis omnivora, Physalospora abdita, Physa- lospora disrupta, Physalospora perseae, Physarum cinereum, Physoderma alfalfae, Physoderma leproides, Physoderma trifolii, Physopella ampelopsidis, Phytophthora, Phytophthora alni, Phytophthora boehmeriae, Phytophthora cactorum, Phytophthora ca- jani, Phytophthora cambivora, Phytophthora capsici, Phytophthora cin- namomi, Phytophthora citricola, Phytophthora citrophthora, Phytophthora cryptogea, Phytophthora drechsleri, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora fragariae, Phytophthora fragariae var. rubi, Phytophthora gallica, Phytophthora hibernalis, Phytophthora infestans, Phytophthora inflata, Phytophthora iranica, Phytophthora katsurae, Phytophthora kernoviae, Phytophthora lateralis, Phytophthora medica- ginis, Phytophthora megakarya, Phytophthora megasperma, Phytophthora nicotianae, Phytophthora palmivora, Phytophthora phase- oli, Phytophthora plurivora, Phytophthora ramorum, Phytophthora sementes de sojae, Phytophthora syringae, Phytophthora tentaculata, Phytoplasma, Pichia membranifaciens, Pichia subpelliculosa, Pileolaria terebinthi, Pilidiella quercicola, Plasmodiophora brassicae, Plasmopara, Plasmopara halstedii, Plasmopara helianthi f. helianthi, Plasmopara lac- tucae-radicis, Plasmopara nivea, Plasmopara obducens, Plasmopara penniseti, Plasmopara pygmaea, Plasmopara viticola, Platychora ulmi, Plenodomus destruens, Plenodomus meliloti, Pleochaeta, Pleosphaeru- lina sojicola, Pleospora alfalfae, Pleospora betae, Pleospora herbarum, Pleospora lycopersici, Pleospora tarda, Pleospora theae, Pleurotus dryi- nus, Podosphaera, Podosphaera clandestina var. clandestine, Podos- phaera fusca, Podosphaera leucotricha, Podosphaera macularis, Po- dosphaera pannosa, Podosphaera tridactyla, Podosphaera tridactyla var. tridactyla, Podosphaera xanthii, Polymyxa graminis, Polyscytalum pustulans, Polystigma fulvum, Poria hypobrunnea, Postia tephroleuca, Potato cyst nematode, Pratylenchus alleni, Pratylenchus brachyurus, Pratylenchus coffeae, Pratylenchus crenatus, Pratylenchus dulscus, Pratylenchus fallax, Pratylenchus flakkensis, Pratylenchus goodeyi, Pratylenchus hexincisus, Pratylenchus loosi, Pratylenchus minutus, Pratylenchus mulchandi, Pratylenchus musicola, Pratylenchus neglec- tus, Pratylenchus penetrans, Pratylenchus pratensis, Pratylenchus reni- formia, Pratylenchus scribneri, Pratylenchus thornei, Pratylenchus vulnus, Pratylenchus zeae, Pseudocercospora, Pseudocercospora are- cacearum, Pseudocercospora cannabina, Pseudocercospora fuligena, Pseudocercospora gunnerae, Pseudocercospora kaki, Pseudocercos- pora mali, Pseudocercospora pandoreae, Pseudocercospora puderi, Pseudocercospora purpurea, Pseudocercospora rhapisicola, Pseudo- cercospora subsessilis, Pseudocercospora theae, Pseudocercospora vi- tis, Pseudocercosporella capsellae, Pseudocochliobolus eragrostidis, Pseudoepicoccum cocos, Pseudomonas amygdali, Pseudomonas as- plenii, Pseudomonas avellanae, Pseudomonas caricapapayae, Pseudo-monas cichorii, Pseudomonas coronafaciens, Pseudomonas corrugate, Pseudomonas ficuserectae, Pseudomonas flavescens, Pseudomonas fuscovaginae, Pseudomonas helianthi, Pseudomonas marginalis, Pseu-domonas meliae, Pseudomonas oryzihabitans, Pseudomonas palleroni- ana, Pseudomonas papaveris, Pseudomonas salomonii, Pseudomonas savastanoi, Pseudomonas syringae, Pseudomonas tomato, Pseudomonas tremae, Pseudomonas turbinellae, Pseudomonas viridiflava, Pseu- doperonospora cannabina, Pseudoperonospora cubensis, Pseudopero- nospora humuli, Pseudopezicula tetraspora, Pseudopezicula trachei- phila, Pseudopeziza jonesii, Pseudopeziza medicaginis, Pseudopeziza trifolii, Pseudoseptoria donacis, Puccinia, Puccinia angustata, Puccinia arachidis, Puccinia aristidae, Puccinia asparagi, Puccinia cacabata, Puccinia campanulae, Puccinia carthami, Puccinia coronate, Puccinia coronata var. hordei, Puccinia dioicae, Puccinia erianthi, Puccinia exten- sicola var. hieraciata, Puccinia helianthi, Puccinia hordei, Puccinia ja- ceae var. solstitialis, Puccinia kuehnii, Puccinia mariae-wilsoniae, Puc- cinia melanocephala, Puccinia menthae, Puccinia pelargonii-zonalis, Puccinia pittieriana, Puccinia poarum, Puccinia psidii, Puccinia purpurea, Puccinia recondita, Puccinia schedonnardii, Puccinia sessilis, Puc- cinia striiformis f. sp. hordei, Puccinia striiformis var. striiformis, Puccinia subnitens, Puccinia substriata var. indica, Puccinia verruca, Puccinia xanthii, Pucciniaceae, Pucciniastrum, Pucciniastrum americanum, Puc- ciniastrum arcticum, Pucciniastrum coryli, Pucciniastrum epilobii, Pucci- niastrum hydrangeae, Punctodera chalcoensis, Pycnoporus cinnabari- nus, Pycnoporus sanguineus, Pycnostysanus azaleae, Pyrenochaeta lycopersici, Pyrenochaeta terrestris, Pyrenopeziza brassicae, Pyre- nophora, Pyrenophora avenae, Pyrenophora chaetomioides, Pyre- nophora graminea, Pyrenophora seminiperda, Pyrenophora teres, Pyre- nophora teres f. maculata, Pyrenophora teres f. teres, Pyrenophora tri- tici-repentis, Pythiaceae, Pythiales, Pythium, Pythium acanthicum, Pythium aphanidermatum, Pythium aristosporum, Pythium arrhenoma- nes, Pythium buismaniae, Pythium debaryanum, Pythium deliense, Pythium dissotocum, Pythium graminicola, Pythium heterothallicum, Pythium hypogynum, Pythium irregulare, Pythium iwayamae, Pythium mastophorum, Pythium middletonii, Pythium myriotylum, Pythium oka- noganense, Pythium paddicum, Pythium paroecandrum, Pythium perni- ciosum, Pythium rostratum, Pythium scleroteichum, Pythium spinosum, Pythium splendens, Pythium sulcatum, Pythium sylvaticum, Pythium tar- dicrescens, Pythium tracheiphilum, Pythium ultimum, Pythium ultimum var. ultimum, Pythium vexans, Pythium violae, Pythium volutum, Quini- sulcius acutus, Quinisulcius capitatus, Radopholous similis, Radopholus similis, Ralstonia solanacearum, Ramichloridium musae, Ramularia, Ra- mularia beticola, Ramularia brunnea, Ramularia coryli, Ramularia cycla- minicola, Ramularia macrospora, Ramularia menthicola, Ramularia ne- cator, Ramularia primulae, Ramularia spinaciae, Ramularia subtilis, Ra- mularia tenella, Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghicola, Resini- cium bicolor, Rhabdocline pseudotsugae, Rhabdocline weirii Rhabdoviridae, Rhinocladium corticola, Rhizoctonia, Rhizoctonia legu- minicola, Rhizoctonia rubi, Rhizoctonia solani, Rhizomorpha subcortica- lis, Rhizophydium graminis, Rhizopus arrhizus, Rhizopus circinans, Rhi- zopus microsporus var. microspores, Rhizopus oryzae, Rhodococcus fascians, Rhynchosporium, Rhynchosporium secalis, Rhytidhysteron ru- fulum, Rhytisma acerinum, Rhytisma vitis, Rigidoporus lineatus, Rigido- porus microporus, Rigidoporus ulmarius, Rigidoporus vinctus, Rosellinia arcuata, Rosellinia bunodes, Rosellinia necatrix, Rosellinia pepo, Rosel- linia subiculata, Rotylenchulus, Rotylenchulus parvus, Rotylenchulus re- niformis, Rotylenchus brachyurus, Rotylenchus robustus, Saccharicola taiwanensis, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces kluyveri, Sa- rocladium oryzae, Sawadaea, Sawadaea tulasnei, Schiffnerula cannabis, Schizoparme straminea, Schizophyllum commune, Schizopora fla- vipora, Schizothyrium pomi, Scleroderris canker, Sclerophthora macros- pora, Sclerophthora rayssiae, Sclerospora graminicola, Sclerospora mischanthi, Sclerotinia borealis, Sclerotinia minor, Sclerotinia ricini, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia spermophila, Sclerotinia trifoliorum, Sclerotium, Sclerotium cinnamomi, Sclerotium delphinii, Scutellonema brachyurum, Scutellonema cavenessi, Scytinostroma galactinum, Sei- matosporium mariae, Seimatosporium rhododendri, Selenophoma lini- cola, Septobasidium, Septobasidium bogoriense, Septobasidium pilo- sum, Septobasidium pseudopedicellatum, Septobasidium theae, Sep- tocyta ruborum, Septogloeum potentillae, Septoria, Septoria aciculosa, Septoria ampelina, Septoria azalea, Septoria bataticola, Septoria cam- panulae, Septoria cannabis, Septoria caryae, Septoria citri, Septoria cu-curbitacearum, Septoria darrowii, Septoria dianthi, Septoria eumusae, Septoria fragariae, Septoria fragariaecola, Septoria glycines, Septoria helianthi, Septoria humuli, Septoria hydrangeae, Septoria lactucae, Sep- toria liquidambaris, Septoria lycopersici, Septoria lycopersici var. mala- gutii, Septoria menthae, Septoria ostryae, Septoria passerinii, Septoria pisi, Septoria pistaciae, Septoria platanifolia, Septoria rhododendri, Sep- toria secalis, Septoria selenophomoides, Setosphaeria rostrata, Setos- phaeria turcica, Sirosporium diffusum, Sparassis, Sphaceloma, Sphace- loma arachidis, Sphaceloma coryli, Sphaceloma menthae, Sphaceloma perseae, Sphaceloma poinsettiae, Sphaceloma pyrinum, Sphaceloma randii, Sphaceloma sacchari, Sphaceloma theae, Sphacelotheca reiliana, Sphaerella platanifolia, Sphaeropsis tumefaciens, Sphaerotheca, Sphaerotheca castagnei, Sphaerotheca fuliginea, Sphaerulina oryzina, Sphaerulina rehmiana, Sphaerulina rubi, Sphenospora kevorkianii, Spi- niger meineckellus, Spiroplasma, Spongipellis unicolor, Sporisorium cru- entum, Sporisorium ehrenbergi, Sporisorium scitamineum, Sporisorium sorghi, Sporonema phacidioides, Stagonospora avenae f.sp. triticae, Stagonospora meliloti, Stagonospora recedens, Stagonospora sacchari, Stagonospora tainanensis, Steccherinum ochraceum, Stegocintractia junci, Stegophora ulmea, Stemphylium alfalfa, Stemphylium bolickii, Stemphylium cannabinum, Stemphylium globuliferum, Stemphylium lycopersici, Stemphylium sarciniforme, Stemphylium solani, Stem- phylium vesicarium, Stenella anthuriicola, Stereum, Stereum hirsutum, Stereum rameale, Stereum sanguinolentum, Stigmatomycosis, Stig- mella platani-racemosae, Stigmina carpophila, Stigmina liquidambaris, Stigmina palmivora, Stigmina platani, Stigmina platani-racemosae, Su- banguina radicicola, Subanguina wevelli, Sydowia polyspora, Sydowi- ella depressula, Sydowiellaceae, Synchytrium endobioticum, Syn- chytrium fragariae, Synchytrium liquidambaris, Taiwanofungus camphoratus, Tapesia acuformis, Tapesia yallundae, Taphrina aurea, Taphrina bullata, Taphrina caerulescens, Taphrina coryli, Taphrina deformans, Taphrina entomospora, Taphrina johansonii, Taphrina potentillae, Ta- phrina ulmi, Taphrina wiesneri, Thanatephorus cucumeris, Thielavio- psis, Thielaviopsis basicola, Thyrostroma compactum, Tilletia barcla- yana, Tilletia caries, Tilletia controversa, Tilletia laevis, Tilletia tritici, Tilletia walkeri, Tilletiariaceae, Tobacco necrosis virus, Togniniaceae, Trachysphaera fructigena, Trametes gibbosa, Trametes hirsute, Trame- tes nivosa, Trametes pubescens, Tranzschelia discolor f.sp. persica, Tranzschelia pruni-spinosae var. discolor, Trichaptum biforme, Tricho- derma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma viride, Trichothe- cium roseum, Tripospermum acerinum, Truncatella, Truncatella lauro- cerasi, Tubercularia lateritia, Tubercularia ulmea, Tubeufia pezizula, Tunstallia aculeata, Tylenchorhynchus, Tylenchorhynchus brevilineatus, Tylenchorhynchus claytoni, Tylenchorhynchus dubius, Tylenchorhyn- chus maximus, Tylenchorhynchus nudus, Tylenchorhynchus phaseoli, Tylenchorhynchus vulgaris, Tylenchorhynchus zeae, Tylenchulus semi- penetrans, Typhula idahoensis, Typhula incarnate, Typhula ishikarien- sis, Typhula ishikariensis var. canadensis, Typhula variabilis, Typhulo- chaeta, Tyromyces calkinsii, Tyromyces chioneus, Tyromyces galacti- nus, Ulocladium atrum, Ulocladium consortiale, Uncinula, Uncinula ma- crospora, Uncinula necator, Uredo behnickiana, Uredo kriegeriana, Uredo musae, Uredo nigropuncta, Uredo rangelii, Urocystis, Urocystis agropyri, Urocystis brassicae, Urocystis occulta, Uromyces, Uromyces apiosporus, Uromyces beticola, Uromyces ciceris-arietini, Uromyces di- anthi, Uromyces euphorbiae, Uromyces graminis, Uromyces inconspi- cuus, Uromyces lineolatus subsp. nearcticus, Uromyces medicaginis, Uromyces musae, Uromyces oblongus, Uromyces pisi-sativi, Uromyces proêminens var. poinsettiae, Uromyces trifolii-repentis var. fallens, Uromyces viciae-fabae var. viciae-fabae, Urophlyctis leproides, Urophlyctis trifolii, Urophora cardui, Ustilaginales, Ustilaginoidea virens, Ustilaginomycetes, Ustilago, Ustilago avenae, Ustilago hordei, Ustilago maydis, Ustilago nigra, Ustilago nuda, Ustilago scitaminea, Ustilago tri- tici, Valsa abietis, Valsa ambiens, Valsa auerswaldii, Valsa ceratos- perma, Valsa kunzei, Valsa nivea, Valsa sordida, Valsaria insitiva, Venturia carpophila, Venturia inaequalis, Venturia pirina, Venturia pyrina, Veronaea musae, Verticillium, Verticillium albo-atrum, Verticillium albo- atrum var. menthae, Verticillium dahliae, Verticillium longisporum, Verti- cillium theobromae, Villosiclava virens, Virescence, Waitea circinata, Wuestneiopsis Georgiana, Xanthomonas ampelina, Xanthomonas axo- nopodis, Xanthomonas campestris, Xanthomonas campestris pv. cam- pestris, Xanthomonas oryzae, Xeromphalina fraxinophila, Xiphinema americanum, Xiphinema bakeri, Xiphinema brevicolle, Xiphinema diver- sicaudatum, Xiphinema insigne, Xiphinema rivesi, Xiphinema vuittenezi, Xylaria mali, Xylaria polymorpha, Xylella fastidiosa, Xylophilus, Xylophi- lus ampelinus, Zopfia rhizophila, Zygosaccharomyces bailii e Zygosac- charomyces florentinus.
[00118] Os patógenos de insetos e larvas incluem Acalymma, Acyr- thosiphon pisum, largarta do cartucho africana, abelha africanizada, Agromyzidae, Agrotis munda, Agrotis porphyricollis, Aleurocanthus wo- glumi, Aleyrodes proletella, Alphitobius diaperinus, Altica chalybea, Anasa tristis, Anguina tritici, Anisoplia austriaca, Anthonomus pomorum, Anthonomus signatus, Aonidiella aurantii, Apamea apamiformis, Apa- mea niveivenosa, Aphelenchoides spp., aphid, Aphis gossypii, apple maggot, formiga argentina, Euxoa auxiliaris, Arotrophora arcuatalis, As- terolecanium coffeae, Athous haemorrhoidalis, Aulacophora, praga de gafanhotos australiana, Bactericera cockerelli, Bactrocera, Bactrocera correcta, Bagrada hilaris, broca listrada da nogueira, lagarta militar da beterraba, Belonolaimus spp., pulgão do feijão, Blepharidopterus chlori- onis, mariposa Bogon, bicudo-do-algodoeiro, Bradysia similigibbosa, mosquito da vagem Brassica, Brevicoryne brassicae, gafanhoto marrom, percevejo da sementes de soja, Fulguroidea marrom, Bursephe- lenchus spp., mariposa do repolho, lagarta do repolho, Callosobruchus maculatus, besouro-da-cana, mosca da cenousa, nemátodo de cisto de cereal, Cecidomyiidae, Ceratitis capitata, Ceratitis rosa, besouro de folha de cereal, Chlorops pumilionis, escaravelho dos citros, Coccus viridis, lagarta, broca-do-café, besouro-da-batata, gorgulho confuso da farinha, crambus, besouro do pepino, Curculio nucum, Curculio occiden- tis, lagarta-rosca, Cyclocephala borealis, Agrotis ipsilon, Coccotrypes dactyliperda, Delia spp., Delia antiqua, Delia floralis, Delia radicum, Desert locust, Diabrotica, Diabrotica balteata, Diabrotica speciosa, traça das crucíferas, Diaphania indica, Diaphania nitidalis, Diaphorina citri, Di- aprepes abbreviatus, Diatraea saccharalis, gafanhoto diferencial, Ditylenchus spp., Dociostaurus maroccanus, Drosophila suzukii, Dryo- cosmus kuriphilus, Earias perhuegeli, Epicauta vittata, Epilachna vari- vestis, Erionota thrax, Eriosomatinae, Euleia heraclei, Eumetopina flavi- pes, Eupoecilia ambiguella, broca europeia do milho, Eurydema olera- cea, Eurygaster integriceps, Pentatoma rufipes, Frankliniella tritici, Galleria mellonella, Euxoa nigricans, cigarrinha, mosca branca das estufas, Gryllotalpa orientalis, Gryllus pennsylvanicus, mariposa-cigana, Helico- verpa armigera, Helicoverpa gelotopoeon, Helicoverpa punctigera, Heli- coverpa zea, Heliothis virescens, Henosepilachna vigintioctopunctata, Hessian fly, Heterodera spp., Jacobiasca formosana, besouro japonês, besouro Khapra, Lampides boeticus, minador, Lepidiota consobrina, Le- pidosaphes beckii, Lepidosaphes ulmi, Leptoglossus zonatus, Leptop- terna dolabrata, Achroia grisella, Leucoptera (mariposa), Leucoptera caffeina, mariposa-das-maçãs, Lissorhoptrus oryzophilus, long-tailed Skipper, Lygus, Lygus hesperus, Maconellicoccus hirsutus, Macrodactylus subspinosus, Macrosiphum euphorbiae, gorgulho-do-milho, Manduca sexta, Mayetiola hordei, Mealybug, Meloidogyne spp., Megacopta cribraria, Metcalfa pruinosa, mariposas, Acrolepiopsis assectella, Myzus persicae, Naccobus spp., Nezara viridula, processionário do carvalho, mosca-da-azeitona, Ophiomyia simplex, Opisina arenosella, Opomyza, Opomyza florum, Opomyzidae, Oscinella frit, Ostrinia furnacalis, Oxyca- renus hyalinipennis, Paracoccus marginatus, Papilio demodocus, Para- tachardina pseudolobata, Pentatomoidea, Phthorimaea operculella, Phyllophaga, Phylloxera, Phylloxeridae, Phylloxeroidea, Pieris brassi- cae, pink bollworm, Planococcus citri, Platynota idaeusalis, Plum curcu- lio, Pratylenchus spp., Prionus californicus, Pseudococcus viburni, Pyra- lis farinalis, formiga-de-fogo, gafanhoto vermelho, nemátodos de raízes, nemátodo de nódulos radiculares, Radopholus spp., Rotylenchulus spp., Rhagoletis cerasi, Rhagoletis indifferens, Rhagoletis mendax, Rhopalosiphum maidis, Rhyacionia frustrana, Rhynchophorus ferrugi- neus, Rhynchophorus palmarum, Rhyzopertha, mariposa do arroz, per-cevejo do arroz, afídeo russo do trigo, escala de San Jose, Coccoidea, Schistocerca americana, Sciaridae, Scirtothrips dorsalis, Scutelleridae, Scutiphora pedicellata, Anguina tritici, bicho mineiro, mosca-branca-da- folha-prateada, Sipha flava, pequeno besouro das colmeias, broca do milho do sudoeste, afídeo da sementes de soja, Spodoptera cilium, Spodoptera litura, besouro do pepino manchado, broca da abóbora, ne- mátodos dos caules, Stenotus binotatus, Strauzia longipennis, pulga listrada, percevejos-escudo, besoudo da batata doce, Lygus lineolaris, ti- sanópteros, Thrips angusticeps, Thrips palmi, Toxoptera citricida, Tri- chodorus spp., Trioza erytreae, Agrotis segetum, Tuta absoluta, Tylen- chulus spp., vários percevejos de carpete, Virachola isocrates, Galleria mellonella, crisomelídeo do milho, tripes Frankliniella occidentalis, mosca do trigo, gorgulho do trigo, mosca branca, mariposa do inverno e Xiphenema spp.
