JP2019030335A - 調整油 - Google Patents

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Abstract

【課題】所望の脂肪酸プロフィール及び位置特異的又は立体特異的プロフィールを有するトリグリセリド油を産生する油産生組換え細胞を提供すること。【解決手段】操作される遺伝子には、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、及びリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼをコードするものが含まれる。産生される油は高い酸化安定性又は熱安定性を有することができ、又はフライ油、ショートニング、ロールイン用ショートニング、テンパリング脂肪、ココアバター代用物として、潤滑剤として、又は様々な化学プロセスの供給原料として有用であり得る。この脂肪酸プロフィールは中鎖プロフィールを高濃度化することができ、又は油は飽和−不飽和−飽和型のトリグリセリドを高濃度化することができる。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１３年１０月４日に出願された米
国仮特許出願第６１／８８７，２６８号明細書；２０１３年１０月１７日に出願された同
第６１／８９２，３９９号明細書；２０１３年１０月２４日に出願された同第６１／８９
５，３５５号明細書；２０１４年１月３日に出願された同第６１／９２３，３２７号明細
書；及び２０１４年７月１０日に出願された同第６２／０２３，１０９号明細書の利益を
主張する。これらの出願の各々は、あらゆる目的から全体として参照により本明細書に援
用される。本願は、２０１４年７月１０日に出願された「Ｎｏｖｅｌ Ｋｅｔｏａｃｙｌ
ＡＣＰ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題さ
れる米国仮特許出願第６２／０２３，１１２号明細書（これもまた、本明細書によってあ
らゆる目的から全体として参照により援用される）に開示されるものに関する主題を含む
。詳細には、米国仮特許出願第６２／０２３，１１２号明細書の表１、表７及び表８、並
びに同明細書中に特定される対応する配列が、本明細書によって参照により援用される。
配列表の参照
本願は、本明細書に添付される配列表を含む。
本発明の実施形態は、油／脂肪、燃料、食品、及び油脂化学品並びに遺伝子操作された
細胞の培養物からのそれらの生成に関する。特定の実施形態は、グリセロール骨格に特定
の位置特異的パターンで脂肪酸アシル基を有するトリグリセリドの含有量が高い油、高度
に安定した油、高濃度のオレイン酸又は中鎖脂肪酸を含む油、及びかかる油から生成され
る製品に関する。
国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６０３２
号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレット、国際公開第２０１
１／１５０４１１号パンフレット、国際公開第２０１２／０６１６４７号パンフレット、
及び国際公開第２０１２／１０６５６０号パンフレットは、油及びそうした油を微細藻類
を含めた微生物で生成するための方法を開示している。これらの公報はまた、かかる油を
使用した油脂化学品及び燃料の作製についても記載している。
テンパリングは、脂肪又は脂肪含有物質の温度を操作することにより脂肪を所望の多形
形態に変換するプロセスであり、チョコレートの製造においてよく用いられる。
脂肪酸アシル−ＣｏＡ伸長経路のある種の酵素は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ分子の長さを
伸ばす働きをする。エロンガーゼ複合酵素は脂肪酸アシル−ＣｏＡ分子を２炭素ずつ加え
て伸ばし、例えばミリストイル−ＣｏＡからパルミトイル−ＣｏＡ、ステアロイル−Ｃｏ
Ａからアラキジル−ＣｏＡ、又はオレオイル−ＣｏＡからエイコサノイル−ＣｏＡ、エイ
コサノイル−ＣｏＡからエルシル−ＣｏＡに伸ばす。加えて、エロンガーゼ酵素はまたア
シル鎖長も２炭素ずつ増やして伸ばす。ＫＣＳ酵素はアシル−ＣｏＡ分子をマロニル−Ｃ
ｏＡの２つの炭素と縮合させてβ−ケトアシル−ＣｏＡにする。ＫＣＳ及びエロンガーゼ
は、特定の炭素長、修飾（ヒドロキシル化など）、又は飽和度のアシル基質の縮合に対し
て特異性を示し得る。例えば、ホホバ（Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）の
β−ケトアシル−ＣｏＡ合成は、一価不飽和及び飽和Ｃ１８−及びＣ２０−ＣｏＡ基質に
対する選択性によりトランスジェニック植物におけるエルカ酸の産生を上昇させることが
実証されており（Ｌａｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１９９６，Ｖ
ｏｌ ８（２），ｐｐ．２８１−２９２）、一方、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅ
ｉの特異的エロンガーゼ酵素は、短鎖及び中鎖飽和ＣｏＡ基質の伸長に選択性を示す（Ｌ
ｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００６，Ｖｏｌ １２６（４），ｐｐ．６９１−９）
。
ＩＩ型脂肪酸生合成経路は、可溶性タンパク質によって触媒される一連の反応を利用し
、酵素間で中間体がアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）のチオエステルとしてやり取
りされる。対照的に、Ｉ型脂肪酸生合成経路は単一の大型多官能性ポリペプチドを用いる
。
油産生性の非光合成藻類であるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓは、栄養
炭素供給が過剰な、しかし他の必須栄養素は制限されているために細胞分裂が阻害される
場合の条件下で、多量のトリアシルグリセリド油を蓄える。最大Ｃ１８の炭素鎖長を有す
る脂肪酸のバルク生合成がプラスチドで起こる；次に脂肪酸が小胞体に輸送され、そこで
Ｃ１８を越える伸長及びトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）への取り込みが（それが起こる
場合には）起こると考えられている。脂質は脂肪体と呼ばれる大きい細胞質小器官に蓄え
られ、環境条件が成長に有利に変化すると直ちに動員され、同化代謝のためのエネルギー
及び炭素分子を提供する。
国際公開第２００８／１５１１４９号 国際公開第２０１１／１５０４１０号 国際公開第２０１１／１５０４１１号 国際公開第２０１２／０６１６４７号 国際公開第２０１２／１０６５６０号
Ｌａｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１９９６，Ｖｏｌ ８（２），ｐｐ．２８１−２９２ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００６，Ｖｏｌ １２６（４），ｐｐ．６９１−９
ある実施形態において、方法は、組換え細胞を培養する工程であって、細胞が、
（ｉ）配列番号４６〜４９のいずれかによってコードされる酵素と少なくとも６０、６５
、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質
を任意選択でコードする外来性ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ遺伝子と、配列番号１１、８７、
８９、１５９、１６２又は１６３と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９
０、又は９５％の核酸配列同一性を有するタンパク質を任意選択でコードする少なくとも
１つのＦＡＴＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子とを発現するか；
（ｉｉ）配列番号１２９〜１４７のいずれかと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０
、８５、９０、又は９５％の配列同一性を有する窒素感受性プロモーターの制御下でＦＡ
ＴＡ、ＦＡＴＢ、ＫＡＳＩ、ＫＡＳＩＩ、ＬＰＡＡＴ、ＳＡＤ、又はＦＡＤ２をコードす
る遺伝子を発現するか；又は
（ｉｉｉ）ＳＡＤ遺伝子、ＦＡＤ２遺伝子、及びＦＡＴＡ遺伝子のノックアウト又はノッ
クダウンを有し、外来性Ｃ１８選択的ＦＡＴＡ遺伝子、オレオイル選択的ＬＰＡＡＴ遺伝
子、及びＫＡＳＩＩ遺伝子を過剰発現する、工程と；
細胞から油を抽出する工程とを含む。
関連する実施形態において、細胞はタイプ（ｉｉ）のものであり、且つ配列番号１１、
８７、８９、１５９、１６２又は１６３のいずれかと少なくとも６０、６５、７０、７５
、８０、８５、９０、又は９５％の核酸配列同一性を有するタンパク質を任意選択でコー
ドする第２のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを少なくとも含む。油は少なくとも３０％
のＣ１０：０及び少なくとも３０％のＣ１２：０を有し得る。油はＡＳＴＭ Ｄ４４５に
よって測定したとき４０℃で３０ｃＳ未満及び任意選択で２５ｃＳ±２０％の粘度を有し
得る。Ｃ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸は２０％、１０％又は５％以内にバランスしてい
てもよい。
関連する実施形態において、細胞はタイプ（ｉｉｉ）の細胞であり、細胞油は少なくと
も６０％のステアリン酸−オレイン酸−ステアリン酸（ＳＯＳ）を含む。任意選択で、Ｃ
１８選択的ＦＡＴＡ遺伝子は、配列番号１５６と少なくとも６０、６５、７０、７５、８
０、８５、９０、又は９５％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードし、ＬＰＡＡ
Ｔ遺伝子は、配列番号１５７と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、
又は９５％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードし及び／又はＫＡＳＩＩ遺伝子
は、配列番号１６０又は１６１と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０
、又は９５％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードする。
任意選択で、細胞は微細藻であり、任意選択でＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅの微
細藻、及び任意選択でＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻である。
関連する実施形態には、前述の方法の一つに従い製造される油、石鹸、油脂化学品、食
料品、又は他の油由来製品がある。
本発明の実施形態において、方法は、油産生組換え細胞を培養する工程を含む。細胞は
、ＦＡＭＥ ＧＣ／ＦＩＤ分析によって決定するとき少なくとも０．１のパルミトレイン
酸対パルミチン酸比及び／又は０．５％以上のパルミトレイン酸レベルによって特徴付け
られる脂肪酸プロフィールを有する油を産生する活性を有するパルミチン酸ＡＣＰ−デサ
チュラーゼ酵素をコードする外来遺伝子を含む。任意選択で、細胞は、油産生組換え真核
微細藻の細胞である。
関連する実施形態において、外来遺伝子は、ＡＣＰ−パルミチン酸に対して不飽和化活
性を有するパルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＰＡＤ）をコードする。任意選択で、
外来性ＰＡＤ遺伝子は、ＡＣＰ−パルミチン酸に対する活性が増加したステアロイル−Ａ
ＣＰデサチュラーゼ変異体をコードする。変異体はＬ１１８Ｗ突然変異体であってもよい
。遺伝子は、真核油産生微細藻で遺伝子産物を発現させる活性を有するプロモーター、プ
ラスチド標的トランジットペプチド、及び５’ＵＴＲに作動可能に連結していてもよい。
微細藻は、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅの微細藻、及び任意選択でＣｈｌｏｒｅｌ
ｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻であってもよい。或いは、微細藻は、配列番
号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオチド配列
同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡを有する。
任意選択で、脂肪酸プロフィールは３．５％未満の飽和脂肪酸によってさらに特徴付け
られる。任意選択で、細胞は乾燥細胞重量基準で少なくとも４０％の油となるまで培養さ
れる。任意選択で、微細藻は、内在性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのノックアウト又
はノックダウン及び／又は外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子をさらに含む。これによって油中の飽
和脂肪酸レベルを低減し得る。例えば、外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子を内因性アシル−ＡＣＰ
チオエステラーゼのコード領域に挿入することができる。任意選択で、挿入されたＫＡＳ
ＩＩ遺伝子は、内因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼと逆向きにされる。
これらの実施形態のいずれにおいても、油はショ糖上での微細藻の従属栄養培養によっ
て生成することができ、微細藻は、それがショ糖を代謝することを可能にする外来性イン
ベルターゼ遺伝子を含む。
油は回収されてもよい。回収された油は、フライ調理に又は加工食品の一成分として使
用され得る。油は微細藻類ステロールプロフィールを有し得る。具体的な実施形態におい
て、微細藻類ステロールプロフィールは、β−シトステロールと比べたエルゴステロール
の過剰及び／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又は
クリオナステロールの存在によって特徴付けられる。
別の実施形態において、方法は、油産生細胞、任意選択で微細藻を培養する工程を含み
、それにより細胞は、１０％未満のパルミチン酸、超（ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ）を有
する油を産生する。任意選択で、細胞は、ＦＡＤ及びＦＡＴＡノックアウトを有する微細
藻であり、外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子を発現する。
関連する実施形態において、方法は、油産生細胞、任意選択で微細藻を培養する工程を
含み、それにより細胞は、ラウリン酸とミリスチン酸との合計が少なくとも５０％であり
；総飽和脂肪酸が少なくとも５０％であり、且つカプリン酸及びラウリン脂肪酸レベルが
２０％以内にバランスしており；又はカプリン酸が少なくとも４５％であり、且つラウリ
ン酸が少なくとも４５％である脂肪酸プロフィールを有する油を産生する。具体的な関連
実施形態において、ラウリン酸とミリスチン酸との合計は少なくとも６０％、７０％又は
７％％である。任意選択で、細胞は外来性植物ＦＡＴＢ遺伝子を含む。任意選択で、細胞
は外来性の外来性ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ遺伝子を含む。
油は回収されてもよい。回収された油は、フライ調理に又は加工食品の一成分として使
用され得る。油は微細藻類ステロールプロフィールを有し得る。具体的な実施形態におい
て、微細藻類ステロールプロフィールは、β−シトステロールと比べたエルゴステロール
の過剰及び／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又は
クリオナステロールの存在によって特徴付けられる。油は食料品又は化学品の作製に使用
することができる。
別の実施形態において、方法は、油産生細胞、任意選択で微細藻を培養する工程を含み
、それにより細胞は、１０％以下のリノレン酸及び２０％以上のリノール酸によって特徴
付けられる脂肪酸プロフィールを有する油を産生する。細胞は、過剰発現するＫＡＳＩＩ
遺伝子とＦＡＤ遺伝子置換とを含むことができる。任意選択で、細胞は、オレイン酸特異
的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子を含むか、又は１つ以上のＦ
ＡＴＡ対立遺伝子のノックアウトを、オレイン酸特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ
をコードする外来遺伝子と共に含む。ＦＡＤ遺伝子の過剰発現は、調節可能なプロモータ
ーの環境制御によることができる。油は、回収して、食料品又は化学品の製造に使用する
ことができる。油は微細藻類ステロールプロフィールを含み得る。
別の態様において、本発明は、トリグリセリド油の生成方法を提供し、ここでこの方法
は、（ａ）窒素充満条件下で油産生細胞を培養する工程であって、それにより細胞の数を
増加させる工程と、次に；（ｂ）窒素欠乏条件下で細胞を培養する工程であって、それに
より細胞に乾燥細胞重量基準で少なくとも２０％までトリグリセリドを蓄積させる工程と
（窒素充満条件下で活性及び窒素飢餓条件下で不活性なプロモーターであって、ｐＨ７．
０と比較してｐＨ５．０でその活性の少なくとも半分を維持するプロモーターの制御下に
あるＦＡＤｃ（ＦＡＤ２）対立遺伝子、任意選択で単独の対立遺伝子を含む）；（ｃ）油
を得る工程であって、油が、窒素飢餓条件下におけるＦＡＤｃ遺伝子の下方調節に起因し
て減少したリノール酸を含む、工程とを含む。
一部の実施形態では、細胞はインベルターゼの存在下でショ糖を使用して６．５未満の
ｐＨで培養される。ある場合には、インベルターゼは細胞によって産生される。ある場合
には、インベルターゼは、細胞が発現する外来遺伝子から産生される。
一部の実施形態では、得られる油は、３％、２％、１％、又は０．５％未満のリノール
酸を含む脂肪酸プロフィールを有する。
一部の実施形態では、細胞は、リノール酸の変化を増幅させるためＦＡＤｃノックアウ
トをさらに含む。ある場合には、窒素充満条件と窒素飢餓条件との間でＦＡＤｃの転写物
レベルは１０倍以上低下する。
別の態様において、本発明は、トリグリセリド細胞油の生成方法を提供し、この方法は
、外来性ＦＡＴＢ遺伝子と外来性ＫＡＳＩ遺伝子とを含む組換え細胞を培養する工程を含
み、ここでＫＡＳＩ遺伝子の発現によって、油は、ＦＡＴＢ遺伝子を有するがＫＡＳＩ遺
伝子を有しない対照細胞と比べてより短鎖の分布を有する。
別の態様において、本発明は、配列番号９０若しくは９１と少なくとも７５、８０、８
５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は８８％のヌクレオチ
ド同一性又は遺伝子コードの縮重に起因して等価な配列を有するか、或いは配列番号９０
又は９１と少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、
９７、９８、又は８８％のアミノ酸同一性を有する酵素をコードするＦＡＴＢアシル−Ａ
ＣＰチオエステラーゼ遺伝子を含む組換え細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は
、ＦＡＴＢ遺伝子の発現に起因して脂肪酸プロフィールがシフトしているトリグリセリド
を産生する。
本発明のある実施形態には、油の生成方法がある。この方法は、遺伝子操作された微生
物、任意選択で微細藻から細胞油を得る工程と、細胞油を分画してステアリン画分を生成
する工程とを含む。ステアリン画分は、少なくとも７０％のＳＯＳを有してトリ飽和物が
４％以下であるＴＡＧプロフィールと、ｓｎ−２位における最小９０％のオレイン酸によ
って特徴付けられるｓｎ−２プロフィールとによって特徴付けることができる。任意選択
で、微生物は、過剰発現するＫＡＳＩＩ遺伝子、ＳＡＤノックアウト若しくはノックダウ
ン、又は外来性Ｃ１８選択的ＦＡＴＡ遺伝子、外来性ＬＰＡＡＴ、及びＦＡＤ２ノックア
ウト若しくはノックダウンのうちの１つ以上を含む微細藻である。任意選択で、ステアリ
ン画分は、コクムバターの等価な曲線と本質的に同一の、最大ヒートフロー温度又はＤＳ
Ｃで得られるＳＦＣ曲線を有する。分画は、ＯＯＳを除去する第１の温度、任意選択で約
２４℃、及びトリ飽和物を除去する第２の温度、任意選択で約２９℃で行われる二段階分
画であってもよい。
本発明の実施形態において、方法は、ＴＡＧプロフィールによって特徴付けられるトリ
グリセリド油を生成する。この方法は、ＫＡＳＩＩ遺伝子、外来性ＦＡＴＡ遺伝子及び外
来性ＬＰＡＡＴ遺伝子を過剰発現する油産生プラスチド宿主細胞を提供する工程と、油を
産生させるため細胞を培養する工程と、油を分離する工程とを含み；ＴＡＧプロフィール
は５０％超のＳＯＳ及び１０％未満のトリ飽和物を有する。
関連する実施形態において、細胞は、内在性ＳＡＤ２遺伝子のノックダウン又はノック
アウト及び／又は内在性ＦＡＴＡ遺伝子のノックダウン又はノックアウトを含む。外来性
ＦＡＴＡ遺伝子は、配列番号９２と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９
６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する機能性ＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエ
ステラーゼタンパク質をコードすることができる。外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子は、配列番号
９３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％
の配列同一性を有する機能性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質
をコードすることができる。任意選択で、宿主細胞は微細藻、任意選択でＴｒｅｂｏｕｘ
ｉｏｐｈｙｃｅａｅの微細藻、及び任意選択でＣｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈ
ｅｃａ属の微細藻であって、且つ任意選択で、配列番号７６と少なくとも６５、７０、７
５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオチド配列同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡを
有する微細藻であってもよい。
ある実施形態では、任意選択でＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅのもの、及び任意選
択でＣｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属のものであって、且つ任意選択で
、配列番号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオ
チド配列同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡを有する組換え微細藻類（ｍｉｃｒｏｌａｇａ
ｌ）宿主細胞が、配列番号９２と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６
、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する機能性ＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエス
テラーゼタンパク質をコードする外来性ＦＡＴＡ遺伝子を発現する。
ある実施形態では、任意選択でＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅのもの、及び任意選
択でＣｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属のものであって、且つ任意選択で
、配列番号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオ
チド配列同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡを有する組換え微細藻類（ｍｉｃｒｏｌａｇａ
ｌ）宿主細胞が、配列番号９３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６
、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する機能性リゾホスファチジン酸アシルトラ
ンスフェラーゼタンパク質をコードする外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子を発現する。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
（ａ）組換え細胞を培養する工程であって、前記細胞が
（ｉ）配列番号４６〜４９のいずれかによってコードされる酵素と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を任意選択でコードする外来性ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ遺伝子と、配列番号１１、８７、８９、１５９、１６２又は１６３と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％の核酸配列同一性を有するタンパク質を任意選択でコードする少なくとも１つのＦＡＴＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子とを発現するか；
（ｉｉ）配列番号１２９〜１４７のいずれかと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％の配列同一性を有する窒素感受性プロモーターの制御下でＦＡＴＡ、ＦＡＴＢ、ＫＡＳＩ、ＫＡＳＩＩ、ＬＰＡＡＴ、ＳＡＤ、又はＦＡＤ２をコードする遺伝子を発現するか；又は
（ｉｉｉ）ＳＡＤ遺伝子、ＦＡＤ２遺伝子、及びＦＡＴＡ遺伝子のノックアウト又はノックダウンを有し、外来性Ｃ１８選択的ＦＡＴＡ遺伝子、オレオイル選択的ＬＰＡＡＴ遺伝子、及びＫＡＳＩＩ遺伝子を過剰発現する、工程と；
（ｂ）前記細胞から油を抽出する工程と
を含む方法。
（項目２）
前記細胞がタイプ（ｉ）の細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞が、配列番号１１、８７、８９、１５９、１６２又は１６３のいずれかと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％の核酸配列同一性を有するタンパク質を任意選択でコードする第２のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを少なくとも含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記油が少なくとも３０％のＣ１０：０及び少なくとも３０％のＣ１２：０を含む、項目２又は３に記載の方法。
（項目５）
前記油が、ＡＳＴＭ Ｄ４４５によって測定したとき４０℃で３０ｃＳ未満及び任意選択で２５ｃＳ±２０％の粘度を有する、項目２〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
Ｃ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸が２０％、１０％又は５％以内にバランスしている、項目２〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記細胞がタイプ（ｉｉｉ）の細胞である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記細胞油が少なくとも６０％のステアリン酸−オレイン酸−ステアリン酸（ＳＯＳ）を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
（ａ）前記Ｃ１８選択的ＦＡＴＡ遺伝子が、配列番号１５６と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードし、
（ｂ）前記ＬＰＡＡＴ遺伝子が、配列番号１５７と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードし；及び／又は
（ｃ）前記ＫＡＳＩＩ遺伝子が、配列番号１６０又は１６１と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードする、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞が微細藻、任意選択でＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅの微細藻、及び任意選択でＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻である、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
項目１〜１０のいずれか一項により製造される油、石鹸、油脂化学品、食料品、又は他の油由来製品。
（項目１２）
油産生組換え細胞、任意選択で油産生組換え真核微細藻のものを培養する工程を含む方法であって、前記細胞が、ＦＡＭＥ ＧＣ／ＦＩＤ分析によって決定するとき少なくとも０．１のパルミトレイン酸対パルミチン酸比及び／又は０．５％以上のパルミトレイン酸レベルによって特徴付けられる脂肪酸プロフィールを有する油を産生する活性を有するパルミチン酸ＡＣＰ−デサチュラーゼ酵素をコードする外来遺伝子を含む、方法。
（項目１３）
前記外来遺伝子が、ＡＣＰ−パルミチン酸に対して不飽和化活性を有するパルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＰＡＤ）をコードする、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記外来遺伝子が、ＡＣＰ−パルミチン酸に対する活性が増加したステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ変異体をコードする、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ変異体がＬ１１８Ｗ突然変異体である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記遺伝子が、真核油産生微細藻で遺伝子産物を発現させる活性を有するプロモーター、プラスチド標的トランジットペプチド、及び５’ＵＴＲに作動可能に連結している、項目１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記微細藻がＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅの微細藻、及び任意選択でＣｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記微細藻が、配列番号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオチド配列同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡを有する、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記脂肪酸プロフィールが３．５％未満の飽和脂肪酸によってさらに特徴付けられる、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞が乾燥細胞重量基準で少なくとも４０％の油となるまで培養される、項目１２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記微細藻が、内在性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのノックアウト又はノックダウン及び／又は外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子をさらに含む、項目１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記油が、内在性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのノックアウト又はノックダウン及び／又は外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子の結果として飽和脂肪酸量の減少を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子が前記内因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのコード領域に挿入される、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記挿入されたＫＡＳＩＩ遺伝子が前記内因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼと逆向きにされる、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記油がショ糖上での前記微細藻の従属栄養培養によって生成され、前記微細藻は、それがショ糖を代謝することを可能にする外来性インベルターゼ遺伝子を含む、項目１２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記油が、少なくとも９０％のオレイン酸、３％未満の飽和脂肪、及びリノール酸より多いオレイン酸を有する脂肪酸プロフィールを有する、項目１２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記油を回収する工程をさらに含む、項目１２〜２６のいずれか一項に記載の方法。（項目２８）
項目２７に記載の油をフライ調理に又は加工食品の一成分として使用する工程を含む方法。
（項目２９）
微細藻類ステロールプロフィールを含む、項目１〜２８のいずれか一項に記載の方法によって生成される油。
（項目３０）
前記微細藻類ステロールプロフィールが、β−シトステロールと比べたエルゴステロールの過剰及び／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又はクリオナステロールの存在によって特徴付けられる、項目２７に記載の油。
（項目３１）
油産生組換え細胞、任意選択で油産生組換え真核微細藻のものを培養する工程を含む方法であって、前記細胞が、２０％超のリノール酸及び１０％未満のリノレン酸を有する油を産生する、方法。
（項目３２）
前記細胞が、外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子及び／又はＦＡＴＡノックアウト又はノックダウンを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞が、任意選択で環境条件によって調節可能なプロモーターの制御下にある、過剰発現するＦＡＤ２遺伝子をさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記細胞がＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅの微細藻、及び任意選択でＣｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻であるか、又は配列番号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオチド配列同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡを有する、項目３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記細胞が乾燥細胞重量基準で少なくとも４０％の油となるまで培養される、項目３１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記細胞がショ糖で培養され、及び前記細胞が、前記細胞による前記ショ糖の代謝を可能にする外来性インベルターゼ遺伝子を含む、項目３１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記油を回収する工程をさらに含む、項目３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
微細藻類ステロールプロフィールを含む、項目３７に記載の方法によって生成される油。
（項目３９）
前記微細藻類ステロールプロフィールが、β−シトステロールと比べたエルゴステロールの過剰及び／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又はクリオナステロールの存在によって特徴付けられる、項目３８に記載の油。
（項目４０）
油産生細胞、任意選択で微細藻を培養する工程を含む方法であって、それにより細胞が、１０％未満のパルミチン酸、８５％超のオレイン酸、１％以下の多価不飽和脂肪酸、及び７％未満の飽和脂肪酸を有する油を産生する、方法。
（項目４１）
前記細胞が、ＦＡＤ及びＦＡＴＡノックアウトを有する微細藻であり、且つ外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子を発現する、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記細胞から前記油を抽出する工程をさらに含む、項目４０又は４１に記載の方法。
（項目４３）
項目４２に記載の方法によって生成される油。
（項目４４）
微細藻類ステロールプロフィールを含む、項目４３に記載の油。
（項目４５）
項目４３又は４４に記載の油から製造される食料品又は化学品。
（項目４６）
油産生細胞、任意選択で微細藻を培養する工程を含む方法であって、それにより前記細胞が、
（ａ）ラウリン酸とミリスチン酸との合計が少なくとも５０％であり；
（ｂ）総飽和脂肪酸が少なくとも５０％であり、且つカプリン酸及びラウリン脂肪酸レベルが２０％以内にバランスしており、
（ｃ）カプリン酸が少なくとも４５％であり、且つラウリン酸が少なくとも４５％である脂肪酸プロフィールを有する油を産生する、方法。
（項目４７）
ラウリン酸とミリスチン酸との合計が少なくとも６０％である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
ラウリン酸とミリスチン酸との合計が少なくとも７０％である、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
ラウリン酸とミリスチン酸との合計が少なくとも７５％である、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
前記細胞が外来性植物ＦＡＴＢ遺伝子を含む、項目４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記細胞が外来性ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ遺伝子を含む、項目４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記細胞から前記油を抽出する工程をさらに含む、項目４６〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
項目５２に記載の方法によって生成される油。
（項目５４）
微細藻類ステロールプロフィールを含む、項目５３に記載の油。
（項目５５）
項目５３又は５４に記載の油から製造される食料品又は化学品。
（項目５６）
油産生細胞、任意選択で微細藻を培養する工程を含む方法であって、それにより前記細胞が、１０％以下のリノレン酸及び２０％以上のリノール酸によって特徴付けられる脂肪酸プロフィールを有する油を産生する、方法。
（項目５７）
前記細胞が、過剰発現するＫＡＳＩＩ遺伝子と、ＦＡＤ遺伝子置換と、任意選択で、
（ａ）オレイン酸特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子とを含むか；又は
（ｂ）１つ以上のＦＡＴＡ対立遺伝子のノックアウトとを、オレイン酸特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子と共に含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記ＦＡＤ遺伝子の過剰発現が調節可能なプロモーターの環境制御による、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記細胞から前記油を抽出する工程をさらに含む、項目５６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
項目５９に記載の方法によって生成される油。
（項目６１）
微細藻類ステロールプロフィールを含む、項目６０に記載の油。
（項目６２）
項目６１又は６２に記載の油から製造される食料品又は化学品。
（項目６３）
トリグリセリド油の生成方法において、
（ａ）窒素充満条件下で油産生細胞を培養する工程であって、それにより細胞の数を増加させる工程と、次に；
（ｂ）窒素欠乏条件下で細胞を培養する工程であって、それにより細胞に乾燥細胞重量基準で少なくとも２０％までトリグリセリドを蓄積させる工程であって、窒素充満条件下で活性及び窒素飢餓条件下で不活性なプロモーターであって、ｐＨ７．０と比較してｐＨ５．０ではその活性の少なくとも半分を維持するプロモーターの制御下にあるＦＡＤｃ対立遺伝子、任意選択で単独の対立遺伝子を含む、工程と；
（ｃ）前記油を得る工程であって、前記油が、前記窒素飢餓条件下における前記ＦＡＤｃ遺伝子の下方調節に起因して減少したリノール酸を含む、工程と
を含む方法。
（項目６４）
前記細胞がインベルターゼの存在下でショ糖を使用して６．５未満のｐＨで培養される、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記インベルターゼが前記細胞によって産生される、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
前記インベルターゼが、前記細胞によって発現される外来遺伝子から産生される、項目６４又は６５に記載の方法。
（項目６７）
前記得られる油が、３％、２％、１％、又は０．５％未満のリノール酸を含む脂肪酸プロフィールを有する、項目６４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記細胞が、リノール酸の変化を増幅させるためＦＡＤｃノックアウトをさらに含む、項目６４〜６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
窒素充満条件と窒素飢餓条件との間でＦＡＤｃの転写物レベルが１０倍以上低下する、項目６４〜６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
外来性ＦＡＴＢ遺伝子と外来性ＫＡＳＩ遺伝子とを含む組換え細胞を培養する工程を含むトリグリセリド細胞油の生成方法であって、前記ＫＡＳＩ遺伝子の発現により、前記油が、前記ＦＡＴＢ遺伝子を有するが前記ＫＡＳＩ遺伝子を有しない対照細胞と比べてより短鎖の分布を有する、方法。
（項目７１）
配列番号９０又は９１と少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は８８％のヌクレオチド同一性又は遺伝子コードの縮重に起因して等価な配列を有するか、或いは配列番号９０又は９１と少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は８８％のアミノ酸同一性を有する酵素をコードするＦＡＴＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を含む組換え細胞。
（項目７２）
前記細胞が、前記ＦＡＴＢ遺伝子の発現に起因して脂肪酸プロフィールがシフトしているトリグリセリドを産生する、項目７１に記載の細胞。
（項目７３）
油を生成する方法であって、遺伝子操作された微生物、任意選択で微細藻から細胞油を得る工程と、前記細胞油を分画することにより、少なくとも７０％のＳＯＳを有してトリ飽和物が４％以下であるＴＡＧプロフィールと、ｓｎ−２位における少なくとも９０％のオレイン酸によって特徴付けられるｓｎ−２プロフィールとによって特徴付けられるステアリン画分を生成する工程とを含む方法。
（項目７４）
前記微生物が、過剰発現するＫＡＳＩＩ遺伝子、ＳＡＤノックアウト若しくはノックダウン、又は外来性Ｃ１８選択的ＦＡＴＡ遺伝子、外来性ＬＰＡＡＴ、及びＦＡＤ２ノックアウト若しくはノックダウンのうちの１つ以上を含む微細藻である、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記ステアリン画分が、コクムバターの等価な曲線と本質的に同一の、最大ヒートフロー温度又はＤＳＣで得られるＳＦＣ曲線を有する、項目７３又は７４に記載の方法。
（項目７６）
前記分画が、ＯＯＳを除去する第１の温度、任意選択で約２４℃、及びトリ飽和物を除去する第２の温度、任意選択で約２９℃で実施される二段階分画である、項目７３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
ＴＡＧプロフィールによって特徴付けられるトリグリセリド油の生成方法であって、（ａ）ＫＡＳＩＩ遺伝子、外来性ＦＡＴＡ遺伝子及び外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子を過剰発現する油産生プラスチド宿主細胞を提供する工程と、（ｂ）前記油を産生させるため前記細胞を培養する工程と、（ｃ）前記油を分離する工程とを含み、それらからなり、又はそれらから本質的になる方法において、前記ＴＡＧプロフィールが５０％超のＳＯＳ及び１０％未満のトリ飽和物を有する、方法。
（項目７８）
前記細胞が内在性ＳＡＤ２遺伝子のノックダウン又はノックアウトをさらに含む、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記細胞が内在性ＦＡＴＡ遺伝子のノックダウン又はノックアウトをさらに含む、項目７７又は７８に記載の方法。
（項目８０）
前記外来性ＦＡＴＡ遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する機能性ＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする、項目７７〜７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子が、配列番号９３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する機能性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする、項目７７〜８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記宿主細胞が微細藻、任意選択でＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅの微細藻、及び任意選択でＣｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻であって、且つ任意選択で、配列番号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオチド配列同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡを有する微細藻である、項目７７〜８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
任意選択でＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅのもの、及び任意選択でＣｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属のものであって、且つ任意選択で、配列番号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオチド配列同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡを有する組換え微細藻類（ｍｉｃｒｏｌａｇａｌ）宿主細胞であって、配列番号９２と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する機能性ＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来性ＦＡＴＡ遺伝子を発現する宿主細胞。
（項目８４）
任意選択でＴｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅのもの、及び任意選択でＣｈｌｏｒｅｌｌａ属又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属のものであって、且つ任意選択で、配列番号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のヌクレオチド配列同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡを有する組換え微細藻類（ｍｉｃｒｏｌａｇａｌ）宿主細胞であって、配列番号９３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する機能性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子を発現する宿主細胞。
本発明のこれら及び他の態様及び実施形態を、添付の図面（その簡単な説明がこの直後
に続く）、本発明の詳細な説明、及び例に説明及び／又は例示する。上記に及び本願全体
を通じて考察される特徴はいずれも、本発明の様々な実施形態において組み合わせること
ができる。
実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例４で考察するとおりの、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株から精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を示す。 実施例５で考察するとおりの、抗酸化剤濃度に応じた種々の油の安定性を示す。 本発明の実施形態における超低濃度の多価不飽和脂肪酸を含む細胞油の様々な特性を示す。 以下のとおりの様々な油に関するパーセント固形脂肪含有量のプロットを示す：（ａ）脂質経路を操作していないＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＲＢＤ油；（ｂ）ブラジル産ココアバター＋２５％乳脂肪；（ｃ）ＴＡＧプロフィールにおけるオレイン酸の低下及びステアリン酸の増加のためＳＡＤ対立遺伝子のレベルを低下させるヘアピン核酸を発現する株からのＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＲＢＤ油の３つのレプリケート；（ｄ）内因性ＯＴＥ（オレオイルアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、実施例４５を参照）を過剰発現する株からのＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＲＢＤ油；（ｅ）マレーシア産ココアバター＋２５％乳脂肪；及び（ｆ）マレーシア産ココアバター。ココアバター及びココアバター乳脂肪の値は文献値である（Ｂａｉｌｅｙ’ｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｏｉｌｓ ａｎｄ Ｆａｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，６ｔｈ ｅｄ．）。 大豆メチルエステル対照サンプルと比較した、従属栄養成長させた油産生微細藻類から調製した高オレイン酸（ＨＯ）及び高安定性高オレイン酸（ＨＳＡＯ）トリグリセリド油から調製したメチル化油に対して行った熱安定性試験の結果を示す。 高オレイン酸及び高安定性高オレイン酸藻類油の様々な特性を示す。 フラスコ及び発酵槽バイオマスからの株Ｋ−４油、株ＡＵ油及び株ＡＶ油のＴＡＧ組成を示す。Ｌａ＝ラウリン酸塩（Ｃ１２：０）、Ｍ＝ミリスチン酸塩（Ｃ１４：０）、Ｐ＝パルミチン酸塩（Ｃ１６：０）、Ｐｏ＝パルミトレイン酸塩（Ｃ１６：１）、Ｓ＝ステアリン酸塩（Ｃ１８：０）、Ｏ＝オレイン酸塩（Ｃ１８：１）、Ｌ＝リノール酸塩（Ｃ１８：２）、Ｌｎ＝α−リノレン酸塩（Ｃ１８：３）、Ａ＝アラキジン酸塩（Ｃ２０：０）、Ｂ＝ベヘン酸塩（Ｃ２２：０）、Ｌｇ＝リグノセリン酸塩（Ｃ２４：０）、Ｈｘ＝ヘキサコサン酸塩（Ｃ２６：０） Ｓ−Ｓ−Ｓは、３つ全ての脂肪酸が飽和しているＴＡＧの合計を指す。バーの各ブロックにおいて、株は図の下部に示す順序で示される。 振盪フラスコバイオマスからの株ＡＷ油、株ＡＸ油及び株ＡＹ油のＴＡＧ組成を示す。Ｌａ＝ラウリン酸塩（Ｃ１２：０）、Ｍ＝ミリスチン酸塩（Ｃ１４：０）、Ｐ＝パルミチン酸塩（Ｃ１６：０）、Ｐｏ＝パルミトレイン酸塩（Ｃ１６：１）、Ｓ＝ステアリン酸塩（Ｃ１８：０）、Ｏ＝オレイン酸塩（Ｃ１８：１）、Ｌ＝リノール酸塩（Ｃ１８：２）、Ｌｎ＝α−リノレン酸塩（Ｃ１８：３）、Ａ＝アラキジン酸塩（Ｃ２０：０）、Ｂ＝ベヘン酸塩（Ｃ２２：０）、Ｌｇ＝リグノセリン酸塩（Ｃ２４：０）、Ｈｘ＝ヘキサコサン酸塩（Ｃ２６：０）。Ｓ−Ｓ−Ｓは、３つ全ての脂肪酸が飽和しているＴＡＧの合計を指す。バーの各ブロックにおいて、株は図の下部に示す順序で示される。 実施例５２で考察するとおりの遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株からの精製、漂白及び脱臭したミリスチン酸リッチな油の脂肪酸プロフィール及び固形脂肪含有量を示す。 株Ｚで発現した異種ＦＡＥタンパク質のペアワイズアラインメントを示す。 ＦＡＤ２／ＦＡＤｃ及びＦＡＴＡの二重ノックアウトを作製するための微細藻類株の遺伝子改変を示す。
Ｉ．定義
「対立遺伝子」は、生物が同じ染色体上であっても複数の類似した又は同一の遺伝子コ
ピーを有する遺伝子のコピーを指す。対立遺伝子は同じ又は類似したタンパク質をコード
し得る。
脂肪酸プロフィール中の２つの脂肪酸に関連して、「バランスしている」は、２つの脂
肪酸がそれらの平均面積パーセントの規定の割合の範囲内であることを意味するものとす
る。従って、ｘ％の存在量の脂肪酸ａ及びｙ％の存在量の脂肪酸ｂに関して、脂肪酸は、
｜ｘ−（（ｘ＋ｙ）／２）｜及び｜ｙ−（（ｘ＋ｙ）／２）｜が≦１００（ｚ）であるな
らば、「ｚ％以内にバランスしている」。
「細胞油」又は「細胞脂肪」は、生物から得られる主にトリグリセリドの油を意味する
ものとし、ここでこの油は、トリグリセリドの脂肪酸プロフィールを実質的に変えるよう
な別の天然油若しくは合成油とのブレンド、又は分画を受けていない。特定の位置特異性
のトリグリセリドを含む油に関連して、細胞油又は細胞脂肪は、当該の位置特異的トリグ
リセリドプロフィールを得るためのエステル交換又は他の合成プロセスに供されておらず
、むしろ位置特異性は細胞又は細胞集団によって自然に生じる。細胞によって産生される
細胞油について、油のステロールプロフィールは、概して、細胞油を模倣するためステロ
ールを添加することによる油の人工的な再構成によるのでなく、細胞が産生するステロー
ルによって決定される。細胞油又は細胞脂肪に関連して、及び概して本開示全体を通じて
使用されるとき、油及び脂肪という用語は、特に注記される場合を除き同義的に使用され
る。従って、「油」又は「脂肪」は、物質の組成及び他の条件に応じて室温で液体、固体
、又は一部固体であり得る。ここで、用語「分画」は、どのように達成するにしても、生
物が産生するプロフィールと比べて油の脂肪酸プロフィールを変化させる形で油から材料
を取り出すことを意味する。用語「細胞油」及び「細胞脂肪」は、生物から得られるかか
る油を包含し、ここで油は、精製、漂白及び／又は脱ガムを含めた、そのトリグリセリド
プロフィールを実質的に変化させることのない最小限の処理を受けている。細胞油はまた
、「非エステル交換細胞油」であってもよく、これは、脂肪酸がグリセロールに対するそ
のアシル結合において再分布されたプロセスをその細胞油が受けておらず、生物から回収
したときと本質的に同じ配置のままであることを意味する。
「外来遺伝子」は、細胞に（例えば形質転換／トランスフェクションによって）導入さ
れたＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現をコードする核酸を意味するものとし、「導入遺
伝子」とも称される。外来遺伝子を含む細胞は、組換え細胞と称することができ、そこに
さらなる外来遺伝子が導入され得る。外来遺伝子は、形質転換される細胞と異なる種由来
（従って異種）であってもよく、又は同じ種由来（従って同種）であってもよい。このよ
うに、外来遺伝子には、遺伝子の内在性コピーと比べて細胞のゲノムにおいて異なる位置
を占めるか、又は異なる制御下にある同種遺伝子が含まれ得る。外来遺伝子は細胞に２つ
以上のコピーで存在してもよい。外来遺伝子は、ゲノム（核又はプラスチド）への挿入と
して、又はエピソーム分子として細胞に維持され得る。
「ＦＡＤｃ」は、「ＦＡＤ２」とも称され、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼをコード
する遺伝子である。
「脂肪酸」は、グリセロ脂質中の遊離脂肪酸、脂肪酸塩、又は脂肪酸アシル部分を意味
するものとする。グリセロ脂質の脂肪酸アシル基は、トリグリセリドが加水分解又は鹸化
されるときに生成されるカルボン酸又はカルボン酸の陰イオンの観点で記載され得ること
が理解されるであろう。
「固定炭素源」は、炭素を含有する分子、典型的には有機分子であり、そこで培養され
る微生物によって利用され得る培養培地中に周囲温度及び圧力で固体又は液体の形態で存
在する。従って、二酸化炭素は固定炭素源ではない。
「作動可能に連結している」は、制御配列（典型的にはプロモーター）及び連結された
配列（典型的にはタンパク質をコードする配列、コード配列とも称される）など、２つの
核酸配列間の機能的な連結である。プロモーターは、それが遺伝子の転写を仲介すること
ができる場合、外来遺伝子と作動可能に連結している。
「微細藻類」は、葉緑体又は他のプラスチドを含有する、場合により光合成を行うこと
が可能な真核微生物、又は光合成を行うことが可能な原核微生物である。微細藻類には、
固定炭素源をエネルギーとして代謝することができない偏性光独立栄養生物、並びに唯一
固定炭素源で生存し得る従属栄養生物が含まれる。微細藻類には、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏ
ｎａｓなどの、細胞分裂直後に姉妹細胞から分離する単細胞生物、並びに、例えばＶｏｌ
ｖｏｘなどの、２つの別個の細胞型の単純な多細胞光合成微生物である微生物が含まれる
。微細藻類には、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃ
ａなどの細胞が含まれる。微細藻類にはまた、Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ
、及びＰｙｒｏｂｏｔｒｙｓなどの細胞間接着を呈する他の光合成微生物も含まれる。微
細藻類はまた、特定の渦鞭毛藻類種及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種など、光合成を行う
能力を失った偏性従属栄養微生物も含まれる。
脂肪酸長さに関連して、「中鎖」は、Ｃ８〜Ｃ１６脂肪酸を意味するものとする。
組換え細胞に関連して、用語ノックダウンは、遺伝子によりコードされるタンパク質の
産生又は活性の点で部分的に（例えば約１〜９５％）抑制されている遺伝子を指す。
また、組換え細胞に関連して、用語ノックアウトは、遺伝子によりコードされるタンパ
ク質の産生又は活性の点で完全に又はほぼ完全に（例えば＞９５％）抑制されている遺伝
子を指す。ノックアウトは、コード配列への非コード配列の相同組換え、遺伝子欠失、突
然変異又は他の方法により調製することができる。
「油産生」細胞は、天然に、又は組換えの若しくは古典的な株改良によって、乾燥細胞
重量基準で少なくとも２０％の脂質を産生する能力を有する細胞である。「油産生微生物
（ｍｉｃｒｏｂｅ）」又は「油産生微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」は、微細藻
を含め、油産生性の微生物（特に、脂質を蓄える真核微細藻）である。油産生細胞はまた
、その脂質又は他の含有分の一部又は全てが取り除かれた細胞、並びに生細胞及び死細胞
のいずれも包含する。
「規則性油（ｏｒｄｅｒｅｄ ｏｉｌ）」又は「規則性脂肪（ｏｒｄｅｒｅｄ ｆａｔ
）」は、主として所与の多形構造である結晶を形成するものである。例えば、規則性油又
は規則性脂肪は、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％超がβ又はβ’多形形態
である結晶を有し得る。
細胞油に関連して、「プロフィール」は、油中の特定の種又はトリグリセリド又は脂肪
酸アシル基の分布である。「脂肪酸プロフィール」は、グリセロール骨格との結合に関係
なく、油のトリグリセリド中の脂肪酸アシル基の分布である。脂肪酸プロフィールは、典
型的には、実施例１のように、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）への変換と、続く水素
炎イオン化検出（ＦＩＤ）によるガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によって決定され
る。脂肪酸プロフィールは、ある脂肪酸の曲線下面積から求めた全脂肪酸シグナルに対す
る当該の脂肪酸の１つ以上の百分率として表すことができる。ＦＡＭＥ−ＧＣ−ＦＩＤ計
測値は、脂肪酸の重量百分率を概算する。「ｓｎ−２プロフィール」は、油中のトリアシ
ルグリセリドのｓｎ−２位に見られる脂肪酸の分布である。「位置特異的プロフィール」
は、立体特異性に関係なく、グリセロール骨格に対するアシル基結合の位置に関するトリ
グリセリドの分布である。換言すれば、位置特異的プロフィールは、ｓｎ−１／３と、対
するｓｎ−２とにおけるアシル基結合を表す。従って、位置特異的プロフィールでは、Ｐ
ＯＳ（パルミチン酸塩−オレイン酸塩−ステアリン酸塩）及びＳＯＰ（ステアリン酸塩−
オレイン酸塩−パルミチン酸塩）は同じものとして扱われる。「立体特異的プロフィール
」は、ｓｎ−１、ｓｎ−２及びｓｎ−３におけるアシル基の結合を表す。特に指示されな
い限り、ＳＯＰ及びＰＯＳなどのトリグリセリドは同等と見なされる。「ＴＡＧプロフィ
ール」は、結合の位置特異的な性質に関係なく、グリセロール骨格との結合に関してトリ
グリセリドに見られる脂肪酸の分布である。従って、ＴＡＧプロフィールでは、油中のＳ
ＳＯの百分率はＳＳＯとＳＯＳとの合計であり、一方、位置特異的プロフィールでは、油
中のＳＯＳ種を含めない、ＳＳＯの百分率が計算される。ＦＡＭＥ−ＧＣ−ＦＩＤ分析の
重量百分率と対照的に、トリグリセリドの割合は、典型的にはモル百分率、すなわちＴＡ
Ｇ混合物中における所与のＴＡＧ分子の百分率として提供される。
用語「パーセント配列同一性」は、２つ以上のアミノ酸配列又は核酸配列との関連では
、配列比較アルゴリズムを使用した又は目視検査による計測で最大の一致となるように比
較及びアラインメントしたとき同じであるか、又は同じであるアミノ酸残基若しくはヌク
レオチドを特定の割合だけ有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセントヌクレ
オチド又はアミノ酸同一性を決定する配列比較では、典型的には一方の配列が参照配列と
して働き、それと試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配
列及び参照配列がコンピュータに入力され、必要であれば部分配列の座標が指定され、及
び配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次に配列比較アルゴリズムが、
指定されたプログラムパラメータに基づき、１つ又は複数の試験配列について参照配列と
比べたパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列の最適アラインメントは、デ
フォルトパラメータに設定したＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を使用して実行することができる。例えば、２つの核酸
配列の比較には、以下のデフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｓ」ツール、バージョン２．０．１２（２０００年４月２１日）でｂｌａｓｔｎを
使用し得る：行列：ＢＬＯＳＵＭ６２；マッチに対するリワード：１；ミスマッチに対す
るペナルティ：−２；開始ギャップ：５及び伸長ギャップ：２ペナルティ；ギャップｘド
ロップオフ：５０；期待値：１０；ワードサイズ：１１；フィルタ：オン。２つのアミノ
酸配列のペアワイズ比較には、例えば以下のデフォルトパラメータに設定したｂｌａｓｔ
ｐで「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツール、バージョン２．０．１２（２００
０年４月２１日）を使用し得る：行列：ＢＬＯＳＵＭ６２；開始ギャップ：１１及び伸長
ギャップ：１ペナルティ；ギャップｘドロップオフ５０；期待値：１０；ワードサイズ：
３；フィルタ：オン。
「組換え」は、外来核酸の導入又は天然核酸の変化によって改変された細胞、核酸、タ
ンパク質又はベクターである。従って、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の
細胞中には見られない遺伝子を発現し、又は当該の遺伝子が非組換え細胞によって発現す
る場合とは異なる形で天然遺伝子を発現することができる。組換え細胞には、限定なしに
、遺伝子産物をコードするか、又は細胞中の活性遺伝子産物レベルを低下させる抑制エレ
メント、例えば突然変異、ノックアウト、アンチセンス、干渉性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）又は
ｄｓＲＮＡをコードする組換え核酸が含まれ得る。「組換え核酸」は、概して、例えばポ
リメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、及びエンドヌクレアーゼを使用した、化学
合成を使用した核酸の操作により、当初インビトロで形成される核酸であるか、又はその
他の天然では通常見られない形態である。組換え核酸は、例えば、２つ以上の核酸を作動
可能に連結した状態に置くために作製されてもよい。従って、天然では通常つながってい
ないＤＮＡ分子をライゲートすることによりインビトロで形成される単離核酸又は発現ベ
クターは、両方とも、本発明の目的上組換えと見なされる。組換え核酸は、それを作製し
て宿主細胞又は生物に導入した後、宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製し得る；し
かしながら、かかる核酸は組換え産生後、続いて細胞内で複製されるが、それでもなお本
発明の目的上組換えと見なされる。同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技術を用い
て、すなわち組換え核酸の発現によって作製されたタンパク質である。
用語「トリグリセリド」、「トリアシルグリセリド」及び「ＴＡＧ」は、当該技術分野
において周知されているとおり同義的に使用される。
ＩＩ．概要
本発明の例示的な実施形態は、グリセロ脂質における変化した脂肪酸プロフィール及び
／又は変化した脂肪酸位置特異的分布を生じる油産生細胞、及びその細胞から生成される
生成物を特徴とする。油産生細胞の例としては、プラスチド油産生細胞、例えば油産生藻
類のものを含めた、ＩＩ型脂肪酸生合成経路を有する微生物細胞、並びに該当する場合に
は、限定はされないが市販の油糧種子作物、例えば、大豆、トウモロコシ、菜種／キャノ
ーラ、綿、アマ、ヒマワリ、ベニバナ及びピーナッツを含めた高等植物の油生成細胞が挙
げられる。細胞の他の具体的な例としては、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｔｙａ門、Ｔｒｅｂｏｕｘ
ｉｏｐｈｙｔａｅ綱、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ目、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａｃａｅ科の
従属栄養又は偏性従属栄養微細藻類が挙げられる。油産生微細藻類及び培養方法の例はま
た、偏性従属栄養生物を含む属であるＣｈｌｏｒｅｌｌａ属及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属
の種を含め、国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／
０６０３２号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレット、及び国
際公開第２０１１／１５０４１１号パンフレットにも提供される。油産生細胞は、例えば
、細胞重量基準で２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、又は約９０％±５
％の油を産生する能力を有し得る。場合により、産生される油は、高度不飽和脂肪酸、例
えばＤＨＡ又はＥＰＡ脂肪酸が低くてもよい。例えば、油は、５％、２％、又は１％未満
のＤＨＡ及び／又はＥＰＡを含み得る。上述の公報はまた、かかる細胞を培養して油を、
特に微細藻類細胞から抽出する方法も開示している；かかる方法は本明細書に開示される
細胞に適用することができ、これらの教示について参照により援用される。微細藻類細胞
が使用される場合、それらは独立栄養で培養するか（偏性従属栄養生物でない限り）又は
暗所で糖（例えば、グルコース、フルクトース及び／又はショ糖）を使用して培養するこ
とができる。本明細書に記載される任意の実施形態において、細胞は、細胞によるショ糖
原料からの油の産生を可能にするため外来性インベルターゼ遺伝子を含む従属栄養細胞で
あってもよい。それに代えて、又は加えて、細胞はセルロース系原料からキシロースを代
謝することができる。例えば、活性キシロース輸送体、キシルロース−５−リン酸輸送体
、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ及びキシ
ロースレダクターゼをコードする遺伝子など、１つ以上のキシロース代謝遺伝子を発現す
るように細胞を遺伝子操作することができる。キシロースを利用する遺伝子操作されたＰ
ｒｏｔｏｔｈｅｃａ株の開示を含め、２０１２年１１月１５日に公開された国際公開第２
０１２／１５４６２６号パンフレット、「ＧＥＮＥＴＩＣＡＬＬＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＥ
Ｄ ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ ＴＨＡＴ ＭＥＴＡＢＯＬＩＺＥ ＸＹＬＯＳＥ」
を参照のこと。
油産生細胞は、任意選択で、バイオリアクター／発酵槽で培養されてもよい。例えば、
従属栄養油産生微細藻類細胞は、糖含有栄養ブロスで培養することができる。任意選択で
、培養は二段階：シード段階及び脂質産生段階で進めることができる。シード段階では、
細胞数がｓスターター培養物から増加する。従って、シード段階は、典型的には、急速な
細胞分裂を促進するように設計された栄養リッチな窒素充満培地を含む。シード段階後、
栄養制限（例えば窒素希薄）条件下で細胞に糖が供給されてもよく、これにより糖がトリ
グリセリドに変換されることになる。例えば、脂質産生段階における細胞分裂速度はシー
ド段階と比べて５０％、８０％以上低下し得る。加えて、シード段階と脂質産生段階との
間での培地の変動によって組換え細胞が誘導され、異なる脂質合成遺伝子が発現すること
により、産生されるトリグリセリドが変化し得る。例えば、以下で考察するとおり、内在
性又は外来性遺伝子の前に窒素感受性及び／又はｐＨ感受性プロモーターを置くことがで
きる。これは、シード段階における細胞の最適成長を支持しない脂質産生段階で油が産生
されるべきである場合に特に有用である。以下の例では、細胞は脂肪酸デサチュラーゼを
ｐＨ感受性プロモーターと共に有し、従って脂質産生段階ではリノール酸が低い油が産生
される一方、シード段階中には細胞分裂に十分なリノール酸を有する油が産生される。得
られる低リノール酸油は酸化安定性が極めて高い。
油産生細胞は、脂肪酸生合成酵素をコードする１つ以上の外来遺伝子を発現する。結果
として、一部の実施形態は、非植物油若しくは非種子油からは得ることのできなかった、
又は全く得ることのできなかった細胞油を特徴とする。
油産生細胞（任意選択で微細藻類細胞）は、ＵＶ及び／又は化学的突然変異誘発と、続
く化学的又は生化学的毒素での選択を含めた、環境条件下でのスクリーニング又は選択な
ど、古典的な株改良技術によって改良することができる。例えば細胞は、脂肪酸合成阻害
薬、糖代謝阻害薬、又は除草剤で選択することができる。選択の結果として、糖での収率
が高い株、油産生（例えば、細胞容積、乾燥重量、又は細胞培養物１リットルの割合とし
て）が多い株、又は脂肪酸若しくはＴＡＧプロフィールが改良された株を得ることができ
る。
例えば、細胞は、１，２−シクロヘキサンジオン；１９−酢酸ノルエチンドロン（ｎｏ
ｒｅｔｈｉｎｄｏｎｅ）；２，２−ジクロロプロピオン酸；２，４，５−トリクロロフェ
ノキシ酢酸；２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、メチルエステル；２，４−ジクロ
ロフェノキシ酢酸；２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ブチルエステル；２，４−ジクロ
ロフェノキシ酢酸、イソオクチルエステル；２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、メチルエ
ステル；２，４−ジクロロフェノキシ酪酸；２，４−ジクロロフェノキシ酪酸、メチルエ
ステル；２，６−ジクロロベンゾニトリル；２−デオキシグルコース；５−テトラデシル
オキシ−ｗ−フロ酸；Ａ−９２２５００；アセトクロル；アラクロル；アメトリン；アム
ホテリシン；アトラジン；ベンフルラリン；ベンスリド；ベンタゾン；ブロマシル；ブロ
モキシニル；カフェンストロール；カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（
ＣＣＣＰ）；カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣ
ＣＰ）；セルレニン；クロルプロファム；クロルスルフロン；クロフィブリン酸；クロピ
ラリド；コルヒチン；シクロエート；シクロヘキサミド；Ｃ７５；ＤＡＣＴＨＡＬ（テト
ラクロロテレフタル酸ジメチル）；ジカンバ；ジクロロプロップ（（Ｒ）−２−（２，４
−ジクロロフェノキシ）プロパン酸）；ジフルフェニカン；ジヒドロジャスモン酸（ｄｉ
ｈｙｒｏｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、メチルエステル；ジクワット；ジウロン；ジメ
チルスルホキシド；没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）；エンドサル；エタルフルラ
リン；エタノール；エトフメセート；フェノキサプロップ−ｐ−エチル；フルアジホップ
−ｐ−ブチル；フルオメツロン；ホメサフェン（ｆｏｍａｓｅｆｅｎ）；ホラムスルフロ
ン；ジベレリン酸；グルホシネートアンモニウム；グリホセート；ハロキシホップ；ヘキ
サジノン；イマザキン；イソキサベン；リパーゼ阻害薬ＴＨＬ（（−）−テトラヒドロリ
プスタチン）；マロン酸；ＭＣＰＡ（２−メチル−４−クロロフェノキシ酢酸）；ＭＣＰ
Ｂ（４−（４−クロロ−ｏ−トリルオキシ）酪酸）；メソトリオン；ジヒドロジャスモン
酸メチル；メトラクロル；メトリブジン；ミルドロネート（Ｍｉｌｄｒｏｎａｔｅ）；モ
リナート；ナプタラム；ノルハルマン；オルリスタット；オキサジアゾン；オキシフルオ
ルフェン；パラコート；ペンジメタリン；ペンタクロロフェノール；ＰＦ−０４６２０１
１０；フェネチルアルコール；フェンメジファム；ピクロラム；プラテンシン；プラテン
シマイシン；プロメトン；プロメトリン；プロナミド；プロパクロル；プロパニル；プロ
パジン；ピラゾン；キザロホップ−ｐ−エチル；ジプロピルチオカルバミン酸Ｓ−エチル
（ＥＰＴＣ）；Ｓ，Ｓ，Ｓ−トリブチルホスホロトリチオエート；サリチルヒドロキサム
酸；セサモール；シデュロン；メタンアルソン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔｈａ
ｎｅ ａｒｓｅｎａｔｅ）；シマジン；Ｔ−８６３（ＤＧＡＴ阻害薬）；テブチウロン；
テルバシル；チオベンカルブ；トラルコキシジム；トリアレート；トリクロピル；トリク
ロサン；トリフルラリン；及びブルピン酸の１つ以上で選択することができる。
油産生細胞は貯蔵油を産生し、貯蔵油は主としてトリアシルグリセリドであり、細胞の
貯蔵体に貯蔵され得る。生油は、細胞から、細胞を破壊して油を分離することにより得ら
れ得る。生油は、細胞によって産生されるステロールを含み得る。国際公開第２００８／
１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６０３２号パンフレット、国際公
開第２０１１／１５０４１０号パンフレット、及び国際公開第２０１１／１５０４号パン
フレットが、油産生微細藻類についての従属栄養培養及び油分離技術を開示している。例
えば、細胞を提供又は培養し、乾燥させてプレスすることにより、油を得ることができる
。生成された油は、当該技術分野において公知のとおり、又は国際公開第２０１０／１２
０９３９号パンフレットに記載されるとおり、精製、漂白、及び脱臭（ＲＢＤ）され得る
。この生油又はＲＢＤ油は、様々な食品、化学及び工業製品又はプロセスに使用され得る
。かかる処理の後であっても、油は供給源に特有のステロールプロフィールを維持し得る
。微細藻類ステロールプロフィールは以下に開示する。特に本特許出願の第ＸＩＩ節を参
照のこと。油の回収後、有用な残渣バイオマスが残る。残渣バイオマスの用途としては、
紙、プラスチック、吸収剤、吸着剤、掘削液の製造、動物用飼料として、人間の栄養用、
又は肥料用が挙げられる。
トリグリセリド（「トリアシルグリセリド」又は「ＴＡＧ」とも称される）細胞油の脂
肪酸プロフィールが本明細書に提供される場合、それは、細胞から抽出した貯蔵油の非分
画サンプルを、リン脂質が除去された条件下で分析するか、又はリン脂質の脂肪酸に対し
て実質的に感度のない分析方法で（例えばクロマトグラフィー及び質量分析法を使用して
）分析したものを指すことが理解されるであろう。油はＲＢＤプロセスに供してリン脂質
、遊離脂肪酸及び匂いを除去してもよく、しかし油中のトリグリセリドの脂肪酸プロフィ
ールの変化はごく僅か又は無視し得る程度である。細胞は油を産生するため、ある場合に
は、貯蔵油が細胞における全ＴＡＧの大部分を占めることになる。以下の実施例１、２、
及び８は、ＴＡＧ脂肪酸組成及び位置特異的構造を決定するための分析法を提供する。
大別すると、本発明の特定の実施形態は、（ｉ）特定の脂肪酸の栄養要求株；（ｉｉ）
不飽和脂肪酸要求性の細胞を含めた、低濃度の多価不飽和脂肪酸を有する油を産生する細
胞；（ｉｉｉ）脂肪酸をグリセロール又はグリセロールエステルに転移させる酵素をコー
ドする１つ以上の外来遺伝子の発現に起因して、高濃度の特定の脂肪酸を有する油を産生
する細胞；（ｉｖ）位置特異的な油を産生する細胞、（ｖ）Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３由
来のＬＰＡＡＴ酵素をコードする新規に発見された遺伝子をコードする遺伝子構築物又は
細胞（実施例４３を参照）、（ｖｉ）低レベルの飽和脂肪酸及び／又は高レベルのパルミ
トレイン酸を産生する細胞、（ｖｉｉ）エルカ酸を産生する細胞、及び（ｖｉｉｉ）プロ
フィールが変化した細胞油を産生することに関連する他の発明を含む。これらの実施形態
はまた、かかる細胞によって作られる油、油抽出後のかかる細胞からの残渣バイオマス、
そうした油から作られる油脂化学品、燃料及び食品並びに細胞の培養方法も包含する。
以下の任意の実施形態において、使用される細胞は、場合により、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙ
ｔａ、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌ
ｌａｃｅａｅ、又はＣｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅに分類される細胞を含めた、従属栄養又
は偏性従属栄養微細藻類細胞を含む微細藻類細胞などのＩＩ型脂肪酸生合成経路を有する
細胞であるか、又は合成生物学のツールを使用してＩＩ型脂肪酸生合成経路を有するよう
に操作された細胞（すなわち、かかる経路を欠く生物にＩＩ型脂肪酸生合成の遺伝機構を
移植する）である。ＩＩ型経路を有する宿主細胞を使用すると、外来性アシル−ＡＣＰチ
オエステラーゼ又は他のＡＣＰ結合酵素とＩ型細胞機構の多酵素複合体との間で相互作用
が起こらない可能性が回避される。特定の実施形態において、細胞は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅ
ｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ種、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｋｒｕｇａｎｉ種、Ｐｒｏｔｏ
ｔｈｅｃａ ｓｔａｇｎｏｒａ種又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｚｏｐｆｉｉ種の細胞であ
るか、又は配列番号７６と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％の
ヌクレオチド同一性を有する２３Ｓ ｒＲＮＡ配列を有する。暗所で培養するか又は偏性
従属栄養生物を使用することにより、産生される細胞油はクロロフィル又は他の色素が低
下し得る。例えば、細胞油は、実質的な精製なしに１００、５０、１０、５、１、０．０
．５ｐｐｍ未満のクロロフィルを有し得る。
安定炭素同位体値δ１３Ｃは、標準（例えばＰＤＢ、サウスカロライナ州のＰｅｅｄｅ
ｅ層からのＢｅｌｅｍｎｉｔｅ ａｍｅｒｉｃａｎａの化石骨格のカーボナイト）に対す
る１３Ｃ／１２Ｃの比の表現である。油の安定炭素同位体値δ１３Ｃ（０／００）は、使
用される供給原料のδ１３Ｃ値に関係し得る。一部の実施形態では、油は、トウモロコシ
又はサトウキビなどのＣ４植物に由来する糖上で従属栄養成長させた油産生生物から得ら
れる。一部の実施形態では、油のδ１３Ｃ（０／００）は、−１０〜−１７０／００又は
−１３〜−１６０／００である。
以下に考察する特定の実施形態及び例において、１つ以上の脂肪酸合成遺伝子（例えば
、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、ケト−アシルＡＣＰシンターゼ、ＬＰＡＡＴ、ステ
アロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は本明細書に記載される他のものをコードする）は、
微細藻に組み込まれる。特定の微細藻について、植物脂肪酸合成遺伝子産物は、その遺伝
子産物がアシル−ＡＣＰチオエステラーゼなどの、機能するのにＡＣＰの結合を要求する
酵素である場合にも、対応する植物アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）の非存在下で
機能し得ることが分かっている。従って、場合により微細藻類細胞は、植物ＡＣＰ遺伝子
の共発現なしにかかる遺伝子を利用して所望の油を作り得る。
外来遺伝子又は遺伝子の組み合わせを含む組換え細胞の様々な実施形態について、６０
、７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９
９％の核酸配列同一性を有する遺伝子によるそれらの遺伝子の置換は、６０、７０、８０
、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７
．５、９８、９８．５、９９又は９９．５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を
コードする遺伝子の置換と同じく、同様の結果をもたらし得ることが考えられる。同様に
、新規調節エレメントについて、６０、７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９
４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の核酸を有する核酸によるそれらの核酸の置換
が有効であり得ることが考えられる。様々な実施形態において、機能に不要な配列（例え
ばＦＬＡＧ（登録商標）タグ又は挿入された制限部位）は多くの場合に使用が省略され、
又は遺伝子、タンパク質及び変異体の比較において無視されることは理解されるであろう
。
微細藻類を使用して発見され又は微細藻類によって例示されているが、ここに報告され
る新規遺伝子及び遺伝子の組み合わせは、当該技術分野において周知されている技術を用
いて高等植物で使用することができる。例えば、高等植物における外来性脂質代謝遺伝子
の使用が、米国特許第６０２８２４７号明細書、同第５８５００２２号明細書、同第５６
３９７９０号明細書、同第５４５５１６７号明細書、同第５，５１２，４８２号明細書、
及び同第５，２９８，４２１号明細書に開示されており、外来性アシル−ＡＣＰチオエス
テラーゼを含む高等植物を開示している。国際公開第２００９１２９５８２号パンフレッ
ト及び国際公開第１９９５０２７７９１号パンフレットは植物におけるＬＰＡＡＴのクロ
ーニングを開示している。高等植物におけるＦＡＤ２抑制が国際公開第２０１３１１２５
７８号パンフレット、及び国際公開第２００８００６１７１号パンフレットに教示されて
いる。
実施例６３に記載するとおり、転写プロファイリングを用いて、低窒素条件に応答して
発現を調節するプロモーターが発見された。このプロモーターは、様々な遺伝子を選択的
に発現させ、及び微生物油の脂肪酸組成を変化させるのに有用である。ある実施形態にお
いては、異種プロモーターと遺伝子とを含む非天然構築物があり、ここでプロモーターは
、実施例６３のプロモーター（例えば、配列番号１３０〜１４７）のいずれかと少なくと
も６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％の配列同一性を含み、遺伝子
は低窒素条件下と高窒素条件下とで示差的に発現する。任意選択で、発現のｐＨ感受性は
ＡＭＴ０３プロモーターより低い。例えば、このプロモーターをリノール酸要求株におい
てＦＡＤ２遺伝子の前に置くと、高窒素条件下、次に低窒素条件下で培養した後に、リノ
ール酸が５、４、３、２、又は１％未満の油を生成することができる。
ＩＩＩ．脂肪酸栄養要求株／油産生期間中の成長阻害条件に対する脂肪酸レベルの低下
ある実施形態では、細胞は、脂質経路遺伝子の全ての対立遺伝子がノックアウトされる
ように遺伝子操作される。或いは、脂肪酸の補足を要求するように、それらの対立遺伝子
の遺伝子産物の量又は活性がノックダウンされる。遺伝子の対立遺伝子の１つ以上と相同
なドナー配列を有する第１の形質転換構築物を作成することができる。この第１の形質転
換構築物が導入され、続く選択方法により、１つ以上の対立遺伝子破壊を特徴とする分離
株が得られ得る。或いは、第１の対立遺伝子への挿入により第１の対立遺伝子を不活性化
する選択可能なマーカーを発現するように操作された第１の株を作製してもよい。この株
は、脂質経路遺伝子の残りの対立遺伝子をノックアウト又はノックダウンするさらに別の
遺伝子操作のための宿主として使用することができる（例えば、第２の選択マーカーを使
用して第２の対立遺伝子を破壊する）。当初活性を消失させた内在性遺伝子を有するさら
なる形質転換構築物の操作された発現によって、又は好適な異種遺伝子の発現によって、
内在性遺伝子の補足を実現することができる。補足遺伝子の発現は、構成的に調節されて
も、或いは調節可能な制御によって調節されてもよく、それにより成長を可能にし、又は
任意に栄養要求条件を作り出すための所望のレベルに至る発現の調整が可能となる。ある
実施形態では、脂肪酸要求細胞の集団を使用して補足遺伝子が、例えば外因性脂肪酸合成
酵素に対する特定の遺伝子候補、又はかかる候補を含むと考えられる核酸ライブラリによ
る形質転換により、スクリーニング又は選択される。
所望の遺伝子の全ての対立遺伝子のノックアウト及びノックアウトした遺伝子の補足は
、順次行われる必要はない。目的の内在性遺伝子の破壊及び好適な補足遺伝子の構成的発
現又は誘導性発現のいずれかによるその補足は、いくつかの方法で行うことができる。一
つの方法では、これは好適な構築物の同時形質転換によって実現することができ、１つが
目的の遺伝子を破壊し、２つ目が好適な代替的遺伝子座に補足を提供する。別の方法では
、誘導性プロモーターの制御下で標的遺伝子を好適な遺伝子に直接置き換えることにより
、標的遺伝子の消失を生じさせることができる（「プロモーターハイジャック法」）。こ
のようにして、ここで標的遺伝子の発現が調節可能なプロモーターの制御下に置かれる。
さらなる手法は、遺伝子の内在性調節エレメントを外来性の誘導性遺伝子発現系に置き換
えることである。かかるレジーム下では、ここで目的の遺伝子を、特定の必要性に応じて
オン又はオフに切り換えることができる。さらに別の方法は、目的の遺伝子の補足能を有
する外来遺伝子を発現する第１の株を作成し、次にこの第１の株における目的の遺伝子の
全ての対立遺伝子をノックアウト又はノックダウンすることである。外来遺伝子による複
数の対立遺伝子のノックダウン又はノックアウト及び補足手法を使用して、操作される細
胞の脂肪酸プロフィール、位置特異的プロフィール、ｓｎ−２プロフィール、又はＴＡＧ
プロフィールを変えてもよい。
調節可能なプロモーターが使用される場合、プロモーターはｐＨ感受性（例えば、ａｍ
ｔ０３）か、窒素及びｐＨ感受性（例えば、ａｍｔ０３）か、又は窒素感受性であるがｐ
Ｈ非感受性である（例えば、実施例６３の新規に発見されたプロモーター）か又は前述の
プロモーターのいずれかと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５
、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を含むそれらの変異体であってもよい。プロ
モーターに関連して、ｐＨ非感受性（ｐＨ−ｉｎｅｎｓｉｔｉｖｅ）は、環境条件がｐＨ
６．８から５．０にシフトしたときのそのプロモーターの感受性がａｍｔ０３プロモータ
ーと比べて低い（例えば、プロモーターとしてａｍｔ０３を有する等価な細胞と比較した
とき、ｐＨシフト時の活性の相対的変化が少なくとも５、１０、１５、又は２０％小さい
）ことを意味する。
特定の実施形態において、組換え細胞は、内因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ；例
えば長さＣ１８の脂肪酸アシル−ＡＣＰ鎖（例えば、ステアリン酸塩（Ｃ１８：０）又は
オレイン酸塩（Ｃ１８：１）、又はＣ８：０〜Ｃ１６：０脂肪酸の加水分解に対して選択
性を有するＦａｔＡ又はＦａｔＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの活性を低下させる働
きをする核酸を含む。内因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの活性は、ノックアウト又
はノックダウン手法により低下させ得る。ノックダウンは、例えば、１つ以上のＲＮＡヘ
アピン構築物の使用によるか、プロモーターハイジャック法（低活性又は誘導性プロモー
ターを内在性遺伝子の天然プロモーターに代える置換）によるか、又は誘導性プロモータ
ーの制御下にある同様の又は同一の遺伝子の導入と組み合わせた遺伝子ノックアウトによ
り実現され得る。実施例３４は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株の操作を記載しており、ここで
は内因性脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＦＡＴＡ１）の２つの対立遺伝子がノ
ックアウトされている。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＴＡ１の活
性が、外因性ＦａｔＡ又はＦａｔＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現によって補完
された。実施例３６は、ＰｒｏｔｏｔｈｅｃａにおけるＦＡＴＡの発現を低下させるＲＮ
Ａヘアピン構築物の使用について詳述し、これはパルミチン酸がより少なく、且つオレイ
ン酸がより多い、変化した脂肪酸プロフィールをもたらした。
従って、油産生細胞は、ＩＩ型脂肪酸生合成経路を有する生物のものを含め、脂肪酸の
補給又は遺伝的補足の非存在下における細胞の生存能力を消失させるか又は厳しく制限す
る程度に至るまでの、対立遺伝子をコードするアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼのノッ
クアウト又はノックダウンを有することができる。このような株を使用して、アシル−Ａ
ＣＰ−チオエステラーゼ導入遺伝子を発現する形質転換体を選択することができる。それ
に代えて、又は加えて、この株を使用して外因性アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼを完
全に移し替え、かかる細胞によって産生される細胞油の劇的に異なる脂肪酸プロフィール
を提供することができる。例えば、ＦＡＴＡ発現を完全に又はほぼ完全に消失させ、中鎖
脂肪酸を産生するＦＡＴＢ遺伝子に置き換えることができる。或いは、ステアリン酸又は
オレイン酸（Ｃ１８）と比べてパルミチン酸（Ｃ１６）に特異性を有する内在性ＦａｔＡ
遺伝子を有する生物を、ステアリン酸（Ｃ１８：０）に対してより高い相対的特異性を有
する外来性ＦａｔＡ遺伝子に置き換えるか、又はオレイン酸（Ｃ１８：１）に対してより
高い相対的特異性を有する外来性ＦａｔＡ遺伝子に置き換えることができる。特定の具体
的な実施形態において、このような内因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの二重ノック
アウトを有する形質転換体は、５０、６０、７０、８０、又は９０％超のカプリル酸、カ
プリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、又はパルミチン酸、又は１８炭素未満の鎖長の全
脂肪酸を有する細胞油を産生する。かかる細胞は、ステアリン酸又はオレイン酸などのよ
り長鎖の脂肪酸の補給、又はＦａｔＡ遺伝子を調節する誘導性プロモーターの場合には成
長許容的な状態と成長制限的な状態との間での環境条件の切り替えを必要とし得る。
ある実施形態では、油産生細胞は培養される（例えば、バイオリアクター内で）。細胞
は、１種以上の脂肪酸に関して完全に栄養要求性であるか又は部分的に栄養要求性（すな
わち、致死性又は合成病（ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｏｒ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｉｃｋｎ
ｅｓｓ））である。細胞数を増やすため、脂肪酸を補給して細胞を培養し、次に細胞に油
を蓄積させる（例えば乾燥細胞重量基準で少なくとも４０％まで）。或いは、細胞が、環
境条件に基づき活性を切り替えることのできる調節可能な脂肪酸合成遺伝子を含み、第１
の細胞分裂期間における環境条件が脂肪酸の産生に有利であり、且つ第２の油蓄積期間に
おける環境条件が脂肪酸の産生に不利である。誘導性遺伝子の場合、その誘導性遺伝子の
調節は、限定なしに環境ｐＨによって（例えば、実施例に記載されるとおりのＡＭＴ３プ
ロモーターを使用することにより）媒介され得る。
これらの補給又は調節方法のいずれかを適用する結果として、最適な細胞増殖に必須の
１つ以上の脂肪酸の量が少ない細胞から細胞油が得られ得る。得ることのできる油の具体
的な例としては、ステアリン酸、リノール酸及び／又はリノレン酸が低いものが挙げられ
る。
これらの細胞及び方法は、低多価不飽和油に関連してこの直後の章に及び実施例６（脂
肪酸デサチュラーゼ要求株）に多価不飽和脂肪酸が低い油に関連して及び実施例３４（ア
シル−ＡＣＰチオエステラーゼ要求株）に例示される。
同様に、脂肪酸要求株は、ＳＡＤ、ＦＡＤ、ＫＡＳＩＩＩ、ＫＡＳＩ、ＫＡＳＩＩ、Ｋ
ＣＳ、エロンガーゼ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＤＧＡＴ又はＡＧＰＡＴ又はＰＡＰをコー
ドするものを含め、他の脂肪酸合成遺伝子において作製することができる。これらの栄養
要求株を使用して補足遺伝子を選択し、又はそれらの遺伝子の天然発現を消失させて所望
の外来遺伝子に有利になるようにして、油産生細胞により産生される細胞油の脂肪酸プロ
フィール、位置特異的プロフィール、又はＴＡＧプロフィールを変えることもできる。
従って、本発明のある実施形態には、油／脂肪の生成方法がある。この方法は、ある脂
肪酸が存在することにより細胞数を増加させるための細胞分裂に対して許容的な第１の一
連の条件下にある成長期間に組換え油産生細胞を培養する工程と、細胞分裂に対して制限
的な、しかしその脂肪酸が欠乏している油の産生に対しては許容的な第２の一連の条件下
にある油産生期間に細胞を培養する工程と、細胞から油を抽出する工程とを含み、ここで
細胞は、脂肪酸合成酵素の活性を抑制する働きをする突然変異又は外来核酸を有し、その
酵素は場合によりステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、デルタ１２脂肪酸デサチュラー
ゼ、又はケトアシル−ＡＣＰシンターゼである。細胞により産生される油は、脂肪酸が少
なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％欠乏していてもよい。細胞は従属栄養培養
することができる。細胞は、従属栄養培養又は独立栄養培養される微細藻類細胞であって
よく、乾燥細胞重量基準で少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％の油を
産生し得る。
ＩＶ．（Ａ）低多価不飽和細胞油
本発明の実施形態において、細胞により産生される細胞油は、極めて低濃度の多価不飽
和脂肪酸を有する。結果として、細胞油は、酸化安定性を含めた安定性の向上を備え得る
。細胞油は、下述する位置特異的又は立体特異的な（ｓｔｅｒｅｒｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）
油、高ステアリン酸油、又は高中鎖油を含め、室温で液体又は固体であっても、又は液体
油と固体油とのブレンドであってもよい。酸化安定性は、規定の温度でＡＯＣＳ Ｃｄ
１２ｂ−９２標準試験を使用したランシマット方法により計測することができる。例えば
、ＯＳＩ（酸化安定性指数）試験を１１０℃〜１４０℃の温度で実行することができる。
油は、１つ以上の脂肪酸デサチュラーゼの活性が低下するように遺伝子操作された細胞（
例えば、上記又は本明細書の他の部分で言及しているプラスチド微生物細胞のいずれか）
を培養することにより生成される。例えば、細胞は、オレイン酸（１８：１）からリノー
ル酸（１８：２）への変換に関与する１つ以上の脂肪酸アシルΔ１２デサチュラーゼ及び
／又はリノール酸（１８：２）からリノレン酸（１８：３）への変換に関与する１つ以上
の脂肪酸アシルΔ１５デサチュラーゼの活性が低下するように遺伝子操作されてもよい。
コード領域又は調節領域にあるデサチュラーゼをコードする遺伝子の１つ以上の対立遺伝
子のノックアウト又は突然変異、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アン
チセンス、及びヘアピンＲＮＡ技術を含めた、ＲＮＡ転写、又は酵素の翻訳の阻害を含め
、様々な方法を使用してデサチュラーゼを阻害することができる。阻害タンパク質又はデ
サチュラーゼに特異的な他の物質を産生する外来遺伝子の導入を含め、当該技術分野にお
いて公知の他の技法もまた用いることができる。具体的な例では、一方の脂肪酸アシルΔ
１２デサチュラーゼ対立遺伝子のノックアウトが第２の対立遺伝子のＲＮＡレベルの阻害
と組み合わされる。
特定の実施形態において、細胞における脂肪酸デサチュラーゼ（例えば、Δ１２脂肪酸
デサチュラーゼ）活性は、細胞を培養できないか又は培養することが困難になる（例えば
、細胞分裂速度が１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９７
又は９９％より大きく低下する）ような程度まで減少させる。かかる条件の実現は、デサ
チュラーゼの複数の遺伝子コピー（例えば２、３、４個又はそれを超える）又はそれらの
遺伝子産物の活性のノックアウト、又は有効な抑制を伴い得る。特定の実施形態は、細胞
数を増加させるため脂肪酸又は脂肪酸混合物を補給した完全な又は部分的な脂肪酸要求株
の細胞培養での培養と、次に細胞に油を（例えば細胞重量基準で少なくとも４０％まで）
蓄積させることを含む。或いは、細胞は、活性を切り替えることのできる調節可能な脂肪
酸合成遺伝子を含む。例えば、調節は環境条件に基づくことができ、第１の細胞分裂期間
における環境条件が脂肪酸の産生に有利であり、且つ第２の油蓄積期間における環境条件
が油の産生に不利である。例えば、培養培地ｐＨ及び／又は窒素レベルを環境制御として
使用して脂質経路遺伝子の発現を切り替え、合成酵素活性が高い又は低い状態を生じさせ
ることができる。かかる細胞の例が実施例７に記載される。
特定の実施形態では、細胞内のリノール酸濃度の調節を用いて細胞が培養される。詳細
には、リノール酸が存在するために細胞数の増加に許容的な第１の条件下で細胞を培養し
、次にリノール酸飢餓により特徴付けられる、従って細胞分裂に対して抑制的な、しかし
油の蓄積には許容的な第２の条件下で細胞を培養することにより細胞油が産生される。例
えば、培養培地に添加したリノール酸の存在下で細胞のシード培養物が作られてもよい。
例えば、脂肪酸アシルΔ１２デサチュラーゼの２つの対立遺伝子を消失させたためにリノ
ール酸産生を欠くＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株（すなわちリノール酸要求株）のシード培養物
に対し、０．２５ｇ／Ｌになるようなリノール酸の添加が、の細胞分裂を野生型細胞と同
等のレベルに支持するのに十分であった。場合により、次にリノール酸を細胞に消費させ
るか、又は他の方法で除去又は希釈してもよい。次に細胞は油産生期間に切り替えられる
（例えば、国際公開第２０１０／０６３０３２号パンフレットに記載されるとおり窒素制
限条件下で糖を供給する）。意外にも、油の産生はリノール酸産生又は補給の非存在下で
あっても起こることが認められており、これは偏性従属栄養生物の油産生微細藻類Ｐｒｏ
ｔｏｔｈｅｃａで実証されるとおりであるが、しかし概して他の油産生微細藻類、微生物
、又はさらには多細胞生物（例えば、培養植物細胞）に適用可能である。これらの条件下
で、細胞の含油量は、乾燥細胞重量基準で約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０
、８０、９０％又はそれを超えるまで増加し得る一方、産生される油は、油中の合計トリ
アシルグリセロール脂肪酸に対する百分率として、５％、４％、３％、２％、１％、０．
５％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％又はそれ以下の多価不飽和脂肪酸（例
えば；リノール酸＋リノレン酸）プロフィールを有し得る。例えば、細胞の含油量が乾燥
細胞重量基準で５０％又はそれを超え、産生される油のトリグリセリドが３％未満の多価
不飽和脂肪酸であってもよい。
これらの油はまた、細胞分裂期間中はリノール酸を産生する細胞機構を用いることによ
り、しかし脂質産生期間中はリノール酸を減らして又はそれなしに、リノール酸を培養物
に補足する必要なしに（又はその必要性を低減して）生成することができる。リノール酸
を産生する細胞機構は、油産生期間中に産生するリノール酸が実質的に少なくなるように
調節可能であり得る。この調節は、１つ又は複数のデサチュラーゼ遺伝子の転写調節か又
は阻害物質の産生の調節若しくは調節（例えば、調節されたヘアピンＲＮＡ／ＲＮＡｉ産
生）を介し得る。例えば、脂肪酸Δ１２デサチュラーゼ活性の大部分、好ましくは全てを
、細胞分裂期間はデサチュラーゼを発現するが油蓄積期間中はそれが低下し又は消失する
ように調節された調節可能なプロモーター下に置くことができる。この調節は、本明細書
の例に記載されるとおり、ｐＨ、及び／又は窒素濃度などの細胞培養条件、又は他の環境
条件と関係付けることができる。実際には、条件は、物質（例えば、酸又は塩基の添加に
よるプロトン）を添加若しくは除去するか、又は細胞に物質（例えば、窒素供給栄養素）
を消費させて、デサチュラーゼ活性の調節に所望の切り替えを生じさせることにより操作
され得る。
デサチュラーゼ活性を調節するための他の遺伝的又は非遺伝的方法もまた用いることが
できる。例えば、油産生期間における多価不飽和脂肪酸の産生を阻害するのに有効な方法
で培養培地にデサチュラーゼの阻害薬を添加することができる。
従って、本発明の特定の実施形態には、環境条件による組換え調節エレメントの制御下
にある、調節可能なデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子を有する組換え細胞を提供す
る工程を含む方法がある。細胞は、細胞増殖に有利な条件下で培養される。所与の細胞密
度に達したところで細胞培地が変更され、細胞が栄養制限（例えば利用可能な窒素の減少
）によって脂質産生モードに切り替えられる。脂質産生期間の間は、デルタ１２脂肪酸デ
サチュラーゼの活性が下方調節されるような環境条件である。次に細胞が回収され、場合
により油が抽出される。脂質産生期間はデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼが低レベルであ
るため、油は多価不飽和脂肪酸が少なくなり、酸化安定性が向上する。場合により、細胞
は従属栄養培養され、場合により微細藻類細胞である。
これらのデサチュラーゼ調節方法の１つ以上を用いると、特にバイオリアクター（例え
ば１０００Ｌ超）における大規模培養ではこれまで得ることができなかったと考えらる細
胞油を得ることが可能となる。油は、油中の合計トリアシルグリセロール脂肪酸の面積パ
ーセントとして、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．３％、０．２％、又は
それ以下の多価不飽和脂肪酸レベルを有し得る。
かかる低レベルの多価不飽和物を有することの一つの帰結は、油が酸化に対して極めて
安定することである。実際、ある場合に油は、これまでに知られているどの細胞細胞油と
比べても高い安定性を有し得る。特定の実施形態では、油は抗酸化剤の添加なしに、１１
０℃で、ＡＯＣＳ Ｃｄ １２ｂ−９２．ランシマット試験条件下１０時間、１５時間、
２０時間、３０時間、４０時間、５０時間、６０時間、又は７０時間までに未だ電気伝導
度の変曲点に達しない安定性を有する。極めて安定した油について、かかる試験では、か
かる長い試験期間により蒸発が起こるため、水の補充が必要となり得ることが注記される
（実施例５を参照のこと）。例えば油は、抗酸化剤の添加なしに１１０℃で４０〜５０時
間又は４１〜４６時間のＯＳＩ値を有し得る。抗酸化剤（食品に好適なもの等）が添加さ
れる場合、計測されるＯＳＩ値はさらに高くなり得る。例えば、トコフェロール（１００
ｐｐｍ）及びパルミチン酸アスコルビル（５００ｐｐｍ）又はＰＡＮＡ及びパルミチン酸
アスコルビルを添加すると、かかる油は、ランシマット試験により計測したとき、１１０
℃で１００又は２００時間を超える酸化安定性指数（ＯＳＩ値）を有し得る。別の例にお
いて、１０５０ｐｐｍの混合トコフェロール及び５００ｐｍのパルミチン酸アスコルビル
を、１％未満のリノール酸又は１％未満のリノール酸＋リノレン酸を含む油に添加する；
結果として、この油は１１０℃で１、２、３、４、５、６、７、８、又は９、１０、１１
、１２、１３、１４、１５、又は１６、２０、３０、４０又は５０日、５〜１５日、６〜
１４日、７〜１３日、８〜１２日、９〜１１日、約１０日、又は約２０日間安定である。
油はまた、１３０℃で１、２、３、４、５、６、７、８、又は９、１０、１１、１２、１
３、１４、１５、又は１６、２０、３０、４０又は５０日、５〜１５日、６〜１４日、７
〜１３日、８〜１２日、９〜１１日、約１０日、又は約２０日間安定であり得る。特定の
例では、かかる油は、１００時間を超えて（観察時約１２８時間）安定であることが認め
られた。さらなる実施形態において、抗酸化剤を添加しない細胞油の１２０℃でのＯＳＩ
値は１５時間又は２０時間より長く、又は１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、又は２
５〜５０時間、又は５０〜１００時間の範囲である。
ある例では、これらの方法を用いると、微細藻類細胞の含油量は乾燥細胞重量基準で４
０〜約８５％であり、油の脂肪酸プロフィールにおける多価不飽和脂肪酸は油の脂肪酸プ
ロフィールの０．００１％〜３％であり、場合により抗酸化剤の添加なしに１１０℃で少
なくとも２０時間のＯＳＩ誘導時間を有する細胞油を生じる。さらに別の例には、油産生
細胞由来の細胞油のＲＢＤ処理により生成される細胞油があり、この油は０．００１％〜
２％の多価不飽和脂肪酸を含み、抗酸化剤の添加なしに１１０℃で３０時間を超えるＯＳ
Ｉ誘導時間を有する。さらに別の例には、油産生細胞由来の細胞油のＲＢＤ処理により産
生される細胞油があり、この油は０．００１％〜１％の多価不飽和脂肪酸を含み、抗酸化
剤の添加なしに１１０℃で３０時間を超えるＯＳＩ誘導時間を有する。
別の特定の実施形態には、上述の方法によって生成される多価不飽和度が低下した油が
ある。この油は、ＰＡＮＡ及びパルミチン酸アスコルビルなどの抗酸化剤と組み合わされ
る。例えば、かかる油を０．５％のＰＡＮＡ及び５００ｐｐｍのパルミチン酸アスコルビ
ルと組み合わせると、油が１３０℃で約５日又は１１０℃で２１日のＯＳＩ値を有したこ
とが認められた。これらの注目に値する結果は、この油が極めて安定しているのみならず
、これらの２つの抗酸化剤がトリグリセリド油の極めて強力な安定化剤であり、これらの
抗酸化剤の組み合わせが、安定な生分解性潤滑剤（例えば、ジェットエンジン潤滑剤）の
製造における適用性を含め、普遍的な適用性を有し得ることを示唆している。特定の実施
形態において、脂肪酸アシルΔ１２デサチュラーゼの遺伝子操作により、操作しない株と
比べて、ＯＳＩの（例えば、１１０℃における）２〜３０倍、又は５〜２５倍、又は１０
〜２０倍の増加がもたらされる。油は、上記に記載したとおりのことを含め、細胞のデサ
チュラーゼ活性を抑制することにより生成することができる。
本発明の油で使用するのに好適な抗酸化剤としては、アルファ、デルタ、及びガンマト
コフェロール（ビタミンＥ）、トコトリエノール、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、グル
タチオン、リポ酸、尿酸、β−カロチン、リコペン、ルテイン、レチノール（ビタミンＡ
）、ユビキノール（補酵素Ｑ）、メラトニン、レスベラトロール、フラボノイド、ローズ
マリー抽出物、没食子酸プロピル（ＰＧ）、第三ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）、ブチ
ル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、及びブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、Ｎ
，Ｎ’−ジ−２−ブチル−１，４−フェニレンジアミン、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル
−４−メチルフェノール、２，４−ジメチル−６−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、２，４
−ジメチル−６−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、２，４−ジメチル−６−ｔｅｒｔ−ブチ
