JP6517196B2 - 調整油 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１３年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６１／８８７，２６８号明細書；２０１３年１０月１７日に出願された同第６１／８９２，３９９号明細書；２０１３年１０月２４日に出願された同第６１／８９５，３５５号明細書；２０１４年１月３日に出願された同第６１／９２３，３２７号明細書；及び２０１４年７月１０日に出願された同第６２／０２３，１０９号明細書の利益を主張する。これらの出願の各々は、あらゆる目的から全体として参照により本明細書に援用される。本願は、２０１４年７月１０日に出願された「Ｎｏｖｅｌ Ｋｅｔｏａｃｙｌ ＡＣＰ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題される米国仮特許出願第６２／０２３，１１２号明細書（これもまた、本明細書によってあらゆる目的から全体として参照により援用される）に開示されるものに関する主題を含む。詳細には、米国仮特許出願第６２／０２３，１１２号明細書の表１、表７及び表８、並びに同明細書中に特定される対応する配列が、本明細書によって参照により援用される。
配列表の参照
本願は、本明細書に添付される配列表を含む。
本発明の実施形態は、油／脂肪、燃料、食品、及び油脂化学品並びに遺伝子操作された細胞の培養物からのそれらの生成に関する。特定の実施形態は、グリセロール骨格に特定の位置特異的パターンで脂肪酸アシル基を有するトリグリセリドの含有量が高い油、高度に安定した油、高濃度のオレイン酸又は中鎖脂肪酸を含む油、及びかかる油から生成される製品に関する。
国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６０３２号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１１号パンフレット、国際公開第２０１２／０６１６４７号パンフレット、及び国際公開第２０１２／１０６５６０号パンフレットは、油及びそうした油を微細藻類を含めた微生物で生成するための方法を開示している。これらの公報はまた、かかる油を使用した油脂化学品及び燃料の作製についても記載している。
テンパリングは、脂肪又は脂肪含有物質の温度を操作することにより脂肪を所望の多形形態に変換するプロセスであり、チョコレートの製造においてよく用いられる。
脂肪酸アシル−ＣｏＡ伸長経路のある種の酵素は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ分子の長さを伸ばす働きをする。エロンガーゼ複合酵素は脂肪酸アシル−ＣｏＡ分子を２炭素ずつ加えて伸ばし、例えばミリストイル−ＣｏＡからパルミトイル−ＣｏＡ、ステアロイル−ＣｏＡからアラキジル−ＣｏＡ、又はオレオイル−ＣｏＡからエイコサノイル−ＣｏＡ、エイコサノイル−ＣｏＡからエルシル−ＣｏＡに伸ばす。加えて、エロンガーゼ酵素はまたアシル鎖長も２炭素ずつ増やして伸ばす。ＫＣＳ酵素はアシル−ＣｏＡ分子をマロニル−ＣｏＡの２つの炭素と縮合させてβ−ケトアシル−ＣｏＡにする。ＫＣＳ及びエロンガーゼは、特定の炭素長、修飾（ヒドロキシル化など）、又は飽和度のアシル基質の縮合に対して特異性を示し得る。例えば、ホホバ（Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）のβ−ケトアシル−ＣｏＡ合成は、一価不飽和及び飽和Ｃ１８−及びＣ２０−ＣｏＡ基質に対する選択性によりトランスジェニック植物におけるエルカ酸の産生を上昇させることが実証されており（Ｌａｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１９９６，Ｖｏｌ ８（２），ｐｐ．２８１−２９２）、一方、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉの特異的エロンガーゼ酵素は、短鎖及び中鎖飽和ＣｏＡ基質の伸長に選択性を示す（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００６，Ｖｏｌ １２６（４），ｐｐ．６９１−９）。
ＩＩ型脂肪酸生合成経路は、可溶性タンパク質によって触媒される一連の反応を利用し、酵素間で中間体がアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）のチオエステルとしてやり取りされる。対照的に、Ｉ型脂肪酸生合成経路は単一の大型多官能性ポリペプチドを用いる。
油産生性の非光合成藻類であるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓは、栄養炭素供給が過剰な、しかし他の必須栄養素は制限されているために細胞分裂が阻害される場合の条件下で、多量のトリアシルグリセリド油を蓄える。最大Ｃ１８の炭素鎖長を有する脂肪酸のバルク生合成がプラスチドで起こる；次に脂肪酸が小胞体に輸送され、そこでＣ１８を越える伸長及びトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）への取り込みが（それが起こる場合には）起こると考えられている。脂質は脂肪体と呼ばれる大きい細胞質小器官に蓄えられ、環境条件が成長に有利に変化すると直ちに動員され、同化代謝のためのエネルギー及び炭素分子を提供する。
国際公開第２００８／１５１１４９号 国際公開第２０１１／１５０４１０号 国際公開第２０１１／１５０４１１号 国際公開第２０１２／０６１６４７号 国際公開第２０１２／１０６５６０号
Ｌａｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１９９６，Ｖｏｌ ８（２），ｐｐ．２８１−２９２ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００６，Ｖｏｌ １２６（４），ｐｐ．６９１−９
ある実施形態において、方法は、組換え細胞を培養する工程であって、細胞が、
（ｉ）配列番号４６〜４９のいずれかによってコードされる酵素と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を任意選択でコードする外来性ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ遺伝子と、配列番号１１、８７、８９、１５９、１６２又は１６３と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％の核酸配列同一性を有するタンパク質を任意選択でコードする少なくとも１つのＦＡＴＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子とを発現するか；
（ｉｉ）配列番号１２９〜１４７のいずれかと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％の配列同一性を有する窒素感受性プロモーターの制御下でＦＡＴＡ、ＦＡＴＢ、ＫＡＳＩ、ＫＡＳＩＩ、ＬＰＡＡＴ、ＳＡＤ、又はＦＡＤ２をコードする遺伝子を発現するか；又は
（ｉｉｉ）ＳＡＤ遺伝子、ＦＡＤ２遺伝子、及びＦＡＴＡ遺伝子のノックアウト又はノックダウンを有し、外来性Ｃ１８選択的ＦＡＴＡ遺伝子、オレオイル選択的ＬＰＡＡＴ遺伝子、及びＫＡＳＩＩ遺伝子を過剰発現する、工程と；
細胞から油を抽出する工程とを含む。
関連する実施形態において、細胞はタイプ（ｉｉ）のものであり、且つ配列番号１１、８７、８９、１５９、１６２又は１６３のいずれかと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％の核酸配列同一性を有するタンパク質を任意選択でコードする第２のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を少なくとも含む。油は少なくとも３０％のＣ１０：０及び少なくとも３０％のＣ１２：０を有し得る。油はＡＳＴＭ Ｄ４４５によって測定したとき４０℃で３０ｃＳ未満及び任意選択で２５ｃＳ±２０％の粘度を有し得る。Ｃ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸は２０％、１０％又は５％以内にバランスしていてもよい。
関連する実施形態において、細胞はタイプ（ｉｉｉ）の細胞であり、細胞油は少なくとも６０％のステアリン酸−オレイン酸−ステアリン酸（ＳＯＳ）を含む。任意選択で、Ｃ１８選択的ＦＡＴＡ遺伝子は、配列番号１５６と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードし、ＬＰＡＡＴ遺伝子は、配列番号１５７と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードし及び／又はＫＡＳＩＩ遺伝子は、配列番号１６０又は１６１と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードする。
任意選択で、細胞は微細藻であり、任意選択でＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅの微細藻、及び任意選択でＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻である。
関連する実施形態には、前述の方法の一つに従い製造される油、石鹸、油脂化学品、食料品、又は他の油由来製品がある。
本発明の実施形態において、方法は、油産生組換え細胞を培養する工程を含む。細胞は、ＦＡＭＥ ＧＣ／ＦＩＤ分析によって決定するとき少なくとも０．１のパルミトレイン酸対パルミチン酸比及び／又は０．５％以上のパルミトレイン酸レベルによって特徴付けられる脂肪酸プロフィールを有する油を産生する活性を有するパルミチン酸ＡＣＰ−デサチュラーゼ酵素をコードする外来遺伝子を含む。任意選択で、細胞は、油産生組換え真核微細藻の細胞である。
関連する実施形態において、外来遺伝子は、ＡＣＰ−パルミチン酸に対して不飽和化活性を有するパルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＰＡＤ）をコードする。任意選択で、外来性ＰＡＤ遺伝子は、ＡＣＰ−パルミチン酸に対する活性が増加したステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ変異体をコードする。変異体はＬ１１８Ｗ突然変異体であってもよい。遺伝子は、真核油産生微細藻で遺伝子産物を発現させる活性を有するプロモーター、プラスチド標的トランジットペプチド、及び５’ＵＴＲに作動可能に連結していてもよい。微細藻は、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅの微細藻、及び任意選択でＣｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻であってもよい。或いは、微細藻は、配列番号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオチド配列同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡを有する。
任意選択で、脂肪酸プロフィールは３．５％未満の飽和脂肪酸によってさらに特徴付けられる。任意選択で、細胞は乾燥細胞重量基準で少なくとも４０％の油となるまで培養される。任意選択で、微細藻は、内在性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのノックアウト又はノックダウン及び／又は外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子をさらに含む。これによって油中の飽和脂肪酸レベルを低減し得る。例えば、外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子を内因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのコード領域に挿入することができる。任意選択で、挿入されたＫＡＳＩＩ遺伝子は、内因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼと逆向きにされる。
これらの実施形態のいずれにおいても、油はショ糖上での微細藻の従属栄養培養によって生成することができ、微細藻は、それがショ糖を代謝することを可能にする外来性インベルターゼ遺伝子を含む。
油は回収されてもよい。回収された油は、フライ調理に又は加工食品の一成分として使用され得る。油は微細藻類ステロールプロフィールを有し得る。具体的な実施形態において、微細藻類ステロールプロフィールは、β−シトステロールと比べたエルゴステロールの過剰及び／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又はクリオナステロールの存在によって特徴付けられる。
別の実施形態において、方法は、油産生細胞、任意選択で微細藻を培養する工程を含み、それにより細胞は、１０％未満のパルミチン酸、８５％超のオレイン酸を有する油を産生する。任意選択で、細胞は、ＦＡＤ及びＦＡＴＡノックアウトを有する微細藻であり、外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子を発現する。
関連する実施形態において、方法は、油産生細胞、任意選択で微細藻を培養する工程を含み、それにより細胞は、ラウリン酸とミリスチン酸との合計が少なくとも５０％であり；総飽和脂肪酸が少なくとも５０％であり、且つカプリン酸及びラウリン脂肪酸レベルが２０％以内にバランスしており；又はカプリン酸が少なくとも４５％であり、且つラウリン酸が少なくとも４５％である脂肪酸プロフィールを有する油を産生する。具体的な関連実施形態において、ラウリン酸とミリスチン酸との合計は少なくとも６０％、７０％又は７５％である。任意選択で、細胞は外来性植物ＦＡＴＢ遺伝子を含む。任意選択で、細胞は外来性ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ遺伝子を含む。
油は回収されてもよい。回収された油は、フライ調理に又は加工食品の一成分として使用され得る。油は微細藻類ステロールプロフィールを有し得る。具体的な実施形態において、微細藻類ステロールプロフィールは、β−シトステロールと比べたエルゴステロールの過剰及び／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又はクリオナステロールの存在によって特徴付けられる。油は食料品又は化学品の作製に使用することができる。
別の実施形態において、方法は、油産生細胞、任意選択で微細藻を培養する工程を含み、それにより細胞は、１０％以下のリノレン酸及び２０％以上のリノール酸によって特徴付けられる脂肪酸プロフィールを有する油を産生する。細胞は、過剰発現するＫＡＳＩＩ遺伝子とＦＡＤ遺伝子置換とを含むことができる。任意選択で、細胞は、オレイン酸特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子を含むか、又は１つ以上のＦＡＴＡ対立遺伝子のノックアウトを、オレイン酸特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子と共に含む。ＦＡＤ遺伝子の過剰発現は、調節可能なプロモーターの環境制御によることができる。油は、回収して、食料品又は化学品の製造に使用することができる。油は微細藻類ステロールプロフィールを含み得る。
別の態様において、本発明は、トリグリセリド油の生成方法を提供し、ここでこの方法は、（ａ）窒素充満条件下で油産生細胞を培養する工程であって、それにより細胞の数を増加させる工程と、次に；（ｂ）窒素欠乏条件下で細胞を培養する工程であって、それにより細胞に乾燥細胞重量基準で少なくとも２０％までトリグリセリドを蓄積させる工程と（窒素充満条件下で活性及び窒素飢餓条件下で不活性なプロモーターであって、ｐＨ７．０と比較してｐＨ５．０でその活性の少なくとも半分を維持するプロモーターの制御下にあるＦＡＤｃ（ＦＡＤ２）対立遺伝子、任意選択で単独の対立遺伝子を含む）；（ｃ）油を得る工程であって、油が、窒素飢餓条件下におけるＦＡＤｃ遺伝子の下方調節に起因して減少したリノール酸を含む、工程とを含む。
一部の実施形態では、細胞はインベルターゼの存在下でショ糖を使用して６．５未満のｐＨで培養される。ある場合には、インベルターゼは細胞によって産生される。ある場合には、インベルターゼは、細胞が発現する外来遺伝子から産生される。
一部の実施形態では、得られる油は、３％、２％、１％、又は０．５％未満のリノール酸を含む脂肪酸プロフィールを有する。
一部の実施形態では、細胞は、リノール酸の変化を増幅させるためＦＡＤｃノックアウトをさらに含む。ある場合には、窒素充満条件と窒素飢餓条件との間でＦＡＤｃの転写物レベルは１０倍以上低下する。
別の態様において、本発明は、トリグリセリド細胞油の生成方法を提供し、この方法は、外来性ＦＡＴＢ遺伝子と外来性ＫＡＳＩ遺伝子とを含む組換え細胞を培養する工程を含み、ここでＫＡＳＩ遺伝子の発現によって、油は、ＦＡＴＢ遺伝子を有するがＫＡＳＩ遺伝子を有しない対照細胞と比べてより短鎖の分布を有する。
別の態様において、本発明は、配列番号９０若しくは９１と少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％のヌクレオチド同一性又は遺伝子コードの縮重に起因して等価な配列を有するか、或いは配列番号９０又は９１と少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％のアミノ酸同一性を有する酵素をコードするＦＡＴＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を含む組換え細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ＦＡＴＢ遺伝子の発現に起因して脂肪酸プロフィールがシフトしているトリグリセリドを産生する。
本発明のある実施形態には、油の生成方法がある。この方法は、遺伝子操作された微生物、任意選択で微細藻から細胞油を得る工程と、細胞油を分画してステアリン画分を生成する工程とを含む。ステアリン画分は、少なくとも７０％のＳＯＳを有してトリ飽和物が４％以下であるＴＡＧプロフィールと、ｓｎ−２位における最小９０％のオレイン酸によって特徴付けられるｓｎ−２プロフィールとによって特徴付けることができる。任意選択で、微生物は、過剰発現するＫＡＳＩＩ遺伝子、ＳＡＤノックアウト若しくはノックダウン、又は外来性Ｃ１８選択的ＦＡＴＡ遺伝子、外来性ＬＰＡＡＴ、及びＦＡＤ２ノックアウト若しくはノックダウンのうちの１つ以上を含む微細藻である。任意選択で、ステアリン画分は、コクムバターの等価な曲線と本質的に同一の、最大ヒートフロー温度又はＤＳＣで得られるＳＦＣ曲線を有する。分画は、ＯＯＳを除去する第１の温度、任意選択で約２４℃、及びトリ飽和物を除去する第２の温度、任意選択で約２９℃で行われる二段階分画であってもよい。
本発明の実施形態において、方法は、ＴＡＧプロフィールによって特徴付けられるトリグリセリド油を生成する。この方法は、ＫＡＳＩＩ遺伝子、外来性ＦＡＴＡ遺伝子及び外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子を過剰発現する油産生プラスチド宿主細胞を提供する工程と、油を産生させるため細胞を培養する工程と、油を分離する工程とを含み；ＴＡＧプロフィールは５０％超のＳＯＳ及び１０％未満のトリ飽和物を有する。
関連する実施形態において、細胞は、内在性ＳＡＤ２遺伝子のノックダウン又はノックアウト及び／又は内在性ＦＡＴＡ遺伝子のノックダウン又はノックアウトを含む。外来性ＦＡＴＡ遺伝子は、配列番号９２と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する機能性ＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードすることができる。外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子は、配列番号９３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する機能性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質をコードすることができる。任意選択で、宿主細胞は微細藻、任意選択でＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅの微細藻、及び任意選択でＣｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻であって、且つ任意選択で、配列番号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオチド配列同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡを有する微細藻であってもよい。
ある実施形態では、任意選択でＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅのもの、及び任意選択でＣｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属のものであって、且つ任意選択で、配列番号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオチド配列同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡを有する組換え微細藻類（ｍｉｃｒｏｌａｇａｌ）宿主細胞が、配列番号９２と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する機能性ＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来性ＦＡＴＡ遺伝子を発現する。
ある実施形態では、任意選択でＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅのもの、及び任意選択でＣｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属のものであって、且つ任意選択で、配列番号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオチド配列同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡを有する組換え微細藻類（ｍｉｃｒｏｌａｇａｌ）宿主細胞が、配列番号９３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する機能性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子を発現する。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
（ａ）組換え細胞を培養する工程であって、前記細胞が
（ｉ）配列番号４６〜４９のいずれかによってコードされる酵素と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を任意選択でコードする外来性ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ遺伝子と、配列番号１１、８７、８９、１５９、１６２又は１６３と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％の核酸配列同一性を有するタンパク質を任意選択でコードする少なくとも１つのＦＡＴＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子とを発現するか；
（ｉｉ）配列番号１２９〜１４７のいずれかと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％の配列同一性を有する窒素感受性プロモーターの制御下でＦＡＴＡ、ＦＡＴＢ、ＫＡＳＩ、ＫＡＳＩＩ、ＬＰＡＡＴ、ＳＡＤ、又はＦＡＤ２をコードする遺伝子を発現するか；又は
（ｉｉｉ）ＳＡＤ遺伝子、ＦＡＤ２遺伝子、及びＦＡＴＡ遺伝子のノックアウト又はノックダウンを有し、外来性Ｃ１８選択的ＦＡＴＡ遺伝子、オレオイル選択的ＬＰＡＡＴ遺伝子、及びＫＡＳＩＩ遺伝子を過剰発現する、工程と；
（ｂ）前記細胞から油を抽出する工程と
を含む方法。
（項目２）
前記細胞がタイプ（ｉ）の細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞が、配列番号１１、８７、８９、１５９、１６２又は１６３のいずれかと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％の核酸配列同一性を有するタンパク質を任意選択でコードする第２のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを少なくとも含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記油が少なくとも３０％のＣ１０：０及び少なくとも３０％のＣ１２：０を含む、項目２又は３に記載の方法。
（項目５）
前記油が、ＡＳＴＭ Ｄ４４５によって測定したとき４０℃で３０ｃＳ未満及び任意選択で２５ｃＳ±２０％の粘度を有する、項目２〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
Ｃ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸が２０％、１０％又は５％以内にバランスしている、項目２〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記細胞がタイプ（ｉｉｉ）の細胞である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記細胞油が少なくとも６０％のステアリン酸−オレイン酸−ステアリン酸（ＳＯＳ）を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
（ａ）前記Ｃ１８選択的ＦＡＴＡ遺伝子が、配列番号１５６と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードし、
（ｂ）前記ＬＰＡＡＴ遺伝子が、配列番号１５７と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードし；及び／又は
（ｃ）前記ＫＡＳＩＩ遺伝子が、配列番号１６０又は１６１と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードする、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞が微細藻、任意選択でＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅの微細藻、及び任意選択でＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻である、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
項目１〜１０のいずれか一項により製造される油、石鹸、油脂化学品、食料品、又は他の油由来製品。
（項目１２）
油産生組換え細胞、任意選択で油産生組換え真核微細藻のものを培養する工程を含む方法であって、前記細胞が、ＦＡＭＥ ＧＣ／ＦＩＤ分析によって決定するとき少なくとも０．１のパルミトレイン酸対パルミチン酸比及び／又は０．５％以上のパルミトレイン酸レベルによって特徴付けられる脂肪酸プロフィールを有する油を産生する活性を有するパルミチン酸ＡＣＰ−デサチュラーゼ酵素をコードする外来遺伝子を含む、方法。
（項目１３）
前記外来遺伝子が、ＡＣＰ−パルミチン酸に対して不飽和化活性を有するパルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＰＡＤ）をコードする、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記外来遺伝子が、ＡＣＰ−パルミチン酸に対する活性が増加したステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ変異体をコードする、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ変異体がＬ１１８Ｗ突然変異体である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記遺伝子が、真核油産生微細藻で遺伝子産物を発現させる活性を有するプロモーター、プラスチド標的トランジットペプチド、及び５’ＵＴＲに作動可能に連結している、項目１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記微細藻がＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅの微細藻、及び任意選択でＣｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記微細藻が、配列番号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオチド配列同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡを有する、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記脂肪酸プロフィールが３．５％未満の飽和脂肪酸によってさらに特徴付けられる、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞が乾燥細胞重量基準で少なくとも４０％の油となるまで培養される、項目１２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記微細藻が、内在性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのノックアウト又はノックダウン及び／又は外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子をさらに含む、項目１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記油が、内在性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのノックアウト又はノックダウン及び／又は外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子の結果として飽和脂肪酸量の減少を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子が前記内因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのコード領域に挿入される、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記挿入されたＫＡＳＩＩ遺伝子が前記内因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼと逆向きにされる、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記油がショ糖上での前記微細藻の従属栄養培養によって生成され、前記微細藻は、それがショ糖を代謝することを可能にする外来性インベルターゼ遺伝子を含む、項目１２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記油が、少なくとも９０％のオレイン酸、３％未満の飽和脂肪、及びリノール酸より多いオレイン酸を有する脂肪酸プロフィールを有する、項目１２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記油を回収する工程をさらに含む、項目１２〜２６のいずれか一項に記載の方法。（項目２８）
項目２７に記載の油をフライ調理に又は加工食品の一成分として使用する工程を含む方法。
（項目２９）
微細藻類ステロールプロフィールを含む、項目１〜２８のいずれか一項に記載の方法によって生成される油。
（項目３０）
前記微細藻類ステロールプロフィールが、β−シトステロールと比べたエルゴステロールの過剰及び／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又はクリオナステロールの存在によって特徴付けられる、項目２７に記載の油。
（項目３１）
油産生組換え細胞、任意選択で油産生組換え真核微細藻のものを培養する工程を含む方法であって、前記細胞が、２０％超のリノール酸及び１０％未満のリノレン酸を有する油を産生する、方法。
（項目３２）
前記細胞が、外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子及び／又はＦＡＴＡノックアウト又はノックダウンを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞が、任意選択で環境条件によって調節可能なプロモーターの制御下にある、過剰発現するＦＡＤ２遺伝子をさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記細胞がＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅの微細藻、及び任意選択でＣｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻であるか、又は配列番号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオチド配列同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡを有する、項目３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記細胞が乾燥細胞重量基準で少なくとも４０％の油となるまで培養される、項目３１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記細胞がショ糖で培養され、及び前記細胞が、前記細胞による前記ショ糖の代謝を可能にする外来性インベルターゼ遺伝子を含む、項目３１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記油を回収する工程をさらに含む、項目３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
微細藻類ステロールプロフィールを含む、項目３７に記載の方法によって生成される油。
（項目３９）
前記微細藻類ステロールプロフィールが、β−シトステロールと比べたエルゴステロールの過剰及び／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又はクリオナステロールの存在によって特徴付けられる、項目３８に記載の油。
（項目４０）
油産生細胞、任意選択で微細藻を培養する工程を含む方法であって、それにより細胞が、１０％未満のパルミチン酸、８５％超のオレイン酸、１％以下の多価不飽和脂肪酸、及び７％未満の飽和脂肪酸を有する油を産生する、方法。
（項目４１）
前記細胞が、ＦＡＤ及びＦＡＴＡノックアウトを有する微細藻であり、且つ外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子を発現する、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記細胞から前記油を抽出する工程をさらに含む、項目４０又は４１に記載の方法。
（項目４３）
項目４２に記載の方法によって生成される油。
（項目４４）
微細藻類ステロールプロフィールを含む、項目４３に記載の油。
（項目４５）
項目４３又は４４に記載の油から製造される食料品又は化学品。
（項目４６）
油産生細胞、任意選択で微細藻を培養する工程を含む方法であって、それにより前記細胞が、
（ａ）ラウリン酸とミリスチン酸との合計が少なくとも５０％であり；
（ｂ）総飽和脂肪酸が少なくとも５０％であり、且つカプリン酸及びラウリン脂肪酸レベルが２０％以内にバランスしており、
（ｃ）カプリン酸が少なくとも４５％であり、且つラウリン酸が少なくとも４５％である脂肪酸プロフィールを有する油を産生する、方法。
（項目４７）
ラウリン酸とミリスチン酸との合計が少なくとも６０％である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
ラウリン酸とミリスチン酸との合計が少なくとも７０％である、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
ラウリン酸とミリスチン酸との合計が少なくとも７５％である、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
前記細胞が外来性植物ＦＡＴＢ遺伝子を含む、項目４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記細胞が外来性ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ遺伝子を含む、項目４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記細胞から前記油を抽出する工程をさらに含む、項目４６〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
項目５２に記載の方法によって生成される油。
（項目５４）
微細藻類ステロールプロフィールを含む、項目５３に記載の油。
（項目５５）
項目５３又は５４に記載の油から製造される食料品又は化学品。
（項目５６）
油産生細胞、任意選択で微細藻を培養する工程を含む方法であって、それにより前記細胞が、１０％以下のリノレン酸及び２０％以上のリノール酸によって特徴付けられる脂肪酸プロフィールを有する油を産生する、方法。
（項目５７）
前記細胞が、過剰発現するＫＡＳＩＩ遺伝子と、ＦＡＤ遺伝子置換と、任意選択で、
（ａ）オレイン酸特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子とを含むか；又は
（ｂ）１つ以上のＦＡＴＡ対立遺伝子のノックアウトとを、オレイン酸特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子と共に含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記ＦＡＤ遺伝子の過剰発現が調節可能なプロモーターの環境制御による、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記細胞から前記油を抽出する工程をさらに含む、項目５６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
項目５９に記載の方法によって生成される油。
（項目６１）
微細藻類ステロールプロフィールを含む、項目６０に記載の油。
（項目６２）
項目６１又は６２に記載の油から製造される食料品又は化学品。
（項目６３）
トリグリセリド油の生成方法において、
（ａ）窒素充満条件下で油産生細胞を培養する工程であって、それにより細胞の数を増加させる工程と、次に；
（ｂ）窒素欠乏条件下で細胞を培養する工程であって、それにより細胞に乾燥細胞重量基準で少なくとも２０％までトリグリセリドを蓄積させる工程であって、窒素充満条件下で活性及び窒素飢餓条件下で不活性なプロモーターであって、ｐＨ７．０と比較してｐＨ５．０ではその活性の少なくとも半分を維持するプロモーターの制御下にあるＦＡＤｃ対立遺伝子、任意選択で単独の対立遺伝子を含む、工程と；
（ｃ）前記油を得る工程であって、前記油が、前記窒素飢餓条件下における前記ＦＡＤｃ遺伝子の下方調節に起因して減少したリノール酸を含む、工程と
を含む方法。
（項目６４）
前記細胞がインベルターゼの存在下でショ糖を使用して６．５未満のｐＨで培養される、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記インベルターゼが前記細胞によって産生される、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
前記インベルターゼが、前記細胞によって発現される外来遺伝子から産生される、項目６４又は６５に記載の方法。
（項目６７）
前記得られる油が、３％、２％、１％、又は０．５％未満のリノール酸を含む脂肪酸プロフィールを有する、項目６４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記細胞が、リノール酸の変化を増幅させるためＦＡＤｃノックアウトをさらに含む、項目６４〜６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
窒素充満条件と窒素飢餓条件との間でＦＡＤｃの転写物レベルが１０倍以上低下する、項目６４〜６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
外来性ＦＡＴＢ遺伝子と外来性ＫＡＳＩ遺伝子とを含む組換え細胞を培養する工程を含むトリグリセリド細胞油の生成方法であって、前記ＫＡＳＩ遺伝子の発現により、前記油が、前記ＦＡＴＢ遺伝子を有するが前記ＫＡＳＩ遺伝子を有しない対照細胞と比べてより短鎖の分布を有する、方法。
（項目７１）
配列番号９０又は９１と少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は８８％のヌクレオチド同一性又は遺伝子コードの縮重に起因して等価な配列を有するか、或いは配列番号９０又は９１と少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は８８％のアミノ酸同一性を有する酵素をコードするＦＡＴＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を含む組換え細胞。
（項目７２）
前記細胞が、前記ＦＡＴＢ遺伝子の発現に起因して脂肪酸プロフィールがシフトしているトリグリセリドを産生する、項目７１に記載の細胞。
（項目７３）
油を生成する方法であって、遺伝子操作された微生物、任意選択で微細藻から細胞油を得る工程と、前記細胞油を分画することにより、少なくとも７０％のＳＯＳを有してトリ飽和物が４％以下であるＴＡＧプロフィールと、ｓｎ−２位における少なくとも９０％のオレイン酸によって特徴付けられるｓｎ−２プロフィールとによって特徴付けられるステアリン画分を生成する工程とを含む方法。
（項目７４）
前記微生物が、過剰発現するＫＡＳＩＩ遺伝子、ＳＡＤノックアウト若しくはノックダウン、又は外来性Ｃ１８選択的ＦＡＴＡ遺伝子、外来性ＬＰＡＡＴ、及びＦＡＤ２ノックアウト若しくはノックダウンのうちの１つ以上を含む微細藻である、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記ステアリン画分が、コクムバターの等価な曲線と本質的に同一の、最大ヒートフロー温度又はＤＳＣで得られるＳＦＣ曲線を有する、項目７３又は７４に記載の方法。
（項目７６）
前記分画が、ＯＯＳを除去する第１の温度、任意選択で約２４℃、及びトリ飽和物を除去する第２の温度、任意選択で約２９℃で実施される二段階分画である、項目７３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
ＴＡＧプロフィールによって特徴付けられるトリグリセリド油の生成方法であって、（ａ）ＫＡＳＩＩ遺伝子、外来性ＦＡＴＡ遺伝子及び外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子を過剰発現する油産生プラスチド宿主細胞を提供する工程と、（ｂ）前記油を産生させるため前記細胞を培養する工程と、（ｃ）前記油を分離する工程とを含み、それらからなり、又はそれらから本質的になる方法において、前記ＴＡＧプロフィールが５０％超のＳＯＳ及び１０％未満のトリ飽和物を有する、方法。
（項目７８）
前記細胞が内在性ＳＡＤ２遺伝子のノックダウン又はノックアウトをさらに含む、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記細胞が内在性ＦＡＴＡ遺伝子のノックダウン又はノックアウトをさらに含む、項目７７又は７８に記載の方法。
（項目８０）
前記外来性ＦＡＴＡ遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する機能性ＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする、項目７７〜７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子が、配列番号９３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する機能性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする、項目７７〜８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記宿主細胞が微細藻、任意選択でＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅの微細藻、及び任意選択でＣｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻であって、且つ任意選択で、配列番号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオチド配列同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡを有する微細藻である、項目７７〜８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
任意選択でＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅのもの、及び任意選択でＣｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属のものであって、且つ任意選択で、配列番号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオチド配列同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡを有する組換え微細藻類（ｍｉｃｒｏｌａｇａｌ）宿主細胞であって、配列番号９２と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する機能性ＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来性ＦＡＴＡ遺伝子を発現する宿主細胞。
（項目８４）
任意選択でＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅのもの、及び任意選択でＣｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属のものであって、且つ任意選択で、配列番号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオチド配列同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡを有する組換え微細藻類（ｍｉｃｒｏｌａｇａｌ）宿主細胞であって、配列番号９３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する機能性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子を発現する宿主細胞。
本発明のこれら及び他の態様及び実施形態を、添付の図面（その簡単な説明がこの直後に続く）、本発明の詳細な説明、及び例に説明及び／又は例示する。上記に及び本願全体を通じて考察される特徴はいずれも、本発明の様々な実施形態において組み合わせることができる。
実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例５で考察するとおりの、抗酸化剤濃度に応じた種々の油の安定性を示す。 本発明の実施形態における超低濃度の多価不飽和脂肪酸を含む細胞油の様々な特性を示す。 以下のとおりの様々な油に関するパーセント固形脂肪含有量のプロットを示す：（ａ）脂質経路を操作していないＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＲＢＤ油；（ｂ）ブラジル産ココアバター＋２５％乳脂肪；（ｃ）ＴＡＧプロフィールにおけるオレイン酸の低下及びステアリン酸の増加のためＳＡＤ対立遺伝子のレベルを低下させるヘアピン核酸を発現する株からのＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＲＢＤ油の３つのレプリケート；（ｄ）内因性ＯＴＥ（オレオイルアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、実施例４５を参照）を過剰発現する株からのＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＲＢＤ油；（ｅ）マレーシア産ココアバター＋２５％乳脂肪；及び（ｆ）マレーシア産ココアバター。ココアバター及びココアバター乳脂肪の値は文献値である（Ｂａｉｌｅｙ’ｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｏｉｌｓ ａｎｄ Ｆａｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，６ｔｈ ｅｄ．）。 大豆メチルエステル対照サンプルと比較した、従属栄養成長させた油産生微細藻類から調製した高オレイン酸（ＨＯ）及び高安定性高オレイン酸（ＨＳＡＯ）トリグリセリド油から調製したメチル化油に対して行った熱安定性試験の結果を示す。 高オレイン酸及び高安定性高オレイン酸藻類油の様々な特性を示す。 フラスコ及び発酵槽バイオマスからの株Ｋ−４油、株ＡＵ油及び株ＡＶ油のＴＡＧ組成を示す。Ｌａ＝ラウリン酸塩（Ｃ１２：０）、Ｍ＝ミリスチン酸塩（Ｃ１４：０）、Ｐ＝パルミチン酸塩（Ｃ１６：０）、Ｐｏ＝パルミトレイン酸塩（Ｃ１６：１）、Ｓ＝ステアリン酸塩（Ｃ１８：０）、Ｏ＝オレイン酸塩（Ｃ１８：１）、Ｌ＝リノール酸塩（Ｃ１８：２）、Ｌｎ＝α−リノレン酸塩（Ｃ１８：３）、Ａ＝アラキジン酸塩（Ｃ２０：０）、Ｂ＝ベヘン酸塩（Ｃ２２：０）、Ｌｇ＝リグノセリン酸塩（Ｃ２４：０）、Ｈｘ＝ヘキサコサン酸塩（Ｃ２６：０） Ｓ−Ｓ−Ｓは、３つ全ての脂肪酸が飽和しているＴＡＧの合計を指す。バーの各ブロックにおいて、株は図の下部に示す順序で示される。 振盪フラスコバイオマスからの株ＡＷ油、株ＡＸ油及び株ＡＹ油のＴＡＧ組成を示す。Ｌａ＝ラウリン酸塩（Ｃ１２：０）、Ｍ＝ミリスチン酸塩（Ｃ１４：０）、Ｐ＝パルミチン酸塩（Ｃ１６：０）、Ｐｏ＝パルミトレイン酸塩（Ｃ１６：１）、Ｓ＝ステアリン酸塩（Ｃ１８：０）、Ｏ＝オレイン酸塩（Ｃ１８：１）、Ｌ＝リノール酸塩（Ｃ１８：２）、Ｌｎ＝α−リノレン酸塩（Ｃ１８：３）、Ａ＝アラキジン酸塩（Ｃ２０：０）、Ｂ＝ベヘン酸塩（Ｃ２２：０）、Ｌｇ＝リグノセリン酸塩（Ｃ２４：０）、Ｈｘ＝ヘキサコサン酸塩（Ｃ２６：０）。Ｓ−Ｓ−Ｓは、３つ全ての脂肪酸が飽和しているＴＡＧの合計を指す。バーの各ブロックにおいて、株は図の下部に示す順序で示される。 実施例５２で考察するとおりの遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株からの精製、漂白及び脱臭したミリスチン酸リッチな油の脂肪酸プロフィール及び固形脂肪含有量を示す。 株Ｚで発現した異種ＦＡＥタンパク質のペアワイズアラインメントを示す。 ＦＡＤ２／ＦＡＤｃ及びＦＡＴＡの二重ノックアウトを作製するための微細藻類株の遺伝子改変を示す。
Ｉ．定義
「対立遺伝子」は、生物が同じ染色体上であっても複数の類似した又は同一の遺伝子コピーを有する遺伝子のコピーを指す。対立遺伝子は同じ又は類似したタンパク質をコードし得る。
脂肪酸プロフィール中の２つの脂肪酸に関連して、「バランスしている」は、２つの脂肪酸がそれらの平均面積パーセントの規定の割合の範囲内であることを意味するものとする。従って、ｘ％の存在量の脂肪酸ａ及びｙ％の存在量の脂肪酸ｂに関して、脂肪酸は、｜ｘ−（（ｘ＋ｙ）／２）｜及び｜ｙ−（（ｘ＋ｙ）／２）｜が≦１００（ｚ）であるならば、「ｚ％以内にバランスしている」。
「細胞油」又は「細胞脂肪」は、生物から得られる主にトリグリセリドの油を意味するものとし、ここでこの油は、トリグリセリドの脂肪酸プロフィールを実質的に変えるような別の天然油若しくは合成油とのブレンド、又は分画を受けていない。特定の位置特異性のトリグリセリドを含む油に関連して、細胞油又は細胞脂肪は、当該の位置特異的トリグリセリドプロフィールを得るためのエステル交換又は他の合成プロセスに供されておらず、むしろ位置特異性は細胞又は細胞集団によって自然に生じる。細胞によって産生される細胞油について、油のステロールプロフィールは、概して、細胞油を模倣するためステロールを添加することによる油の人工的な再構成によるのでなく、細胞が産生するステロールによって決定される。細胞油又は細胞脂肪に関連して、及び概して本開示全体を通じて使用されるとき、油及び脂肪という用語は、特に注記される場合を除き同義的に使用される。従って、「油」又は「脂肪」は、物質の組成及び他の条件に応じて室温で液体、固体、又は一部固体であり得る。ここで、用語「分画」は、どのように達成するにしても、生物が産生するプロフィールと比べて油の脂肪酸プロフィールを変化させる形で油から材料を取り出すことを意味する。用語「細胞油」及び「細胞脂肪」は、生物から得られるかかる油を包含し、ここで油は、精製、漂白及び／又は脱ガムを含めた、そのトリグリセリドプロフィールを実質的に変化させることのない最小限の処理を受けている。細胞油はまた、「非エステル交換細胞油」であってもよく、これは、脂肪酸がグリセロールに対するそのアシル結合において再分布されたプロセスをその細胞油が受けておらず、生物から回収したときと本質的に同じ配置のままであることを意味する。
「外来遺伝子」は、細胞に（例えば形質転換／トランスフェクションによって）導入されたＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現をコードする核酸を意味するものとし、「導入遺伝子」とも称される。外来遺伝子を含む細胞は、組換え細胞と称することができ、そこにさらなる外来遺伝子が導入され得る。外来遺伝子は、形質転換される細胞と異なる種由来（従って異種）であってもよく、又は同じ種由来（従って同種）であってもよい。このように、外来遺伝子には、遺伝子の内在性コピーと比べて細胞のゲノムにおいて異なる位置を占めるか、又は異なる制御下にある同種遺伝子が含まれ得る。外来遺伝子は細胞に２つ以上のコピーで存在してもよい。外来遺伝子は、ゲノム（核又はプラスチド）への挿入として、又はエピソーム分子として細胞に維持され得る。
「ＦＡＤｃ」は、「ＦＡＤ２」とも称され、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼをコードする遺伝子である。
「脂肪酸」は、グリセロ脂質中の遊離脂肪酸、脂肪酸塩、又は脂肪酸アシル部分を意味するものとする。グリセロ脂質の脂肪酸アシル基は、トリグリセリドが加水分解又は鹸化されるときに生成されるカルボン酸又はカルボン酸の陰イオンの観点で記載され得ることが理解されるであろう。
「固定炭素源」は、炭素を含有する分子、典型的には有機分子であり、そこで培養される微生物によって利用され得る培養培地中に周囲温度及び圧力で固体又は液体の形態で存在する。従って、二酸化炭素は固定炭素源ではない。
「作動可能に連結している」は、制御配列（典型的にはプロモーター）及び連結された配列（典型的にはタンパク質をコードする配列、コード配列とも称される）など、２つの核酸配列間の機能的な連結である。プロモーターは、それが遺伝子の転写を仲介することができる場合、外来遺伝子と作動可能に連結している。
「微細藻類」は、葉緑体又は他のプラスチドを含有する、場合により光合成を行うことが可能な真核微生物、又は光合成を行うことが可能な原核微生物である。微細藻類には、固定炭素源をエネルギーとして代謝することができない偏性光独立栄養生物、並びに唯一固定炭素源で生存し得る従属栄養生物が含まれる。微細藻類には、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓなどの、細胞分裂直後に姉妹細胞から分離する単細胞生物、並びに、例えばＶｏｌｖｏｘなどの、２つの別個の細胞型の単純な多細胞光合成微生物である微生物が含まれる。微細藻類には、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａなどの細胞が含まれる。微細藻類にはまた、Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ、及びＰｙｒｏｂｏｔｒｙｓなどの細胞間接着を呈する他の光合成微生物も含まれる。微細藻類はまた、特定の渦鞭毛藻類種及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種など、光合成を行う能力を失った偏性従属栄養微生物も含まれる。
脂肪酸長さに関連して、「中鎖」は、Ｃ８〜Ｃ１６脂肪酸を意味するものとする。
組換え細胞に関連して、用語ノックダウンは、遺伝子によりコードされるタンパク質の産生又は活性の点で部分的に（例えば約１〜９５％）抑制されている遺伝子を指す。
また、組換え細胞に関連して、用語ノックアウトは、遺伝子によりコードされるタンパク質の産生又は活性の点で完全に又はほぼ完全に（例えば＞９５％）抑制されている遺伝子を指す。ノックアウトは、コード配列への非コード配列の相同組換え、遺伝子欠失、突然変異又は他の方法により調製することができる。
「油産生」細胞は、天然に、又は組換えの若しくは古典的な株改良によって、乾燥細胞重量基準で少なくとも２０％の脂質を産生する能力を有する細胞である。「油産生微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」又は「油産生微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」は、微細藻を含め、油産生性の微生物（特に、脂質を蓄える真核微細藻）である。油産生細胞はまた、その脂質又は他の含有分の一部又は全てが取り除かれた細胞、並びに生細胞及び死細胞のいずれも包含する。
「規則性油（ｏｒｄｅｒｅｄ ｏｉｌ）」又は「規則性脂肪（ｏｒｄｅｒｅｄ ｆａｔ）」は、主として所与の多形構造である結晶を形成するものである。例えば、規則性油又は規則性脂肪は、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％超がβ又はβ’多形形態である結晶を有し得る。
細胞油に関連して、「プロフィール」は、油中の特定の種又はトリグリセリド又は脂肪酸アシル基の分布である。「脂肪酸プロフィール」は、グリセロール骨格との結合に関係なく、油のトリグリセリド中の脂肪酸アシル基の分布である。脂肪酸プロフィールは、典型的には、実施例１のように、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）への変換と、続く水素炎イオン化検出（ＦＩＤ）によるガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によって決定される。脂肪酸プロフィールは、ある脂肪酸の曲線下面積から求めた全脂肪酸シグナルに対する当該の脂肪酸の１つ以上の百分率として表すことができる。ＦＡＭＥ−ＧＣ−ＦＩＤ計測値は、脂肪酸の重量百分率を概算する。「ｓｎ−２プロフィール」は、油中のトリアシルグリセリドのｓｎ−２位に見られる脂肪酸の分布である。「位置特異的プロフィール」は、立体特異性に関係なく、グリセロール骨格に対するアシル基結合の位置に関するトリグリセリドの分布である。換言すれば、位置特異的プロフィールは、ｓｎ−１／３と、対するｓｎ−２とにおけるアシル基結合を表す。従って、位置特異的プロフィールでは、ＰＯＳ（パルミチン酸塩−オレイン酸塩−ステアリン酸塩）及びＳＯＰ（ステアリン酸塩−オレイン酸塩−パルミチン酸塩）は同じものとして扱われる。「立体特異的プロフィール」は、ｓｎ−１、ｓｎ−２及びｓｎ−３におけるアシル基の結合を表す。特に指示されない限り、ＳＯＰ及びＰＯＳなどのトリグリセリドは同等と見なされる。「ＴＡＧプロフィール」は、結合の位置特異的な性質に関係なく、グリセロール骨格との結合に関してトリグリセリドに見られる脂肪酸の分布である。従って、ＴＡＧプロフィールでは、油中のＳＳＯの百分率はＳＳＯとＳＯＳとの合計であり、一方、位置特異的プロフィールでは、油中のＳＯＳ種を含めない、ＳＳＯの百分率が計算される。ＦＡＭＥ−ＧＣ−ＦＩＤ分析の重量百分率と対照的に、トリグリセリドの割合は、典型的にはモル百分率、すなわちＴＡＧ混合物中における所与のＴＡＧ分子の百分率として提供される。
用語「パーセント配列同一性」は、２つ以上のアミノ酸配列又は核酸配列との関連では、配列比較アルゴリズムを使用した又は目視検査による計測で最大の一致となるように比較及びアラインメントしたとき同じであるか、又は同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを特定の割合だけ有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセントヌクレオチド又はアミノ酸同一性を決定する配列比較では、典型的には一方の配列が参照配列として働き、それと試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列がコンピュータに入力され、必要であれば部分配列の座標が指定され、及び配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次に配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づき、１つ又は複数の試験配列について参照配列と比べたパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列の最適アラインメントは、デフォルトパラメータに設定したＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を使用して実行することができる。例えば、２つの核酸配列の比較には、以下のデフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツール、バージョン２．０．１２（２０００年４月２１日）でｂｌａｓｔｎを使用し得る：行列：ＢＬＯＳＵＭ６２；マッチに対するリワード：１；ミスマッチに対するペナルティ：−２；開始ギャップ：５及び伸長ギャップ：２ペナルティ；ギャップｘドロップオフ：５０；期待値：１０；ワードサイズ：１１；フィルタ：オン。２つのアミノ酸配列のペアワイズ比較には、例えば以下のデフォルトパラメータに設定したｂｌａｓｔｐで「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツール、バージョン２．０．１２（２０００年４月２１日）を使用し得る：行列：ＢＬＯＳＵＭ６２；開始ギャップ：１１及び伸長ギャップ：１ペナルティ；ギャップｘドロップオフ５０；期待値：１０；ワードサイズ：３；フィルタ：オン。
「組換え」は、外来核酸の導入又は天然核酸の変化によって改変された細胞、核酸、タンパク質又はベクターである。従って、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞中には見られない遺伝子を発現し、又は当該の遺伝子が非組換え細胞によって発現する場合とは異なる形で天然遺伝子を発現することができる。組換え細胞には、限定なしに、遺伝子産物をコードするか、又は細胞中の活性遺伝子産物レベルを低下させる抑制エレメント、例えば突然変異、ノックアウト、アンチセンス、干渉性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）又はｄｓＲＮＡをコードする組換え核酸が含まれ得る。「組換え核酸」は、概して、例えばポリメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、及びエンドヌクレアーゼを使用した、化学合成を使用した核酸の操作により、当初インビトロで形成される核酸であるか、又はその他の天然では通常見られない形態である。組換え核酸は、例えば、２つ以上の核酸を作動可能に連結した状態に置くために作製されてもよい。従って、天然では通常つながっていないＤＮＡ分子をライゲートすることによりインビトロで形成される単離核酸又は発現ベクターは、両方とも、本発明の目的上組換えと見なされる。組換え核酸は、それを作製して宿主細胞又は生物に導入した後、宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製し得る；しかしながら、かかる核酸は組換え産生後、続いて細胞内で複製されるが、それでもなお本発明の目的上組換えと見なされる。同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技術を用いて、すなわち組換え核酸の発現によって作製されたタンパク質である。
用語「トリグリセリド」、「トリアシルグリセリド」及び「ＴＡＧ」は、当該技術分野において周知されているとおり同義的に使用される。
ＩＩ．概要
本発明の例示的な実施形態は、グリセロ脂質における変化した脂肪酸プロフィール及び／又は変化した脂肪酸位置特異的分布を生じる油産生細胞、及びその細胞から生成される生成物を特徴とする。油産生細胞の例としては、プラスチド油産生細胞、例えば油産生藻類のものを含めた、ＩＩ型脂肪酸生合成経路を有する微生物細胞、並びに該当する場合には、限定はされないが市販の油糧種子作物、例えば、大豆、トウモロコシ、菜種／キャノーラ、綿、アマ、ヒマワリ、ベニバナ及びピーナッツを含めた高等植物の油生成細胞が挙げられる。細胞の他の具体的な例としては、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｔｙａ門、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｔａｅ綱、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ目、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａｃａｅ科の従属栄養又は偏性従属栄養微細藻類が挙げられる。油産生微細藻類及び培養方法の例はまた、偏性従属栄養生物を含む属であるＣｈｌｏｒｅｌｌａ属及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種を含め、国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６０３２号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレット、及び国際公開第２０１１／１５０４１１号パンフレットにも提供される。油産生細胞は、例えば、細胞重量基準で２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、又は約９０％±５％の油を産生する能力を有し得る。場合により、産生される油は、高度不飽和脂肪酸、例えばＤＨＡ又はＥＰＡ脂肪酸が低くてもよい。例えば、油は、５％、２％、又は１％未満のＤＨＡ及び／又はＥＰＡを含み得る。上述の公報はまた、かかる細胞を培養して油を、特に微細藻類細胞から抽出する方法も開示している；かかる方法は本明細書に開示される細胞に適用することができ、これらの教示について参照により援用される。微細藻類細胞が使用される場合、それらは独立栄養で培養するか（偏性従属栄養生物でない限り）又は暗所で糖（例えば、グルコース、フルクトース及び／又はショ糖）を使用して培養することができる。本明細書に記載される任意の実施形態において、細胞は、細胞によるショ糖原料からの油の産生を可能にするため外来性インベルターゼ遺伝子を含む従属栄養細胞であってもよい。それに代えて、又は加えて、細胞はセルロース系原料からキシロースを代謝することができる。例えば、活性キシロース輸送体、キシルロース−５−リン酸輸送体、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ及びキシロースレダクターゼをコードする遺伝子など、１つ以上のキシロース代謝遺伝子を発現するように細胞を遺伝子操作することができる。キシロースを利用する遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株の開示を含め、２０１２年１１月１５日に公開された国際公開第２０１２／１５４６２６号パンフレット、「ＧＥＮＥＴＩＣＡＬＬＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ ＴＨＡＴ ＭＥＴＡＢＯＬＩＺＥ ＸＹＬＯＳＥ」を参照のこと。
油産生細胞は、任意選択で、バイオリアクター／発酵槽で培養されてもよい。例えば、従属栄養油産生微細藻類細胞は、糖含有栄養ブロスで培養することができる。任意選択で、培養は二段階：シード段階及び脂質産生段階で進めることができる。シード段階では、細胞数がスターター培養物から増加する。従って、シード段階は、典型的には、急速な細胞分裂を促進するように設計された栄養リッチな窒素充満培地を含む。シード段階後、栄養制限（例えば窒素希薄）条件下で細胞に糖が供給されてもよく、これにより糖がトリグリセリドに変換されることになる。例えば、脂質産生段階における細胞分裂速度はシード段階と比べて５０％、８０％以上低下し得る。加えて、シード段階と脂質産生段階との間での培地の変動によって組換え細胞が誘導され、異なる脂質合成遺伝子が発現することにより、産生されるトリグリセリドが変化し得る。例えば、以下で考察するとおり、内在性又は外来性遺伝子の前に窒素感受性及び／又はｐＨ感受性プロモーターを置くことができる。これは、シード段階における細胞の最適成長を支持しない脂質産生段階で油が産生されるべきである場合に特に有用である。以下の例では、細胞は脂肪酸デサチュラーゼをｐＨ感受性プロモーターと共に有し、従って脂質産生段階ではリノール酸が低い油が産生される一方、シード段階中には細胞分裂に十分なリノール酸を有する油が産生される。得られる低リノール酸油は酸化安定性が極めて高い。
油産生細胞は、脂肪酸生合成酵素をコードする１つ以上の外来遺伝子を発現する。結果として、一部の実施形態は、非植物油若しくは非種子油からは得ることのできなかった、又は全く得ることのできなかった細胞油を特徴とする。
油産生細胞（任意選択で微細藻類細胞）は、ＵＶ及び／又は化学的突然変異誘発と、続く化学的又は生化学的毒素での選択を含めた、環境条件下でのスクリーニング又は選択など、古典的な株改良技術によって改良することができる。例えば細胞は、脂肪酸合成阻害薬、糖代謝阻害薬、又は除草剤で選択することができる。選択の結果として、糖での収率が高い株、油産生（例えば、細胞容積、乾燥重量、又は細胞培養物１リットルの割合として）が多い株、又は脂肪酸若しくはＴＡＧプロフィールが改良された株を得ることができる。
例えば、細胞は、１，２−シクロヘキサンジオン；１９−酢酸ノルエチンドロン（ｎｏｒｅｔｈｉｎｄｏｎｅ）；２，２−ジクロロプロピオン酸；２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸；２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、メチルエステル；２，４−ジクロロフェノキシ酢酸；２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ブチルエステル；２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、イソオクチルエステル；２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、メチルエステル；２，４−ジクロロフェノキシ酪酸；２，４−ジクロロフェノキシ酪酸、メチルエステル；２，６−ジクロロベンゾニトリル；２−デオキシグルコース；５−テトラデシルオキシ−ｗ−フロ酸；Ａ−９２２５００；アセトクロル；アラクロル；アメトリン；アムホテリシン；アトラジン；ベンフルラリン；ベンスリド；ベンタゾン；ブロマシル；ブロモキシニル；カフェンストロール；カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）；カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）；セルレニン；クロルプロファム；クロルスルフロン；クロフィブリン酸；クロピラリド；コルヒチン；シクロエート；シクロヘキサミド；Ｃ７５；ＤＡＣＴＨＡＬ（テトラクロロテレフタル酸ジメチル）；ジカンバ；ジクロロプロップ（（Ｒ）−２−（２，４−ジクロロフェノキシ）プロパン酸）；ジフルフェニカン；ジヒドロジャスモン酸（ｄｉｈｙｒｏｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、メチルエステル；ジクワット；ジウロン；ジメチルスルホキシド；没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）；エンドサル；エタルフルラリン；エタノール；エトフメセート；フェノキサプロップ−ｐ−エチル；フルアジホップ−ｐ−ブチル；フルオメツロン；ホメサフェン（ｆｏｍａｓｅｆｅｎ）；ホラムスルフロン；ジベレリン酸；グルホシネートアンモニウム；グリホセート；ハロキシホップ；ヘキサジノン；イマザキン；イソキサベン；リパーゼ阻害薬ＴＨＬ（（−）−テトラヒドロリプスタチン）；マロン酸；ＭＣＰＡ（２−メチル−４−クロロフェノキシ酢酸）；ＭＣＰＢ（４−（４−クロロ−ｏ−トリルオキシ）酪酸）；メソトリオン；ジヒドロジャスモン酸メチル；メトラクロル；メトリブジン；ミルドロネート（Ｍｉｌｄｒｏｎａｔｅ）；モリナート；ナプタラム；ノルハルマン；オルリスタット；オキサジアゾン；オキシフルオルフェン；パラコート；ペンジメタリン；ペンタクロロフェノール；ＰＦ−０４６２０１１０；フェネチルアルコール；フェンメジファム；ピクロラム；プラテンシン；プラテンシマイシン；プロメトン；プロメトリン；プロナミド；プロパクロル；プロパニル；プロパジン；ピラゾン；キザロホップ−ｐ−エチル；ジプロピルチオカルバミン酸Ｓ−エチル（ＥＰＴＣ）；Ｓ，Ｓ，Ｓ−トリブチルホスホロトリチオエート；サリチルヒドロキサム酸；セサモール；シデュロン；メタンアルソン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔｈａｎｅ ａｒｓｅｎａｔｅ）；シマジン；Ｔ−８６３（ＤＧＡＴ阻害薬）；テブチウロン；テルバシル；チオベンカルブ；トラルコキシジム；トリアレート；トリクロピル；トリクロサン；トリフルラリン；及びブルピン酸の１つ以上で選択することができる。
油産生細胞は貯蔵油を産生し、貯蔵油は主としてトリアシルグリセリドであり、細胞の貯蔵体に貯蔵され得る。生油は、細胞から、細胞を破壊して油を分離することにより得られ得る。生油は、細胞によって産生されるステロールを含み得る。国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６０３２号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレット、及び国際公開第２０１１／１５０４号パンフレットが、油産生微細藻類についての従属栄養培養及び油分離技術を開示している。例えば、細胞を提供又は培養し、乾燥させてプレスすることにより、油を得ることができる。生成された油は、当該技術分野において公知のとおり、又は国際公開第２０１０／１２０９３９号パンフレットに記載されるとおり、精製、漂白、及び脱臭（ＲＢＤ）され得る。この生油又はＲＢＤ油は、様々な食品、化学及び工業製品又はプロセスに使用され得る。かかる処理の後であっても、油は供給源に特有のステロールプロフィールを維持し得る。微細藻類ステロールプロフィールは以下に開示する。特に本特許出願の第ＸＩＩ節を参照のこと。油の回収後、有用な残渣バイオマスが残る。残渣バイオマスの用途としては、紙、プラスチック、吸収剤、吸着剤、掘削液の製造、動物用飼料として、人間の栄養用、又は肥料用が挙げられる。
トリグリセリド（「トリアシルグリセリド」又は「ＴＡＧ」とも称される）細胞油の脂肪酸プロフィールが本明細書に提供される場合、それは、細胞から抽出した貯蔵油の非分画サンプルを、リン脂質が除去された条件下で分析するか、又はリン脂質の脂肪酸に対して実質的に感度のない分析方法で（例えばクロマトグラフィー及び質量分析法を使用して）分析したものを指すことが理解されるであろう。油はＲＢＤプロセスに供してリン脂質、遊離脂肪酸及び匂いを除去してもよく、しかし油中のトリグリセリドの脂肪酸プロフィールの変化はごく僅か又は無視し得る程度である。細胞は油を産生するため、ある場合には、貯蔵油が細胞における全ＴＡＧの大部分を占めることになる。以下の実施例１、２、及び８は、ＴＡＧ脂肪酸組成及び位置特異的構造を決定するための分析法を提供する。
大別すると、本発明の特定の実施形態は、（ｉ）特定の脂肪酸の栄養要求株；（ｉｉ）不飽和脂肪酸要求性の細胞を含めた、低濃度の多価不飽和脂肪酸を有する油を産生する細胞；（ｉｉｉ）脂肪酸をグリセロール又はグリセロールエステルに転移させる酵素をコードする１つ以上の外来遺伝子の発現に起因して、高濃度の特定の脂肪酸を有する油を産生する細胞；（ｉｖ）位置特異的な油を産生する細胞、（ｖ）Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３由来のＬＰＡＡＴ酵素をコードする新規に発見された遺伝子をコードする遺伝子構築物又は細胞（実施例４３を参照）、（ｖｉ）低レベルの飽和脂肪酸及び／又は高レベルのパルミトレイン酸を産生する細胞、（ｖｉｉ）エルカ酸を産生する細胞、及び（ｖｉｉｉ）プロフィールが変化した細胞油を産生することに関連する他の発明を含む。これらの実施形態はまた、かかる細胞によって作られる油、油抽出後のかかる細胞からの残渣バイオマス、そうした油から作られる油脂化学品、燃料及び食品並びに細胞の培養方法も包含する。
以下の任意の実施形態において、使用される細胞は、場合により、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｃｅａｅ、又はＣｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅに分類される細胞を含めた、従属栄養又は偏性従属栄養微細藻類細胞を含む微細藻類細胞などのＩＩ型脂肪酸生合成経路を有する細胞であるか、又は合成生物学のツールを使用してＩＩ型脂肪酸生合成経路を有するように操作された細胞（すなわち、かかる経路を欠く生物にＩＩ型脂肪酸生合成の遺伝機構を移植する）である。ＩＩ型経路を有する宿主細胞を使用すると、外来性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ又は他のＡＣＰ結合酵素とＩ型細胞機構の多酵素複合体との間で相互作用が起こらない可能性が回避される。特定の実施形態において、細胞は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ種、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｋｒｕｇａｎｉ種、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｓｔａｇｎｏｒａ種又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｚｏｐｆｉｉ種の細胞であるか、又は配列番号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオチド同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡ配列を有する。暗所で培養するか又は偏性従属栄養生物を使用することにより、産生される細胞油はクロロフィル又は他の色素が低下し得る。例えば、細胞油は、実質的な精製なしに１００、５０、１０、５、１、０．０．５ｐｐｍ未満のクロロフィルを有し得る。
安定炭素同位体値δ１３Ｃは、標準（例えばＰＤＢ、サウスカロライナ州のＰｅｅｄｅｅ層からのＢｅｌｅｍｎｉｔｅ ａｍｅｒｉｃａｎａの化石骨格のカーボナイト）に対する１３Ｃ／１２Ｃの比の表現である。油の安定炭素同位体値δ１３Ｃ（０／００）は、使用される供給原料のδ１３Ｃ値に関係し得る。一部の実施形態では、油は、トウモロコシ又はサトウキビなどのＣ４植物に由来する糖上で従属栄養成長させた油産生生物から得られる。一部の実施形態では、油のδ１３Ｃ（０／００）は、−１０〜−１７０／００又は−１３〜−１６０／００である。
以下に考察する特定の実施形態及び例において、１つ以上の脂肪酸合成遺伝子（例えば、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、ケト−アシルＡＣＰシンターゼ、ＬＰＡＡＴ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は本明細書に記載される他のものをコードする）は、微細藻に組み込まれる。特定の微細藻について、植物脂肪酸合成遺伝子産物は、その遺伝子産物がアシル−ＡＣＰチオエステラーゼなどの、機能するのにＡＣＰの結合を要求する酵素である場合にも、対応する植物アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）の非存在下で機能し得ることが分かっている。従って、場合により微細藻類細胞は、植物ＡＣＰ遺伝子の共発現なしにかかる遺伝子を利用して所望の油を作り得る。
外来遺伝子又は遺伝子の組み合わせを含む組換え細胞の様々な実施形態について、６０、７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の核酸配列同一性を有する遺伝子によるそれらの遺伝子の置換は、６０、７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、９９又は９９．５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子の置換と同じく、同様の結果をもたらし得ることが考えられる。同様に、新規調節エレメントについて、６０、７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の核酸を有する核酸によるそれらの核酸の置換が有効であり得ることが考えられる。様々な実施形態において、機能に不要な配列（例えばＦＬＡＧ（登録商標）タグ又は挿入された制限部位）は多くの場合に使用が省略され、又は遺伝子、タンパク質及び変異体の比較において無視されることは理解されるであろう。
微細藻類を使用して発見され又は微細藻類によって例示されているが、ここに報告される新規遺伝子及び遺伝子の組み合わせは、当該技術分野において周知されている技術を用いて高等植物で使用することができる。例えば、高等植物における外来性脂質代謝遺伝子の使用が、米国特許第６０２８２４７号明細書、同第５８５００２２号明細書、同第５６３９７９０号明細書、同第５４５５１６７号明細書、同第５，５１２，４８２号明細書、及び同第５，２９８，４２１号明細書に開示されており、外来性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを含む高等植物を開示している。国際公開第２００９１２９５８２号パンフレット及び国際公開第１９９５０２７７９１号パンフレットは植物におけるＬＰＡＡＴのクローニングを開示している。高等植物におけるＦＡＤ２抑制が国際公開第２０１３１１２５７８号パンフレット、及び国際公開第２００８００６１７１号パンフレットに教示されている。
実施例６３に記載するとおり、転写プロファイリングを用いて、低窒素条件に応答して発現を調節するプロモーターが発見された。このプロモーターは、様々な遺伝子を選択的に発現させ、及び微生物油の脂肪酸組成を変化させるのに有用である。ある実施形態においては、異種プロモーターと遺伝子とを含む非天然構築物があり、ここでプロモーターは、実施例６３のプロモーター（例えば、配列番号１３０〜１４７）のいずれかと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％の配列同一性を含み、遺伝子は低窒素条件下と高窒素条件下とで示差的に発現する。任意選択で、発現のｐＨ感受性はＡＭＴ０３プロモーターより低い。例えば、このプロモーターをリノール酸要求株においてＦＡＤ２遺伝子の前に置くと、高窒素条件下、次に低窒素条件下で培養した後に、リノール酸が５、４、３、２、又は１％未満の油を生成することができる。
ＩＩＩ．脂肪酸栄養要求株／油産生期間中の成長阻害条件に対する脂肪酸レベルの低下
ある実施形態では、細胞は、脂質経路遺伝子の全ての対立遺伝子がノックアウトされるように遺伝子操作される。或いは、脂肪酸の補足を要求するように、それらの対立遺伝子の遺伝子産物の量又は活性がノックダウンされる。遺伝子の対立遺伝子の１つ以上と相同なドナー配列を有する第１の形質転換構築物を作成することができる。この第１の形質転換構築物が導入され、続く選択方法により、１つ以上の対立遺伝子破壊を特徴とする分離株が得られ得る。或いは、第１の対立遺伝子への挿入により第１の対立遺伝子を不活性化する選択可能なマーカーを発現するように操作された第１の株を作製してもよい。この株は、脂質経路遺伝子の残りの対立遺伝子をノックアウト又はノックダウンするさらに別の遺伝子操作のための宿主として使用することができる（例えば、第２の選択マーカーを使用して第２の対立遺伝子を破壊する）。当初活性を消失させた内在性遺伝子を有するさらなる形質転換構築物の操作された発現によって、又は好適な異種遺伝子の発現によって、内在性遺伝子の補足を実現することができる。補足遺伝子の発現は、構成的に調節されても、或いは調節可能な制御によって調節されてもよく、それにより成長を可能にし、又は任意に栄養要求条件を作り出すための所望のレベルに至る発現の調整が可能となる。ある実施形態では、脂肪酸要求細胞の集団を使用して補足遺伝子が、例えば外因性脂肪酸合成酵素に対する特定の遺伝子候補、又はかかる候補を含むと考えられる核酸ライブラリによる形質転換により、スクリーニング又は選択される。
所望の遺伝子の全ての対立遺伝子のノックアウト及びノックアウトした遺伝子の補足は、順次行われる必要はない。目的の内在性遺伝子の破壊及び好適な補足遺伝子の構成的発現又は誘導性発現のいずれかによるその補足は、いくつかの方法で行うことができる。一つの方法では、これは好適な構築物の同時形質転換によって実現することができ、１つが目的の遺伝子を破壊し、２つ目が好適な代替的遺伝子座に補足を提供する。別の方法では、誘導性プロモーターの制御下で標的遺伝子を好適な遺伝子に直接置き換えることにより、標的遺伝子の消失を生じさせることができる（「プロモーターハイジャック法」）。このようにして、ここで標的遺伝子の発現が調節可能なプロモーターの制御下に置かれる。さらなる手法は、遺伝子の内在性調節エレメントを外来性の誘導性遺伝子発現系に置き換えることである。かかるレジーム下では、ここで目的の遺伝子を、特定の必要性に応じてオン又はオフに切り換えることができる。さらに別の方法は、目的の遺伝子の補足能を有する外来遺伝子を発現する第１の株を作成し、次にこの第１の株における目的の遺伝子の全ての対立遺伝子をノックアウト又はノックダウンすることである。外来遺伝子による複数の対立遺伝子のノックダウン又はノックアウト及び補足手法を使用して、操作される細胞の脂肪酸プロフィール、位置特異的プロフィール、ｓｎ−２プロフィール、又はＴＡＧプロフィールを変えてもよい。
調節可能なプロモーターが使用される場合、プロモーターはｐＨ感受性（例えば、ａｍｔ０３）か、窒素及びｐＨ感受性（例えば、ａｍｔ０３）か、又は窒素感受性であるがｐＨ非感受性である（例えば、実施例６３の新規に発見されたプロモーター）か又は前述のプロモーターのいずれかと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を含むそれらの変異体であってもよい。プロモーターに関連して、ｐＨ非感受性（ｐＨ−ｉｎｅｎｓｉｔｉｖｅ）は、環境条件がｐＨ６．８から５．０にシフトしたときのそのプロモーターの感受性がａｍｔ０３プロモーターと比べて低い（例えば、プロモーターとしてａｍｔ０３を有する等価な細胞と比較したとき、ｐＨシフト時の活性の相対的変化が少なくとも５、１０、１５、又は２０％小さい）ことを意味する。
特定の実施形態において、組換え細胞は、内因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ；例えば長さＣ１８の脂肪酸アシル−ＡＣＰ鎖（例えば、ステアリン酸塩（Ｃ１８：０）又はオレイン酸塩（Ｃ１８：１）、又はＣ８：０〜Ｃ１６：０脂肪酸の加水分解に対して選択性を有するＦａｔＡ又はＦａｔＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの活性を低下させる働きをする核酸を含む。内因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの活性は、ノックアウト又はノックダウン手法により低下させ得る。ノックダウンは、例えば、１つ以上のＲＮＡヘアピン構築物の使用によるか、プロモーターハイジャック法（低活性又は誘導性プロモーターを内在性遺伝子の天然プロモーターに代える置換）によるか、又は誘導性プロモーターの制御下にある同様の又は同一の遺伝子の導入と組み合わせた遺伝子ノックアウトにより実現され得る。実施例３４は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株の操作を記載しており、ここでは内因性脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＦＡＴＡ１）の２つの対立遺伝子がノックアウトされている。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＴＡ１の活性が、外因性ＦａｔＡ又はＦａｔＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現によって補完された。実施例３６は、ＰｒｏｔｏｔｈｅｃａにおけるＦＡＴＡの発現を低下させるＲＮＡヘアピン構築物の使用について詳述し、これはパルミチン酸がより少なく、且つオレイン酸がより多い、変化した脂肪酸プロフィールをもたらした。
従って、油産生細胞は、ＩＩ型脂肪酸生合成経路を有する生物のものを含め、脂肪酸の補給又は遺伝的補足の非存在下における細胞の生存能力を消失させるか又は厳しく制限する程度に至るまでの、対立遺伝子をコードするアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼのノックアウト又はノックダウンを有することができる。このような株を使用して、アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ導入遺伝子を発現する形質転換体を選択することができる。それに代えて、又は加えて、この株を使用して外因性アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼを完全に移し替え、かかる細胞によって産生される細胞油の劇的に異なる脂肪酸プロフィールを提供することができる。例えば、ＦＡＴＡ発現を完全に又はほぼ完全に消失させ、中鎖脂肪酸を産生するＦＡＴＢ遺伝子に置き換えることができる。或いは、ステアリン酸又はオレイン酸（Ｃ１８）と比べてパルミチン酸（Ｃ１６）に特異性を有する内在性ＦａｔＡ遺伝子を有する生物を、ステアリン酸（Ｃ１８：０）に対してより高い相対的特異性を有する外来性ＦａｔＡ遺伝子に置き換えるか、又はオレイン酸（Ｃ１８：１）に対してより高い相対的特異性を有する外来性ＦａｔＡ遺伝子に置き換えることができる。特定の具体的な実施形態において、このような内因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの二重ノックアウトを有する形質転換体は、５０、６０、７０、８０、又は９０％超のカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、又はパルミチン酸、又は１８炭素未満の鎖長の全脂肪酸を有する細胞油を産生する。かかる細胞は、ステアリン酸又はオレイン酸などのより長鎖の脂肪酸の補給、又はＦａｔＡ遺伝子を調節する誘導性プロモーターの場合には成長許容的な状態と成長制限的な状態との間での環境条件の切り替えを必要とし得る。
ある実施形態では、油産生細胞は培養される（例えば、バイオリアクター内で）。細胞は、１種以上の脂肪酸に関して完全に栄養要求性であるか又は部分的に栄養要求性（すなわち、致死性又は合成病（ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｏｒ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｉｃｋｎｅｓｓ））である。細胞数を増やすため、脂肪酸を補給して細胞を培養し、次に細胞に油を蓄積させる（例えば乾燥細胞重量基準で少なくとも４０％まで）。或いは、細胞が、環境条件に基づき活性を切り替えることのできる調節可能な脂肪酸合成遺伝子を含み、第１の細胞分裂期間における環境条件が脂肪酸の産生に有利であり、且つ第２の油蓄積期間における環境条件が脂肪酸の産生に不利である。誘導性遺伝子の場合、その誘導性遺伝子の調節は、限定なしに環境ｐＨによって（例えば、実施例に記載されるとおりのＡＭＴ３プロモーターを使用することにより）媒介され得る。
これらの補給又は調節方法のいずれかを適用する結果として、最適な細胞増殖に必須の１つ以上の脂肪酸の量が少ない細胞から細胞油が得られ得る。得ることのできる油の具体的な例としては、ステアリン酸、リノール酸及び／又はリノレン酸が低いものが挙げられる。
これらの細胞及び方法は、低多価不飽和油に関連してこの直後の章に及び実施例６（脂肪酸デサチュラーゼ要求株）に多価不飽和脂肪酸が低い油に関連して及び実施例３４（アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ要求株）に例示される。
同様に、脂肪酸要求株は、ＳＡＤ、ＦＡＤ、ＫＡＳＩＩＩ、ＫＡＳＩ、ＫＡＳＩＩ、ＫＣＳ、エロンガーゼ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＤＧＡＴ又はＡＧＰＡＴ又はＰＡＰをコードするものを含め、他の脂肪酸合成遺伝子において作製することができる。これらの栄養要求株を使用して補足遺伝子を選択し、又はそれらの遺伝子の天然発現を消失させて所望の外来遺伝子に有利になるようにして、油産生細胞により産生される細胞油の脂肪酸プロフィール、位置特異的プロフィール、又はＴＡＧプロフィールを変えることもできる。
従って、本発明のある実施形態には、油／脂肪の生成方法がある。この方法は、ある脂肪酸が存在することにより細胞数を増加させるための細胞分裂に対して許容的な第１の一連の条件下にある成長期間に組換え油産生細胞を培養する工程と、細胞分裂に対して制限的な、しかしその脂肪酸が欠乏している油の産生に対しては許容的な第２の一連の条件下にある油産生期間に細胞を培養する工程と、細胞から油を抽出する工程とを含み、ここで細胞は、脂肪酸合成酵素の活性を抑制する働きをする突然変異又は外来核酸を有し、その酵素は場合によりステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ、又はケトアシル−ＡＣＰシンターゼである。細胞により産生される油は、脂肪酸が少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％欠乏していてもよい。細胞は従属栄養培養することができる。細胞は、従属栄養培養又は独立栄養培養される微細藻類細胞であってよく、乾燥細胞重量基準で少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％の油を産生し得る。
ＩＶ．（Ａ）低多価不飽和細胞油
本発明の実施形態において、細胞により産生される細胞油は、極めて低濃度の多価不飽和脂肪酸を有する。結果として、細胞油は、酸化安定性を含めた安定性の向上を備え得る。細胞油は、下述する位置特異的又は立体特異的な（ｓｔｅｒｅｒｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）油、高ステアリン酸油、又は高中鎖油を含め、室温で液体又は固体であっても、又は液体油と固体油とのブレンドであってもよい。酸化安定性は、規定の温度でＡＯＣＳ Ｃｄ １２ｂ−９２標準試験を使用したランシマット方法により計測することができる。例えば、ＯＳＩ（酸化安定性指数）試験を１１０℃〜１４０℃の温度で実行することができる。油は、１つ以上の脂肪酸デサチュラーゼの活性が低下するように遺伝子操作された細胞（例えば、上記又は本明細書の他の部分で言及しているプラスチド微生物細胞のいずれか）を培養することにより生成される。例えば、細胞は、オレイン酸（１８：１）からリノール酸（１８：２）への変換に関与する１つ以上の脂肪酸アシルΔ１２デサチュラーゼ及び／又はリノール酸（１８：２）からリノレン酸（１８：３）への変換に関与する１つ以上の脂肪酸アシルΔ１５デサチュラーゼの活性が低下するように遺伝子操作されてもよい。コード領域又は調節領域にあるデサチュラーゼをコードする遺伝子の１つ以上の対立遺伝子のノックアウト又は突然変異、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アンチセンス、及びヘアピンＲＮＡ技術を含めた、ＲＮＡ転写、又は酵素の翻訳の阻害を含め、様々な方法を使用してデサチュラーゼを阻害することができる。阻害タンパク質又はデサチュラーゼに特異的な他の物質を産生する外来遺伝子の導入を含め、当該技術分野において公知の他の技法もまた用いることができる。具体的な例では、一方の脂肪酸アシルΔ１２デサチュラーゼ対立遺伝子のノックアウトが第２の対立遺伝子のＲＮＡレベルの阻害と組み合わされる。
特定の実施形態において、細胞における脂肪酸デサチュラーゼ（例えば、Δ１２脂肪酸デサチュラーゼ）活性は、細胞を培養できないか又は培養することが困難になる（例えば、細胞分裂速度が１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９７又は９９％より大きく低下する）ような程度まで減少させる。かかる条件の実現は、デサチュラーゼの複数の遺伝子コピー（例えば２、３、４個又はそれを超える）又はそれらの遺伝子産物の活性のノックアウト、又は有効な抑制を伴い得る。特定の実施形態は、細胞数を増加させるため脂肪酸又は脂肪酸混合物を補給した完全な又は部分的な脂肪酸要求株の細胞培養での培養と、次に細胞に油を（例えば細胞重量基準で少なくとも４０％まで）蓄積させることを含む。或いは、細胞は、活性を切り替えることのできる調節可能な脂肪酸合成遺伝子を含む。例えば、調節は環境条件に基づくことができ、第１の細胞分裂期間における環境条件が脂肪酸の産生に有利であり、且つ第２の油蓄積期間における環境条件が油の産生に不利である。例えば、培養培地ｐＨ及び／又は窒素レベルを環境制御として使用して脂質経路遺伝子の発現を切り替え、合成酵素活性が高い又は低い状態を生じさせることができる。かかる細胞の例が実施例７に記載される。
特定の実施形態では、細胞内のリノール酸濃度の調節を用いて細胞が培養される。詳細には、リノール酸が存在するために細胞数の増加に許容的な第１の条件下で細胞を培養し、次にリノール酸飢餓により特徴付けられる、従って細胞分裂に対して抑制的な、しかし油の蓄積には許容的な第２の条件下で細胞を培養することにより細胞油が産生される。例えば、培養培地に添加したリノール酸の存在下で細胞のシード培養物が作られてもよい。例えば、脂肪酸アシルΔ１２デサチュラーゼの２つの対立遺伝子を消失させたためにリノール酸産生を欠くＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株（すなわちリノール酸要求株）のシード培養物に対し、０．２５ｇ／Ｌになるようなリノール酸の添加が、の細胞分裂を野生型細胞と同等のレベルに支持するのに十分であった。場合により、次にリノール酸を細胞に消費させるか、又は他の方法で除去又は希釈してもよい。次に細胞は油産生期間に切り替えられる（例えば、国際公開第２０１０／０６３０３２号パンフレットに記載されるとおり窒素制限条件下で糖を供給する）。意外にも、油の産生はリノール酸産生又は補給の非存在下であっても起こることが認められており、これは偏性従属栄養生物の油産生微細藻類Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａで実証されるとおりであるが、しかし概して他の油産生微細藻類、微生物、又はさらには多細胞生物（例えば、培養植物細胞）に適用可能である。これらの条件下で、細胞の含油量は、乾燥細胞重量基準で約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％又はそれを超えるまで増加し得る一方、産生される油は、油中の合計トリアシルグリセロール脂肪酸に対する百分率として、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％又はそれ以下の多価不飽和脂肪酸（例えば；リノール酸＋リノレン酸）プロフィールを有し得る。例えば、細胞の含油量が乾燥細胞重量基準で５０％又はそれを超え、産生される油のトリグリセリドが３％未満の多価不飽和脂肪酸であってもよい。
これらの油はまた、細胞分裂期間中はリノール酸を産生する細胞機構を用いることにより、しかし脂質産生期間中はリノール酸を減らして又はそれなしに、リノール酸を培養物に補足する必要なしに（又はその必要性を低減して）生成することができる。リノール酸を産生する細胞機構は、油産生期間中に産生するリノール酸が実質的に少なくなるように調節可能であり得る。この調節は、１つ又は複数のデサチュラーゼ遺伝子の転写調節か又は阻害物質の産生の調節（例えば、調節されたヘアピンＲＮＡ／ＲＮＡｉ産生）を介し得る。例えば、脂肪酸Δ１２デサチュラーゼ活性の大部分、好ましくは全てを、細胞分裂期間はデサチュラーゼを発現するが油蓄積期間中はそれが低下し又は消失するように調節された調節可能なプロモーター下に置くことができる。この調節は、本明細書の例に記載されるとおり、ｐＨ、及び／又は窒素濃度などの細胞培養条件、又は他の環境条件と関係付けることができる。実際には、条件は、物質（例えば、酸又は塩基の添加によるプロトン）を添加若しくは除去するか、又は細胞に物質（例えば、窒素供給栄養素）を消費させて、デサチュラーゼ活性の調節に所望の切り替えを生じさせることにより操作され得る。
デサチュラーゼ活性を調節するための他の遺伝的又は非遺伝的方法もまた用いることができる。例えば、油産生期間における多価不飽和脂肪酸の産生を阻害するのに有効な方法で培養培地にデサチュラーゼの阻害薬を添加することができる。
従って、本発明の特定の実施形態には、環境条件による組換え調節エレメントの制御下にある、調節可能なデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子を有する組換え細胞を提供する工程を含む方法がある。細胞は、細胞増殖に有利な条件下で培養される。所与の細胞密度に達したところで細胞培地が変更され、細胞が栄養制限（例えば利用可能な窒素の減少）によって脂質産生モードに切り替えられる。脂質産生期間の間は、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼの活性が下方調節されるような環境条件である。次に細胞が回収され、場合により油が抽出される。脂質産生期間はデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼが低レベルであるため、油は多価不飽和脂肪酸が少なくなり、酸化安定性が向上する。場合により、細胞は従属栄養培養され、場合により微細藻類細胞である。
これらのデサチュラーゼ調節方法の１つ以上を用いると、特にバイオリアクター（例えば１０００Ｌ超）における大規模培養ではこれまで得ることができなかったと考えらる細胞油を得ることが可能となる。油は、油中の合計トリアシルグリセロール脂肪酸の面積パーセントとして、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．３％、０．２％、又はそれ以下の多価不飽和脂肪酸レベルを有し得る。
かかる低レベルの多価不飽和物を有することの一つの帰結は、油が酸化に対して極めて安定することである。実際、ある場合に油は、これまでに知られているどの細胞油と比べても高い安定性を有し得る。特定の実施形態では、油は抗酸化剤の添加なしに、１１０℃で、ＡＯＣＳ Ｃｄ １２ｂ−９２．ランシマット試験条件下１０時間、１５時間、２０時間、３０時間、４０時間、５０時間、６０時間、又は７０時間までに未だ電気伝導度の変曲点に達しない安定性を有する。極めて安定した油について、かかる試験では、かかる長い試験期間により蒸発が起こるため、水の補充が必要となり得ることが注記される（実施例５を参照のこと）。例えば油は、抗酸化剤の添加なしに１１０℃で４０〜５０時間又は４１〜４６時間のＯＳＩ値を有し得る。抗酸化剤（食品に好適なもの等）が添加される場合、計測されるＯＳＩ値はさらに高くなり得る。例えば、トコフェロール（１００ｐｐｍ）及びパルミチン酸アスコルビル（５００ｐｐｍ）又はＰＡＮＡ及びパルミチン酸アスコルビルを添加すると、かかる油は、ランシマット試験により計測したとき、１１０℃で１００又は２００時間を超える酸化安定性指数（ＯＳＩ値）を有し得る。別の例において、１０５０ｐｐｍの混合トコフェロール及び５００ｐｍのパルミチン酸アスコルビルを、１％未満のリノール酸又は１％未満のリノール酸＋リノレン酸を含む油に添加する；結果として、この油は１１０℃で１、２、３、４、５、６、７、８、又は９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６、２０、３０、４０又は５０日、５〜１５日、６〜１４日、７〜１３日、８〜１２日、９〜１１日、約１０日、又は約２０日間安定である。油はまた、１３０℃で１、２、３、４、５、６、７、８、又は９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６、２０、３０、４０又は５０日、５〜１５日、６〜１４日、７〜１３日、８〜１２日、９〜１１日、約１０日、又は約２０日間安定であり得る。特定の例では、かかる油は、１００時間を超えて（観察時約１２８時間）安定であることが認められた。さらなる実施形態において、抗酸化剤を添加しない細胞油の１２０℃でのＯＳＩ値は１５時間又は２０時間より長く、又は１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、又は２５〜５０時間、又は５０〜１００時間の範囲である。
ある例では、これらの方法を用いると、微細藻類細胞の含油量は乾燥細胞重量基準で４０〜約８５％であり、油の脂肪酸プロフィールにおける多価不飽和脂肪酸は油の脂肪酸プロフィールの０．００１％〜３％であり、場合により抗酸化剤の添加なしに１１０℃で少なくとも２０時間のＯＳＩ誘導時間を有する細胞油を生じる。さらに別の例には、油産生細胞由来の細胞油のＲＢＤ処理により生成される細胞油があり、この油は０．００１％〜２％の多価不飽和脂肪酸を含み、抗酸化剤の添加なしに１１０℃で３０時間を超えるＯＳＩ誘導時間を有する。さらに別の例には、油産生細胞由来の細胞油のＲＢＤ処理により産生される細胞油があり、この油は０．００１％〜１％の多価不飽和脂肪酸を含み、抗酸化剤の添加なしに１１０℃で３０時間を超えるＯＳＩ誘導時間を有する。
別の特定の実施形態には、上述の方法によって生成される多価不飽和度が低下した油がある。この油は、ＰＡＮＡ及びパルミチン酸アスコルビルなどの抗酸化剤と組み合わされる。例えば、かかる油を０．５％のＰＡＮＡ及び５００ｐｐｍのパルミチン酸アスコルビルと組み合わせると、油が１３０℃で約５日又は１１０℃で２１日のＯＳＩ値を有したことが認められた。これらの注目に値する結果は、この油が極めて安定しているのみならず、これらの２つの抗酸化剤がトリグリセリド油の極めて強力な安定化剤であり、これらの抗酸化剤の組み合わせが、安定な生分解性潤滑剤（例えば、ジェットエンジン潤滑剤）の製造における適用性を含め、普遍的な適用性を有し得ることを示唆している。特定の実施形態において、脂肪酸アシルΔ１２デサチュラーゼの遺伝子操作により、操作しない株と比べて、ＯＳＩの（例えば、１１０℃における）２〜３０倍、又は５〜２５倍、又は１０〜２０倍の増加がもたらされる。油は、上記に記載したとおりのことを含め、細胞のデサチュラーゼ活性を抑制することにより生成することができる。
本発明の油で使用するのに好適な抗酸化剤としては、アルファ、デルタ、及びガンマトコフェロール（ビタミンＥ）、トコトリエノール、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、グルタチオン、リポ酸、尿酸、β−カロチン、リコペン、ルテイン、レチノール（ビタミンＡ）、ユビキノール（補酵素Ｑ）、メラトニン、レスベラトロール、フラボノイド、ローズマリー抽出物、没食子酸プロピル（ＰＧ）、第三ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、及びブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、Ｎ，Ｎ’−ジ−２−ブチル−１，４−フェニレンジアミン、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール、２，４−ジメチル−６−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、２，４−ジメチル−６−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、２，４−ジメチル−６−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、及びフェニル−α−ナフチルアミン（ＰＡＮＡ）が挙げられる。
デサチュラーゼの改変に加え、関連する実施形態では、全体を通して記載するとおり、鎖長特異性が変化したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの導入又は置換及び／又はＫＡＳ、ＳＡＤ、ＬＰＡＡＴ、又はＤＧＡＴ遺伝子をコードする内在性又は外来性遺伝子の過剰発現を含め、油の特性をさらに調整するため他の遺伝子改変が作製され得る。例えば、高いオレイン酸レベルを生じる株が、低レベルの多価不飽和物も生じ得る。かかる遺伝子改変には、外来性ＳＡＤ遺伝子の導入によってステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）の活性を増加させること、外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子の導入によってエロンガーゼ活性を増加させること、及び／又はＦＡＴＡ遺伝子をノックダウン又はノックアウトすることが含まれ得る。
特定の実施形態では、低多価不飽和物の高オレイン酸細胞油が生成され得る。例えば、この油は、６０、７０、８０、９０、又は９５％超のオレイン酸及び５、４、３、２、又は１％未満の多価不飽和物を含む脂肪酸プロフィールを有し得る。関連する実施形態では、３％以下の多価不飽和脂肪酸であって６０％超のオレイン酸、２％未満の多価不飽和脂肪酸且つ７０％超のオレイン酸、１％未満の多価不飽和脂肪酸且つ８０％超のオレイン酸、又は０．５％未満の多価不飽和脂肪酸且つ９０％超のオレイン酸を有する油を産生するため、脂肪酸Δ１２デサチュラーゼ活性及び場合により脂肪酸Δ１５デサチュラーゼを低下させる働きをする組換え核酸を有する細胞により細胞油が生成される。オレイン酸を増加させる一つの方法は、ＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現を低下させるとともに、場合によりＫＡＳ ＩＩ遺伝子を過剰発現させる働きをする組換え核酸を使用することであることが分かっている；かかる細胞は、７５％以上のオレイン酸を含む油を産生することができる。或いは、ＦＡＴＡノックアウト又はノックダウンなしにＫＡＳＩＩの過剰発現を用いることができる。オレイン酸レベルは、上記の方法を用いてデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ活性を低下させ、それにより不飽和のリノール酸及びリノレン酸に変換されるオレイン酸の量を減少させることにより、さらに増加させることができる。従って、産生される油は、少なくとも７５％のオレイン酸及び高々３％、２％、１％、又は０．５％のリノール酸を含む脂肪酸プロフィールを有し得る。関連する例では、油は、８０〜９５％のオレイン酸及び約０．００１〜２％のリノール酸、０．０１〜２％のリノール酸、又は０．１〜２％のリノール酸を有する。別の関連する実施形態では、油は、１０％未満のパルミチン酸、８５％超のオレイン酸、１％以下の多価不飽和脂肪酸、及び７％未満の飽和脂肪酸を有する細胞油が微生物によって産生されるように油産生細胞（例えば、微細藻）を培養することにより産生される。実施例５８を参照されたく、ここではかかる油が、ＦＡＤ及びＦＡＴＡノックアウトに加えて外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子の発現を有する微細藻で産生される。かかる油は低い凝固点を有して安定性に優れ、食品において、フライ用、燃料用に、又は化学的応用において有用である。さらに、これらの油は、時間が経過しても変色し難い傾向を呈し得る。例示的な化学的応用では、高オレイン酸油を使用して化学品が製造される。油中のトリグリセリドのオレイン酸基のオレイン酸二重結合をエポキシ化又はヒドロキシル化してポリオールを作製することができる。エポキシ化油又はヒドロキシル化油は、様々な用途で用いられ得る。かかる用途の一つは、ヒドロキシル化大豆油又はヒマシ油で実施されているとおりの、ヒドロキシル化トリグリセリドとイソシアネートとの縮合によるポリウレタン（ポリウレタンフォームを含む）の製造である。ヒドロキシル化及びポリウレタン縮合化学の例については、例えば、米国特許出願公開第２００５／０２３９９１５号明細書、米国特許出願公開第２００９／０１７６９０４号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１７６８３９号明細書、米国特許出願公開第２００９／０２７０５２０号明細書、及び米国特許第４，２６４，７４３号明細書及びＺｌａｔａｎｉｃ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００２，３，１０４８−１０５６（２００２）を参照のこと。好適なヒドロキシル形成反応としては、脂肪酸の１つ以上の二重結合のエポキシ化と、続く水（ジオールの形成）、アルコール（ヒドロキシルエーテルの形成）、又は酸（ヒドロキシルエステルの形成）による酸触媒エポキシド開環が挙げられる。バイオベースのポリウレタンの製造において高オレイン酸／低多価不飽和油を使用することには、複数の利点がある：（１）ポリウレタンフォームの保存寿命、色又は匂いが向上し得る；（２）多価不飽和物により生じる不要な副反応がないため、製品の再現性が向上し得る；（３）多価不飽和物がないため、より高度にヒドロキシル化反応が起こり、従ってポリウレタン製品の構造特性を向上させることができる。