[00119] Por exemplo, o patógeno de inseto ou larva pode ser uma lagarta de cereais, lagarta-rosca, broca de milho europeia, lagarta-do- cartucho-do-milho, besouro japonês, lagarta-elasmo, gorgulho, verme da semente do milho, lagarta-elasmo do sul, Diabrotica de milho do sul, larva os elaterídeos da batata do sul, Papaipema nebris, besouro-da- cana, Dermolepida albohirtum, larvas de folhas, bicudo-do-algodoeiro, lagarta-do-cartucho com listras amarelas, Oulema melanopus, Blissus leucopterus, afídeos, lagarta-do-cartucho-da-beterraba, Epilachna varivestis, lagarta-falsa-medideira-de-soja, Dectes texanus ou combinações destes. Proteínas e peptídeos que aumentam a resistência a estresse nas plantas.
[00120] A invenção relaciona-se também a proteínas de fusão que compreender uma sequência de escolha, proteína do exosporium, ou fragmento da proteína do exosporium, e pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência a estresse em um vegetal.
[00121] Por exemplo, a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência a estresse em um vegetal compreende uma enzima que degrada um composto relacionado a estresse. Os compostos relacionados a estresse incluem, mas não se limitam a, ácido aminociclopropano-1-car- boxílico (ACC), espécie de oxigênio reativo, óxido nítrico, oxilipinas e fenólicos. A espécie de oxigênio reativo específica inclui hidroxil, hidrogênio, peróxido, oxigênio e superóxido. A enzima que degrada um composto relacionado a estresse pode compreender uma dismutase de su- peróxido, uma oxidase, uma catalase, uma deaminase de ácido amino- ccropano-1-carboxílico, uma peroxidase, uma enzima antioxidante ou um peptídeo antioxidante.
[00122] A proteína ou peptídeo que aumenta a resistência a estresse em um vegetal pode compreender ainda uma proteína ou um peptídeo que protege um vegetal da estresse ambiental. A estresse ambiental pode compreender, por exemplo, seca, enchente, aquecimento, congelamento, sal, metais pesados, pH baixo, pH alto ou uma combinação destes. Por exemplo, a proteína ou o peptídeo que protege um vegetal de uma estresse ambiental pode compreender uma proteína de nuclea- ção de gelo, uma prolinase, uma liase de amônia de fenilalanina, uma sintase de isocorismato, uma liase de piruvato de isocorismato ou uma dehidrogenase de colina.
Peptídeos e proteínas de ligação vegetal
[00123] A invenção relaciona-se também a proteínas de fusão que compreender uma sequência de escolha, proteína do exosporium, ou fragmento da proteína do exosporium e pelo menos uma proteína ou peptídeo vegetal. A proteína ou peptídeo de ligação vegetal pode ser qualquer proteína ou peptídeo que seja capaz de ligar-se especificamente ou não-especificamente a qualquer parte de um vegetal (por exemplo, uma raiz de um vegetal ou uma parte aérea de um vegetal, como uma folha, um caule, uma flor ou uma fruta) ou um material de origem vegetal. Assim, por exemplo, o peptídeo ou proteína de ligação vegetal pode ser um peptídeo ou uma proteína de ligação de raiz, ou um peptídeo ou uma proteína de ligação de folha.
[00124] Os peptídeos e as proteínas de ligação vegetal apropriados incluem adesinas (por exemplo, ricadesina), flagelinas, omptinas, lecti- nas, expansinas, proteínas estruturais de biopelícula (por exemplo, TasA ou YuaB), proteínas pilus, proteínas curlus, intiminas, invasinas, aglutininas e proteínas afimbriais.
Outras proteínas de fusão
[00125] A presente invenção relaciona-se ainda a proteínas de fusão que compreendem pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e proteína de exosporium compreendendo uma proteína exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com qualquer uma das SEQ ID N°s: 71, 75, 80, 81,82, 83 e 84. Alternativamente, a proteína de exosporium pode compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID N°s: 71, 75, 80, 81,82, 83 e 84.
[00126] A proteína ou peptídeo de interesse pode compreender qualquer proteína ou peptídeo. Por exemplo, a proteína ou peptídeo de interesse pode compreender quaisquer das proteínas ou peptídeos descritos aqui. Por exemplo, a proteína ou peptídeo de interesse pode compreender qualquer uma das proteínas ou peptídeos estimulantes de crescimento da planta descritos aqui, qualquer das proteínas ou peptí- deos que protegem um vegetal de um patógeno descritos aqui, qualquer proteína ou peptídeo que aumente a resistência a estresse em um vegetal descritos aqui ou qualquer planta ou peptídeo de ligação vegetal descritos aqui.
[00127] Assim, onde a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma proteína ou peptídeo estimulantes de crescimento da planta, o peptídeo ou proteína estimulantes de crescimento da planta podem compreender um hormônio de peptídeo, um peptídeo não-hormonal ou uma enzina envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador de crescimento da planta. De modo alternativo, a proteína ou peptídeo estimulantes de crescimento da planta podem compreender qualquer enzina que degrade ou modifique uma fonte bacteriana, fúngica ou de nutriente vegetal descrita a partir de então.
Membros da família do Bacillus cereus recombinante que expressam proteínas de fusão
[00128] A presente invenção também se relaciona a um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão. A proteína da fusão pode ser qualquer uma dentre as proteínas de fusão discutidas acima.
[00129] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode co- expressar duas ou mais de qualquer uma dentre as proteínas de fusão discutidas acima. Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus re- combinante pode coexpressar pelo menos uma proteína de fusão que compreende uma proteína ou peptídeo de ligação vegetal, juntamente com pelo menos uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo estimulantes de crescimento vegetal, pelo menos uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo que protegem um vegetal de um patógeno ou pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumentam a resistência a estresse em um vegetal.
[00130] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacilluspseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus- gaemokensis, Bacillus weihenstephensis ou uma combinação destes. Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus pseu- domycoides ou Bacillus mycoides. Em especial, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoides.
[00131] Para gerar um membro da família Bacillus cereus recombi- nante que expressa uma proteína de fusão, qualquer membro da família Bacillus cereus pode ser conjugado, transduzido ou transformado com um vetor que codifica a proteína de fusão usando métodos padrão conhecidos na técnica (por exemplo, por eletroporação). As bactérias podem então ser selecionadas para identificar transformantes por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, onde o vetor inclui um gene de resistência a antibiótico, a bactéria pode ser triada para resistência a antibiótico. Alternativamente, o DNA que codifica a proteína de fusão pode ser integrado ao DNA cromossômico de um hospedeiro de um membro da família B. cereus. O membro da família Bacillus cereus recombinante pode então ser exposto a condições que induzirão a es- porulação. As condições apropriadas para induzir a esporulação são conhecidas na técnica. Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode ser laminado em lâminas de ágar e incubado a uma temperatura de cerca de 30°C por vários dias (por exemplo, por 3 dias).
[00132] As cepas tóxicas, as cepas não-tóxicas ou as cepas geneticamente manipuladas de qualquer uma das espécies acima podem também ser usadas de maneira apropriada. Por exemplo, um Bacillus thu- ringiensis sem a critoxina pode ser usado. Alternativamente, ou adicionalmente, uma vez que os esportos da família B. cereus recombinante expressando a proteína de fusão tiverem sido gerados, eles podem ser desativados a fim de evitar novas germinações quando estiver em uso. Qualquer método para desativar os esporos bacterianos que seja co-nhecido na técnica pode ser usado. Os métodos apropriados incluem, sem limitação, tratamento de calor, irradiação gama, irradiação de raio- x, irradiação UV-A, irradiação UV-B, tratamento químico (por exemplo, tratamento com gluteraldeído, formaldeído, peróxido de hidrogênio, ácido acético, alvejante ou qualquer combinação destes) ou uma combinação destes. Alternativamente, os esporos derivados de cepas não- toxigênicas, ou cepas geneticamente ou fisicamente desativadas, podem ser usados.
Membros da família Bacillus cereus recombinante que têm efeitos de promoção de crescimento vegetal e/ou atributos benéficos
[00133] Muitos membros das cepas dos membros da família Bacillus cereus possuem atributos benéficos inerentes. Por exemplo, algumas cepas possuem efeitos de promoção de crescimento vegetal. Algumas das proteínas da fusão descritas aqui poder ser expressadas nessas cepas.
[00134] Por exemplo, o membro da família Bacillus cereusrecombi- nante pode compreender uma cepa de promoção de crescimento vegetal da bactéria.
[00135] A cepa de promoção de crescimento vegetal da bactéria pode compreender uma cepa da bactéria que produz uma toxina inseticida (por exemplo, uma critoxina), produz um composto fungicida (por exemplo, uma β-1,3-glucanase, uma quitosinase, uma liticase ou uma combinação destes), produz um composto nematocida (por exemplo, uma critoxina), produz um composto bactericida, é resistente a um ou mais antibióticos, compreende um ou mais plasmídeos de replicação livre, liga-se às raízes da planta, coloniza as raízes da planta, forma biopelículas, solubiliza nutrientes, secreta ácidos orgânicos ou uma combinação destes.
[00136] Por exemplo, onde o membro da família Bacillus cereus re- combinante compreende uma cepa de promoção de crescimento vegetal da bactéria, a cepa de promoção de crescimento vegetal da bactéria pode compreender Bacillus mycoides BT155 (NRRL N° B-50921), Bacillus mycoides EE118 (NRRL N° B-50918), Bacillus mycoides EE141 (NRRL N° B-50916), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL N° B-50922), o membro da família Bacillus cereus EE128 (NRRL N° B-50917), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL N° B-50924) ou membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL N° B-50928). Cada uma dessas cepas foi depositada com o United StatesDepartment of Agriculture (USDA) Agricultural ResearchService (ARS), com o endereço 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EUA, em 10 de março de 2014, e é identificado pelo número de depósito NRRL fornecido em parêntese.
[00137] Essas cepas de promoção de crescimento vegetal foram isoladas das rizosferas de várias plantas vigorosas e foram identificadas por suas sequências de 16S rRNA (fornecidas aqui como SEQ ID NOs. 104-110), e através de análises bioquímicas. As cepas foram identificadas pelo menos à sua designação de gênero por meio de indicadores morfológicos e bioquímicos convencionais. As análises bioquímicas para as cepas Gram-positivas confirmadas, como Bacillus, incluíram crescimento em meio de PEA e ágar nutriente, examinação microscópica, crescimento em meio de 5% e 7,5% de NaCl, crescimento em pH 5 e pH 9, crescimento a 42°C e 50°C, a capacidade de produzir ácido a partir da fermentação com celobiose, lactose, glicerol, glicose, sucarose, d-manitol e amido; produção de pigmento fluorescente, hidrólise de gelatina, redução de nitrato; produção de catalase, hidrólise de amido; reação de oxidase; produção de urease e motilidade. A identificação dessas cepas e a demonstração de seus efeitos de promoção de crescimento vegetal são descritos com mais detalhes nos exemplos abaixo.
[00138] Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombi- nante compreendendo uma cepa de promoção de crescimento vegetal da bactéria pode compreenderBacillus mycoides BT155, Bacillus mycoi- des EE141 ou Bacillus thuringiensis BT013A. O membro da família Bacillus cereus recombinante pode expressar qualquer uma das proteínas de fusão descritas aqui, por exemplo, a proteína de fusão que compreende a sequência de escolha do SEQ ID N°: 60 e um peptídeo não- hormonal (por exemplo, um inibidor de tripsina kunitz (KTI)), uma enzina envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento vegetal (por exemplo, uma quitosinase), um peptídeo ou proteína de ligação vegetal (por exemplo, TasA); uma proteína ou pep- tídeo que protegem um vegetal de um patógeno (por exemplo, TasA) ou uma enzina que degrada ou modifica a fonte bacteriana, fúngica ou nutriente vegetal (por exemplo, uma fosfatase, como PhoA ou fitase ou uma endoglucanase).
Promotores
[00139] Em qualquer um dos membros da família Bacillus cereus re- combinante descritos aqui, a proteína de fusão pode ser expressada sob o controle de um promotor que é nativo para a sequência de escolha, para a proteína de exosporium ou para o fragmento da proteína de exosporium da proteína de fusão. Por exemplo, onde a proteína de fusão compreende uma sequência de escolha derivada do B. anthracis Sterne BclA (por exemplo, aminoácidos 20-35 da SEQ ID N°: 1, aminoácidos 1-35 da SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 1, ou SEQ ID N°: 60) ou onde a proteína de fusão compreende o BclA de comprimento total (SEQ ID N°: 2) ou um fragmento do BclA de comprimento total (por exemplo, SEQ ID N°: 59), a proteína de fusão pode ser expressada sob o controle de um promotor que é nominalmente associado ao gene BclA no ge- noma do B. anthracis Sterne (por exemplo, o promotor da SEQ ID N°: 85).
[00140] Alternativamente, a proteína de fusão pode ser expressada sob o controle de um Promotor de esporulação de alta expressão. Em alguns casos, o promotor que é nativo para a sequência de escolha, para a proteína de exosporium ou para o fragmento da proteína de exos- porium será um Promotor de esporulação de alta expressão. Em outros casos, o promotor que é nativo para a sequência de escolha, para a proteína de exosporium ou para o fragmento da proteína de exosporium será um Promotor de esporulação de alta expressão. Nestes casos, será vantajoso substituir o promotor nativo por um Promotor de esporu- lação de alta expressão. A expressão da proteína de fusão sob o controle de um Promotor de esporulação de alta expressão proporciona uma expressão aumentada da proteína de fusão no exosporium do membro da família Bacillus cereus.
[00141] O Promotor de esporulação de alta expressão pode compreender uma ou mais sequências de promotores de polimerase específicos para esporulação de sigma-K.
[00142] Promotores de esporulação de alta expressão apropriados para uso na expressão de proteínas de fusão em um membro da família Bacillus cereus inclui aqueles listados na Tabela 2 abaixo: Tabela 2. Sequências de promotor
[00143] Nas sequências d o promotor listadas na Iabela 2 acima, os locais das sequências de Promotor de polimerase específica para espo- rulação de sigma-K são indicados por texto em negrito e sublinhado. O Promotor de CrylA (B. thuringiensis HD-73; SEQ ID N°: 90) tem um total de quatro sequências de sigma-K, duas das quais sobrepõem-se uma a outra, como indicado pelo duplo sublinhado na Tabela 2.
[00144] Os promotores de esporulação de alta expressão preferidos para uso na expressão de proteínas de fusão em um membro da família Bacillus cereus incluem o promotor BetA (B. anthracis Sterne; SEQ ID N°: 86), o Promotor de BclA (B. anthracis Sterne; SEQ ID N°: 85), os promotores de óperons de transferase de glicosil do agrupamento BclA 1 e 2 (B. anthracis Sterne; SEQ ID NOs: 101 e 102), e o Promotor de proteína de hélice YVTN β (B. weihenstephensis KBAB 4; SEQ ID N°: 89).
[00145] Em qualquer um dos membros da família Bacillus cereus re- combinante descritos aqui, a proteína de fusão pode ser expressada sob o controle de um Promotor de esporulação compreendendo uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID N°s: 85-103.
[00146] Quando o Promotor de esporulação compreendendo uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID N°s: 85-103, a sequência ou as sequências do Promotor de polimerase específica para esporulação de sigma-K têm preferencialmente 100% de identidade com os nucleotídeos correspondentes da SEQ ID N°: 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 ou 103. Por exemplo, como ilustrado na Tabela 2 acima, o Promotor de BclA do B. anthracis Sterne (SEQ ID N°: 85) tem sequências do Promotor de polimerase específica para esporulação de sigma-K nos nucleotídeos 24-32, 35-43 e 129-137. Assim, se o Promotor de esporulação compreender uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID N°: 85, é preferível que os nu- cleotídeos do Promotor de esporulação correspondente aos nucleotí- deos 24-32, 35-43 e 129-137 da SEQ ID N°: 85 tenham 100% de identidade com os nucleotídeos 24-32, 35-43 e 129-137 da SEQ ID N°: 85.
Formulações
[00147] A presente invenção se relaciona também a formulações que compreendem qualquer um dos membros da família Bacillus cereus re- combinante discutido na seção anterior e um transportador aceitável agricolamente.
[00148] O transportador aceitável agricolamente pode ser qualquer transportador compatível com o uso agrícola. Por exemplo, os trans-portadores aceitáveis agricolamente incluem, mas não se limitam a, dispersantes, surfactantes, aditivos, água, espessantes, agentes anti- rachaduras, quebra de resíduo, formulações de compostagem, aplicações granulares, terra diatomácea, óleos, agentes de colorização, estabilizadores, conservantes, polímeros, revestimentos e combinações destes.
[00149] O aditivo pode compreender um óleo, uma goma, uma resina, uma argila, um glicol de polioxietileno, um terpeno, um orgânico pegajoso, um éster de ácido graxo, um álcool sulfatado, um sulfonato de alquil, um sulfonato de petróleo, um sulfonato de álcool, um diamato de alquil butano de sódio, um poliéster de dioato de tiobutano de sódio, um derivado de acetonitrilo de benzeno, um material proteináceo (por exemplo, um produto derivado do leite, farinha de trigo, farinha de sementes de soja, sangue, albumina, gelatina ou uma combinação destes) ou uma combinação destes.
[00150] O espessante pode compreender uma longa cadeia de alqui- lsulfonato de glicol de polietileno, um oleato de polioxietileno ou uma combinação destes.
[00151] O surfactante pode compreender um óleo de petróleo pesado, um distilado de petróleo pesado, um éster de ácido graxo de po- liol, um éster de ácido graxo polietoxilado, um glicol de aril alquil polioxi- etileno, um acetado de amina de alquil, um alquil aril sulfonato, um álcool polihídrico, um fosfato de alquil ou uma combinação destes.
[00152] O agente antiglutinante compreende um sal de sódio, um carbonato de cálcio, terra diatomácea ou uma combinação destes. Por exemplo, o sal de sódio pode compreender um sal de sódio de sulfonato de monometilnaftaleno, um sal de sódio de sulfonato de dimetilnafta- leno, um sulfito de sódio, um sulfato de sódio ou uma combinação destes.
[00153] Os transportadores agricolamente aceitáveis apropriados incluem vermiculite, carvão vegetal, lama de prensa de carbonação de indústria açucareira, casca de arroz, celulose de carboximetil, turfa, perlite, areia fina, carbonato de cálcio, farinha, alume, um amido, falco, pir- rolidona de polivinil ou uma combinação destes.
[00154] A formulação pode compreender uma formulação de revestimento de semente, uma formulação líquida para aplicação em plantas ou a um meio de crescimento vegetal ou uma formulação sólida para aplicação a plantas ou a um meio de crescimento vegetal.
[00155] Por exemplo, a formulação de revestimento de semente pode compreender uma solução aquosa ou à base de óleo para aplicação a sementes. Alternativamente, a formulação de revestimento de semente pode compreender um pó ou uma formulação granular para aplicação a sementes.
[00156] A formulação líquida para a aplicação a vegetais ou a um meio de crescimento vegetal pode compreender uma formulação concentrada ou uma formulação pronta para uso.
[00157] A formulação sólida para aplicação a vegetais ou a um meio de crescimento vegetal pode compreender uma formulação granular ou um agente pulverizador.
[00158] Algumas das formulações acima podem também compreender produto agroquímico, por exemplo, um fertilizante, um material fertilizante de micronutriente, uma inseticida, um herbicida, uma emenda de crescimento vegetal, um fungicida, um inseticida, um moluscocida, um algicida, um inoculante bacteriano, um inoculante fúngico ou uma combinação destes.
[00159] O fertilizante pode compreender um fertilizante líquido.