ルフェノール、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール、２，６−ジ−ｔ
ｅｒｔ−ブチルフェノール、及びフェニル−α−ナフチルアミン（ＰＡＮＡ）が挙げられ
る。
デサチュラーゼの改変に加え、関連する実施形態では、全体を通して記載するとおり、
鎖長特異性が変化したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの導入又は置換及び／又はＫＡＳ
、ＳＡＤ、ＬＰＡＡＴ、又はＤＧＡＴ遺伝子をコードする内在性又は外来性遺伝子の過剰
発現を含め、油の特性をさらに調整するため他の遺伝子改変が作製され得る。例えば、高
いオレイン酸レベルを生じる株が、低レベルの多価不飽和物も生じ得る。かかる遺伝子改
変には、外来性ＳＡＤ遺伝子の導入によってステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡ
Ｄ）の活性を増加させること、外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子の導入によってエロンガーゼ活性
を増加させること、及び／又はＦＡＴＡ遺伝子をノックダウン又はノックアウトすること
が含まれ得る。
特定の実施形態では、低多価不飽和物の高オレイン酸細胞油が生成され得る。例えば、
この油は、６０、７０、８０、９０、又は９５％超のオレイン酸及び５、４、３、２、又
は１％未満の多価不飽和物を含む脂肪酸プロフィールを有し得る。関連する実施形態では
、３％以下の多価不飽和脂肪酸であって６０％超のオレイン酸、２％未満の多価不飽和脂
肪酸且つ７０％超のオレイン酸、１％未満の多価不飽和脂肪酸且つ８０％超のオレイン酸
、又は０．５％未満の多価不飽和脂肪酸且つ９０％超のオレイン酸を有する油を産生する
ため、脂肪酸Δ１２デサチュラーゼ活性及び場合により脂肪酸Δ１５デサチュラーゼを低
下させる働きをする組換え核酸を有する細胞により細胞油が生成される。オレイン酸を増
加させる一つの方法は、ＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現を低下させると
ともに、場合によりＫＡＳ ＩＩ遺伝子を過剰発現させる働きをする組換え核酸を使用す
ることであることが分かっている；かかる細胞は、７５％以上のオレイン酸を含む油を産
生することができる。或いは、ＦＡＴＡノックアウト又はノックダウンなしにＫＡＳＩＩ
の過剰発現を用いることができる。オレイン酸レベルは、上記の方法を用いてデルタ１２
脂肪酸デサチュラーゼ活性を低下させ、それにより不飽和のリノール酸及びリノレン酸に
変換されるオレイン酸の量を減少させることにより、さらに増加させることができる。従
って、産生される油は、少なくとも７５％のオレイン酸及び高々３％、２％、１％、又は
０．５％のリノール酸を含む脂肪酸プロフィールを有し得る。関連する例では、油は、８
０〜９５％のオレイン酸及び約０．００１〜２％のリノール酸、０．０１〜２％のリノー
ル酸、又は０．１〜２％のリノール酸を有する。別の関連する実施形態では、油は、１０
％未満のパルミチン酸、８５％超のオレイン酸、１％以下の多価不飽和脂肪酸、及び７％
未満の飽和脂肪酸を有する細胞油が微生物によって産生されるように油産生細胞（例えば
、微細藻）を培養することにより産生される。実施例５８を参照されたく、ここではかか
る油が、ＦＡＤ及びＦＡＴＡノックアウトに加えて外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子の発現を有す
る微細藻で産生される。かかる油は低い凝固点を有して安定性に優れ、食品において、フ
ライ用、燃料用に、又は化学的応用において有用である。さらに、これらの油は、時間が
経過しても変色し難い傾向を呈し得る。例示的な化学的応用では、高オレイン酸油を使用
して化学品が製造される。油中のトリグリセリドのオレイン酸基のオレイン酸二重結合を
エポキシ化又はヒドロキシル化してポリオールを作製することができる。エポキシ化油又
はヒドロキシル化油は、様々な用途で用いられ得る。かかる用途の一つは、ヒドロキシル
化大豆油又はヒマシ油で実施されているとおりの、ヒドロキシル化トリグリセリドとイソ
シアネートとの縮合によるポリウレタン（ポリウレタンフォームを含む）の製造である。
ヒドロキシル化及びポリウレタン縮合化学の例については、例えば、米国特許出願公開第
２００５／０２３９９１５号明細書、米国特許出願公開第２００９／０１７６９０４号明
細書、米国特許出願公開第２００５／０１７６８３９号明細書、米国特許出願公開第２０
０９／０２７０５２０号明細書、及び米国特許第４，２６４，７４３号明細書及びＺｌａ
ｔａｎｉｃ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００２，３，１０４
８−１０５６（２００２）を参照のこと。好適なヒドロキシル形成反応としては、脂肪酸
の１つ以上の二重結合のエポキシ化と、続く水（ジオールの形成）、アルコール（ヒドロ
キシルエーテルの形成）、又は酸（ヒドロキシルエステルの形成）による酸触媒エポキシ
ド開環が挙げられる。バイオベースのポリウレタンの製造において高オレイン酸／低多価
不飽和油を使用することには、複数の利点がある：（１）ポリウレタンフォームの保存寿
命、色又は匂いが向上し得る；（２）多価不飽和物により生じる不要な副反応がないため
、製品の再現性が向上し得る；（３）多価不飽和物がないため、より高度にヒドロキシル
化反応が起こり、従ってポリウレタン製品の構造特性を向上させることができる。
本明細書に記載される低多価不飽和油又は高オレイン酸／低多価不飽和油は、有利には
、黄変が望ましくない化学的応用において使用され得る。例えば、トリグリセリドに由来
するトリグリセリド脂肪酸から作られるペンキ又はコーティングにおいて、黄変は望まし
くないものであり得る。黄変は、多価不飽和脂肪酸及びトコトリエノール及び／又はトコ
フェロールが関わる反応によって生じ得る。従って、油産生微生物において低レベルのト
コトリエノールを含む高い安定性の油を生成することは、油を使用して作られる化学組成
物の高い色安定性を向上させるのに有利であり得る。一般的に使用される植物油と対照的
に、油産生微生物を適切に選択することにより、これらの実施形態の細胞油は１ｇ／Ｌ以
下のトコフェロール及びトコトリエノールレベルを有し得る。特定の実施形態において、
細胞油は、多価不飽和脂肪酸が２％未満であり、且つトコフェロール、トコトリエノール
又はトコフェロールとトコトリエノールとの合計が１ｇ／Ｌ未満である脂肪酸プロフィー
ルを有する。別の特定の実施形態において、細胞油は、多価不飽和脂肪酸が１％未満であ
り、且つトコフェロール、トコトリエノール又はトコフェロールとトコトリエノールとの
合計が０．５ｇ／Ｌ未満である脂肪酸プロフィールを有する。
高安定性（低多価不飽和）の細胞油のいずれか又はその誘導体は、食品、薬物、ビタミ
ン、ニュートラシューティカルズ、パーソナルケア製品又は他の製品の配合に使用するこ
とができ、特に酸化の影響を受け易い製品に有用である。例えば、高安定性細胞油（例え
ば、３％、２％又は１％以下の多価不飽和物）を使用して、多価不飽和脂肪酸に関連する
フリーラジカル反応がないため保存寿命が増加した日焼け防止剤（例えば、アボベンゾン
、ホモサレート、オクチサレート、オクトクリレン又はオキシベンゾンの１つ以上を有す
る組成物）又はレチノイド顔用クリームを配合することができる。例えば、５４℃で４週
間の加速劣化後に残る色、匂い、官能特性又は％活性化合物の点で、保存寿命が増加し得
る。高安定性の油はまた、高温安定性に優れた潤滑剤としても使用することができる。安
定性に加え、油は生分解性であってもよく、これはまれな組み合わせの特性である。
別の関連する実施形態では、細胞油の脂肪酸プロフィールのＣ８〜Ｃ１６脂肪酸を、さ
らなる遺伝子改変によって、例えば短鎖乃至中鎖選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ
の過剰発現又は本明細書に記載される他の改変によって上昇させる。これらの実施形態に
おける低多価不飽和油は、酸化安定性の向上が求められるものを含め、様々な工業、食品
、又は消費者製品に使用することができる。食品用途では、油は高温での寿命が長い、又
は保存寿命が長いことで、フライに用いられ得る。
油がフライに使用される場合、油の安定性が高いことで、抗酸化剤及び／又は消泡剤（
例えばシリコーン）を添加しないフライが可能となり得る。消泡剤を含まない結果として
、フライ食品による油の吸収が少なくなり得る。燃料用途でトリグリセリドとして、或い
はバイオディーゼル若しくは再生可能ディーゼルに処理されて（例えば、国際公開第２０
０８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６３０３２号パンフレット
、及び国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレットを参照のこと）使用される場合
、高い安定性により長期保存が促進され、又は高温での使用が可能となり得る。例えば、
高安定性の油から作製される燃料は、補助発電機における使用のため、１年超又は５年超
にわたり保存することができる。フライ油は２００℃より高い発煙点、及び０．１％未満
の遊離脂肪酸を有し得る（細胞油として又は精製後のいずれか）。
低多価不飽和油は、以下に記載するとおり生成されるものを含めた、β結晶又はβプラ
イム結晶を形成するものなどの構造化脂肪を含む食品油とブレンドされてもよい。このよ
うな油はまた、液体油とブレンドすることもできる。リノール酸を有する油、例えばトウ
モロコシ油と混合される場合、ブレンドのリノール酸レベルは、高オレイン酸ヒマワリ油
などの高オレイン酸植物油のレベルに近付き得る（例えば、約８０％オレイン酸及び８％
リノール酸）。
低多価不飽和細胞油のブレンドは、他の油とエステル交換させることができる。例えば
、油は化学的又は酵素的にエステル交換されてもよい。特定の実施形態において、本発明
の実施形態に係る低多価不飽和油は、その脂肪酸プロフィール中少なくとも１０％のオレ
イン酸及び５％未満の多価不飽和物を有し、ｓｎ−１及びｓｎ−２トリアシルグリセロー
ル位置に特異的な酵素を使用して高飽和油（例えば水素化大豆油又は高ステアリン酸濃度
の他の油）と酵素的にエステル交換される。この結果、ステアリン酸−オレイン酸−ステ
アリン酸（ＳＯＳ）を含む油となる。エステル交換の方法は当該技術分野において公知で
ある；例えば、「Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（脂質
改変における酵素）」，Ｕｗｅ Ｔ．Ｂｏｒｎｓｃｈｕｅｒ，ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＿ＶＣ
Ｈ，２０００，ＩＳＢＮ ３−５２７−３０１７６−３を参照のこと。
高安定性の油は、スプレー油として使用することができる。例えば、レーズンなどの乾
燥果実に、多価不飽和物が５、４、３、２、又は１％未満である高安定性油を吹き付けて
もよい。結果として、他の場合には多価不飽和物の存在によって生じ得るノズルにおける
重合又は酸化生成物の蓄積が原因となって使用スプレーノズルが詰まることが少なくなる
。
さらなる実施形態において、以下に記載するものなどのＳＯＳが高い油は、デルタ１２
脂肪酸デサチュラーゼのノックダウン又は調節により安定性を向上させることができる。
任意選択で、ＦＡＤｃプロモーターが調節される場合、それは、低ｐＨで作動可能なプ
ロモーター（例えば、ｐＨ７．０での培養からｐＨ５．０での培養に切り換えたときＦＡ
Ｄｃの転写レベルが半分未満に低下するもの）で調節することができる。プロモーターは
低窒素条件下での培養に感受性を有することができ、従ってプロモーターは窒素充満条件
下で活性であり、窒素飢餓条件下で不活性である。例えば、プロモーターは、窒素飢餓時
に５、１０、１５倍又はそれ以上のＦＡＤｃ転写物レベルの低下を生じさせ得る。プロモ
ーターはｐＨ５．０で作動可能であるため、より最適なインベルターゼ活性が達成され得
る。例えば、細胞は、インベルターゼの存在下に６．５、６．０又は５．５未満のｐＨで
培養することができる。細胞はＦＡＤｃノックアウトを有し、調節ＦＡＤｃの相対的遺伝
子投与量は増加し得る。任意選択で、インベルターゼは細胞によって（天然に又は外来性
インベルターゼ遺伝子に起因して）産生される。プロモーターは窒素飢餓条件下で活性が
低いため、細胞増殖段階における最適な細胞増殖を許容しない脂質産生期間中に脂肪酸産
生が進行し得る。詳細には、低リノール酸油が産生され得る。細胞は、乾燥細胞重量基準
で少なくとも２０％脂質の油含有量になるまで培養することができる。油は、リノール酸
が５、４、３、２、１、又は０．５、０．２、又は０．１％未満の脂肪酸プロフィールを
有し得る。実施例６２は、かかるプロモーターの発見について記載する。
ＩＶ．（Ｂ）ＦＡＤ遺伝子置換を使用して得られる高１８：２／低１８：３油
意外にも、上記に記載したとおりの低多価不飽和油の生成について研究する間、多価不
飽和物が高いもののユニークな脂肪酸プロフィールを有する油が発見された。この油の発
見は、実施例５９に記載する。従って、油産生プラスチド細胞（例えば、微細藻類）培養
物を使用して、１０％以下のリノレン酸（Ｃ１８：３）及び２０％以上のリノール酸（Ｃ
１８：２）によって特徴付けられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成することが可能
である。かかる油は、油産生微細藻又は他の油産生プラスチド細胞において、（内在性又
は外来性）ＫＡＳＩＩの過剰発現及びＦＡＤｃ（ＦＡＤ２とも称される）の遺伝子置換に
よって、及び必要であれば宿主細胞に基づき天然アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を
置き換えることによって生成し得る。実施例５８〜５９では、内因性ＫＡＳＩＩを過剰発
現させて、内在性ＦＡＤｃ遺伝子をｐＨ誘導性プロモーターの制御下に置いたが、しかし
構成的発現もまた機能し得た。興味深いことに、リノール酸要求株（例えば、ＦＡＤｃ二
重ノックアウト）でＦＡＤｃを過剰発現させたとき、油はリノール酸が非常に高かった。
これは、微細藻類にこれまでに認識されていない遺伝子レベルの調節システムが存在し、
リノール酸の効率的な蓄積のためにはこれを機能不能にしなければならないことが原因と
考えられる。加えて、内在性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの２つのコピーをノックア
ウトしてオレイン酸特異的植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼに置き換えた。許容的ｐ
Ｈ条件下では、１０％以下のリノレン酸（Ｃ１８：３）及び２０％以上のリノール酸（Ｃ
１８：２）を有する油。この油は、抽出して、食料品又は化学品に含められる様々な用途
に使用することができる。宿主細胞が微細藻である場合、油は微細藻類ステロールを含む
ことができる。他の実施形態と同様に、宿主細胞は、外因性インベルターゼを発現するよ
うに形質転換された、従って従属栄養培養条件下でショ糖を油に変換することが可能な微
細藻であってもよい。
具体的な実施形態において、宿主細胞は、ＦＡＤｃノックダウン、ノックアウト、又は
下方調節可能なプロモーターを有するＦＡＤｃを、実施例５８に開示されるＰｒｏｔｏｔ
ｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ遺伝子によってコードされるタンパク質と
少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９
９％のアミノ酸同一性を有するタンパク質を発現する外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子と組み合わ
せて含み、及び任意選択で、オレイン酸特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ酵素を産
生するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を発現する。任意選択で、細胞は植物細胞
、微生物細胞、又は微細藻類細胞であってもよい。
Ｖ．外来性アシルトランスフェラーゼを含む細胞
本発明の様々な実施形態において、細胞により産生される細胞油の脂肪酸組成を変化さ
せるため、アシルトランスフェラーゼ（脂肪酸とグリセロール又はグリセロール誘導体と
の縮合によるアシルグリセリドの形成に関与する酵素）をコードする１つ以上の遺伝子を
油産生細胞（例えば、プラスチド微細藻類細胞）に導入することができる。この遺伝子は
、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、１−アシルグリセ
ロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＡＧＰＡＴ）としても知られるリゾホス
ファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ホスファチジン酸ホスファター
ゼ（ＰＡＰ）、又はアシル基をＤＡＧのｓｎ−３位に転移させて、それによりＴＡＧを産
生するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）の１つ以上をコード
し得る。
組換え核酸は細胞のプラスミド又は染色体に組み込まれてもよい。或いは、遺伝子は、
上記のものとは別個の脂肪酸アシル−ＣｏＡ非依存経路でＴＡＧ前駆体分子を生成する脂
質経路の酵素をコードする。アシル−ＡＣＰは、プラスチドＧＰＡＴ及びＬＰＡＡＴ酵素
及び／又はミトコンドリアＧＰＡＴ及びＬＰＡＡＴ酵素の基質であり得る。ＴＡＧを産生
するため（例えば膜リン脂質から）アシル基を取り入れる能力を有するさらなる酵素の中
には、リン脂質ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）がある。さ
らに別のアシルトランスフェラーゼが、リゾホスホスファチジルコリン（ｌｙｓｏｐｈｏ
ｓｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）
、リゾホスホスファチジルセリン（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉ
ｎｅ）アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＳＡＴ）、リゾホスホスファチジルエタノールア
ミン（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）アシルト
ランスフェラーゼ（ＬＰＥＡＴ）、及びリゾホスホスファチジルイノシトール（ｌｙｓｏ
ｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アシルトランスフェラーゼ（ＬＰ
ＩＡＴ）を含め、トリグリセリド組成に影響を及ぼし得るリン脂質合成及びリモデリング
に関与する。
外来遺伝子は、特定の炭素原子数及び／又は特定の飽和度を含むアシル基質の転移に選
択的な特異性を有するアシルトランスフェラーゼ酵素をコードすることができ、これが、
所与の位置特異的トリグリセリドが高濃度化された油の産生のため、油産生細胞に導入さ
れる。例えば、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）リゾホスファチジン酸アシル
トランスフェラーゼは、他のアシル−ＣｏＡ基質よりＣ１２：０−ＣｏＡ基質に選択性を
示すことが実証されており（Ｋｎｕｔｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２０，１９９９，ｐｐ ７３９−７４６）、一方、成熟ベニバナ種
子の１−アシル−ｓｎ−３−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼは、ス
テアロイル−ＣｏＡを含め、他のアシル−ＣｏＡ基質よりリノレオイル−ＣｏＡ及びオレ
オイル−ＣｏＡ基質に選択性を示す（Ｉｃｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａ
ｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１６７，１９８９，ｐ
ｐ．３３９−３４７）。さらに、アシルトランスフェラーゼタンパク質が、１つ以上の短
鎖、中鎖、又は長鎖アシル−ＣｏＡ又はアシル−ＡＣＰ基質に対する選択的特異性を示し
得るが、この選択性は、リゾホスファチジン酸ドナー基質のｓｎ−１位又はｓｎ−３位に
特定のアシル基、例えば中鎖アシル基が存在する場合にのみ起こり得る。外来遺伝子があ
る結果として、細胞により、ＴＡＧ分子の２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０、
又は９０％超で特定の脂肪酸がｓｎ−２位に見られるＴＡＧ油が生成され得る。
本発明の一部の実施形態では、細胞は、飽和−不飽和−飽和（ｓａｔ−ｕｎｓａｔ−ｓ
ａｔ）ＴＡＧリッチな油を作り出す。ｓａｔ−ｕｎｓａｔ−ｓａｔ ＴＡＧとしては、１
，３−ジヘキサデカノイル−２−（９Ｚ−オクタデセノイル）−グリセロール（１−パル
ミトイル−２−オレイル−グリセロ−３−パルミトイルと称される）、１，３−ジオクタ
デカノイル−２−（９Ｚ−オクタデセノイル）−グリセロール（１−ステアロイル−２−
オレイル−グリセロ−３−ステアロイルと称される）、及び１−ヘキサデカノイル−２−
（９Ｚ−オクタデセノイル）−３−オクタデカノイ（ｏｃｔａｄｅｃａｎｏｙ）−グリセ
ロール（１−パルミトイル−２−オレイル−グリセロ−３−ステアロイルと称される）が
挙げられる。これらの分子はより一般的には、それぞれ、ＰＯＰ、ＳＯＳ、及びＰＯＳと
称され、ここで「Ｐ」はパルミチン酸を表し、「Ｓ」はステアリン酸を表し、及び「Ｏ」
はオレイン酸を表す。飽和−不飽和−飽和ＴＡＧのさらなる例としては、ＭＯＭ、ＬＯＬ
、ＭＯＬ、ＣＯＣ及びＣＯＬが挙げられ、ここで「Ｍ」はミリスチン酸を表し、「Ｌ」は
ラウリン酸を表し、及び「Ｃ」はカプリン酸（Ｃ８：０）を表す。３つの飽和脂肪酸アシ
ル基を含むトリグリセリドであるトリ飽和物（ｔｒｉｓａｔｕｒａｔｅ）は、一般に、他
の種類のトリグリセリドより高いその結晶化率のため、食品用途での使用が求められる。
トリ飽和物の例としては、ＰＰＭ、ＰＰＰ、ＬＬＬ、ＳＳＳ、ＣＣＣ、ＰＰＳ、ＰＰＬ、
ＰＰＭ、ＬＬＰ、及びＬＬＳが挙げられる。加えて、ＴＡＧにおける脂肪酸の位置特異的
分布は、消化及び吸収中の食事性脂肪の代謝運命の重要な決定要因である。
本発明の特定の実施形態によれば、油産生細胞は組換え核酸によって形質転換され、そ
れにより特定の位置特異的トリグリセリド、例えば１−アシル−２−オレイル−グリセロ
−３−アシル、又は１−アシル−２−ラウリン酸−グリセロ−３−アシル（ここでは組換
え核酸の導入の結果として、それぞれオレイン酸又はラウリン酸がｓｎ−２位にある）を
より多量に含む細胞油が生産される。或いは、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、
又はパルミチン酸がｓｎ−２位にあってもよい。細胞油中に存在する特定の位置特異的ト
リグリセリドの量は、組換え核酸を含まない微生物によって産生される細胞油と比べて５
％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、５０
％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、１００〜５００％超、又は５００％超
増加し得る。結果として、細胞トリグリセリドのｓｎ−２プロフィールは、１０、２０、
３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％超の特定の脂肪酸を有し得る。
グリセロ脂質において個別の立体特異的又は位置特異的な位置にあるアシル鎖の同一性
を、当該技術分野において公知の（Ｌｕｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．，４１，６９３−６９６（１９６４）、Ｂｒｏｃｋｅｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｌ
ｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，６，１０−１５（１９６５）、Ａｎｇｅｒｓ ａｎｄ Ａｒｙｌ，
Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．７６：４，（１９９９）、Ｂｕｃｈｇ
ｒａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１０
６，６２１−６４８（２００４）を参照のこと）、又は、以下に提供する実施例１、２、
及び８における１つ以上の分析法により評価することができる。
トリグリセリド分子における脂肪酸の位置分布は、アシルトランスフェラーゼの基質特
異性、並びに利用可能なアシル部分基質プールの濃度及び種類により影響を受け得る。組
換え微生物で産生されるトリグリセリドの位置特異性を変化させるのに好適な酵素の非限
定的な例を表１〜表４に掲載する。当業者は、さらに好適なタンパク質を同定し得る。
本発明の微生物及び方法での使用に好適なリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラ
ーゼとしては、限定なしに、表２に掲載するものが挙げられる。
本発明の微生物及び方法での使用に好適なジアシルグリセロールアシルトランスフェラ
ーゼとしては、限定なしに、表３に掲載するものが挙げられる。
本発明の微生物及び方法での使用に好適なリン脂質ジアシルグリセロールアシルトラン
スフェラーゼとしては、限定なしに、表４に掲載するものが挙げられる。
本発明の実施形態では、既知又は新規のＬＰＡＡＴ遺伝子を油産生細胞に形質転換し、
それによりそうした細胞によって産生されるトリグリセリドの脂肪酸プロフィールを、最
も顕著にはトリグリセリドのｓｎ−２プロフィールを変えることにより変化させる。例え
ば、油産生細胞において外来性活性ＬＰＡＡＴが発現することにより、ｓｎ−２位におけ
る不飽和脂肪酸の割合が、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％又
はそれを超えて増加する。例えば、細胞は、３０％がｓｎ−２位の不飽和物（これは主と
して１８：１及び１８：２及び１８：３脂肪酸であってよい）であるトリグリセリドを産
生し得る。この例では、ＬＰＡＡＴ活性を導入することにより、ｓｎ−２位における不飽
和物が２０％増加し、従ってトリグリセリドの３６％がｓｎ−２位における不飽和物を含
む。或いは、外因性ＬＰＡＡＴを使用して、ｓｎ−２位におけるＣ８：０、Ｃ１０：０、
Ｃ１２：０、Ｃ１４：０又はＣ１６：０部分などの飽和中鎖を含む中鎖脂肪酸を増加させ
ることができる。結果として、脂肪酸プロフィール全体の中鎖レベルが増加し得る。実施
例４３及び４４は、油産生微生物におけるｓｎ−２及び脂肪酸プロフィールの改変につい
て記載している。これらの例から分かるとおり、ＬＰＡＡＴ遺伝子の選択は、異なるＬＰ
ＡＡＴがｓｎ−２及び脂肪酸プロフィールにおいて異なるアシル基鎖長又は飽和度へのシ
フトを引き起こし得る点で重要である。例えば、実施例４３のＬＰＡＡＴはＣ１０〜Ｃ１
４脂肪酸を増加させ、実施例４４のＬＰＡＡＴはＣ１６及びＣ１８脂肪酸の増加を生じさ
せる。これらの例にあるとおり、外因性ＬＰＡＡＴの導入は、外来性アシル−ＡＣＰチオ
エステラーゼの導入と組み合わせることができる。中鎖選択的ＬＰＡＡＴと中鎖選択的Ｆ
ａｔＢとの組み合わせが相加効果をもたらすことが分かった；脂肪酸プロフィールは、外
因性ＬＰＡＡＴ及びＦａｔＢ遺伝子の両方が存在したとき、外来性ＦａｔＢ遺伝子のみが
存在したときよりもさらに中鎖脂肪酸の方にシフトした。特定の実施形態において、外来
性中鎖特異的ＬＰＡＡＴと（場合により）外来性ＦａｔＢアシル−ＡＣＰチオエステラー
ゼ遺伝子とを含む細胞によって産生される油は、Ｃ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ
１４：０、又はＣ１６：０脂肪酸が（個別に又は合計で）４０、５０、６０、７０、８０
％又はそれを超える脂肪酸プロフィールを有し得る。
本発明の具体的な実施形態は、核酸構築物、核酸構築物を含む細胞、トリグリセリドを
生成するための細胞の培養方法、及び生成されるトリグリセリド油であり、ここで核酸構
築物は、新規ＬＰＡＡＴコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを有する。この
コード配列は、上流に開始コドン及び下流に終止コドンと、続く３ ＵＴＲ配列を有し得
る。具体的な実施形態において、ＬＰＡＡＴ遺伝子はＬＰＡＡＴ活性を有し、コード配列
は、配列番号８０〜８５のｃＤＮＡのいずれかと少なくとも７５、８０、８５、９０、９
５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性又は遺伝子コードの縮重に起因して等価
な配列を含めたその機能断片を有する。イントロンも同様に配列に挿入され得る。或いは
、ＬＰＡＡＴ遺伝子は、配列番号７７〜７９のアミノ酸配列又はその機能断片、又は少な
くとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％のアミノ酸配列同
一性を有するタンパク質をコードする。微細藻類及び他の油産生細胞に加えて、導入遺伝
子として新規ＬＰＡＡＴを発現する植物が、これらの実施形態に明示的に包含され、公知
の遺伝子工学技術を用いて作製することができる。
ＶＩ．外因性エロンガーゼ又はエロンガーゼ複合体酵素を含む細胞
本発明の様々な実施形態において、エロンガーゼ又は脂肪酸アシル−ＣｏＡ伸長複合体
の成分をコードする１つ以上の遺伝子を油産生細胞（例えばプラスチド微細藻類細胞）に
導入することにより、細胞又は細胞により産生される細胞油の脂肪酸組成を変えることが
できる。遺伝子は、β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（３−ケトアシルシンターゼ、β
−ケトアシルシンターゼ又はＫＣＳとも称される）、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、又はエロン
ガーゼをコードし得る。これらの遺伝子によりコードされる酵素は、アシル−ＡＣＰチオ
エステラーゼによって遊離するアシル−ｃｏＡ分子の伸長に活性を有する。組換え核酸が
細胞のプラスミド又は染色体に組み込まれてもよい。特定の実施形態において、細胞は、
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞などの従属栄養細胞を含めた、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａの
細胞である。
本発明の微生物及び方法での使用に好適なβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ及びエロ
ンガーゼ酵素としては、限定なしに、表５に掲載するものが挙げられる。
本発明のある実施形態では、特定の炭素原子数及び／又は特定のアシル鎖飽和度を含む
アシル基質の伸長に選択的特異性を有するβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ又はエロン
ガーゼ酵素をコードする外来遺伝子が油産生細胞に導入され、それにより特定の鎖長及び
／又は飽和の脂肪酸が高濃度化された細胞又は油が生成される。実施例４０はＰｒｏｔｏ
ｔｈｅｃａ株の操作について記載し、ここでは中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡの延長に選択性
を有する外因性脂肪酸エロンガーゼを過剰発現させることによりステアリン酸濃度を増加
させた。実施例４２及び５４はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの操作について記載し、ここでは一
価不飽和及び飽和Ｃ１８−及びＣ２０−ＣｏＡ基質の延長に選択性を有する外因性エロン
ガーゼ又はβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを過剰発現させることによりエルカ酸濃度
を増加させる。
特定の実施形態において、油産生細胞は、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４
０、５０、６０、７０、又は８０％超のエルカ酸及び／又はエイコセン酸を含む油を産生
する。或いは、細胞は、０．５〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０、
３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、又は９０
〜９９％のエルカ酸又はエイコセン酸を含む油を産生する。細胞は、オレオイル−ＣｏＡ
の伸長に活性を有する外因性β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをさらに導入することで
、高オレイン酸油に関連して上記に記載する組換え酸を含み得る。外因性β−ケトアシル
−ＣｏＡシンターゼが発現する結果として、細胞によるエルカ酸又はエイコセン酸の天然
産生が２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、７０、１００、１３０、１７０
又は２００倍超増加し得る。高エルカ酸及び／又はエイコセン酸油はまた、高い安定性の
油；例えば、５、４、３、２、又は１％未満の多価不飽和物を含み及び／又は第ＩＶ節又
は本願及び添付の実施例に記載されるＯＳＩ値を有するものであり得る。特定の実施形態
において、細胞は微細藻類細胞であり、場合により従属栄養培養される。他の実施形態に
あるとおり、油／脂肪は、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ門、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｔａｅ
綱、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ目、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａｃａｅ科の従属栄養微細藻類
を含めたプラスチド細胞の遺伝子操作によって生成することができる。好ましくは、細胞
は油産生性であり、乾燥細胞重量基準で少なくとも４０％の油を蓄積する能力を有する。
細胞は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｚｏ
ｐｆｉｉを含めたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの種などの、偏性従属栄養生物であってもよい。
具体的な実施形態において、油産生微生物細胞、任意選択で油産生微細藻類細胞、任意
選択でＣｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ門、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｔａｅ綱、Ｃｈｌｏｒｅｌ
ｌａｌｅｓ目、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａｃａｅ科のものは、表５の酵素と８０、８５、９
０、９５、９６、９７、９８、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する酵素を発現する
。
ＶＩＩ．位置特異的及び立体特異的油／脂肪
ある実施形態では、組換え細胞は、所与の位置特異的組成を有する細胞脂肪又は油を産
生する。結果として、細胞は、所与の多形形態の結晶を（例えば、融解温度を上回るまで
加熱し、次に脂肪の融解温度未満に冷却するとき）形成する傾向を有するトリグリセリド
脂肪を産生することができる。例えば、脂肪は、テンパリングするかしないかに関わらず
、β型又はβ’型の結晶多形（例えばＸ線回折解析によって決定するとき）を形成する傾
向を有し得る。脂肪は規則性脂肪であってもよい。特定の実施形態において、脂肪は、冷
却するとβ結晶或いはβ’結晶を直接形成し得る；或いは、脂肪はβ型を経てβ’型へと
進み得る。かかる脂肪は、食品用途での構造化ラミネート用又はコーティング用脂肪とし
て使用することができる。この細胞脂肪は、キャンディー、ダーク又はホワイトチョコレ
ート、チョコレート風味の糖菓、アイスクリーム、マーガリン又は他のスプレッド、クリ
ームの詰め物、ペストリー、又は他の食品に添合することができる。場合により、脂肪は
（室温で）半固体であってもよいが、しかし人工的に作られたトランス脂肪酸は含まない
。かかる脂肪はまた、スキンケア及び他の消費者製品又は工業製品においても有用であり
得る。
他の実施形態にあるとおり、脂肪は、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ門、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏ
ｐｈｙｔａｅ綱、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ目、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａｃａｅ科の従属
栄養真核微細藻類を含めたプラスチド細胞の遺伝子操作によって生成され得る。好ましく
は、細胞は油産生性であり、乾燥細胞重量基準で少なくとも４０％の油を蓄積する能力を
有する。細胞は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃ
ａ ｚｏｐｆｉｉを含めたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの種などの、偏性従属栄養生物であって
もよい。脂肪はまた、独立栄養性の藻類又は植物においても産生され得る。場合により、
細胞は、油を産生するためにショ糖を利用する能力を有し、国際公開第２００８／１５１
１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６０３２号パンフレット、国際公開第２
０１１／１５０４１０号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１１号パンフレッ
ト、及びＰＣＴ／ＵＳ１２／２３６９６号明細書に記載されるとおり、ショ糖を代謝させ
るため組換えインベルターゼ遺伝子が導入され得る。ここで言及する全ての遺伝子と同じ
く、インベルターゼはコドン最適化され、細胞の染色体に組み込まれてもよい。培養され
た組換え微細藻類は、ハードストック脂肪の融点未満の温度でハードストック脂肪を産生
し得ることが分かっている。例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓは、
１５〜３０℃の範囲の温度で５０％超のステアリン酸を有するトリグリセリド油を従属栄
養的に産生するように変化させることができ、ここでこの油は、３０℃に保たれると凝固
する。
ある実施形態では、細胞脂肪は、全体的な構造［飽和脂肪酸（ｓｎ−１）−不飽和脂肪
酸（ｓｎ−２）−飽和脂肪酸（ｓｎ−３）］の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０
、８０、又は９０％の脂肪を有する。これは以下にＳａｔ−Ｕｎｓａｔ−Ｓａｔ脂肪とし
て示される。特定の実施形態において、この構造中の飽和脂肪酸は、好ましくはステアリ
ン酸又はパルミチン酸であり、不飽和脂肪酸は好ましくはオレイン酸である。結果として
、脂肪は主にβ又はβ’多形結晶、又はそれらの混合物を形成し、対応する物理的特性を
、食品又はパーソナルケア製品での使用に望ましいものを含めて有し得る。例えば、脂肪
は、食品用には口腔体温で溶解し、又はクリーム、ローション又は他のパーソナルケア製
品用には皮膚温度で（例えば、３０〜４０、又は３２〜３５℃の融解温度）溶解し得る。
場合により、脂肪は、２Ｌ又は３Ｌラメラ構造を（例えば、Ｘ線回折解析によって決定す
るとき）有し得る。場合により、脂肪はテンパリングなしにこの多形形態を形成し得る。
特定の関連する実施形態において、細胞脂肪トリグリセリドは高濃度のＳＯＳを有する
（すなわち、グリセロール骨格の末端ｓｎ−１位及びｓｎ−３位にステアリン酸を含み、
ｓｎ−２位にオレイン酸を含むトリグリセリド）。例えば、脂肪は、少なくとも５０、６
０、７０、８０又は９０％のＳＯＳを含むトリグリセリドを有し得る。ある実施形態では
、脂肪は、少なくとも８０％のＳＯＳのトリグリセリドを有する。場合により、ｓｎ−２
結合脂肪酸の少なくとも５０、６０、７０、８０又は９０％が不飽和脂肪酸である。特定
の実施形態では、ｓｎ−２結合脂肪酸の少なくとも９５％が不飽和脂肪酸である。加えて
、ＳＳＳ（トリステアリン酸）レベルは２０、１０又は５％未満であってもよく、及び／
又はＣ２０：０脂肪酸（アラキジン酸）レベルは６％未満であってもよく、場合により１
％超（例えば、１〜５％）であってもよい。例えば、特定の実施形態において、組換え細
胞によって産生される細胞脂肪は、少なくとも７０％のＳＯＳトリグリセリドを有し、少
なくとも８０％がｓｎ−２不飽和脂肪酸アシル部分である。別の特定の実施形態において
、組換え細胞によって産生される細胞脂肪は、少なくとも８０％のＳＯＳトリグリセリド
を含み、且つ少なくとも９５％がｓｎ−２不飽和脂肪酸アシル部分であるＴＡＧを有する
。さらに別の特定の実施形態において、組換え細胞によって産生される細胞脂肪は、少な
くとも８０％のＳＯＳを含み、少なくとも９５％がｓｎ−２不飽和脂肪酸アシル部分であ
り、且つ１〜６％がＣ２０脂肪酸であるＴＡＧを有する。
さらに別の特定の実施形態において、細胞脂肪の脂肪酸プロフィールにおけるステアリ
ン酸塩とパルミチン酸塩との合計割合は、オレイン酸塩の割合の２倍±１０、２０、３０
又は４０％である［例えば、（％Ｐ＋％Ｓ）／％Ｏ＝２．０±２０％］。場合により、こ
の脂肪のｓｎ−２プロフィールは、少なくとも４０％、及び好ましくは少なくとも５０、
６０、７０、又は８０％オレイン酸である（ｓｎ−２位で）。また場合により、この脂肪
は少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％ＳＯＳであってよい。場合によ
り、脂肪は１〜６％のＣ２０脂肪酸を含む。
これらの実施形態のいずれにおいても、高ＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ脂肪は、β’多形結
晶を形成する傾向を有し得る。ココアバターのようなこれまでに利用可能な植物脂肪とは
異なり、この細胞によって産生されるＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ脂肪はテンパリングなしに
β’多形結晶を形成し得る。ある実施形態では、融解温度を上回るまで加熱して、融解温
度未満に３、２、１、又は０．５時間冷却すると、多形が形成される。関連する実施形態
において、６０℃を上回るまで加熱して、１０℃に３、２、１、又は０．５時間冷却する
と、多形が形成される。
様々な実施形態において、脂肪は、融解温度を上回って加熱して融解温度未満に冷却し
たときβ型、β’型、又は両方の多形を形成し、場合により融解温度を上回るまで加熱し
て、次に１０℃で冷却したとき、５、４、３、２、１、０．５時間以内又はそれ未満で少
なくとも５０％の多形平衡まで進む。脂肪はココアバターより速い速度でβ’結晶を形成
し得る。
場合により、任意のこれらの脂肪が、２モル％未満のジアシルグリセロール、又は２モ
ル％未満のモノアシルグリセロールとジアシルグリセロールとの合計を有し得る。
ある実施形態では、脂肪は３０〜６０℃、３０〜４０℃、３２〜３７℃、４０〜６０℃
又は４５〜５５℃の融解温度を有し得る。別の実施形態において、脂肪は２０℃で４０〜
５０％、１５〜２５％、又は１５％未満の固形脂肪含有量（ＳＦＣ）を有し、及び／又は
３５℃で１５％未満のＳＦＣを有し得る。
脂肪を作るために使用される細胞は、ＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ脂肪の形成に有利となる
ように、細胞トリグリセリドにおける脂肪酸の飽和対不飽和比を改変する働きをする組換
え核酸を含み得る。例えば、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）遺伝子のノ
ックアウト又はノックダウンを用いて、オレイン酸よりステアリン酸の形成に有利となる
ようにすることができ、又は外来性中鎖選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の
発現により、中鎖飽和レベルを増加させることができる。或いは、ＳＡＤ酵素をコードす
る遺伝子を過剰発現させて不飽和物を増加させることができる。
特定の実施形態において、細胞は、細胞のステアリン酸レベルを上昇させる働きをする
組換え核酸を有する。結果として、ＳＯＳの濃度が増加し得る。実施例９は、Ｂｒａｓｓ
ｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｃ１８：０選択的チオエステラーゼが過剰発現する結果として、組
換え微生物の位置特異的プロフィールがＳａｔＵｎｓａｔＳａｔトリグリセリドＰＯＰ、
ＰＯＳ、及びＳＯＳについて高濃度化されることを実証する。細胞のステアリン酸を増加
させるさらなる方法は、オレイン酸レベルを低下させることである。高オレイン酸レベル
を（例えば、ステアリン酸レベルの２分の１を超えて）有する細胞については、オレイン
酸レベルを低下させる働きをする組換え核酸又は古典的な遺伝子突然変異もまた用いるこ
とができる。例えば、細胞は、オレイン酸を遊離させるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ
をコードする１つ以上のＦＡＴＡ対立遺伝子、及び／又はステアロイルＡＣＰデサチュラ
ーゼ（ＳＡＤ）をコードする１つ以上の対立遺伝子にノックアウト、ノックダウン、又は
突然変異を有し得る。実施例３５は、ヘアピンＲＮＡを使用したＳＡＤ２遺伝子産物発現
の阻害によるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）にお
ける３７％ステアリン酸の脂肪酸プロフィールの生成について記載し、一方で野生型株は
４％未満のステアリン酸を生成したことから、９倍を超える改善であった。さらに、実施
例３５の株はＳＡＤ活性を低下させるように操作されるが、ＳＯＳ、ＰＯＰ、及びＰＯＳ
を作る十分なオレイン酸を生成するのに十分なＳＡＤ活性は残る。実施例４７のＴＡＧプ
ロフィールを参照のこと。特定の例では、アンチセンス、ＲＮＡｉ、又はｓｉＲＮＡ、ヘ
アピンＲＮＡ又はそれらの組み合わせなどの阻害技法を用いて、複数のＳＡＤコード対立
遺伝子のうちの１つがノックアウトされてもよく、及び／又は１つ以上の対立遺伝子が下
方調節される。様々な実施形態において、細胞は、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０
、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、又は９０〜約１００％ステアリン
酸を有するＴＡＧを産生し得る。他の実施形態では、細胞は、２０〜３０、３０〜４０、
４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、又は９０〜約１００％
ＳＯＳであるＴＡＧを産生し得る。場合により、又は遺伝子改変に加えて、ステアロイル
ＡＣＰデサチュラーゼを化学的に阻害することができる；これは例えば油産生中に細胞培
養物にステルクリン酸を添加することによる。
意外にも、単一のＦＡＴＡ対立遺伝子のノックアウトが、微細藻類で産生されるＣ１８
脂肪酸の存在を増加させることが見出された。１つの対立遺伝子をノックアウトするか、
又は他の方法でＦＡＴＡ遺伝子産物の活性を（例えばヘアピンＲＮＡを使用して）抑制す
る一方で、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼの活性もまた（本明細書に開示される技
法を用いて）抑制することにより、細胞におけるステアリン酸レベルを増加させることが
できる。
ステアリン酸レベルを増加させる別の遺伝子改変としては、ステアリン酸産生速度を増
加させるため、細胞におけるケトアシルＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳ）活性を増加させるこ
とが挙げられる。微細藻類では、ＫＡＳＩＩ活性の増加がＣ１８合成の増加に有効であり
、特にＳＡＤ活性の低下に有効な組換えＤＮＡと組み合わせた細胞トリグリセリドにおけ
るステアリン酸レベルの上昇に有効であることが分かっている。ＫＡＳＩＩを増加させる
働きをする組換え核酸（例えば、外来性ＫａｓＩＩ遺伝子）をまた、ＦａｔＡ遺伝子のノ
ックアウト又はノックダウン、又はＦａｔＡ遺伝子及びＳＡＤ遺伝子の両方のノックアウ
ト又はノックダウンと組み合わせてもよい。任意選択で、ＫＡＳＩＩ遺伝子は、ＫＡＳＩ
Ｉ Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（配列番号１６１に提供される成熟タ
ンパク質）と少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％
のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードするか、又は本明細書に（例えば、実施例
６０に）開示される若しくは微細藻類ＫＡＳＩＩを含めた当該技術分野において公知の任
意の植物ＫＡＳＩＩ遺伝子である。
場合により、細胞は、単独の改変として、或いはステアリン酸を増加させる他の１つ以
上の遺伝子改変との組み合わせで、外因性ステアリン酸遊離アシル−ＡＣＰチオエステラ
ーゼを含み得る。例えば、細胞が、Ｃ１８：０−ＡＣＰの切断に選択性を有するアシル−
ＡＣＰチオエステラーゼを過剰発現するように操作されてもよい。実施例９は、微細藻類
、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の脂肪酸プロフ
ィールにおいてステアリン酸を約３．７％から約３０．４％（８倍超）に増加させる外因
性Ｃ１８：０選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現について記載する。実施例４
１は、ＰｒｏｔｏｔｈｅｃａにおいてＣ１８：０レベルを上昇させる働きをするＣ１８：
０選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのさらなる例を提供する。任意選択で、ステア
リン酸選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子は、実施例９又は実施例４１の遺伝
子産物（配列番号２８、６５、６７、６９、７１、７３、又は７５（存在する場合にＦＬ
ＡＧタグを除く））と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９
６、９７、９８又は９％のアミノ酸同一性を有する酵素をコードする。アシル−ＡＣＰチ
オエステラーゼの導入は、１つ以上の内在性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ対立遺伝子
のノックアウト又はノックダウンと組み合わせることができる。チオエステラーゼの導入
はまた、エロンガーゼ（ＫＣＳ）又はβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの過剰発現と組
み合わせることもできる。加えて、１つ以上の外来遺伝子（例えば、ＳＡＤ又はＫＡＳＩ
Ｉをコードするもの）を、環境条件によって（例えば、調節可能なプロモーターと作動可
能に連結した状態に置くことにより）調節してもよい。特定の例では、ｐＨ及び／又は窒
素濃度を用いてａｍｔ０３プロモーターを調節する。次に環境条件を調整することにより
、細胞トリグリセリド中に現れるステアリン酸の所望の量を（例えばオレイン酸濃度の２
倍となるよう）産生するように細胞が調整され得る。これらの操作の結果として、細胞は
少なくとも５、１０、１５、又は２０倍のステアリン酸の増加を呈し得る。
単独での、又はステアリン酸を増加させる他の改変と組み合わせたさらなる改変として
、細胞は、エロンガーゼ又はβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを発現する働きをする組
換え核酸を含むことができる。例えば、Ｃ１８：０選択的アシル−ＡＣＰチオエステラー
ゼの過剰発現を、中鎖延長エロンガーゼ又はＫＣＳの過剰発現と組み合わせることにより
、組換え細胞におけるステアリン酸産生を増加させ得る。外来遺伝子（例えば、チオエス
テラーゼ、エロンガーゼ、又はＫＣＳをコードするもの）の１つ以上を、環境条件によっ
て（例えば、調節可能なプロモーターと作動可能に連結した状態に置くことにより）調節
してもよい。具体的な例では、ｐＨ及び／又は窒素レベルを用いることにより、ａｍｔ０
３プロモーター、又はａｍｔ０３よりｐＨ感受性が低いものを含めた実施例６３の任意の
プロモーターが調節される。次に環境条件を調整することにより、細胞トリグリセリド中
に現れるステアリン酸の所望の量を（例えばオレイン酸濃度の２倍となるよう）産生する
ように細胞が調整され得る。これらの操作の結果として、細胞は少なくとも５、１０、１
５、又は２０倍のステアリン酸の増加を呈し得る。ステアリン酸に加え、アラキジン酸、
ベヘン酸、リグノセリン酸、及びセロチン酸もまた産生され得る。
特定の実施形態では、ステアリン酸レベルを増加させる細胞の遺伝子操作により、細胞
により産生される油中のステアリン酸対オレイン酸の比は、２：１±３０％（すなわち１
．４：１〜２．６：１の範囲）、２：１±２０％又は２：１±１０％となる。
或いは、細胞をＳａｔＵｎｓａｔＳａｔの形成に有利となるように操作することができ
、ここでＳａｔはパルミチン酸又はパルミチン酸とステアリン酸との混合物である。この
場合、外因性パルミチン酸を遊離させるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの導入が、パル
ミチン酸形成を促進し得る。この実施形態において、細胞は、少なくとも３０、４０、５
０、６０、７０、又は８０％ＰＯＰであるトリグリセリド、又はＰＯＰ、ＳＯＳ、及びＰ
ＯＳの合計が細胞トリグリセリドの少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、又
は９０％であるトリグリセリドを産生し得る。他の関連する実施形態において、ＰＯＳレ
ベルは、細胞によって産生されるトリグリセリドの少なくとも３０、４０、５０、６０、
７０、８０、又は９０％である。
特定の実施形態において、油の融解温度はココアバターの融解温度（約３０〜３２℃）
と同程度である。ＰＯＰ、ＰＯＳ及びＳＯＳレベルは、それぞれ約１６、３８、及び２３
％でココアバターに近くなり得る。例えば、ＰＯＰは１６％±２０％であってもよく、Ｐ
ＯＳは３８％±２０％であってもよく、ＳＯＳは２３％±２０％であってもよい。或いは
、ＰＯＰは１６％±１５％であってもよく、ＰＯＳは３８％±１５％であってもよく、Ｓ
ＯＳは２３％±１５％であってもよい。或いは、ＰＯＰは１６％±１０％であってもよく
、ＰＯＳは３８％±１０％であってもよく、ＳＯＳは２３％±１０％であってもよい。
ステアリン酸を増加させる組換え核酸の結果として、脂肪酸プロフィールのある割合が
アラキジン酸となってもよい。例えば、脂肪酸プロフィールは、０．０１％〜５％、０．
１〜４％、又は１〜３％のアラキジン酸となり得る。さらに、位置特異的プロフィールは
、０．０１％〜４％、０．０５％〜３％、又は０．０７％〜２％のＡＯＳを有してもよく
、又は０．０１％〜４％、０．０５％〜３％、又は０．０７％〜２％のＡＯＡを有しても
よい。ＡＯＳ及びＡＯＡは、数ある潜在的利益の中でも特に、本発明の脂肪を含む糖菓に
おけるブルーミング及び脂肪マイグレーションを低減し得ると考えられる。
ステアリン酸及び／又はパルミチン酸を増加させ、且つＳａｔＵｎｓａｔＳａｔレベル
を改変するよう設計される操作に加え、多価不飽和物レベルが、上記に記載したとおりデ
ルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ活性（例えば、Ｆａｄ遺伝子によりコードされるとおりの
）の低下、及び場合により成長培地の補給又はＦＡＤ発現の調節によることを含め抑制さ
れ得る。微細藻類では（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株での研究から明らかなように）、多価不
飽和物がｓｎ−２位に選択的に付加されることが分かっている。従って、ｓｎ−２位にオ
レイン酸を含むトリグリセリドの割合を上昇させるためには、細胞によるリノール酸の産
生が抑制され得る。高度に酸化安定性の油に関連した、脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）
遺伝子又は遺伝子産物を阻害又は除去するための本明細書に記載される技術は、ｓｎ−２
位の多価不飽和物を減少させることによるＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ油の産生に向けて良い
効果を伴い適用することができる。さらなる利益として、かかる油は酸化安定性の向上を
有し得る。本明細書に同様に記載されるとおり、脂肪は二段階で生成されてもよく、第１
の段階で多価不飽和物が供給されるか又は細胞によって産生され、脂肪産生段階で多価不
飽和物を欠乏させる。生成される脂肪は、１５，１０，７、５、４、３、２、１、又は０
．５％以下の多価不飽和物を有する脂肪酸プロフィールを有し得る。特定の実施形態では
、細胞によって産生される油／脂肪は、５０％超のＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ、場合により
５０％超のＳＯＳを有するが、多価不飽和物は３％未満である。場合により、多価不飽和
物は、脂肪酸プロフィール中のリノール酸とリノレン酸との合計面積％によって概算され
得る。
ある実施形態では、細胞脂肪は、６５％〜９５％ＳＯＳ、場合により０．００１〜５％
ＳＳＳを有するシアステアリン代用物である。関連する実施形態において、脂肪は、６５
％〜９５％ＳＯＳ、０．００１〜５％ＳＳＳ、場合により０．１〜８％アラキジン酸を含
有するトリグリセリドを有する。別の関連する実施形態において、脂肪は６５％〜９５％
ＳＯＳを有し、ＳＳＳとＳＳＯとの合計は１０％未満又は５％未満である。
細胞の位置特異的選択性は、以下に記載する分析法（実施例１〜２、８）を用いて知る
ことができる。上記に記載したとおりの飽和物と不飽和物とのバランスにも関わらず、細
胞酵素がｓｎ−２位に不飽和脂肪酸を置かないことも可能である。その場合、遺伝子を操
作して、（ｉ）内因性ｓｎ−２特異的アシルトランスフェラーゼ（例えばＬＰＡＡＴ）の
活性を低下させること、及び／又は（ｉｉ）所望の特異性を有する外因性ＬＰＡＡＴを導
入すること（すなわち、ｓｎ−２におけるオレイン酸の導入）により、所望の位置特異性
を付与することができる。外因性ＬＰＡＡＴが導入される場合、好ましくはＬＰＡＡＴを
コードする遺伝子が宿主染色体に組み込まれ、小胞体に標的化される。ある場合には、宿
主細胞は特異的及び非特異的の両方のＬＰＡＡＴ対立遺伝子を有してもよく、これらの対
立遺伝子の一方の活性を（例えば遺伝子ノックアウトによって）抑制すると、所望の特異
性が付与されることになる。例えば、配列番号７８及び配列番号７９のＬＰＡＡＴ又はこ
れらの配列又はその機能断片のいずれかと少なくとも９０、９５、９８、又は９９％のア
ミノ酸同一性を含むＬＰＡＡＴをコードする遺伝子を使用してｓｎ−２位にオレイン酸を
付加することにより、ＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ ＴＡＧのレベルを増進させることができ
る。遺伝子は、配列番号８０〜８５又は遺伝子コードの縮重の理由で等価な配列のいずれ
かと少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％のヌクレオチド
同一性を有し得る。或いは、この遺伝子によってコードされるタンパク質は、配列番号８
０〜８５のいずれかの遺伝子産物と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９
８、又は９９％のヌクレオチド同一性を有し得る。これらの遺伝子は、これらの配列又は
その機能断片（これは、公知の技術を用いて配列から核酸を体系的に欠失させることによ
り見出され得る）を含む組換え核酸構築物、ベクター、染色体又は宿主細胞として現れ得
る。遺伝子の発現の結果として、ＳＯＳ、ＰＯＳ、ＰＯＰなどのｓａｔ−ｕｎｓａｔ−ｓ
ａｔ ＴＡＧ、又はｓｎ−２位にＣ８〜Ｃ１６脂肪酸を含むトリグリセリドの量が宿主細
胞において増加し得る。
いくつかある発見の中でも特に、上記の考察及び以下の実施例は、微生物又は植物にお
いて一般に高Ｓａｔ−Ｕｎｓａｔ−Ｓａｔ油及び詳細にはＳＯＳ油を得るための特定の経
路を強調する。従って、遺伝子工学技術を任意選択で古典的な突然変異誘発及び育種と組
み合わせて用いることにより、出発株と比べて少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、
５倍、又はそれ以上のＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ又はＳＯＳ産生量の増加を有する微細藻又
は高等植物を作製し得る可能性がある。別の態様では、野生型が２０％、３０％、４０％
又は５０％未満のＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ又はＳＯＳを産生する種のＳａｔＵｎｓａｔＳ
ａｔ又はＳＯＳ濃度を増加させることで、ＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ又はＳＯＳをそれぞれ
少なくとも３０％、４０％、５０％又は６０％まで増加させることができる。出発又は野
生型生物と比べた主な変化は、ステアリン酸量の増加（例えば、ステアリン酸から形成さ
れるオレイン酸の量が例えばＳＡＤ活性の低下によって低下することによる、及び／又は
ステアリン酸に変換されるパルミチン酸の量がＦＡＴＡの活性の低下及び／又はＫＡＳＩ
Ｉの活性の増加によって増加することによる）及びＦＡＤ２／ＦＡＤｃ活性の低下によっ
てリノール酸の量が減少することによるものである。
任意選択で、出発生物は、ｓｎ−２位でオレイン酸又は不飽和脂肪酸が優勢なＴＡＧ種
を合成する傾向があるトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）生合成機構を有し得る。多くの
油糧種子作物がこの特徴を有する。リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（Ｌ
ＰＡＡＴ）は、最終的にｓｎ−２位に挿入されることになる脂肪酸種の決定において重要
な役割を果たすことが実証されている。実際には、高等植物種子における異種遺伝子発現
によるＬＰＡＡＴの操作によって、ｓｎ−２位を占有する脂肪酸種を変えることができる
。
農業上重要な油糧種子及び藻類において顕著なレベルのいわゆる構造化脂肪（典型的に
は種ＳＯＳ−ステアリン酸−オレイン酸−ステアリン酸、ＰＯＳ−パルミチン酸−オレイ
ン酸−ステアリン酸、又はＰＯＰ−パルミチン酸−オレイン酸−パルミチン酸で構成され
る）を有する油を生成する一つの手法は、内因性並びに異種性ＬＰＡＡＴ発現の操作を介
するものである。高レベルの構造化脂肪を含有する種子由来のＬＰＡＡＴの発現は、例え
ば、通常はかかる脂肪を限られた量しか含有しない油糧種子又は油産生藻類の構造化脂肪
レベルを増加させる一つの戦略であり得る。
しかしながら、代替的又は補足的な戦略は、農業上重要な（ａｇｒｉｃｕｌｔｕａｒｌ
ｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ）油糧種子（例えば、ベニバナ−Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｓｐ．
、ヒマワリ−Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ．、キャノーラ−Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．、
ピーナッツ−Ａｒａｃｈｉｓ ｓｐ．、ダイズ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｐ．、トウモロコシ
−Ｚｅａ ｓｐ．、オリーブ−Ｏｌｅａ ｓｐ．、アマ−Ｌｉｎｕｍ ｓｐ．、パーム−
Ｅｌａｅｉｓ ｓｐ．及び綿−Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｐ．、以下の表５ａの代表的なプ
ロフィールを参照のこと）におけるＬＰＡＡＴの固有の傾向を利用することであり、遺伝
子工学単独又は遺伝子工学と古典的株改良（即ち突然変異誘発）との組み合わせのいずれ
かによって構造化脂肪レベルを増加させるため存在する脂肪酸の種を選択的に操作するこ
とである。ＳＯＳの場合、これらの操作には、独立して実施することのできる一連の個別
的な工程が含まれる。それらとしては、以下が挙げられる。
ステアリン酸レベルを増加させること。これは、本発明者らがここで微細藻類において
実証しており、及び他の研究者らが高等植物で示しているとおり、ステアリン酸特異的Ｆ
ＡＴＡ活性の発現によるか又は内因性ＳＡＤ活性の下方調節によって；例えば、直接的な
遺伝子ノックアウト、ＲＮＡサイレンシング、又は古典的な株改良を含めた突然変異によ
って達成することができる。しかしながら、ステアリン酸レベルのみを上記の手法によっ
て単純に上昇させることは、最適とはいえない。例えば、パーム油の場合、既に高レベル
のパルミチン酸がステアリン酸レベルの上昇と相まって既存のＬＰＡＡＴ活性を打ち負か
し、トリ飽和脂肪酸（ＳＳＳ、ＰＰＰ、ＳＳＰ、ＰＰＳなど）への多量のステアリン酸及
びパルミチン酸の取り込みをもたらす可能性がある。従って、さらにパルミチン酸レベル
を制御する工程も行う必要がある。
高ＳＯＳ含有脂肪を作り出すには、パルミチン酸レベルを最小限に抑えなければならず
、なぜならパルミチン酸は、高機能ＬＰＡＡＴを伴ったとしても、ステアリン酸が占め得
たｓｎ−１位又はｓｎ−３位を占有し得るとともに、上記に概説したとおり、飽和物が多
過ぎて著しいレベルのトリ飽和ＴＡＧ種が生じることになるためである。パルミチン酸レ
ベルは、例えば、突然変異／古典的な株改良による内因性ＦＡＴＡ活性の下方調節、内因
性ＦＡＴＡ活性が高いパルミチン酸活性を有する場合には遺伝子ノックアウト又はＲＮＡ
ｉ媒介性戦略によって低下させることができる。それに代えて、又は上記と併せて、パル
ミチン酸レベルは、内因性ＫＡＳＩＩ活性の過剰発現又は同じ試みとして現れる古典的な
株改良の試みによって、パルミチン酸からステアリン酸への伸長が促進されるようにして
低下させることができる。しかしながら、上記の方法でパルミチン酸レベルを単純に低下
させることは十分でない場合もある。再びパーム油を例にとる。前出の方法によるパルミ
チン酸の減少及びステアリン酸の上昇では、なおも相当なレベルのリノール酸が残り得る
。ほとんどの高等植物種における内因性ＬＰＡＡＴ活性は、ｓｎ−２位にオレイン酸を優
先的に挿入し得るものの、次の最優先種としてリノール酸を挿入し得る。オレイン酸レベ
ルの低下に伴いリノール酸がｓｎ−２位を占有するようになり、その頻度が高まる。ｓｎ
−２位にリノール酸を有するＴＡＧ種は、それらのＴＡＧが構造化脂肪で所望されるもの
と比べてはるかに高い融解温度を呈する傾向を有するため、構造化特性が不十分である。
従って、次にはリノール脂肪酸レベルの低下によってステアリン酸の増加及びパルミチン
酸の減少がバランスしなければならない。
次には、高ＳＯＳ含有脂肪を作り出すためには、リノール脂肪酸レベルを最小限に抑え
なければならず、なぜなら、リノール酸は、高機能ＬＰＡＡＴを伴ったとしても、オレイ
ン酸を排除するまでｓｎ−２位を占有し、所望の固形脂肪（室温で）とは対照的な液体油
が作り出されるためである。リノール酸レベルは、本発明者らが微細藻類で実証しており
、及び他の研究者らが植物油糧種子で示しているとおり、内因性ＦＡＤ２デサチュラーゼ
の下方調節によって；例えば、突然変異／古典的な株改良、ＦＡＤ２ノックアウト又は内
因性ＦＡＤ２活性のＲＮＡｉ媒介性下方調節によって低下させることができる。これに伴
い、脂肪酸プロフィール中のリノール酸レベルは少なくとも１０、２０、３０、４０、５
０、１００、２００、又は３００％低下し得る。例えば、本明細書に開示されるものと少
なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性
を有するＲＮＡｉ構築物を使用してＦＡＤ２を下方調節することができる。
かかるｓｎ−２選択性を有する出発株を選択してもよいが、また、ｓｎ−２位における
オレイン酸をさらに押し上げ、且つＴＡＧプロフィール中のＳａｔ−Ｕｎｓａｔ−Ｓａｔ
をさらに押し上げるため、より高いオレイン酸選択性を有する外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子を
導入することもできる。任意選択で、１つ以上の内因性ＬＰＡＡＴ対立遺伝子を、外来性
の、特異性がより高いＬＰＡＡＴに置き換えることができる。
ＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ／ＳＯＳ産生生物から得られる細胞油は、ステロールプロフィ
ールが従来の供給源と区別可能なものとして宿主生物の指標となる点で、従来のＳＯＳ／
ＰＯＰ／ＰＯＳ供給源と区別することができる。従来のＳＯＳ／ＰＯＰ／ＰＯＳ供給源に
は、ココア、シア、マンゴー、サラノキ、イリッペ、コクム、及びアランブラキアが含ま
れる。微細藻類ステロールの考察については本開示の第ＸＩＩ節を参照のこと。
従って、本発明の実施形態には、細胞によって産生される油（即ち油又は脂肪）中のＳ
ＯＳの量を増加させる方法がある。この方法は、細胞を提供する工程と、古典的技術及び
／又は遺伝子工学技術（例えば、突然変異、選択、株改良、外来遺伝子の導入及び／又は
調節因子エレメント、又はＲＮＡｉなどのＲＮＡレベル調節）を用いて（ｉ）油中のステ
アリン酸を増加させ、（ｉｉ）油中のリノール酸を減少させ、及び任意選択で（ｉｉｉ）
ｓｎ−２位におけるオレイン酸の付加の立体特異性を増加させる工程とを含む。ステアリ
ン酸を増加させる工程は、ＳＡＤによって不飽和化を減少させる工程（例えば、ノックア
ウト、ノックダウン又は調節エレメントの使用）と、パルミチン酸からステアリン酸への
変換を増加させる工程（内在性又は外来性ＫＡＳＩＩの過剰発現及び／又はＦＡＴＡのノ
ックアウト又はノックダウンを含む）とを含む。任意選択で、内因性ＦＡＴＡと比べてス
テアリン酸特異性がより高い外因性ＦＡＴＡを細胞で発現させることにより、ステアリン
酸レベルを増加させる。ここで、ＦＡＴＡ遺伝子のステアリン酸特異性は、遺伝子産物に
よるパルミチン酸と比べたステアリン酸の切断速度の尺度である。ステアリン酸特異的Ｆ
ＡＴＡ遺伝子の挿入は、特異性の低い内在性ＦＡＴＡ遺伝子のノックダウン又はノックア
ウトと組み合わせることができる。このようにして、ステアリン酸の対パルミチン酸比を
１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％以上増加させることができる。リノ
ール酸を減少させる工程は、ノックアウト及び／又はノックダウンを含めたＦＡＤｃ／Ｆ
ＡＤ２活性の低減によることができる。ｓｎ−２位のオレイン酸を増加させる工程は、本
明細書に開示されるＬＰＡＡＴと少なくとも７５、８０、８５、９０、８５、９６、９７
、９８、又は９９％のアミノ酸同一性を有するＬＰＡＡＴなどの外因性オレイン酸選択的
ＬＰＡＡＴを発現する工程を含むことができる。
具体的な実施形態において、細胞（例えば、油産生微細藻類細胞又は他のプラスチド細
胞）は、ＳＯＳリッチの（例えば、少なくとも５０％ＳＯＳ及びある場合には６０％ＳＯ
Ｓの）油を産生する。細胞は少なくとも４つの遺伝子が改変される：（ｉ）β−ケトアシ
ル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＫＡＳＩＩ）が過剰発現し、（ｉｉ）内因性ＦＡＴＡアシル
−ＡＣＰチオエステラーゼの活性が低下し、（ｉｉｉ）ステアリン酸特異的ＦＡＴＡアシ
ル−ＡＣＰチオエステラーゼが過剰発現し、（ｉｉｉ）内因性ＳＡＤ活性が低下し、及び
（ｉｖ）内因性ＦＡＤ活性が低下する。実施例６５は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉ
ｆｏｒｍｉｓ微細藻で、内因性ＦＡＴＡ及びＳＡＤ２のコード領域を相同組換えで破壊し
、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＫＡＳＩＩ）遺伝子を過剰発現させ、及びＦ
ＡＤ２ ＲＮＡｉを活性化させて多価不飽和物を減少させることによってこの実施形態を
実証する。
別の具体的な実施形態において、細胞（例えば、油産生微細藻類細胞又は他のプラスチ
ド細胞）は、ＳＯＳリッチの（例えば、少なくとも５０％ＳＯＳ及びある場合には６０％
ＳＯＳの）油を産生する。細胞は、少なくとも４つの遺伝子が改変される：（ｉ）β−ケ
トアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＫＡＳＩＩ）が過剰発現し、（ｉｉ）内因性ＦＡＴＡ
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの活性が低下し、（ｉｉｉ）ステアリン酸特異的ＦＡＴ
Ａアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが過剰発現し、（ｉｖ）内因性ＳＡＤ活性が低下し、
（ｖ）内因性ＦＡＤ活性が低下し、及び（ｖｉ）外因性オレイン酸選択的ＬＰＡＡＴが発
現する。実施例６５及び６６を参照のこと。任意選択で、これらの遺伝子又は調節エレメ
ントは、本明細書に開示される遺伝子又は遺伝子産物又は調節エレメントと少なくとも７
５、８０、８５、９０、８５、９６、９７、９８、又は９９％の核酸又はアミノ酸同一性
を有する。任意選択で、これらの遺伝子のうちの１つ以上が、本明細書に開示されるもの
の一つと少なくとも７５、８０、８５、９０、８５、９６、９７、９８、又は９９％の核
酸同一性を有するものなどの、ｐＨ感受性又は窒素感受性（ｐＨ感受性又はｐＨ非感受性
）プロモーターの制御下にある。任意選択で、細胞油は分画される（実施例６４を参照）
。
ある実施形態では、本発明に係る細胞によって産生される脂肪を使用して、糖菓、キャ
ンディーのコーティング、又は他の食品が製造される。結果として、チョコレート又はキ
ャンディーバーのような食品は、ココアバターを使用して製造される類似製品の「スナッ
プ性」（例えば割ったときの）を有し得る。使用される脂肪はβ多形形態であるか、又は
β多形形態となる傾向を有し得る。ある実施形態では、方法は、糖菓にかかる脂肪を加え
ることを含む。場合により、脂肪は、６５％超のＳＯＳ、４５％未満の不飽和脂肪酸、５
％未満の多価不飽和脂肪酸、１％未満のラウリン酸、及び２％未満のトランス脂肪酸を有
するＥＥＣ規則に従うココアバター同等物であってもよい。この脂肪はまた、ココアバタ
ー増量剤、向上剤、代替剤、又は抗ブルーミング剤として、又はシアバター代用物として
、食品及びパーソナルケア製品中のものを含め使用することができる。本明細書に開示さ
れる細胞及び方法を使用して生成される高ＳＯＳ脂肪は、シアバター又はシア画分が要求
される任意の用途又は配合で使用することができる。しかしながら、シアバターと異なり
、本発明の実施形態により生成される脂肪は不鹸化物が低量であり；例えば、７、５、３
、又は２％未満の不鹸化物であり得る。加えて、シアバターは、ジアシルグリセリドの存
在に起因して劣化が速い傾向があるが、本発明の実施形態により生成される脂肪はジアシ
ルグリセリドが低量であり；例えば、５、４、３、２、１、又は０．５％未満のジアシル
グリセリドであり得る。
本発明のある実施形態には、ショートニング、詳細にはロールイン用ショートニングと
して好適な細胞脂肪がある。従って、ショートニングを使用して、ペストリー又は他の多
層状食品を作製してもよい。ショートニングは、本明細書に開示される操作された生物及
び特に従属栄養微細藻類の生成方法を用いて生成することができる。ある実施形態では、
ショートニングは、４０〜６０℃、好ましくは４５〜５５℃の融解温度を有し、１５〜２
０％中鎖脂肪酸（Ｃ８〜Ｃ１４）、４５〜５０％長鎖飽和脂肪酸（Ｃ１６以上）、及び３
０〜３５％不飽和脂肪酸（好ましくはリノール酸よりオレイン酸を多く含む）のトリグリ
セリドプロフィールを有し得る。ショートニングは、場合によりβ多形形態を経ることな
しに、β’多形結晶を形成し得る。ショートニングはチキソトロピックであってもよい。
ショートニングは３５℃で１５％未満の固形脂肪含有量を有し得る。特定の実施形態には
、組換え微細藻によって産生されるロールイン用ショートニングとして好適な細胞油があ
り、ここで油は４００〜７００又は５００〜６００Ｐａの降伏応力及び１×１０５Ｐａ又
は１×１０６Ｐａより大きい貯蔵弾性率を有する（実施例４６を参照のこと）。
構造化された固液脂肪系は、構造化油を使用して、それらを室温で液体の油（例えば、
トリステアリン又はトリオレインが高い油）とブレンドすることにより生成され得る。こ
のブレンドされる系は、食品スプレッド、マヨネーズ、ドレッシング、ショートニングに
おける使用に（すなわち油水油型エマルションを形成することにより）好適であり得る。
本明細書に記載される実施形態に係る構造化脂肪、特にＳＯＳが高いものは、他の油／脂
肪とブレンドしてココアバター同等物、代用物、又は増量剤を作製することができる。例
えば、６５％超のＳＯＳを有する細胞脂肪をパーム中融点画分とブレンドして、ココアバ
ター同等物を作製することができる。
一般に、かかる高いＳａｔ−Ｕｎｓａｔ−Ｓａｔ脂肪又は脂肪系は、ホイップ済みクリ
ーム、マーガリン、スプレッド、サラダドレッシング、ベイクド食品（例えばパン、クッ
キー、クラッカー、マフィン、及びペストリー）、チーズ、クリームチーズ、マヨネーズ
等を含めた、様々な他の製品で使用することができる。
特定の実施形態では、上記に記載するＳａｔ−Ｕｎｓａｔ−Ｓａｔ脂肪がマーガリン、
スプレッドなどの製造に使用される。例えば、米国特許第７１１８７７３号明細書、第６
１７１６３６号明細書、第４４４７４６２号明細書、第５６９０９８５号明細書、第５８
８８５７５号明細書、第５９７２４１２号明細書、第６１７１６３６号明細書、又は国際
公開第９１０８６７７Ａ１号パンフレットに記載されるレシピ又は方法のいずれかを使用
して、この脂肪からマーガリンを作製することができる。
ある実施形態では、脂肪は、場合により別の脂肪とブレンドされた、細胞の（例えば微
細藻類細胞由来の）脂肪を含み、スプレッド又はマーガリン又は他の食品の製造に有用で
あり、遺伝子操作された細胞によって製造され、以下を含む脂肪酸に由来するグリセリド
を有する：
（ａ）少なくとも１０重量％のＣ１８〜Ｃ２４飽和脂肪酸、
（ｂ）ステアリン酸及び／又はアラキジン酸及び／又はベヘン酸及び／又はリグノセリン
酸を含むもの、及び
（ｃ）オレイン酸及び／又はリノール酸、一方、
（ｄ）飽和Ｃ１８酸／飽和（Ｃ２０＋Ｃ２２＋Ｃ２４）酸の比≧１、好ましくは≧５、よ
り好ましくは≧１０、
これらのグリセリドは以下を含有する：
（ｅ）総脂肪酸重量に対して計算して≦５重量％のリノレン酸
（ｆ）総脂肪酸重量に対して計算して≦５重量％のトランス脂肪酸
（ｇ）ｓｎ−２位における≦７５重量％、好ましくは≦６０重量％のオレイン酸：これら
のグリセリドは総グリセリド重量に対して計算して以下を含有する
（ｈ）≧８重量％ＨＯＨ＋ＨＨＯトリグリセリド
（ｉ）≦５重量％トリ飽和トリグリセリド、及び場合により以下の１つ以上の特性を有す
る：
（ｊ）１０℃で＞１０％の固形脂肪含有量
（ｋ）３５℃で≦１５％固形脂肪含有量、
（ｌ）１０℃で＞１５％の固形脂肪含有量及び３５℃で≦２５％の固形脂肪含有量、
（ｍ）（ＨＯＨ＋ＨＨＯ）及び（ＨＬＨ＋ＨＨＬ）トリグリセリドの比が＞１、好ましく
は＞２であり、
ここでＨはＣ１８〜Ｃ２４飽和脂肪酸を表し、Ｏはオレイン酸を表し、Ｌはリノール酸を
表す。
場合により、固体脂肪含有量（％ＳＦＣ）は、１０℃で１１〜３０、２０℃で４〜１５
、３０℃で０．５〜８、及び３５℃で０〜４である。或いは、脂肪の％ＳＦＣは、１０℃
で２０〜４５、２０℃で１４〜２５、３０℃で２〜１２、及び３５℃で０〜５である。関
連する実施形態において、脂肪の％ＳＦＣは、１０℃で３０〜６０、２０℃で２０〜５５
、３０℃で５〜３５、及び３５℃で０〜１５である。Ｃ１２〜Ｃ１６脂肪酸含有量は≦１
５重量％であってもよい。脂肪は≦５重量％の不飽和ジグリセリドを有し得る。
関連する実施形態には、細胞油又は細胞油ブレンドから作製されるスプレッド、マーガ
リン又は他の食品がある。例えば、細胞脂肪を使用して、３０〜８０ｗｔ．％の脂肪相に
分散した７０〜２０ｗｔ．％の水相を含む食用Ｗ／Ｏ（水／油）エマルションスプレッド
を作製することができ、この脂肪相は、５０〜９９ｗｔ．％の植物性トリグリセリド油Ａ
と１〜５０ｗｔ．％の構造化トリグリセリド脂肪Ｂとの混合物であり、この脂肪は、５〜
１００ｗｔ．％のハードストック脂肪Ｃと、最大９５ｗｔ．％の脂肪Ｄとからなり、ハー
ドストック脂肪Ｃトリグリセリドの少なくとも４５ｗｔ．％がＳａｔＯＳａｔトリグリセ
リドからなり、ここでＳａｔは飽和Ｃ１８〜Ｃ２４炭素鎖を含む脂肪酸残基を表し、及び
Ｏはオレイン酸残基を表すが、但し、脂肪の分画、水素化、エステル化又はエステル交換
によって得られた任意のハードストック脂肪Ｃは除外するものとする。ハードストック脂
肪は、本明細書に開示される方法に従い細胞によって生成される細胞脂肪であってよい。
従って、ハードストック脂肪は、少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％のＳＯ
Ｓを有する位置特異的プロフィールを有する脂肪であってよい。Ｗ／Ｏエマルションは、
米国特許第７，１１８，７７３号明細書を含む当該技術分野において公知の方法に合わせ
て調製することができる。
関連する実施形態において、細胞はまた、リシノール酸を産生する内因性ヒドロリアー
ゼ酵素も発現する。結果として、産生される油（例えば、液体油又は構造化脂肪）はより
容易に乳化してマーガリン、スプレッド、又は他の食品又は非食品になり得る。例えば、
産生される油は、乳化剤の添加を用いない又はより少量のかかる乳化剤を使用して乳化さ
せることができる。米国特許出願第１３／３６５，２５３号明細書は、かかるヒドロキシ
ラーゼを微細藻類及び他の細胞で発現させる方法を開示している。特定の実施形態におい
て、細胞油は少なくとも１、２、又は５％のＳＲＳを含み、ここでＳはステアリン酸であ
り、Ｒはリシノール酸である。
代替的実施形態において、上記に記載したとおりのココアバター模倣物（又は、シア若
しくはコラム模倣物等の他の高飽和−不飽和―飽和（ｓａｔ−ｕｎｓａｔ−ｓａｔ）油）
である細胞油を分画してトリ飽和物（例えば、トリステアリン及びトリパルミチン、ＳＳ
Ｐ、及びＰＰＳ）を取り除くことができる。例えば、ＳＯＳ濃度の増加のためＳＡＤ活性
が低下するように操作された微細藻類は、分画してトリ飽和物を取り除くことのできる油
を作ることが分かっている。実施例４７及び実施例６４を参照のこと。特定の実施形態に
おいて、分画された細胞油の融解温度は、ココアバターの融解温度（約３０〜３２℃）と
同程度である。ＰＯＰ、ＰＯＳ及びＳＯＳレベルは、それぞれ約１６、３８、及び２３％
でココアバターに近くなり得る。例えば、ＰＯＰは１６％±２０％であってもよく、ＰＯ
Ｓは３８％±２０％であってもよく、ＳＯＳは２３％±２０％であってもよい。或いは、
ＰＯＰは１６％±１５％であってもよく、ＰＯＳは３８％±１５％であってもよく、ＳＯ
Ｓは２３％±１５％であってもよい。或いは、ＰＯＰは１６％±１０％であってもよく、
ＰＯＳは３８％±１０％であってもよく、ＳＯＳは２３％±１０％であってもよい。加え
て、トリステアリンレベルはトリアシルグリセリドの５％未満であってもよい。
ある実施形態では、方法は、少なくとも４０、５０、又は６０％のＳＯＳを有するＴＡ
Ｇプロフィールを有する出発油を産生する遺伝子操作された（例えば、微細藻又は他の微
生物）細胞から得られる細胞油を得る工程を含む。任意選択で、細胞は、過剰発現するＫ
ＡＳＩＩ遺伝子、ＳＡＤノックアウト若しくはノックダウン、又は外来性Ｃ１８選択的Ｆ
ＡＴＡ遺伝子、外来性ＬＰＡＡＴ、及びＦＡＤ２ノックアウト若しくはノックダウンのう
ちの１つ以上を含む。油は乾燥分画又は溶媒分画によって分画され、出発油と比べてＳＯ
Ｓが増加し且つトリ飽和物が減少した濃縮油（ステアリン画分）が提供される。濃縮油は
、少なくとも６０％、７０％又は８０％のＳＯＳを有し、トリ飽和物が５％、４％、３％
、２％又は１％以下であり得る。濃縮油は、ｓｎ−２位に８５、９０、９５％以上のオレ
イン酸を有するｓｎ−２プロフィールを有し得る。例えば、分画油は、少なくとも６０％
のＳＯＳ、５％以下のトリ飽和物及びｓｎ−２位における少なくとも８５％のオレイン酸
を含み得る。或いは、油は、少なくとも７０％のＳＯＳ、４％以下のトリ飽和物及びｓｎ
−２位における少なくとも９０％のオレイン酸か、又は８０％のＳＯＳ、４％以下のトリ
飽和物及びｓｎ−２位における少なくとも９５％のオレイン酸を含み得る。任意選択で、
油は、コクムバターと本質的に同一の最大ヒートフロー温度及び／又はＤＳＣで得られる
ＳＦＣ曲線を有する。ステアリン画分は、乾燥分画、溶媒分画、又はこれらの組み合わせ
によって得ることができる。任意選択で、本方法は、第１の温度及び第２の温度での二段
階乾燥分画を含む。第１の温度（ｔｅｒｍｐｅｒａｔｕｒｅ）は第２の温度より高くても
又は低くてもよい。具体的な実施形態において、第１の温度はＯＯＳの除去に有効であり
、第２の温度はトリ飽和物の除去において有効である。任意選択で、第１の温度で処理し
た後、ステアリン画分が溶媒（例えばアセトン）で洗浄されることによりＯＯＳが除去さ
れる。任意選択で、第１の温度は約２４℃であり、第２の温度は約２９℃である。
ＶＩＩＩ．高中鎖油
本発明の実施形態において、細胞は、細胞中又は細胞の油中の中鎖脂肪酸（例えば、Ｃ
８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、又はＣ１６：０脂肪酸）のレベルを上昇
させる働きをする組換え核酸を有する。細胞中又は細胞の油中の中鎖脂肪酸のレベルを増
加させる一つの方法は、単独の改変として、或いは１つ以上の他の遺伝子改変との組み合
わせで、中鎖脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して活性を有する外因性アシル−ＡＣＰチオ
エステラーゼ（例えば、ＦａｔＢ遺伝子によりコードされるもの）を発現するように細胞
を操作することである。細胞又は細胞の油中の中鎖脂肪酸レベルを増加させるさらなる遺
伝子改変は、置換アシルグリセロエステルのｓｎ−２位への中鎖脂肪酸アシル基の転移を
触媒する活性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードす
る外来性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現である。例えば、
ＬＰＡＡＴ遺伝子は、実施例４３〜４４に開示される中鎖選択的ＬＰＡＡＴ（配列番号７
７、７８、７９、８１、８２、８４、及び８５）と７５、８０、８５、９０、９１、９２
、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％のアミノ酸配列同一性を有し、又は７
５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の
核酸配列同一性（又は遺伝子コードの縮重と等価な配列）を有し得る。特定の関連する実
施形態では、外因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びＬＰＡＡＴの両方が細胞で安定
に発現する。ある実施形態では、組換え核酸は、外因性中鎖特異的チオエステラーゼ、及
び置換アシルグリセロエステルのｓｎ−２位への中鎖脂肪酸アシル基の転移を触媒する外
因性ＬＰＡＡＴの発現を生じさせる油産生細胞に（特にプラスチド微生物細胞に）導入さ
れる。結果として、細胞は、それが産生するＴＡＧ中の中鎖脂肪酸の割合が１０、２０、
３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０倍、又はそれを超えて増加するように作られ
得る。外因性ＬＰＡＡＴを導入すると、外来性中鎖選択的アシル−ＡＣＰチオエステラー
ゼを単独で導入するのと比較して、ｓｎ−２位における中鎖脂肪酸が１．２、１．５、１
．７、２、３、４倍又はそれを超えて増加し得る。ある実施形態では、中鎖脂肪酸は、細
胞によって産生されるＴＡＧ脂肪酸の３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％
超である。様々な実施形態において、中鎖脂肪酸は、ラウリン酸、ミリスチン酸、又はパ
ルミチン酸である。実施例３、４３、及び４４は、脂肪酸プロフィールの変化をもたらす
微細藻類細胞における植物ＬＰＡＡＴの発現を記載する。これらの例にあるとおり、細胞
はまた、外因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（これもまた植物由来であってよい）も
、所与の脂肪酸アシル−ＡＣＰ鎖長に対する選択性を伴い発現し得る。例えば、微細藻類
細胞は、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ８〜Ｃ１２、又はＣ８〜Ｃ１０脂肪酸を選択
的に切断するＬＰＡＡＴ及びアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子を
含み得る。特定の実施形態において、かかる細胞は、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４
０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、又は９０〜９９％
、＞２０％、＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％又は＞９０
％のＣ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ８〜Ｃ１２、又はＣ８〜Ｃ１０脂肪酸を含む脂肪
酸プロフィールの細胞油を産生する能力を有する。他のＬＰＡＡＴは、Ｃ１６又はＣ１８
脂肪酸を選択的に切断し得る（実施例４４を参照のこと）。脂肪酸デサチュラーゼ経路の
さらなる遺伝子操作（例えば、以下に記載するとおり）により、油の安定性を増加させる
ことができる。
これらの細胞油のいずれもエステル交換することができる。エステル交換は、例えば油
の融解温度又は流動点を下げるために用いることができる。特定の実施形態では、細胞油
は少なくとも５０％のカプリル酸とカプリン酸との合計を含み、流動点及び／又は動粘性
率を低下させるためエステル交換され得る。かかる油（細胞油又はエステル交換油）は、
場合により、例えば２％未満の多価不飽和脂肪酸を含む高安定性の油となり得る。
或いは、又は外因性ＬＰＡＡＴの発現に加えて、細胞は、外因性ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩ
Ｖ酵素を発現させ、場合によりＫＡＳＩＩの活性を低下又は消失させる働きをする組換え
核酸を含んでもよく、これは、中鎖選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現させる
場合に特に有利である。実施例３７は、中鎖選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼと併
せてＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ酵素を過剰発現するようにＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞を操作
することによる、Ｃ１０〜Ｃ１２脂肪酸の産生が全脂肪酸の約５９％となる株の作成につ
いて記載する。中鎖産生はまた、ＫＡＳＩ及び／又はＫＡＳＩＩの活性を（例えばノック
アウト又はノックダウンを用いて）抑制することによっても増加させることができる。実
施例３８は、約７６％又は８４％のＣ１０〜Ｃ１４脂肪酸となる脂肪酸プロフィールを実
現する、中鎖選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの過剰発現と併せたＰｒｏｔｏｔｈ
ｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）ＫＡＳＩの異なる対立遺伝子の染
色体ノックアウトについて詳細する。実施例３９は、ＫＡＳＩ ＲＮＡヘアピンポリヌク
レオチドが発現する結果として高い中鎖脂肪酸を特徴とする組換え細胞及び油を提供する
。これらの改変のいずれかに加え、ＳＡＤ又はＦＡＤ酵素の不飽和又は多価不飽和脂肪酸
の産生を（例えばノックアウト又はノックダウンによって）抑制することができる。
詳細な実施形態において、組換え細胞は、４０％又はそれを超えるラウリン酸を有する
ＴＡＧを産生する。別の関連する実施形態において、組換え細胞は、４０％又はそれを超
えるミリスチン酸、カプリル酸、カプリン酸、又はパルミチン酸の脂肪酸プロフィールを
有するＴＡＧを産生する。例えば、油産生組換え緑色植物（ｃｌｏｒｏｐｈｙｔｅ）細胞
は、油中４０％のラウリン酸又はミリスチン酸を産生することができ、これは細胞乾燥重
量の４０、５０、又は６０％又はそれを超える割合を構成する。
特定の実施形態において、組換え細胞は、置換アシルグリセロエステルのｓｎ−２位へ
の中鎖脂肪酸アシル基の転移を触媒するリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ
をコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸と、ＡＣＰからの中鎖脂肪酸の
切断を触媒する活性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするアシル−ＡＣＰチオエ
ステラーゼ外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸とを含む。結果として、一実施形
態において、産生される油は、組換え核酸の結果としてＣ１０及びＣ１２脂肪酸が上昇し
、且つＣ１６、Ｃ１８、及びＣ１８：１脂肪酸が低下した脂肪酸プロフィールにより特徴
付けられ得る。実施例３を参照されたく、ここではＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉアシ
ル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びＣｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ ＬＰＡＡＴ遺伝子の過
剰発現によりＣ１２脂肪酸の割合が非形質転換細胞における約０．０４％から約４６％に
増加し、Ｃ１０脂肪酸の割合が非形質転換細胞における約０．０１％から約１１％に増加
した。例えば、ＦＡＴＢ遺伝子は、配列番号１０又は１１と７５、８０、８５、９０、９
１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％のアミノ酸配列同一性を有し
、又は７５、８０、８５ ９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は
９９％の核酸配列同一性（又は遺伝子コードの縮重と等価な配列）を有し得る。関連する
実施形態では、中鎖脂肪酸産生の増加は７０％より大きく、７５〜８５％、７０〜９０％
、９０〜２００％、２００〜３００％、３００〜４００％、４００〜５００％、又は５０
０％より大きい。
平均鎖長もまた、Ｃ１８特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの過剰発現によって低
下させることができる。Ｃ１８又は他のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを過剰発現させ
る働きをする組換え核酸を、単独で、又は本明細書に記載される他の構築物との組み合わ
せで使用して、平均鎖長をさらに低下させることができる。数ある用途の中でも特に、産
生される油は、ココアバター／乳脂肪代用物として使用することができる。実施例４５及
び図１７の考察を参照のこと。ある実施形態では、上述の高中鎖産生細胞の１つが、上記
第ＩＶ章で記載したとおり１つ以上の脂肪酸アシルデサチュラーゼをノックアウト又はノ
ックダウンすることにより、低多価不飽和油を産生するようにさらに操作される。従って
、産生される油は、当該の章又は対応する実施例で言及している高い安定特性を有し得る
。特定の実施形態において、細胞は、３０％超の中鎖脂肪酸及び５％以下の多価不飽和物
を含む油を産生する。関連する実施形態において、細胞は、４０％超の中鎖脂肪酸及び４
％以下の多価不飽和物を含む油を産生する。さらなる関連する実施形態において、細胞は
、５０％超の中鎖脂肪酸及び３％以下の多価不飽和物を含む油を産生する。
具体的な実施形態において、細胞は、ラウリン酸とミリスチン酸との合計が少なくとも
５０％、６０％、７０％、又は７５％である脂肪酸プロフィールによって特徴付けられる
油を産生する。これは、実施例３７〜３９、４３〜４４、５２、及び６０〜６１の技法を
用いて達成することができる。例えば、実施例５２は、外因性植物ＦＡＴＢアシル−ＡＣ
Ｐチオエステラーゼを有する組換え細胞を使用してラウリン酸とミリスチン酸との合計が
約７９％である脂肪酸プロフィールを有する油を生成する方法を記載する。
別の具体的な実施形態において、細胞は、カプリン酸（Ｃ１０：０）が少なくとも３０
％であり、且つラウリン酸（Ｃ１２：０）が少なくとも３０％である脂肪酸プロフィール
によって特徴付けられる細胞油を産生する。例えば、細胞油中のカプリン酸及びラウリン
酸の絶対レベルは、５、１０、１５、２０又は３０％以内にバランスしていてもよい。こ
れは、実施例３７〜３９、４３〜４４、５２、及び６０〜６１の技法を用いて達成するこ
とができる。実施例６０にあるとおり、外来性植物ＦＡＴＢ及びＫＡＳＩ（又はＫＡＳＩ
Ｖ）遺伝子を組み合わせることにより、バランスしているカプリン酸及びラウリン酸レベ
ルを提供し得る。任意選択で、内在性ＫＡＳＩ遺伝子をノックアウトし、外来性ＫＡＳＩ
に置き換えることができる。加えて、２つ以上の外来性ＦＡＴＢ遺伝子を使用することに
より、所望の脂肪酸プロフィールに確実に達することができる。具体的な実施形態におい
て、微細藻類細胞は少なくとも１つ及び任意選択で少なくとも２つの外来性ＦＡＴＢ遺伝
子及び外来性ＫＡＳＩ／ＫＡＳＩＶ遺伝子を発現し、少なくとも３０％のＣ１０及び少な
くとも３０％のＣ１２脂肪酸を有する抽出可能な細胞油を産生する。例えば、細胞は、Ｃ
ｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ ＦＡＴＢ２（配列番号１５８）と少なくとも７０、
７５、８０、８５、９０又は９５％のアミノ酸配列同一性を有するＦＡＴＢアシル−ＡＣ
Ｐチオエステラーゼ及びＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＡ１（配列番号１５９
、代替トランジットペプチドを含む）と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０又は９
５％のアミノ酸配列同一性を有するβ−ケトアシルＡＣＰシンターゼを発現することがで
きる。さらに、第２の外来性ＦＡＴＢ遺伝子／酵素を発現させることができる。第２のＦ
ＡＴＢは、Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＦＡＴＢ２アシル−ＡＣＰチオエステラー
ゼ（配列番号１１）と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０又は９５％のアミノ酸配
列同一性を有し得る。これらの目的上、プラスチド標的ペプチドは、プラスチド標的トラ
ンジットペプチド（これはあまり保存されておらず、残りの酵素ドメイン配列と比べてよ
り容易に置換可能である）を含んで又は含まずアラインメントすることができる。
ある実施形態では、細胞は、７５％超の飽和脂肪酸を含む油を生成する。任意選択で、
細胞は、７５％超の飽和脂肪酸を含み、２５％未満のカプリン酸、５０％未満のラウリン
酸、及び５％未満のパルミチン酸を有する油を産生する。関連する実施形態では、油は少
なくとも８０％、９５％又は９０％の飽和脂肪酸を含む。実施例６０は、複数の外来性Ｆ
ＡＴＢ遺伝子、及び植物由来の外来性ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ遺伝子による内在性ＫＡＳ
Ｉ遺伝子の置換を含む微細藻類によるかかる油の産生を記載する。
実施例６０及び６２はまた、ＦＡＴＢ及びＫＡＳ遺伝子の選択によって、少なくとも５
０％の総飽和物を有し、カプリン酸及びラウリン酸が２０％以内に（又はさらには１５％
、又は１０％以内に）バランスしている油を生じさせ得ることを示す。
一般に高度中鎖油、及び実施例６０及び６２のものと同様の株によって産生されるもの
は、低い動粘性率を有し得る。例えば、油は、４０℃でＡＳＴＭ Ｄ４４５を使用して計
測したとき２５ｃＳ±２０％、２５ｃＳ±１０％、又は２５ｃＳ±５％の動粘性率を有し
得る。同様に、油は、１００℃でＡＳＴＭ Ｄ４４５によるとき５．４ｃＳ±２０％、５
．４ｃＳ±１０％、又は５．４ｃＳ±５％の動粘性率を有し得る。油は、ＡＳＴＭ ２２
８０を使用して計測したとき１６０±２０％、１６０±１０％、又は１６０±５％の粘度
指数を有し得る。
具体的な例では、実施例６０に報告されるものと同様の株を使用して調製された油は、
３０％超のＣ１０：０及び３０％超のＣ１２：０脂肪酸を有する油を産生した。この油は
、４０℃で２４．６１ｃＳｔ及び１００℃で５．３６ｃＳｔのＡＳＴＭ ４４５による動
粘性率（ｋｉｎｅｍａｔｉｃ ｖｉｓｃｏｃｉｔｙ）を有し、１５９の粘度指数（ＡＳＴ
Ｍ ２２７０）であった。この油を作るため、Ｃｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ Ｆ
ＡＴＢ２アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＡ
１遺伝子（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＳＡＤトランジットペプチドを含む）と共に、Ｐ
ｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおいて、それぞれＵＡＰＡ１及びＡＭＴ０
３プロモーターの存在下で発現させた。選択マーカーにおいてネオマイシン耐性（ｒｅｓ
ｉｔａｎｃｅ）を使用し、構築物をＫＡＳ１−１部位に組み込んだ。従って、ある実施形
態では、宿主細胞は、配列番号１５８と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、又は
９５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を発現し、また、配列番号１５９と少な
くとも７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパ
ク質も発現する外来遺伝子を含む。細胞は、少なくとも３０％のＣ１０：０及び／又は少
なくとも３０％のＣ１２：０脂肪酸を含む油を産生する。任意選択で、細胞から、４０℃
でＡＳＴＭ Ｄ４４５を使用して計測したとき３０ｃＳｔ未満の動粘性率を有する細胞油
を抽出することができる。
これらの油の加水分解により得られる高中鎖油又は脂肪酸は、潤滑剤及び界面活性剤の
製造を含め、食品、燃料（ｆｕｌｅ）及び油脂化学品用途において特に有用であり得る。
例えば、細胞から得られる脂肪酸は、エステル化、クラッキング、アルデヒド又はアルコ
ールへの還元、アミノ化、硫酸化、スルホン化、又は当該技術分野において公知の他の化
学的処理に供され得る。
一部の実施形態では、細胞油はエステル交換され、エステル交換した細胞油の動粘性率
は、４０℃で３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１センチ
ストーク未満である。一部の実施形態では、動粘性率は４０℃で３センチストーク未満で
ある。一部の実施形態では、エステル交換した細胞油の流動点は、５℃、０℃、−１０℃
、−１２℃、−１５℃、−２０℃、−２５℃、−３０℃、−３５℃、−４０℃、−４５℃
、又は−５０℃未満である。一部の実施形態では、流動点は−１０℃未満である。一部の
実施形態では、流動点は−２０℃未満である。
実施例５３は、微細藻類において６０％超のミリスチン酸を含む油を産生するための藻
類における植物ＦａｔＢ遺伝子の使用について記載する。ある実施形態では、配列番号８
７又は配列番号８９と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％のアミノ酸
同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、場合により上記に記載したとおりの中
鎖選択的ＬＰＡＡＴと組み合わせて使用される。
実施例６２に記載されるとおり、本発明者らは、意外にも、ＫＡＳＩ遺伝子とＦＡＴＢ
遺伝子との組み合わせが、いずれの遺伝子も単独では行うことができないような形で細胞
によって産生される油の脂肪酸プロフィールをシフトさせ得ることを発見した。具体的に
は、外来性植物ミリスチン酸選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを有する組換え細胞
は、ＫＡＳＩ遺伝子を共発現させたとき、ラウリン酸の割合が大きくなるようにその脂肪
酸プロフィールをシフトさせることが発見された。ＫＡＳＩはエロンガーゼ活性を有する
が、それにも関わらず脂肪酸プロフィールは短鎖の方にシフトしたため、これは予想外で
ある。換言すれば、外来性ＦＡＴＢ及びＫＡＳＩ遺伝子の両方を発現する細胞は、ＦＡＴ
Ｂ遺伝子を有するがＫＡＳＩ遺伝子は有しない対照細胞と比べてより短い脂肪酸鎖の方に
シフトする脂肪酸プロフィールを有する油を産生した。従って、本発明の実施形態は、組
換え細胞を構築する工程又はその細胞を使用して油を作る工程を含み、ここで細胞は、所
与の鎖長選好を有する外来性ＦＡＴＢとＫＡＳＩ遺伝子とを含み、細胞は、ＫＡＳＩ遺伝
子なしに得られるものと比べてより短鎖に向かう分布のシフトを伴う油を作る。任意選択
で、ＦＡＴＢ遺伝子は、実施例６２のＣｃＦＡＴＢ２−ＵｃＦＡＴＢ２ ＦＡＴＢ（配列
番号１６２）、Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＦＡＴＢ２（配列番号１１）、Ｃｕｐ
ｈｅａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＦＡＴＢ２（配列番号８７；配列番号８９）、Ｃｕｐｈｅ
ａ ｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ ＦＡＴＢ１（配列番号１６３）、Ｃｕｐｈｅａ ｈｙｓ
ｓｏｐｉｆｏｌｉａ ＦＡＴＢ３（配列番号１６４）、又はＣｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒ
ｉａｎａ ＦＡＴＢ２（配列番号１５８）と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、
９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一の核酸配列（又は遺伝子コードの
縮重（ｄｅｇｅｎｅｒｅｃｙ）により等価な配列）を有するか、或いは最低８０、８５、
９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一のアミノ酸配
列を有する。任意選択で、ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ遺伝子は、実施例６２のＣｕｐｈｅａ
ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＡＩ（配列番号１５９）、配列番号４９の配列によってコー
ドされるＣｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ ＫＡＳＩＶ、又は配列番号４８によって
コードされるＣｕｐｈｅａ ｐｕｌｃｈ ＫＡＳＩＶと少なくとも８０、８５、９０、９
１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一の核酸配列（又は遺伝
子コードの縮重（ｄｅｇｅｎｅｒｅｃｙ）により等価な配列）を有するか、或いは最低８
０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一の
アミノ酸配列を有する。
ＩＸ．高オレイン酸／パルミチン酸油
別の実施形態には、約６０％のオレイン酸、２５％のパルミチン酸及び場合により５％
又はそれ以下の多価不飽和物を含む高オレイン酸油がある。高オレイン酸油は、米国特許
出願第１３／３６５，２５３号明細書（その関連する部分が参照により援用される）に開
示される方法を用いて生成することができる。例えば、細胞が、アシル−ＡＣＰチオエス
テラーゼを抑制（例えばＦＡＴＡをコードする遺伝子のノックアウト又はノックダウン）
するとともにＫＡＳＩＩ活性を増加させる遺伝子を発現する働きをする核酸を有し得る。
細胞は、上記に記載するとおりの遺伝子発現の調節を含め、デルタ１２脂肪酸デサチュラ
ーゼの発現を阻害するさらなる改変を有してもよい。結果として、多価不飽和物は、５、
４、３、２、又は１面積％以下となり得る。
Ｘ．低飽和物油
ある実施形態では、細胞油は組換え細胞から産生される。産生される油は、４％、３％
、２％、又は１％（面積％）未満の飽和脂肪酸を有する脂肪酸プロフィールを有する。特
定の実施形態において、油は０．１〜３．５％の飽和脂肪酸を有する。特定のかかる油を
使用して、飽和脂肪酸の量が無視し得る程度である食品を製造することができる。場合に
より、これらの油は、少なくとも９０％のオレイン酸又は少なくとも９０％のオレイン酸
と少なくとも３％の多価不飽和脂肪酸を含む脂肪酸プロフィールを有し得る。ある実施形
態では、組換え細胞によって産生される細胞油は、少なくとも９０％のオレイン酸、少な
くとも３％のリノール酸とリノレン酸との合計を含み、且つ３．５％未満の飽和脂肪酸を
有する。関連する実施形態において、組換え細胞によって産生される細胞油は、少なくと
も９０％のオレイン酸、少なくとも３％のリノール酸とリノレン酸との合計を含み、且つ
３．５％未満の飽和脂肪酸を有し、この飽和脂肪酸の大部分は鎖長１０〜１６で構成され
る。これらの油は、限定はされないが、本明細書及び米国特許出願第１３／３６５，２５
３号明細書に記載されるものを含め、組換え油産生細胞によって産生され得る。例えば、
高活性ＳＡＤを含む細胞におけるＫＡＳＩＩ酵素の過剰発現は、飽和物が３．５％以下の
高オレイン酸油を産生し得る。場合により、オレイン酸特異的アシル−ＡＣＰチオエステ
ラーゼ及び／又はノックアウト若しくは抑制されたＣ１８未満のアシル鎖を加水分解する
傾向を有する内因性チオエステラーゼもまた過剰発現される。オレイン酸特異的アシル−
ＡＣＰチオエステラーゼは、産生される油の脂肪酸プロフィールにおけるパルミチン酸と
ステアリン酸との合計に対するオレイン酸の比が３、５、７、又は１０より大きくなるよ
うに、ＡＣＰ−パルミチン酸及びＡＣＰ−ステアリン酸に対する活性が低い導入遺伝子で
あってもよい。或いは、又はそれに加えて、以下の実施例３６にあるとおり、ＦＡＴＡ遺
伝子がノックアウト又はノックダウンされてもよい。ＦＡＴＡ遺伝子をノックアウト又は
ノックダウンし、且つ外来性ＫＡＳＩＩを過剰発現させてもよい。別の任意選択の改変は
、ＫＡＳＩ及び／又はＫＡＳＩＩＩ活性を増加させることであり、これは、より短鎖の飽
和物の形成をさらに抑制し得る。場合により、置換グリセロールに対する不飽和脂肪酸ア
シル部分の転移に特異性を有する１つ以上のアシルトランスフェラーゼ（例えばＬＰＡＡ
Ｔ）もまた過剰発現され、及び／又は内因性アシルトランスフェラーゼがノックアウト又
は減弱される。さらなる任意選択の改変は、不飽和脂肪酸の伸長に特異性を有するＫＣＳ
酵素の活性を増加させることであり、及び／又は飽和脂肪酸の伸長に特異性を有する内因
性ＫＣＳがノックアウト又は減弱される。場合により、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ
のノックアウト又はノックダウンにより、リノール酸産生を犠牲にしてオレイン酸が増加
する；例えば、本特許出願の第ＩＶ章の技術が用いられる。任意選択で、使用される外来
遺伝子は植物遺伝子；例えば、油糧種子に見られるｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡから得ら
れるものであってもよい。
実施例５１に記載するとおり、飽和脂肪のレベルはまた、パルミチン酸をパルミトレイ
ン酸に不飽和化する外来遺伝子（例えば、植物遺伝子）の導入によって低下させてもよい
。油産生細胞において使用される好適な遺伝子の例が、Ｍａｃｆａｄｙｅｎａ ｕｎｇｕ
ｉｓ（キャッツクロー）、Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ（マカダミア