本明細書に記載される低多価不飽和油又は高オレイン酸／低多価不飽和油は、有利には、黄変が望ましくない化学的応用において使用され得る。例えば、トリグリセリドに由来するトリグリセリド脂肪酸から作られるペンキ又はコーティングにおいて、黄変は望ましくないものであり得る。黄変は、多価不飽和脂肪酸及びトコトリエノール及び／又はトコフェロールが関わる反応によって生じ得る。従って、油産生微生物において低レベルのトコトリエノールを含む高い安定性の油を生成することは、油を使用して作られる化学組成物の高い色安定性を向上させるのに有利であり得る。一般的に使用される植物油と対照的に、油産生微生物を適切に選択することにより、これらの実施形態の細胞油は１ｇ／Ｌ以下のトコフェロール及びトコトリエノールレベルを有し得る。特定の実施形態において、細胞油は、多価不飽和脂肪酸が２％未満であり、且つトコフェロール、トコトリエノール又はトコフェロールとトコトリエノールとの合計が１ｇ／Ｌ未満である脂肪酸プロフィールを有する。別の特定の実施形態において、細胞油は、多価不飽和脂肪酸が１％未満であり、且つトコフェロール、トコトリエノール又はトコフェロールとトコトリエノールとの合計が０．５ｇ／Ｌ未満である脂肪酸プロフィールを有する。
高安定性（低多価不飽和）の細胞油のいずれか又はその誘導体は、食品、薬物、ビタミン、ニュートラシューティカルズ、パーソナルケア製品又は他の製品の配合に使用することができ、特に酸化の影響を受け易い製品に有用である。例えば、高安定性細胞油（例えば、３％、２％又は１％以下の多価不飽和物）を使用して、多価不飽和脂肪酸に関連するフリーラジカル反応がないため保存寿命が増加した日焼け防止剤（例えば、アボベンゾン、ホモサレート、オクチサレート、オクトクリレン又はオキシベンゾンの１つ以上を有する組成物）又はレチノイド顔用クリームを配合することができる。例えば、５４℃で４週間の加速劣化後に残る色、匂い、官能特性又は％活性化合物の点で、保存寿命が増加し得る。高安定性の油はまた、高温安定性に優れた潤滑剤としても使用することができる。安定性に加え、油は生分解性であってもよく、これはまれな組み合わせの特性である。
別の関連する実施形態では、細胞油の脂肪酸プロフィールのＣ８〜Ｃ１６脂肪酸を、さらなる遺伝子改変によって、例えば短鎖乃至中鎖選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの過剰発現又は本明細書に記載される他の改変によって上昇させる。これらの実施形態における低多価不飽和油は、酸化安定性の向上が求められるものを含め、様々な工業、食品、又は消費者製品に使用することができる。食品用途では、油は高温での寿命が長い、又は保存寿命が長いことで、フライに用いられ得る。
油がフライに使用される場合、油の安定性が高いことで、抗酸化剤及び／又は消泡剤（例えばシリコーン）を添加しないフライが可能となり得る。消泡剤を含まない結果として、フライ食品による油の吸収が少なくなり得る。燃料用途でトリグリセリドとして、或いはバイオディーゼル若しくは再生可能ディーゼルに処理されて（例えば、国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６３０３２号パンフレット、及び国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレットを参照のこと）使用される場合、高い安定性により長期保存が促進され、又は高温での使用が可能となり得る。例えば、高安定性の油から作製される燃料は、補助発電機における使用のため、１年超又は５年超にわたり保存することができる。フライ油は２００℃より高い発煙点、及び０．１％未満の遊離脂肪酸を有し得る（細胞油として又は精製後のいずれか）。
低多価不飽和油は、以下に記載するとおり生成されるものを含めた、β結晶又はβプライム結晶を形成するものなどの構造化脂肪を含む食品油とブレンドされてもよい。このような油はまた、液体油とブレンドすることもできる。リノール酸を有する油、例えばトウモロコシ油と混合される場合、ブレンドのリノール酸レベルは、高オレイン酸ヒマワリ油などの高オレイン酸植物油のレベルに近付き得る（例えば、約８０％オレイン酸及び８％リノール酸）。
低多価不飽和細胞油のブレンドは、他の油とエステル交換させることができる。例えば、油は化学的又は酵素的にエステル交換されてもよい。特定の実施形態において、本発明の実施形態に係る低多価不飽和油は、その脂肪酸プロフィール中少なくとも１０％のオレイン酸及び５％未満の多価不飽和物を有し、ｓｎ−１及びｓｎ−２トリアシルグリセロール位置に特異的な酵素を使用して高飽和油（例えば水素化大豆油又は高ステアリン酸濃度の他の油）と酵素的にエステル交換される。この結果、ステアリン酸−オレイン酸−ステアリン酸（ＳＯＳ）を含む油となる。エステル交換の方法は当該技術分野において公知である；例えば、「Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（脂質改変における酵素）」，Ｕｗｅ Ｔ．Ｂｏｒｎｓｃｈｕｅｒ，ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＿ＶＣＨ，２０００，ＩＳＢＮ ３−５２７−３０１７６−３を参照のこと。
高安定性の油は、スプレー油として使用することができる。例えば、レーズンなどの乾燥果実に、多価不飽和物が５、４、３、２、又は１％未満である高安定性油を吹き付けてもよい。結果として、他の場合には多価不飽和物の存在によって生じ得るノズルにおける重合又は酸化生成物の蓄積が原因となって使用スプレーノズルが詰まることが少なくなる。
さらなる実施形態において、以下に記載するものなどのＳＯＳが高い油は、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼのノックダウン又は調節により安定性を向上させることができる。
任意選択で、ＦＡＤｃプロモーターが調節される場合、それは、低ｐＨで作動可能なプロモーター（例えば、ｐＨ７．０での培養からｐＨ５．０での培養に切り換えたときＦＡＤｃの転写レベルが半分未満に低下するもの）で調節することができる。プロモーターは低窒素条件下での培養に感受性を有することができ、従ってプロモーターは窒素充満条件下で活性であり、窒素飢餓条件下で不活性である。例えば、プロモーターは、窒素飢餓時に５、１０、１５倍又はそれ以上のＦＡＤｃ転写物レベルの低下を生じさせ得る。プロモーターはｐＨ５．０で作動可能であるため、より最適なインベルターゼ活性が達成され得る。例えば、細胞は、インベルターゼの存在下に６．５、６．０又は５．５未満のｐＨで培養することができる。細胞はＦＡＤｃノックアウトを有し、調節ＦＡＤｃの相対的遺伝子投与量は増加し得る。任意選択で、インベルターゼは細胞によって（天然に又は外来性インベルターゼ遺伝子に起因して）産生される。プロモーターは窒素飢餓条件下で活性が低いため、細胞増殖段階における最適な細胞増殖を許容しない脂質産生期間中に脂肪酸産生が進行し得る。詳細には、低リノール酸油が産生され得る。細胞は、乾燥細胞重量基準で少なくとも２０％脂質の油含有量になるまで培養することができる。油は、リノール酸が５、４、３、２、１、又は０．５、０．２、又は０．１％未満の脂肪酸プロフィールを有し得る。実施例６２は、かかるプロモーターの発見について記載する。
ＩＶ．（Ｂ）ＦＡＤ遺伝子置換を使用して得られる高１８：２／低１８：３油
意外にも、上記に記載したとおりの低多価不飽和油の生成について研究する間、多価不飽和物が高いもののユニークな脂肪酸プロフィールを有する油が発見された。この油の発見は、実施例５９に記載する。従って、油産生プラスチド細胞（例えば、微細藻類）培養物を使用して、１０％以下のリノレン酸（Ｃ１８：３）及び２０％以上のリノール酸（Ｃ１８：２）によって特徴付けられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成することが可能である。かかる油は、油産生微細藻又は他の油産生プラスチド細胞において、（内在性又は外来性）ＫＡＳＩＩの過剰発現及びＦＡＤｃ（ＦＡＤ２とも称される）の遺伝子置換によって、及び必要であれば宿主細胞に基づき天然アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を置き換えることによって生成し得る。実施例５８〜５９では、内因性ＫＡＳＩＩを過剰発現させて、内在性ＦＡＤｃ遺伝子をｐＨ誘導性プロモーターの制御下に置いたが、しかし構成的発現もまた機能し得た。興味深いことに、リノール酸要求株（例えば、ＦＡＤｃ二重ノックアウト）でＦＡＤｃを過剰発現させたとき、油はリノール酸が非常に高かった。これは、微細藻類にこれまでに認識されていない遺伝子レベルの調節システムが存在し、リノール酸の効率的な蓄積のためにはこれを機能不能にしなければならないことが原因と考えられる。加えて、内在性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの２つのコピーをノックアウトしてオレイン酸特異的植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼに置き換えた。許容的ｐＨ条件下では、１０％以下のリノレン酸（Ｃ１８：３）及び２０％以上のリノール酸（Ｃ１８：２）を有する油。この油は、抽出して、食料品又は化学品に含められる様々な用途に使用することができる。宿主細胞が微細藻である場合、油は微細藻類ステロールを含むことができる。他の実施形態と同様に、宿主細胞は、外因性インベルターゼを発現するように形質転換された、従って従属栄養培養条件下でショ糖を油に変換することが可能な微細藻であってもよい。
具体的な実施形態において、宿主細胞は、ＦＡＤｃノックダウン、ノックアウト、又は下方調節可能なプロモーターを有するＦＡＤｃを、実施例５８に開示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ遺伝子によってコードされるタンパク質と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％のアミノ酸同一性を有するタンパク質を発現する外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子と組み合わせて含み、及び任意選択で、オレイン酸特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ酵素を産生するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を発現する。任意選択で、細胞は植物細胞、微生物細胞、又は微細藻類細胞であってもよい。
Ｖ．外来性アシルトランスフェラーゼを含む細胞
本発明の様々な実施形態において、細胞により産生される細胞油の脂肪酸組成を変化させるため、アシルトランスフェラーゼ（脂肪酸とグリセロール又はグリセロール誘導体との縮合によるアシルグリセリドの形成に関与する酵素）をコードする１つ以上の遺伝子を油産生細胞（例えば、プラスチド微細藻類細胞）に導入することができる。この遺伝子は、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、１−アシルグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＡＧＰＡＴ）としても知られるリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、又はアシル基をＤＡＧのｓｎ−３位に転移させて、それによりＴＡＧを産生するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）の１つ以上をコードし得る。
組換え核酸は細胞のプラスミド又は染色体に組み込まれてもよい。或いは、遺伝子は、上記のものとは別個の脂肪酸アシル−ＣｏＡ非依存経路でＴＡＧ前駆体分子を生成する脂質経路の酵素をコードする。アシル−ＡＣＰは、プラスチドＧＰＡＴ及びＬＰＡＡＴ酵素及び／又はミトコンドリアＧＰＡＴ及びＬＰＡＡＴ酵素の基質であり得る。ＴＡＧを産生するため（例えば膜リン脂質から）アシル基を取り入れる能力を有するさらなる酵素の中には、リン脂質ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）がある。さらに別のアシルトランスフェラーゼが、リゾホスホスファチジルコリン（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、リゾホスホスファチジルセリン（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＳＡＴ）、リゾホスホスファチジルエタノールアミン（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＥＡＴ）、及びリゾホスホスファチジルイノシトール（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＩＡＴ）を含め、トリグリセリド組成に影響を及ぼし得るリン脂質合成及びリモデリングに関与する。
外来遺伝子は、特定の炭素原子数及び／又は特定の飽和度を含むアシル基質の転移に選択的な特異性を有するアシルトランスフェラーゼ酵素をコードすることができ、これが、所与の位置特異的トリグリセリドが高濃度化された油の産生のため、油産生細胞に導入される。例えば、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼは、他のアシル−ＣｏＡ基質よりＣ１２：０−ＣｏＡ基質に選択性を示すことが実証されており（Ｋｎｕｔｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２０，１９９９，ｐｐ ７３９−７４６）、一方、成熟ベニバナ種子の１−アシル−ｓｎ−３−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼは、ステアロイル−ＣｏＡを含め、他のアシル−ＣｏＡ基質よりリノレオイル−ＣｏＡ及びオレオイル−ＣｏＡ基質に選択性を示す（Ｉｃｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１６７，１９８９，ｐｐ．３３９−３４７）。さらに、アシルトランスフェラーゼタンパク質が、１つ以上の短鎖、中鎖、又は長鎖アシル−ＣｏＡ又はアシル−ＡＣＰ基質に対する選択的特異性を示し得るが、この選択性は、リゾホスファチジン酸ドナー基質のｓｎ−１位又はｓｎ−３位に特定のアシル基、例えば中鎖アシル基が存在する場合にのみ起こり得る。外来遺伝子がある結果として、細胞により、ＴＡＧ分子の２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０、又は９０％超で特定の脂肪酸がｓｎ−２位に見られるＴＡＧ油が生成され得る。
本発明の一部の実施形態では、細胞は、飽和−不飽和−飽和（ｓａｔ−ｕｎｓａｔ−ｓａｔ）ＴＡＧリッチな油を作り出す。ｓａｔ−ｕｎｓａｔ−ｓａｔ ＴＡＧとしては、１，３−ジヘキサデカノイル−２−（９Ｚ−オクタデセノイル）−グリセロール（１−パルミトイル−２−オレイル−グリセロ−３−パルミトイルと称される）、１，３−ジオクタデカノイル−２−（９Ｚ−オクタデセノイル）−グリセロール（１−ステアロイル−２−オレイル−グリセロ−３−ステアロイルと称される）、及び１−ヘキサデカノイル−２−（９Ｚ−オクタデセノイル）−３−オクタデカノイ（ｏｃｔａｄｅｃａｎｏｙ）−グリセロール（１−パルミトイル−２−オレイル−グリセロ−３−ステアロイルと称される）が挙げられる。これらの分子はより一般的には、それぞれ、ＰＯＰ、ＳＯＳ、及びＰＯＳと称され、ここで「Ｐ」はパルミチン酸を表し、「Ｓ」はステアリン酸を表し、及び「Ｏ」はオレイン酸を表す。飽和−不飽和−飽和ＴＡＧのさらなる例としては、ＭＯＭ、ＬＯＬ、ＭＯＬ、ＣＯＣ及びＣＯＬが挙げられ、ここで「Ｍ」はミリスチン酸を表し、「Ｌ」はラウリン酸を表し、及び「Ｃ」はカプリン酸（Ｃ８：０）を表す。３つの飽和脂肪酸アシル基を含むトリグリセリドであるトリ飽和物（ｔｒｉｓａｔｕｒａｔｅ）は、一般に、他の種類のトリグリセリドより高いその結晶化率のため、食品用途での使用が求められる。トリ飽和物の例としては、ＰＰＭ、ＰＰＰ、ＬＬＬ、ＳＳＳ、ＣＣＣ、ＰＰＳ、ＰＰＬ、ＰＰＭ、ＬＬＰ、及びＬＬＳが挙げられる。加えて、ＴＡＧにおける脂肪酸の位置特異的分布は、消化及び吸収中の食事性脂肪の代謝運命の重要な決定要因である。
本発明の特定の実施形態によれば、油産生細胞は組換え核酸によって形質転換され、それにより特定の位置特異的トリグリセリド、例えば１−アシル−２−オレイル−グリセロ−３−アシル、又は１−アシル−２−ラウリン酸−グリセロ−３−アシル（ここでは組換え核酸の導入の結果として、それぞれオレイン酸又はラウリン酸がｓｎ−２位にある）をより多量に含む細胞油が生産される。或いは、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、又はパルミチン酸がｓｎ−２位にあってもよい。細胞油中に存在する特定の位置特異的トリグリセリドの量は、組換え核酸を含まない微生物によって産生される細胞油と比べて５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、１００〜５００％超、又は５００％超増加し得る。結果として、細胞トリグリセリドのｓｎ−２プロフィールは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％超の特定の脂肪酸を有し得る。
グリセロ脂質において個別の立体特異的又は位置特異的な位置にあるアシル鎖の同一性を、当該技術分野において公知の（Ｌｕｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，４１，６９３−６９６（１９６４）、Ｂｒｏｃｋｅｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，６，１０−１５（１９６５）、Ａｎｇｅｒｓ ａｎｄ Ａｒｙｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．７６：４，（１９９９）、Ｂｕｃｈｇｒａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１０６，６２１−６４８（２００４）を参照のこと）、又は、以下に提供する実施例１、２、及び８における１つ以上の分析法により評価することができる。
トリグリセリド分子における脂肪酸の位置分布は、アシルトランスフェラーゼの基質特異性、並びに利用可能なアシル部分基質プールの濃度及び種類により影響を受け得る。組換え微生物で産生されるトリグリセリドの位置特異性を変化させるのに好適な酵素の非限定的な例を表１〜表４に掲載する。当業者は、さらに好適なタンパク質を同定し得る。
本発明の微生物及び方法での使用に好適なリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼとしては、限定なしに、表２に掲載するものが挙げられる。
本発明の微生物及び方法での使用に好適なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼとしては、限定なしに、表３に掲載するものが挙げられる。
本発明の微生物及び方法での使用に好適なリン脂質ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼとしては、限定なしに、表４に掲載するものが挙げられる。
本発明の実施形態では、既知又は新規のＬＰＡＡＴ遺伝子を油産生細胞に形質転換し、それによりそうした細胞によって産生されるトリグリセリドの脂肪酸プロフィールを、最も顕著にはトリグリセリドのｓｎ−２プロフィールを変えることにより変化させる。例えば、油産生細胞において外来性活性ＬＰＡＡＴが発現することにより、ｓｎ−２位における不飽和脂肪酸の割合が、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％又はそれを超えて増加する。例えば、細胞は、３０％がｓｎ−２位の不飽和物（これは主として１８：１及び１８：２及び１８：３脂肪酸であってよい）であるトリグリセリドを産生し得る。この例では、ＬＰＡＡＴ活性を導入することにより、ｓｎ−２位における不飽和物が２０％増加し、従ってトリグリセリドの３６％がｓｎ−２位における不飽和物を含む。或いは、外因性ＬＰＡＡＴを使用して、ｓｎ−２位におけるＣ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０又はＣ１６：０部分などの飽和中鎖を含む中鎖脂肪酸を増加させることができる。結果として、脂肪酸プロフィール全体の中鎖レベルが増加し得る。実施例４３及び４４は、油産生微生物におけるｓｎ−２及び脂肪酸プロフィールの改変について記載している。これらの例から分かるとおり、ＬＰＡＡＴ遺伝子の選択は、異なるＬＰＡＡＴがｓｎ−２及び脂肪酸プロフィールにおいて異なるアシル基鎖長又は飽和度へのシフトを引き起こし得る点で重要である。例えば、実施例４３のＬＰＡＡＴはＣ１０〜Ｃ１４脂肪酸を増加させ、実施例４４のＬＰＡＡＴはＣ１６及びＣ１８脂肪酸の増加を生じさせる。これらの例にあるとおり、外因性ＬＰＡＡＴの導入は、外来性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの導入と組み合わせることができる。中鎖選択的ＬＰＡＡＴと中鎖選択的ＦａｔＢとの組み合わせが相加効果をもたらすことが分かった；脂肪酸プロフィールは、外因性ＬＰＡＡＴ及びＦａｔＢ遺伝子の両方が存在したとき、外来性ＦａｔＢ遺伝子のみが存在したときよりもさらに中鎖脂肪酸の方にシフトした。特定の実施形態において、外来性中鎖特異的ＬＰＡＡＴと（場合により）外来性ＦａｔＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子とを含む細胞によって産生される油は、Ｃ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、又はＣ１６：０脂肪酸が（個別に又は合計で）４０、５０、６０、７０、８０％又はそれを超える脂肪酸プロフィールを有し得る。
本発明の具体的な実施形態は、核酸構築物、核酸構築物を含む細胞、トリグリセリドを生成するための細胞の培養方法、及び生成されるトリグリセリド油であり、ここで核酸構築物は、新規ＬＰＡＡＴコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを有する。このコード配列は、上流に開始コドン及び下流に終止コドンと、続く３ ＵＴＲ配列を有し得る。具体的な実施形態において、ＬＰＡＡＴ遺伝子はＬＰＡＡＴ活性を有し、コード配列は、配列番号８０〜８５のｃＤＮＡのいずれかと少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性又は遺伝子コードの縮重に起因して等価な配列を含めたその機能断片を有する。イントロンも同様に配列に挿入され得る。或いは、ＬＰＡＡＴ遺伝子は、配列番号７７〜７９のアミノ酸配列又はその機能断片、又は少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードする。微細藻類及び他の油産生細胞に加えて、導入遺伝子として新規ＬＰＡＡＴを発現する植物が、これらの実施形態に明示的に包含され、公知の遺伝子工学技術を用いて作製することができる。
ＶＩ．外因性エロンガーゼ又はエロンガーゼ複合体酵素を含む細胞
本発明の様々な実施形態において、エロンガーゼ又は脂肪酸アシル−ＣｏＡ伸長複合体の成分をコードする１つ以上の遺伝子を油産生細胞（例えばプラスチド微細藻類細胞）に導入することにより、細胞又は細胞により産生される細胞油の脂肪酸組成を変えることができる。遺伝子は、β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（３−ケトアシルシンターゼ、β−ケトアシルシンターゼ又はＫＣＳとも称される）、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、又はエロンガーゼをコードし得る。これらの遺伝子によりコードされる酵素は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼによって遊離するアシル−ｃｏＡ分子の伸長に活性を有する。組換え核酸が細胞のプラスミド又は染色体に組み込まれてもよい。特定の実施形態において、細胞は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞などの従属栄養細胞を含めた、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａの細胞である。
本発明の微生物及び方法での使用に好適なβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ及びエロンガーゼ酵素としては、限定なしに、表５に掲載するものが挙げられる。
本発明のある実施形態では、特定の炭素原子数及び／又は特定のアシル鎖飽和度を含むアシル基質の伸長に選択的特異性を有するβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ又はエロンガーゼ酵素をコードする外来遺伝子が油産生細胞に導入され、それにより特定の鎖長及び／又は飽和の脂肪酸が高濃度化された細胞又は油が生成される。実施例４０はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株の操作について記載し、ここでは中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡの延長に選択性を有する外因性脂肪酸エロンガーゼを過剰発現させることによりステアリン酸濃度を増加させた。実施例４２及び５４はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの操作について記載し、ここでは一価不飽和及び飽和Ｃ１８−及びＣ２０−ＣｏＡ基質の延長に選択性を有する外因性エロンガーゼ又はβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを過剰発現させることによりエルカ酸濃度を増加させる。
特定の実施形態において、油産生細胞は、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、又は８０％超のエルカ酸及び／又はエイコセン酸を含む油を産生する。或いは、細胞は、０．５〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、又は９０〜９９％のエルカ酸又はエイコセン酸を含む油を産生する。細胞は、オレオイル−ＣｏＡの伸長に活性を有する外因性β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをさらに導入することで、高オレイン酸油に関連して上記に記載する組換え酸を含み得る。外因性β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼが発現する結果として、細胞によるエルカ酸又はエイコセン酸の天然産生が２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、７０、１００、１３０、１７０又は２００倍超増加し得る。高エルカ酸及び／又はエイコセン酸油はまた、高い安定性の油；例えば、５、４、３、２、又は１％未満の多価不飽和物を含み及び／又は第ＩＶ節又は本願及び添付の実施例に記載されるＯＳＩ値を有するものであり得る。特定の実施形態において、細胞は微細藻類細胞であり、場合により従属栄養培養される。他の実施形態にあるとおり、油／脂肪は、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ門、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｔａｅ綱、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ目、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａｃａｅ科の従属栄養微細藻類を含めたプラスチド細胞の遺伝子操作によって生成することができる。好ましくは、細胞は油産生性であり、乾燥細胞重量基準で少なくとも４０％の油を蓄積する能力を有する。細胞は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｚｏｐｆｉｉを含めたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの種などの、偏性従属栄養生物であってもよい。
具体的な実施形態において、油産生微生物細胞、任意選択で油産生微細藻類細胞、任意選択でＣｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ門、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｔａｅ綱、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ目、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａｃａｅ科のものは、表５の酵素と８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する酵素を発現する。
ＶＩＩ．位置特異的及び立体特異的油／脂肪
ある実施形態では、組換え細胞は、所与の位置特異的組成を有する細胞脂肪又は油を産生する。結果として、細胞は、所与の多形形態の結晶を（例えば、融解温度を上回るまで加熱し、次に脂肪の融解温度未満に冷却するとき）形成する傾向を有するトリグリセリド脂肪を産生することができる。例えば、脂肪は、テンパリングするかしないかに関わらず、β型又はβ’型の結晶多形（例えばＸ線回折解析によって決定するとき）を形成する傾向を有し得る。脂肪は規則性脂肪であってもよい。特定の実施形態において、脂肪は、冷却するとβ結晶或いはβ’結晶を直接形成し得る；或いは、脂肪はβ型を経てβ’型へと進み得る。かかる脂肪は、食品用途での構造化ラミネート用又はコーティング用脂肪として使用することができる。この細胞脂肪は、キャンディー、ダーク又はホワイトチョコレート、チョコレート風味の糖菓、アイスクリーム、マーガリン又は他のスプレッド、クリームの詰め物、ペストリー、又は他の食品に添合することができる。場合により、脂肪は（室温で）半固体であってもよいが、しかし人工的に作られたトランス脂肪酸は含まない。かかる脂肪はまた、スキンケア及び他の消費者製品又は工業製品においても有用であり得る。
他の実施形態にあるとおり、脂肪は、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ門、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｔａｅ綱、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ目、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａｃａｅ科の従属栄養真核微細藻類を含めたプラスチド細胞の遺伝子操作によって生成され得る。好ましくは、細胞は油産生性であり、乾燥細胞重量基準で少なくとも４０％の油を蓄積する能力を有する。細胞は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｚｏｐｆｉｉを含めたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの種などの、偏性従属栄養生物であってもよい。脂肪はまた、独立栄養性の藻類又は植物においても産生され得る。場合により、細胞は、油を産生するためにショ糖を利用する能力を有し、国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６０３２号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１１号パンフレット、及びＰＣＴ／ＵＳ１２／２３６９６号明細書に記載されるとおり、ショ糖を代謝させるため組換えインベルターゼ遺伝子が導入され得る。ここで言及する全ての遺伝子と同じく、インベルターゼはコドン最適化され、細胞の染色体に組み込まれてもよい。培養された組換え微細藻類は、ハードストック脂肪の融点未満の温度でハードストック脂肪を産生し得ることが分かっている。例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓは、１５〜３０℃の範囲の温度で５０％超のステアリン酸を有するトリグリセリド油を従属栄養的に産生するように変化させることができ、ここでこの油は、３０℃に保たれると凝固する。
ある実施形態では、細胞脂肪は、全体的な構造［飽和脂肪酸（ｓｎ−１）−不飽和脂肪酸（ｓｎ−２）−飽和脂肪酸（ｓｎ−３）］の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％の脂肪を有する。これは以下にＳａｔ−Ｕｎｓａｔ−Ｓａｔ脂肪として示される。特定の実施形態において、この構造中の飽和脂肪酸は、好ましくはステアリン酸又はパルミチン酸であり、不飽和脂肪酸は好ましくはオレイン酸である。結果として、脂肪は主にβ又はβ’多形結晶、又はそれらの混合物を形成し、対応する物理的特性を、食品又はパーソナルケア製品での使用に望ましいものを含めて有し得る。例えば、脂肪は、食品用には口腔体温で溶解し、又はクリーム、ローション又は他のパーソナルケア製品用には皮膚温度で（例えば、３０〜４０、又は３２〜３５℃の融解温度）溶解し得る。場合により、脂肪は、２Ｌ又は３Ｌラメラ構造を（例えば、Ｘ線回折解析によって決定するとき）有し得る。場合により、脂肪はテンパリングなしにこの多形形態を形成し得る。
特定の関連する実施形態において、細胞脂肪トリグリセリドは高濃度のＳＯＳを有する（すなわち、グリセロール骨格の末端ｓｎ−１位及びｓｎ−３位にステアリン酸を含み、ｓｎ−２位にオレイン酸を含むトリグリセリド）。例えば、脂肪は、少なくとも５０、６０、７０、８０又は９０％のＳＯＳを含むトリグリセリドを有し得る。ある実施形態では、脂肪は、少なくとも８０％のＳＯＳのトリグリセリドを有する。場合により、ｓｎ−２結合脂肪酸の少なくとも５０、６０、７０、８０又は９０％が不飽和脂肪酸である。特定の実施形態では、ｓｎ−２結合脂肪酸の少なくとも９５％が不飽和脂肪酸である。加えて、ＳＳＳ（トリステアリン酸）レベルは２０、１０又は５％未満であってもよく、及び／又はＣ２０：０脂肪酸（アラキジン酸）レベルは６％未満であってもよく、場合により１％超（例えば、１〜５％）であってもよい。例えば、特定の実施形態において、組換え細胞によって産生される細胞脂肪は、少なくとも７０％のＳＯＳトリグリセリドを有し、少なくとも８０％がｓｎ−２不飽和脂肪酸アシル部分である。別の特定の実施形態において、組換え細胞によって産生される細胞脂肪は、少なくとも８０％のＳＯＳトリグリセリドを含み、且つ少なくとも９５％がｓｎ−２不飽和脂肪酸アシル部分であるＴＡＧを有する。さらに別の特定の実施形態において、組換え細胞によって産生される細胞脂肪は、少なくとも８０％のＳＯＳを含み、少なくとも９５％がｓｎ−２不飽和脂肪酸アシル部分であり、且つ１〜６％がＣ２０脂肪酸であるＴＡＧを有する。
さらに別の特定の実施形態において、細胞脂肪の脂肪酸プロフィールにおけるステアリン酸塩とパルミチン酸塩との合計割合は、オレイン酸塩の割合の２倍±１０、２０、３０又は４０％である［例えば、（％Ｐ＋％Ｓ）／％Ｏ＝２．０±２０％］。場合により、この脂肪のｓｎ−２プロフィールは、少なくとも４０％、及び好ましくは少なくとも５０、６０、７０、又は８０％オレイン酸である（ｓｎ−２位で）。また場合により、この脂肪は少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％ＳＯＳであってよい。場合により、脂肪は１〜６％のＣ２０脂肪酸を含む。
これらの実施形態のいずれにおいても、高ＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ脂肪は、β’多形結晶を形成する傾向を有し得る。ココアバターのようなこれまでに利用可能な植物脂肪とは異なり、この細胞によって産生されるＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ脂肪はテンパリングなしにβ’多形結晶を形成し得る。ある実施形態では、融解温度を上回るまで加熱して、融解温度未満に３、２、１、又は０．５時間冷却すると、多形が形成される。関連する実施形態において、６０℃を上回るまで加熱して、１０℃に３、２、１、又は０．５時間冷却すると、多形が形成される。
様々な実施形態において、脂肪は、融解温度を上回って加熱して融解温度未満に冷却したときβ型、β’型、又は両方の多形を形成し、場合により融解温度を上回るまで加熱して、次に１０℃で冷却したとき、５、４、３、２、１、０．５時間以内又はそれ未満で少なくとも５０％の多形平衡まで進む。脂肪はココアバターより速い速度でβ’結晶を形成し得る。
場合により、任意のこれらの脂肪が、２モル％未満のジアシルグリセロール、又は２モル％未満のモノアシルグリセロールとジアシルグリセロールとの合計を有し得る。
ある実施形態では、脂肪は３０〜６０℃、３０〜４０℃、３２〜３７℃、４０〜６０℃又は４５〜５５℃の融解温度を有し得る。別の実施形態において、脂肪は２０℃で４０〜５０％、１５〜２５％、又は１５％未満の固形脂肪含有量（ＳＦＣ）を有し、及び／又は３５℃で１５％未満のＳＦＣを有し得る。
脂肪を作るために使用される細胞は、ＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ脂肪の形成に有利となるように、細胞トリグリセリドにおける脂肪酸の飽和対不飽和比を改変する働きをする組換え核酸を含み得る。例えば、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）遺伝子のノックアウト又はノックダウンを用いて、オレイン酸よりステアリン酸の形成に有利となるようにすることができ、又は外来性中鎖選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現により、中鎖飽和レベルを増加させることができる。或いは、ＳＡＤ酵素をコードする遺伝子を過剰発現させて不飽和物を増加させることができる。
特定の実施形態において、細胞は、細胞のステアリン酸レベルを上昇させる働きをする組換え核酸を有する。結果として、ＳＯＳの濃度が増加し得る。実施例９は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｃ１８：０選択的チオエステラーゼが過剰発現する結果として、組換え微生物の位置特異的プロフィールがＳａｔＵｎｓａｔＳａｔトリグリセリドＰＯＰ、ＰＯＳ、及びＳＯＳについて高濃度化されることを実証する。細胞のステアリン酸を増加させるさらなる方法は、オレイン酸レベルを低下させることである。高オレイン酸レベルを（例えば、ステアリン酸レベルの２分の１を超えて）有する細胞については、オレイン酸レベルを低下させる働きをする組換え核酸又は古典的な遺伝子突然変異もまた用いることができる。例えば、細胞は、オレイン酸を遊離させるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする１つ以上のＦＡＴＡ対立遺伝子、及び／又はステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）をコードする１つ以上の対立遺伝子にノックアウト、ノックダウン、又は突然変異を有し得る。実施例３５は、ヘアピンＲＮＡを使用したＳＡＤ２遺伝子産物発現の阻害によるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）における３７％ステアリン酸の脂肪酸プロフィールの生成について記載し、一方で野生型株は４％未満のステアリン酸を生成したことから、９倍を超える改善であった。さらに、実施例３５の株はＳＡＤ活性を低下させるように操作されるが、ＳＯＳ、ＰＯＰ、及びＰＯＳを作る十分なオレイン酸を生成するのに十分なＳＡＤ活性は残る。実施例４７のＴＡＧプロフィールを参照のこと。特定の例では、アンチセンス、ＲＮＡｉ、又はｓｉＲＮＡ、ヘアピンＲＮＡ又はそれらの組み合わせなどの阻害技法を用いて、複数のＳＡＤコード対立遺伝子のうちの１つがノックアウトされてもよく、及び／又は１つ以上の対立遺伝子が下方調節される。様々な実施形態において、細胞は、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、又は９０〜約１００％ステアリン酸を有するＴＡＧを産生し得る。他の実施形態では、細胞は、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、又は９０〜約１００％ＳＯＳであるＴＡＧを産生し得る。場合により、又は遺伝子改変に加えて、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼを化学的に阻害することができる；これは例えば油産生中に細胞培養物にステルクリン酸を添加することによる。
意外にも、単一のＦＡＴＡ対立遺伝子のノックアウトが、微細藻類で産生されるＣ１８脂肪酸の存在を増加させることが見出された。１つの対立遺伝子をノックアウトするか、又は他の方法でＦＡＴＡ遺伝子産物の活性を（例えばヘアピンＲＮＡを使用して）抑制する一方で、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼの活性もまた（本明細書に開示される技法を用いて）抑制することにより、細胞におけるステアリン酸レベルを増加させることができる。
ステアリン酸レベルを増加させる別の遺伝子改変としては、ステアリン酸産生速度を増加させるため、細胞におけるケトアシルＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳ）活性を増加させることが挙げられる。微細藻類では、ＫＡＳＩＩ活性の増加がＣ１８合成の増加に有効であり、特にＳＡＤ活性の低下に有効な組換えＤＮＡと組み合わせた細胞トリグリセリドにおけるステアリン酸レベルの上昇に有効であることが分かっている。ＫＡＳＩＩを増加させる働きをする組換え核酸（例えば、外来性ＫａｓＩＩ遺伝子）をまた、ＦａｔＡ遺伝子のノックアウト又はノックダウン、又はＦａｔＡ遺伝子及びＳＡＤ遺伝子の両方のノックアウト又はノックダウンと組み合わせてもよい。任意選択で、ＫＡＳＩＩ遺伝子は、ＫＡＳＩＩ Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（配列番号１６１に提供される成熟タンパク質）と少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードするか、又は本明細書に（例えば、実施例６０に）開示される若しくは微細藻類ＫＡＳＩＩを含めた当該技術分野において公知の任意の植物ＫＡＳＩＩ遺伝子である。
場合により、細胞は、単独の改変として、或いはステアリン酸を増加させる他の１つ以上の遺伝子改変との組み合わせで、外因性ステアリン酸遊離アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを含み得る。例えば、細胞が、Ｃ１８：０−ＡＣＰの切断に選択性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを過剰発現するように操作されてもよい。実施例９は、微細藻類、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の脂肪酸プロフィールにおいてステアリン酸を約３．７％から約３０．４％（８倍超）に増加させる外因性Ｃ１８：０選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現について記載する。実施例４１は、ＰｒｏｔｏｔｈｅｃａにおいてＣ１８：０レベルを上昇させる働きをするＣ１８：０選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのさらなる例を提供する。任意選択で、ステアリン酸選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子は、実施例９又は実施例４１の遺伝子産物（配列番号２８、６５、６７、６９、７１、７３、又は７５（存在する場合にＦＬＡＧタグを除く））と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％のアミノ酸同一性を有する酵素をコードする。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの導入は、１つ以上の内在性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ対立遺伝子のノックアウト又はノックダウンと組み合わせることができる。チオエステラーゼの導入はまた、エロンガーゼ（ＫＣＳ）又はβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの過剰発現と組み合わせることもできる。加えて、１つ以上の外来遺伝子（例えば、ＳＡＤ又はＫＡＳＩＩをコードするもの）を、環境条件によって（例えば、調節可能なプロモーターと作動可能に連結した状態に置くことにより）調節してもよい。特定の例では、ｐＨ及び／又は窒素濃度を用いてａｍｔ０３プロモーターを調節する。次に環境条件を調整することにより、細胞トリグリセリド中に現れるステアリン酸の所望の量を（例えばオレイン酸濃度の２倍となるよう）産生するように細胞が調整され得る。これらの操作の結果として、細胞は少なくとも５、１０、１５、又は２０倍のステアリン酸の増加を呈し得る。
単独での、又はステアリン酸を増加させる他の改変と組み合わせたさらなる改変として、細胞は、エロンガーゼ又はβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを発現する働きをする組換え核酸を含むことができる。例えば、Ｃ１８：０選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの過剰発現を、中鎖延長エロンガーゼ又はＫＣＳの過剰発現と組み合わせることにより、組換え細胞におけるステアリン酸産生を増加させ得る。外来遺伝子（例えば、チオエステラーゼ、エロンガーゼ、又はＫＣＳをコードするもの）の１つ以上を、環境条件によって（例えば、調節可能なプロモーターと作動可能に連結した状態に置くことにより）調節してもよい。具体的な例では、ｐＨ及び／又は窒素レベルを用いることにより、ａｍｔ０３プロモーター、又はａｍｔ０３よりｐＨ感受性が低いものを含めた実施例６３の任意のプロモーターが調節される。次に環境条件を調整することにより、細胞トリグリセリド中に現れるステアリン酸の所望の量を（例えばオレイン酸濃度の２倍となるよう）産生するように細胞が調整され得る。これらの操作の結果として、細胞は少なくとも５、１０、１５、又は２０倍のステアリン酸の増加を呈し得る。ステアリン酸に加え、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、及びセロチン酸もまた産生され得る。
特定の実施形態では、ステアリン酸レベルを増加させる細胞の遺伝子操作により、細胞により産生される油中のステアリン酸対オレイン酸の比は、２：１±３０％（すなわち１．４：１〜２．６：１の範囲）、２：１±２０％又は２：１±１０％となる。
或いは、細胞をＳａｔＵｎｓａｔＳａｔの形成に有利となるように操作することができ、ここでＳａｔはパルミチン酸又はパルミチン酸とステアリン酸との混合物である。この場合、外因性パルミチン酸を遊離させるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの導入が、パルミチン酸形成を促進し得る。この実施形態において、細胞は、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、又は８０％ＰＯＰであるトリグリセリド、又はＰＯＰ、ＳＯＳ、及びＰＯＳの合計が細胞トリグリセリドの少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％であるトリグリセリドを産生し得る。他の関連する実施形態において、ＰＯＳレベルは、細胞によって産生されるトリグリセリドの少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％である。
特定の実施形態において、油の融解温度はココアバターの融解温度（約３０〜３２℃）と同程度である。ＰＯＰ、ＰＯＳ及びＳＯＳレベルは、それぞれ約１６、３８、及び２３％でココアバターに近くなり得る。例えば、ＰＯＰは１６％±２０％であってもよく、ＰＯＳは３８％±２０％であってもよく、ＳＯＳは２３％±２０％であってもよい。或いは、ＰＯＰは１６％±１５％であってもよく、ＰＯＳは３８％±１５％であってもよく、ＳＯＳは２３％±１５％であってもよい。或いは、ＰＯＰは１６％±１０％であってもよく、ＰＯＳは３８％±１０％であってもよく、ＳＯＳは２３％±１０％であってもよい。
ステアリン酸を増加させる組換え核酸の結果として、脂肪酸プロフィールのある割合がアラキジン酸となってもよい。例えば、脂肪酸プロフィールは、０．０１％〜５％、０．１〜４％、又は１〜３％のアラキジン酸となり得る。さらに、位置特異的プロフィールは、０．０１％〜４％、０．０５％〜３％、又は０．０７％〜２％のＡＯＳを有してもよく、又は０．０１％〜４％、０．０５％〜３％、又は０．０７％〜２％のＡＯＡを有してもよい。ＡＯＳ及びＡＯＡは、数ある潜在的利益の中でも特に、本発明の脂肪を含む糖菓におけるブルーミング及び脂肪マイグレーションを低減し得ると考えられる。
ステアリン酸及び／又はパルミチン酸を増加させ、且つＳａｔＵｎｓａｔＳａｔレベルを改変するよう設計される操作に加え、多価不飽和物レベルが、上記に記載したとおりデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ活性（例えば、Ｆａｄ遺伝子によりコードされるとおりの）の低下、及び場合により成長培地の補給又はＦＡＤ発現の調節によることを含め抑制され得る。微細藻類では（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株での研究から明らかなように）、多価不飽和物がｓｎ−２位に選択的に付加されることが分かっている。従って、ｓｎ−２位にオレイン酸を含むトリグリセリドの割合を上昇させるためには、細胞によるリノール酸の産生が抑制され得る。高度に酸化安定性の油に関連した、脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）遺伝子又は遺伝子産物を阻害又は除去するための本明細書に記載される技術は、ｓｎ−２位の多価不飽和物を減少させることによるＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ油の産生に向けて良い効果を伴い適用することができる。さらなる利益として、かかる油は酸化安定性の向上を有し得る。本明細書に同様に記載されるとおり、脂肪は二段階で生成されてもよく、第１の段階で多価不飽和物が供給されるか又は細胞によって産生され、脂肪産生段階で多価不飽和物を欠乏させる。生成される脂肪は、１５，１０，７、５、４、３、２、１、又は０．５％以下の多価不飽和物を有する脂肪酸プロフィールを有し得る。特定の実施形態では、細胞によって産生される油／脂肪は、５０％超のＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ、場合により５０％超のＳＯＳを有するが、多価不飽和物は３％未満である。場合により、多価不飽和物は、脂肪酸プロフィール中のリノール酸とリノレン酸との合計面積％によって概算され得る。
ある実施形態では、細胞脂肪は、６５％〜９５％ＳＯＳ、場合により０．００１〜５％ＳＳＳを有するシアステアリン代用物である。関連する実施形態において、脂肪は、６５％〜９５％ＳＯＳ、０．００１〜５％ＳＳＳ、場合により０．１〜８％アラキジン酸を含有するトリグリセリドを有する。別の関連する実施形態において、脂肪は６５％〜９５％ＳＯＳを有し、ＳＳＳとＳＳＯとの合計は１０％未満又は５％未満である。
細胞の位置特異的選択性は、以下に記載する分析法（実施例１〜２、８）を用いて知ることができる。上記に記載したとおりの飽和物と不飽和物とのバランスにも関わらず、細胞酵素がｓｎ−２位に不飽和脂肪酸を置かないことも可能である。その場合、遺伝子を操作して、（ｉ）内因性ｓｎ−２特異的アシルトランスフェラーゼ（例えばＬＰＡＡＴ）の活性を低下させること、及び／又は（ｉｉ）所望の特異性を有する外因性ＬＰＡＡＴを導入すること（すなわち、ｓｎ−２におけるオレイン酸の導入）により、所望の位置特異性を付与することができる。外因性ＬＰＡＡＴが導入される場合、好ましくはＬＰＡＡＴをコードする遺伝子が宿主染色体に組み込まれ、小胞体に標的化される。ある場合には、宿主細胞は特異的及び非特異的の両方のＬＰＡＡＴ対立遺伝子を有してもよく、これらの対立遺伝子の一方の活性を（例えば遺伝子ノックアウトによって）抑制すると、所望の特異性が付与されることになる。例えば、配列番号７８及び配列番号７９のＬＰＡＡＴ又はこれらの配列又はその機能断片のいずれかと少なくとも９０、９５、９８、又は９９％のアミノ酸同一性を含むＬＰＡＡＴをコードする遺伝子を使用してｓｎ−２位にオレイン酸を付加することにより、ＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ ＴＡＧのレベルを増進させることができる。遺伝子は、配列番号８０〜８５又は遺伝子コードの縮重の理由で等価な配列のいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％のヌクレオチド同一性を有し得る。或いは、この遺伝子によってコードされるタンパク質は、配列番号８０〜８５のいずれかの遺伝子産物と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％のヌクレオチド同一性を有し得る。これらの遺伝子は、これらの配列又はその機能断片（これは、公知の技術を用いて配列から核酸を体系的に欠失させることにより見出され得る）を含む組換え核酸構築物、ベクター、染色体又は宿主細胞として現れ得る。遺伝子の発現の結果として、ＳＯＳ、ＰＯＳ、ＰＯＰなどのｓａｔ−ｕｎｓａｔ−ｓａｔ ＴＡＧ、又はｓｎ−２位にＣ８〜Ｃ１６脂肪酸を含むトリグリセリドの量が宿主細胞において増加し得る。
いくつかある発見の中でも特に、上記の考察及び以下の実施例は、微生物又は植物において一般に高Ｓａｔ−Ｕｎｓａｔ−Ｓａｔ油及び詳細にはＳＯＳ油を得るための特定の経路を強調する。従って、遺伝子工学技術を任意選択で古典的な突然変異誘発及び育種と組み合わせて用いることにより、出発株と比べて少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、又はそれ以上のＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ又はＳＯＳ産生量の増加を有する微細藻又は高等植物を作製し得る可能性がある。別の態様では、野生型が２０％、３０％、４０％又は５０％未満のＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ又はＳＯＳを産生する種のＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ又はＳＯＳ濃度を増加させることで、ＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ又はＳＯＳをそれぞれ少なくとも３０％、４０％、５０％又は６０％まで増加させることができる。出発又は野生型生物と比べた主な変化は、ステアリン酸量の増加（例えば、ステアリン酸から形成されるオレイン酸の量が例えばＳＡＤ活性の低下によって低下することによる、及び／又はステアリン酸に変換されるパルミチン酸の量がＦＡＴＡの活性の低下及び／又はＫＡＳＩＩの活性の増加によって増加することによる、及びＦＡＤ２／ＦＡＤｃ活性の低下によってリノール酸の量が減少することによる）することである。
任意選択で、出発生物は、ｓｎ−２位でオレイン酸又は不飽和脂肪酸が優勢なＴＡＧ種を合成する傾向があるトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）生合成機構を有し得る。多くの油糧種子作物がこの特徴を有する。リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）は、最終的にｓｎ−２位に挿入されることになる脂肪酸種の決定において重要な役割を果たすことが実証されている。実際には、高等植物種子における異種遺伝子発現によるＬＰＡＡＴの操作によって、ｓｎ−２位を占有する脂肪酸種を変えることができる。
農業上重要な油糧種子及び藻類において顕著なレベルのいわゆる構造化脂肪（典型的には種ＳＯＳ−ステアリン酸−オレイン酸−ステアリン酸、ＰＯＳ−パルミチン酸−オレイン酸−ステアリン酸、又はＰＯＰ−パルミチン酸−オレイン酸−パルミチン酸で構成される）を有する油を生成する一つの手法は、内因性並びに異種性ＬＰＡＡＴ発現の操作を介するものである。高レベルの構造化脂肪を含有する種子由来のＬＰＡＡＴの発現は、例えば、通常はかかる脂肪を限られた量しか含有しない油糧種子又は油産生藻類の構造化脂肪レベルを増加させる一つの戦略であり得る。
しかしながら、代替的又は補足的な戦略は、農業上重要な（ａｇｒｉｃｕｌｔｕａｒｌｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ）油糧種子（例えば、ベニバナ−Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｓｐ．、ヒマワリ−Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ．、キャノーラ−Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．、ピーナッツ−Ａｒａｃｈｉｓ ｓｐ．、ダイズ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｐ．、トウモロコシ−Ｚｅａ ｓｐ．、オリーブ−Ｏｌｅａ ｓｐ．、アマ−Ｌｉｎｕｍ ｓｐ．、パーム−Ｅｌａｅｉｓ ｓｐ．及び綿−Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｐ．、以下の表５ａの代表的なプロフィールを参照のこと）におけるＬＰＡＡＴの固有の傾向を利用することであり、遺伝子工学単独又は遺伝子工学と古典的株改良（即ち突然変異誘発）との組み合わせのいずれかによって構造化脂肪レベルを増加させるため存在する脂肪酸の種を選択的に操作することである。ＳＯＳの場合、これらの操作には、独立して実施することのできる一連の個別的な工程が含まれる。それらとしては、以下が挙げられる。
ステアリン酸レベルを増加させること。これは、本発明者らがここで微細藻類において実証しており、及び他の研究者らが高等植物で示しているとおり、ステアリン酸特異的ＦＡＴＡ活性の発現によるか又は内因性ＳＡＤ活性の下方調節によって；例えば、直接的な遺伝子ノックアウト、ＲＮＡサイレンシング、又は古典的な株改良を含めた突然変異によって達成することができる。しかしながら、ステアリン酸レベルのみを上記の手法によって単純に上昇させることは、最適とはいえない。例えば、パーム油の場合、既に高レベルのパルミチン酸がステアリン酸レベルの上昇と相まって既存のＬＰＡＡＴ活性を打ち負かし、トリ飽和脂肪酸（ＳＳＳ、ＰＰＰ、ＳＳＰ、ＰＰＳなど）への多量のステアリン酸及びパルミチン酸の取り込みをもたらす可能性がある。従って、さらにパルミチン酸レベルを制御する工程も行う必要がある。
高ＳＯＳ含有脂肪を作り出すには、パルミチン酸レベルを最小限に抑えなければならず、なぜならパルミチン酸は、高機能ＬＰＡＡＴを伴ったとしても、ステアリン酸が占め得たｓｎ−１位又はｓｎ−３位を占有し得るとともに、上記に概説したとおり、飽和物が多過ぎて著しいレベルのトリ飽和ＴＡＧ種が生じることになるためである。パルミチン酸レベルは、例えば、突然変異／古典的な株改良による内因性ＦＡＴＡ活性の下方調節、内因性ＦＡＴＡ活性が高いパルミチン酸活性を有する場合には遺伝子ノックアウト又はＲＮＡｉ媒介性戦略によって低下させることができる。それに代えて、又は上記と併せて、パルミチン酸レベルは、内因性ＫＡＳＩＩ活性の過剰発現又は同じ試みとして現れる古典的な株改良の試みによって、パルミチン酸からステアリン酸への伸長が促進されるようにして低下させることができる。しかしながら、上記の方法でパルミチン酸レベルを単純に低下させることは十分でない場合もある。再びパーム油を例にとる。前出の方法によるパルミチン酸の減少及びステアリン酸の上昇では、なおも相当なレベルのリノール酸が残り得る。ほとんどの高等植物種における内因性ＬＰＡＡＴ活性は、ｓｎ−２位にオレイン酸を優先的に挿入し得るものの、次の最優先種としてリノール酸を挿入し得る。オレイン酸レベルの低下に伴いリノール酸がｓｎ−２位を占有するようになり、その頻度が高まる。ｓｎ−２位にリノール酸を有するＴＡＧ種は、それらのＴＡＧが構造化脂肪で所望されるものと比べてはるかに高い融解温度を呈する傾向を有するため、構造化特性が不十分である。従って、次にはリノール脂肪酸レベルの低下によってステアリン酸の増加及びパルミチン酸の減少がバランスしなければならない。
次には、高ＳＯＳ含有脂肪を作り出すためには、リノール脂肪酸レベルを最小限に抑えなければならず、なぜなら、リノール酸は、高機能ＬＰＡＡＴを伴ったとしても、オレイン酸を排除するまでｓｎ−２位を占有し、所望の固形脂肪（室温で）とは対照的な液体油が作り出されるためである。リノール酸レベルは、本発明者らが微細藻類で実証しており、及び他の研究者らが植物油糧種子で示しているとおり、内因性ＦＡＤ２デサチュラーゼの下方調節によって；例えば、突然変異／古典的な株改良、ＦＡＤ２ノックアウト又は内因性ＦＡＤ２活性のＲＮＡｉ媒介性下方調節によって低下させることができる。これに伴い、脂肪酸プロフィール中のリノール酸レベルは少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、又は３００％低下し得る。例えば、本明細書に開示されるものと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＲＮＡｉ構築物を使用してＦＡＤ２を下方調節することができる。
かかるｓｎ−２選択性を有する出発株を選択してもよいが、また、ｓｎ−２位におけるオレイン酸をさらに押し上げ、且つＴＡＧプロフィール中のＳａｔ−Ｕｎｓａｔ−Ｓａｔをさらに押し上げるため、より高いオレイン酸選択性を有する外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子を導入することもできる。任意選択で、１つ以上の内因性ＬＰＡＡＴ対立遺伝子を、外来性の、特異性がより高いＬＰＡＡＴに置き換えることができる。
ＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ／ＳＯＳ産生生物から得られる細胞油は、ステロールプロフィールが従来の供給源と区別可能なものとして宿主生物の指標となる点で、従来のＳＯＳ／ＰＯＰ／ＰＯＳ供給源と区別することができる。従来のＳＯＳ／ＰＯＰ／ＰＯＳ供給源には、ココア、シア、マンゴー、サラノキ、イリッペ、コクム、及びアランブラキアが含まれる。微細藻類ステロールの考察については本開示の第ＸＩＩ節を参照のこと。
従って、本発明の実施形態には、細胞によって産生される油（即ち油又は脂肪）中のＳＯＳの量を増加させる方法がある。この方法は、細胞を提供する工程と、古典的技術及び／又は遺伝子工学技術（例えば、突然変異、選択、株改良、外来遺伝子の導入及び／又は調節因子エレメント、又はＲＮＡｉなどのＲＮＡレベル調節）を用いて（ｉ）油中のステアリン酸を増加させ、（ｉｉ）油中のリノール酸を減少させ、及び任意選択で（ｉｉｉ）ｓｎ−２位におけるオレイン酸の付加の立体特異性を増加させる工程とを含む。ステアリン酸を増加させる工程は、ＳＡＤによって不飽和化を減少させる工程（例えば、ノックアウト、ノックダウン又は調節エレメントの使用）と、パルミチン酸からステアリン酸への変換を増加させる工程（内在性又は外来性ＫＡＳＩＩの過剰発現及び／又はＦＡＴＡのノックアウト又はノックダウンを含む）とを含む。任意選択で、内因性ＦＡＴＡと比べてステアリン酸特異性がより高い外因性ＦＡＴＡを細胞で発現させることにより、ステアリン酸レベルを増加させる。ここで、ＦＡＴＡ遺伝子のステアリン酸特異性は、遺伝子産物によるパルミチン酸と比べたステアリン酸の切断速度の尺度である。ステアリン酸特異的ＦＡＴＡ遺伝子の挿入は、特異性の低い内在性ＦＡＴＡ遺伝子のノックダウン又はノックアウトと組み合わせることができる。このようにして、ステアリン酸の対パルミチン酸比を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％以上増加させることができる。リノール酸を減少させる工程は、ノックアウト及び／又はノックダウンを含めたＦＡＤｃ／ＦＡＤ２活性の低減によることができる。ｓｎ−２位のオレイン酸を増加させる工程は、本明細書に開示されるＬＰＡＡＴと少なくとも７５、８０、８５、９０、８５、９６、９７、９８、又は９９％のアミノ酸同一性を有するＬＰＡＡＴなどの外因性オレイン酸選択的ＬＰＡＡＴを発現する工程を含むことができる。
具体的な実施形態において、細胞（例えば、油産生微細藻類細胞又は他のプラスチド細胞）は、ＳＯＳリッチの（例えば、少なくとも５０％ＳＯＳ及びある場合には６０％ＳＯＳの）油を産生する。細胞は少なくとも４つの遺伝子が改変される：（ｉ）β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＫＡＳＩＩ）が過剰発現し、（ｉｉ）内因性ＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの活性が低下し、（ｉｉｉ）ステアリン酸特異的ＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが過剰発現し、（ｉｉｉ）内因性ＳＡＤ活性が低下し、及び（ｉｖ）内因性ＦＡＤ活性が低下する。実施例６５は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ微細藻で、内因性ＦＡＴＡ及びＳＡＤ２のコード領域を相同組換えで破壊し、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＫＡＳＩＩ）遺伝子を過剰発現させ、及びＦＡＤ２ ＲＮＡｉを活性化させて多価不飽和物を減少させることによってこの実施形態を実証する。
別の具体的な実施形態において、細胞（例えば、油産生微細藻類細胞又は他のプラスチド細胞）は、ＳＯＳリッチの（例えば、少なくとも５０％ＳＯＳ及びある場合には６０％ＳＯＳの）油を産生する。細胞は、少なくとも４つの遺伝子が改変される：（ｉ）β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＫＡＳＩＩ）が過剰発現し、（ｉｉ）内因性ＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの活性が低下し、（ｉｉｉ）ステアリン酸特異的ＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが過剰発現し、（ｉｖ）内因性ＳＡＤ活性が低下し、（ｖ）内因性ＦＡＤ活性が低下し、及び（ｖｉ）外因性オレイン酸選択的ＬＰＡＡＴが発現する。実施例６５及び６６を参照のこと。任意選択で、これらの遺伝子又は調節エレメントは、本明細書に開示される遺伝子又は遺伝子産物又は調節エレメントと少なくとも７５、８０、８５、９０、８５、９６、９７、９８、又は９９％の核酸又はアミノ酸同一性を有する。任意選択で、これらの遺伝子のうちの１つ以上が、本明細書に開示されるものの一つと少なくとも７５、８０、８５、９０、８５、９６、９７、９８、又は９９％の核酸同一性を有するものなどの、ｐＨ感受性又は窒素感受性（ｐＨ感受性又はｐＨ非感受性）プロモーターの制御下にある。任意選択で、細胞油は分画される（実施例６４を参照）。
ある実施形態では、本発明に係る細胞によって産生される脂肪を使用して、糖菓、キャンディーのコーティング、又は他の食品が製造される。結果として、チョコレート又はキャンディーバーのような食品は、ココアバターを使用して製造される類似製品の「スナップ性」（例えば割ったときの）を有し得る。使用される脂肪はβ多形形態であるか、又はβ多形形態となる傾向を有し得る。ある実施形態では、方法は、糖菓にかかる脂肪を加えることを含む。場合により、脂肪は、６５％超のＳＯＳ、４５％未満の不飽和脂肪酸、５％未満の多価不飽和脂肪酸、１％未満のラウリン酸、及び２％未満のトランス脂肪酸を有するＥＥＣ規則に従うココアバター同等物であってもよい。この脂肪はまた、ココアバター増量剤、向上剤、代替剤、又は抗ブルーミング剤として、又はシアバター代用物として、食品及びパーソナルケア製品中のものを含め使用することができる。本明細書に開示される細胞及び方法を使用して生成される高ＳＯＳ脂肪は、シアバター又はシア画分が要求される任意の用途又は配合で使用することができる。しかしながら、シアバターと異なり、本発明の実施形態により生成される脂肪は不鹸化物が低量であり；例えば、７、５、３、又は２％未満の不鹸化物であり得る。加えて、シアバターは、ジアシルグリセリドの存在に起因して劣化が速い傾向があるが、本発明の実施形態により生成される脂肪はジアシルグリセリドが低量であり；例えば、５、４、３、２、１、又は０．５％未満のジアシルグリセリドであり得る。
本発明のある実施形態には、ショートニング、詳細にはロールイン用ショートニングとして好適な細胞脂肪がある。従って、ショートニングを使用して、ペストリー又は他の多層状食品を作製してもよい。ショートニングは、本明細書に開示される操作された生物及び特に従属栄養微細藻類の生成方法を用いて生成することができる。ある実施形態では、ショートニングは、４０〜６０℃、好ましくは４５〜５５℃の融解温度を有し、１５〜２０％中鎖脂肪酸（Ｃ８〜Ｃ１４）、４５〜５０％長鎖飽和脂肪酸（Ｃ１６以上）、及び３０〜３５％不飽和脂肪酸（好ましくはリノール酸よりオレイン酸を多く含む）のトリグリセリドプロフィールを有し得る。ショートニングは、場合によりβ多形形態を経ることなしに、β’多形結晶を形成し得る。ショートニングはチキソトロピックであってもよい。ショートニングは３５℃で１５％未満の固形脂肪含有量を有し得る。特定の実施形態には、組換え微細藻によって産生されるロールイン用ショートニングとして好適な細胞油があり、ここで油は４００〜７００又は５００〜６００Ｐａの降伏応力及び１×１０５Ｐａ又は１×１０６Ｐａより大きい貯蔵弾性率を有する（実施例４６を参照のこと）。
構造化された固液脂肪系は、構造化油を使用して、それらを室温で液体の油（例えば、トリステアリン又はトリオレインが高い油）とブレンドすることにより生成され得る。このブレンドされる系は、食品スプレッド、マヨネーズ、ドレッシング、ショートニングにおける使用に（すなわち油水油型エマルションを形成することにより）好適であり得る。本明細書に記載される実施形態に係る構造化脂肪、特にＳＯＳが高いものは、他の油／脂肪とブレンドしてココアバター同等物、代用物、又は増量剤を作製することができる。例えば、６５％超のＳＯＳを有する細胞脂肪をパーム中融点画分とブレンドして、ココアバター同等物を作製することができる。
一般に、かかる高いＳａｔ−Ｕｎｓａｔ−Ｓａｔ脂肪又は脂肪系は、ホイップ済みクリーム、マーガリン、スプレッド、サラダドレッシング、ベイクド食品（例えばパン、クッキー、クラッカー、マフィン、及びペストリー）、チーズ、クリームチーズ、マヨネーズ等を含めた、様々な他の製品で使用することができる。
特定の実施形態では、上記に記載するＳａｔ−Ｕｎｓａｔ−Ｓａｔ脂肪がマーガリン、スプレッドなどの製造に使用される。例えば、米国特許第７１１８７７３号明細書、第６１７１６３６号明細書、第４４４７４６２号明細書、第５６９０９８５号明細書、第５８８８５７５号明細書、第５９７２４１２号明細書、第６１７１６３６号明細書、又は国際公開第９１０８６７７Ａ１号パンフレットに記載されるレシピ又は方法のいずれかを使用して、この脂肪からマーガリンを作製することができる。
ある実施形態では、脂肪は、場合により別の脂肪とブレンドされた、細胞の（例えば微細藻類細胞由来の）脂肪を含み、スプレッド又はマーガリン又は他の食品の製造に有用であり、遺伝子操作された細胞によって製造され、以下を含む脂肪酸に由来するグリセリドを有する：
（ａ）少なくとも１０重量％のＣ１８〜Ｃ２４飽和脂肪酸、
（ｂ）ステアリン酸及び／又はアラキジン酸及び／又はベヘン酸及び／又はリグノセリン酸を含むもの、及び
（ｃ）オレイン酸及び／又はリノール酸、一方、
（ｄ）飽和Ｃ１８酸／飽和（Ｃ２０＋Ｃ２２＋Ｃ２４）酸の比≧１、好ましくは≧５、より好ましくは≧１０、
これらのグリセリドは以下を含有する：
（ｅ）総脂肪酸重量に対して計算して≦５重量％のリノレン酸
（ｆ）総脂肪酸重量に対して計算して≦５重量％のトランス脂肪酸
（ｇ）ｓｎ−２位における≦７５重量％、好ましくは≦６０重量％のオレイン酸：これらのグリセリドは総グリセリド重量に対して計算して以下を含有する
（ｈ）≧８重量％ＨＯＨ＋ＨＨＯトリグリセリド
（ｉ）≦５重量％トリ飽和トリグリセリド、及び場合により以下の１つ以上の特性を有する：
（ｊ）１０℃で＞１０％の固形脂肪含有量
（ｋ）３５℃で≦１５％固形脂肪含有量、
（ｌ）１０℃で＞１５％の固形脂肪含有量及び３５℃で≦２５％の固形脂肪含有量、
（ｍ）（ＨＯＨ＋ＨＨＯ）及び（ＨＬＨ＋ＨＨＬ）トリグリセリドの比が＞１、好ましくは＞２であり、
ここでＨはＣ１８〜Ｃ２４飽和脂肪酸を表し、Ｏはオレイン酸を表し、Ｌはリノール酸を表す。
場合により、固体脂肪含有量（％ＳＦＣ）は、１０℃で１１〜３０、２０℃で４〜１５、３０℃で０．５〜８、及び３５℃で０〜４である。或いは、脂肪の％ＳＦＣは、１０℃で２０〜４５、２０℃で１４〜２５、３０℃で２〜１２、及び３５℃で０〜５である。関連する実施形態において、脂肪の％ＳＦＣは、１０℃で３０〜６０、２０℃で２０〜５５、３０℃で５〜３５、及び３５℃で０〜１５である。Ｃ１２〜Ｃ１６脂肪酸含有量は≦１５重量％であってもよい。脂肪は≦５重量％の不飽和ジグリセリドを有し得る。
関連する実施形態には、細胞油又は細胞油ブレンドから作製されるスプレッド、マーガリン又は他の食品がある。例えば、細胞脂肪を使用して、３０〜８０ｗｔ．％の脂肪相に分散した７０〜２０ｗｔ．％の水相を含む食用Ｗ／Ｏ（水／油）エマルションスプレッドを作製することができ、この脂肪相は、５０〜９９ｗｔ．％の植物性トリグリセリド油Ａと１〜５０ｗｔ．％の構造化トリグリセリド脂肪Ｂとの混合物であり、この脂肪は、５〜１００ｗｔ．％のハードストック脂肪Ｃと、最大９５ｗｔ．％の脂肪Ｄとからなり、ハードストック脂肪Ｃトリグリセリドの少なくとも４５ｗｔ．％がＳａｔＯＳａｔトリグリセリドからなり、ここでＳａｔは飽和Ｃ１８〜Ｃ２４炭素鎖を含む脂肪酸残基を表し、及びＯはオレイン酸残基を表すが、但し、脂肪の分画、水素化、エステル化又はエステル交換によって得られた任意のハードストック脂肪Ｃは除外するものとする。ハードストック脂肪は、本明細書に開示される方法に従い細胞によって生成される細胞脂肪であってよい。従って、ハードストック脂肪は、少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％のＳＯＳを有する位置特異的プロフィールを有する脂肪であってよい。Ｗ／Ｏエマルションは、米国特許第７，１１８，７７３号明細書を含む当該技術分野において公知の方法に合わせて調製することができる。
関連する実施形態において、細胞はまた、リシノール酸を産生する内因性ヒドロリアーゼ酵素も発現する。結果として、産生される油（例えば、液体油又は構造化脂肪）はより容易に乳化してマーガリン、スプレッド、又は他の食品又は非食品になり得る。例えば、産生される油は、乳化剤の添加を用いない又はより少量のかかる乳化剤を使用して乳化させることができる。米国特許出願第１３／３６５，２５３号明細書は、かかるヒドロキシラーゼを微細藻類及び他の細胞で発現させる方法を開示している。特定の実施形態において、細胞油は少なくとも１、２、又は５％のＳＲＳを含み、ここでＳはステアリン酸であり、Ｒはリシノール酸である。
代替的実施形態において、上記に記載したとおりのココアバター模倣物（又は、シア若しくはコラム模倣物等の他の高飽和−不飽和―飽和（ｓａｔ−ｕｎｓａｔ−ｓａｔ）油）である細胞油を分画してトリ飽和物（例えば、トリステアリン及びトリパルミチン、ＳＳＰ、及びＰＰＳ）を取り除くことができる。例えば、ＳＯＳ濃度の増加のためＳＡＤ活性が低下するように操作された微細藻類は、分画してトリ飽和物を取り除くことのできる油を作ることが分かっている。実施例４７及び実施例６４を参照のこと。特定の実施形態において、分画された細胞油の融解温度は、ココアバターの融解温度（約３０〜３２℃）と同程度である。ＰＯＰ、ＰＯＳ及びＳＯＳレベルは、それぞれ約１６、３８、及び２３％でココアバターに近くなり得る。例えば、ＰＯＰは１６％±２０％であってもよく、ＰＯＳは３８％±２０％であってもよく、ＳＯＳは２３％±２０％であってもよい。或いは、ＰＯＰは１６％±１５％であってもよく、ＰＯＳは３８％±１５％であってもよく、ＳＯＳは２３％±１５％であってもよい。或いは、ＰＯＰは１６％±１０％であってもよく、ＰＯＳは３８％±１０％であってもよく、ＳＯＳは２３％±１０％であってもよい。加えて、トリステアリンレベルはトリアシルグリセリドの５％未満であってもよい。
ある実施形態では、方法は、少なくとも４０、５０、又は６０％のＳＯＳを有するＴＡＧプロフィールを有する出発油を産生する遺伝子操作された（例えば、微細藻又は他の微生物）細胞から得られる細胞油を得る工程を含む。任意選択で、細胞は、過剰発現するＫＡＳＩＩ遺伝子、ＳＡＤノックアウト若しくはノックダウン、又は外来性Ｃ１８選択的ＦＡＴＡ遺伝子、外来性ＬＰＡＡＴ、及びＦＡＤ２ノックアウト若しくはノックダウンのうちの１つ以上を含む。油は乾燥分画又は溶媒分画によって分画され、出発油と比べてＳＯＳが増加し且つトリ飽和物が減少した濃縮油（ステアリン画分）が提供される。濃縮油は、少なくとも６０％、７０％又は８０％のＳＯＳを有し、トリ飽和物が５％、４％、３％、２％又は１％以下であり得る。濃縮油は、ｓｎ−２位に８５、９０、９５％以上のオレイン酸を有するｓｎ−２プロフィールを有し得る。例えば、分画油は、少なくとも６０％のＳＯＳ、５％以下のトリ飽和物及びｓｎ−２位における少なくとも８５％のオレイン酸を含み得る。或いは、油は、少なくとも７０％のＳＯＳ、４％以下のトリ飽和物及びｓｎ−２位における少なくとも９０％のオレイン酸か、又は８０％のＳＯＳ、４％以下のトリ飽和物及びｓｎ−２位における少なくとも９５％のオレイン酸を含み得る。任意選択で、油は、コクムバターと本質的に同一の最大ヒートフロー温度及び／又はＤＳＣで得られるＳＦＣ曲線を有する。ステアリン画分は、乾燥分画、溶媒分画、又はこれらの組み合わせによって得ることができる。任意選択で、本方法は、第１の温度及び第２の温度での二段階乾燥分画を含む。第１の温度（ｔｅｒｍｐｅｒａｔｕｒｅ）は第２の温度より高くても又は低くてもよい。具体的な実施形態において、第１の温度はＯＯＳの除去に有効であり、第２の温度はトリ飽和物の除去において有効である。任意選択で、第１の温度で処理した後、ステアリン画分が溶媒（例えばアセトン）で洗浄されることによりＯＯＳが除去される。任意選択で、第１の温度は約２４℃であり、第２の温度は約２９℃である。
ＶＩＩＩ．高中鎖油
本発明の実施形態において、細胞は、細胞中又は細胞の油中の中鎖脂肪酸（例えば、Ｃ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、又はＣ１６：０脂肪酸）のレベルを上昇させる働きをする組換え核酸を有する。細胞中又は細胞の油中の中鎖脂肪酸のレベルを増加させる一つの方法は、単独の改変として、或いは１つ以上の他の遺伝子改変との組み合わせで、中鎖脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して活性を有する外因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＦａｔＢ遺伝子によりコードされるもの）を発現するように細胞を操作することである。細胞又は細胞の油中の中鎖脂肪酸レベルを増加させるさらなる遺伝子改変は、置換アシルグリセロエステルのｓｎ−２位への中鎖脂肪酸アシル基の転移を触媒する活性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする外来性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現である。例えば、ＬＰＡＡＴ遺伝子は、実施例４３〜４４に開示される中鎖選択的ＬＰＡＡＴ（配列番号７７、７８、７９、８１、８２、８４、及び８５）と７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％のアミノ酸配列同一性を有し、又は７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の核酸配列同一性（又は遺伝子コードの縮重に起因して等価な配列）を有し得る。特定の関連する実施形態では、外因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びＬＰＡＡＴの両方が細胞で安定に発現する。ある実施形態では、組換え核酸は、外因性中鎖特異的チオエステラーゼ、及び置換アシルグリセロエステルのｓｎ−２位への中鎖脂肪酸アシル基の転移を触媒する外因性ＬＰＡＡＴの発現を生じさせる油産生細胞に（特にプラスチド微生物細胞に）導入される。結果として、細胞は、それが産生するＴＡＧ中の中鎖脂肪酸の割合が１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０倍、又はそれを超えて増加するように作られ得る。外因性ＬＰＡＡＴを導入すると、外来性中鎖選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを単独で導入するのと比較して、ｓｎ−２位における中鎖脂肪酸が１．２、１．５、１．７、２、３、４倍又はそれを超えて増加し得る。ある実施形態では、中鎖脂肪酸は、細胞によって産生されるＴＡＧ脂肪酸の３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％超である。様々な実施形態において、中鎖脂肪酸は、ラウリン酸、ミリスチン酸、又はパルミチン酸である。実施例３、４３、及び４４は、脂肪酸プロフィールの変化をもたらす微細藻類細胞における植物ＬＰＡＡＴの発現を記載する。これらの例にあるとおり、細胞はまた、外因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（これもまた植物由来であってよい）も、所与の脂肪酸アシル−ＡＣＰ鎖長に対する選択性を伴い発現し得る。例えば、微細藻類細胞は、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ８〜Ｃ１２、又はＣ８〜Ｃ１０脂肪酸を選択的に切断するＬＰＡＡＴ及びアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子を含み得る。特定の実施形態において、かかる細胞は、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、又は９０〜９９％、＞２０％、＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％又は＞９０％のＣ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ８〜Ｃ１２、又はＣ８〜Ｃ１０脂肪酸を含む脂肪酸プロフィールの細胞油を産生する能力を有する。他のＬＰＡＡＴは、Ｃ１６又はＣ１８脂肪酸を選択的に切断し得る（実施例４４を参照のこと）。脂肪酸デサチュラーゼ経路のさらなる遺伝子操作（例えば、以下に記載するとおり）により、油の安定性を増加させることができる。
これらの細胞油のいずれもエステル交換することができる。エステル交換は、例えば油の融解温度又は流動点を下げるために用いることができる。特定の実施形態では、細胞油は少なくとも５０％のカプリル酸とカプリン酸との合計を含み、流動点及び／又は動粘性率を低下させるためエステル交換され得る。かかる油（細胞油又はエステル交換油）は、場合により、例えば２％未満の多価不飽和脂肪酸を含む高安定性の油となり得る。
或いは、又は外因性ＬＰＡＡＴの発現に加えて、細胞は、外因性ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ酵素を発現させ、場合によりＫＡＳＩＩの活性を低下又は消失させる働きをする組換え核酸を含んでもよく、これは、中鎖選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現させる場合に特に有利である。実施例３７は、中鎖選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼと併せてＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ酵素を過剰発現するようにＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞を操作することによる、Ｃ１０〜Ｃ１２脂肪酸の産生が全脂肪酸の約５９％となる株の作成について記載する。中鎖産生はまた、ＫＡＳＩ及び／又はＫＡＳＩＩの活性を（例えばノックアウト又はノックダウンを用いて）抑制することによっても増加させることができる。実施例３８は、約７６％又は８４％のＣ１０〜Ｃ１４脂肪酸となる脂肪酸プロフィールを実現する、中鎖選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの過剰発現と併せたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）ＫＡＳＩの異なる対立遺伝子の染色体ノックアウトについて詳細する。実施例３９は、ＫＡＳＩ ＲＮＡヘアピンポリヌクレオチドが発現する結果として高い中鎖脂肪酸を特徴とする組換え細胞及び油を提供する。これらの改変のいずれかに加え、ＳＡＤ又はＦＡＤ酵素の不飽和又は多価不飽和脂肪酸の産生を（例えばノックアウト又はノックダウンによって）抑制することができる。
詳細な実施形態において、組換え細胞は、４０％又はそれを超えるラウリン酸を有するＴＡＧを産生する。別の関連する実施形態において、組換え細胞は、４０％又はそれを超えるミリスチン酸、カプリル酸、カプリン酸、又はパルミチン酸の脂肪酸プロフィールを有するＴＡＧを産生する。例えば、油産生組換え緑色植物（ｃｌｏｒｏｐｈｙｔｅ）細胞は、油中４０％のラウリン酸又はミリスチン酸を産生することができ、これは細胞乾燥重量の４０、５０、又は６０％又はそれを超える割合を構成する。
特定の実施形態において、組換え細胞は、置換アシルグリセロエステルのｓｎ−２位への中鎖脂肪酸アシル基の転移を触媒するリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸と、ＡＣＰからの中鎖脂肪酸の切断を触媒する活性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸とを含む。結果として、一実施形態において、産生される油は、組換え核酸の結果としてＣ１０及びＣ１２脂肪酸が上昇し、且つＣ１６、Ｃ１８、及びＣ１８：１脂肪酸が低下した脂肪酸プロフィールにより特徴付けられ得る。実施例３を参照されたく、ここではＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びＣｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ ＬＰＡＡＴ遺伝子の過剰発現によりＣ１２脂肪酸の割合が非形質転換細胞における約０．０４％から約４６％に増加し、Ｃ１０脂肪酸の割合が非形質転換細胞における約０．０１％から約１１％に増加した。例えば、ＦＡＴＢ遺伝子は、配列番号１０又は１１と７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％のアミノ酸配列同一性を有し、又は７５、８０、８５ ９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の核酸配列同一性（又は遺伝子コードの縮重に起因して等価な配列）を有し得る。関連する実施形態では、中鎖脂肪酸産生の増加は７０％より大きく、７５〜８５％、７０〜９０％、９０〜２００％、２００〜３００％、３００〜４００％、４００〜５００％、又は５００％より大きい。
平均鎖長もまた、Ｃ１８特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの過剰発現によって低下させることができる。Ｃ１８又は他のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを過剰発現させる働きをする組換え核酸を、単独で、又は本明細書に記載される他の構築物との組み合わせで使用して、平均鎖長をさらに低下させることができる。数ある用途の中でも特に、産生される油は、ココアバター／乳脂肪代用物として使用することができる。実施例４５及び図１７の考察を参照のこと。ある実施形態では、上述の高中鎖産生細胞の１つが、上記第ＩＶ章で記載したとおり１つ以上の脂肪酸アシルデサチュラーゼをノックアウト又はノックダウンすることにより、低多価不飽和油を産生するようにさらに操作される。従って、産生される油は、当該の章又は対応する実施例で言及している高い安定特性を有し得る。特定の実施形態において、細胞は、３０％超の中鎖脂肪酸及び５％以下の多価不飽和物を含む油を産生する。関連する実施形態において、細胞は、４０％超の中鎖脂肪酸及び４％以下の多価不飽和物を含む油を産生する。さらなる関連する実施形態において、細胞は、５０％超の中鎖脂肪酸及び３％以下の多価不飽和物を含む油を産生する。
具体的な実施形態において、細胞は、ラウリン酸とミリスチン酸との合計が少なくとも５０％、６０％、７０％、又は７５％である脂肪酸プロフィールによって特徴付けられる油を産生する。これは、実施例３７〜３９、４３〜４４、５２、及び６０〜６１の技法を用いて達成することができる。例えば、実施例５２は、外因性植物ＦＡＴＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを有する組換え細胞を使用してラウリン酸とミリスチン酸との合計が約７９％である脂肪酸プロフィールを有する油を生成する方法を記載する。
別の具体的な実施形態において、細胞は、カプリン酸（Ｃ１０：０）が少なくとも３０％であり、且つラウリン酸（Ｃ１２：０）が少なくとも３０％である脂肪酸プロフィールによって特徴付けられる細胞油を産生する。例えば、細胞油中のカプリン酸及びラウリン酸の絶対レベルは、５、１０、１５、２０又は３０％以内にバランスしていてもよい。これは、実施例３７〜３９、４３〜４４、５２、及び６０〜６１の技法を用いて達成することができる。実施例６０にあるとおり、外来性植物ＦＡＴＢ及びＫＡＳＩ（又はＫＡＳＩＶ）遺伝子を組み合わせることにより、バランスしているカプリン酸及びラウリン酸レベルを提供し得る。任意選択で、内在性ＫＡＳＩ遺伝子をノックアウトし、外来性ＫＡＳＩに置き換えることができる。加えて、２つ以上の外来性ＦＡＴＢ遺伝子を使用することにより、所望の脂肪酸プロフィールに確実に達することができる。具体的な実施形態において、微細藻類細胞は少なくとも１つ及び任意選択で少なくとも２つの外来性ＦＡＴＢ遺伝子及び外来性ＫＡＳＩ／ＫＡＳＩＶ遺伝子を発現し、少なくとも３０％のＣ１０及び少なくとも３０％のＣ１２脂肪酸を有する抽出可能な細胞油を産生する。例えば、細胞は、Ｃｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ ＦＡＴＢ２（配列番号１５８）と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のアミノ酸配列同一性を有するＦＡＴＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＡ１（配列番号１５９、代替トランジットペプチドを含む）と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のアミノ酸配列同一性を有するβ−ケトアシルＡＣＰシンターゼを発現することができる。さらに、第２の外来性ＦＡＴＢ遺伝子／酵素を発現させることができる。第２のＦＡＴＢは、Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＦＡＴＢ２アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号１１）と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のアミノ酸配列同一性を有し得る。これらの目的上、プラスチド標的ペプチドは、プラスチド標的トランジットペプチド（これはあまり保存されておらず、残りの酵素ドメイン配列と比べてより容易に置換可能である）を含んで又は含まずアラインメントすることができる。
ある実施形態では、細胞は、７５％超の飽和脂肪酸を含む油を生成する。任意選択で、細胞は、７５％超の飽和脂肪酸を含み、２５％未満のカプリン酸、５０％未満のラウリン酸、及び５％未満のパルミチン酸を有する油を産生する。関連する実施形態では、油は少なくとも８０％、９５％又は９０％の飽和脂肪酸を含む。実施例６０は、複数の外来性ＦＡＴＢ遺伝子、及び植物由来の外来性ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ遺伝子による内在性ＫＡＳＩ遺伝子の置換を含む微細藻類によるかかる油の産生を記載する。
実施例６０及び６２はまた、ＦＡＴＢ及びＫＡＳ遺伝子の選択によって、少なくとも５０％の総飽和物を有し、カプリン酸及びラウリン酸が２０％以内に（又はさらには１５％、又は１０％以内に）バランスしている油を生じさせ得ることを示す。
一般に高度中鎖油、及び実施例６０及び６２のものと同様の株によって産生されるものは、低い動粘性率を有し得る。例えば、油は、４０℃でＡＳＴＭ Ｄ４４５を使用して計測したとき２５ｃＳ±２０％、２５ｃＳ±１０％、又は２５ｃＳ±５％の動粘性率を有し得る。同様に、油は、１００℃でＡＳＴＭ Ｄ４４５によるとき５．４ｃＳ±２０％、５．４ｃＳ±１０％、又は５．４ｃＳ±５％の動粘性率を有し得る。油は、ＡＳＴＭ ２２８０を使用して計測したとき１６０±２０％、１６０±１０％、又は１６０±５％の粘度指数を有し得る。
具体的な例では、実施例６０に報告されるものと同様の株を使用して調製された油は、３０％超のＣ１０：０及び３０％超のＣ１２：０脂肪酸を有する油を産生した。この油は、４０℃で２４．６１ｃＳｔ及び１００℃で５．３６ｃＳｔのＡＳＴＭ ４４５による動粘性率（ｋｉｎｅｍａｔｉｃ ｖｉｓｃｏｃｉｔｙ）を有し、１５９の粘度指数（ＡＳＴＭ ２２７０）であった。この油を作るため、Ｃｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ ＦＡＴＢ２アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＡ１遺伝子（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＳＡＤトランジットペプチドを含む）と共に、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおいて、それぞれＵＡＰＡ１及びＡＭＴ０３プロモーターの存在下で発現させた。選択マーカーにおいてネオマイシン耐性（ｒｅｓｉｔａｎｃｅ）を使用し、構築物をＫＡＳ１−１部位に組み込んだ。従って、ある実施形態では、宿主細胞は、配列番号１５８と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を発現し、また、配列番号１５９と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質も発現する外来遺伝子を含む。細胞は、少なくとも３０％のＣ１０：０及び／又は少なくとも３０％のＣ１２：０脂肪酸を含む油を産生する。任意選択で、細胞から、４０℃でＡＳＴＭ Ｄ４４５を使用して計測したとき３０ｃＳｔ未満の動粘性率を有する細胞油を抽出することができる。
これらの油の加水分解により得られる高中鎖油又は脂肪酸は、潤滑剤及び界面活性剤の製造を含め、食品、燃料（ｆｕｌｅ）及び油脂化学品用途において特に有用であり得る。例えば、細胞から得られる脂肪酸は、エステル化、クラッキング、アルデヒド又はアルコールへの還元、アミノ化、硫酸化、スルホン化、又は当該技術分野において公知の他の化学的処理に供され得る。
一部の実施形態では、細胞油はエステル交換され、エステル交換した細胞油の動粘性率は、４０℃で３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１センチストーク未満である。一部の実施形態では、動粘性率は４０℃で３センチストーク未満である。一部の実施形態では、エステル交換した細胞油の流動点は、５℃、０℃、−１０℃、−１２℃、−１５℃、−２０℃、−２５℃、−３０℃、−３５℃、−４０℃、−４５℃、又は−５０℃未満である。一部の実施形態では、流動点は−１０℃未満である。一部の実施形態では、流動点は−２０℃未満である。
実施例５３は、微細藻類において６０％超のミリスチン酸を含む油を産生するための藻類における植物ＦａｔＢ遺伝子の使用について記載する。ある実施形態では、配列番号８７又は配列番号８９と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、場合により上記に記載したとおりの中鎖選択的ＬＰＡＡＴと組み合わせて使用される。
実施例６２に記載されるとおり、本発明者らは、意外にも、ＫＡＳＩ遺伝子とＦＡＴＢ遺伝子との組み合わせが、いずれの遺伝子も単独では行うことができないような形で細胞によって産生される油の脂肪酸プロフィールをシフトさせ得ることを発見した。具体的には、外来性植物ミリスチン酸選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを有する組換え細胞は、ＫＡＳＩ遺伝子を共発現させたとき、ラウリン酸の割合が大きくなるようにその脂肪酸プロフィールをシフトさせることが発見された。ＫＡＳＩはエロンガーゼ活性を有するが、それにも関わらず脂肪酸プロフィールは短鎖の方にシフトしたため、これは予想外である。換言すれば、外来性ＦＡＴＢ及びＫＡＳＩ遺伝子の両方を発現する細胞は、ＦＡＴＢ遺伝子を有するがＫＡＳＩ遺伝子は有しない対照細胞と比べてより短い脂肪酸鎖の方にシフトする脂肪酸プロフィールを有する油を産生した。従って、本発明の実施形態は、組換え細胞を構築する工程又はその細胞を使用して油を作る工程を含み、ここで細胞は、所与の鎖長選好を有する外来性ＦＡＴＢとＫＡＳＩ遺伝子とを含み、細胞は、ＫＡＳＩ遺伝子なしに得られるものと比べてより短鎖に向かう分布のシフトを伴う油を作る。任意選択で、ＦＡＴＢ遺伝子は、実施例６２のＣｃＦＡＴＢ２−ＵｃＦＡＴＢ２ ＦＡＴＢ（配列番号１６２）、Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＦＡＴＢ２（配列番号１１）、Ｃｕｐｈｅａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＦＡＴＢ２（配列番号８７；配列番号８９）、Ｃｕｐｈｅａ ｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ ＦＡＴＢ１（配列番号１６３）、Ｃｕｐｈｅａ ｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ ＦＡＴＢ３（配列番号１６４）、又はＣｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ ＦＡＴＢ２（配列番号１５８）と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一の核酸配列（又は遺伝子コードの縮重（ｄｅｇｅｎｅｒｅｃｙ）により等価な配列）を有するか、或いは最低８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する。任意選択で、ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ遺伝子は、実施例６２のＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＡＩ（配列番号１５９）、配列番号４９の配列によってコードされるＣｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ ＫＡＳＩＶ、又は配列番号４８によってコードされるＣｕｐｈｅａ ｐｕｌｃｈ ＫＡＳＩＶと少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一の核酸配列（又は遺伝子コードの縮重（ｄｅｇｅｎｅｒｅｃｙ）により等価な配列）を有するか、或いは最低８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する。
ＩＸ．高オレイン酸／パルミチン酸油
別の実施形態には、約６０％のオレイン酸、２５％のパルミチン酸及び場合により５％又はそれ以下の多価不飽和物を含む高オレイン酸油がある。高オレイン酸油は、米国特許出願第１３／３６５，２５３号明細書（その関連する部分が参照により援用される）に開示される方法を用いて生成することができる。例えば、細胞が、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを抑制（例えばＦＡＴＡをコードする遺伝子のノックアウト又はノックダウン）するとともにＫＡＳＩＩ活性を増加させる遺伝子を発現する働きをする核酸を有し得る。細胞は、上記に記載するとおりの遺伝子発現の調節を含め、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼの発現を阻害するさらなる改変を有してもよい。結果として、多価不飽和物は、５、４、３、２、又は１面積％以下となり得る。
Ｘ．低飽和物油
ある実施形態では、細胞油は組換え細胞から産生される。産生される油は、４％、３％、２％、又は１％（面積％）未満の飽和脂肪酸を有する脂肪酸プロフィールを有する。特定の実施形態において、油は０．１〜３．５％の飽和脂肪酸を有する。特定のかかる油を使用して、飽和脂肪酸の量が無視し得る程度である食品を製造することができる。場合により、これらの油は、少なくとも９０％のオレイン酸又は少なくとも９０％のオレイン酸と少なくとも３％の多価不飽和脂肪酸を含む脂肪酸プロフィールを有し得る。ある実施形態では、組換え細胞によって産生される細胞油は、少なくとも９０％のオレイン酸、少なくとも３％のリノール酸とリノレン酸との合計を含み、且つ３．５％未満の飽和脂肪酸を有する。関連する実施形態において、組換え細胞によって産生される細胞油は、少なくとも９０％のオレイン酸、少なくとも３％のリノール酸とリノレン酸との合計を含み、且つ３．５％未満の飽和脂肪酸を有し、この飽和脂肪酸の大部分は鎖長１０〜１６で構成される。これらの油は、限定はされないが、本明細書及び米国特許出願第１３／３６５，２５３号明細書に記載されるものを含め、組換え油産生細胞によって産生され得る。例えば、高活性ＳＡＤを含む細胞におけるＫＡＳＩＩ酵素の過剰発現は、飽和物が３．５％以下の高オレイン酸油を産生し得る。場合により、オレイン酸特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及び／又はノックアウト若しくは抑制されたＣ１８未満のアシル鎖を加水分解する傾向を有する内因性チオエステラーゼもまた過剰発現される。オレイン酸特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、産生される油の脂肪酸プロフィールにおけるパルミチン酸とステアリン酸との合計に対するオレイン酸の比が３、５、７、又は１０より大きくなるように、ＡＣＰ−パルミチン酸及びＡＣＰ−ステアリン酸に対する活性が低い導入遺伝子であってもよい。或いは、又はそれに加えて、以下の実施例３６にあるとおり、ＦＡＴＡ遺伝子がノックアウト又はノックダウンされてもよい。ＦＡＴＡ遺伝子をノックアウト又はノックダウンし、且つ外来性ＫＡＳＩＩを過剰発現させてもよい。別の任意選択の改変は、ＫＡＳＩ及び／又はＫＡＳＩＩＩ活性を増加させることであり、これは、より短鎖の飽和物の形成をさらに抑制し得る。場合により、置換グリセロールに対する不飽和脂肪酸アシル部分の転移に特異性を有する１つ以上のアシルトランスフェラーゼ（例えばＬＰＡＡＴ）もまた過剰発現され、及び／又は内因性アシルトランスフェラーゼがノックアウト又は減弱される。さらなる任意選択の改変は、不飽和脂肪酸の伸長に特異性を有するＫＣＳ酵素の活性を増加させることであり、及び／又は飽和脂肪酸の伸長に特異性を有する内因性ＫＣＳがノックアウト又は減弱される。場合により、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼのノックアウト又はノックダウンにより、リノール酸産生を犠牲にしてオレイン酸が増加する；例えば、本特許出願の第ＩＶ章の技術が用いられる。任意選択で、使用される外来遺伝子は植物遺伝子；例えば、油糧種子に見られるｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡから得られるものであってもよい。
実施例５１に記載するとおり、飽和脂肪のレベルはまた、パルミチン酸をパルミトレイン酸に不飽和化する外来遺伝子（例えば、植物遺伝子）の導入によって低下させてもよい。油産生細胞において使用される好適な遺伝子の例が、Ｍａｃｆａｄｙｅｎａ ｕｎｇｕｉｓ（キャッツクロー）、Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ（マカダミアナッツ）及びＨｉｐｐｏｐｈａｅ ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ（シーバックソーン）を含む植物に見られる。パルミトイル−ＡＣＰを不飽和化する変異体外因性又は内在性ＳＡＤもまた使用することができ、これは実施例５１でさらに考察する。場合により、ＰＡＤ又はＳＡＤ遺伝子は、実施例５１に記載される遺伝子産物と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。この改変は、単独で用いることもでき、又はこの直前、第ＩＸ章及び実施例に記載するものなど、１つ以上の内在性ＦＡＴＡ対立遺伝子のノックアウト又はノックダウン及び／又はＫＡＳＩＩの過剰発現を含めた、オレイン酸を増加させる改変との組み合わせで用いることもできる。一実施形態において、油産生微細藻類などの油産生細胞は、（ｉ）ＦＡＴＡノックアウト又はノックダウンと、（ｉｉ）外来性ＰＡＤ遺伝子（これはまた、Ｌ１１８Ｗ変異体又は等価物等のＰＡＤ活性を有する変異体ＳＡＤであってもよい、実施例５５〜５６を参照のこと）の発現及び／又はＰＡＤ活性を付与する内在性ＳＡＤ遺伝子における突然変異との組み合わせを有する。かかる細胞は、過剰発現した内在性又は外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子をさらに含み得る。本発明のこれらの実施形態のいずれにおいても、油産生細胞は、１〜２、２〜３、３〜４、５〜６、７〜８、９〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、又は９０〜１００面積パーセントのパルミトレイン酸を含む脂肪酸プロフィールを有する油を産生する。具体的な実施形態において、細胞は、５０％超のオレイン酸、１％超のパルミトレイン酸、及び３．５面積％以下の飽和脂肪酸を産生する。別の具体的な実施形態において、真核微細藻類細胞は、微細藻類細胞において作動可能な調節エレメントに作動可能に連結した、パルミチン酸をパルミトレイン酸に不飽和化する外来遺伝子を含む。外来遺伝子産物の発現及び活性に起因して、細胞は、パルミチン酸（Ｃ１６：０）に対するパルミトレイン酸（Ｃ１６：１）の比が少なくとも０．０５、０．１又は０．１５、又は０．１８である脂肪酸プロフィールを有する細胞油を産生する。例えば、かかる油を産生する細胞の実施例５５を参照のこと。任意選択で、パルミトレイン酸はプロフィールの０．５％以上を占める。任意選択で、細胞油は３．５％未満の飽和脂肪酸を含む。
上記の遺伝子改変に加え、低飽和物油は、多価不飽和脂肪酸が低量であるために高安定性の油であり得る。高安定性、低多価不飽和の油の方法及び特性決定は、内因性Δ１２脂肪酸デサチュラーゼの活性を低下させる方法を含め、低多価不飽和油という見出しの上記の章に記載される。特定の実施形態において、油は、ＩＩ型脂肪酸合成経路を有する油産生微生物細胞によって産生され、飽和脂肪酸が３．５％以下であり、また多価不飽和脂肪酸も３％以下である。別の特定の実施形態において、油は、飽和脂肪酸が３％以下であり、また多価不飽和脂肪酸も２％以下である。別の特定の実施形態において、油は、飽和脂肪酸が３％以下であり、また多価不飽和脂肪酸も１％以下である。別の具体的な実施形態において、真核微細藻類細胞は、微細藻類細胞において作動可能な調節エレメントに作動可能に連結した、パルミチン酸をパルミトレイン酸に不飽和化する外来遺伝子を含む。細胞は、ＦＡＤ遺伝子のノックアウト又はノックダウンをさらに含む。遺伝子改変に起因して、細胞は、パルミチン酸（Ｃ１６：０）に対するパルミトレイン酸（Ｃ１６：１）の比が０．１を超え、多価不飽和脂肪酸が３％以下である脂肪酸プロフィールを有する細胞油を産生する。任意選択で、パルミトレイン酸はプロフィールの０．５％以上を占める。任意選択で、細胞油は３．５％未満の飽和脂肪酸を含む。
低コストで目標の飽和脂肪酸レベルに達するように、低飽和及び低飽和／高安定性の油を安価な油とブレンドすることができる。例えば、１％飽和脂肪の油を、７％の飽和脂肪を有する油（例えば高オレイン酸ヒマワリ油）とブレンドして、３．５％以下の飽和脂肪を有する油を提供することができる。
本発明の実施形態により生成される油は、数ある用途の中でも特に、輸送燃料、油脂化学品、及び／又は食品及び化粧品工業において使用することができる。例えば、脂質のエステル転移反応により、バイオディーゼルとして有用な長鎖脂肪酸エステルが生じ得る。他の酵素的及び化学的プロセスを、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、アルカン、及びアルケンの産生に合わせて調整することができる。用途によっては、再生可能ディーゼル、ジェット燃料、又は他の炭化水素化合物が生成される。本開示はまた、生産性の増加及び脂質収率の増加のため、及び／又は本明細書に記載される組成物のより費用対効果の高い生産のために微細藻類を培養する方法も提供する。本明細書に記載される方法は、プラスチド細胞培養物からの油の大規模な（例えば、１０００、１０，０００、１００，０００リットル又はそれを超える）生成を可能にする。
ある実施形態では、細胞から抽出された油は、３．５％、３％、２．５％、又は２％以下の飽和脂肪を有し、食品に添合される。完成した食品は、３．５、３、２．５、又は２％以下の飽和脂肪を有する。例えば、かかる組換え微細藻類から回収される油は、フライ油に、又は飽和脂肪が低い加工食品の一成分として使用することができる。油はニートで使用されてもよく、又は食品が有する飽和脂肪が一食当たり０．５ｇ未満であり、従って（米国の規制に従い）ゼロ飽和脂肪を謳う表示が可能となるように、他の油とブレンドされてもよい。具体的な実施形態において、油は、少なくとも９０％のオレイン酸、３％未満の飽和脂肪、及びリノール酸より多いオレイン酸を有する脂肪酸プロフィールを有する。
本特許出願に開示される他の油と同様に、本節に記載される低飽和油は、高レベルのパルミトレイン酸を有するものを含め、本願の第ＸＩＩ節に記載されるとおりの微細藻類ステロールプロフィールを有し得る。例えば、外来性ＰＡＤ遺伝子の発現によって、ＦＡＭＥ ＧＣ／ＦＩＤ分析によって決定するとき少なくとも０．１のパルミチン酸に対するパルミトレイン酸の比及び／又は０．５％以上のパルミトレイン酸レベルによって特徴付けられる脂肪酸プロフィールと、β−シトステロールと比べたエルゴステロールの過剰及び／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又はクリオナステロールの存在によって特徴付けられるステロールプロフィールとを有する油を生成することができる。
ＸＩ．ココアバター／乳脂肪ブレンド模倣物
特定の実施形態において、細胞は、ココアバターと乳脂肪とのブレンドに近い温度依存性固形脂肪含有量（「ＳＦＣ曲線」）を有する細胞油を生成する。かかる油は、ココアバター／乳脂肪ブレンドを使用できるところ；例えば、チョコレート、他の糖菓、アイスクリーム又は他の冷菓、ペストリー、又はクイックブレッド用、若しくは他のベイクド食品用を含む生地において使用され得る。この油は、ブルーミングを抑え、風味を増強し、テクスチャを増強し、又はコストを低減し得る。特定の例では、細胞油に近い。従って、本発明の実施形態は、レシピにおけるココアバター／乳脂肪（ｍｉｌｆａｔ）ブレンドに代えて組換え微細藻類細胞からの細胞油を使用することである。関連する実施形態において、
図１７は、以下のとおりの様々な油についての％固形脂肪含有量のプロットを示す：（ａ）脂質経路を操作していないＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＲＢＤ油、（ｂ）ブラジル産ココアバター＋２５％乳脂肪、（ｃ）ＳＡＤ対立遺伝子のレベルを低下させ、従ってＴＡＧプロフィールにおけるオレイン酸を低下させてステアリン酸を増加させるヘアピン核酸を発現する株からのＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＲＢＤ油の３レプリケート、（ｄ）内因性ＯＴＥ（オレオイルアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、実施例４５を参照）を過剰発現する株からのＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＲＢＤ油、（ｅ）マレーシア産ココアバター＋２５％乳脂肪、及び（ｆ）マレーシア産ココアバター。ココアバター及びココアバター乳脂肪値は文献値である（Ｂａｉｌｅｙ’ｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｏｉｌｓ ａｎｄ Ｆａｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，６ｔｈ ｅｄ．）、
本発明の実施形態において、７５％ココアバター／２５％乳脂肪ブレンドと熱的特性が類似している細胞油が、上記に記載する微細藻類細胞又は他の細胞により生成される。細胞は、油の固形脂肪含有量（例えばＮＭＲによって決定するとき）が２０℃で３８％±３０％、２５℃で３２％±３０％、３０℃で１７％±３０％、及び３５℃で５％未満±３０％になるようにするため、細胞によって産生されるトリグリセリドの脂肪酸プロフィールを変える働きをする組換え核酸を含む。明確にする目的から、±１０％は、パーセントＳＦＣに対するパーセントを指す（例えば、５％ＳＦＣの３０％は１．５％ＳＦＣであり、従って範囲は３５℃で３．５〜６．５％ＳＦＣである）。関連する実施形態では、油の固形脂肪含有量（例えばＮＭＲによって決定するとき）は、２０℃で３８％±２０％、２５℃で３２％±２０％、３０℃で１７％±２０％、及び３５℃で５％未満±２０％であり、又は油の固形脂肪含有量（例えば、ＮＭＲによって決定するとき）は、２０℃で３８％±１０％、２５℃で３２％±１０％、３０℃で１７％±１０％、及び３５℃で５％未満±１０％である。