[00160] O fertilizante pode compreender um sulfato de amônio, um nitrato de amônio, um nitrato de sulfato de amônio, um cloreto de amô- nio, um bissulfato de amônio, um polissulfeto de amônio, um tiossulfato de amônio, uma amônia aquosa, uma amônia anidrosa, um polifosfato de amônio, um sulfato de alumínio, um nitrato de cálcio, um nitrato de amônio de cálcio, um sulfato de cálcio, magnesita calcinada, pedra calcária calcítica, óxido de cálcio, nitrato de cálcio, pedra calcária dolomí- tica, cal hidratado, carbonato de cálcio, fosfato de diamônio, fosfato de monoamônio, nitrato de magnésio, sulfato de magnésio, nitrato de potássio, cloreto de potássio, sulfato de magnésio de potássio, sulfato de potássio, nitratos de sódio, pedra calcária magnesiana, magnésia, ureia, formaldeídos de ureia, nitrato de amônio de ureia, ureia revestida de enxofre, ureia revestida de polímero, diureia de isobutileno, K2SO4- 2MgSO4, cainita, silvinita, quieserita, sais Epsom, enxofre elementar, marga, conchas de ostras, farinha de peixe, bagaços oleaginosos, comida de peixe, farinha de sangue, fosfato de rocha, superfosfatos, entulho, farinha de osso, cinza de madeira, esterco, guano de morcego, turfa, adubo, areia verde, farinha de semente de algodão, farinha de pena, farinha de caranguejo, emulsão de peixe, ácido húmico ou uma combinação destes.
[00161] O material fertilizante de micronutriente pode compreender um ácido bórico, um borato, um boro frito, um sulfato de cobre, uma frita de cobre, um quelato de cobre, um decahidrato tetraborato de sódio, um sulfato de ferro, um óxido de ferro, um sulfato de amônio de ferro, uma frita de ferro, um quelato de ferro, um sulfato de manganês, um óxido de manganês, um quelato de manganês, um cloreto de manganês, uma frita de manganês, um molibdato de sódio, um ácido molíbdico, um sulfato de zinco, um óxido de zinco, um carbonato de zinco, uma frita de zinco, um fosfato de zinco, um quelato de zinco ou uma combinação destes.
[00162] O insecticida pode compreender um organofosfato, um car- bamato, um piretroide, uma acaricida, um ftalato de alquil, um ácido bórico, um borato, um fluorídeo, uma ureia substituída com um haloaromá- tico, um éster de hidrocarboneto, uma inseticida de base biológica ou uma combinação destes.
[00163] O herbicida pode compreender um composto clorofenóxi, um composto nitrofenólico, um composto nitrocresólico, um composto de dipiridil, uma acetamida, um ácido alifático, uma anilida, uma benza- mida, um ácido benzoico, um derivado do ácido benzoico, um ácido aní- sico, um derivado de ácido anísico, um benzonitrilo, um dióxido de ben- zotiadiazinona, um tiocarbamato, um carbamato, um carbanilato, um cloropiridinil, um derivado da ciclohexenona, um derivado do dinitroami- nobenzeno, um composto de fluorodinitrotoluidina, uma isoxazolidinona, um ácido nicotínico, uma isopropilamina, derivados da isopropilamina, oxadiazolinona, um fosfato, um ftalato, um composto de ácido picolínico, uma triazina, um triazol, um uracil, um derivado de ureia, endotal, clorato de sódio ou uma combinação destes.
[00164] O fungicida pode compreender um benzeno substituído, um tiocarbamato, um etileno bis ditiocarbamato, uma tioftalidamida, um composto de cobre, um composto de organomercúrio, um composto de organotina, um composto de cádmio, uma anilazina, benomil, ciclohe- xamida, dodina, etridiazol, iprodiona, metlaxil, tiamimefona, triforina ou uma combinação destes.
[00165] O inoculante fúngico pode compreender um inoculante fúngico da família Glomeraceae, um inoculante fúngico da família Claroido- glomeraceae, um inoculante fúngico da família Gigasporaceae, um ino- culante fúngico da família Acaulosporaceae, um inoculante fúngico da família Sacculosporaceae, um inoculante fúngico da família Entrophos- poraceae, um inoculante fúngico da família Pacidsporaceae, um inocu- lante fúngico da família Diversisporaceae, um inoculante fúngico da família Paraglomeraceae, um inoculante fúngico da família Archaeospo- raceae, um inoculante fúngico da família Geosiphonaceae, um inocu- lante fúngico da família Ambisporaceae, um inoculante fúngico da família Scutellosporaceae, um inoculante fúngico da família Dentiscultata- ceae, um inoculante fúngico da família Racocetraceae, um inoculante fúngico do filo Basidiomycota, um inoculante fúngico do filo Ascomycota, um inoculante fúngico do filo Zygomycota ou uma combinação destes.
[00166] O inoculante bacteriano pode compreender um inoculante bacteriano do gênero Rhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Bradyrhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Mesorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Azorhizobium, um inoculante bac- teriano do gênero Allorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Sinorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Kluyvera, um inocu- lante bacteriano do gênero Azotobacter, um inoculante bacteriano do gênero Pseudomonas, um inoculante bacteriano do gênero Azospiril- lium, um inoculante bacteriano do gênero Bacillus, um inoculante bac- teriano do gênero Streptomyces, um inoculante bacteriano do gênero Paenibacillus, um inoculante bacteriano do gênero Paracoccus, um ino- culante bacteriano do gênero Enterobacter, um inoculante bacteriano do gênero Alcaligenes, um inoculante bacteriano do gênero Mycobacterium, um inoculante bacteriano do gênero Trichoderma, um inoculante bacteriano do gênero Gliocladium, um inoculante bacteriano do gênero Glomus, um inoculante bacteriano do gênero Klebsiella ou uma combinação destes.
[00167] O inoculante bacteriano pode compreender uma cepa de promoção de crescimento vegetal da bactéria. A cepa de promoção de crescimento de planta da bactéria pode compreender uma cepa da bactéria que produz uma toxina inseticida (por exemplo, uma critoxina), produz um composto fungicida (por exemplo, uma β-1,3-glucanase, uma quitosinase, uma liticase ou uma combinação destes), produz um composto nematocida (por exemplo, uma critoxina), produz um composto bactericida, é resistente a um ou mais antibióticos, compreende um ou mais plasmídeos de replicação livre, liga-se às raízes da planta, coloniza as raízes da planta, forma biopelículas, solubiliza nutrientes, secreta ácidos orgânicos ou uma combinação destes.
[00168] Por exemplo, o inoculante bacteriano pode compreender Bacillus aryabhattai CAP53 (NRRL N° B-50819), Bacillus aryabhattai CAP56 (NRRL N° B-50817), Bacillus flexus BT054 (NRRL N° B-50816), Paracoccus kondratievae NC35 (NRRL N° B-50820), Bacillus mycoides BT155 (NRRL N° B-50921), Enterobacter cloacae CAP12 (NRRL N° B- 50822), Bacillus nealsonii BOBA57 (NRRL N° NRRL B-50821), Bacillus mycoides EE118 (NRRL N° B-50918), Bacillus subtilis EE148 (NRRL N° B-50927), Alcaligenes faecalis EE107 (NRRL N° B-50920), Bacillus mycoides EE141 (NRRL N° B-50916), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL N°. B-50922), membro da família Bacillus cereus EE128 (NRRL N°. B- 50917), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL N°. B-50924), Paenibaci- llus massiliensis BT23 (NRRL N°. B-50923), um membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL N°. B-50928), Bacillus subtilis EE218 (NRRL N°. B-50926), Bacillus megaterium EE281 (NRRL N°. B-50925) ou uma combinação destes. Cada uma dessas cepas foi depositada junto ao Serviço de Pesquisa Agrícola (ARS) do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), tendo como endereço 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, EUA, em 11 de março de 2013 (Bacillus aryabhattai CAP53, Bacillus aryabhattai CAP56, Bacillus flexus BT054, Paracoccus kondratievae NC35, Enterobacter cloacae CAP12 e Bacillus nealsonii BOBA57) ou em 10 de março de 2014 (Bacillus mycoi- des BT155, Bacillus mycoides EE118, Bacillus subtilis EE148, Alcaligenes faecalis EE107, Bacillus mycoides EE141, Bacillus mycoi- des BT46-3, um membro da família Bacillus cereus EE128, Bacillus thu- ringiensis BT013A, Paenibacillus massiliensis BT23, um membro da família Bacillus cereus EE349, Bacillus subtilis EE218 e Bacillus megate- rium EE281), e são identificadas pelos números de NRRL fornecidos entre parêntesis.
[00169] Essas cepas de promoção de crescimento de planta foram isoladas das rizosferas de várias plantas vigorosas e foram identificadas por suas sequências de 16S rRNA (fornecidas aqui como SEQ ID NOs. 104-121), e através de análises bioquímicas. As cepas foram identificadas pelo menos à sua designação de gênero por meio de indicadores morfológicos e bioquímicos convencionais. As análises bioquímicas para as cepas Gram-negativas confirmadas, como Paracoccus kondra- tievae, Alcaligenes faecalis e Enterobacter cloacae incluíram crescimento em meio MacConkey e ágar nutriente, examinação microscópica, crescimento em meio de 5% e 7,5% de NaCl, crescimento em pH 5 e pH 9, crescimento a 42°C e 50°C, a capacidade de produzir ácido a partir da fermentação com celobiose, lactose, glicerol, glicose, suca- rose, d-manitol e amido; produção de pigmento fluorescente, hidrólise de gelatina, redução de nitrato; produção de catalase, hidrólise de amido; reação de oxidase; produção de urease e motilidade. De modo semelhante, análises bioquímicas para as cepas Gram-positivas confirmadas, como Bacillus e Paenibacillus, incluíram crescimento em meio de PEA e ágar nutriente, examinação microscópica, crescimento em meio de 5% e 7,5% de NaCl, crescimento em pH 5 e pH 9, crescimento a 42°C e 50°C, a capacidade de produzir ácido a partir da fermentação com celobiose, lactose, glicerol, glicose, sucarose, d-manitol e amido; produção de pigmento fluorescente, hidrólise de gelatina, redução de nitrato; produção de catalase, hidrólise de amido; reação de oxidase; produção de urease e motilidade. A identificação dessas cepas e a demonstração de seus efeitos de promoção de crescimento de planta são descritos com mais detalhes nos exemplos abaixo.
[00170] Por exemplo, a formulação pode compreender uma cepa de promoção de crescimento vegetal de bactéria compreendendo Paracoccus kondratievae NC35, Bacillus aryabhattai CAP53, or Bacillus mega- terium EE281, em que a formulação compreende ainda qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante descritos aqui, incluindo qualquer uma das cepas de membros da família Bacillus ce- reus de promoção de crescimento vegetal recombinante aqui presentes (por exemplo, Bacillus mycoides recombinante BT155, Bacillus mycoi- des EE141 ou Bacillus thuringiensis BT013A). A cepa do membro da família Bacillus cereus de promoção de crescimento vegetal recombi- nante pode expressar qualquer uma das proteínas de fusão descritas aqui, por exemplo, uma proteína de fusão compreendendo a sequência de escolha da SEQ ID N°: 60 e um peptídeo não-hormonal (por exemplo, um inibidor de tripsina kunitz (KTI)), uma enzina envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento de planta (por exemplo, uma quitosinase), um peptídeo ou proteína de ligação vegetal (por exemplo, TasA); uma proteína ou peptídeo que protegem um vegetal de um patógeno (por exemplo, TasA) ou uma enzina que degrada ou modifica a fonte bacteriana, fúngica ou nutriente vegetal (por exemplo, uma fosfatase, como PhoA ou fitase ou uma endogluca- nase).
Métodos de promoção de crescimento vegetal
[00171] A presente invenção relaciona-se ainda a métodos para estimular o crescimento vegetal. O método para estimular o crescimento vegetal compreende a introdução em um meio de crescimento vegetal de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante discutidos acima ou qualquer uma das formulações discutidas acima. Alternativamente, qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante discutido acima ou qualquer uma das formulações discutidas acima pode ser aplicada a um vegetal, a uma semente vegetal ou uma área em torno de um vegetal ou de uma semente vegetal. Em tais métodos, a proteína ou o peptídeo de estímulo de crescimento vegetal é fisicamente acoplado ao exosporium do membro da família Bacillus recombinante.
[00172] Alternativamente, o método para estimular o crescimento vegetal compreende a introdução de um membro da família Bacillus ce- reus recombinante que expressa uma proteína de fusão em um meio de crescimento vegetal ou a aplicação de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão para um vegetal, uma semente de vegetal ou uma área em torn de um vegetal ou de uma semente de vegetal. A proteína de fusão compreende pelo menos uma proteína de estímulo de crescimento vegetal e uma sequência de escolha, uma proteína de exosporium ou um fragmento da proteína do exosporium. A proteína ou o peptídeo de estímulo de crescimento vegetal é fisicamente acoplado ao exosporium do membro da família Bacillus recombinante. A sequência de escolha, a proteína do exospo- rium ou fragmento de proteína do exosporium pode ser qualquer uma das sequências de direcionamento, das proteínas do exosporium ou fragmentos de proteína do exosporium listados acima no parágrafo [0005].
[00173] Além disso, a sequência de escolha pode consistir em 16 aminoácidos e ter pelo menos aproximadamente 43% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 54%. Alternativamente, a sequência de escolha pode consistir em aminoácidos de 1-35 da SEQ ID N°: 1, aminoácidos 20-35 da SEQ ID N°: 1; SEQ ID N°: 1, ou SEQ ID N°: 60.
[00174] Além disso, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 63%. Alternativamente, a se-quência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consis-tindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 50% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com ami- noácidos 25-35 é de pelo menos 63%.
[00175] Além disso, a sequência de direcionamento pode compreen der uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 72%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 50% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com ami- noácidos 25-35 é de pelo menos 72%.
[00176] Além disso, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 56% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 63%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 56% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com ami- noácidos 25-35 é de pelo menos 63%.
[00177] Além disso, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de amino tendo pelo menos 62% de identidade com aminoácidos 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com amino- ácidos 25-35 é de pelo menos 72%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 62% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 2535 da SEQ ID N°:1 é de pelo menos 72%.
[00178] Além disso, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 68% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 81%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoá- cidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 68% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 81%.
[00179] Além disso, a sequência de escolha pode compreender uma sequência de amino tendo pelo menos 75% de identidade com aminoá- cidos 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 72%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 amino- ácidos e tendo pelo menos 75% de identidade com aminoácidos de 2035 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 da SEQ ID N°:1 é de pelo menos 72%.
[00180] Além disso, a sequência de escolha pode compreender uma sequência de amino tendo pelo menos 75% de identidade com aminoá- cidos 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 81%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 amino- ácidos e tendo pelo menos 75% de identidade com aminoácidos de 2035 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 da SEQ ID N°:1 é de pelo menos 81%.
[00181] Além disso, a sequência de escolha pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 81% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°:1, em que a identidade com aminoácidos de 25-35 é de pelo menos aproximadamente 81%. Al-ternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 81% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°:1, em que a identidade com aminoácidos de 25-35 é de pelo menos apro-ximadamente 81%.
[00182] Além disso, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 81% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 90%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 81% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID N°: 1, em que a identidade com ami- noácidos 25-35 é de pelo menos 90%.
[00183] Alternativamente, a proteína de exosporium ou fragmento de proteína do exosporium pode compreender uma sequência de aminoá- cidos que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID N°s: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 e 84.
[00184] A proteína estimulante de crescimento vegetal pode compreender uma enzima. Por exemplo, a enzima pode compreender uma enzima que degrada ou modifica uma fonte bacteriana, fúngica ou de nutriente vegetal. Tais enzimas incluem celulases, lipases, oxidases de lig- nina, proteases, hidrolases de glicosídeo, fosfatases, nitrogenases, nucleases, amidases, reductases de nitrato, reductases de nitrito, amila- ses, oxidases de amônia, ligninases, glicosidases, fosfolipases, fitases, pectinases, glucanases, sulfatases, ureases, xilanases e sideróforos. Quando introduzido em um meio do crescimento vegetal ou aplicado a uma planta, semente ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente vegetal, as proteínas de fusão compreendendo enzimas que degradam ou modificam uma fonte bacteriana, fúngica ou de nutriente vegetal pode auxiliar no processamento de nutrientes nos arredores da planta e resultar em uma melhor absorção de nutrientes por parte da planta ou pelas bactérias benéficas ou fungos nos arredores da planta.
[00185] As celulases apropriadas incluem endocelulases (por exemplo, endogliconases como uma endoglucanase Bacillus subtilis, uma endoglucanase Bacillus thuringiensis, uma endoglucanase Bacillus cereus ou uma endoglucanase Bacillus clausii), exocelulases (por exemplo, uma exocelulase Trichoderma reesei) e β-glucosidases (por exemplo, uma β-glucosidase Bacillus subtilis, uma β-glucosidase Bacillus thuringiensis, uma β-glucosidase Bacillus cereus ou uma β-glu- cosidase Bacillus clausii).
[00186] A lipase pode compreender uma lipase Bacillus subtilis, uma lipase Bacillus thuringiensis, uma lipase Bacillus cereus ou uma lipase Bacillus clausii.
[00187] As oxidases de lignina apropriadas compreendem peroxidases de lignina, lacases, oxidases glioxais, ligninases e peroxidases de manganês.
[00188] A protease pode compreender uma subtilisina, uma protease ácida, uma protease alcalina, uma proteinase, uma peptidase, uma endopeptidase, uma exopeptidase, uma termolisina, uma papaína, uma pepsina, uma tripsina, uma pronase, uma carboxilase, uma protease de serina, uma protease glutâmica, uma protease de aspartato, uma protease cisteína ou uma metaloprotease.
[00189] O fosfato pode compreender uma hidrolase de monoéster fosfórica, uma fosfomonoesterase (por exemplo, PhoA4), uma hidrolase de diéster fosfórica, fosfodiesterase, uma hidrolase de monoéster trifos- fórica, uma hidrolase de anidrido de fosforil, fitase (por exemplo, fitase de Bacillus subtilis EE148 ou fitase de Bacillus thuringiensisBT013A), uma trimetafosfatase ou uma trifosfatase.
[00190] A nitrogenase pode compreender uma nitrogenase da família Nif (por exemplo, Paenibacillus massiliensis NifBDEHKNXV).
[00191] Em qualquer um dos métodos acima para estímulo de crescimento vegetal, os vegetais cultivados no meio de crescimento vegetal compreendendo um membro da família Bacillus cereus recombinante exibe um crescimento maior em comparação ao crescimento dos vegetais em um meio de crescimento vegetal idêntico que não contém o membro da família Bacillus cereus recombinante.
[00192] Em qualquer um dos métodos para estimular o crescimento vegetal, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender qualquer uma das cepas de promoção de crescimento vegetal recombinante das bactérias descritas acima.
[00193] Em alguns dos métodos acima para estimular o crescimento vegetal, a proteína de fusão pode ser expressada sob o controle de qualquer um dos promotores descritos acima.
Métodos para proteger um vegetal contra um patógeno
[00194] A presente invenção relaciona-se ainda a métodos para proteger um vegetal contra um patógeno. Tais métodos compreendem a introdução em um meio de crescimento vegetal de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante discutidos acima ou qualquer uma das formulações discutidas acima em um meio de crescimento vegetal. Alternativamente, tais métodos compreendem a aplicação de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante discutidos acima ou qualquer uma das formulações discutidas acima a um vegetal, a uma semente vegetal ou uma área em torno de um vegetal ou de uma semente vegetal. Nesses métodos, a proteína ou o peptídeo que protegem um vegetal contra um patógeno encontram-se fisicamente acoplados ao exosporium do membro da famíliaBacillus cereus recombinante.
[00195] Os vegetais cultivados no meio de crescimento vegetal compreendendo o membro da família Bacillus cereus recombinante são menos suscetíveis à infecção com o patógeno em comparação a vegetais cultivados em um meio de crescimento vegetal idêntico que não contenha o membro da família Bacillus cereus recombinante. A suscetibilidade reduzida do patógeno pode ser um resultado do estímulo do sistema imunológico do vegetal por parte da proteína ou do peptídeo que protegem o vegetal de um patógeno, ou pode resultar de um efeito direto ou indireto da proteína ou do peptídeo que protegem o vegetal contra um patógeno no patógeno.
Métodos para aumentar a resistência a estresse em um vegetal
[00196] A presente invenção relaciona-se ainda a métodos para aumentar a resistência a estresse em um vegetal. Tais métodos compreendem a introdução em um meio de crescimento vegetal de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante discutidos acima ou qualquer uma das formulações discutidas acima em um meio de crescimento vegetal. Alternativamente, tais métodos compreendem a aplicação de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante discutidos acima ou qualquer uma das formulações discutidas acima a um vegetal, a uma semente vegetal ou uma área em torno de um vegetal ou de uma semente vegetal. Nesses métodos, a proteína ou o peptídeo que aumentam a resistência a estresse em um vegetal encontram-se fisicamente acoplados ao exosporium do membro da famíliaBacillus cereus recombinante.
[00197] Os vegetais cultivados no meio de crescimento vegetal compreendendo o membro da família Bacillus cereus recombinante são menos suscetíveis a estresse em comparação a vegetais cultivados em um meio de crescimento vegetal idêntico que não contenha o membro da família Bacillus cereus recombinante.
Métodos de imobilização de esporos de um membro da família Bacillus cereus em um vegetal
[00198] A presente invenção também se dirige a métodos de imobilização de um esporo de um membro da família Bacillus cereus recombinante em um vegetal. Esses métodos compreendem a introdução em um meio de crescimento vegetal de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante discutidos acima ou qualquer uma das formulações discutidas acima em um meio de crescimento vegetal. Alternativamente, tais métodos compreendem a aplicação de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recom- binante discutidos acima ou qualquer uma das formulações discutidas acima a um vegetal, a uma semente vegetal ou uma área em torno de um vegetal ou de uma semente vegetal. O peptídeo ou a proteína de ligação do vegetal é fisicamente acoplado ao exosporium do membro da família Bacillus recombinante.