ナッツ）及びＨｉｐｐｏｐｈａｅ ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ（シーバックソーン）を含む植
物に見られる。パルミトイル−ＡＣＰを不飽和化する変異体外因性又は内在性ＳＡＤもま
た使用することができ、これは実施例５１でさらに考察する。場合により、ＰＡＤ又はＳ
ＡＤ遺伝子は、実施例５１に記載される遺伝子産物と少なくとも９５％のアミノ酸配列同
一性を有する。この改変は、単独で用いることもでき、又はこの直前、第ＩＸ章及び実施
例に記載するものなど、１つ以上の内在性ＦＡＴＡ対立遺伝子のノックアウト又はノック
ダウン及び／又はＫＡＳＩＩの過剰発現を含めた、オレイン酸を増加させる改変との組み
合わせで用いることもできる。一実施形態において、油産生微細藻類などの油産生細胞は
、（ｉ）ＦＡＴＡノックアウト又はノックダウンと、（ｉｉ）外来性ＰＡＤ遺伝子（これ
はまた、Ｌ１１８Ｗ変異体又は等価物等のＰＡＤ活性を有する変異体ＳＡＤであってもよ
い、実施例５５〜５６を参照のこと）の発現及び／又はＰＡＤ活性を付与する内在性ＳＡ
Ｄ遺伝子における突然変異との組み合わせを有する。かかる細胞は、過剰発現した内在性
又は外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子をさらに含み得る。本発明のこれらの実施形態のいずれにお
いても、油産生細胞は、１〜２、２〜３、３〜４、５〜６、７〜８、９〜１０、１０〜１
５、１５〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０
〜９０、又は９０〜１００面積パーセントのパルミトレイン酸を含む脂肪酸プロフィール
を有する油を産生する。具体的な実施形態において、細胞は、５０％超のオレイン酸、１
％超のパルミトレイン酸、及び３．５面積％以下の飽和脂肪酸を産生する。別の具体的な
実施形態において、真核微細藻類細胞は、微細藻類細胞において作動可能な調節エレメン
トに作動可能に連結した、パルミチン酸をパルミトレイン酸に不飽和化する外来遺伝子を
含む。外来遺伝子産物の発現及び活性に起因して、細胞は、パルミチン酸（Ｃ１６：０）
に対するパルミトレイン酸（Ｃ１６：１）の比が少なくとも０．０５、０．１又は０．１
５、又は０．１８である脂肪酸プロフィールを有する細胞油を産生する。例えば、かかる
油を産生する細胞の実施例５５を参照のこと。任意選択で、パルミトレイン酸はプロフィ
ールの０．５％以上を占める。任意選択で、細胞油は３．５％未満の飽和脂肪酸を含む。
上記の遺伝子改変に加え、低飽和物油は、多価不飽和脂肪酸が低量であるために高安定
性の油であり得る。高安定性、低多価不飽和の油の方法及び特性決定は、内因性Δ１２脂
肪酸デサチュラーゼの活性を低下させる方法を含め、低多価不飽和油という見出しの上記
の章に記載される。特定の実施形態において、油は、ＩＩ型脂肪酸合成経路を有する油産
生微生物細胞によって産生され、飽和脂肪酸が３．５％以下であり、また多価不飽和脂肪
酸も３％以下である。別の特定の実施形態において、油は、飽和脂肪酸が３％以下であり
、また多価不飽和脂肪酸も２％以下である。別の特定の実施形態において、油は、飽和脂
肪酸が３％以下であり、また多価不飽和脂肪酸も１％以下である。別の具体的な実施形態
において、真核微細藻類細胞は、微細藻類細胞において作動可能な調節エレメントに作動
可能に連結した、パルミチン酸をパルミトレイン酸に不飽和化する外来遺伝子を含む。細
胞は、ＦＡＤ遺伝子のノックアウト又はノックダウンをさらに含む。遺伝子改変に起因し
て、細胞は、パルミチン酸（Ｃ１６：０）に対するパルミトレイン酸（Ｃ１６：１）の比
が０．１を超え、多価不飽和脂肪酸が３％以下である脂肪酸プロフィールを有する細胞油
を産生する。任意選択で、パルミトレイン酸はプロフィールの０．５％以上を占める。任
意選択で、細胞油は３．５％未満の飽和脂肪酸を含む。
低コストで目標の飽和脂肪酸レベルに達するように、低飽和及び低飽和／高安定性の油
を安価な油とブレンドすることができる。例えば、１％飽和脂肪の油を、７％の飽和脂肪
を有する油（例えば高オレイン酸ヒマワリ油）とブレンドして、３．５％以下の飽和脂肪
を有する油を提供することができる。
本発明の実施形態により生成される油は、数ある用途の中でも特に、輸送燃料、油脂化
学品、及び／又は食品及び化粧品工業において使用することができる。例えば、脂質のエ
ステル転移反応により、バイオディーゼルとして有用な長鎖脂肪酸エステルが生じ得る。
他の酵素的及び化学的プロセスを、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、アルカン、及びア
ルケンの産生に合わせて調整することができる。用途によっては、再生可能ディーゼル、
ジェット燃料、又は他の炭化水素化合物が生成される。本開示はまた、生産性の増加及び
脂質収率の増加のため、及び／又は本明細書に記載される組成物のより費用対効果の高い
生産のために微細藻類を培養する方法も提供する。本明細書に記載される方法は、プラス
チド細胞培養物からの油の大規模な（例えば、１０００、１０，０００、１００，０００
リットル又はそれを超える）生成を可能にする。
ある実施形態では、細胞から抽出された油は、３．５％、３％、２．５％、又は２％以
下の飽和脂肪を有し、食品に添合される。完成した食品は、３．５、３、２．５、又は２
％以下の飽和脂肪を有する。例えば、かかる組換え微細藻類から回収される油は、フライ
油に、又は飽和脂肪が低い加工食品の一成分として使用することができる。油はニートで
使用されてもよく、又は食品が有する飽和脂肪が一食当たり０．５ｇ未満であり、従って
（米国の規制に従い）ゼロ飽和脂肪を謳う表示が可能となるように、他の油とブレンドさ
れてもよい。具体的な実施形態において、油は、少なくとも９０％のオレイン酸、３％未
満の飽和脂肪、及びリノール酸より多いオレイン酸を有する脂肪酸プロフィールを有する
。
本特許出願に開示される他の油と同様に、本節に記載される低飽和油は、高レベルのパ
ルミトレイン酸を有するものを含め、本願の第ＸＩＩ節に記載されるとおりの微細藻類ス
テロールプロフィールを有し得る。例えば、外来性ＰＡＤ遺伝子の発現によって、ＦＡＭ
Ｅ ＧＣ／ＦＩＤ分析によって決定するとき少なくとも０．１のパルミチン酸に対するパ
ルミトレイン酸の比及び／又は０．５％以上のパルミトレイン酸レベルによって特徴付け
られる脂肪酸プロフィールと、β−シトステロールと比べたエルゴステロールの過剰及び
／又は２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール又はクリオナス
テロールの存在によって特徴付けられるステロールプロフィールとを有する油を生成する
ことができる。
ＸＩ．ココアバター／乳脂肪ブレンド模倣物
特定の実施形態において、細胞は、ココアバターと乳脂肪とのブレンドに近い温度依存
性固形脂肪含有量（「ＳＦＣ曲線」）を有する細胞油を生成する。かかる油は、ココアバ
ター／乳脂肪ブレンドを使用できるところ；例えば、チョコレート、他の糖菓、アイスク
リーム又は他の冷菓、ペストリー、又はクイックブレッド用、若しくは他のベイクド食品
用を含む生地において使用され得る。この油は、ブルーミングを抑え、風味を増強し、テ
クスチャを増強し、又はコストを低減し得る。特定の例では、細胞油に近い。従って、本
発明の実施形態は、レシピにおけるココアバター／乳脂肪（ｍｉｌｆａｔ）ブレンドに代
えて組換え微細藻類細胞からの細胞油を使用することである。関連する実施形態において
、
図１７は、以下のとおりの様々な油についての％固形脂肪含有量のプロットを示す：（
ａ）脂質経路を操作していないＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＲＢＤ油、（ｂ）ブラジル産
ココアバター＋２５％乳脂肪、（ｃ）ＳＡＤ対立遺伝子のレベルを低下させ、従ってＴＡ
Ｇプロフィールにおけるオレイン酸を低下させてステアリン酸を増加させるヘアピン核酸
を発現する株からのＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＲＢＤ油の３レプリケート、（ｄ）内因
性ＯＴＥ（オレオイルアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、実施例４５を参照）を過剰発現
する株からのＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＲＢＤ油、（ｅ）マレーシア産ココアバター＋
２５％乳脂肪、及び（ｆ）マレーシア産ココアバター。ココアバター及びココアバター乳
脂肪値は文献値である（Ｂａｉｌｅｙ’ｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｏｉｌｓ ａｎｄ
Ｆａｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，６ｔｈ ｅｄ．）、
本発明の実施形態において、７５％ココアバター／２５％乳脂肪ブレンドと熱的特性が
類似している細胞油が、上記に記載する微細藻類細胞又は他の細胞により生成される。細
胞は、油の固形脂肪含有量（例えばＮＭＲによって決定するとき）が２０℃で３８％±３
０％、２５℃で３２％±３０％、３０℃で１７％±３０％、及び３５℃で５％未満±３０
％になるようにするため、細胞によって産生されるトリグリセリドの脂肪酸プロフィール
を変える働きをする組換え核酸を含む。明確にする目的から、±１０％は、パーセントＳ
ＦＣに対するパーセントを指す（例えば、５％ＳＦＣの３０％は１．５％ＳＦＣであり、
従って範囲は３５℃で３．５〜６．５％ＳＦＣである）。関連する実施形態では、油の固
形脂肪含有量（例えばＮＭＲによって決定するとき）は、２０℃で３８％±２０％、２５
℃で３２％±２０％、３０℃で１７％±２０％、及び３５℃で５％未満±２０％であり、
又は油の固形脂肪含有量（例えば、ＮＭＲによって決定するとき）は、２０℃で３８％±
１０％、２５℃で３２％±１０％、３０℃で１７％±１０％、及び３５℃で５％未満±１
０％である。
別の実施形態において、第ＩＸ節又は対応する実施例の方法に従い生成される高オレイ
ン酸細胞油は、飽和脂肪酸の供給源（例えばハードストック脂肪又は飽和脂肪酸エステル
）との酵素エステル交換又はエステル転移反応によってココアバター等価物、代用物、増
量剤などの構造化脂肪に変換される。例えば、１，３−特異的リパーゼを使用して、８０
％超のオレイン酸を有する高オレイン酸油にステアリン酸、パルミチン酸又は両方を加え
ることができる。
ＸＩＩ．微量油成分
上記の方法により産生される油は、ある場合には、微細藻類宿主細胞を使用して作製さ
れる。上記に記載したとおり、微細藻は、限定なしに、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ、Ｔｒｅ
ｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｃｅａｅ
、又はＣｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅの分類に含まれる。Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａ
ｅの微細藻類は、そのステロールプロフィールに基づき植物油と区別できることが分かっ
ている。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓにより産生される油は、Ｇ
Ｃ−ＭＳによって検出したとき、ブラシカステロール、エルゴステロール、カンペステロ
ール、スチグマステロール、及びβ−シトステロールであるように見えるステロールを産
生することが見出された。しかしながら、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａによって産生されるステロ
ールは全て、Ｃ２４β立体化学を有すると考えられる。従って、カンペステロール、スチ
グマステロール、及びβ−シトステロールとして検出された分子は、実際には、それぞれ
２２，２３−ジヒドロブラシカステロール、ポリフェラステロール及びクリオナステロー
ルであると考えられる。従って、上記に記載する微細藻類によって産生される油は、Ｃ２
４β立体化学を有するステロールの存在と、存在するステロールにおけるＣ２４α立体化
学の非存在とにより植物油と区別することができる。例えば、産生される油は２２，２３
−ジヒドロブラシカステロールを含有する一方、カンペステロールが欠損していてもよい
；クリオナステロールを含有する一方、β−シトステロールが欠損していてもよく、及び
／又はポリフェラステロールを含有する一方、スチグマステロールが欠損していてもよい
。或いは、又は加えて、油は多量のΔ７−ポリフェラステロールを含有していてもよい。
一実施形態において、本明細書に提供される油は植物油ではない。植物油は、植物及び
植物の種子から抽出された油である。植物油は、本明細書に提供される非植物油と、それ
らの含油量に基づき区別することができる。含油量を分析するための様々な方法を用いて
、油の供給源、又は本明細書に提供される油と異なる（例えば植物）由来の油との不純物
混和が起こったかどうかを決定することができる。この決定は、分析法の１つ又は組み合
わせに基づき行うことができる。これらの試験としては、限定はされないが、遊離脂肪酸
、脂肪酸プロフィール、全トリアシルグリセロール含有量、ジアシルグリセロール含有量
、過酸化物価、分光特性（例えば紫外吸収）、ステロールプロフィール、ステロール分解
産物、抗酸化剤（例えばトコフェロール）、色素（例えばクロロフィル）、ｄ１３Ｃ値及
び官能分析（例えば、味、匂い、及び口当たり）の１つ以上の分析が挙げられる。食用脂
肪及び油に関するＣｏｄｅｘ Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ規格など、市販の油用に多くの
かかる試験が標準化されている。
ステロールプロフィール分析は、生物学的有機物源の決定に特によく知られている方法
である。カンペステロール、ｂ−シトステロール、及びスチグマステロールが一般的な植
物ステロールであり、ｂ−シトステロールは主要な植物ステロールである。例えば、ｂ−
シトステロールは、ある種の種子油の分析で最も多い存在量であることが見出されており
、トウモロコシ油において約６４％、菜種油において２９％、ヒマワリ油において６４％
、綿実油において７４％、大豆油において２６％、及びオリーブ油において７９％であっ
た（Ｇｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
５：７１−７９，２００６）。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株ＵＴＥＸ１４３５から分離した油を個
別に清澄化（ＣＬ）、精製及び漂白（ＲＢ）するか、又は精製、漂白、及び脱臭（ＲＢＤ
）し、ＪＡＯＣＳ ｖｏｌ．６０，ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ １９８３に記載される手順
に従いステロール含有量について試験した。分析結果を以下の表５ｂに示す（ｍｇ／１０
０ｇ単位）。
これらの結果は、３つの顕著な特徴を示す。第一に、あらゆるステロールのなかでエル
ゴステロールが最も豊富であり、全ステロールの約５０％以上を占めることが分かった。
エルゴステロールの量は、カンペステロール、β−シトステロール、及びスチグマステロ
ールを合わせた量より多い。エルゴステロールは真菌によく見られ、一般に植物には見ら
れないステロイドであり、その存在、特に多量の存在は、非植物油の有用なマーカーとな
る。第二に、この油はブラシカステロールを含有することが分かった。菜種油を除いては
、ブラシカステロールは一般に植物系の油には見られない。第三に、２％未満のβ−シト
ステロールが存在することが分かった。β−シトステロールは、一般に微細藻類には見ら
れない顕著な植物ステロールであり、その存在、特に多量の存在は、植物由来の油の有用
なマーカーとなる。要約すれば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株ＵＴＥ
Ｘ１４３５は、全ステロール含有量に対する割合として多量のエルゴステロールを含有す
ると共に、β−シトステロールは微量にしか含有しないことが見出された。従って、エル
ゴステロール：β−シトステロールの比又はブラシカステロールの存在との組み合わせを
使用して、この油を植物油と区別することができる。
一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合
として、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満のβ−シトス
テロールを含有する。他の実施形態では、油はβ−シトステロールを含まない。本願に開
示される任意の油又は細胞油について、油は、上記の表５ｂの任意の列のステロールプロ
フィールを有することができ、ステロール毎に３０％、２０％、１０％以下のばらつきが
ある。
一部の実施形態では、油は、β−シトステロール、カンペステロール、又はスチグマス
テロールの１つ以上を含まない。一部の実施形態では、油は、β−シトステロール、カン
ペステロール、及びスチグマステロールを含まない。一部の実施形態では、油はカンペス
テロールを含まない。一部の実施形態では、油はスチグマステロールを含まない。
一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合
として、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の２４−エチ
ルコレスタ−５−エン−３−オールを含む。一部の実施形態では、２４−エチルコレスタ
−５−エン−３−オールはクリオナステロールである。一部の実施形態では、本明細書に
提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも１％、２％、３
％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％のクリオナステロールを含む。
一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合
として、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の２４−メチ
ルコレスタ−５−エン−３−オールを含有する。一部の実施形態では、２４−メチルコレ
スタ−５−エン−３−オールは２２，２３−ジヒドロブラシカステロールである。一部の
実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合として、
少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％の２２
，２３−ジヒドロブラシカステロールを含む。
一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合
として、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の５，２２−
コレスタジエン−２４−エチル−３−オールを含有する。一部の実施形態では、５，２２
−コレスタジエン−２４−エチル−３−オールはポリフェラステロールである。一部の実
施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、全ステロールに対する割合として、少
なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％のポリフ
ェラステロールを含む。
一部の実施形態では、本明細書に提供される油の含油量は、エルゴステロール又はブラ
シカステロール又はこれらの２つの組み合わせを含有する。一部の実施形態では、含油量
は、全ステロールに対する割合として、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３５
％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、又は６５％のエルゴステロールを含有す
る。一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも２５
％のエルゴステロールを含有する。一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対す
る割合として、少なくとも４０％のエルゴステロールを含有する。一部の実施形態では、
含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％
、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、又は６５％のエルゴステロールと
ブラシカステロールとの組み合わせを含有する。
一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも１％、
２％、３％、４％又は５％のブラシカステロールを含有する。一部の実施形態では、含油
量は、全ステロールに対する割合として、１０％、９％、８％、７％、６％、又は５％未
満のブラシカステロールを含有する。
一部の実施形態では、エルゴステロールとブラシカステロールとの比は、少なくとも５
：１、１０：１、１５：１、又は２０：１である。
一部の実施形態では、含油量は、全ステロールに対する割合として、少なくとも５％、
１０％、２０％、２５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、又は６５
％のエルゴステロールと、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％
未満のβ−シトステロールとを含有する。一部の実施形態では、含油量は、全ステロール
に対する割合として、少なくとも２５％のエルゴステロール及び５％未満のβ−シトステ
ロールを含有する。一部の実施形態では、含油量はブラシカステロールをさらに含む。
ステロールは２７〜２９個の炭素原子を含有し（Ｃ２７〜Ｃ２９）、あらゆる真核生物
に見られる。動物はＣ２７ステロールをさらに改変してＣ２８及びＣ２９ステロールを生
成する能力を有しないため、専らＣ２７ステロールを作る。しかしながら植物にはＣ２８
及びＣ２９ステロールを合成する能力があり、Ｃ２８／Ｃ２９植物ステロールは多くの場
合にフィトステロールと称される。所与の植物のステロールプロフィールはＣ２９ステロ
ールが高く、植物における主要なステロールは、典型的にはＣ２９ステロールのｂ−シト
ステロール及びスチグマステロールである。対照的に、非植物生物のステロールプロフィ
ールには、より大きい割合のＣ２７及びＣ２８ステロールが含まれる。例えば真菌類及び
多くの微細藻類中のステロールは、主としてＣ２８ステロールである。このステロールプ
ロフィール、特に、植物でＣ２８ステロールと比べてＣ２９ステロールが顕著に優勢であ
ることが、土壌試料中の植物と海洋物との比率を決定する際に利用されている（Ｈｕａｎ
ｇ，Ｗｅｎ−Ｙｅｎ，Ｍｅｉｎｓｃｈｅｉｎ Ｗ．Ｇ．，“Ｓｔｅｒｏｌｓ ａｓ ｅｃ
ｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ”；Ｇｅｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｃｏｓｍｏ
ｃｈｉｍｉａ Ａｃｔａ．Ｖｏｌ ４３．ｐｐ ７３９−７４５）。
一部の実施形態では、本明細書に提供される微細藻類油中の主要ステロールは、ｂ−シ
トステロール及びスチグマステロール以外のステロールである。微細藻類油の一部の実施
形態では、Ｃ２９ステロールは重量基準で総ステロール含有量の５０％、４０％、３０％
、２０％、１０％、又は５％未満を占める。
一部の実施形態では、本明細書に提供される微細藻類油は、Ｃ２９ステロールより多い
Ｃ２８ステロールを含有する。微細藻類油の一部の実施形態では、Ｃ２８ステロールは、
重量基準で総ステロール含有量の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％
超を占める。一部の実施形態では、Ｃ２８ステロールはエルゴステロールである。一部の
実施形態では、Ｃ２８ステロールはブラシカステロールである。
ＸＩＩＩ．燃料及び化学品
上記で考察した油は、単独で、又は組み合わせで、食品、燃料及び化学品（プラスチッ
ク、発泡体、フィルム等を含む）の製造において有用である。油、トリグリセリド、油由
来の脂肪酸は、Ｃ−Ｈ活性化、ヒドロアミノメチル化、メトキシ炭酸化（ｍｅｔｈｏｘｙ
−ｃａｒｂｏｎａｔｉｏｎ）、オゾン分解、酵素変換反応、エポキシ化、メチル化、二量
化、チオール化、メタセシス、ヒドロアルキル化、ラクトン化、又は他の化学的プロセス
に供され得る。
油はアルカン（例えば、再生可能ディーゼル）又はエステル（例えば、エステル転移反
応によって生成されるバイオディーゼル（ｂｉｏｄｉｓｅｓｅｌ）用のメチル又はエチル
エステル）に変換することができる。アルカン又はエステルは、燃料として、溶剤又は潤
滑剤として、又は化学供給原料として用いられ得る。再生可能ディーゼル及びバイオディ
ーゼルの製造方法は、当該技術分野で十分に確立されている。例えば、国際公開第２０１
１／１５０４１１号パンフレットを参照のこと。
本発明の特定の実施形態では、上記に記載する高オレイン酸油又は高オレイン酸−高安
定性油がエステル化される。例えば、油は、オレイン酸メチルがリッチな油にメタノール
をエステル転移反応させ得る。実施例４９に記載するとおり、かかる配合は大豆油由来の
オレイン酸メチルに遜色がないことが分かった。
別の特定の例では、油はＣ３６二酸又はＣ３６二酸の生成物に変換される。油から生成
される脂肪酸を重合して、Ｃ３６ダイマー酸リッチな組成を提供することができる。特定
の例では、高オレイン酸油を分割して高オレイン酸脂肪酸材料が得られ、これを重合させ
ると、Ｃ３６ダイマー酸リッチな組成が得られる。場合により、油は高オレイン酸高安定
性油である（例えば、６０％超のオレイン酸で多価不飽和物が３％未満、７０％超のオレ
イン酸で多価不飽和物が２％未満、又は８０％超のオレイン酸で多価不飽和物が１％未満
）。高オレイン酸、高安定性の出発物質を使用すると、生じる環状生成物の量が少なくな
ると考えられ、これは場合によって望ましいことがある。油の加水分解後、高濃度のオレ
イン酸が得られる。ダイマー酸の作製過程で、高オレイン酸流は「より清澄な」Ｃ３６ダ
イマー酸に変換され、トリマー酸（Ｃ５４）及び他のより複雑な環状副産物（これらはＣ
１８：２酸及びＣ１８：３酸の存在に起因して得られる）を生じない。例えば、油を脂肪
酸に加水分解し、その脂肪酸をモンモリロナイト粘土の存在下２５０℃で精製及び二量化
することができる。ＳＲＩ Ｎａｔｕｒａｌ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ，Ｍａｒｃｈ ２０
０９を参照のこと。オレイン酸のＣ３６ダイマーリッチな生成物が回収される。
さらに、Ｃ３６ダイマー酸は、エステル化及び水素化されることによりジオールを提供
し得る。ジオールは、接触脱水により重合させることができる。ポリマーもまた、炭酸ジ
メチルによるダイマージオールのエステル転移反応により生成することができる。
本発明の方法における燃料の製造について、本発明の細胞によって産生される脂質は、
任意の好都合な手段により回収されるか、又は他の方法で収集される。脂質は全細胞抽出
によって単離することができる。細胞が初めに破壊され、次に、遠心の使用によるなどし
て、細胞塊から細胞内及び細胞膜／細胞壁関連脂質並びに細胞外炭化水素が分離される。
油産生細胞で産生される細胞内脂質は、一部の実施形態では、細胞を溶解した後に抽出さ
れる。抽出後、脂質をさらに精製することにより、油、燃料、又は油脂化学品が作られる
。
細胞溶解物からの脂質の分離には、様々な方法が利用可能である。例えば、脂質及び脂
質誘導体、例えば脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、及び炭化水素、例えばアルカンは、
ヘキサンなどの疎水性溶媒で抽出することができる（Ｆｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．１９８９
，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１１：７１７を参照）。脂質及び脂
質誘導体はまた、液化（例えば、Ｓａｗａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｂｉｏｍａ
ｓｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ １７：３３−３９及びＩｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．１
９９３，Ｂｉｏｍａｓｓ Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ ６（４）：２６９−２７４を参照のこと
）；油液化（例えば、Ｍｉｎｏｗａ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｆｕｅｌ ７４（１２）：
１７３５−１７３８を参照）；及び超臨界ＣＯ２抽出（例えば、Ｍｅｎｄｅｓ ｅｔ ａ
ｌ．２００３，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３５６：３２８−３
３４を参照）を用いても抽出することができる。Ｍｉａｏ ａｎｄ Ｗｕは、Ｃｈｌｏｒ
ｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓの培養物からの微細藻類脂質の回収プロトコル
について記載しており、ここでは細胞が遠心によって回収され、蒸留水で洗浄され、凍結
乾燥によって乾燥された。得られた細胞粉末が乳鉢において粉砕され、次にｎ−ヘキサン
で抽出された。Ｍｉａｏ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（
２００６）９７：８４１−８４６。
脂質及び脂質誘導体は、有機溶媒による抽出によって回収することができる。ある場合
には、好ましい有機溶媒はヘキサンである。典型的には有機溶媒は、溶解物成分を予め分
離することなしに、溶解物に直接添加される。一実施形態において、上記に記載する方法
の１つ以上によって生じる溶解物を、脂質及び／又は炭化水素成分が有機溶媒と溶液を形
成し得るのに十分な期間にわたり有機溶媒と接触させる。ある場合には、次に溶液をさら
に精製して、特定の所望の脂質又は炭化水素成分を回収することができる。ヘキサン抽出
方法は当該技術分野において公知である。
本明細書に記載されるとおりの、インビボで細胞によって産生された、又はインビトロ
で酵素的に改変された脂質は、場合により従来の手段によりさらに処理され得る。そうし
た処理には、炭化水素分子のサイズを低減し、それにより水素：炭素比を増加させる「ク
ラッキング」が含まれ得る。炭化水素及びトリグリセリド油の加工では、通常、触媒及び
熱クラッキング法が用いられている。触媒法は、固体酸触媒などの触媒の使用を伴う。触
媒はシリカ−アルミナ又はゼオライトであってもよく、炭素−炭素結合のヘテロリシスな
、すなわち不均一な分解を生じさせてカルボカチオン及びヒドリドアニオンをもたらす。
これらの反応中間体は、次に、別の炭化水素との転位又はヒドリド移動のいずれかを受け
る。このように、この反応により中間体が再生され、自己増殖型の連鎖機構がもたらされ
得る。炭化水素はまた、その中の炭素−炭素二重結合、又は三重結合の数が、場合により
ゼロまで低下するように処理されてもよい。炭化水素はまた、その中の環状又は環式構造
を除去し又は消失させるように処理されてもよい。炭化水素はまた、水素：炭素比を増加
させるように処理されてもよい。これには、水素の添加（「水素化」）及び／又はより小
さい炭化水素への炭化水素の「クラッキング」が含まれ得る。
熱的方法は、高温高圧の使用による炭化水素サイズの低減を伴う。約８００℃の高温及
び約７００ｋＰａの圧力が用いられ得る。これらの条件は、時に水素リッチな炭化水素分
子（フォトンフラックスと区別されるとおり）を指して用いられる用語である「軽質」を
生じる一方、縮合によって、比較的水素が欠乏したより重質の炭化水素分子もまた生じる
。この方法は、ホモリシスな、すなわち均一な分解を提供し、場合により上記に記載した
とおり酵素的に飽和していてもよいアルケンを生成する。
触媒法及び熱的方法は、植物において炭化水素処理及び油精製の標準である。従って本
明細書に記載されるとおりの細胞によって産生される炭化水素は、従来の手段によって収
集及び処理され、又は精製され得る。微細藻類により産生される炭化水素の水素化分解に
関する報告については、Ｈｉｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａ
ｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＸＸＩＶ：１９３−２０５（１９８２）
）を参照のこと。代替的実施形態において、画分は、有機化合物、熱、及び／又は無機化
合物などの別の触媒で処理される。脂質をバイオディーゼルに処理するため、本章で以下
に記載するとおり、エステル転移反応プロセスが用いられる。
本発明の方法によって生成される炭化水素は、様々な工業用途に有用である。例えば、
ほぼ全種の洗浄剤及びクリーニング用配合物に使用される陰イオン界面活性剤である直鎖
アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）の製造では、一般に１０〜１４個の炭素原子の
鎖を含む炭化水素が利用される。例えば、米国特許第６，９４６，４３０号明細書；同第
５，５０６，２０１号明細書；同第６，６９２，７３０号明細書；同第６，２６８，５１
７号明細書；同第６，０２０，５０９号明細書；同第６，１４０，３０２号明細書；同第
５，０８０，８４８号明細書；同第５，５６７，３５９号明細書を参照のこと。ＬＡＳな
どの界面活性剤は、米国特許第５，９４２，４７９号明細書；同第６，０８６，９０３号
明細書；同第５，８３３，９９９号明細書；同第６，４６８，９５５号明細書；同第６，
４０７，０４４号明細書に記載されるものなど、パーソナルケア組成物及び洗浄剤の製造
で使用することができる。
化石燃料由来の出発物質に代替し得る再生可能な生物学的出発物質が利用可能となり、
且つその使用が望ましいため、バイオディーゼル、再生可能ディーゼル、及びジェット燃
料などの燃料における生物学的起源の炭化水素成分の使用に関心が高まっている。生物学
的材料からの炭化水素成分の生成方法が、差し迫って必要とされている。本発明は、バイ
オディーゼル、再生可能ディーゼル、及びジェット燃料を製造するための生物学的材料と
して本明細書に記載される方法により生成される脂質を使用した、バイオディーゼル、再
生可能ディーゼル、及びジェット燃料の製造方法を提供することにより、この必要性を満
たす。
従来のディーゼル燃料は、パラフィン系炭化水素を豊富に含む石油蒸留物である。その
沸点範囲は３７０°Ｆ〜７８０°Ｆと広く、ディーゼルエンジン車両などの圧縮点火機関
での燃焼に好適である。米国材料試験協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ
Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ：ＡＳＴＭ）が、沸点範囲に加えて他の燃
料特性、例えばセタン価、雲り点、引火点、粘度、アニリン点、硫黄分、水分、灰分、銅
板腐食、及び残留炭素などの許容範囲に従いディーゼルの等級を規定している。技術的に
は、バイオマスに由来する任意の炭化水素蒸留材料又はその他適切なＡＳＴＭ規格に適合
するものを、ディーゼル燃料（ＡＳＴＭ Ｄ９７５）、ジェット燃料（ＡＳＴＭ Ｄ１６
５５）として、又はそれが脂肪酸メチルエステルである場合にはバイオディーゼル（ＡＳ
ＴＭ Ｄ６７５１）として定義することができる。
抽出後、本明細書に記載される微生物バイオマスから回収された脂質及び／又は炭化水
素成分を化学的処理に供し、ディーゼル車両及びジェットエンジンで使用される燃料を製
造することができる。
バイオディーゼルは液体であり、製造原料に応じて色が異なる（琥珀色乃至暗褐色）。
バイオディーゼルは水に対して実質的に不混和性であり、沸点が高く、且つ蒸気圧が低い
。バイオディーゼルは、ディーゼルエンジン車両で使用されるディーゼルと同等の処理燃
料を指す。バイオディーゼルは生分解性且つ非毒性である。従来のディーゼル燃料と比べ
たバイオディーゼルのさらなる利点は、エンジン摩耗の低さである。典型的には、バイオ
ディーゼルはＣ１４〜Ｃ１８アルキルエステルを含む。バイオマス又は本明細書に記載さ
れるとおり生成及び単離された脂質は、種々のプロセスによってディーゼル燃料に変換さ
れる。バイオディーゼルの好ましい生成方法は、本明細書に記載されるとおりの脂質のエ
ステル転移反応による。バイオディーゼルとしての使用に好ましいアルキルエステルは、
メチルエステル又はエチルエステルである。
本明細書に記載される方法によって生成されるバイオディーゼルは、単独で使用するこ
ともでき、又はほとんどの現代のディーゼルエンジン車両では従来のディーゼル燃料と任
意の濃度でブレンドすることもできる。バイオディーゼルは、従来のディーゼル燃料（石
油ディーゼル）とブレンドされる場合、約０．１％〜約９９．９％存在し得る。世界の大
部分で、任意の燃料混合物中のバイオディーゼルの量を記述するため、「Ｂ」ファクター
として知られるシステムが用いられている。例えば、２０％のバイオディーゼルを含有す
る燃料はＢ２０と表示される。純粋なバイオディーゼルはＢ１００と参照される。
バイオディーゼルは、油リッチなバイオマスに含まれるトリグリセリドのエステル転移
反応によって生成することができる。従って、本発明の別の態様では、バイオディーゼル
の生成方法が提供される。好ましい実施形態では、このバイオディーゼルの生成方法は、
（ａ）本明細書に開示される方法を用いて脂質含有微生物を培養する工程と、（ｂ）脂質
含有微生物を溶解して溶解物を生成する工程と、（ｃ）溶解した微生物から脂質を単離す
る工程と、（ｄ）脂質組成物をエステル転移反応させる工程とを含み、これによりバイオ
ディーゼルが生成される。微生物を成長させる方法、微生物を溶解して溶解物を生成する
方法、有機溶媒を含む培地で溶解物を処理することにより不均一混合物を形成する方法、
及び処理した溶解物を脂質組成物に分離する方法は上記に記載しており、バイオディーゼ
ルの製造方法においても用いられ得る。バイオディーゼルの脂質プロフィールは、通常、
原料油の脂質プロフィールと極めて類似している。
脂質組成物をエステル転移反応に供し、バイオディーゼルとして有用な長鎖脂肪酸エス
テルを得ることができる。好ましいエステル転移反応は以下に概説し、それには塩基触媒
エステル転移反応及び組換えリパーゼを使用したエステル転移反応が含まれる。塩基触媒
エステル転移反応プロセスでは、アルカリ触媒、典型的には水酸化カリウムの存在下で、
トリアシルグリセリドをアルコール、例えばメタノール又はエタノールと反応させる。こ
の反応により、メチル又はエチルエステル及び副産物としてのグリセリン（グリセロール
）が形成される。
エステル転移反応はまた、上記に考察したとおり、塩基の代わりにリパーゼなどの酵素
を使用しても実施されている。リパーゼ触媒エステル転移反応は、例えば、室温乃至８０
℃の温度、及び１：１より大きく、好ましくは約３：１のＴＡＧと低級アルコールとのモ
ル比で実施することができる。エステル転移反応における使用に好適なリパーゼとしては
、限定はされないが、表９に掲載されるものが挙げられる。エステル転移反応に有用なリ
パーゼの他の例が、例えば、米国特許第４，７９８，７９３号明細書；同第４，９４０，
８４５号明細書 同第５，１５６，９６３号明細書；同第５，３４２，７６８号明細書；
同第５，７７６，７４１号明細書及び国際公開第８９／０１０３２号パンフレットに掲載
されている。かかるリパーゼとしては、限定はされないが、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｉｚｏｍ
ｕｃｏｒ、Ｃａｎｄｉｄａ、及びＨｕｍｉｃｏｌａの微生物によって産生されるリパーゼ
並びに膵リパーゼが挙げられる。
バイオディーゼルが特に低温で使用される場合、続くプロセスもまた用いられ得る。か
かるプロセスには、脱ろう及び分画が含まれる。いずれのプロセスとも、雲り点（バイオ
ディーゼルが結晶化し始める温度）を低下させることにより燃料のコールドフロー及び冬
季性能を向上させるように設計される。バイオディーゼルの脱ろう手法はいくつかある。
一つの手法は、バイオディーゼルを石油ディーゼルとブレンドすることである。別の手法
は、バイオディーゼルの雲り点を低下させることのできる添加剤を使用することである。
別の手法は、添加剤を混ぜ入れて飽和物を結晶化させ、次に結晶をろ去することにより、
飽和メチルエステルを手当たり次第に除去することである。分画は、メチルエステルを個
々の成分又は画分に選択的に分離して、特定のメチルエステルの除去又は混入を可能にす
る。分画法には、尿素分画、溶媒分画及び熱蒸留が含まれる。
本発明の方法により提供される別の有益な燃料は再生可能ディーゼルであり、これは、
アルカン、例えばＣ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０及びＣ１８：０を含
み、従って、バイオディーゼルとは区別することができる。高品質再生可能ディーゼルは
ＡＳＴＭ Ｄ９７５規格に適合する。本発明の方法によって生成される脂質は、再生可能
ディーゼルを製造するための供給原料となり得る。従って、本発明の別の態様では、再生
可能ディーゼルの製造方法が提供される。再生可能ディーゼルは少なくとも３つのプロセ
ス、すなわち、熱水処理（水素処理）；水素化処理；及び間接液化により生成され得る。
これらのプロセスから、非エステル蒸留物が得られる。これらのプロセスの間、本明細書
に記載されるとおり生成及び単離されるトリアシルグリセリドは、アルカンに変換される
。
一実施形態において、再生可能ディーゼルの製造方法は、（ａ）本明細書に開示される
方法を用いて脂質含有微生物を培養する工程と、（ｂ）微生物を溶解して溶解物を生成す
る工程と、（ｃ）溶解した微生物から脂質を単離する工程と、（ｄ）脂質を脱酸素及び水
素処理してアルカンを生成する工程とを含み、これにより再生可能ディーゼルが生成され
る。再生可能ディーゼルの製造に好適な脂質は、微生物バイオマスからヘキサンなどの有
機溶媒を使用して抽出することによるか、又は米国特許第５，９２８，６９６号明細書に
記載されるものなど、他の方法によって得ることができる。一部の好適な方法には、機械
的な圧搾及び遠心が含まれ得る。
一部の方法では、微生物脂質は、初めにクラッキングを水素処理と併せて行うことによ
り、それぞれ炭素鎖長及び飽和二重結合を減少させる。次にこの材料を異性化し、これも
また水素処理と併用する。次にナフサ（ｎａｐｔｈａ）画分を蒸留によって除去し、続い
てさらに蒸留することにより、ＡＳＴＭ Ｄ９７５規格に適合するためにディーゼル燃料
中に求められる成分を気化させて蒸留し、一方で、Ｄ９７５規格に適合するために求めら
れる成分より重い成分は残すことができる。トリグリセリド油を含めた、化学的に改変さ
れた油の水素処理、水素化分解、脱酸素及び異性化方法は、当該技術分野において公知で
ある。例えば、欧州特許出願公開第１７４１７６８（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開
第１７４１７６７（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開第１６８２４６６（Ａ１）号明細
書；欧州特許出願公開第１６４０４３７（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開第１６８１
３３７（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開第１７９５５７６（Ａ１）号明細書；及び米
国特許第７，２３８，２７７号明細書；同第６，６３０，０６６号明細書；同第６，５９
６，１５５号明細書；同第６，９７７，３２２号明細書；同第７，０４１，８６６号明細
書；同第６，２１７，７４６号明細書；同第５，８８５，４４０号明細書；同第６，８８
１，８７３号明細書を参照のこと。
再生可能ディーゼルの製造方法の一実施形態において、脂質を処理してアルカンを生成
する工程は、脂質組成物を水素処理することにより実施される。熱水処理では、典型的に
は、バイオマスを高温及び高圧の水中で反応させて油及び残留固形物を形成する。変換温
度は、典型的には３００°Ｆ〜６６０°Ｆであり、圧力は、水を主に液体として保つのに
十分な１００〜１７０標準大気圧（ａｔｍ）である。反応時間は１５〜３０分程度である
。反応完了後、水から有機物を分離する。それによりディーゼルに好適な蒸留物が生成さ
れる。
再生可能ディーゼルを作製する一部の方法では、トリグリセリドを処理する初めの工程
は、二重結合を飽和させる水素化処理であり、次に水素及び触媒の存在下における高温で
の脱酸素が続く。一部の方法では、水素化及び脱酸素は同じ反応で起こる。他の方法では
、脱酸素は水素化より前に起こる。次に、場合により、同様に水素及び触媒の存在下で異
性化が実施される。ナフサ成分は、好ましくは蒸留によって除去される。例えば、米国特
許第５，４７５，１６０号明細書（トリグリセリドの水素化）；同第５，０９１，１１６
号明細書（脱酸素、水素化及びガス除去）；同第６，３９１，８１５号明細書（水素化）
；同第５，８８８，９４７号明細書（異性化）を参照のこと。
トリグリセリドを水素化するための一つの好適な方法には、銅、亜鉛、マグネシウム及
びランタンの塩の水溶液、並びにアルカリ金属又は好ましくは炭酸アンモニウムの別の溶
液の調製が含まれる。これらの２つの溶液を約２０℃〜約８５℃及の温度に加熱し、沈殿
容器のｐＨが５．５〜７．５に維持されるような速度で沈殿容器に一緒に秤量することに
より、触媒が形成され得る。追加の水を最初に沈殿容器に使用してもよく、又は塩溶液及
び沈殿溶液と同時に加えてもよい。次に得られた沈殿物を十分に洗浄し、乾燥させ、約３
００℃で焼成して、水素下約１００℃〜約４００℃の範囲の温度で活性化させ得る。次に
１つ以上のトリグリセリドを接触させ、反応槽において上述の触媒の存在下で水素と反応
させ得る。反応槽は、トリクルベッド反応槽、固定床気体−固体反応槽、充填気泡塔反応
槽、連続撹拌型タンク反応槽、スラリー相反応槽、又は当該技術分野において周知されて
いる任意の他の好適な反応槽タイプであってよい。このプロセスはバッチ式で行われても
よく、或いは連続方式で行われてもよい。反応温度は典型的には約１７０℃〜約２５０℃
の範囲である一方、反応圧力は典型的には約３００ｐｓｉｇ〜約２０００ｐｓｉｇの範囲
である。さらに、本発明のプロセスにおける水素とトリグリセリドとのモル比は、典型的
には約２０：１〜約７００：１の範囲である。このプロセスは、典型的には約０．１時間
−１〜約５時間−１の範囲の毎時重量空間速度（ＷＨＳＶ）で実施される。当業者は、用
いられる温度、水素とトリグリセリドとのモル比、及び水素の分圧によって、反応に要す
る時間が異なり得ることを認識するであろう。かかる水素化プロセスによって生成される
生成物には、脂肪アルコール、グリセロール、微量のパラフィン及び未反応のトリグリセ
リドが含まれる。これらの生成物は、典型的には従来の手段、例えば、蒸留、抽出、ろ過
、結晶化などによって分離される。
石油精製装置は、原材料を水素で処理することにより、水素化処理を使用して不純物を
除去する。水素化処理の変換温度は、典型的には３００°Ｆ〜７００°Ｆである。圧力は
、典型的には４０〜１００ａｔｍである。反応時間は、典型的には１０〜６０分程度であ
る。固体触媒を用いると、特定の反応速度が増加し、特定の生成物に対する選択性が向上
し、且つ水素消費が最適化される。
油の脱酸素に好適な方法には、油を約３５０°Ｆ〜約５５０°Ｆの範囲の温度に加熱し
、加熱した油を少なくともほぼ大気圧乃至それ以上の範囲の圧力下で少なくとも約５分間
窒素と連続的に接触させることが含まれる。
好適な異性化方法には、当該技術分野で周知されているアルカリ異性化及び他の油異性
化を用いることが含まれる。
水素処理及び水素化処理は、最終的にトリグリセリド原材料の分子量の低減をもたらす
。トリグリセリド分子は、水素化処理条件下で４つの炭化水素分子、すなわちプロパン分
子と、３つのより重い、典型的にはＣ８〜Ｃ１８範囲の炭化水素分子とに低減される。
従って、一実施形態において、本発明の脂質組成物に対して行われる１つ以上の化学反
応の生成物は、ＡＳＴＭ Ｄ９７５再生可能ディーゼルを含むアルカン混合物である。微
生物による炭化水素の生成について、Ｍｅｔｚｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００５）６６：４８６−４９６及びＡ Ｌｏｏｋ
Ｂａｃｋ ａｔ ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ
Ａｑｕａｔｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｐｒｏｇｒａｍ：Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ ｆｒｏｍ Ａ
ｌｇａｅ，ＮＲＥＬ／ＴＰ−５８０−２４１９０，Ｊｏｈｎ Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｔｅｒｒ
ｉ Ｄｕｎａｈａｙ，Ｊｏｈｎ Ｂｅｎｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｕｌ Ｒｏｅｓｓｌｅ
ｒ（１９９８）により概説されている。
ディーゼル燃料の蒸留特性は、Ｔ１０−Ｔ９０（それぞれ１０％及び９０％の容積が蒸
留されたときの温度）の点から記載される。実施例１３で生成された材料のＴ１０−Ｔ９
０は、５７．９℃であった。本明細書に開示される油の水素処理、異性化、及び他の共有
結合的改変の方法、並びに本明細書に開示される蒸留及び分画（冷温ろ過など）の方法を
用いることにより、本明細書に開示される方法に従い生成されるトリグリセリド油を使用
して、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０及び６５℃などの他のＴ１０−
Ｔ９０範囲の再生可能ディーゼル組成を生じさせることができる。
本明細書に開示される油の水素処理、異性化、及び他の共有結合的改変の方法、並びに
本明細書に開示される蒸留及び分画（冷温ろ過など）の方法を用いることにより、１８０
〜２９５、１９０〜２７０、２１０〜２５０、２２５〜２４５、及び少なくとも２９０の
Ｔ１０などの他のＴ１０値の再生可能ディーゼル組成を生じさせることができる。
本明細書に開示される油の水素処理、異性化、及び他の共有結合的改変の方法、並びに
本明細書に開示される蒸留及び分画（冷温ろ過など）の方法を用いることにより、２８０
〜３８０、２９０〜３６０、３００〜３５０、３１０〜３４０、及び少なくとも２９０の
Ｔ９０などの特定のＴ９０値の再生可能ディーゼル組成を生じさせることができる。
実施例１３で生成した材料のＦＢＰは３００℃であった。本明細書に開示される油の水
素処理、異性化、及び他の共有結合的改変の方法、並びに本明細書に開示される蒸留及び
分画（冷温ろ過など）の方法を用いることにより、２９０〜４００、３００〜３８５、３
１０〜３７０、３１５〜３６０、及び少なくとも３００のＦＢＰなどの他のＦＢＰ値の再
生可能ディーゼル組成を生じさせることができる。
本発明の方法及び組成によって生成される他の油は、（ａ）少なくとも１％〜５％、好
ましくは少なくとも４％のＣ８〜Ｃ１４；（ｂ）少なくとも０．２５％〜１％、好ましく
は少なくとも０．３％のＣ８；（ｃ）少なくとも１％〜５％、好ましくは少なくとも２％
のＣ１０；（ｄ）少なくとも１％〜５％、好ましくは少なくとも２％のＣ１２；及び（３
）少なくとも２０％〜４０％、好ましくは少なくとも３０％のＣ８〜Ｃ１４を含む脂質プ
ロフィールの油を含め、水素処理、異性化、及び他の共有結合性改変の組み合わせに供し
てもよい。
従来の超低硫黄ディーゼルは、任意の形態のバイオマスから二段階プロセスにより製造
され得る。第一に、バイオマスが、水素及び一酸化炭素リッチなガス状混合物であるシン
ガスに変換される。次に、このシンガスが液体に触媒変換される。典型的には、液体の生
成は、フィッシャー・トロプシュ（ＦＴ）合成を用いて達成される。この技術は石炭、天
然ガス、及び重油に応用されている。従って、再生可能ディーゼルの製造方法のさらに別
の好ましい実施形態において、脂質組成物を処理することによりアルカンを生成する工程
は、脂質組成物の間接液化によって行われる。
本発明はまた、ジェット燃料の製造方法も提供する。ジェット燃料は、透明乃至淡黄色
である。最も一般的な燃料は、航空機用Ａ−１（Ａｅｒｏｐｌａｎｅ Ａ−１）に分類さ
れる無鉛／パラフィン油系燃料であり、これは国際的に標準化された一連の規格に合わせ
て製造される。ジェット燃料は、千種又はそれを超えて多い可能性もある多数の異なる炭
化水素の混合物である。そのサイズ（分子量又は炭素数）の範囲は、生成物の要件、例え
ば凝固点又は発煙点によって制限される。ケロシン系の航空機用燃料（Ｊｅｔ Ａ及びＪ
ｅｔ Ａ−１を含む）は、約８〜１６炭素数の炭素数分布を有する。ワイドカット系又は
ナフサ系航空機用燃料（Ｊｅｔ Ｂを含む）は、典型的には約５〜１５炭素の炭素数分布
を有する。
本発明の一実施形態では、藻類燃料を既存のジェット燃料とブレンドすることによりジ
ェット燃料が製造される。本発明の方法によって生成される脂質は、ジェット燃料を製造
するための供給原料となり得る。従って、本発明の別の態様において、ジェット燃料の製
造方法が提供される。本明細書によって、本発明の方法により生成される脂質からジェッ
ト燃料を製造する２つの方法、すなわち流動接触クラッキング（ＦＣＣ）及び水素化脱酸
素（ＨＤＯ）が提供される。
流動接触クラッキング（ＦＣＣ）は、重質粗油画分からのオレフィン、特にプロピレン
の生成に用いられる一つの方法である。本発明の方法によって生成される脂質はオレフィ
ンに変換することができる。このプロセスには、生成された脂質をＦＣＣゾーンに流し、
ジェット燃料として有用な、オレフィンを含む生成物流を収集することが含まれる。生成
された脂質がクラッキング条件でクラッキング触媒と接触することにより、ジェット燃料
として有用なオレフィン及び炭化水素を含む生成物流が提供される。
一実施形態において、ジェット燃料の製造方法は、（ａ）本明細書に開示される方法を
用いて脂質含有微生物を培養する工程と、（ｂ）脂質含有微生物を溶解することにより溶
解物を生成する工程と、（ｃ）溶解物から脂質を単離する工程と、（ｄ）脂質組成物を処
理する工程とを含み、これによりジェット燃料が製造される。ジェット燃料の製造方法の
一実施形態では、脂質組成物を流動接触クラッキングゾーンに流すことができ、これは、
一実施形態では、脂質組成物をクラッキング条件でクラッキング触媒と接触させることに
より、Ｃ２〜Ｃ５オレフィンを含む生成物流を提供することを含み得る。
この方法の特定の実施形態では、脂質組成物中に存在し得るいかなる汚染物質も除去す
ることが望ましいとされ得る。従って、脂質組成物を流動接触クラッキングゾーンに流す
前に、脂質組成物が前処理される。前処理には、脂質組成物をイオン交換樹脂と接触させ
ることが含まれ得る。イオン交換樹脂は酸性イオン交換樹脂、例えばＡｍｂｅｒｌｙｓｔ
（商標）−１５であり、脂質組成物が上向流又は下向流のいずれかで流れる反応槽中の床
層として使用することができる。他の前処理には、硫酸、酢酸、硝酸、又は塩酸などの酸
に脂質組成物を接触させることによる弱酸洗浄が含まれ得る。接触は、通常周囲温度及び
大気圧下、希釈酸性溶液で行われる。
場合により前処理された脂質組成物はＦＣＣゾーンに流れ、そこで炭化水素系成分がオ
レフィンへとクラッキングされる。触媒クラッキングは、反応ゾーンにおいて、微粉化さ
れた粒子状物質で構成される触媒に脂質組成物を接触させることにより達成される。水素
化分解とは対照的に、この反応は触媒クラッキングであり、水素の添加又は水素の消費な
しに行われる。クラッキング反応が進むに従い、触媒に相当量のコークスが堆積する。こ
の触媒は、再生ゾーンで触媒からコークスを燃焼させることにより、高温で再生される。
コークスを含有する触媒は、本明細書では「コークス化触媒」と称され、反応ゾーンから
再生ゾーンへと連続的に輸送されて再生され、再生ゾーンからの本質的にコークスを含ま
ない再生触媒に置き換わる。様々なガス流による触媒粒子の流動化が、反応ゾーンと再生
ゾーンとの間の触媒の輸送を可能にする。流動化された触媒流中における、本明細書に記
載される脂質組成物の炭化水素など炭化水素のクラッキング方法、反応ゾーンと再生ゾー
ンとの間での触媒の輸送方法、及び再生器におけるコークスの燃焼方法は、ＦＣＣプロセ
スの当業者には周知されている。例示的なＦＣＣ適用及び脂質組成物のクラッキングによ
るＣ２〜Ｃ５オレフィンの製造に有用な触媒が、米国特許第６，５３８，１６９号明細書
、同第７，２８８，６８５号明細書（これらは全体として参照により援用される）に記載
される。
好適なＦＣＣ触媒は、概して、同じマトリックス上にあっても又はなくてもよい少なく
とも２つの成分を含む。一部の実施形態では、２つの成分は両方とも反応槽全体にわたっ
て循環し得る。第１の成分は、概して、活性非晶質粘土タイプの触媒及び／又は高活性結
晶性分子篩など、流動接触クラッキングの技術分野で使用される周知の触媒のいずれかを
含む。分子篩触媒は所望の生成物に対する選択性が大幅に向上しているため、非晶質触媒
と比べて好ましいこともある。一部の好ましい実施形態では、ＦＣＣプロセスにおける分
子篩としてゼオライトが使用される。好ましくは、第１の触媒成分が、大孔ゼオライト、
例えばＹ型ゼオライト、活性アルミナ材料、バインダー材料（シリカ又はアルミナのいず
れかを含むもの）及びカオリンなどの不活性充填剤を含む。
一実施形態において、本発明の脂質組成物のクラッキングは、ＦＣＣゾーンのライザー
部、或いはリフト部で行われる。脂質組成物は、脂質組成物の急速蒸発を生じさせるノズ
ルによってライザーに導入される。触媒との接触前、脂質組成物の温度は通常約１４９℃
〜約３１６℃（３００°Ｆ〜６００°Ｆ）であり得る。触媒がブレンド容器からライザー
に流れ、そこで触媒が約２秒以下の間にわたり脂質組成物と接触する。
ブレンドされた触媒及び反応脂質組成物の蒸気は、次にライザーの上から出口を通って
吐き出され、オレフィンを含むクラッキング後の生成物蒸気流と、相当量のコークスで被
覆された、概して「コークス化触媒」と称される一群の触媒粒子とに分けられる。脂質組
成物と触媒との接触時間を最小限に抑えるため（これは所望の生成物から不要な他の生成
物へのさらなる変換を促進し得る）、旋回アーム装置などの任意のセパレータ装置を使用
して、生成物流からコークス化触媒を速やかに除去することができる。セパレータ、例え
ば旋回アームセパレータがチャンバの上部に位置し、ストリッピングゾーンがチャンバの
下部にある。旋回アーム装置により分離された触媒はストリッピングゾーンに落ちる。軽
質オレフィンを含む分解炭化水素と一部の触媒とを含む分解生成物蒸気流が、導管を通っ
てチャンバを出て、この導管はサイクロンと連通している。サイクロンによって生成物蒸
気流から残りの触媒粒子が除去され、粒子濃度が超低濃度に低下する。次に生成物蒸気流
が分離容器の上から出る。サイクロンによって分離された触媒は分離容器に戻され、次に
ストリッピングゾーンに戻される。ストリッピングゾーンは、蒸気との向流接触によって
触媒の表面から吸着炭化水素を除去する。
低い炭化水素分圧は、軽質オレフィンの生成に有利に働く。従って、ライザー圧力は約
１７２〜２４１ｋＰａ（２５〜３５ｐｓｉａ）、炭化水素分圧は約３５〜１７２ｋＰａ（
５〜２５ｐｓｉａ）に設定され、好ましい炭化水素分圧は約６９〜１３８ｋＰａ（１０〜
２０ｐｓｉａ）である。炭化水素のこの比較的低い分圧は、希釈剤が脂質組成物の１０〜
５５ｗｔ％、好ましくは脂質組成物の約１５ｗｔ％である範囲で蒸気を希釈剤として使用
することにより実現される。乾性ガスなどの他の希釈剤を使用して、同等の炭化水素分圧
を達成することができる。
ライザー出口の分解流の温度は約５１０℃〜６２１℃（９５０°Ｆ〜１１５０°Ｆ）と
なる。しかしながら、ライザー出口温度が５６６℃（１０５０°Ｆ）を上回ると、ガスが
一層乾燥し、オレフィンが増す。一方、ライザー出口温度が５６６℃（１０５０°Ｆ）を
下回ると、エチレン及びプロピレンが減る。従って、ＦＣＣプロセスは、約５６６℃〜約
６３０℃の好ましい温度、約１３８ｋＰａ〜約２４０ｋＰａ（２０〜３５ｐｓｉａ）の好
ましい圧力で実施することが好ましい。別のプロセス条件は触媒の対脂質組成物比であり
、これは約５から約２０、好ましくは約１０から約１５まで異なり得る。
ジェット燃料の製造方法の一実施形態では、脂質組成物がＦＣＣ反応槽のリフト部に導
入される。リフト部の温度は極めて高く、約７００℃（１２９２°Ｆ）〜約７６０℃（１
４００°Ｆ）の範囲となり、触媒の対脂質組成物比は約１００〜約１５０である。脂質組
成物をリフト部に導入すると、多量のプロピレン及びエチレンが生じることが予想される
。
本明細書に記載されるとおり生成された脂質組成物又は脂質を使用したジェット燃料の
製造方法の別の実施形態では、脂質組成物又は脂質の構造が、水素化脱酸素（ＨＤＯ）と
称されるプロセスによって壊される。ＨＤＯは、水素を用いた酸素の除去を意味し、すな
わち、材料の構造を壊しながら酸素が除去される。オレフィン二重結合が水素化され、任
意の硫黄及び窒素化合物が除去される。硫黄の除去は水素化脱硫（ＨＤＳ）と呼ばれる。
原材料（脂質組成物又は脂質）の前処理及び純度が、触媒の有効寿命に寄与する。
一般に、ＨＤＯ／ＨＤＳ工程では、水素を供給原料（脂質組成物又は脂質）と混合し、
次に混合物を並流として、単相或いは二相供給原料として触媒床に通す。ＨＤＯ／ＭＤＳ
工程の後、生成物画分が分離され、別個の異性化反応槽に送られる。生物学的出発物質用
の異性化反応槽については、文献（ＦＩ １００ ２４８）に並流反応槽として記載され
ている。
供給炭化水素、例えば本明細書では脂質組成物又は脂質を水素化することによる燃料の
製造方法はまた、脂質組成物又は脂質を水素ガスと共に並流として第１の水素化ゾーンに
通して実施することもでき、その後、水素ガスを第２の水素化ゾーンに流出炭化水素に対
する向流として通すことにより、流出炭化水素が第２の水素化ゾーンでさらに水素化され
る。Ｃ２〜Ｃ５オレフィンを生成するための脂質組成物のクラッキングに有用な例示的Ｈ
ＤＯ適用及び触媒が、米国特許第７，２３２，９３５号明細書（全体として参照により援
用される）に記載されている。
典型的には、水素化脱酸素工程では、本明細書における脂質組成物又は脂質などの生物
学的成分の構造が分解され、酸素、窒素、リン及び硫黄化合物、並びにガスとしての軽質
炭化水素が除去され、及びオレフィン結合が水素化される。このプロセスの第２の工程で
は、すなわちいわゆる異性化工程では、炭化水素鎖の分枝及び低温でのパラフィン性能の
向上のため、異性化が実施される。
クラッキングプロセスの第１の工程、すなわちＨＤＯ工程では、水素ガス及び水素化す
る本明細書の脂質組成物又は脂質が、並流又は向流のいずれかとしてＨＤＯ触媒床システ
ムに送り込まれ、前記触媒床システムは１つ以上の触媒床、好ましくは１〜３つの触媒床
を含む。ＨＤＯ工程は、典型的には並流方式で動作する。２つ以上の触媒床を含むＨＤＯ
触媒床システムの場合、床のうち１つ以上を向流原理を用いて動作させてもよい。ＨＤＯ
工程では、圧力は２０〜１５０バールの間、好ましくは５０〜１００バールの間で異なり
、温度は２００〜５００℃の間、好ましくは３００〜４００℃の範囲で異なる。ＨＤＯ工
程では、周期律表第ＶＩＩ族及び／又は第ＶＩＢ族の金属を含有する周知の水素化触媒が
使用され得る。好ましくは、水素化触媒は担持Ｐｄ、Ｐｔ、Ｎｉ、ＮｉＭｏ又はＣｏＭｏ
触媒であり、担体はアルミナ及び／又はシリカである。典型的には、ＮｉＭｏ／Ａｌ２Ｏ
３及びＣｏＭｏ／Ａｌ２Ｏ３触媒が使用される。
ＨＤＯ工程の前に、場合により本明細書の脂質組成物又は脂質は、より穏和な条件下で
、従って二重結合の副反応を回避して予備的に水素化処理され得る。かかる予備水素化は
、予備水素化触媒の存在下、５０〜４００℃の温度及び１〜２００バールの水素圧、好ま
しくは１５０〜２５０℃の温度及び１０〜１００バールの水素圧で実施される。触媒は、
周期律表第ＶＩＩＩ族及び／又は第ＶＩＢ族の金属を含有し得る。好ましくは、予備水素
化触媒は担持Ｐｄ、Ｐｔ、Ｎｉ、ＮｉＭｏ又はＣｏＭｏ触媒であり、担体はアルミナ及び
／又はシリカである。
水素を含有するＨＤＯ工程のガス流が冷却され、次にそれから一酸化炭素、二酸化炭素
、窒素、リン及び硫黄化合物、ガス状軽質炭化水素及び他の不純物が除去される。圧縮後
、精製水素又は再生水素が第１の触媒床及び／又は触媒床の間に戻され、抜き取られたガ
ス流を補う。濃縮液体から水が除去される。この液体が第１の触媒床又は触媒床間に送り
込まれる。
ＨＤＯ工程の後、生成物は異性化工程に供される。このプロセスには、炭化水素を異性
化触媒と接触させる前に可能な限り完全に不純物を除去することが重要である。異性化工
程は任意選択のストリッピング工程を含み、ここではＨＤＯ工程からの反応生成物が、水
蒸気又は好適なガス、例えば、軽質炭化水素、窒素又は水素によるストリッピングにより
精製され得る。任意選択のストリッピング工程は、異性化触媒の上流のユニットにおいて
向流方式で実施されるか（ここではガスと液体とが互いに接触する）、又は実際の異性化
反応槽の前に、別個のストリッピングユニットにおいて向流原理を利用して実施される。
ストリッピング工程の後、水素ガス及び本明細書の水素化された脂質組成物又は脂質、
及び場合によりｎ−パラフィン混合物が、１つ又はいくつかの触媒床を含む反応異性化ユ
ニットに送り込まれる。異性化工程の触媒床は並流方式又は向流方式のいずれで動作して
もよい。
このプロセスについては、異性化工程で向流原理が適用されることが重要である。異性
化工程では、これは任意選択のストリッピング工程又は異性化反応工程の一方又は両方を
向流方式で実施することにより行われる。異性化工程では、圧力は２０〜１５０バールの
範囲、好ましくは２０〜１００バールの範囲で異なり、温度は２００〜５００℃、好まし
くは３００〜４００℃である。異性化工程では、当該技術分野において公知の異性化触媒
が使用され得る。好適な異性化触媒は、分子篩及び／又は第ＶＩＩ族の金属及び／又は担
体を含有する。好ましくは、異性化触媒は、ＳＡＰＯ−１１若しくはＳＡＰＯ４１又はＺ
ＳＭ−２２若しくはＺＳＭ−２３又はフェリエライト及びＰｔ、Ｐｄ又はＮｉ及びＡｌ２
Ｏ３又はＳｉＯ２を含有する。典型的な異性化触媒は、例えば、Ｐｔ／ＳＡＰＯ−１１／
Ａｌ２Ｏ３、Ｐｔ／ＺＳＭ−２２／Ａｌ２Ｏ３、Ｐｔ／ＺＳＭ−２３／Ａｌ２Ｏ３及びＰ
ｔ／ＳＡＰＯ−１１／ＳｉＯ２である。異性化工程とＨＤＯ工程とは、同じ圧力容器で、
又は別個の圧力容器で実施されてもよい。任意選択の予備水素化は、別個の圧力容器で、
又はＨＤＯ工程及び異性化工程と同じ圧力容器で実施されてもよい。
従って、一実施形態において、１つ以上の化学反応の生成物は、ＨＲＪ−５を含むアル
カン混合物である。別の実施形態において、１つ以上の化学反応の生成物は、ＡＳＴＭ
Ｄ１６５５ジェット燃料を含むアルカン混合物である。一部の実施形態では、ＡＳＴＭ
１６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、１０ｐｐｍ未満の硫黄分を有する。他の
実施形態では、ＡＳＴＭ １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、２０５℃未満
の蒸留曲線のＴ１０値を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ １６５５ジェット燃
料規格に適合する組成物は、３００℃未満の終沸点（ＦＢＰ）を有する。別の実施形態に
おいて、ＡＳＴＭ １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、少なくとも３８℃の
引火点を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ １６５５ジェット燃料規格に適合す
る組成物は、７７５Ｋ／Ｍ３〜８４０Ｋ／Ｍ３の密度を有する。さらに別の実施形態にお
いて、ＡＳＴＭ １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、−４７℃未満の凝固点
を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ １６５５ジェット燃料規格に適合する組成
物は、少なくとも４２．８ＭＪ／Ｋの真燃焼熱を有する。別の実施形態において、ＡＳＴ
Ｍ １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、少なくとも１３．４質量％の水素分
を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ １６５５ジェット燃料規格に適合する組成
物は、２６０℃で定量重量分析ＪＦＴＯＴによって試験したとき、３ｍｍＨｇ未満である
熱安定性を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ １６５５ジェット燃料規格に適合
する組成物は、７ｍｇ／ｄｌ未満の実在ガムを有する。
従って、本発明は、微細藻類脂質の化学的改変を行うことにより様々な工業用途及び他
の用途で有用な生成物を得る様々な方法を開示する。本明細書に開示される方法によって
生成される油の改変方法の例としては、限定はされないが、油の加水分解、油の水素化処
理、及び油のエステル化が挙げられる。微細藻類脂質の他の化学的改変としては、限定な
しに、エポキシ化、酸化、加水分解、硫酸化、スルホン化、エトキシ化、プロポキシル化
、アミド化、及び鹸化が挙げられる。微細藻類油の改変により基礎油脂化学品が生成され
、これをさらに、所望の機能のための選択された誘導油脂化学品に改変することができる
。上記に燃料製造方法に関連して記載した方法と同様の方法で、本明細書に記載される微
生物培養物から産生された油に対してこれらの化学的改変を実施することもできる。基礎
油脂化学品の例としては、限定はされないが、石鹸、脂肪酸、脂肪エステル、脂肪アルコ
ール、脂肪アミドを含む脂肪窒素化合物、脂肪酸メチルエステル、及びグリセロールが挙
げられる。誘導油脂化学品の例としては、限定はされないが、脂肪ニトリル、エステル、
ダイマー酸、第四級アンモニウム化合物（ｑｕａｔｓ）（ベタインを含む）、界面活性剤
、脂肪アルカノールアミド、脂肪アルコールスルフェート、樹脂、乳化剤、脂肪アルコー
ル、オレフィン、掘削泥水、ポリオール、ポリウレタン、ポリアクリレート、ゴム、ロウ
ソク、化粧品、金属石鹸、石鹸、α−スルホン酸化メチルエステル、脂肪アルコールスル
フェート、脂肪アルコールエトキシレート、脂肪アルコールエーテルスルフェート、イミ
ダゾリン、界面活性剤、洗浄剤、エステル、第四級アンモニウム化合物（ｑｕａｔｓ）（
ベタインを含む）、オゾン分解生成物、脂肪アミン、脂肪アルカノールアミド、エトキシ
スルフェート、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド（中鎖トリグリセリドを
含む）、潤滑剤、油圧作動油、グリース、誘電性流体、離型剤、金属加工液、熱伝導流体
、他の機能性流体、工業化学品（例えば、クリーナー、繊維加工助剤、可塑剤、安定化剤
、添加剤）、表面コーティング、ペンキ及びラッカー、電気配線絶縁体、及び高級アルカ
ンが挙げられる。他の誘導体としては、脂肪アミドアミン類、アミドアミンカルボキシレ
ート類、アミドアミンオキシド類、アミドアミンオキシドカルボキシレート類、アミドア
ミンエステル類、エタノールアミンアミド類、スルホネート類、アミドアミンスルホネー
ト類、ジアミドアミンジオキシド類、スルホン化アルキルエステルアルコキシレート類、
ベタイン類、四級化（ｑｕａｒｔｅｒｎｉｚｅｄ）ジアミドアミンベタイン類、及びスル
ホベタイン類が挙げられる。
本発明の方法によって生成されるグリセロ脂質の脂肪酸構成要素の加水分解により、他
の有用な化学品を生成するため誘導体化することのできる遊離脂肪酸が得られる。加水分
解は、水と、酸又は塩基のいずれかであってよい触媒との存在下で起こる。放出された遊
離脂肪酸を誘導体化することにより、以下に報告されるとおり様々な生成物を産生するこ
とができる：米国特許第５，３０４，６６４号明細書（高度に硫酸化された脂肪酸）；同
第７，２６２，１５８号明細書（クレンジング組成物）；同第７，１１５，１７３号明細
書（織物柔軟剤組成物）；同第６，３４２，２０８号明細書（皮膚処置用のエマルション
）；同第７，２６４，８８６号明細書（撥水組成物）；同第６，９２４，３３３（ペンキ
添加剤）；同第６，５９６，７６８号明細書（脂質リッチの反芻動物飼料）；同第６，３
８０，４１０号明細書（洗浄剤及びクリーナー用の界面活性剤）。
一部の方法では、化学的改変の第１の工程は、水素化処理により二重結合を飽和させ、
続いて水素及び触媒の存在下、高温で脱酸素することであり得る。他の方法では、水素化
と脱酸素とを同じ反応内で行ってもよい。さらに他の方法では、脱酸素は水素化前に行わ
れる。次に場合により異性化が、同様に水素及び触媒の存在下で実施されてもよい。最後
に、必要であればガス及びナフサ成分を除去することができる。例えば、米国特許第５，
４７５，１６０号明細書（トリグリセリドの水素化）；同第５，０９１，１１６号明細書
（脱酸素、水素化及びガス除去）；同第６，３９１，８１５号明細書（水素化）；同第５
，８８８，９４７号明細書（異性化）を参照のこと。
本発明の一部の実施形態では、トリグリセリド油は部分的に又は完全に脱酸素される。
脱酸素反応により、限定はされないが、脂肪酸、脂肪アルコール、ポリオール、ケトン、
及びアルデヒドを含めた所望の生成物が形成される。一般に、いかなる特定の理論によっ
ても制限されることなしに、脱酸素反応は、限定なしに水素化分解、水素化、連続水素化
−水素化分解、連続水素化分解−水素化、及び併用される水素化−水素化分解反応を含め
た、様々な異なる反応経路の組み合わせを含み、脂肪酸又は脂肪酸エステルからの酸素の
少なくとも部分的な除去を生じさせることにより、さらなる処理によって所望の化学品に
容易に変換することのできる反応生成物、例えば脂肪アルコールを生成する。例えば、一
実施形態において、脂肪アルコールがＦＣＣ反応によってオレフィンに変換されてもよく
、又は縮合反応によって高級アルカンに変換されてもよい。
かかる化学的改変の一つは水素化であり、これは、グリセロ脂質又は遊離脂肪酸の脂肪
酸構成要素の二重結合に水素を添加するものである。水素化プロセスは、特定の用途によ
り好適であり得る半固体又は固体脂肪への液体油の転換を可能にする。
本明細書に記載される方法により生成される油の水素化は、以下に報告されるとおり、
本明細書に提供される方法及び／又は材料の１つ以上と併せて実施することができる：米
国特許第７，２８８，２７８号明細書（食品添加剤又は薬剤）；同第５，３４６，７２４
号明細書（潤滑製品）；同第５，４７５，１６０号明細書（脂肪アルコール）；同第５，
０９１，１１６号明細書（食用油）；同第６，８０８，７３７号明細書（マーガリン及び
スプレッド用構造脂肪）；同第５，２９８，６３７号明細書（低カロリー脂肪代用物）；
同第６，３９１，８１５号明細書（水素化触媒及び硫黄吸着剤）；同第５，２３３，０９
９号明細書及び同第５，２３３，１００号明細書（脂肪アルコール）；同第４，５８４，
１３９号明細書（水素化触媒）；同第６，０５７，３７５号明細書（泡止め剤）；同第７
，１１８，７７３号明細書（食用エマルションスプレッド）。
当業者は、様々なプロセスを用いて炭水化物を水素化し得ることを認識するであろう。
一つの好適な方法としては、水素化反応槽において水素化生成物が形成されるのに十分な
条件下で炭水化物を水素又は好適なガスと混合された水素及び触媒と接触させることが挙
げられる。水素化触媒は、概して、Ｃｕ、Ｒｅ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｒｕ、Ｐｄ、Ｒｈ、
Ｐｔ、Ｏｓ、Ｉｒ、及び合金又はそれらの任意の組み合わせを、単独で、或いはＷ、Ｍｏ
、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｒ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｓｎ、Ｂ、Ｐ、Ｂｉ、及び合金又はそれらの任意の組
み合わせなどの助触媒と共に含むことができる。他の有効な水素化触媒材料としては、担
持ニッケルか、或いはレニウムで修飾されたルテニウムが挙げられる。ある実施形態では
、水素化触媒はまた、触媒の所望の機能性に応じた担体のうちいずれか一つも含む。水素
化触媒は、当業者に公知の方法によって調製され得る。
一部の実施形態では、水素化触媒には、担持第ＶＩＩＩ族金属触媒及び金属スポンジ材
料（例えばスポンジニッケル触媒）が含まれる。ラネーニッケルは、この発明での使用に
好適な活性スポンジニッケル触媒の例を提供する。他の実施形態では、本発明における水
素化反応は、ニッケル−レニウム触媒又はタングステン修飾ニッケル触媒を含む触媒を使
用して実施される。本発明の水素化反応に好適な触媒の一例は、炭素担持ニッケル−レニ
ウム触媒である。
ある実施形態では、重量単位でほぼ等量のニッケル及びアルミニウムの合金を、約２５
重量％の水酸化ナトリウムを例えば含有するアルカリ水溶液で処理することにより、好適
なラネーニッケル触媒が調製されてもよい。アルミニウムはアルカリ水溶液に選択的に溶
解し、大部分がニッケルで少量のアルミニウムを含むスポンジ型材料をもたらす。初期合
金は、形成されたスポンジニッケル触媒中に約１〜２重量％が残るような量の助触媒金属
（すなわちモリブデン又はクロム）を含む。別の実施形態では、水素化触媒は、水中のト
リニトラトニトロシルルテニウム（ＩＩＩ）、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）の溶液を使用し
、好適な担体材料を含浸させて調製される。次に溶液を乾燥させ、含水量が約１重量％未
満の固体を形成する。次に固体を回転式ボール炉において４時間、大気圧下３００℃（焼
成なし）又は４００℃（焼成あり）の水素流中で還元してもよい。冷却し、且つ窒素で触
媒を不活性化した後、窒素中５容積％の酸素が触媒に２時間送られる。
特定の実施形態において、記載される触媒は触媒担体を含む。触媒担体は触媒を安定化
させ、担持する。使用される触媒担体の種類は、選択した触媒及び反応条件に依存する。
本発明に好適な担体としては、限定はされないが、炭素、シリカ、シリカ−アルミナ、ジ
ルコニア、チタニア、セリア、バナジア、窒化物、窒化ホウ素、ヘテロポリ酸、ヒドロキ
シアパタイト、酸化亜鉛、クロミア、ゼオライト、カーボンナノチューブ、炭素フラーレ
ン及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
この発明で使用される触媒は、当業者に公知の従来の方法を用いて調製することができ
る。好適な方法としては、限定はされないが、初期湿潤、蒸発含浸、化学蒸着、洗浄−コ
ーティング、マグネトロンスパッタリング技術などを挙げることができる。
水素化反応を実施するための条件は、出発物質の種類及び所望の生成物に基づき異なり
得る。当業者は、本開示の利益をもって、適切な反応条件を認識するであろう。一般に、
水素化反応は８０℃〜２５０℃の温度で、好ましくは９０℃〜２００℃で、最も好ましく
は１００℃〜１５０℃で行われる。一部の実施形態では、水素化反応は５００ＫＰａ〜１
４０００ＫＰａの圧力で行われる。
本発明の水素化分解反応で使用される水素には、外部水素、再生水素、現場で発生する
水素、及びそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。本明細書で使用されるとき、用語「
外部水素」は、バイオマス反応それ自体から生じるのではなく、むしろ別の供給源からそ
の系に添加される水素を指す。
本発明の一部の実施形態では、出発炭水化物をより小さい分子に変換し、所望の高級炭
化水素への変換を容易にすることが望ましい。この変換に好適な一つの方法は、水素化分
解反応によるものである。炭水化物の水素化分解の実施については、様々なプロセスが知
られている。一つの好適な方法としては、水素化分解反応槽においてより小さい分子又は
ポリオールを含む反応生成物が形成されるのに十分な条件下で炭水化物を水素又は好適な
ガスと混合された水素及び水素化分解触媒と接触させることが挙げられる。本明細書で使
用されるとき、用語「より小さい分子又はポリオール」は、より低い分子量を有する任意
の分子を含み、これは出発炭水化物より少ない炭素原子数又は酸素原子数を含み得る。あ
る実施形態では、反応生成物は、ポリオール及びアルコールを含むより小さい分子を含む
。一部の当業者は、水素化分解反応の実施に適切な方法を選択することが可能であろう。
一部の実施形態では、五炭糖及び／又は六炭糖又は糖アルコールを、水素化分解触媒を
使用してプロピレングリコール、エチレングリコール、及びグリセロールに変換してもよ
い。水素化分解触媒は、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｒｅ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｃｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、
Ｐｔ、Ｐｄ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｉｒ、Ｏｓ、及び合金又はそれらの任意の組み合わせを、単独
で、或いはＡｕ、Ａｇ、Ｃｒ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｓｎ、Ｂｉ、Ｂ、Ｏ、及び合金又はそれらの
任意の組み合わせなどの助触媒と共に含み得る。水素化分解触媒はまた、遷移金属（例え
ば、クロム、モリブデン、タングステン、レニウム、マンガン、銅、カドミウム）又は第
ＶＩＩＩ族金属（例えば、鉄、コバルト、ニッケル、白金、パラジウム、ロジウム、ルテ
ニウム、イリジウム、及びオスミウム）を含有する炭素質パイロポリマー触媒も含み得る
。特定の実施形態において、水素化分解触媒は、アルカリ土類金属酸化物と組み合わせる
か、又は触媒活性担体に付着した上記の金属のいずれかを含み得る。特定の実施形態にお
いて、水素化分解反応において記載される触媒には、水素化反応について上記に記載した
とおりの触媒担体が含まれ得る。
水素化分解反応を実施するための条件は、出発物質の種類及び所望の生成物に基づき異
なり得る。当業者は、本開示の利益をもって、反応の実施に用いるのに適切な条件を認識
するであろう。一般に、水素化分解反応は１１０℃〜３００℃の温度、好ましくは１７０
℃〜２２０℃、最も好ましくは２００℃〜２２５℃で行われる。一部の実施形態では、水
素化分解反応は塩基性条件下、好ましくは８〜１３のｐＨ、さらにより好ましくは１０〜
１２のｐＨで行われる。一部の実施形態では、水素化分解反応は、６０ＫＰａ〜１６５０
０ＫＰａの範囲、好ましくは１７００ＫＰａ〜１４０００ＫＰａ、さらにより好ましくは
４８００ＫＰａ〜１１０００ＫＰａの範囲の圧力で行われる。
本発明の水素化分解反応で使用される水素には、外部水素、再生水素、現場で発生する
水素、及びそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
一部の実施形態では、上記で考察する反応生成物は、縮合反応槽において縮合反応によ
って高級炭化水素に変換されてもよい。かかる実施形態において、反応生成物の縮合は、
高級炭化水素を形成することが可能な触媒の存在下で起こる。理論によって制限されるこ
とを意図するものではないが、高級炭化水素の生成は、炭素−炭素結合、又は炭素−酸素
結合の形成を含め、段階的な付加反応によって進むものと考えられる。得られる反応生成
物は、以下にさらに詳細に記載するとおり、これらの部分を含有する任意の数の化合物を
含む。
特定の実施形態において、好適な縮合触媒には、酸触媒、塩基触媒、又は酸／塩基触媒
が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「酸／塩基触媒」は、酸及び塩基の両方の
機能性を有する触媒を指す。一部の実施形態では、縮合触媒として、限定なしに、ゼオラ
イト、カーバイド、窒化物、ジルコニア、アルミナ、シリカ、アルミノケイ酸塩、リン酸
塩、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化バナジウム、酸化ランタン、酸化イットリウム、酸化ス
カンジウム、酸化マグネシウム、酸化セリウム、酸化バリウム、酸化カルシウム、水酸化
物、ヘテロポリ酸、無機酸、酸修飾した樹脂、塩基修飾した樹脂、及びそれらの任意の組
み合わせを挙げることができる。一部の実施形態では、縮合触媒にはまた、改変剤も含ま
れ得る。好適な改変剤としては、Ｌａ、Ｙ、Ｓｃ、Ｐ、Ｂ、Ｂｉ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ
、Ｃｓ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。一部の
実施形態では、縮合触媒にはまた、金属も含まれ得る。好適な金属としては、Ｃｕ、Ａｇ
、Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｒｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｉｒ、
Ｒｅ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｓｎ、Ｏｓ、合金、及びそれらの任意の組み合わせが挙げ
られる。
特定の実施形態において、縮合反応において記載される触媒には、水素化反応について
上記に記載したとおりの触媒担体が含まれ得る。特定の実施形態において、縮合触媒は自
己担持型である。本明細書で使用されるとき、用語「自己担持型」は、その触媒が担体と
して機能するために別の材料を必要としないことを意味する。他の実施形態では、縮合触
媒は、触媒を懸濁するのに好適な別の担体と併せて使用される。ある実施形態では、縮合
触媒担体はシリカである。
縮合反応が起こる条件は、出発物質の種類及び所望の生成物に基づき異なり得る。当業
者は、本開示の利益をもって、反応の実施に用いるのに適切な条件を認識するであろう。
一部の実施形態では、縮合反応は、提案されている反応の熱力学が有利となる温度で実施
される。縮合反応の温度は、具体的な出発ポリオール又はアルコールに応じて異なり得る
。一部の実施形態では、縮合反応の温度は、８０℃〜５００℃、好ましくは１２５℃〜４
５０℃、最も好ましくは１２５℃〜２５０℃の範囲である。一部の実施形態では、縮合反
応は、０ＫＰａ〜９０００ＫＰａの範囲、好ましくは０ＫＰａ〜７０００ＫＰａ、さらに
より好ましくは０ＫＰａ〜５０００ＫＰａの範囲の圧力で実施される。
本発明により形成される高級アルカンとしては、限定はされないが、４〜３０個の炭素
原子を有する分枝又は直鎖アルカン、４〜３０個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルケ
ン、５〜３０個の炭素原子を有するシクロアルカン、５〜３０個の炭素原子を有するシク
ロアルケン、アリール、縮合アリール、アルコール、及びケトンが挙げられる。好適なア
ルカンとしては、限定はされないが、ブタン、ペンタン、ペンテン、２−メチルブタン、
ヘキサン、ヘキセン、２−メチルペンタン、３−メチルペンタン、２，２，−ジメチルブ
タン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプテン、オクタン、オクテン、２，２，４
−トリメチルペンタン、２，３−ジメチルヘキサン、２，３，４−トリメチルペンタン、
２，３−ジメチルペンタン、ノナン、ノネン、デカン、デセン、ウンデカン、ウンデセン
、ドデカン、ドデセン、トリデカン、トリデセン、テトラデカン、テトラデセン、ペンタ
デカン、ペンタデセン、ノニルデカン、ノニルデセン、エイコサン、エイコセン、ウンエ
イコサン、ウンエイコセン、ドエイコサン、ドエイコセン、トリエイコサン、トリエイコ
セン、テトラエイコサン、テトラエイコセン、及びその異性体が挙げられる。これらの生
成物の一部は、燃料としての使用に好適であり得る。
一部の実施形態では、シクロアルカン及びシクロアルケンは非置換である。他の実施形
態では、シクロアルカン及びシクロアルケンは一置換である。さらに他の実施形態では、
シクロアルカン及びシクロアルケンは多置換である。置換シクロアルカン及びシクロアル
ケンを含む実施形態において、置換基には、限定なしに、１〜１２個の炭素原子を有する
分枝又は直鎖アルキル、１〜１２個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルキレン、フェニ
ル、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。好適なシクロアルカン及びシクロアルケ
ンとしては、限定はされないが、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シ
クロヘキセン、メチル−シクロペンタン、メチル−シクロペンテン、エチル−シクロペン
タン、エチル−シクロペンテン、エチル−シクロヘキサン、エチル−シクロヘキセン、異
性体及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
一部の実施形態では、形成されるアリールは非置換である。別の実施形態において、形
成されるアリールは一置換である。置換アリールを含む実施形態において、置換基には、
限定なしに、１〜１２個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルキル、１〜１２個の炭素原
子を有する分枝又は直鎖アルキレン、フェニル、及びそれらの任意の組み合わせが含まれ
る。本発明に好適なアリールとしては、限定はされないが、ベンゼン、トルエン、キシレ
ン、エチルベンゼン、パラキシレン、メタキシレン、及びそれらの任意の組み合わせが挙
げられる。
本発明において生成されるアルコールは、４〜３０個の炭素原子を有する。一部の実施
形態では、アルコールは環式である。他の実施形態では、アルコールは分枝状である。別
の実施形態では、アルコールは直鎖状である。本発明に好適なアルコールとしては、限定
はされないが、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール
、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデ
カノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプチルデカノール、オクチルデカノ
ール、ノニルデカノール、エイコサノール、ウンエイコサノール、ドエイコサノール、ト
リエイコサノール、テトラエイコサノール、及びその異性体が挙げられる。
本発明において生成されるケトンは、４〜３０個の炭素原子を有する。ある実施形態で
は、ケトンは環式である。別の実施形態では、ケトンは分枝状である。別の実施形態にお
いて、ケトンは直鎖状である。本発明に好適なケトンとしては、限定はされないが、ブタ
ノン、ペンタノン、ヘキサノン、ヘプタノン、オクタノン、ノナノン、デカノン、ウンデ
カノン、ドデカノン、トリデカノン、テトラデカノン、ペンタデカノン、ヘキサデカノン
、ヘプチルデカノン、オクチルデカノン、ノニルデカノン、エイコサノン、ウンエイコサ
ノン、ドエイコサノン、トリエイコサノン、テトラエイコサノン、及びその異性体が挙げ
られる。
別のかかる化学的改変は、エステル交換である。天然で産生されるグリセロ脂質は、脂
肪酸構成要素の分布が均一でない。油との関連において、エステル交換は、異なるグリセ
ロ脂質の２つのエステル間でのアシル基の交換を指す。エステル交換プロセスは、グリセ
ロ脂質の混合物の脂肪酸構成要素を転位させて分布パターンを改変し得る機構を提供する
。エステル交換は周知の化学的プロセスであり、概して、油の混合物をある時間にわたり
（例えば３０分間）、アルカリ金属又はアルキル化アルカリ金属（例えばナトリウムメト
キシド）などの触媒の存在下で（約２００℃に）加熱することを含む。このプロセスを用
いて油混合物の脂肪酸構成要素の分布パターンをランダム化することができ、又は所望の
分布パターンを生成するように指向させることができる。脂質を化学的に改変するこの方
法は、脂質としての乾燥細胞重に対する割合が少なくとも２０％である微生物バイオマス
などの、本明細書に提供される材料に対して実施することができる。
起こり得る一部のＴＡＧの融点未満の温度に油混合物を維持することにより、指向性エ
ステル交換を実施することができ、ここでは脂肪酸の特定の分布パターンが求められる。
これによりそれらのＴＡＧの選択的な結晶化がもたらされ、このようなＴＡＧは結晶化に
伴い反応混合物から効果的に除去される。このプロセスは、例えば、油中の脂肪酸の大部
分が沈殿し終えるまで続けることができる。指向性エステル交換プロセスを使用すると、
例えば、より長鎖の脂肪酸をより短鎖のカウンターパートによって置換することで、より
低いカロリー含有量の生成物を生成することができる。指向性エステル交換はまた、不要
なトランス異性体を生じ得る水素化に頼ることなしに、食品添加剤又は生成物（例えばマ
ーガリン）において求められる所望の融解特性及び構造的特徴を提供できる脂肪の混合物
を含む生成物の生成にも用いられる。
本明細書に記載される方法により生成される油のエステル交換は、以下に報告されるよ
うな方法及び／又は材料の１つ以上と併せて実施するか、又はそのような生成物を生成す
るため実施することができる：米国特許第６，０８０，８５３号明細書（非可消化性脂肪
代用物）；同第４，２８８，３７８号明細書（ピーナッツバター安定化剤）；同第５，３
９１，３８３号明細書（食用スプレー油）；同第６，０２２，５７７号明細書（食品用の
食用脂肪）；同第５，４３４，２７８号明細書（食品用の食用脂肪）；同第５，２６８，
１９２号明細書（低カロリーナッツ製品）；同第５，２５８，１９７号明細書（低カロリ
ー食用組成物）；同第４，３３５，１５６号明細書（食用脂肪生成物）；同第７，２８８
，２７８号明細書（食品添加剤又は薬剤）；同第７，１１５，７６０号明細書（分画プロ
セス）；同第６，８０８，７３７号明細書（構造脂肪）；同第５，８８８，９４７号明細
書（エンジン潤滑剤）；同第５，６８６，１３１号明細書（食用油混合物）；及び同第４
，６０３，１８８号明細書（硬化性ウレタン組成物）。
本発明における一実施形態では、上記に記載したとおりの油のエステル転移反応の後に
、米国特許第６，４６５，６４２号明細書に報告されるとおり、エステル転移反応した生
成物とポリオールとの反応が続き、ポリオール脂肪酸ポリエステルが生成される。かかる
エステル化及び分離プロセスは、以下のとおりの工程を含み得る：石鹸の存在下で低級ア
ルキルエステルをポリオールと反応させる工程；生成物混合物から残留石鹸を除去する工
程；生成物混合物を水洗及び乾燥することにより不純物を除去する工程；精製のため生成
物混合物を漂白する工程；生成物混合物中のポリオール脂肪酸ポリエステルから未反応低
級アルキルエステルの少なくとも一部を分離する工程；及び分離した未反応低級アルキル
エステルを再生利用する工程。
エステル転移反応はまた、米国特許第６，２７８，００６号明細書に報告されるとおり
、短鎖脂肪酸エステルを含む微生物バイオマスに対して実施することもできる。一般に、
エステル転移反応は、好適な触媒の存在下で油に短鎖脂肪酸エステルを添加し、混合物を
加熱することによって実施され得る。一部の実施形態では、油は、重量単位で反応混合物
の約５％〜約９０％を含む。一部の実施形態では、短鎖脂肪酸エステルは、重量単位で反
応混合物の約１０％〜約５０％であってもよい。触媒の非限定的な例としては、塩基触媒
、ナトリウムメトキシド、酸触媒、例えば、硫酸及び酸性粘土などの無機酸、メタンスル
ホン酸、ベンゼンスルホン酸、及びトルエンスルホン酸などの有機酸、並びにＡｍｂｅｒ
ｌｙｓｔ １５などの酸性樹脂が挙げられる。ナトリウム及びマグネシウムなどの金属、
及び金属水素化物もまた、有用な触媒である。
別のかかる化学的改変はヒドロキシル化であり、これには、二重結合への水の付加によ
ってもたらされる飽和及びヒドロキシル部分の取り込みが関わる。ヒドロキシル化プロセ
スは、グリセロ脂質の１つ以上の脂肪酸構成要素からヒドロキシ脂肪酸への変換機構を提
供する。ヒドロキシル化は、例えば米国特許第５，５７６，０２７号明細書に報告される
方法を用いて実施することができる。ヒマシ油及びその誘導体を含むヒドロキシル化脂肪
酸は、食品添加剤、界面活性剤、色素湿潤剤、消泡剤、防水添加剤、可塑剤、化粧品用乳
化剤及び／又は脱臭剤を含めたいくつかの工業用途、並びにエレクトロニクス、医薬品、
ペンキ、インク、接着剤、及び潤滑剤における成分として有用である。グリセリドのヒド
ロキシル化がどのように実施され得るかについての一例は、以下のとおりである：脂肪を
、ヘプタンと組み合わせて好ましくは約３０〜５０℃に加熱し、３０分間以上温度を維持
し得る；次に混合物に酢酸を添加した後、硫酸水溶液を添加し、続いて過酸化水素水溶液
を添加することができ、これは少量ずつ増加させながら１時間かけて混合物に添加される
；過酸化水素水の後、次に温度を少なくとも約６０℃に上昇させ、少なくとも６時間撹拌
し得る；撹拌後、混合物を沈殿させ、反応により形成された下層の水層を取り出すと同時
に、反応により形成された上層のヘプタン層を約６０℃の温度の熱水で洗浄し得る；次に
洗浄したヘプタン層を水酸化カリウム水溶液でｐＨ約５〜７に中和し、次に真空留去し得
る；次に反応生成物を１００℃で真空乾燥させ、乾燥した生成物を真空条件下で蒸気脱臭
し、珪藻土を使用して約５０°〜６０℃でろ過する。
本明細書に記載される方法によって生成される微生物油のヒドロキシル化は、以下に報
告されるような方法及び／又は材料の１つ以上と併せて実施するか、又はそのような生成
物を生成するため実施することができる：米国特許第６，５９０，１１３号明細書（油性
コーティング及びインク）；同第４，０４９，７２４号明細書（ヒドロキシル化プロセス
）；同第６，１１３，９７１号明細書（オリーブ油バター）；同第４，９９２，１８９号
明細書（潤滑剤及び潤滑添加剤）；同第５，５７６，０２７号明細書（ヒドロキシル化乳
）；同第６，８６９，５９７号明細書（化粧品）。
ヒドロキシル化したグリセロ脂質は、エストライドに変換することができる。エストラ
イドはグリセロ脂質からなり、ここではヒドロキシル化脂肪酸構成要素が別の脂肪酸分子
とエステル化されている。ヒドロキシル化グリセロ脂質からエストライドへの変換は、Ｉ
ｓｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＯＣＳ ７１（２）：１６９−１７４（１９９４）によ
り記載されるとおり、グリセロ脂質と脂肪酸との混合物を加温し、混合物を鉱酸に接触さ
せることによって行われ得る。エストライドは、限定なしに以下に報告されるものを含め
た、様々な用途において有用である：米国特許第７，１９６，１２４号明細書（エラスト
マー材料及び床仕上げ材）；同第５，４５８，７９５号明細書（高温用途の濃化油）；同
第５，４５１，３３２号明細書（工業用途の流体）；同第５，４２７，７０４号明細書（
燃料添加剤）；同第５，３８０，８９４号明細書（潤滑剤、グリース、可塑剤、及び印刷
インク）。
別のかかる化学的改変は、オレフィンメタセシスである。オレフィンメタセシスでは、
触媒がアルケン（オレフィン）中のアルキリデン炭素を切り離し、その各々を異なるアル
キリジン炭素と対にすることにより新しいアルケンを形成する。オレフィンメタセシス反
応は、エテノリシスによるアルケンでの不飽和脂肪酸アルキル鎖の切断、自己メタセシス
によるアルケン結合を介した脂肪酸の架橋結合、及び誘導体化アルケンとのクロスメタセ
シスによる脂肪酸に対する新しい官能基の導入などのプロセスに対する機構を提供する。
エステル転移反応及び水素化などの他の反応と併せて、オレフィンメタセシスは、不飽
和グリセロ脂質を多様な最終生成物に変えることができる。これらの生成物としては、ワ
ックス用のグリセロ脂質オリゴマー；潤滑剤用の短鎖グリセロ脂質；化学品及びポリマー
用のホモ及びヘテロ二官能性アルキル鎖；バイオ燃料用の短鎖エステル；及びジェット燃
料用の短鎖炭化水素が挙げられる。オレフィンメタセシスは、トリアシルグリセロール及
び脂肪酸誘導体に対し、例えば、米国特許第７，１１９，２１６号明細書、米国特許出願
公開第２０１０／０１６０５０６号明細書、及び米国特許出願公開第２０１０／０１４５
０８６号明細書に報告される触媒及び方法を用いて実施することができる。
バイオ油のオレフィンメタセシスは、概して、不活性条件下において、他のアルケンの
存在下（クロスメタセシス）又はその非存在下（自己メタセシス）で不飽和脂肪酸エステ
ルに約１０〜２５０ｐｐｍの負荷でＲｕ触媒の溶液を添加することを含む。こうした反応
は、典型的には数時間乃至数日間進行させて、最終的にある分布のアルケン生成物が得ら
れる。オレフィンメタセシスを脂肪酸誘導体に対してどのように実施し得るかについての
一例は、以下のとおりである：触媒負荷２２２ｐｐｍの第１世代グラブス触媒（ジクロロ
［２（１−メチルエトキシ−α−Ｏ）フェニル］メチレン−α−Ｃ］（トリシクロヘキシ
ルホスフィン）のトルエン中溶液を、脱気して乾燥させたオレイン酸メチルが入った容器
に加え得る。次に容器を約６０ｐｓｉｇのエチレンガスで加圧し、約３０℃以下に３時間
維持すると、それにより約５０％の収率のメチル９−デセノエートが生成され得る。
本明細書に記載される方法によって生成される油のオレフィンメタセシスは、以下に報
告されるような方法及び／又は材料の１つ以上と併せて実施するか、又はそのような生成
物を生成するため実施することができる：ＰＣＴ／ＵＳ０７／０８１４２７号明細書（α
−オレフィン脂肪酸）及び米国特許出願第１２／２８１，９３８号明細書（石油クリーム
）、同第１２／２８１，９３１号明細書（ペイントボールガンカプセル）、同第１２／６
５３，７４２号明細書（可塑剤及び潤滑剤）、同第１２／４２２，０９６号明細書（二官
能性有機化合物）、及び同第１１／７９５，０５２号明細書（ロウソクワックス）。
微生物油に対して実施することのできる他の化学反応としては、米国特許第６，０５１
，５３９号明細書に報告されるとおり、トリアシルグリセロールをシクロプロパン化剤と
反応させることにより流動性及び／又は酸化安定性を増進させること；米国特許第６，７
７０，１０４号明細書に報告されるとおり、トリアシルグリセロールからワックスを製造
すること；及び「エポキシ化トリアシルグリセロールのアクリル化速度論に及ぼす脂肪酸
組成の影響（Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉ
ｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｅｐｏｘｉｄｉ
ｚｅｄ ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ，７９：１，５９−６３，（
２００１）及びＦｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
，３７：１，１０４−１１４（２００４）に報告されるとおり、トリアシルグリセロール
のエポキシ化が挙げられる。
上記に記載したとおりの燃料及び化学製品用の油含有微生物バイオマスの生成は、脱脂
バイオマスミールの生成をもたらす。脱脂ミールは、藻類油の調製の副産物であり、家畜
、例えば、反芻動物、家禽、ブタ及び水産養殖の動物用飼料として有用である。得られる
ミールは、含油量が低いものの、高品質タンパク質、炭水化物、繊維、灰分、残留油及び
動物用飼料に適切な他の栄養素をなお含有する。細胞は主に油分離過程で溶解されるため
、脱脂ミールはかかる動物によって容易に消化可能である。脱脂ミールは場合により、動
物用飼料中で穀物などの他の成分と組み合わされ得る。脱脂ミールは粉末状の稠度を有す
るため、エクストルーダ又はエキスパンダー又は市販の別のタイプの機械を使用してペレ
ットに圧縮することができる。
上記では本発明を詳細に記載したが、本発明は以下の例に例示される。これらの例は、
特許請求される本発明を限定するのではなく、例示するために提供される。
ＸＩＶ．実施例
実施例１：脂肪酸メチルエステル検出による脂肪酸分析
乾燥バイオマスから脂質サンプルを調製した。２０〜４０ｍｇの乾燥バイオマスを２ｍ
ＬのＭｅＯＨ中５％Ｈ２ＳＯ４に再懸濁し、適切な量の好適な内部標準（Ｃ１９：０）を
含有する２００ｕｌのトルエンを添加した。この混合物を短時間超音波処理してバイオマ
スを分散させ、次に７０〜７５℃で３．５時間加熱した。２ｍＬのヘプタンを添加して脂
肪酸メチルエステルを抽出し、続いて２ｍＬの６％Ｋ２ＣＯ３（水溶液）を添加して酸を
中和した。混合物を激しく撹拌し、標準ＦＡＭＥ ＧＣ／ＦＩＤ（脂肪酸メチルエステル
ガスクロマトグラフィー水素炎イオン化検出）法を用いるガスクロマトグラフィー分析の
ため、上層の一部を、Ｎａ２ＳＯ４（無水）が入ったバイアルに移した。以下に報告する
脂肪酸プロフィールは、この方法によって決定した。
実施例２：油からのトリアシルグリセリド精製及びトリアシルグリセリドリパーゼ消化方
法
ジクロロメタン中に約１０ｍｇの油を溶解し、それを、ヘプタンでプレコンディショニ
ングしたＢｏｎｄ−Ｅｌｕｔアミノプロピル固相抽出カートリッジ（５００ＭＧ）に負荷
することにより、各油サンプルのトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）画分を単離した。ジク
ロロメタン（ｄｉｃｈｏｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）−ＭｅＯＨ（１：１）でＴＡＧを収集
チューブに溶出させ、その間、極性脂質はカラムに保持された。窒素ガス流で溶媒を除去
した。トリス緩衝液及び２ｍｇブタ膵リパーゼ（ＩＩ型、Ｓｉｇｍａ、１００〜４００単
位／ｍｇ）をＴＡＧ画分に加え、続いて胆汁酸塩及び塩化カルシウム溶液を添加した。ブ
タ膵リパーゼはｓｎ−１及びｓｎ−３脂肪酸を切断し、それにより２−モノアシルグリセ
リド及び遊離脂肪酸が生じる。この混合物を撹拌しながら４０℃で３分間加熱し、短時間
冷却し、次に６Ｎ ＨＣｌでクエンチした。次に混合物をジエチルエーテルで抽出し、エ
ーテル層を水で洗浄し、次に硫酸ナトリウムで乾燥させた。窒素流下で溶媒を除去した。
モノアシルグリセリド（ＭＡＧ）画分を単離するため、残渣をヘプタン中に溶解し、ヘプ
タンで前処理した第２のアミノプロピル固相抽出カートリッジに負荷した。残留ＴＡＧを
ジエチルエーテル−ジクロロメタン−ヘプタン（１：９：４０）で溶出し、ジアシルグリ
セリド（ＤＡＧ）を酢酸エチル−ヘプタン（１：４）で溶出し、ＭＡＧをカートリッジか
らジクロロメタン−メタノール（２：１）で溶出した。得られたＭＡＧ、ＤＡＧ、及びＴ
ＡＧ画分を、次に窒素流下で濃縮乾固し、実施例１に記載するとおりのＧＣ／ＦＩＤ分析
の定法の直接エステル転移法に供した。
実施例３：脂肪酸及びｓｎ−２プロフィールのため微生物を操作すると、外因性ＬＰＡＡ
Ｔ発現を介してラウリン酸が増加した
この例では、Ｃ．ｎｕｃｉｆｅｒａ １−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸ア
シルトランスフェラーゼ（ＣＮ ＬＰＡＡＴ）酵素をコードする組換えポリヌクレオチド
の使用による、形質転換微生物の脂肪酸プロフィール及びｓｎ−２プロフィールにおいて
ラウリン酸が高濃度化した微生物の操作を記載する。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的な突然
変異誘発株、株Ａを、初めに、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／
ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、
ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９
６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により、プラスミド構築物
ｐＳＺ１２８３で形質転換した。本明細書により参照によって援用されるＰＣＴ／ＵＳ２
０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰ
ＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるｐＳＺ１２８３は、Ｃｕｐｈｅ
ａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＦＡＴＢ２（ＣｗＴＥ２）チオエステラーゼのコード配列（配列
番号１０）、核ゲノムへの組み込み用の６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１）及び
３’（配列番号２）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａ
ｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒ
ｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下で配列
番号３に示されるタンパク質配列を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２ショ糖
インベルターゼコード領域（配列番号４）を含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓ
ｕｃ２発現カセットは配列番号７として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。配
列番号１１に示されるタンパク質配列を発現するＣｗＴＥ２タンパク質コード配列は、Ｐ
．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及びＣ．
ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲの制御下にあった。ＣｗＴＥ２及びｓｕｃ
２のタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／
ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、
ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９
６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝
子に固有のコドンバイアスを反映するようにコドンを最適化した。
ｐＳＺ１２８３を株Ａに形質転換した後、ショ糖を単一炭素源として含む寒天プレート
上で陽性クローンを選択した。次に一次形質転換体をクローン精製し、単一の形質転換体
、株Ｂを、さらなる遺伝子改変用に選択した。この遺伝子操作株をプラスミド構築物ｐＳ
Ｚ２０４６で形質転換して株ＢのｐＬｏｏｐゲノム遺伝子座に割り込ませた。構築物ｐＳ
Ｚ２０４６は、Ｃ．ｎｕｃｉｆｅｒａ １−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸ア
シルトランスフェラーゼ（Ｃｎ ＬＰＡＡＴ）酵素のコード配列（配列番号１２）、核ゲ
ノムへの組み込み用のｐＬｏｏｐゲノム領域に対する５’（配列番号１３）及び３’（配
列番号１４）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔ
ｉｉ β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）、及びＣｈｌｏｒｅｌ
ｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあるネオ
マイシン耐性タンパク質コード配列を含んだ。このＮｅｏＲ発現カセットは配列番号１５
として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。Ｃｎ ＬＰＡＡＴタンパク質コード
配列は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８
）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲの制御下にあった。Ｃｎ ＬＰ
ＡＡＴ及びＮｅｏＲのタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号
明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８
４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０
１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ
１４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにコドンを最適化した。Ｃｎ
ＬＰＡＡＴのアミノ酸配列を、配列番号１６として提供する。
ｐＳＺ２０４６を株Ｂに形質転換し、それにより株Ｃを作成した後、Ｇ４１８（ジェネ
ティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ））を含む寒天プレート上で陽性クローンを選択した。個
々の形質転換体をクローン精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣ
Ｔ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細
書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３
６９６号明細書に詳述されるとおりの脂質産生に好適な条件下、ｐＨ７．０で成長させた
。各形質転換体由来の乾燥バイオマスから脂質サンプルを調製し、実施例１に記載される
とおりの標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化（ＦＡＭ
Ｅ ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いてこれらのサンプルの脂肪酸プロフィールを分析した。
単一炭素源としてグルコース上で成長させたＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４
３５（Ｕ１）、非形質転換株Ｂ及び５つのｐＳＺ２０４６陽性形質転換体（株Ｃ、１〜５
）の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表６に提供する。
表６に示されるとおり、ＣｗＴＥ２を発現する株Ｂの脂肪酸プロフィールは、非形質転
換ＵＴＥＸ １４３５株の脂肪酸プロフィールと比べてＣ１０：０、Ｃ１２：０、及びＣ
１４：０脂肪酸の組成の増加並びにＣ１６：０、Ｃ１８：０、及びＣ１８：１脂肪酸の減
少を示した。形質転換株の脂肪酸プロフィールに対するさらなる遺伝子改変、すなわち株
ＢにおけるＣｎＬＰＡＡＴの発現の影響は、Ｃ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸の組成のさ
らに一層の増加、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、及びＣ１８：１脂肪酸のさらに一層の減少で
あるが、Ｃ１４：０脂肪酸組成に対して大きい効果はない。これらのデータは、微生物宿
主生物との関連においてＣｎＬＰＡＡＴが基質選択性を示すことを示している。
非形質転換Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株Ａは、０．５％未満のＣ１２脂肪酸及び１％未
満のＣ１０〜Ｃ１２脂肪酸を含む脂肪酸プロフィールによって特徴付けられる。対照的に
、Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼを発現する株Ｂの脂肪酸プロフィールは、３１
％のＣ１２：０脂肪酸を含み、Ｃ１０〜Ｃ１２脂肪酸が全脂肪酸の３６％超含まれた。さ
らに、高等植物チオエステラーゼ及びＣｎＬＰＡＡＴ酵素を発現する株Ｃの脂肪酸プロフ
ィールは、４５．６７％〜４６．６３％のＣ１２：０脂肪酸を含み、Ｃ１０〜Ｃ１２％脂
肪酸が全脂肪酸の７１〜７３％含まれた。外因性チオエステラーゼが発現した結果は、操
作された微生物中に存在するＣ１２脂肪酸の割合の６２倍の増加であった。外因性チオエ
ステラーゼ及び外因性ＬＰＡＡＴが発現した結果は、操作された微生物中に存在するＣ１
２脂肪酸の割合の９２倍の増加であった。
株Ａ、Ｂ、及びＣから抽出した油サンプルのＴＡＧ画分を、それらのトリアシルグリセ
リドのｓｎ−２プロフィールについて分析した。実施例２に記載されるとおりＴＡＧを抽
出して処理し、実施例１及び２のとおり分析した。株Ａ、Ｂ、及びＣから抽出した油のＴ
ＡＧ画分の脂肪酸組成及びｓｎ−２プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）
を、表７に提供する。報告されない値は「ｎ．ｒ．」と指示される。
表７に示されるとおり、ＣｗＴＥ２を発現する株Ｂから単離したトリグリセリド（ＴＡ
Ｇ）の脂肪酸組成は、非形質転換株Ａから単離されたＴＡＧの脂肪酸プロフィールと比べ
てＣ１０：０、Ｃ１２：０、及びＣ１４：０脂肪酸について増加し、Ｃ１６：０及びＣ１
８：１脂肪酸が減少した。形質転換株の脂肪酸プロフィールに対するさらなる遺伝子改変
、すなわちＣｎＬＰＡＡＴの発現の影響は、Ｃ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸の組成のさ
らに一層の増加、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、及びＣ１８：１脂肪酸のさらに一層の減少で
あったが、Ｃ１４：０脂肪酸組成に対して大きい効果はなかった。これらのデータは、外
因性ＣｎＬＰＡＡＴの発現により形質転換微生物の中鎖脂肪酸プロフィールが向上するこ
とを示している。
非形質転換Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株Ａは、約０．６％ Ｃ１４、約１．６％ Ｃ１
６：０、約０．３％ Ｃ１８：０、約９０％ Ｃ１８：１、及び約５．８％ Ｃ１８：２
のｓｎ−２プロフィールによって特徴付けられる。株Ａと対照的に、Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉ
ｉチオエステラーゼを発現する株Ｂは、中鎖脂肪酸が高く、長鎖脂肪酸が低いｓｎ−２プ
ロフィールによって特徴付けられる。Ｃ１２脂肪酸は株Ｂのｓｎ−２プロフィールの２５
％を含んだ。形質転換株のｓｎ−２プロフィールに対するさらなる遺伝子改変、すなわち
ＣｎＬＰＡＡＴの発現の影響は、Ｃ１２脂肪酸のさらに一層の増加（２５％から５２．８
％）、Ｃ１８：１脂肪酸の減少（３６．６％から１７．５％）、及びＣ１０：０脂肪酸の
減少であった（株Ｂ及び株ＣについてＣ１４：０及びＣ１６：０脂肪酸のｓｎ−２プロフ
ィール組成は比較的類似していた）。
これらのデータは、外因性ＬＰＡＡＴ発現によって操作微生物の脂肪酸プロフィールを
変えることが可能なポリヌクレオチドの、詳細には微生物細胞中のＣ１０：０及びＣ１２
：０脂肪酸の濃度を増加させることにおける有用性及び有効性を実証している。これらの
データは、さらに、外因性チオエステラーゼ及び外因性ＬＰＡＡＴ発現によって微生物細
胞が産生するＴＡＧのｓｎ−２プロフィールを変えることが可能なポリヌクレオチドの、
詳細にはｓｎ−２プロフィールのＣ１２組成を増加させ、且つｓｎ−２プロフィールのＣ
１８：１組成を減少させることにおける有用性及び有効性を実証している。
実施例４：組換え微細藻類から産生された油の熱挙動
図１〜図１４は、遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株か
らの精製、漂白、及び脱臭した油の脂肪酸プロフィール及び融解曲線を含む。ある場合に
は、遺伝子操作によって融解曲線の改変が達成される。例えば、産生される油によっては
、対照微細藻類油（すなわち、所与の遺伝子改変を欠く株から産生されるもの）と比べて
、又は広く利用可能な植物油と比べてより緩やかな又はよりシャープな融解遷移を有する
ものもある。加えて、図１２は、高パルミチン酸油について室温で数日間保持することに
よりテンパリングしたとき（上側のトレース）及び同じ油について第１の走査を実施した
後（下側のトレース）の走査熱量測定を示す。走査は１０℃／分の加熱速度で−６０℃〜
＋５０℃の範囲であった。２つのトレース間の違いから、油のテンパリングにより油中の
結晶構造に変化が生じたことが示唆される。
同様に注目すべきものとして、図１０及び図１１がＲＢＤ−５及びＲＢＤ ６の安定性
試験を示す。著しいことに、０．１％未満の１８：２及び１８：３脂肪酸を含む油である
ＲＢＤ−６は、酸化安定性指数（ＡＯＣＳ法Ｃｄ １２ｂ−９２）によって測定したとき
、１１０℃で加熱して３６時間経った後にも実質的に安定していた。
以下の表８は、図１〜図１３に特定される株の遺伝子操作の詳細を提供する。
実施例５：操作された微生物から生成した加工油の特徴
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）を形質転換ベク
ターｐＳＺ１５００（配列番号１７）で形質転換する方法及び効果については、ＰＣＴ出
願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８
４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に既に記載されてい
る。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的に変異
を誘発した（より高い油生成のため）誘導体、株Ａを、本明細書及びＰＣＴ／ＵＳ２００
９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及
びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形
質転換方法により、ｐＳＺ１５００で形質転換した。ｐＳＺ１５００は、Ｐ．ｍｏｒｉｆ
ｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５における発現にコドン最適化されたＣａｒｔｈａｍｕｓ
ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓオレイル−チオエステラーゼ（ＣｔＯＴＥ）遺伝子のヌクレオチ
ド配列を含んだ。ｐＳＺ１５００発現構築物は、核ゲノムへの組み込み用のＦＡＤｃゲノ
ム領域に対する５’（配列番号１８）及び３’（配列番号１９）相同組換え標的配列（構
築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター
／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３
’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２ショ糖イン
ベルターゼコード領域を含む。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２発現カセットは
配列番号７として列挙され、選択マーカーとして働いた。ＣｔＯＴＥコード領域は、Ｐ．
ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及びＣ．ｖ
ｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあり、天然のトランジットペプチドは
、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジット
ペプチド（配列番号９）により置換した。ＣｔＯＴＥ及びｓｕｃ２のタンパク質コード領
域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１
４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／
０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載される
とおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有のコドンバイア
スを反映するようコドン最適化した。
株Ａの一次ｐＳＺ１５００形質転換体を、ショ糖を単一炭素源として含有する寒天プレ
ート上で選択してクローン精製し、単一の操作された系統、株Ｄを分析用に選択した。株
Ｄは、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１
４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／
０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載される
とおり成長させた。次に、生成されたバイオマスからの油のヘキサン抽出を、標準方法を
用いて実施し、得られたトリグリセリド油が残留ヘキサンを含まないことを決定した。連
続圧搾機での圧縮を用いて微細藻類から油を抽出する他の方法が、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／
ＵＳ２０１０／０３１１０８号明細書に記載され、本明細書により参照によって援用され
る。
株Ｄのバイオマスから抽出した油の種々のロットを、標準的な植物油加工方法を用いて
精製、漂白、脱臭した。これらの手順により油サンプルＲＢＤ４３７、ＲＢＤ４６９、Ｒ
ＢＤ５０１、ＲＢＤ５０２、ＲＢＤ５０３、及びＲＢＤ５２９を生成し、これらを、米国
油脂化学協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ）、米国
材料試験協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ
Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）、及び国際標準化機構（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｒｇａｎ
ｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ）が定義する方法に従い分析
的試験プロトコルに供した。これらの分析の結果は、以下の表９〜表１４に要約する。
ＲＢＤ４６９油を、ＡＯＣＳ方法に従い微量元素含有量、固形脂肪含有量、及びロビボ
ンド色について分析した。これらの分析の結果を、以下の表１０、表１０、及び表１１に
提供する。
ＲＢＤ４６９油をエステル転移反応に供して脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を生成
した。ＲＢＤ４６９の得られたＦＡＭＥプロフィールを表１２に示す。
抗酸化剤を補足しない６つのＲＢＤ油サンプル及び抗酸化剤を補足した３つのＲＢＤ油
サンプルの油安定性指数（ＯＳＩ）を、油安定性指数ＡＯＣＳ方法Ｃｄ １２ｂ−９２に
従い分析した。表１４には、Ｍｅｔｒｏｈｍ ８７３ Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ Ｒａｎｃｉ
ｍａｔを使用して実施した、１１０℃で行ったＯＳＩ ＡＯＣＳ Ｃｄ １２ｂ−９２試
験の結果を示す。結果は、星印（＊）で示した場合を除き、複数のＯＳＩランの平均値で
ある。分析していないサンプルは、（ＮＡ）で示す。
形質転換されていないＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）酸プロフィー
ルは、６０％未満のＣ１８：１脂肪酸及び７％超のＣ１８：２脂肪酸を含む。対照的に、
株Ｄ（ｐＳＺ１５００を含む）は、Ｃ１８：１脂肪酸の組成が増加（８５％を上回るまで
）し且つＣ１８：２脂肪酸が減少（０．０６％未満まで）した脂肪酸プロフィールを呈し
た。精製、漂白、及び脱ガム後、株Ｅで作製した油から調製したＲＢＤ油サンプルは、Ｏ
ＳＩ値＞２６時間を呈した。抗酸化剤を添加すると、株Ｄの油から調製したＲＢＤ油のＯ
ＳＩは、４８．６０時間から２４２時間超に増加した。他の実験では、４００時間以上に
わたるＯＳＩ値を得た。本発明の実施形態に係る低多価不飽和油のさらなる特性を図１６
に示す。
実施例６：脂肪酸デサチュラーゼ及びアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの対立遺伝子破壊
による操作微生物のオレイン酸濃度の改善
この例では、形質転換ベクターを使用することによる、高いオレイン酸及び低いリノー
ル酸を産生するように先に操作したＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株のＦ
ＡＴＡ遺伝子座の破壊を記載する。この例で使用した形質転換カセットは、微生物を操作
するため選択可能なマーカー及びＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ酵素をコードす
るヌクレオチド配列を含み、ここで形質転換微生物の脂肪酸プロフィールは、さらにオレ
イン酸濃度が増加し、且つパルミチン酸濃度が低下するように改変されていた。
実施例５及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載される株Ｄは、Ｐ．
ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的に変異を誘発した（より高い油生
成のため）誘導体であり、続いて、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣ
Ｔ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細
書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３
６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法に従い形質転換構築物
ｐＳＺ１５００（配列番号１７）で形質転換した。この株を、構築物ｐＳＺ２２７６によ
る形質転換用の宿主として使用して、ＫＡＳＩＩ酵素の発現を増加させると同時に、内在
性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子座を除去して株Ｅを作成した。ｐＳＺ２２７６
形質転換構築物は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ核ゲノムへの組み込み用のＦＡＴＡ１ゲノ
ム領域に対する５’（配列番号２０）及び３’（配列番号２１）相同組換え標的配列（構
築物に隣接する）、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓアクチンプロモーター／５’ＵＴ
Ｒ（配列番号２２）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号６）の
制御下にあるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＴＨＩＣタンパク質コード領域を含んだ。このＡｔ
ＴＨＩＣ発現カセットは配列番号２３として列挙され、選択マーカーとして働いた。Ｐ．
ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩタンパク質コード領域は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ
Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還
元酵素３’ＵＴＲの制御下にあり、ＫＡＳＩＩ酵素の天然のトランジットペプチドは、Ｃ
．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプ
チド（配列番号９）により置換した。Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ Ｓ１０６ステ
アロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドを含むＰｍＫＡＳＩＩ（Ｐｒｏｔ
ｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ）のコドン最適化配列は、配列表に配
列番号２４として提供される。配列番号２５は、配列番号２４のタンパク質翻訳を提供す
る。ＰｍＫＡＳＩＩ及びｓｕｃ２のタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０
６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０
１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣ
Ｔ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉ
ｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようコドン最適化し
た。
株Ｄの一次ｐＳＺ２２７６形質転換体を、チアミン不含の寒天プレート上で選択してク
ローン精製し、単一の操作された系統、株Ｅを分析用に選択した。株Ｅは、ＰＣＴ／ＵＳ
２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣ
Ｔ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細
書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの、ｐＨ５．
０及びｐＨ７．０の従属栄養脂質産生条件下で培養した。脂質サンプルを各形質転換体由
来の乾燥バイオマスから調製し、それらのサンプルの脂肪酸プロフィールを、実施例１に
記載されるとおりの標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン
化（ＦＡＭＥ ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いて分析した。ｐＳＺ２２７６を株Ｄに形質転
換することによって生じるトランスジェニック系の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対す
る面積％で表される）を、表１５に示す。
表１５に示されるとおり、ＣｔＯＴＥ発現カセットによりＦＡＤｃ対立遺伝子を標的化
して破壊すると、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールが影響を受けた。株Ｄ（ｐＳＺ１
５００形質転換ベクターを含む）の脂肪酸プロフィールは、株Ａと比べてＣ１８：１脂肪
酸の組成の増加と、同時にＣ１６：０及びＣ１８：２脂肪酸の低下を示した。続くｐＳＺ
２２７６による株Ｄの形質転換によりＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）
ＫＡＳＩＩタンパク質を過剰発現させると同時にＦＡＴＡ遺伝子座を除去すると（それに
より株Ｅを作成する）、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールになおもさらなる影響がも
たらされた。株Ｅの脂肪酸プロフィールは、株Ａ及びＤと比べてＣ１８：１脂肪酸の組成
の増加と、Ｃ１６：０脂肪酸のさらなる低下を示した。Ａｍｔ０３プロモーターからの発
現を誘導するための、ｐＨ７の培養条件における株Ｅの増殖は、ｐＨ５で培養した同じ株
と比べてＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸が多く、且つＣ１６：０脂肪酸が少ない脂肪酸
プロフィールをもたらした。
これらのデータは、オレイン酸の濃度を増加させると同時にリノール酸及びパルミチン
酸の濃度を低下させるための、宿主生物の脂肪酸プロフィールに影響を与える複数の遺伝
子改変の有用性を実証している。さらに、この例は、宿主微生物の脂肪酸プロフィールを
変化させるための、外来性ＫＡＳＩＩタンパク質コード領域の発現を制御するｐＨ調節可
能なプロモーターを含むカセットによる、組換えポリヌクレオチドを使用した内在性ＦＡ
ＴＡ対立遺伝子の標的遺伝子破壊を例示する。
実施例７：脂肪酸デサチュラーゼの条件的発現
この例では、形質転換ベクターを使用することによる、シード及び脂質生産性の両方の
増殖段階で高いオレイン酸及び極めて低いリノール酸を産生するように先に操作したＰｒ
ｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株におけるデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ（
ＦＡＤ）の条件的発現を記載する。細胞油における極めて低いリノール酸濃度は、特定の
用途において使用が求められる。しかしながら、宿主微生物の細胞分裂期（「シード段階
」）にリノール酸が存在しないことは不利である。リノール酸をシード培地に補足して細
胞分裂を促進し、且つ脂質産生中は添加しないことでもよいが、しかしながらこの追加に
より不要なコストがかかる。この問題を解消するため、細胞分裂に十分なリノール酸の濃
度が達成され得るとともに、微生物培養の油生成段階において極めて低濃度のリノール酸
を有する油が産生され得るように、ＦＡＤ２酵素を制御して発現させるための形質転換カ
セットを構築した。この例で用いられる形質転換カセットは、微生物を操作するため選択
可能なマーカー、ｐＨ調節可能なプロモーター、及びＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ
２酵素をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで形質転換微生物の脂肪酸プロフィー
ルは、オレイン酸産生が増加し、且つリノール酸産生が調節可能となるように改変されて
いた。
実施例５、６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載される株Ｄは、
Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的に変異を誘発した（より高い
油生成のため）誘導体であり、続いて、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、
ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号
明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０
２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により形質転換構
築物ｐＳＺ１５００（配列番号１７）で形質転換した。この株を、構築物ｐＳＺ２４１３
による形質転換用の宿主として使用して、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ２酵素を調
節するためのｐＨ駆動性プロモーターを導入した。ｐＳＺ２４１３形質転換構築物は、Ｐ
．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ核ゲノムへの組み込み用の６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番
号１）及び３’（配列番号２）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、Ｃ．ｐｒｏｔ
ｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓアクチンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号２２）及びＣ．ｖｕ
ｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあるＡ．ｔｈａｌｉａｎ
ａ ＴＨＩＣタンパク質コード領域を含んだ。このＡｔＴＨＩＣ発現カセットは配列番号
２３として列挙され、選択マーカーとして働いた。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ２
タンパク質コード領域は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Ａｍｔ０３プロモーター／５’Ｕ
ＴＲ（配列番号８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあった
。ＰｍＦＡＤ２のコドン最適化配列は、配列表に配列番号２６として提供される。配列番
号２７は、配列番号２６のタンパク質翻訳を提供する。ＰｍＦＡＤ２及びｓｕｃ２のタン
パク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０
０９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／
ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細
書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有
のコドンバイアスを反映するようコドン最適化した。
株Ｄの一次ｐＳＺ２４１３形質転換体を、チアミン不含の寒天プレート上で選択してク
ローン精製し、操作された系統、株Ｆの単離物を分析用に選択した。これらの単離物を、
ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号
明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８
４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり
、従属栄養脂質産生条件下にｐＨ７．０で培養し（それによりＰｍＡｍｔ０３プロモータ
ーからのＦＡＤ２の発現を活性化した）、及びｐＨ５．０で培養した。脂質サンプルを各
形質転換体由来の乾燥バイオマスから調製し、それらのサンプルの脂肪酸プロフィールを
、実施例１に記載されるとおりの標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー
水素炎イオン化（ＦＡＭＥ ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いて分析した。ｐＳＺ２４１３で
株Ｄに形質転換することにより生じるトランスジェニック株Ｆの９つの代表的な単離物（
Ｆ−１〜Ｆ−９）の得られたＣ１８：２脂肪酸プロフィール（面積％で表される）を、表
１６に示す。
表１６に示されるとおり、異なるｐＨ値で株を培養したことにより生じた、ＰｍＦＡＤ
２酵素の制御された発現の影響は、形質転換微生物におけるＣ１８：２脂肪酸の組成の明
らかな増加である。リノール酸は、株Ａの脂肪酸の約６％〜約７．３％を含む。対照的に
、株Ｄ（両方のＦＡＤ２対立遺伝子を除去するｐＳＺ１５００形質転換ベクターを含む）
は、０．０１％リノール酸の脂肪酸プロフィールにより特徴付けられる。ｐＳＺ２４１３
で株Ｄを形質転換することによる株Ｆの作成は、リノール酸の産生がＡｍｔ０３プロモー
ターにより調節される組換え微生物をもたらす。Ａｍｔ０３プロモーターからのＦＡＤ２
発現を誘導するため、ｐＨ７の培養条件で株Ｆ単離物を増殖させると、約４．５％〜約７
．５％リノール酸により特徴付けられる脂肪酸プロフィールとなった。対照的に、ｐＨ５
の培養条件で株Ｆ単離物を増殖させると、約０．３３〜約０．７７％リノール酸により特
徴付けられる脂肪酸プロフィールとなった。
これらのデータは、ＦＡＤ２酵素の条件的発現を可能にする組換えポリヌクレオチドが
、操作された微生物の脂肪酸プロフィールの改変に、及び詳細には、微生物細胞における
Ｃ１８：２脂肪酸産生の調節において、有用且つ有効であることを実証している。
実施例８：位置特異的プロフィールの分析
ＡＰＣＩ源を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ ８０３０トリプル四重極型質量分析
器と結合したＳｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ超高速液体クロマトグラフィー装置（ＳＩ
Ｌ−３０ＡＣオートサンプラー、２つのＬＣ−３０ＡＤポンプ、ＤＧＵ−２０Ａ５インラ
インデガッサー、及びＣＴＯ−２０Ａカラムオーブンを含む）を使用して、ＬＣ／ＭＳ
ＴＡＧ分布解析を実施した。データは、ｍ／ｚ ３５０〜１０５０のＱ３スキャンを使用
し、陽イオンモードにおいて１４２８ｕ／秒の走査速度で、ＣＩＤガス（アルゴン）圧力
を２３０ＫＰａに設定して取得した。ＡＰＣＩ、脱溶媒和ライン、及びヒートブロックの
温度はそれぞれ３００、２５０、及び２００℃に設定し、噴霧ガス及び乾燥ガスの流速は
それぞれ３．０Ｌ／分及び５．０Ｌ／分であり、及び界面電圧は４５００Ｖであった。油
サンプルを、濃度が５ｍｇ／ｍＬとなるようにジクロロメタン−メタノール（１：１）中
に溶解し、０．８μＬのサンプルを、３０℃に維持したＳｈｉｍａｄｚｕ Ｓｈｉｍ−ｐ
ａｃｋ ＸＲ−ＯＤＳ ＩＩＩ（２．２μｍ、２．０×２００ｍｍ）に注入した。クロマ
トグラフ分離には、０．４８ｍＬ／分で２７分間の３０％ジクロロメタン−２−プロパノ
ール（１：１）／アセトニトリルから５１％ジクロロメタン−２−プロパノール（１：１
）／アセトニトリルに至る直線勾配を使用した。
実施例９：ＳＯＳ、ＰＯＰ、及びＰＯＳトリアシルグリセリドの産生を増加させるための
微生物の操作
この例では、Ｃ１８：０選択的Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓチオエステラーゼ（Ｂｎ
ＯＴＥ）酵素をコードする組換えポリヌクレオチドの使用による、形質転換微生物のトリ
アシルグリセリド分布においてＳＯＳ、ＰＯＳ、及びＰＯＰトリアシルグリセリドが高濃
度化した微生物の操作を記載する。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的な突然
変異誘発株、株Ａを、初めに、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／
ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、
ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９
６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により、プラスミド構築物
ｐＳＺ１３５８で形質転換した。本明細書により参照によって援用されるＰＣＴ／ＵＳ２
０１２／０２３６９６号明細書に記載されるｐＳＺ１３５８は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａ
ｐｕｓチオエステラーゼ（ＢｎＯＴＥ）チオエステラーゼのコード配列（配列番号２８）
、核ゲノムへの組み込み用の６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１）及び３’（配列
番号２）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ
β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ
ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下で配列番号３に示
されるタンパク質配列を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２ショ糖インベルタ
ーゼコード領域（配列番号４）を含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２発現
カセットは配列番号７として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。配列番号２９
に示されるタンパク質配列を発現するＢｎＯＴＥタンパク質コード配列は、Ｐ．ｍｏｒｉ
ｆｏｒｍｉｓ Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及びＣ．ｖｕｌｇａ
ｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲの制御下にあった。ＢｎＯＴＥ及びｓｕｃ２のタンパ
ク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００
９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書
に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有の
コドンバイアスを反映するようにコドンを最適化した。
株Ａの一次ｐＳＺ１３５８形質転換体を、ショ糖を単一炭素源として含有する寒天プレ
ート上で選択してクローン精製し、単一の操作された系、株Ｇを分析用に選択した。株Ｇ
を、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４
２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０
３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されると
おり従属栄養脂質産生条件下ｐＨ７．０で培養した（それによりＰｍＡｍｔ０３プロモー
ターからのＢｎＯＴＥの発現を活性化した）。株Ａ及び株Ｇから得られた油サンプルを、
実施例１及び２に記載される方法を用いて脂肪酸組成について分析し、及び、実施例８に
記載される方法を用いて、油中のトリアシルグリセリドの位置特異性について分析した。
株Ａ及び株Ｇから単離したＴＡＧの脂肪酸プロフィールを表１７に示す。表１８は、株Ａ
及び株Ｇ由来の油サンプル中に存在するＰＯＰ、ＰＯＳ、及びＳＯＳ ＴＡＧの位置特異
性プロフィールを提供する。
表１７に示されるとおり、ＢｎＯＴＥを発現する株Ｇから単離されたＴＡＧの脂肪酸組
成は、非形質転換株Ａから単離されたＴＡＧの脂肪酸プロフィールと比べて、著しくＣ１
８：０脂肪酸（３．７％から３０．４％）が増加し、且つＣ１８：１脂肪酸が減少した（
６４．３％から３０．２％）。株Ａから単離されたＴＡＧの脂肪酸組成は、約２３．９％
パルミチン酸、３．７％ステアリン酸、及び６４．３％オレイン酸、約６．５：１：１７
．４のＰ：Ｓ：Ｏ比によって特徴付けられた。対照的に、株Ｇから単離されたＴＡＧの脂
肪酸組成は、約２５．８％パルミチン酸、３０．４％ステアリン酸、及び３０．２％のオ
レイン酸、約１：１．１８：１．１７のＰ：Ｏ：Ｓ比によって特徴付けられた。
形質転換微生物から産生された油のＰＯＰ、ＰＯＳ、及びＳＯＳ ＴＡＧの位置特異的
プロフィールに対するＣ１８：０選択的チオエステラーゼの発現の影響は、油中に存在す
る全ＴＡＧの割合としての３つ全てのＴＡＧの増加であった。表１８に示されるとおり、
ＰＯＰ＋ＰＯＳ＋ＳＯＳ ＴＡＧの合計は、株Ｇによって産生されるＴＡＧの４５％を占
め、一方、ＰＯＰ、ＰＯＳ、及びＳＯＳ ＴＡＧは、合計が株Ａで産生されるＴＡＧの僅
か約１７％であった。株ＧのＰＯＰ、ＰＯＳ及びＳＯＳの割合を、表１８においてココア
バターと比較する。見て分かるとおり、株ＧのＰＯＰ、ＰＯＳ及びＳＯＳの比は、ココア
バターで観察される比と極めて類似している。
これらのデータは、外因性チオエステラーゼ発現によって操作微生物のＴＡＧの脂肪酸
プロフィール及び位置特異的プロフィールを変えることが可能な、詳細にはＰＯＰ、ＰＯ
Ｓ、及びＳＯＳ ＴＡＧの分布を増加させることが可能なポリヌクレオチドの有用性及び
有効性を実証している。
実施例１０〜３３：微生物の操作
以下の実施例１０〜３３は、本発明における様々な微生物の操作を記載する。微生物の
脂肪酸プロフィールを変化させるため、微生物を遺伝子改変することができ、ここでは内
在性又は外来性の脂質生合成経路酵素を発現させるか、過剰発現させるか、又は減弱させ
る。脂肪酸不飽和度に関して脂肪酸プロフィールが変化し、脂肪酸鎖長が減少又は増加す
るように微生物を遺伝子操作する工程は、形質転換ベクター（例えば、プラスミド）の設
計及び構築、１つ以上のベクターによる微生物の形質転換、形質転換微生物（形質転換体
）の選択、形質転換微生物の成長、及び操作された微生物により産生された脂質の脂肪酸
プロフィールの分析を含む。
宿主生物の脂肪酸プロフィールを変化させる導入遺伝子は、数多くの真核微生物で発現
させることができる。真核微生物における導入遺伝子の発現の例は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍ
ｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ、Ｃ
ｈｌｏｒｅｌｌａ ｓａｃｃａｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ
、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎ
ａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａ
ｌｅ、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ
、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ、Ｃｌ
ｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ
複合体、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓ
ｅｕｄｏｎａｎａ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｎａｖｉｃ
ｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ、
Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄ
ｒｉａｃｔｉｃｕｍ、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ
．、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ、及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉ
ｃａを含め、科学文献に見出すことができる。これらの発現技法を本発明の教示と組み合
わせて、変化した脂肪酸プロフィールを有する操作された微生物を生成することができる
。
宿主生物の脂肪酸プロフィールを変化させるか、又は宿主生物により産生されるグリセ
ロ脂質の位置特異的分布を変化させる導入遺伝子はまた、数多くの原核微生物で発現させ
ることができる。油産生微生物における導入遺伝子の発現の例は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｏｐａｃｕｓを含め、文献に見出すことができる。これらの発現技法を本発明の教示
と組み合わせて、変化した脂肪酸プロフィールを有する操作された微生物を生成し得る。
実施例１０：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａの操作
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発
現は、本明細書において考察されるとおりＤａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及
びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｄａｗｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３５（１９９７）
ｐｐ．３５６−３６２は、プラスミドＤＮＡによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎ
ｉａｎａの安定な核形質転換を報告した。Ｄａｗｓｏｎは、微粒子銃の形質転換方法を用
いて、完全なＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素遺伝子（ＮＲ、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ寄託番号Ｕ３９９３１）をコードするプラスミドｐＳＶ７２−ＮＲｇを、突然変
異体Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａに導入した（ＮＲ突然変異体）。この
ＮＲ突然変異体は、窒素源として硝酸塩を利用することなしには成長することができない
。硝酸還元酵素は硝酸塩から亜硝酸塩への変換を触媒する。形質転換前、Ｃｈｌｏｒｅｌ
ｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ ＮＲ突然変異体は、唯一の窒素源として硝酸塩（ＮＯ３
−）を含む培養培地上で微小コロニー段階より先に成長することはできなかった。ＮＲ突
然変異体Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａにおけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖ
ｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ遺伝子産物の発現を選択可能なマーカーとして使用して、硝酸塩代
謝の欠損を取り戻した。ｐＳＶ７２−ＮＲｇプラスミドによる形質転換後、Ｃｈｌｏｒｅ
ｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ遺伝子産物を安定的に発現するＮＲ突然変異体Ｃｈｌｏ
ｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａが得られ、これは単一炭素源として硝酸塩を含む寒
天プレート上で微小コロニー段階より先に成長することができた。安定な形質転換体のＤ
ＮＡの評価はサザン解析により実施し、安定な形質転換体のＲＮＡの評価はＲＮアーゼ保
護により実施した。形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ（ＮＲ突
然変異体）の選択及び維持は、０．２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４、０．６７ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ
４、３．５ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／Ｌ Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７・Ｈ２Ｏ及び１６
．０ｇ／Ｌ寒天、適切な窒素源（例えば、ＮＯ３ −）、微量栄養素、及び炭素源を含む寒
天プレート（ｐＨ７．４）上で実施した。Ｄａｗｓｏｎはまた、液体培養培地におけるＣ
ｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉ
ａｎａ ＮＲ突然変異体の増殖も報告した。Ｄａｗｓｏｎは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕ
ｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素遺伝子のプラスミドｐＳＶ７２−ＮＲｇ並びにプロモーター及
び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ ＮＲ
突然変異体における異種遺伝子発現を可能にするのに好適であったことを報告した。Ｄａ
ｗｓｏｎはまた、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素遺伝子産物の発現
が、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ ＮＲ突然変異体における選択可能な
マーカーとして使用するのに好適であったことも報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖ
ｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素（ＣｖＮＲ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含
むベクターｐＳＶ７２−ＮＲｇが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含
むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセ
ットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タン
パク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ
の核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉ
ｎｉａｎａにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク
質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｖＮ
Ｒプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又
は下流で、ＣｖＮＲ ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。
形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ
ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性
脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換
ベクターによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａの安定な形質転換は、微粒
子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。Ｃｖ
ＮＲ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして用いることにより、Ｃｈｌｏｒｅｌｌ
ａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ ＮＲ突然変異株の窒素同化の欠損を取り戻し、形質転換ベ
クターを安定的に発現するＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ ＮＲ突然変異
体を選択し得る。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ脂質産生に好適な成長培
地としては、限定はされないが、微量栄養素並びに適切な窒素源及び炭素源を補足した、
０．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、０．２５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ
４−７Ｈ２Ｏが挙げられる（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｌｉｐｉｄｓ Ｖｏｌ．５：７（１９
７０），ｐｐ．５９７−６００）。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ脂質の
脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によ
って評価することができる。
実施例１１：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの操作
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、
本明細書において考察されるとおりＣｈｏｗ ａｎｄ Ｔｕｎｇ ｅｔ ａｌ．が教示す
る方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｃｈｏ
ｗ ａｎｄ Ｔｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ
ｕｍｅ １８（１９９９），ｐｐ．７７８−７８０は、プラスミドＤＮＡによるＣｈｌｏ
ｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの安定な核形質転換を報告した。Ｃｈｏｗ ａｎｄ Ｔｕ
ｎｇは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、プラスミドｐＩＧ１２１−Ｈ
ｍ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢ４８９１４２）をＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉ
ｓに導入した。ｐＩＧ１２１−Ｈｍのヌクレオチド配列は、ＧＵＳタンパク質コード配列
の上流でＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結され、且つＧＵＳタンパク質コ
ード配列の下流でノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに
さらに動作可能に連結されたβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子産物をコ
ードする配列を含んだ。プラスミドｐＩＧ１２１−Ｈｍの配列は、ハイグロマイシンＢ抗
生物質耐性カセットをさらに含んだ。このハイグロマイシンＢ抗生物質耐性カセットは、
ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＢＡＨ２
４２５９）遺伝子産物をコードする配列に動作可能に連結されたＣａＭＶ ３５Ｓプロモ
ーターを含んだ。形質転換前、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓは、５０ｕｇ／ｍ
ｌハイグロマイシンＢを含む培養培地で増殖することができなかった。ｐＩＧ１２１−Ｈ
ｍプラスミドによる形質転換後、５０ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含む培養培地で増
殖するＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの形質転換体が得られた。Ｃｈｌｏｒｅｌ
ｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓにおけるｈｐｔ遺伝子産物の発現により、５０ｕｇ／ｍＬハイグ
ロマイシンＢの存在下における形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの増
殖が可能となり、従ってＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓにおいて使用される選択
可能なマーカーとしてのハイグロマイシンＢ耐性カセットの有用性が確立された。ＧＵＳ
レポーター遺伝子の検出可能な活性から、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター及びｎｏｓ ３
’ＵＴＲが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓにおける異種遺伝子発現を可能にす
るのに好適であることが示された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡ
の評価を行った。形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの選択及び維持は
、ＹＡ培地（寒天及び４ｇ／Ｌ酵母エキス）を含む寒天プレート上で行った。液体培養培
地におけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの増殖は、Ｃｈｏｗ ａｎｄ Ｔｕｎ
ｇにより考察されるとおり実施した。ＹＡ培地以外の培地におけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ
ｖｕｌｇａｒｉｓの増殖については記載されている（例えば、Ｃｈａｄｅｒ ｅｔ ａｌ
．，Ｒｅｖｕｅ ｄｅｓ Ｅｎｅｒｇｉｅｓ Ｒｅｎｏｕｖｅｌａｂｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ
１４（２０１１），ｐｐ．２１−２６及びＩｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ
ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７（２０００），ｐ
ｐ．６３１−６３５を参照）。Ｃｈｏｗ ａｎｄ Ｔｕｎｇは、プラスミドｐＩＧ１２１
−Ｈｍ、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈｌｏｒｅｌ
ｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告
した。加えて、Ｃｈｏｗ ａｎｄ Ｔｕｎｇは、ハイグロマイシンＢ耐性カセットが、Ｃ
ｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好
適であったことを報告した。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓにおける異種遺伝子
発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネ
ーター、及び選択可能なマーカーは、Ｃｈａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖｕｅ ｄｅｓ
Ｅｎｅｒｇｉｅｓ Ｒｅｎｏｕｖｅｌａｂｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １４（２０１１），ｐ
ｐ．２１−２６において考察されている。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるハイグロマイシンＢ遺伝
子産物をコードするヌクレオチド配列を含むｐＩＧ１２１−Ｈｍが構築され、脂質生合成
経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成
される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経
路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＣｈｌｏｒｅ
ｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｈｌｏ
ｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質
生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード
配列の上流でＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード
配列の３’領域において、又は下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結すること
ができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｈｌｏｒ
ｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内
在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質
転換ベクターによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの安定な形質転換は、エレク
トロポレーション又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現さ
れる。ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベ
クターで形質転換されたＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓを、限定はされないが、
ハイグロマイシンを含む寒天培地上で選択することができる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕ
ｌｇａｒｉｓ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、微量金属と、場合
により１．５ｇ／Ｌ ＮａＮＯ３を補足したＢＧ１１培地（０．０４ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ
４、０．０７５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、０．０３６ｇ／Ｌ クエン酸、０．００６ｇ／Ｌ
クエン酸鉄アンモニウム、１ｍｇ／Ｌ ＥＤＴＡ、及び０．０２ｇ／Ｌ Ｎａ２ＣＯ３）
が挙げられる。脂質産生のためのＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの培養に好適な
さらなる培地としては、例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ培地（１．５ｇ／Ｌ ＫＮＯ３、１．
２５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．２５ｇｌ−１ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇｌ−１
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを微量栄養素と共に含む）及びＩｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅ
ｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７（２０
００），ｐｐ．６３１−６３５により報告されるとおりの低窒素培地（２０３ｍｇ／ｌ（
ＮＨ４）２ＨＰＯ４、２．２３６ｇ／ｌ ＫＣｌ、２．４６５ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４、１．
３６１ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４及び１０ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ４を含む）が挙げられる。Ｃｈ
ｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載
される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例１２：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの操作
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発
現は、本明細書において考察されるとおりＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベ
クターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．３９：５（２００１），ｐｐ．３６
５−３７０は、プラスミドＤＮＡによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの
安定な形質転換を報告した。Ｃｈｅｎは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用い
て、プラスミドｐＢｉｎＵΩＮＰ−１をＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａに
導入した。ｐＢｉｎＵΩＮＰ−１のヌクレオチド配列は、ＮＰ−１タンパク質コード領域
の上流でＺｅａ ｍａｙｓユビキチン（ｕｂｉ１）遺伝子プロモーターに動作可能に連結
され、且つＮＰ−１タンパク質コード領域の下流でノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子
の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、好中球ペプチド−１（ＮＰ−１
）ウサギ遺伝子産物をコードする配列を含んだ。プラスミドｐＢｉｎＵΩＮＰ−１の配列
は、Ｇ４１８抗生物質耐性カセットをさらに含んだ。このＧ４１８抗生物質耐性カセット
は、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ａｐｈ ３’）遺伝子産物をコ
ードする配列を含んだ。ａｐｈ ３’遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付
与する。形質転換前、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａは、３０ｕｇ／ｍＬ
Ｇ４１８を含む培養培地で増殖することができなかった。ｐＢｉｎＵΩＮＰ−１プラス
ミドによる形質転換後、３０ｕｇ／ｍＬ Ｇ４１８を含む選択的培養培地で増殖するＣｈ
ｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの形質転換体が得られた。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ
ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおけるａｐｈ ３’遺伝子産物の発現により、３０ｕｇ／ｍ
Ｌ Ｇ４１８の存在下における形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅ
ａの増殖が可能となり、従ってＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおいて使
用される選択可能なマーカーとしてのＧ４１８抗生物質耐性カセットの有用性が確立され
た。ＮＰ−１遺伝子産物の検出可能な活性から、ｕｂｉ１プロモーター及びｎｏｓ ３’
ＵＴＲが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける異種遺伝子発現を可能
にするのに好適であることが示された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤ
ＮＡの評価を行った。形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの選択
及び維持は、１５ｕｇ／ｍＬ Ｇ４１８（液体培養用）を含むか又は３０ｕｇ／ｍＬ Ｇ
４１８（１．８％寒天を含む固体培養用）を含むＫｎｏｐ培地（０．２ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰ
Ｏ４、０．２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、及び１０ｍｇ／
Ｌ ＦｅＣｌ３を含む、ｐＨ６．０〜８．０、０．１％酵母エキス及び０．２％グルコー
スを補足）上で行った。Ｋｎｏｐ培地以外の培地におけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉ
ｐｓｏｉｄｅａの増殖が報告されている（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．７３：５（２００７），ｐｐ．１０５０−１０５６、Ｊａｒｖ
ｉｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１９（１９９
１），ｐｐ．３１７−３２１及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４（２００２），ｐｐ．６３−７３を参照）。Ｃｈｌｏｒｅｌｌ
ａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプ
ラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが報告
されている（Ｊａｒｖｉｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒｉｎ
ｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４（２００２），ｐｐ．６３−７３を参照）
。Ｃｈｅｎは、プラスミドｐＢｉｎＵΩＮＰ−１、ｕｂｉ１プロモーター、及びＡｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／タ
ーミネーターが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける外来遺伝子発現
を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｃｈｅｎは、ｐＢｉｎＵΩＮＰ−
１でコードされるＧ４１８耐性カセットが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅ
ａにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるＧ４１８に対する耐性を
付与するａｐｈ ３’遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＢｉｎ
ＵΩＮＰ−１が構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され
、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０か
ら選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列
は、表１９Ａ〜Ｄに従いＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの核遺伝子に固有
のコドンバイアスを反映するようにＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおけ
る発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コド
ン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＺｅａ ｍａｙｓ ｕｂ
ｉ１プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、
又は下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ
遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物
は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏ
ｉｄｅａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路
遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによる
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの安定な形質転換は、エレクトロポレーシ
ョン又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ａｐｈ
３’遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換された
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａを、限定はされないが、Ｇ４１８を含むＫ
ｎｏｐ寒天培地上で選択することができる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅ
ａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｋｎｏｐ培地並びにＪａｒｖ
ｉｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．により報告される培養培地が挙げら
れる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は
、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例１３：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉの操作
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、
本明細書において考察されるとおりＥｌ−Ｓｈｅｅｋｈ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及
びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｅｌ−Ｓｈｅｅ
ｋｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｉｕｍ，Ｖｏｌ．４２：２（１
９９９），ｐｐ．２０９−２１６は、プラスミドＤＮＡによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅ
ｓｓｌｅｒｉの安定な形質転換を報告した。Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈは、微粒子銃の形質転換
方法を用いて、プラスミドｐＢＩ１２１（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ４８５７８３）を
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉに導入した。プラスミドｐＢＩ１２１は、カナマ
イシン／ネオマイシン抗生物質耐性カセットを含んだ。このカナマイシン／ネオマイシン
抗生物質耐性カセットは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリ
ンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモーター、カナマイシン及びＧ４１８に対する耐性用
の、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａ
ｎｋ寄託番号ＡＡＬ９２０３９）をコードする配列、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネー
ターを含んだ。ｐＢＩ１２１はさらに、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結
され、且つｎｏｓ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、β−グ
ルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子産物をコードする配列を含んだ。形質転換前
、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉは、１５ｕｇ／Ｌカナマイシンを含む培養培地
で増殖することができなかった。ｐＢＩ１２１プラスミドによる形質転換後、１５ｍｇ／
Ｌカナマイシンを含む選択的培養培地で増殖するＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉ
の形質転換体が得られた。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉにおけるｎｐｔＩＩ遺
伝子産物の発現により、１５ｍｇ／Ｌカナマイシンの存在下における増殖が可能となり、
従ってＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉにおいて使用される選択可能なマーカーと
してのカナマイシン／ネオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。ＧＵＳ
遺伝子産物の検出可能な活性から、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター及びｎｏｓ ３’ＵＴ
Ｒが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける異種遺伝子発現を可能にするのに
好適であることが示された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価
を行った。Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈにより報告されるとおり、形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌ
ａ ｋｅｓｓｌｅｒｉの選択及び維持は、ＹＥＧ培地（１％酵母エキス、１％グルコース
）及び１５ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む半流動寒天プレート上で実施した。Ｅｌ−Ｓｈｅ
ｅｋｈはまた、ＹＥＧ液体培養培地におけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉの増
殖も報告した。脂質産生のためのＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉの培養に好適な
さらなる培地が、Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖｏｌ．１６３３（２００３），ｐｐ．２
７−３４に開示されている。Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈは、プラスミドｐＢＩ１２１、ＣａＭＶ
プロモーター、及びノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈｌｏ
ｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適であること
を報告した。加えて、Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈは、ｐＢＩ１２１でコードされるカナマイシン
／ネオマイシン耐性カセットが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける選択可
能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるカナマイシン／ネオマイ
シン耐性遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＢＩ１２１が構築さ
れ、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換
ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上
の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従
いＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映する
ようにＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける発現にコドン最適化されている。
表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タ
ンパク質コード配列の上流でＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結し、且つタ
ンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能
に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用
の、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相
同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択
され得る。形質転換ベクターによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉの安定な形質
転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現
される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形
質転換されたＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉを、限定はされないが、カナマイシ
ン又はネオマイシンを含むＹＥＧ寒天培地上で選択することができる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌ
ａ ｋｅｓｓｌｅｒｉ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＹＥＧ培
地、及びＳａｔｏ ｅｔ ａｌ．により報告される培養培地が挙げられる。Ｃｈｌｏｒｅ
ｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標
準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例１４：Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの操作
Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおける本発明に従う組換え遺伝子の
発現は、本明細書において考察されるとおりＷａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．が教示する方法
及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｗａｌｋｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ
．１７（２００５），ｐｐ．３６３−３６８は、プラスミドＤＮＡによるＤｕｎａｌｉｅ
ｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの安定な核形質転換を報告した。Ｗａｌｋｅｒは、エレ
クトロポレーションの形質転換方法を用いて、プラスミドｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２をＤ
ｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａに導入した。ｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２は
、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａリブロース−１，５−二リン酸カルボ
キシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット遺伝子（ｒｂｃＳ１、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番
号ＡＹ５３０１５５）のプロモーター及び３’ＵＴＲに動作可能に連結された、抗生物質
フレオマイシンに対する耐性用の、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕ
ｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（ｂｌｅ）をコードする配列を含むブレオマ
イシン抗生物質耐性カセットをコードする配列を含んだ。形質転換前、Ｄｕｎａｌｉｅｌ
ｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａは、１ｍｇ／Ｌフレオマイシンを含む培養培地で増殖する
ことができなかった。ｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２プラスミドによる形質転換後、１ｍｇ／
Ｌフレオマイシンを含む選択的培養培地で増殖するＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏ
ｌｅｃｔａの形質転換体が得られた。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａに
おけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、１ｍｇ／Ｌフレオマイシンの存在下における増殖
が可能となり、従ってＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおいて使用され
る選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立され
た。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｗａｌｋｅｒ
により報告されるとおり、形質転換したＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ
の選択及び維持は、４．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ及び１ｍｇ／Ｌフレオマイシン（ｐｈｅｏｍ
ｙｃｉｎ）をさらに含むＤｕｎａｌｉｅｌｌａ培地（ＤＭ、Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ ｅｔ
ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ，Ｖｏｌ．２５（１９５７
），ｐｐ．３９２−４２８により記載されるとおり）において実施した。脂質産生のため
のＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの培養に好適なさらなる培地は、Ｔａ
ｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉ
ｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１０１：３（２００６），ｐｐ．２２３−２２６及
びＭａｓｓａｒｔ ａｎｄ Ｈａｎｓｔｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｖｅｎｉｃｅ
２０１０，Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｅｎ
ｅｒｇｙ ｆｒｏｍ Ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ Ｗａｓｔｅにおいて考察される。Ｗａｌ
ｋｅｒは、プラスミドｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２並びにＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔ
ｉｏｌｅｃｔａリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブ
ユニット遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏ
ｌｅｃｔａにおける異種発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｗａ
ｌｋｅｒは、ｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２でコードされるブレオマイシン耐性カセットが、
Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおける選択可能なマーカーとして使用
するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｂｌｅ遺伝子産物をコー
ドするヌクレオチド配列を含むベクターｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２が構築され、脂質生合
成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作
成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成
経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＤｕｎａｌ
ｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するよう
にＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおける発現にコドン最適化されてい
る。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に
、タンパク質コード配列の上流でｒｂｃＳ１プロモーターに動作可能に連結し、且つタン
パク質コード配列の３’領域において、又は下流で、ｒｂｃＳ１ ３’ＵＴＲ／ターミネ
ーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的
ゲノム組み込み用の、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａゲノムとの相同性
領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム
部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔ
ｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの安定な形質転換は、エレクトロポレーション又は他の公知の方法
を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性をマー
カーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒ
ｔｉｏｌｅｃｔａを、限定はされないが、フレオマイシン（ｐｈｅｏｍｙｃｉｎ）を含む
ＤＭ培地上で選択することができる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ脂
質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＤＭ培地並びにＴａｋａｇｉ ｅ
ｔ ａｌ．及びＭａｓｓａｒｔ ａｎｄ Ｈａｎｓｔｏｎにより記載される培養培地が挙
げられる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ脂質の脂肪酸プロフィールの
評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することがで
きる。
実施例１５：Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉの操作
Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書
において考察されるとおりＨａｌｌｍａｎ ａｎｄ Ｒａｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．が教示
する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｈａ
ｌｌｍａｎ ａｎｄ Ｒａｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ，Ｖｏｌｕｍｅ １７（１９９９），ｐｐ．９９−１０９は、プラスミドＤＮＡによる
Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉの安定な核形質転換を報告した。Ｈａｌｌｍａｎ ａｎｄ
Ｒａｐｐｅｌは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、ｐｚｅｏＥプラスミドをＶｏｌｖ
ｏｘ ｃａｒｔｅｒｉに導入した。ｐｚｅｏＥプラスミドは、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅ
ｒｉ β−チューブリン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ２４５４７）のプロモーター
及び３’ＵＴＲに動作可能に連結された、抗生物質ゼオシンに対する耐性用の、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質
（ｂｌｅ）をコードする配列を含むブレオマイシン抗生物質耐性カセットをコードする配
列を含んだ。形質転換前、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉは、１．５ｕｇ／ｍｌゼオシン
を含む培養培地で増殖することができなかった。ｐｚｅｏＥプラスミドによる形質転換後
、２０ｕｇ／ｍｌ超のゼオシンを含む選択的培養培地で増殖するＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔ
ｅｒｉの形質転換体が得られた。Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉにおけるｂｌｅ遺伝子産
物の発現により、２０ｕｇ／ｍｌゼオシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＶ
ｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのブレオマイ
シン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体
のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｈａｌｌｍａｎ ａｎｄ Ｒａｐｐｅｌにより報告され
るとおり、形質転換したＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉの選択及び維持は、１ｍｇ／Ｌフ
レオマイシン（ｐｈｅｏｍｙｃｉｎ）を含むＶｏｌｖｏｘ培地（ＶＭ、Ｐｒｏｖａｓｏｌ
ｉ ａｎｄ Ｐｉｎｔｎｅｒ，Ｔｈｅ Ｅｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｌｇａｅ，Ｓｐｅｃｉ
ａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２（１９５９），Ｔｙｒｏｎ，Ｃ．Ａ．ａｎｄ
Ｈａｒｔｍａｎ，Ｒ．Ｔ．，ｅｄｓ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ｐｐ．８８−９６により記載されるとおり）において実施
した。脂質産生のためのＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉの培養に好適な培地はまた、Ｓｔ
ａｒｒによりＳｔａｒｒ Ｒ，Ｃ，．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｕｐｐｌ．，Ｖｏｌ．４（１
９７０），ｐｐ．５９−１００においても考察される。Ｈａｌｌｍａｎ ａｎｄ Ｒａｐ
ｐｅｌは、プラスミドｐｚｅｏＥ並びにＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ β−チューブリ
ン遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉにおける異種
発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｈａｌｌｍａｎ ａｎｄ Ｒ
ａｐｐｅｌは、ｐｚｅｏＥでコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｖｏｌｖｏｘ
ｃａｒｔｅｒｉにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報
告した。Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適で
、及びＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉにおける選択的マーカーとして使用するのに好適な
さらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマー
カーが報告されている（例えば、Ｈａｌｌａｍａｎｎ ａｎｄ Ｓｕｍｐｅｒ，Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ，Ｖｏｌ．９１（１９９４），ｐｐ １１５６２−１１５６６及びＨａｌｌｍａｎ
ａｎｄ Ｗｏｄｎｉｏｋ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ２
５（２００６），ｐｐ．５８２−５８１を参照）。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｂｌｅ遺伝子産物をコー
ドするヌクレオチド配列を含むベクターｐｚｅｏＥが構築され、脂質生合成経路発現カセ
ット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質
生合成経路発現カセットは、表１９から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質
をコードし、各タンパク質コード配列は、表９Ａ〜Ｄに従いＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒ
ｉの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉに
おける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、
コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＶｏｌｖｏｘ ｃａ
ｒｔｅｒｉ β−チューブリンプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード
配列の３’領域において、又は下流で、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ β−チューブリ
ン３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、
形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉゲノムとの
相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上の
ゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉゲ
ノムの配列内のそのような相同性領域を同定することができる（Ｐｒｏｃｈｎｉｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３２９：５９８８（２０１０），ｐｐ２２３−２２
６による文献において参照される）。形質転換ベクターによるＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅ
ｒｉの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換
技法によって実現される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換
ベクターで形質転換されたＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉを、限定はされないが、ゼオシ
ンを含むＶＭ培地上で選択することができる。Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ脂質産生に
好適な成長培地としては、限定はされないが、ＶＭ培地及びＳｔａｒｒにより考察される
培養培地が挙げられる。Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ脂質の脂肪酸プロフィールの評価
は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる
。
実施例１６：Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの操作
Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける本発明に従う組換え遺伝子
の発現は、本明細書において考察されるとおりＳｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｓａ
ｎｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成する
ことができる。簡潔に言えば、Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｓａｎｄｍａｎｎ
ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７２：１２（２００６），ｐｐ．７４７７−７４８４は、プラスミ
ドＤＮＡによるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの安定な核形質転換を
報告した。Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、プラスミド
ｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４ＲをＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓに
導入した。プラスミドｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒはノルフルラゾン耐性カセットを
含み、このカセットは、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓフィトエンデ
サチュラーゼ遺伝子（Ｐｄｓ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ７８１１７０）のプロモータ
ー、タンパク質コード配列、及び３’ＵＴＲを含み、ここでＰｄｓのタンパク質コード配
列は、除草剤ノルフルラゾンに対する耐性を付与する遺伝子産物（Ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒ）
をコードするように５０４位で改変された（それによりロイシンがアルギニンに変更され
た）。ｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒによる形質転換前、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｌｕｖｉａｌｉｓは、５ｕＭノルフルラゾンを含む培地上で増殖することができなか
った。ｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒプラスミドによる形質転換後、５ｕＭノルフルラ
ゾンを含む選択的培養培地で増殖するＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ
の形質転換体が得られた。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおけるＰ
ｄｓ−Ｌ５０４Ｒ遺伝子産物の発現により、５ｕＭノルフルラゾンの存在下における増殖
が可能となり、従ってＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおいて使用さ
れる選択可能なマーカーとしてのノルフルラゾン除草剤耐性カセットの有用性が確立され
た。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｓｔｅｉｎｂ
ｒｅｎｎｅｒにより報告されるとおり、形質転換したＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌ
ｕｖｉａｌｉｓの選択及び維持は、２．４２ｇ／Ｌトリス酢酸塩、及び５ｍＭノルフルラ
ゾンを補足したＯＨＡ培地（ＯＨＭ（０．４１ｇ／Ｌ ＫＮＯ３、０．０３ｇ／Ｌ Ｎａ
２ＨＰＯ４、０．２４６ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１１ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・
２Ｈ２Ｏ、２．６２ｍｇ／Ｌ Ｆｅ（ＩＩＩ）クエン酸塩×Ｈ２Ｏ、０．０１１ｍｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１２ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０７５ｍｇ
／Ｌ Ｃｒ２Ｏ３、０．９８ｍｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．１２ｍｇ／Ｌ Ｎａ
２ＭｏＯ４×２Ｈ２０、０．００５ｍｇ／Ｌ ＳｅＯ２及び２５ｍｇ／Ｌビオチン、１７
．５ｍｇ／Ｌチアミン、及び１５ｍｇ／ＬビタミンＢ１２）を含む寒天プレート上で実施
した。液体培地におけるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの増殖は、Ｓ
ｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｓａｎｄｍａｎｎにより、基本培地（Ｋｏｂａｙａｓ
ｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５９（１９９３），ｐｐ．８６７−８７３により記載される
とおりの基本培地）を使用して行った。Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｓａｎｄｍ
ａｎｎは、ｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒプラスミド並びにＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓフィトエンデサチュラーゼ遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ
が、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける異種発現を可能にするの
に好適であることを報告した。加えて、Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｓａｎｄｍ
ａｎｎは、ｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒでコードされるノルフルラゾン耐性カセット
が、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける選択可能なマーカーとし
て使用するのに好適であったことを報告した。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉ
ａｌｉｓにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモー
ター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが報告されている（Ｋａｔ
ｈｉｒｅｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．
４５（２００９），ｐｐ ６４２−６４９を参照）。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるＰｄｓ−Ｌ５０４Ｒ遺伝
子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒが
構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形
質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１
つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜
Ｄに従いＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの核遺伝子に固有のコドンバ
イアスを反映するようにＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける発現
にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適
化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｌｕｖｉａｌｉｓ ｐｄｓ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コ
ード配列の３’領域において、又は下流で、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａ
ｌｉｓ ｐｄｓ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。
形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内
在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質
転換ベクターによるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの安定な形質転換
は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現され
る。Ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクター
で形質転換されたＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓを、限定はされない
が、ノルフルラゾンを含むＯＨＡ培地上で選択することができる。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、基
本培地並びにＫｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｋａｔｈｉｒｅｓａｎ ｅｔ ａｌ、
及びＧｏｎｇ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｃｏ
ｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９：５（１９９７），ｐｐ．４３７−４４４により記載される培養培
地が挙げられる。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ脂質の脂肪酸プロフ
ィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価する
ことができる。
実施例１７：Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌ
ｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の操作
Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒ
ａｌｅ複合体における本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察される
とおりＡｂｅ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成する
ことができる。簡潔に言えば、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５２：９（２０１１），ｐｐ．１６７６−１６８５は、プラスミ
ドＤＮＡによるＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−
ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の安定な核形質転換を報告した。Ａｂｅは、微粒子銃の形質転
換方法を用いて、プラスミドｐＳＡ１０６をＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓ
ｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体に導入した。プラスミドｐＳＡ１
０６は、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔ
ｔｏｒａｌｅ複合体クロロフィルａ／ｂ−結合タンパク質遺伝子（ＣＡＢ、ＧｅｎＢａｎ
ｋ寄託番号ＡＢ３６３４０３）のプロモーター及び３’ＵＴＲに動作可能に連結された、
Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タ
ンパク質遺伝子（ｂｌｅ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＡ３７０５０）をコードする配列
を含むブレオマイシン耐性カセットを含んだ。ｐＳＡ１０６による形質転換前、Ｃｌｏｓ
ｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合