別の実施形態において、第ＩＸ節又は対応する実施例の方法に従い生成される高オレイン酸細胞油は、飽和脂肪酸の供給源（例えばハードストック脂肪又は飽和脂肪酸エステル）との酵素エステル交換又はエステル転移反応によってココアバター等価物、代用物、増量剤などの構造化脂肪に変換される。例えば、１，３−特異的リパーゼを使用して、８０％超のオレイン酸を有する高オレイン酸油にステアリン酸、パルミチン酸又は両方を加えることができる。
ＸＩＩ．微量油成分
上記の方法により産生される油は、ある場合には、微細藻類宿主細胞を使用して作製される。上記に記載したとおり、微細藻は、限定なしに、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｃｅａｅ、又はＣｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅの分類に含まれる。Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅの微細藻類は、そのステロールプロフィールに基づき植物油と区別できることが分かっている。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓにより産生される油は、ＧＣ−ＭＳによって検出したとき、ブラシカステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、及びβ−シトステロールであるように見えるステロールを産生することが見出された。しかしながら、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａによって産生されるステロールは全て、Ｃ２４β立体化学を有すると考えられる。従って、カンペステロール、スチグマステロール、及びβ−シトステロールとして検出された分子は、実際には、それぞれ２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール及びクリオナステロールであると考えられる。従って、上記に記載する微細藻類によって産生される油は、Ｃ２４β立体化学を有するステロールの存在と、存在するステロールにおけるＣ２４α立体化学の非存在とにより植物油と区別することができる。例えば、産生される油は２２，２３−ジヒドロブラシカステロールを含有する一方、カンペステロールが欠損していてもよい；クリオナステロールを含有する一方、β−シトステロールが欠損していてもよく、及び／又はポリフェラステロールを含有する一方、スチグマステロールが欠損していてもよい。或いは、又は加えて、油は多量のΔ７−ポリフェラステロールを含有していてもよい。
一実施形態において、本明細書に提供される油は植物油ではない。植物油は、植物及び植物の種子から抽出された油である。植物油は、本明細書に提供される非植物油と、それらの含油量に基づき区別することができる。含油量を分析するための様々な方法を用いて、油の供給源、又は本明細書に提供される油と異なる（例えば植物）由来の油との不純物混和が起こったかどうかを決定することができる。この決定は、分析法の１つ又は組み合わせに基づき行うことができる。これらの試験としては、限定はされないが、遊離脂肪酸、脂肪酸プロフィール、全トリアシルグリセロール含有量、ジアシルグリセロール含有量、過酸化物価、分光特性（例えば紫外吸収）、ステロールプロフィール、ステロール分解産物、抗酸化剤（例えばトコフェロール）、色素（例えばクロロフィル）、ｄ１３Ｃ値及び官能分析（例えば、味、匂い、及び口当たり）の１つ以上の分析が挙げられる。食用脂肪及び油に関するＣｏｄｅｘ Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ規格など、市販の油用に多くのかかる試験が標準化されている。
ステロールプロフィール分析は、生物学的有機物源の決定に特によく知られている方法である。カンペステロール、ｂ−シトステロール、及びスチグマステロールが一般的な植物ステロールであり、ｂ−シトステロールは主要な植物ステロールである。例えば、ｂ−シトステロールは、ある種の種子油の分析で最も多い存在量であることが見出されており、トウモロコシ油において約６４％、菜種油において２９％、ヒマワリ油において６４％、綿実油において７４％、大豆油において２６％、及びオリーブ油において７９％であった（Ｇｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：７１−７９，２００６）。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株ＵＴＥＸ１４３５から分離した油を個別に清澄化（ＣＬ）、精製及び漂白（ＲＢ）するか、又は精製、漂白、及び脱臭（ＲＢＤ）し、ＪＡＯＣＳ ｖｏｌ．６０，ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ １９８３に記載される手順に従いステロール含有量について試験した。分析結果を以下の表５ｂに示す（ｍｇ／１００ｇ単位）。
これらの結果は、３つの顕著な特徴を示す。第一に、あらゆるステロールのなかでエルゴステロールが最も豊富であり、全ステロールの約５０％以上を占めることが分かった。エルゴステロールの量は、カンペステロール、β−シトステロール、及びスチグマステロールを合わせた量より多い。エルゴステロールは真菌によく見られ、一般に植物には見られないステロイドであり、その存在、特に多量の存在は、非植物油の有用なマーカーとなる。第二に、この油はブラシカステロールを含有することが分かった。菜種油を除いては、ブラシカステロールは一般に植物系の油には見られない。第三に、２％未満のβ−シトステロールが存在することが分かった。β−シトステロールは、一般に微細藻類には見られない顕著な植物ステロールであり、その存在、特に多量の存在は、植物由来の油の有用なマーカーとなる。要約すれば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株ＵＴＥＸ１４３５は、全ステロール含有量に対する割合として多量のエルゴステロールを含有すると共に、β−シトステロールは微量にしか含有しないことが見出された。従って、エルゴステロール：β−シトステロールの比又はブラシカステロールの存在との組み合わせを使用して、この油を植物油と区別することができる。
一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合として、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満のβ−シトステロールを含有する。他の実施形態では、油はβ−シトステロールを含まない。本願に開示される任意の油又は細胞油について、油は、上記の表５ｂの任意の列のステロールプロフィールを有することができ、ステロール毎に３０％、２０％、１０％以下のばらつきがある。
一部の実施形態では、油は、β−シトステロール、カンペステロール、又はスチグマステロールの１つ以上を含まない。一部の実施形態では、油は、β−シトステロール、カンペステロール、及びスチグマステロールを含まない。一部の実施形態では、油はカンペステロールを含まない。一部の実施形態では、油はスチグマステロールを含まない。
一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合として、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の２４−エチルコレスタ−５−エン−３−オールを含む。一部の実施形態では、２４−エチルコレスタ−５−エン−３−オールはクリオナステロールである。一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％のクリオナステロールを含む。
一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合として、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の２４−メチルコレスタ−５−エン−３−オールを含有する。一部の実施形態では、２４−メチルコレスタ−５−エン−３−オールは２２，２３−ジヒドロブラシカステロールである。一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％の２２，２３−ジヒドロブラシカステロールを含む。
一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合として、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の５，２２−コレスタジエン−２４−エチル−３−オールを含有する。一部の実施形態では、５，２２−コレスタジエン−２４−エチル−３−オールはポリフェラステロールである。一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％のポリフェラステロールを含む。
一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、エルゴステロール又はブラシカステロール又はこれらの２つの組み合わせを含有する。一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、又は６５％のエルゴステロールを含有する。一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも２５％のエルゴステロールを含有する。一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも４０％のエルゴステロールを含有する。一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、又は６５％のエルゴステロールとブラシカステロールとの組み合わせを含有する。
一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも１％、２％、３％、４％又は５％のブラシカステロールを含有する。一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、１０％、９％、８％、７％、６％、又は５％未満のブラシカステロールを含有する。
一部の実施形態では、エルゴステロールとブラシカステロールとの比は、少なくとも５：１、１０：１、１５：１、又は２０：１である。
一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、又は６５％のエルゴステロールと、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満のβ−シトステロールとを含有する。一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも２５％のエルゴステロール及び５％未満のβ−シトステロールを含有する。一部の実施形態では、含油量はブラシカステロールをさらに含む。
ステロールは２７〜２９個の炭素原子を含有し（Ｃ２７〜Ｃ２９）、あらゆる真核生物に見られる。動物はＣ２７ステロールをさらに改変してＣ２８及びＣ２９ステロールを生成する能力を有しないため、専らＣ２７ステロールを作る。しかしながら植物にはＣ２８及びＣ２９ステロールを合成する能力があり、Ｃ２８／Ｃ２９植物ステロールは多くの場合にフィトステロールと称される。所与の植物のステロールプロフィールはＣ２９ステロールが高く、植物における主要なステロールは、典型的にはＣ２９ステロールのｂ−シトステロール及びスチグマステロールである。対照的に、非植物生物のステロールプロフィールには、より大きい割合のＣ２７及びＣ２８ステロールが含まれる。例えば真菌類及び多くの微細藻類中のステロールは、主としてＣ２８ステロールである。このステロールプロフィール、特に、植物でＣ２８ステロールと比べてＣ２９ステロールが顕著に優勢であることが、土壌試料中の植物と海洋物との比率を決定する際に利用されている（Ｈｕａｎｇ，Ｗｅｎ−Ｙｅｎ，Ｍｅｉｎｓｃｈｅｉｎ Ｗ．Ｇ．，“Ｓｔｅｒｏｌｓ ａｓ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ”；Ｇｅｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｃｏｓｍｏｃｈｉｍｉａ Ａｃｔａ．Ｖｏｌ ４３．ｐｐ ７３９−７４５）。
一部の実施形態では、本明細書に提供される微細藻類油中の主要ステロールは、ｂ−シトステロール及びスチグマステロール以外のステロールである。微細藻類油の一部の実施形態では、Ｃ２９ステロールは重量基準で総ステロール含有量の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、又は５％未満を占める。
一部の実施形態では、本明細書に提供される微細藻類油は、Ｃ２９ステロールより多いＣ２８ステロールを含有する。微細藻類油の一部の実施形態では、Ｃ２８ステロールは、重量基準で総ステロール含有量の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％超を占める。一部の実施形態では、Ｃ２８ステロールはエルゴステロールである。一部の実施形態では、Ｃ２８ステロールはブラシカステロールである。
ＸＩＩＩ．燃料及び化学品
上記で考察した油は、単独で、又は組み合わせで、食品、燃料及び化学品（プラスチック、発泡体、フィルム等を含む）の製造において有用である。油、トリグリセリド、油由来の脂肪酸は、Ｃ−Ｈ活性化、ヒドロアミノメチル化、メトキシ炭酸化（ｍｅｔｈｏｘｙ−ｃａｒｂｏｎａｔｉｏｎ）、オゾン分解、酵素変換反応、エポキシ化、メチル化、二量化、チオール化、メタセシス、ヒドロアルキル化、ラクトン化、又は他の化学的プロセスに供され得る。
油はアルカン（例えば、再生可能ディーゼル）又はエステル（例えば、エステル転移反応によって生成されるバイオディーゼル（ｂｉｏｄｉｓｅｓｅｌ）用のメチル又はエチルエステル）に変換することができる。アルカン又はエステルは、燃料として、溶剤又は潤滑剤として、又は化学供給原料として用いられ得る。再生可能ディーゼル及びバイオディーゼルの製造方法は、当該技術分野で十分に確立されている。例えば、国際公開第２０１１／１５０４１１号パンフレットを参照のこと。
本発明の特定の実施形態では、上記に記載する高オレイン酸油又は高オレイン酸−高安定性油がエステル化される。例えば、油は、オレイン酸メチルがリッチな油にメタノールをエステル転移反応させ得る。実施例４９に記載するとおり、かかる配合は大豆油由来のオレイン酸メチルに遜色がないことが分かった。
別の特定の例では、油はＣ３６二酸又はＣ３６二酸の生成物に変換される。油から生成される脂肪酸を重合して、Ｃ３６ダイマー酸リッチな組成を提供することができる。特定の例では、高オレイン酸油を分割して高オレイン酸脂肪酸材料が得られ、これを重合させると、Ｃ３６ダイマー酸リッチな組成が得られる。場合により、油は高オレイン酸高安定性油である（例えば、６０％超のオレイン酸で多価不飽和物が３％未満、７０％超のオレイン酸で多価不飽和物が２％未満、又は８０％超のオレイン酸で多価不飽和物が１％未満）。高オレイン酸、高安定性の出発物質を使用すると、生じる環状生成物の量が少なくなると考えられ、これは場合によって望ましいことがある。油の加水分解後、高濃度のオレイン酸が得られる。ダイマー酸の作製過程で、高オレイン酸流は「より清澄な」Ｃ３６ダイマー酸に変換され、トリマー酸（Ｃ５４）及び他のより複雑な環状副産物（これらはＣ１８：２酸及びＣ１８：３酸の存在に起因して得られる）を生じない。例えば、油を脂肪酸に加水分解し、その脂肪酸をモンモリロナイト粘土の存在下２５０℃で精製及び二量化することができる。ＳＲＩ Ｎａｔｕｒａｌ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ，Ｍａｒｃｈ ２００９を参照のこと。オレイン酸のＣ３６ダイマーリッチな生成物が回収される。
さらに、Ｃ３６ダイマー酸は、エステル化及び水素化されることによりジオールを提供し得る。ジオールは、接触脱水により重合させることができる。ポリマーもまた、炭酸ジメチルによるダイマージオールのエステル転移反応により生成することができる。
本発明の方法における燃料の製造について、本発明の細胞によって産生される脂質は、任意の好都合な手段により回収されるか、又は他の方法で収集される。脂質は全細胞抽出によって単離することができる。細胞が初めに破壊され、次に、遠心の使用によるなどして、細胞塊から細胞内及び細胞膜／細胞壁関連脂質並びに細胞外炭化水素が分離される。油産生細胞で産生される細胞内脂質は、一部の実施形態では、細胞を溶解した後に抽出される。抽出後、脂質をさらに精製することにより、油、燃料、又は油脂化学品が作られる。
細胞溶解物からの脂質の分離には、様々な方法が利用可能である。例えば、脂質及び脂質誘導体、例えば脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、及び炭化水素、例えばアルカンは、ヘキサンなどの疎水性溶媒で抽出することができる（Ｆｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．１９８９，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１１：７１７を参照）。脂質及び脂質誘導体はまた、液化（例えば、Ｓａｗａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ １７：３３−３９及びＩｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｂｉｏｍａｓｓ Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ ６（４）：２６９−２７４を参照のこと）；油液化（例えば、Ｍｉｎｏｗａ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｆｕｅｌ ７４（１２）：１７３５−１７３８を参照）；及び超臨界ＣＯ２抽出（例えば、Ｍｅｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３５６：３２８−３３４を参照）を用いても抽出することができる。Ｍｉａｏ ａｎｄ Ｗｕは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓの培養物からの微細藻類脂質の回収プロトコルについて記載しており、ここでは細胞が遠心によって回収され、蒸留水で洗浄され、凍結乾燥によって乾燥された。得られた細胞粉末が乳鉢において粉砕され、次にｎ−ヘキサンで抽出された。Ｍｉａｏ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）９７：８４１−８４６。
脂質及び脂質誘導体は、有機溶媒による抽出によって回収することができる。ある場合には、好ましい有機溶媒はヘキサンである。典型的には有機溶媒は、溶解物成分を予め分離することなしに、溶解物に直接添加される。一実施形態において、上記に記載する方法の１つ以上によって生じる溶解物を、脂質及び／又は炭化水素成分が有機溶媒と溶液を形成し得るのに十分な期間にわたり有機溶媒と接触させる。ある場合には、次に溶液をさらに精製して、特定の所望の脂質又は炭化水素成分を回収することができる。ヘキサン抽出方法は当該技術分野において公知である。
本明細書に記載されるとおりの、インビボで細胞によって産生された、又はインビトロで酵素的に改変された脂質は、場合により従来の手段によりさらに処理され得る。そうした処理には、炭化水素分子のサイズを低減し、それにより水素：炭素比を増加させる「クラッキング」が含まれ得る。炭化水素及びトリグリセリド油の加工では、通常、触媒及び熱クラッキング法が用いられている。触媒法は、固体酸触媒などの触媒の使用を伴う。触媒はシリカ−アルミナ又はゼオライトであってもよく、炭素−炭素結合のヘテロリシスな、すなわち不均一な分解を生じさせてカルボカチオン及びヒドリドアニオンをもたらす。これらの反応中間体は、次に、別の炭化水素との転位又はヒドリド移動のいずれかを受ける。このように、この反応により中間体が再生され、自己増殖型の連鎖機構がもたらされ得る。炭化水素はまた、その中の炭素−炭素二重結合、又は三重結合の数が、場合によりゼロまで低下するように処理されてもよい。炭化水素はまた、その中の環状又は環式構造を除去し又は消失させるように処理されてもよい。炭化水素はまた、水素：炭素比を増加させるように処理されてもよい。これには、水素の添加（「水素化」）及び／又はより小さい炭化水素への炭化水素の「クラッキング」が含まれ得る。
熱的方法は、高温高圧の使用による炭化水素サイズの低減を伴う。約８００℃の高温及び約７００ｋＰａの圧力が用いられ得る。これらの条件は、時に水素リッチな炭化水素分子（フォトンフラックスと区別されるとおり）を指して用いられる用語である「軽質」を生じる一方、縮合によって、比較的水素が欠乏したより重質の炭化水素分子もまた生じる。この方法は、ホモリシスな、すなわち均一な分解を提供し、場合により上記に記載したとおり酵素的に飽和していてもよいアルケンを生成する。
触媒法及び熱的方法は、植物において炭化水素処理及び油精製の標準である。従って本明細書に記載されるとおりの細胞によって産生される炭化水素は、従来の手段によって収集及び処理され、又は精製され得る。微細藻類により産生される炭化水素の水素化分解に関する報告については、Ｈｉｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＸＸＩＶ：１９３−２０５（１９８２））を参照のこと。代替的実施形態において、画分は、有機化合物、熱、及び／又は無機化合物などの別の触媒で処理される。脂質をバイオディーゼルに処理するため、本章で以下に記載するとおり、エステル転移反応プロセスが用いられる。
本発明の方法によって生成される炭化水素は、様々な工業用途に有用である。例えば、ほぼ全種の洗浄剤及びクリーニング用配合物に使用される陰イオン界面活性剤である直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）の製造では、一般に１０〜１４個の炭素原子の鎖を含む炭化水素が利用される。例えば、米国特許第６，９４６，４３０号明細書；同第５，５０６，２０１号明細書；同第６，６９２，７３０号明細書；同第６，２６８，５１７号明細書；同第６，０２０，５０９号明細書；同第６，１４０，３０２号明細書；同第５，０８０，８４８号明細書；同第５，５６７，３５９号明細書を参照のこと。ＬＡＳなどの界面活性剤は、米国特許第５，９４２，４７９号明細書；同第６，０８６，９０３号明細書；同第５，８３３，９９９号明細書；同第６，４６８，９５５号明細書；同第６，４０７，０４４号明細書に記載されるものなど、パーソナルケア組成物及び洗浄剤の製造で使用することができる。
化石燃料由来の出発物質に代替し得る再生可能な生物学的出発物質が利用可能となり、且つその使用が望ましいため、バイオディーゼル、再生可能ディーゼル、及びジェット燃料などの燃料における生物学的起源の炭化水素成分の使用に関心が高まっている。生物学的材料からの炭化水素成分の生成方法が、差し迫って必要とされている。本発明は、バイオディーゼル、再生可能ディーゼル、及びジェット燃料を製造するための生物学的材料として本明細書に記載される方法により生成される脂質を使用した、バイオディーゼル、再生可能ディーゼル、及びジェット燃料の製造方法を提供することにより、この必要性を満たす。
従来のディーゼル燃料は、パラフィン系炭化水素を豊富に含む石油蒸留物である。その沸点範囲は３７０°Ｆ〜７８０°Ｆと広く、ディーゼルエンジン車両などの圧縮点火機関での燃焼に好適である。米国材料試験協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ：ＡＳＴＭ）が、沸点範囲に加えて他の燃料特性、例えばセタン価、雲り点、引火点、粘度、アニリン点、硫黄分、水分、灰分、銅板腐食、及び残留炭素などの許容範囲に従いディーゼルの等級を規定している。技術的には、バイオマスに由来する任意の炭化水素蒸留材料又はその他適切なＡＳＴＭ規格に適合するものを、ディーゼル燃料（ＡＳＴＭ Ｄ９７５）、ジェット燃料（ＡＳＴＭ Ｄ１６５５）として、又はそれが脂肪酸メチルエステルである場合にはバイオディーゼル（ＡＳＴＭ Ｄ６７５１）として定義することができる。
抽出後、本明細書に記載される微生物バイオマスから回収された脂質及び／又は炭化水素成分を化学的処理に供し、ディーゼル車両及びジェットエンジンで使用される燃料を製造することができる。
バイオディーゼルは液体であり、製造原料に応じて色が異なる（琥珀色乃至暗褐色）。バイオディーゼルは水に対して実質的に不混和性であり、沸点が高く、且つ蒸気圧が低い。バイオディーゼルは、ディーゼルエンジン車両で使用されるディーゼルと同等の処理燃料を指す。バイオディーゼルは生分解性且つ非毒性である。従来のディーゼル燃料と比べたバイオディーゼルのさらなる利点は、エンジン摩耗の低さである。典型的には、バイオディーゼルはＣ１４〜Ｃ１８アルキルエステルを含む。バイオマス又は本明細書に記載されるとおり生成及び単離された脂質は、種々のプロセスによってディーゼル燃料に変換される。バイオディーゼルの好ましい生成方法は、本明細書に記載されるとおりの脂質のエステル転移反応による。バイオディーゼルとしての使用に好ましいアルキルエステルは、メチルエステル又はエチルエステルである。
本明細書に記載される方法によって生成されるバイオディーゼルは、単独で使用することもでき、又はほとんどの現代のディーゼルエンジン車両では従来のディーゼル燃料と任意の濃度でブレンドすることもできる。バイオディーゼルは、従来のディーゼル燃料（石油ディーゼル）とブレンドされる場合、約０．１％〜約９９．９％存在し得る。世界の大部分で、任意の燃料混合物中のバイオディーゼルの量を記述するため、「Ｂ」ファクターとして知られるシステムが用いられている。例えば、２０％のバイオディーゼルを含有する燃料はＢ２０と表示される。純粋なバイオディーゼルはＢ１００と参照される。
バイオディーゼルは、油リッチなバイオマスに含まれるトリグリセリドのエステル転移反応によって生成することができる。従って、本発明の別の態様では、バイオディーゼルの生成方法が提供される。好ましい実施形態では、このバイオディーゼルの生成方法は、（ａ）本明細書に開示される方法を用いて脂質含有微生物を培養する工程と、（ｂ）脂質含有微生物を溶解して溶解物を生成する工程と、（ｃ）溶解した微生物から脂質を単離する工程と、（ｄ）脂質組成物をエステル転移反応させる工程とを含み、これによりバイオディーゼルが生成される。微生物を成長させる方法、微生物を溶解して溶解物を生成する方法、有機溶媒を含む培地で溶解物を処理することにより不均一混合物を形成する方法、及び処理した溶解物を脂質組成物に分離する方法は上記に記載しており、バイオディーゼルの製造方法においても用いられ得る。バイオディーゼルの脂質プロフィールは、通常、原料油の脂質プロフィールと極めて類似している。
脂質組成物をエステル転移反応に供し、バイオディーゼルとして有用な長鎖脂肪酸エステルを得ることができる。好ましいエステル転移反応は以下に概説し、それには塩基触媒エステル転移反応及び組換えリパーゼを使用したエステル転移反応が含まれる。塩基触媒エステル転移反応プロセスでは、アルカリ触媒、典型的には水酸化カリウムの存在下で、トリアシルグリセリドをアルコール、例えばメタノール又はエタノールと反応させる。この反応により、メチル又はエチルエステル及び副産物としてのグリセリン（グリセロール）が形成される。
エステル転移反応はまた、上記に考察したとおり、塩基の代わりにリパーゼなどの酵素を使用しても実施されている。リパーゼ触媒エステル転移反応は、例えば、室温乃至８０℃の温度、及び１：１より大きく、好ましくは約３：１のＴＡＧと低級アルコールとのモル比で実施することができる。エステル転移反応における使用に好適なリパーゼとしては、限定はされないが、表９に掲載されるものが挙げられる。エステル転移反応に有用なリパーゼの他の例が、例えば、米国特許第４，７９８，７９３号明細書；同第４，９４０，８４５号明細書 同第５，１５６，９６３号明細書；同第５，３４２，７６８号明細書；同第５，７７６，７４１号明細書及び国際公開第８９／０１０３２号パンフレットに掲載されている。かかるリパーゼとしては、限定はされないが、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｃａｎｄｉｄａ、及びＨｕｍｉｃｏｌａの微生物によって産生されるリパーゼ並びに膵リパーゼが挙げられる。
バイオディーゼルが特に低温で使用される場合、続くプロセスもまた用いられ得る。かかるプロセスには、脱ろう及び分画が含まれる。いずれのプロセスとも、雲り点（バイオディーゼルが結晶化し始める温度）を低下させることにより燃料のコールドフロー及び冬季性能を向上させるように設計される。バイオディーゼルの脱ろう手法はいくつかある。一つの手法は、バイオディーゼルを石油ディーゼルとブレンドすることである。別の手法は、バイオディーゼルの雲り点を低下させることのできる添加剤を使用することである。別の手法は、添加剤を混ぜ入れて飽和物を結晶化させ、次に結晶をろ去することにより、飽和メチルエステルを手当たり次第に除去することである。分画は、メチルエステルを個々の成分又は画分に選択的に分離して、特定のメチルエステルの除去又は混入を可能にする。分画法には、尿素分画、溶媒分画及び熱蒸留が含まれる。
本発明の方法により提供される別の有益な燃料は再生可能ディーゼルであり、これは、アルカン、例えばＣ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０及びＣ１８：０を含み、従って、バイオディーゼルとは区別することができる。高品質再生可能ディーゼルはＡＳＴＭ Ｄ９７５規格に適合する。本発明の方法によって生成される脂質は、再生可能ディーゼルを製造するための供給原料となり得る。従って、本発明の別の態様では、再生可能ディーゼルの製造方法が提供される。再生可能ディーゼルは少なくとも３つのプロセス、すなわち、熱水処理（水素処理）；水素化処理；及び間接液化により生成され得る。これらのプロセスから、非エステル蒸留物が得られる。これらのプロセスの間、本明細書に記載されるとおり生成及び単離されるトリアシルグリセリドは、アルカンに変換される。
一実施形態において、再生可能ディーゼルの製造方法は、（ａ）本明細書に開示される方法を用いて脂質含有微生物を培養する工程と、（ｂ）微生物を溶解して溶解物を生成する工程と、（ｃ）溶解した微生物から脂質を単離する工程と、（ｄ）脂質を脱酸素及び水素処理してアルカンを生成する工程とを含み、これにより再生可能ディーゼルが生成される。再生可能ディーゼルの製造に好適な脂質は、微生物バイオマスからヘキサンなどの有機溶媒を使用して抽出することによるか、又は米国特許第５，９２８，６９６号明細書に記載されるものなど、他の方法によって得ることができる。一部の好適な方法には、機械的な圧搾及び遠心が含まれ得る。
一部の方法では、微生物脂質は、初めにクラッキングを水素処理と併せて行うことにより、それぞれ炭素鎖長及び飽和二重結合を減少させる。次にこの材料を異性化し、これもまた水素処理と併用する。次にナフサ（ｎａｐｔｈａ）画分を蒸留によって除去し、続いてさらに蒸留することにより、ＡＳＴＭ Ｄ９７５規格に適合するためにディーゼル燃料中に求められる成分を気化させて蒸留し、一方で、Ｄ９７５規格に適合するために求められる成分より重い成分は残すことができる。トリグリセリド油を含めた、化学的に改変された油の水素処理、水素化分解、脱酸素及び異性化方法は、当該技術分野において公知である。例えば、欧州特許出願公開第１７４１７６８（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開第１７４１７６７（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開第１６８２４６６（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開第１６４０４３７（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開第１６８１３３７（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開第１７９５５７６（Ａ１）号明細書；及び米国特許第７，２３８，２７７号明細書；同第６，６３０，０６６号明細書；同第６，５９６，１５５号明細書；同第６，９７７，３２２号明細書；同第７，０４１，８６６号明細書；同第６，２１７，７４６号明細書；同第５，８８５，４４０号明細書；同第６，８８１，８７３号明細書を参照のこと。
再生可能ディーゼルの製造方法の一実施形態において、脂質を処理してアルカンを生成する工程は、脂質組成物を水素処理することにより実施される。熱水処理では、典型的には、バイオマスを高温及び高圧の水中で反応させて油及び残留固形物を形成する。変換温度は、典型的には３００°Ｆ〜６６０°Ｆであり、圧力は、水を主に液体として保つのに十分な１００〜１７０標準大気圧（ａｔｍ）である。反応時間は１５〜３０分程度である。反応完了後、水から有機物を分離する。それによりディーゼルに好適な蒸留物が生成される。
再生可能ディーゼルを作製する一部の方法では、トリグリセリドを処理する初めの工程は、二重結合を飽和させる水素化処理であり、次に水素及び触媒の存在下における高温での脱酸素が続く。一部の方法では、水素化及び脱酸素は同じ反応で起こる。他の方法では、脱酸素は水素化より前に起こる。次に、場合により、同様に水素及び触媒の存在下で異性化が実施される。ナフサ成分は、好ましくは蒸留によって除去される。例えば、米国特許第５，４７５，１６０号明細書（トリグリセリドの水素化）；同第５，０９１，１１６号明細書（脱酸素、水素化及びガス除去）；同第６，３９１，８１５号明細書（水素化）；同第５，８８８，９４７号明細書（異性化）を参照のこと。
トリグリセリドを水素化するための一つの好適な方法には、銅、亜鉛、マグネシウム及びランタンの塩の水溶液、並びにアルカリ金属又は好ましくは炭酸アンモニウムの別の溶液の調製が含まれる。これらの２つの溶液を約２０℃〜約８５℃及の温度に加熱し、沈殿容器のｐＨが５．５〜７．５に維持されるような速度で沈殿容器に一緒に秤量することにより、触媒が形成され得る。追加の水を最初に沈殿容器に使用してもよく、又は塩溶液及び沈殿溶液と同時に加えてもよい。次に得られた沈殿物を十分に洗浄し、乾燥させ、約３００℃で焼成して、水素下約１００℃〜約４００℃の範囲の温度で活性化させ得る。次に１つ以上のトリグリセリドを接触させ、反応槽において上述の触媒の存在下で水素と反応させ得る。反応槽は、トリクルベッド反応槽、固定床気体−固体反応槽、充填気泡塔反応槽、連続撹拌型タンク反応槽、スラリー相反応槽、又は当該技術分野において周知されている任意の他の好適な反応槽タイプであってよい。このプロセスはバッチ式で行われてもよく、或いは連続方式で行われてもよい。反応温度は典型的には約１７０℃〜約２５０℃の範囲である一方、反応圧力は典型的には約３００ｐｓｉｇ〜約２０００ｐｓｉｇの範囲である。さらに、本発明のプロセスにおける水素とトリグリセリドとのモル比は、典型的には約２０：１〜約７００：１の範囲である。このプロセスは、典型的には約０．１時間−１〜約５時間−１の範囲の毎時重量空間速度（ＷＨＳＶ）で実施される。当業者は、用いられる温度、水素とトリグリセリドとのモル比、及び水素の分圧によって、反応に要する時間が異なり得ることを認識するであろう。かかる水素化プロセスによって生成される生成物には、脂肪アルコール、グリセロール、微量のパラフィン及び未反応のトリグリセリドが含まれる。これらの生成物は、典型的には従来の手段、例えば、蒸留、抽出、ろ過、結晶化などによって分離される。
石油精製装置は、原材料を水素で処理することにより、水素化処理を使用して不純物を除去する。水素化処理の変換温度は、典型的には３００°Ｆ〜７００°Ｆである。圧力は、典型的には４０〜１００ａｔｍである。反応時間は、典型的には１０〜６０分程度である。固体触媒を用いると、特定の反応速度が増加し、特定の生成物に対する選択性が向上し、且つ水素消費が最適化される。
油の脱酸素に好適な方法には、油を約３５０°Ｆ〜約５５０°Ｆの範囲の温度に加熱し、加熱した油を少なくともほぼ大気圧乃至それ以上の範囲の圧力下で少なくとも約５分間窒素と連続的に接触させることが含まれる。
好適な異性化方法には、当該技術分野で周知されているアルカリ異性化及び他の油異性化を用いることが含まれる。
水素処理及び水素化処理は、最終的にトリグリセリド原材料の分子量の低減をもたらす。トリグリセリド分子は、水素化処理条件下で４つの炭化水素分子、すなわちプロパン分子と、３つのより重い、典型的にはＣ８〜Ｃ１８範囲の炭化水素分子とに低減される。
従って、一実施形態において、本発明の脂質組成物に対して行われる１つ以上の化学反応の生成物は、ＡＳＴＭ Ｄ９７５再生可能ディーゼルを含むアルカン混合物である。微生物による炭化水素の生成について、Ｍｅｔｚｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００５）６６：４８６−４９６及びＡ Ｌｏｏｋ Ｂａｃｋ ａｔ ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ Ａｑｕａｔｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｐｒｏｇｒａｍ：Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ ｆｒｏｍ Ａｌｇａｅ，ＮＲＥＬ／ＴＰ−５８０−２４１９０，Ｊｏｈｎ Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｔｅｒｒｉ Ｄｕｎａｈａｙ，Ｊｏｈｎ Ｂｅｎｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｕｌ Ｒｏｅｓｓｌｅｒ（１９９８）により概説されている。
ディーゼル燃料の蒸留特性は、Ｔ１０−Ｔ９０（それぞれ１０％及び９０％の容積が蒸留されたときの温度）の点から記載される。実施例１３で生成された材料のＴ１０−Ｔ９０は、５７．９℃であった。本明細書に開示される油の水素処理、異性化、及び他の共有結合的改変の方法、並びに本明細書に開示される蒸留及び分画（冷温ろ過など）の方法を用いることにより、本明細書に開示される方法に従い生成されるトリグリセリド油を使用して、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０及び６５℃などの他のＴ１０−Ｔ９０範囲の再生可能ディーゼル組成を生じさせることができる。
本明細書に開示される油の水素処理、異性化、及び他の共有結合的改変の方法、並びに本明細書に開示される蒸留及び分画（冷温ろ過など）の方法を用いることにより、１８０〜２９５、１９０〜２７０、２１０〜２５０、２２５〜２４５、及び少なくとも２９０のＴ１０などの他のＴ１０値の再生可能ディーゼル組成を生じさせることができる。
本明細書に開示される油の水素処理、異性化、及び他の共有結合的改変の方法、並びに本明細書に開示される蒸留及び分画（冷温ろ過など）の方法を用いることにより、２８０〜３８０、２９０〜３６０、３００〜３５０、３１０〜３４０、及び少なくとも２９０のＴ９０などの特定のＴ９０値の再生可能ディーゼル組成を生じさせることができる。
実施例１３で生成した材料のＦＢＰは３００℃であった。本明細書に開示される油の水素処理、異性化、及び他の共有結合的改変の方法、並びに本明細書に開示される蒸留及び分画（冷温ろ過など）の方法を用いることにより、２９０〜４００、３００〜３８５、３１０〜３７０、３１５〜３６０、及び少なくとも３００のＦＢＰなどの他のＦＢＰ値の再生可能ディーゼル組成を生じさせることができる。
本発明の方法及び組成によって生成される他の油は、（ａ）少なくとも１％〜５％、好ましくは少なくとも４％のＣ８〜Ｃ１４；（ｂ）少なくとも０．２５％〜１％、好ましくは少なくとも０．３％のＣ８；（ｃ）少なくとも１％〜５％、好ましくは少なくとも２％のＣ１０；（ｄ）少なくとも１％〜５％、好ましくは少なくとも２％のＣ１２；及び（３）少なくとも２０％〜４０％、好ましくは少なくとも３０％のＣ８〜Ｃ１４を含む脂質プロフィールの油を含め、水素処理、異性化、及び他の共有結合性改変の組み合わせに供してもよい。
従来の超低硫黄ディーゼルは、任意の形態のバイオマスから二段階プロセスにより製造され得る。第一に、バイオマスが、水素及び一酸化炭素リッチなガス状混合物であるシンガスに変換される。次に、このシンガスが液体に触媒変換される。典型的には、液体の生成は、フィッシャー・トロプシュ（ＦＴ）合成を用いて達成される。この技術は石炭、天然ガス、及び重油に応用されている。従って、再生可能ディーゼルの製造方法のさらに別の好ましい実施形態において、脂質組成物を処理することによりアルカンを生成する工程は、脂質組成物の間接液化によって行われる。
本発明はまた、ジェット燃料の製造方法も提供する。ジェット燃料は、透明乃至淡黄色である。最も一般的な燃料は、航空機用Ａ−１（Ａｅｒｏｐｌａｎｅ Ａ−１）に分類される無鉛／パラフィン油系燃料であり、これは国際的に標準化された一連の規格に合わせて製造される。ジェット燃料は、千種又はそれを超えて多い可能性もある多数の異なる炭化水素の混合物である。そのサイズ（分子量又は炭素数）の範囲は、生成物の要件、例えば凝固点又は発煙点によって制限される。ケロシン系の航空機用燃料（Ｊｅｔ Ａ及びＪｅｔ Ａ−１を含む）は、約８〜１６炭素数の炭素数分布を有する。ワイドカット系又はナフサ系航空機用燃料（Ｊｅｔ Ｂを含む）は、典型的には約５〜１５炭素の炭素数分布を有する。
本発明の一実施形態では、藻類燃料を既存のジェット燃料とブレンドすることによりジェット燃料が製造される。本発明の方法によって生成される脂質は、ジェット燃料を製造するための供給原料となり得る。従って、本発明の別の態様において、ジェット燃料の製造方法が提供される。本明細書によって、本発明の方法により生成される脂質からジェット燃料を製造する２つの方法、すなわち流動接触クラッキング（ＦＣＣ）及び水素化脱酸素（ＨＤＯ）が提供される。
流動接触クラッキング（ＦＣＣ）は、重質粗油画分からのオレフィン、特にプロピレンの生成に用いられる一つの方法である。本発明の方法によって生成される脂質はオレフィンに変換することができる。このプロセスには、生成された脂質をＦＣＣゾーンに流し、ジェット燃料として有用な、オレフィンを含む生成物流を収集することが含まれる。生成された脂質がクラッキング条件でクラッキング触媒と接触することにより、ジェット燃料として有用なオレフィン及び炭化水素を含む生成物流が提供される。
一実施形態において、ジェット燃料の製造方法は、（ａ）本明細書に開示される方法を用いて脂質含有微生物を培養する工程と、（ｂ）脂質含有微生物を溶解することにより溶解物を生成する工程と、（ｃ）溶解物から脂質を単離する工程と、（ｄ）脂質組成物を処理する工程とを含み、これによりジェット燃料が製造される。ジェット燃料の製造方法の一実施形態では、脂質組成物を流動接触クラッキングゾーンに流すことができ、これは、一実施形態では、脂質組成物をクラッキング条件でクラッキング触媒と接触させることにより、Ｃ２〜Ｃ５オレフィンを含む生成物流を提供することを含み得る。
この方法の特定の実施形態では、脂質組成物中に存在し得るいかなる汚染物質も除去することが望ましいとされ得る。従って、脂質組成物を流動接触クラッキングゾーンに流す前に、脂質組成物が前処理される。前処理には、脂質組成物をイオン交換樹脂と接触させることが含まれ得る。イオン交換樹脂は酸性イオン交換樹脂、例えばＡｍｂｅｒｌｙｓｔ（商標）−１５であり、脂質組成物が上向流又は下向流のいずれかで流れる反応槽中の床層として使用することができる。他の前処理には、硫酸、酢酸、硝酸、又は塩酸などの酸に脂質組成物を接触させることによる弱酸洗浄が含まれ得る。接触は、通常周囲温度及び大気圧下、希釈酸性溶液で行われる。
場合により前処理された脂質組成物はＦＣＣゾーンに流れ、そこで炭化水素系成分がオレフィンへとクラッキングされる。触媒クラッキングは、反応ゾーンにおいて、微粉化された粒子状物質で構成される触媒に脂質組成物を接触させることにより達成される。水素化分解とは対照的に、この反応は触媒クラッキングであり、水素の添加又は水素の消費なしに行われる。クラッキング反応が進むに従い、触媒に相当量のコークスが堆積する。この触媒は、再生ゾーンで触媒からコークスを燃焼させることにより、高温で再生される。コークスを含有する触媒は、本明細書では「コークス化触媒」と称され、反応ゾーンから再生ゾーンへと連続的に輸送されて再生され、再生ゾーンからの本質的にコークスを含まない再生触媒に置き換わる。様々なガス流による触媒粒子の流動化が、反応ゾーンと再生ゾーンとの間の触媒の輸送を可能にする。流動化された触媒流中における、本明細書に記載される脂質組成物の炭化水素など炭化水素のクラッキング方法、反応ゾーンと再生ゾーンとの間での触媒の輸送方法、及び再生器におけるコークスの燃焼方法は、ＦＣＣプロセスの当業者には周知されている。例示的なＦＣＣ適用及び脂質組成物のクラッキングによるＣ２〜Ｃ５オレフィンの製造に有用な触媒が、米国特許第６，５３８，１６９号明細書、同第７，２８８，６８５号明細書（これらは全体として参照により援用される）に記載される。
好適なＦＣＣ触媒は、概して、同じマトリックス上にあっても又はなくてもよい少なくとも２つの成分を含む。一部の実施形態では、２つの成分は両方とも反応槽全体にわたって循環し得る。第１の成分は、概して、活性非晶質粘土タイプの触媒及び／又は高活性結晶性分子篩など、流動接触クラッキングの技術分野で使用される周知の触媒のいずれかを含む。分子篩触媒は所望の生成物に対する選択性が大幅に向上しているため、非晶質触媒と比べて好ましいこともある。一部の好ましい実施形態では、ＦＣＣプロセスにおける分子篩としてゼオライトが使用される。好ましくは、第１の触媒成分が、大孔ゼオライト、例えばＹ型ゼオライト、活性アルミナ材料、バインダー材料（シリカ又はアルミナのいずれかを含むもの）及びカオリンなどの不活性充填剤を含む。
一実施形態において、本発明の脂質組成物のクラッキングは、ＦＣＣゾーンのライザー部、或いはリフト部で行われる。脂質組成物は、脂質組成物の急速蒸発を生じさせるノズルによってライザーに導入される。触媒との接触前、脂質組成物の温度は通常約１４９℃〜約３１６℃（３００°Ｆ〜６００°Ｆ）であり得る。触媒がブレンド容器からライザーに流れ、そこで触媒が約２秒以下の間にわたり脂質組成物と接触する。
ブレンドされた触媒及び反応脂質組成物の蒸気は、次にライザーの上から出口を通って吐き出され、オレフィンを含むクラッキング後の生成物蒸気流と、相当量のコークスで被覆された、概して「コークス化触媒」と称される一群の触媒粒子とに分けられる。脂質組成物と触媒との接触時間を最小限に抑えるため（これは所望の生成物から不要な他の生成物へのさらなる変換を促進し得る）、旋回アーム装置などの任意のセパレータ装置を使用して、生成物流からコークス化触媒を速やかに除去することができる。セパレータ、例えば旋回アームセパレータがチャンバの上部に位置し、ストリッピングゾーンがチャンバの下部にある。旋回アーム装置により分離された触媒はストリッピングゾーンに落ちる。軽質オレフィンを含む分解炭化水素と一部の触媒とを含む分解生成物蒸気流が、導管を通ってチャンバを出て、この導管はサイクロンと連通している。サイクロンによって生成物蒸気流から残りの触媒粒子が除去され、粒子濃度が超低濃度に低下する。次に生成物蒸気流が分離容器の上から出る。サイクロンによって分離された触媒は分離容器に戻され、次にストリッピングゾーンに戻される。ストリッピングゾーンは、蒸気との向流接触によって触媒の表面から吸着炭化水素を除去する。
低い炭化水素分圧は、軽質オレフィンの生成に有利に働く。従って、ライザー圧力は約１７２〜２４１ｋＰａ（２５〜３５ｐｓｉａ）、炭化水素分圧は約３５〜１７２ｋＰａ（５〜２５ｐｓｉａ）に設定され、好ましい炭化水素分圧は約６９〜１３８ｋＰａ（１０〜２０ｐｓｉａ）である。炭化水素のこの比較的低い分圧は、希釈剤が脂質組成物の１０〜５５ｗｔ％、好ましくは脂質組成物の約１５ｗｔ％である範囲で蒸気を希釈剤として使用することにより実現される。乾性ガスなどの他の希釈剤を使用して、同等の炭化水素分圧を達成することができる。
ライザー出口の分解流の温度は約５１０℃〜６２１℃（９５０°Ｆ〜１１５０°Ｆ）となる。しかしながら、ライザー出口温度が５６６℃（１０５０°Ｆ）を上回ると、ガスが一層乾燥し、オレフィンが増す。一方、ライザー出口温度が５６６℃（１０５０°Ｆ）を下回ると、エチレン及びプロピレンが減る。従って、ＦＣＣプロセスは、約５６６℃〜約６３０℃の好ましい温度、約１３８ｋＰａ〜約２４０ｋＰａ（２０〜３５ｐｓｉａ）の好ましい圧力で実施することが好ましい。別のプロセス条件は触媒の対脂質組成物比であり、これは約５から約２０、好ましくは約１０から約１５まで異なり得る。
ジェット燃料の製造方法の一実施形態では、脂質組成物がＦＣＣ反応槽のリフト部に導入される。リフト部の温度は極めて高く、約７００℃（１２９２°Ｆ）〜約７６０℃（１４００°Ｆ）の範囲となり、触媒の対脂質組成物比は約１００〜約１５０である。脂質組成物をリフト部に導入すると、多量のプロピレン及びエチレンが生じることが予想される。
本明細書に記載されるとおり生成された脂質組成物又は脂質を使用したジェット燃料の製造方法の別の実施形態では、脂質組成物又は脂質の構造が、水素化脱酸素（ＨＤＯ）と称されるプロセスによって壊される。ＨＤＯは、水素を用いた酸素の除去を意味し、すなわち、材料の構造を壊しながら酸素が除去される。オレフィン二重結合が水素化され、任意の硫黄及び窒素化合物が除去される。硫黄の除去は水素化脱硫（ＨＤＳ）と呼ばれる。原材料（脂質組成物又は脂質）の前処理及び純度が、触媒の有効寿命に寄与する。
一般に、ＨＤＯ／ＨＤＳ工程では、水素を供給原料（脂質組成物又は脂質）と混合し、次に混合物を並流として、単相或いは二相供給原料として触媒床に通す。ＨＤＯ／ＭＤＳ工程の後、生成物画分が分離され、別個の異性化反応槽に送られる。生物学的出発物質用の異性化反応槽については、文献（ＦＩ １００ ２４８）に並流反応槽として記載されている。
供給炭化水素、例えば本明細書では脂質組成物又は脂質を水素化することによる燃料の製造方法はまた、脂質組成物又は脂質を水素ガスと共に並流として第１の水素化ゾーンに通して実施することもでき、その後、水素ガスを第２の水素化ゾーンに流出炭化水素に対する向流として通すことにより、流出炭化水素が第２の水素化ゾーンでさらに水素化される。Ｃ２〜Ｃ５オレフィンを生成するための脂質組成物のクラッキングに有用な例示的ＨＤＯ適用及び触媒が、米国特許第７，２３２，９３５号明細書（全体として参照により援用される）に記載されている。
典型的には、水素化脱酸素工程では、本明細書における脂質組成物又は脂質などの生物学的成分の構造が分解され、酸素、窒素、リン及び硫黄化合物、並びにガスとしての軽質炭化水素が除去され、及びオレフィン結合が水素化される。このプロセスの第２の工程では、すなわちいわゆる異性化工程では、炭化水素鎖の分枝及び低温でのパラフィン性能の向上のため、異性化が実施される。
クラッキングプロセスの第１の工程、すなわちＨＤＯ工程では、水素ガス及び水素化する本明細書の脂質組成物又は脂質が、並流又は向流のいずれかとしてＨＤＯ触媒床システムに送り込まれ、前記触媒床システムは１つ以上の触媒床、好ましくは１〜３つの触媒床を含む。ＨＤＯ工程は、典型的には並流方式で動作する。２つ以上の触媒床を含むＨＤＯ触媒床システムの場合、床のうち１つ以上を向流原理を用いて動作させてもよい。ＨＤＯ工程では、圧力は２０〜１５０バールの間、好ましくは５０〜１００バールの間で異なり、温度は２００〜５００℃の間、好ましくは３００〜４００℃の範囲で異なる。ＨＤＯ工程では、周期律表第ＶＩＩ族及び／又は第ＶＩＢ族の金属を含有する周知の水素化触媒が使用され得る。好ましくは、水素化触媒は担持Ｐｄ、Ｐｔ、Ｎｉ、ＮｉＭｏ又はＣｏＭｏ触媒であり、担体はアルミナ及び／又はシリカである。典型的には、ＮｉＭｏ／Ａｌ２Ｏ３及びＣｏＭｏ／Ａｌ２Ｏ３触媒が使用される。
ＨＤＯ工程の前に、場合により本明細書の脂質組成物又は脂質は、より穏和な条件下で、従って二重結合の副反応を回避して予備的に水素化処理され得る。かかる予備水素化は、予備水素化触媒の存在下、５０〜４００℃の温度及び１〜２００バールの水素圧、好ましくは１５０〜２５０℃の温度及び１０〜１００バールの水素圧で実施される。触媒は、周期律表第ＶＩＩＩ族及び／又は第ＶＩＢ族の金属を含有し得る。好ましくは、予備水素化触媒は担持Ｐｄ、Ｐｔ、Ｎｉ、ＮｉＭｏ又はＣｏＭｏ触媒であり、担体はアルミナ及び／又はシリカである。
水素を含有するＨＤＯ工程のガス流が冷却され、次にそれから一酸化炭素、二酸化炭素、窒素、リン及び硫黄化合物、ガス状軽質炭化水素及び他の不純物が除去される。圧縮後、精製水素又は再生水素が第１の触媒床及び／又は触媒床の間に戻され、抜き取られたガス流を補う。濃縮液体から水が除去される。この液体が第１の触媒床又は触媒床間に送り込まれる。
ＨＤＯ工程の後、生成物は異性化工程に供される。このプロセスには、炭化水素を異性化触媒と接触させる前に可能な限り完全に不純物を除去することが重要である。異性化工程は任意選択のストリッピング工程を含み、ここではＨＤＯ工程からの反応生成物が、水蒸気又は好適なガス、例えば、軽質炭化水素、窒素又は水素によるストリッピングにより精製され得る。任意選択のストリッピング工程は、異性化触媒の上流のユニットにおいて向流方式で実施されるか（ここではガスと液体とが互いに接触する）、又は実際の異性化反応槽の前に、別個のストリッピングユニットにおいて向流原理を利用して実施される。
ストリッピング工程の後、水素ガス及び本明細書の水素化された脂質組成物又は脂質、及び場合によりｎ−パラフィン混合物が、１つ又はいくつかの触媒床を含む反応異性化ユニットに送り込まれる。異性化工程の触媒床は並流方式又は向流方式のいずれで動作してもよい。
このプロセスについては、異性化工程で向流原理が適用されることが重要である。異性化工程では、これは任意選択のストリッピング工程又は異性化反応工程の一方又は両方を向流方式で実施することにより行われる。異性化工程では、圧力は２０〜１５０バールの範囲、好ましくは２０〜１００バールの範囲で異なり、温度は２００〜５００℃、好ましくは３００〜４００℃である。異性化工程では、当該技術分野において公知の異性化触媒が使用され得る。好適な異性化触媒は、分子篩及び／又は第ＶＩＩ族の金属及び／又は担体を含有する。好ましくは、異性化触媒は、ＳＡＰＯ−１１若しくはＳＡＰＯ４１又はＺＳＭ−２２若しくはＺＳＭ−２３又はフェリエライト及びＰｔ、Ｐｄ又はＮｉ及びＡｌ２Ｏ３又はＳｉＯ２を含有する。典型的な異性化触媒は、例えば、Ｐｔ／ＳＡＰＯ−１１／Ａｌ２Ｏ３、Ｐｔ／ＺＳＭ−２２／Ａｌ２Ｏ３、Ｐｔ／ＺＳＭ−２３／Ａｌ２Ｏ３及びＰｔ／ＳＡＰＯ−１１／ＳｉＯ２である。異性化工程とＨＤＯ工程とは、同じ圧力容器で、又は別個の圧力容器で実施されてもよい。任意選択の予備水素化は、別個の圧力容器で、又はＨＤＯ工程及び異性化工程と同じ圧力容器で実施されてもよい。
従って、一実施形態において、１つ以上の化学反応の生成物は、ＨＲＪ−５を含むアルカン混合物である。別の実施形態において、１つ以上の化学反応の生成物は、ＡＳＴＭ Ｄ１６５５ジェット燃料を含むアルカン混合物である。一部の実施形態では、ＡＳＴＭ １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、１０ｐｐｍ未満の硫黄分を有する。他の実施形態では、ＡＳＴＭ １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、２０５℃未満の蒸留曲線のＴ１０値を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、３００℃未満の終沸点（ＦＢＰ）を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、少なくとも３８℃の引火点を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、７７５Ｋ／Ｍ３〜８４０Ｋ／Ｍ３の密度を有する。さらに別の実施形態において、ＡＳＴＭ １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、−４７℃未満の凝固点を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、少なくとも４２．８ＭＪ／Ｋの真燃焼熱を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、少なくとも１３．４質量％の水素分を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、２６０℃で定量重量分析ＪＦＴＯＴによって試験したとき、３ｍｍＨｇ未満である熱安定性を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、７ｍｇ／ｄｌ未満の実在ガムを有する。
従って、本発明は、微細藻類脂質の化学的改変を行うことにより様々な工業用途及び他の用途で有用な生成物を得る様々な方法を開示する。本明細書に開示される方法によって生成される油の改変方法の例としては、限定はされないが、油の加水分解、油の水素化処理、及び油のエステル化が挙げられる。微細藻類脂質の他の化学的改変としては、限定なしに、エポキシ化、酸化、加水分解、硫酸化、スルホン化、エトキシ化、プロポキシル化、アミド化、及び鹸化が挙げられる。微細藻類油の改変により基礎油脂化学品が生成され、これをさらに、所望の機能のための選択された誘導油脂化学品に改変することができる。上記に燃料製造方法に関連して記載した方法と同様の方法で、本明細書に記載される微生物培養物から産生された油に対してこれらの化学的改変を実施することもできる。基礎油脂化学品の例としては、限定はされないが、石鹸、脂肪酸、脂肪エステル、脂肪アルコール、脂肪アミドを含む脂肪窒素化合物、脂肪酸メチルエステル、及びグリセロールが挙げられる。誘導油脂化学品の例としては、限定はされないが、脂肪ニトリル、エステル、ダイマー酸、第四級アンモニウム化合物（ｑｕａｔｓ）（ベタインを含む）、界面活性剤、脂肪アルカノールアミド、脂肪アルコールスルフェート、樹脂、乳化剤、脂肪アルコール、オレフィン、掘削泥水、ポリオール、ポリウレタン、ポリアクリレート、ゴム、ロウソク、化粧品、金属石鹸、石鹸、α−スルホン酸化メチルエステル、脂肪アルコールスルフェート、脂肪アルコールエトキシレート、脂肪アルコールエーテルスルフェート、イミダゾリン、界面活性剤、洗浄剤、エステル、第四級アンモニウム化合物（ｑｕａｔｓ）（ベタインを含む）、オゾン分解生成物、脂肪アミン、脂肪アルカノールアミド、エトキシスルフェート、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド（中鎖トリグリセリドを含む）、潤滑剤、油圧作動油、グリース、誘電性流体、離型剤、金属加工液、熱伝導流体、他の機能性流体、工業化学品（例えば、クリーナー、繊維加工助剤、可塑剤、安定化剤、添加剤）、表面コーティング、ペンキ及びラッカー、電気配線絶縁体、及び高級アルカンが挙げられる。他の誘導体としては、脂肪アミドアミン類、アミドアミンカルボキシレート類、アミドアミンオキシド類、アミドアミンオキシドカルボキシレート類、アミドアミンエステル類、エタノールアミンアミド類、スルホネート類、アミドアミンスルホネート類、ジアミドアミンジオキシド類、スルホン化アルキルエステルアルコキシレート類、ベタイン類、四級化（ｑｕａｒｔｅｒｎｉｚｅｄ）ジアミドアミンベタイン類、及びスルホベタイン類が挙げられる。
本発明の方法によって生成されるグリセロ脂質の脂肪酸構成要素の加水分解により、他の有用な化学品を生成するため誘導体化することのできる遊離脂肪酸が得られる。加水分解は、水と、酸又は塩基のいずれかであってよい触媒との存在下で起こる。放出された遊離脂肪酸を誘導体化することにより、以下に報告されるとおり様々な生成物を産生することができる：米国特許第５，３０４，６６４号明細書（高度に硫酸化された脂肪酸）；同第７，２６２，１５８号明細書（クレンジング組成物）；同第７，１１５，１７３号明細書（織物柔軟剤組成物）；同第６，３４２，２０８号明細書（皮膚処置用のエマルション）；同第７，２６４，８８６号明細書（撥水組成物）；同第６，９２４，３３３（ペンキ添加剤）；同第６，５９６，７６８号明細書（脂質リッチの反芻動物飼料）；同第６，３８０，４１０号明細書（洗浄剤及びクリーナー用の界面活性剤）。
一部の方法では、化学的改変の第１の工程は、水素化処理により二重結合を飽和させ、続いて水素及び触媒の存在下、高温で脱酸素することであり得る。他の方法では、水素化と脱酸素とを同じ反応内で行ってもよい。さらに他の方法では、脱酸素は水素化前に行われる。次に場合により異性化が、同様に水素及び触媒の存在下で実施されてもよい。最後に、必要であればガス及びナフサ成分を除去することができる。例えば、米国特許第５，４７５，１６０号明細書（トリグリセリドの水素化）；同第５，０９１，１１６号明細書（脱酸素、水素化及びガス除去）；同第６，３９１，８１５号明細書（水素化）；同第５，８８８，９４７号明細書（異性化）を参照のこと。
本発明の一部の実施形態では、トリグリセリド油は部分的に又は完全に脱酸素される。脱酸素反応により、限定はされないが、脂肪酸、脂肪アルコール、ポリオール、ケトン、及びアルデヒドを含めた所望の生成物が形成される。一般に、いかなる特定の理論によっても制限されることなしに、脱酸素反応は、限定なしに水素化分解、水素化、連続水素化−水素化分解、連続水素化分解−水素化、及び併用される水素化−水素化分解反応を含めた、様々な異なる反応経路の組み合わせを含み、脂肪酸又は脂肪酸エステルからの酸素の少なくとも部分的な除去を生じさせることにより、さらなる処理によって所望の化学品に容易に変換することのできる反応生成物、例えば脂肪アルコールを生成する。例えば、一実施形態において、脂肪アルコールがＦＣＣ反応によってオレフィンに変換されてもよく、又は縮合反応によって高級アルカンに変換されてもよい。
かかる化学的改変の一つは水素化であり、これは、グリセロ脂質又は遊離脂肪酸の脂肪酸構成要素の二重結合に水素を添加するものである。水素化プロセスは、特定の用途により好適であり得る半固体又は固体脂肪への液体油の転換を可能にする。
本明細書に記載される方法により生成される油の水素化は、以下に報告されるとおり、本明細書に提供される方法及び／又は材料の１つ以上と併せて実施することができる：米国特許第７，２８８，２７８号明細書（食品添加剤又は薬剤）；同第５，３４６，７２４号明細書（潤滑製品）；同第５，４７５，１６０号明細書（脂肪アルコール）；同第５，０９１，１１６号明細書（食用油）；同第６，８０８，７３７号明細書（マーガリン及びスプレッド用構造脂肪）；同第５，２９８，６３７号明細書（低カロリー脂肪代用物）；同第６，３９１，８１５号明細書（水素化触媒及び硫黄吸着剤）；同第５，２３３，０９９号明細書及び同第５，２３３，１００号明細書（脂肪アルコール）；同第４，５８４，１３９号明細書（水素化触媒）；同第６，０５７，３７５号明細書（泡止め剤）；同第７，１１８，７７３号明細書（食用エマルションスプレッド）。
当業者は、様々なプロセスを用いて炭水化物を水素化し得ることを認識するであろう。一つの好適な方法としては、水素化反応槽において水素化生成物が形成されるのに十分な条件下で炭水化物を水素又は好適なガスと混合された水素及び触媒と接触させることが挙げられる。水素化触媒は、概して、Ｃｕ、Ｒｅ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｒｕ、Ｐｄ、Ｒｈ、Ｐｔ、Ｏｓ、Ｉｒ、及び合金又はそれらの任意の組み合わせを、単独で、或いはＷ、Ｍｏ、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｒ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｓｎ、Ｂ、Ｐ、Ｂｉ、及び合金又はそれらの任意の組み合わせなどの助触媒と共に含むことができる。他の有効な水素化触媒材料としては、担持ニッケルか、或いはレニウムで修飾されたルテニウムが挙げられる。ある実施形態では、水素化触媒はまた、触媒の所望の機能性に応じた担体のうちいずれか一つも含む。水素化触媒は、当業者に公知の方法によって調製され得る。
一部の実施形態では、水素化触媒には、担持第ＶＩＩＩ族金属触媒及び金属スポンジ材料（例えばスポンジニッケル触媒）が含まれる。ラネーニッケルは、この発明での使用に好適な活性スポンジニッケル触媒の例を提供する。他の実施形態では、本発明における水素化反応は、ニッケル−レニウム触媒又はタングステン修飾ニッケル触媒を含む触媒を使用して実施される。本発明の水素化反応に好適な触媒の一例は、炭素担持ニッケル−レニウム触媒である。
ある実施形態では、重量単位でほぼ等量のニッケル及びアルミニウムの合金を、約２５重量％の水酸化ナトリウムを例えば含有するアルカリ水溶液で処理することにより、好適なラネーニッケル触媒が調製されてもよい。アルミニウムはアルカリ水溶液に選択的に溶解し、大部分がニッケルで少量のアルミニウムを含むスポンジ型材料をもたらす。初期合金は、形成されたスポンジニッケル触媒中に約１〜２重量％が残るような量の助触媒金属（すなわちモリブデン又はクロム）を含む。別の実施形態では、水素化触媒は、水中のトリニトラトニトロシルルテニウム（ＩＩＩ）、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）の溶液を使用し、好適な担体材料を含浸させて調製される。次に溶液を乾燥させ、含水量が約１重量％未満の固体を形成する。次に固体を回転式ボール炉において４時間、大気圧下３００℃（焼成なし）又は４００℃（焼成あり）の水素流中で還元してもよい。冷却し、且つ窒素で触媒を不活性化した後、窒素中５容積％の酸素が触媒に２時間送られる。
特定の実施形態において、記載される触媒は触媒担体を含む。触媒担体は触媒を安定化させ、担持する。使用される触媒担体の種類は、選択した触媒及び反応条件に依存する。本発明に好適な担体としては、限定はされないが、炭素、シリカ、シリカ−アルミナ、ジルコニア、チタニア、セリア、バナジア、窒化物、窒化ホウ素、ヘテロポリ酸、ヒドロキシアパタイト、酸化亜鉛、クロミア、ゼオライト、カーボンナノチューブ、炭素フラーレン及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
この発明で使用される触媒は、当業者に公知の従来の方法を用いて調製することができる。好適な方法としては、限定はされないが、初期湿潤、蒸発含浸、化学蒸着、洗浄−コーティング、マグネトロンスパッタリング技術などを挙げることができる。
水素化反応を実施するための条件は、出発物質の種類及び所望の生成物に基づき異なり得る。当業者は、本開示の利益をもって、適切な反応条件を認識するであろう。一般に、水素化反応は８０℃〜２５０℃の温度で、好ましくは９０℃〜２００℃で、最も好ましくは１００℃〜１５０℃で行われる。一部の実施形態では、水素化反応は５００ＫＰａ〜１４０００ＫＰａの圧力で行われる。
本発明の水素化分解反応で使用される水素には、外部水素、再生水素、現場で発生する水素、及びそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。本明細書で使用されるとき、用語「外部水素」は、バイオマス反応それ自体から生じるのではなく、むしろ別の供給源からその系に添加される水素を指す。
本発明の一部の実施形態では、出発炭水化物をより小さい分子に変換し、所望の高級炭化水素への変換を容易にすることが望ましい。この変換に好適な一つの方法は、水素化分解反応によるものである。炭水化物の水素化分解の実施については、様々なプロセスが知られている。一つの好適な方法としては、水素化分解反応槽においてより小さい分子又はポリオールを含む反応生成物が形成されるのに十分な条件下で炭水化物を水素又は好適なガスと混合された水素及び水素化分解触媒と接触させることが挙げられる。本明細書で使用されるとき、用語「より小さい分子又はポリオール」は、より低い分子量を有する任意の分子を含み、これは出発炭水化物より少ない炭素原子数又は酸素原子数を含み得る。ある実施形態では、反応生成物は、ポリオール及びアルコールを含むより小さい分子を含む。一部の当業者は、水素化分解反応の実施に適切な方法を選択することが可能であろう。
一部の実施形態では、五炭糖及び／又は六炭糖又は糖アルコールを、水素化分解触媒を使用してプロピレングリコール、エチレングリコール、及びグリセロールに変換してもよい。水素化分解触媒は、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｒｅ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｃｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｉｒ、Ｏｓ、及び合金又はそれらの任意の組み合わせを、単独で、或いはＡｕ、Ａｇ、Ｃｒ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｓｎ、Ｂｉ、Ｂ、Ｏ、及び合金又はそれらの任意の組み合わせなどの助触媒と共に含み得る。水素化分解触媒はまた、遷移金属（例えば、クロム、モリブデン、タングステン、レニウム、マンガン、銅、カドミウム）又は第ＶＩＩＩ族金属（例えば、鉄、コバルト、ニッケル、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、イリジウム、及びオスミウム）を含有する炭素質パイロポリマー触媒も含み得る。特定の実施形態において、水素化分解触媒は、アルカリ土類金属酸化物と組み合わせるか、又は触媒活性担体に付着した上記の金属のいずれかを含み得る。特定の実施形態において、水素化分解反応において記載される触媒には、水素化反応について上記に記載したとおりの触媒担体が含まれ得る。
水素化分解反応を実施するための条件は、出発物質の種類及び所望の生成物に基づき異なり得る。当業者は、本開示の利益をもって、反応の実施に用いるのに適切な条件を認識するであろう。一般に、水素化分解反応は１１０℃〜３００℃の温度、好ましくは１７０℃〜２２０℃、最も好ましくは２００℃〜２２５℃で行われる。一部の実施形態では、水素化分解反応は塩基性条件下、好ましくは８〜１３のｐＨ、さらにより好ましくは１０〜１２のｐＨで行われる。一部の実施形態では、水素化分解反応は、６０ＫＰａ〜１６５００ＫＰａの範囲、好ましくは１７００ＫＰａ〜１４０００ＫＰａ、さらにより好ましくは４８００ＫＰａ〜１１０００ＫＰａの範囲の圧力で行われる。
本発明の水素化分解反応で使用される水素には、外部水素、再生水素、現場で発生する水素、及びそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
一部の実施形態では、上記で考察する反応生成物は、縮合反応槽において縮合反応によって高級炭化水素に変換されてもよい。かかる実施形態において、反応生成物の縮合は、高級炭化水素を形成することが可能な触媒の存在下で起こる。理論によって制限されることを意図するものではないが、高級炭化水素の生成は、炭素−炭素結合、又は炭素−酸素結合の形成を含め、段階的な付加反応によって進むものと考えられる。得られる反応生成物は、以下にさらに詳細に記載するとおり、これらの部分を含有する任意の数の化合物を含む。
特定の実施形態において、好適な縮合触媒には、酸触媒、塩基触媒、又は酸／塩基触媒が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「酸／塩基触媒」は、酸及び塩基の両方の機能性を有する触媒を指す。一部の実施形態では、縮合触媒として、限定なしに、ゼオライト、カーバイド、窒化物、ジルコニア、アルミナ、シリカ、アルミノケイ酸塩、リン酸塩、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化バナジウム、酸化ランタン、酸化イットリウム、酸化スカンジウム、酸化マグネシウム、酸化セリウム、酸化バリウム、酸化カルシウム、水酸化物、ヘテロポリ酸、無機酸、酸修飾した樹脂、塩基修飾した樹脂、及びそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。一部の実施形態では、縮合触媒にはまた、改変剤も含まれ得る。好適な改変剤としては、Ｌａ、Ｙ、Ｓｃ、Ｐ、Ｂ、Ｂｉ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、縮合触媒にはまた、金属も含まれ得る。好適な金属としては、Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｒｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｉｒ、Ｒｅ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｓｎ、Ｏｓ、合金、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
特定の実施形態において、縮合反応において記載される触媒には、水素化反応について上記に記載したとおりの触媒担体が含まれ得る。特定の実施形態において、縮合触媒は自己担持型である。本明細書で使用されるとき、用語「自己担持型」は、その触媒が担体として機能するために別の材料を必要としないことを意味する。他の実施形態では、縮合触媒は、触媒を懸濁するのに好適な別の担体と併せて使用される。ある実施形態では、縮合触媒担体はシリカである。
縮合反応が起こる条件は、出発物質の種類及び所望の生成物に基づき異なり得る。当業者は、本開示の利益をもって、反応の実施に用いるのに適切な条件を認識するであろう。一部の実施形態では、縮合反応は、提案されている反応の熱力学が有利となる温度で実施される。縮合反応の温度は、具体的な出発ポリオール又はアルコールに応じて異なり得る。一部の実施形態では、縮合反応の温度は、８０℃〜５００℃、好ましくは１２５℃〜４５０℃、最も好ましくは１２５℃〜２５０℃の範囲である。一部の実施形態では、縮合反応は、０ＫＰａ〜９０００ＫＰａの範囲、好ましくは０ＫＰａ〜７０００ＫＰａ、さらにより好ましくは０ＫＰａ〜５０００ＫＰａの範囲の圧力で実施される。
本発明により形成される高級アルカンとしては、限定はされないが、４〜３０個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルカン、４〜３０個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルケン、５〜３０個の炭素原子を有するシクロアルカン、５〜３０個の炭素原子を有するシクロアルケン、アリール、縮合アリール、アルコール、及びケトンが挙げられる。好適なアルカンとしては、限定はされないが、ブタン、ペンタン、ペンテン、２−メチルブタン、ヘキサン、ヘキセン、２−メチルペンタン、３−メチルペンタン、２，２，−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプテン、オクタン、オクテン、２，２，４−トリメチルペンタン、２，３−ジメチルヘキサン、２，３，４−トリメチルペンタン、２，３−ジメチルペンタン、ノナン、ノネン、デカン、デセン、ウンデカン、ウンデセン、ドデカン、ドデセン、トリデカン、トリデセン、テトラデカン、テトラデセン、ペンタデカン、ペンタデセン、ノニルデカン、ノニルデセン、エイコサン、エイコセン、ウンエイコサン、ウンエイコセン、ドエイコサン、ドエイコセン、トリエイコサン、トリエイコセン、テトラエイコサン、テトラエイコセン、及びその異性体が挙げられる。これらの生成物の一部は、燃料としての使用に好適であり得る。
一部の実施形態では、シクロアルカン及びシクロアルケンは非置換である。他の実施形態では、シクロアルカン及びシクロアルケンは一置換である。さらに他の実施形態では、シクロアルカン及びシクロアルケンは多置換である。置換シクロアルカン及びシクロアルケンを含む実施形態において、置換基には、限定なしに、１〜１２個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルキル、１〜１２個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルキレン、フェニル、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。好適なシクロアルカン及びシクロアルケンとしては、限定はされないが、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキセン、メチル−シクロペンタン、メチル−シクロペンテン、エチル−シクロペンタン、エチル−シクロペンテン、エチル−シクロヘキサン、エチル−シクロヘキセン、異性体及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
一部の実施形態では、形成されるアリールは非置換である。別の実施形態において、形成されるアリールは一置換である。置換アリールを含む実施形態において、置換基には、限定なしに、１〜１２個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルキル、１〜１２個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルキレン、フェニル、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。本発明に好適なアリールとしては、限定はされないが、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、パラキシレン、メタキシレン、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
本発明において生成されるアルコールは、４〜３０個の炭素原子を有する。一部の実施形態では、アルコールは環式である。他の実施形態では、アルコールは分枝状である。別の実施形態では、アルコールは直鎖状である。本発明に好適なアルコールとしては、限定はされないが、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプチルデカノール、オクチルデカノール、ノニルデカノール、エイコサノール、ウンエイコサノール、ドエイコサノール、トリエイコサノール、テトラエイコサノール、及びその異性体が挙げられる。
本発明において生成されるケトンは、４〜３０個の炭素原子を有する。ある実施形態では、ケトンは環式である。別の実施形態では、ケトンは分枝状である。別の実施形態において、ケトンは直鎖状である。本発明に好適なケトンとしては、限定はされないが、ブタノン、ペンタノン、ヘキサノン、ヘプタノン、オクタノン、ノナノン、デカノン、ウンデカノン、ドデカノン、トリデカノン、テトラデカノン、ペンタデカノン、ヘキサデカノン、ヘプチルデカノン、オクチルデカノン、ノニルデカノン、エイコサノン、ウンエイコサノン、ドエイコサノン、トリエイコサノン、テトラエイコサノン、及びその異性体が挙げられる。
別のかかる化学的改変は、エステル交換である。天然で産生されるグリセロ脂質は、脂肪酸構成要素の分布が均一でない。油との関連において、エステル交換は、異なるグリセロ脂質の２つのエステル間でのアシル基の交換を指す。エステル交換プロセスは、グリセロ脂質の混合物の脂肪酸構成要素を転位させて分布パターンを改変し得る機構を提供する。エステル交換は周知の化学的プロセスであり、概して、油の混合物をある時間にわたり（例えば３０分間）、アルカリ金属又はアルキル化アルカリ金属（例えばナトリウムメトキシド）などの触媒の存在下で（約２００℃に）加熱することを含む。このプロセスを用いて油混合物の脂肪酸構成要素の分布パターンをランダム化することができ、又は所望の分布パターンを生成するように指向させることができる。脂質を化学的に改変するこの方法は、脂質としての乾燥細胞重に対する割合が少なくとも２０％である微生物バイオマスなどの、本明細書に提供される材料に対して実施することができる。
起こり得る一部のＴＡＧの融点未満の温度に油混合物を維持することにより、指向性エステル交換を実施することができ、ここでは脂肪酸の特定の分布パターンが求められる。これによりそれらのＴＡＧの選択的な結晶化がもたらされ、このようなＴＡＧは結晶化に伴い反応混合物から効果的に除去される。このプロセスは、例えば、油中の脂肪酸の大部分が沈殿し終えるまで続けることができる。指向性エステル交換プロセスを使用すると、例えば、より長鎖の脂肪酸をより短鎖のカウンターパートによって置換することで、より低いカロリー含有量の生成物を生成することができる。指向性エステル交換はまた、不要なトランス異性体を生じ得る水素化に頼ることなしに、食品添加剤又は生成物（例えばマーガリン）において求められる所望の融解特性及び構造的特徴を提供できる脂肪の混合物を含む生成物の生成にも用いられる。
本明細書に記載される方法により生成される油のエステル交換は、以下に報告されるような方法及び／又は材料の１つ以上と併せて実施するか、又はそのような生成物を生成するため実施することができる：米国特許第６，０８０，８５３号明細書（非可消化性脂肪代用物）；同第４，２８８，３７８号明細書（ピーナッツバター安定化剤）；同第５，３９１，３８３号明細書（食用スプレー油）；同第６，０２２，５７７号明細書（食品用の食用脂肪）；同第５，４３４，２７８号明細書（食品用の食用脂肪）；同第５，２６８，１９２号明細書（低カロリーナッツ製品）；同第５，２５８，１９７号明細書（低カロリー食用組成物）；同第４，３３５，１５６号明細書（食用脂肪生成物）；同第７，２８８，２７８号明細書（食品添加剤又は薬剤）；同第７，１１５，７６０号明細書（分画プロセス）；同第６，８０８，７３７号明細書（構造脂肪）；同第５，８８８，９４７号明細書（エンジン潤滑剤）；同第５，６８６，１３１号明細書（食用油混合物）；及び同第４，６０３，１８８号明細書（硬化性ウレタン組成物）。
本発明における一実施形態では、上記に記載したとおりの油のエステル転移反応の後に、米国特許第６，４６５，６４２号明細書に報告されるとおり、エステル転移反応した生成物とポリオールとの反応が続き、ポリオール脂肪酸ポリエステルが生成される。かかるエステル化及び分離プロセスは、以下のとおりの工程を含み得る：石鹸の存在下で低級アルキルエステルをポリオールと反応させる工程；生成物混合物から残留石鹸を除去する工程；生成物混合物を水洗及び乾燥することにより不純物を除去する工程；精製のため生成物混合物を漂白する工程；生成物混合物中のポリオール脂肪酸ポリエステルから未反応低級アルキルエステルの少なくとも一部を分離する工程；及び分離した未反応低級アルキルエステルを再生利用する工程。
エステル転移反応はまた、米国特許第６，２７８，００６号明細書に報告されるとおり、短鎖脂肪酸エステルを含む微生物バイオマスに対して実施することもできる。一般に、エステル転移反応は、好適な触媒の存在下で油に短鎖脂肪酸エステルを添加し、混合物を加熱することによって実施され得る。一部の実施形態では、油は、重量単位で反応混合物の約５％〜約９０％を含む。一部の実施形態では、短鎖脂肪酸エステルは、重量単位で反応混合物の約１０％〜約５０％であってもよい。触媒の非限定的な例としては、塩基触媒、ナトリウムメトキシド、酸触媒、例えば、硫酸及び酸性粘土などの無機酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、及びトルエンスルホン酸などの有機酸、並びにＡｍｂｅｒｌｙｓｔ １５などの酸性樹脂が挙げられる。ナトリウム及びマグネシウムなどの金属、及び金属水素化物もまた、有用な触媒である。
別のかかる化学的改変はヒドロキシル化であり、これには、二重結合への水の付加によってもたらされる飽和及びヒドロキシル部分の取り込みが関わる。ヒドロキシル化プロセスは、グリセロ脂質の１つ以上の脂肪酸構成要素からヒドロキシ脂肪酸への変換機構を提供する。ヒドロキシル化は、例えば米国特許第５，５７６，０２７号明細書に報告される方法を用いて実施することができる。ヒマシ油及びその誘導体を含むヒドロキシル化脂肪酸は、食品添加剤、界面活性剤、色素湿潤剤、消泡剤、防水添加剤、可塑剤、化粧品用乳化剤及び／又は脱臭剤を含めたいくつかの工業用途、並びにエレクトロニクス、医薬品、ペンキ、インク、接着剤、及び潤滑剤における成分として有用である。グリセリドのヒドロキシル化がどのように実施され得るかについての一例は、以下のとおりである：脂肪を、ヘプタンと組み合わせて好ましくは約３０〜５０℃に加熱し、３０分間以上温度を維持し得る；次に混合物に酢酸を添加した後、硫酸水溶液を添加し、続いて過酸化水素水溶液を添加することができ、これは少量ずつ増加させながら１時間かけて混合物に添加される；過酸化水素水の後、次に温度を少なくとも約６０℃に上昇させ、少なくとも６時間撹拌し得る；撹拌後、混合物を沈殿させ、反応により形成された下層の水層を取り出すと同時に、反応により形成された上層のヘプタン層を約６０℃の温度の熱水で洗浄し得る；次に洗浄したヘプタン層を水酸化カリウム水溶液でｐＨ約５〜７に中和し、次に真空留去し得る；次に反応生成物を１００℃で真空乾燥させ、乾燥した生成物を真空条件下で蒸気脱臭し、珪藻土を使用して約５０°〜６０℃でろ過する。
本明細書に記載される方法によって生成される微生物油のヒドロキシル化は、以下に報告されるような方法及び／又は材料の１つ以上と併せて実施するか、又はそのような生成物を生成するため実施することができる：米国特許第６，５９０，１１３号明細書（油性コーティング及びインク）；同第４，０４９，７２４号明細書（ヒドロキシル化プロセス）；同第６，１１３，９７１号明細書（オリーブ油バター）；同第４，９９２，１８９号明細書（潤滑剤及び潤滑添加剤）；同第５，５７６，０２７号明細書（ヒドロキシル化乳）；同第６，８６９，５９７号明細書（化粧品）。
ヒドロキシル化したグリセロ脂質は、エストライドに変換することができる。エストライドはグリセロ脂質からなり、ここではヒドロキシル化脂肪酸構成要素が別の脂肪酸分子とエステル化されている。ヒドロキシル化グリセロ脂質からエストライドへの変換は、Ｉｓｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＯＣＳ ７１（２）：１６９−１７４（１９９４）により記載されるとおり、グリセロ脂質と脂肪酸との混合物を加温し、混合物を鉱酸に接触させることによって行われ得る。エストライドは、限定なしに以下に報告されるものを含めた、様々な用途において有用である：米国特許第７，１９６，１２４号明細書（エラストマー材料及び床仕上げ材）；同第５，４５８，７９５号明細書（高温用途の濃化油）；同第５，４５１，３３２号明細書（工業用途の流体）；同第５，４２７，７０４号明細書（燃料添加剤）；同第５，３８０，８９４号明細書（潤滑剤、グリース、可塑剤、及び印刷インク）。
別のかかる化学的改変は、オレフィンメタセシスである。オレフィンメタセシスでは、触媒がアルケン（オレフィン）中のアルキリデン炭素を切り離し、その各々を異なるアルキリジン炭素と対にすることにより新しいアルケンを形成する。オレフィンメタセシス反応は、エテノリシスによるアルケンでの不飽和脂肪酸アルキル鎖の切断、自己メタセシスによるアルケン結合を介した脂肪酸の架橋結合、及び誘導体化アルケンとのクロスメタセシスによる脂肪酸に対する新しい官能基の導入などのプロセスに対する機構を提供する。
エステル転移反応及び水素化などの他の反応と併せて、オレフィンメタセシスは、不飽和グリセロ脂質を多様な最終生成物に変えることができる。これらの生成物としては、ワックス用のグリセロ脂質オリゴマー；潤滑剤用の短鎖グリセロ脂質；化学品及びポリマー用のホモ及びヘテロ二官能性アルキル鎖；バイオ燃料用の短鎖エステル；及びジェット燃料用の短鎖炭化水素が挙げられる。オレフィンメタセシスは、トリアシルグリセロール及び脂肪酸誘導体に対し、例えば、米国特許第７，１１９，２１６号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１６０５０６号明細書、及び米国特許出願公開第２０１０／０１４５０８６号明細書に報告される触媒及び方法を用いて実施することができる。
バイオ油のオレフィンメタセシスは、概して、不活性条件下において、他のアルケンの存在下（クロスメタセシス）又はその非存在下（自己メタセシス）で不飽和脂肪酸エステルに約１０〜２５０ｐｐｍの負荷でＲｕ触媒の溶液を添加することを含む。こうした反応は、典型的には数時間乃至数日間進行させて、最終的にある分布のアルケン生成物が得られる。オレフィンメタセシスを脂肪酸誘導体に対してどのように実施し得るかについての一例は、以下のとおりである：触媒負荷２２２ｐｐｍの第１世代グラブス触媒（ジクロロ［２（１−メチルエトキシ−α−Ｏ）フェニル］メチレン−α−Ｃ］（トリシクロヘキシルホスフィン）のトルエン中溶液を、脱気して乾燥させたオレイン酸メチルが入った容器に加え得る。次に容器を約６０ｐｓｉｇのエチレンガスで加圧し、約３０℃以下に３時間維持すると、それにより約５０％の収率のメチル９−デセノエートが生成され得る。
本明細書に記載される方法によって生成される油のオレフィンメタセシスは、以下に報告されるような方法及び／又は材料の１つ以上と併せて実施するか、又はそのような生成物を生成するため実施することができる：ＰＣＴ／ＵＳ０７／０８１４２７号明細書（α−オレフィン脂肪酸）及び米国特許出願第１２／２８１，９３８号明細書（石油クリーム）、同第１２／２８１，９３１号明細書（ペイントボールガンカプセル）、同第１２／６５３，７４２号明細書（可塑剤及び潤滑剤）、同第１２／４２２，０９６号明細書（二官能性有機化合物）、及び同第１１／７９５，０５２号明細書（ロウソクワックス）。
微生物油に対して実施することのできる他の化学反応としては、米国特許第６，０５１，５３９号明細書に報告されるとおり、トリアシルグリセロールをシクロプロパン化剤と反応させることにより流動性及び／又は酸化安定性を増進させること；米国特許第６，７７０，１０４号明細書に報告されるとおり、トリアシルグリセロールからワックスを製造すること；及び「エポキシ化トリアシルグリセロールのアクリル化速度論に及ぼす脂肪酸組成の影響（Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｅｐｏｘｉｄｉｚｅｄ ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ，７９：１，５９−６３，（２００１）及びＦｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３７：１，１０４−１１４（２００４）に報告されるとおり、トリアシルグリセロールのエポキシ化が挙げられる。
上記に記載したとおりの燃料及び化学製品用の油含有微生物バイオマスの生成は、脱脂バイオマスミールの生成をもたらす。脱脂ミールは、藻類油の調製の副産物であり、家畜、例えば、反芻動物、家禽、ブタ及び水産養殖の動物用飼料として有用である。得られるミールは、含油量が低いものの、高品質タンパク質、炭水化物、繊維、灰分、残留油及び動物用飼料に適切な他の栄養素をなお含有する。細胞は主に油分離過程で溶解されるため、脱脂ミールはかかる動物によって容易に消化可能である。脱脂ミールは場合により、動物用飼料中で穀物などの他の成分と組み合わされ得る。脱脂ミールは粉末状の稠度を有するため、エクストルーダ又はエキスパンダー又は市販の別のタイプの機械を使用してペレットに圧縮することができる。
上記では本発明を詳細に記載したが、本発明は以下の例に例示される。これらの例は、特許請求される本発明を限定するのではなく、例示するために提供される。
ＸＩＶ．実施例
実施例１：脂肪酸メチルエステル検出による脂肪酸分析
乾燥バイオマスから脂質サンプルを調製した。２０〜４０ｍｇの乾燥バイオマスを２ｍＬのＭｅＯＨ中５％Ｈ２ＳＯ４に再懸濁し、適切な量の好適な内部標準（Ｃ１９：０）を含有する２００ｕｌのトルエンを添加した。この混合物を短時間超音波処理してバイオマスを分散させ、次に７０〜７５℃で３．５時間加熱した。２ｍＬのヘプタンを添加して脂肪酸メチルエステルを抽出し、続いて２ｍＬの６％Ｋ２ＣＯ３（水溶液）を添加して酸を中和した。混合物を激しく撹拌し、標準ＦＡＭＥ ＧＣ／ＦＩＤ（脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化検出）法を用いるガスクロマトグラフィー分析のため、上層の一部を、Ｎａ２ＳＯ４（無水）が入ったバイアルに移した。以下に報告する脂肪酸プロフィールは、この方法によって決定した。
実施例２：油からのトリアシルグリセリド精製及びトリアシルグリセリドリパーゼ消化方法
ジクロロメタン中に約１０ｍｇの油を溶解し、それを、ヘプタンでプレコンディショニングしたＢｏｎｄ−Ｅｌｕｔアミノプロピル固相抽出カートリッジ（５００ＭＧ）に負荷することにより、各油サンプルのトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）画分を単離した。ジクロロメタン（ｄｉｃｈｏｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）−ＭｅＯＨ（１：１）でＴＡＧを収集チューブに溶出させ、その間、極性脂質はカラムに保持された。窒素ガス流で溶媒を除去した。トリス緩衝液及び２ｍｇブタ膵リパーゼ（ＩＩ型、Ｓｉｇｍａ、１００〜４００単位／ｍｇ）をＴＡＧ画分に加え、続いて胆汁酸塩及び塩化カルシウム溶液を添加した。ブタ膵リパーゼはｓｎ−１及びｓｎ−３脂肪酸を切断し、それにより２−モノアシルグリセリド及び遊離脂肪酸が生じる。この混合物を撹拌しながら４０℃で３分間加熱し、短時間冷却し、次に６Ｎ ＨＣｌでクエンチした。次に混合物をジエチルエーテルで抽出し、エーテル層を水で洗浄し、次に硫酸ナトリウムで乾燥させた。窒素流下で溶媒を除去した。モノアシルグリセリド（ＭＡＧ）画分を単離するため、残渣をヘプタン中に溶解し、ヘプタンで前処理した第２のアミノプロピル固相抽出カートリッジに負荷した。残留ＴＡＧをジエチルエーテル−ジクロロメタン−ヘプタン（１：９：４０）で溶出し、ジアシルグリセリド（ＤＡＧ）を酢酸エチル−ヘプタン（１：４）で溶出し、ＭＡＧをカートリッジからジクロロメタン−メタノール（２：１）で溶出した。得られたＭＡＧ、ＤＡＧ、及びＴＡＧ画分を、次に窒素流下で濃縮乾固し、実施例１に記載するとおりのＧＣ／ＦＩＤ分析の定法の直接エステル転移法に供した。
実施例３：脂肪酸及びｓｎ−２プロフィールのため微生物を操作すると、外因性ＬＰＡＡＴ発現を介してラウリン酸が増加した
この例では、Ｃ．ｎｕｃｉｆｅｒａ １−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＣＮ ＬＰＡＡＴ）酵素をコードする組換えポリヌクレオチドの使用による、形質転換微生物の脂肪酸プロフィール及びｓｎ−２プロフィールにおいてラウリン酸が高濃度化した微生物の操作を記載する。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的な突然変異誘発株、株Ａを、初めに、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により、プラスミド構築物ｐＳＺ１２８３で形質転換した。本明細書により参照によって援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるｐＳＺ１２８３は、Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＦＡＴＢ２（ＣｗＴＥ２）チオエステラーゼのコード配列（配列番号１０）、核ゲノムへの組み込み用の６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１）及び３’（配列番号２）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下で配列番号３に示されるタンパク質配列を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域（配列番号４）を含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２発現カセットは配列番号７として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。配列番号１１に示されるタンパク質配列を発現するＣｗＴＥ２タンパク質コード配列は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲの制御下にあった。ＣｗＴＥ２及びｓｕｃ２のタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにコドンを最適化した。
ｐＳＺ１２８３を株Ａに形質転換した後、ショ糖を単一炭素源として含む寒天プレート上で陽性クローンを選択した。次に一次形質転換体をクローン精製し、単一の形質転換体、株Ｂを、さらなる遺伝子改変用に選択した。この遺伝子操作株をプラスミド構築物ｐＳＺ２０４６で形質転換して株ＢのｐＬｏｏｐゲノム遺伝子座に割り込ませた。構築物ｐＳＺ２０４６は、Ｃ．ｎｕｃｉｆｅｒａ １−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（Ｃｎ ＬＰＡＡＴ）酵素のコード配列（配列番号１２）、核ゲノムへの組み込み用のｐＬｏｏｐゲノム領域に対する５’（配列番号１３）及び３’（配列番号１４）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）、及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあるネオマイシン耐性タンパク質コード配列を含んだ。このＮｅｏＲ発現カセットは配列番号１５として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。Ｃｎ ＬＰＡＡＴタンパク質コード配列は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲの制御下にあった。Ｃｎ ＬＰＡＡＴ及びＮｅｏＲのタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにコドンを最適化した。Ｃｎ ＬＰＡＡＴのアミノ酸配列を、配列番号１６として提供する。
ｐＳＺ２０４６を株Ｂに形質転換し、それにより株Ｃを作成した後、Ｇ４１８（ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ））を含む寒天プレート上で陽性クローンを選択した。個々の形質転換体をクローン精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述されるとおりの脂質産生に好適な条件下、ｐＨ７．０で成長させた。各形質転換体由来の乾燥バイオマスから脂質サンプルを調製し、実施例１に記載されるとおりの標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化（ＦＡＭＥ ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いてこれらのサンプルの脂肪酸プロフィールを分析した。単一炭素源としてグルコース上で成長させたＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５（Ｕ１）、非形質転換株Ｂ及び５つのｐＳＺ２０４６陽性形質転換体（株Ｃ、１〜５）の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表６に提供する。
表６に示されるとおり、ＣｗＴＥ２を発現する株Ｂの脂肪酸プロフィールは、非形質転換ＵＴＥＸ １４３５株の脂肪酸プロフィールと比べてＣ１０：０、Ｃ１２：０、及びＣ１４：０脂肪酸の組成の増加並びにＣ１６：０、Ｃ１８：０、及びＣ１８：１脂肪酸の減少を示した。形質転換株の脂肪酸プロフィールに対するさらなる遺伝子改変、すなわち株ＢにおけるＣｎＬＰＡＡＴの発現の影響は、Ｃ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸の組成のさらに一層の増加、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、及びＣ１８：１脂肪酸のさらに一層の減少であるが、Ｃ１４：０脂肪酸組成に対して大きい効果はない。これらのデータは、微生物宿主生物との関連においてＣｎＬＰＡＡＴが基質選択性を示すことを示している。
非形質転換Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株Ａは、０．５％未満のＣ１２脂肪酸及び１％未満のＣ１０〜Ｃ１２脂肪酸を含む脂肪酸プロフィールによって特徴付けられる。対照的に、Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼを発現する株Ｂの脂肪酸プロフィールは、３１％のＣ１２：０脂肪酸を含み、Ｃ１０〜Ｃ１２脂肪酸が全脂肪酸の３６％超含まれた。さらに、高等植物チオエステラーゼ及びＣｎＬＰＡＡＴ酵素を発現する株Ｃの脂肪酸プロフィールは、４５．６７％〜４６．６３％のＣ１２：０脂肪酸を含み、Ｃ１０〜Ｃ１２％脂肪酸が全脂肪酸の７１〜７３％含まれた。外因性チオエステラーゼが発現した結果は、操作された微生物中に存在するＣ１２脂肪酸の割合の６２倍の増加であった。外因性チオエステラーゼ及び外因性ＬＰＡＡＴが発現した結果は、操作された微生物中に存在するＣ１２脂肪酸の割合の９２倍の増加であった。
株Ａ、Ｂ、及びＣから抽出した油サンプルのＴＡＧ画分を、それらのトリアシルグリセリドのｓｎ−２プロフィールについて分析した。実施例２に記載されるとおりＴＡＧを抽出して処理し、実施例１及び２のとおり分析した。株Ａ、Ｂ、及びＣから抽出した油のＴＡＧ画分の脂肪酸組成及びｓｎ−２プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表７に提供する。報告されない値は「ｎ．ｒ．」と指示される。
表７に示されるとおり、ＣｗＴＥ２を発現する株Ｂから単離したトリグリセリド（ＴＡＧ）の脂肪酸組成は、非形質転換株Ａから単離されたＴＡＧの脂肪酸プロフィールと比べてＣ１０：０、Ｃ１２：０、及びＣ１４：０脂肪酸について増加し、Ｃ１６：０及びＣ１８：１脂肪酸が減少した。形質転換株の脂肪酸プロフィールに対するさらなる遺伝子改変、すなわちＣｎＬＰＡＡＴの発現の影響は、Ｃ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸の組成のさらに一層の増加、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、及びＣ１８：１脂肪酸のさらに一層の減少であったが、Ｃ１４：０脂肪酸組成に対して大きい効果はなかった。これらのデータは、外因性ＣｎＬＰＡＡＴの発現により形質転換微生物の中鎖脂肪酸プロフィールが向上することを示している。
非形質転換Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株Ａは、約０．６％ Ｃ１４、約１．６％ Ｃ１６：０、約０．３％ Ｃ１８：０、約９０％ Ｃ１８：１、及び約５．８％ Ｃ１８：２のｓｎ−２プロフィールによって特徴付けられる。株Ａと対照的に、Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼを発現する株Ｂは、中鎖脂肪酸が高く、長鎖脂肪酸が低いｓｎ−２プロフィールによって特徴付けられる。Ｃ１２脂肪酸は株Ｂのｓｎ−２プロフィールの２５％を含んだ。形質転換株のｓｎ−２プロフィールに対するさらなる遺伝子改変、すなわちＣｎＬＰＡＡＴの発現の影響は、Ｃ１２脂肪酸のさらに一層の増加（２５％から５２．８％）、Ｃ１８：１脂肪酸の減少（３６．６％から１７．５％）、及びＣ１０：０脂肪酸の減少であった（株Ｂ及び株ＣについてＣ１４：０及びＣ１６：０脂肪酸のｓｎ−２プロフィール組成は比較的類似していた）。
これらのデータは、外因性ＬＰＡＡＴ発現によって操作微生物の脂肪酸プロフィールを変えることが可能なポリヌクレオチドの、詳細には微生物細胞中のＣ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸の濃度を増加させることにおける有用性及び有効性を実証している。これらのデータは、さらに、外因性チオエステラーゼ及び外因性ＬＰＡＡＴ発現によって微生物細胞が産生するＴＡＧのｓｎ−２プロフィールを変えることが可能なポリヌクレオチドの、詳細にはｓｎ−２プロフィールのＣ１２組成を増加させ、且つｓｎ−２プロフィールのＣ１８：１組成を減少させることにおける有用性及び有効性を実証している。
実施例４：組換え微細藻類から産生された油の熱挙動
図１〜図１４は、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株からの精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を含む。ある場合には、遺伝子操作によって融解曲線の改変が達成される。例えば、産生される油によっては、対照微細藻類油（すなわち、所与の遺伝子改変を欠く株から産生されるもの）と比べて、又は広く利用可能な植物油と比べてより緩やかな又はよりシャープな融解遷移を有するものもある。加えて、図１２は、高パルミチン酸油について室温で数日間保持することによりテンパリングしたとき（上側のトレース）及び同じ油について第１の走査を実施した後（下側のトレース）の走査熱量測定を示す。走査は１０℃／分の加熱速度で−６０℃〜＋５０℃の範囲であった。２つのトレース間の違いから、油のテンパリングにより油中の結晶構造に変化が生じたことが示唆される。
同様に注目すべきものとして、図１０及び図１１がＲＢＤ−５及びＲＢＤ ６の安定性試験を示す。著しいことに、０．１％未満の１８：２及び１８：３脂肪酸を含む油であるＲＢＤ−６は、酸化安定性指数（ＡＯＣＳ法Ｃｄ １２ｂ−９２）によって測定したとき、１１０℃で加熱して３６時間経った後にも実質的に安定していた。
以下の表８は、図１〜図１３に特定される株の遺伝子操作の詳細を提供する。
実施例５：操作された微生物から生成した加工油の特徴
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）を形質転換ベクターｐＳＺ１５００（配列番号１７）で形質転換する方法及び効果については、ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に既に記載されている。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的に変異を誘発した（より高い油生成のため）誘導体、株Ａを、本明細書及びＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により、ｐＳＺ１５００で形質転換した。ｐＳＺ１５００は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５における発現にコドン最適化されたＣａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓオレイル−チオエステラーゼ（ＣｔＯＴＥ）遺伝子のヌクレオチド配列を含んだ。ｐＳＺ１５００発現構築物は、核ゲノムへの組み込み用のＦＡＤｃゲノム領域に対する５’（配列番号１８）及び３’（配列番号１９）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域を含む。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２発現カセットは配列番号７として列挙され、選択マーカーとして働いた。ＣｔＯＴＥコード領域は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあり、天然のトランジットペプチドは、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチド（配列番号９）により置換した。ＣｔＯＴＥ及びｓｕｃ２のタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようコドン最適化した。
株Ａの一次ｐＳＺ１５００形質転換体を、ショ糖を単一炭素源として含有する寒天プレート上で選択してクローン精製し、単一の操作された系統、株Ｄを分析用に選択した。株Ｄは、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり成長させた。次に、生成されたバイオマスからの油のヘキサン抽出を、標準方法を用いて実施し、得られたトリグリセリド油が残留ヘキサンを含まないことを決定した。連続圧搾機での圧縮を用いて微細藻類から油を抽出する他の方法が、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３１１０８号明細書に記載され、本明細書により参照によって援用される。
株Ｄのバイオマスから抽出した油の種々のロットを、標準的な植物油加工方法を用いて精製、漂白、脱臭した。これらの手順により油サンプルＲＢＤ４３７、ＲＢＤ４６９、ＲＢＤ５０１、ＲＢＤ５０２、ＲＢＤ５０３、及びＲＢＤ５２９を生成し、これらを、米国油脂化学協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ）、米国材料試験協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）、及び国際標準化機構（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ）が定義する方法に従い分析的試験プロトコルに供した。これらの分析の結果は、以下の表９〜表１４に要約する。
ＲＢＤ４６９油を、ＡＯＣＳ方法に従い微量元素含有量、固形脂肪含有量、及びロビボンド色について分析した。これらの分析の結果を、以下の表１０、表１０、及び表１１に提供する。
ＲＢＤ４６９油をエステル転移反応に供して脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を生成した。ＲＢＤ４６９の得られたＦＡＭＥプロフィールを表１２に示す。
抗酸化剤を補足しない６つのＲＢＤ油サンプル及び抗酸化剤を補足した３つのＲＢＤ油サンプルの油安定性指数（ＯＳＩ）を、油安定性指数ＡＯＣＳ方法Ｃｄ １２ｂ−９２に従い分析した。表１４には、Ｍｅｔｒｏｈｍ ８７３ Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ Ｒａｎｃｉｍａｔを使用して実施した、１１０℃で行ったＯＳＩ ＡＯＣＳ Ｃｄ １２ｂ−９２試験の結果を示す。結果は、星印（＊）で示した場合を除き、複数のＯＳＩランの平均値である。分析していないサンプルは、（ＮＡ）で示す。
形質転換されていないＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）酸プロフィールは、６０％未満のＣ１８：１脂肪酸及び７％超のＣ１８：２脂肪酸を含む。対照的に、株Ｄ（ｐＳＺ１５００を含む）は、Ｃ１８：１脂肪酸の組成が増加（８５％を上回るまで）し且つＣ１８：２脂肪酸が減少（０．０６％未満まで）した脂肪酸プロフィールを呈した。精製、漂白、及び脱ガム後、株Ｅで作製した油から調製したＲＢＤ油サンプルは、ＯＳＩ値＞２６時間を呈した。抗酸化剤を添加すると、株Ｄの油から調製したＲＢＤ油のＯＳＩは、４８．６０時間から２４２時間超に増加した。他の実験では、４００時間以上にわたるＯＳＩ値を得た。本発明の実施形態に係る低多価不飽和油のさらなる特性を図１６に示す。
実施例６：脂肪酸デサチュラーゼ及びアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの対立遺伝子破壊による操作微生物のオレイン酸濃度の改善
この例では、形質転換ベクターを使用することによる、高いオレイン酸及び低いリノール酸を産生するように先に操作したＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株のＦＡＴＡ遺伝子座の破壊を記載する。この例で使用した形質転換カセットは、微生物を操作するため選択可能なマーカー及びＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ酵素をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで形質転換微生物の脂肪酸プロフィールは、さらにオレイン酸濃度が増加し、且つパルミチン酸濃度が低下するように改変されていた。
実施例５及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載される株Ｄは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的に変異を誘発した（より高い油生成のため）誘導体であり、続いて、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法に従い形質転換構築物ｐＳＺ１５００（配列番号１７）で形質転換した。この株を、構築物ｐＳＺ２２７６による形質転換用の宿主として使用して、ＫＡＳＩＩ酵素の発現を増加させると同時に、内在性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子座を除去して株Ｅを作成した。ｐＳＺ２２７６形質転換構築物は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ核ゲノムへの組み込み用のＦＡＴＡ１ゲノム領域に対する５’（配列番号２０）及び３’（配列番号２１）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓアクチンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号２２）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＴＨＩＣタンパク質コード領域を含んだ。このＡｔＴＨＩＣ発現カセットは配列番号２３として列挙され、選択マーカーとして働いた。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩタンパク質コード領域は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあり、ＫＡＳＩＩ酵素の天然のトランジットペプチドは、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチド（配列番号９）により置換した。Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドを含むＰｍＫＡＳＩＩ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ）のコドン最適化配列は、配列表に配列番号２４として提供される。配列番号２５は、配列番号２４のタンパク質翻訳を提供する。ＰｍＫＡＳＩＩ及びｓｕｃ２のタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようコドン最適化した。
株Ｄの一次ｐＳＺ２２７６形質転換体を、チアミン不含の寒天プレート上で選択してクローン精製し、単一の操作された系統、株Ｅを分析用に選択した。株Ｅは、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの、ｐＨ５．０及びｐＨ７．０の従属栄養脂質産生条件下で培養した。脂質サンプルを各形質転換体由来の乾燥バイオマスから調製し、それらのサンプルの脂肪酸プロフィールを、実施例１に記載されるとおりの標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化（ＦＡＭＥ ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いて分析した。ｐＳＺ２２７６を株Ｄに形質転換することによって生じるトランスジェニック系の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表１５に示す。