[00199] Esses métodos permitem que o esporo de um membro da família Bacillus cereus recombinante se ligue a um vegetal, de modo que o esporo seja mantido no vegetal. Por exemplo, esses métodos permitem que o esporo de um membro da família Bacillus cereus se ligue a uma raiz de um vegetal ou uma parte aérea de um vegetal (por exemplo, folhagem, caules, frutos ou flores), de modo que o esporo seja mantido na estrutura da raiz ou em uma parte aérea de um vegetal em vez de dissipar-se no meio de crescimento vegetal ou no ambiente em torno da porção aérea do vegetal.
[00200] Em alguns dos métodos de imobilização de um esporo de um membro da família Bacillus cereus recombinante em um vegetal, o peptídeo ou a proteína de ligação do vegetal pode direcionar-se seletivamente ao membro da família Bacillus cereus e mantê-lo no vegetal ou na estrutura ou substrutura do vegetal (por exemplo, nas raízes do vegetal e substruturas das raízes do vegetal ou em uma parte aérea de um vegetal ou de uma substrutura de uma parte aérea de um vegetal).
Meio de crescimento vegetal
[00201] Em qualquer um dos métodos acima, o meio de crescimento vegetal é um material capaz de sustentar o crescimento de um vegetal. O meio de crescimento vegetal pode compreender solo, água, uma solução aquosa, areia, cascalho, um polissacarídeo, adubação verde, compostagem, turfa, palha, argila, farinha de sementes de soja, extrato de levedura ou uma combinação destes. Por exemplo, o meio de crescimento vegetal compreende solo, compos- tagem, turfa ou uma combinação destes.
[00202] O meio de crescimento vegetal pode, opcionalmente, ser suplementado com um substrato por uma enzima. Por exemplo, o substrato pode compreender triptofano, monofosfato de adenosina, difosfato de adenosina, trifosfato de adenosina, (por exemplo 3-trifos- fato de adenosina), indol, trimetafosfato, ferrodoxina, acetoína, diacetil, piruvato, acetolactato, pectina, celululose, metilcelulose, amido, quitina, pectina, uma farinha proteica, um derivado de celulose, fosfato, acetoína, quitosano, um derivado inativo do ácido indol-3-acé- tico, um derivado inativo do ácido giberélico, um xilano, colina, um derivado de colina, prolina, poliprolina, uma farinha rica em prolina, uma proteína rica em prolina, fenilalanina, corismato, um arabinoxi- lano, uma gordura, um graxo, um óleo, ácido fítico, lignina, ácido hú- mico, colina, um derivado de colina ou uma combinação destes.
Métodos de aplicação
[00203] Em qualquer um dos métodos acima, o membro da família Bacillus cereus recombinante ou uma formulação pode ser introduzido no meio de crescimento vegetal ou aplicado a um vegetal, a uma semente do vegetal ou a uma área em torno do vegetal ou da semente do vegetal.
[00204] Por exemplo, o método pode compreender o revestimento de sementes com o membro da família Bacillus cereus recombinante ou uma formulação contendo o membro da família Bacillus cereus recom- binante antes do plantio.
[00205] De modo alternativo, o método pode compreender a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante ou uma formulação a uma parte aérea de uma planta, por exemplo, a folhagem, caules, frutos ou flores. Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombinante ou formulação pode ser esguichado, esfregado, pingato ou aplicado de alguma outra forma às folhas ou outras partes aéreas de um vegetal.
[00206] O método pode compreender a introdução de um membro da família Bacillus cereus recombinante em um meio de crescimento vegetal aplicando-se uma formulação sólida ou líquida contendo o membro da família Bacillus cereus recombinante ao meio (por exemplo, solo, compostagem, turfa ou uma combinação destes).
[00207] A formulação pode ser aplicada ao meio de crescimento vegetal para, concomitantemente ao, ou após o plantio das sementes, mudas, bulbos ou vegetais no meio de crescimento vegetal.
Coaplicação de produtos agroquímicos
[00208] Qualquer um dos métodos acima pode compreender ainda a introdução de pelo menos um produto agroquímico no meio de cresci-mento vegetal ou a aplicação de pelo menos um produto agroquímico aos vegetais ou às sementes. O produto agroquímico pode ser qualquer um daqueles listados acima para inclusão nas formulações ou qualquer combinação deles.
Vegetais
[00209] Os métodos acima podem ser praticados com uma variedade de vegetais. Por exemplo, o vegetal pode ser uma dicotiledônea, uma monocotiledônea ou um gimnosperma.
[00210] Por exemplo, onde o vegetal for uma monocotiledônea, a monocotiledônea pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em feijão, ervilha, tomate, pimenta, abóbora, alfalfa, amêndoa, semente de anis, maçã, damasco, arrachá, alcachofra, abacate, vigna subterrânea, beterraba, bergamota, pimenta preta, barbilhão preto, amora, mirtilo, laranja amarga, bok-choi, castanha-do-pará, fruta-pão, brócolis, fava, couve-de-bruxelas, trigo mourisco, repolho, camelina, repolho chinês, cacau, cantalupo, sementes de cominho, cardo, alfarroba, cenoura, castanha de caju, mandioca, mamona, couve-flor, aipo, sal- são, cereja, castanha, grão de bico, chicória, pimenta malagueta, crisântemo, canela, cidra, clementina, cravo, café, semente de cola, colza, milho, algodão, semente de algodão, feijão-frade, crambe, oxicoco, agrião, pepino, passa de Corinto, anona, acácia branca, ervilha da terra, berinjela, endívia, funchi, feno-grego, figo, avelã, linho, gerânio, groselha, cabaça, uva, toranja, goiaba, cânhamo, semente de cânhamo, hena, lúpulo, fava de cavalo, rábano, anil, jasmim, alcachofra de Jerusalém, juta, couve, sumaúma, kenaf, couve-rábano, kumquat, lavanda, limão, lentilha, lespedeza, alface, lima, alcaçuz, litchi, nespereira, lupino, noz de macadâmia, macis, mandarina, mangel, manga, ameixa, melão, menta, amora, mostarda, nectarina, bagaço de níger, noz-moscada, quiabo, azeitona, ópio, laranja, mamão papaia, pastinaca, esvilha, pêssego, amendoim, pêra, noz de pécan, diospiro, guandu, noz de pistácio, plátano, ameixa, romã, pomelo, semente de papoula, batata, batata doce, ameixa seca, abóbora, quebracho, marmelo, árvores do gênero Cinchona, quínoa, rabanete, rami, colza, framboesa, rhea, ruibarbo, rosa, borracha, couve-nabo, cártamo, sanfeno, cercefi, sapotilha, Satsuma, scorzonera, gergelim, frutos de karité, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba sacarina, cana-de-açúcar, girassol, rutabaga, pimentão-doce, tangerina, chá, teff, tabaco, tomate, trifólio, tungue, nabo, urena, ervilhaca, noz, melancia, erva-mate, erva-de-santa-bárbara, bolsa-de-pastor, agrião de jardim, agrião picante, agrião aquático, pennycress (Thlaspi arvense), anis estrelado, loureiro, louro, cássia, jamelão, endro, tamarindo, hortelã, orégano, alecrim, salva, graviola, cen- tela, calophyllum, pera de bálsamo, noz da Índia, castanha do Taiti, manjericão, uveira, hibisco, maracujazeiro, maçã estrela, sassafrás, cacto, hipericão, salicária, espinheiro, coentro, erva-caril, kiwi, tomilho, abobrinha, olluco, jicama, beldroega grande, macaco laranja, seriguela amarela, carambola, amaranto, wasabi, pimenta japonesa, ameixa amarela, mashua, toona chinesa, espinafre da Nova Zelândia, Tetragonia implexicoma, ugu, catinga-de-mulata, morrião-dos-passarinhos, jocote, jambo vermelho, jambu, serralha, batata chinesa, salsa-de-cavalo, sa- ramago, silene dioica, ágata, cássia-de-sião, cardo, pimpinela, groselha baiana, gramata, salicórnia, alazão, samambaia vitória, couve-galega, prímula vulgar, prímula real, beldroegas, erva-de-bicho, cornalheira, Pi- sonia alba, bétel selvagem, pimenta da Guiné, yerba santa, estragão, salsinha, cerefólio, agrião de sequeiro, saxifraga, Cyclopia meyeriana, Petasites, shiso, pimenta aquática, perilla, fava amargosa, oca, kam- pong, aipo chinês, manjericão limoncino, manjericão tailandês, Neptunia oleracea, mirra, dracaena arbórea, moringa, mauka, samambaia de avestruz, erva de arroz paddy, Limnocharis flava, levístico, mastruço, maca, cabaceira, Lablab, espinafre d'água, leiterigas, planta-peixe, espinafre Okinawa, Glinus lotoides, bravos soldados, culantro, rúcula, cardo, maxixe-do-reino, mitsuba, chipilín, perrexil, mampat, ebolo, Coc- cinia grandis, Cirsium oleraceum, Crambe maritima, chaya, Chenopo-dium nuttalliae, mostarda da Abissínia, árvore de espinafre, Chenopodium bonus-henricus, ambrósia do México, fedegoso, celósia plumosa, alcaparra, grelo, Brassica rapa, mizuna, couve chinesa, kai-lan, mostarda castanha, bertalha, acelga, marshmallow, Senegalia pennata, juta chinesa, paprika, semente de urucum, hortelã verde, segurelha, marje- rona, cominho, camomila, bálsamo de limão, pimenta-da-jamaica, arano, cherimoia, amora ártica, ameixa pequena, pitaya, durião, baga de sabugueiro, feijoa, jaca, jamelão, jujuba, physalis, mangostão, ram- butão, groselha vermelha, groselha preta, salal, satsuma, ugli, feijão azuki, feijão preto, feijão-frade, feijão borlotti, feijão comum, feijão verde, feijão, feijão de sete anos, feijão mungo, feijão branco, feijão carioca, feijão-escarlate, ervilhas de vagem comestível, snap ervilhas, romanesco, brócolis americano, urtiga, pimentão, chicória, daikon, rabanete branco, cherovia, tat soi, broccolini, rabanete preto, raiz de bardana, fava, brócolis rabe, lablab, lupino, sterculia, Mucuna pruriens, feijão-de- asa, jícama, acácia do tipo mulga, Vernonia, Acacia ligulata, Acacia mur- rayana, Acacia tetragonophylla, Acacia kampeana, Acacia coriacea, chia, noz de faia, noz da Índia, Citrullus colocynthis, mamoncillo, noz maia, mongongo, manga de arbusto, sapucaia e cempedak.
[00211] De modo alternativo, a dicotiledônea pode ser de uma família selecionada a partir do grupo que consiste em Acanthaceae (acanto), Aceraceae (bordo), Achariaceae, Achatocarpaceae (achatocarpus), Ac- tinidiaceae (groselha chinesa), Adoxaceae (moscatelina), Aextoxica- ceae, Aizoaceae (calêndula da figueira), Akaniaceae, Alangiaceae, Al- seuosmiaceae, Alzateaceae, Amaranthaceae (amaranto), Amborella- ceae, Anacardiaceae (sumagre), Ancistrocladaceae, Anisophylleaceae, Annonaceae (anoneira), Apiaceae (cenoura), Apocynaceae (Luobuma), Aquifoliaceae (azevinho), Araliaceae (ginseng), Aristolochiaceae (papo- de-peru), Asclepiadaceae (milkweed), Asteraceae (asteráceas), Aus- trobaileyaceae, Balanopaceae, Balanophoraceae (balanophora), Balsa- minaceae (Maris-sem-vergonha), Barbeyaceae, Barclayaceae, Basella- ceae (basella), Bataceae (gramata), Begoniaceae (begônia), Berberida- ceae (bérberis), Betulaceae (bétula), Bignoniaceae (trombeta americana), Bixaceae (urucum), Bombacaceae (sumaumeira), Boraginaceae (borragem), Brassicaceae (mostarda ou Cruciferae), Bretschneidera- ceae, Brunelliaceae (brunellia), Bruniaceae, Brunoniaceae, Buddleja- ceae (Buddleia), Burseraceae (olíbano), Buxaceae (buxo), Byblidaceae, Cabombaceae (espelho d'água), Cactaceae (cacto), Caesalpiniaceae, Callitrichaceae (lentilhas-da-água), Calycanthaceae (morango-arbusto), Calyceraceae (calycera), Campanulaceae (campânula), Canellaceae (Canella), Cannabaceae (cânhamo), Capparaceae (alcaparra), Caprifo- liaceae (madressilva), Cardiopteridaceae, Caricaceae (papaia), Caryo- caraceae (pequi), Caryophyllaceae (cravos), Casuarinaceae (casua- rina), Cecropiaceae (embaúba), Celastraceae (algoz-das-árvores), Cephalotaceae, Ceratophyllaceae (Anthocerotophyta), Cercidiphylla- ceae (árvore katsura), Chenopodiaceae (erva-de-santa-maria), Chloran- thaceae (chloranthus), Chrysobalanaceae (ameixa-bicha), Circaeaste- raceae, Cistaceae (esteva), Clethraceae (clethra), Clusiaceae (mangos- tão ou Guttiferae), Cneoraceae, Columelliaceae, Combretaceae (amendoeira indiana), Compositae (asteráceas), Connaraceae (cannarus), Convolvulaceae (ipomeia), Coriariaceae, Cornaceae (corniso), Coryno- carpaceae (karaka), Crassulaceae (erva-pinheira), Crossosomataceae (crossosoma), Crypteroniaceae, Cucurbitaceae (pepino), Cunoniaceae (Cunonia), Cuscutaceae (cuscuta), Cyrillaceae (cyrilla), Daphniphylla- ceae, Datiscaceae (datisca), Davidsoniaceae, Degeneriaceae, Dialype- talanthaceae, Diapensiaceae (diapensia), Dichapetalaceae, Didierea- ceae, Didymelaceae, Dilleniaceae (dillenia), Dioncophyllaceae, Dipen- todontaceae, Dipsacaceae (cardo-penteador), Dipterocarpaceae (me- ranti), Donatiaceae, Droseraceae (drósera), Duckeodendraceae, Ebe- naceae (ébano), Elaeagnaceae (zambujeiro), Elaeocarpaceae (Elaeo- carpus), Elatinaceae (Elatine), Empetraceae (camarinheira), Epacrida- ceae (Epacris), Eremolepidaceae, Ericaceae (urze), Erythroxylaceae (coca), Eucommiaceae, Eucryphiaceae, Euphorbiaceae (Eufórbia), Eu- pomatiaceae, Eupteleaceae, Fabaceae (ervilha ou leguminosa), Faga- ceae (faia), Flacourtiaceae (Flacourtia), Fouquieriaceae (Ocotillo), Fran- keniaceae (Frankenia), Fumariaceae (Fumaria), Garryaceae (Garrya el- liptica), Geissolomataceae, Gentianaceae (genciana), Geraniaceae (gerânio), Gesneriaceae (Gesneriáceas), Globulariaceae, Gomortegaceae, Goodeniaceae (Goodenia), Greyiaceae, Grossulariaceae (passa de Corinto), Grubbiaceae, Gunneraceae (Gunnera), Gyrostemonaceae, Haloragaceae (pinheirinha-da-água), Hamamelidaceae (hamamélis), Hernandiaceae (Hernandia), Himantandraceae, Hippocastanaceae (castanha-da-índia), Hippocrateaceae (Hippocratea), Hippuridaceae (Hippuris vulgaris), Hoplestigmataceae, Huaceae, Hugoniaceae, Humi- riaceae, Hydnoraceae, Hydrangeaceae (hortênsia), Hydrophyllaceae (caruru), Hydrostachyaceae, Icacinaceae (Icacina), Idiospermaceae, Il- liciaceae (anis estrelado), Ixonanthaceae, Juglandaceae (nogueira), Ju- lianiaceae, Krameriaceae (Krameria), Lacistemataceae, Lamiaceae (menta ou Labiatae), Lardizabalaceae (Lardizabala), Lauraceae (loureiro), Lecythidaceae (castanha-do-pará), Leeaceae, Leitneriaceae (cortiça), Lennoaceae (Lennoa), Lentibulariaceae (utricularia), Limnantha- ceae (Limnanthes alba), Linaceae (linho), Lissocarpaceae, Loasaceae (Loasa), Loganiaceae (Logania), Loranthaceae (Loranthus), Lythraceae (Lythrum), Magnoliaceae (magnólia), Malesherbiaceae, Malpighiaceae (Cereja de Barbados), Malvaceae (malva), Marcgraviaceae (hera-das- árvores), Medusagynaceae, Medusandraceae, Melastomataceae (me- lastoma), Meliaceae (mogno), Melianthaceae, Mendonciaceae, Menis- permaceae (Menispermum canadense), Menyanthaceae (Menyanthes), Mimosaceae, Misodendraceae, Mitrastemonaceae, Molluginaceae (ca- pim-tapete), Monimiaceae (Monimia), Monotropaceae (Monotropa uniflora), Moraceae (amoreira), Moringaceae (árvore de rábano), Myopora- ceae (Myoporum), Myricaceae (faia), Myristicaceae (noz-moscada), Myrothamnaceae, Myrsinaceae (capororoca), Myrtaceae (murta), Ne- lumbonaceae (flor de lótus), Nepenthaceae (Nepenthes khasiana), Neu- radaceae, Nolanaceae, Nothofagaceae, Nyctaginaceae (four-o’clock), Nymphaeaceae (nenúcar), Nyssaceae (tupelo), Ochnaceae (Ochna), Olacaceae (Olax), Oleaceae (oliveira), Oliniaceae, Onagraceae (ona- gra), Oncothecaceae, Opiliaceae, Orobanchaceae (Orobanche), Oxalidaceae (azedinha), Paeoniaceae (peônia), Pandaceae, Papaveraceae (papoula), Papilionaceae, Paracryphiaceae, Passifloraceae (maracujazeiro), Pedaliaceae (gergelim), Pellicieraceae, Penaeaceae, Pentaphragmataceae, Pentaphylacaceae, Peridiscaceae, Physena- ceae, Phytolaccaceae (Phytolacca), Piperaceae (pimenta), Pittospora- ceae (Pittosporum), Plantaginaceae (violeta do campo), Platanaceae (plátano), Plumbaginaceae (plumbago), Podostemaceae (ervas daninhas), Polemoniaceae (Phlox), Polygalaceae (Polygala), Polygonaceae (trigo mourisco), Portulacaceae (beldroegas), Primulaceae (prímula), Proteaceae (Protea), Punicaceae (romã), Pyrolaceae (medronheiro), Quiinaceae, Rafflesiaceae (Rafflesia), Ranunculaceae (ranúnculo), Re- sedaceae (mignonette), Retziaceae, Rhabdodendraceae, Rhamnaceae (espinheiro), Rhizophoraceae (mangue vermelho), Rhoipteleaceae, Rhynchocalycaceae, Rosaceae (rosa), Rubiaceae (granza), Rutaceae (arruda), Sabiaceae (sabia), Saccifoliaceae, Salicaceae (salgueiro), Sal- vadoraceae, Santalaceae (sândalo), Sapindaceae (Sapindus), Sapota- ceae (sapotilha), Sarcolaenaceae, Sargentodoxaceae, Sarraceniaceae (planta-jarro), Saururaceae (lizard’s tail ou Saururus cernuus), Saxifra- gaceae (Saxifraga), Schisandraceae (esquisandra), Scrophulariaceae (escrofulária), Scyphostegiaceae, Scytopetalaceae, Simaroubaceae (Quassia), Simmondsiaceae (jojoba), Solanaceae (batata), Sonneratia- ceae (Sonneratia), Sphaerosepalaceae, Sphenocleaceae (Spenoclea), Stackhousiaceae (Stackhousia), Stachyuraceae, Staphyleaceae (Sta- phylea), Sterculiaceae (cacau), Stylidiaceae, Styracaceae (Storax), Su- rianaceae (Suriana), Symplocaceae (estévia), Tamaricaceae (Tamarix), Tepuianthaceae, Tetracentraceae, Tetrameristaceae, Theaceae (chá), Theligonaceae, Theophrastaceae (Theophrasta), Thymelaeaceae (Me- zereum), Ticodendraceae, Tiliaceae (tília), Tovariaceae, Trapaceae (castanha de água), Tremandraceae, Trigoniaceae, Trimeniaceae, Tro- chodendraceae, Tropaeolaceae (Nasturtium), Turneraceae (Turnera), Ulmaceae (olmo), Urticaceae (urtiga), Valerianaceae (valeriana), Verbe- naceae (verbena), Violaceae (violeta), Viscaceae (visco do Natal), Vitaceae (videira), Vochysiaceae, Winteraceae (Wintera), Xanthophylla- ceae e Zygophyllaceae (creosoto).