体は、３ｕｇ／ｍｌフレオマイシンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＳＡ
１０６による形質転換後、３ｕｇ／ｍｌフレオマイシンを含む選択的培養培地で増殖する
Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａ
ｌｅ複合体の形質転換体が得られた。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−
ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体におけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により
、３ｕｇ／ｍｌフレオマイシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＣｌｏｓｔｅ
ｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体に
おいて使用される選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有
用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った
。Ａｂｅにより報告されるとおり、形質転換したＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒ
ｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の選択及び維持は、初めにＣ
培地（０．１ｇ／Ｌ ＫＮＯ３、０．０１５ｇ／Ｌ Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ、０．
０５ｇ／Ｌグリセロリン酸塩−Ｎａ２、０．０４ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５
ｇ／Ｌトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン、微量ミネラル、ビオチン、ビタミン
Ｂ１及びＢ１２）を含む上層寒天において実施した後、続いてフレオマイシンを補足した
Ｃ培地を含む寒天プレートに単離した。Ａｂｅにより報告されるとおり、液体培地におけ
るＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒ
ａｌｅ複合体の増殖は、Ｃ培地で行った。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕ
ｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の増殖に好適なさらなる液体培養培
地は、Ｓｅｋｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０：４（２００
３），ｐｐ．１４７−１５３により考察される。Ａｂｅは、ｐＳＡ１０６プラスミド並び
にＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒ
ａｌｅ複合体ＣＡＢ遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐ
ｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における異種遺
伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ａｂｅは、ｐＳＡ１０６
でコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒ
ｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における選択可能なマーカー
として使用するのに好適であったことを報告した。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅ
ｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における異種遺伝子発現を
可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター
、及び選択可能なマーカーが報告されている（Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅ
ｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４９（２００８），ｐｐ．６２５−６３２を参照
）。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｂｌｅ遺伝子産物をコー
ドするヌクレオチド配列を含むベクターｐＳＡ１０６が構築され、脂質生合成経路発現カ
セット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂
質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク
質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ
ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の核遺伝子に
固有のコドンバイアスを反映するようにＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ
−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における発現にコドン最適化されてい
る。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に
、タンパク質コード配列の上流でＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔ
ｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体ＣＡＢ遺伝子プロモーターに動作可能に連結
し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ
ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体ＣＡＢ遺伝
子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、
形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏ
ｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体ゲノムとの相同性領域をさらに
含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊す
るように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒ
ｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の安定な形質転換は、微粒子
銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ｂｌｅ
遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣｌｏ
ｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複
合体を、限定はされないが、フレオマイシンを含むＣ培地上で選択することができる。Ｃ
ｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌ
ｅ複合体脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｃ培地並びにＡｂｅ
ｅｔ ａｌ．及びＳｅｋｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．により報告される培養培地が挙げられ
る。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏ
ｒａｌｅ複合体脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質
抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例１８：Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓの操作
Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、
本明細書において考察されるとおりＳｕｎ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを
改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅ
ｎｅ，Ｖｏｌ．３７７（２００６），ｐｐ．１４０−１４９は、プラスミドＤＮＡによる
Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓの安定な形質転換を報告した。Ｓｕｎは、エレク
トロポレーション（ｅｌｅｃｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）の形質転換方法を用いて、完全なＤ
ｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ硝酸還元酵素遺伝子をコードするプラスミドｐＤＶ
ＮＲを、突然変異体Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖ
ｉｒｉｄｉｓ ＮＲ突然変異体）に導入した。このＮＲ突然変異体は、窒素源として硝酸
塩を使用しない限り成長できない。硝酸還元酵素は硝酸塩から亜硝酸塩への変換を触媒す
る。形質転換前、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＮＲ突然変異体は、唯一の窒
素源として硝酸塩（ＮＯ３ −）を含む培養培地において増殖することができなかった。Ｎ
Ｒ突然変異体Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓにおけるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖ
ｉｒｉｄｉｓ ＮＲ遺伝子産物の発現を選択可能なマーカーとして使用して、硝酸塩代謝
の欠損を取り戻した。ｐＤＶＮＲプラスミドによる形質転換後、単一炭素源として硝酸塩
を含む寒天プレート上で成長可能な、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＮＲ遺伝
子産物を安定的に発現するＮＲ突然変異体Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓが得ら
れた。サザン解析により、安定な形質転換体のＤＮＡの評価を行った。形質転換したＤｕ
ｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ（ＮＲ突然変異体）の選択及び維持は、５ｍＭ ＫＮ
Ｏ３を含む寒天プレート上で行った。Ｓｕｎはまた、液体培養培地におけるＤｕｎａｌｉ
ｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ及びＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＮＲ突然変異体
の増殖も報告した。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓの増殖に好適なさらなる培地
は、Ｇｏｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙ
ｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０：２（１９９８），ｐｐ．１３５−１４４及びＭｏｕｌｔｏ
ｎ ａｎｄ Ｂｕｒｆｏｒｄ，Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，Ｖｏｌｓ．２０４−２０５
：１（１９９０），ｐｐ．４０１−４０８により報告される。Ｓｕｎは、プラスミドｐＤ
ＶＮＲ並びにＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ硝酸還元酵素遺伝子のプロモーター
及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＮＲ突然
変異体における異種発現を可能にするのに好適であったことを報告した。Ｓｕｎはまた、
Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ硝酸還元酵素遺伝子産物の発現が、Ｄｕｎａｌｉ
ｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＮＲ突然変異体における選択可能なマーカーとして使用する
のに好適であったことも報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ
ｖｉｒｉｄｉｓ硝酸還元酵素（ＤｖＮＲ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含
むベクターｐＤＶＮＲが構築され、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように
改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合成経路発現カセットは、
表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コ
ード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓの核遺伝子に固
有のコドンバイアスを反映するようにＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓにおける発
現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最
適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＤｖＮＲプロモーターに動作
可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、ＤｖＮＲ
３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形
質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓゲノ
ムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ
以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＤｕｎａｌｉ
ｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＮＲ突然変異体の安定な形質転換は、エレクトロポレーショ
ン（ｅｌｅｃｔｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）又は他の公知の方法を含む周知されている形質転
換技法によって実現される。ＤｖＮＲ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして用い
ることにより、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＮＲ突然変異株の窒素同化の欠
損を取り戻し、形質転換ベクターを安定的に発現するＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄ
ｉｓ ＮＲ突然変異体を選択することができる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ
脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｕ
ｌｔｏｎ ａｎｄ Ｂｕｒｆｏｒｄ、及びＧｏｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．により考察さ
れる培地が挙げられる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ脂質の脂肪酸プロフィー
ルの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価すること
ができる。
実施例１９：Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａの操作
Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本
明細書において考察されるとおりＧｅｎｇ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを
改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５（２００３）
，ｐｐ．４５１−４５６は、プラスミドＤＮＡによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎ
ａの安定な形質転換を報告した。Ｇｅｎｇは、エレクトロポレーションの形質転換方法を
用いて、ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴプラスミドをＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａに
導入した。ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴは、ＨＢｓＡＧタンパク質コード領域の上流でＺｅ
ａ ｍａｙｓ ｕｂｉ１プロモーターに動作可能に連結され、且つＨＢｓＡＧタンパク質
コード領域の下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシ
ンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、Ｂ型
肝炎表面抗原をコードする配列を含むＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡＧ）発現カセットを含
む。ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴは、シミアンウイルス４０プロモーター及びエンハンサー
に動作可能に連結された、抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性を付与するクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子産物をコードする配列を含
むクロラムフェニコール耐性カセットをさらに含んだ。ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴによる
形質転換前、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａは、６０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコー
ルを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴプラスミドに
よる形質転換後、６０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含む選択的培養培地で増殖するＤ
ｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａの形質転換体が得られた。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓ
ａｌｉｎａにおけるＣＡＴ遺伝子産物の発現により、６０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール
の存在下における増殖が可能となり、従ってＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａにおい
て使用される選択可能なマーカーとしてのクロラムフェニコール耐性カセットの有用性が
確立された。ＨＢｓＡｇ遺伝子産物の検出可能な活性から、ｕｂｉ１プロモーター及びｎ
ｏｓ ３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａにおける遺
伝子発現を可能にするのに好適であることが示された。サザン解析により、安定な形質転
換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｇｅｎｇは、形質転換したＤｕｎａｌｉｅｌｌａ
ｓａｌｉｎａの選択及び維持を、６０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含むＪｏｈｎｓｏ
ｎ培地（Ｊ１、Ｂｏｒｏｗｉｔｚｋａ ａｎｄ Ｂｏｒｏｗｉｔｚｋａ（ｅｄｓ），Ｍｉ
ｃｒｏ−ａｌｇａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ｐｐ．４６０−４６１により記載される）
を含む寒天プレート上で行ったことを報告した。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａの
液体増殖は、Ｇｅｎｇにより、６０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含むＪ１培地におい
て行われた。Ｊ１培地以外の培地におけるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａの増殖が
考察されている（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ．
３６（２００９），ｐｐ．１４３３−１４３９及びＢｏｒｏｗｉｔｚｋａ ｅｔ ａｌ．
，Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，Ｖｏｌｓ．１１６−１１７：１（１９８４），ｐｐ．１
１５−１２１を参照）。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａにおける異種遺伝子発現を
可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター
、及び選択可能なマーカーが、Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．により報告されている。Ｇｅｎｇ
は、プラスミドｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴ、ｕｂｉ１プロモーター、及びＡｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネ
ーターが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａにおける外来遺伝子発現を可能にするの
に好適であることを報告した。加えて、Ｇｅｎｇは、ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴでコード
されるＣＡＴ耐性カセットが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａにおける選択可能な
マーカーとして使用するのに好適であったことを報告する。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるＣＡＴ遺伝子産物をコー
ドするヌクレオチド配列を含むベクターｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴが構築され、脂質生合
成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作
成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成
経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＤｕｎａｌ
ｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＤｕｎａ
ｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生
合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配
列の上流でｕｂｉ１プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’
領域において、又は下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパ
リンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。
形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ
ｓａｌｉｎａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合
成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクター
によるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａの安定な形質転換は、エレクトロポレーショ
ン又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ＣＡＴ遺
伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換され
たＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａを、限定はされないが、クロラムフェニコールを
含むＪ１培地において選択することができる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ脂質
産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｊ１培地並びにＦｅｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．及びＢｏｒｏｗｉｔｚｋａ ｅｔ ａｌ．により記載される培養培地が挙げられる。
Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記
載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例２０：Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌの操作
Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細
書において考察されるとおりＬｅｒｃｈｅ ａｎｄ Ｈａｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．が教
示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｌ
ｅｒｃｈｅ ａｎｄ Ｈａｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ９：６４，２００９は、プラスミドＤＮＡによるＧｏｎｉｕｍ ｐ
ｅｃｔｏｒａｌｅの安定な核形質転換を報告した。Ｌｅｒｃｈｅは、微粒子銃の形質転換
方法を用いて、プラスミドｐＰｍｒ３をＧｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅに導入した。
プラスミドｐＰｍｒ３は、ａｐｈＶＩＩＩタンパク質コード領域の上流でＶｏｌｖｏｘ
ｃａｒｔｅｒｉ ｈｓｐ７０Ａ−ｒｂｃＳ３ハイブリッドプロモーターに動作可能に連結
され、且つａｐｈＶＩＩＩタンパク質コード領域の下流でＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ
ｒｂｃＳ３遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、抗生物質パ
ロモマイシンに対する耐性用の、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓのアミノグ
リコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ａｐｈＶＩＩＩ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎ
ｋ寄託番号ＡＡＢ０３８５６）をコードする配列を含むパロモマイシン耐性カセットを含
んだ。ｐＰｍｒ３による形質転換前、Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅは、０．０６ｕ
ｇ／ｍｌパロモマイシンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＰｍｒ３による
形質転換後、０．７５ｕｇ／ｍｌ以上のパロモマイシンを含む選択的培養培地で増殖する
Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅの形質転換体が得られた。Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏ
ｒａｌｅにおけるａｐｈＶＩＩＩ遺伝子産物の発現により、０．７５ｕｇ／ｍｌ以上のパ
ロモマイシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＧｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａ
ｌｅにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのパロモマイシン抗生物質耐性カセッ
トの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を
行った。Ｌｅｒｃｈｅ ａｎｄ Ｈａｌｌｍａｎは、形質転換したＧｏｎｉｕｍ ｐｅｃ
ｔｏｒａｌｅの選択及び維持を、１．０ｕｇ／ｍｌパロモマイシンを含む液体Ｊａｗｏｒ
ｓｋｉ培地（２０ｍｇ／Ｌ Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ、１２．４ｍｇ／Ｌ ＫＨ２Ｐ
Ｏ４、５０ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１５．９ｍｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３、２．２
５ｍｇ／Ｌ ＥＤＴＡ−ＦｅＮａ、２．２５ｍｇ／Ｌ ＥＤＴＡ Ｎａ２、２．４８ｇ／
Ｌ Ｈ３ＢＯ３、１．３９ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、１ｍｇ／Ｌ（ＮＨ４）６ＭＯ
７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ、０．０４ｍｇ／ＬビタミンＢ１２、０．０４ｍｇ／Ｌチアミン−Ｈ
Ｃｌ、０．０４ｍｇ／Ｌビオチン、８０ｍｇ／Ｌ ＮａＮＯ３、３６ｍｇ／Ｌ Ｎａ４Ｈ
ＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ）において行ったことを報告した。Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌ
ｅにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、
３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーが、Ｌｅｒｃｈｅ ａｎｄ Ｈａ
ｌｌｍａｎによりさらに考察される。Ｌｅｒｃｈｅ ａｎｄ Ｈａｌｌｍａｎは、プラス
ミドｐＰｍｒ３、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ ｈｓｐ７０Ａ−ｒｂｃＳ３ハイブリッ
ドプロモーター、及びＶｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ ｒｂｃＳ３遺伝子の３’ＵＴＲ／
ターミネーターが、Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅにおける外来遺伝子発現を可能に
するのに好適であることを報告した。加えて、Ｌｅｒｃｈｅ ａｎｄ Ｈａｌｌｍａｎは
、パロモマイシン耐性カセットコードされるｐＰｍｒ３が、Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒ
ａｌｅにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるａｐｈＶＩＩＩ遺伝子産
物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＰｍｒ３が構築され、脂質生合成経路
発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成され
る。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タ
ンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＧｏｎｉｕｍ ｐ
ｅｃｔｏｒａｌｅの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＧｏｎｉｕｍ ｐ
ｅｃｔｏｒａｌｅにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タ
ンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流で
Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ ｈｓｐ７０Ａ−ｒｂｃＳ３ハイブリッドプロモーターに
動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｖｏｌ
ｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ ｒｂｃＳ３遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連
結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、
Ｇｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域
は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る
。形質転換ベクターによるＧｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅの安定な形質転換は、微粒
子銃又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現することができ
る。ａｐｈＶＩＩＩ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベ
クターで形質転換されたＧｏｎｉｕｍ ｐｅｃｔｏｒａｌｅを、限定はされないが、パロ
モマイシンを含むＪａｗｏｒｓｋｉ培地において選択することができる。Ｇｏｎｉｕｍ
ｐｅｃｔｏｒａｌｅ脂質産生に好適な成長培地としては、Ｊａｗｏｒｓｋｉ培地及びＳｔ
ｅｉｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ，Ｖｏｌ．４５：９（
１９５８），ｐｐ．６６４−６７２により報告される培地が挙げられる。Ｇｏｎｉｕｍ
ｐｅｃｔｏｒａｌｅ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な
脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例２１：Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの操作
Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける本発明に従う組換え遺
伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＡｐｔ ｅｔ ａｌ．が教示する方法
及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ａｐｔ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．
２５２（１９９６），ｐｐ．５７２−５７９は、ベクターＤＮＡによるＰｈａｅｏｄａｃ
ｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの安定な核形質転換を報告した。Ａｐｔは、微粒子
銃の形質転換技法を用いて、プラスミドｐｆｃｐＡをＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒ
ｉｃｏｒｎｕｔｕｍに導入した。プラスミドｐｆｃｐＡは、ｂｌｅタンパク質コード領域
の上流でＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍフコキサンチンクロロフ
ィルａ結合タンパク質遺伝子（ｆｃｐＡ）のプロモーターに動作可能に連結され、且つｂ
ｌｅタンパク質コード領域の３’領域において、又は下流で、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕ
ｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ ｆｃｐＡ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能
に連結された、抗生物質フレオマイシン及びゼオシンに対する耐性用の、Ｓｔｒｅｐｔｏ
ａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（ｂｌ
ｅ）をコードする配列を含むブレオマイシン耐性カセットを含んだ。ｐｆｃｐＡによる形
質転換前、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍは、５０ｕｇ／ｍｌゼ
オシンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐｆｃｐＡによる形質転換後、５０
ｕｇ／ｍｌゼオシンを含む選択的培養培地で増殖するＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒ
ｉｃｏｒｎｕｔｕｍの形質転換体が得られた。Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏ
ｒｎｕｔｕｍにおけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、５０ｕｇ／ｍｌゼオシンの存在下
における増殖が可能となり、従ってＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕ
ｍにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセット
の有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行
った。Ａｐｔは、形質転換したＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの
選択及び維持を、５０ｍｇ／Ｌゼオシンを含むＬＤＭ培地（Ｓｔａｒｒ ａｎｄ Ｚｅｉ
ｋｕｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９，Ｓｕｐｐｌｅｍｅ
ｎｔ，（１９９３）により報告されるとおり）を含む寒天プレート上で行ったことを報告
した。Ａｐｔは、５０ｍｇ／Ｌゼオシンを含むＬＤＭ培地におけるＰｈａｅｏｄａｃｔｙ
ｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ形質転換体の液体増殖を報告した。ＬＤＭ培地以外の培
地におけるＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの増殖が（Ｚａｓｌａ
ｖｓｋａｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２９２（２００１），ｐｐ．２
０７３−２０７５により、及びＲａｄｏｋｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉ
ｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１３（２０１１），ｐｐ．８９−９５により）考
察されている。Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける異種遺伝
子発現を可能にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミ
ネーター、及び選択可能なマーカーが、Ａｐｔ ｅｔ ａｌ．、Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａ
ｅｔ ａｌ．、及びＲａｄｏｋｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．による同じ報告に報告されて
いる。Ａｐｔは、プラスミドｐｆｃｐＡ、並びにＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃ
ｏｒｎｕｔｕｍ ｆｃｐＡプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｐｈａｅｏ
ｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好
適であることを報告した。加えて、Ａｐｔは、ｐｆｃｐＡでコードされるブレオマイシン
耐性カセットが、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける選択可
能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｂｌｅ遺伝子産物をコー
ドするヌクレオチド配列を含むベクターｐｆｃｐＡが構築され、脂質生合成経路発現カセ
ット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質
生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質
をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕ
ｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＰｈａ
ｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける発現にコドン最適化されている
。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、
タンパク質コード配列の上流でＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ
ｆｃｐＡ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域
において、又は下流で、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ ｆｃｐ
Ａ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築
物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒ
ｉｃｏｒｎｕｔｕｍゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質
生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｐ
ｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍゲノムの配列内のそのような相同性
領域を同定することができる（Ｂｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４
５６（２００８），ｐｐ．２３９−２４４による文献において参照される）。形質転換ベ
クターによるＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの安定な形質転換は
、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される
。ｂｌｅ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換され
たＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍを、限定はされないが、パロモ
マイシンを含むＬＤＭ培地において選択することができる。Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ
ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｒａ
ｄｏｋｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．により報告されるとおりのｆ／２培地が挙げられる。Ｐ
ｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は
、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例２２：Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．の操作
Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．における本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細
書において考察されるとおりＹａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベク
ターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５９：２（２０
１１），ｐｐ．１１３−１１９は、プラスミドＤＮＡによるＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓ
ｐ．の安定な核形質転換を報告した。Ｙａｍａｇｕｃｈｉは、微粒子銃の形質転換方法を
用いて、プラスミドｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔをＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．に導入した
。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔは、ｎａｔタンパク質コード領域の上流でＴｈａｌａｓｓｉｏｓ
ｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａフコキサンチンクロロフィルａ／ｃ結合タンパク質遺伝子
（ｆｃｐ）プロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ｎａｔタンパク質コード
配列の下流）でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ ｆｃｐ遺伝子３’
ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ヌルセオトリシンアセチルトランスフ
ェラーゼ（ｎａｔ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＣ６０４３９）をコードす
る配列を含むヌルセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性カセットを含んだ
。ｎａｔ遺伝子産物は、抗生物質ヌルセオトリシンに対する耐性を付与する。ｐＴｐｆｃ
ｐ／ｎａｔによる形質転換前、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．は、５００ｕｇ／ｍｌヌ
ルセオトリシンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔによ
る形質転換後、５００ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンを含む選択的培養培地で増殖するＣｈ
ａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．の形質転換体が得られた。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．
におけるｎａｔ遺伝子産物の発現により、５００ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンの存在下に
おける増殖が可能となり、従ってＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．において使用される選
択可能なマーカーとしてのヌルセオトリシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された
。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｙａｍａｇｕｃ
ｈｉは、形質転換したＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．の選択及び維持を、５００ｕｇ／
ｍｌヌルセオトリシンを含むｆ／２培地（Ｇｕｉｌａｒｄ，Ｒ．Ｒ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ ｆｏｒ ｆｅｅｄｉｎｇ ｍａｒｉｎｅ ｉｎｖｅ
ｒｔｅｂｒａｔｅｓ，Ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ
ａｔｅ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｃｈａｎｌｅｙ（ｅｄｓ）１９７５，Ｐ
ｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６−６０により報告されるとおり
）を含む寒天プレート上で行ったことを報告した。Ｙａｍａｇｕｃｈｉにより実施された
とおりの、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．形質転換体の液体増殖を、５００ｍｇ／Ｌヌ
ルセオトリシンを含むｆ／２培地で行った。さらなる培養培地におけるＣｈａｅｔｏｃｅ
ｒｏｓ ｓｐ．の増殖が（例えば、Ｎａｐｏｌｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｖｏｌ．２
１：２（１９９０），ｐｐ．１２２−１３０において、及びＶｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２８：３（１９８９），ｐｐ．２１９−２４０に
より）報告されている。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．における異種遺伝子発現を可能
にするのに好適なさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及
び選択可能なマーカーが、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．による同じ報告に報告され
ている。Ｙａｍａｇｕｃｈｉは、プラスミドｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔ、並びにＴｈａｌａｓ
ｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ ｆｃｐプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネ
ーターが、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．における外来遺伝子発現を可能にするのに好
適であることを報告した。加えて、Ｙａｍａｇｕｃｈｉは、ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔでコー
ドされるヌルセオトリシン耐性カセットが、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．における選
択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｎａｔ遺伝子産物をコー
ドするヌクレオチド配列を含むベクターｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔが構築され、脂質生合成経
路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成さ
れる。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路
タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＣｈａｅｔｏｃ
ｅｒｏｓ ｃｏｍｐｒｅｓｓｕｍの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するように近
縁のＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃｏｍｐｒｅｓｓｕｍにおける発現にコドン最適化されて
いる。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々
に、タンパク質コード配列の上流でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ
ｆｃｐ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域
において、又は下流で、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ ｆｃｐ遺
伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は
、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．ゲノム
との相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以
上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｈａｅｔｏｃ
ｅｒｏｓ ｓｐ．の安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含む周知されてい
る形質転換によって実現される。ｎａｔ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使
用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．を、限定は
されないが、ヌルセオトリシンを含むｆ／２寒天培地において選択することができる。Ｃ
ｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、
ｆ／２培地、並びにＮａｐｏｌｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．及びＶｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａ
ｌ．により考察される培養培地が挙げられる。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．脂質の脂
肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によっ
て評価することができる。
実施例２３：Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの操作
Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおける本発明に従う組換え遺伝
子の発現は、本明細書において考察されるとおりＰｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒ
ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる
。簡潔に言えば、Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．２７２（２００５），ｐｐ．３４１３−３４２３は、プラスミド
ＤＮＡによるＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの形質転換を報告した
。Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、ｐＣＦ
−ｂｌｅプラスミドをＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓに導入した。
プラスミドｐＣＦ−ｂｌｅは、ｂｌｅタンパク質コード領域の上流でＣｙｌｉｎｄｒｏｔ
ｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓフコキサンチン（ｆｕｃｏｚａｎｔｈｉｎ）クロロフィ
ルａ／ｃ結合タンパク質遺伝子（ｆｃｐＡ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ１２５５８０）
プロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ｂｌｅタンパク質コード領域の下流
）でＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ ｆｃｐＡ遺伝子３’ＵＴＲ／
ターミネーターに動作可能に連結された、抗生物質ゼオシン及びフレオマイシンに対する
耐性用の、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイ
シン結合タンパク質（ｂｌｅ）をコードする配列を含むブレオマイシン耐性カセットを含
んだ。ｐＣＦ−ｂｌｅによる形質転換前、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒ
ｍｉｓは、１ｍｇ／ｍｌゼオシンを含む培地上で増殖することができなかった。ｐＣＦ−
ｂｌｅによる形質転換後、１ｍｇ／ｍｌゼオシンを含む選択的培養培地で増殖するＣｙｌ
ｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの形質転換体が得られた。Ｃｙｌｉｎｄｒ
ｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、１ｍｇ／
ｍｌゼオシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ
ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗
生物質耐性カセットの有用性が確立された。Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒは、
形質転換したＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの選択及び維持を、１
ｍｇ／ｍｌゼオシン含有の人工海水培地を含む寒天プレート上で行ったことを報告した。
Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒは、１ｍｇ／ｍｌゼオシンを含む人工海水培地に
おけるＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ形質転換体の液体増殖を報告
した。さらなる培養培地におけるＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの
増殖が（例えば、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７：１（２００５），ｐｐ．６１−６５において、及び
Ｏｒｃｕｔｔ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖｏｌ．９：１２（１９７
４），ｐｐ．１０００−１００３により）考察されている。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓ
ｐ．における異種遺伝子発現を可能にするためのさらなるプラスミド、プロモーター、及
び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒによる同じ報
告に報告されている。Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒは、プラスミドｐＣＦ−ｂ
ｌｅ並びにＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ ｆｃｐプロモーター及
び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ
における外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｐｏｕｌ
ｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒは、ｐＣＦ−ｂｌｅでコードされるブレオマイシン耐性カ
セットが、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおける選択可能なマー
カーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｂｌｅ遺伝子産物をコー
ドするヌクレオチド配列を含むベクターｐＣＦ−ｂｌｅが構築され、脂質生合成経路発現
カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。
脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパ
ク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈ
ｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｙ
ｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおける発現にコドン最適化されている
。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、
タンパク質コード配列の上流でＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ ｆ
ｃｐ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域にお
いて、又は下流で、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ ｆｃｐ遺伝子
３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形
質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏ
ｒｍｉｓゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路
遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによる
Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの安定な形質転換は、微粒子銃又は
他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現される。ｂｌｅ遺伝子
産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＣ
ｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓを、限定はされないが、ゼオシンを含
む人工海水寒天培地において選択することができる。Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕ
ｓｉｆｏｒｍｉｓ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、人工海水並び
にＬｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．及びＯｒｃｕｔｔ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎにより報告
される培地が挙げられる。Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ脂質の脂
肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によっ
て評価することができる。
実施例２４：Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．の操作
Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．における本発明に従う組換え遺伝子の発現は、本明細
書において考察されるとおりｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ
．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言え
ば、ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ
Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１３：３（１９９８），ｐｐ．４２７−４３５は、プラスミ
ドＤＮＡによるＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．の安定な形質転換を報告した。ｔｅｎ
Ｌｏｈｕｉｓは、炭化ケイ素ウィスカーの存在下における撹拌の形質転換技法を用いて、
プラスミドｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳをＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．に導入した。ｐＭ
Ｔ ＮＰＴ／ＧＵＳは、ｎｐｔＩＩタンパク質コード領域の上流、又は５’でＡｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモ
ーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ｎｐｔＩＩタンパク質コード領域の下流）
でｎｏｓ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＬ
９２０３９）をコードする配列を含むネオマイシン耐性カセットを含んだ。ｎｐｔＩＩ遺
伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。ｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳプラス
ミドは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結され、且つＣａＭＶ ３５Ｓ
３’ＵＴＲ／ターミネーターにさらに動作可能に連結された、β−グルクロニダーゼ（Ｇ
ＵＳ）レポーター遺伝子産物をコードする配列をさらに含んだ。ｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳ
による形質転換前、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．は、３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む
培地で増殖することができなかった。ｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳによる形質転換後、３ｍｇ
／ｍｌ Ｇ４１８を含む選択的培養培地で増殖するＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．の形
質転換体が得られた。Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．におけるｎｐｔＩＩ遺伝子産物の
発現により、３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８の存在下における増殖が可能となり、従ってＡｍｐ
ｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．において使用される選択可能なマーカーとしてのネオマイシン
抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。ＧＵＳレポーター遺伝子の検出可能な活性
から、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ
．における遺伝子発現を可能にするのに好適であることが示された。サザン解析により、
安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉ
ｌｌｅｒは、Ｆ／２濃縮溶液（供給業者Ｓｉｇｍａにより提供される）及び３ｍｇ／ｍｌ
Ｇ４１８を補足した海水を含む培地におけるＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ形質転換体
の液体増殖並びにＦ／２濃縮溶液及び３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補足した海水を含む寒天
培地でのＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．形質転換体の選択及び維持を報告した。さらな
る培養培地におけるＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．の増殖が（例えば、Ｍａｎｓｏｕｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ
．１７：４（２００５）ｐｐ．２８７−ｖ３００において）報告されている。Ａｍｐｈｉ
ｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．における異種遺伝子発現を可能にするための、さらなるプロモータ
ー、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーを含む、さらなるプラスミド
が、ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒによる同じ報告に報告されている。ｔ
ｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒは、プラスミドｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳ並び
にｎｏｓ及びＣａＭＶ ３５Ｓ遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが
、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．における外来遺伝子発現を可能にするのに好適である
ことを報告した。加えて、ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒは、ｐＭＴ Ｎ
ＰＴ／ＧＵＳでコードされるネオマイシン耐性カセットが、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓ
ｐ．における選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｎｐｔＩＩ遺伝子産物を
コードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳが構築され、脂質生
合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが
作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合
成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従い近縁種Ａ
ｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｃａｒｔｅｒａｅの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映する
ようにＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．における発現にコドン最適化されている。表２０
の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク
質コード配列の上流でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシ
ンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列
の３’領域において、又は下流で、ｎｏｓ ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連
結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、
Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．ゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は
、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。
形質転換ベクターによるＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．の安定な形質転換は、シリコン
繊維媒介マイクロインジェクション又は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技
法によって実現される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用し
て、形質転換ベクターで形質転換されたＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．を、限定はされ
ないが、Ｇ４１８を含む海水寒天培地において選択することができる。Ａｍｐｈｉｄｉｎ
ｉｕｍ ｓｐ．脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、人工海水並びに
Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．及びｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒにより
報告される培地が挙げられる。Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．脂質の脂肪酸プロフィー
ルの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価すること
ができる。
実施例２５：Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの操作
Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける本発明に従う
組換え遺伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎ
ｄ Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及びベクターを改良することにより達成
することができる。簡潔に言えば、ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１３：３（１９９８），ｐｐ
．４２７−４３５は、プラスミドＤＮＡによるＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａ
ｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの安定な形質転換を報告した。ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓは、シリコン
繊維媒介マイクロインジェクションの形質転換技法を用いて、プラスミドｐＭＴ ＮＰＴ
／ＧＵＳをＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍに導入した。
ｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳは、ｎｐｔＩＩタンパク質コード領域の上流、又は５’でＡｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プ
ロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ｎｐｔＩＩタンパク質コード領域の下
流）でｎｏｓ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ａ
ＡＬ９２０３９）をコードする配列を含むネオマイシン耐性カセットを含んだ。ｎｐｔＩ
Ｉ遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。ｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳプ
ラスミドは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結され、且つＣａＭＶ ３５
Ｓ ３’ＵＴＲ／ターミネーターにさらに動作可能に連結された、β−グルクロニダーゼ
（ＧＵＳ）レポーター遺伝子産物をコードする配列をさらに含んだ。ｐＭＴ ＮＰＴ／Ｇ
ＵＳによる形質転換前、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍ
は、３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む培地で増殖することができなかった。ｐＭＴ ＮＰＴ
／ＧＵＳによる形質転換後、３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む選択的培養培地で増殖するＳ
ｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの形質転換体が得られた。
Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおけるｎｐｔＩＩ遺伝
子産物の発現により、３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８の存在下における増殖が可能となり、従っ
てＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおいて使用される選
択可能なマーカーとしてのネオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。Ｇ
ＵＳレポーター遺伝子の検出可能な活性から、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター及び３’Ｕ
ＴＲが、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける遺伝子
発現を可能にするのに好適であることが示された。サザン解析により、安定な形質転換体
のゲノムＤＮＡの評価を行った。ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒは、Ｆ／
２濃縮溶液（供給業者Ｓｉｇｍａにより提供される）及び３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補足
した海水を含む培地におけるＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃ
ｕｍ形質転換体の液体増殖並びにＦ／２濃縮溶液及び３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補足した
海水を含む寒天培地でのＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍ
形質転換体の選択及び維持を報告した。さらなる培養培地におけるＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉ
ｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの増殖が（例えば、Ｉｇｌｅｓｉａｓ−Ｐｒｉ
ｅｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａ
ｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．８９：２１（１９９２）ｐｐ．１０３
０２−１０３０５において）考察されている。Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａ
ｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける異種遺伝子発現を可能にするための、さらなるプロモータ
ー、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーを含む、さらなるプラスミド
が、ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒによる同じ報告において考察されてい
る。ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒは、プラスミドｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵ
Ｓ並びにｎｏｓ及びＣａＭＶ ３５Ｓ遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネー
ターが、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける外来遺
伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、ｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ
ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒは、ｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳでコードされるネオマイシン耐性カセ
ットが、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける選択可
能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｎｐｔＩＩ遺伝子産物を
コードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＭＴ ＮＰＴ／ＧＵＳが構築され、脂質生
合成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが
作成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合
成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＳｙｍｂ
ｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの核遺伝子に固有のコドンバイア
スを反映するようにＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにお
ける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コ
ドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモーターに動
作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、ｎｏｓ
３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形
質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄ
ｒｉａｃｔｉｃｕｍゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質
生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベク
ターによるＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの安定な形質
転換は、シリコン繊維媒介マイクロインジェクション又は他の公知の方法を含む周知され
ている形質転換技法によって実現される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性を選択可能なマー
カーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍ
ｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍを、限定はされないが、Ｇ４１８を含む海水寒天培地に
おいて選択することができる。Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉ
ｃｕｍ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、人工海水並びにＩｇｌｅ
ｓｉａｓ−Ｐｒｉｅｔｏ ｅｔ ａｌ．及びｔｅｎ Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅ
ｒにより報告される培地が挙げられる。Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｄｒｉ
ａｃｔｉｃｕｍ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質
抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例２６：Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．の操作
Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおける本発明に従う組換え遺伝
子の発現は、本明細書において考察されるとおりＫｉｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．が教示する
方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｋｉｌｉ
ａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃ
ａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．１０８：５２（２０１１）ｐｐ．２１２
６５−２１２６９は、形質転換構築物によるＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓの安定な核
形質転換を報告した。Ｋｉｌｉａｎは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて
、形質転換構築物Ｃ２をＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂに導入した
。Ｃ２形質転換構築物は、ｂｌｅタンパク質コード領域の上流でＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏ
ｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子Ｖ
ＣＰ２のプロモーターに動作可能に連結され、且つｂｌｅタンパク質コード領域の下流で
Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂビオラキサンチン／クロロフィルａ
結合遺伝子ＶＣＰ１の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、抗生物質フ
レオマイシン及びゼオシンに対する耐性用の、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ
ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（ｂｌｅ）のコード配列を含むブ
レオマイシン耐性カセットを含んだ。Ｃ２による形質転換前、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐ
ｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂは、２ｕｇ／ｍｌゼオシンを含む培地上で増殖することができ
なかった。Ｃ２による形質転換後、２ｕｇ／ｍｌゼオシンを含む選択的培養培地で増殖す
るＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂの形質転換体が得られた。Ｎａｎ
ｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、
２ｕｇ／ｍｌゼオシンの存在下における増殖が可能となり、従ってＮａｎｎｏｃｈｌｏｒ
ｏｐｓｉｓにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性
カセットの有用性が確立された。ＰＣＲにより、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価
を行った。Ｋｉｌｉａｎは、５倍レベルの微量金属、ビタミン、及びリン酸塩溶液を含み
、さらに２ｕｇ／ｍｌゼオシンを含むＦ／２培地（Ｇｕｉｌａｒｄ ａｎｄ Ｒｙｔｈｅ
ｒ，Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８
（１９６２），ｐｐ．２２９−２３９により報告される）におけるＮａｎｎｏｃｈｌｏｒ
ｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ形質転換体の液体増殖を報告した。Ｋｉｌｉａｎはまた、
人工海水２ｍｇ／ｍｌゼオシンを含む寒天Ｆ／２培地上でのＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓ
ｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ形質転換体の選択及び維持も報告した。さらなる培養培地におけ
るＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓの増殖が（例えば、Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ
ｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１００：２（２００９），ｐｐ．８３３−８
３８及びＰａｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９０：４（２０１１），ｐｐ．１４２９−１４４
１において）考察されている。Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにお
ける異種遺伝子発現を可能にするための、さらなるプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミ
ネーターを含むさらなる形質転換構築物、及び形質転換体選択用の選択可能なマーカーが
、Ｋｉｌｉａｎによる同じ報告において考察されている。Ｋｉｌｉａｎは、形質転換構築
物Ｃ２並びにＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂビオラキサンチン／ク
ロロフィルａ結合タンパク質遺伝子ＶＣＰ２のプロモーター及びＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏ
ｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子Ｖ
ＣＰ１の３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２
Ｊ３Ｂにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｋ
ｉｌｉａｎは、Ｃ２でコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏ
ｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適で
あったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｂｌｅ遺伝子産物をコー
ドするヌクレオチド配列を含む形質転換構築物Ｃ２が構築され、脂質生合成経路発現カセ
ット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質
生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質
をコードし、各タンパク質コード配列は、表９Ａ〜Ｄに従いＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓ
ｉｓ ｓｐ．の核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＮａｎｎｏｃｈｌｏｒ
ｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質
生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード
配列の上流でＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ ＶＣＰ２遺伝子プロ
モーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流
で、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ ＶＣＰ１遺伝子３’ＵＴＲ／
ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクタ
ーの標的ゲノム組み込み用の、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂゲノ
ムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ
以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＮａｎｎｏｃ
ｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂの安定な形質転換は、エレクトロポレーション又
は他の公知の方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される。ｂｌｅ遺伝子
産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＮ
ａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂを、限定はされないが、ゼオシンを含
むＦ／２培地において選択することができる。Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．
Ｗ２Ｊ３Ｂ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、Ｆ／２培地並びにＣ
ｈｉｕ ｅｔ ａｌ．及びＰａｌ ｅｔ ａｌ．により報告される培地が挙げられる。Ｎ
ａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、
本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例２７：Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ操作
Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は
、本明細書において考察されるとおりＤｕｎａｈａｙ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及び
ベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｄｕｎａｈａｙ
ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３１（１９９５）
，ｐｐ．１００４−１０１２は、プラスミドＤＮＡによるＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙ
ｐｔｉｃａの安定な形質転換を報告した。Ｄｕｎａｈａｙは、微粒子銃の形質転換方法を
用いて、プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１をＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａに
導入した。プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１は、ｎｐｔＩＩコード領域の上流でＣｙｃｌ
ｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）遺
伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ２０７８４）のプロモーターに動作可能に連結され、且
つ３’領域（ｎｐｔＩＩコード領域の下流）でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ
ＡＣＣアーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ネオマイ
シンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物のコード配列を含むネオマ
イシン耐性カセットを含んだ。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性
を付与する。ｐＡＣＣＮＰＴ５．１による形質転換前、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐ
ｔｉｃａは、１００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む５０％人工海水培地で増殖することがで
きなかった。ｐＡＣＣＮＰＴ５．１による形質転換後、１００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含
む選択的５０％人工海水培地において増殖するＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ
の形質転換体が得られた。Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａにおけるｎｐｔＩＩ
遺伝子産物の発現により、１００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８の存在下における増殖が可能とな
り、従ってＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａにおいて使用される選択可能なマー
カーとしてのネオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析によ
り、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｄｕｎａｈａｙは、１．０７ｍＭ
ケイ酸ナトリウム及び１００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補足した人工海水培地（ＡＳＷ、Ｂ
ｒｏｗｎ，Ｌ．，Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉａ，Ｖｏｌ．２１（１９８２），ｐｐ．４０８−４
１０により考察されるとおり）におけるＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａの液体
増殖を報告した。Ｄｕｎａｈａｙはまた、１００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８含有のＡＳＷ培地
を含む寒天プレート上でのＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ形質転換体の選択及
び維持も報告した。さらなる培養培地におけるＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ
の増殖が（例えば、Ｓｒｉｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８−２９：１（１９９１
），ｐｐ．３１７−３２６及びＰａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１０９：３（２０１
０），ｐｐ．２３５−２３９において）考察されている。Ｄｕｎａｈａｙは、プラスミド
ｐＡＣＣＮＰＴ５．１及びＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａアセチル−ＣｏＡカ
ルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）遺伝子のプロモーターが、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒ
ｙｐｔｉｃａにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加え
て、Ｄｕｎａｈａｙは、ｐＡＣＣＮＰＴ５．１でコードされるネオマイシン耐性カセット
が、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａにおける選択可能なマーカーとして使用す
るのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｎｐｔＩＩ遺伝子産物を
コードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＡＣＣＮＰＴ５．１が構築され、脂質生合
成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作
成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成
経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＣｙｃｌｏ
ｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＣｙ
ｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａにおける発現にコドン最適化されている。表２０の
各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質
コード配列の上流でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ ＡＣＣアーゼプロモータ
ーに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｃ
ｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ ＡＣＣアーゼ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動
作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み
込み用の、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａゲノムとの相同性領域をさらに含み
得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するよ
うに選択され得る。形質転換ベクターによるＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａの
安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法に
よって実現される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベ
クターで形質転換されたＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａを、限定はされないが
、Ｇ４１８を含む寒天ＡＳＷ培地において選択することができる。Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ
ｃｒｙｐｔｉｃａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＡＳＷ培地
並びにＳｒｉｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１及びＰａｈｌ ｅｔ ａｌ．により報
告される培地が挙げられる。Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ脂質の脂肪酸プロ
フィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価す
ることができる。
実施例２８：Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの操作
Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は
、本明細書において考察されるとおりＤｕｎａｈａｙ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及び
ベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｄｕｎａｈａｙ
ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３１（１９９５）
，ｐｐ．１００４−１０１２は、プラスミドＤＮＡによるＮａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏ
ｐｈｉｌａの安定な形質転換を報告した。Ｄｕｎａｈａｙは、微粒子銃の形質転換方法を
用いて、プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１をＮａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａに
導入した。プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１は、ｎｐｔＩＩコード領域の上流でＣｙｃｌ
ｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）遺
伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ２０７８４）のプロモーターに動作可能に連結され、且
つ３’領域（ｎｐｔＩＩコード領域の下流）でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ
ＡＣＣアーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ネオマイ
シンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物のコード配列を含むネオマ
イシン耐性カセットを含んだ。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性
を付与する。ｐＡＣＣＮＰＴ５．１による形質転換前、Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐ
ｈｉｌａは、１００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む人工海水培地で増殖することができなか
った。ｐＡＣＣＮＰＴ５．１による形質転換後、１００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む選択
的人工海水培地において増殖するＮａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの形質転換体
が得られた。Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおけるｎｐｔＩＩ遺伝子産物の
発現により、Ｇ４１８の存在下における増殖が可能となり、従ってＮａｖｉｃｕｌａ ｓ
ａｐｒｏｐｈｉｌａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのネオマイシン抗生物
質耐性カセットの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤ
ＮＡの評価を行った。Ｄｕｎａｈａｙは、１．０７ｍＭ ケイ酸ナトリウム及び１００ｕ
ｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補足した人工海水培地（ＡＳＷ、Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．，Ｐｈｙｃｏｌ
ｏｇｉａ，Ｖｏｌ．２１（１９８２），ｐｐ．４０８−４１０により考察されるとおり）
におけるＮａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの液体増殖を報告した。Ｄｕｎａｈａ
ｙはまた、１００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８含有のＡＳＷ培地を含む寒天プレート上でのＮａ
ｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ形質転換体の選択及び維持も報告した。さらなる培
養培地におけるＮａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの増殖が（例えば、Ｔａｄｒｏ
ｓ ａｎｄ Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．
２４：４（１９８８），ｐｐ．４４５−４５２及びＳｒｉｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏ
ｌ．２０−２１：１（１９８９），ｐｐ．２８１−２９１において）考察されている。Ｄ