表１５に示されるとおり、ＣｔＯＴＥ発現カセットによりＦＡＤｃ対立遺伝子を標的化して破壊すると、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールが影響を受けた。株Ｄ（ｐＳＺ１５００形質転換ベクターを含む）の脂肪酸プロフィールは、株Ａと比べてＣ１８：１脂肪酸の組成の増加と、同時にＣ１６：０及びＣ１８：２脂肪酸の低下を示した。続くｐＳＺ２２７６による株Ｄの形質転換によりＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）ＫＡＳＩＩタンパク質を過剰発現させると同時にＦＡＴＡ遺伝子座を除去すると（それにより株Ｅを作成する）、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールになおもさらなる影響がもたらされた。株Ｅの脂肪酸プロフィールは、株Ａ及びＤと比べてＣ１８：１脂肪酸の組成の増加と、Ｃ１６：０脂肪酸のさらなる低下を示した。Ａｍｔ０３プロモーターからの発現を誘導するための、ｐＨ７の培養条件における株Ｅの増殖は、ｐＨ５で培養した同じ株と比べてＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸が多く、且つＣ１６：０脂肪酸が少ない脂肪酸プロフィールをもたらした。
これらのデータは、オレイン酸の濃度を増加させると同時にリノール酸及びパルミチン酸の濃度を低下させるための、宿主生物の脂肪酸プロフィールに影響を与える複数の遺伝子改変の有用性を実証している。さらに、この例は、宿主微生物の脂肪酸プロフィールを変化させるための、外来性ＫＡＳＩＩタンパク質コード領域の発現を制御するｐＨ調節可能なプロモーターを含むカセットによる、組換えポリヌクレオチドを使用した内在性ＦＡＴＡ対立遺伝子の標的遺伝子破壊を例示する。
実施例７：脂肪酸デサチュラーゼの条件的発現
この例では、形質転換ベクターを使用することによる、シード及び脂質生産性の両方の増殖段階で高いオレイン酸及び極めて低いリノール酸を産生するように先に操作したＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株におけるデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）の条件的発現を記載する。細胞油における極めて低いリノール酸濃度は、特定の用途において使用が求められる。しかしながら、宿主微生物の細胞分裂期（「シード段階」）にリノール酸が存在しないことは不利である。リノール酸をシード培地に補足して細胞分裂を促進し、且つ脂質産生中は添加しないことでもよいが、しかしながらこの追加により不要なコストがかかる。この問題を解消するため、細胞分裂に十分なリノール酸の濃度が達成され得るとともに、微生物培養の油生成段階において極めて低濃度のリノール酸を有する油が産生され得るように、ＦＡＤ２酵素を制御して発現させるための形質転換カセットを構築した。この例で用いられる形質転換カセットは、微生物を操作するため選択可能なマーカー、ｐＨ調節可能なプロモーター、及びＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ２酵素をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで形質転換微生物の脂肪酸プロフィールは、オレイン酸産生が増加し、且つリノール酸産生が調節可能となるように改変されていた。
実施例５、６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載される株Ｄは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的に変異を誘発した（より高い油生成のため）誘導体であり、続いて、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により形質転換構築物ｐＳＺ１５００（配列番号１７）で形質転換した。この株を、構築物ｐＳＺ２４１３による形質転換用の宿主として使用して、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ２酵素を調節するためのｐＨ駆動性プロモーターを導入した。ｐＳＺ２４１３形質転換構築物は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ核ゲノムへの組み込み用の６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１）及び３’（配列番号２）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓアクチンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号２２）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＴＨＩＣタンパク質コード領域を含んだ。このＡｔＴＨＩＣ発現カセットは配列番号２３として列挙され、選択マーカーとして働いた。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ２タンパク質コード領域は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあった。ＰｍＦＡＤ２のコドン最適化配列は、配列表に配列番号２６として提供される。配列番号２７は、配列番号２６のタンパク質翻訳を提供する。ＰｍＦＡＤ２及びｓｕｃ２のタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようコドン最適化した。
株Ｄの一次ｐＳＺ２４１３形質転換体を、チアミン不含の寒天プレート上で選択してクローン精製し、操作された系統、株Ｆの単離物を分析用に選択した。これらの単離物を、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、従属栄養脂質産生条件下にｐＨ７．０で培養し（それによりＰｍＡｍｔ０３プロモーターからのＦＡＤ２の発現を活性化した）、及びｐＨ５．０で培養した。脂質サンプルを各形質転換体由来の乾燥バイオマスから調製し、それらのサンプルの脂肪酸プロフィールを、実施例１に記載されるとおりの標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化（ＦＡＭＥ ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いて分析した。ｐＳＺ２４１３で株Ｄに形質転換することにより生じるトランスジェニック株Ｆの９つの代表的な単離物（Ｆ−１〜Ｆ−９）の得られたＣ１８：２脂肪酸プロフィール（面積％で表される）を、表１６に示す。
表１６に示されるとおり、異なるｐＨ値で株を培養したことにより生じた、ＰｍＦＡＤ２酵素の制御された発現の影響は、形質転換微生物におけるＣ１８：２脂肪酸の組成の明らかな増加である。リノール酸は、株Ａの脂肪酸の約６％〜約７．３％を含む。対照的に、株Ｄ（両方のＦＡＤ２対立遺伝子を除去するｐＳＺ１５００形質転換ベクターを含む）は、０．０１％リノール酸の脂肪酸プロフィールにより特徴付けられる。ｐＳＺ２４１３で株Ｄを形質転換することによる株Ｆの作成は、リノール酸の産生がＡｍｔ０３プロモーターにより調節される組換え微生物をもたらす。Ａｍｔ０３プロモーターからのＦＡＤ２発現を誘導するため、ｐＨ７の培養条件で株Ｆ単離物を増殖させると、約４．５％〜約７．５％リノール酸により特徴付けられる脂肪酸プロフィールとなった。対照的に、ｐＨ５の培養条件で株Ｆ単離物を増殖させると、約０．３３〜約０．７７％リノール酸により特徴付けられる脂肪酸プロフィールとなった。
これらのデータは、ＦＡＤ２酵素の条件的発現を可能にする組換えポリヌクレオチドが、操作された微生物の脂肪酸プロフィールの改変に、及び詳細には、微生物細胞におけるＣ１８：２脂肪酸産生の調節において、有用且つ有効であることを実証している。
実施例８：位置特異的プロフィールの分析
ＡＰＣＩ源を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ ８０３０トリプル四重極型質量分析器と結合したＳｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ超高速液体クロマトグラフィー装置（ＳＩＬ−３０ＡＣオートサンプラー、２つのＬＣ−３０ＡＤポンプ、ＤＧＵ−２０Ａ５インラインデガッサー、及びＣＴＯ−２０Ａカラムオーブンを含む）を使用して、ＬＣ／ＭＳ ＴＡＧ分布解析を実施した。データは、ｍ／ｚ ３５０〜１０５０のＱ３スキャンを使用し、陽イオンモードにおいて１４２８ｕ／秒の走査速度で、ＣＩＤガス（アルゴン）圧力を２３０ＫＰａに設定して取得した。ＡＰＣＩ、脱溶媒和ライン、及びヒートブロックの温度はそれぞれ３００、２５０、及び２００℃に設定し、噴霧ガス及び乾燥ガスの流速はそれぞれ３．０Ｌ／分及び５．０Ｌ／分であり、及び界面電圧は４５００Ｖであった。油サンプルを、濃度が５ｍｇ／ｍＬとなるようにジクロロメタン−メタノール（１：１）中に溶解し、０．８μＬのサンプルを、３０℃に維持したＳｈｉｍａｄｚｕ Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＸＲ−ＯＤＳ ＩＩＩ（２．２μｍ、２．０×２００ｍｍ）に注入した。クロマトグラフ分離には、０．４８ｍＬ／分で２７分間の３０％ジクロロメタン−２−プロパノール（１：１）／アセトニトリルから５１％ジクロロメタン−２−プロパノール（１：１）／アセトニトリルに至る直線勾配を使用した。
実施例９：ＳＯＳ、ＰＯＰ、及びＰＯＳトリアシルグリセリドの産生を増加させるための微生物の操作
この例では、Ｃ１８：０選択的Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓチオエステラーゼ（ＢｎＯＴＥ）酵素をコードする組換えポリヌクレオチドの使用による、形質転換微生物のトリアシルグリセリド分布においてＳＯＳ、ＰＯＳ、及びＰＯＰトリアシルグリセリドが高濃度化した微生物の操作を記載する。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的な突然変異誘発株、株Ａを、初めに、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により、プラスミド構築物ｐＳＺ１３５８で形質転換した。本明細書により参照によって援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるｐＳＺ１３５８は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓチオエステラーゼ（ＢｎＯＴＥ）チオエステラーゼのコード配列（配列番号２８）、核ゲノムへの組み込み用の６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１）及び３’（配列番号２）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下で配列番号３に示されるタンパク質配列を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域（配列番号４）を含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２発現カセットは配列番号７として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。配列番号２９に示されるタンパク質配列を発現するＢｎＯＴＥタンパク質コード配列は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲの制御下にあった。ＢｎＯＴＥ及びｓｕｃ２のタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにコドンを最適化した。
株Ａの一次ｐＳＺ１３５８形質転換体を、ショ糖を単一炭素源として含有する寒天プレート上で選択してクローン精製し、単一の操作された系、株Ｇを分析用に選択した。株Ｇを、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり従属栄養脂質産生条件下ｐＨ７．０で培養した（それによりＰｍＡｍｔ０３プロモーターからのＢｎＯＴＥの発現を活性化した）。株Ａ及び株Ｇから得られた油サンプルを、実施例１及び２に記載される方法を用いて脂肪酸組成について分析し、及び、実施例８に記載される方法を用いて、油中のトリアシルグリセリドの位置特異性について分析した。株Ａ及び株Ｇから単離したＴＡＧの脂肪酸プロフィールを表１７に示す。表１８は、株Ａ及び株Ｇ由来の油サンプル中に存在するＰＯＰ、ＰＯＳ、及びＳＯＳ ＴＡＧの位置特異性プロフィールを提供する。
表１７に示されるとおり、ＢｎＯＴＥを発現する株Ｇから単離されたＴＡＧの脂肪酸組成は、非形質転換株Ａから単離されたＴＡＧの脂肪酸プロフィールと比べて、著しくＣ１８：０脂肪酸（３．７％から３０．４％）が増加し、且つＣ１８：１脂肪酸が減少した（６４．３％から３０．２％）。株Ａから単離されたＴＡＧの脂肪酸組成は、約２３．９％パルミチン酸、３．７％ステアリン酸、及び６４．３％オレイン酸、約６．５：１：１７．４のＰ：Ｓ：Ｏ比によって特徴付けられた。対照的に、株Ｇから単離されたＴＡＧの脂肪酸組成は、約２５．８％パルミチン酸、３０．４％ステアリン酸、及び３０．２％のオレイン酸、約１：１．１８：１．１７のＰ：Ｏ：Ｓ比によって特徴付けられた。
形質転換微生物から産生された油のＰＯＰ、ＰＯＳ、及びＳＯＳ ＴＡＧの位置特異的プロフィールに対するＣ１８：０選択的チオエステラーゼの発現の影響は、油中に存在する全ＴＡＧの割合としての３つ全てのＴＡＧの増加であった。表１８に示されるとおり、ＰＯＰ＋ＰＯＳ＋ＳＯＳ ＴＡＧの合計は、株Ｇによって産生されるＴＡＧの４５％を占め、一方、ＰＯＰ、ＰＯＳ、及びＳＯＳ ＴＡＧは、合計が株Ａで産生されるＴＡＧの僅か約１７％であった。株ＧのＰＯＰ、ＰＯＳ及びＳＯＳの割合を、表１８においてココアバターと比較する。見て分かるとおり、株ＧのＰＯＰ、ＰＯＳ及びＳＯＳの比は、ココアバターで観察される比と極めて類似している。
これらのデータは、外因性チオエステラーゼ発現によって操作微生物のＴＡＧの脂肪酸プロフィール及び位置特異的プロフィールを変えることが可能な、詳細にはＰＯＰ、ＰＯＳ、及びＳＯＳ ＴＡＧの分布を増加させることが可能なポリヌクレオチドの有用性及び有効性を実証している。
実施例１０〜３３：微生物の操作
以下の実施例１０〜３３は、本発明における様々な微生物の操作を記載する。微生物の脂肪酸プロフィールを変化させるため、微生物を遺伝子改変することができ、ここでは内在性又は外来性の脂質生合成経路酵素を発現させるか、過剰発現させるか、又は減弱させる。脂肪酸不飽和度に関して脂肪酸プロフィールが変化し、脂肪酸鎖長が減少又は増加するように微生物を遺伝子操作する工程は、形質転換ベクター（例えば、プラスミド）の設計及び構築、１つ以上のベクターによる微生物の形質転換、形質転換微生物（形質転換体）の選択、形質転換微生物の成長、及び操作された微生物により産生された脂質の脂肪酸プロフィールの分析を含む。
宿主生物の脂肪酸プロフィールを変化させる導入遺伝子は、数多くの真核微生物で発現させることができる。真核微生物における導入遺伝子の発現の例は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓａｃｃａｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅ、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍ、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ、及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含め、科学文献に見出すことができる。これらの発現技法を本発明の教示と組み合わせて、変化した脂肪酸プロフィールを有する操作された微生物を生成することができる。
宿主生物の脂肪酸プロフィールを変化させるか、又は宿主生物により産生されるグリセロ脂質の位置特異的分布を変化させる導入遺伝子はまた、数多くの原核微生物で発現させることができる。油産生微生物における導入遺伝子の発現の例は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓを含め、文献に見出すことができる。これらの発現技法を本発明の教示と組み合わせて、変化した脂肪酸プロフィールを有する操作された微生物を生成し得る。
実施例１０：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａの操作
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＤａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３５（１９９７）ｐｐ．３５６−３６２は、プラスミドＤＮＡによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａの安定な核形質転換を報告した。Ｄａｗｓｏｎは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、完全なＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素遺伝子（ＮＲ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ３９９３１）をコードするプラスミドｐＳＶ７２−ＮＲｇを、突然変異体Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａに導入した（ＮＲ突然変異体）。このＮＲ突然変異体は、窒素源として硝酸塩を利用することなしには成長することができない。硝酸還元酵素は硝酸塩から亜硝酸塩への変換を触媒する。形質転換前、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ ＮＲ突然変異体は、唯一の窒素源として硝酸塩（ＮＯ３ −）を含む培養培地上で微小コロニー段階より先に成長することはできなかった。ＮＲ突然変異体Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａにおけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ遺伝子産物の発現を選択可能なマーカーとして使用して、硝酸塩代謝の欠損を取り戻した。ｐＳＶ７２−ＮＲｇプラスミドによる形質転換後、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ遺伝子産物を安定的に発現するＮＲ突然変異体Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａが得られ、これは単一炭素源として硝酸塩を含む寒天プレート上で微小コロニー段階より先に成長することができた。安定な形質転換体のＤＮＡの評価はサザン解析により実施し、安定な形質転換体のＲＮＡの評価はＲＮアーゼ保護により実施した。形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ（ＮＲ突然変異体）の選択及び維持は、０．２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４、０．６７ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、３．５ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／Ｌ Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７・Ｈ２Ｏ及び１６．０ｇ／Ｌ寒天、適切な窒素源（例えば、ＮＯ３ −）、微量栄養素、及び炭素源を含む寒天プレート（ｐＨ７．４）上で実施した。Ｄａｗｓｏｎはまた、液体培養培地におけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ ＮＲ突然変異体の増殖も報告した。Ｄａｗｓｏｎは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素遺伝子のプラスミドｐＳＶ７２−ＮＲｇ並びにプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ ＮＲ突然変異体における異種遺伝子発現を可能にするのに好適であったことを報告した。Ｄａｗｓｏｎはまた、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素遺伝子産物の発現が、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ ＮＲ突然変異体における選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことも報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素（ＣｖＮＲ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＳＶ７２−ＮＲｇが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｖＮＲプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、ＣｖＮＲ ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ＣｖＮＲ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして用いることにより、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ ＮＲ突然変異株の窒素同化の欠損を取り戻し、形質転換ベクターを安定的に発現するＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ ＮＲ突然変異体を選択し得る。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、微量栄養素並びに適切な窒素源及び炭素源を補足した、０．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、０．２５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏが挙げられる（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｌｉｐｉｄｓ Ｖｏｌ．５：７（１９７０），ｐｐ．５９７−６００）。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例１１：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの操作
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＣｈｏｗ ａｎｄ Ｔｕｎｇ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｃｈｏｗ ａｎｄ Ｔｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １８（１９９９），ｐｐ．７７８−７８０は、プラスミドＤＮＡによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの安定な核形質転換を報告した。Ｃｈｏｗ ａｎｄ Ｔｕｎｇは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、プラスミドｐＩＧ１２１−Ｈｍ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢ４８９１４２）をＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓに導入した。ｐＩＧ１２１−Ｈｍのヌクレオチド配列は、ＧＵＳタンパク質コード配列の上流でＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結され、且つＧＵＳタンパク質コード配列の下流でノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターにさらに動作可能に連結されたβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子産物をコードする配列を含んだ。プラスミドｐＩＧ１２１−Ｈｍの配列は、ハイグロマイシンＢ抗生物質耐性カセットをさらに含んだ。このハイグロマイシンＢ抗生物質耐性カセットは、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＢＡＨ２４２５９）遺伝子産物をコードする配列に動作可能に連結されたＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを含んだ。形質転換前、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓは、５０ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含む培養培地で増殖することができなかった。ｐＩＧ１２１−Ｈｍプラスミドによる形質転換後、５０ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含む培養培地で増殖するＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの形質転換体が得られた。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓにおけるｈｐｔ遺伝子産物の発現により、５０ｕｇ／ｍＬハイグロマイシンＢの存在下における形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの増殖が可能となり、従ってＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのハイグロマイシンＢ耐性カセットの有用性が確立された。ＧＵＳレポーター遺伝子の検出可能な活性から、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター及びｎｏｓ ３’ＵＴＲが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることが示された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの選択及び維持は、ＹＡ培地（寒天及び４ｇ／Ｌ酵母エキス）を含む寒天プレート上で行った。液体培養培地におけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの増殖は、Ｃｈｏｗ ａｎｄ Ｔｕｎｇにより考察されるとおり実施した。ＹＡ培地以外の培地におけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの増殖については記載されている（例えば、Ｃｈａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖｕｅ ｄｅｓ Ｅｎｅｒｇｉｅｓ Ｒｅｎｏｕｖｅｌａｂｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １４（２０１１），ｐｐ．２１−２６及びＩｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７（２０００），ｐｐ．６３１−６３５を参照）。Ｃｈｏｗ ａｎｄ Ｔｕｎｇは、プラスミドｐＩＧ１２１−Ｈｍ、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｃｈｏｗ ａｎｄ Ｔｕｎｇは、ハイグロマイシンＢ耐性カセットが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーは、Ｃｈａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖｕｅ ｄｅｓ Ｅｎｅｒｇｉｅｓ Ｒｅｎｏｕｖｅｌａｂｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １４（２０１１），ｐｐ．２１−２６において考察されている。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるハイグロマイシンＢ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むｐＩＧ１２１−Ｈｍが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの安定な形質転換は、エレクトロポレーション又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓを、限定はされないが、ハイグロマイシンを含む寒天培地上で選択することができる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、微量金属と、場合により１．５ｇ／Ｌ ＮａＮＯ３を補足したＢＧ１１培地（０．０４ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．０７５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、０．０３６ｇ／Ｌ クエン酸、０．００６ｇ／Ｌ クエン酸鉄アンモニウム、１ｍｇ／Ｌ ＥＤＴＡ、及び０．０２ｇ／Ｌ Ｎａ２ＣＯ３）が挙げられる。脂質産生のためのＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの培養に好適なさらなる培地としては、例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ培地（１．５ｇ／Ｌ ＫＮＯ３、１．２５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．２５ｇｌ−１ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇｌ−１ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを微量栄養素と共に含む）及びＩｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７（２０００），ｐｐ．６３１−６３５により報告されるとおりの低窒素培地（２０３ｍｇ／ｌ（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、２．２３６ｇ／ｌ ＫＣｌ、２．４６５ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４、１．３６１ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４及び１０ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ４を含む）が挙げられる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例１２：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの操作
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．３９：５（２００１），ｐｐ．３６５−３７０は、プラスミドＤＮＡによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの安定な形質転換を報告した。Ｃｈｅｎは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、プラスミドｐＢｉｎＵΩＮＰ−１をＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａに導入した。ｐＢｉｎＵΩＮＰ−１のヌクレオチド配列は、ＮＰ−１タンパク質コード領域の上流でＺｅａ ｍａｙｓユビキチン（ｕｂｉ１）遺伝子プロモーターに動作可能に連結され、且つＮＰ−１タンパク質コード領域の下流でノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、好中球ペプチド−１（ＮＰ−１）ウサギ遺伝子産物をコードする配列を含んだ。プラスミドｐＢｉｎＵΩＮＰ−１の配列は、Ｇ４１８抗生物質耐性カセットをさらに含んだ。このＧ４１８抗生物質耐性カセットは、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ａｐｈ ３’）遺伝子産物をコードする配列を含んだ。ａｐｈ ３’遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。形質転換前、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａは、３０ｕｇ／ｍＬ Ｇ４１８を含む培養培地で増殖することができなかった。ｐＢｉｎＵΩＮＰ−１プラスミドによる形質転換後、３０ｕｇ／ｍＬ Ｇ４１８を含む選択的培養培地で増殖するＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの形質転換体が得られた。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおけるａｐｈ ３’遺伝子産物の発現により、３０ｕｇ／ｍＬ Ｇ４１８の存在下における形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの増殖が可能となり、従ってＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのＧ４１８抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。ＮＰ−１遺伝子産物の検出可能な活性から、ｕｂｉ１プロモーター及びｎｏｓ ３’ＵＴＲが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることが示された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの選択及び維持は、１５ｕｇ／ｍＬ Ｇ４１８（液体培養用）を含むか又は３０ｕｇ／ｍＬ Ｇ４１８（１．８％寒天を含む固体培養用）を含むＫｎｏｐ培地（０．２ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、０．２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、及び１０ｍｇ／Ｌ ＦｅＣｌ３を含む、ｐＨ６．０〜８．０、０．１％酵母エキス及び０．２％グルコースを補足）上で行った。Ｋｎｏｐ培地以外の培地におけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの増殖が報告されている（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．７３：５（２００７），ｐｐ．１０５０−１０５６、Ｊａｒｖｉｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１９（１９９１），ｐｐ．３１７−３２１及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４（２００２），ｐｐ．６３−７３を参照）。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが報告されている（Ｊａｒｖｉｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４（２００２），ｐｐ．６３−７３を参照）。Ｃｈｅｎは、プラスミドｐＢｉｎＵΩＮＰ−１、ｕｂｉ１プロモーター、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｃｈｅｎは、ｐＢｉｎＵΩＮＰ−１でコードされるＧ４１８耐性カセットが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるＧ４１８に対する耐性を付与するａｐｈ ３’遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＢｉｎＵΩＮＰ−１が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＺｅａ ｍａｙｓ ｕｂｉ１プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの安定な形質転換は、エレクトロポレーション又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ａｐｈ ３’遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａを、限定はされないが、Ｇ４１８を含むＫｎｏｐ寒天培地上で選択することができる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｋｎｏｐ培地並びにＪａｒｖｉｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．により報告される培養培地が挙げられる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例１３：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉの操作
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＥｌ−Ｓｈｅｅｋｈ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｉｕｍ，Ｖｏｌ．４２：２（１９９９），ｐｐ．２０９−２１６は、プラスミドＤＮＡによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉの安定な形質転換を報告した。Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、プラスミドｐＢＩ１２１（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ４８５７８３）をＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉに導入した。プラスミドｐＢＩ１２１は、カナマイシン／ネオマイシン抗生物質耐性カセットを含んだ。このカナマイシン／ネオマイシン抗生物質耐性カセットは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモーター、カナマイシン及びＧ４１８に対する耐性用の、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＬ９２０３９）をコードする配列、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターを含んだ。ｐＢＩ１２１はさらに、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結され、且つｎｏｓ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子産物をコードする配列を含んだ。形質転換前、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉは、１５ｕｇ／Ｌカナマイシンを含む培養培地で増殖することができなかった。ｐＢＩ１２１プラスミドによる形質転換後、１５ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む選択的培養培地で増殖するＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉの形質転換体が得られた。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉにおけるｎｐｔＩＩ遺伝子産物の発現により、１５ｍｇ／Ｌカナマイシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのカナマイシン／ネオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。ＧＵＳ遺伝子産物の検出可能な活性から、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター及びｎｏｓ ３’ＵＴＲが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることが示された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈにより報告されるとおり、形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉの選択及び維持は、ＹＥＧ培地（１％酵母エキス、１％グルコース）及び１５ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む半流動寒天プレート上で実施した。Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈはまた、ＹＥＧ液体培養培地におけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉの増殖も報告した。脂質産生のためのＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉの培養に好適なさらなる培地が、Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖｏｌ．１６３３（２００３），ｐｐ．２７−３４に開示されている。Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈは、プラスミドｐＢＩ１２１、ＣａＭＶプロモーター、及びノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈは、ｐＢＩ１２１でコードされるカナマイシン／ネオマイシン耐性カセットが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるカナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＢＩ１２１が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉを、限定はされないが、カナマイシン又はネオマイシンを含むＹＥＧ寒天培地上で選択することができる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＹＥＧ培地、及びＳａｔｏ ｅｔ ａｌ．により報告される培養培地が挙げられる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例１４：Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの操作
Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＷａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７（２００５），ｐｐ．３６３−３６８は、プラスミドＤＮＡによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの安定な核形質転換を報告した。Ｗａｌｋｅｒは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、プラスミドｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２をＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａに導入した。ｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２は、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット遺伝子（ｒｂｃＳ１、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ５３０１５５）のプロモーター及び３’ＵＴＲに動作可能に連結された、抗生物質フレオマイシンに対する耐性用の、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（ｂｌｅ）をコードする配列を含むブレオマイシン抗生物質耐性カセットをコードする配列を含んだ。形質転換前、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａは、１ｍｇ／Ｌフレオマイシンを含む培養培地で増殖することができなかった。ｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２プラスミドによる形質転換後、１ｍｇ／Ｌフレオマイシンを含む選択的培養培地で増殖するＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの形質転換体が得られた。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、１ｍｇ／Ｌフレオマイシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｗａｌｋｅｒにより報告されるとおり、形質転換したＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの選択及び維持は、４．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ及び１ｍｇ／Ｌフレオマイシン（ｐｈｅｏｍｙｃｉｎ）をさらに含むＤｕｎａｌｉｅｌｌａ培地（ＤＭ、Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ，Ｖｏｌ．２５（１９５７），ｐｐ．３９２−４２８により記載されるとおり）において実施した。脂質産生のためのＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの培養に好適なさらなる培地は、Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１０１：３（２００６），ｐｐ．２２３−２２６及びＭａｓｓａｒｔ ａｎｄ Ｈａｎｓｔｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｖｅｎｉｃｅ ２０１０，Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｅｎｅｒｇｙ ｆｒｏｍ Ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ Ｗａｓｔｅにおいて考察される。Ｗａｌｋｅｒは、プラスミドｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２並びにＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおける異種発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｗａｌｋｅｒは、ｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２でコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｂｌｅ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でｒｂｃＳ１プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、ｒｂｃＳ１ ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの安定な形質転換は、エレクトロポレーション又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａを、限定はされないが、フレオマイシン（ｐｈｅｏｍｙｃｉｎ）を含むＤＭ培地上で選択することができる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＤＭ培地並びにＴａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．及びＭａｓｓａｒｔ ａｎｄ Ｈａｎｓｔｏｎにより記載される培養培地が挙げられる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例１５：Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉの操作
Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＨａｌｌｍａｎ ａｎｄ Ｒａｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｈａｌｌｍａｎ ａｎｄ Ｒａｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ １７（１９９９），ｐｐ．９９−１０９は、プラスミドＤＮＡによるＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉの安定な核形質転換を報告した。Ｈａｌｌｍａｎ ａｎｄ Ｒａｐｐｅｌは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、ｐｚｅｏＥプラスミドをＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉに導入した。ｐｚｅｏＥプラスミドは、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ β−チューブリン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ２４５４７）のプロモーター及び３’ＵＴＲに動作可能に連結された、抗生物質ゼオシンに対する耐性用の、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（ｂｌｅ）をコードする配列を含むブレオマイシン抗生物質耐性カセットをコードする配列を含んだ。形質転換前、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉは、１．５ｕｇ／ｍｌゼオシンを含む培養培地で増殖することができなかった。ｐｚｅｏＥプラスミドによる形質転換後、２０ｕｇ／ｍｌ超のゼオシンを含む選択的培養培地で増殖するＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉの形質転換体が得られた。Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉにおけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、２０ｕｇ／ｍｌゼオシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｈａｌｌｍａｎ ａｎｄ Ｒａｐｐｅｌにより報告されるとおり、形質転換したＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉの選択及び維持は、１ｍｇ／Ｌフレオマイシン（ｐｈｅｏｍｙｃｉｎ）を含むＶｏｌｖｏｘ培地（ＶＭ、Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ ａｎｄ Ｐｉｎｔｎｅｒ，Ｔｈｅ Ｅｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｌｇａｅ，Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２（１９５９），Ｔｙｒｏｎ，Ｃ．Ａ．ａｎｄ Ｈａｒｔｍａｎ，Ｒ．Ｔ．，ｅｄｓ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ｐｐ．８８−９６により記載されるとおり）において実施した。脂質産生のためのＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉの培養に好適な培地はまた、ＳｔａｒｒによりＳｔａｒｒ Ｒ，Ｃ，．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｕｐｐｌ．，Ｖｏｌ．４（１９７０），ｐｐ．５９−１００においても考察される。Ｈａｌｌｍａｎ ａｎｄ Ｒａｐｐｅｌは、プラスミドｐｚｅｏＥ並びにＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ β−チューブリン遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉにおける異種発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｈａｌｌｍａｎ ａｎｄ Ｒａｐｐｅｌは、ｐｚｅｏＥでコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適で、及びＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉにおける選択的マーカーとして使用するのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが報告されている（例えば、Ｈａｌｌａｍａｎｎ ａｎｄ Ｓｕｍｐｅｒ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．９１（１９９４），ｐｐ １１５６２−１１５６６及びＨａｌｌｍａｎ ａｎｄ Ｗｏｄｎｉｏｋ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ２５（２００６），ｐｐ．５８２−５８１を参照）。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｂｌｅ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐｚｅｏＥが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表１９から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表９Ａ〜Ｄに従いＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ β−チューブリンプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ β−チューブリン３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉゲノムの配列内のそのような相同性領域を同定することができる（Ｐｒｏｃｈｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３２９：５９８８（２０１０），ｐｐ２２３−２２６による文献において参照される）。形質転換ベクターによるＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉを、限定はされないが、ゼオシンを含むＶＭ培地上で選択することができる。Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＶＭ培地及びＳｔａｒｒにより考察される培養培地が挙げられる。Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例１６：Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの操作
Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＳｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｓａｎｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｓａｎｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７２：１２（２００６），ｐｐ．７４７７−７４８４は、プラスミドＤＮＡによるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの安定な核形質転換を報告した。Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、プラスミドｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４ＲをＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓに導入した。プラスミドｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒはノルフルラゾン耐性カセットを含み、このカセットは、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓフィトエンデサチュラーゼ遺伝子（Ｐｄｓ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ７８１１７０）のプロモーター、タンパク質コード配列、及び３’ＵＴＲを含み、ここでＰｄｓのタンパク質コード配列は、除草剤ノルフルラゾンに対する耐性を付与する遺伝子産物（Ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒ）をコードするように５０４位で改変された（それによりロイシンがアルギニンに変更された）。ｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒによる形質転換前、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓは、５ｕＭノルフルラゾンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒプラスミドによる形質転換後、５ｕＭノルフルラゾンを含む選択的培養培地で増殖するＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの形質転換体が得られた。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおけるＰｄｓ−Ｌ５０４Ｒ遺伝子産物の発現により、５ｕＭノルフルラゾンの存在下における増殖が可能となり、従ってＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのノルフルラゾン除草剤耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒにより報告されるとおり、形質転換したＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの選択及び維持は、２．４２ｇ／Ｌトリス酢酸塩、及び５ｍＭノルフルラゾンを補足したＯＨＡ培地（ＯＨＭ（０．４１ｇ／Ｌ ＫＮＯ３、０．０３ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２４６ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１１ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２．６２ｍｇ／Ｌ Ｆｅ（ＩＩＩ）クエン酸塩×Ｈ２Ｏ、０．０１１ｍｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１２ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０７５ｍｇ／Ｌ Ｃｒ２Ｏ３、０．９８ｍｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．１２ｍｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２０、０．００５ｍｇ／Ｌ ＳｅＯ２及び２５ｍｇ／Ｌビオチン、１７．５ｍｇ／Ｌチアミン、及び１５ｍｇ／ＬビタミンＢ１２）を含む寒天プレート上で実施した。液体培地におけるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの増殖は、Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｓａｎｄｍａｎｎにより、基本培地（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５９（１９９３），ｐｐ．８６７−８７３により記載されるとおりの基本培地）を使用して行った。Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｓａｎｄｍａｎｎは、ｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒプラスミド並びにＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓフィトエンデサチュラーゼ遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける異種発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｓａｎｄｍａｎｎは、ｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒでコードされるノルフルラゾン耐性カセットが、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが報告されている（Ｋａｔｈｉｒｅｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４５（２００９），ｐｐ ６４２−６４９を参照）。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるＰｄｓ−Ｌ５０４Ｒ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ ｐｄｓ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ ｐｄｓ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。Ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓを、限定はされないが、ノルフルラゾンを含むＯＨＡ培地上で選択することができる。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、基本培地並びにＫｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｋａｔｈｉｒｅｓａｎ ｅｔ ａｌ、及びＧｏｎｇ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９：５（１９９７），ｐｐ．４３７−４４４により記載される培養培地が挙げられる。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例１７：Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の操作
Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＡｂｅ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５２：９（２０１１），ｐｐ．１６７６−１６８５は、プラスミドＤＮＡによるＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の安定な核形質転換を報告した。Ａｂｅは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、プラスミドｐＳＡ１０６をＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体に導入した。プラスミドｐＳＡ１０６は、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体クロロフィルａ／ｂ−結合タンパク質遺伝子（ＣＡＢ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢ３６３４０３）のプロモーター及び３’ＵＴＲに動作可能に連結された、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質遺伝子（ｂｌｅ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＡ３７０５０）をコードする配列を含むブレオマイシン耐性カセットを含んだ。ｐＳＡ１０６による形質転換前、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体は、３ｕｇ／ｍｌフレオマイシンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＳＡ１０６による形質転換後、３ｕｇ／ｍｌフレオマイシンを含む選択的培養培地で増殖するＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の形質転換体が得られた。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体におけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、３ｕｇ／ｍｌフレオマイシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体において使用される選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ａｂｅにより報告されるとおり、形質転換したＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の選択及び維持は、初めにＣ培地（０．１ｇ／Ｌ ＫＮＯ３、０．０１５ｇ／Ｌ Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／Ｌグリセロリン酸塩−Ｎａ２、０．０４ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／Ｌトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン、微量ミネラル、ビオチン、ビタミンＢ１及びＢ１２）を含む上層寒天において実施した後、続いてフレオマイシンを補足したＣ培地を含む寒天プレートに単離した。Ａｂｅにより報告されるとおり、液体培地におけるＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の増殖は、Ｃ培地で行った。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の増殖に好適なさらなる液体培養培地は、Ｓｅｋｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０：４（２００３），ｐｐ．１４７−１５３により考察される。Ａｂｅは、ｐＳＡ１０６プラスミド並びにＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体ＣＡＢ遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ａｂｅは、ｐＳＡ１０６でコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが報告されている（Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４９（２００８），ｐｐ．６２５−６３２を参照）。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｂｌｅ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＳＡ１０６が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体ＣＡＢ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体ＣＡＢ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体ゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体を、限定はされないが、フレオマイシンを含むＣ培地上で選択することができる。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｃ培地並びにＡｂｅ ｅｔ ａｌ．及びＳｅｋｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．により報告される培養培地が挙げられる。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例１８：Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓの操作
Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＳｕｎ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．３７７（２００６），ｐｐ．１４０−１４９は、プラスミドＤＮＡによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓの安定な形質転換を報告した。Ｓｕｎは、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）の形質転換方法を用いて、完全なＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ硝酸還元酵素遺伝子をコードするプラスミドｐＤＶＮＲを、突然変異体Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＮＲ突然変異体）に導入した。このＮＲ突然変異体は、窒素源として硝酸塩を使用しない限り成長できない。硝酸還元酵素は硝酸塩から亜硝酸塩への変換を触媒する。形質転換前、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＮＲ突然変異体は、唯一の窒素源として硝酸塩（ＮＯ３ −）を含む培養培地において増殖することができなかった。ＮＲ突然変異体Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓにおけるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＮＲ遺伝子産物の発現を選択可能なマーカーとして使用して、硝酸塩代謝の欠損を取り戻した。ｐＤＶＮＲプラスミドによる形質転換後、単一炭素源として硝酸塩を含む寒天プレート上で成長可能な、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＮＲ遺伝子産物を安定的に発現するＮＲ突然変異体Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓが得られた。サザン解析により、安定な形質転換体のＤＮＡの評価を行った。形質転換したＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ（ＮＲ突然変異体）の選択及び維持は、５ｍＭ ＫＮＯ３を含む寒天プレート上で行った。Ｓｕｎはまた、液体培養培地におけるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ及びＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＮＲ突然変異体の増殖も報告した。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓの増殖に好適なさらなる培地は、Ｇｏｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０：２（１９９８），ｐｐ．１３５−１４４及びＭｏｕｌｔｏｎ ａｎｄ Ｂｕｒｆｏｒｄ，Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，Ｖｏｌｓ．２０４−２０５：１（１９９０），ｐｐ．４０１−４０８により報告される。Ｓｕｎは、プラスミドｐＤＶＮＲ並びにＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ硝酸還元酵素遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＮＲ突然変異体における異種発現を可能にするのに好適であったことを報告した。Ｓｕｎはまた、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ硝酸還元酵素遺伝子産物の発現が、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＮＲ突然変異体における選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことも報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ硝酸還元酵素（ＤｖＮＲ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＤＶＮＲが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＤｖＮＲプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、ＤｖＮＲ ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＮＲ突然変異体の安定な形質転換は、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ＤｖＮＲ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして用いることにより、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＮＲ突然変異株の窒素同化の欠損を取り戻し、形質転換ベクターを安定的に発現するＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＮＲ突然変異体を選択することができる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｕｌｔｏｎ ａｎｄ Ｂｕｒｆｏｒｄ、及びＧｏｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．により考察される培地が挙げられる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例１９：Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａの操作
Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＧｅｎｇ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５（２００３），ｐｐ．４５１−４５６は、プラスミドＤＮＡによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａの安定な形質転換を報告した。Ｇｅｎｇは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴプラスミドをＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａに導入した。ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴは、ＨＢｓＡＧタンパク質コード領域の上流でＺｅａ ｍａｙｓ ｕｂｉ１プロモーターに動作可能に連結され、且つＨＢｓＡＧタンパク質コード領域の下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、Ｂ型肝炎表面抗原をコードする配列を含むＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡＧ）発現カセットを含む。ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴは、シミアンウイルス４０プロモーター及びエンハンサーに動作可能に連結された、抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性を付与するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子産物をコードする配列を含むクロラムフェニコール耐性カセットをさらに含んだ。ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴによる形質転換前、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａは、６０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴプラスミドによる形質転換後、６０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含む選択的培養培地で増殖するＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａの形質転換体が得られた。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａにおけるＣＡＴ遺伝子産物の発現により、６０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールの存在下における増殖が可能となり、従ってＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのクロラムフェニコール耐性カセットの有用性が確立された。ＨＢｓＡｇ遺伝子産物の検出可能な活性から、ｕｂｉ１プロモーター及びｎｏｓ ３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａにおける遺伝子発現を可能にするのに好適であることが示された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｇｅｎｇは、形質転換したＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａの選択及び維持を、６０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含むＪｏｈｎｓｏｎ培地（Ｊ１、Ｂｏｒｏｗｉｔｚｋａ ａｎｄ Ｂｏｒｏｗｉｔｚｋａ（ｅｄｓ），Ｍｉｃｒｏ−ａｌｇａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ｐｐ．４６０−４６１により記載される）を含む寒天プレート上で行ったことを報告した。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａの液体増殖は、Ｇｅｎｇにより、６０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含むＪ１培地において行われた。Ｊ１培地以外の培地におけるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａの増殖が考察されている（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ．３６（２００９），ｐｐ．１４３３−１４３９及びＢｏｒｏｗｉｔｚｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，Ｖｏｌｓ．１１６−１１７：１（１９８４），ｐｐ．１１５−１２１を参照）。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが、Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．により報告されている。Ｇｅｎｇは、プラスミドｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴ、ｕｂｉ１プロモーター、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｇｅｎｇは、ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴでコードされるＣＡＴ耐性カセットが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告する。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるＣＡＴ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でｕｂｉ１プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａの安定な形質転換は、エレクトロポレーション又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ＣＡＴ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａを、限定はされないが、クロラムフェニコールを含むＪ１培地において選択することができる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｊ１培地並びにＦｅｎｇ ｅｔ ａｌ．及びＢｏｒｏｗｉｔｚｋａ ｅｔ ａｌ．により記載される培養培地が挙げられる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例２０：Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌの操作
Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＬｅｒｃｈｅ ａｎｄ Ｈａｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｌｅｒｃｈｅ ａｎｄ Ｈａｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ９：６４，２００９は、プラスミドＤＮＡによるＧｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅの安定な核形質転換を報告した。Ｌｅｒｃｈｅは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、プラスミドｐＰｍｒ３をＧｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅに導入した。プラスミドｐＰｍｒ３は、ａｐｈＶＩＩＩタンパク質コード領域の上流でＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ ｈｓｐ７０Ａ−ｒｂｃＳ３ハイブリッドプロモーターに動作可能に連結され、且つａｐｈＶＩＩＩタンパク質コード領域の下流でＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ ｒｂｃＳ３遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、抗生物質パロモマイシンに対する耐性用の、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓのアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ａｐｈＶＩＩＩ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＢ０３８５６）をコードする配列を含むパロモマイシン耐性カセットを含んだ。ｐＰｍｒ３による形質転換前、Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅは、０．０６ｕｇ／ｍｌパロモマイシンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＰｍｒ３による形質転換後、０．７５ｕｇ／ｍｌ以上のパロモマイシンを含む選択的培養培地で増殖するＧｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅの形質転換体が得られた。Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅにおけるａｐｈＶＩＩＩ遺伝子産物の発現により、０．７５ｕｇ／ｍｌ以上のパロモマイシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＧｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのパロモマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｌｅｒｃｈｅ ａｎｄ Ｈａｌｌｍａｎは、形質転換したＧｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅの選択及び維持を、１．０ｕｇ／ｍｌパロモマイシンを含む液体Ｊａｗｏｒｓｋｉ培地（２０ｍｇ／Ｌ Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ、１２．４ｍｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、５０ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１５．９ｍｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３、２．２５ｍｇ／Ｌ ＥＤＴＡ−ＦｅＮａ、２．２５ｍｇ／Ｌ ＥＤＴＡ Ｎａ２、２．４８ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、１．３９ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、１ｍｇ／Ｌ（ＮＨ４）６ＭＯ７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ、０．０４ｍｇ／ＬビタミンＢ１２、０．０４ｍｇ／Ｌチアミン−ＨＣｌ、０．０４ｍｇ／Ｌビオチン、８０ｍｇ／Ｌ ＮａＮＯ３、３６ｍｇ／Ｌ Ｎａ４ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ）において行ったことを報告した。Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが、Ｌｅｒｃｈｅ ａｎｄ Ｈａｌｌｍａｎによりさらに考察される。Ｌｅｒｃｈｅ ａｎｄ Ｈａｌｌｍａｎは、プラスミドｐＰｍｒ３、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ ｈｓｐ７０Ａ−ｒｂｃＳ３ハイブリッドプロモーター、及びＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ ｒｂｃＳ３遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｌｅｒｃｈｅ ａｎｄ Ｈａｌｌｍａｎは、パロモマイシン耐性カセットコードされるｐＰｍｒ３が、Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるａｐｈＶＩＩＩ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＰｍｒ３が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＧｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＧｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ ｈｓｐ７０Ａ−ｒｂｃＳ３ハイブリッドプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ ｒｂｃＳ３遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＧｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現することができる。ａｐｈＶＩＩＩ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＧｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅを、限定はされないが、パロモマイシンを含むＪａｗｏｒｓｋｉ培地において選択することができる。Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅ脂質産生に好適な成長培地としては、Ｊａｗｏｒｓｋｉ培地及びＳｔｅｉｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ，Ｖｏｌ．４５：９（１９５８），ｐｐ．６６４−６７２により報告される培地が挙げられる。Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例２１：Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの操作
Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＡｐｔ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ａｐｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２５２（１９９６），ｐｐ．５７２−５７９は、ベクターＤＮＡによるＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの安定な核形質転換を報告した。Ａｐｔは、微粒子銃の形質転換技法を用いて、プラスミドｐｆｃｐＡをＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍに導入した。プラスミドｐｆｃｐＡは、ｂｌｅタンパク質コード領域の上流でＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍフコキサンチンクロロフィルａ結合タンパク質遺伝子（ｆｃｐＡ）のプロモーターに動作可能に連結され、且つｂｌｅタンパク質コード領域の３’領域において、又は下流で、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ ｆｃｐＡ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、抗生物質フレオマイシン及びゼオシンに対する耐性用の、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（ｂｌｅ）をコードする配列を含むブレオマイシン耐性カセットを含んだ。ｐｆｃｐＡによる形質転換前、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍは、５０ｕｇ／ｍｌゼオシンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐｆｃｐＡによる形質転換後、５０ｕｇ／ｍｌゼオシンを含む選択的培養培地で増殖するＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの形質転換体が得られた。Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、５０ｕｇ／ｍｌゼオシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ａｐｔは、形質転換したＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの選択及び維持を、５０ｍｇ／Ｌゼオシンを含むＬＤＭ培地（Ｓｔａｒｒ ａｎｄ Ｚｅｉｋｕｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，（１９９３）により報告されるとおり）を含む寒天プレート上で行ったことを報告した。Ａｐｔは、５０ｍｇ／Ｌゼオシンを含むＬＤＭ培地におけるＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ形質転換体の液体増殖を報告した。ＬＤＭ培地以外の培地におけるＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの増殖が（Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２９２（２００１），ｐｐ．２０７３−２０７５により、及びＲａｄｏｋｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１３（２０１１），ｐｐ．８９−９５により）考察されている。Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが、Ａｐｔ ｅｔ ａｌ．、Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａ ｅｔ ａｌ．、及びＲａｄｏｋｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．による同じ報告に報告されている。Ａｐｔは、プラスミドｐｆｃｐＡ、並びにＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ ｆｃｐＡプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ａｐｔは、ｐｆｃｐＡでコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｂｌｅ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐｆｃｐＡが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ ｆｃｐＡ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ ｆｃｐＡ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍゲノムの配列内のそのような相同性領域を同定することができる（Ｂｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４５６（２００８），ｐｐ．２３９−２４４による文献において参照される）。形質転換ベクターによるＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍを、限定はされないが、パロモマイシンを含むＬＤＭ培地において選択することができる。Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｒａｄｏｋｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．により報告されるとおりのｆ／２培地が挙げられる。Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例２２：Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．の操作
Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．における本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＹａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５９：２（２０１１），ｐｐ．１１３−１１９は、プラスミドＤＮＡによるＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．の安定な核形質転換を報告した。Ｙａｍａｇｕｃｈｉは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、プラスミドｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔをＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．に導入した。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔは、ｎａｔタンパク質コード領域の上流でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａフコキサンチンクロロフィルａ／ｃ結合タンパク質遺伝子（ｆｃｐ）プロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ｎａｔタンパク質コード配列の下流）でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ ｆｃｐ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ヌルセオトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｎａｔ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＣ６０４３９）をコードする配列を含むヌルセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性カセットを含んだ。ｎａｔ遺伝子産物は、抗生物質ヌルセオトリシンに対する耐性を付与する。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔによる形質転換前、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．は、５００ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔによる形質転換後、５００ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンを含む選択的培養培地で増殖するＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．の形質転換体が得られた。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．におけるｎａｔ遺伝子産物の発現により、５００ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．において使用される選択可能なマーカーとしてのヌルセオトリシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｙａｍａｇｕｃｈｉは、形質転換したＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．の選択及び維持を、５００ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンを含むｆ／２培地（Ｇｕｉｌａｒｄ，Ｒ．Ｒ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ ｆｏｒ ｆｅｅｄｉｎｇ ｍａｒｉｎｅ ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ，Ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｃｈａｎｌｅｙ（ｅｄｓ）１９７５，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６−６０により報告されるとおり）を含む寒天プレート上で行ったことを報告した。Ｙａｍａｇｕｃｈｉにより実施されたとおりの、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．形質転換体の液体増殖を、５００ｍｇ／Ｌヌルセオトリシンを含むｆ／２培地で行った。さらなる培養培地におけるＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．の増殖が（例えば、Ｎａｐｏｌｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｖｏｌ．２１：２（１９９０），ｐｐ．１２２−１３０において、及びＶｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２８：３（１９８９），ｐｐ．２１９−２４０により）報告されている。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．における異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．による同じ報告に報告されている。Ｙａｍａｇｕｃｈｉは、プラスミドｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔ、並びにＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ ｆｃｐプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．における外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｙａｍａｇｕｃｈｉは、ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔでコードされるヌルセオトリシン耐性カセットが、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．における選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｎａｔ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃｏｍｐｒｅｓｓｕｍの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するように近縁のＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃｏｍｐｒｅｓｓｕｍにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ ｆｃｐ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ ｆｃｐ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．ゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．の安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換によって実現される。ｎａｔ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．を、限定はされないが、ヌルセオトリシンを含むｆ／２寒天培地において選択することができる。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ｆ／２培地、並びにＮａｐｏｌｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．及びＶｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．により考察される培養培地が挙げられる。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例２３：Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの操作
Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＰｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．２７２（２００５），ｐｐ．３４１３−３４２３は、プラスミドＤＮＡによるＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの形質転換を報告した。Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、ｐＣＦ−ｂｌｅプラスミドをＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓに導入した。プラスミドｐＣＦ−ｂｌｅは、ｂｌｅタンパク質コード領域の上流でＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓフコキサンチン（ｆｕｃｏｚａｎｔｈｉｎ）クロロフィルａ／ｃ結合タンパク質遺伝子（ｆｃｐＡ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ１２５５８０）プロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ｂｌｅタンパク質コード領域の下流）でＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ ｆｃｐＡ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、抗生物質ゼオシン及びフレオマイシンに対する耐性用の、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（ｂｌｅ）をコードする配列を含むブレオマイシン耐性カセットを含んだ。ｐＣＦ−ｂｌｅによる形質転換前、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓは、１ｍｇ／ｍｌゼオシンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＣＦ−ｂｌｅによる形質転換後、１ｍｇ／ｍｌゼオシンを含む選択的培養培地で増殖するＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの形質転換体が得られた。Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、１ｍｇ／ｍｌゼオシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒは、形質転換したＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの選択及び維持を、１ｍｇ／ｍｌゼオシン含有の人工海水培地を含む寒天プレート上で行ったことを報告した。Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒは、１ｍｇ／ｍｌゼオシンを含む人工海水培地におけるＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ形質転換体の液体増殖を報告した。さらなる培養培地におけるＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの増殖が（例えば、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７：１（２００５），ｐｐ．６１−６５において、及びＯｒｃｕｔｔ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖｏｌ．９：１２（１９７４），ｐｐ．１０００−１００３により）考察されている。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．における異種遺伝子発現を可能にするためのさらなるプラスミド、プロモーター、及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒによる同じ報告に報告されている。Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒは、プラスミドｐＣＦ−ｂｌｅ並びにＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ ｆｃｐプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒは、ｐＣＦ−ｂｌｅでコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｂｌｅ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＣＦ−ｂｌｅが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ ｆｃｐ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ ｆｃｐ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓを、限定はされないが、ゼオシンを含む人工海水寒天培地において選択することができる。Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、人工海水並びにＬｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．及びＯｒｃｕｔｔ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎにより報告される培地が挙げられる。Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例２４：Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．の操作
Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．における本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１３：３（１９９８），ｐｐ．４２７−４３５は、プラスミドＤＮＡによるＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．の安定な形質転換を報告した。ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓは、炭化ケイ素ウィスカーの存在下における撹拌の形質転換技法を用いて、プラスミドｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳをＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．に導入した。ｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳは、ｎｐｔＩＩタンパク質コード領域の上流、又は５’でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ｎｐｔＩＩタンパク質コード領域の下流）でｎｏｓ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＬ９２０３９）をコードする配列を含むネオマイシン耐性カセットを含んだ。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。ｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳプラスミドは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結され、且つＣａＭＶ ３５Ｓ ３’ＵＴＲ／ターミネーターにさらに動作可能に連結された、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子産物をコードする配列をさらに含んだ。ｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳによる形質転換前、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．は、３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む培地で増殖することができなかった。ｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳによる形質転換後、３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む選択的培養培地で増殖するＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．の形質転換体が得られた。Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．におけるｎｐｔＩＩ遺伝子産物の発現により、３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８の存在下における増殖が可能となり、従ってＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．において使用される選択可能なマーカーとしてのネオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。ＧＵＳレポーター遺伝子の検出可能な活性から、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．における遺伝子発現を可能にするのに好適であることが示された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒは、Ｆ／２濃縮溶液（供給業者Ｓｉｇｍａにより提供される）及び３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補足した海水を含む培地におけるＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ形質転換体の液体増殖並びにＦ／２濃縮溶液及び３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補足した海水を含む寒天培地でのＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．形質転換体の選択及び維持を報告した。さらなる培養培地におけるＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．の増殖が（例えば、Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７：４（２００５）ｐｐ．２８７−ｖ３００において）報告されている。Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．における異種遺伝子発現を可能にするための、さらなるプロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーを含む、さらなるプラスミドが、ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒによる同じ報告に報告されている。ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒは、プラスミドｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳ並びにｎｏｓ及びＣａＭＶ ３５Ｓ遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．における外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒは、ｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳでコードされるネオマイシン耐性カセットが、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．における選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｎｐｔＩＩ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従い近縁種Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｃａｒｔｅｒａｅの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．における発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、ｎｏｓ ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．ゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．の安定な形質転換は、シリコン繊維媒介マイクロインジェクション又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．を、限定はされないが、Ｇ４１８を含む海水寒天培地において選択することができる。Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、人工海水並びにＭａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．及びｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒにより報告される培地が挙げられる。Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例２５：Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの操作
Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１３：３（１９９８），ｐｐ．４２７−４３５は、プラスミドＤＮＡによるＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの安定な形質転換を報告した。ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓは、シリコン繊維媒介マイクロインジェクションの形質転換技法を用いて、プラスミドｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳをＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍに導入した。ｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳは、ｎｐｔＩＩタンパク質コード領域の上流、又は５’でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ｎｐｔＩＩタンパク質コード領域の下流）でｎｏｓ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＬ９２０３９）をコードする配列を含むネオマイシン耐性カセットを含んだ。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。ｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳプラスミドは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結され、且つＣａＭＶ ３５Ｓ ３’ＵＴＲ／ターミネーターにさらに動作可能に連結された、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子産物をコードする配列をさらに含んだ。ｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳによる形質転換前、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍは、３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む培地で増殖することができなかった。ｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳによる形質転換後、３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む選択的培養培地で増殖するＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの形質転換体が得られた。Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおけるｎｐｔＩＩ遺伝子産物の発現により、３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８の存在下における増殖が可能となり、従ってＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのネオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。ＧＵＳレポーター遺伝子の検出可能な活性から、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける遺伝子発現を可能にするのに好適であることが示された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒは、Ｆ／２濃縮溶液（供給業者Ｓｉｇｍａにより提供される）及び３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補足した海水を含む培地におけるＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍ形質転換体の液体増殖並びにＦ／２濃縮溶液及び３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補足した海水を含む寒天培地でのＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍ形質転換体の選択及び維持を報告した。さらなる培養培地におけるＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの増殖が（例えば、Ｉｇｌｅｓｉａｓ−Ｐｒｉｅｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．８９：２１（１９９２）ｐｐ．１０３０２−１０３０５において）考察されている。Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける異種遺伝子発現を可能にするための、さらなるプロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーを含む、さらなるプラスミドが、ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒによる同じ報告において考察されている。ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒは、プラスミドｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳ並びにｎｏｓ及びＣａＭＶ ３５Ｓ遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒは、ｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳでコードされるネオマイシン耐性カセットが、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｎｐｔＩＩ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、ｎｏｓ ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの安定な形質転換は、シリコン繊維媒介マイクロインジェクション又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍを、限定はされないが、Ｇ４１８を含む海水寒天培地において選択することができる。Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、人工海水並びにＩｇｌｅｓｉａｓ−Ｐｒｉｅｔｏ ｅｔ ａｌ．及びｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒにより報告される培地が挙げられる。Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例２６：Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．の操作
Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＫｉｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｋｉｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．１０８：５２（２０１１）ｐｐ．２１２６５−２１２６９は、形質転換構築物によるＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓの安定な核形質転換を報告した。Ｋｉｌｉａｎは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、形質転換構築物Ｃ２をＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂに導入した。Ｃ２形質転換構築物は、ｂｌｅタンパク質コード領域の上流でＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子ＶＣＰ２のプロモーターに動作可能に連結され、且つｂｌｅタンパク質コード領域の下流でＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂビオラキサンチン／クロロフィルａ結合遺伝子ＶＣＰ１の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、抗生物質フレオマイシン及びゼオシンに対する耐性用の、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（ｂｌｅ）のコード配列を含むブレオマイシン耐性カセットを含んだ。Ｃ２による形質転換前、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂは、２ｕｇ／ｍｌゼオシンを含む培地上で増殖することができなかった。Ｃ２による形質転換後、２ｕｇ／ｍｌゼオシンを含む選択的培養培地で増殖するＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂの形質転換体が得られた。Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、２ｕｇ／ｍｌゼオシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。ＰＣＲにより、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｋｉｌｉａｎは、５倍レベルの微量金属、ビタミン、及びリン酸塩溶液を含み、さらに２ｕｇ／ｍｌゼオシンを含むＦ／２培地（Ｇｕｉｌａｒｄ ａｎｄ Ｒｙｔｈｅｒ，Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８（１９６２），ｐｐ．２２９−２３９により報告される）におけるＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ形質転換体の液体増殖を報告した。Ｋｉｌｉａｎはまた、人工海水２ｍｇ／ｍｌゼオシンを含む寒天Ｆ／２培地上でのＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ形質転換体の選択及び維持も報告した。さらなる培養培地におけるＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓの増殖が（例えば、Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１００：２（２００９），ｐｐ．８３３−８３８及びＰａｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９０：４（２０１１），ｐｐ．１４２９−１４４１において）考察されている。Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおける異種遺伝子発現を可能にするための、さらなるプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターを含むさらなる形質転換構築物、及び形質転換体選択用の選択可能なマーカーが、Ｋｉｌｉａｎによる同じ報告において考察されている。Ｋｉｌｉａｎは、形質転換構築物Ｃ２並びにＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子ＶＣＰ２のプロモーター及びＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子ＶＣＰ１の３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｋｉｌｉａｎは、Ｃ２でコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｂｌｅ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む形質転換構築物Ｃ２が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表９Ａ〜Ｄに従いＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．の核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ ＶＣＰ２遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ ＶＣＰ１遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂの安定な形質転換は、エレクトロポレーション又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂを、限定はされないが、ゼオシンを含むＦ／２培地において選択することができる。Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｆ／２培地並びにＣｈｉｕ ｅｔ ａｌ．及びＰａｌ ｅｔ ａｌ．により報告される培地が挙げられる。Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例２７：Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ操作
Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＤｕｎａｈａｙ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｄｕｎａｈａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３１（１９９５），ｐｐ．１００４−１０１２は、プラスミドＤＮＡによるＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａの安定な形質転換を報告した。Ｄｕｎａｈａｙは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１をＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａに導入した。プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１は、ｎｐｔＩＩコード領域の上流でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ２０７８４）のプロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ｎｐｔＩＩコード領域の下流）でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ ＡＣＣアーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物のコード配列を含むネオマイシン耐性カセットを含んだ。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。ｐＡＣＣＮＰＴ５．１による形質転換前、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａは、１００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む５０％人工海水培地で増殖することができなかった。ｐＡＣＣＮＰＴ５．１による形質転換後、１００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む選択的５０％人工海水培地において増殖するＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａの形質転換体が得られた。Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａにおけるｎｐｔＩＩ遺伝子産物の発現により、１００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８の存在下における増殖が可能となり、従ってＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのネオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｄｕｎａｈａｙは、１．０７ｍＭケイ酸ナトリウム及び１００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補足した人工海水培地（ＡＳＷ、Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．，Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉａ，Ｖｏｌ．２１（１９８２），ｐｐ．４０８−４１０により考察されるとおり）におけるＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａの液体増殖を報告した。Ｄｕｎａｈａｙはまた、１００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８含有のＡＳＷ培地を含む寒天プレート上でのＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ形質転換体の選択及び維持も報告した。さらなる培養培地におけるＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａの増殖が（例えば、Ｓｒｉｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８−２９：１（１９９１），ｐｐ．３１７−３２６及びＰａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１０９：３（２０１０），ｐｐ．２３５−２３９において）考察されている。Ｄｕｎａｈａｙは、プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１及びＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）遺伝子のプロモーターが、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｄｕｎａｈａｙは、ｐＡＣＣＮＰＴ５．１でコードされるネオマイシン耐性カセットが、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｎｐｔＩＩ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＡＣＣＮＰＴ５．１が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ ＡＣＣアーゼプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ ＡＣＣアーゼ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａを、限定はされないが、Ｇ４１８を含む寒天ＡＳＷ培地において選択することができる。Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＡＳＷ培地並びにＳｒｉｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１及びＰａｈｌ ｅｔ ａｌ．により報告される培地が挙げられる。Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例２８：Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの操作
Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＤｕｎａｈａｙ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｄｕｎａｈａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３１（１９９５），ｐｐ．１００４−１０１２は、プラスミドＤＮＡによるＮａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの安定な形質転換を報告した。Ｄｕｎａｈａｙは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１をＮａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａに導入した。プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１は、ｎｐｔＩＩコード領域の上流でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ２０７８４）のプロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ｎｐｔＩＩコード領域の下流）でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ ＡＣＣアーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物のコード配列を含むネオマイシン耐性カセットを含んだ。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。ｐＡＣＣＮＰＴ５．１による形質転換前、Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａは、１００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む人工海水培地で増殖することができなかった。ｐＡＣＣＮＰＴ５．１による形質転換後、１００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む選択的人工海水培地において増殖するＮａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの形質転換体が得られた。Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおけるｎｐｔＩＩ遺伝子産物の発現により、Ｇ４１８の存在下における増殖が可能となり、従ってＮａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのネオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｄｕｎａｈａｙは、１．０７ｍＭ ケイ酸ナトリウム及び１００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補足した人工海水培地（ＡＳＷ、Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．，Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉａ，Ｖｏｌ．２１（１９８２），ｐｐ．４０８−４１０により考察されるとおり）におけるＮａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの液体増殖を報告した。Ｄｕｎａｈａｙはまた、１００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８含有のＡＳＷ培地を含む寒天プレート上でのＮａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ形質転換体の選択及び維持も報告した。さらなる培養培地におけるＮａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの増殖が（例えば、Ｔａｄｒｏｓ ａｎｄ Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４：４（１９８８），ｐｐ．４４５−４５２及びＳｒｉｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０−２１：１（１９８９），ｐｐ．２８１−２９１において）考察されている。Ｄｕｎａｈａｙは、プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１及びＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）遺伝子のプロモーターが、Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｄｕｎａｈａｙは、ｐＡＣＣＮＰＴ５．１でコードされるネオマイシン耐性カセットが、Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｎｐｔＩＩ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＡＣＣＮＰＴ５．１が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従い近縁のＮａｖｉｃｕｌａ ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＮａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ ＡＣＣアーゼ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ ＡＣＣアーゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＮａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＮａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａを、限定はされないが、Ｇ４１８を含む寒天ＡＳＷ培地において選択することができる。Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＡＳＷ培地並びにＳｒｉｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．１９８９及びＴａｄｒｏｓ ａｎｄ Ｊｏｈａｎｓｅｎにより報告される培地が挙げられる。Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例２９：Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの操作
Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＰｏｕｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｐｏｕｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４２（２００６），ｐｐ．１０５９−１０６５は、プラスミドＤＮＡによるＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの安定な形質転換を報告した。Ｐｏｕｌｓｅｎは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、プラスミドｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔをＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａに導入した。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔは、ｎａｔタンパク質コード領域の上流でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａフコキサンチンクロロフィルａ／ｃ結合タンパク質遺伝子（ｆｃｐ）プロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ｎａｔタンパク質コード配列の下流）でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ ｆｃｐ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ヌルセオトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｎａｔ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＣ６０４３９）をコードする配列を含むヌルセオトリシン耐性カセットを含んだ。ｎａｔ遺伝子産物は、抗生物質ヌルセオトリシンに対する耐性を付与する。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔによる形質転換前、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａは、１０ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンを含む培地で増殖することができなかった。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔによる形質転換後、１００ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンを含む選択的培養培地で増殖するＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの形質転換体が得られた。Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおけるｎａｔ遺伝子産物の発現により、１００ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのヌルセオトリシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｐｏｕｌｓｅｎは、形質転換したＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの選択及び維持を、１００ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンを含む変法ＥＳＡＷ培地（Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６（１９８０），ｐｐ．２８−３５により考察されるとおり）を含む液体培地において行ったことを報告した。さらなる培養培地におけるＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの増殖が（例えば、Ｖｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２８：３（１９８９），ｐｐ．２１９−２４０において）考察されている。Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおける使用に好適なさらなる選択可能なマーカーを含む、さらなるプラスミドが、Ｐｏｕｌｓｅｎによる同じ報告において考察されている。Ｐｏｕｌｓｅｎは、プラスミドｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔ、並びにＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ ｆｃｐプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｐｏｕｌｓｅｎは、ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔでコードされるヌルセオトリシン耐性カセットが、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｎａｔ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ ｆｃｐ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ ｆｃｐ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａゲノムの配列内のそのような相同性領域を同定することができる（Ａｒｍｂｒｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３０６：５６９３（２００４）：ｐｐ．７９−８６による文献において参照される）。形質転換ベクターによるＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ｎａｔ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａを、限定はされないが、ヌルセオトリシンを含むＥＳＡＷ寒天培地において選択することができる。Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＥＳＡＷ培地、並びにＶｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．及びＨａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．により考察される培養培地が挙げられる。Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例３０：Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの操作
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＣｅｒｕｔｔｉ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｃｅｒｕｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１４５：１（１９９７），ｐｐ．９７−１１０は、形質転換ベクターによるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの安定な核形質転換を報告した。Ｃｅｒｕｔｔｉは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、形質転換構築物Ｐ［１０３０］をＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに導入した。構築物Ｐ［１０３０］は、ａａｄＡタンパク質コード領域の上流でＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット遺伝子（ＲｂｃＳ２、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ０４４７２）プロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ａａｄＡタンパク質コード配列の下流）でＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ＲｂｃＳ２遺伝子３”ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、アミノグルコシド３’−アデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）遺伝子産物をコードする配列を含むスペクチノマイシン耐性カセットを含んだ。ａａｄＡ遺伝子産物は、抗生物質スペクチノマイシンに対する耐性を付与する。Ｐ［１０３０］による形質転換前、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉは、９０ｕｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含む培地で増殖することができなかった。Ｐ［１０３０］による形質転換後、９０ｕｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含む選択的培養培地で増殖するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの形質転換体が得られ、従ってＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのスペクチノマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｃｅｒｕｔｔｉは、形質転換したＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの選択及び維持を、９０ｕｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含むトリス酢酸塩リン酸塩培地（ＴＡＰ、Ｈａｒｒｉｓ，Ｔｈｅ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９８９により記載されるとおり）を含む寒天プレート上で行ったことを報告した。Ｃｅｒｕｔｔｉはさらに、９０ｕｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含むＴＡＰ液体培地におけるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの増殖を報告した。代替的な培養培地におけるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの増殖が（例えば、Ｄｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｆｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５：３（２０１１），ｐｐ．２６０−２７０及びＹａｎｔａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１０７：２（２０１０），ｐｐ．２５８−２６８において）考察されている。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける使用に好適なさらなる選択可能なマーカーを含む、さらなる構築物、並びにＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける異種遺伝子発現を促進するのに好適なプロトマー及び３’ＵＴＲを含む数多くの調節配列は、当該技術分野において公知であり、考察されている（レビューは、Ｒａｄａｋｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．９：４（２０１０），ｐｐ．４８６−５０１を参照）。Ｃｅｒｕｔｔｉは、形質転換ベクターＰ［１０３０］並びにＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｃｅｒｕｔｔｉは、Ｐ［１０３０］でコードされるスペクチノマイシン耐性カセットが、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるａａｄＡ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターＰ［１０３０］が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ＲｂｃＳ２プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ＲｂｃＳ２ ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉゲノムの配列内のそのような相同性領域を同定することができる（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３１８：５８４８（２００７），ｐｐ．２４５−２５０による文献において参照される）。形質転換ベクターによるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ａａｄＡ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉを、限定はされないが、スペクチノマイシンを含むＴＡＰ寒天培地上で選択することができる。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＥＳＡＷ培地、並びにＹａｎｔａｏ ｅｔ ａｌ．及びＤｅｎｔ ｅｔ ａｌ．により考察される培養培地が挙げられる。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例３１：Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの操作
Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＦｉｃｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｆｉｃｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．５５（２００３），ｐｐ．７２７−７３７は、プラスミドＤＮＡによるＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの安定な核形質転換を報告した。Ｆｉｃｋｅｒｓは、酢酸リチウム形質転換方法を用いて、プラスミドＪＭＰ１２３をＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに導入した。プラスミドＪＭＰ１２３は、ｈｐｈタンパク質コード領域の上流でＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＬＩＰ２遺伝子プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＪ０１２６３２）に動作可能に連結され、且つｈｐｈタンパク質コード領域の下流でＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＬＩＰ２遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子産物（ｈｐｈ）をコードする配列を含むハイグロマイシンＢ耐性カセットを含んだ。ＪＭＰ１２３による形質転換前、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、１００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む培地上で増殖することができなかった。ＪＭＰ１２３による形質転換後、１００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む培地で増殖することが可能な形質転換Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが得られ、従ってＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのハイグロマイシンＢ抗生物質耐性カセットが確立された。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＬＩＰ２遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターのＪＭＰ１２３に提供されたヌクレオチド配列は、ＬＩＰ２遺伝子座へのｈｐｈコード配列の相同組換え用ドナー配列として働いた。サザン法により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｆｉｃｋｅｒｓは、形質転換したＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの選択及び維持を、１００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシン含有の標準ＹＰＤ培地（酵母エキスペプトンデキストロース）を含む寒天プレート上で行ったことを報告した。形質転換したＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの液体培養は、ハイグロマイシン含有のＹＰＤ培地において行った。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの培養に用いられる他の培地及び技法が報告されており、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて使用される数多くの他のプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ、及び選択可能なマーカーが報告されている（例えば、Ｐｉｇｎｅｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６：８（２０００），ｐｐ．３２８３−３２８９，Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７：４（２０１０），ｐｐ．２７７−２８２、及びＢａｒｔｈ ａｎｄ Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ，（１９９６），Ｉｎ：Ｋ，Ｗ．（Ｅｄ．），Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｙｅａｓｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ．Ｓｐｒｉｎｔｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒ，ｐｐ．３１３−３８８を参照）。Ｆｉｃｋｅｒｓは、形質転換ベクターＪＭＰ１２３並びにＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＬＩＰ２遺伝子プロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｆｉｃｋｅｒｓは、ＪＭＰ１２３でコードされるハイグロマイシン耐性カセットが、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｈｐｈ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターＪＭＰ１２３が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＬＩＰ２遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＬＩＰ２遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムの配列内のそのような相同性領域を同定することができる（Ｄｕｊｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４３０（２００４），ｐｐ．３５−４４による文献において参照される）。形質転換ベクターによるＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの安定な形質転換は、酢酸リチウム形質転換又は他の公知方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ｈｐｈ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを、限定はされないが、ハイグロマイシンを含むＹＰＤ培地上で選択することができる。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＹＰＤ培地、並びにＣｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．により記載される培養培地が挙げられる。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例３２：Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎｅの操作
Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎｅにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＭａｃｋｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６（２０００），ｐｐ．４６５５−４６６１は、プラスミドＤＮＡによるＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａの安定な核形質転換を報告した。ＭａｃＫｅｎｚｉｅは、プロトプラスト形質転換方法を用いて、プラスミドｐＤ４をＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａに導入した。プラスミドｐＤ４は、ｈｐｔタンパク質コード領域の上流でＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａヒストンＨ４．１遺伝子プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＪ２４９８１２）に動作可能に連結され、且つｈｐｔタンパク質コード領域の下流でＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ Ｎ−（５’−ホスホリボシル（ｐｈｏｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ））アントラニル酸イソメラーゼ（ｔｒｐＣ）遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子産物（ｈｐｔ）をコードする配列を含むハイグロマイシンＢ耐性カセットを含んだ。ｐＤ４による形質転換前、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａは、３００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＤ４による形質転換後、３００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む培地上で増殖する形質転換Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａが得られ、従ってＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのハイグロマイシンＢ抗生物質耐性カセットが確立された。サザン法により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｍａｃｋｅｎｚｉｅは、形質転換したＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａの選択及び維持を、ハイグロマイシンを含むＰＤＡ（ポテトデキストロース寒天）培地上で行ったことを報告した。Ｍａｃｋｅｎｚｉｅによる形質転換したＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａの液体培養は、ハイグロマイシン含有の、ＰＤＡ培地又はＳ２ＧＹＥ培地（５％グルコース、０．５％酵母エキス、０．１８％ ＮＨ４ＳＯ４、０．０２％ ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、０．０００１％ ＦｅＣｌ３−６Ｈ２Ｏ、０．１％微量元素、１０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４を含む）において行われた。Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａの培養に用いられる他の培地及び技法が報告されており、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａにおいて使用される他のプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ、及び選択可能なマーカーが報告されている（例えば、Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７５：１７（２００９）ｐｐ．５５２９−３５及びＬｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６４：７（２００１），ｐｐ．９７９−９０を参照）。Ｍａｃｋｅｎｚｉｅは、形質転換ベクターｐＤ４並びにＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａヒストンＨ４．１プロモーター及びＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ｔｒｐＣ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅは、ｐＤ４でコードされるハイグロマイシン耐性カセットが、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｈｐｔ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＤ４が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａヒストンＨ４．１遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ｔｒｐＣ ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａゲノムの配列内のそのような相同性領域を同定することができる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，Ｖｏｌ．６：１２（２０１１）による文献において参照される）。形質転換ベクターによるＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａの安定な形質転換は、プロトプラスト形質転換又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ｈｐｔ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａを、限定はされないが、ハイグロマイシンを含むＰＤＡ培地で選択することができる。Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｓ２ＧＹＥ培地、並びにＬｕ ｅｔ ａｌ．及びＡｎｄｏ ｅｔ ａｌ．により記載される培養培地が挙げられる。Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例３３：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０の操作
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０における本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＫａｌｓｃｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５２（１９９９），ｐｐ．５０８−５１５は、プラスミドＤＮＡによるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓの安定な形質転換を報告した。Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、プラスミドｐＮＣ９５０１をＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０に導入した。プラスミドｐＮＣ９５０１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｚｕｒｅｕｓ ２３Ｓ ｒＲＮＡ Ａ１０６７メチルトランスフェラーゼ遺伝子の完全ヌクレオチド配列を含む（この遺伝子のプロモーター及び３’ターミネーター配列を含む）チオストレプトン耐性（ｔｈｉｏｒ）カセットを含んだ。ｐＮＣ９５０１による形質転換前、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓは、１ｍｇ／ｍｌチオストレプトンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＮＣ９５０１によるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０の形質転換後、１ｍｇ／ｍｌチオストレプトンを含む培養培地上で増殖する形質転換体が得られ、従ってＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０における選択可能なマーカーとしてのチオストレプトン耐性カセットの使用が確立された。Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒにより記載される第２のプラスミド、ｐＡＫ６８は、耐性ｔｈｉｏｒカセット並びにｌａｃＺプロモーターにより駆動される、ポリヒドロキシアルカノエート生合成用のＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ β−ケトチオラーゼ（ｐｈａＢ）、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素（ｐｈａＡ）、及びポリ３−ヒドロキシアルカン酸シンターゼ（ｐｈａＣ）遺伝子の遺伝子配列を含んだ。ポリヒドロキシアルカノエート生合成が欠損しているＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０株のｐＡＫ６８形質転換後、非形質転換株と比べてより多量のポリヒドロキシアルカノエートを産生する形質転換Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０が得られた。導入されたＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ｐｈａＢ、ｐｈａＡ、及びｐｈａＣ酵素の検出可能な活性から、ｐＡＫ６８プラスミドでコードされる調節エレメントがＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０における異種遺伝子発現に好適であったことが示された。Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒは、形質転換したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０の選択及び維持を、チオストレプトンを含む標準的なルリアブロス（ＬＢ）培地、栄養ブイヨン（ＮＢ）、又は無機塩類培地（ＭＳＭ）上で行ったことを報告した。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０の培養に用いられる他の培地及び技法が記載されている（例えば、Ｋｕｒｏｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４７：３−４（２０１０），ｐｐ．２１２−２１８及びＡｌｖｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５４：２（２０００），ｐｐ．２１８−２２３を参照）。Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒは、形質転換ベクターｐＮＣ９５０１及びｐＡＫ６８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｚｕｒｅｕｓ ２３Ｓ ｒＲＮＡ Ａ１０６７メチルトランスフェラーゼ遺伝子及びｌａｃＺ遺伝子のプロモーターが、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０における異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒは、ｐＮＣ９５０１及びｐＡＫ６８でコードされるｔｈｉｏｒカセットが、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０における選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｔｈｉｏｒ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＮＣ９５０１が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０における発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でｌａｃＺ遺伝子プロモーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０ゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０ゲノムの配列内のそのような相同性領域を同定することができる（Ｈｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．７：９（２０１１）による文献において参照される。形質転換ベクターによるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０の形質転換は、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｚｕｒｅｕｓ ２３Ｓ ｒＲＮＡ Ａ１０６７メチルトランスフェラーゼ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０を、限定はされないが、チオストレプトンを含むＬＢ培地上で選択することができるｆ。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｋｕｒｏｓａｗａ ｅｔ ａｌ．及びＡｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．により考察される培養培地が挙げられる。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例３４：脂肪酸栄養要求性のための微細藻類の操作
実施例３の株Ｂ、Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼ（ＣｗＴＥ２）を発現するように操作したＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）を、両方の内在性チオエステラーゼ対立遺伝子ＦＡＴＡ１−１及びＦＡＴＡ１−２をノックアウトするさらなる遺伝子改変用の宿主生物として使用した。ここで、第１の形質転換構築物は、ＦＡＴＡ１−１遺伝子座の株Ｂにネオマイシン発現カセットを組み込むように作成した。この構築物、ｐＳＺ２２２６は、核ゲノムのＦＡＴＡ１−１遺伝子座に対する５’（配列番号３０）及び３’（配列番号３１）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあるネオマイシン耐性タンパク質コード配列を含んだ。このＮｅｏＲ発現カセットは配列番号１５として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。
ｐＳＺ２２２６の株Ｂへの形質転換後、個々の形質転換体を、ショ糖及びＧ４１８を含む寒天プレート上で選択した。単一の単離物、株Ｈを、さらなる遺伝子改変用に選択した。第２の形質転換構築物、ｐＳＺ２２３６は、チアミン選択可能マーカーの発現を可能にするポリヌクレオチドをＦＡＴＡ１−２遺伝子座で株Ｈに組み込むように作成した。ｐＳＺ２２３６は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ１４３５）核ゲノムへの組み込み用のＦＡＴＡ１−２ゲノム領域に対する５’（配列番号３２）及び３’（配列番号３３）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）並びにＣ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓアクチンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号２２）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＴＨＩＣタンパク質コード領域を含んだ。このＡｔＴＨＩＣ発現カセットは配列番号２３として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。ｐＳＺ２２３６による株Ｈの形質転換によって株Ｉを作成した後、個々の形質転換体を、遊離脂肪酸を含む寒天プレート上で選択した。株Ｉは、寒天プレート上で、及びチアミン不含且つ遊離脂肪酸を補足した培地において増殖することができた。
実施例３５：ステアリン酸の産生を増加させるための微生物の操作
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的に変異を誘発した株、株Ｊを、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法によりプラスミド構築物ｐＳＺ２２８１で形質転換した。ｐＳＺ２２８１は、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼの発現を下方調節するＲＮＡヘアピン（ＳＡＤ２ｈｐＣ、配列番号３４）をコードするポリヌクレオチド、核ゲノムへの組み込み用の６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１）及び３’（配列番号２）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びに配列番号３に示されるタンパク質配列を発現する、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域（配列番号４）を含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２発現カセットは配列番号７として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。ＳＡＤ２ｈｐＣ ＲＮＡヘアピンをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓアクチンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号２２）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあった。
構築物ｐＳＺ２２８１による株Ｊの形質転換によって株Ｋを作成した後、陽性クローンを、ショ糖を単一炭素源として含有する寒天プレート上で選択した。個々の形質転換体をクローン精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述されるとおりの脂質産生に好適な従属栄養条件下で増殖させた。乾燥バイオマスから脂質サンプルを調製し、実施例１に記載されるとおりの（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書も参照のこと）標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化検出法を用いて分析した。単一炭素源としてグルコース上で増殖させたＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ株Ｊ及び単一炭素源としてショ糖上で増殖させた株Ｋの３つの代表的な単離物の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表２１に提供する。
表２１に提供されるデータは、形質転換生物のＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸プロフィールに対するＳＡＤ２ヘアピンＲＮＡ構築物の発現の明らかな影響を示している。ＳＡＤ２ヘアピンＲＮＡ構築物を含む株Ｋ形質転換体の脂肪酸プロフィールは、飽和Ｃ１８：０脂肪酸の割合の増加と、同時の不飽和Ｃ１８：１脂肪酸の減少を実証した。非形質転換株の脂肪酸プロフィールは、約３％のＣ１８：０を含む。形質転換株の脂肪酸プロフィールは、約３７％のＣ１８：０を含む。これらのデータは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおけるＳＡＤ ＲＮＡヘアピン構築物の発現を可能にするポリヌクレオチドの発現及び使用の成功による、操作された宿主微生物における飽和脂肪酸の割合の改変、詳細には微生物細胞におけるＣ１８：０脂肪酸の濃度の増加及びＣ１８：１脂肪酸の減少を示す。
表２１には、株Ｋ−４においてステアリン酸レベルがさらに一層上昇したことも示される。株Ｋ４は、株Ｋ１〜Ｋ３の構築物をＳＡＤ２Ｂ遺伝子座に挿入することによって作成した。従って、ＳＡＤ遺伝子の１つのコピーをノックアウトし、残りのコピーをＲＮＡレベルで阻害することにより、オレイン酸のさらなる減少及び対応するステアリン酸の増加が得られた。株Ｋ４から得られたＲＢＤ油のトリグリセリド分析は、約１２％ＰＯＰ、２７％ＰＯＳ及び１８％ＳＯＳを示した。
実施例３６：内在性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのノックダウンによるオレイン酸の産生を増加させるための微生物の操作
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的に変異を誘発した株、株Ｊを、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により、構築物ｐＳＺ２４０２〜ｐＳＺ２４０７の各々で独立して形質転換した。構築物ｐＳＺ２４０２〜ｐＳＺ２４０７の各々は、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現を下方調節するようにＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＴＡ１ ｍＲＮＡ転写物に対して標的化されたヘアピンＲＮＡをコードする異なるポリヌクレオチド、核ゲノムへの組み込み用の６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１）及び３’（配列番号２）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にある、配列番号３に示されるタンパク質配列を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域（配列番号４）を含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２発現カセットは配列番号７として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。各ヘアピンに対応するポリヌクレオチドの配列表識別情報を表２２に列挙する。各ＲＮＡヘアピンをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあった。
表２２に列挙される構築物の各々で株Ｊを独立して形質転換した後、ショ糖を単一炭素源として含有する寒天プレート上で陽性クローンを選択した。個々の形質転換体をクローン精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述されるとおりの脂質産生に好適な従属栄養条件下で増殖させた。乾燥バイオマスから脂質サンプルを調製し、実施例１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書）に記載されるとおりの標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化検出法を用いて分析した。単一炭素源としてグルコース上で増殖させたＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ１４３５）株Ｊ及び単一炭素源としてショ糖上で増殖させた株Ｊの各形質転換の代表的な単離物の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表２３に提供する。
表２３に提供されるデータは、形質転換生物のＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸プロフィールに対するＦＡＴＡヘアピンＲＮＡ構築物の発現の明らかな影響を示している。ＦＡＴＡヘアピンＲＮＡ構築物を含む株Ｊ形質転換体の脂肪酸プロフィールは、Ｃ１８：１脂肪酸の割合の増加と、同時のＣ１６：０及びＣ１８：０脂肪酸の減少を実証した。非形質転換株Ｊの脂肪酸プロフィールは、約２６．６６％のＣ１６：０、３％のＣ１８：０、及び約５９％のＣ１８：１脂肪酸である。対照的に、形質転換株の脂肪酸プロフィールは、８．６％もの低さのＣ１６：０及び１．５４％のＣ１８：０及び７８％より高いＣ１８：１脂肪酸を含む。
これらのデータは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおけるポリヌクレオチド ＦＡＴＡ ＲＮＡヘアピン構築物の有用性及び使用の成功による、操作された微生物の脂肪酸プロフィールの改変、詳細には微生物細胞におけるＣ１８：１脂肪酸の濃度の増加及びＣ１８：０及びＣ１６：０脂肪酸の減少を示す。
実施例３７：ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶの過剰発現によって中鎖脂肪酸の産生を増加させるための微生物の操作
この例では、ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ酵素をコードする組換えポリヌクレオチドの使用による、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールにおいてラウリン酸、Ｃ１０：０、及び全飽和脂肪酸が高濃度化した微生物の操作を記載する。
構築物ｐＳＺＤ１１３２、ｐＳＺＤ１１３３、ｐＳＺＤ１１３４、又はｐＳＺＤ１２０１の各々を独立して使用して、実施例３の株Ｂ、Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼ（ＣｗＴＥ２）を発現するように操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）を、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により形質転換した。上記の構築物の各々は、ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ酵素をコードする異なるポリヌクレオチド、核ゲノムへの組み込み用のｐＬｏｏｐゲノム領域に対する５’（配列番号１３）及び３’（配列番号１４）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあるネオマイシン耐性タンパク質コード配列を含んだ。このＮｅｏＲ発現カセットは配列番号１５として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。各構築物に対応するポリヌクレオチドの配列表識別情報を表２０に掲載する。各ＫＡＳ酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５ Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあった。ＫＡＳ酵素及びネオマイシン耐性遺伝子のタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにコドンを最適化した。
個々のプラスミドを株Ｂに形質転換した後、Ｇ４１８を含む寒天プレート上で陽性クローンを選択した。個々の形質転換体をクローン精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述されるとおりの脂質産生に好適な条件下、ｐＨ７．０で、単一炭素源としてのショ糖上で成長させた。各形質転換体由来の乾燥バイオマスから脂質サンプルを調製し、実施例１に記載されるとおりの標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化（ＦＡＭＥ ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いてこれらのサンプルの脂肪酸プロフィールを分析した。株Ｂ及びｐＳＺ２０４６の各々の４つの陽性形質転換体（株Ｍ〜Ｐ、１〜４）の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表２４に提供する。
表２５に提供するデータは、ＫＡＳＩ及びＫＡＳＩＶ酵素の外来性発現が形質転換生物のＣ１０：０及びＣ１２脂肪酸プロフィールに対して及ぼす明らかな影響を示す。Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼのみを発現する株Ｂの脂肪酸プロフィールは、約８％ Ｃ１０：０及び約３５．５％ Ｃ１２：０を含み、飽和脂肪酸が全脂肪酸の７２．５５％を占めた。対照的に、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓステアロイルＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドを含むＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＩをさらに発現するように操作された株Ｂの形質転換体は、約１３％ Ｃ１０：０及び約４６％ Ｃ１２：０の脂肪酸プロフィールによって特徴付けられた。飽和脂肪酸は、Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＩ融合タンパク質を共発現する株Ｂの形質転換体において７７％もの高さを占めた。同様に、酵素の天然トランジットペプチドを含むＣ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＩを発現するように操作された株Ｂの形質転換体は、約１５％ Ｃ１０、約４４％ Ｃ１２、及び約７９％飽和脂肪酸の脂肪酸プロフィールによって特徴付けられた。Ｃｕｐｈｅａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ ＫＡＳＩＶ又はＣｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ ＫＡＳＩＶのいずれかを発現する株Ｂの脂肪酸プロフィール又は多くの形質転換体もまた、株Ｂそれ自体の脂肪酸プロフィールと比較してＣ１０％及びＣ１２％レベルの上昇を呈した。
これらのデータは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）におけるＫＡＳＩ及びＫＡＳＩＶ構築物の発現によって操作宿主微生物における飽和脂肪酸の割合を変えることが可能なポリヌクレオチドの、詳細には微生物細胞におけるＣ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸の濃度を増加させることにおける有用性及び有効性を実証している。
実施例３８：ＫＡＳＩノックアウトによって中鎖脂肪酸の産生を増加させるための微生物の操作
この例では、種々のＫＡＳＩ対立遺伝子を破壊する組換えポリヌクレオチドの使用による、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールにおいてＣ１０：０及び中鎖脂肪酸が高濃度化した微生物の操作を記載する。
構築物ｐＳＺ２３０２及びｐＳＺ２３０４を使用して、実施例３の株Ｂ、Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼ（ＣｗＴＥ２）を発現するように操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）を、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により独立して形質転換した。ｐＳＺ２３０２は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ核ゲノムへの組み込み用のＫＡＳ１対立遺伝子１ゲノム領域に対する５’（配列番号５０）及び３’（配列番号５１）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓアクチンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号２２）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＴＨＩＣタンパク質コード領域を含んだ。ｐＳＺ２３０４は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ核ゲノムへの組み込み用のＫＡＳ１対立遺伝子２ゲノム領域に対する５’（配列番号５２）及び３’（配列番号５３）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓアクチンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号２２）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＴＨＩＣタンパク質コード領域を含んだ。このＡｔＴＨＩＣ発現カセットは配列番号２３として列挙され、選択マーカーとして働いた。ＡｔＴＨＩＣのタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにコドンを最適化した。
ｐＳＺ２３０２及びｐＳＺ２３０４を株Ｂに独立して形質転換し、それにより株Ｑ及び株Ｒを作成した後、チアミンを含む寒天プレート上で陽性クローンを選択した。個々の形質転換体をクローン精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述されるとおりの脂質産生に好適な従属栄養条件下、ｐＨ５．０又はｐＨ７．０で単一炭素源としてのショ糖上で培養した。各形質転換体由来の乾燥バイオマスから脂質サンプルを調製し、これらのサンプルの脂肪酸プロフィールを、実施例１に記載されるとおり脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化（ＦＡＭＥ ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いて分析した。株Ｂ並びに陽性ｐＳＺ２３０２（株Ｑ、１〜５）及びｐＳＺ２３０４（株Ｒ、１〜５）形質転換体の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表２６及び表２７に提供する。
表２６及び表２７に提供されるデータは、種々のＫＡＳＩ対立遺伝子の破壊が形質転換生物の脂肪酸プロフィールに対して及ぼす明らかな影響を示す。ｐＨ５．０で培養したとき、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）と、ｐＨ調節可能なプロモーターの制御下でＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＦＡＴＢ２チオエステラーゼを発現するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）株Ｂとは、脂肪酸プロフィールが極めて類似していた。これらのプロフィールは、約１％ Ｃ１４：０、約２１〜２６％ Ｃ１６：０、約２〜３％ Ｃ１８：０、約６０〜６５％ Ｃ１８：１、約７％ Ｃ１８：２によって特徴付けられ、Ｃ１０〜Ｃ１４脂肪酸が全脂肪酸の約１．１９〜１．３％含まれた。対照的に、ｐＨ５．０で培養したとき、ＫＡＳＩ対立遺伝子１（株Ｑ）又はＫＡＳＩ対立遺伝子２（株Ｒ）を破壊するようにさらに操作された株Ｂは、株Ｂ又はＵＴＥＸ １４３５と比較してＣ１２脂肪酸レベルの増加、Ｃ１４脂肪酸レベルの増加、Ｃ１８脂肪酸のレベルの減少、及びＣ１８：１脂肪酸レベルの減少によって特徴付けられた脂肪酸プロフィールの変化を示した。株Ｑ及び株Ｒの単離物の脂肪酸プロフィールは、株Ｒ（対立遺伝子２ノックアウト）単離物が概して株Ｑ（対立遺伝子１ノックアウト）と比べて高いＣ１２及び低いＣ１６及びＣ１８：１を有した点で異なった。
ｐＨ７．０で培養したとき、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の脂肪酸プロフィールは、ｐＨ調節可能なプロモーターの制御下でＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＦＡＴＢ２チオエステラーゼを発現するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）株Ｂのものと異なる。ｐＨ７．０で培養したとき、株Ｂは、Ｃ１０、Ｃ１２、及びＣ１４脂肪酸（これらは全脂肪酸の約５０％含まれた）が上昇した脂肪酸プロフィールによって特徴付けられた。ｐＨ７．０で培養したとき、株Ｑ及び株Ｒは、株Ｂと比べてＣ１０、Ｃ１２、及びＣ１４脂肪酸がさらに一層増加し、且つＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸がさらに一層減少した脂肪酸プロフィールを示した。ここでもまた、株Ｑと株Ｒとの脂肪酸プロフィールの違いが観察され、株Ｒのプロフィールは株Ｑと比べて高いＣ１２パーセンテージレベル及び低いＣ１８：１レベルを含んだ。
これらのデータは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおけるＫＡＳＩ及びＫＡＳＩＶ構築物の発現によって操作宿主微生物における飽和脂肪酸の割合を変えることが可能なポリヌクレオチドの発現及び使用の、詳細にはＣ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸の濃度を増加させ、且つ微生物細胞におけるＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸の濃度を減少させることにおける成功を示している。加えて、ここでのデータは、種々のＫＡＳＩ対立遺伝子の破壊によって形質転換生物の脂肪酸プロフィールに変化をもたらすことができることを示している。
実施例３９：ＫＡＳＩノックダウンによって中鎖脂肪酸の産生を増加させるための微生物の操作
この例では、ＫＡＳＩ酵素を減弱させるＲＮＡヘアピンをコードする組換えポリヌクレオチドの使用による、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールにおいて中鎖脂肪酸が高濃度化した微生物の操作を記載する。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的な突然変異誘発株、株Ｓを、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により、構築物ｐＳＺ２４８２〜ｐＳＺ２４８５の各々で独立して形質転換した。構築物ｐＳＺ２４８２〜ｐＳＺ２４８５の各々は、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現を下方調節するようにＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）ＫＡＳＩ ｍＲＮＡ転写物に標的化されたヘアピンＲＮＡをコードする異なるポリヌクレオチド、核ゲノムへの組み込み用の６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１）及び３’（配列番号２）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下で配列番号３に示されるタンパク質配列を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域（配列番号４）を含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２発現カセットは配列番号７として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。各ＫＡＳＩヘアピンに対応するポリヌクレオチドの配列表識別情報を、表２８に列挙する。各ＲＮＡヘアピンをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあった。ｓｕｃ２発現カセットのタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにコドンを最適化した。
株Ｓを表２８に掲載する構築物の各々で独立して形質転換した後、ショ糖を単一炭素源として含有する寒天プレート上で陽性クローンを選択した。個々の形質転換体をクローン精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述されるような脂質産生に好適な従属栄養条件下で増殖させた。乾燥バイオマスから脂質サンプルを調製し、実施例１に記載されるとおりの（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書もまた参照）脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化検出法を用いて分析した。単一炭素源としてのグルコース上で増殖させたＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５、及び単一炭素源としてのショ糖上で増殖させた株Ｓの各形質転換の４つの代表的な単離物の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表２９に提供する。
表２９に提供されるデータは、ＫＡＳヘアピンＲＮＡ構築物の発現が形質転換生物の脂肪酸プロフィールに対して及ぼす明らかな影響を示す。ｐＳＺ２４８２又はｐＳＺ２４８４のいずれかのＫＡＳＩヘアピンＲＮＡ構築物を含む株Ｓ形質転換体の脂肪酸プロフィールは、ＵＴＥＸ １４３５の脂肪酸プロフィールと比べたＣ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、及びＣ１６脂肪酸の割合の増加と、付随するＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸の減少を示した。
これらのデータは、操作された微生物の脂肪酸プロフィールを変えるための、詳細には微生物細胞中の中鎖脂肪酸の濃度を増加させ、且つＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸を減少させることにおける、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）におけるポリヌクレオチドＫＡＳＩ ＲＮＡヘアピン構築物の有用性及び使用の成功を示している。
実施例４０：脂肪酸エロンガーゼの過剰発現によってステアリン酸の産生を増加させるための微生物の操作
この例では、脂肪酸エロンガーゼをコードする組換えポリヌクレオチドの使用による、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールにおいてステアリン酸、アラキジン酸、及びドコサジエン酸が高濃度化した微生物の操作を記載する。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的な突然変異誘発株、株Ｊを、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により、構築物ｐＳＺ２３２３、ｐＳＺ２３２４、又はｐＳＺ２３２８の各々で独立して形質転換した。構築物の各々は、エロンガーゼを過剰発現させるタンパク質コード領域、核ゲノムへの組み込み用の６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１）及び３’（配列番号２）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下で配列番号３に示されるタンパク質配列を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域（配列番号４）を含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２発現カセットは配列番号７として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。各エロンガーゼに対応するポリヌクレオチドの配列表識別情報を、表３０に列挙する。各エロンガーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあった。外因性エロンガーゼ及びｓｕｃ２発現カセットのタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにコドンを最適化した。
表３０に掲載する構築物で株Ｊを独立して形質転換した後、ショ糖を単一炭素源として含有する寒天プレート上で陽性クローンを選択した。個々の形質転換体をクローン精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述されるような脂質産生に好適な従属栄養条件下で増殖させた。乾燥バイオマスから脂質サンプルを調製し、実施例１に記載されるとおりの（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書もまた参照）脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化検出法を用いて分析した。単一炭素源としてのグルコース上で増殖させたＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５株Ｊ、及び単一炭素源としてのショ糖上で増殖させた株Ｊの各形質転換の３つの代表的な単離物の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表３１に提供する。
表３１に提供されるデータは、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ酵素の発現が形質転換生物のＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、及びＣ２２：２ｎ６脂肪酸プロフィールに対して及ぼす明らかな影響を示す。非形質転換株Ｊの脂肪酸プロフィールは、約２７．４２％ Ｃ１６：０、約３％ Ｃ１８：０、約５７．５％ Ｃ１８：１、約０．３％ Ｃ２０：０及び約０．０３％ Ｃ２２：２ｎ６脂肪酸であった。株Ｊとは対照的に、エロンガーゼを発現するように種々のプラスミド構築物で形質転換した株Ｊの脂肪酸プロフィールは、低いパーセンテージレベルのＣ１６脂肪酸及び高いパーセンテージレベルのＣ１８：０、Ｃ２０：０、及びＣ２２：２ｎ６脂肪酸を含んだ。Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａエロンガーゼの過剰発現の結果は、株Ｊの脂肪酸プロフィールと比べてＣ１８：０脂肪酸パーセンテージレベルの約２．５倍の増加、Ｃ２０：０脂肪酸パーセンテージレベルの２倍の増加、及びＣ２２：２ｎ６脂肪酸パーセンテージレベルの約１５〜３０倍の増加であった。
これらのデータは、操作された微生物の脂肪酸プロフィールを変えるための、詳細には組換え微生物細胞におけるＣ１８：０、Ｃ２０：０、及びＣ２２：２ｎ６脂肪酸の濃度を増加させ、且つＣ１６：０脂肪酸を減少させることにおける、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）で発現するエロンガーゼをコードするポリヌクレオチドの使用の成功を示している。
実施例４１：アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの過剰発現によってステアリン酸の産生を増加させるための微生物の操作
この例では、種々のＣ１８：０選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする組換えポリヌクレオチドの使用による、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールにおいてステアリン酸が高濃度化した微生物の操作を記載する。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的な突然変異誘発株、株Ｊ又は株Ａを、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により、表３２に掲載する構築物で独立して形質転換した。構築物の各々は、Ｃ末端３Ｘ ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープタグを伴う脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを過剰発現させるタンパク質コード領域、核ゲノムへの組み込み用の６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１）及び３’（配列番号２）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下で配列番号３に示されるタンパク質配列を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域（配列番号４）を含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２発現カセットは配列番号７として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。各チオエステラーゼに対応するポリヌクレオチドの配列表識別情報を表３２に掲載する。各チオエステラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあった。外因性チオエステラーゼ及びｓｕｃ２発現カセットのタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにコドンを最適化した。
株Ａ又は株Ｊを表３２に掲載する構築物で独立して形質転換した後、ショ糖を単一炭素源として含有する寒天プレート上で陽性クローンを選択した。個々の形質転換体をクローン精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述されるような脂質産生に好適な従属栄養条件下で増殖させた。乾燥バイオマスから脂質サンプルを調製し、実施例１に記載されるとおりの（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書もまた参照）脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化検出法を用いて分析した。単一炭素源としてのグルコース上で増殖させたＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５株Ｊ、及び単一炭素源としてのショ糖上で増殖させた、株Ｊの各形質転換の代表的な単離物の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表３３に提供する。
表３３に提供されるデータは、外因性アシル−ＡＣＰ酵素が形質転換微生物の脂肪酸プロフィールに対して及ぼす明らかな影響を示す。非形質転換株Ａ及び株Ｊの脂肪酸プロフィールは、約２５％ Ｃ１６：０、約３．３％ Ｃ１８：０、約５７〜６０％ Ｃ１８：１であった。対照的に、アシル−ＡＣＰ酵素を発現するように種々のプラスミド構築物で形質転換した株Ａの脂肪酸プロフィールは、株Ａと比べて高いパーセンテージレベルのＣ１８：０脂肪酸及び低いパーセンテージレベルのＣ１８：１脂肪酸を含んだ。株Ａ又は株ＪにおけるＢ．ｎａｐｕｓ、Ｃ．ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ、Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ及びＧ．ｍａｎｇｏｓｔａｎａ由来のＦＡＴＡ酵素の発現により、形質転換生物におけるステアリン酸レベルの蓄積が可能となった。Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの過剰発現の結果は、株Ａの脂肪酸プロフィールと比べた形質転換生物の脂肪酸プロフィールのＣ１８：０脂肪酸パーセンテージレベルの約２〜５倍の増加であった。Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＳＡＤ１トランジットペプチドを含むＧ．ｍａｎｇｏｓｔａｎａアシル−ＡＣＰ ＦＡＴＡチオエステラーゼを過剰発現するように操作された細胞の脂肪酸プロフィールは、株Ｊの脂肪酸プロフィールと比べた形質転換生物の脂肪酸プロフィールのＣ１８：０脂肪酸パーセンテージレベルの約２〜３倍の増加によって特徴付けられた。
これらのデータは、操作された微生物の脂肪酸プロフィールを変えるための、詳細には組換え微生物細胞におけるＣ１８：０脂肪酸の濃度を増加させ、且つＣ１８：１脂肪酸を減少させることにおける、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）で発現する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするポリヌクレオチドの有用性及び有効な使用を示している。
実施例４２：エロンガーゼ又はβ−ケトアシル−ＣＯＡシンターゼの過剰発現によってエルカ酸の産生を増加させるための微生物の操作
本発明の実施形態において、場合によりプラスチドの油産生微生物で外因性エロンガーゼ又はβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを発現する働きをする組換えポリヌクレオチド形質転換ベクターを構築し、それを利用して、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換法によりＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）を形質転換し、エルカ酸の産生が増加した細胞を得る。形質転換ベクターは、表５に掲載するようなエロンガーゼ又はβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを過剰発現させるタンパク質コード領域、外来遺伝子の発現を調節するプロモーター及び３’ＵＴＲ制御配列、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）核ゲノムへの組み込み用の組換えポリヌクレオチドを標的化する５’及び３’相同組換え標的配列、並びに選択可能なマーカーを発現する働きをするヌクレオチドを含む。形質転換ベクターのタンパク質コード配列は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）での発現用にコドンを最適化する。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）での発現用に働くプロモーター、３’ＵＴＲ、及び選択可能なマーカーをコードする組換えポリヌクレオチドは、本明細書及びＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に開示される。
形質転換ベクターをＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）に、又はＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的な突然変異誘発株に形質転換した後、寒天プレート上で陽性クローンを選択する。個々の形質転換体をクローン精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述されるとおりの脂質産生に好適な従属栄養条件下で培養する。各形質転換体由来の乾燥バイオマスから脂質サンプルを調製し、実施例１に記載されるとおり脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化（ＦＡＭＥ ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いてこれらのサンプルの脂肪酸プロフィールを分析する。これらの操作の結果として、細胞は少なくとも５、１０、１５、又は２０倍のエルカ酸の増加を呈し得る。
実施例４３：Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴの発現による株ＵＴＥＸ１４３５におけるカプリン酸、ラウリン酸、及びミリスチン酸リッチな油の生成
本発明者らは、Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ由来のアシルＡＣＰチオエステラーゼ（ＦＡＴＢ２）を発現する先述のＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）トランスジェニック株における２つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）の発現の効果を試験した。ＣｕＰＳＲ２３ゲノム配列とシードＲＮＡに由来するトランスクリプトーム配列との組み合わせを分析することにより、Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３（ＣｕＰＳＲ２３）由来のＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３遺伝子を同定した。これらの２つのＬＰＡＡＴについては、これまで記載がなかった。これらの遺伝子は、ＵＴＥＸ １４３５コドン使用頻度を反映するようにコドンを最適化した。形質転換、細胞培養、脂質産生及び脂肪酸分析は、全て既述のとおり実施した。
Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ １−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３）［それぞれｐＳＺ２２９９及びｐＳＺ２３００］の発現による株Ｂにおけるカプリン酸の、ラウリン酸、及びミリスチン酸蓄積の増加：この例では、それぞれＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３をコードする構築物ｐＳＺ２２９９又はｐＳＺ２３００で株Ｂを形質転換することにより、トランスジェニック株を作成した。これらのトランスジェニック株を、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性について選択した。構築物ｐＳＺ２２９９は、ｐＬＯＯＰ５’：：ＣｒＴＵＢ２：ＮｅｏＲ：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ３：ＣｕＰＳＲ２３ＬＰＡＡＴ２−１：ＣｖＮＲ：：ｐＬＯＯＰ３’として表すことができる。構築物ｐＳＺ２３００は、ｐＬＯＯＰ５’：：ＣｒＴＵＢ２：ＮｅｏＲ：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ３：ＣｕＰＳＲ２３ＬＰＡＡＴ３−１：ＣｖＮＲ：：ｐＬＯＯＰ３’として表すことができる。形質転換ＤＮＡ（ｐＳＺ２２９９及びｐＳＺ２３００）の配列は以下に提供する。構築物中の関連する制限部位は、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩであり、小文字、太字、及び下線で示される。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。構築物の５’及び３’末端にある太字で小文字の配列は、相同組換えによるｐＬｏｏｐ遺伝子座への組み込みを標的とするＵＴＥＸ １４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、選択カセットは、ＮｅｏＲ遺伝子（Ｇ４１８に対する耐性を付与する）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲのＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター駆動発現を有する。このプロモーターは、小文字で囲い文字のテキストにより示す。ＮｅｏＲのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示す。２つのカセット間のスペーサー領域を大文字のテキストにより示す。Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３由来のコドン最適化したＬＰＡＡＴ２遺伝子（ｐＳＺ２２９９）又はＬＰＡＡＴ３遺伝子（ｐＳＺ２３００）を含む第２のカセットは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ内在性ＡＭＴ３プロモーターにより駆動され、同じＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを有する。このカセットでは、ＡＭＴ３プロモーターを小文字の囲い文字テキストにより示す。ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックで示し、一方コード領域を小文字のイタリックにより示す。３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示す。正しいリーディングフレーム及び標的配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
ｐＳＺ２２９９形質転換構築物：