[00212] Onde a planta for uma monocotiledônea, a monocotiledônea pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em milho, trigo, aveia, arroz, cevada, painço, banana, cebola, alho, aspargo, azevém, painço, fonio, raishan, nipa, cúrcuma, açafrão, galangal, cebolinha, car- damomo, tamareira, abacaxi, chalota, alho-poró, castanha de água, ale- crim-de-cheiro, lágrimas-de-Jó, bambu, capim coracana, Wolffia arrhiza, orelha de elefante, espinafre do Taiti, abacá, areca, mexoeira, noz de bétel, Proso millet, Sorghum bicolor, citronella, coco, taro, milho, dasheen, durra, trigo macarrão, edo, fique, formio, gengibre, Dactylis, esparto, sorgo-Sudão, milho-da-guiné, cânhamo de manilha, henequen, milho híbrido, sorgo, capim-limão, pita, bulrush millet, finger millet, Setaria italica, Echinochloa esculenta, Panicum miliaceum, linho da Nova Zelândia, aveia, azeite de dendê, Borassus, palmeira-sagu, Agrostis gi- gantea, sisal, sorgo, espelta, milho doce, sorgo doce, taro, teff, rabo-de- gato, triticale, baunilha, trigo e inhame.
[00213] De modo alternativo, a monocotiledônea pode ser de uma família selecionada a partir do grupo que consiste em Acoraceae (cá- lamo), Agavaceae (Agave americana), Alismataceae (Alisma), Aloea- ceae (Aloe), Aponogetonaceae (Aponogeton distachyos), Araceae (Arum), Arecaceae (palmeira), Bromeliaceae (bromélia), Burmannia- ceae (Burmannia), Butomaceae (Butomus umbellatus), Cannaceae (Canna), Centrolepidaceae, Commelinaceae (coração-roxo), Corsia- ceae, Costaceae (Costus), Cyanastraceae, Cyclanthaceae (Ciclanto), Cymodoceaceae (capim-agulha), Cyperaceae (junça), Dioscoreaceae (inhame), Eriocaulaceae (Eriocaulon), Flagellariaceae, Geosiridaceae, Haemodoraceae (Sanguinaria canadensis), Hanguanaceae (hanguana), Heliconiaceae (helicônia), Hydatellaceae, Hydrocharitaceae (va- lisnéria), Iridaceae (Iris), Joinvilleaceae (joinvillea), Juncaceae (juncos), Juncaginaceae (Triglochin maritima), Lemnaceae (lentinha d'água), Lili- aceae (lírio), Limnocharitaceae (papoula d'água), Lowiaceae, Maranta- ceae (Maranta), Mayacaceae (Mayaca), Musaceae (banana), Najada- ceae (ninfa d'água), Orchidaceae (orquídea), Pandanaceae (pândano), Petrosaviaceae, Philydraceae (filidráceas), Poaceae (relva), Pontederi- aceae (jacinto-de-água), Posidoniaceae (posidônia), Potamogetona- ceae (serralha-de-folha-redonda), Rapateaceae, Restionaceae, Ruppi- aceae (Ruppia maritima), Scheuchzeriaceae (scheuchzeria), Smilaca- ceae (Smilax glauca), Sparganiaceae (espadana), Stemonaceae (ste- mona), Strelitziaceae, Taccaceae (flor-morcego), Thurniaceae, Triurida- ceae, Typhaceae (amentilho), Velloziaceae, Xanthorrhoeaceae, Xyrida- ceae (Sisyrinchium californicum), Zannichelliaceae (Zannichellia palus- tris), Zingiberaceae (gengibre) e Zosteraceae (Zostera).
[00214] Onde o vegetal for uma gimnosperma, a gimnosperma pode ser de uma família selecionada a partir do grupo que consiste em Arau- cariaceae, Boweniaceae, Cephalotaxaceae, Cupressaceae, Cycada- ceae, Ephedraceae, Ginkgoaceae, Gnetaceae, Pinaceae, Podocarpa- ceae, Taxaceae, Taxodiaceae, Welwitschiaceae e Zamiaceae.
Exemplos
[00215] Os exemplos não limitantes a seguir são fornecidos para ilustrar melhor a presente invenção.
Exemplo 1. Uso de um membro da família Bacillus cereus recombi- nante exibindo uma endoglucanase ou uma lipase para estimular o crescimento vegetal em sementes de soja
[00216] Os genes de lipase e endoglucanase Bacillus subtilis foram amplificados através de uma reação em cadeia de polimerase (PCR) utilizando os seguintes acionadores exibidos abaixo, na Tabela 3: TABELA 3
[00217] Para criar construtos de fusão, os fenes foram fusionados ao promotor bclA nativo do DNA do Bacillus thuringiensis codificando os 35 primeiros aminoácidos do BclA (aminoácidos de 1-35 da SEQ ID N°:1) utilizando o splicing através da técnica de extensão de sobreposição (SOE). Os amplicons corretos foram clonados no vetor de lançadeira pHP13 E. coli/Bacillus, e os clones corretos foram triados por sequenci- amento de DNA. Os clones corretos foram eletroporados no Bacillus thuringiensis (Cri-, plasmídeo-) e triados para resistência a cloranfeni- col. Os transformadores corretos foram cultivados em caldo de infusão cérebro-coração durante uma noite a 30°C, cromados em placas de ágar de nutrientes e incubados por 3 dias a 30°C. Os esporos que expressam o construto de fusão (esporos de BEMD) foram coletados para fora das placas por lavagem em salina tamponada de fosfato (PBS) e purificados por centrifugação e lavagens adicionais em PBS. Bacillus thuringiensis (B.t.) de controle não-transformado os esporos foram criados de maneira idêntica.
[00218] As sementes de sementes de soja (cepa Jake 011-28-04) foram plantadas a uma profundidade de 2,54 cm em vasos fundos de 10 cm com solo arenoso arável padrão. Os esporos foram diluídos em uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados em cada semente na plantação. As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 11 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até saturação a cada três dias durante um ensaio de duas semanas. Ao fim de duas semanas, a altura de cada vegetal foi medida, e as medidas foram normalizadas para controlar os esporos do Bacillus thuringiensis. Dois ensaios independentes foram realizados.
[00219] Os resultados são exibidos na Tabela 4, juntamente com o erro padrão do meio. Nos dois ensaios, as sementes de soja cultivadas na presença de esporos de BEMD, que exibiam endoglicanase, cresceu significativamente mais alto do que as sementes de soja tratadas com esporos de B.t. de controle (análise estatística avaliada através de um teste-t). Tabela 4
Exemplo 2. Uso de um membro da família Bacillus cereus recombi- nante exibindo uma endoglucanase para estimular o crescimento vegetal em milho
[00220] Esporos de BEMD que expressam endoglucanase foram cri-ados de uma forma idêntica ao descrito acima no Exemplo 1. Milho foi plantado com 3,8 cm de profundidade em vasos fundos fundos de 10 cm preenchidos com solo superficial de barro padrão. Os esporos, o controle e o BEMD que expressam endoglucanase foram diluídos a uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados em cada vegetal da plantação. Um controle somente de água também foi incluído. As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 11 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até saturação a cada três dias durante o ensaio de uma semana. Ao fim de uma semana, a altura de cada vegetal foi medida, e as medidas foram normalizadas para controlar os esporos do Bacillus thuringiensis.
[00221] Os resultados são exibidos na Tabela 5, juntamente com o erro padrão do meio. O milho cultivado na presença de esporos de BEMD, que exibiam endoglucanase, cresceu significativamente mais alto do que as sementes de soja tratadas com esporos de B.t. de controle e com vegetais de controle somente com água (análise estatística avaliada através de um teste-t). Tabela 5.
Exemplo 3. Uso de um membro da família Bacillus cereus recombi- nante exibindo uma endoglucanase ou uma protease para estimular o crescimento vegetal em azevém
[00222] Esporos de BEMD que expressam endoglucanase foram criados de uma forma idêntica ao descrito acima no Exemplo 1. Os esporos de BEMD que expressão a protease E. coli PtrB foram criadas utilizando-se métodos semelhantes aos descritos acima, no Exemplo 1, e os seguintes acionadores: ggatccatgctaccaaaagcc (direto, SEQ ID N°: 41) e ggatccttagtccgcaggcgtagc (reverso, SEQ ID N°: 42).
[00223] O trigo duro do inverno foi plantado a uma profundidade de 2,54 cm em vasos fundos de 10 cm com solo arenoso arável padrão. Os esporos, de controle e BEMD expressando endoglucanase ou protease, foram diluídos em uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados em cada planta na plantação. Um controle somente de água também foi incluído. As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 11 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até saturação a cada três dias durante o ensaio de uma semana. No fim de uma semana, a altura de cada planta foi medida, e as medições foram normalizadas para as plantas com somente controle de água.
[00224] Os resultados são exibidos na Tabela 6, juntamente com o erro padrão do meio. O trigo cultivado na presença de esporos de BEMD, que exibiam endoglucanase ou protease cresceu significativamente mais alto do que os esporos de B.t. controles tratados ou sojas com controle de água (análise estatística analisada através de um teste- t). Tabela 6.
Exemplo 4. Uso De Membros Da Família De Bacillus Cereus Recom- binante Exibindo Uma Endonuclease Para Estimular O Crescimento Da Planta Em Azevém
[00225] Esporos de BEMD que expressam endoglucanase foram criados de uma forma idêntica ao descrito acima no Exemplo 1. O azevém perene foi plantado com 6,4 mm de profundidade em potes fundos de 10 cm preenchidos com solo superficial de barro padrão. Os esporos, de controle e BEMD expressando endoglucanase, foram diluídos em uma concentração de 1x104/ml em 50 ml deágua e aplicados em cada planta na plantação. Um controle somente de água também foi incluído. As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 11 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até saturação a cada três dias durante o ensaio de duas semanas. No final das duas semanas, a altura de cada planta foi medida, e as medições foram normalizadas para as plantas com somente controle de água.
[00226] Os resultados são mostrados na Tabela 7, juntamente com o erro padrão da média. O azevém crescido na presença de esporos de BEMD, que exibiam endocelulase, cresceu significativamente mais alto do que os esporos de B.t. controles tratados ou azevém com controle de água (análise estatística analisada através de um teste-t). Tabela 7.
Exemplo 5. Uso De Membros Da Família De Bacillus Cereus Recom- binante Exibindo Enzimas Envolvidas Na Síntese Ou Ativação De Hormônios Vegetais Para Estimular O Crescimento Da Planta
[00227] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir enzimas envolvidas na síntese de hormônios vegetais. Por exemplo, o ácido indol-3-acético do hormônio vegetal é um estimulador de crescimento potente em plantas. O ácido indol-3-acético é sintetizado in vivo a partir do triptofano pelas enzimas triptofano mono-oxigenase e indol- 3-acetamida hidrolase. O ácido indol-3-acético e outros hormônios também podem ser sintetizados in vivo a partir de trptofano e/ou indol pelas enzimas nitrilase, triptofano aminotransferase, indol-3-acetaldeído desi- drogenase, indol-3-piruvato descarboxilase, amina oxidase, triptofano descarboxilase, e oxidases de cadeia lateral do triptofano.
[00228] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir enzimas envolvidas na modificação dos hormônios de crescimento da planta nas formas bioativa ou inativa. Por exemplo, a nitrilase pode ser expressa no sistema de BEMD para catalisar a conversão da indol-3- acetonitrila no ácido indol-3-acético bioativo. Adicionalmente, as formas inativas dos hormônios vegetais, tais como indol-3-acetonitrila podem ser adicionadas no meio de crescimento da planta com a nitrilase expressa por BEMD para proporcionar uma liberação gradual do hormônio ativo no meio de crescimento da planta. Muitas outras formas inativas ou menos ativas de hormônios vegetais podem ser modificadas usando suas enzimas correspondentes.
[00229] Os hormônios de crescimento da planta relacionados (auxi- nas) incluem ácido indol-3-pirúvico, indol-3-acetaldoxima, indol-3- acetamida, indol-3-acetonitrila, indol-3-etanol, indol-3-piruvato, ácido in- dol-3-butírico, ácidos fenilacéticos, ácido 4-cloroindol-3-acético, e indol- 3-acetaldoxima. Esses hormônios são sintetizados a partir de triptofano e/ou indol in vivo através das enzimas triptofano mono-oxigenase, indol- 3-acetamida hidrolase, nitrilase, nitrila hidrolase, acetolactato sintetase, alfa acetolactato descarboxilase, triptofano aminotransferase, indol-3- acetaldeído desidrogenase, indol-3-piruvato descarboxilase, amina oxidase, triptofano descarboxilase, e oxidases de cadeia lateral do tripto- fano.
[00230] Os hormônios de crescimento da família de citocinina também podem ser sintetizados pelas enzimas expressas no sistema de BEMD. Exemplos de citocininas incluem cinetina, zeatina (cis e trans), 6-benzilaminopurina, dihidroxizeatina, N6-(D2-isopentenil) adenina, ri- bosilzeatina, N6-(D2-isopentenil) adenosina, 2 metiltio-cis-ribosilzea- tina, cis ribosilzeatina, ribosilzeatina-5-monosfosfato, N6-metilaminopu- rina, N6-dimetilaminopurina, 2’-desoxizeatina ribosídeo, 4-hidroxi-3-me- til-trans-2-butenilaminopurina, orto-topolina, meta-topolina, benzilade- nina, orto-metiltopolina, e meta-metiltopolina. Esses compostos estimulantes do crescimento da planta são sintetizados in vivo a partir de me- valonato ou adenosina mono/di/trifosfato por enzimas, incluindo adeno- sina fosfato isopenteniltransferases, fosfatases, adenosina cinases, adenina fosforribosiltransferase, CYP735A, 5’ribonucleotídeo fosfohi- drolase, adenosina nucleosidases, zeatina cis-trans isomerase, zeatina O-glucosiltransferases, β-glucosidases, cis-hidroxilases, CK cis-hidroxi- lases, CK N-glucosiltransferases, 2,5-ribonucleotídeo fosfohidrolases, adenosina nucleosidases, purina nucleosídeo fosforilases, e zeatina re- dutases.
[00231] Usando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1, qualquer uma dessas enzimas podem ser incorporadas no sistema de BEMD para exibir nos esporos de BEMD, criando um construto de fusão compreendendo a enzima e uma sequência de dire-cionamento que direciona a enzima expressa ao exosporium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. Um membro da família de Bacillus cereus recombinante que expressa tal construto pode ser então adicionado ao solo ou outro meio de crescimento da planta ou aplicado diretamente à folhagem da planta usando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1 para a estimulação do crescimento da planta.
[00232] O meio de crescimento da planta pode ser complementado com precursores ou substratos para as enzimas. Por exemplo, o meio de crescimento da planta pode ser complementado com triptofano, ade- nosina monofosfatos, adenosina difosfatos, adenosina trifosfatos, ou in- dol. Concentrações adequadas desses substratos estão entre 100 nM e 100 μM.
Exemplo 6. O uso de membros da família de Bacillus cereus recom- binante que exibem proteases ou peptidases que clivam proteínas, peptídeos, proproteínas, ou pré-proproteínas em peptídeos bioati- vos para estimulação do crescimento da planta
[00233] As proteases e peptidases podem ser expressas no sistema de BEMD que pode clivar enzimaticamente proteínas disponíveis no meio de crescimento da planta em peptídeos bioativos que podem agir sobre a planta direta ou indiretamente. Exemplos incluem a clivagem enzimática de farinha de soja, extrato de levedura, ou outras farinhas ricas em proteína adicionadas ao meio de crescimento da planta em peptídeos ativos que podem estimular diretamente o crescimento da planta. Peptídeos bioativos gerados pela clivagem enzimática de farinhas de proteína incluem RHPP e RKN 16D10, estimulantes potentes do desenvolvimento da raiz da planta. Adicionalmente, proproteínas ou pré-proproteínas podem ser clivadas nas formas ativas pelas proteases e peptidases expressas por BEMD em suas formas bioativas. As proproteínas ou pré-proproteínas inativas podem ser adicionadas no meio de crescimento da planta para facilitar sua clivagem gradual pelas proteases de BEMD e retardar a liberação de proteínas bioativas.
[00234] Usando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1, qualquer uma dessas proteases e peptidases podem ser incorporadas no sistema de BEMD para exibir nos esporos de BEMD, criando um construto de fusão compreendendo a protease ou peptidase e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima expressa ao exosporium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. Um membro da família de Bacillus cereus recombinante que expressa tal construto pode então ser adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta complementado com farinha de soja, extrato de levedura ou outra farinha rica em proteína para a estimulação do crescimento da planta. A farinha de soja, extrato de levedura ou outra farinha rica em proteína é adequadamente adicionada ao meio de crescimento da planta na forma de uma composição líquida compreendendo cerca de 10 μg/L a cerca de 100 mg/L da farinha de proteína, extrato de levedura ou outra farinha rica em proteína.
Exemplo 7. Uso de esporos de BEMD que expressam PtrB da protease para estimulação do crescimento da planta
[00235] Os esporos de BEMD que expressam PtrB da protease de E. coli foram criados conforme descrito acima no Exemplo 3. Sementes de soja foram plantadas com 2,54 cm de profundidade em potes fundos de 10 cm preenchidos com solo superficial de barro padrão. Os esporos, de controle e BEMD expressando protease, foram diluídos em uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados em cada planta na plantação. Um controle somente de água também foi incluído. Farinha de soja em 25 mg/pote foi adicionada em água na plantação. As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até saturação a cada três dias durante o ensaio de uma semana. No final das duas semanas, a altura de cada planta foi medida, e as medições foram normalizadas para as plantas com somente controle de água.
[00236] Os resultados são mostrados na Tabela 8, juntamente com o erro padrão da média como uma porcentagem de controle de água. A soja crescida na presença de esporos de BEMD, que exibiam protease, cresceu significativamente mais alto do que os esporos de B.t. controles tratados ou sojas com controle de água (análise estatística analisada através de um teste-t). A adição da farinha de soja às plantas de controle de água ou de controle de B. thuringiensis teve pouco efeito. Em contraste, na presença da farinha de soja e o sistema de protease de BEMD, as plantas de soja responderam significativamente durante todos os outros tratamentos. Tabela 8.
Exemplo 8. Uso de membros da família de Bacillus cereus recombinante que exibe proteínas ou peptídeos envolvidos na estimulação do crescimento da planta
[00237] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir proteínas ou peptídeos que estão diretamente envolvidos na promoção do crescimento da planta. Por exemplo, hormônios vegetais peptídicos ou peptídeos não-hormonais que estimulam o crescimento da planta podem ser expressos no sistema de BEMD. Por exemplo, os peptídeos não-hor-monais que se ligam diretamente e ativam receptores da planta podem ser expressos no sistema de BEMD para agir diretamente nos receptores na planta e raízes da planta alvo. Tais hormônios peptídicos e peptídeos não-hormonais incluem fitossulfocina, calcalva 3 (CLV3), sistemina, RKN 16D10, Hg-Syv46, eNOD40, proteínas da família NOD, ZmlGF, proteínas e peptídeos da família SCR/SP11, RHPP, POLARIS e KTI. Esses peptí- deos e peptídeos relacionados podem ser expressos no sistema de BEMD e distribuído ao meio de crescimento da planta ou diretamente aplicados à folhagem para estimular o crescimento da planta.
[00238] Usando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1, qualquer uma dessas proteínas ou peptídeos podem ser incorporados no sistema de BEMD para exibir nos esporos de BEMD, criando um construto de fusão compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima expressa ao exosporium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. Um membro da família de Bacillus cereus recombinante que expressa tal construto pode ser então adicionado ao solo ou outro meio de crescimento da planta ou aplicado diretamente à folhagem da planta usando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1 para a estimulação do crescimento da planta.
Exemplo 9. Uso de esporos de BEMD expressando POLARIS ou KTI para estimulação do crescimento da planta
[00239] Os esporos de BEMD que expressam o peptídeo vegetal POLARIS e peptídeo da soja KTI foram criados, sintetizando-se genes codificantes dos peptídeos POLARIS ou KIT ligados à sequência de di-recionamento da SEQ ID N°: 60. Os genes foram então introduzidos em Bacillus thuringiensis e os esporos foram feitos conforme descrito no Exemplo 1. Sementes de soja foram plantadas com 2,54 cm de profun-didade em potes fundos de 10 cm preenchidos com solo superficial de barro padrão. Os esporos de BEMD que expressam POLARIS ou KTI foram diluídos em uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados em cada planta na plantação. Um controle somente de água também foi incluído. Peptídeos POLARIS e KTI puros também foram testados para seus efeitos nas sojas em 0,05 mg/pot. As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até saturação a cada três dias durante o ensaio de duas semanas. No final das duas semanas, a altura de cada planta foi medida, as raízes medidas, e as medições foram normalizadas para as plantas com somente controle de água.
[00240] Os resultados são mostrados na Tabela 9, juntamente com o erro padrão da média como uma porcentagem de controle de água. A soja crescida na presença de esporos de BEMD, que exibem POLARIS, cresceu mais alta e teve um ligeiro aumento no desenvolvimento da raiz do que as sojas com controle de água. A presença do peptídeo KTI livre levou a uma retardamento significativo das plantas, perdendo entre 6-8% de sua altura, mas adicionando 15% ao comprimento das raízes. A expressão de KTI no sistema de BEMD levou ao benefício do crescimento da raiz, mas sem o efeito retardante na altura da planta. De forma relevante, a presença dos esporos de controle de Bacillus thuringiensis com o peptídeo KTI livre não impediu o efeito retardante do KTI, enquanto o BEMD com KTI não exibiu esse retardamento. Tabela 9.