ｕｎａｈａｙは、プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１及びＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐ
ｔｉｃａアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）遺伝子のプロモーターが、
Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適
であることを報告した。加えて、Ｄｕｎａｈａｙは、ｐＡＣＣＮＰＴ５．１でコードされ
るネオマイシン耐性カセットが、Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおける選択
可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｎｐｔＩＩ遺伝子産物を
コードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＡＣＣＮＰＴ５．１が構築され、脂質生合
成経路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作
成される。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成
経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従い近縁のＮａ
ｖｉｃｕｌａ ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するよ
うにＮａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおける発現にコドン最適化されている。
表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タ
ンパク質コード配列の上流でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ ＡＣＣアーゼ遺
伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、
又は下流で、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ ＡＣＣアーゼ遺伝子３’ＵＴＲ
／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベク
ターの標的ゲノム組み込み用の、Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａゲノムとの相
同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲ
ノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＮａｖｉｃｕｌａ ｓ
ａｐｒｏｐｈｉｌａの安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知され
ている形質転換技法によって実現される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性を選択可能なマー
カーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＮａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏ
ｐｈｉｌａを、限定はされないが、Ｇ４１８を含む寒天ＡＳＷ培地において選択すること
ができる。Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ脂質産生に好適な成長培地としては
、限定はされないが、ＡＳＷ培地並びにＳｒｉｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．１９８９及びＴ
ａｄｒｏｓ ａｎｄ Ｊｏｈａｎｓｅｎにより報告される培地が挙げられる。Ｎａｖｉｃ
ｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載され
る標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例２９：Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの操作
Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおける本発明に従う組換え遺伝
子の発現は、本明細書において考察されるとおりＰｏｕｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．が教示す
る方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｐｏｕ
ｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４２（
２００６），ｐｐ．１０５９−１０６５は、プラスミドＤＮＡによるＴｈａｌａｓｓｉｏ
ｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの安定な形質転換を報告した。Ｐｏｕｌｓｅｎは、微粒
子銃の形質転換方法を用いて、プラスミドｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔをＴｈａｌａｓｓｉｏｓ
ｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａに導入した。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔは、ｎａｔタンパク質
コード領域の上流でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａフコキサンチン
クロロフィルａ／ｃ結合タンパク質遺伝子（ｆｃｐ）プロモーターに動作可能に連結され
、且つ３’領域（ｎａｔタンパク質コード配列の下流）でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ
ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ ｆｃｐ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結され
た、ヌルセオトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｎａｔ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎ
ｋ寄託番号ＡＡＣ６０４３９）をコードする配列を含むヌルセオトリシン耐性カセットを
含んだ。ｎａｔ遺伝子産物は、抗生物質ヌルセオトリシンに対する耐性を付与する。ｐＴ
ｐｆｃｐ／ｎａｔによる形質転換前、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎ
ａは、１０ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンを含む培地で増殖することができなかった。ｐＴ
ｐｆｃｐ／ｎａｔによる形質転換後、１００ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンを含む選択的培
養培地で増殖するＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの形質転換体が得
られた。Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおけるｎａｔ遺伝子産物
の発現により、１００ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンの存在下における増殖が可能となり、
従ってＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおいて使用される選択可能
なマーカーとしてのヌルセオトリシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。サザ
ン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った。Ｐｏｕｌｓｅｎは、形
質転換したＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの選択及び維持を、１０
０ｕｇ／ｍｌヌルセオトリシンを含む変法ＥＳＡＷ培地（Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６（１９８０），ｐｐ．２
８−３５により考察されるとおり）を含む液体培地において行ったことを報告した。さら
なる培養培地におけるＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの増殖が（例
えば、Ｖｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２８：３（１
９８９），ｐｐ．２１９−２４０において）考察されている。Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒ
ａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおける使用に好適なさらなる選択可能なマーカーを含む、さ
らなるプラスミドが、Ｐｏｕｌｓｅｎによる同じ報告において考察されている。Ｐｏｕｌ
ｓｅｎは、プラスミドｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔ、並びにＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓ
ｅｕｄｏｎａｎａ ｆｃｐプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｔｈａｌａ
ｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適
であることを報告した。加えて、Ｐｏｕｌｓｅｎは、ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔでコードされ
るヌルセオトリシン耐性カセットが、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎ
ａにおける選択可能なマーカーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｎａｔ遺伝子産物をコー
ドするヌクレオチド配列を含むベクターｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔが構築され、脂質生合成経
路発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成さ
れる。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路
タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＴｈａｌａｓｓ
ｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するよう
にＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおける発現にコドン最適化され
ている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個
々に、タンパク質コード配列の上流でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎ
ａ ｆｃｐ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領
域において、又は下流で、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ ｆｃｐ
遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物
は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅ
ｕｄｏｎａｎａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合
成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｔｈａ
ｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａゲノムの配列内のそのような相同性領域を
同定することができる（Ａｒｍｂｒｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３
０６：５６９３（２００４）：ｐｐ．７９−８６による文献において参照される）。形質
転換ベクターによるＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの安定な形質転
換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法によって実現さ
れる。ｎａｔ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換
されたＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａを、限定はされないが、ヌル
セオトリシンを含むＥＳＡＷ寒天培地において選択することができる。Ｔｈａｌａｓｓｉ
ｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされない
が、ＥＳＡＷ培地、並びにＶｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．及びＨａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．により考察される培養培地が挙げられる。Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕ
ｄｏｎａｎａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽
出及び分析方法によって評価することができる。
実施例３０：Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの操作
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける本発明に従う組換え遺
伝子の発現は、本明細書において考察されるとおりＣｅｒｕｔｔｉ ｅｔ ａｌ．が教示
する方法及びベクターを改良することにより達成し得る。簡潔に言えば、Ｃｅｒｕｔｔｉ
ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１４５：１（１９９７），ｐｐ．９７−１
１０は、形質転換ベクターによるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ
の安定な核形質転換を報告した。Ｃｅｒｕｔｔｉは、微粒子銃の形質転換方法を用いて、
形質転換構築物Ｐ［１０３０］をＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ
に導入した。構築物Ｐ［１０３０］は、ａａｄＡタンパク質コード領域の上流でＣｈｌａ
ｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉリブロース−１，５−二リン酸カルボキシ
ラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット遺伝子（ＲｂｃＳ２、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ
０４４７２）プロモーターに動作可能に連結され、且つ３’領域（ａａｄＡタンパク質コ
ード配列の下流）でＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ＲｂｃＳ２
遺伝子３”ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、アミノグルコシド３’−ア
デニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）遺伝子産物をコードする配列を含むスペクチノマ
イシン耐性カセットを含んだ。ａａｄＡ遺伝子産物は、抗生物質スペクチノマイシンに対
する耐性を付与する。Ｐ［１０３０］による形質転換前、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ
ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉは、９０ｕｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含む培地で増殖するこ
とができなかった。Ｐ［１０３０］による形質転換後、９０ｕｇ／ｍｌスペクチノマイシ
ンを含む選択的培養培地で増殖するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉ
ｉの形質転換体が得られ、従ってＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ
において使用される選択可能なマーカーとしてのスペクチノマイシン抗生物質耐性カセッ
トの有用性が確立された。サザン解析により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を
行った。Ｃｅｒｕｔｔｉは、形質転換したＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒ
ｄｔｉｉの選択及び維持を、９０ｕｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含むトリス酢酸塩リン
酸塩培地（ＴＡＰ、Ｈａｒｒｉｓ，Ｔｈｅ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｓｏｕｒｃｅ
ｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９８９により記載さ
れるとおり）を含む寒天プレート上で行ったことを報告した。Ｃｅｒｕｔｔｉはさらに、
９０ｕｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含むＴＡＰ液体培地におけるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏ
ｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの増殖を報告した。代替的な培養培地におけるＣｈｌａ
ｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの増殖が（例えば、Ｄｅｎｔ ｅｔ ａｌ
．，Ａｆｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ，Ｖｏｌ．５：３（２０１１），ｐｐ．２６０−２７０及びＹａｎｔａｏ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．
１０７：２（２０１０），ｐｐ．２５８−２６８において）考察されている。Ｃｈｌａｍ
ｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける使用に好適なさらなる選択可能なマ
ーカーを含む、さらなる構築物、並びにＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄ
ｔｉｉにおける異種遺伝子発現を促進するのに好適なプロトマー及び３’ＵＴＲを含む数
多くの調節配列は、当該技術分野において公知であり、考察されている（レビューは、Ｒ
ａｄａｋｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．９：４
（２０１０），ｐｐ．４８６−５０１を参照）。Ｃｅｒｕｔｔｉは、形質転換ベクターＰ
［１０３０］並びにＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉプロモーター
及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔ
ｉｉにおける外来遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、Ｃｅ
ｒｕｔｔｉは、Ｐ［１０３０］でコードされるスペクチノマイシン耐性カセットが、Ｃｈ
ｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける選択可能なマーカーとして使
用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるａａｄＡ遺伝子産物をコ
ードするヌクレオチド配列を含むベクターＰ［１０３０］が構築され、脂質生合成経路発
現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される
。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タン
パク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＣｈｌａｍｙｄｏｍ
ｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するように
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける発現にコドン最適化され
ている。表２０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個
々に、タンパク質コード配列の上流でＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔ
ｉｉ ＲｂｃＳ２プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領
域において、又は下流で、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ Ｒｂ
ｃＳ２ ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築
物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅ
ｉｎｈａｒｄｔｉｉゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質
生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｃ
ｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉゲノムの配列内のそのような相同性
領域を同定することができる（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏ
ｌ．３１８：５８４８（２００７），ｐｐ．２４５−２５０による文献において参照され
る）。形質転換ベクターによるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの
安定な形質転換は、微粒子銃又は他の公知の方法を含めた周知されている形質転換技法に
よって実現される。ａａｄＡ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベク
ターで形質転換されたＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉを、限定は
されないが、スペクチノマイシンを含むＴＡＰ寒天培地上で選択することができる。Ｃｈ
ｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ脂質産生に好適な成長培地としては、
限定はされないが、ＥＳＡＷ培地、並びにＹａｎｔａｏ ｅｔ ａｌ．及びＤｅｎｔ ｅ
ｔ ａｌ．により考察される培養培地が挙げられる。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅ
ｉｎｈａｒｄｔｉｉ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な
脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例３１：Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの操作
Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は
、本明細書において考察されるとおりＦｉｃｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及び
ベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｆｉｃｋｅｒｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ，Ｖｏｌ．５５（２００３），ｐｐ．７２７−７３７は、プラスミドＤＮＡによるＹａ
ｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの安定な核形質転換を報告した。Ｆｉｃｋｅｒｓは
、酢酸リチウム形質転換方法を用いて、プラスミドＪＭＰ１２３をＹａｒｒｏｗｉａ ｌ
ｉｐｏｌｙｔｉｃａに導入した。プラスミドＪＭＰ１２３は、ｈｐｈタンパク質コード領
域の上流でＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＬＩＰ２遺伝子プロモーター（Ｇ
ｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＪ０１２６３２）に動作可能に連結され、且つｈｐｈタンパク質
コード領域の下流でＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＬＩＰ２遺伝子３’ＵＴ
Ｒ／ターミネーターに動作可能に連結された、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子産物（ｈｐｈ）をコードする配列を含むハイグロマイシンＢ耐性カセットを含
んだ。ＪＭＰ１２３による形質転換前、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、１
００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む培地上で増殖することができなかった。ＪＭＰ１
２３による形質転換後、１００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む培地で増殖することが
可能な形質転換Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが得られ、従ってＹａｒｒｏｗ
ｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのハイグロマ
イシンＢ抗生物質耐性カセットが確立された。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
ＬＩＰ２遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターのＪＭＰ１２３に提供
されたヌクレオチド配列は、ＬＩＰ２遺伝子座へのｈｐｈコード配列の相同組換え用ドナ
ー配列として働いた。サザン法により、安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価を行った
。Ｆｉｃｋｅｒｓは、形質転換したＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの選択及び
維持を、１００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシン含有の標準ＹＰＤ培地（酵母エキスペプトン
デキストロース）を含む寒天プレート上で行ったことを報告した。形質転換したＹａｒｒ
ｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの液体培養は、ハイグロマイシン含有のＹＰＤ培地にお
いて行った。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの培養に用いられる他の培地及び
技法が報告されており、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて使用される数
多くの他のプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ、及び選択可能なマーカーが報告され
ている（例えば、Ｐｉｇｎｅｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ
ｏｎｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６：８（２０００），ｐｐ．３２８３−
３２８９，Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ
．２７：４（２０１０），ｐｐ．２７７−２８２、及びＢａｒｔｈ ａｎｄ Ｇａｉｌｌ
ａｒｄｉｎ，（１９９６），Ｉｎ：Ｋ，Ｗ．（Ｅｄ．），Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａ
ｌ Ｙｅａｓｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ．Ｓｐｒｉｎｔｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ
，Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒ，ｐｐ．３１３−３８８を参照）。Ｆｉｃｋｅｒｓ
は、形質転換ベクターＪＭＰ１２３並びにＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ Ｌ
ＩＰ２遺伝子プロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。
加えて、Ｆｉｃｋｅｒｓは、ＪＭＰ１２３でコードされるハイグロマイシン耐性カセット
が、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける選択可能なマーカーとして使用す
るのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｈｐｈ遺伝子産物をコー
ドするヌクレオチド配列を含むベクターＪＭＰ１２３が構築され、脂質生合成経路発現カ
セット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂
質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク
質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＹａｒｒｏｗｉａ
ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成
経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の
上流でＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＬＩＰ２遺伝子プロモーターに動作可
能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ｙａｒｒｏｗ
ｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＬＩＰ２遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に
連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の
、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相
同性領域は、内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択
され得る。当業者は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムの配列内のそのよ
うな相同性領域を同定することができる（Ｄｕｊｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖ
ｏｌ．４３０（２００４），ｐｐ．３５−４４による文献において参照される）。形質転
換ベクターによるＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの安定な形質転換は、酢酸リ
チウム形質転換又は他の公知方法を含む周知されている形質転換技法によって実現される
。ｈｐｈ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、形質転換ベクターで形質転換され
たＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを、限定はされないが、ハイグロマイシンを
含むＹＰＤ培地上で選択することができる。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ脂
質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、ＹＰＤ培地、並びにＣｈｕａｎｇ
ｅｔ ａｌ．により記載される培養培地が挙げられる。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌ
ｙｔｉｃａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出
及び分析方法によって評価することができる。
実施例３２：Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎｅの操作
Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎｅにおける本発明に従う組換え遺伝子の発現は、
本明細書において考察されるとおりＭａｃｋｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．が教示する方法及
びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、Ｍａｃｋｅｎｚ
ｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６（２０００），ｐｐ．４６５５−４６６１は、プラスミ
ドＤＮＡによるＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａの安定な核形質転換を報告した。
ＭａｃＫｅｎｚｉｅは、プロトプラスト形質転換方法を用いて、プラスミドｐＤ４をＭｏ
ｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａに導入した。プラスミドｐＤ４は、ｈｐｔタンパク質
コード領域の上流でＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａヒストンＨ４．１遺伝子プロ
モーター（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＪ２４９８１２）に動作可能に連結され、且つｈｐ
ｔタンパク質コード領域の下流でＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ Ｎ−（５
’−ホスホリボシル（ｐｈｏｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ））アントラニル酸イソメラーゼ（ｔ
ｒｐＣ）遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ハイグロマイシン
Ｂホスホトランスフェラーゼ遺伝子産物（ｈｐｔ）をコードする配列を含むハイグロマイ
シンＢ耐性カセットを含んだ。ｐＤ４による形質転換前、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌ
ｐｉｎａは、３００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む培地上で増殖することができなか
った。ｐＤ４による形質転換後、３００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む培地上で増殖
する形質転換Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａが得られ、従ってＭｏｒｔｉｅｒｅ
ｌｌａ ａｌｐｉｎａにおいて使用される選択可能なマーカーとしてのハイグロマイシン
Ｂ抗生物質耐性カセットが確立された。サザン法により、安定な形質転換体のゲノムＤＮ
Ａの評価を行った。Ｍａｃｋｅｎｚｉｅは、形質転換したＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌ
ｐｉｎａの選択及び維持を、ハイグロマイシンを含むＰＤＡ（ポテトデキストロース寒天
）培地上で行ったことを報告した。Ｍａｃｋｅｎｚｉｅによる形質転換したＭｏｒｔｉｅ
ｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａの液体培養は、ハイグロマイシン含有の、ＰＤＡ培地又はＳ２
ＧＹＥ培地（５％グルコース、０．５％酵母エキス、０．１８％ ＮＨ４ＳＯ４、０．０
２％ ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、０．０００１％ ＦｅＣｌ３−６Ｈ２Ｏ、０．１％微量元
素、１０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４を含む）において行われた。Ｍｏｒｔｉｅ
ｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａの培養に用いられる他の培地及び技法が報告されており、Ｍｏ
ｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａにおいて使用される他のプラスミド、プロモーター、
３’ＵＴＲ、及び選択可能なマーカーが報告されている（例えば、Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ
．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．
７５：１７（２００９）ｐｐ．５５２９−３５及びＬｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６４：
７（２００１），ｐｐ．９７９−９０を参照）。Ｍａｃｋｅｎｚｉｅは、形質転換ベクタ
ーｐＤ４並びにＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａヒストンＨ４．１プロモーター及
びＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ｔｒｐＣ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｍｏｒｔｉｅ
ｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａにおける異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報
告した。加えて、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅは、ｐＤ４でコードされるハイグロマイシン耐性カ
セットが、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａにおける選択可能なマーカーとして使
用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｈｐｔ遺伝子産物をコー
ドするヌクレオチド配列を含むベクターｐＤ４が構築され、脂質生合成経路発現カセット
配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成される。脂質生合
成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコ
ードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌ
ｐｉｎａの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ
ａｌｐｉｎａにおける発現にコドン最適化されている。表２０の各脂質生合成経路タンパ
ク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク質コード配列の上流でＭｏ
ｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａヒストンＨ４．１遺伝子プロモーターに動作可能に連
結し、且つタンパク質コード配列の３’領域において、又は下流で、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎ
ｓ ｔｒｐＣ ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転
換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａ
ｌｐｉｎａゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在性脂質生合成経
路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｍｏｒｔｉ
ｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａゲノムの配列内のそのような相同性領域を同定することがで
きる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，Ｖｏｌ．６：１２（２０１１）によ
る文献において参照される）。形質転換ベクターによるＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐ
ｉｎａの安定な形質転換は、プロトプラスト形質転換又は他の公知の方法を含む周知され
ている形質転換技法によって実現される。ｈｐｔ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用
して、形質転換ベクターで形質転換されたＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａを、限
定はされないが、ハイグロマイシンを含むＰＤＡ培地で選択することができる。Ｍｏｒｔ
ｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ脂質産生に好適な成長培地としては、限定はされないが、
Ｓ２ＧＹＥ培地、並びにＬｕ ｅｔ ａｌ．及びＡｎｄｏ ｅｔ ａｌ．により記載され
る培養培地が挙げられる。Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ脂質の脂肪酸プロフィ
ールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法によって評価するこ
とができる。
実施例３３：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０の操作
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０における本発明に従う組換え遺伝
子の発現は、本明細書において考察されるとおりＫａｌｓｃｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ．が
教示する方法及びベクターを改良することにより達成することができる。簡潔に言えば、
Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎ
ｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５２（１９９９），ｐｐ．５０８−５１５
は、プラスミドＤＮＡによるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓの安定な形質転換を
報告した。Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、
プラスミドｐＮＣ９５０１をＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０に導入
した。プラスミドｐＮＣ９５０１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｚｕｒｅｕｓ ２３
Ｓ ｒＲＮＡ Ａ１０６７メチルトランスフェラーゼ遺伝子の完全ヌクレオチド配列を含
む（この遺伝子のプロモーター及び３’ターミネーター配列を含む）チオストレプトン耐
性（ｔｈｉｏｒ）カセットを含んだ。ｐＮＣ９５０１による形質転換前、Ｒｈｏｄｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓは、１ｍｇ／ｍｌチオストレプトンを含む培地上で増殖すること
ができなかった。ｐＮＣ９５０１によるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６
３０の形質転換後、１ｍｇ／ｍｌチオストレプトンを含む培養培地上で増殖する形質転換
体が得られ、従ってＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０における選択可
能なマーカーとしてのチオストレプトン耐性カセットの使用が確立された。Ｋａｌｓｃｈ
ｅｕｅｒにより記載される第２のプラスミド、ｐＡＫ６８は、耐性ｔｈｉｏｒカセット並
びにｌａｃＺプロモーターにより駆動される、ポリヒドロキシアルカノエート生合成用の
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ β−ケトチオラーゼ（ｐｈａＢ）、アセトアセ
チル−ＣｏＡ還元酵素（ｐｈａＡ）、及びポリ３−ヒドロキシアルカン酸シンターゼ（ｐ
ｈａＣ）遺伝子の遺伝子配列を含んだ。ポリヒドロキシアルカノエート生合成が欠損して
いるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０株のｐＡＫ６８形質転換後、非
形質転換株と比べてより多量のポリヒドロキシアルカノエートを産生する形質転換Ｒｈｏ
ｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０が得られた。導入されたＲａｌｓｔｏｎｉ
ａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ｐｈａＢ、ｐｈａＡ、及びｐｈａＣ酵素の検出可能な活性から、
ｐＡＫ６８プラスミドでコードされる調節エレメントがＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａ
ｃｕｓ ＰＤ６３０における異種遺伝子発現に好適であったことが示された。Ｋａｌｓｃ
ｈｅｕｅｒは、形質転換したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０の選択
及び維持を、チオストレプトンを含む標準的なルリアブロス（ＬＢ）培地、栄養ブイヨン
（ＮＢ）、又は無機塩類培地（ＭＳＭ）上で行ったことを報告した。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０の培養に用いられる他の培地及び技法が記載されている
（例えば、Ｋｕｒｏｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４７：３−４（２０１０），ｐｐ．２１２−２１８及びＡｌｖｅ
ｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５４：２（２０００），ｐｐ．２１８−２２３を参照）。Ｋａｌ
ｓｃｈｅｕｅｒは、形質転換ベクターｐＮＣ９５０１及びｐＡＫ６８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ａｚｕｒｅｕｓ ２３Ｓ ｒＲＮＡ Ａ１０６７メチルトランスフェラーゼ遺
伝子及びｌａｃＺ遺伝子のプロモーターが、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ Ｐ
Ｄ６３０における異種遺伝子発現を可能にするのに好適であることを報告した。加えて、
Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒは、ｐＮＣ９５０１及びｐＡＫ６８でコードされるｔｈｉｏｒカセ
ットが、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０における選択可能なマーカ
ーとして使用するのに好適であったことを報告した。
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして使用されるｔｈｉｏｒ遺伝子産物を
コードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＮＣ９５０１が構築され、脂質生合成経路
発現カセット配列をさらに含むように改変され、それにより形質転換ベクターが作成され
る。脂質生合成経路発現カセットは、表２０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タ
ンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表１９Ａ〜Ｄに従いＲｈｏｄｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｏｐａｃｕｓの核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにＲｈｏｄｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０における発現にコドン最適化されている。表２０
の各脂質生合成経路タンパク質について、コドン最適化遺伝子配列を、個々に、タンパク
質コード配列の上流でｌａｃＺ遺伝子プロモーターに動作可能に連結することができる。
形質転換構築物は、形質転換ベクターの標的ゲノム組み込み用の、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０ゲノムとの相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、
内在性脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当
業者は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０ゲノムの配列内のそのよう
な相同性領域を同定することができる（Ｈｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．７：９（２０１１）による文献において参照される。形質転換ベク
ターによるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０の形質転換は、エレクト
ロポレーション（ｅｌｅｃｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）又は他の公知の方法を含む周知されて
いる形質転換技法によって実現される。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｚｕｒｅｕｓ ２
３Ｓ ｒＲＮＡ Ａ１０６７メチルトランスフェラーゼ遺伝子産物の活性をマーカーとし
て使用して、形質転換ベクターで形質転換されたＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ
ＰＤ６３０を、限定はされないが、チオストレプトンを含むＬＢ培地上で選択すること
ができるｆ。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０脂質産生に好適な成長
培地としては、限定はされないが、Ｋｕｒｏｓａｗａ ｅｔ ａｌ．及びＡｌｖａｒｅｚ
ｅｔ ａｌ．により考察される培養培地が挙げられる。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐ
ａｃｕｓ ＰＤ６３０脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的
な脂質抽出及び分析方法によって評価することができる。
実施例３４：脂肪酸栄養要求性のための微細藻類の操作
実施例３の株Ｂ、Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼ（ＣｗＴＥ２）を
発現するように操作したＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４
３５）を、両方の内在性チオエステラーゼ対立遺伝子ＦＡＴＡ１−１及びＦＡＴＡ１−２
をノックアウトするさらなる遺伝子改変用の宿主生物として使用した。ここで、第１の形
質転換構築物は、ＦＡＴＡ１−１遺伝子座の株Ｂにネオマイシン発現カセットを組み込む
ように作成した。この構築物、ｐＳＺ２２２６は、核ゲノムのＦＡＴＡ１−１遺伝子座に
対する５’（配列番号３０）及び３’（配列番号３１）相同組換え標的配列（構築物に隣
接する）並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴ
Ｒ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（
配列番号６）の制御下にあるネオマイシン耐性タンパク質コード配列を含んだ。このＮｅ
ｏＲ発現カセットは配列番号１５として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。
ｐＳＺ２２２６の株Ｂへの形質転換後、個々の形質転換体を、ショ糖及びＧ４１８を含
む寒天プレート上で選択した。単一の単離物、株Ｈを、さらなる遺伝子改変用に選択した
。第２の形質転換構築物、ｐＳＺ２２３６は、チアミン選択可能マーカーの発現を可能に
するポリヌクレオチドをＦＡＴＡ１−２遺伝子座で株Ｈに組み込むように作成した。ｐＳ
Ｚ２２３６は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ１４３５）核ゲノムへの組み込み用
のＦＡＴＡ１−２ゲノム領域に対する５’（配列番号３２）及び３’（配列番号３３）相
同組換え標的配列（構築物に隣接する）並びにＣ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓアクチ
ンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号２２）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３
’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＴＨＩＣタンパク質コー
ド領域を含んだ。このＡｔＴＨＩＣ発現カセットは配列番号２３として列挙され、選択可
能なマーカーとして働いた。ｐＳＺ２２３６による株Ｈの形質転換によって株Ｉを作成し
た後、個々の形質転換体を、遊離脂肪酸を含む寒天プレート上で選択した。株Ｉは、寒天
プレート上で、及びチアミン不含且つ遊離脂肪酸を補足した培地において増殖することが
できた。
実施例３５：ステアリン酸の産生を増加させるための微生物の操作
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的に変異
を誘発した株、株Ｊを、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２
００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ
／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明
細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法によりプラスミド構築物ｐＳＺ２
２８１で形質転換した。ｐＳＺ２２８１は、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼの発現
を下方調節するＲＮＡヘアピン（ＳＡＤ２ｈｐＣ、配列番号３４）をコードするポリヌク
レオチド、核ゲノムへの組み込み用の６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１）及び３
’（配列番号２）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びに配列番号３に示され
るタンパク質配列を発現する、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモー
ター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵
素３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２ショ糖
インベルターゼコード領域（配列番号４）を含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓ
ｕｃ２発現カセットは配列番号７として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。Ｓ
ＡＤ２ｈｐＣ ＲＮＡヘアピンをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔ
ｈｅｃｏｉｄｅｓアクチンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号２２）及びＣ．ｖｕｌｇ
ａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあった。
構築物ｐＳＺ２２８１による株Ｊの形質転換によって株Ｋを作成した後、陽性クローン
を、ショ糖を単一炭素源として含有する寒天プレート上で選択した。個々の形質転換体を
クローン精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９
／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ
２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に
詳述されるとおりの脂質産生に好適な従属栄養条件下で増殖させた。乾燥バイオマスから
脂質サンプルを調製し、実施例１に記載されるとおりの（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３
６９６号明細書も参照のこと）標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水
素炎イオン化検出法を用いて分析した。単一炭素源としてグルコース上で増殖させたＰ．
ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ株Ｊ及び単一炭素源としてショ糖上で増殖させた株Ｋの
３つの代表的な単離物の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、
表２１に提供する。
表２１に提供されるデータは、形質転換生物のＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸プロフ
ィールに対するＳＡＤ２ヘアピンＲＮＡ構築物の発現の明らかな影響を示している。ＳＡ
Ｄ２ヘアピンＲＮＡ構築物を含む株Ｋ形質転換体の脂肪酸プロフィールは、飽和Ｃ１８：
０脂肪酸の割合の増加と、同時の不飽和Ｃ１８：１脂肪酸の減少を実証した。非形質転換
株の脂肪酸プロフィールは、約３％のＣ１８：０を含む。形質転換株の脂肪酸プロフィー
ルは、約３７％のＣ１８：０を含む。これらのデータは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒ
ｉｆｏｒｍｉｓにおけるＳＡＤ ＲＮＡヘアピン構築物の発現を可能にするポリヌクレオ
チドの発現及び使用の成功による、操作された宿主微生物における飽和脂肪酸の割合の改
変、詳細には微生物細胞におけるＣ１８：０脂肪酸の濃度の増加及びＣ１８：１脂肪酸の
減少を示す。
表２１には、株Ｋ−４においてステアリン酸レベルがさらに一層上昇したことも示され
る。株Ｋ４は、株Ｋ１〜Ｋ３の構築物をＳＡＤ２Ｂ遺伝子座に挿入することによって作成
した。従って、ＳＡＤ遺伝子の１つのコピーをノックアウトし、残りのコピーをＲＮＡレ
ベルで阻害することにより、オレイン酸のさらなる減少及び対応するステアリン酸の増加
が得られた。株Ｋ４から得られたＲＢＤ油のトリグリセリド分析は、約１２％ＰＯＰ、２
７％ＰＯＳ及び１８％ＳＯＳを示した。
実施例３６：内在性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのノックダウンによるオレイン酸の
産生を増加させるための微生物の操作
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的に変異
を誘発した株、株Ｊを、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２
００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ
／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明
細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により、構築物ｐＳＺ２４０２〜
ｐＳＺ２４０７の各々で独立して形質転換した。構築物ｐＳＺ２４０２〜ｐＳＺ２４０７
の各々は、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現を下方調節するようにＰｒｏｔ
ｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＴＡ１ ｍＲＮＡ転写物に対して標的化され
たヘアピンＲＮＡをコードする異なるポリヌクレオチド、核ゲノムへの組み込み用の６Ｓ
ゲノム領域に対する５’（配列番号１）及び３’（配列番号２）相同組換え標的配列（構
築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター
／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３
’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にある、配列番号３に示されるタンパク質配列を発現す
るＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域（配列番号４）
を含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２発現カセットは配列番号７として列
挙され、選択可能なマーカーとして働いた。各ヘアピンに対応するポリヌクレオチドの配
列表識別情報を表２２に列挙する。各ＲＮＡヘアピンをコードするポリヌクレオチド配列
は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番
号５）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあっ
た。
表２２に列挙される構築物の各々で株Ｊを独立して形質転換した後、ショ糖を単一炭素
源として含有する寒天プレート上で陽性クローンを選択した。個々の形質転換体をクロー
ン精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６
６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１
１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述さ
れるとおりの脂質産生に好適な従属栄養条件下で増殖させた。乾燥バイオマスから脂質サ
ンプルを調製し、実施例１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書）に記載され
るとおりの標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化検出法
を用いて分析した。単一炭素源としてグルコース上で増殖させたＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉ
ｓ（ＵＴＥＸ１４３５）株Ｊ及び単一炭素源としてショ糖上で増殖させた株Ｊの各形質転
換の代表的な単離物の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を、表
２３に提供する。
表２３に提供されるデータは、形質転換生物のＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸プロフ
ィールに対するＦＡＴＡヘアピンＲＮＡ構築物の発現の明らかな影響を示している。ＦＡ
ＴＡヘアピンＲＮＡ構築物を含む株Ｊ形質転換体の脂肪酸プロフィールは、Ｃ１８：１脂
肪酸の割合の増加と、同時のＣ１６：０及びＣ１８：０脂肪酸の減少を実証した。非形質
転換株Ｊの脂肪酸プロフィールは、約２６．６６％のＣ１６：０、３％のＣ１８：０、及
び約５９％のＣ１８：１脂肪酸である。対照的に、形質転換株の脂肪酸プロフィールは、
８．６％もの低さのＣ１６：０及び１．５４％のＣ１８：０及び７８％より高いＣ１８：
１脂肪酸を含む。
これらのデータは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおけるポリヌクレ
オチド ＦＡＴＡ ＲＮＡヘアピン構築物の有用性及び使用の成功による、操作された微
生物の脂肪酸プロフィールの改変、詳細には微生物細胞におけるＣ１８：１脂肪酸の濃度
の増加及びＣ１８：０及びＣ１６：０脂肪酸の減少を示す。
実施例３７：ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶの過剰発現によって中鎖脂肪酸の産生を増加させる
ための微生物の操作
この例では、ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ酵素をコードする組換えポリヌクレオチドの使用
による、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールにおいてラウリン酸、Ｃ１０：０、及び全
飽和脂肪酸が高濃度化した微生物の操作を記載する。
構築物ｐＳＺＤ１１３２、ｐＳＺＤ１１３３、ｐＳＺＤ１１３４、又はｐＳＺＤ１２０
１の各々を独立して使用して、実施例３の株Ｂ、Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエ
ステラーゼ（ＣｗＴＥ２）を発現するように操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉ
ｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）を、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書
、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３
号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／
０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により形質転換
した。上記の構築物の各々は、ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ酵素をコードする異なるポリヌク
レオチド、核ゲノムへの組み込み用のｐＬｏｏｐゲノム領域に対する５’（配列番号１３
）及び３’（配列番号１４）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅ
ｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣ
ｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御
下にあるネオマイシン耐性タンパク質コード配列を含んだ。このＮｅｏＲ発現カセットは
配列番号１５として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。各構築物に対応するポ
リヌクレオチドの配列表識別情報を表２０に掲載する。各ＫＡＳ酵素をコードするポリヌ
クレオチド配列は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５ Ａｍｔ０３プロモ
ーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴ
Ｒ（配列番号６）の制御下にあった。ＫＡＳ酵素及びネオマイシン耐性遺伝子のタンパク
質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９
／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ
２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に
記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有のコ
ドンバイアスを反映するようにコドンを最適化した。
個々のプラスミドを株Ｂに形質転換した後、Ｇ４１８を含む寒天プレート上で陽性クロ
ーンを選択した。個々の形質転換体をクローン精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１
４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／
０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／Ｕ
Ｓ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述されるとおりの脂質産生に好適な条件下、ｐＨ
７．０で、単一炭素源としてのショ糖上で成長させた。各形質転換体由来の乾燥バイオマ
スから脂質サンプルを調製し、実施例１に記載されるとおりの標準的な脂肪酸メチルエス
テルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化（ＦＡＭＥ ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いて
これらのサンプルの脂肪酸プロフィールを分析した。株Ｂ及びｐＳＺ２０４６の各々の４
つの陽性形質転換体（株Ｍ〜Ｐ、１〜４）の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積
％で表される）を、表２４に提供する。
表２５に提供するデータは、ＫＡＳＩ及びＫＡＳＩＶ酵素の外来性発現が形質転換生物
のＣ１０：０及びＣ１２脂肪酸プロフィールに対して及ぼす明らかな影響を示す。Ｃｕｐ
ｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼのみを発現する株Ｂの脂肪酸プロフィールは
、約８％ Ｃ１０：０及び約３５．５％ Ｃ１２：０を含み、飽和脂肪酸が全脂肪酸の７
２．５５％を占めた。対照的に、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓステアロイルＡＣＰデサチュ
ラーゼトランジットペプチドを含むＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＩをさらに
発現するように操作された株Ｂの形質転換体は、約１３％ Ｃ１０：０及び約４６％ Ｃ
１２：０の脂肪酸プロフィールによって特徴付けられた。飽和脂肪酸は、Ｃ．ｗｒｉｇｈ
ｔｉｉ ＫＡＳＩ融合タンパク質を共発現する株Ｂの形質転換体において７７％もの高さ
を占めた。同様に、酵素の天然トランジットペプチドを含むＣ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡ
ＳＩを発現するように操作された株Ｂの形質転換体は、約１５％ Ｃ１０、約４４％ Ｃ
１２、及び約７９％飽和脂肪酸の脂肪酸プロフィールによって特徴付けられた。Ｃｕｐｈ
ｅａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ ＫＡＳＩＶ又はＣｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ
ＫＡＳＩＶのいずれかを発現する株Ｂの脂肪酸プロフィール又は多くの形質転換体もまた
、株Ｂそれ自体の脂肪酸プロフィールと比較してＣ１０％及びＣ１２％レベルの上昇を呈
した。
これらのデータは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３
５）におけるＫＡＳＩ及びＫＡＳＩＶ構築物の発現によって操作宿主微生物における飽和
脂肪酸の割合を変えることが可能なポリヌクレオチドの、詳細には微生物細胞におけるＣ
１０：０及びＣ１２：０脂肪酸の濃度を増加させることにおける有用性及び有効性を実証
している。
実施例３８：ＫＡＳＩノックアウトによって中鎖脂肪酸の産生を増加させるための微生物
の操作
この例では、種々のＫＡＳＩ対立遺伝子を破壊する組換えポリヌクレオチドの使用によ
る、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールにおいてＣ１０：０及び中鎖脂肪酸が高濃度化
した微生物の操作を記載する。
構築物ｐＳＺ２３０２及びｐＳＺ２３０４を使用して、実施例３の株Ｂ、Ｃｕｐｈｅａ
ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼ（ＣｗＴＥ２）を発現するように操作されたＰｒｏ
ｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）を、ＰＣＴ／ＵＳ２００
９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及
びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形
質転換方法により独立して形質転換した。ｐＳＺ２３０２は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ
核ゲノムへの組み込み用のＫＡＳ１対立遺伝子１ゲノム領域に対する５’（配列番号５０
）及び３’（配列番号５１）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、Ｃ．ｐｒｏｔｏ
ｔｈｅｃｏｉｄｅｓアクチンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号２２）及びＣ．ｖｕｌ
ｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあるＡ．ｔｈａｌｉａ
ｎａ ＴＨＩＣタンパク質コード領域を含んだ。ｐＳＺ２３０４は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒ
ｍｉｓ核ゲノムへの組み込み用のＫＡＳ１対立遺伝子２ゲノム領域に対する５’（配列番
号５２）及び３’（配列番号５３）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、Ｃ．ｐｒ
ｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓアクチンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号２２）及びＣ．
ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあるＡ．ｔｈａ
ｌｉａｎａ ＴＨＩＣタンパク質コード領域を含んだ。このＡｔＴＨＩＣ発現カセットは
配列番号２３として列挙され、選択マーカーとして働いた。ＡｔＴＨＩＣのタンパク質コ
ード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０
６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０
１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載
されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有のコドン
バイアスを反映するようにコドンを最適化した。
ｐＳＺ２３０２及びｐＳＺ２３０４を株Ｂに独立して形質転換し、それにより株Ｑ及び
株Ｒを作成した後、チアミンを含む寒天プレート上で陽性クローンを選択した。個々の形
質転換体をクローン精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、Ｐ
ＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６
号明細書に詳述されるとおりの脂質産生に好適な従属栄養条件下、ｐＨ５．０又はｐＨ７
．０で単一炭素源としてのショ糖上で培養した。各形質転換体由来の乾燥バイオマスから
脂質サンプルを調製し、これらのサンプルの脂肪酸プロフィールを、実施例１に記載され
るとおり脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化（ＦＡＭＥ ＧＣ
／ＦＩＤ）検出法を用いて分析した。株Ｂ並びに陽性ｐＳＺ２３０２（株Ｑ、１〜５）及
びｐＳＺ２３０４（株Ｒ、１〜５）形質転換体の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する
面積％で表される）を、表２６及び表２７に提供する。
表２６及び表２７に提供されるデータは、種々のＫＡＳＩ対立遺伝子の破壊が形質転換
生物の脂肪酸プロフィールに対して及ぼす明らかな影響を示す。ｐＨ５．０で培養したと
き、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）と、ｐＨ調節
可能なプロモーターの制御下でＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＦＡＴＢ２チオエステ
ラーゼを発現するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）
株Ｂとは、脂肪酸プロフィールが極めて類似していた。これらのプロフィールは、約１％
Ｃ１４：０、約２１〜２６％ Ｃ１６：０、約２〜３％ Ｃ１８：０、約６０〜６５％
Ｃ１８：１、約７％ Ｃ１８：２によって特徴付けられ、Ｃ１０〜Ｃ１４脂肪酸が全脂
肪酸の約１．１９〜１．３％含まれた。対照的に、ｐＨ５．０で培養したとき、ＫＡＳＩ
対立遺伝子１（株Ｑ）又はＫＡＳＩ対立遺伝子２（株Ｒ）を破壊するようにさらに操作さ
れた株Ｂは、株Ｂ又はＵＴＥＸ １４３５と比較してＣ１２脂肪酸レベルの増加、Ｃ１４
脂肪酸レベルの増加、Ｃ１８脂肪酸のレベルの減少、及びＣ１８：１脂肪酸レベルの減少
によって特徴付けられた脂肪酸プロフィールの変化を示した。株Ｑ及び株Ｒの単離物の脂
肪酸プロフィールは、株Ｒ（対立遺伝子２ノックアウト）単離物が概して株Ｑ（対立遺伝
子１ノックアウト）と比べて高いＣ１２及び低いＣ１６及びＣ１８：１を有した点で異な
った。
ｐＨ７．０で培養したとき、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ
１４３５）の脂肪酸プロフィールは、ｐＨ調節可能なプロモーターの制御下でＣｕｐｈ
ｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＦＡＴＢ２チオエステラーゼを発現するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ
ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）株Ｂのものと異なる。ｐＨ７．０で培養
したとき、株Ｂは、Ｃ１０、Ｃ１２、及びＣ１４脂肪酸（これらは全脂肪酸の約５０％含
まれた）が上昇した脂肪酸プロフィールによって特徴付けられた。ｐＨ７．０で培養した
とき、株Ｑ及び株Ｒは、株Ｂと比べてＣ１０、Ｃ１２、及びＣ１４脂肪酸がさらに一層増
加し、且つＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸がさらに一層減少した脂肪酸プロフィールを
示した。ここでもまた、株Ｑと株Ｒとの脂肪酸プロフィールの違いが観察され、株Ｒのプ
ロフィールは株Ｑと比べて高いＣ１２パーセンテージレベル及び低いＣ１８：１レベルを
含んだ。
これらのデータは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおけるＫＡＳＩ及
びＫＡＳＩＶ構築物の発現によって操作宿主微生物における飽和脂肪酸の割合を変えるこ
とが可能なポリヌクレオチドの発現及び使用の、詳細にはＣ１０：０及びＣ１２：０脂肪
酸の濃度を増加させ、且つ微生物細胞におけるＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸の濃度を
減少させることにおける成功を示している。加えて、ここでのデータは、種々のＫＡＳＩ
対立遺伝子の破壊によって形質転換生物の脂肪酸プロフィールに変化をもたらすことがで
きることを示している。
実施例３９：ＫＡＳＩノックダウンによって中鎖脂肪酸の産生を増加させるための微生物
の操作
この例では、ＫＡＳＩ酵素を減弱させるＲＮＡヘアピンをコードする組換えポリヌクレ
オチドの使用による、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールにおいて中鎖脂肪酸が高濃度
化した微生物の操作を記載する。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的な突然
変異誘発株、株Ｓを、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０
０９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／
ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細
書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により、構築物ｐＳＺ２４８２〜ｐ
ＳＺ２４８５の各々で独立して形質転換した。構築物ｐＳＺ２４８２〜ｐＳＺ２４８５の
各々は、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現を下方調節するようにＰｒｏｔｏ
ｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）ＫＡＳＩ ｍＲＮＡ転写物に
標的化されたヘアピンＲＮＡをコードする異なるポリヌクレオチド、核ゲノムへの組み込
み用の６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１）及び３’（配列番号２）相同組換え標
的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプ
ロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸
レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下で配列番号３に示されるタンパク質配列
を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域（配列
番号４）を含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２発現カセットは配列番号７
として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。各ＫＡＳＩヘアピンに対応するポリ
ヌクレオチドの配列表識別情報を、表２８に列挙する。各ＲＮＡヘアピンをコードするポ
リヌクレオチド配列は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴ
Ｒ（配列番号８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）
の制御下にあった。ｓｕｃ２発現カセットのタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２０
０９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／
ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、
及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆ
ｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにコド
ンを最適化した。
株Ｓを表２８に掲載する構築物の各々で独立して形質転換した後、ショ糖を単一炭素源
として含有する寒天プレート上で陽性クローンを選択した。個々の形質転換体をクローン
精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６
１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１
／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述され
るような脂質産生に好適な従属栄養条件下で増殖させた。乾燥バイオマスから脂質サンプ
ルを調製し、実施例１に記載されるとおりの（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明
細書もまた参照）脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化検出法を
用いて分析した。単一炭素源としてのグルコース上で増殖させたＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉ
ｓ ＵＴＥＸ １４３５、及び単一炭素源としてのショ糖上で増殖させた株Ｓの各形質転
換の４つの代表的な単離物の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）
を、表２９に提供する。
表２９に提供されるデータは、ＫＡＳヘアピンＲＮＡ構築物の発現が形質転換生物の脂
肪酸プロフィールに対して及ぼす明らかな影響を示す。ｐＳＺ２４８２又はｐＳＺ２４８
４のいずれかのＫＡＳＩヘアピンＲＮＡ構築物を含む株Ｓ形質転換体の脂肪酸プロフィー
ルは、ＵＴＥＸ １４３５の脂肪酸プロフィールと比べたＣ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、及び
Ｃ１６脂肪酸の割合の増加と、付随するＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸の減少を示した
。
これらのデータは、操作された微生物の脂肪酸プロフィールを変えるための、詳細には
微生物細胞中の中鎖脂肪酸の濃度を増加させ、且つＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸を減
少させることにおける、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４
３５）におけるポリヌクレオチドＫＡＳＩ ＲＮＡヘアピン構築物の有用性及び使用の成
功を示している。
実施例４０：脂肪酸エロンガーゼの過剰発現によってステアリン酸の産生を増加させるた
めの微生物の操作
この例では、脂肪酸エロンガーゼをコードする組換えポリヌクレオチドの使用による、
形質転換微生物の脂肪酸プロフィールにおいてステアリン酸、アラキジン酸、及びドコサ
ジエン酸が高濃度化した微生物の操作を記載する。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的な突然
変異誘発株、株Ｊを、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０
０９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／
ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細
書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により、構築物ｐＳＺ２３２３、ｐ
ＳＺ２３２４、又はｐＳＺ２３２８の各々で独立して形質転換した。構築物の各々は、エ
ロンガーゼを過剰発現させるタンパク質コード領域、核ゲノムへの組み込み用の６Ｓゲノ
ム領域に対する５’（配列番号１）及び３’（配列番号２）相同組換え標的配列（構築物
に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター／５
’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３
’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下で配列番号３に示されるタンパク質配列を発現するＳ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域（配列番号４）を含ん
だ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２発現カセットは配列番号７として列挙され
、選択可能なマーカーとして働いた。各エロンガーゼに対応するポリヌクレオチドの配列
表識別情報を、表３０に列挙する。各エロンガーゼをコードするポリヌクレオチド配列は
、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及び
Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあった。外
因性エロンガーゼ及びｓｕｃ２発現カセットのタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２
００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ
／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書
、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉ
ｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにコ
ドンを最適化した。
表３０に掲載する構築物で株Ｊを独立して形質転換した後、ショ糖を単一炭素源として
含有する寒天プレート上で陽性クローンを選択した。個々の形質転換体をクローン精製し
、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２
号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３
８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述されるよう
な脂質産生に好適な従属栄養条件下で増殖させた。乾燥バイオマスから脂質サンプルを調
製し、実施例１に記載されるとおりの（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書も
また参照）脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化検出法を用いて
分析した。単一炭素源としてのグルコース上で増殖させたＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Ｕ
ＴＥＸ １４３５株Ｊ、及び単一炭素源としてのショ糖上で増殖させた株Ｊの各形質転換
の３つの代表的な単離物の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される）を
、表３１に提供する。
表３１に提供されるデータは、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ及びＴｒ
ｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ酵素の発現が形質転換生物のＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８
：０、Ｃ２０：０、及びＣ２２：２ｎ６脂肪酸プロフィールに対して及ぼす明らかな影響
を示す。非形質転換株Ｊの脂肪酸プロフィールは、約２７．４２％ Ｃ１６：０、約３％
Ｃ１８：０、約５７．５％ Ｃ１８：１、約０．３％ Ｃ２０：０及び約０．０３％
Ｃ２２：２ｎ６脂肪酸であった。株Ｊとは対照的に、エロンガーゼを発現するように種々
のプラスミド構築物で形質転換した株Ｊの脂肪酸プロフィールは、低いパーセンテージレ
ベルのＣ１６脂肪酸及び高いパーセンテージレベルのＣ１８：０、Ｃ２０：０、及びＣ２
２：２ｎ６脂肪酸を含んだ。Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａエロンガーゼ
の過剰発現の結果は、株Ｊの脂肪酸プロフィールと比べてＣ１８：０脂肪酸パーセンテー
ジレベルの約２．５倍の増加、Ｃ２０：０脂肪酸パーセンテージレベルの２倍の増加、及
びＣ２２：２ｎ６脂肪酸パーセンテージレベルの約１５〜３０倍の増加であった。
これらのデータは、操作された微生物の脂肪酸プロフィールを変えるための、詳細には
組換え微生物細胞におけるＣ１８：０、Ｃ２０：０、及びＣ２２：２ｎ６脂肪酸の濃度を
増加させ、且つＣ１６：０脂肪酸を減少させることにおける、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍ
ｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）で発現するエロンガーゼをコードするポリヌ
クレオチドの使用の成功を示している。
実施例４１：アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの過剰発現によってステアリン酸の産生を
増加させるための微生物の操作
この例では、種々のＣ１８：０選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする組
換えポリヌクレオチドの使用による、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールにおいてステ
アリン酸が高濃度化した微生物の操作を記載する。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的な突然
変異誘発株、株Ｊ又は株Ａを、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／
ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、
ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９
６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換方法により、表３２に掲載する
構築物で独立して形質転換した。構築物の各々は、Ｃ末端３Ｘ ＦＬＡＧ（登録商標）エ
ピトープタグを伴う脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを過剰発現させるタンパク質
コード領域、核ゲノムへの組み込み用の６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号１）及び
３’（配列番号２）相同組換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａ
ｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号５）及びＣｈｌｏｒ
ｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下で配列
番号３に示されるタンパク質配列を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｃ２ショ糖
インベルターゼコード領域（配列番号４）を含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓ
ｕｃ２発現カセットは配列番号７として列挙され、選択可能なマーカーとして働いた。各
チオエステラーゼに対応するポリヌクレオチドの配列表識別情報を表３２に掲載する。各
チオエステラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Ａ
ｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダク
ターゼ３’ＵＴＲ（配列番号６）の制御下にあった。外因性チオエステラーゼ及びｓｕｃ
２発現カセットのタンパク質コード領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細
書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６
３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２
／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＴＥＸ １
４３５核遺伝子に固有のコドンバイアスを反映するようにコドンを最適化した。
株Ａ又は株Ｊを表３２に掲載する構築物で独立して形質転換した後、ショ糖を単一炭素
源として含有する寒天プレート上で陽性クローンを選択した。個々の形質転換体をクロー
ン精製し、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６
６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１
１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述さ
れるような脂質産生に好適な従属栄養条件下で増殖させた。乾燥バイオマスから脂質サン
プルを調製し、実施例１に記載されるとおりの（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号
明細書もまた参照）脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー水素炎イオン化検出法
を用いて分析した。単一炭素源としてのグルコース上で増殖させたＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍ
ｉｓ ＵＴＥＸ １４３５株Ｊ、及び単一炭素源としてのショ糖上で増殖させた、株Ｊの
各形質転換の代表的な単離物の脂肪酸プロフィール（全脂肪酸に対する面積％で表される
）を、表３３に提供する。
表３３に提供されるデータは、外因性アシル−ＡＣＰ酵素が形質転換微生物の脂肪酸プ
ロフィールに対して及ぼす明らかな影響を示す。非形質転換株Ａ及び株Ｊの脂肪酸プロフ
ィールは、約２５％ Ｃ１６：０、約３．３％ Ｃ１８：０、約５７〜６０％ Ｃ１８：
１であった。対照的に、アシル−ＡＣＰ酵素を発現するように種々のプラスミド構築物で
形質転換した株Ａの脂肪酸プロフィールは、株Ａと比べて高いパーセンテージレベルのＣ
１８：０脂肪酸及び低いパーセンテージレベルのＣ１８：１脂肪酸を含んだ。株Ａ又は株
ＪにおけるＢ．ｎａｐｕｓ、Ｃ．ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ、Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ及びＧ．
ｍａｎｇｏｓｔａｎａ由来のＦＡＴＡ酵素の発現により、形質転換生物におけるステアリ
ン酸レベルの蓄積が可能となった。Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓアシル−ＡＣＰチオエ
ステラーゼの過剰発現の結果は、株Ａの脂肪酸プロフィールと比べた形質転換生物の脂肪
酸プロフィールのＣ１８：０脂肪酸パーセンテージレベルの約２〜５倍の増加であった。
Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＳＡＤ１トランジットペプチドを含むＧ．ｍａｎｇ
ｏｓｔａｎａアシル−ＡＣＰ ＦＡＴＡチオエステラーゼを過剰発現するように操作され
た細胞の脂肪酸プロフィールは、株Ｊの脂肪酸プロフィールと比べた形質転換生物の脂肪
酸プロフィールのＣ１８：０脂肪酸パーセンテージレベルの約２〜３倍の増加によって特
徴付けられた。
これらのデータは、操作された微生物の脂肪酸プロフィールを変えるための、詳細には
組換え微生物細胞におけるＣ１８：０脂肪酸の濃度を増加させ、且つＣ１８：１脂肪酸を
減少させることにおける、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １
４３５）で発現する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするポリヌクレオチ
ドの有用性及び有効な使用を示している。
実施例４２：エロンガーゼ又はβ−ケトアシル−ＣＯＡシンターゼの過剰発現によってエ
ルカ酸の産生を増加させるための微生物の操作
本発明の実施形態において、場合によりプラスチドの油産生微生物で外因性エロンガー
ゼ又はβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを発現する働きをする組換えポリヌクレオチド
形質転換ベクターを構築し、それを利用して、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明
細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４
６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１
２／０２３６９６号明細書に記載されるとおりの遺伝子銃による形質転換法によりＰｒｏ
ｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）を形質転換し、エルカ酸
の産生が増加した細胞を得る。形質転換ベクターは、表５に掲載するようなエロンガーゼ
又はβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを過剰発現させるタンパク質コード領域、外来遺
伝子の発現を調節するプロモーター及び３’ＵＴＲ制御配列、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ
（ＵＴＥＸ １４３５）核ゲノムへの組み込み用の組換えポリヌクレオチドを標的化する
５’及び３’相同組換え標的配列、並びに選択可能なマーカーを発現する働きをするヌク
レオチドを含む。形質転換ベクターのタンパク質コード配列は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／
０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２
０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰ
ＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に記載されるとおり、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍ
ｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）での発現用にコドンを最適化する。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉ
ｓ（ＵＴＥＸ １４３５）での発現用に働くプロモーター、３’ＵＴＲ、及び選択可能な
マーカーをコードする組換えポリヌクレオチドは、本明細書及びＰＣＴ／ＵＳ２００９／
０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２
０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６４号明細書、及びＰ
ＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に開示される。
形質転換ベクターをＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）に、又はＰ．ｍ
ｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の古典的な突然変異誘発株に形質転換した後
、寒天プレート上で陽性クローンを選択する。個々の形質転換体をクローン精製し、ＰＣ
Ｔ／ＵＳ２００９／０６６１４１号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細
書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６
４号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２３６９６号明細書に詳述されるとおりの脂
質産生に好適な従属栄養条件下で培養する。各形質転換体由来の乾燥バイオマスから脂質
サンプルを調製し、実施例１に記載されるとおり脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラ
フィー水素炎イオン化（ＦＡＭＥ ＧＣ／ＦＩＤ）検出法を用いてこれらのサンプルの脂
肪酸プロフィールを分析する。これらの操作の結果として、細胞は少なくとも５、１０、
１５、又は２０倍のエルカ酸の増加を呈し得る。
実施例４３：Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴの発現による株ＵＴＥＸ１４３５に
おけるカプリン酸、ラウリン酸、及びミリスチン酸リッチな油の生成
本発明者らは、Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ由来のアシルＡＣＰチオエステラーゼ
（ＦＡＴＢ２）を発現する先述のＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）トラ
ンスジェニック株における２つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルト
ランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）の発現の効果を試験した。ＣｕＰＳＲ２３ゲノム配列と
シードＲＮＡに由来するトランスクリプトーム配列との組み合わせを分析することにより
、Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３（ＣｕＰＳＲ２３）由来のＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３遺
伝子を同定した。これらの２つのＬＰＡＡＴについては、これまで記載がなかった。これ
らの遺伝子は、ＵＴＥＸ １４３５コドン使用頻度を反映するようにコドンを最適化した
。形質転換、細胞培養、脂質産生及び脂肪酸分析は、全て既述のとおり実施した。
Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ １−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトラ
ンスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３）［それぞれｐＳＺ２２９９及びｐＳＺ
２３００］の発現による株Ｂにおけるカプリン酸の、ラウリン酸、及びミリスチン酸蓄積
の増加：この例では、それぞれＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３をコード
する構築物ｐＳＺ２２９９又はｐＳＺ２３００で株Ｂを形質転換することにより、トラン
スジェニック株を作成した。これらのトランスジェニック株を、抗生物質Ｇ４１８に対す
る耐性について選択した。構築物ｐＳＺ２２９９は、ｐＬＯＯＰ５’：：ＣｒＴＵＢ２：
ＮｅｏＲ：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ３：ＣｕＰＳＲ２３ＬＰＡＡＴ２−１：ＣｖＮＲ：：
ｐＬＯＯＰ３’として表すことができる。構築物ｐＳＺ２３００は、ｐＬＯＯＰ５’：：
ＣｒＴＵＢ２：ＮｅｏＲ：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ３：ＣｕＰＳＲ２３ＬＰＡＡＴ３−１
：ＣｖＮＲ：：ｐＬＯＯＰ３’として表すことができる。形質転換ＤＮＡ（ｐＳＺ２２９
９及びｐＳＺ２３００）の配列は以下に提供する。構築物中の関連する制限部位は、５’
−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩであり、小文字、太字、及び下線で示さ
れる。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。構築物
の５’及び３’末端にある太字で小文字の配列は、相同組換えによるｐＬｏｏｐ遺伝子座
への組み込みを標的とするＵＴＥＸ １４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’
方向に進んで、選択カセットは、ＮｅｏＲ遺伝子（Ｇ４１８に対する耐性を付与する）及
びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲの
Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター駆動発現を有する。このプ
ロモーターは、小文字で囲い文字のテキストにより示す。ＮｅｏＲのイニシエーターＡＴ
Ｇ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字
のイタリックで示す。３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示す。２つのカセット間
のスペーサー領域を大文字のテキストにより示す。Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３由来のコド
ン最適化したＬＰＡＡＴ２遺伝子（ｐＳＺ２２９９）又はＬＰＡＡＴ３遺伝子（ｐＳＺ２
３００）を含む第２のカセットは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ内在性
ＡＭＴ３プロモーターにより駆動され、同じＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸
レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを有する。このカセットでは、ＡＭＴ３プロモー
ターを小文字の囲い文字テキストにより示す。ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡ
ＡＴ３遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックで
示し、一方コード領域を小文字のイタリックにより示す。３’ＵＴＲを小文字の下線テキ
ストにより示す。正しいリーディングフレーム及び標的配列を確実にするため、最終構築
物を配列決定した。
ｐＳＺ２２９９形質転換構築物：