ｐＳＺ２３００形質転換構築物：


ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３遺伝子が中鎖脂肪酸蓄積に対して及ぼす影響を決定するため、ＵＴＥＸ １４５３ ＡＭＴ３プロモーターによって駆動されるコドン最適化ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２又はＬＰＡＡＴ３遺伝子を含む上記の構築物を株Ｂに形質転換した。
一次形質転換体をクローン精製し、標準的な脂質産生条件下、ｐＨ７．０で成長させた（いずれの株も、ｐＨ調節性ＡＭＴ３プロモーターにより駆動されるＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２又はＬＰＡＡＴ３遺伝子の最大発現を可能にするためには、ｐＨ７．０での成長を必要とする）。これらの形質転換によって生じた一組の代表的なクローンから得られたプロフィールを、以下の表３４に示す。Ｄ１５２０は、ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２を含む株Ｂのクローンを表し、Ｄ１５２１は、ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ３を含む株Ｂのクローンを表す。
トランスジェニックＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２株（Ｄ１５２０Ａ〜Ｅ）は、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、及びＣ１４：０脂肪酸の蓄積の大幅な増加と、付随するＣ１８：１及びＣ１８：２の減少を示す。トランスジェニックＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ３株（Ｄ１５２１Ａ〜Ｅ）は、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、及びＣ１４：０脂肪酸の蓄積の大幅な増加と、付随するＣ１８：１の減少を示す。これらのトランスジェニック系におけるＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴの発現は、一般に中鎖脂肪酸の、特にラウリン酸の蓄積が増加する直接の原因であるものと思われる。トランスジェニック系は、より長鎖の脂肪酸（Ｃ１６：０以上）から中鎖脂肪酸へのシフトを示すが、このシフトは主にＣ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸が標的となり、Ｃ１４：０脂肪酸に対する効果は僅かである。提供されるデータはまた、Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３由来のＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３遺伝子と、Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ由来のＦＡＴＢ２（株Ｂの株で発現する）との共発現が、Ｃ１２：０脂肪酸の蓄積に対して相加効果を有することも示している。
本発明者らの結果は、ＵＴＥＸ １４３５に由来する藻類株においてＣｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３のＬＰＡＡＴ酵素が活性であることを示唆している。これらの結果はまた、この酵素が、株Ｂで発現する異種性ＦａｔＢ２アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ酵素（これはＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉに由来する）と共に機能することも示している。
実施例４４：Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＦＡＴＢ２と組み合わせたＣｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴＸの発現による株ＵＴＥＸ１４３５における脂肪酸レベルの改変
ここで本発明者らは、先述のＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）トランスジェニック株、株Ｂにおける１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）の発現の効果を示す。上記に記載したとおり、株Ｂは、Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ由来のアシルＡＣＰチオエステラーゼ（ＦＡＴＢ２）を発現するトランスジェニック株であり、４０〜４９％のＣ１２：０脂肪酸を蓄積する。実施例４３に加えて、ＣｕＰＳＲ２３ゲノム配列とシードＲＮＡに由来するトランスクリプトーム配列との組み合わせを分析することにより、第３のＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ、ＬＰＡＡＴｘが同定された。従って、中鎖特異的ＬＰＡＡＴの発現により、ｓｎ−２位にカプリン酸（Ｃ１０：０脂肪酸）、ラウリン酸（Ｃ１２：０脂肪酸）、又はミリスチン酸（Ｃ１４：０脂肪酸）を有するＴＡＧの割合が増加するはずであり、結果的にこれらの脂肪酸のレベル全体が上昇するはずである。実施例４３では、ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３が、株Ｂにおけるカプリン酸、ラウリン酸、及びミリスチン酸蓄積を増加させることが示された。株ＢにＬＰＡＡＴｘを導入し、この株における脂肪酸レベルに対するその効果を決定した。ＬＰＡＡＴｘ遺伝子は、ＵＴＥＸ １４３５コドン使用頻度を反映するようにコドンを最適化した。形質転換、細胞培養、脂質産生及び脂肪酸分析は、全て既述のとおり実施した。
Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ １−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴｘ）［ｐＳＺ２５７５］の発現による株の株Ｂにおけるカプリン酸、ラウリン酸、及びミリスチン酸蓄積の減少及びパルミチン酸及びステアリン酸蓄積の増加：この例では、ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘをコードする構築物ｐＳＺ２５７５で株Ｂを形質転換することによってトランスジェニック株を作成した。このトランスジェニック株を、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性について選択した。構築物ｐＳＺ２５７５は、ｐＬＯＯＰ５’：：ＣｒＴＵＢ２：ＮｅｏＲ：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ３：ＣｕＰＳＲ２３ＬＰＡＡＴｘ：ＣｖＮＲ：：ｐＬＯＯＰ３’として表すことができる。形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する（ｐＳＺ２５７５）。構築物中の関連する制限部位は、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ１、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱ１であり、小文字、太字、及び下線で示される。ＢｓｐＱ１部位は、形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。構築物の５’及び３’末端にある太字で小文字の配列は、相同組換えによるｐＬｏｏｐ遺伝子座への組み込みを標的とするＵＴＥＸ １４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、選択カセットは、ＮｅｏＲ遺伝子（Ｇ４１８に対する耐性を付与する）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲのＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター駆動発現を有する。このプロモーターは、小文字で囲い文字のテキストにより示す。ＮｅｏＲのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示す。２つのカセット間のスペーサー領域を大文字のテキストにより示す。Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３由来のコドン最適化ＬＰＡＡＴｘ遺伝子（ｐＳＺ２５７５）を含む第２のカセットは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ内在性ＡＭＴ３プロモーターにより駆動され、同じＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを有する。このカセットでは、ＡＭＴ３プロモーターを、小文字の囲い文字のテキストにより示す。ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘ遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックで示し、一方コード領域は小文字のイタリックにより示す。３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示す。正しいリーディングフレーム及び標的配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
ｐＳＺ２５７５形質転換構築物


ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘ遺伝子が脂肪酸蓄積に対して及ぼす影響を決定するため、ＵＴＥＸ １４５３ ＡＭＴ３プロモーターによって駆動されるコドン最適化ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘ遺伝子を含む上記の構築物を、株Ｂに形質転換した。
一次形質転換体をクローン精製し、低窒素条件下ｐＨ７．０で成長させた；ｐＨ調節性ＡＭＴ３プロモーターにより駆動されるＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘ及びＣｗＦＡＴＢ２遺伝子の最大発現を可能にするためには、株はｐＨ７．０での成長を必要とする。これらの形質転換によって生じた一組の代表的なクローンから得られたプロフィールを、以下の表３５に示す。Ｄ１５４２は、ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘを含む株Ｂのクローンを表す。
トランスジェニックＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘ株（Ｄ１５４２Ａ〜Ｅ）は、親の株Ｂと比べてＣ１０：０、Ｃ１２：０、及びＣ１４：０脂肪酸の蓄積の大幅な減少と、付随するＣ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１及びＣ１８：２の増加を示す。これらのトランスジェニック系におけるＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘ遺伝子の発現は、中鎖脂肪酸（Ｃ１０〜Ｃ１４）の蓄積減少及びＣ１６：０及びＣ１８脂肪酸の蓄積増加の直接の原因であるものと思われ、最も顕著な増加はパルミチン酸（Ｃ１６：０）で観察された。提供されるデータはまた、Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ由来の中鎖特異的ＦＡＴＢ２（株Ｂに存在する）の発現にも関わらず、ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘの発現がＴＡＧへのより長鎖の脂肪酸の取り込みに有利であるように見えることも示している。
本発明者らの結果は、ＵＴＥＸ １４３５に由来する藻類株においてＣｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３のＬＰＡＡＴｘ酵素が活性であることを示唆している。中鎖脂肪酸レベルを増加させるＣｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３とは対照的に、ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘはＣ１６：０及びＣ１８：０レベルの増加をもたらす。これらの結果は、ＣｕＰＳＲ２３に由来する異なるＬＰＡＡＴ（ＬＰＡＡＴ２、ＬＰＡＡＴ３、及びＬＰＡＡＴｘ）が、全体的な脂肪酸レベルに対するそれらの効果により判断するとき、株Ｂにおいて異なる脂肪酸特異性を呈することを示している。
実施例４５：内因性微細藻類ＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが過剰発現する結果としての脂肪酸プロフィールの鎖長の減少
ここで、本発明者らは、ＵＴＥＸ１４３５におけるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ内因性チオエステラーゼＦＡＴＡ１の過剰発現が、細胞トリグリセリドＣ１８：０及びＣ１８：１アシル鎖の明確な減少とＣ１６：０、Ｃ１４：０の増加をもたらすことを示す。
Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＴＡ１遺伝子の過剰発現に使用した構築物（ｐＳＺ２４２２、ｐＳＺ２４２１）：Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ 株ＪにおいてＰｍＦＡＴＡ１を過剰発現させるため、コドン最適化ＰｍＦＡＴＡ１遺伝子を株Ｊに形質転換した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ遺伝子を選択可能なマーカーとして利用して、ショ糖培地上で成長する能力を付与した。株Ｊで発現した構築物ｐＳＺ２４２２は、６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ３’：ＰｍＡＭＴ３−Ｐｍ ＦＡＴＡ１（ｏｐｔ）−ＣｖＮＲ３’：：６ＳＢとして表すことができ、構築物ｐＳＺ２４２１は、６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ３’：ＰｍＡＭＴ３−Ｓ１０６ＳＡＤ ＴＰ−Ｐｍ ＦＡＴＡ１（ｏｐｔ）−ＣｖＮＲ３’：：６ＳＢとして表すことができる。
形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する。構築物ｐＳＺ２４２２における関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６ｓ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にする株Ｊ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子（ショ糖を代謝する株Ｊの能力を付与する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性ａｍｔ０３プロモーターが続く。ＰｍＦＡＴＡ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りの遺伝子は太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される株Ｊ ６Ｓゲノム領域が続く。
構築物ｐＳＺ２４２１における関連する制限部位はｐＳＺ２４２２と同じである。ｐＳＺ２４２１では、ＰｍＦＡＴＡ１は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドと融合し、このトランジットペプチドは、ＰｍＦＡＴＡ１のイニシエーターＡＴＧとＡｓｃ Ｉ部位との間に位置する。
ｐＳＺ２４２２に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列



内在性ＦＡＴＡ１遺伝子が株Ｊにおいて過剰発現したときの脂肪酸プロフィールに対する影響を決定するため、天然トランジットペプチドを含むＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＴＡ１、及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＳＡＤトランジットペプチドと融合したＰｍＦＡＴＡ１を両方ともにａｍｔ０３プロモーターにより駆動し、得られたプラスミドを独立に株Ｊに形質転換した。
一次形質転換体をクローン精製し、低窒素脂質産生条件下ｐＨ７．０で成長させた（いずれのプラスミドも、ｐＨ調節性ａｍｔ０３プロモーターにより駆動されるとき、ＰｍＦＡＴＡ１遺伝子発現の最大発現を可能にするためには、ｐＨ７．０での成長を必要とする）。ｐＳＺ２４２２及びｐＳＺ２４２１を株Ｊに形質転換することによって生じた代表的なクローンから得られたプロフィールを、以下の表に示す。
以下の表３６において、天然ＰｍＦＡＴＡ１が過剰発現することの影響は、Ｃ１８：１鎖長の明確な減少と、Ｃ１６：０、Ｃ１４：０の、及び場合によりＣ１８：０の増加である。プロセシングのタンパク質局在を考慮して、本発明者らはまた、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドと融合したＰｍＦＡＴＡ１も試みた。本発明者らがａｍｔ０３−天然ＰｍＦＡＴＡ１構築物で観察した結果と同様に、Ｃ１６：０及びＣ１４：０レベルは親株の株Ｊより大幅に高くなる。
従って、本発明者らは、微細藻類細胞の脂肪酸プロフィールにおけるパーセントミリスチン酸及びラウリン酸レベルを、Ｃ１８選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの過剰発現によって増加させることができると結論付ける。
実施例４６：ロールイン用ショートニングとしての使用に好適な細胞油
食用脂肪の栄養及び機能特性は、従来、特定の化学組成及び結晶化条件と結び付けられている。ある油供給源から別の供給源に切り替えることは、脂肪の融解挙動及び構造のいずれもが劇的に変化して機能性に有害な変化が及ぶため、通常は困難な課題である。ここ最近のことで、部分的に水素化した脂肪がパーム油及びパーム油画分に置き換えられた際の苦しい時期が思い起こされ得る。本発明者らは、化学組成が大きく異なる２つの脂肪の降伏応力、弾性率、多形、微細構造及び融解特性をどうすれば一致させることができるかを調べた。油Ａは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓプラスチド標的配列を含む外因性インベルターゼ及びＵｌｍｕｓ ａｍｅｒｉｃａｎａアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞から生成した。油Ｂは、外因性インベルターゼ及びＣｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞から生成した。油Ａは、６２％（ｗ／ｗ）超の中鎖脂肪酸、又はＭＣＴ（Ｃ８：０〜Ｃ１４：０）、２３％（Ｃ１６：０＋Ｃ１８：０）及び９％のＣ１８：１を含有した一方、油Ｂは、２％未満のＣ８：０〜Ｃ１４：０、５４％（Ｃ１６：０＋Ｃ１８：０）及び２９％のＣ１８：１を含有した。従って油Ａは中鎖トリグリセリドリッチな脂肪であり、一方、油Ｂはパーム油に似ていた。両方の油とも、２０℃で約４５％の固形脂肪含有量を有し、ＳＦＣ対温度プロフィールは極めて類似していた。ＤＳＣ（動的走査熱量測定）融解プロフィールは、約１２〜１３℃及び約２８〜３５℃を中心とする２つの主要なピークを示した。両方の脂肪とも、βプライム多形形態（Ｘ線回折によって決定するとき）であり、特有の特徴を備える非対称の細長いクリスタリット形態を呈した。油Ａ及び油Ｂの降伏応力及び貯蔵弾性率（Ｇ’）は、それぞれ５２０〜５５０Ｐａ、及び７×１０６Ｐａ〜１．８×１０７Ｐａであった。この範囲の降伏応力は十分な可塑性を示唆しており、これが高い貯蔵弾性率と組み合わさると、理想的なロールイン用ショートニングになる。従って、食品油の薄層形成の機能性を保持しながらもその化学組成を変えることが可能である。
本発明の上記の実施形態のいずれかの細胞及び方法と共に使用される他の好適な酵素としては、上記の説明において挙げたタンパク質の一つと少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するもの、及び対応する所望の酵素活性を呈するものが挙げられる。さらなる実施形態において、酵素活性は、上記の核酸配列（これらは全て、完全に示されたものとして本明細書によって参照により援用される）の一つと少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する配列に存在する。
実施例４７：ココアバター模倣物である調整微生物油からトリ飽和物を除去するための分画
精製、漂白及び脱臭された油を株Ｋ４から得た（実施例３５を参照）。油を７０℃に加熱し、毎分０．５℃で３６℃に冷却し、３６℃に１時間保った。次に約２．５ｍｌのサンプルを３６℃で１時間、４３００で遠心した。液体上清を回収し、リパーゼ及び質量分析法を用いて分析した。サンプルは、トリステアリン（ＳＳＳ）、ＳＳＰ、及びＰＰＳが欠乏していることが分かった。サンプルのトリアシルグリセロールはココアバターのトリアシルグリセロールと極めて類似していることが見出され、液体上清は、トリ飽和物の量が少ない点でさらにココアバターに近いものであった。さらなる分画実験を実施例６４に記載する。
実施例４８：ＫＡＳＩＩの過剰発現、一方のＳＡＤ対立遺伝子のノックアウト及び第２のＳＡＤ対立遺伝子の抑制による油産生細胞における高ステアリン酸トリグリセリド油の産生
油産生性の非光合成藻類であるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓは、栄養炭素供給が過剰な条件下で多量のトリアシルグリセリド油を蓄えるが、他の必須栄養素が制限されるため、細胞分裂は阻害される。最長Ｃ１８の炭素鎖長を有する脂肪酸のバルク生合成がプラスチドで起こる；次に脂肪酸が小胞体に輸送され、そこでＣ１８を越える伸長及びトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）への取り込みが（それが起こる場合には）起こると考えられている。脂質は脂肪体と呼ばれる大きい細胞質小器官に蓄えられ、環境条件が成長に有利に変化すると、直ちに動員され、同化代謝にエネルギー及び炭素分子を提供する。野生型Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ貯蔵脂質は、主に約６０％オレイン酸（Ｃ１８：１）、約２５〜３０％パルミチン酸（Ｃ１６：０）、及び約５〜８％リノール酸（Ｃ１８：２）から構成され、少量のステアリン酸（Ｃ１８：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、α−リノレン酸（Ｃ１８：３α）、及びパルミトレイン酸（Ｃ１６：１）を含む。この脂肪酸プロフィールは、内在性脂肪酸生合成経路の酵素の相対活性及び基質親和性によってもたらされる。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓは、分子遺伝学的ツールを使用した脂肪酸及び脂質生合成の操作を行い易く、脂肪酸プロフィールが野生型組成と極めて異なる油の産生を可能にする。本明細書では、最大５７％のステアリン酸を含み、且つパルミチン酸が７％もの低さである株を作成するため、本発明者らがステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）及びβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＫＡＳＩＩ）遺伝子の発現を改変した株について記載する。本発明者らは、ＦＡＴＡチオエステラーゼ及びＦＡＤ２脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子の発現の下方調節と併せた同様の改変を実施するとき、最大５５％のステアリン酸を含み、且つリノール酸が２．４％もの低さであるさらなる株を同定する。
可溶性ＳＡＤは、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）が結合したステアリン酸からオレイン酸（Ｃ１８：１ｃｉｓ−Δ９）への不飽和化を触媒するプラスチド局在性のジ鉄酵素である。これまでに、本発明者らは、ＳＡＤ１又はＳＡＤ２転写物を標的化するヘアピン構築物が細胞ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）機構を活性化し、ＳＡＤ活性を下方調節して、貯蔵脂質中のＣ１８：０レベルの上昇をもたらすことを確立している。ＳＡＤ活性はまた、貯蔵脂質生合成中に発現する主要なＳＡＤをコードするＳＡＤ２の２つの対立遺伝子のうちの一方を破壊する株において減少する。脂肪酸デサチュラーゼ２（ＦＡＤ２）遺伝子は、オレイン酸をリノール酸（Ｃ１８：２ｃｉｓ−Δ９、ｃｉｓ−Δ１２）に変換する小胞体膜結合性デサチュラーゼをコードする。ＦＡＤ２を標的化するヘアピンＲＮＡｉ構築物は、リノール酸レベルを１〜２％に低下させる。ＫＡＳＩＩは、マロニル−ＡＣＰとパルミトイル（Ｃ１６：０）−ＡＣＰとの縮合を特異的に触媒してβ−ケト−ステアロイル−ＡＣＰを形成させる脂肪酸シンターゼである。本発明者らは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおけるＫＡＳＩＩの過剰発現がＣ１６：０レベルの低下と、付随するＣ１８：１存在量の増加を引き起こすことを明らかにしている。以下の例において、本発明者らは、ＲＮＡｉを使用してＳＡＤ遺伝子発現を下方調節し、ＳＡＤ２遺伝子の対立遺伝子を破壊し、及びＫＡＳＩＩ脂肪酸シンターゼを過剰発現することにより、全脂肪酸の５０％を超えるステアリン酸の蓄積能を有するとともにＳＯＳを主要なＴＡＧ種として含む株が、本発明者らによって作成されることを示す。ＳＯＳレベルは、ＳＡＤ２及びＦＡＤ２の下方調節とＫＡＳＩＩ過剰発現とを組み合わせる株において最大４７％に増加した。
株ＪにおけるＳＡＤ２ノックアウト／ＲＮＡｉに使用される構築物：Ｓ１９２０においてＳＡＤ２−１対立遺伝子を破壊すると同時にＳＡＤ２ヘアピン構築物を発現させるため、ＤＮＡ構築物ｐＳＺ２２８２を作製した。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける発現用にコドンを最適化した、ショ糖インベルターゼをコードするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＵＣ２遺伝子を、形質転換の選択可能なマーカーとして利用した。形質転換ＤＮＡの配列は、このすぐ後に提供する。関連する制限部位は小文字の太字で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＡｓｃＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｖｒＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎＤＩＩＩ、及びＳａｃＩである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。構築物の５’及び３’フランクの下線の配列は、ＳＡＤ２−１遺伝子座における相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＵＣ２遺伝子（ショ糖加水分解活性をコードし、それによりショ糖上での株の成長を可能にする）の発現を駆動するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ＴＵＢ２プロモーターは、小文字の囲い文字のテキストにより示す。ＳＵＣ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子の３’ＵＴＲをスモールキャピタルにより示し、その後に、小文字テキストにより示されるスペーサー領域が続く。小文字の囲い文字のテキストにより示される第２のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ＴＵＢ２プロモーター配列は、ＳＡＤ２ヘアピンＣ配列の発現を駆動する。センス鎖及びアンチセンス鎖は大文字、太字のイタリックで示し、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Δ１２−脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ２）イントロン及び第２のエクソンの最初の１０塩基（大文字のイタリック）によって分けられる。第２のＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ ３’ＵＴＲをスモールキャピタルにより示す。
ｐＳＺ２２８２由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：


ＳＡＤ２ノックアウト／ノックダウン株の同定及び分析：ｐＳＺ２２８２に由来する構築物Ｄ１２８３を、株Ｊに形質転換した。一次形質転換体をクローン精製し、標準的な脂質産生条件下、ｐＨ５で成長させた。ｐＳＺ２２８２を株Ｊに形質転換することによって生じた代表的なクローンから得られた脂肪酸プロフィールを、以下の表３９に要約する。Ｄ１２８３形質転換体は、Ｃ１８：１を犠牲にして最大約４２％のＣ１８：０を蓄積したことから、これらの株でＳＡＤ活性が大幅に低下したことが示される。
表３９では、野生型レベルと比べて高いステアリン酸（Ｃ１８：０）レベルを太字テキストで強調している。
形質転換体Ｄ１２８３−４及び−７の脂肪酸プロフィールは、選択（ショ糖上での成長）の非存在下で３０代を超えて成長した後にも安定であることが決定された。次に振盪フラスコアッセイにおける選択された株のパフォーマンスを評価した。脂肪酸プロフィール及び脂質価を以下の表４０に提供する。株Ｘは株Ｊ親と比べて最高レベルのＣ１８：０（約４４％）、及び最良の脂質価（約２６％）を有し、従ってさらなる発酵展開用に選択した。
表４０では、野生型レベルと比べて高いステアリン酸（Ｃ１８：０）レベルを太字テキストで強調している。
本発明者らは、７Ｌ発酵における株Ｘのパフォーマンスを最適化し、振盪フラスコで達成される約４４％のＣ１８：０レベルに匹敵させ得ることを見出し、ここで脂質生産性は野生型親の約４５％であった。代表的な株Ｋ−４発酵の脂肪酸プロフィール及び脂質価を、以下の表４１に要約する。最適条件下での株Ｘの発酵によってほぼ４４％のＣ１８：０が得られ、これは、振盪フラスコアッセイで蓄積したステアリン酸レベルと同程度であった。株Ｘは、フラスコ及び７Ｌ規模の両方で高いＣ１８：０レベルを生じ、７Ｌ発酵で許容できる脂質生産性を有した；結果的に、Ｃ１８：０蓄積を増加させることを目的とするさらなる改変用の基本株として、この株を選択した。
表４１では、対照より高いステアリン酸（Ｃ１８：０）レベルを太字テキストで強調している。株Ｙは、６Ｓ遺伝子座に組み込まれた、ショ糖インベルターゼをコードするＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＵＣ２を含み、株Ｊ野生型親と区別がつかない脂肪酸プロフィールを有する。
株Ｋ−４におけるＫＡＳＩＩ過剰発現に使用した構築物：株Ｘにおいてコドン最適化Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ遺伝子を過剰発現させるため、ＤＮＡ構築物ｐＳＺ２７３４を作製した。アミノグリコシド抗生物質に対する耐性を付与するトランスポゾンＴｎ５由来のｎｅｏＲ遺伝子を、形質転換の選択可能なマーカーとして使用した。形質転換ＤＮＡの配列は、このすぐ後に提供する。関連する制限部位は小文字の太字で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｖｒＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＨｉｎＤＩＩＩ及びＳａｃＩである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。構築物の５’及び３’フランクの下線の配列は、６Ｓ遺伝子座における相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、ｎｅｏＲ（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ活性をコードし、それによりＧ４１８上での株の成長を可能にする）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ＴＵＢ２プロモーターを、小文字の囲い文字のテキストにより示す。ｎｅｏＲのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ遺伝子の３’ＵＴＲをスモールキャピタルにより示し、その後に、小文字テキストにより示されるスペーサー領域が続く。囲い文字のテキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＳＡＤ２−２プロモーター配列は、コドン最適化Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ遺伝子の発現を駆動する。ＫＡＳＩＩプラスチド標的配列をコードする領域を、大文字のイタリックにより示す。成熟Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩポリペプチドをコードする配列を、太字、大文字のイタリックで示し、一方３ｘＦＬＡＧエピトープコード配列は太字、下線、大文字のイタリックである。第２のＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ ３’ＵＴＲを、スモールキャピタルにより示す。