Exemplo 10. Uso de membros da família de Bacillus cereus recom- binante que exibem enzimas que degradam ou modificam uma fonte de nutriente bacteriana, fúngica ou vegetal para estimular o crescimento da planta e/ou nutrientes do processo
[00241] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir enzimas que degradam ou modificam beneficamente uma fonte de nutriente bacteriana, fúngica ou vegetal presente no solo ou outro meio de crescimento da planta. Essas enzimas degradam produtos presentes no solo ou outro meio de crescimento da planta nas formas que podem facilmente serem assimiladas pelas plantas e/ou bactérias e/ou fungos benéficos da rizosfera. Essas enzimas incluem, por exemplo, glucosí- deo hidrolases para degradar carboidratos complexos, celulases para degradar celulose; lipases para degradar lipídios, incluindo óleo, gorduras e ceras; lignina oxidases para degradar lignina e ácidos húmicos; proteases para degradar polipeptídeos; fosfolipases para degradar membranas; amidases e nitrogenases para recuperar nitrogênio; amila- ses para processar amidos; nucleases para recuperar nucleotídeos, pectinases para quebrar pectina, sulfatases para recuperar enxofre, e xilanases para quebrar xilanos e arabinoxilanos. Os produtos resultantes, incluindo açúcares simples, aminoácidos, ácidos graxos, e outros nutrientes, estarão prontamente disponíveis para a absorção direta pelas plantas e/ou para estimular bactérias e/ou fungos benéficos a crescerem e se desenvolverem nas rizosferas das plantas.
[00242] Além disso, enzimas e outras moléculas biológicas podem ser utilizadas para liberar ou sequestrar fosfato, nitrogênio, e outros nutrientes elementares chave para a planta absorver a partir de suas diversas formas orgânicas e inorgânicas no solo. Por exemplo, as fosfa- tases podem ser usadas para degradar fosfatos no ambiente em fosfa- tos inorgânicos utilizáveis para o uso da planta. Os fosfatos podem ser fosfatos de ocorrência naturas presentes em um meio de crescimento da planta. Alternativa ou adicionalmente, o meio de crescimento da planta pode ser complementado com fosfatos, tais como trimetafosfato, uma melhoria agrícola comum. Exemplos de fosfatases úteis incluem monoéster fosfórico hidrolases, fosfomonoesterases, diéster fosfórico hidrolases, fosfodiesterases, monoéster trifosfórico hidrolases, fosforil anidrido hidrolases, pirofosfatases, fitase, trimetafosfatases, e trifosfata- ses. Por exemplo, as enzimas trimetafosfatase, trifosfatase e pirofosfa- tase quebram sequencialmente o trimetafosfato em fosfato inorgânico utilizável.
[00243] A família de enzimas da nitrogenase converte nitrogênio at-mosférico (N2) em amônia, convertendo, desse modo, nitrogênio que, de outra forma, estaria inacessível às plantas, em uma forma utilizável. Enzimas adequadas pertencem à família Nif de nitrogenases.
[00244] A energia química também pode ser diretamente adicionada ao meio de crescimento da planta como adenosina-3-trifosfato, ferrodoxina ou enzimas adicionais que criam essa energia no sistema de BEMD. Esses são cofatores para as nitrogenases e estão limitados no solo. Assim, tais cofatores podem ser adicionados ao solo para intensificar as reações descritas acima.
[00245] Outros complementos que podem ser adicionados ao meio de crescimento da planta incluem amidos, celulose e derivados de celulose, pectinas, xilanos e arabinoxilanos, gorduras, ceras, óleos, ácidos fíticos, ligninas, ácidos húmicos, e outras fontes de nutrientes sobre as quais as classes de enzima acima exercem atividade.
[00246] Usando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1, qualquer uma dessas enzimas podem ser incorporadas no sistema de BEMD para exibir nos esporos de BEMD, criando um cons- truto de fusão compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento para direcionar o construto de fusão ao exosporium de um membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão pode então ser expresso em um membro da família de Bacillus cereus, este membro da família de Bacillus cereus recombinante pode ser adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta usando métodos semelhantes descritos acima no Exemplo 1 para estimulação do crescimento da planta.
Exemplo 11. Uso de esporos de BEMD que expressam fosfatase para estimulação do crescimento da planta
[00247] Esporos de BEMD que expressam Fosfatase A4 (PhoA4) de Bacillus subtilis foram criados, sintetizando-se um gene codificante de PhoA4 ligado à sequência de direcionamento da SEQ ID N°: 60. Este gene foi então introduzido em Bacillus thuringiensis e os esporos foram feitos como no Exemplo 1. Milho foi plantado com 2,54 cm de profundidade em potes fundos de 10 cm preenchidos com solo superficial de barro padrão. Os esporos de BEMD que expressam PhoA4 foram diluídos em uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados em cada planta na plantação. Um controle somente de água também foi incluído. Polifosfato foi adicionado aos potes em líquido numa taxa de 0,5 mg/pote. As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até saturação a cada três dias durante o ensaio de duas semanas. No final das duas semanas, a altura de cada planta foi medida, e as medições foram normalizadas para as plantas com somente controle de água.
[00248] Os resultados são mostrados na Tabela 10. O milho crescido na presença de esporos de BEMD, que exibiam PhoA4, intensificaram o crescimento, especialmente na presença de polifos- fato adicionado. Este efeito foi maior do que o efeito do polifosfato sozinho. Tabela 10.
Exemplo 12. Uso de membros da família de Bacillus cereus recom- binante exibindo enzimas envolvidas na síntese de 2,3-butanodiol ou a síntese ou ativação de ácido giberélico para estimulação do crescimento da planta
[00249] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir enzimas envolvidas na síntese do composto 2,3-butanodiol promotor do crescimento da planta. In vivo, o 2,3-butanodiol é sintetizado por bactérias e fungos benéficos na rizosfera a partir de acetoína, diacetil, aceto- lactato, ou piruvato pelas enzimas acetolactato sintetase, α-acetolactato descarboxilase, piruvato descarboxilase, diacetil redutase, butanodiol desidrogenases, e acetoína redutase.
[00250] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir enzimas envolvidas na síntese ou ativação do composto ácido giberé- lico promotor do crescimento da planta. O ácido giberélico pode ser produzido a partir de formas inativas ou menos ativas através da ação de enzimas, incluindo, mas não se limitando a, hidroxilamina redutases, 2- oxogluturato dioxigenases, giberelina 2B/3B hidrolases, giberelina 3-oxi- dases, e giberelina 20-oxidases.
[00251] Qualquer uma dessas enzimas pode ser incorporada no sistema de BEMD para se exibir em esporos de BEMD usando métodos semelhantes àqueles descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima ao exosporium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso em um membro da família de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereusé adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta para estimulação do crescimento da planta.
[00252] Para aumentar o efeito das enzimas exibidas em BEMD, o solo pode ser complementado com substratos para as enzimas. Por exemplo, o solo ou outro meio de crescimento da planta pode ser complementado com acetoína, que é um substrato para a acetoína redu- tase; piruvato, que é um substrato para a piruvato descarboxilase; diacetil, que é um substrato para a diacetil redutase; e/ou acetolatato, que é um substrato para a acetolatato descarboxilase. Alternativa ou adicionalmente, o solo ou outro meio de crescimento da planta pode ser complementado com formas menos potentes ou inativas do ácido gi- berélico, que se converterão em formas mais ativas pelas enzimas descritas acima no solo ou em outro meio de crescimento da planta.
Exemplo 13. Uso de membros da família de Bacillus cereus recombinante exibindo proteases de proteger plantas de patógenos
[00253] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir proteases que protegem as plantas de um ou mais patógenos. Por exemplo, determinados patógenos bacterianos podem se comunicar entre membros individuais através da secreção de homosserinas de lactona bacteriana ou moléculas de sinalização relacionadas. Assim, proteases específicas para moléculas de sinalização de homosserina de lactona bacteriana podem proteger as plantas desses patógenos bacte- rianos, rompendo a comunicação entre bactérias, uma etapa essencial para que as bactérias secretem toxinas e regulem positivamente fatores de virulência. Proteases adequadas específicas para moléculas de sinalização de homosserina de lactona bacteriana incluem endopeptidases e exopeptidases.
[00254] Proteases específicas para moléculas de sinalização de ho- mosserina de lactona bacteriana podem ser incorporadas no sistema de BEMD usando métodos semelhantes àqueles descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado compreendendo a protease e uma sequência de direcionamento que direciona a protease ao exosporium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso em um membro da família de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereusé adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta para estimulação do crescimento da planta. A protease pode então degradar as moléculas de sinalização de homosserina de lactona bacteriana, bloqueando uma etapa chave na virulência desses organismos e, ajudando, desse modo, a proteger a planta desses patógenos. Outras proteases e peptidases trabalham efetivamente nesta capacidade no sistema de BEMD conforme demostrado acima no Exemplo 6 e 7.
Exemplo 14. Uso de membros da família de Bacillus cereus recom- binante exibindo proteínas e peptídeos antimicrobianos para proteger as plantas dos patógenos
[00255] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir enzimas que exibem atividades antibacterianas e/ou antifúngicas que podem ajudar a proteger as plantas de um ou mais patógenos. Por exemplo, proteínas e peptídeos antimicrobianos, tais como bacterioci- nas, lisozimas (por exemplo, LysM), sideróforos, conalbumina, albumina, lactoferrinas (por exemplo, LfcinB), ou TasA podem todos ser expressos no sistema de BEMD para exercer seu efeito sobre patógenos bacterianos e fúngicos de plantas. Bacteriocinas, albumina, conalbu- mina, lisozimas e lactoferrina exercem ação antimicrobiana direta sobre seus alvos, enquanto sideróforos ligam nutrientes essenciais que pató- genos exigem para virulência. Por exemplo, o peptídeo LfcinB de lacto- ferrina, quando expresso na superfície do sistema de BEMD lisaria células bacterianas que são suscetíveis aos peptídeos de lactoferrina no meio de crescimento da planta. Essas proteínas e peptídeos têm ação específica sobre a seleção de micróbios, e podem direcionar seletivamente um grupo de patógenos sem obstruir todos os micróbios no meio de crescimento da planta.
[00256] Qualquer uma dessas proteínas ou peptídeos pode ser incorporada no sistema de BEMD para se exibir em esporos de BEMD usando métodos semelhantes àqueles descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima ao exospo- rium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso em um membro da família de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereusé adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta para proteção das plantas de um ou mais patógenos.
Exemplo 15. Uso de esporos de BEMD que expressam peptídeos antimicrobianos para proteger as plantas de bactérias
[00257] Foram sintetizados genes que codificam qualquer um dos dois peptídeos antimicrobianos, LfcinB (derivado da lactoferrina bovina) e LysM (derivado da lisozima de galinha), ligados a uma sequência de direcionamento de BclA (SEQ ID N°: 60), sob o controle do promotor de BclA (SEQ ID N°: 85). Os genes foram introduzidos em Bacillus thurin- giensis BT013A e os esporos foram feitos, cultivando-se uma cultura durante a noite do Bacillus transformado em caldo de infusão de coração e cérebro, plaqueando em placas de ágar nutriente a 30°C e deixando crescer por 3 dias. Os esporos foram lavados das placas e lavados 3X em PBS. Culturas de Staphylococcus epidermidis foram cultivadas durante a noite em caldo TSB a 37°C. A cultura durante a noite foi então peletizada, lavada em PBS e resuspensa em PBS em um Abs595 = 0,2. 1x104 BEMD expressando os peptídeos LysM ou LfcinB foram incubados no PBS com o S. epidermidis por 3 horas a 37°C, com agitação. Uma amostra de controle de S. epidermidis foi deixada sem tratamento (nenhum esporo de BEMD). Após a incubação de 3 horas, as placas de diluição do S. epidermidis foram feitas e incubadas a 37°C durante a noite. Culturas de S. epidermidis foram contadas no dia seguinte, e a morte percentual foi quantificada. Na Tabela 11 abaixo, foi registrado um registro da atividade de morte. Os peptídeos de BEMD expressos mataram um número significativo de células de S. epidermidis. Isto se traduziria diretamente na morte de bactérias na rizosfera, sementes, ou outro material vegetal. A seleção de peptídeos específicos para determinadas classes de bactérias também poderia distorcer a população dos micro-organismos próximos à planta de uma forma benéfica, ou podem direcionar seletivamente patógenos chave. Tabela 11.
Exemplo 16. Uso de membros da família de Bacil us cereus recom- binante exibindo enzimas para proteger as plantas de patógenos
[00258] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir enzimas que protegem as plantas de um ou mais patógenos. Por exemplo, paredes de células de levedura e bolor são degradas por enzimas, tais como β-1,3-glucanases, β-1,4-glucanases, β-1,6-glucanases, quito- sinases, quitinases, proteínas semelhantes à quitosinase, e liticases. As paredes de células bacterianas são degradas por enzimas selecionadas de proteinases, proteases, mutanolisina, stafolisina e lisozimas. Cada uma dessas enzimas de degradação da parede celular pode ser expressa no sistema de BEMD e adicionada ao meio de crescimento da planta para inibição seletiva de micróbios patogênicos na rizosfera.
[00259] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir enzimas ou proteínas que protegem as plantas de patógenos de insetos ou de verme, por exemplo, suprimindo a predação do inseto e/ou verme das plantas desejadas. Exemplos de tais proteínas e enzimas de interesse incluem endotoxinas, toxinas Cty, outras toxinas de proteína inseticida, inibidores de protease, cisteína proteases, a proteína Cry5B, a proteína Cry21A, quitinase, proteínas inibidoras da protease, peptídeos inibidores da protease, inibidores de tripsina, e inibidores da protease de ponta-de-seta.
[00260] Qualquer uma dessas proteínas ou peptídeos pode ser incorporada no sistema de BEMD para se exibir em esporos de BEMD usando métodos semelhantes àqueles descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima ao exosporium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso em um membro da família de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereusé adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta para proteção das plantas de patógenos.
Exemplo 17. Uso de esporos de BEMD que expressam uma enzima antifúngica para proteger plantas, e demonstração da eficácia contra Sacchromyces
[00261] Foi sintetizado um gene que codifica uma enzima antifún- gica, β-1,3-glucanase de Bacillus subtilis, ligado a uma sequência de direcionamento de BclA (SEQ ID N°: 60) sob o controle do promotor de BclA (SEQ ID N°: 85). O gene foi introduzido em Bacillus thuringiensis BT013A e os poros foram feitos, cultivando-se uma cultura durante a noite do Bacillus transformado em caldo de infusão de coração e cérebro, plaqueando em placas de ágar nutriente a 30°C e deixando crescer por 3 dias. Os esporos foram lavados das placas e lavados 3X em PBS. Culturas de Saccharomyces cerevisiae foram cultivadas durante a noite em caldo YZ a 37°C. A cultura durante a noite foi então peletizada, lavada em PBS e resuspensa em PBS em um Abs595 = 0,2. 1x104 BEMD expressando a β-1,3-glucanase foi incubado em PBS com o Saccha- romyces por 1 hora a 37°C, com agitação. Uma amostra de controle de Saccharomyces foi deixada sem tratamento (nenhum esporo de BEMD). Após a incubação de 3 horas, as placas de diluição do Saccha- romyces foram feitas e incubadas a 37°C durante a noite. Culturas de Saccharomyces foram contadas no dia seguinte, e a morte percentual foi quantificada. A Tabela 12 abaixo mostra a atividade de morte dos esporos de BEMD que expressam a β-1,3-glucanase. A enzima ex-pressa por BEMD matou um número significativo de células de Saccha- romyces. Isto se traduziria diretamente na morte de micro-organismos fúngicos na rizosfera, sementes, ou outro material vegetal. A seleção de proteínas específicas para determinadas classes de fungos também po-deria distorcer a população dos micro-organismos próximos à planta de uma forma benéfica, ou podem direcionar seletivamente patógenos fún-gicos chave. Tabela 12.
Exemplo 18. Uso de membros da família de Bacillus cereus recom- binante exibindo peptídeos ou proteínas estimulantes do sistema imune vegetal para proteger as plantas dos patógenos
[00262] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir peptídeos e proteínas potenciadores do sistema imune vegetal. Essas proteínas podem ser expressas na parte externa do esporo de BEMD e distribuídas no meio de crescimento da planta para estimular o sistema imune da planta para permitir que a planta se proteja dos patógenos de plantas. Exemplos de proteínas e peptídeos incluem as proteínas e pep- tídeos harpina, α-elastinas, β-elastinas, sisteminas, fenilalanina amônia- liase, elicitinas, defensinas, criptogeína, e flagellina. A exposição das plantas a essas proteínas e peptídeos estimulará a resistência a vários patógenos de plantas nas plantas.
[00263] Qualquer uma dessas proteínas ou peptídeos pode ser incorporada no sistema de BEMD para se exibir em esporos de BEMD usando métodos semelhantes àqueles descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima ao exosporium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso em um membro da família de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereusé adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta para proteção das plantas de patógenos.
Exemplo 19. Uso de membros da família de Bacillus cereus recom- binante que exibem uma proteína ou peptídeo de ligação à raiz ou à folha para imobilizar o membro da família de Bacillus cereus recom- binante em um sistema de raízes de uma planta ou nas folhas de uma planta
[00264] As proteínas e peptídeos de ligação à raiz e folhas também podem ser incorporadas no sistema de BEMD para permitir que os esporos de BEMD sejam imobilizados em um sistema de raiz ou nas folhas de uma planta. A exibição desses ligantes de ligação à raiz ou folhas nos esporos de BEMD permite o direcionamento dos esporos para o sistema de raiz de uma planta ou para as subestruturas do sistema de raiz ou para as folhas ou para as subestruturas das folhas para manter os esporos de BEMD numa localização ideal para que outras moléculas biológicas e enzimas sejam eficazes.
[00265] Por exemplo, a ricadesina é um ligante de ligação que se liga aos filamentos da raiz. Assim, a exibição da ricadesina nos esporos de BEMD direciona os esporos para os filamentos da raiz. Proteínas adicionais que poderiam ser utilizadas para a ligação seletiva às raízes da planta ou às folhas incluem adesinas, flagellina, omptinas, lectinas, proteínas do píli, proteínas do curlus, intiminas, invasinas, aglutinina, proteínas afimbriais, TasA, ou YuaB.
[00266] Essas proteínas e peptídeos de ligação à raiz ou às folhas podem ser incorporadas no sistema de BEMD usando métodos semelhantes àqueles descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado compreendendo a proteína ou peptídeo de ligação à raiz ou às folhas e uma sequência de direcionamento que direciona a proteína ou peptídeo ao exosporium quando o construto é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão contendo o ligante de ligação à raiz ou folha é então expresso em um membro da família de Bacillus cereus. Tais construtos de fusão podem ser coexpres- sos com um ou mais construtos de fusão adicionais compreendendo qualquer uma das enzimas benéficas discutidas neste documento (por exemplo, uma enzima envolvida na síntese de um hormônio vegetal, uma enzima que degrade uma fonte de nutriente, ou uma protease que proteja uma planta de um patógeno). O membro da família de Bacillus cereus recombinante é adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta, ou aplicado às folhas de uma planta. O ligante de ligação à raiz ou folha direciona o membro da família de Bacillus cereus para o sistema de raízes da planta ou para as folhas da planta e o imobiliza, permitindo, assim, que o construto de fusão coexpresso exerça seus efeitos em estreita proximidade ao sistema de raízes ou folhas.
Exemplo 20. Uso de membros da família de Bacillus cereus recom- binante que exibem proteínas ou enzimas para potencializar a resistência ao estresse das plantas
[00267] As proteínas, peptídeos e enzimas que potencializam a resistência ao estresse em uma planta podem ser incorporados no sistema de BEMD e distribuídos às plantas alvo através da adição Às raízes, folhas, ou ao meio de crescimento da planta. Durante períodos de estresse, as plantas liberam compostos relacionados ao estresse, incluindo o ácido aminociclopropano-1-carboxílico (ACC), espécies reativas de oxigênio, e outros, resultando em um impacto negativo sobre o crescimento da planta. O sistema de BEMD pode ser usado para exibir enzimas que degradam esses compostos relacionados ao estresse, tais como a ácido aminociclopropano-1-carboxílico desaminase, superóxido dismutases, oxidases, catalases, e outras enzimas que agem em espécies reativas de oxigênio. Tais enzimas reduzem a quantidade desses compostos relacionados ao estresse e permitem que as plantas continuem a crescer e até mesmo se desenvolvam sob condições de estresse.
[00268] Qualquer uma dessas proteínas ou peptídeos pode ser incorporada no sistema de BEMD para se exibir em esporos de BEMD usando métodos semelhantes àqueles descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima ao exospo- rium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso em um membro da família de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereus é adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta ou aplicado às folhas de uma planta para potencializar a resistência ao estresse de uma planta alvo.