株ＸにおけるＫＡＳＩＩの過剰発現：ｐＳＺ２７３４に由来する構築物Ｄ１６４３を、先述のとおり株Ｘに形質転換した。一次形質転換体をクローン精製し、標準的な脂質産生条件下、ｐＨ５で成長させた。株ＸをＤ１６４３で形質転換することによって生じた代表的なクローンから得られた脂肪酸プロフィールを、以下の表４２に要約する。ＳＡＤ２ノックアウト／ノックダウン株Ｋ−４バックグラウンドにおけるＫＡＳＩＩの過剰発現により、５０％を超えるＣ１８：０を蓄積する、且つＣ１６：０のレベルが実質的に低下した複数の株が生じた。本発明者らはまた、飽和脂肪酸の不飽和脂肪酸に対する全体的な比がＫＡＳＩＩ過剰発現系は株Ｘと比較して小さいことも観察した。
表４２では、野生型レベルと比べて高いステアリン酸（Ｃ１８：０）レベルを太字テキストで強調している。株Ｘ又はＪより低いパルミチン酸（Ｃ１６：０）レベルを太字で強調している。３つの株について、飽和脂肪酸の不飽和脂肪酸に対する比は≦２：１である；これらを太字、イタリック体のテキストで強調している。
表４２に示す一次形質転換体から安定系を単離した。振盪フラスコ培養物の脂肪酸プロフィール及び脂質価を、以下の表４３に提供する。これらの株は最大５５％のＣ１８：０を蓄積し、Ｃ１６：０は７％もの低さであり、株Ｘ親と同等の脂質価であった。飽和物：不飽和物比は、株Ｘと比較して実質的に低下した。株ＡＵ及びＡＶを、３Ｌ高密度発酵における評価用に選択した。
表４３では、株Ｘは親株であり；株Ｊは野生型基本株である。野生型株より少なくとも２倍高いステアリン酸（Ｃ１８：０）レベルを太字で強調している。株Ｊ及び株Ｋ−４より低いパルミチン酸レベルを太字で強調している。太字のイタリックは、飽和物：不飽和物比が≦２：１であることを示している。
株ＡＵ及びＡＶの脂肪酸プロフィール及びパフォーマンス測定を、以下の表４４に詳述する。同じ発酵条件下で成長した親株Ｘの脂肪酸プロフィールを、比較のため提供する。ＫＡＳＩＩを過剰発現する株は、株Ｋ−４親より約１１％多いＣ１８：０を蓄積する。Ｃ１６：０は７〜９％に低下し、不飽和脂肪酸レベルは４〜５％増加する。株ＡＵ及びＡＶの脂質価はＫ−４と同等であったことから、ＫＡＳＩＩの過剰発現が脂質産生に対して有害な効果を有しなかったことが示される。
流加培養法を用いて発酵物を６日間培養した。発酵物１２０５８０Ｆ１の株Ｘ脂肪酸プロフィールを表４１に提供しており、株ＡＵ及びＡＶとの比較のため表４４に再掲する。全ての発酵を、３２℃、ｐＨ５、３０％溶存酸素（ＤＯ）、３００ｍＭ窒素［Ｎ］、及び５５７．５μＭ鉄で実施した。糖の供給源は７０％ショ糖（Ｓ７０）であった。野生型株より高いステアリン酸（Ｃ１８：０）レベルを太字で示す。野生型より低いパルミチン酸（Ｃ１６：０）レベルを太字で強調している。
上記に記載する振盪フラスコ及び発酵によって得られたバイオマスから、実験室規模の油を調製した。ＬＣ／ＭＳによりこれらの油のＴＡＧ組成を決定した。ＳＯＳは株ＡＵ及びＡＶの両方の主要なＴＡＧ種であり、振盪フラスコからのバイオマスの３３〜３５％の範囲であり、高密度発酵バイオマスの３７％に達する。主なパルミチン酸含有ＴＡＧは実質的に低下し、トリ飽和物レベルは株Ｘ油で観察されるものの半分未満である。これらの結果は、高ステアリン酸バックグラウンドにおけるＫＡＳＩＩの過剰発現がＳＯＳ蓄積を大幅に改善し、トリ飽和ＴＡＧの蓄積を低下させることを示している。
株ＪにおけるＦＡＴＡ−１破壊、ＫＡＳＩＩ過剰発現及びＦＡＤ２ ＲＮＡｉに使用した構築物：株ＪにおいてＦＡＴＡ−１対立遺伝子を破壊すると同時にＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩを過剰発現させ、且つＦＡＤ２ヘアピン構築物を発現させるため、ＤＮＡ構築物ｐＳＺ２４１９を作製した。ショ糖インベルターゼをコードするＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＵＣ２遺伝子の、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける発現用にコドンを最適化したバージョンを、形質転換の選択可能なマーカーとして利用した。形質転換ＤＮＡの配列は、このすぐ後に提供する。関連する制限部位は小文字の太字で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＡｓｃＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｖｒＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＨｉｎＤＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｅＩ、及びＸｈｏＩである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。構築物の５’及び３’フランクの下線の配列は、ＦＡＴＡ−１遺伝子座における相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＵＣ２遺伝子（ショ糖加水分解活性をコードし、それによりショ糖上での株の成長を可能にする）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ＴＵＢ２プロモーターを、小文字の囲い文字のテキストにより示す。ＳＵＣ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子の３’ＵＴＲをスモールキャピタルにより示し、その後に、小文字テキストにより示されるスペーサー領域が続く。小文字の囲い文字のテキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＡＭＴ３プロモーターは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ遺伝子の発現を駆動する。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＳＡＤ１由来のプラスチド標的ペプチドをコードする領域を、大文字のイタリックにより示す。成熟Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩポリペプチドをコードする配列を、太字、大文字のイタリックで示し、一方３ｘＦＬＡＧエピトープコード配列は太字、下線、大文字のイタリックである。第２のＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ ３’ＵＴＲを、スモールキャピタルにより示す。小文字の囲い文字のテキストにより示される第２のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ＴＵＢ２プロモーター配列は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ２ヘアピンＡ配列の発現を駆動する。センス鎖及びアンチセンス鎖は大文字、太字のイタリックで示し、ＦＡＤ２イントロン及び第２のエクソンの最初の１０塩基（大文字のイタリック）によって分けられる。第３のＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ ３’ＵＴＲをスモールキャピタルにより示し、その後に、小文字テキストにより示される第２のスペーサー領域が続く。
ｐＳＺ２４１９由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：



ＦＡＴＡ−１ノックアウト、ＫＡＳＩＩ過剰発現及びＦＡＤ２ ＲＮＡｉ株の同定及び分析：ｐＳＺ２４１９に由来する構築物Ｄ１３５８を、先述のとおり株Ｊに形質転換した。一次形質転換体をクローン精製し、標準的な脂質産生条件下、ｐＨ５で成長させた。株ＪをＤ１３５８で形質転換することによって生じた代表的なクローンから得られた脂肪酸プロフィールを、以下の表４５に要約する。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＡＭＴ３プロモーターはｐＨ５で抑制されるため、観察された表現型はＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩの過剰発現を反映しなかった。それにも関わらず、本発明者らは、複数の株が実質的に低いＣ１６：０レベル及びＣ１８：１の１０〜１５％の増加を有したことを観察しており、この構築物がＦＡＴＡ−１標的遺伝子を破壊し、内因性ＫＡＳＩＩによる伸長に利用可能なパルミトイル−ＡＣＰの量が増加したことが示唆される。１つの系Ｄ１３５８−１３を、さらなる分析用に選択した。Ｄ１３５８−１３は約１７％のＣ１６：０、約７５％のＣ１８：１及び２％未満のＣ１８：２を蓄積し、本発明者らがこの株でＦＡＴＡ−１における組み込み及びＦＡＤ２ Δ１２−デサチュラーゼの活性の下方調節に成功したことが示される。
表４５では、野生型レベルと比べて高いオレイン酸（Ｃ１８：１）レベルを太字テキストで強調している。野生型より低いパルミチン酸（Ｃ１６：０）レベルを太字テキストで強調している。株Ｊ親と比較して１％以上低下したリノール酸（Ｃ１８：２）のレベルを太字テキストで強調している。
形質転換体Ｄ１３５８−１３から得られた株の脂肪酸プロフィールは、選択（ショ糖上での成長）の非存在下で６０代を超えて成長した後にも安定であることが決定された。次に振盪フラスコアッセイにおける選択された株のパフォーマンスを評価した。脂肪酸プロフィール及び脂質価を以下の表４６に提供する。フラスコ実験をｐＨ７で実施し、ＫＡＳＩＩ導入遺伝子の発現を駆動するＰｍＡＭＴ３プロモーターの活性化を可能にした。ＫＡＳＩＩ過剰発現とＦＡＴＡ−１ノックアウトとの組み合わせは、ｐＨ５で観察された表現型（表４５）と比較してパルミチン酸レベルのさらなる低下及びオレイン酸蓄積の増進をもたらす。８２％より多いＣ１８：１、１１％未満のＣ１６：０、２％未満のＣ１８：２及び約８３％の野生型脂質価により、株ＡＡが、続くステアリン酸レベルを上昇させるための改変用の宿主株としてこのセットから供するのに最適な株であると決定された。ＤＮＡブロット分析から、Ｓ５００３がＦＡＴＡ−１遺伝子座に構築物Ｄ１３５８［ｐＳＺ２４１９］の単純な挿入を有することが示された。
表４６では、野生型レベルと比べて高いステアリン酸（Ｃ１８：１）レベルを太字テキストで強調している。野生型より低いパルミチン酸（Ｃ１６：０）レベルを太字テキストで強調している。野生型より低いリノール酸（Ｃ１８：２）レベルを太字テキストで示している。
株ＡＡにおけるＳＡＤ２ノックアウト／ＲＮＡｉに使用した構築物：Ｓ５００３においてＳＡＤ２−１対立遺伝子を破壊すると同時にＳＡＤ２ヘアピン構築物を発現させるため、２つのＤＮＡ構築物ｐＳＺ２２８３及びｐＳＺ２６９７を作製した。各構築物において、アミノグリコシド抗生物質に対する耐性を付与するトランスポゾンＴｎ５由来のｎｅｏＲ遺伝子を、形質転換の選択可能なマーカーとして使用した。ｐＳＺ２２８３に由来する形質転換ＤＮＡの配列を、この直後に提供する。関連する制限部位は小文字の太字で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｖｒＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎＤＩＩＩ、及びＳａｃＩである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。構築物の５’及び３’フランクの下線の配列は、ＳＡＤ２−１遺伝子座における相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、ｎｅｏＲ（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ活性をコードし、それによりＧ４１８上での株の成長を可能にする）の発現を駆動するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ＴＵＢ２プロモーターを、小文字の囲い文字のテキストにより示す。ｎｅｏＲのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ遺伝子の３’ＵＴＲをスモールキャピタルにより示し、その後に、小文字テキストにより示されるスペーサー領域が続く。小文字の囲い文字のテキストにより示される第２のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ＴＵＢ２プロモーター配列は、ＳＡＤ２ヘアピンＣ配列の発現を駆動する。センス鎖及びアンチセンス鎖は大文字、太字のイタリックで示し、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ２イントロン及び第２のエクソンの最初の１０塩基（大文字のイタリック）によって分けられる。第２のＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ ３’ＵＴＲを、スモールキャピタルにより示す。
ｐＳＺ２２８３由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：

ｐＳＺ２６９７に由来する形質転換ＤＮＡの配列を、この直後に提供する。関連する制限部位は小文字の太字で示し、５’−３’にそれぞれＮｓｉＩ、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎＤＩＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｖｒＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩである。構築物の５’及び３’フランクの下線の配列は、ＳＡＤ２−１遺伝子座における相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、ＳＡＤ２ヘアピンＣセンス鎖及びアンチセンス鎖は大文字、太字のイタリックで示し、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ２イントロン及び第２のエクソンの最初の１０塩基（大文字のイタリック）によって分けられる。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ遺伝子の３’ＵＴＲをスモールキャピタルにより示す。ｎｅｏＲ（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ活性をコードし、それによりＧ４１８上での株の成長を可能にする）の発現を駆動するＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）プロモーターを、小文字の囲い文字のテキストにより示す。ｎｅｏＲのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。第２のＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ ３’ＵＴＲをスモールキャピタルにより示し、その後に、小文字テキストにより示されるスペーサー領域が続く。
ｐＳＺ２６９７由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：


Ｓ５００３バックグラウンドにおけるＳＡＤ２ノックアウト／ノックダウン株の同定及び分析：ｐＳＺ２６９７に由来する構築物Ｄ１６３９、及びｐＳＺ２２８３に由来するＤ１６８２を、先述のとおり株ＡＡに形質転換した。一次形質転換体をクローン精製し、標準的な脂質産生条件下、ｐＨ７で成長させた。形質転換することによって生じた代表的なクローンから得られた脂肪酸プロフィールを、以下の表４７に要約する。Ｄ１６３９形質転換体は最大５６％のＣ１８：０を蓄積し、Ｄ１６８２形質転換体は最大約３５％のＣ１８：０を蓄積した。ステアリン酸の増加のほとんどはＣ１８：１を犠牲に得られたもので、これらの株においてＳＡＤ２ノックアウト／ＲＮＡｉ構築物によりＳＡＤ活性が大幅に低下したことが示される。Ｃ１６：０レベルは６％から１４％まで異なった；Ｃ１８：２は２〜５％の範囲であった。ほとんどの株は、株ＡＡ親の低いＣ１６：０及びＣ１８：２表現型を維持した。これらの脂肪酸プロフィールから、破壊されたＦＡＴＡ−１、ＫＡＳＩＩ過剰発現及びＦＡＤ２ ＲＮＡｉのバックグラウンドでノックアウト／ＲＮＡｉ構築物を使用してＳＡＤ２発現を下方調節すると、高Ｃ１８：０、低Ｃ１６：０及び低Ｃ１８：２の表現型の株が生じることが示される。これらの株は、高い安定性の高ステアリン酸、高オレイン酸の油、及びＳＯＳ含有量が高い油の生成に有用となり得る。
表４７では、野生型レベルと比べて高いステアリン酸（Ｃ１８：０）レベルを太字テキストで強調している。野生型より高いオレイン酸（Ｃ１８：１）レベルを太字テキストで示す。野生型レベル未満のパルミチン酸（Ｃ１６：０）レベルを太字で強調している。野生型と比較して低いレベルのリノール酸（Ｃ１８：２）を太字テキストで強調している。
数多くのＤ１６３９及びＤ１６８２形質転換体から安定系を単離した。振盪フラスコアッセイを実施して、Ｄ１６３９−５に由来する４つの系のパフォーマンスを評価した。バイオマスの脂肪酸プロフィール及び相対脂質価を、以下の表４８に示す。
表４８では、株ＡＡは親株であり；株Ｊは野生型基本株である。野生型株より高いステアリン酸（Ｃ１８：０）レベルを太字で示す。太字のテキストは、野生型と比較して増加した株ＡＡ中のオレイン酸（Ｃ１８：１）レベルを示す。野生型未満のパルミチン酸（Ｃ１６：０）レベルを太字で強調している。野生型未満のリノール酸（Ｃ１８：２）レベルを太字で示す。
株ＡＷ、株ＡＸ及び株ＡＹ振盪フラスコから収集したバイオマスから実験室規模の油を調製した。ＬＣ／ＭＳによりこれらの油のＴＡＧ組成を決定し、図２１に示す。これらの株においてＳＯＳ蓄積は４２〜４７％の範囲であった。ＰＯＳは、１６〜１７％で、次に最も豊富なＴＡＧであった。リノール酸を含有するＴＡＧは、上記に記載される株ＡＵ及び株ＡＶ油と比較して５０％超減少した。株ＡＷ、株ＡＸ及び株ＡＹ油は、株ＡＵ及び株ＡＸ油で蓄積された量と同程度の、１２〜１３％のトリ飽和ＴＡＧ（Ｓ−Ｓ−Ｓ）を含有した。油産生中のＳＡＤ活性を調節して飽和脂肪酸の過剰産生を防ぐことが、トリ飽和物の蓄積の低減に役立ち得る。
実施例４９：高オレイン酸微細藻類油のオレイン酸メチルの特性
高オレイン酸メチルのエステル化油は、機械類のクリーニング及び潤滑など、様々な用途に有用である。これらの用途の一部については、高い熱安定性が所望される。上記に記載したとおり従属栄養成長させた油産生微細藻類から調製した高オレイン酸及び高安定性−高オレイン酸トリグリセリド油から調製したメチル化油に対し、熱安定性試験を実施した。油はメチル化前に漂白及び脱臭した。市販の大豆メチルエステルを対照として使用した。
ＦａｔＡ１＿Ｂｔｕｂ：ｉｎｖ：ｎｒ：：ａｍｔ０３−ＣｗＴＥ２：ｎｒ＿ＦａｔＡ１として表すことのできるプラスミドで形質転換したＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの高油産生株から高オレイン酸（ＨＯ）油を調製した。このプラスミドは、ＦＡＴＡ１染色体部位で相同組換えして、それによりＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ染色体対立遺伝子を除去すると同時に、ｐＨ調節可能ａｍｔ３プロモーターの制御下でＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ由来の外因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＣｗＴＥ２、配列番号１１）を発現するように設計した。ＣｗＴＥ２遺伝子を油産生中にｐＨ５で培養することにより下方調節し、オレイン酸産生をさらに上昇させることができる。ショ糖インベルターゼもまた選択マーカーとして発現させて、単一炭素源としてのショ糖上での株の培養を可能にした。３’ＵＴＲ配列は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ遺伝子由来である。得られたＨＯ株はステインＱ（Ｓｔａｉｎ Ｑ）と命名される。株Ｑによって産生される油の脂肪酸プロフィールを、以下の表４９に掲載する。
高安定性−高オレイン酸油（ＨＳＡＯ）もまた、ＦＡＤｃ５’＿Ｂｔｕｂ：ｉｎｖ：ｎｒ：：ｂｔｕｂ−ＣｐＳＡＤ＿ＣｔＯＴＥ：ｎｒ＿ＦＡＤｃ３’と記載することのできるプラスミドで形質転換したＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの高油産生株から調製した。得られた株（株Ｒ）はショ糖インベルターゼを選択マーカーとして発現し、単一炭素源としてのショ糖上での培養を可能にする。加えて、ＦＡＤ対立遺伝子（オレイン酸からリノール酸への変換に関与する脂肪酸デサチュラーゼをコードする）が破壊され、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓのＳＡＤ遺伝子由来のトランジットペプチドと融合したオレイン酸特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ ＯＴＥ、実施例５を参照）がβチューブリンプロモーターの制御下で発現する。３’ＵＴＲ配列は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ遺伝子由来である。従属栄養培養後に株Ｒによって産生された油の脂肪酸プロフィールを、以下の表５０に掲載する。脂肪酸プロフィールは８５％超のオレイン酸を有するが、主要な多価不飽和物、リノール酸及びリノレン酸はほぼ一つも有しない。
ＨＯ及びＨＳＡＯ油を、公知のバイオディーゼル生成技術によってメチル化し、メチル−ＨＯ及びメチル−ＨＳＡＯエステルを作製した。次にこれらのメチルエステルを、以下の手順に従い熱試験に供した：
１．図１に示すとおり器具を準備する。
２．試験容器に１リットルの水を加え、ホットプレート上で沸騰させる．
３．各試験生成物に５０ｐｐｍコバルト（１００．０グラムのサンプル中０．０８３ｇの６％ナフテン酸コバルト（Ｃｏｂａｌｔ Ｎａｐｔｈｅｎａｔｅ））を加え、十分に混合する。
４．時計皿に７．０ｇの１００％綿ガーゼ（＃５０チーズクロス）を秤量する。
５．ステップ３で調製したとおりの試験生成物１４．０ｇをガーゼ上に均一に広げる。
６．＃１５栓の中心に貫通させて熱電対（温度計）を置く。熱電対の周りに綿を巻き付ける。
７．２４メッシュワイヤフレームシリンダの中に巻かれた綿を、それが上側４．５インチを占めるように置く。
８．ガーゼを巻き付けたシリンダを１Ｌトールビーカーの中に位置決めする。ビーカーを沸騰水中に固定し、時間に伴う温度増加の記録を開始する。
９．温度の観察を２時間、又は１０度の温度降下が観察されるまで続ける。
１０．温度対時間をグラフにプロットする。
１１．１時間で１００℃又は２時間で２００℃を超える温度を示すサンプルはいずれも、危険な酸化リスク又は自然発火する可能性があるリスクであると見なされなければならない。
結果：ＨＯ及びＨＳＡＯメチルエステルは、温度上昇から明らかなように、自己酸化を呈しなかった。対照の大豆メチルエステルサンプルは自己酸化の可能性を呈しなかった。時間−温度プロフィールを図１８に示す。
加えて、株Ｑによって産生される油のメチル化脂肪酸は、以下の特性を有することが分かった：
・１８２℃の引火点（ＡＳＴＭ Ｄ９３）
・非ＶＯＣ
・５３．５のカウリブタノール値（ＡＳＴＭ Ｄ１１３３）
・４．５７ｍｍ２／ｓの４０℃における粘度（ＡＳＴＭ Ｄ４４５）
・０．１７ｍｇ ＫＯＨ／ｇの酸価（ＡＳＴＭ Ｄ６６４）
・沸点範囲分布（ＡＳＴＭ Ｄ２８８７）３２５〜３６２℃。
実施例５０：高オレイン酸（ＨＯ）及び高安定性−高オレイン酸（ＨＳＡＯ）微細藻類油のさらなる特性
高オレイン酸油及び高安定性高オレイン酸藻類油は、図１９に示す特性又は計測パラメータについてこれらの値の±２０％を有し得る。
一つの実験では、ＨＳＡＯ微細藻類油は、０．５％フェニル−α−ナフチルアミン（ＰＡＮＡ）及び５００ｐｐｍパルミチン酸アスコルビル（ＡＰ）の抗酸化剤を伴い１１０°ＣにおけるＯＳＩにより計測（１３０℃データを使用して推定）したとき、５１２時間の安定性を示した。
実施例５１：パルミチン酸からパルミトレイン酸への変換による低飽和物油の産生
上記の例に記載されるとおり、微細藻類の遺伝子操作は、特にオレイン酸の産生を増加させることにより、飽和脂肪レベルを低下させることができる。しかしながら、ある場合には、油産生細胞で発現したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、望ましい量より多くのパルミチン酸を遊離する。ここで、本発明者らは、パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＰＡＤ）遺伝子を過剰発現させることによりパルミチン酸（１６：０）をパルミトレイン酸（１６：１）に変換する方法について記載する。ＰＡＤ遺伝子は、Ｍａｃｆａｄｙｅｎａ ｕｎｇｕｉｓ（キャッツクロー）、Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ（マカダミアナッツ）、Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ（シーバックソーン）などの天然の供給源から得るか、又は１６：１活性を有するようステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼを突然変異させてＰＡＤを作成することにより得ることができる。Ｍａｃｆａｄｙｅｎａ ｕｎｇｕｉｓデサチュラーゼ（ＭｕＰＡＤ）と命名される。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの高油産生株（株Ｚ）をＰＡＤ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ構築物で遺伝子銃により形質転換した。例えば、実施例６、３６、又は４９に記載される高オレイン酸株の一つは、外来性ＰＡＤ遺伝子をさらに含み得る。構築物は、選択可能なマーカーとしてのショ糖インベルターゼ、及び基質特異性をパルミチン酸の方にシフトさせるＬ１１８Ｗ突然変異を有するＭｕＰＡＤ又はＳＡＤ遺伝子のいずれか（例えば、Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＢ６７８４０．１）を含む。Ｃａｈｏｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｏｉｌ（１９９８）１１７：５９３−５９８を参照のこと。ａｍｔ３及びβチューブリン（Ｂｔｕｂ）プロモーターの両方が用いられる。加えて、植物ＰＡＤ遺伝子の天然トランジットペプチドを、微細藻類において有効であることが知られるもの（例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌａｒｉｓ ＳＡＤ遺伝子由来のトランジットペプチド）と取り換えることができる。
ＰＡＤ遺伝子は、ＦＡＴＡノックアウト若しくはノックダウン及び／又はＫＡＳＩＩノックインにより高オレイン酸油を産生するものを含め、様々な株で発現させることができる。場合により、これらの株はまた、ＦＡＤ（デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ）ノックアウト、ノックダウンによるか、又はＦＡＤ発現を調節可能なプロモーターの制御下に置き、ＦＡＤを下方調節する条件下で油を生成することにより、高安定性（低多価不飽和物）油を生成することもできる。加えて、ＰＡＤ遺伝子活性の導入に有用な基本株はまた、ＫＡＳＩＩノックアウト、及びＦＡＴＡノックインを有する株であって、それによりＣ１６：０パルミチン酸のレベルを上昇させる株も含み得る。
結果として、パルミチン酸がｃｉｓ−パルミトレイン酸及びｃｉｓ−バクセン酸に変換されるため、微細藻類油の脂肪酸プロフィールには、より低いレベルのパルミチン酸が見られる。ある場合には、飽和脂肪酸の全面積パーセントは３．５％、３％又は２．５％以下である。
Ｍａｃｆａｄｙｅｎａ ｕｎｇｕｉｓ Ｃ１６：０デサチュラーゼ（ＭｕＰＡＤ）の過剰発現用の構築物を以下に続ける：
１）ｐＳＺ３１４２： ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ３：ＣｐＳＡＤｔｐ：ＭｕＰＡＤ：ＣｖＮＲ：：６Ｓ
構築物ｐＳＺ３１４２ ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ３：ＣｐＳＡＤｔｐ：ＭｕＰＡＤ：ＣｖＮＲ：：６Ｓにおける関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６ｓ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にするゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子（ショ糖を代謝する株Ｚの能力を付与する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性ａｍｔ０３プロモーターが続く。ＭｕＰＡＤのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのコード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドは、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ Ｉ部位との間に位置する。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される６Ｓゲノム領域が続く。
ｐＳＺ３１４２に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：


２）ｐＳＺ３１４５： ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ３：ＭｕＰＡＤ：ＣｖＮＲ：：６Ｓ
構築物ｐＳＺ３１４５ ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ３：ＭｕＰＡＤ：ＣｖＮＲ：：６Ｓにおける関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６ｓ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にするゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子（ショ糖を代謝する株Ｚの能力を付与する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性ａｍｔ０３プロモーターが続く。ＭｕＰＡＤのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのコード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される６Ｓゲノム領域が続く。
ｐＳＺ３１４５に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：


３）ｐＳＺ３１３７： ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵＢ２：ＣｐＳＡＤｔｐ：ＭｕＰＡＤ：ＣｖＮＲ：：６Ｓ
構築物ｐＳＺ３１３７ ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵＢ２：ＣｐＳＡＤｔｐ：ＭｕＰＡＤ：ＣｖＮＲ：：６Ｓにおける関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６ｓ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にするゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子（ショ糖を代謝する株Ｚの能力を付与する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターが続く。ＭｕＰＡＤのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのコード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドは、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ Ｉ部位との間に位置する。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される６Ｓゲノム領域が続く。
ｐＳＺ３１３７に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：


実施例５２：Ｃｕｐｈｅａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓチオエステラーゼの過剰発現により生成されるミリスチン酸リッチ油
ここで、本発明者らは、ＵＴＥＸ１４３５におけるＣｕｐｈｅａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓチオエステラーゼ（Ｃｐａｌ ＦＡＴＢ２、寄託ＡＡＣ４９１８０）の過剰発現がＣ１４：０産生の大幅な増加（脂肪酸プロフィールの６０％超）をもたらすことを示す。
Ｃｐａｌ ＦＡＴＢ２遺伝子の過剰発現に使用した構築物は、本明細書に記載されるとおりＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける発現用にコドンを最適化した。Ｃｕｐｈｅａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＦＡＴＢ２はＣ１４選択的チオエステラーゼである。両方ともにＣｐａｌ ＦＡＴＢ２遺伝子をコードする２つの構築物を調製した。第１の構築物ｐＳＺ２４７９は、６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＥｘｔＡ−ＣｖＮＲ：：６ＳＢとして表すことができる。ＦａｔＢ２コード配列は配列番号８６として提供され、アミノ酸配列は配列番号８７として提供される。第２の構築物ｐＳＺ２４８０は、６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ＿ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＦＬＡＧ＿ＥｘｔＡ−ＣｖＮＲ：：６ＳＢとして表すことができる。核酸配列及びアミノ酸配列は配列番号８８及び配列番号８９として提供される。
ｐＳＺ２４８０で形質転換されたＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓは、高濃度のミリスチン酸を生成した。ミリスチン酸含有量は６５．７０パーセントであった。これは約１％のミリスチン酸含有量を有する基本株によって産生される野生型油のミリスチン酸含有量と比較すると、非常に大幅な増加である。
高ミリスチン酸株の脂肪酸プロフィールを、以下の表５１に示す。
実施例５３：エイコセン酸及びエルカ酸脂肪酸の生成
この例では、本発明者らは、Ｃｒａｍｂｌｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ（ＣａＦＡＥ、寄託番号ＡＹ７９３５４９）、Ｌｕｎａｒｉａ ａｎｎｕａ（ＬａＦＡＥ、ＡＣＪ６１７７７）、及びＣａｒｄａｍｉｎｅ ｇｒａｅｃａ（ＣｇＦＡＥ、ＡＣＪ６１７７８）由来の、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）としても知られる異種脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）遺伝子の発現が、ＵＴＥＸ １４３５の古典的突然変異誘発誘導体、株Ｚにおいてエイコセン酸（２０：１Δ１１）及びエルカ酸（２２：１Δ１３）などの極めて長鎖の一価不飽和脂肪酸の産生をもたらすことを示す。他方でＴｒｏｐａｅｏｌｕｍ ｍａｊｕｓ由来の推定ＦＡＥ遺伝子（ＴｍＦＡＥ、ＡＢＤ７７０９７）及びＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ由来の２つのＦＡＥ遺伝子（ＢｎＦＡＥ１、ＡＡＡ９６０５４及びＢｎＦＡＥ２、ＡＡＴ６５２０６）は、株Ｚにおいてエイコセン酸（２０：１Δ１１）の中程度の増加をもたらした一方、検出可能なエルカ酸を産生しなかった。興味深いことに、株ＺにおけるＢｎＦＡＥ１の異種発現で得られる不飽和脂肪酸プロフィールは、ドコサジエン酸（２２：２ｎ６）の顕著な増加をもたらした。全ての遺伝子は、ＵＴＥＸ １４３５コドン使用頻度を反映するようにコドンを最適化した。これらの結果は、ＣａＦＡＥ、ＬａＦＡＥ又はＣｇＦＡＥ遺伝子が、エイコセン酸及びエルカ酸含有量を向上させる特異な能力によって、一価不飽和及び飽和アシル基質を利用する超長鎖の生合成に関与する縮合酵素をコードすることを示唆している。
Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５株の株Ｚ）におけるＣｒａｍｂｌｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ脂肪酸エロンガーゼ（ＣａＦＡＥ）の発現に使用される構築物−［ｐＳＺ３０７０］：この例では、構築物ｐＳＺ３０７０で形質転換された株、株Ｚを作成し、これはショ糖インベルターゼ（ショ糖を含有する培地上でのその選択及び成長を可能にする）及びＣ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ ＦＡＥ遺伝子を発現する。株Ｚにおける発現のため導入された構築物ｐＳＺ３０７０は、６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−Ｃｖｎｒ：ＰｍＡｍｔ０３−ＣａＦＡＥ−Ｃｖｎｒ：：６Ｓとして表すことができる。
形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する。構築物における関連する制限部位を小文字の太字で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、相同組換えによる６Ｓ遺伝子座での標的化した組み込みを可能にする株Ｚ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＵＣ２遺伝子（ショ糖加水分解活性をコードし、それによりショ糖上での株の成長を可能にする）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターを、小文字の囲い文字のテキストにより示す。ＳＵＣ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字のイタリックにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内在性ＡＭＴ３プロモーターが続く。ＣａＦＡＥのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りの遺伝子は太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される株Ｚ ６Ｓゲノム領域が続く。正しいリーディングフレーム及び標的配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
プラスミドｐＳＺ３０７０に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：


株Ｚにおける高等植物由来のＦＡＥ遺伝子の発現に使用される構築物：ＣａＦＡＥ遺伝子（ｐＳＺ３０７０）に加え、Ｌｕｎａｒｉａ ａｎｎｕａ由来のＬａＦＡＥ（ｐＳＺ３０７１）、Ｃａｒｄａｍｉｎｅ ｇｒａｅｃａ由来のＣｇＦＡＥ（ｐＳＺ３０７２）、Ｔｒｏｐａｅｏｌｕｍ ｍａｊｕｓ ＴｍＦＡＥ（ｐＳＺ３０６７）及びＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ由来のＢｎＦＡＥ１（ｐＳＺ３０６８）及びＢｎＦＡＥ２（ｐＳＺ３０６９）遺伝子を、株Ｚにおける発現のため構築した。これらの構築物は以下のとおり表すことができる：
ｐＳＺ３０７１− ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−Ｃｖｎｒ：ＰｍＡｍｔ０３−ＬａＦＡＥ−Ｃｖｎｒ：：６Ｓ
ｐＳＺ３０７２− ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−Ｃｖｎｒ：ＰｍＡｍｔ０３−ＣｇＦＡＥ−Ｃｖｎｒ：：６Ｓ
ｐＳＺ３０６７− ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−Ｃｖｎｒ：ＰｍＡｍｔ０３−ＴｍＦＡＥ−Ｃｖｎｒ：：６Ｓ
ｐＳＺ３０６８− ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−Ｃｖｎｒ：ＰｍＡｍｔ０３−ＢｎＦＡＥ１−Ｃｖｎｒ：：６Ｓ
ｐＳＺ３０６９− ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−Ｃｖｎｒ：ＰｍＡｍｔ０３−ＢｎＦＡＥ２−Ｃｖｎｒ：：６Ｓ
これらの構築物は全て、ｐＳＺ３０７０と同じベクター骨格、すなわち選択可能なマーカー、プロモーター、及び３’ｕｔｒを有し、それぞれのＦＡＥ遺伝子のみが異なる。これらの構築物における関連する制限部位もまた、ｐＳＺ３０７０と同じである。ＬａＦＡＥ、ＣｇＦＡＥ、ＴｍＦＡＥ、ＢｎＦＡＥ１及びＢｎＦＡＥ２の配列を以下に示す。ＳｐｅＩ及びＡｆｌＩＩを含む太字テキストのとおりの関連する制限部位を、それぞれ５’−３’で示す。
ｐＳＺ３０７１に含まれるＬａＦＡＥのヌクレオチド配列：
ｐＳＺ３０７２に含まれるＣｇＦＡＥのヌクレオチド配列：
ｐＳＺ３０６７に含まれるＴｍＦＡＥのヌクレオチド配列：
ｐＳＺ３０６８に含まれるＢｎＦＡＥ１のヌクレオチド配列：
ｐＳＺ３０６９に含まれるＢｎＦＡＥ２のヌクレオチド配列：
脂肪酸プロフィールに対するその影響を決定するため、ＰｍＡＭＴ３プロモーターにより駆動される、様々な異種ＦＡＥ遺伝子を含む上記の構築物を、独立して株Ｚに形質転換した。
一次形質転換体をクローン精製し、低窒素脂質産生条件下、ｐＨ７．０で成長させた（いずれのプラスミドも、ｐＨ調節性ＰｍＡＭＴ０３プロモーターにより駆動されるとき、ＦＡＥ遺伝子発現の最大発現を可能にするためにはｐＨ７．０での成長を必要とする）。ｐＳＺ３０７０、ｐＳＺ３０７１、ｐＳＺ３０７２、ｐＳＺ３０６７、ｐＳＺ３０６８及びｐＳＺ３０６９によって株Ｚに形質転換することにより生じる一組の代表的なクローンから得られたプロフィールを、それぞれ以下の表５２〜表５７に示す。
異種ＦＡＥ遺伝子を発現するトランスジェニック株Ｚの株全てが、Ｃ２０：１及びＣ２２：１脂肪酸の蓄積増加を示す（表５２〜表５７を参照のこと）。野生型と比べたエイコセン酸（２０：１Δ１１）及びエルカ酸（２２：１Δ１３）のレベル増加は、一貫して野生型のレベルより高い。加えて、株ＺにおけるＢｎＦＡＥ１の異種発現で得られた不飽和脂肪酸プロフィールは、ドコサジエン酸（Ｃ２２：２ｎ６）の顕著な増加をもたらした。株Ｚで発現した前述のＦＡＥのタンパク質アラインメントを図２３に示す。
実施例５４：異種デサチュラーゼ遺伝子を発現することによる全不飽和脂肪酸レベルの上昇
「ゼロ飽和脂肪（ｚｅｒｏ ＳＡＴ ＦＡＴ）」（例えば、９７％以上の全不飽和脂肪酸目標／３％以下の飽和脂肪）株の生成手法の一つは、株Ｎ（本発明者らは、これが複数回の発酵ランにおいて全不飽和物約９３％で約８５％のＣ１８：１を産生することを見出している）などの高オレイン酸株でデサチュラーゼ遺伝子を発現させることである。本発明者らは、株Ｎでデサチュラーゼ遺伝子を発現させることにより、全飽和物がさらに減少するかどうかについて調べた。
以下の例では、本発明者らは、Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ、及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ由来のデサチュラーゼを含めた異種ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子の過剰発現により、野生型株ＵＴＥＸ１４３５においてステアリン酸及びパルミチン酸レベルを減少させる能力を示す。
Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼの発現に使用される構築物：Ｏ．ｅｕｒｏｐａｅａステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（寄託番号ＡＡＢ６７８４０．１）をＵＴＥＸ１４３５、株Ａに導入するため、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ遺伝子を選択可能なマーカーとして利用して、ショ糖培地上で成長する能力を付与した。ＵＴＥＸ１４３５、株Ａで発現した構築物は、６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵＢ２：ＣｐＳＡＤｔｐ：ＯｅＳＡＤ：ＣｖＮＲ：：６ＳＢとして表すことができ、ｐＳＺ１３７７と命名される。
構築物ｐＳＺ１３７７における関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６ｓ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にするゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示される、ＯｅＳＡＤの発現を駆動する第２のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターが続く。ＯｅＳＡＤのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼコード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドは、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ Ｉ部位との間に位置する。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される６Ｓゲノム領域が続く。
ｐＳＺ １３７７に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：


Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼの発現に使用される構築物：Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（寄託番号ＡＡＡ７４６９２．１）をＵＴＥＸ１４３５、株Ａに導入するため、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ遺伝子を選択可能なマーカーとして利用して、ショ糖培地上で成長する能力を付与した。ＵＴＥＸ１４３５、株Ａで発現した構築物は、６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ０３：ＣｐＳＡＤｔｐ：ＲｃＳＡＤ：ＣｖＮＲ：：６ＳＢとして表すことができ、ｐＳＺ１４５４と命名される。
構築物ｐＳＺ１４５４における関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６ｓ核染色体座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にするゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示される、ＲｃＳＡＤの発現を駆動する内在性ＡＭＴ０３プロモーターが続く。ＲｃＳＡＤのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼコード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドは、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ Ｉ部位との間に位置する。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される６Ｓゲノム領域が続く。
ｐＳＺ１４５４に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：



Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼの発現に使用される構築物：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼをＵＴＥＸ１４３５、株Ｚに導入するため、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ遺伝子を選択可能なマーカーとして利用して、ショ糖培地上で成長する能力を付与した。ＵＴＥＸ１４３５、株Ｚで発現した構築物は、６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ０３：ＣｐＳＡＤ１：ＣｖＮＲ：：６ＳＢとして表すことができ、ｐＳＺ３１４４と命名される。
構築物ｐＳＺ３１４４における関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６ｓ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にするゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示される、ＣｐＳＡＤ１の発現を駆動する内在性ＡＭＴ０３プロモーターが続く。ＣｐＳＡＤ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼコード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される６Ｓゲノム領域が続く。
ｐＳＺ３１４４に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：


一次形質転換体をクローン精製し、低窒素脂質産生条件下、デサチュラーゼ遺伝子の発現を駆動するプロモーターに応じてｐＨ５．０又はｐＨ７．０のいずれかで成長させた。プロモーターの性質、及びＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓがｐＨ５．０でより多くの脂質を生成するという事実から、ｐＳＺ１３７７（Ｄ５８３）で形質転換することにより生じたトランスジェニック系はｐＨ５．０の（低窒素）脂質産生培地でアッセイした。ｐＳＺ１４５４（Ｄ６４８）及びｐＳＺ３１４４（Ｄ１９２３）の形質転換により生成されたトランスジェニック系は、ｐＨ調節性ＰｍＡＭＴ３プロモーターにより駆動するとき最大デサチュラーゼ遺伝子発現が可能となるようにｐＨ７．０でアッセイする。Ｄ５８３、Ｄ６４８、及びＤ１９２３による形質転換によって生じた代表的なクローンから得られたプロフィールを、それぞれ以下の表５８、５９及び６０に示す。ＯｅＳＡＤ及びＣｐＳＡＤ１遺伝子の発現の結果は、Ｃ１８：０鎖長の明確な減少と、それに伴うＣ１８：１の増加である。また、本発明者らはＣ１６：１レベルに僅かな増加があることを認めたことから、これらのステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼが幅広い特異性を有し得ることが示される。ＲｃＳＡＤ遺伝子の発現により生じた形質転換体もまたＣ１８：０レベルを低下させ、Ｃ１６：１レベルを上昇させる。特に、Ｃ１６：１は、１％未満から１．５％超又は２％超に増加し得る。しかしながら、Ｃ１８：１脂肪酸レベルの降下及びＣ１８：２レベル上昇もまたあり、これはこれらのトランスジェニック系の成長不良により引き起こされ得る。
実施例５５：突然変異（Ｌ１１８Ｗ）ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼを導入することによるパルミトレイン酸の生成
低総飽和物（ゼロＳＡＴ脂肪）株を作成するため、本発明者らは、推定ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）及びパルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＰＡＤ）遺伝子の両方をＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓに導入している。本発明者らは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＳＡＤ２−１及びＯｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ ＳＡＤにおける単一アミノ酸置換（Ｌ１１８Ｗ）が、細胞によって産生されるトリグリセリド中のパルミチン酸部分の不飽和化の増加をもたらしたことを見出した。得られたトランスジェニック系においては、５％を超えるパルミトレイン酸の脂肪酸プロフィールを有する油が産生された。従って、これらの突然変異ＳＡＤは、総飽和物を低下させる方法としてパルミトレイン酸を上昇させること、又はパルミトレイン酸含有油を得ることにおいて極めて有用であり得た。２、３、４、及び５面積％を超えるパルミトレイン酸を有する油が得られた。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ遺伝子（寄託番号ＮＰ ０１２１０４）を選択可能なマーカーとして利用して、以前記載された遺伝子銃による形質転換方法を用いる相同組換えによってＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼＰｍＳＡＤ２−１（Ｌ１１８Ｗ）及びＯｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼＯｅＳＡＤ（Ｌ１１８Ｗ）をＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株Ｚの６Ｓ核染色体座に導入した。
本発明者らが株Ｚの形質転換に使用した構築物は、以下のとおり表すことができる。
１） ６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＵＡＰＡ１： ＰｍＳＡＤ２−１（Ｌ１１８Ｗ）−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ （ｐＳＺ３３０５， Ｄ２０６６）
２） ６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵＢ２： ＰｍＳＡＤ２−１（Ｌ１１８Ｗ）−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ （ｐＳＺ３２９９， Ｄ２０６０）
３） ６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵＢ２：ＣｐＳＡＤｔｐ−ＯｅＳＡＤ （Ｌ１１８Ｗ）−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ （ｐＳＺ３２９８， Ｄ２０５９）
−−構築物ｐＳＺ３３０５： ６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＵＡＰＡ１：ＰｍＳＡＤ２−１（Ｌ１１８Ｗ）−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ ｐＳＺ３３０５形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する。ｐＳＺ３３０５ ６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＵＡＰＡ１：ＰｍＳＡＤ２−１（Ｌ１１８Ｗ）−ＣｖＮＲ：：６ＳＢにおける関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６Ｓ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にする６ＳＡゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＡＰＡ１プロモーターが続く。ＰｍＳＡＤ２−１（Ｌ１１８Ｗ）のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのコード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される６ＳＢゲノム領域が続く。
ｐＳＺ３３０５に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：


−−構築物ｐＳＺ３２９９： ６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵＢ２：ＰｍＳＡＤ２−１（Ｌ１１８Ｗ）−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ ｐＳＺ３２９９形質転換ＤＮＡの配列は配列５６−２に提供される。ｐＳＺ３２９９ ６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵＢ２：ＰｍＳＡＤ２−１（Ｌ１１８Ｗ）−ＣｖＮＲ：：６ＳＢにおける関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、ＸｂａＩ、Ｍｆｅ Ｉ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６Ｓ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にする６ＳＡゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターが続く。ＰｍＳＡＤ２−１（Ｌ１１８Ｗ）のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのコード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される６ＳＢゲノム領域が続く。
ｐＳＺ３２９９に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：


−−構築物ｐＳＺ３２９８： ６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵＢ２：ＣｐＳＡＤｔｐ−ＯｅＳＡＤ（Ｌ１１８Ｗ）−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ ｐＳＺ３２９９形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する。構築物ｐＳＺ３２９８ ６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵＢ２：ＣｐＳＡＤｔｐ−ＯｅＳＡＤ（Ｌ１１８Ｗ）−ＣｖＮＲ：：６ＳＢにおける関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、ＸｂａＩ、Ｍｆｅ Ｉ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６Ｓ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にする６ＳＡゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターが続く。ＯｅＳＡＤ（Ｌ１１８Ｗ）のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのコード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドは、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ Ｉ部位との間に位置する。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される６ＳＢゲノム領域が続く。
ｐＳＺ３２９８に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：


一次形質転換体をクローン精製し、低窒素脂質産生条件下、ｐＨ５．０で成長させた。ｐＳＺ３３０５、ｐＳＺ３２９９及びｐＳＺ３２９８を株Ｚに形質転換することによって生じる代表的なクローンから得られたプロフィールを、それぞれ表６１〜表６３に示す。従って、かかる突然変異又は遺伝子を導入すると、組換え微細藻類によって産生される油の脂肪酸プロフィール中のパルミトレイン酸レベルを増加させ、且つ飽和レベルを低下させることができる。少なくとも０．１、０．１５、及び０．１８のＣ１６：１／Ｃ１６：０比の油が得られた。
実施例５６：ＦＡＴＡの下方調節及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓケト−アシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＰＭＫＡＳＩＩ）遺伝子の過剰発現
内在性ＦＡＴＡ１遺伝子の下方調節を内在性ＫＡＳＩＩ遺伝子の過剰発現と組み合わせてトランスジェニックＰ．Ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ系を作成した。得られた株は、オレイン酸が高濃度化したトリグリセリドリッチの油を産生した。
以下の例では、本発明者らは、先行研究のフォローアップにより、内在性ＦＡＴＡ１（単一のＦＡＴＡ対立遺伝子）の下方調節及び内在性ＫＡＳＩＩ活性の過剰発現などの分子遺伝学的手法を利用して藻類におけるトリアシルグリセロールのオレイン酸（Ｃ１８：１）レベルを大幅に高濃度化し得ることを実証している。この例では、本発明者らは、これらの手法を単一のトランスジェニック系に組み合わせる試みに注力する。ＦＡＴＡ１対立遺伝子の単一コピーを破壊すると同時にＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ遺伝子（ＰｍＫＡＳＩＩ）を過剰発現する構築物を、高オレイン酸Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株ＡＯに導入した。株ＡＯは、古典的突然変異誘発技法を用いてＵＴＥＸ １４３５から誘導された高１８：１産生突然変異体から誘導された。株ＡＰと命名される得られた株の一つは、複数回の発酵ランで、８５％のＣ１８：１を有して総不飽和物が約９３％である脂肪酸プロフィールを有する油を産生した。株ＡＰはまた、高い脂質生産性も有した。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ遺伝子（寄託番号ＮＰ ０１２１０４）を選択可能なマーカーとして利用して、遺伝子銃による形質転換を用いる相同組換えによってＰｍＫＡＳＩＩをＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株ＡＯのＦＡＴＡ１核染色体座に導入した。種々のプロモーターで駆動したときのＫＡＳＩＩ活性を調べるため、ＰｍＫＡＳＩＩをいくつかのプロモーターと融合した：ＰｍＵＡＰＡ１、ＰｍＬＤＨ１、及びＰｍＡＭＴ３。組み込み構築物は全てＦＡＴＡ１遺伝子と逆向きで設計されることに留意されたい；これにより安定したインベルターゼ発現となる可能性が高まることが分かった。従って、株ＡＨで発現させた構築物は、以下のとおり表すことができる。
１） ＦＡＴＡ１ ３’：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＵＡＰＡ１：ＰｍＫＡＳＩＩ−ＣｖＮＲ：：ＦＡＴＡ１ ５’ （ｐＳＺ２５３３）
２） ＦＡＴＡ１ ３’：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＬＤＨ１：ＰｍＫＡＳＩＩ−ＣｖＮＲ：：ＦＡＴＡ１ ５’ （ｐＳＺ２５３２）
３） ＦＡＴＡ１ ３’：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ３：ＰｍＫＡＳＩＩ−ＣｖＮＲ：：ＦＡＴＡ１ ５’ （ｐＳＺ２７５０）
株ＡＰは、ｐＳＺ２５３３から作成される形質転換体の一つである。構築物ｐＳＺ２５３３ ＦＡＴＡ１３’：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＵＡＰＡ１：ＰｍＫＡＳＩＩ−ＣｖＮＲ：：ＦＡＴＡ１ ５’における関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、ＦＡＴＡ１遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にするＦＡＴＡ１ ３’ゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＡＰＡ１プロモーターが続く。ＰｍＫＡＳＩＩのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのコード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドは、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ Ｉ部位との間に位置する。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＦＡＴＡ１ ５’ゲノム領域が続く。
ｐＳＺ２５３３に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：



構築物ｐＳＺ２５３３に加えて、本発明者らはまた、ＫＡＳＩＩ遺伝子が、ＰｍＬＤＨ１、及びＰｍＡＭＴ３を含む他のプロモーターによって駆動されるときのＰｍＫＡＳＩＩ活性も調べた。プラスミドｐＳＺ２５３２はＦＡＴＡ１ ３’：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＬＤＨ１：ＰｍＫＡＳＩＩ−ＣｖＮＲ：：ＦＡＴＡ１ ５’として表すことができ、一方、プラスミドｐＳＺ２７５０はＦＡＴＡ１ ３’：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ３：ＰｍＫＡＳＩＩ−ＣｖＮＲ：：ＦＡＴＡ１ ５’として表すことができる。これらの２つのプラスミドの配列は、ＰｍＫＡＳＩＩを駆動するプロモーターを除きｐＳＺ２５３３と同じであるため、以下の配列はＰｍＬＤＨ１及びＰｍＡＭＴ３プロモーターの配列のみを示す。
ｐＳＺ２５３２におけるＰｍＫＡＳＩＩの発現を駆動するＰｍＬＤＨ１プロモーターのヌクレオチド配列：
ｐＳＺ２７５０におけるＰｍＫＡＳＩＩの発現を駆動するＰｍＡＭＴ３プロモーターのヌクレオチド配列：
一次形質転換体をクローン精製し、低窒素脂質産生条件下、ＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子の発現を駆動するプロモーターに応じてｐＨ５．０又はｐＨ７．０のいずれかで成長させた。ｐＳＺ２５３３（Ｄ１６３６）及びｐＳＺ２５３２（Ｄ１６３７）での形質転換により生じるトランスジェニック系は、プロモーターの性質及びＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓがｐＨ５．０でより多くの脂質を産生するという事実のため、ｐＨ５．０の脂質産生培地でアッセイした。ｐＳＺ２７５０（Ｄ１６８４）の形質転換により作成されたトランスジェニック系はｐＨ７．０でアッセイし、ｐＨを調節したＰｍＡＭＴ３プロモーターによって駆動されるときの最大のＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子発現を可能にした。Ｄ１６３６（ｐＳＺ２５３３）、Ｄ１６３７（ｐＳＺ２５３２）、及びＤ１６８４（ｐＳＺ２７５０）での形質転換により生じた代表的なクローンから得られたプロフィールを、それぞれ表６４〜表６６に示す。
ＦＡＴＡ１ノックアウト及び同時のＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ遺伝子の過剰発現の影響は、Ｃ１８：１の大幅な増加を伴うＣ１６：０鎖長の明確な減少であった。ｐＨ５．０では、ＰｍＵＡＰＡ１はＰｍＬＤＨ１より強力であるように見え、Ｄ１６３６形質転換体におけるパルミチン酸レベルは３％に近く、一方、Ｄ１６３７における形質転換体はいずれも同じ条件で７％を下回ることはない。
実施例５７：高オレイン酸高安定性（ＨＯＨＳ）油産生株の作成
実施例５６の株ＡＰは、約８５％オレイン酸で総不飽和物が約９３％の油を産生する。ここで本発明者らは、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼをノックダウンして油産生細胞におけるリノール酸産生を低減することにより、高オレイン酸油の酸化安定性を改良し得ることを示す。
本発明者らは、内在性ＦＡＤ遺伝子ＰｍＦＡＤ２を標的化する株ＡＰにおいてヘアピン−ＲＮＡ産生構築物を発現させた。得られた株は、株ＡＱを含め、発酵槽において＞９０％のＣ１８：１及び＜１％のＣ１８：２を産生する。最も重要なことには、株ＡＱは、その親株の株ＡＰと同じレベルの脂質生産性及びショ糖加水分解能力を維持する。
高オレイン酸高安定性油産生株ＡＱ：ＰｍＦＡＤ２の下方調節に使用される構築物の作成。高い酸化安定性の油を産生する株を作成するため、ＡＰにヘアピンＰｍＦＡＤ２を導入してＰｍＦＡＤ２発現を下方調節した。株ＡＱは、ｐＳＺ３３７２ ＤＮＡ（６ＳＡ：：ＰｍＨＸＴ１：ＳｃａｒＭＥＬ１：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵＢ２：ヘアピンＰｍＦＡＤ２：ＣｖＮＲ：：６ＳＢ）を株ＡＰに形質転換することによって作成される安定系である。この構築物では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＭＥＬ１遺伝子を選択可能なマーカーとして利用して、以前記載された形質転換方法（遺伝子銃）を用いる相同組換えによってヘアピンＰｍＦＡＤ２をＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株ＡＱの６Ｓ核染色体座に導入した。
ｐＳＺ３３７２形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する。ｐＳＺ３３７２における関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、ＳｐｅＩ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６Ｓ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にする６ＳＡゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＭＥＬ１遺伝子の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＨＸＴ１プロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃａｒＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターが続く。ヘアピンＰｍＦＡＤ２カセットは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ２エクソン１（イタリックの下線テキストにより示される）、ＰｍＦＡＤ２のイントロン（イタリックの小文字テキスト）と、続いて逆位ＰｍＦＡＤ２エクソン１（イタリックの下線テキストにより示される）を含む。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される６ＳＢゲノム領域が続く。
ｐＳＺ３３７２に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：


本発明者らは、ヘアピンＰｍＦＡＤ２構築物を株ＡＰに導入した。ｐＳＺ３３７２での形質転換により生じたトランスジェニック系（Ｄ２０８２）をｐＨ５．０の脂質産生培地でアッセイした。代表的なクローンから得られたプロフィールを表６７に示す。本発明者らがスクリーニングし終えていた４００個を超える形質転換体の中で、初期プロフィールスクリーニングにおいて＜１％のＣ１８：２を産生した形質転換体Ｄ２０８２．１から株ＡＱを分離した。従って、この株は、オレイン酸が高いとともに多価不飽和物が低いトリグリセリド油の生成に使用することができる。多価不飽和物レベルが低いため、この油は、ＡＯＣＳ Ｃｄ １２ｂ−９２法によって試験したとき高い酸化安定性を有するものと予想される（本特許出願の第ＩＶ節及び対応する実施例を参照のこと）。
実施例５８：Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＰＭ）ＦＡＤ２及びＦＡＴＡ遺伝子のノックアウト並びにＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子の過剰発現による高オレイン酸「ゼロ」リノール酸株の作成
微細藻類のトリアシルグリセロールは、内在性ＦＡＴＡ１及びＦＡＤｃ遺伝子の下方調節並びに内在性ＫＡＳＩＩ活性の過剰発現などの分子遺伝学的手法を利用してオレイン酸（Ｃ１８：１）のレベルを大幅に高濃度化することができる。この例では、本発明者らは、これらの手法を単一のトランスジェニック系に組み合わせる試みに注力する。ＦＡＴＡ１対立遺伝子の単一コピーを破壊すると同時にＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ遺伝子を過剰発現する構築物を、株Ｒ及び株Ｄと命名される種々のΔｆａｄ２系に導入した（図２４の系統図を参照）。得られた株、例えば株ＡＳ及び株ＡＺは、＜０．０５％のＣ１８：２で約９０％のＣ１８：１を産生する。
株Ｄ及び株Ｒは、０％のＣ１８：２、及びそれぞれ振盪フラスコで成長するか、それとも高細胞密度発酵で成長するかに応じて７６％〜８７％のＣ１８：１を含む油を産生するΔｆａｄ２系である。株Ｄ及び株Ｒのオレイン酸レベルをさらに上昇させるため、ＦＡＴＡ１対立遺伝子の単一コピーを破壊すると同時にＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳ ＩＩ遺伝子を過剰発現する構築物をパーティクルボンバードメントによって株Ｄ／株Ｒに導入した。
Ｓ２５３０バックグラウンドでＦＡＴＡ遺伝子をノックアウトし且つＰｍＫＡＳＩＩを過剰発現させる構築物。構築物ＦＡＴＡ１：：ＣｐＡＣＴ−ＡｔＴｈｉｃ−ｎｒ：ＡＭＴ０３−Ｓ１０６ＳＡＤ−ＰｍＫＡＳＩＩ−ｎｒ：：ＦＡＴＡ１（ｐＳＺ２２７６と命名される）における関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、ＦＡＴＡ１遺伝子での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にするＵＴＥＸ１４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＴＨＩＣ遺伝子の発現を駆動するＵＴＥＸ ２５０由来のアクチン遺伝子プロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。ＡｔＴＨＩＣのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性ＡＭＴ０３プロモーターが続く。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのＰｍＫＡＳＩＩコード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＵＴＥＸ ２５０ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドは、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ Ｉ部位との間に位置する。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＵＴＥＸ１４３５ ＦＡＴＡ１ゲノム領域が続く。
ｐＳＺ２２７６に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：



Ｓ２５３２バックグラウンドでＦＡＴＡ遺伝子をノックアウトし且つＰｍＫＡＳＩＩを過剰発現させる構築物。構築物ＦＡＴＡ１：：ＣｐＡＣＴ−ＡｔＴｈｉｃ−ｎｒ：ＰｍＵＡＰＡ１−Ｓ１０６ＳＡＤ−ＰｍＫＡＳＩＩ−ｎｒ：：ＦＡＴＡ１（ｐＳＺ２４４１と命名される）における関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｖ、Ｓｐｅ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、ＦＡＴＡ１遺伝子での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にするＵＴＥＸ１４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＴＨＩＣ遺伝子の発現を駆動するＵＴＥＸ ２５０由来のアクチン遺伝子プロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。ＡｔＴＨＩＣのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性ＵＡＰＡ１プロモーターが続く。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのＰｍＫＡＳＩＩコード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＵＴＥＸ ２５０ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドは、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ Ｉ部位との間に位置する。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＵＴＥＸ１４３５ ＦＡＴＡ１ゲノム領域が続く。
ｐＳＺ２４４１に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：



株ＡＳ及び株ＡＺのサザンブロット解析から、両方ともにＰｍＦＡＴＡ二重ノックアウト突然変異体であることが示された。ＰｍＦＡＤ２破壊カセットはＣａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ推定オレオイル特異的ＡＣＰ−チオエステラーゼ（ＣｔＯＴＥ）を含むため、内在性ＦＡＴＡ遺伝子が存在しないことが、ＣｔＯＴＥの発現によって完全に補完されるように見える。
ＦＡＴＡ１不活性化及びＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子の過剰発現がΔｆａｄ２系株Ｄ／株Ｒの脂質組成に及ぼす影響を決定するため、Ｄ１２６６／株Ｄ及びＤ１４１５／株Ｒの一次形質転換体をクローン精製し、標準的な脂質産生条件下、ｐＨ５．０及びｐＨ７．０の両方で成長させた。ｐＳＺ２２７６で株Ｄに形質転換することにより生じるトランスジェニック系から得られたプロフィールを表６８に示し、ｐＳＺ２４４１で株Ｒに形質転換することにより生じるトランスジェニック系を表６９に示す。
表６８、ｐＨ７．０の株ＡＺを見ると分かるとおり、ＡＭＴ０３によって駆動されるＰｍＫＡＳＩＩの完全な活性とＦＡＴＡ１ノックとの組み合わせは極めて低いレベルのＣ１６：０（２％）をもたらす。一方、同様にＡＭＴ０３プロモーターによって駆動されるため、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓチオエステラーゼもまた活性化する。株ＡＺをｐＨ７で培養したとき、７．８％のＣ１８：０が観察される。ｐＨ５．０では、Ｃ１６：０レベルの低下に主としてＦＡＴＡ１不活性化が寄与し、しかしながら本発明者らはｐＨ６．８でシード培養を行うため、ＰｍＫＡＳＩＩは部分的に活性化し得る。株ＡＺのステアリン酸レベルは、ｐＨ５．０ではＣ．ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ ＴＥの低発現に起因して低い。総じて、株ＡＺのオレイン酸レベルはｐＨ７．０及びｐＨ５．０の両方で８５％を超える（約８８％）。
トランスジェニック系株ＡＳでは、ＣｒＴＵＢ２及びＰｍＵＡＰＡ１プロモーターは両方ともｐＨバイアスがなく、従って表６９に報告されるとおり、ｐＨ５．０及びｐＨ７．０での脂質プロフィールは本質的に同じである。株ＡＺと比べて、株ＡＳは産生するステアリン酸がはるかに少ない。株ＡＳのパルミチン酸レベルは株ＡＺよりやや高いが、株ＡＳのオレイン酸レベルは９０％を上回り、これは本発明者らが振盪フラスコ実験で観察した最も高いレベルである。
実施例５９：ＦＡＤ２及びＦＡＴＡノックアウトの補完並びにＫＡＳＩＩ過剰発現によって高Ｃ１８−２及び低Ｃ１８−３レベルのユニークな油が生じる
実施例５８に記載されるとおり、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株におけるＰｍＦＡＴＡ１の両方のコピーをノックすると同時にＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子を過剰発現させることによりΔｆａｄ２系（株Ｒ）に株ＡＳを作成した。株Ｒは、ＦＡＤ２遺伝子座においてＣｒＴＵＢ２プロモーターの制御下にオレイン酸特異的Ｃ．ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＡ３３０１９．１）をＵＴＥＸ １４３５に由来する高脂質産生株に挿入することにより作成されるＦＡＤ２（ＦＡＤｃとしても知られる）ノックアウト株である。株ＡＳ及びその親、株Ｒは内在性ＰｍＦＡＤ２−１遺伝子の破壊を有し、そのためΔ１２特異的デサチュラーゼ活性がなくなっており、これは窒素リッチシード条件及び低窒素脂質産生条件の両方で０％のＣ１８：２（リノール酸）レベルとして現れる。株（Ｓｔａｉｎ）ＡＳ（及びその親株Ｒ）ではＣ１８：２が存在しないため成長不良となり、これはシード段階でリノール酸を外因的に添加することによって部分的に軽減し得る。しかしながら、工業的応用には、リノール酸の外因的な添加は高価である。株Ｒ（及び二次Δｆａｄ２株）をＰｍＦＡＤ２−１で補完することにより、リノール酸を補足することなしにＣ１８：２レベルが野生型レベルに回復し、またシード及び脂質産生の間の成長特性のレスキューももたらされた。
本例では、本発明者らは以下を実証する：
・ｐＨ誘導性ＰｍＡＭＴ３プロモーターの制御下におけるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来の脂肪酸デサチュラーゼ−２遺伝子（ＰｍＦａｄ２−１）のトランス発現では、ＰｍＦＡＤ２−１の機能的補完がもたらされ、Δｆａｄ２、Δｆａｔａ１株ＡＳにおける成長及びＣ１８：２レベルが回復する；
・株ＡＳの補完は条件的／誘導性であり、ＡＭＴ３プロモーターが不活性であるときのｐＨ５．０とは対照的に、ｐＨ７．０で、ＡＭＴ３プロモーターが活性化してＰｍＦＡＤ２−１の発現を駆動しているときに起こる；及び
・ｐＨ７．０でのＰｍＦＡＤ２−１の過剰発現は、＞２０％のＣ１８：２レベルの株をもたらす。これらの高Ｃ１８：２株の脂肪酸プロフィールは、この新規油がキャノーラ油（１０％）の５分の１のＣ１８：３を有することを除き、キャノーラ油を厳密に模倣する。この高いＣ１８：２レベルは、野生型（即ち、操作されていない）対照株Ｚにおける同じ遺伝子の過剰発現がより高いＣ１８：２レベルをもたらさないため、ＰｍＦＡＤ２−１を過剰発現する株ＡＳから誘導された株においてのみ見られる。
Δｆａｄ２株の株ＡＳ及び株ＺにおけるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ脂肪酸デサチュラーゼ２（ＰｍＦＡＤ２−１）の発現に使用される構築物−［ｐＳＺ２７２１］。Δｆａｄ２Δｆａｔａ１株ＡＳ及び株Ｚを構築物ｐＳＺ２７２１で形質転換した。形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する。構築物ｐＳＺ２７２１（６Ｓ：：ＣｐＡＣＴ−ＳｃＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ３−ＰｍＦＡＤ２−１−ＣｖＮＲ：：６Ｓ）における関連する制限部位は、小文字、下線及び太字で示され、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、ＫｐｎＩ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６Ｓ遺伝子座での相同組換えによるＰｍＦＡＤ２−１の標的化した組み込みを可能にするＵＴＥＸ １４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＥＬ１遺伝子の発現を駆動するＵＴＥＸ ２５０由来のアクチン（ＡＣＴ）遺伝子プロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性ＡＭＴ０３プロモーターが続く。ＰｍＦＡＤ２−１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りの遺伝子は太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＵＴＥＸ １４３５ ６Ｓゲノム領域が続く。正しいリーディングフレーム及び標的配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
ｐＳＺ２７２１に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：


成長及び脂肪酸プロフィールに及ぼすその影響を決定するため、上記の構築物を独立にΔｆａｄ２Δｆａｔａ１株ＡＳ又は野生型株Ｚに形質転換した。一次形質転換体をクローン精製し、低窒素脂質産生条件下、株ＡＳ形質転換体についてはｐＨ７．０（ＡＭＴ３プロモーター活性）及びｐＨ５．０（ＡＭＴ３プロモーター不活性）で、又は株Ｚ形質転換体についてはｐＨ７．０で成長させた。形質転換によって生じた一組の代表的なクローンから得られたプロフィールを、それぞれ表７０〜表７３に示す。
株ＡＳにおけるｐＨ７．０でＡＭＴ３プロモーターによって駆動される内因性ＰｍＦａｄ２−１の発現は、Δ１２特異的デサチュラーゼ活性をもたらし、基本株ＡのＣ１８：２脂肪酸レベルが完全に回復した（表７０）。ｐＨ５．０でＡＭＴ３プロモーターが不活性であるときに脂質産生を行った場合、かかるΔ１２特異的デサチュラーゼ活性は検出されず、従って顕著なＣ１８：２回復は検出されない（表７１）。
興味深いことに、ｐＨ７．０での補完された株ＡＳ株における脂質産生は、Ｃ１８：２レベルの２倍以上の増加を伴ういくつかの株をもたらす。得られた株は、新規油が市販のキャノーラ油より低いＣ１８：３レベルを有することを除き、キャノーラ油と同様の油プロフィールを生じる（表７２）。このＣ１８：２の増加は、同じＡＭＴ３駆動ＰｍＦＡＤ２−１で形質転換した野生型（株Ｚ）株には見られない。
本発明者らは、高いＣ１８：２レベルを有する他の株を認めているが、それらは全て、シード並びに脂質産生培地での成長不良を伴った。しかしながら、ここで本発明者らは、得られる株の成長に対する有害な影響なしにＣ１８：２レベルを標的化した形で増加させることが可能となっている。Δｆａｄ２株Ｒ及びΔｆａｄ２Δｆａｔａ１株ＡＳの成長は極めて悪く、４２時間で１０〜２０のＯＤ７５０にもほとんど達しないが、補完された株ＡＳ（Ｄ１６７３）系は同じ期間で極めて急速に成長し、５０〜８０のＯＤ７５０に達する。
従って、本発明者らが、１０％未満のリノレン酸だが＞２０％リノール酸の脂肪酸プロフィールを有する細胞油を生成可能であったことが分かる（実際、本発明者らは＜２％リノレン酸及び＞２０％リノール酸を達成した）。株ＡＳにおいてのみＣ１８：２レベルが上昇することは意外であり、５７％のＣ１８：１レベルに過ぎない株Ｚと比較して株ＡＳはほぼ９０％のＣ１８：１レベルを有し、ＥＲにおける利用可能な基質Ｃ１８：１の過剰がＣ１８：２レベルを押し上げる鍵であることが示唆される。ＰｒｏｔｏｔｈｅｃａはＴＡＧ上のＣ１８：１を極めて効率的に利用するように進化しているため、野生型の状況では、基質はＦＡＤ２酵素によってさらに不飽和化される前にＥＲを極めて急速に離れる可能性が最も高い。ＰｍＦＡＤ２−１による不飽和化に利用可能なまま留まるものと思われる極めて高いＣ１８：１レベルを有する株ＡＳなどの株では、この制約は解消され得る。
実施例６０：中鎖チオエステラーゼ及びケトアシルシンターゼのコンビナトリアル発現による極めて高い且つバランスしたＣ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸レベルを有する油の作成
この例では、本発明者らは、古典的に突然変異誘発したＵＴＥＸ １４３５の高油産生誘導体、株ＢＡにおいて極めて高い且つバランスしたＣ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸を有する油を作成するための二分子手法を記載する。得られるトランスジェニック株は２つの異なる中鎖特異的チオエステラーゼ、広域特異性Ｃ１０：０〜Ｃ１４：０ Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＦＡＴＢ２チオエステラーゼ（株（Ｓｔａｉｎ）ＢＡで発現する）と、主にＣ１０：０特異的Ｃｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ ＦＡＴＢ２チオエステラーゼ（入ってくるベクターの一部）とを発現する。加えて、Ｄ１５５０形質転換体が、中性ゲノム部位Ｔｈｉ４ｂに組み込まれたＣ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＩＶエロンガーゼ遺伝子を発現し（ベクターｐＳＺ２４２４）、一方、Ｄ１６８１形質転換体が、内因性ＫＡＳＩ破壊カセットの一部としてのＣ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＡＩエロンガーゼを発現する（ベクターｐＳＺ２７４６）。植物起源の異なるＫＡＳＩ活性を外因性チオエステラーゼと組み合わせて使用することにより、全体的なＣ１０〜Ｃ１２レベルの大幅な増加並びにＣ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａチオエステラーゼのＣ１０：０特異性の向上がもたらされた。最良の株は、バランスしたそれぞれ約４２％のＣ１０：０及び約４４％のＣ１２：０脂肪酸レベルを有する約８５％の総Ｃ１０：０〜Ｃ１２：０の脂肪酸を合成し、４％未満のＣ１４：０、及び１．５％未満のＣ８：０であった。これらの結果は、ＦＡＴＢ及びＫＡＳ遺伝子の選択によって、カプリン酸及びラウリン酸が２０％以内に（又はさらには１５％、又は１０％以内に）バランスした少なくとも５０％の総飽和物を有する油を生じさせ得ることを示している。
ｐＳＺ２４２４における関連する制限部位は、小文字、太字及び下線テキストで示され、５’−３’にそれぞれＰｍｅ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、ＳｎａＢＩ、Ｓｐｅ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。Ｐｍｅ Ｉ及びＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、Ｔｈｉ４ｂ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にするＵＴＥＸ１４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮｅｏＲ、細胞がＧ４１８で成長する能力を付与する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ Ｂ−チューブリンプロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。ＮｅｏＲのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示す。次は、小文字イタリックで示されるＣｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ ＫＡＳＩＶ遺伝子（ＣｈＫＡＳＩＶ）の発現を駆動する囲い文字の小文字テキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＡＭＴ０３プロモーターである。ＣｈＫＡＳＩＶのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは、大文字、太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示す。次は、小文字イタリックで示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ遺伝子に由来するプラスチドトランジットペプチド配列に融合したＣｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ ＦＡＴＢ２遺伝子（ＣｈＦＡＴＢ２）の発現を駆動する囲い文字の小文字テキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＡＭＴ０３プロモーターである。ＣｈＦＡＴＢ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは、大文字、太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、ＵＴＥＸ１４３５ Ｔｈｉ４ｂフランキング配列が続く。
＞ｐＳＺ２４２４ ［Ｔｈｉ４ｂ：：ＣｒＴＵＢ２−ＮｅｏＲ−ＣｖＮＲ：ＰｍＡｍｔ０３−ＣｈＫＡＳＩＶ−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ０３−ＣｈＴＥ２−ＣｖＮＲ：：Ｔｈｉ４ｂ］． ｐＳＺ２４２４に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：