Exemplo 21. Preparação de esporos de BEMD que expressam a enzima protetora catalase
[00269] Foi sintetizado um gene que codifica a enzima protetora catalase de Bacillus cereus ligado a uma sequência de direcionamento de BetA (SEQ ID N°: 61) sob o controle do promotor de BetA (SEQ ID N°: 86). Este gene foi introduzido em Bacillus thuringiensis BT013A. Os esporos foram feitos, cultivando-se uma cultura durante a noite do Bacillus transformado e da cepa do tipo selvagem em caldo de infusão de coração e cérebro, plaqueando em placas de ágar nutriente a 30°C e deixando crescer por 3 dias. Os esporos foram lavados das placas e lavados 3X em PBS. 3 gotas de peróxido de hidrogênio foram adicionadas em cada pélete de esporo. A enzima catalase converte o peróxido de hidrogênio em água e gás O2. Os esporos de controle não produziram bolhas, enquanto os esporos de BEMD com catalase rapidamente o fizeram, demonstrando a atividade da enzima na superfície dos esporos. Outras enzimas protetoras podem ser exibidas de uma forma semelhante e distribuídos à planta para agirem sobre radicais livres produzidos durante o estresse pelas plantas.
Exemplo 22. Uso de membros da família de Bacillus cereus recom- binante que exibem proteínas ou enzimas que protegem sementes ou plantas de um estresse ambiental
[00270] As proteínas, peptídeos e enzimas que protegem uma planta de um estresse ambiental podem ser incorporados no sistema de BEMD e distribuídos às plantas alvo através da adição às raízes, fo- lhas,fruto, ou ao meio de crescimento da planta. Durante períodos de congelamento, as plantas podem ser danificadas pelo efeito do gelo. O sistema de BEMD pode ser usado para exibir peptídeos, proteínas ou enzimas que protejam as plantas de tais efeitos. Por exemplo, o sistema de BEMD pode ser usado para exibir colina desidrogenases, que agem produzindo produtos protetores que protegem a planta ou semente da geada. Substratos para essas enzimas (por exemplo, colina e/ou derivados de colina) também podem ser adicionado ao meio de crescimento da planta. A adição desses substratos pode potencializar a quantidade de protetor (betaína e produtos químicos relacionados) produzida no ambiente da planta pelas enzimas expressas por BEMD. Derivados de betaína são conhecidos por proteger as sementes do estresse do frio.
[00271] Qualquer uma dessas proteínas ou peptídeos pode ser incorporada no sistema de BEMD para se exibir em esporos de BEMD usando métodos semelhantes àqueles descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima ao exospo- rium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso em um membro da família de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereus é adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta ou aplicado às folhas de uma planta para proteger a planta dos estresses e fatores ambientais.
Exemplo 23. Expressão potencializada de construtos de fusão no sistema de BEMD pelo uso de elementos promotores potencializados ou alternativos
[00272] O sistema de BEMD pode exibir uma ampla gama de proteínas, peptídeos e enzimas usando uma ou mais das sequências de di-recionamento descritas neste documento. Algumas dessas sequências de direcionamento têm uma alta afinidade pelo exosporium, o que poderia ser benéfico para a expressão da proteína de fusão, mas seu baixo nível de expressão da proteína de fusão limita seu uso no sistema de BEMD. Para essas proteínas e sequências de fusão, promotores alternativos de esporulação de alta expressão podem ser usados, em vez dos promotores nativos.
[00273] Por exemplo, a SEQ ID N°: 13 (aminoácidos 1-39 do gene 3572 deB. weihenstephensis KBAB4) fornece uma sequência N-termi- nal muito eficaz para a distribuição de proteínas ao exosporium dos membros da família de Bacillus cereus, como mostrado na Tabela 13 abaixo. Todos os genes foram sintetizados em sua forma completa (incluindo regiões promotoras e regiões codificantes das proteínas de fusão), conforme descrito neste documento. Quando os elementos promotores nativos para o gene 3572 de B. weihenstephensis KBAB4 (SEQ ID N°: 88) foram usados para expressar uma proteína de fusão compreendendo a sequência de direcionamento da SEQ ID N°: 13 fundida a uma enzima β-galactosidase (de E. coli), um baixo nível da proteína de fusão foi expresso, levando a uma redução da atividade da enzima na superfície do esporo. A atividade da enzima foi medida pela conversão de 0,5M o-nitrofenilgalactosídeo em solução durante 10 minutos. A conversão da enzima foi medida com um espectrofotômetro em ABS540. A substituição dos elementos promotores nativos do gene 3572 de B. wei- henstephensis KBAB4 pelos promotores de alta expressão da SEQ ID N°: 86 (B. anthracis BetA/BAS3290) ou SEQ ID N°: 89 (proteína YVTN e—hélice de B. weihenstephensis KBAB4) levou a um aumento dramático da atividade enzimática dos esporos. Por outro lado, a substituição dos elementos promotores nativos para o gene 3572 de B. weihenstephen- sis KBAB4 pelo promotor nativo para B. anthracis Sterne BAS1882 (SEQ ID N°: 87) levou a uma diminuição da atividade enzimática dos esporos. O nível de expressão da sequência de direcionamento da SEQ ID N°: 13 fundida à β-galactosidase foi muito mais menor (0,38X) quando acionado pelo promotor de BAS1882 (SEQ ID N°: 87), e foi enor-memente melhorado quando acionado a partir do promotor BetA (SEQ ID N°: 86) ou promotor da proteína YVTN (SEQ ID N°: 89). Tabela 13.
Exemplo 24. Isolamento e identificação de cepas bacterianas promotoras do crescimento da planta
[00274] Amostras de solo de rizosferas das plantas mais resistentes e mais saudáveis de batata (Solanum tuberosum), abobrinha amarela (Cucurbita pepo), tomate (Solanum lycopersicum), e feijão-da- Espanha (Phaseolus coccineus) foram coletadas, diluídas em água estéril, e espelhadas em placas de ágar nutriente. Isolados bacteria- nos que demonstraram altas taxas de crescimento e foram capazes de serem passados e propagados foram selecionados para estudo adicional. As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g, e glicose 1 g, por L de peso seco). As culturas de durante a noite (30°C) das cepas selecionadas foram giradas, os meios decantados, e ressupensas em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de alface por tratamento foram plantadas em uma profundidade de 1 cm em solo superficial de barro (Columbia, MO) que foi peneirado para remover os debris grandes. As sementes foram inoculadas na plantação em potes de 4 cm com 0,5 μl de meios de ressupensos em água misturada em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para distribuir as bactérias nas 3 pol3 (7,62 cm3) do solo, bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 65-75°F (18-24°C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de re- gamento a cada 3 dias. Depois de uma semana, a altura da planta e diâmetros da folha, bem como a saúde geral das plantas foram coletados. A triagem inicial de isolados de rizosfera resultou na obtenção de mais de 200 espécies distintas de bactérias e fungos da rizosfera das quatro plantas. Algumas das espécies bacterianas são descritas na Tabela 14. As cepas identificadas estão indicadas por suas identificações bacterianas adequadas. Outras cepas estão indicadas por seus números de identificação desconhecidos. Os inóculos que geraram resultados próximos ao controlo (+/- 2%) não foram incluídos na tabela. Tabela 14
[00275] As cepas bacterianas que produziram o maior efeito na saúde geral da planta e na altura da planta no ensaio com alface inicial foram submetidas à identificação adicional. As cepas bacterianas foram cultivadas durante a noite em caldo de Luria Bertani a 37°C, e as culturas de durante a noite foram giradas em uma centrífuga. Os meios foram decantados e o pélete bacteriano restante foram submetidos ao isolamento de DNA cromossômico usando o kit Bacterial Chromosomal DNA Isolation da Qiagen. O DNA cromossômico foi submetido à amplificação por PCR das regiões codificantes de rRNA 16S usando os iniciadores E338F 5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3’ (SEQ ID N°: 122), E1099R A 5’-GGG TTG CGC TCG TTG C-3’ (SEQ ID N°: 123), e E1099R B 5’-GGG TTG CGC TCG TTA C-3’ (SEQ ID N°: 124). Os amplicons do PCR foram purificados usando um kit de purificação de PCR da Promega, e os amplicons resultante foram diluídos e enviados ao DNA Core da University of Missouri para o sequenciamento de DNA. As sequências de DNA foram comparadas ao banco de dados de isolados bacterianos do NCBI BLAST, e o gênero e espécies foram identificados por comparação direta a cepas conhecidas. As principais espécies identificadas estão indicadas na Tabela 14. Em muitos casos, as sequências de DNA de rRNA 16S foram somente capazes de delinear o gênero da cepa bacteriana selecionada. Nos casos onde uma identificação direta não aparecia, análises bioquímicas adicionais, usando métodos padrão do campo, foram realizadas para diferenciar as cepas nas espécies e níveis da cepa, e estão listadas na Tabela 15. Tabela 15
Exemplo 25. Isolamento e identificação de cepas bacterianas adicionais promotoras do crescimento da planta
[00276] Amostras de solo de campos agrícolas próximos a Gas, Kansas foram coletadas, diluídas em água estéril, e espalhadas em placas de ágar nutriente. Isolados bacterianos que demonstraram altas taxas de crescimento e foram capazes de serem passados e propagados foram selecionados para estudo adicional. As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15g, CaCl2 2H20 0,013g, e glicose 1 g, por L de peso seco). As culturas de durante a noite (30°C) das cepas selecionadas foram giradas, os meios decantados, e ressupensas em uma quantidade igual de água destilada. Sementes de milho foram revestidas com polímero de semente comercial com água sozinhas (1.6 μl por total de semente) ou polímero de semente comercial contendo as cepas bacterianas selecionadas (1,6 μl por total de semente). As sementes revestidas foram plantadas em potes de 7,62 cm de diâmetro (3 polegadas) numa profundidade de uma polegada (2,54 cm) em solo superficial de barro (Columbia, MO) que foi peneirado para remover os grandes debris. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 18-24oC (65-75oF) com 11 horas de luz/dia, e 50 ml de regamento na plantação e a cada 3 dias. Depois de duas semanas, a altura da planta e diâmetros da folha, bem como a saúde geral das plantas foram coletados. Para ensaios de germinação e determinação do comprimento da raiz em 3 dias, as sementes foram revestidas conforme indicado acima e dispersas uniformemente em 10 sementes por toalha de papal. As toalhas de papel foram molhadas com 10 ml de água, enroladas, colocadas em uma pequena sacola plástica e incubadas a 30°C ou colocadas em uma esteira de aquecimento de germinação a 27-30°C (80-85°F). As medições da raiz foram registradas após 3 dias. A triagem inicial de isolados de rizosfera resultou na obtenção de mais de 100 espécies distintas de bactérias e fungos da rizosfera. Algumas das espécies bacterianas são descritas na Tabela 16. As cepas identificadas estão indicadas por suas identificações bacterianas adequadas. Tabela 16
[00277] As cepas bacterianas que produziram o maior efeito na saúde da planta são descritas na Tabela 16. As cepas bacterianas foram cultivadas durante a noite em caldo de Luria Bertani a 37°C, e as culturas de durante a noite foram giradas em uma centrífuga. Os meios foram decantados e o pélete bacteriano restante foram submetidos ao isolamento de DNA cromossômico usando o kit Bacterial Chromosomal DNA Isolation da Qiagen. O DNA cromossômico foi submetido à amplificação por PCR das regiões codificantes de rRNA 16S usando os iniciadores E338F 5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3’ (SEQ ID N°: 122), E1099R A 5’-GGG TTG CGC TCG TTG C-3’ (SEQ ID N°: 123), e E1099R B 5’-GGG TTG CGC TCG TTA C-3’ (SEQ ID N°: 124). Os amplicons do PCR foram purificados usando um kit de purificação de PCR da Promega, e os amplicons resultante foram diluídos e enviados ao DNA Core da University of Missouri para o sequenciamento de DNA. As sequências de DNA foram comparadas ao banco de dados de isolados bacterianos do NCBI BLAST, e o gênero e espécies foram identificados por comparação direta a cepas conhecidas. As principais espécies identificadas estão indicadas na Tabela 16. Em muitos casos, as sequências de DNA de rRNA 16S foram somente capazes de delinear o gênero da cepa bacteriana selecionada. Nos casos onde uma identificação direta não aparecia, análises bioquímicas adicionais, usando métodos padrão do campo, foram realizadas para diferenciar as cepas nas espécies e níveis da cepa, e as cepas diferenciadas estão listadas na Tabela 17. Tabela 17 wk = crescimento semanal ou baixo crescimento
Exemplo 26. Teste de cepas bacterianas promotoras do crescimento da planta na alfafa
[00278] As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g, e glicose 1 g, por L de peso seco). As culturas de durante a noite (30°C) das cepas selecionadas foram giradas, os meios decantados, e as bactérias ressupensas em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de alfafa revestidas por Zeba foram plantadas para cada tratamento em uma profundidade de 0,6 cm em solo superficial de barro (Columbia, MO) que foi peneirado para remover os debris grandes. As sementes foram inoculadas na plantação em 0,5 μl de bactérias ressuspendidas em água misturada em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para distribuir as bactérias nas 3 pol3 (7,62 cm3) do solo, bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 65-75°F (18-24°C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de rega- mento a cada 3 dias. A alfafa foi deixada crescer por 1 semana para analisar o surgimento e o desenvolvimento inicial das plantas sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas adequadas e dados de altura final estão listadas na Tabela 18. Tabela 18
Exemplo 27. Teste de cepas bacterianas promotoras do crescimento da planta em pepinos
[00279] As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g, e glicose 1 g, por L de peso seco). As culturas de durante a noite (30°C) das cepas selecionadas foram giradas, os meios decantados, e ressupensas em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de pepino foram plantadas para cada tratamento em uma profundidade de 1 cm em solo superficial de barro (Columbia, MO) que foi peneirado para remover os debris grandes. As sementes foram inoculadas na plantação em 0,5 μl de bactérias ressus- pendidas em água misturada em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para distribuir as bactérias nas 3 pol3 (7,62 cm3) do solo, bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 65-75°F (18-24°C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de regamento a cada 3 dias. Os pepinos foram deixados crescer por duas semanas para analisar o surgimento e o desenvolvimento inicial das plantas sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas adequadas e dados de altura final estão listadas na Tabela 19. Tabela 19
Exemplo 28. Teste de cepas bacterianas promotoras do crescimento da planta na abobrinha amarela
[00280] As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g, e glicose 1 g, por L de peso seco). As culturas de durante a noite (30°C) das cepas selecionadas foram giradas, os meios decantados, e ressupensas em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de abobrinha amarela foram plantadas para cada tratamento em uma profundidade de 1 cm em solo superficial de barro (Columbia, MO) que foi peneirado para remover os debris grandes. As sementes foram inoculadas na plantação em 0,5 μl de bactérias ressuspendidas em água misturada em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para distribuir as bactérias nas 3 pol3 (7,62 cm3) do solo, bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 65-75°F (18-24°C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de regamento a cada 3 dias. A abobrinha foi deixada crescer por duas semanas para analisar o surgimento e o desenvolvimento inicial das plantas sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacteri- anas adequadas, dados de altura final, e dados de diâmetro de folha final (pela extensão das duas folhas) estão listadas na Tabela 20. Tabela 20
Exemplo 29. Teste de cepas bacterianas promotoras do crescimento da planta em azevém
[00281] As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g, e glicose 1 g, por L de peso seco). As culturas de durante a noite (30°C) das cepas selecionadas foram giradas, os meios decantados, e ressupensas em uma quantidade igual de água destilada. Trinta sementes de azevém foram plantadas para cada tratamento em uma profundidade de 0,3 cm em solo superficial de barro (Columbia, MO) que foi peneirado para remover os debris grandes. As sementes foram inoculadas na plantação em 0,5 μl de bactérias ressus- pendidas em água misturada em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para distribuir as bactérias nas 3 pol3 (7,62 cm3) do solo, bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 65-75°F (18-24°C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de regamento a cada 3 dias. O azevém foi deixado crescer por 1,5 semana para analisar o surgimento e o desenvolvimento inicial das plantas sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas adequadas e dados de altura final estão listadas na Tabela 21. Tabela 21
Exemplo 30 Teste de cepas bacterianas promotoras do crescimento da planta no milho
[00282] As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g, e glicose 1 g, por L de peso seco). As culturas de durante a noite (30°C) das cepas selecionadas foram giradas, os meios decantados, e ressupensas em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de milho foram plantadas para cada tratamento em uma profundidade de 2,5 cm em solo superficial de barro (Columbia, MO) que foi peneirado para remover os debris grandes. As sementes foram inoculadas na plantação em 0,5 μl de bactérias ressuspendidas em água misturada em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para distribuir as bactérias nas 3 pol3 (7,62 cm3) do solo, bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 65-75°F (18-24°C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de regamento a cada 3 dias. O milho foi deixado crescer por duas semanas para analisar o surgimento e o desenvolvimento inicial das plantas sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas adequadas e dados de altura final estão listadas na Tabela 22. Tabela 22
Exemplo 31 Teste de cepas bacterianas promotoras do crescimento da planta em soja
[00283] As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g, e glicose 1 g, por L de peso seco, ou para Bradyrhizobium ou Rhizobium em meios de levedura com manitol). As culturas de durante a noite (30°C) das cepas selecionadas foram giradas, os meios decantados, e ressupensas em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de soja foram plantadas para cada tratamento em uma profundidade de 2,5 cm em solo superficial de barro (Columbia, MO) que foi peneirado para remover os debris grandes. As sementes foram inoculadas na plantação com 0,5 μl de bactérias ressupendidas em água misturada em 10 ml de H2O. Ao testar duas cepas bacterianas, 0,5 μl de cada bactéria ressuspendida foi misturado em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para distribuir as bactérias nas 3 pol3 (7,62 cm3) de solo, bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 65-75°F (18-24°C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de rega- mento a cada 3 dias. As sojas foram deixadas crescer por duas semanas para analisar o surgimento e o desenvolvimento inicial das plantas sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas adequadas e dados de altura final estão listadas na Tabela 23. A co-inoculação das cepas de bactérias na presente invenção com membros de Bradyrhizo- bium sp. ou Rhizobium sp. levou a um aumento no crescimento da planta em comparação a qualquer inóculo sozinho. Tabela 23
Exemplo 32. Membros da família de Bacillus cereus com atributos promotores do crescimento da planta ]
[00284] Bacillus mycoides cepa BT155, Bacillus mycoides cepa EE118, Bacillus mycoides cepa EE141, Bacillus mycoides cepa BT46- 3, membro da família de Bacillus cereus cepa EE349, Bacillus thurin- giensis cepa BT013A, e Bacillus megaterium cepa EE281 foram cultivados em caldo de Luria Bertani a 37°C e as culturas de durante a noite foram giradas, os meios decantados, e ressuspensas em quantidade igual de água destilada. 20 sementes de milho foram plantadas para cada tratamento em uma profundidade de 2,5 cm em solo superficial de barro (Columbia, MO) que foi peneirado para remover os debris grandes. As sementes foram inoculadas na plantação em 0,5 μl de bactérias ressuspendidas em água misturada em 50 ml de H2O. Cinquenta ml de H2O foram suficientes para distribuir as bactérias nas 29 pol3 (442,5 cm3) do solo, bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 65-72°F com 13 horas de luz/dia, e 5 ml de regamento a cada 3 dias. As mudas foram deixadas crescer por duas semanas para analisar o surgimento e o desenvolvimento inicial das plantas sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bac- terianas adequadas e dados de altura final estão listadas na Tabela 24. Tabela 24
[00285] Todas as bactérias promotoras do crescimento da planta testadas tiveram um efeito benéfico na altura do milho em duas semanas sob as condições descritas. O membro da família de Bacillus cereus cepa EE128 teve o maior efeito neste ensaio, gerando mais de 14% de impulso na altura do milho.
Exemplo 33. Seleção potencializada dos membro da família de Bacillus cereus para triar a promoção do crescimento da planta e outras atividades benéficas como o hospedeiro de expressão de BEMD
[00286] O sistema de BEMD pode ser usado para exibir uma ampla gama de proteínas, peptídeos e enzimas usando qualquer uma das sequências de direcionamento descritas neste documento para proporcionar efeitos agrícolas benéficos. Efeitos benéficos adicionais podem ser obtidos pela seleção de um hospedeiro de expressão (um membro da família de Bacillus cereus) tendo atributos benéficos inerentes. Muitas cepas dos membros da família de Bacillus cereus têm benefícios da promoção do crescimento da planta. Adicionalmente, muitas cepas do membro da família de Bacillus cereus têm efeitos protetores, através de atividades diretas fúngicas, inseticidas, nematocidas, ou outras atividades. Ao usar tais cepas como o hospedeiro de expressão para o sistema de BEMD, o produto do esporo final teria uma combinação de benefícios positivos na agricultura.
[00287] A Tabela 25 fornece resultados para experimentos, em que uma proteína de fusão foi expressa em várias cepas do membro da família de Bacillus cereus. Todas as cepas expressaram uma proteína de fusão que compreende os aminoácidos 1-35 da SEQ ID N°: 1 e a fosfatase PhoA4 de Bacillus subtilis, uma enzima benéfica para a absorção potencializada do fosfato no milho. O gene foi sintetizado, clonado no vetor pMK4, e introduzido em cada um do Bacillus spp. indicado na Tabela 25 abaixo. As cepas foram tiradas em espo- rulação pela incubação a 30°C em placas de ágar nutriente contendo 10 μg/ml de cloranfenicol por três dias. Os esporos foram coletados, lavados e aplicados no milho na plantação numa taxa de 1x105 UFC/ml em 50 ml de água por pote de 7,62 cm de diâmetro com 5 mg de polifosfato por pote. O milho foi cultivado em solo de barro fino por duas semanas. As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até a saturação a cada três dias durante um ensaio de duas semanas. Ao fim das duas semanas, a altura de cada planta foi medida, e as medições foram normalizadas para controlar os esporos de Bacillus thuringiensis Expressão da SEQ ID N°: 1 - A proteína de fusão da fosfatase levou a um aumento na altura do milho em duas semanas, independentemente da cepa hospedeira de expressão selecionada. Como mostradona Tabela 25, o uso de um membro da família de Bacillus cereus promotor do crescimento da planta aumentou ainda mais a altura do milho Tabela 25.
Exemplo 34. Uso de diversas sequências de direcionamento para expressar a β-galactosidase na superfície de Bacillus thuringiensis
[00288] Uma ampla variedade de sequências de direcionamento que têm uma alto grau de homologia com os aminoácidos 20-35 de BclA (aminoácidos 20-35 da SEQ ID N°: 1) pode ser usada para exibir enzimas, proteínas e peptídeos na superfície de membros da família de Bacillus cereus. Várias sequências de direcionamento foram comparadas, produzindo-se proteínas de fusão contendo as sequências de dire-cionamento ligadas à lipase de Bacillus subtilis. Os construtos de fusão foram sintetizados usando os promotores nativos à sequência de direci-onamento, clonados no plasmídeo de replicação pMK4, e introduzidos no Bacillus thuringiensis BT013A. As cepas foram tiradas em esporula- ção por incubação a 30°C em placas de ágar nutriente contendo 10 μg/ml de cloranfenicol por 3 dias. Os esporos foram coletados, lavados e ressupendidos em PBS numa taxa de 1x108/ml. 1 X 105 esporos para cada construto de fusão foram suspendidos em 400 μl de dH2O. As reações foram aquecidas com os componentes da reação à temperatura de reação desejada (40°C). 200 μl de tampão de trabalho foram adicionados (9:1 de Solução A: Solução B). A solução A era 50 mM Tris pH 10 e 13,6 mM ácido deoxicólico e a Solução B era 3 mg/ml de p-nitrofenil palmitato em isopropanol. A reação foi incubada a 40°C por 10 minutos e colocada em gelo, centrifugada para remover os esporos, e a absor- bância em 420 nm foi registrada. Os resultados são mostrados na Tabela 26 abaixo. A atividade foi normalizada para uma proteína de fusão compreendendo os aminoácidos 1-35 da SEQ ID N°: 1 fundidos à lipase do Bacillus subtilis. Tabela 26.
[00289] Várias sequências de direcionamento ligadas à lipase resultam em níveis de expressão e atividade mais altos da enzima na superfície dos esporos. Em particular, as SEQ ID N°s. 60, 62, e 64, cada uma contendo uma sequência de direcionamento mais curta, resultaram em expressão de fusão potencializada na superfície dos esporos de BEMD. Todas as proteínas de fusão contendo sequências de direcionamento testadas resultaram na exibição da lipase na superfície.
Exemplo 35. Uso de diversas sequências de exosporium para expressar a lipase na superfície de Bacillus thuringiensis e demonstração da localização da proteína de fusão na superfície do exos- porium
[00290] Uma ampla variedade de proteínas de exosporium pode ser usada para exibir enzimas, proteínas e peptídeos na superfície dos membros da família de Bacillus cereus. Várias proteínas do exosporium diferentes foram comparadas, produzindo-se proteínas de fusão contendo proteínas do exosporium ligadas à lipase do Bacillus subtilis, como descrito no Exemplo 34. Os construtos de fusão foram sintetizados usando o promotor nativo à proteína do exosporium indicada na Tabela 27 abaixo, clonados no plasmídeo de replicação pMK4, e introduzidos no Bacillus thuringiensis BT013A. Os esporos que exibem as diversas fusões de lipase de Bacillus subtilis 168 à proteína do exospo- rium foram feitos, cultivando-se as bactérias transformadas em caldo de infusão de cérebro e coração com pressão seletiva de 10 μg/ml de clo- ranfenicol, plaqueando em placas de ágar nutriente, e incubando a 30°C por 3 dias. Após 3 dias, os esporos foram lavados das placas, purificados por centrifugação e ressuspendidos em PBS a 1 X 108 UFC/ml.
[00291] 1 X 105 esporos para cada construto de fusão foram res- suspendidos em 400 μl de dH2O. As reações foram aquecidas com os componentes de reação à temperatura desejada (40°C). 200 μl de tampão de trabalho foram adicionados (9:1 de Solução A: Solução B). A solução A era 50 mM Tris pH 10 e 13,6 mM ácido deoxicólico e a Solução B era 3 mg/ml de p-nitrofenil palmitato em isopropanol. A reação foi incubada a 40°C por 10 minutos e colocada em gelo, centrifugada para remover os esporos, e a absorbância em 420 nm foi registrada. Os resultados são mostrados na Tabela 27 abaixo. A atividade foi normalizada para a SEQ ID N°: 72 ligada à lipase. Tabela 27.
[00292] O uso das proteínas do exosporium das SEQ ID NOs. 72 e 73 resultou na maior atividade da enzima no esporo. Todas as proteínas de fusão contendo as proteínas do exosporium resultaram na exibição na superfície da lipase de Bacillus subtilis 168 ativo, embora em diferentes níveis.
[00293] Proteínas do exosporium adicionais foram demonstradas resultar no direcionamento das proteínas de fusão para o exosporium usando mCherry repórter fluorescente. Foram criados construtos de fusão que continham as proteínas do exosporium das SEQ ID NOs. 74, 83 e 73 ligadas ao repórter mCherry. Os esporos cresceram por 1,5 dia, foram coletados e ressuspendidos, conforme descrito acima. 7 μl de esporos fluorescentes foram colocados sob um microscópio Nikon E1000 e imageados durante a esporulação tardia. A localização circular em um anel é indicativa da localização da camada externa de esporos, e a aparência corresponde a de uma proteína do exosporium. Os resultados da microscopia fluorescente estão mostrados na Figura 2. As Fig. 2A, 2B e 2C são imagens de microscopia fluorescente de esporos expressando proteínas de fusão compreendendo as proteínas do exosporium das SEQ ID N°s: 74, 83 e 73, respectivamente, e o repórter mCherry. Todas as três fusões demonstraram altos níveis de fluorescência e localização do exosporium, demonstrando sua potencial utilidade para a expressão de proteínas estranhas na superfície do exosporium.
Exemplo 36. Uso de diversas sequências de direcionamento e proteínas de exosporium para expressar a fosfatase em esporos de Bacillus subtilis e efeitos dos esporos expressores da fosfatase em soja
[00294] Os esporos de BEMD que expressam a Fosfatase A4 (PhoA4) de Bacillus subtilis EE148 foram criados pela síntese gênica dos genes codificante de diversas sequências de direcionamento e proteínas do exosporium sob o controle de seus promotores nativos ligados à PhoA4. Os genes sintetizados foram clonados em pMK4 e introduzidos no Bacillus thuringiensis BT013A. Os esporos que exibem as diversas fusões de PhoA4 de Bacillus subtilis EE148 à proteína do exospo- rium foram feitos, cultivando-se as bactérias transformadas em caldo de infusão de cérebro e coração com pressão seletiva de 10 μg/ml de clo- ranfenicol, plaqueando em placas de ágar nutriente, e incubando a 30°C por três dias. Após três dias, os esporos foram lavados das placas, purificados por centrifugação e ressuspendidos em PBS a 1 X 108 UFC/ml.
[00295] A sojas foram plantadas com 2,54 cm de profundidade em potes fundos de 10 cm preenchidos com solo superficial de barro padrão. Os esporos de BEMD que expressam PhoA4 foram diluídos em uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados em cada planta na plantação. Um controle somente de água também foi incluído. Polifosfato foi adicionado aos potes em líquido numa taxa de 0,5 mg/pote. As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até saturação a cada três dias durante o ensaio de duas semanas. No final das duas semanas, a altura de cada planta foi medida, e as medições foram normalizadas para as plantas com somente controle de água.
[00296] Os resultados são mostrados na Tabela 28. A soja crescida na presença de esporos de BEMD que expressam proteínas de fusão contendo PhoA4 ligada a várias sequências de direcionamento e proteínas de exosporium com diferentes parceiros de fusão com PhoA4, todos exibiram crescimento potencializado, mas o grau do efeito variou dependendo da sequência de direiconamento ou proteína do exospo- rium usada. Tabela 28.
Exemplo 37. Co-aplicação de esporos de BEMD e tratamentos com sementes, fertilizantes líquidos e outros aditivos
[00297] Os esporos de BEMD que expressam proteínas de fusão foram testados para a compatibilidade com vários tratamentos com semente. Os esporos de BEMD expressaram proteínas de fusão compreendendo a sequência de direcionamento dos aminoácidos 1-35 da SEQ ID N°: 1 ligado a uma fosfatase (PhoA4) de Bacillus subtilis EE148 ou o peptídeo POLARIS. Os genes sintetizados foram clonados em pMK4 e introduzidos no Bacillus thuringiensis BT013A. Os esporos que exibem as diversas fusões de PhoA4 ou POLARIS de Bacillus subtilis EE148 à proteína do exosporium foram feitos, cultivando-se as bactérias transformadas em caldo de infusão de cérebro e coração com pressão seletiva de 10 μg/ml de cloranfenicol, plaqueando em placas de ágar nutriente, e incubando a 30°C por três dias. Após três dias, os esporos foram lavados das placas, purificados por centrifugação e ressuspendidos em PBS a 1 X 108 UFC/ml.
[00298] As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até saturação a cada três dias durante o ensaio de duas semanas. No final das duas semanas, a altura de cada planta foi medida, e as medições foram normalizadas para as plantas com somente controle de água. Os resultados são mostrados na Tabela 29 abaixo. Banho = aplicado no solo a 50 ml por pote. Polímero = somente polímero de re-vestimento de semente ACCELERON Esporos de BEMD foram adicionado a 1 x 104 células/50 ml para aplicações de banho. Os esporos de BEMD foram adicionados a 1,3 x10 4/células/semente para aplicações de revestimento de semente. 10-34-0 e 6-24-6 são composições de fertilizantes de iniciador comercial padrão. 10-34-0 é fosfato de amônio líquido. 6-24-6 é fertilizante de fosfato líquido com pouco sal com uma formulação orto/poli. Corante = agente corante de revestimento de semente vermelho Becker Underwood. MACHO, APRON e CRUISER são fungicidas comerciais usados em sementes. MACHO contém o ingrediente ativo imidacloprida, APRON contém o ingrediente ativo mefe- noxam, e CRUISER contém uma mistura dos ingredientes ativos tiame- toxam, mefenoxam e fludioxonil. Encontrou-se que os esporos eram compatíveis com muitas aplicações de semente e mantinham sua capacidade de estimular o crescimento da planta no milho. Tabela 29.
[00299] Encontrou-se que os esporos de BEMD eram compatíveis com todas as melhorias de revestimento de semente testadas. Houve uma ligeira diminuição na atividade quando os esporos de PhoA4 de BEMD foram combinados com o corante e polímero sozinhos, mas os esporos recuperaram a atividade completa com o corante em combinação com outros fungicidas. Os esporos de BEMD também funcionaram bem com os fertilizantes líquidos. Os fertilizantes de iniciador contribuíram para o crescimento da planta mais provavelmente através do complemento nutricional direto. Os esporos de BEMD funcionaram com ambos os fertilizantes de iniciador, sugerindo que a atividade da fosfatase ainda pode levar a um maior crescimento da planta na presença de excesso de nutrientes. As combinações de esporos de BEMD com fungicidas exibiram maiores aumentos no crescimento da planta do que os esporos de BEMd sozinhos, provavelmente devido à proteção dada às plantas de milho jovens durante o crescimento inicial.
Exemplo 38. Uso dos esporos de BEMD como uma adição foliar para reduzir o estresse da inibição do crescimento no milho
[00300] O sistema de exibição de esporos de BEMD pode ser usado para distribuir enzimas que possam aliviar um pouco do estresse do crescimento de plantas no campo ou estufa. Para realizar isto, foram selecionadas enzimas que agem seletivamente sobre espécies reativas de oxigênio no solo. As espécies reativas de oxigênio são um marcador chave do estresse nas plantas.
[00301] Os esporos de BEMD que expressam proteínas de fusão compreendendo a sequência de direcionamento dos aminoácidos 1-35 da SEQ ID N°: 1 ligados à quitosinase, superóxido dismutase, catalase, ou β1,3-glucanase de Bacillus thuringiensis BT013A foram gerados. Os genes sintetizados foram clonados em pMK4 e introduzidos no Bacillus thuringiensis BT013A. Os esporos que exibem as diversas fusões de proteína foram feitos, cultivando-se as bactérias transformadas em caldo de infusão de cérebro e coração com pressão seletiva de 10 μg/ml de cloranfenicol, plaqueando em placas de ágar nutriente, e incubando a 30°C por três dias. Após três dias, os esporos foram lavados das placas, purificados por centrifugação e ressuspendidos em PBS a 1 X 108 UFC/ml.
[00302] Plantas de milho de três semanas de idade no estágio V5 cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até a saturação a cada três dias durante o curso do ensaio. Conforme as plantas atingem V5, os esporos de BEMD ou produtos químicos de controle positivo foram pulverizados nas folhas tanto em 1 X 105 de esporos de BEMD/ml quanto nas taxas recomendadas para os produtos químicos. Um total de 1 ml de spray foi aplicado em cada planta individualmente. As alturas das plantas foram medidas logo antes da aplicação dos sprays foliares. As plantas de milho foram então estressadas, aquecendo-se a 32,2°C e diminuindo a rega em uma vez por semana. As plantas foram mantidas sob condições de estresse por duas semanas. No final das duas semanas, as alturas das plantas foram novamente medidas, e a aparência visual registrada. Sob essas condições de estresse, o crescimento da planta foi mínimo nos tratamentos controles. A capacidade de continuar a crescer sob condições de estresse foi medida por um aumento na altura da planta ao longo das duas semanas, em comparação ao controle somente de água. Os resultados são mostrados na tabela 30 abaixo. Tabela 30.
[00303] Várias enzimas desestressantes foram aplicadas ao milho usando o sistema de BEMD, como mostrado na Tabela 30 acima. Os esporos de controle não tiveram efeito significativo (diminuição da altura da planta de -1,6%. A enzima quitosinase de BEMD teve um efeito positivo quando combinada a seu substrato, a quitosana. As duas melhores enzimas no desempenho foram a β-1,3-glucanase de BEMD e superóxido dismutase de BEMD. A β-1,3-glucanase de BEMD tem uma atividade primariamente antifúngica, mas também pode ter efeitos diretos nas plantas. O ácido salicílico e BTH foram controles positivos para o ensaio foliar, e foram vistas respostas positivas para ambos. Este método de distribuição foliar pode ser usado para distribuir as enzimas desestressantes às plantas em diversos momentos da estação.
Exemplo 39. Níveis de expressão do proteínas de fusão usando vários promotores contendo Sigma-K
[00304] Conforme mostrado no Exemplo 23 acima, a substituição de um promotor nativo de uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium, pode afetar enormemente o nível da proteína de fusão expressa no exosporium de um esporo da família de Bacillus cereus. Por exemplo, a substituição do promotor BclA nativo pelo promotor BclB reduz enormemente o nível da proteína de fusão na superfície dos esporos do membro da família de Bacillus cereus. Alternativamente, a substituição do promotor BclB nativo pelo promotor BclA aumenta os níveis da proteína de fusão no exos- porium drasticamente.
[00305] Níveis de expressão do promotor relativo para várias proteínas do exosporium sob o controle de seus promotores de esporulação nativos foram obtidos a partir de dados de microarranjo de Bergman et al., 2008. Os níveis de expressão relativos foram determinados durante o tempo da esporulação tardia (300 minutos após o início do experimento), quando promotores sigma K são mais eficazes. Os promotores sigma K são promotores chave para a expressão de genes localizados no exosporium e proteínas associadas. A expressão relativa é o aumento do nível de expressão de um gene quando comparado à média de todos os outros genes do cromossomo em todos os momentos. A Tabela 31 abaixo mostra os níveis de expressão relativa de uma variedade de genes acionados por sigma K nos membros da família de Bacillus cereus. Tabela 31.
[00306] Tendo em conta o acima exposto, será visto que os vários objetos da invenção são obtidos e outros resultados vantajosos são alcançados.
[00307] Uma vez que várias mudanças podem ser feitas nas proteínas de fusão acima, membros da família de Bacillus cereus, formulações e métodos sem se desviar do escopo da invenção, pretende-se que todo o assunto contido na descrição acima e mostrado nas figuras acompanhantes sejam interpretados como ilustrativos e não em um sentido limitado.

Claims (7)

1. Método para proteger uma planta de um patogênio, carac-terizado pelo fato de que compreende a introdução de uma bactéria Bacillus recombinante que expressa uma proteína de fusão em um meio de crescimento de planta ou a aplicação de uma bactéria Bacillus re- combinante que expressa uma proteína de fusão a uma planta, uma semente de planta ou uma área ao redor de uma planta ou uma semente de planta, em que: a bactéria Bacillus recombinante compreende Bacillus an- thracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis, ou uma combinação dos mesmos, em que quando a bactéria Bacillus recombinante compreende Bacillus anthracis, o método compreende ainda a inativação da bactéria Bacillus recombinante antes da introdução no meio de crescimento da planta ou aplicação na planta, na semente da planta ou na área ao redor da planta ou da semente da planta; e a proteína de fusão compreende: (A) uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno, em que a proteína ou peptídeo é selecionado do grupo que consiste em: uma harpina, uma α-elastina, uma β-elastina, uma sis- temina, uma fenilalanina amônia-liase, uma elicitina, uma defensina, uma criptogeína, uma proteína flagelina, um peptídeo flagelina, uma bacteriocina, uma lisozima, um peptídeo de lisozima, um sideróforo, um peptídeo ativo não ribossomal, uma conalbumina, uma albumina, uma lactoferrina, um peptídeo de lactoferrina, TasA, uma toxina bacteriana inseticida, uma endotoxina, uma toxina Cry, uma proteína ou peptídeo inibidor de protease, uma quitinase, uma protease uma lactonase, uma β-1,3-glucanase, uma β-1,4-glucanase, uma β-1,6-glucanase, uma quitosinase, uma quitinase, uma enzima semelhante à quitosinase, uma liticase, uma peptidase, uma proteinase, um mutanolisina e uma estafo- lisina; e (B) uma sequência de direcionamento compreendendo: (a) aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1; (b) aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; (c) aminoácidos 22-31 da SEQ ID NO: 1; (d) aminoácidos 22-33 da SEQ ID NO: 1; (e) aminoácidos 20-31 da SEQ ID NO: 1; ou (f) a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; em que a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno está operacionalmente ligado à sequência de direcionamento; e em que as plantas cultivadas na presença da bactéria Bacillus recombinante são menos suscetíveis à infecção com o patógeno em comparação com as plantas cultivadas na ausência da bactéria Bacillus recombinante, nas mesmas condições.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão compreende ainda um ligante de aminoácidos entre a sequência de direcionamento, e a proteína ou pep- tídeo que protege uma planta de um patógeno; e em que o ligante com-preende: um ligante de polialanina, um ligante de poliglicina ou um li- gante compreendendo uma mistura de resíduos de alanina e glicina; ou um sítio de reconhecimento de protease.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo lisozima compreende LysM ou o peptídeo lactoferrina compreende LfcinB.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno compreende a β-1,3-glucanase.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno compreende: uma toxina bacteriana inseticida e a toxina bacteriana inseticida compreende uma toxina inseticida VIP; uma proteína ou peptídeo inibidor de protease e a proteína ou peptídeo inibidor de protease compreende um inibidor de tripsina ou um inibidor de protease em ponta de seta; uma toxina Cry e a toxina Cry compreende uma toxina Cry de Bacillus thuringiensis; ou uma lactonase e a lactonase compreende 1,4-lactonase, 2- pirona-4,6-dicarboxilato lactonase, 3-oxoadipato enol-lactonase, actino- micina lactonase, desoxilimonato A-anel-lactonase, gluconolactonase L-ramnono-1,4-lactonase, limonina-D-anel-lactonase, esteróide-lacto- nase, triacetato-lactonase ou xilono-1,4-lactonase.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: revestimento de sementes com a bactéria Bacillus recombi- nante ou uma formulação contendo a bactéria Bacillus recombinante antes do plantio; aplicar a bactéria ou formulação Bacillus recombinante a uma porção aérea de uma planta; ou introduzir a bactéria Bacillus recombinante no meio de crescimento da planta aplicando uma formulação líquida ou sólida contendo a bactéria Bacillus recombinante ao meio.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por introduzir a bactéria Bacillus recombinante no meio de crescimento vegetal ou aplicar a bactéria Bacillus recombinante à planta, a uma semente de planta ou à área ao redor da planta ou à semente de planta compreende a introdução ou aplicação da bactéria Bacillus recombi- nante em uma formulação que compreende a bactéria Bacillus recom- binante e um veículo agricolamente aceitável.
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