ｐＳＺ２７４６における関連する制限部位は、小文字、太字及び下線テキストで示され、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、ＡｓｃＩ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｎｄｅ Ｉ、Ｓｎａ ＢＩ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、ＫＡＳＩ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込み（及びノックアウト）を可能にするＵＴＥＸ１４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮｅｏＲ、細胞がＧ４１８で成長する能力を付与する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ Ｂ−チューブリンプロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。ＮｅｏＲのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示す。次は、小文字イタリックで示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ遺伝子に由来するプラスチドトランジットペプチド配列に融合したＣｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ ＦＡＴＢ２遺伝子（ＣｈＦＡＴＢ２）の発現を駆動する囲い文字の小文字テキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＵＡＰＡ１プロモーターである。ＣｈＦＡＴＢ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは、大文字、太字のイタリックにより示す。Ｂ．ｂｒａｕｎｉｉ ｃｄ１９１ ３’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示す。次は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＳＡＤ１プラスチドトランジットペプチド配列に融合した小文字のイタリックにより示されるＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＡＩ遺伝子の発現を駆動する囲い文字の小文字テキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＡｍｔ０３プロモーターである。Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＡＩ配列は小文字イタリックであり、イニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡにより区切られる。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、ＵＴＥＸ１４３５ ＫＡＳＩフランキング配列が続く。
＞ｐＳＺ２７４６ ［ＫＡＳＩ−１：：ＣｒＴＵＢ２−ＮｅｏＲ−ＣｖＮＲ：ＰｍＵＡＰＡ１−ＣｈＦＡＴＢ２−Ｂｂｃｄ１８１：ＰｍＡｍｔ０３−ＰｍＳＡＤｔｐ−ＣｗＫＡＳＡ１−ＣｖＮＲ：：ＫａｓＩ−１］． ｐＳＺ２７４６に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：



Ｄ１５５０形質転換体に由来する安定系の代表的な振盪フラスコ培養物からの脂肪酸プロフィールを表７４に示す。２つの独立した遺伝系統が、高い且つバランスしたＣ１０〜Ｃ１２：０脂肪酸レベルの株を生じた。
次に、本発明者らは、ＫＡＳＩ置換戦略を用いて構築したＤ１６８１株のパフォーマンスを分析した。興味深いことに、Ｄ１５５０形質転換体と異なり、Ｄ１６８１株は脂肪酸プロフィールのより大きいばらつきを示した（表７５）。加えて、Ｄ１６８１由来の系は、本発明者らがＤ１５５０由来のトランスジェニック系で観察したものより低いＣ８：０レベルを有したことから、Ｃ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ ＦＡＴＢ２チオエステラーゼのＣ１０：０特異性の改善におけるＣ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＡ１の直接的な役割が示唆される。
続いてＤ１５５０及びＤ１６８１ファミリーを代表する８個の株（表７４〜表７５から）を、表７６に示すとおり高細胞密度発酵で評価した。発酵により、実験室規模の発酵と比較してやや改善された中鎖プロフィール又はＣ１０〜Ｃ１２：０脂肪酸レベルのバランスを有する油がもたらされた。２つの独立した発酵で評価した株ＢＥは、８５．２％のＣ１０〜Ｃ１２：０脂肪酸レベル、３．５％のＣ１４：０レベル、及び約１．２％のＣ８：０脂肪酸レベルに達する優れたプロフィールを示し、９２％を超える総飽和物を蓄積した。
実施例６１：Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３遺伝子の発現によるＵＴＥＸ１４３５におけるＴＡＧ位置特異性
実施例４３において、本発明者らは、ＵＴＥＸ１４３５誘導株Ｓ２０１４におけるＣｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３（ＣｕＰＳＲ２３）由来の２個の異なる１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３遺伝子の発現が、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０及びＣ１４：０脂肪酸レベルの上昇をもたらしたことを実証した。本例では、本発明者らは、Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２がＴＡＧにおけるｓｎ−２位でのＣ１０：０脂肪酸組み込みに対して高い特異性を呈することのエビデンスを提供する。Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ３は、ＴＡＧにおけるｓｎ−２位にＣ１８：２脂肪酸を特異的に組み込む。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）トランスジェニック株Ｂの組成及び特性、それぞれＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３遺伝子を発現する形質転換ベクターｐＳＺ２２９９及びｐＳＺ２３００、及びそれらの配列は、既に記載している。
Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ遺伝子が得られる脂肪酸プロフィールに及ぼす影響を決定するため、本発明者らは、比較的高いレベルで中鎖及び長鎖脂肪酸の両方を合成する株Ｂを利用している。表７７に示すとおり、株ＢにおけるＬＰＡＡＴ２遺伝子（Ｄ１５２０）の発現は、Ｃ１０〜Ｃ１２：０レベルの（最良の株、Ｄ１５２０．３〜７で最大１２％の）増加をもたらしたことから、このＬＰＡＡＴが中鎖脂肪酸に特異的であることが示唆される。或いは、ＬＰＡＡＴ３遺伝子の発現が比較的控えめな（最良の株、Ｄ１５２１．２８〜７で最大５％の）増加をもたらしたことから、中鎖レベルへの影響がほとんど又は全くないことが示される。
Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ遺伝子の発現がｓｎ−２位における脂肪酸の位置特異性に影響を及ぼしたかどうかを決定するため、本発明者らは、ブタ膵リパーゼ法を利用して代表的なＤ１５２０及びＤ１５２１株のＴＡＧを分析した。実施例２を参照のこと。表７８に示すとおり、Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２遺伝子はＣ１０：０脂肪酸に対して顕著な特異性を示し、ｓｎ−２位に５０％多いＣ１０：０脂肪酸を組み込むように見える。Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ３遺伝子はＣ１８：２脂肪酸にのみ作用してｓｎ−２位へのＣ１８：２脂肪酸の再分布をもたらすように見える。従って、対応する特異性を有する外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子を導入することにより、１５％又は２０％超のＣ１０：０又はＣ１８：２脂肪酸のｓｎ−２プロフィールを有する微生物トリグリセリド油を得ることが可能である。
実施例６２：異種ＫＡＳ発現Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株への異種チオエステラーゼの導入
ここで本発明者らは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）トランスジェニック株Ｓ５８１８において異種植物ＫＡＳＩ遺伝子、Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳ）、ＣｗＫＡＳＡ１と組み合わせたとき、異種脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼがチオエステラーゼ特異性の変化を呈することを実証する。Ｓ５８１８は、６Ｓ遺伝子座でＣｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｍｐｈｏｒａ及びＵｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ由来のチオエステラーゼキメラ、ＣｃＦＡＴＢ２−Ｕｃ ＦＡＴＢ２キメラＢを発現し、さらにｐＬＯＯＰ遺伝子座でＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳ、ＣｗＫＡＳＡ１を発現するトランスジェニック株である。ＣｃＦＡＴＢ２−ＵｃＦＡＴＢ２キメラＢ及びＣｗＫＡＳＡ１遺伝子を加えることにより、４５％のＣ１２：０及び１４％のＣ１４：０のＳ５８１８脂肪酸プロフィールがもたらされる。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおいて主にＣ１４：０チオエステラーゼ活性を呈し且つＣ１２：０チオエステラーゼ活性がそれ程顕著でないことが以前示された、チオエステラーゼをコードする５つの異なる構築物を、このバックグラウンドでＣ１４：０及びＣ１２：０レベルを増加させるためＳ５８１８に導入した。しかしながら、５つの異なるＣ１４：０チオエステラーゼをＳ５８１８に導入すると、Ｃ１２：０脂肪酸レベルの予想外ながら大幅な増加（全体で＞５０％）が生じ、Ｃ１４：０脂肪酸レベルの増加はごく僅かであった（全体で＜２０％）。この結果は、ＫＡＳＩ−ＦＡＴＢチオエステラーゼの組み合わせが、いずれか一方の遺伝子を別々に導入したときには示されないユニークな活性を呈することを示唆している。これらの結果は、油産生細胞における異種ＫＡＳ遺伝子と異種チオエステラーゼとの組み合わせを用いることにより、いずれか一方の遺伝子を単独で導入することによっては示されない脂肪酸プロフィールを生じさせ得ることを実証している。さらに、異種ＫＡＳの導入は、さらなる異種チオエステラーゼの新規特異性を明らかにするための重要且つ有益な手法であり得る。
株Ｓ５８１８の作成。２つの連続的な形質転換によってＳ５８１８を作成した。ＵＴＥＸ１４３５基本株Ｓ３１５０（上記の株Ｚ）を、６Ｓ遺伝子座を標的化するＣｃＦＡＴＢ２−ＵｃＦＡＴＢ２キメラＢチオエステラーゼをコードするｐＳＺ２４４８（６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｃＦＡＴＢ２−ＵｃＦＡＴＢ２−ｃｈｉｍｅｒａＢ−ＥｘｔＡ−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ）で形質転換することにより、株Ｓ４９５４を得た。Ｓ４９５４は約３２％のＣ１２：０及び約１６％のＣ１４：０脂肪酸レベルを生じる（表６２−１）。続いてＳ４９５４を、ｐＬＯＯＰ遺伝子座を標的化するＣ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＡ１遺伝子をコードするｐＳＺ２２２９（ｐＬＯＯＰ：：ＣｒＴＵＢ２−ＮｅｏＲ−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＰｍＳＡＤｔｐ＿ＣｗＫＡＳＡＩ−ＣｖＮＲ：：ｐＬＯＯＰ）で形質転換することにより、株Ｓ５８１８を得た。Ｓ５８１８は約４５％のＣ１２：０及び約１４％のＣ１４：０脂肪酸レベルを生じる（表７９）。
Ｃ１４：０チオエステラーゼの同定。Ｃ１４：０脂肪酸レベルを増加させ、Ｃ１２：０脂肪酸レベルの程度を下げるため、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおいてＣ１４：０及びＣ１２：０チオエステラーゼ活性を呈することが分かったいくつかのチオエステラーゼを、Ｓ５８１８に導入するベクターにクローニングした。Ｃｕｐｈｅａ ｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａチオエステラーゼＣｈｓＦＡＴＢ３は、本発明者らによって、Ｃ．ｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａの成熟植物油糧種子を配列決定することにより新規チオエステラーゼを同定しようとする試みの一環として発見された。Ｃ．ｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ種子は約８４％のＣ１２：０及び約５％のＣ１４：０脂肪酸レベルを呈するが、本発明者らが同定したＣｈｓＦＡＴＢ３チオエステラーゼは、Ｓ３１５０で発現させるとき強力なＣ１４：０チオエステラーゼ活性を呈する（最大約３４％のＣ１４：０）。ｐＳＡＤ１ｔｐ＿トリミング型：ＣｈｓＦＡＴＢ３と命名される、本発明者らが推定プラスチド標的トランジットペプチドを最適化したバージョンのＣｈｓＦＡＴＢ３も、同様に強力なＣ１４：０チオエステラーゼ活性を呈した（約３３％のＣ１４：０；表８０）。
同様に、本発明者らはまた、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａの成熟植物油糧種子を配列決定することにより新規チオエステラーゼを同定しようとする試みの一環としてＣｕｐｈｅａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａチオエステラーゼＣｈｔＦＡＴＢ１ａも同定した。Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ種子は約４４％のＣ１０：０、約４０％のＣ１２：０脂肪酸レベル、及び僅か約４％のＣ１４：０を呈するが、本発明者らが同定したトランジットペプチド最適化バージョンのＣｈｔＦＡＴＢ１ａチオエステラーゼ、ＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿トリミング型：ＣｈｔＦＡＴＢ１ａは、Ｓ３１５０で発現させるとき強力なＣ１４：０チオエステラーゼ活性を呈する（最大約３５％のＣ１４：０；表８１）。
既発表のＣｕｐｈｅａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ Ｃ１４：０チオエステラーゼ、ＣｐａｌＦＡＴＢ２もまたＳ５８１８に導入した（下記参照）。
Ｓ５８１８へのＣ１４：０チオエステラーゼの導入。Ｓ５８１８に導入するためＣ１４：０チオエステラーゼを使用して５つの構築物を作成した（表８２）。
ｐＳＺ３３９０及びｐＳＺ３５３１は、ｐＨ５応答性ＵＡＰＡ１プロモーターの制御下でＣｐａｌＦＡＴＢ２チオエステラーゼ遺伝子をそれぞれＤＡＯ１ｂ及びＴＨＩ４Ａ遺伝子座に導入する。ｐＳＺ３４９３、ｐＳＺ３４９４、及びｐＳＺ３４９５は、ｐＨ７応答性ＡＭＴ３プロモーターの制御下でそれぞれＣｈｓＦＡＴＢ３、ＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿トリミング型：ＣｈｓＦＡＴＢ３、及びＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿トリミング型：ＣｈｔＦＡＴＢ１ａをＤＡＯ１ｂ遺伝子座に導入する。トランスジェニック株をメリビオースでの成長能力で選択した。細胞培養物、脂質産生、及び脂肪酸分析は、全て先述のとおり実施した。ｐＳＺ３３９０、ｐＳＺ３４９３、ｐＳＺ３４９４、ｐＳＺ３４９５、及びｐＳＺ３５３１の形質転換ＤＮＡを以下に提供する。
ｐＳＺ３３９０： ｐＳＺ３３９０は、ＤＡＯ１ｂ：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭｅｌ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＵＡＰＡ１ｎｏＳａｃＩ−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＦＬＡＧＥｘｔＡ−ＣｖＮＲ：：ＤＡＯ１ｂとして表すことができる。構築物における関連する制限部位、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩは、小文字、太字、及び下線で示される。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。構築物の５’末端及び３’末端における太字で小文字の配列は、ＤＡＯ１ｂ遺伝子座への相同組換えによる組み込みを標的化するＵＴＥＸ １４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、選択カセットは、Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＭＥＬ１遺伝子（メリビオースで成長する能力を付与する）の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＨＸＴ１プロモーター及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを有する。プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃａｒＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは太字、大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。３’ＵＴＲは、小文字、下線のテキストにより示す。異種Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＳＡＤ１プラスチド標的トランジットペプチドに融合した、ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＦＬＡＧＥｘｔＡ遺伝子を含む第２のカセットは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＡＰＡ１ ｐＨ５応答性プロモーターによって駆動され、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを有する。このカセットでは、ＵＡＰＡ１プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＦＬＡＧＥｘｔＡ遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは、太字、大文字のイタリックで示し、一方、コード領域は小文字のイタリックにより示す。３’ＵＴＲは、小文字、下線のテキストにより示す。
ｐＳＺ３３９０形質転換構築物：


ｐＳＺ３４９３、ｐＳＺ３４９４、及びｐＳＺ３４９５：ｐＳＺ３４９３は、ＤＡＯ１ｂ５’：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｈｓＦＡＴＢ３−ＣｖＮＲ：：ＤＡＯ１ｂ３’として表すことができる。ｐＳＺ３４９４は、ＤＡＯ１ｂ５’：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿トリミング型：ＣｈｓＦＡＴＢ３−ＣｖＮＲ：：ＤＡＯ１ｂ３’として表すことができる。ｐＳＺ３４９５は、ＤＡＯ１ｂ５’：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿トリミング型：ＣｈｔＦＡＴＢ１ａ−ＣｖＮＲ：：ＤＡＯ１ｂ３’として表すことができる。これらの３つの構築物の配列は、チオエステラーゼ遺伝子の配列のみが異なる。ｐＳＺ３４９３の完全な形質転換配列は配列番号１２４に示される。ＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿トリミング型：ＣｈｓＦＡＴＢ３及びＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿トリミング型：ＣｈｔＦＡＴＢ１ａ遺伝子単独の配列は、ｐＳＺ３４９４及びｐＳＺ３４９５配列においてｐＳＺ３４９３のＣｈｓＦＡＴＢ３に取って代わるものであり、それぞれ隣接制限部位と共に配列番号１２５及び１２６に示される。
ｐＳＺ３４９３構築物における関連する制限部位、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩは、小文字、太字、及び下線で示される。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。構築物の５’末端及び３’末端における太字で小文字の配列は、ＤＡＯ１ｂ遺伝子座への相同組換えによる組み込みを標的化するＵＴＥＸ １４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、選択カセットは、Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＭＥＬ１遺伝子（メリビオースで成長する能力を付与する）の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＨＸＴ１プロモーター及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを有する。プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃａｒＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは太字、大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。３’ＵＴＲは、小文字、下線のテキストにより示す。第２のカセットは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＡＭＴ３ ｐＨ７応答性プロモーターによって駆動されるＣｈｓＦＡＴＢ３遺伝子を含み、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを有する。このカセットでは、ＡＭＴ３プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＣｈｓＦＡＴＢ３遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは、太字、大文字のイタリックで示し、一方、コード領域は小文字のイタリックにより示す。３’ＵＴＲは、小文字、下線のテキストにより示す。
ｐＳＺ３４９３形質転換構築物：



ＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿トリミング型：ＣｈｓＦＡＴＢ３ （ｐＳＺ３４９４由来）：
ＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿トリミング型：ＣｈｔＦＡＴＢ１ａ （ｐＳＺ３４９５由来）：
ｐＳＺ３５３１：ｐＳＺ３５３１は、ＴＨＩ４Ａ：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭｅｌ１−ＣｐＥＦ１ａ：ＰｍＵＡＰＡ１ｎｏＳａｃＩ−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＦＬＡＧＥｘｔＡ−ＣｖＮＲ：：ＴＨＩ４Ａとして表すことができる。この構築物に関連する制限部位、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩは、小文字、太字、及び下線で示される。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。構築物の５’末端及び３’末端における太字で小文字の配列は、ＴＨＩ４Ａ遺伝子座への相同組換えによる組み込みを標的化するＵＴＥＸ １４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、選択カセットは、Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＭＥＬ１遺伝子（メリビオースで成長する能力を付与する）の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＨＸＴ１プロモーター及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＥＦ１Ａ遺伝子３’ＵＴＲを有する。プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃａｒＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは太字、大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。３’ＵＴＲは、小文字、下線のテキストにより示す。異種Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＳＡＤ１プラスチド標的トランジットペプチドに融合した、ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＦＬＡＧＥｘｔＡ遺伝子を含む第２のカセットは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＡＰＡ１ ｐＨ５応答性プロモーターによって駆動され、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを有する。このカセットでは、ＵＡＰＡ１プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＦＬＡＧＥｘｔＡ遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは、太字、大文字のイタリックで示し、一方、コード領域は小文字のイタリックにより示す。３’ＵＴＲは、小文字、下線のテキストにより示す。
ｐＳＺ３５３１形質転換構築物：


異種「Ｃ１４：０特異的」チオエステラーゼの発現による株Ｓ５８１８におけるＣ１２：０レベルの増加。Ｓ５８１８におけるＣ１４：０脂肪酸レベルを増加させるため、これまでにＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおいて際立ったＣ１４：０チオエステラーゼ活性を示しているいくつかのチオエステラーゼをＳ５８１８バックグラウンドに形質転換した。本発明者らの予想に反し、Ｃ１２：０レベルの顕著な増加と、Ｃ１４：０レベルの低下又はごく僅かな増加が観察された。例えば、ＣｈｓＦＡＴＢ３チオエステラーゼ（Ｓ３１５０において最大３４％のＣ１４：０レベルの増加を生じさせる）をＳ５８１８に導入すると、Ｃ１２：０レベルが約７７％に上昇し（Δ＝＋３２％のＣ１２：０）、Ｃ１４：０レベルが約７％に降下する（Δ＝−７％）。加えて、ＣｐａｌＦＡＴＢ２をＳ５８１８のＤＡＯ１ｂ遺伝子座に導入すると、Ｃ１２：０レベルが約６４％に上昇し（Δ＝＋１９％）、Ｃ１４：０レベルが約１２％に降下する（Δ＝−２％）。５つの構築物の各々に関する上位５つの形質転換体の結果を表８３に示す。
留意すべきこととして、Ｓ５８１８はｐＬＯＯＰ遺伝子座からＣ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＡ１遺伝子を発現する。Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉは６２％のＣ１２：０の種子油を産生するため、本発明者らは、Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼと組み合わせたときＣ１２：０脂肪酸の産生に特異的となるようＣｗＫＡＳＡ１遺伝子が進化している可能性が高いと考える。実際、Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＦＡＴＢ２は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓに導入したときにＣ１２：０活性を呈するチオエステラーゼをコードする。従って、本発明者らのトランスクリプトーム配列決定で同定された「Ｃ１４：０」チオエステラーゼ遺伝子、即ちＣｈｓＦＡＴＢ３及びＣｈｔＦＡＴＢ１ａは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ内在性ＫＡＳＩ遺伝子と組み合わせたときに限りＣ１４：０活性を呈する可能性がある。これらの結果はさらにＣｐａｌＦＡＴＢ２にまで及び、ＣｐａｌＦＡＴＢ２は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおいてＣ１４：０レベルを増加させることが繰り返し示されている（データは示さず）。しかしながら、ＣｈｓＦＡＴＢ３、ＣｈｔＦＡＴＢ１ａ、及びＣｐａｌＦＡＴＢ２を、高Ｃ１２：０脂肪酸を産生するＣｕｐｈｅａ種由来のＫＡＳＩ遺伝子、例えばＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ由来のＣｗＫＡＳＡ１と組み合わせると、これらのチオエステラーゼのＣ１２：０活性が明らかになる／示される。さらに、Ｃ．ｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ及びＣ．ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａは油糧種子において低レベルのＣ１４：０のみを産生し（それぞれ５％及び４％）、一方で比較的高レベルのＣ１２：０を産生する（それぞれ８４％及び４０％）ことに留意しなければならない。ＣｈｓＦＡＴＢ３及びＣｈｔＦＡＴＢ１ａチオエステラーゼは成熟油糧種子で発現するＲＮＡから同定したため、これらのチオエステラーゼが実際にＣｕｐｈｅａ種子でＣ１２：０活性を呈し、そこで見られる高レベルのＣ１２：０に大きく寄与した可能性がある。
本発明者らの結果は、チオエステラーゼとＫＡＳとの組み合わせが、中鎖脂肪酸の生成におけるチオエステラーゼ−ＫＡＳ機構の特異性の決定に極めて重要である可能性が高いことを示している。さらに、異種ＫＡＳの導入が、さらなる異種チオエステラーゼの新規の特異性を明らかにするのに重要且つ有益な手法であり得る。
実施例６３：脂質産生と同期して油産生細胞における遺伝子発現レベルを条件的に制御する一組の調節可能なプロモーター
Δｆａｄ２系、Ｓ２５３２においてＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＦＡＴＡ１の両方のコピー（ＰＭＦＡＴＡ１）をノックアウトし、同時に内在性ＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子を過剰発現させることによりＳ５２０４を作成した。Ｓ２５３２それ自体はＦＡＤ２（ＦＡＤｃとしても知られる）二重ノックアウト株であり、先に、ＦＡＤ２遺伝子座においてＣｒＴＵＢ２プロモーターの制御下でＣ．ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ ＡＣＰチオエステラーゼ（寄託番号ＡＡＡ３３０１９．１）をＳ１３３１に挿入することにより作成された。Ｓ５２０４及びその親Ｓ２５３２は内在性ＰｍＦＡＤ２−１遺伝子の破壊を有するためΔ１２特異的デサチュラーゼ活性がなく、これはシード段階及び脂質産生段階の両方で０％のＣ１８：２（リノール酸）レベルとして現れる。Ｓ５２０４（及びその親Ｓ２５３２）にはＣ１８：２が全くないため成長不良となり、これはシード段階でリノール酸を外因的に添加することによって部分的に軽減し得る。しかしながら、ゼロリノール酸油の工業的応用には、リノール酸の外因的な添加はコストの増加を伴う。本発明者らは先に、Ｓ５２０４（及び他のΔｆａｄ２株Ｓ２５３０及びＳ２５３２）をｐＨ誘導性ＡＭＴ０３ｐ駆動ＰｍＦＡＤ２−１で補完することにより、いかなるリノール酸も補足することなしにｐＨ７．０でＣ１８：２が野生型レベルに回復し、またシード段階の間の成長特性のレスキューももたらされることを示している。さらに、続いてｐＨ７．０で成長させた補完系のシードを、ｐＨが（ＡＭＴ０３駆動ＦＡＤ２タンパク質レベルを制御するため）５．０に調整された低窒素脂質産生フラスコに移したとき、得られる最終的な油プロフィールは親Ｓ５２０４又はＳ２５３２プロフィールと一致して、ゼロリノール酸レベルながら成長及び生産性の尺度がレスキューされる。従って本質的にはＡＭＴ０３ｐ駆動ＦＡＤ２−１によって、本発明者らは、所望の用途に応じた各種リノール酸レベルを有する油の作成に使用し得る可能性のあるｐＨ調節可能な株を開発している。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓは発酵槽において最初の２４〜３０時間で急速な細胞分裂を起こした後、培地中の窒素を使い尽くし、細胞は脂質の貯蔵に切り換わる。発酵槽におけるこの初期の細胞分裂及び成長は株の全体的な生産性に重要であり、上記に報告したとおり、ＦＡＤ２タンパク質が、特定の株の持続的な力強い成長特性に決定的である。しかしながら、第一世代、単一の挿入の、遺伝的にクリーンなＰｍＦＡＤ２−１補完株（Ｓ４６９４及びＳ４６９５）のランを７Ｌ発酵槽においてｐＨ５．０で行ったとき（シードはｐＨ７．０で成長させた）、そのパフォーマンスは生産性の点で元の親基本株（Ｓ１３３１）と同等ではなかった。ウエスタンデータから、発酵槽ではＰｍＦＡＤ２−１を駆動するＡＭＴ０３ｐプロモーターが（ＦＡＤ２タンパク質レベルによって測定したとき）発酵槽のｐＨ（５．０又は７．０）に関係なく０〜３０時間の間に重度に下方調節されることが示唆された。発酵条件を動かすと（バッチ式対非バッチ式／制限的な初期Ｎ、産生期間中の種々の時点における７から５へのｐＨシフト）、初期脂質産生中の窒素の最初のバッチ（及び過剰量）が、発酵槽におけるＡＭＴ０３ｐプロモーター下方調節の原因である可能性が高かったことが示唆された。実際、ＡＭＴ０３のこの初期の抑制は、発酵中の転写物の経時的変化に直接見ることができる。Ａｍｔ０３発現の大幅な抑制がランの初期に観察されており、これは発酵槽中のＮＨ４レベルに直接対応する。
制限Ｎで発酵を実施したとき、本発明者らはＡＭＴ０３ｐプロモーター活性を部分的にレスキューすることが可能であったとともに、Ｓ４６９４／Ｓ４６９５の細胞当たりの生産性は親Ｓ１３３１と同等であったが、全体的な生産性はなおも遅れを取っていた。これらの結果から、最適以下の又は不活性なＡＭＴ０３ｐプロモーター、従って発酵初期段階におけるＦＡＤ２タンパク質の制限によって、任意の補完株がその完全な成長能力及び全体的生産性の達成を阻まれることが示唆される。ここで本発明者らは、高窒素成長期間と低窒素脂質産生期間との間で示差的な遺伝子活性を可能にする新規の改良されたプロモーターを同定する。
詳細には、本発明者らは以下を観察した。
・トランスクリプトームベースのバイオインフォマティクス手法を用いて同定された下方調節プロモーターエレメントの制御下におけるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来の脂肪酸デサチュラーゼ−２遺伝子（ＰｍＦａｄ２−１）のトランス発現では、ＰｍＦＡＤ２−１の機能的補完がもたらされ、Δｆａｄ２、Δｆａｔａ１株Ｓ５２０４の成長が回復する。
・ロバストな成長表現型として現れるＳ５２０４の補完は、シード段階及び初期発酵段階において新規プロモーターエレメントが活性でＰｍＦＡＤ２−１の発現を駆動しているときにのみ起こる。
・細胞が活性脂質産生期間に入ると（およそ発酵槽においてＮが使い尽くされた時点）、新規に同定されたプロモーターは下方調節され、それ以上のＦＡＤ２タンパク質をもたらさず、補完系の最終的な油プロフィールは、成長特性がより良好ではあるが、親Ｓ５２０４と同じである。
・これらの株は、初期の補完株においてＡＭＴ０３ｐ駆動ＦＡＤ２で直面した問題を潜在的に軽減するはずである。
・重要なことには、本発明者らは、様々な強さの下方調節可能なプロモーターを同定しており、そのうちのいくつかは初めは比較的強力で、ランの残りの間は低度乃至中程度のレベルが提供される。従って、表現型に応じてこれらのプロモーターを選択し、所望の導入遺伝子レベルを微調整することができる。
バイオインフォマティクス方法：典型的な発酵槽ランの間の８時点で採取した細胞からＲＮＡを調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑでのラン用にＲＮＡをポリＡ選択した。Ｉｌｌｕｍｉｎａペアエンドデータ（１００ｂｐリード×２、約６００ｂｐ断片サイズ）を収集し、ＦａｓｔＱＣ［ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／］を使用してリードクオリティについて処理した。リードのデュプリケートを除去し、クオリティトリミングし、及び長さをトリミングするカスタムリード処理パイプラインを用いてリードをランにかけた。
Ｏａｓｅｓ／ｖｅｌｖｅｔ［Ｖｅｌｖｅｔ：ド・ブラングラフを使用したデノボショートリードアセンブルのためのアルゴリズム（Ｖｅｌｖｅｔ：ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｕｓｉｎｇ ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎ ｇｒａｐｈｓ）．Ｄ．Ｒ．Ｚｅｒｂｉｎｏ ａｎｄ Ｅ．Ｂｉｒｎｅｙ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８：８２１−８２９］を使用してＩｌｌｕｍｉｎａペアエンドリードから転写物をアセンブルし、Ｎ５０及び他の尺度で評価した。ＣＤ−Ｈｉｔを使用して全８時点の転写物をさらに縮小（ｃｏｌｌａｐｓｅ）した。［Ｌｉｍｉｎ Ｆｕ，Ｂｅｉｆａｎｇ Ｎｉｕ，Ｚｈｅｎｇｗｅｉ Ｚｈｕ，Ｓｉｔａｏ Ｗｕ ａｎｄ Ｗｅｉｚｈｏｎｇ Ｌｉ，「ＣＤ−ＨＩＴ：次世代シーケンシングデータのクラスタリングに向けて加速される（ＣＤ−ＨＩＴ：ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｆｏｒ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ）」．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，（２０１２），２８（２３）：３１５０−３１５２．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｓ５６５；「Ｃｄ−ｈｉｔ：大規模タンパク質又はヌクレオチド配列セットのクラスタリング及び比較のための高速プログラム（Ｃｄ−ｈｉｔ：ａ ｆａｓｔ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｌａｒｇｅ ｓｅｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」，Ｗｅｉｚｈｏｎｇ Ｌｉ ＆ Ａｄａｍ Ｇｏｄｚｉｋ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，（２００６）２２：１６５８−９］。
これらの転写物を発現レベル解析の基本（参照アセンブリ）として使用した。ローリードカウント並びに転写物百万分率（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ Ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ：ＴＰＭ）で提供される正規化値を提供するＲＳＥＭを使用して８つの時点からのリードを解析した。［Ｌｉ，Ｂｏ ＆ Ｄｅｗｅｙ，Ｃｏｌｉｎ Ｎ．（２０１１）．「ＲＳＥＭ：参照ゲノム有り又は無しでのＲＮＡ−Ｓｅｑデータからの転写物定量化を加速させる（ＲＳＥＭ：ａｃｃｕｒａｔｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＲＮＡ−Ｓｅｑ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ）」，ＢｉｏＭｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ：Ｔｈｅ Ｏｐｅｎ Ａｃｃｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ．ウェブサイトｗｗｗ．ｔｅｍｏａ．ｉｎｆｏ／ｎｏｄｅ／４４１６１４のｔｅｍｏａ：Ｏｐｅｎ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＯＥＲ）Ｐｏｒｔａｌから２０１２年１０月１０日に検索］。ＴＰＭを使用して発現レベルを決定した。先に強力なプロモーターのスクリーニングで同定された遺伝子もまた使用して、どのレベルを有意に高い又は低いと見なすべきかを判断した。このデータをＰｏｓｔｇｒｅｓデータベースにロードし、遺伝子機能及び他の特性、例えば発現プロファイルに基づく分類を含む統合データと共にＳｐｏｔｆｉｒｅで視覚化した。これにより、発現が顕著に変化する遺伝子の迅速な且つ標的化した解析が可能となった。
本発明者らが選択した遺伝子用プロモーターを、Ｓ３７６（本発明者らの参照Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株）のハイクオリティ参照ゲノムにマッピングした。簡潔に言えば、ＰａｃＢｉｏロングリード（約２ｋｂ）をハイクオリティＰａｃＢｉｏ ＣＣＳリード（約６００ｂｐ）によってエラー修正し、ＳＭＲＴＰｉｐｅ［ｐａｃｂｉｏｄｅｖｎｅｔ．ｃｏｍ］のＡｌｌｏｒａアセンブラを使用してアセンブルした。この参照ゲノムをトランスクリプトームリードマッピングと併せて使用して正確な遺伝子構造、プロモーター及びＵＴＲ位置、及び目的領域内にあるプロモーターエレメントをアノテートし、次にはこれが、さらなる配列決定及びプロモーターエレメント選択をガイドした。
新規プロモーターエレメントを同定するために使用した基準は、以下であった。
１．シード段階及び初期脂質産生段階（Ｔ０〜Ｔ３０時間）における下流遺伝子の妥当な発現（例えば、＞５００、＜１００、又は＜５０転写物百万分率［ＴＰＭ］）
２．発酵槽で窒素が枯渇したときの上記遺伝子の重度の下方調節（例えば、＞５倍、１０倍、又は１５倍）。
３．プロモーターエレメントのｐＨ中立性（例えば、培養条件がｐＨ５．０から７．０に移ったときのＴＰＭ変化が２倍未満）、又は少なくとも、ｐＨ５条件下での有効な作動。
上述の基準を用いて、本発明者らは、いくつかの潜在的に下方調節されるプロモーターエレメントを同定し、最終的にＳ５２０４におけるＰｍＦＡＤ２−１発現の駆動にそれらを使用した。種々のプロモーターを選択し、それらには、弱いプロモーターとして始まり極端に低いレベルまで下がるものから、非常に高く始まってやや低いレベルまでしか落ちないものまでが含まれた。このようにしたのは、ロバストな成長を支持するために初期のＦＡＤ２にどの程度の発現が必要になるのか、及びゼロリノール酸表現型を達成するために脂質産生期間中に要求されるＦＡＤ２がどの程度の少なさであるのかが、先験的に不明であったためである。
スクリーニングに選択したプロモーターエレメント及びそれらの対立形質は、それらの下流遺伝子にちなんで命名し、以下のとおりである。
１．カルバモイルリン酸シンターゼ（ＰｍＣＰＳ１ｐ及びＰｍＣＰＳ２ｐ）
２．ジフチンシンターゼ（ｄｉｐｔｈｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）（ＰｍＤＰＳ１ｐ及びＰｍＤＰＳ２ｐ）
３．無機ピロホスファターゼ（ＰｍＩＰＰ１ｐ）
４．アデノシルホモシステイナーゼ（ＰｍＡＨＣ１ｐ及びＰｍＡＨＣ２ｐ）
５．ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ（ＰｍＰＰＩ１ｐ及びＰｍＰＰＩ２ｐ）
６．ＧＭＰシンテターゼ（ＰｍＧＭＰＳ１ｐ及びＰｍＧＭＰＳ２ｐ）
７．グルタミン酸シンターゼ（ＰｍＧＳｐ）
８．クエン酸シンターゼ（ＰｍＣＳ１ｐ及びＰｍＣＳ２ｐ）
９．γグルタミルヒドロラーゼ（ＰｍＧＧＨ１ｐ）
１０．アセトヒドロキシ酸イソメラーゼ（ＰｍＡＨＩ１ｐ及びＰｍＡＨＩ２ｐ）
１１．システインエンドペプチダーゼ（ＰｍＣＥＰ１ｐ）
１２．脂肪酸デサチュラーゼ２（ＰｍＦＡＤ２−１ｐ及びＰｍＦａｄ２−２ｐ）［対照］
２つの代表的な遺伝子、即ちＰｍＩＰＰ（無機ピロホスファターゼ）及びＰｍＡＨＣ（アデノシルホモシステイナーゼ）の転写物プロフィールは極めて強力に始まり（４０００〜５０００ＴＰＭ）、しかし細胞が活性脂質産生に入ると、そのレベルは急速に下降する。ＰｍＩＰＰの転写物レベルはほぼ０ＴＰＭまで下落するが、ＰｍＡＨＣのレベルは約２５０ＴＰＭまで下落した後、残りの発酵にわたりそのまま留まる。他のプロモーターは全て（それらの下流遺伝子転写物レベルに基づけば）、同様の下方発現プロファイルを示した。
エレメントをＰＣＲ増幅し、可能ならば対立遺伝子のプロモーターを同定し、クローニングし、それに従い命名し、例えばカルバモイルリン酸シンターゼの２つの遺伝子のプロモーターエレメントはＰｍＣＰＳ１ｐ及びＰｍＣＰＳ２ｐと命名した。比較としてＰｍＦＡＤ２−１及びＰｍＦＡＤ２−２のプロモーターエレメントもまた増幅し、ＰｍＦＡＤ２−１遺伝子の駆動に使用した。一方、本例では、本発明者らはＦＡＤ２−１発現、従ってＣ１８：２レベルを使用して新規に同定される下方調節されるプロモーターを調べた（原則的にこれらのプロモーターエレメントは任意の目的遺伝子の下方調節に使用することができる）。
Δｆａｄ２株Ｓ５２０４におけるＰｍＣＰＳ１ｐの発現下でのＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ脂肪酸デサチュラーゼ２（ＰｍＦＡＤ２−１）の発現に使用される構築物−［ｐＳＺ３３７７］：Δｆａｄ２Δｆａｔａ１ Ｓ５２０４株を構築物ｐＳＺ３３７７で形質転換した。この形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する。構築物ｐＳＺ３３７７（６Ｓ：：ＰｍＨＸＴ１ｐ−ＳｃＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：：ＰｍＣＰＳ１ｐ−ＰｍＦＡＤ２−１−ＣｖＮＲ：：６Ｓ）における関連する制限部位は、小文字、下線及び太字で示され、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＡｆＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６Ｓ遺伝子座での相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＵＴＥＸ １４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅメリビアーゼ（ＳｃＭＥＬ１）遺伝子の発現を駆動するＵＴＥＸ １４３５由来のヘキソース輸送体（ＨＸＴ１）遺伝子プロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＵＴＥＸ １４３５ ＣＰＳ１ｐプロモーターが続く。ＰｍＦＡＤ２−１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りの遺伝子は太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＵＴＥＸ １４３５ ６Ｓゲノム領域が続く。正しいリーディングフレーム及び標的配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
ｐＳＺ３３７７に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：



構築物ｐＳＺ３３７７におけるＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ間の組換えはトランスジェニック系においてＰｍＦＡＤ２−１の複数のコピーをもたらし、次にはこれが、最も高い可能性としては発酵終了時により高いＣ１８：２レベルとして現れ得る。目標は０％最終Ｃ１８：２の株を作り出すことであったため、本発明者らはこの組換えを回避する予防策を講じた。別のバージョンの上記プラスミドＳｃＭＥＬ１遺伝子は、後ろにＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ３’ＵＴＲの代わりにＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ ２５０）伸長因子１ａ（ＣｐＥＦ１ａ）３’ＵＴＲが続いた。構築物ｐＳＺ３３８４及びこの３’ＵＴＲを有する他の構築物（以下に記載される）で使用されるＣ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ ２５０）伸長因子１ａ（ＣｐＥＦ１ａ）３’ＵＴＲの配列を以下に示す。プラスミドｐＳＺ３３８４は、６Ｓ：：ＰｍＨＸＴ１ｐ−ＳｃＭＥＬ１−ＣｐＥＦ１ａ：：ＰｍＣＰＳ１ｐ−ＰｍＦＡＤ２−１−ＣｖＮＲ：：６Ｓと表すことができる。
ｐＳＺ３３８４におけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ （ＵＴＥＸ ２５０）伸長因子１ａ （ＣｐＥＦ１ａ） ３’ＵＴＲのヌクレオチド配列：
Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ ２５０）伸長因子１ａ ３’ＵＴＲ配列は、５’末端側に制限部位ＳｎａＢＩ及び３’末端側にＥｃｏＲＶ（小文字、太字の下線テキストで示される）が隣接する。ＳｃＭＥＬ１終止コドンの後にＣｐＥＦ１ａ ３’ＵＴＲを含むプラスミド（ｐＳＺ３３８４及び以下に記載する他のもの）は、５’ＳｎａＢＩ部位の前に１０個の追加的なヌクレオチドを含むことが注記される。これらのヌクレオチドは、Ｓ．ＳｃＭＥＬ１終止コドンの後にＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを含むプラスミドには存在しない。
上記に記載する組換えＣｖＮＲ−プロモーター−ＰｍＦＡＤ２−１−ＣｖＮＲ又は非組換えＣｐＥＦ１ａ−プロモーター−ＰｍＦＡＤ２−１−ＣｖＮＲ発現ユニットのいずれかを発現するプラスミドｐＳＺ３３７７及びｐＳＺ３３８４に加えて、上述の他のプロモーターエレメントを使用するプラスミドをＳ５２０４での発現用に構築した。これらの構築物は、それらの形質転換識別名（Ｄ番号）と共に、以下のとおり記載することができる。
上記の構築物は、ＰｍＦＡＤ２−１を駆動するプロモーターエレメントを除き、ｐＳＺ３３７７又はｐＳＺ３３８４と同じである。上記の構築物に使用した種々のプロモーターエレメントの配列を以下に示す。
プラスミドｐＳＺ３３７８及びｐＳＺ３３８５に含まれるカルバモイルリン酸シンターゼ対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＣＰＳ２ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３３７９及びｐＳＺ３３８６に含まれるジフチンシンターゼ（ｄｉｐｔｈｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＤＰＳ１ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３３８０及びｐＳＺ３３８７に含まれるジフチンシンターゼ（ｄｉｐｔｈｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＤＰＳ２ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３４８０及びｐＳＺ３４８１に含まれる無機ピロホスファターゼ対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＩＰＰ１ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３５０９及びｐＳＺ３５１６に含まれるアデノシルホモシステイナーゼ対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＡＨＣ１ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３５１０に含まれるアデノシルホモシステイナーゼ対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＡＨＣ２ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３５１３及びｐＳＺ３６８９に含まれるペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＰＰＩ１ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３５１４及びｐＳＺ３５１８に含まれるペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＰＰＩ２ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３５１５及びｐＳＺ３５１９に含まれるＧＭＰシンテターゼ対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＧＭＰＳ１ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３５２０に含まれるＧＭＰシンテターゼ対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＧＭＰＳ２ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３６８４及びｐＳＺ３６８６に含まれるクエン酸シンターゼ対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＣＳ１ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３６８５に含まれるクエン酸シンターゼ対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＣＳ２ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３６８８に含まれるγグルタミルヒドロラーゼ対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＧＧＨ１ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３５１７に含まれるアセトヒドロキシ酸イソメラーゼ対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＡＨＩ１ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３５１１に含まれるアセトヒドロキシ酸イソメラーゼ対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＡＨＩ２ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３５１２に含まれるシステインエンドペプチダーゼ対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＣＥＰ１プロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３３７５及び３３８２に含まれる脂肪酸デサチュラーゼ２対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＦＡＤ２−１プロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３３７６及び３３８３に含まれる脂肪酸デサチュラーゼ２対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＦＡＤ２−２プロモーター配列）：
上述の構築物が成長及び脂肪酸プロフィールに及ぼす影響を決定するため、それらの構築物を独立にΔｆａｄ２Δｆａｔａ１株Ｓ５２０４に形質転換した。一次形質転換体をクローン精製し、標準的な脂質産生条件下、ｐＨ５．０又はｐＨ７．０で成長させた。形質転換によって生じた一組の代表的なクローンから得られたプロフィールを、表８４〜表１１４に示す。


野生型Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株（Ｓ３１５０、Ｓ１９２０又はＳ１３３１など）における内因性ＰｍＦＡＤ２−１及びＰｍＦＡＤ２−２の組み合わせベースライン発現は、５〜７％のＣ１８：２として現れる。Ｓ５２０４はＰｍＫＡＳＩＩを過剰発現し、それによりＣ１６：０からＣ１８：０への伸長がもたらされる。このＣ１８：０プールの増加は、最終的にはＰｍＳＡＤ２によって不飽和化されるため、Ｃ１８：１レベルの上昇をもたらす。さらにＳ５２０４におけるＰｍＦＡＤ２の両方のコピー（即ち、ＰｍＦＡＤ２−１及びＰｍＦＡＤ２−２）の破壊がＣ１８：１からＣ１８：２へのさらなる不飽和化を防止し、０％リノール酸（Ｃ１８：２）のユニークな高オレイン酸油（Ｃ１８：１）をもたらす。しかしながら、上述のとおり、０％Ｃ１８：２のどの株も成長が極めて悪く、成長／生産性を維持するためにリノール酸の外因的な添加を必要とする。Ｓ５２０４などの株を誘導性ＰｍＡＭＴ０３ｐによって駆動されるＰｍＦＡＤ２−１で補完すると、０％のＣ１８：２レベルで最終的な高Ｃ１８：１を維持しながらも成長表現型をレスキューすることができる。しかしながら、データは、発酵の初期段階でＰｍＡＭＴ０３が止まり、従って任意の補完株がその完全な成長及び生産性の潜在的可能性を実現する能力が深刻に損なわれることを示唆している。本研究の目標は、発酵の初期段階に（Ｔ０〜Ｔ３０時間；発酵槽中の回分供給される過剰のＮとは関係なく）補完株の効率的な成長を可能にし、次に細胞が活性脂質産生に入ると（培地中のＮが枯渇したとき）有効に止まり、従って補完株がなおも極めて高いＣ１８：１及び０％のＣ１８：２レベルで終わり得るプロモーターエレメントを同定することであった。比較として、本発明者らはまた、ＰｍＦＡｄ２−１ｐ又はＰｍＦＡＤ２−２ｐのいずれかのプロモーターエレメントによって駆動されるＰｍＦＡＤ２−１でＳ５２０４を補完した。
ＰｍＦＡＤ２−１ｐ又はＰｍＦＡＤ２−２ｐのいずれかのプロモーターエレメントによって駆動されるＰｍＦＡＤ２−１によるＳ５２０４の補完は、ＰｍＦＡＤ２−１コピー数を増幅するように設計されるか（例えばｐＳＺ３３７５又はｐＳＺ３３７６）、又はＰｍＦＡＤ２−１コピー数が１つに制限されたもの（ｐＳＺ３３８２又はｐＳＺ３３８３）のいずれかのベクターを使用すると、Ｃ１８：２レベルの完全な回復をもたらす。これらの株におけるＰｍＦＡＤ２−１のコピー数が最終Ｃ１８：２レベルに及ぼす効果は極めてごく僅かであるように見える。
他方で、新規プロモーターエレメントのいずれかによって駆動されるＰｍＦＡＤ２−１の発現は、最終的なＣ１８：２レベルの顕著な減少をもたらす。ＦＡＤ２−１を駆動する新規プロモーターを発現する様々な株の代表的なプロフィールを表８４〜表１１４に示す。Ｃ１８：２レベルのこの低下は、ＰｍＦＡＤ２−１のコピー数が１つに制限されている株ではなお一層明白である。ＰｍＤＰＳ１（Ｄ２０９１及びＤ２０９８）、ＰｍＤＰＳ２（Ｄ２０９２及びＤ２０９９）、ＰｍＰＰＩ１（Ｄ２２６３及びＤ２４４０）、ＰｍＰＰＩ２（Ｄ２２６４及びＤ２２６８）、ＰｍＧＭＰＳ１（Ｄ２２６５及びＤ２２６９）、ＰｍＧＭＰＳ２（Ｄ２２７０）などのプロモーターエレメントは、単一コピー又は複数コピーの両方のＰｍＦＡＤ２−１バージョンで０％又は０．５％未満の最終Ｃ１８：２レベルの株をもたらした。残りのプロモーターは、１〜５％の範囲の最終Ｃ１８：２レベルをもたらした。一つの予想外の結果は、Ｄ２４３４及びＤ２４３５におけるＰｍＦＡＤ２−１を駆動するＰｍＡＨＣ１ｐ及びＰｍＡＨＣ２ｐからのデータであった。これらのプロモーターは両方ともに、複数コピーＦＡＤ２−１バージョンで極めて高いレベルのＣ１８：２（９〜２０％）をもたらした。Ｄ２２６６における単一コピーバージョンでの最終Ｃ１８：２レベルは、よりトランスクリプトームデータと合致し、窒素枯渇環境で細胞が活性化して脂質を産生しているときにはＰｍＡＨＣプロモーター活性及び対応するＰｍＡＨＣ転写が重度に下方調節されることが示唆される。トランスクリプトームを簡単に見ると、ＰｍＡＨＣの初期転写が極めて高く（４０００〜５５００ＴＰＭ）、次にはそれが約２５０ＴＰＭまで急降下することが明らかになった。従って、ＰｍＦＡＤ２−１に複数のコピーを有する株（Ｄ２４３４及びＤ２４３５）においては、発酵初期に産生された多量のＰｍＦＡＤ２−１タンパク質が残存し、高いＣ１８：２レベルをもたらすことが考えられ得る。単一コピーＰｍＦＡＤ２−１株ではこれは該当せず、従ってＤ２２６６においてはＣ１８：２レベルの上昇は見られない。
０％の最終Ｃ１８：２レベルの補完株において、重要な問題は、それが最初の段階で補完されたかどうかであった。これを確かめるため、代表的な株を親Ｓ５２０４株及び先にＡＭＴ０３ｐ駆動ＰｍＦＡＤ２−１で補完したＳ２５３２（即ちＳ４６９５）株と共に９６ウェルブロックにおいてシード培地で成長させた。培養物は０．１ＯＤ単位毎ｍｌで播種し、種々の時点でＯＤ７５０を確認した。成長が極めて悪かったＳ５２０４と比較して、Ｓ４６９５及び新規に補完した株のみが２０時間及び４４時間で任意の意味のあるＯＤまで成長し（表１１５）、上記で同定されたプロモーターが初期に活性であり、細胞が活性脂質産生期間に入るとオフになることが実証された。
ここで発見されたこれらのプロモーター、又はその変異体は、微細藻類細胞を含めた細胞で発現する脂肪酸合成遺伝子（例えば、本明細書に開示されるＦＡＴＡ、ＦＡＴＢ、ＳＡＤ、ＦＡＤ２、ＫＡＳＩ／ＩＶ、ＫＡＳＩＩ、ＬＰＡＡＴ又はＫＣＳ遺伝子のいずれか）又は他の遺伝子若しくは遺伝子抑制エレメントの調節に使用し得ることが企図される。変異体は、ここに開示される配列と例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％又はそれ以上の同一性を有し得る。
実施例６４：ＳＯＳ濃度を増加させ、且つトリ飽和物を低下させるための高ＳＯＳ油の分画
乾燥分画法及び溶媒分画法を用いて微細藻類油を分画した。出発物質は、ＳＯＳトリグリセリドが高い油であった。この油はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株Ｓ７５６６から産生され、この株では内因性ＫＡＳＩＩ遺伝子がＳＡＤＩＩ遺伝子座に挿入され（従ってそれをノックアウトする）；加えて、Ｇａｒｃｉｎｉａ ｍａｎｇｏｓｔａｎａ由来のＣ１８選択的ＦＡＴＡ１遺伝子が挿入され、ＦＡＤＩＩヘアピンＲＮＡが産生された（上記に記載したとおり）。培養及び抽出後、油は精製、漂白及び脱臭した。油の脂肪酸プロフィールは表１１５に提供する。ＳＯＳ ＴＡＧ面積％は約６２％であった。ＲＢＤ処理の間、油中の総トリ飽和物（即ち、ＳＳＳ、ＰＳＳ、ＰＰＳ、ＰＰＰ等、３つの完全飽和アシル鎖を有するトリグリセリド）は５．１％から１．２％に低下した。
溶媒（アセトン又はヘキサン）及び乾燥分画を用いて油を分画した。アセトン分画（１：１油−溶媒、ｗ／ｗ；５℃で結晶化）は、ＳＯＳ高濃度化ステアリン画分の良好な回収をもたらし、オレイン画分中のＳＯＳは比較的少なかった。ＳＯＳは７７％で、ステアリン画分について総トリ飽和物＜１％であった。
ヘキサン分画（１：１油−溶媒、ｗ／ｗ；５℃で結晶化）は、より高レベル（８５％）のＳＯＳをもたらし、しかしより高いトリ飽和物（１．６％）もまたもたらした。従って、一段階溶媒分画を用いると、７５％超のＳＯＳ及び２％未満のトリ飽和物の油を得ることが可能であった。
乾燥分画もまた、ＳＯＳの高濃度化及びトリ飽和物の低下に成功した。概略的な手法は、高温での結晶化によってトリ飽和物を除去し、次に低温でＯＯＳを除去することであった。逆の順序もまた試し、より優れた結果が得られた。また、ＳＯＳ高濃度化（「ステアリン」）画分をアセトンでリンスすると、オレイン画分の除去の助けとなることも分かった。
一つの試験では、油を２４℃で結晶化させ、ステアリン画分をアセトンでリンスした。分析によれば、ＯＯＳレベルが低下したことが示された。ステアリン画分を加熱して放冷し、２９℃で一晩結晶化させた。得られた液体油を結晶化したトリ飽和物と分離すると、８４％のＳＯＳ及び＜０．５％の総トリ飽和物の生成物が得られた。リパーゼベースのｓｎ−２プロフィール分析により、当該位置の９６％超を不飽和脂肪酸が占め（９３．３％のオレイン酸、３．２％のリノール酸、及び０．２％のリノレン酸）、一方、そこに位置するステアリン酸は僅か２．２％であったことが明らかになった。
二段階乾燥分画油のＤＳＣ加熱曲線サーモグラム及びＤＳＣで得られる固形脂肪含有量曲線をコクムバターのものと比較した。２つの油は本質的に同一の最大ヒートフロー温度を有し、ＤＳＣで得られるＳＦＣ曲線は重ね合わせることができる。油は機能上コクムバターと同様の挙動を示すと予想し得る。
実施例６５：６０％超のＳＯＳ含有量の微生物油の生成
ここで、本発明者らは、微細藻Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおいて、ＳＡＤ２遺伝子の対立遺伝子の破壊、ＫＡＳＩＩの過剰発現、内在性ＦＡＴＡ−１のノックアウト、内在性ＦＡＴＡと比べてよりステアリン酸特異的なＦＡＴＡ（Ｇａｒｃｉｎｉａ ｍａｎｇｏｓｔａｎａ由来のＧａｒｍＦＡＴＡ１）の過剰発現及びＦＡＤ２ ＲＮＡｉの活性化により、本発明者らが構造化脂肪として有用な６０％超のＳＯＳを蓄積する能力を有する株を作成することを実証する。
ＳＡＤ活性を低下させるため、ＳＡＤ２−１及びＳＡＤ２−２対立遺伝子において組み換えられ、且つ選択可能なマーカーＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈｉａｌｉａｎａ ＴＨＩＣ（ＡｔＴＨＩＣ、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓでの発現にコドン最適化されている）を発現するように設計されたＤＮＡ構築物で株Ｓ３１５０を形質転換した。ＴＨＩＣは４−アミノ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリミジンシンターゼをコードし、それによりチアミンの添加なしに成長することを可能にする。形質転換体は外因性チアミンの非存在下で選択した。
ＳＡＤ２−１除去構築物ｐＳＺ２６０１を作製するため、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＴＨＩＣ遺伝子（ＡｔＴＨＩＣ、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓでの発現にコドン最適化されている）を形質転換の選択可能なマーカーとして利用した。形質転換ＤＮＡの配列は配列番号１４８に示される。関連する制限部位は小文字の太字で示され、５’−３’にＢｓｐＱＩ、ＰｍｅＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩ及びＰｍｅＩである。構築物の５’及び３’隣接部の下線の配列は、ＳＡＤ２−１遺伝子座における相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、ＡｔＴＨＩＣ遺伝子（４−アミノ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリミジンシンターゼ活性をコードし、それにより外因性チアミンの非存在下での株の成長を可能にする）の発現を駆動するＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＡＣＴプロモーター（ＣｐＡＣＴ）は、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＡｔＴＨＩＣのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＣｖＮＲ）遺伝子の３’ＵＴＲは、スモールキャピタルにより示す。
ｐＳＺ２６０１由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：


ＳＡＤ２−１破壊構築物、ｐＳＺ２６０７からの形質転換ＤＮＡの配列は、配列番号１４９に示される。関連する制限部位は小文字の太字で示され、５’−３’にＰｍｅＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩ及びＰｍｅＩである。構築物の５’及び３’隣接部の下線の配列は、ＳＡＤ２−１遺伝子座における相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、ＡｔＴＨＩＣ遺伝子（４−アミノ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリミジンシンターゼ活性をコードし、それにより外因性チアミンの非存在下での株の成長を可能にする）の発現を駆動するＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＡＣＴプロモーター（ＣｐＡＣＴ）は、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＡｔＴＨＩＣのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＣｖＮＲ）遺伝子の３’ＵＴＲは、スモールキャピタルにより示す。
ｐＳＺ２６０７由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：


ＳＡＤ２−２破壊構築物、ｐＳＺ２６２２からの形質転換ＤＮＡの配列は、以下の配列番号１５０に示される。関連する制限部位は小文字の太字で示され、５’−３’にＢｓｐＱＩ、ＰｍｅＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩ及びＰｍｅＩである。構築物の５’及び３’隣接部の下線の配列は、ＳＡＤ２−１遺伝子座における相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、ＡｔＴＨＩＣ遺伝子（４−アミノ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリミジンシンターゼ活性をコードし、それにより外因性チアミンの非存在下での株の成長を可能にする）の発現を駆動するＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＡＣＴプロモーター（ＣｐＡＣＴ）は、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＡｔＴＨＩＣのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＣｖＮＲ）遺伝子の３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。
ｐＳＺ２６２２由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：


それぞれｐＳＺ２６０１、ｐＳＺ２６０７及びｐＳＺ２６２２に由来する構築物Ｄ１５５７、Ｄ１５６５及びＤ１５６６を、先述のとおりＳ３１５０に形質転換した。一次形質転換体をクローン精製し、低窒素脂質産生条件下、ｐＨ５で成長させた。代表的なクローンから得られた脂肪酸プロフィールを表１１７にまとめる。Ｄ１５５７及びＤ１５６５形質転換体に由来するＳＡＤ２−１破壊株はＣ１８：１を代償に１３．４％のＣ１８：０を蓄積したことから、これらの株でＳＡＤ活性が著しく低下したことが示される。ＳＡＤ２−２破壊株ではＣ１８：０レベルは８．５％に増加したに過ぎなかったことから、ＳＡＤ２−２の発現又は活性がＳＡＤ２−１より低かったことが示唆される。本発明者らはまた、Ｃ１８：０が上昇した株においてＣ２０：０レベルが１．１％まで増加したことも観察し、Ｃ１８：０が小胞体（ＥＲ）における脂肪酸伸長反応に有効なプライマーであったことが実証された。
Ｃ１６：０を代償にしてＣ１８：０蓄積を増加させるため、本発明者らは、ＳＡＤ２−１を除去すると同時にコドン最適化バージョンの内在性β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＰｍＫＡＳＩＩ）遺伝子を過剰発現するＤＮＡ構築物を作成した。ＳＡＤ２−１除去、ＰｍＫＡＳＩＩ過剰発現構築物、ｐＳＺ２６２４からの形質転換ＤＮＡの配列は、以下の配列番号１５１に示される。関連する制限部位は小文字の太字で示され、５’−３’にＰｍｅＩ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、ＳａｃＩ、ＡｖｒＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＡｆｌＩＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｓｐＱＩ及びＰｍｅＩである。構築物の５’及び３’隣接部の下線の配列は、ＳＡＤ２−１遺伝子座における相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。ＳＡＤ２−１ ５’組み込み隣接部は内因性ＳＡＤ２−１プロモーターを含み、ＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子のインサイチューでの活性化を可能にした。５’から３’方向に進んで、ＰｍＫＡＳＩＩプラスチド標的配列をコードする領域は、小文字、下線のイタリックにより示す。成熟ＰｍＫＡＳＩＩポリペプチドをコードする配列は小文字のイタリックで示され、一方、３ｘＦＬＡＧエピトープコード配列は太字のイタリックである。ＰｍＫＡＳＩＩ−ＦＬＡＧのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示す。２つのスペーサー領域は小文字テキストにより表す。ＡｔＴＨＩＣ遺伝子の発現を駆動するＣｐＡＣＴプロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＡｔＴＨＩＣのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＣｖＮＲ）遺伝子の３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。
ｐＳＺ２６２４由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：



本例の方法を用いて、ＫＡＳＩＩ、及びＧａｒｃｉｎｉａ ｍａｎｇｏｓｔａｎａ ＦＡＴＡを過剰発現させ、及び内在性ＳＡＤ、ＦＡＤ２、及びＦＡＴＡの発現を低下させることにより、本発明者らは、５５％超のＳＯＳで、Ｓａｔ−Ｏ−Ｓａｔ（ここでＯはオレイン酸であり、Ｓａｔは任意の飽和脂肪酸である）が約７０〜７５％及びトリ飽和（ｔｒｉｓａｔｕｒａｔａｔｅｄ）ＴＡＧが６．５％未満の油を産生したＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの株を作製した。
実施例６６：ＫＡＳＩＩ、ＦＡＴＡ及びＬＰＡＡＴ導入遺伝子を組み合わせることによるＳＯＳが高い油の生成
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおいて、本発明者らは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩを過剰発現させ、内在性ＳＡＤ２対立遺伝子をノックアウトし、内在性ＦＡＴＡ対立遺伝子をノックアウトし、並びにＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ由来のＬＰＡＡＴ及びＧａｒｃｉｎｉａ ｍａｎｇｏｓｔａｎａ由来のＦＡＴＡ遺伝子（「ＧａｒｍＦＡＴ１」）の両方を過剰発現させた。得られた株は、５５％超のＳＯＳ、７０％超のＳａｔ−Ｏ−Ｓａｔ、及び８％未満のトリ飽和ＴＡＧを有する油を産生した。
ＳＡＤ２部位における相同組換え用に設計されたフランキング領域を有する線状化プラスミドで基本株を形質転換した。上記の例にあるとおり、構築物はＳＡＤ２を除去し、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩを過剰発現した。ＴｈｉＣ選択マーカーを使用した。この株を、インベルターゼを選択マーカーとして使用する６Ｓ染色体部位における相同組換えによって、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＳＡＳＤ１プラスチド標的ペプチドを有するＧａｒｍＦＡＴＡ１を過剰発現するように設計された構築物でさらに形質転換した。得られた株は、約６２％のステアリン酸、６％のパルミチン酸、５％のリノール酸、４５％のＳＯＳ及び２０％のトリ飽和物を有する油を産生した。
ＧａｒｍＦＡＴＡ１発現構築物（ｐＳＺ３２０４）からの形質転換ＤＮＡの配列は、以下の配列番号１５２に示される。関連する制限部位は小文字の太字で示され、５’−３’にＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｖｒＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、ＡｆｌＩＩ、ＳａｃＩ及びＢｓｐＱＩである。構築物の５’及び３’隣接部の下線の配列は、６Ｓ遺伝子座における相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、株による外因性ショ糖の利用を可能にするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＵＣ２（ＳｃＳＵＣ２）遺伝子の発現を駆動するＣｒＴＵＢ２プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃＳＵＣ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックにより表す。ＣｖＮＲ遺伝子の３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。スペーサー領域は小文字テキストにより表す。キメラＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿ＧａｒｍＦＡＴＡ１＿ＦＬＡＧ遺伝子の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＳＡＤ２−２（ＰｍＳＡＤ２−２）プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。イニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示す；ＣｐＳＡＤ１ｔｐをコードする配列は、小文字、下線のイタリックにより表し；ＧａｒｍＦＡＴＡ１成熟ポリペプチドをコードする配列は、小文字のイタリックにより示し；及び３Ｘ ＦＬＡＧエピトープタグは、大文字、太字のイタリックにより表す。第２のＣｖＮＲ ３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。
ｐＳＺ３２０４由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：



得られた株を、内在性ＦＡＴＡで組み換えられ（及びそれによりそれを破壊し）、またＵＡＰＡ１プロモーターの制御下でＢ．ｎａｐｕｓ由来のＬＰＡＡＴも発現するように設計された構築物で、且つメリビオース（ｍｅｌｂｉｏｓｅ）での選択を伴う選択可能なマーカーとしてαガラクトシダーゼを使用して、さらに形質転換した。得られた株は、ＳＯＳ（約５７〜６０％）及びＳａｔ−Ｏ−Ｓａｔ（約７０〜７６％）の産生の増加及びトリ飽和物量（４．８〜７．６％）の減少を示した。
本発明者らがＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ＬＰＡＴ２（Ｂｎ１．１３）遺伝子及びＰｍＦＡＤ２ｈｐＡ ＲＮＡｉ構築物の両方をＦＡＴＡ−１遺伝子座に標的化することによってＳＯＳ産生を最大化し且つトリ飽和ＴＡＧの形成を最小化した高Ｃ１８：０ Ｓ６５７３バックグラウンドで、株を作成した。ＰｍＦＡＤ２ｈｐＡ発現構築物ｐＳＺ４１６４からの形質転換ＤＮＡの配列は、以下の配列番号１５３に示される。関連する制限部位は小文字の太字で示され、５’−３’にＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｄｅＩ、ＮｓｉＩ、ＡｆｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｉＷＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ及びＢｓｐＱＩである。構築物の５’及び３’隣接部の下線の配列は、ＦＡＴＡ−１遺伝子座における相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、株による外因性メリビオースの利用を可能にするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＭＥＬ１（ＳｃａｒＭＥＬ１）遺伝子の発現を駆動するＰｍＨＸＴ１プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃａｒＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックにより表す。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＰＧＫ遺伝子の３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。スペーサー領域は小文字テキストにより表す。ＢｎＬＰＡＴ２（Ｂｎ１．１３）遺伝子の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＡＰＡ１プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。イニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示す；ＢｎＬＰＡＴ２（Ｂｎ１．１３）をコードする配列は、小文字、下線のイタリックにより表す。ＣｖＮＲ遺伝子の３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。第２のスペーサー領域は小文字テキストにより表す。ＰｍＦＡＤ２ｈｐＡヘアピン配列の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ＣｒＴＵＢ２プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。フォワード方向のＦＡＤ２エクソン１配列は小文字のイタリックで示し；ＦＡＤ２イントロン１配列は小文字、太字のイタリックで表し；ショートリンカー領域は小文字テキストで示し、及び逆方向のＦＡＤ２エクソン１配列は小文字、下線のイタリックで示す。第２のＣｖＮＲ ３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。
ｐＳＺ４１６４由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：



本発明の記載される実施形態は単に例示を目的としているに過ぎず、当業者には数多くの変形例及び改良例が明らかであろう。かかる変形例及び改良例は全て、本発明の範囲内に含まれることが意図される。例えば、様々なトリグリセリド油を、油又は油から作られた化学品の極性、溶解性、及び泡高さなどのパラメータを適合させるように中鎖及び長鎖脂肪酸の混合物に調整することができる。加えて、遺伝子のノックアウトが求められる場合、突然変異及びＲＮＡｉ又はアンチセンスなどの阻害性物質の発現を含めたノックダウン技術を用いて同等の結果を達成し得る。

Claims (20)

  1. トリグリセリド油を生成するための方法であって、該方法は、
    ａ．Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属またはＣｈｌｏｒｅｌｌａ属の組換え細胞を提供する工程であって、該細胞が、内因性脂肪アシル−ＡＣＰチオエステラーゼＡ（ＦＡＴＡ）遺伝子のノックアウトまたはノックダウンおよびオレオイル選択的リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子を含む、工程と、
    ｂ．該細胞を培養して、該油を生成する工程と、
    ｃ．該油を単離する工程と
    を含む、方法。
  2. 前記外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子が、配列番号９２または９３と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、または前記外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子が、配列番号１５７と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するＬＰＡＡＴをコードする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記細胞が、内因性のステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）遺伝子または脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）遺伝子のノックダウンまたはノックアウトをさらに含む、
    請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記細胞が、ケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）をコードする外来性遺伝子をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記外来性遺伝子が、配列番号１６０または配列番号１６１と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するＫＡＳをコードする、請求項４に記載の方法。
  6. 前記細胞が、オレオイル選択的ＦＡＴＡ遺伝子をコードする外来性遺伝子をさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記オレオイル選択的ＦＡＴＡ遺伝子をコードする外来性遺伝子が、配列番号１５２と少なくとも９０％の同一性を有するか、または配列番号１５６と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するＦＡＴＡをコードする、請求項６に記載の方法。
  8. 前記トリグリセリド油が、少なくとも６０％のステアリン酸−オレイン酸−ステアリン酸を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記トリグリセリド油が、少なくとも８０％のステアリン酸−オレイン酸−ステアリン酸を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記細胞が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属またはＣｈｌｏｒｅｌｌａ属の組換え細胞であって、該細胞が、内因性脂肪アシル−ＡＣＰチオエステラーゼＡ（ＦＡＴＡ）遺伝子のノックアウトまたはノックダウンおよびオレオイル選択的リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子を含む、細胞。
  12. 前記外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子が、配列番号９２または９３と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、または前記外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子が、配列番号１５７と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するＬＰＡＡＴをコードする、請求項１１に記載の細胞。
  13. 前記細胞が、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）遺伝子または脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）遺伝子のノックダウンまたはノックアウトをさらに含む、請求項１１または１２に記載の細胞。
  14. 前記細胞が、ケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）をコードする外来性遺伝子をさらに含む、請求項１１〜１３のいずれかに記載の細胞。
  15. 前記外来性遺伝子が、配列番号１６０または配列番号１６１と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するＫＡＳをコードする、請求項１４に記載の細胞。
  16. 前記細胞が、オレオイル選択的ＦＡＴＡ遺伝子をコードする外来性遺伝子をさらに含む、請求項１１〜１５のいずれかに記載の細胞。
  17. 前記オレオイル選択的ＦＡＴＡ遺伝子をコードする外来性遺伝子が、配列番号１５２と少なくとも９０％の同一性を有するか、または配列番号１５６と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するＦＡＴＡをコードする、請求項１６に記載の細胞。
  18. 前記細胞がトリグリセリド油を生成し、該トリグリセリド油が、少なくとも６０％のステアリン酸−オレイン酸−ステアリン酸を含む、請求項１１〜１７のいずれかに記載の細胞。
  19. 前記トリグリセリド油が、少なくとも８０％のステアリン酸−オレイン酸−ステアリン酸を含む、請求項１８のいずれかに記載の細胞。
  20. 前記細胞が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓである、請求項１１〜１９のいずれかに記載の細胞。
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