ｐＳＺ２３００形質転換構築物：




ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３遺伝子が中鎖脂肪酸蓄積に対して及ぼ
す影響を決定するため、ＵＴＥＸ １４５３ ＡＭＴ３プロモーターによって駆動される
コドン最適化ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２又はＬＰＡＡＴ３遺伝子を含む上記の構築物
を株Ｂに形質転換した。
一次形質転換体をクローン精製し、標準的な脂質産生条件下、ｐＨ７．０で成長させた
（いずれの株も、ｐＨ調節性ＡＭＴ３プロモーターにより駆動されるＣｕＰＳＲ２３ Ｌ
ＰＡＡＴ２又はＬＰＡＡＴ３遺伝子の最大発現を可能にするためには、ｐＨ７．０での成
長を必要とする）。これらの形質転換によって生じた一組の代表的なクローンから得られ
たプロフィールを、以下の表３４に示す。Ｄ１５２０は、ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２
を含む株Ｂのクローンを表し、Ｄ１５２１は、ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ３を含む株Ｂ
のクローンを表す。
トランスジェニックＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２株（Ｄ１５２０Ａ〜Ｅ）は、Ｃ１０
：０、Ｃ１２：０、及びＣ１４：０脂肪酸の蓄積の大幅な増加と、付随するＣ１８：１及
びＣ１８：２の減少を示す。トランスジェニックＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ３株（Ｄ１
５２１Ａ〜Ｅ）は、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、及びＣ１４：０脂肪酸の蓄積の大幅な増加
と、付随するＣ１８：１の減少を示す。これらのトランスジェニック系におけるＣｕＰＳ
Ｒ２３ ＬＰＡＡＴの発現は、一般に中鎖脂肪酸の、特にラウリン酸の蓄積が増加する直
接の原因であるものと思われる。トランスジェニック系は、より長鎖の脂肪酸（Ｃ１６：
０以上）から中鎖脂肪酸へのシフトを示すが、このシフトは主にＣ１０：０及びＣ１２：
０脂肪酸が標的となり、Ｃ１４：０脂肪酸に対する効果は僅かである。提供されるデータ
はまた、Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３由来のＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３遺伝子と、Ｃ．
ｗｒｉｇｈｔｉｉ由来のＦＡＴＢ２（株Ｂの株で発現する）との共発現が、Ｃ１２：０脂
肪酸の蓄積に対して相加効果を有することも示している。
本発明者らの結果は、ＵＴＥＸ １４３５に由来する藻類株においてＣｕｐｈｅａ Ｐ
ＳＲ２３のＬＰＡＡＴ酵素が活性であることを示唆している。これらの結果はまた、この
酵素が、株Ｂで発現する異種性ＦａｔＢ２アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ酵素（これは
Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉに由来する）と共に機能することも示している。
実施例４４：Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＦＡＴＢ２と組み合わせたＣｕｐｈｅａ
ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴＸの発現による株ＵＴＥＸ１４３５における脂肪酸レベルの改
変
ここで本発明者らは、先述のＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）トラン
スジェニック株、株Ｂにおける１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトラ
ンスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）の発現の効果を示す。上記に記載したとおり、株Ｂは、Ｃ
ｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ由来のアシルＡＣＰチオエステラーゼ（ＦＡＴＢ２）を発
現するトランスジェニック株であり、４０〜４９％のＣ１２：０脂肪酸を蓄積する。実施
例４３に加えて、ＣｕＰＳＲ２３ゲノム配列とシードＲＮＡに由来するトランスクリプト
ーム配列との組み合わせを分析することにより、第３のＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ、Ｌ
ＰＡＡＴｘが同定された。従って、中鎖特異的ＬＰＡＡＴの発現により、ｓｎ−２位にカ
プリン酸（Ｃ１０：０脂肪酸）、ラウリン酸（Ｃ１２：０脂肪酸）、又はミリスチン酸（
Ｃ１４：０脂肪酸）を有するＴＡＧの割合が増加するはずであり、結果的にこれらの脂肪
酸のレベル全体が上昇するはずである。実施例４３では、ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３
が、株Ｂにおけるカプリン酸、ラウリン酸、及びミリスチン酸蓄積を増加させることが示
された。株ＢにＬＰＡＡＴｘを導入し、この株における脂肪酸レベルに対するその効果を
決定した。ＬＰＡＡＴｘ遺伝子は、ＵＴＥＸ １４３５コドン使用頻度を反映するように
コドンを最適化した。形質転換、細胞培養、脂質産生及び脂肪酸分析は、全て既述のとお
り実施した。
Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ １−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトラ
ンスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴｘ）［ｐＳＺ２５７５］の発現による株の株Ｂにおけるカプ
リン酸、ラウリン酸、及びミリスチン酸蓄積の減少及びパルミチン酸及びステアリン酸蓄
積の増加：この例では、ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘをコードする構築物ｐＳＺ２５７
５で株Ｂを形質転換することによってトランスジェニック株を作成した。このトランスジ
ェニック株を、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性について選択した。構築物ｐＳＺ２５７５
は、ｐＬＯＯＰ５’：：ＣｒＴＵＢ２：ＮｅｏＲ：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ３：ＣｕＰＳ
Ｒ２３ＬＰＡＡＴｘ：ＣｖＮＲ：：ｐＬＯＯＰ３’として表すことができる。形質転換Ｄ
ＮＡの配列は、以下に提供する（ｐＳＺ２５７５）。構築物中の関連する制限部位は、５
’−３’にそれぞれＢｓｐＱ１、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱ１であり、小文字、太字、及び下線で示さ
れる。ＢｓｐＱ１部位は、形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。構築
物の５’及び３’末端にある太字で小文字の配列は、相同組換えによるｐＬｏｏｐ遺伝子
座への組み込みを標的とするＵＴＥＸ １４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３
’方向に進んで、選択カセットは、ＮｅｏＲ遺伝子（Ｇ４１８に対する耐性を付与する）
及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲ
のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーター駆動発現を有する。この
プロモーターは、小文字で囲い文字のテキストにより示す。ＮｅｏＲのイニシエーターＡ
ＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文
字のイタリックで示す。３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示す。２つのカセット
間のスペーサー領域を大文字のテキストにより示す。Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３由来のコ
ドン最適化ＬＰＡＡＴｘ遺伝子（ｐＳＺ２５７５）を含む第２のカセットは、Ｐｒｏｔｏ
ｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ内在性ＡＭＴ３プロモーターにより駆動され、同じＣ
ｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを有す
る。このカセットでは、ＡＭＴ３プロモーターを、小文字の囲い文字のテキストにより示
す。ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘ遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴ
ＧＡは大文字のイタリックで示し、一方コード領域は小文字のイタリックにより示す。３
’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示す。正しいリーディングフレーム及び標的配列
を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
ｐＳＺ２５７５形質転換構築物




ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘ遺伝子が脂肪酸蓄積に対して及ぼす影響を決定するため
、ＵＴＥＸ １４５３ ＡＭＴ３プロモーターによって駆動されるコドン最適化ＣｕＰＳ
Ｒ２３ ＬＰＡＡＴｘ遺伝子を含む上記の構築物を、株Ｂに形質転換した。
一次形質転換体をクローン精製し、低窒素条件下ｐＨ７．０で成長させた；ｐＨ調節性
ＡＭＴ３プロモーターにより駆動されるＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘ及びＣｗＦＡＴＢ
２遺伝子の最大発現を可能にするためには、株はｐＨ７．０での成長を必要とする。これ
らの形質転換によって生じた一組の代表的なクローンから得られたプロフィールを、以下
の表３５に示す。Ｄ１５４２は、ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘを含む株Ｂのクローンを
表す。
トランスジェニックＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘ株（Ｄ１５４２Ａ〜Ｅ）は、親の株
Ｂと比べてＣ１０：０、Ｃ１２：０、及びＣ１４：０脂肪酸の蓄積の大幅な減少と、付随
するＣ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１及びＣ１８：２の増加を示す。これらのトラン
スジェニック系におけるＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘ遺伝子の発現は、中鎖脂肪酸（Ｃ
１０〜Ｃ１４）の蓄積減少及びＣ１６：０及びＣ１８脂肪酸の蓄積増加の直接の原因であ
るものと思われ、最も顕著な増加はパルミチン酸（Ｃ１６：０）で観察された。提供され
るデータはまた、Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ由来の中鎖特異的ＦＡＴＢ２（株Ｂに存在する）
の発現にも関わらず、ＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘの発現がＴＡＧへのより長鎖の脂肪
酸の取り込みに有利であるように見えることも示している。
本発明者らの結果は、ＵＴＥＸ １４３５に由来する藻類株においてＣｕｐｈｅａ Ｐ
ＳＲ２３のＬＰＡＡＴｘ酵素が活性であることを示唆している。中鎖脂肪酸レベルを増加
させるＣｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３とは対照的に、ＣｕＰ
ＳＲ２３ ＬＰＡＡＴｘはＣ１６：０及びＣ１８：０レベルの増加をもたらす。これらの
結果は、ＣｕＰＳＲ２３に由来する異なるＬＰＡＡＴ（ＬＰＡＡＴ２、ＬＰＡＡＴ３、及
びＬＰＡＡＴｘ）が、全体的な脂肪酸レベルに対するそれらの効果により判断するとき、
株Ｂにおいて異なる脂肪酸特異性を呈することを示している。
実施例４５：内因性微細藻類ＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが過剰発現する結
果としての脂肪酸プロフィールの鎖長の減少
ここで、本発明者らは、ＵＴＥＸ１４３５におけるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆ
ｏｒｍｉｓ内因性チオエステラーゼＦＡＴＡ１の過剰発現が、細胞トリグリセリドＣ１８
：０及びＣ１８：１アシル鎖の明確な減少とＣ１６：０、Ｃ１４：０の増加をもたらすこ
とを示す。
Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＴＡ１遺伝子の過剰発現に使用した構築物（ｐＳＺ２
４２２、ｐＳＺ２４２１）：Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ 株ＪにおいてＰｍＦＡＴＡ１を
過剰発現させるため、コドン最適化ＰｍＦＡＴＡ１遺伝子を株Ｊに形質転換した。Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ遺伝子を選択可能なマーカ
ーとして利用して、ショ糖培地上で成長する能力を付与した。株Ｊで発現した構築物ｐＳ
Ｚ２４２２は、６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ３’：ＰｍＡＭＴ３−
Ｐｍ ＦＡＴＡ１（ｏｐｔ）−ＣｖＮＲ３’：：６ＳＢとして表すことができ、構築物ｐ
ＳＺ２４２１は、６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ３’：ＰｍＡＭＴ３
−Ｓ１０６ＳＡＤ ＴＰ−Ｐｍ ＦＡＴＡ１（ｏｐｔ）−ＣｖＮＲ３’：：６ＳＢとして
表すことができる。
形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する。構築物ｐＳＺ２４２２における関連する制
限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ
Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、
Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’
末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６ｓ遺伝子座での相同組換え
による標的化した組み込みを可能にする株Ｊ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方
向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子（ショ糖を代謝する株Ｊの能力を付与する
）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターを、囲
い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネータ
ーＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリッ
クで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字
の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰ
．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性ａｍｔ０３プロモーターが続く。ＰｍＦＡＴＡ１のイニ
シエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより
示し、一方、残りの遺伝子は太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レ
ダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小
文字テキストにより示される株Ｊ ６Ｓゲノム領域が続く。
構築物ｐＳＺ２４２１における関連する制限部位はｐＳＺ２４２２と同じである。ｐＳ
Ｚ２４２１では、ＰｍＦＡＴＡ１は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅ
ｓ Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドと融合し、この
トランジットペプチドは、ＰｍＦＡＴＡ１のイニシエーターＡＴＧとＡｓｃ Ｉ部位との
間に位置する。
ｐＳＺ２４２２に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列






内在性ＦＡＴＡ１遺伝子が株Ｊにおいて過剰発現したときの脂肪酸プロフィールに対す
る影響を決定するため、天然トランジットペプチドを含むＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Ｆ
ＡＴＡ１、及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＳＡＤトランジッ
トペプチドと融合したＰｍＦＡＴＡ１を両方ともにａｍｔ０３プロモーターにより駆動し
、得られたプラスミドを独立に株Ｊに形質転換した。
一次形質転換体をクローン精製し、低窒素脂質産生条件下ｐＨ７．０で成長させた（い
ずれのプラスミドも、ｐＨ調節性ａｍｔ０３プロモーターにより駆動されるとき、ＰｍＦ
ＡＴＡ１遺伝子発現の最大発現を可能にするためには、ｐＨ７．０での成長を必要とする
）。ｐＳＺ２４２２及びｐＳＺ２４２１を株Ｊに形質転換することによって生じた代表的
なクローンから得られたプロフィールを、以下の表に示す。
以下の表３６において、天然ＰｍＦＡＴＡ１が過剰発現することの影響は、Ｃ１８：１
鎖長の明確な減少と、Ｃ１６：０、Ｃ１４：０の、及び場合によりＣ１８：０の増加であ
る。プロセシングのタンパク質局在を考慮して、本発明者らはまた、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ
ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプ
チドと融合したＰｍＦＡＴＡ１も試みた。本発明者らがａｍｔ０３−天然ＰｍＦＡＴＡ１
構築物で観察した結果と同様に、Ｃ１６：０及びＣ１４：０レベルは親株の株Ｊより大幅
に高くなる。
従って、本発明者らは、微細藻類細胞の脂肪酸プロフィールにおけるパーセントミリス
チン酸及びラウリン酸レベルを、Ｃ１８選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの過剰発
現によって増加させることができると結論付ける。
実施例４６：ロールイン用ショートニングとしての使用に好適な細胞油
食用脂肪の栄養及び機能特性は、従来、特定の化学組成及び結晶化条件と結び付けられ
ている。ある油供給源から別の供給源に切り替えることは、脂肪の融解挙動及び構造のい
ずれもが劇的に変化して機能性に有害な変化が及ぶため、通常は困難な課題である。ここ
最近のことで、部分的に水素化した脂肪がパーム油及びパーム油画分に置き換えられた際
の苦しい時期が思い起こされ得る。本発明者らは、化学組成が大きく異なる２つの脂肪の
降伏応力、弾性率、多形、微細構造及び融解特性をどうすれば一致させることができるか
を調べた。油Ａは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓプラスチド標的
配列を含む外因性インベルターゼ及びＵｌｍｕｓ ａｍｅｒｉｃａｎａアシル−ＡＣＰチ
オエステラーゼを発現するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞から生成し
た。油Ｂは、外因性インベルターゼ及びＣｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａアシル−Ａ
ＣＰチオエステラーゼを発現するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞から
生成した。油Ａは、６２％（ｗ／ｗ）超の中鎖脂肪酸、又はＭＣＴ（Ｃ８：０〜Ｃ１４：
０）、２３％（Ｃ１６：０＋Ｃ１８：０）及び９％のＣ１８：１を含有した一方、油Ｂは
、２％未満のＣ８：０〜Ｃ１４：０、５４％（Ｃ１６：０＋Ｃ１８：０）及び２９％のＣ
１８：１を含有した。従って油Ａは中鎖トリグリセリドリッチな脂肪であり、一方、油Ｂ
はパーム油に似ていた。両方の油とも、２０℃で約４５％の固形脂肪含有量を有し、ＳＦ
Ｃ対温度プロフィールは極めて類似していた。ＤＳＣ（動的走査熱量測定）融解プロフィ
ールは、約１２〜１３℃及び約２８〜３５℃を中心とする２つの主要なピークを示した。
両方の脂肪とも、βプライム多形形態（Ｘ線回折によって決定するとき）であり、特有の
特徴を備える非対称の細長いクリスタリット形態を呈した。油Ａ及び油Ｂの降伏応力及び
貯蔵弾性率（Ｇ’）は、それぞれ５２０〜５５０Ｐａ、及び７×１０６Ｐａ〜１．８×１
０７Ｐａであった。この範囲の降伏応力は十分な可塑性を示唆しており、これが高い貯蔵
弾性率と組み合わさると、理想的なロールイン用ショートニングになる。従って、食品油
の薄層形成の機能性を保持しながらもその化学組成を変えることが可能である。
本発明の上記の実施形態のいずれかの細胞及び方法と共に使用される他の好適な酵素と
しては、上記の説明において挙げたタンパク質の一つと少なくとも７０％のアミノ酸同一
性を有するもの、及び対応する所望の酵素活性を呈するものが挙げられる。さらなる実施
形態において、酵素活性は、上記の核酸配列（これらは全て、完全に示されたものとして
本明細書によって参照により援用される）の一つと少なくとも約７５％、少なくとも約８
０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも
約９９％の同一性を有する配列に存在する。
実施例４７：ココアバター模倣物である調整微生物油からトリ飽和物を除去するための
分画
精製、漂白及び脱臭された油を株Ｋ４から得た（実施例３５を参照）。油を７０℃に加
熱し、毎分０．５℃で３６℃に冷却し、３６℃に１時間保った。次に約２．５ｍｌのサン
プルを３６℃で１時間、４３００で遠心した。液体上清を回収し、リパーゼ及び質量分析
法を用いて分析した。サンプルは、トリステアリン（ＳＳＳ）、ＳＳＰ、及びＰＰＳが欠
乏していることが分かった。サンプルのトリアシルグリセロールはココアバターのトリア
シルグリセロールと極めて類似していることが見出され、液体上清は、トリ飽和物の量が
少ない点でさらにココアバターに近いものであった。さらなる分画実験を実施例６４に記
載する。
実施例４８：ＫＡＳＩＩの過剰発現、一方のＳＡＤ対立遺伝子のノックアウト及び第２の
ＳＡＤ対立遺伝子の抑制による油産生細胞における高ステアリン酸トリグリセリド油の産
生
油産生性の非光合成藻類であるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓは、栄養
炭素供給が過剰な条件下で多量のトリアシルグリセリド油を蓄えるが、他の必須栄養素が
制限されるため、細胞分裂は阻害される。最長Ｃ１８の炭素鎖長を有する脂肪酸のバルク
生合成がプラスチドで起こる；次に脂肪酸が小胞体に輸送され、そこでＣ１８を越える伸
長及びトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）への取り込みが（それが起こる場合には）起こる
と考えられている。脂質は脂肪体と呼ばれる大きい細胞質小器官に蓄えられ、環境条件が
成長に有利に変化すると、直ちに動員され、同化代謝にエネルギー及び炭素分子を提供す
る。野生型Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ貯蔵脂質は、主に約６０％オレイン酸（Ｃ１８：１
）、約２５〜３０％パルミチン酸（Ｃ１６：０）、及び約５〜８％リノール酸（Ｃ１８：
２）から構成され、少量のステアリン酸（Ｃ１８：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、
α−リノレン酸（Ｃ１８：３α）、及びパルミトレイン酸（Ｃ１６：１）を含む。この脂
肪酸プロフィールは、内在性脂肪酸生合成経路の酵素の相対活性及び基質親和性によって
もたらされる。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓは、分子遺伝学的ツールを使用した脂肪酸及び
脂質生合成の操作を行い易く、脂肪酸プロフィールが野生型組成と極めて異なる油の産生
を可能にする。本明細書では、最大５７％のステアリン酸を含み、且つパルミチン酸が７
％もの低さである株を作成するため、本発明者らがステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ
（ＳＡＤ）及びβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＫＡＳＩＩ）遺伝子の発現を改
変した株について記載する。本発明者らは、ＦＡＴＡチオエステラーゼ及びＦＡＤ２脂肪
酸デサチュラーゼ遺伝子の発現の下方調節と併せた同様の改変を実施するとき、最大５５
％のステアリン酸を含み、且つリノール酸が２．４％もの低さであるさらなる株を同定す
る。
可溶性ＳＡＤは、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）が結合したステアリン酸から
オレイン酸（Ｃ１８：１ｃｉｓ−Δ９）への不飽和化を触媒するプラスチド局在性のジ鉄
酵素である。これまでに、本発明者らは、ＳＡＤ１又はＳＡＤ２転写物を標的化するヘア
ピン構築物が細胞ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）機構を活性化し、ＳＡＤ活性を下方調節して、
貯蔵脂質中のＣ１８：０レベルの上昇をもたらすことを確立している。ＳＡＤ活性はまた
、貯蔵脂質生合成中に発現する主要なＳＡＤをコードするＳＡＤ２の２つの対立遺伝子の
うちの一方を破壊する株において減少する。脂肪酸デサチュラーゼ２（ＦＡＤ２）遺伝子
は、オレイン酸をリノール酸（Ｃ１８：２ｃｉｓ−Δ９、ｃｉｓ−Δ１２）に変換する小
胞体膜結合性デサチュラーゼをコードする。ＦＡＤ２を標的化するヘアピンＲＮＡｉ構築
物は、リノール酸レベルを１〜２％に低下させる。ＫＡＳＩＩは、マロニル−ＡＣＰとパ
ルミトイル（Ｃ１６：０）−ＡＣＰとの縮合を特異的に触媒してβ−ケト−ステアロイル
−ＡＣＰを形成させる脂肪酸シンターゼである。本発明者らは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉ
ｓにおけるＫＡＳＩＩの過剰発現がＣ１６：０レベルの低下と、付随するＣ１８：１存在
量の増加を引き起こすことを明らかにしている。以下の例において、本発明者らは、ＲＮ
Ａｉを使用してＳＡＤ遺伝子発現を下方調節し、ＳＡＤ２遺伝子の対立遺伝子を破壊し、
及びＫＡＳＩＩ脂肪酸シンターゼを過剰発現することにより、全脂肪酸の５０％を超える
ステアリン酸の蓄積能を有するとともにＳＯＳを主要なＴＡＧ種として含む株が、本発明
者らによって作成されることを示す。ＳＯＳレベルは、ＳＡＤ２及びＦＡＤ２の下方調節
とＫＡＳＩＩ過剰発現とを組み合わせる株において最大４７％に増加した。
株ＪにおけるＳＡＤ２ノックアウト／ＲＮＡｉに使用される構築物：Ｓ１９２０におい
てＳＡＤ２−１対立遺伝子を破壊すると同時にＳＡＤ２ヘアピン構築物を発現させるため
、ＤＮＡ構築物ｐＳＺ２２８２を作製した。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける発現用に
コドンを最適化した、ショ糖インベルターゼをコードするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＵＣ２遺伝子を、形質転換の選択可能なマーカーとして利用し
た。形質転換ＤＮＡの配列は、このすぐ後に提供する。関連する制限部位は小文字の太字
で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＡｓｃＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ
、ＡｖｒＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎＤＩＩＩ、及び
ＳａｃＩである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定め
る。構築物の５’及び３’フランクの下線の配列は、ＳＡＤ２−１遺伝子座における相同
組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉ
ｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＵＣ２遺伝子（ショ糖加水分解活性をコードし、それにより
ショ糖上での株の成長を可能にする）の発現を駆動するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒ
ｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ＴＵＢ２プロモーターは、小文字の囲い文字のテキストにより示
す。ＳＵＣ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックに
より示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇ
ａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子の３’ＵＴＲをスモールキャピタルにより示し
、その後に、小文字テキストにより示されるスペーサー領域が続く。小文字の囲い文字の
テキストにより示される第２のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ＴＵＢ２プロモーター配列
は、ＳＡＤ２ヘアピンＣ配列の発現を駆動する。センス鎖及びアンチセンス鎖は大文字、
太字のイタリックで示し、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ Δ１２−脂肪酸デサチュラーゼ（
ＦＡＤ２）イントロン及び第２のエクソンの最初の１０塩基（大文字のイタリック）によ
って分けられる。第２のＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ ３’ＵＴＲをスモールキャピタル
により示す。
ｐＳＺ２２８２由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：




ＳＡＤ２ノックアウト／ノックダウン株の同定及び分析：ｐＳＺ２２８２に由来する構
築物Ｄ１２８３を、株Ｊに形質転換した。一次形質転換体をクローン精製し、標準的な脂
質産生条件下、ｐＨ５で成長させた。ｐＳＺ２２８２を株Ｊに形質転換することによって
生じた代表的なクローンから得られた脂肪酸プロフィールを、以下の表３９に要約する。
Ｄ１２８３形質転換体は、Ｃ１８：１を犠牲にして最大約４２％のＣ１８：０を蓄積した
ことから、これらの株でＳＡＤ活性が大幅に低下したことが示される。
表３９では、野生型レベルと比べて高いステアリン酸（Ｃ１８：０）レベルを太字テキ
ストで強調している。
形質転換体Ｄ１２８３−４及び−７の脂肪酸プロフィールは、選択（ショ糖上での成長
）の非存在下で３０代を超えて成長した後にも安定であることが決定された。次に振盪フ
ラスコアッセイにおける選択された株のパフォーマンスを評価した。脂肪酸プロフィール
及び脂質価を以下の表４０に提供する。株Ｘは株Ｊ親と比べて最高レベルのＣ１８：０（
約４４％）、及び最良の脂質価（約２６％）を有し、従ってさらなる発酵展開用に選択し
た。
表４０では、野生型レベルと比べて高いステアリン酸（Ｃ１８：０）レベルを太字テキ
ストで強調している。
本発明者らは、７Ｌ発酵における株Ｘのパフォーマンスを最適化し、振盪フラスコで達
成される約４４％のＣ１８：０レベルに匹敵させ得ることを見出し、ここで脂質生産性は
野生型親の約４５％であった。代表的な株Ｋ−４発酵の脂肪酸プロフィール及び脂質価を
、以下の表４１に要約する。最適条件下での株Ｘの発酵によってほぼ４４％のＣ１８：０
が得られ、これは、振盪フラスコアッセイで蓄積したステアリン酸レベルと同程度であっ
た。株Ｘは、フラスコ及び７Ｌ規模の両方で高いＣ１８：０レベルを生じ、７Ｌ発酵で許
容できる脂質生産性を有した；結果的に、Ｃ１８：０蓄積を増加させることを目的とする
さらなる改変用の基本株として、この株を選択した。
表４１では、対照より高いステアリン酸（Ｃ１８：０）レベルを太字テキストで強調し
ている。株Ｙは、６Ｓ遺伝子座に組み込まれた、ショ糖インベルターゼをコードするＳ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＵＣ２を含み、株Ｊ野生型親と区別がつかない脂肪酸プロフィ
ールを有する。
株Ｋ−４におけるＫＡＳＩＩ過剰発現に使用した構築物：株Ｘにおいてコドン最適化Ｐ
．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ遺伝子を過剰発現させるため、ＤＮＡ構築物ｐＳＺ
２７３４を作製した。アミノグリコシド抗生物質に対する耐性を付与するトランスポゾン
Ｔｎ５由来のｎｅｏＲ遺伝子を、形質転換の選択可能なマーカーとして使用した。形質転
換ＤＮＡの配列は、このすぐ後に提供する。関連する制限部位は小文字の太字で示し、５
’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｖｒＩ
Ｉ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＨｉｎＤＩ
ＩＩ及びＳａｃＩである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境
界を定める。構築物の５’及び３’フランクの下線の配列は、６Ｓ遺伝子座における相同
組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉ
ｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、ｎｅｏＲ（アミノグリコシド
ホスホトランスフェラーゼ活性をコードし、それによりＧ４１８上での株の成長を可能に
する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ＴＵＢ２プロモーターを、小文字
の囲い文字のテキストにより示す。ｎｅｏＲのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーター
ＴＧＡを大文字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。
Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ遺伝子の３’ＵＴＲをスモールキャピタルにより示し、その
後に、小文字テキストにより示されるスペーサー領域が続く。囲い文字のテキストにより
示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＳＡＤ２−２プロモーター配列は、コドン最適化Ｐ
．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ遺伝子の発現を駆動する。ＫＡＳＩＩプラスチド標
的配列をコードする領域を、大文字のイタリックにより示す。成熟Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍ
ｉｓ ＫＡＳＩＩポリペプチドをコードする配列を、太字、大文字のイタリックで示し、
一方３ｘＦＬＡＧエピトープコード配列は太字、下線、大文字のイタリックである。第２
のＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ ３’ＵＴＲを、スモールキャピタルにより示す。




株ＸにおけるＫＡＳＩＩの過剰発現：ｐＳＺ２７３４に由来する構築物Ｄ１６４３を、
先述のとおり株Ｘに形質転換した。一次形質転換体をクローン精製し、標準的な脂質産生
条件下、ｐＨ５で成長させた。株ＸをＤ１６４３で形質転換することによって生じた代表
的なクローンから得られた脂肪酸プロフィールを、以下の表４２に要約する。ＳＡＤ２ノ
ックアウト／ノックダウン株Ｋ−４バックグラウンドにおけるＫＡＳＩＩの過剰発現によ
り、５０％を超えるＣ１８：０を蓄積する、且つＣ１６：０のレベルが実質的に低下した
複数の株が生じた。本発明者らはまた、飽和脂肪酸の不飽和脂肪酸に対する全体的な比が
ＫＡＳＩＩ過剰発現系は株Ｘと比較して小さいことも観察した。
表４２では、野生型レベルと比べて高いステアリン酸（Ｃ１８：０）レベルを太字テキ
ストで強調している。株Ｘ又はＪより低いパルミチン酸（Ｃ１６：０）レベルを太字で強
調している。３つの株について、飽和脂肪酸の不飽和脂肪酸に対する比は≦２：１である
；これらを太字、イタリック体のテキストで強調している。
表４２に示す一次形質転換体から安定系を単離した。振盪フラスコ培養物の脂肪酸プロ
フィール及び脂質価を、以下の表４３に提供する。これらの株は最大５５％のＣ１８：０
を蓄積し、Ｃ１６：０は７％もの低さであり、株Ｘ親と同等の脂質価であった。飽和物：
不飽和物比は、株Ｘと比較して実質的に低下した。株ＡＵ及びＡＶを、３Ｌ高密度発酵に
おける評価用に選択した。
表４３では、株Ｘは親株であり；株Ｊは野生型基本株である。野生型株より少なくとも
２倍高いステアリン酸（Ｃ１８：０）レベルを太字で強調している。株Ｊ及び株Ｋ−４よ
り低いパルミチン酸レベルを太字で強調している。太字のイタリックは、飽和物：不飽和
物比が≦２：１であることを示している。
株ＡＵ及びＡＶの脂肪酸プロフィール及びパフォーマンス測定を、以下の表４４に詳述
する。同じ発酵条件下で成長した親株Ｘの脂肪酸プロフィールを、比較のため提供する。
ＫＡＳＩＩを過剰発現する株は、株Ｋ−４親より約１１％多いＣ１８：０を蓄積する。Ｃ
１６：０は７〜９％に低下し、不飽和脂肪酸レベルは４〜５％増加する。株ＡＵ及びＡＶ
の脂質価はＫ−４と同等であったことから、ＫＡＳＩＩの過剰発現が脂質産生に対して有
害な効果を有しなかったことが示される。
流加培養法を用いて発酵物を６日間培養した。発酵物１２０５８０Ｆ１の株Ｘ脂肪酸プ
ロフィールを表４１に提供しており、株ＡＵ及びＡＶとの比較のため表４４に再掲する。
全ての発酵を、３２℃、ｐＨ５、３０％溶存酸素（ＤＯ）、３００ｍＭ窒素［Ｎ］、及び
５５７．５μＭ鉄で実施した。糖の供給源は７０％ショ糖（Ｓ７０）であった。野生型株
より高いステアリン酸（Ｃ１８：０）レベルを太字で示す。野生型より低いパルミチン酸
（Ｃ１６：０）レベルを太字で強調している。
上記に記載する振盪フラスコ及び発酵によって得られたバイオマスから、実験室規模の
油を調製した。ＬＣ／ＭＳによりこれらの油のＴＡＧ組成を決定した。ＳＯＳは株ＡＵ及
びＡＶの両方の主要なＴＡＧ種であり、振盪フラスコからのバイオマスの３３〜３５％の
範囲であり、高密度発酵バイオマスの３７％に達する。主なパルミチン酸含有ＴＡＧは実
質的に低下し、トリ飽和物レベルは株Ｘ油で観察されるものの半分未満である。これらの
結果は、高ステアリン酸バックグラウンドにおけるＫＡＳＩＩの過剰発現がＳＯＳ蓄積を
大幅に改善し、トリ飽和ＴＡＧの蓄積を低下させることを示している。
株ＪにおけるＦＡＴＡ−１破壊、ＫＡＳＩＩ過剰発現及びＦＡＤ２ ＲＮＡｉに使用し
た構築物：株ＪにおいてＦＡＴＡ−１対立遺伝子を破壊すると同時にＰ．ｍｏｒｉｆｏｒ
ｍｉｓ ＫＡＳＩＩを過剰発現させ、且つＦＡＤ２ヘアピン構築物を発現させるため、Ｄ
ＮＡ構築物ｐＳＺ２４１９を作製した。ショ糖インベルターゼをコードするＳ．ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ ＳＵＣ２遺伝子の、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける発現用にコドンを
最適化したバージョンを、形質転換の選択可能なマーカーとして利用した。形質転換ＤＮ
Ａの配列は、このすぐ後に提供する。関連する制限部位は小文字の太字で示し、５’−３
’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＡｓｃＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｖｒＩＩ、Ｅ
ｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＡｆｌＩＩ、Ｈｉ
ｎＤＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｅＩ、及びＸｈｏＩである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮ
Ａの５’末端及び３’末端の境界を定める。構築物の５’及び３’フランクの下線の配列
は、ＦＡＴＡ−１遺伝子座における相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込
みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向
に進んで、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＵＣ２遺伝子（ショ糖加水分解活性をコードし
、それによりショ糖上での株の成長を可能にする）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒ
ｄｔｉｉ ＴＵＢ２プロモーターを、小文字の囲い文字のテキストにより示す。ＳＵＣ２
のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックにより示し、一
方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（Ｎ
Ｒ）遺伝子の３’ＵＴＲをスモールキャピタルにより示し、その後に、小文字テキストに
より示されるスペーサー領域が続く。小文字の囲い文字のテキストにより示されるＰ．ｍ
ｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＡＭＴ３プロモーターは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ
遺伝子の発現を駆動する。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＳＡＤ
１由来のプラスチド標的ペプチドをコードする領域を、大文字のイタリックにより示す。
成熟Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩポリペプチドをコードする配列を、太字、大
文字のイタリックで示し、一方３ｘＦＬＡＧエピトープコード配列は太字、下線、大文字
のイタリックである。第２のＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ ３’ＵＴＲを、スモールキャ
ピタルにより示す。小文字の囲い文字のテキストにより示される第２のＣ．ｒｅｉｎｈａ
ｒｄｔｉｉ ＴＵＢ２プロモーター配列は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ２ヘアピ
ンＡ配列の発現を駆動する。センス鎖及びアンチセンス鎖は大文字、太字のイタリックで
示し、ＦＡＤ２イントロン及び第２のエクソンの最初の１０塩基（大文字のイタリック）
によって分けられる。第３のＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ ３’ＵＴＲをスモールキャピ
タルにより示し、その後に、小文字テキストにより示される第２のスペーサー領域が続く
。
ｐＳＺ２４１９由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：






ＦＡＴＡ−１ノックアウト、ＫＡＳＩＩ過剰発現及びＦＡＤ２ ＲＮＡｉ株の同定及び
分析：ｐＳＺ２４１９に由来する構築物Ｄ１３５８を、先述のとおり株Ｊに形質転換した
。一次形質転換体をクローン精製し、標準的な脂質産生条件下、ｐＨ５で成長させた。株
ＪをＤ１３５８で形質転換することによって生じた代表的なクローンから得られた脂肪酸
プロフィールを、以下の表４５に要約する。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＡＭＴ３プロモ
ーターはｐＨ５で抑制されるため、観察された表現型はＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡ
ＳＩＩの過剰発現を反映しなかった。それにも関わらず、本発明者らは、複数の株が実質
的に低いＣ１６：０レベル及びＣ１８：１の１０〜１５％の増加を有したことを観察して
おり、この構築物がＦＡＴＡ−１標的遺伝子を破壊し、内因性ＫＡＳＩＩによる伸長に利
用可能なパルミトイル−ＡＣＰの量が増加したことが示唆される。１つの系Ｄ１３５８−
１３を、さらなる分析用に選択した。Ｄ１３５８−１３は約１７％のＣ１６：０、約７５
％のＣ１８：１及び２％未満のＣ１８：２を蓄積し、本発明者らがこの株でＦＡＴＡ−１
における組み込み及びＦＡＤ２ Δ１２−デサチュラーゼの活性の下方調節に成功したこ
とが示される。
表４５では、野生型レベルと比べて高いオレイン酸（Ｃ１８：１）レベルを太字テキス
トで強調している。野生型より低いパルミチン酸（Ｃ１６：０）レベルを太字テキストで
強調している。株Ｊ親と比較して１％以上低下したリノール酸（Ｃ１８：２）のレベルを
太字テキストで強調している。
形質転換体Ｄ１３５８−１３から得られた株の脂肪酸プロフィールは、選択（ショ糖上
での成長）の非存在下で６０代を超えて成長した後にも安定であることが決定された。次
に振盪フラスコアッセイにおける選択された株のパフォーマンスを評価した。脂肪酸プロ
フィール及び脂質価を以下の表４６に提供する。フラスコ実験をｐＨ７で実施し、ＫＡＳ
ＩＩ導入遺伝子の発現を駆動するＰｍＡＭＴ３プロモーターの活性化を可能にした。ＫＡ
ＳＩＩ過剰発現とＦＡＴＡ−１ノックアウトとの組み合わせは、ｐＨ５で観察された表現
型（表４５）と比較してパルミチン酸レベルのさらなる低下及びオレイン酸蓄積の増進を
もたらす。８２％より多いＣ１８：１、１１％未満のＣ１６：０、２％未満のＣ１８：２
及び約８３％の野生型脂質価により、株ＡＡが、続くステアリン酸レベルを上昇させるた
めの改変用の宿主株としてこのセットから供するのに最適な株であると決定された。ＤＮ
Ａブロット分析から、Ｓ５００３がＦＡＴＡ−１遺伝子座に構築物Ｄ１３５８［ｐＳＺ２
４１９］の単純な挿入を有することが示された。
表４６では、野生型レベルと比べて高いステアリン酸（Ｃ１８：１）レベルを太字テキ
ストで強調している。野生型より低いパルミチン酸（Ｃ１６：０）レベルを太字テキスト
で強調している。野生型より低いリノール酸（Ｃ１８：２）レベルを太字テキストで示し
ている。
株ＡＡにおけるＳＡＤ２ノックアウト／ＲＮＡｉに使用した構築物：Ｓ５００３におい
てＳＡＤ２−１対立遺伝子を破壊すると同時にＳＡＤ２ヘアピン構築物を発現させるため
、２つのＤＮＡ構築物ｐＳＺ２２８３及びｐＳＺ２６９７を作製した。各構築物において
、アミノグリコシド抗生物質に対する耐性を付与するトランスポゾンＴｎ５由来のｎｅｏ
Ｒ遺伝子を、形質転換の選択可能なマーカーとして使用した。ｐＳＺ２２８３に由来する
形質転換ＤＮＡの配列を、この直後に提供する。関連する制限部位は小文字の太字で示し
、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、Ａｖ
ｒＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎＤＩＩＩ、及びＳａｃ
Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。構
築物の５’及び３’フランクの下線の配列は、ＳＡＤ２−１遺伝子座における相同組換え
による形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来
のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、ｎｅｏＲ（アミノグリコシドホスホ
トランスフェラーゼ活性をコードし、それによりＧ４１８上での株の成長を可能にする）
の発現を駆動するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ＴＵＢ２プロ
モーターを、小文字の囲い文字のテキストにより示す。ｎｅｏＲのイニシエーターＡＴＧ
及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字の
イタリックで示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ遺伝子の３’ＵＴＲをスモールキャピタ
ルにより示し、その後に、小文字テキストにより示されるスペーサー領域が続く。小文字
の囲い文字のテキストにより示される第２のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ＴＵＢ２プロ
モーター配列は、ＳＡＤ２ヘアピンＣ配列の発現を駆動する。センス鎖及びアンチセンス
鎖は大文字、太字のイタリックで示し、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ２イントロン
及び第２のエクソンの最初の１０塩基（大文字のイタリック）によって分けられる。第２
のＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＲ ３’ＵＴＲを、スモールキャピタルにより示す。
ｐＳＺ２２８３由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：


ｐＳＺ２６９７に由来する形質転換ＤＮＡの配列を、この直後に提供する。関連する制
限部位は小文字の太字で示し、５’−３’にそれぞれＮｓｉＩ、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ、
ＨｉｎＤＩＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ
、ＡｖｒＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩである。構築物の５’及び３’フラ
ンクの下線の配列は、ＳＡＤ２−１遺伝子座における相同組換えによる形質転換ＤＮＡの
標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。
５’から３’方向に進んで、ＳＡＤ２ヘアピンＣセンス鎖及びアンチセンス鎖は大文字、
太字のイタリックで示し、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ２イントロン及び第２のエ
クソンの最初の１０塩基（大文字のイタリック）によって分けられる。Ｃ．ｖｕｌｇａｒ
ｉｓ ＮＲ遺伝子の３’ＵＴＲをスモールキャピタルにより示す。ｎｅｏＲ（アミノグリ
コシドホスホトランスフェラーゼ活性をコードし、それによりＧ４１８上での株の成長を
可能にする）の発現を駆動するＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａグルタミン
酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）プロモーターを、小文字の囲い文字のテキストにより示す
。ｎｅｏＲのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックによ
り示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。第２のＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｎ
Ｒ ３’ＵＴＲをスモールキャピタルにより示し、その後に、小文字テキストにより示さ
れるスペーサー領域が続く。
ｐＳＺ２６９７由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：




Ｓ５００３バックグラウンドにおけるＳＡＤ２ノックアウト／ノックダウン株の同定及
び分析：ｐＳＺ２６９７に由来する構築物Ｄ１６３９、及びｐＳＺ２２８３に由来するＤ
１６８２を、先述のとおり株ＡＡに形質転換した。一次形質転換体をクローン精製し、標
準的な脂質産生条件下、ｐＨ７で成長させた。形質転換することによって生じた代表的な
クローンから得られた脂肪酸プロフィールを、以下の表４７に要約する。Ｄ１６３９形質
転換体は最大５６％のＣ１８：０を蓄積し、Ｄ１６８２形質転換体は最大約３５％のＣ１
８：０を蓄積した。ステアリン酸の増加のほとんどはＣ１８：１を犠牲に得られたもので
、これらの株においてＳＡＤ２ノックアウト／ＲＮＡｉ構築物によりＳＡＤ活性が大幅に
低下したことが示される。Ｃ１６：０レベルは６％から１４％まで異なった；Ｃ１８：２
は２〜５％の範囲であった。ほとんどの株は、株ＡＡ親の低いＣ１６：０及びＣ１８：２
表現型を維持した。これらの脂肪酸プロフィールから、破壊されたＦＡＴＡ−１、ＫＡＳ
ＩＩ過剰発現及びＦＡＤ２ ＲＮＡｉのバックグラウンドでノックアウト／ＲＮＡｉ構築
物を使用してＳＡＤ２発現を下方調節すると、高Ｃ１８：０、低Ｃ１６：０及び低Ｃ１８
：２の表現型の株が生じることが示される。これらの株は、高い安定性の高ステアリン酸
、高オレイン酸の油、及びＳＯＳ含有量が高い油の生成に有用となり得る。
表４７では、野生型レベルと比べて高いステアリン酸（Ｃ１８：０）レベルを太字テキ
ストで強調している。野生型より高いオレイン酸（Ｃ１８：１）レベルを太字テキストで
示す。野生型レベル未満のパルミチン酸（Ｃ１６：０）レベルを太字で強調している。野
生型と比較して低いレベルのリノール酸（Ｃ１８：２）を太字テキストで強調している。
数多くのＤ１６３９及びＤ１６８２形質転換体から安定系を単離した。振盪フラスコア
ッセイを実施して、Ｄ１６３９−５に由来する４つの系のパフォーマンスを評価した。バ
イオマスの脂肪酸プロフィール及び相対脂質価を、以下の表４８に示す。
表４８では、株ＡＡは親株であり；株Ｊは野生型基本株である。野生型株より高いステ
アリン酸（Ｃ１８：０）レベルを太字で示す。太字のテキストは、野生型と比較して増加
した株ＡＡ中のオレイン酸（Ｃ１８：１）レベルを示す。野生型未満のパルミチン酸（Ｃ
１６：０）レベルを太字で強調している。野生型未満のリノール酸（Ｃ１８：２）レベル
を太字で示す。
株ＡＷ、株ＡＸ及び株ＡＹ振盪フラスコから収集したバイオマスから実験室規模の油を
調製した。ＬＣ／ＭＳによりこれらの油のＴＡＧ組成を決定し、図２１に示す。これらの
株においてＳＯＳ蓄積は４２〜４７％の範囲であった。ＰＯＳは、１６〜１７％で、次に
最も豊富なＴＡＧであった。リノール酸を含有するＴＡＧは、上記に記載される株ＡＵ及
び株ＡＶ油と比較して５０％超減少した。株ＡＷ、株ＡＸ及び株ＡＹ油は、株ＡＵ及び株
ＡＸ油で蓄積された量と同程度の、１２〜１３％のトリ飽和ＴＡＧ（Ｓ−Ｓ−Ｓ）を含有
した。油産生中のＳＡＤ活性を調節して飽和脂肪酸の過剰産生を防ぐことが、トリ飽和物
の蓄積の低減に役立ち得る。
実施例４９：高オレイン酸微細藻類油のオレイン酸メチルの特性
高オレイン酸メチルのエステル化油は、機械類のクリーニング及び潤滑など、様々な用
途に有用である。これらの用途の一部については、高い熱安定性が所望される。上記に記
載したとおり従属栄養成長させた油産生微細藻類から調製した高オレイン酸及び高安定性
−高オレイン酸トリグリセリド油から調製したメチル化油に対し、熱安定性試験を実施し
た。油はメチル化前に漂白及び脱臭した。市販の大豆メチルエステルを対照として使用し
た。
ＦａｔＡ１＿Ｂｔｕｂ：ｉｎｖ：ｎｒ：：ａｍｔ０３−ＣｗＴＥ２：ｎｒ＿ＦａｔＡ１
として表すことのできるプラスミドで形質転換したＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏ
ｒｍｉｓの高油産生株から高オレイン酸（ＨＯ）油を調製した。このプラスミドは、ＦＡ
ＴＡ１染色体部位で相同組換えして、それによりＦＡＴＡアシル−ＡＣＰチオエステラー
ゼ染色体対立遺伝子を除去すると同時に、ｐＨ調節可能ａｍｔ３プロモーターの制御下で
Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ由来の外因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＣｗＴ
Ｅ２、配列番号１１）を発現するように設計した。ＣｗＴＥ２遺伝子を油産生中にｐＨ５
で培養することにより下方調節し、オレイン酸産生をさらに上昇させることができる。シ
ョ糖インベルターゼもまた選択マーカーとして発現させて、単一炭素源としてのショ糖上
での株の培養を可能にした。３’ＵＴＲ配列は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ
硝酸レダクターゼ遺伝子由来である。得られたＨＯ株はステインＱ（Ｓｔａｉｎ Ｑ）と
命名される。株Ｑによって産生される油の脂肪酸プロフィールを、以下の表４９に掲載す
る。
高安定性−高オレイン酸油（ＨＳＡＯ）もまた、ＦＡＤｃ５’＿Ｂｔｕｂ：ｉｎｖ：ｎ
ｒ：：ｂｔｕｂ−ＣｐＳＡＤ＿ＣｔＯＴＥ：ｎｒ＿ＦＡＤｃ３’と記載することのできる
プラスミドで形質転換したＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの高油産生株か
ら調製した。得られた株（株Ｒ）はショ糖インベルターゼを選択マーカーとして発現し、
単一炭素源としてのショ糖上での培養を可能にする。加えて、ＦＡＤ対立遺伝子（オレイ
ン酸からリノール酸への変換に関与する脂肪酸デサチュラーゼをコードする）が破壊され
、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓのＳＡＤ遺伝子由来のトランジッ
トペプチドと融合したオレイン酸特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（Ｃａｒｔｈａ
ｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ ＯＴＥ、実施例５を参照）がβチューブリンプロモータ
ーの制御下で発現する。３’ＵＴＲ配列は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸
レダクターゼ遺伝子由来である。従属栄養培養後に株Ｒによって産生された油の脂肪酸プ
ロフィールを、以下の表５０に掲載する。脂肪酸プロフィールは８５％超のオレイン酸を
有するが、主要な多価不飽和物、リノール酸及びリノレン酸はほぼ一つも有しない。
ＨＯ及びＨＳＡＯ油を、公知のバイオディーゼル生成技術によってメチル化し、メチル
−ＨＯ及びメチル−ＨＳＡＯエステルを作製した。次にこれらのメチルエステルを、以下
の手順に従い熱試験に供した：
１．図１に示すとおり器具を準備する。
２．試験容器に１リットルの水を加え、ホットプレート上で沸騰させる．
３．各試験生成物に５０ｐｐｍコバルト（１００．０グラムのサンプル中０．０８３ｇの
６％ナフテン酸コバルト（Ｃｏｂａｌｔ Ｎａｐｔｈｅｎａｔｅ））を加え、十分に混合
する。
４．時計皿に７．０ｇの１００％綿ガーゼ（＃５０チーズクロス）を秤量する。
５．ステップ３で調製したとおりの試験生成物１４．０ｇをガーゼ上に均一に広げる。
６．＃１５栓の中心に貫通させて熱電対（温度計）を置く。熱電対の周りに綿を巻き付け
る。
７．２４メッシュワイヤフレームシリンダの中に巻かれた綿を、それが上側４．５インチ
を占めるように置く。
８．ガーゼを巻き付けたシリンダを１Ｌトールビーカーの中に位置決めする。ビーカーを
沸騰水中に固定し、時間に伴う温度増加の記録を開始する。
９．温度の観察を２時間、又は１０度の温度降下が観察されるまで続ける。
１０．温度対時間をグラフにプロットする。
１１．１時間で１００℃又は２時間で２００℃を超える温度を示すサンプルはいずれも、
危険な酸化リスク又は自然発火する可能性があるリスクであると見なされなければならな
い。
結果：ＨＯ及びＨＳＡＯメチルエステルは、温度上昇から明らかなように、自己酸化を
呈しなかった。対照の大豆メチルエステルサンプルは自己酸化の可能性を呈しなかった。
時間−温度プロフィールを図１８に示す。
加えて、株Ｑによって産生される油のメチル化脂肪酸は、以下の特性を有することが分
かった：
・１８２℃の引火点（ＡＳＴＭ Ｄ９３）
・非ＶＯＣ
・５３．５のカウリブタノール値（ＡＳＴＭ Ｄ１１３３）
・４．５７ｍｍ２／ｓの４０℃における粘度（ＡＳＴＭ Ｄ４４５）
・０．１７ｍｇ ＫＯＨ／ｇの酸価（ＡＳＴＭ Ｄ６６４）
・沸点範囲分布（ＡＳＴＭ Ｄ２８８７）３２５〜３６２℃。
実施例５０：高オレイン酸（ＨＯ）及び高安定性−高オレイン酸（ＨＳＡＯ）微細藻類油
のさらなる特性
高オレイン酸油及び高安定性高オレイン酸藻類油は、図１９に示す特性又は計測パラメ
ータについてこれらの値の±２０％を有し得る。
一つの実験では、ＨＳＡＯ微細藻類油は、０．５％フェニル−α−ナフチルアミン（Ｐ
ＡＮＡ）及び５００ｐｐｍパルミチン酸アスコルビル（ＡＰ）の抗酸化剤を伴い１１０°
ＣにおけるＯＳＩにより計測（１３０℃データを使用して推定）したとき、５１２時間の
安定性を示した。
実施例５１：パルミチン酸からパルミトレイン酸への変換による低飽和物油の産生
上記の例に記載されるとおり、微細藻類の遺伝子操作は、特にオレイン酸の産生を増加
させることにより、飽和脂肪レベルを低下させることができる。しかしながら、ある場合
には、油産生細胞で発現したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、望ましい量より多くの
パルミチン酸を遊離する。ここで、本発明者らは、パルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ
（ＰＡＤ）遺伝子を過剰発現させることによりパルミチン酸（１６：０）をパルミトレイ
ン酸（１６：１）に変換する方法について記載する。ＰＡＤ遺伝子は、Ｍａｃｆａｄｙｅ
ｎａ ｕｎｇｕｉｓ（キャッツクロー）、Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉ
ａ（マカダミアナッツ）、Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ（シーバックソー
ン）などの天然の供給源から得るか、又は１６：１活性を有するようステアロイル−ＡＣ
Ｐデサチュラーゼを突然変異させてＰＡＤを作成することにより得ることができる。Ｍａ
ｃｆａｄｙｅｎａ ｕｎｇｕｉｓデサチュラーゼ（ＭｕＰＡＤ）と命名される。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの高油産生株（株Ｚ）をＰＡＤ遺伝子を
含むプラスミドＤＮＡ構築物で遺伝子銃により形質転換した。例えば、実施例６、３６、
又は４９に記載される高オレイン酸株の一つは、外来性ＰＡＤ遺伝子をさらに含み得る。
構築物は、選択可能なマーカーとしてのショ糖インベルターゼ、及び基質特異性をパルミ
チン酸の方にシフトさせるＬ１１８Ｗ突然変異を有するＭｕＰＡＤ又はＳＡＤ遺伝子のい
ずれか（例えば、Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、Ｇ
ｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＢ６７８４０．１）を含む。Ｃａｈｏｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｌａｎｔ Ｐｈｙｓｏｉｌ（１９９８）１１７：５９３−５９８を参照のこと。ａｍｔ３
及びβチューブリン（Ｂｔｕｂ）プロモーターの両方が用いられる。加えて、植物ＰＡＤ
遺伝子の天然トランジットペプチドを、微細藻類において有効であることが知られるもの
（例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌａｒｉｓ ＳＡＤ遺伝子由来のトランジットペプ
チド）と取り換えることができる。
ＰＡＤ遺伝子は、ＦＡＴＡノックアウト若しくはノックダウン及び／又はＫＡＳＩＩノ
ックインにより高オレイン酸油を産生するものを含め、様々な株で発現させることができ
る。場合により、これらの株はまた、ＦＡＤ（デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ）ノック
アウト、ノックダウンによるか、又はＦＡＤ発現を調節可能なプロモーターの制御下に置
き、ＦＡＤを下方調節する条件下で油を生成することにより、高安定性（低多価不飽和物
）油を生成することもできる。加えて、ＰＡＤ遺伝子活性の導入に有用な基本株はまた、
ＫＡＳＩＩノックアウト、及びＦＡＴＡノックインを有する株であって、それによりＣ１
６：０パルミチン酸のレベルを上昇させる株も含み得る。
結果として、パルミチン酸がｃｉｓ−パルミトレイン酸及びｃｉｓ−バクセン酸に変換
されるため、微細藻類油の脂肪酸プロフィールには、より低いレベルのパルミチン酸が見
られる。ある場合には、飽和脂肪酸の全面積パーセントは３．５％、３％又は２．５％以
下である。
Ｍａｃｆａｄｙｅｎａ ｕｎｇｕｉｓ Ｃ１６：０デサチュラーゼ（ＭｕＰＡＤ）の過
剰発現用の構築物を以下に続ける：
１）ｐＳＺ３１４２： ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ
３：ＣｐＳＡＤｔｐ：ＭｕＰＡＤ：ＣｖＮＲ：：６Ｓ
構築物ｐＳＺ３１４２ ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭ
Ｔ３：ＣｐＳＡＤｔｐ：ＭｕＰＡＤ：ＣｖＮＲ：：６Ｓにおける関連する制限部位は、小
文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ
Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、
Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’
末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６ｓ遺伝子座での相同組換えによる標的化
した組み込みを可能にするゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖
インベルターゼ遺伝子（ショ糖を代謝する株Ｚの能力を付与する）の発現を駆動するＣ．
ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより
示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太
字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅ
ｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示
し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍ
ｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性ａｍｔ０３プロモーターが続く。ＭｕＰＡＤのイニシエータ
ーＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一
方、残りのコード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏ
ｔｈｅｃｏｉｄｅｓ Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチ
ドは、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ Ｉ部位との間に位置する。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ
硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太
字の小文字テキストにより示される６Ｓゲノム領域が続く。
ｐＳＺ３１４２に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：




２）ｐＳＺ３１４５： ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ
３：ＭｕＰＡＤ：ＣｖＮＲ：：６Ｓ
構築物ｐＳＺ３１４５ ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭ
Ｔ３：ＭｕＰＡＤ：ＣｖＮＲ：：６Ｓにおける関連する制限部位は、小文字、太字及び下
線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、
ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉであ
る。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小
文字の配列は、６ｓ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にするゲノ
ムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子（ショ糖
を代謝する株Ｚの能力を付与する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−
チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシ
エーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一
方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸
レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタ
リックテキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性ａ
ｍｔ０３プロモーターが続く。ＭｕＰＡＤのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴ
ＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのコード領域は太字の
イタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小
文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される６Ｓゲ
ノム領域が続く。
ｐＳＺ３１４５に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：




３）ｐＳＺ３１３７： ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵＢ
２：ＣｐＳＡＤｔｐ：ＭｕＰＡＤ：ＣｖＮＲ：：６Ｓ
構築物ｐＳＺ３１３７ ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵ
Ｂ２：ＣｐＳＡＤｔｐ：ＭｕＰＡＤ：ＣｖＮＲ：：６Ｓにおける関連する制限部位は、小
文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ
Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、
Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’
末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６ｓ遺伝子座での相同組換えによる標的化
した組み込みを可能にするゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖
インベルターゼ遺伝子（ショ糖を代謝する株Ｚの能力を付与する）の発現を駆動するＣ．
ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより
示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太
字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅ
ｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示
し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉ
ｉ β−チューブリンプロモーターが続く。ＭｕＰＡＤのイニシエーターＡＴＧ及びター
ミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのコード
領域は太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅ
ｓ Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドは、イニシエー
ターＡＴＧとＡｓｃ Ｉ部位との間に位置する。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ
３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキス
トにより示される６Ｓゲノム領域が続く。
ｐＳＺ３１３７に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：




実施例５２：Ｃｕｐｈｅａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓチオエステラーゼの過剰発現により生成
されるミリスチン酸リッチ油
ここで、本発明者らは、ＵＴＥＸ１４３５におけるＣｕｐｈｅａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ
チオエステラーゼ（Ｃｐａｌ ＦＡＴＢ２、寄託ＡＡＣ４９１８０）の過剰発現がＣ１４
：０産生の大幅な増加（脂肪酸プロフィールの６０％超）をもたらすことを示す。
Ｃｐａｌ ＦＡＴＢ２遺伝子の過剰発現に使用した構築物は、本明細書に記載されると
おりＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける発現用にコドンを最適化した。Ｃｕｐｈｅａ ｐ
ａｌｕｓｔｒｉｓ ＦＡＴＢ２はＣ１４選択的チオエステラーゼである。両方ともにＣｐ
ａｌ ＦＡＴＢ２遺伝子をコードする２つの構築物を調製した。第１の構築物ｐＳＺ２４
７９は、６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ
１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＥｘｔＡ−ＣｖＮＲ：：６ＳＢとして表すことができ
る。ＦａｔＢ２コード配列は配列番号８６として提供され、アミノ酸配列は配列番号８７
として提供される。第２の構築物ｐＳＺ２４８０は、６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵ
Ｃ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ＿ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＦＬＡＧ
＿ＥｘｔＡ−ＣｖＮＲ：：６ＳＢとして表すことができる。核酸配列及びアミノ酸配列は
配列番号８８及び配列番号８９として提供される。
ｐＳＺ２４８０で形質転換されたＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓは、高濃度のミリスチン酸
を生成した。ミリスチン酸含有量は６５．７０パーセントであった。これは約１％のミリ
スチン酸含有量を有する基本株によって産生される野生型油のミリスチン酸含有量と比較
すると、非常に大幅な増加である。
高ミリスチン酸株の脂肪酸プロフィールを、以下の表５１に示す。
実施例５３：エイコセン酸及びエルカ酸脂肪酸の生成
この例では、本発明者らは、Ｃｒａｍｂｌｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ（ＣａＦＡＥ、寄
託番号ＡＹ７９３５４９）、Ｌｕｎａｒｉａ ａｎｎｕａ（ＬａＦＡＥ、ＡＣＪ６１７７
７）、及びＣａｒｄａｍｉｎｅ ｇｒａｅｃａ（ＣｇＦＡＥ、ＡＣＪ６１７７８）由来の
、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）としても知られる異種脂肪酸エロンガー
ゼ（ＦＡＥ）遺伝子の発現が、ＵＴＥＸ １４３５の古典的突然変異誘発誘導体、株Ｚに
おいてエイコセン酸（２０：１Δ１１）及びエルカ酸（２２：１Δ１３）などの極めて長
鎖の一価不飽和脂肪酸の産生をもたらすことを示す。他方でＴｒｏｐａｅｏｌｕｍ ｍａ
ｊｕｓ由来の推定ＦＡＥ遺伝子（ＴｍＦＡＥ、ＡＢＤ７７０９７）及びＢｒａｓｓｉｃａ
ｎａｐｕｓ由来の２つのＦＡＥ遺伝子（ＢｎＦＡＥ１、ＡＡＡ９６０５４及びＢｎＦＡ
Ｅ２、ＡＡＴ６５２０６）は、株Ｚにおいてエイコセン酸（２０：１Δ１１）の中程度の
増加をもたらした一方、検出可能なエルカ酸を産生しなかった。興味深いことに、株Ｚに
おけるＢｎＦＡＥ１の異種発現で得られる不飽和脂肪酸プロフィールは、ドコサジエン酸
（２２：２ｎ６）の顕著な増加をもたらした。全ての遺伝子は、ＵＴＥＸ １４３５コド
ン使用頻度を反映するようにコドンを最適化した。これらの結果は、ＣａＦＡＥ、ＬａＦ
ＡＥ又はＣｇＦＡＥ遺伝子が、エイコセン酸及びエルカ酸含有量を向上させる特異な能力
によって、一価不飽和及び飽和アシル基質を利用する超長鎖の生合成に関与する縮合酵素
をコードすることを示唆している。
Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５株の株Ｚ）におけるＣｒａｍｂｌｅ
ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ脂肪酸エロンガーゼ（ＣａＦＡＥ）の発現に使用される構築物−［
ｐＳＺ３０７０］：この例では、構築物ｐＳＺ３０７０で形質転換された株、株Ｚを作成
し、これはショ糖インベルターゼ（ショ糖を含有する培地上でのその選択及び成長を可能
にする）及びＣ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ ＦＡＥ遺伝子を発現する。株Ｚにおける発現の
ため導入された構築物ｐＳＺ３０７０は、６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−Ｃｖｎ
ｒ：ＰｍＡｍｔ０３−ＣａＦＡＥ−Ｃｖｎｒ：：６Ｓとして表すことができる。
形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する。構築物における関連する制限部位を小文字
の太字で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、Ｂａ
ｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩである。ＢｓｐＱＩ
部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、
相同組換えによる６Ｓ遺伝子座での標的化した組み込みを可能にする株Ｚ由来のゲノムＤ
ＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ ＳＵＣ２遺伝子（ショ糖加水分解活性をコードし、それによりショ糖上での株の
成長を可能にする）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプ
ロモーターを、小文字の囲い文字のテキストにより示す。ＳＵＣ２のイニシエーターＡＴ
Ｇ及びターミネーターＴＧＡを大文字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字
のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）
遺伝子３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字のイタリックによ
り示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内在性ＡＭＴ３プロモーターが続く。ＣａＦＡＥ
のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリック
により示し、一方、残りの遺伝子は太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ
硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太
字の小文字テキストにより示される株Ｚ ６Ｓゲノム領域が続く。正しいリーディングフ
レーム及び標的配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。
プラスミドｐＳＺ３０７０に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：




株Ｚにおける高等植物由来のＦＡＥ遺伝子の発現に使用される構築物：ＣａＦＡＥ遺伝
子（ｐＳＺ３０７０）に加え、Ｌｕｎａｒｉａ ａｎｎｕａ由来のＬａＦＡＥ（ｐＳＺ３
０７１）、Ｃａｒｄａｍｉｎｅ ｇｒａｅｃａ由来のＣｇＦＡＥ（ｐＳＺ３０７２）、Ｔ
ｒｏｐａｅｏｌｕｍ ｍａｊｕｓ ＴｍＦＡＥ（ｐＳＺ３０６７）及びＢｒａｓｓｉｃａ
ｎａｐｕｓ由来のＢｎＦＡＥ１（ｐＳＺ３０６８）及びＢｎＦＡＥ２（ｐＳＺ３０６９
）遺伝子を、株Ｚにおける発現のため構築した。これらの構築物は以下のとおり表すこと
ができる：
ｐＳＺ３０７１− ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−Ｃｖｎｒ：ＰｍＡｍｔ０３−
ＬａＦＡＥ−Ｃｖｎｒ：：６Ｓ
ｐＳＺ３０７２− ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−Ｃｖｎｒ：ＰｍＡｍｔ０３−
ＣｇＦＡＥ−Ｃｖｎｒ：：６Ｓ
ｐＳＺ３０６７− ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−Ｃｖｎｒ：ＰｍＡｍｔ０３−
ＴｍＦＡＥ−Ｃｖｎｒ：：６Ｓ
ｐＳＺ３０６８− ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−Ｃｖｎｒ：ＰｍＡｍｔ０３−
ＢｎＦＡＥ１−Ｃｖｎｒ：：６Ｓ
ｐＳＺ３０６９− ６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−Ｃｖｎｒ：ＰｍＡｍｔ０３−
ＢｎＦＡＥ２−Ｃｖｎｒ：：６Ｓ
これらの構築物は全て、ｐＳＺ３０７０と同じベクター骨格、すなわち選択可能なマー
カー、プロモーター、及び３’ｕｔｒを有し、それぞれのＦＡＥ遺伝子のみが異なる。こ
れらの構築物における関連する制限部位もまた、ｐＳＺ３０７０と同じである。ＬａＦＡ
Ｅ、ＣｇＦＡＥ、ＴｍＦＡＥ、ＢｎＦＡＥ１及びＢｎＦＡＥ２の配列を以下に示す。Ｓｐ
ｅＩ及びＡｆｌＩＩを含む太字テキストのとおりの関連する制限部位を、それぞれ５’−
３’で示す。
ｐＳＺ３０７１に含まれるＬａＦＡＥのヌクレオチド配列：
ｐＳＺ３０７２に含まれるＣｇＦＡＥのヌクレオチド配列：
ｐＳＺ３０６７に含まれるＴｍＦＡＥのヌクレオチド配列：
ｐＳＺ３０６８に含まれるＢｎＦＡＥ１のヌクレオチド配列：
ｐＳＺ３０６９に含まれるＢｎＦＡＥ２のヌクレオチド配列：
脂肪酸プロフィールに対するその影響を決定するため、ＰｍＡＭＴ３プロモーターによ
り駆動される、様々な異種ＦＡＥ遺伝子を含む上記の構築物を、独立して株Ｚに形質転換
した。
一次形質転換体をクローン精製し、低窒素脂質産生条件下、ｐＨ７．０で成長させた（
いずれのプラスミドも、ｐＨ調節性ＰｍＡＭＴ０３プロモーターにより駆動されるとき、
ＦＡＥ遺伝子発現の最大発現を可能にするためにはｐＨ７．０での成長を必要とする）。
ｐＳＺ３０７０、ｐＳＺ３０７１、ｐＳＺ３０７２、ｐＳＺ３０６７、ｐＳＺ３０６８及
びｐＳＺ３０６９によって株Ｚに形質転換することにより生じる一組の代表的なクローン
から得られたプロフィールを、それぞれ以下の表５２〜表５７に示す。
異種ＦＡＥ遺伝子を発現するトランスジェニック株Ｚの株全てが、Ｃ２０：１及びＣ２
２：１脂肪酸の蓄積増加を示す（表５２〜表５７を参照のこと）。野生型と比べたエイコ
セン酸（２０：１Δ１１）及びエルカ酸（２２：１Δ１３）のレベル増加は、一貫して野
生型のレベルより高い。加えて、株ＺにおけるＢｎＦＡＥ１の異種発現で得られた不飽和
脂肪酸プロフィールは、ドコサジエン酸（Ｃ２２：２ｎ６）の顕著な増加をもたらした。
株Ｚで発現した前述のＦＡＥのタンパク質アラインメントを図２３に示す。
実施例５４：異種デサチュラーゼ遺伝子を発現することによる全不飽和脂肪酸レベルの上
昇
「ゼロ飽和脂肪（ｚｅｒｏ ＳＡＴ ＦＡＴ）」（例えば、９７％以上の全不飽和脂肪
酸目標／３％以下の飽和脂肪）株の生成手法の一つは、株Ｎ（本発明者らは、これが複数
回の発酵ランにおいて全不飽和物約９３％で約８５％のＣ１８：１を産生することを見出
している）などの高オレイン酸株でデサチュラーゼ遺伝子を発現させることである。本発
明者らは、株Ｎでデサチュラーゼ遺伝子を発現させることにより、全飽和物がさらに減少
するかどうかについて調べた。
以下の例では、本発明者らは、Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍ
ｍｕｎｉｓ、及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ由来のデサチュラ
ーゼを含めた異種ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子の過剰発現により、野生型
株ＵＴＥＸ１４３５においてステアリン酸及びパルミチン酸レベルを減少させる能力を示
す。
Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼの発現に使用される
構築物：Ｏ．ｅｕｒｏｐａｅａステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（寄託番号ＡＡＢ６
７８４０．１）をＵＴＥＸ１４３５、株Ａに導入するため、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ遺伝子を選択可能なマーカーとして利用して、シ
ョ糖培地上で成長する能力を付与した。ＵＴＥＸ１４３５、株Ａで発現した構築物は、６
ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵＢ２：ＣｐＳＡＤｔｐ：Ｏ
ｅＳＡＤ：ＣｖＮＲ：：６ＳＢとして表すことができ、ｐＳＺ１３７７と命名される。
構築物ｐＳＺ１３７７における関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５
’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ
、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉであ
る。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小
文字の配列は、６ｓ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にするゲノ
ムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子の発現を
駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテ
キストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを
、大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキ
ストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示される、ＯｅＳＡＤ
の発現を駆動する第２のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターが
続く。ＯｅＳＡＤのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、
太字のイタリックにより示し、一方、残りのステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼコード
領域は太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅ
ｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドは、イニシエーターＡＴＧ
とＡｓｃ Ｉ部位との間に位置する。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ
はここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示
される６Ｓゲノム領域が続く。
ｐＳＺ １３７７に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：




Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼの発現に使用
される構築物：Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ
（寄託番号ＡＡＡ７４６９２．１）をＵＴＥＸ１４３５、株Ａに導入するため、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ遺伝子を選択可能なマーカー
として利用して、ショ糖培地上で成長する能力を付与した。ＵＴＥＸ１４３５、株Ａで発
現した構築物は、６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ０３
：ＣｐＳＡＤｔｐ：ＲｃＳＡＤ：ＣｖＮＲ：：６ＳＢとして表すことができ、ｐＳＺ１４
５４と命名される。
構築物ｐＳＺ１４５４における関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５
’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ
、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉであ
る。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小
文字の配列は、６ｓ核染色体座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にするゲ
ノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子の発現
を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターを、囲い文字の
テキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡ
を、大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す
。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テ
キストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示される、ＲｃＳＡ
Ｄの発現を駆動する内在性ＡＭＴ０３プロモーターが続く。ＲｃＳＡＤのイニシエーター
ＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方
、残りのステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼコード領域は太字のイタリックにより示す
。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラ
ーゼトランジットペプチドは、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ Ｉ部位との間に位置する
。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストに
より示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される６Ｓゲノム領域が続く。
ｐＳＺ１４５４に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：






Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラ
ーゼの発現に使用される構築物：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓス
テアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼをＵＴＥＸ１４３５、株Ｚに導入するため、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ遺伝子を選択可能なマーカー
として利用して、ショ糖培地上で成長する能力を付与した。ＵＴＥＸ１４３５、株Ｚで発
現した構築物は、６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ０３
：ＣｐＳＡＤ１：ＣｖＮＲ：：６ＳＢとして表すことができ、ｐＳＺ３１４４と命名され
る。
構築物ｐＳＺ３１４４における関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５
’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ
、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱ
Ｉ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は
、６ｓ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にするゲノムＤＮＡを表
す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子の発現を駆動するＣ．
ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより
示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太
字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅ
ｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示
し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示される、ＣｐＳＡＤ１の発現を駆
動する内在性ＡＭＴ０３プロモーターが続く。ＣｐＳＡＤ１のイニシエーターＡＴＧ及び
ターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのス
テアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼコード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕ
ｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、
その後に、太字の小文字テキストにより示される６Ｓゲノム領域が続く。
ｐＳＺ３１４４に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：




一次形質転換体をクローン精製し、低窒素脂質産生条件下、デサチュラーゼ遺伝子の発
現を駆動するプロモーターに応じてｐＨ５．０又はｐＨ７．０のいずれかで成長させた。
プロモーターの性質、及びＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓがｐＨ５．０でより多くの脂質を生
成するという事実から、ｐＳＺ１３７７（Ｄ５８３）で形質転換することにより生じたト
ランスジェニック系はｐＨ５．０の（低窒素）脂質産生培地でアッセイした。ｐＳＺ１４
５４（Ｄ６４８）及びｐＳＺ３１４４（Ｄ１９２３）の形質転換により生成されたトラン
スジェニック系は、ｐＨ調節性ＰｍＡＭＴ３プロモーターにより駆動するとき最大デサチ
ュラーゼ遺伝子発現が可能となるようにｐＨ７．０でアッセイする。Ｄ５８３、Ｄ６４８
、及びＤ１９２３による形質転換によって生じた代表的なクローンから得られたプロフィ
ールを、それぞれ以下の表５８、５９及び６０に示す。ＯｅＳＡＤ及びＣｐＳＡＤ１遺伝
子の発現の結果は、Ｃ１８：０鎖長の明確な減少と、それに伴うＣ１８：１の増加である
。また、本発明者らはＣ１６：１レベルに僅かな増加があることを認めたことから、これ
らのステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼが幅広い特異性を有し得ることが示される。Ｒ
ｃＳＡＤ遺伝子の発現により生じた形質転換体もまたＣ１８：０レベルを低下させ、Ｃ１
６：１レベルを上昇させる。特に、Ｃ１６：１は、１％未満から１．５％超又は２％超に
増加し得る。しかしながら、Ｃ１８：１脂肪酸レベルの降下及びＣ１８：２レベル上昇も
またあり、これはこれらのトランスジェニック系の成長不良により引き起こされ得る。
実施例５５：突然変異（Ｌ１１８Ｗ）ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼを導入するこ
とによるパルミトレイン酸の生成
低総飽和物（ゼロＳＡＴ脂肪）株を作成するため、本発明者らは、推定ステアロイル−
ＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）及びパルミトイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＰＡＤ）遺
伝子の両方をＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓに導入している。本発明者ら
は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＳＡＤ２−１及びＯｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ ＳＡＤ
における単一アミノ酸置換（Ｌ１１８Ｗ）が、細胞によって産生されるトリグリセリド中
のパルミチン酸部分の不飽和化の増加をもたらしたことを見出した。得られたトランスジ
ェニック系においては、５％を超えるパルミトレイン酸の脂肪酸プロフィールを有する油
が産生された。従って、これらの突然変異ＳＡＤは、総飽和物を低下させる方法としてパ
ルミトレイン酸を上昇させること、又はパルミトレイン酸含有油を得ることにおいて極め
て有用であり得た。２、３、４、及び５面積％を超えるパルミトレイン酸を有する油が得
られた。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ遺伝子（寄託番号
ＮＰ ０１２１０４）を選択可能なマーカーとして利用して、以前記載された遺伝子銃に
よる形質転換方法を用いる相同組換えによってＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍ
ｉｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼＰｍＳＡＤ２−１（Ｌ１１８Ｗ）及びＯｌｅａ
ｅｕｒｏｐａｅａステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼＯｅＳＡＤ（Ｌ１１８Ｗ）をＰ
．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株Ｚの６Ｓ核染色体座に導入した。
本発明者らが株Ｚの形質転換に使用した構築物は、以下のとおり表すことができる。
１） ６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＵＡＰＡ１： ＰｍＳ
ＡＤ２−１（Ｌ１１８Ｗ）−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ （ｐＳＺ３３０５， Ｄ２０６６）
２） ６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵＢ２： ＰｍＳＡ
Ｄ２−１（Ｌ１１８Ｗ）−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ （ｐＳＺ３２９９， Ｄ２０６０）
３） ６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵＢ２：ＣｐＳＡＤ
ｔｐ−ＯｅＳＡＤ （Ｌ１１８Ｗ）−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ （ｐＳＺ３２９８， Ｄ２０
５９）
−−構築物ｐＳＺ３３０５： ６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：
ＰｍＵＡＰＡ１：ＰｍＳＡＤ２−１（Ｌ１１８Ｗ）−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ ｐＳＺ３３
０５形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する。ｐＳＺ３３０５ ６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ
２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＵＡＰＡ１：ＰｍＳＡＤ２−１（Ｌ１１８Ｗ）−Ｃ
ｖＮＲ：：６ＳＢにおける関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３
’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＥｃｏＲＶ、Ｓｐｅ
Ｉ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換
ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６Ｓ遺伝子座で
の相同組換えによる標的化した組み込みを可能にする６ＳＡゲノムＤＮＡを表す。５’か
ら３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈ
ａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。イン
ベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリッ
クにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖ
ｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示し、その後
に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＡＰＡ
１プロモーターが続く。ＰｍＳＡＤ２−１（Ｌ１１８Ｗ）のイニシエーターＡＴＧ及びタ
ーミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのコー
ド領域は太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴ
Ｒはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより
示される６ＳＢゲノム領域が続く。
ｐＳＺ３３０５に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：




−−構築物ｐＳＺ３２９９： ６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：
ＣｒＴＵＢ２：ＰｍＳＡＤ２−１（Ｌ１１８Ｗ）−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ ｐＳＺ３２９
９形質転換ＤＮＡの配列は配列５６−２に提供される。ｐＳＺ３２９９ ６ＳＡ：：Ｃｒ
ＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵＢ２：ＰｍＳＡＤ２−１（Ｌ１１８Ｗ）
−ＣｖＮＲ：：６ＳＢにおける関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’
−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、ＸｂａＩ、Ｍｆｅ Ｉ、ＥｃｏＲＶ、Ｓｐ
ｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転
換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６Ｓ遺伝子座
での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にする６ＳＡゲノムＤＮＡを表す。５’
から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎ
ｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。イ
ンベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリ
ックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ
ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示し、その
後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−
チューブリンプロモーターが続く。ＰｍＳＡＤ２−１（Ｌ１１８Ｗ）のイニシエーターＡ
ＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、
残りのコード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクター
ゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキ
ストにより示される６ＳＢゲノム領域が続く。
ｐＳＺ３２９９に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：




−−構築物ｐＳＺ３２９８： ６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：
ＣｒＴＵＢ２：ＣｐＳＡＤｔｐ−ＯｅＳＡＤ（Ｌ１１８Ｗ）−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ ｐ
ＳＺ３２９９形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する。構築物ｐＳＺ３２９８ ６ＳＡ
：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵＢ２：ＣｐＳＡＤｔｐ−ＯｅＳ
ＡＤ（Ｌ１１８Ｗ）−ＣｖＮＲ：：６ＳＢにおける関連する制限部位は、小文字、太字及
び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、ＸｂａＩ、Ｍｆｅ Ｉ
、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。Ｂｓ
ｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配
列は、６Ｓ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にする６ＳＡゲノム
ＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子の発現を駆
動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターは、囲い文字のテキ
ストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大
文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃ
ｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲは小文字の下線テキス
トにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＣ．ｒｅｉｎｈ
ａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターが続く。ＯｅＳＡＤ（Ｌ１１８Ｗ）のイニ
シエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより
示し、一方、残りのコード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐ
ｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジッ
トペプチドは、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ Ｉ部位との間に位置する。Ｃ．ｖｕｌｇ
ａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その
後に、太字の小文字テキストにより示される６ＳＢゲノム領域が続く。
ｐＳＺ３２９８に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：




一次形質転換体をクローン精製し、低窒素脂質産生条件下、ｐＨ５．０で成長させた。
ｐＳＺ３３０５、ｐＳＺ３２９９及びｐＳＺ３２９８を株Ｚに形質転換することによって
生じる代表的なクローンから得られたプロフィールを、それぞれ表６１〜表６３に示す。
従って、かかる突然変異又は遺伝子を導入すると、組換え微細藻類によって産生される油
の脂肪酸プロフィール中のパルミトレイン酸レベルを増加させ、且つ飽和レベルを低下さ
せることができる。少なくとも０．１、０．１５、及び０．１８のＣ１６：１／Ｃ１６：
０比の油が得られた。
実施例５６：ＦＡＴＡの下方調節及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓケト
−アシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＰＭＫＡＳＩＩ）遺伝子の過剰発現
内在性ＦＡＴＡ１遺伝子の下方調節を内在性ＫＡＳＩＩ遺伝子の過剰発現と組み合わせ
てトランスジェニックＰ．Ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ系を作成した。得られた株は、オレイン
酸が高濃度化したトリグリセリドリッチの油を産生した。
以下の例では、本発明者らは、先行研究のフォローアップにより、内在性ＦＡＴＡ１（
単一のＦＡＴＡ対立遺伝子）の下方調節及び内在性ＫＡＳＩＩ活性の過剰発現などの分子
遺伝学的手法を利用して藻類におけるトリアシルグリセロールのオレイン酸（Ｃ１８：１
）レベルを大幅に高濃度化し得ることを実証している。この例では、本発明者らは、これ
らの手法を単一のトランスジェニック系に組み合わせる試みに注力する。ＦＡＴＡ１対立
遺伝子の単一コピーを破壊すると同時にＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ遺伝子（
ＰｍＫＡＳＩＩ）を過剰発現する構築物を、高オレイン酸Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒ
ｉｆｏｒｍｉｓ株ＡＯに導入した。株ＡＯは、古典的突然変異誘発技法を用いてＵＴＥＸ
１４３５から誘導された高１８：１産生突然変異体から誘導された。株ＡＰと命名され
る得られた株の一つは、複数回の発酵ランで、８５％のＣ１８：１を有して総不飽和物が
約９３％である脂肪酸プロフィールを有する油を産生した。株ＡＰはまた、高い脂質生産
性も有した。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ遺伝子（寄託番号
ＮＰ ０１２１０４）を選択可能なマーカーとして利用して、遺伝子銃による形質転換を
用いる相同組換えによってＰｍＫＡＳＩＩをＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株ＡＯのＦＡＴＡ
１核染色体座に導入した。種々のプロモーターで駆動したときのＫＡＳＩＩ活性を調べる
ため、ＰｍＫＡＳＩＩをいくつかのプロモーターと融合した：ＰｍＵＡＰＡ１、ＰｍＬＤ
Ｈ１、及びＰｍＡＭＴ３。組み込み構築物は全てＦＡＴＡ１遺伝子と逆向きで設計される
ことに留意されたい；これにより安定したインベルターゼ発現となる可能性が高まること
が分かった。従って、株ＡＨで発現させた構築物は、以下のとおり表すことができる。
１） ＦＡＴＡ１ ３’：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＵＡＰＡ１
：ＰｍＫＡＳＩＩ−ＣｖＮＲ：：ＦＡＴＡ１ ５’ （ｐＳＺ２５３３）
２） ＦＡＴＡ１ ３’：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＬＤＨ１：
ＰｍＫＡＳＩＩ−ＣｖＮＲ：：ＦＡＴＡ１ ５’ （ｐＳＺ２５３２）
３） ＦＡＴＡ１ ３’：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ３：
ＰｍＫＡＳＩＩ−ＣｖＮＲ：：ＦＡＴＡ１ ５’ （ｐＳＺ２７５０）
株ＡＰは、ｐＳＺ２５３３から作成される形質転換体の一つである。構築物ｐＳＺ２５
３３ ＦＡＴＡ１３’：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＵＡＰＡ１：
ＰｍＫＡＳＩＩ−ＣｖＮＲ：：ＦＡＴＡ１ ５’における関連する制限部位は、小文字、
太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、Ｍ
ｆｅ Ｉ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉであ
る。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小
文字の配列は、ＦＡＴＡ１遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にす
るＦＡＴＡ１ ３’ゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベ
ルターゼ遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモ
ーターは、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及び
ターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文
字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’Ｕ
ＴＲは小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストによ
り示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＡＰＡ１プロモーターが続く。ＰｍＫＡＳＩＩ
のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリック
により示し、一方、残りのコード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌ
ａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトラ
ンジットペプチドは、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ Ｉ部位との間に位置する。Ｃ．ｖ
ｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し
、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＦＡＴＡ１ ５’ゲノム領域が続く。
ｐＳＺ２５３３に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：






構築物ｐＳＺ２５３３に加えて、本発明者らはまた、ＫＡＳＩＩ遺伝子が、ＰｍＬＤＨ
１、及びＰｍＡＭＴ３を含む他のプロモーターによって駆動されるときのＰｍＫＡＳＩＩ
活性も調べた。プラスミドｐＳＺ２５３２はＦＡＴＡ１ ３’：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳ
ＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＬＤＨ１：ＰｍＫＡＳＩＩ−ＣｖＮＲ：：ＦＡＴＡ１ ５’と
して表すことができ、一方、プラスミドｐＳＺ２７５０はＦＡＴＡ１ ３’：：ＣｒＴＵ
Ｂ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ３：ＰｍＫＡＳＩＩ−ＣｖＮＲ：：ＦＡＴ
Ａ１ ５’として表すことができる。これらの２つのプラスミドの配列は、ＰｍＫＡＳＩ
Ｉを駆動するプロモーターを除きｐＳＺ２５３３と同じであるため、以下の配列はＰｍＬ
ＤＨ１及びＰｍＡＭＴ３プロモーターの配列のみを示す。
ｐＳＺ２５３２におけるＰｍＫＡＳＩＩの発現を駆動するＰｍＬＤＨ１プロモーターのヌ
クレオチド配列：
ｐＳＺ２７５０におけるＰｍＫＡＳＩＩの発現を駆動するＰｍＡＭＴ３プロモーターのヌ
クレオチド配列：
一次形質転換体をクローン精製し、低窒素脂質産生条件下、ＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子の発
現を駆動するプロモーターに応じてｐＨ５．０又はｐＨ７．０のいずれかで成長させた。
ｐＳＺ２５３３（Ｄ１６３６）及びｐＳＺ２５３２（Ｄ１６３７）での形質転換により生
じるトランスジェニック系は、プロモーターの性質及びＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓがｐＨ
５．０でより多くの脂質を産生するという事実のため、ｐＨ５．０の脂質産生培地でアッ
セイした。ｐＳＺ２７５０（Ｄ１６８４）の形質転換により作成されたトランスジェニッ
ク系はｐＨ７．０でアッセイし、ｐＨを調節したＰｍＡＭＴ３プロモーターによって駆動
されるときの最大のＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子発現を可能にした。Ｄ１６３６（ｐＳＺ２５３
３）、Ｄ１６３７（ｐＳＺ２５３２）、及びＤ１６８４（ｐＳＺ２７５０）での形質転換
により生じた代表的なクローンから得られたプロフィールを、それぞれ表６４〜表６６に
示す。
ＦＡＴＡ１ノックアウト及び同時のＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ遺伝子の過
剰発現の影響は、Ｃ１８：１の大幅な増加を伴うＣ１６：０鎖長の明確な減少であった。
ｐＨ５．０では、ＰｍＵＡＰＡ１はＰｍＬＤＨ１より強力であるように見え、Ｄ１６３６
形質転換体におけるパルミチン酸レベルは３％に近く、一方、Ｄ１６３７における形質転
換体はいずれも同じ条件で７％を下回ることはない。
実施例５７：高オレイン酸高安定性（ＨＯＨＳ）油産生株の作成
実施例５６の株ＡＰは、約８５％オレイン酸で総不飽和物が約９３％の油を産生する。
ここで本発明者らは、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼをノックダウンして油産生細胞に
おけるリノール酸産生を低減することにより、高オレイン酸油の酸化安定性を改良し得る
ことを示す。
本発明者らは、内在性ＦＡＤ遺伝子ＰｍＦＡＤ２を標的化する株ＡＰにおいてヘアピン
−ＲＮＡ産生構築物を発現させた。得られた株は、株ＡＱを含め、発酵槽において＞９０
％のＣ１８：１及び＜１％のＣ１８：２を産生する。最も重要なことには、株ＡＱは、そ
の親株の株ＡＰと同じレベルの脂質生産性及びショ糖加水分解能力を維持する。
高オレイン酸高安定性油産生株ＡＱ：ＰｍＦＡＤ２の下方調節に使用される構築物の作
成。高い酸化安定性の油を産生する株を作成するため、ＡＰにヘアピンＰｍＦＡＤ２を導
入してＰｍＦＡＤ２発現を下方調節した。株ＡＱは、ｐＳＺ３３７２ ＤＮＡ（６ＳＡ：
：ＰｍＨＸＴ１：ＳｃａｒＭＥＬ１：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵＢ２：ヘアピンＰｍＦＡＤ２
：ＣｖＮＲ：：６ＳＢ）を株ＡＰに形質転換することによって作成される安定系である。
この構築物では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＭＥＬ１
遺伝子を選択可能なマーカーとして利用して、以前記載された形質転換方法（遺伝子銃）
を用いる相同組換えによってヘアピンＰｍＦＡＤ２をＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株ＡＱの
６Ｓ核染色体座に導入した。
ｐＳＺ３３７２形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する。ｐＳＺ３３７２における関
連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、
Ｋｐｎ Ｉ、ＳｐｅＩ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、Ｓ
ａｃＩ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端
の境界を定める。太字で小文字の配列は、６Ｓ遺伝子座での相同組換えによる標的化した
組み込みを可能にする６ＳＡゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓ．ｃａ
ｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＭＥＬ１遺伝子の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ
ＨＸＴ１プロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃａｒＭＥＬ１のイニシエ
ーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、
コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レ
ダクターゼ３’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリ
ックテキストにより示されるＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモータ
ーが続く。ヘアピンＰｍＦＡＤ２カセットは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ２エク
ソン１（イタリックの下線テキストにより示される）、ＰｍＦＡＤ２のイントロン（イタ
リックの小文字テキスト）と、続いて逆位ＰｍＦＡＤ２エクソン１（イタリックの下線テ
キストにより示される）を含む。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはこ
こでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示され
る６ＳＢゲノム領域が続く。
ｐＳＺ３３７２に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：




本発明者らは、ヘアピンＰｍＦＡＤ２構築物を株ＡＰに導入した。ｐＳＺ３３７２での
形質転換により生じたトランスジェニック系（Ｄ２０８２）をｐＨ５．０の脂質産生培地
でアッセイした。代表的なクローンから得られたプロフィールを表６７に示す。本発明者
らがスクリーニングし終えていた４００個を超える形質転換体の中で、初期プロフィール
スクリーニングにおいて＜１％のＣ１８：２を産生した形質転換体Ｄ２０８２．１から株
ＡＱを分離した。従って、この株は、オレイン酸が高いとともに多価不飽和物が低いトリ
グリセリド油の生成に使用することができる。多価不飽和物レベルが低いため、この油は
、ＡＯＣＳ Ｃｄ １２ｂ−９２法によって試験したとき高い酸化安定性を有するものと
予想される（本特許出願の第ＩＶ節及び対応する実施例を参照のこと）。
実施例５８：Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｆｏｒｍｉｓ（ＰＭ）ＦＡＤ２及びＦＡＴＡ
遺伝子のノックアウト並びにＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子の過剰発現による高オレイン酸「ゼロ
」リノール酸株の作成
微細藻類のトリアシルグリセロールは、内在性ＦＡＴＡ１及びＦＡＤｃ遺伝子の下方調
節並びに内在性ＫＡＳＩＩ活性の過剰発現などの分子遺伝学的手法を利用してオレイン酸
（Ｃ１８：１）のレベルを大幅に高濃度化することができる。この例では、本発明者らは
、これらの手法を単一のトランスジェニック系に組み合わせる試みに注力する。ＦＡＴＡ
１対立遺伝子の単一コピーを破壊すると同時にＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍ
ｉｓ ＫＡＳＩＩ遺伝子を過剰発現する構築物を、株Ｒ及び株Ｄと命名される種々のΔｆ
ａｄ２系に導入した（図２４の系統図を参照）。得られた株、例えば株ＡＳ及び株ＡＺは
、＜０．０５％のＣ１８：２で約９０％のＣ１８：１を産生する。
株Ｄ及び株Ｒは、０％のＣ１８：２、及びそれぞれ振盪フラスコで成長するか、それと
も高細胞密度発酵で成長するかに応じて７６％〜８７％のＣ１８：１を含む油を産生する
Δｆａｄ２系である。株Ｄ及び株Ｒのオレイン酸レベルをさらに上昇させるため、ＦＡＴ
Ａ１対立遺伝子の単一コピーを破壊すると同時にＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳ Ｉ
Ｉ遺伝子を過剰発現する構築物をパーティクルボンバードメントによって株Ｄ／株Ｒに導
入した。
Ｓ２５３０バックグラウンドでＦＡＴＡ遺伝子をノックアウトし且つＰｍＫＡＳＩＩを
過剰発現させる構築物。構築物ＦＡＴＡ１：：ＣｐＡＣＴ−ＡｔＴｈｉｃ−ｎｒ：ＡＭＴ
０３−Ｓ１０６ＳＡＤ−ＰｍＫＡＳＩＩ−ｎｒ：：ＦＡＴＡ１（ｐＳＺ２２７６と命名さ
れる）における関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞ
れＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、
Ｓｐｅ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部
位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、Ｆ
ＡＴＡ１遺伝子での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にするＵＴＥＸ１４３５
由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈ
ａｌｉａｎａ ＴＨＩＣ遺伝子の発現を駆動するＵＴＥＸ ２５０由来のアクチン遺伝子
プロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。ＡｔＴＨＩＣのイニシエーターＡＴＧ
及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は
小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３
’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキスト
により示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性ＡＭＴ０３プロモ
ーターが続く。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及
びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りの
ＰｍＫＡＳＩＩコード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏ
ｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＵＴＥＸ ２５０ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトラン
ジットペプチドは、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ Ｉ部位との間に位置する。Ｃ．ｖｕ
ｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、
その後に、太字の小文字テキストにより示されるＵＴＥＸ１４３５ ＦＡＴＡ１ゲノム領
域が続く。
ｐＳＺ２２７６に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：






Ｓ２５３２バックグラウンドでＦＡＴＡ遺伝子をノックアウトし且つＰｍＫＡＳＩＩを
過剰発現させる構築物。構築物ＦＡＴＡ１：：ＣｐＡＣＴ−ＡｔＴｈｉｃ−ｎｒ：ＰｍＵ
ＡＰＡ１−Ｓ１０６ＳＡＤ−ＰｍＫＡＳＩＩ−ｎｒ：：ＦＡＴＡ１（ｐＳＺ２４４１と命
名される）における関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそ
れぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ
Ｖ、Ｓｐｅ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱ
Ｉ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は
、ＦＡＴＡ１遺伝子での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にするＵＴＥＸ１４
３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ Ｔ
ＨＩＣ遺伝子の発現を駆動するＵＴＥＸ ２５０由来のアクチン遺伝子プロモーターは、
囲い文字のテキストにより示す。ＡｔＴＨＩＣのイニシエーターＡＴＧ及びターミネータ
ーＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリッ
クで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲは小文字
の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰ
ｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性ＵＡＰＡ１プロモーターが続く。Ｐ
．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーター
ＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのＰｍＫＡＳＩＩコ
ード領域は太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉ
ｄｅｓ ＵＴＥＸ ２５０ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドは
、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ Ｉ部位との間に位置する。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸
レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の
小文字テキストにより示されるＵＴＥＸ１４３５ ＦＡＴＡ１ゲノム領域が続く。
ｐＳＺ２４４１に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：






株ＡＳ及び株ＡＺのサザンブロット解析から、両方ともにＰｍＦＡＴＡ二重ノックアウ
ト突然変異体であることが示された。ＰｍＦＡＤ２破壊カセットはＣａｒｔｈａｍｕｓ
ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ推定オレオイル特異的ＡＣＰ−チオエステラーゼ（ＣｔＯＴＥ）を
含むため、内在性ＦＡＴＡ遺伝子が存在しないことが、ＣｔＯＴＥの発現によって完全に
補完されるように見える。
ＦＡＴＡ１不活性化及びＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子の過剰発現がΔｆａｄ２系株Ｄ／株Ｒの
脂質組成に及ぼす影響を決定するため、Ｄ１２６６／株Ｄ及びＤ１４１５／株Ｒの一次形
質転換体をクローン精製し、標準的な脂質産生条件下、ｐＨ５．０及びｐＨ７．０の両方
で成長させた。ｐＳＺ２２７６で株Ｄに形質転換することにより生じるトランスジェニッ
ク系から得られたプロフィールを表６８に示し、ｐＳＺ２４４１で株Ｒに形質転換するこ
とにより生じるトランスジェニック系を表６９に示す。
表６８、ｐＨ７．０の株ＡＺを見ると分かるとおり、ＡＭＴ０３によって駆動されるＰ
ｍＫＡＳＩＩの完全な活性とＦＡＴＡ１ノックとの組み合わせは極めて低いレベルのＣ１
６：０（２％）をもたらす。一方、同様にＡＭＴ０３プロモーターによって駆動されるた
め、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓチオエステラーゼもまた活性化する。株
ＡＺをｐＨ７で培養したとき、７．８％のＣ１８：０が観察される。ｐＨ５．０では、Ｃ
１６：０レベルの低下に主としてＦＡＴＡ１不活性化が寄与し、しかしながら本発明者ら
はｐＨ６．８でシード培養を行うため、ＰｍＫＡＳＩＩは部分的に活性化し得る。株ＡＺ
のステアリン酸レベルは、ｐＨ５．０ではＣ．ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ ＴＥの低発現に起
因して低い。総じて、株ＡＺのオレイン酸レベルはｐＨ７．０及びｐＨ５．０の両方で８
５％を超える（約８８％）。
トランスジェニック系株ＡＳでは、ＣｒＴＵＢ２及びＰｍＵＡＰＡ１プロモーターは両
方ともｐＨバイアスがなく、従って表６９に報告されるとおり、ｐＨ５．０及びｐＨ７．
０での脂質プロフィールは本質的に同じである。株ＡＺと比べて、株ＡＳは産生するステ
アリン酸がはるかに少ない。株ＡＳのパルミチン酸レベルは株ＡＺよりやや高いが、株Ａ
Ｓのオレイン酸レベルは９０％を上回り、これは本発明者らが振盪フラスコ実験で観察し
た最も高いレベルである。
実施例５９：ＦＡＤ２及びＦＡＴＡノックアウトの補完並びにＫＡＳＩＩ過剰発現によっ
て高Ｃ１８−２及び低Ｃ１８−３レベルのユニークな油が生じる
実施例５８に記載されるとおり、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株にお
けるＰｍＦＡＴＡ１の両方のコピーをノックすると同時にＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子を過剰発
現させることによりΔｆａｄ２系（株Ｒ）に株ＡＳを作成した。株Ｒは、ＦＡＤ２遺伝子
座においてＣｒＴＵＢ２プロモーターの制御下にオレイン酸特異的Ｃ．ｔｉｎｃｔｏｒｉ
ｕｓアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＡ３３０１９．１）
をＵＴＥＸ １４３５に由来する高脂質産生株に挿入することにより作成されるＦＡＤ２
（ＦＡＤｃとしても知られる）ノックアウト株である。株ＡＳ及びその親、株Ｒは内在性
ＰｍＦＡＤ２−１遺伝子の破壊を有し、そのためΔ１２特異的デサチュラーゼ活性がなく
なっており、これは窒素リッチシード条件及び低窒素脂質産生条件の両方で０％のＣ１８
：２（リノール酸）レベルとして現れる。株（Ｓｔａｉｎ）ＡＳ（及びその親株Ｒ）では
Ｃ１８：２が存在しないため成長不良となり、これはシード段階でリノール酸を外因的に
添加することによって部分的に軽減し得る。しかしながら、工業的応用には、リノール酸
の外因的な添加は高価である。株Ｒ（及び二次Δｆａｄ２株）をＰｍＦＡＤ２−１で補完
することにより、リノール酸を補足することなしにＣ１８：２レベルが野生型レベルに回
復し、またシード及び脂質産生の間の成長特性のレスキューももたらされた。
本例では、本発明者らは以下を実証する：
・ｐＨ誘導性ＰｍＡＭＴ３プロモーターの制御下におけるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒ
ｉｆｏｒｍｉｓ由来の脂肪酸デサチュラーゼ−２遺伝子（ＰｍＦａｄ２−１）のトランス
発現では、ＰｍＦＡＤ２−１の機能的補完がもたらされ、Δｆａｄ２、Δｆａｔａ１株Ａ
Ｓにおける成長及びＣ１８：２レベルが回復する；
・株ＡＳの補完は条件的／誘導性であり、ＡＭＴ３プロモーターが不活性であるときのｐ
Ｈ５．０とは対照的に、ｐＨ７．０で、ＡＭＴ３プロモーターが活性化してＰｍＦＡＤ２
−１の発現を駆動しているときに起こる；及び
・ｐＨ７．０でのＰｍＦＡＤ２−１の過剰発現は、＞２０％のＣ１８：２レベルの株をも
たらす。これらの高Ｃ１８：２株の脂肪酸プロフィールは、この新規油がキャノーラ油（
１０％）の５分の１のＣ１８：３を有することを除き、キャノーラ油を厳密に模倣する。
この高いＣ１８：２レベルは、野生型（即ち、操作されていない）対照株Ｚにおける同じ
遺伝子の過剰発現がより高いＣ１８：２レベルをもたらさないため、ＰｍＦＡＤ２−１を
過剰発現する株ＡＳから誘導された株においてのみ見られる。
Δｆａｄ２株の株ＡＳ及び株ＺにおけるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ
脂肪酸デサチュラーゼ２（ＰｍＦＡＤ２−１）の発現に使用される構築物−［ｐＳＺ２７
２１］。Δｆａｄ２Δｆａｔａ１株ＡＳ及び株Ｚを構築物ｐＳＺ２７２１で形質転換した
。形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する。構築物ｐＳＺ２７２１（６Ｓ：：ＣｐＡＣ
Ｔ−ＳｃＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ３−ＰｍＦＡＤ２−１−ＣｖＮＲ：：６Ｓ）
における関連する制限部位は、小文字、下線及び太字で示され、５’−３’にそれぞれＢ
ｓｐＱ １、ＫｐｎＩ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ
Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡ
の５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６Ｓ遺伝子座での相同
組換えによるＰｍＦＡＤ２−１の標的化した組み込みを可能にするＵＥＸ １４３５由来
のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＥＬ１遺伝子の発現を駆動するＵＴＥＸ ２５０由来のアクチン（
ＡＣＴ）遺伝子プロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃＭＥＬ１のイニシ
エーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方
、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸
レダクターゼ３’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタ
リックテキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性Ａ
ＭＴ０３プロモーターが続く。ＰｍＦＡＤ２−１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネー
ターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りの遺伝子は太字
のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも
小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＵＴ
ＥＸ １４３５ ６Ｓゲノム領域が続く。正しいリーディングフレーム及び標的配列を確
実にするため、最終構築物を配列決定した。
ｐＳＺ２７２１に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：




成長及び脂肪酸プロフィールに及ぼすその影響を決定するため、上記の構築物を独立に
Δｆａｄ２Δｆａｔａ１株ＡＳ又は野生型株Ｚに形質転換した。一次形質転換体をクロー
ン精製し、低窒素脂質産生条件下、株ＡＳ形質転換体についてはｐＨ７．０（ＡＭＴ３プ
ロモーター活性）及びｐＨ５．０（ＡＭＴ３プロモーター不活性）で、又は株Ｚ形質転換
体についてはｐＨ７．０で成長させた。形質転換によって生じた一組の代表的なクローン
から得られたプロフィールを、それぞれ表７０〜表７３に示す。
株ＡＳにおけるｐＨ７．０でＡＭＴ３プロモーターによって駆動される内因性ＰｍＦａ
ｄ２−１の発現は、Δ１２特異的デサチュラーゼ活性をもたらし、基本株ＡのＣ１８：２
脂肪酸レベルが完全に回復した（表７０）。ｐＨ５．０でＡＭＴ３プロモーターが不活性
であるときに脂質産生を行った場合、かかるΔ１２特異的デサチュラーゼ活性は検出され
ず、従って顕著なＣ１８：２回復は検出されない（表７１）。
興味深いことに、ｐＨ７．０での補完された株ＡＳ株における脂質産生は、Ｃ１８：２
レベルの２倍以上の増加を伴ういくつかの株をもたらす。得られた株は、新規油が市販の
キャノーラ油より低いＣ１８：３レベルを有することを除き、キャノーラ油と同様の油プ
ロフィールを生じる（表７２）。このＣ１８：２の増加は、同じＡＭＴ３駆動ＰｍＦＡＤ
２−１で形質転換した野生型（株Ｚ）株には見られない。
本発明者らは、高いＣ１８：２レベルを有する他の株を認めているが、それらは全て、
シード並びに脂質産生培地での成長不良を伴った。しかしながら、ここで本発明者らは、
得られる株の成長に対する有害な影響なしにＣ１８：２レベルを標的化した形で増加させ
ることが可能となっている。Δｆａｄ２株Ｒ及びΔｆａｄ２Δｆａｔａ１株ＡＳの成長は
極めて悪く、４２時間で１０〜２０のＯＤ７５０にもほとんど達しないが、補完された株
ＡＳ（Ｄ１６７３）系は同じ期間で極めて急速に成長し、５０〜８０のＯＤ７５０に達す
る。
従って、本発明者らが、１０％未満のリノレン酸だが＞２０％リノール酸の脂肪酸プロ
フィールを有する細胞油を生成可能であったことが分かる（実際、本発明者らは＜２％リ
ノレン酸及び＞２０％リノール酸を達成した）。株ＡＳにおいてのみＣ１８：２レベルが
上昇することは意外であり、５７％のＣ１８：１レベルに過ぎない株Ｚと比較して株ＡＳ
はほぼ９０％のＣ１８：１レベルを有し、ＥＲにおける利用可能な基質Ｃ１８：１の過剰
がＣ１８：２レベルを押し上げる鍵であることが示唆される。ＰｒｏｔｏｔｈｅｃａはＴ
ＡＧ上のＣ１８：１を極めて効率的に利用するように進化しているため、野生型の状況で
は、基質はＦＡＤ２酵素によってさらに不飽和化される前にＥＲを極めて急速に離れる可
能性が最も高い。ＰｍＦＡＤ２−１による不飽和化に利用可能なまま留まるものと思われ
る極めて高いＣ１８：１レベルを有する株ＡＳなどの株では、この制約は解消され得る。
実施例６０：中鎖チオエステラーゼ及びケトアシルシンターゼのコンビナトリアル発現に
よる極めて高い且つバランスしたＣ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸レベルを有する油の作
成
この例では、本発明者らは、古典的に突然変異誘発したＵＴＥＸ １４３５の高油産生
誘導体、株ＢＡにおいて極めて高い且つバランスしたＣ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸を
有する油を作成するための二分子手法を記載する。得られるトランスジェニック株は２つ
の異なる中鎖特異的チオエステラーゼ、広域特異性Ｃ１０：０〜Ｃ１４：０ Ｃｕｐｈｅ
ａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＦＡＴＢ２チオエステラーゼ（株（Ｓｔａｉｎ）ＢＡで発現する
）と、主にＣ１０：０特異的Ｃｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ ＦＡＴＢ２チオエス
テラーゼ（入ってくるベクターの一部）とを発現する。加えて、Ｄ１５５０形質転換体が
、中性ゲノム部位Ｔｈｉ４ｂに組み込まれたＣ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＩＶエロンガ
ーゼ遺伝子を発現し（ベクターｐＳＺ２４２４）、一方、Ｄ１６８１形質転換体が、内因
性ＫＡＳＩ破壊カセットの一部としてのＣ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＡＩエロンガーゼ
を発現する（ベクターｐＳＺ２７４６）。植物起源の異なるＫＡＳＩ活性を外因性チオエ
ステラーゼと組み合わせて使用することにより、全体的なＣ１０〜Ｃ１２レベルの大幅な
増加並びにＣ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａチオエステラーゼのＣ１０：０特異性の向上がもた
らされた。最良の株は、バランスしたそれぞれ約４２％のＣ１０：０及び約４４％のＣ１
２：０脂肪酸レベルを有する約８５％の総Ｃ１０：０〜Ｃ１２：０の脂肪酸を合成し、４
％未満のＣ１４：０、及び１．５％未満のＣ８：０であった。これらの結果は、ＦＡＴＢ
及びＫＡＳ遺伝子の選択によって、カプリン酸及びラウリン酸が２０％以内に（又はさら
には１５％、又は１０％以内に）バランスした少なくとも５０％の総飽和物を有する油を
生じさせ得ることを示している。
ｐＳＺ２４２４における関連する制限部位は、小文字、太字及び下線テキストで示され
、５’−３’にそれぞれＰｍｅ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、Ｅｃｏ Ｒ
Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、ＳｎａＢＩ、Ｓｐｅ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ
、Ｘｈｏ Ｉ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。Ｐｍｅ Ｉ及びＢｓｐ
ＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列
は、Ｔｈｉ４ｂ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にするＵＴＥＸ
１４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、ネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼ遺伝子（ＮｅｏＲ、細胞がＧ４１８で成長する能力を付与する）の発現
を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ Ｂ−チューブリンプロモーターは、囲い文字の
テキストにより示す。ＮｅｏＲのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文
字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈ
ｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下線テキスト
により示す。次は、小文字イタリックで示されるＣｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ
ＫＡＳＩＶ遺伝子（ＣｈＫＡＳＩＶ）の発現を駆動する囲い文字の小文字テキストにより
示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＡＭＴ０３プロモーターである
。ＣｈＫＡＳＩＶのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは、大文字、太字の
イタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’Ｕ
ＴＲを小文字の下線テキストにより示す。次は、小文字イタリックで示されるＰｒｏｔｏ
ｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ遺伝子に由来するプラスチドトランジットペ
プチド配列に融合したＣｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ ＦＡＴＢ２遺伝子（ＣｈＦ
ＡＴＢ２）の発現を駆動する囲い文字の小文字テキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅ
ｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＡＭＴ０３プロモーターである。ＣｈＦＡＴＢ２のイニシ
エーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは、大文字、太字のイタリックにより示す。Ｃ
．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより
示し、その後に、ＵＴＥＸ１４３５ Ｔｈｉ４ｂフランキング配列が続く。
＞ｐＳＺ２４２４ ［Ｔｈｉ４ｂ：：ＣｒＴＵＢ２−ＮｅｏＲ−ＣｖＮＲ：ＰｍＡｍｔ０
３−ＣｈＫＡＳＩＶ−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ０３−ＣｈＴＥ２−ＣｖＮＲ：：Ｔｈｉ４ｂ
］． ｐＳＺ２４２４に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：






ｐＳＺ２７４６における関連する制限部位は、小文字、太字及び下線テキストで示され
、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ、ＡｓｃＩ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｎｄｅ Ｉ、Ｓｎａ Ｂ
Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位
が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、ＫＡ
ＳＩ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込み（及びノックアウト）を可能にす
るＵＴＥＸ１４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、ネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮｅｏＲ、細胞がＧ４１８で成長する能力を付与す
る）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ Ｂ−チューブリンプロモーターは、
囲い文字のテキストにより示す。ＮｅｏＲのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴ
ＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで
示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲを小文字の下
線テキストにより示す。次は、小文字イタリックで示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏ
ｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ遺伝子に由来するプラスチドトランジットペプチド配列に融合
したＣｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ ＦＡＴＢ２遺伝子（ＣｈＦＡＴＢ２）の発現
を駆動する囲い文字の小文字テキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆ
ｏｒｍｉｓのＵＡＰＡ１プロモーターである。ＣｈＦＡＴＢ２のイニシエーターＡＴＧ及
びターミネーターＴＧＡは、大文字、太字のイタリックにより示す。Ｂ．ｂｒａｕｎｉｉ
ｃｄ１９１ ３’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示す。次は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅ
ｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＳＡＤ１プラスチドトランジットペプチド配列に融合した
小文字のイタリックにより示されるＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＡＩ遺伝子
の発現を駆動する囲い文字の小文字テキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏ
ｒｉｆｏｒｍｉｓのＡｍｔ０３プロモーターである。Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＡＩ
配列は小文字イタリックであり、イニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡにより
区切られる。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線
テキストにより示し、その後に、ＵＴＥＸ１４３５ ＫＡＳＩフランキング配列が続く。
＞ｐＳＺ２７４６ ［ＫＡＳＩ−１：：ＣｒＴＵＢ２−ＮｅｏＲ−ＣｖＮＲ：ＰｍＵＡＰ
Ａ１−ＣｈＦＡＴＢ２−Ｂｂｃｄ１８１：ＰｍＡｍｔ０３−ＰｍＳＡＤｔｐ−ＣｗＫＡＳ
Ａ１−ＣｖＮＲ：：ＫａｓＩ−１］． ｐＳＺ２７４６に含まれる形質転換ＤＮＡのヌ
クレオチド配列：






Ｄ１５５０形質転換体に由来する安定系の代表的な振盪フラスコ培養物からの脂肪酸プ
ロフィールを表７４に示す。２つの独立した遺伝系統が、高い且つバランスしたＣ１０〜
Ｃ１２：０脂肪酸レベルの株を生じた。
次に、本発明者らは、ＫＡＳＩ置換戦略を用いて構築したＤ１６８１株のパフォーマン
スを分析した。興味深いことに、Ｄ１５５０形質転換体と異なり、Ｄ１６８１株は脂肪酸
プロフィールのより大きいばらつきを示した（表７５）。加えて、Ｄ１６８１由来の系は
、本発明者らがＤ１５５０由来のトランスジェニック系で観察したものより低いＣ８：０
レベルを有したことから、Ｃ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ ＦＡＴＢ２チオエステラーゼのＣ
１０：０特異性の改善におけるＣ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＡ１の直接的な役割が示唆
される。
続いてＤ１５５０及びＤ１６８１ファミリーを代表する８個の株（表７４〜表７５から
）を、表７６に示すとおり高細胞密度発酵で評価した。発酵により、実験室規模の発酵と
比較してやや改善された中鎖プロフィール又はＣ１０〜Ｃ１２：０脂肪酸レベルのバラン
スを有する油がもたらされた。２つの独立した発酵で評価した株ＢＥは、８５．２％のＣ
１０〜Ｃ１２：０脂肪酸レベル、３．５％のＣ１４：０レベル、及び約１．２％のＣ８：
０脂肪酸レベルに達する優れたプロフィールを示し、９２％を超える総飽和物を蓄積した
。
実施例６１：Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３遺伝子の発現に
よるＵＴＥＸ１４３５におけるＴＡＧ位置特異性
実施例４３において、本発明者らは、ＵＴＥＸ１４３５誘導株Ｓ２０１４におけるＣｕ
ｐｈｅａ ＰＳＲ２３（ＣｕＰＳＲ２３）由来の２個の異なる１−アシル−ｓｎ−グリセ
ロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡ
ＡＴ３遺伝子の発現が、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０及びＣ１４：０脂肪酸レベルの上昇をも
たらしたことを実証した。本例では、本発明者らは、Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡ
ＡＴ２がＴＡＧにおけるｓｎ−２位でのＣ１０：０脂肪酸組み込みに対して高い特異性を
呈することのエビデンスを提供する。Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ３は、ＴＡ
Ｇにおけるｓｎ−２位にＣ１８：２脂肪酸を特異的に組み込む。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）トランスジェニ
ック株Ｂの組成及び特性、それぞれＣｕＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２及びＬＰＡＡＴ３遺伝
子を発現する形質転換ベクターｐＳＺ２２９９及びｐＳＺ２３００、及びそれらの配列は
、既に記載している。
Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ遺伝子が得られる脂肪酸プロフィールに及ぼす
影響を決定するため、本発明者らは、比較的高いレベルで中鎖及び長鎖脂肪酸の両方を合
成する株Ｂを利用している。表７７に示すとおり、株ＢにおけるＬＰＡＡＴ２遺伝子（Ｄ
１５２０）の発現は、Ｃ１０〜Ｃ１２：０レベルの（最良の株、Ｄ１５２０．３〜７で最
大１２％の）増加をもたらしたことから、このＬＰＡＡＴが中鎖脂肪酸に特異的であるこ
とが示唆される。或いは、ＬＰＡＡＴ３遺伝子の発現が比較的控えめな（最良の株、Ｄ１
５２１．２８〜７で最大５％の）増加をもたらしたことから、中鎖レベルへの影響がほと
んど又は全くないことが示される。
Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ遺伝子の発現がｓｎ−２位における脂肪酸の位
置特異性に影響を及ぼしたかどうかを決定するため、本発明者らは、ブタ膵リパーゼ法を
利用して代表的なＤ１５２０及びＤ１５２１株のＴＡＧを分析した。実施例２を参照のこ
と。表７８に示すとおり、Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ２遺伝子はＣ１０：０
脂肪酸に対して顕著な特異性を示し、ｓｎ−２位に５０％多いＣ１０：０脂肪酸を組み込
むように見える。Ｃｕｐｈｅａ ＰＳＲ２３ ＬＰＡＡＴ３遺伝子はＣ１８：２脂肪酸に
のみ作用してｓｎ−２位へのＣ１８：２脂肪酸の再分布をもたらすように見える。従って
、対応する特異性を有する外来性ＬＰＡＡＴ遺伝子を導入することにより、１５％又は２
０％超のＣ１０：０又はＣ１８：２脂肪酸のｓｎ−２プロフィールを有する微生物トリグ
リセリド油を得ることが可能である。
実施例６２：異種ＫＡＳ発現Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株への異種チ
オエステラーゼの導入
ここで本発明者らは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）トランスジェ
ニック株Ｓ５８１８において異種植物ＫＡＳＩ遺伝子、Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳ）、ＣｗＫＡＳＡ１と組み合わせたとき、異
種脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼがチオエステラーゼ特異性の変化を呈すること
を実証する。Ｓ５８１８は、６Ｓ遺伝子座でＣｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｍｐｈｏｒａ及
びＵｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ由来のチオエステラーゼキメラ、
ＣｃＦＡＴＢ２−Ｕｃ ＦＡＴＢ２キメラＢを発現し、さらにｐＬＯＯＰ遺伝子座でＣｕ
ｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳ、ＣｗＫＡＳＡ１を発現するトランスジェニック株
である。ＣｃＦＡＴＢ２−ＵｃＦＡＴＢ２キメラＢ及びＣｗＫＡＳＡ１遺伝子を加えるこ
とにより、４５％のＣ１２：０及び１４％のＣ１４：０のＳ５８１８脂肪酸プロフィール
がもたらされる。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおいて主にＣ１４：０チオエステラーゼ活
性を呈し且つＣ１２：０チオエステラーゼ活性がそれ程顕著でないことが以前示された、
チオエステラーゼをコードする５つの異なる構築物を、このバックグラウンドでＣ１４：
０及びＣ１２：０レベルを増加させるためＳ５８１８に導入した。しかしながら、５つの
異なるＣ１４：０チオエステラーゼをＳ５８１８に導入すると、Ｃ１２：０脂肪酸レベル
の予想外ながら大幅な増加（全体で＞５０％）が生じ、Ｃ１４：０脂肪酸レベルの増加は
ごく僅かであった（全体で＜２０％）。この結果は、ＫＡＳＩ−ＦＡＴＢチオエステラー
ゼの組み合わせが、いずれか一方の遺伝子を別々に導入したときには示されないユニーク
な活性を呈することを示唆している。これらの結果は、油産生細胞における異種ＫＡＳ遺
伝子と異種チオエステラーゼとの組み合わせを用いることにより、いずれか一方の遺伝子
を単独で導入することによっては示されない脂肪酸プロフィールを生じさせ得ることを実
証している。さらに、異種ＫＡＳの導入は、さらなる異種チオエステラーゼの新規特異性
を明らかにするための重要且つ有益な手法であり得る。
株Ｓ５８１８の作成。２つの連続的な形質転換によってＳ５８１８を作成した。ＵＴＥ
Ｘ１４３５基本株Ｓ３１５０（上記の株Ｚ）を、６Ｓ遺伝子座を標的化するＣｃＦＡＴＢ
２−ＵｃＦＡＴＢ２キメラＢチオエステラーゼをコードするｐＳＺ２４４８（６ＳＡ：：
ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−Ｃｃ
ＦＡＴＢ２−ＵｃＦＡＴＢ２−ｃｈｉｍｅｒａＢ−ＥｘｔＡ−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ）で形
質転換することにより、株Ｓ４９５４を得た。Ｓ４９５４は約３２％のＣ１２：０及び約
１６％のＣ１４：０脂肪酸レベルを生じる（表６２−１）。続いてＳ４９５４を、ｐＬＯ
ＯＰ遺伝子座を標的化するＣ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＫＡＳＡ１遺伝子をコードするｐＳＺ
２２２９（ｐＬＯＯＰ：：ＣｒＴＵＢ２−ＮｅｏＲ−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＰｍＳＡ
Ｄｔｐ＿ＣｗＫＡＳＡＩ−ＣｖＮＲ：：ｐＬＯＯＰ）で形質転換することにより、株Ｓ５
８１８を得た。Ｓ５８１８は約４５％のＣ１２：０及び約１４％のＣ１４：０脂肪酸レベ
ルを生じる（表７９）。
Ｃ１４：０チオエステラーゼの同定。Ｃ１４：０脂肪酸レベルを増加させ、Ｃ１２：０
脂肪酸レベルの程度を下げるため、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおいてＣ１４：０及びＣ
１２：０チオエステラーゼ活性を呈することが分かったいくつかのチオエステラーゼを、
Ｓ５８１８に導入するベクターにクローニングした。Ｃｕｐｈｅａ ｈｙｓｓｏｐｉｆｏ
ｌｉａチオエステラーゼＣｈｓＦＡＴＢ３は、本発明者らによって、Ｃ．ｈｙｓｓｏｐｉ
ｆｏｌｉａの成熟植物油糧種子を配列決定することにより新規チオエステラーゼを同定し
ようとする試みの一環として発見された。Ｃ．ｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ種子は約８４％
のＣ１２：０及び約５％のＣ１４：０脂肪酸レベルを呈するが、本発明者らが同定したＣ
ｈｓＦＡＴＢ３チオエステラーゼは、Ｓ３１５０で発現させるとき強力なＣ１４：０チオ
エステラーゼ活性を呈する（最大約３４％のＣ１４：０）。ｐＳＡＤ１ｔｐ＿トリミング
型：ＣｈｓＦＡＴＢ３と命名される、本発明者らが推定プラスチド標的トランジットペプ
チドを最適化したバージョンのＣｈｓＦＡＴＢ３も、同様に強力なＣ１４：０チオエステ
ラーゼ活性を呈した（約３３％のＣ１４：０；表８０）。
同様に、本発明者らはまた、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａの成熟植物油糧種子を配列
決定することにより新規チオエステラーゼを同定しようとする試みの一環としてＣｕｐｈ
ｅａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａチオエステラーゼＣｈｔＦＡＴＢ１ａも同定した。Ｃ．
ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ種子は約４４％のＣ１０：０、約４０％のＣ１２：０脂肪酸レ
ベル、及び僅か約４％のＣ１４：０を呈するが、本発明者らが同定したトランジットペプ
チド最適化バージョンのＣｈｔＦＡＴＢ１ａチオエステラーゼ、ＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿トリ
ミング型：ＣｈｔＦＡＴＢ１ａは、Ｓ３１５０で発現させるとき強力なＣ１４：０チオエ
ステラーゼ活性を呈する（最大約３５％のＣ１４：０；表８１）。
既発表のＣｕｐｈｅａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ Ｃ１４：０チオエステラーゼ、Ｃｐａｌ
ＦＡＴＢ２もまたＳ５８１８に導入した（下記参照）。
Ｓ５８１８へのＣ１４：０チオエステラーゼの導入。Ｓ５８１８に導入するためＣ１４
：０チオエステラーゼを使用して５つの構築物を作成した（表８２）。
ｐＳＺ３３９０及びｐＳＺ３５３１は、ｐＨ５応答性ＵＡＰＡ１プロモーターの制御下
でＣｐａｌＦＡＴＢ２チオエステラーゼ遺伝子をそれぞれＤＡＯ１ｂ及びＴＨＩ４Ａ遺伝
子座に導入する。ｐＳＺ３４９３、ｐＳＺ３４９４、及びｐＳＺ３４９５は、ｐＨ７応答
性ＡＭＴ３プロモーターの制御下でそれぞれＣｈｓＦＡＴＢ３、ＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿トリ
ミング型：ＣｈｓＦＡＴＢ３、及びＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿トリミング型：ＣｈｔＦＡＴＢ１
ａをＤＡＯ１ｂ遺伝子座に導入する。トランスジェニック株をメリビオースでの成長能力
で選択した。細胞培養物、脂質産生、及び脂肪酸分析は、全て先述のとおり実施した。ｐ
ＳＺ３３９０、ｐＳＺ３４９３、ｐＳＺ３４９４、ｐＳＺ３４９５、及びｐＳＺ３５３１
の形質転換ＤＮＡを以下に提供する。
ｐＳＺ３３９０： ｐＳＺ３３９０は、ＤＡＯ１ｂ：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭｅｌ
１−ＣｖＮＲ：ＰｍＵＡＰＡ１ｎｏＳａｃＩ−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴ
Ｂ２ＦＬＡＧＥｘｔＡ−ＣｖＮＲ：：ＤＡＯ１ｂとして表すことができる。構築物におけ
る関連する制限部位、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢ
Ｉ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩは、小文
字、太字、及び下線で示される。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末
端の境界を定める。構築物の５’末端及び３’末端における太字で小文字の配列は、ＤＡ
Ｏ１ｂ遺伝子座への相同組換えによる組み込みを標的化するＵＴＥＸ １４３５由来のゲ
ノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、選択カセットは、Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇ
ｅｎｓｉｓ ＭＥＬ１遺伝子（メリビオースで成長する能力を付与する）の発現を駆動す
るＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＨＸＴ１プロモーター及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇ
ａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを有する。プロモーターは、小文字
、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃａｒＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミ
ネーターＴＧＡは太字、大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイ
タリックで示す。３’ＵＴＲは、小文字、下線のテキストにより示す。異種Ｃｈｌｏｒｅ
ｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＳＡＤ１プラスチド標的トランジットペプチド
に融合した、ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＦＬＡＧＥｘｔＡ遺伝子を含
む第２のカセットは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＡＰＡ１ ｐＨ５応答性プロモータ
ーによって駆動され、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）
遺伝子３’ＵＴＲを有する。このカセットでは、ＵＡＰＡ１プロモーターは、小文字、囲
い文字のテキストにより示す。ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＦＬＡＧＥ
ｘｔＡ遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは、太字、大文字のイタ
リックで示し、一方、コード領域は小文字のイタリックにより示す。３’ＵＴＲは、小文
字、下線のテキストにより示す。
ｐＳＺ３３９０形質転換構築物：




ｐＳＺ３４９３、ｐＳＺ３４９４、及びｐＳＺ３４９５：ｐＳＺ３４９３は、ＤＡＯ１
ｂ５’：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｈｓＦＡＴＢ
３−ＣｖＮＲ：：ＤＡＯ１ｂ３’として表すことができる。ｐＳＺ３４９４は、ＤＡＯ１
ｂ５’：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔ
ｐ＿トリミング型：ＣｈｓＦＡＴＢ３−ＣｖＮＲ：：ＤＡＯ１ｂ３’として表すことがで
きる。ｐＳＺ３４９５は、ＤＡＯ１ｂ５’：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭＥＬ１−ＣｖＮ
Ｒ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿トリミング型：ＣｈｔＦＡＴＢ１ａ−ＣｖＮＲ：
：ＤＡＯ１ｂ３’として表すことができる。これらの３つの構築物の配列は、チオエステ
ラーゼ遺伝子の配列のみが異なる。ｐＳＺ３４９３の完全な形質転換配列は配列番号１２
４に示される。ＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿トリミング型：ＣｈｓＦＡＴＢ３及びＣｐＳＡＤ１ｔ
ｐ＿トリミング型：ＣｈｔＦＡＴＢ１ａ遺伝子単独の配列は、ｐＳＺ３４９４及びｐＳＺ
３４９５配列においてｐＳＺ３４９３のＣｈｓＦＡＴＢ３に取って代わるものであり、そ
れぞれ隣接制限部位と共に配列番号１２５及び１２６に示される。
ｐＳＺ３４９３構築物における関連する制限部位、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、
ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、Ｓａｃ
Ｉ、ＢｓｐＱＩは、小文字、太字、及び下線で示される。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮ
Ａの５’末端及び３’末端の境界を定める。構築物の５’末端及び３’末端における太字
で小文字の配列は、ＤＡＯ１ｂ遺伝子座への相同組換えによる組み込みを標的化するＵＴ
ＥＸ １４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、選択カセットは
、Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＭＥＬ１遺伝子（メリビオースで成長する能力を付
与する）の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＨＸＴ１プロモーター及びＣｈｌ
ｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを有する。
プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃａｒＭＥＬ１のイニシエ
ーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは太字、大文字のイタリックにより示し、一方、
コード領域は小文字のイタリックで示す。３’ＵＴＲは、小文字、下線のテキストにより
示す。第２のカセットは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＡＭＴ３ ｐＨ７応答性プロモー
ターによって駆動されるＣｈｓＦＡＴＢ３遺伝子を含み、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇ
ａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを有する。このカセットでは、ＡＭ
Ｔ３プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＣｈｓＦＡＴＢ３遺伝子
のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは、太字、大文字のイタリックで示し
、一方、コード領域は小文字のイタリックにより示す。３’ＵＴＲは、小文字、下線のテ
キストにより示す。
ｐＳＺ３４９３形質転換構築物：






ＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿トリミング型：ＣｈｓＦＡＴＢ３ （ｐＳＺ３４９４由来）：
ＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿トリミング型：ＣｈｔＦＡＴＢ１ａ （ｐＳＺ３４９５由来）：
ｐＳＺ３５３１：ｐＳＺ３５３１は、ＴＨＩ４Ａ：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭｅｌ１
−ＣｐＥＦ１ａ：ＰｍＵＡＰＡ１ｎｏＳａｃＩ−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡ
ＴＢ２ＦＬＡＧＥｘｔＡ−ＣｖＮＲ：：ＴＨＩ４Ａとして表すことができる。この構築物
に関連する制限部位、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢ
Ｉ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩは、小
文字、太字、及び下線で示される。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’
末端の境界を定める。構築物の５’末端及び３’末端における太字で小文字の配列は、Ｔ
ＨＩ４Ａ遺伝子座への相同組換えによる組み込みを標的化するＵＴＥＸ １４３５由来の
ゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、選択カセットは、Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒ
ｇｅｎｓｉｓ ＭＥＬ１遺伝子（メリビオースで成長する能力を付与する）の発現を駆動
するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＨＸＴ１プロモーター及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏ
ｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＥＦ１Ａ遺伝子３’ＵＴＲを有する。プロモーターは、小文字
、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃａｒＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミ
ネーターＴＧＡは太字、大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイ
タリックで示す。３’ＵＴＲは、小文字、下線のテキストにより示す。異種Ｃｈｌｏｒｅ
ｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＳＡＤ１プラスチド標的トランジットペプチド
に融合した、ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＦＬＡＧＥｘｔＡ遺伝子を含
む第２のカセットは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＡＰＡ１ ｐＨ５応答性プロモータ
ーによって駆動され、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）
遺伝子３’ＵＴＲを有する。このカセットでは、ＵＡＰＡ１プロモーターは、小文字、囲
い文字のテキストにより示す。ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＦＬＡＧＥ
ｘｔＡ遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは、太字、大文字のイタ
リックで示し、一方、コード領域は小文字のイタリックにより示す。３’ＵＴＲは、小文
字、下線のテキストにより示す。
ｐＳＺ３５３１形質転換構築物：




異種「Ｃ１４：０特異的」チオエステラーゼの発現による株Ｓ５８１８におけるＣ１２
：０レベルの増加。Ｓ５８１８におけるＣ１４：０脂肪酸レベルを増加させるため、これ
までにＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおいて際立ったＣ１４：０チオエステラーゼ活性を示
しているいくつかのチオエステラーゼをＳ５８１８バックグラウンドに形質転換した。本
発明者らの予想に反し、Ｃ１２：０レベルの顕著な増加と、Ｃ１４：０レベルの低下又は
ごく僅かな増加が観察された。例えば、ＣｈｓＦＡＴＢ３チオエステラーゼ（Ｓ３１５０
において最大３４％のＣ１４：０レベルの増加を生じさせる）をＳ５８１８に導入すると
、Ｃ１２：０レベルが約７７％に上昇し（Δ＝＋３２％のＣ１２：０）、Ｃ１４：０レベ
ルが約７％に降下する（Δ＝−７％）。加えて、ＣｐａｌＦＡＴＢ２をＳ５８１８のＤＡ
Ｏ１ｂ遺伝子座に導入すると、Ｃ１２：０レベルが約６４％に上昇し（Δ＝＋１９％）、
Ｃ１４：０レベルが約１２％に降下する（Δ＝−２％）。５つの構築物の各々に関する上
位５つの形質転換体の結果を表８３に示す。
留意すべきこととして、Ｓ５８１８はｐＬＯＯＰ遺伝子座からＣ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ
ＫＡＳＡ１遺伝子を発現する。Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉは６２％のＣ１２：０の種子油を産
生するため、本発明者らは、Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼと組み合わせたとき
Ｃ１２：０脂肪酸の産生に特異的となるようＣｗＫＡＳＡ１遺伝子が進化している可能性
が高いと考える。実際、Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ ＦＡＴＢ２は、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉ
ｓに導入したときにＣ１２：０活性を呈するチオエステラーゼをコードする。従って、本
発明者らのトランスクリプトーム配列決定で同定された「Ｃ１４：０」チオエステラーゼ
遺伝子、即ちＣｈｓＦＡＴＢ３及びＣｈｔＦＡＴＢ１ａは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ内
在性ＫＡＳＩ遺伝子と組み合わせたときに限りＣ１４：０活性を呈する可能性がある。こ
れらの結果はさらにＣｐａｌＦＡＴＢ２にまで及び、ＣｐａｌＦＡＴＢ２は、Ｐ．ｍｏｒ
ｉｆｏｒｍｉｓにおいてＣ１４：０レベルを増加させることが繰り返し示されている（デ
ータは示さず）。しかしながら、ＣｈｓＦＡＴＢ３、ＣｈｔＦＡＴＢ１ａ、及びＣｐａｌ
ＦＡＴＢ２を、高Ｃ１２：０脂肪酸を産生するＣｕｐｈｅａ種由来のＫＡＳＩ遺伝子、例
えばＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ由来のＣｗＫＡＳＡ１と組み合わせると、これらの
チオエステラーゼのＣ１２：０活性が明らかになる／示される。さらに、Ｃ．ｈｙｓｓｏ
ｐｉｆｏｌｉａ及びＣ．ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａは油糧種子において低レベルのＣ１４
：０のみを産生し（それぞれ５％及び４％）、一方で比較的高レベルのＣ１２：０を産生
する（それぞれ８４％及び４０％）ことに留意しなければならない。ＣｈｓＦＡＴＢ３及
びＣｈｔＦＡＴＢ１ａチオエステラーゼは成熟油糧種子で発現するＲＮＡから同定したた
め、これらのチオエステラーゼが実際にＣｕｐｈｅａ種子でＣ１２：０活性を呈し、そこ
で見られる高レベルのＣ１２：０に大きく寄与した可能性がある。
本発明者らの結果は、チオエステラーゼとＫＡＳとの組み合わせが、中鎖脂肪酸の生成
におけるチオエステラーゼ−ＫＡＳ機構の特異性の決定に極めて重要である可能性が高い
ことを示している。さらに、異種ＫＡＳの導入が、さらなる異種チオエステラーゼの新規
の特異性を明らかにするのに重要且つ有益な手法であり得る。
実施例６３：脂質産生と同期して油産生細胞における遺伝子発現レベルを条件的に制御す
る一組の調節可能なプロモーター
Δｆａｄ２系、Ｓ２５３２においてＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＦ
ＡＴＡ１の両方のコピー（ＰＭＦＡＴＡ１）をノックアウトし、同時に内在性ＰｍＫＡＳ
ＩＩ遺伝子を過剰発現させることによりＳ５２０４を作成した。Ｓ２５３２それ自体はＦ
ＡＤ２（ＦＡＤｃとしても知られる）二重ノックアウト株であり、先に、ＦＡＤ２遺伝子
座においてＣｒＴＵＢ２プロモーターの制御下でＣ．ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ ＡＣＰチオ
エステラーゼ（寄託番号ＡＡＡ３３０１９．１）をＳ１３３１に挿入することにより作成
された。Ｓ５２０４及びその親Ｓ２５３２は内在性ＰｍＦＡＤ２−１遺伝子の破壊を有す
るためΔ１２特異的デサチュラーゼ活性がなく、これはシード段階及び脂質産生段階の両
方で０％のＣ１８：２（リノール酸）レベルとして現れる。Ｓ５２０４（及びその親Ｓ２
５３２）にはＣ１８：２が全くないため成長不良となり、これはシード段階でリノール酸
を外因的に添加することによって部分的に軽減し得る。しかしながら、ゼロリノール酸油
の工業的応用には、リノール酸の外因的な添加はコストの増加を伴う。本発明者らは先に
、Ｓ５２０４（及び他のΔｆａｄ２株Ｓ２５３０及びＳ２５３２）をｐＨ誘導性ＡＭＴ０
３ｐ駆動ＰｍＦＡＤ２−１で補完することにより、いかなるリノール酸も補足することな
しにｐＨ７．０でＣ１８：２が野生型レベルに回復し、またシード段階の間の成長特性の
レスキューももたらされることを示している。さらに、続いてｐＨ７．０で成長させた補
完系のシードを、ｐＨが（ＡＭＴ０３駆動ＦＡＤ２タンパク質レベルを制御するため）５
．０に調整された低窒素脂質産生フラスコに移したとき、得られる最終的な油プロフィー
ルは親Ｓ５２０４又はＳ２５３２プロフィールと一致して、ゼロリノール酸レベルながら
成長及び生産性の尺度がレスキューされる。従って本質的にはＡＭＴ０３ｐ駆動ＦＡＤ２
−１によって、本発明者らは、所望の用途に応じた各種リノール酸レベルを有する油の作
成に使用し得る可能性のあるｐＨ調節可能な株を開発している。
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓは発酵槽において最初の２４〜３０時間
で急速な細胞分裂を起こした後、培地中の窒素を使い尽くし、細胞は脂質の貯蔵に切り換
わる。発酵槽におけるこの初期の細胞分裂及び成長は株の全体的な生産性に重要であり、
上記に報告したとおり、ＦＡＤ２タンパク質が、特定の株の持続的な力強い成長特性に決
定的である。しかしながら、第一世代、単一の挿入の、遺伝的にクリーンなＰｍＦＡＤ２
−１補完株（Ｓ４６９４及びＳ４６９５）のランを７Ｌ発酵槽においてｐＨ５．０で行っ
たとき（シードはｐＨ７．０で成長させた）、そのパフォーマンスは生産性の点で元の親
基本株（Ｓ１３３１）と同等ではなかった。ウエスタンデータから、発酵槽ではＰｍＦＡ
Ｄ２−１を駆動するＡＭＴ０３ｐプロモーターが（ＦＡＤ２タンパク質レベルによって測
定したとき）発酵槽のｐＨ（５．０又は７．０）に関係なく０〜３０時間の間に重度に下
方調節されることが示唆された。発酵条件を動かすと（バッチ式対非バッチ式／制限的な
初期Ｎ、産生期間中の種々の時点における７から５へのｐＨシフト）、初期脂質産生中の
窒素の最初のバッチ（及び過剰量）が、発酵槽におけるＡＭＴ０３ｐプロモーター下方調
節の原因である可能性が高かったことが示唆された。実際、ＡＭＴ０３のこの初期の抑制
は、発酵中の転写物の経時的変化に直接見ることができる。Ａｍｔ０３発現の大幅な抑制
がランの初期に観察されており、これは発酵槽中のＮＨ４レベルに直接対応する。
制限Ｎで発酵を実施したとき、本発明者らはＡＭＴ０３ｐプロモーター活性を部分的に
レスキューすることが可能であったとともに、Ｓ４６９４／Ｓ４６９５の細胞当たりの生
産性は親Ｓ１３３１と同等であったが、全体的な生産性はなおも遅れを取っていた。これ
らの結果から、最適以下の又は不活性なＡＭＴ０３ｐプロモーター、従って発酵初期段階
におけるＦＡＤ２タンパク質の制限によって、任意の補完株がその完全な成長能力及び全
体的生産性の達成を阻まれることが示唆される。ここで本発明者らは、高窒素成長期間と
低窒素脂質産生期間との間で示差的な遺伝子活性を可能にする新規の改良されたプロモー
ターを同定する。
詳細には、本発明者らは以下を観察した。
・トランスクリプトームベースのバイオインフォマティクス手法を用いて同定された下方
調節プロモーターエレメントの制御下におけるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍ
ｉｓ由来の脂肪酸デサチュラーゼ−２遺伝子（ＰｍＦａｄ２−１）のトランス発現では、
ＰｍＦＡＤ２−１の機能的補完がもたらされ、Δｆａｄ２、Δｆａｔａ１株Ｓ５２０４の
成長が回復する。
・ロバストな成長表現型として現れるＳ５２０４の補完は、シード段階及び初期発酵段階
において新規プロモーターエレメントが活性でＰｍＦＡＤ２−１の発現を駆動していると
きにのみ起こる。
・細胞が活性脂質産生期間に入ると（およそ発酵槽においてＮが使い尽くされた時点）、
新規に同定されたプロモーターは下方調節され、それ以上のＦＡＤ２タンパク質をもたら
さず、補完系の最終的な油プロフィールは、成長特性がより良好ではあるが、親Ｓ５２０
４と同じである。
・これらの株は、初期の補完株においてＡＭＴ０３ｐ駆動ＦＡＤ２で直面した問題を潜在
的に軽減するはずである。
・重要なことには、本発明者らは、様々な強さの下方調節可能なプロモーターを同定して
おり、そのうちのいくつかは初めは比較的強力で、ランの残りの間は低度乃至中程度のレ
ベルが提供される。従って、表現型に応じてこれらのプロモーターを選択し、所望の導入
遺伝子レベルを微調整することができる。
バイオインフォマティクス方法：典型的な発酵槽ランの間の８時点で採取した細胞から
ＲＮＡを調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑでのラン用にＲＮＡをポリＡ選択した
。Ｉｌｌｕｍｉｎａペアエンドデータ（１００ｂｐリード×２、約６００ｂｐ断片サイズ
）を収集し、ＦａｓｔＱＣ［ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ
．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／］を使用してリードクオリティについ
て処理した。リードのデュプリケートを除去し、クオリティトリミングし、及び長さをト
リミングするカスタムリード処理パイプラインを用いてリードをランにかけた。
Ｏａｓｅｓ／ｖｅｌｖｅｔ［Ｖｅｌｖｅｔ：ド・ブラングラフを使用したデノボショー
トリードアセンブルのためのアルゴリズム（Ｖｅｌｖｅｔ：ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏ
ｒ ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｕｓｉｎｇ ｄｅ Ｂ
ｒｕｉｊｎ ｇｒａｐｈｓ）．Ｄ．Ｒ．Ｚｅｒｂｉｎｏ ａｎｄ Ｅ．Ｂｉｒｎｅｙ．Ｇ
ｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８：８２１−８２９］を使用してＩｌｌｕｍｉｎａペ
アエンドリードから転写物をアセンブルし、Ｎ５０及び他の尺度で評価した。ＣＤ−Ｈｉ
ｔを使用して全８時点の転写物をさらに縮小（ｃｏｌｌａｐｓｅ）した。［Ｌｉｍｉｎ
Ｆｕ，Ｂｅｉｆａｎｇ Ｎｉｕ，Ｚｈｅｎｇｗｅｉ Ｚｈｕ，Ｓｉｔａｏ Ｗｕ ａｎｄ
Ｗｅｉｚｈｏｎｇ Ｌｉ，「ＣＤ−ＨＩＴ：次世代シーケンシングデータのクラスタリ
ングに向けて加速される（ＣＤ−ＨＩＴ：ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｆｏｒ ｃｌｕｓｔ
ｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔ
ａ）」．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，（２０１２），２８（２３）：３１５０−３１
５２．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｓ５６５；「Ｃｄ
−ｈｉｔ：大規模タンパク質又はヌクレオチド配列セットのクラスタリング及び比較のた
めの高速プログラム（Ｃｄ−ｈｉｔ：ａ ｆａｓｔ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｃｌｕｓ
ｔｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｌａｒｇｅ ｓｅｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅ
ｉｎ ｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」，Ｗｅｉｚｈｏｎｇ Ｌｉ
＆ Ａｄａｍ Ｇｏｄｚｉｋ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，（２００６）２２：１
６５８−９］。
これらの転写物を発現レベル解析の基本（参照アセンブリ）として使用した。ローリー
ドカウント並びに転写物百万分率（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ Ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ：
ＴＰＭ）で提供される正規化値を提供するＲＳＥＭを使用して８つの時点からのリードを
解析した。［Ｌｉ，Ｂｏ ＆ Ｄｅｗｅｙ，Ｃｏｌｉｎ Ｎ．（２０１１）．「ＲＳＥＭ
：参照ゲノム有り又は無しでのＲＮＡ−Ｓｅｑデータからの転写物定量化を加速させる（
ＲＳＥＭ：ａｃｃｕｒａｔｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｆｒｏｍ ＲＮＡ−Ｓｅｑ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ａ ｒｅｆｅ
ｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ）」，ＢｉｏＭｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ：Ｔｈｅ Ｏｐｅｎ Ａ
ｃｃｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ．ウェブサイトｗｗｗ．ｔｅｍｏａ．ｉｎｆｏ／ｎｏｄ
ｅ／４４１６１４のｔｅｍｏａ：Ｏｐｅｎ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ
ｓ（ＯＥＲ）Ｐｏｒｔａｌから２０１２年１０月１０日に検索］。ＴＰＭを使用して発現
レベルを決定した。先に強力なプロモーターのスクリーニングで同定された遺伝子もまた
使用して、どのレベルを有意に高い又は低いと見なすべきかを判断した。このデータをＰ
ｏｓｔｇｒｅｓデータベースにロードし、遺伝子機能及び他の特性、例えば発現プロファ
イルに基づく分類を含む統合データと共にＳｐｏｔｆｉｒｅで視覚化した。これにより、
発現が顕著に変化する遺伝子の迅速な且つ標的化した解析が可能となった。
本発明者らが選択した遺伝子用プロモーターを、Ｓ３７６（本発明者らの参照Ｐｒｏｔ
ｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株）のハイクオリティ参照ゲノムにマッピングした
。簡潔に言えば、ＰａｃＢｉｏロングリード（約２ｋｂ）をハイクオリティＰａｃＢｉｏ
ＣＣＳリード（約６００ｂｐ）によってエラー修正し、ＳＭＲＴＰｉｐｅ［ｐａｃｂｉ
ｏｄｅｖｎｅｔ．ｃｏｍ］のＡｌｌｏｒａアセンブラを使用してアセンブルした。この参
照ゲノムをトランスクリプトームリードマッピングと併せて使用して正確な遺伝子構造、
プロモーター及びＵＴＲ位置、及び目的領域内にあるプロモーターエレメントをアノテー
トし、次にはこれが、さらなる配列決定及びプロモーターエレメント選択をガイドした。
新規プロモーターエレメントを同定するために使用した基準は、以下であった。
１．シード段階及び初期脂質産生段階（Ｔ０〜Ｔ３０時間）における下流遺伝子の妥当な
発現（例えば、＞５００、＜１００、又は＜５０転写物百万分率［ＴＰＭ］）
２．発酵槽で窒素が枯渇したときの上記遺伝子の重度の下方調節（例えば、＞５倍、１０
倍、又は１５倍）。
３．プロモーターエレメントのｐＨ中立性（例えば、培養条件がｐＨ５．０から７．０に
移ったときのＴＰＭ変化が２倍未満）、又は少なくとも、ｐＨ５条件下での有効な作動。
上述の基準を用いて、本発明者らは、いくつかの潜在的に下方調節されるプロモーター
エレメントを同定し、最終的にＳ５２０４におけるＰｍＦＡＤ２−１発現の駆動にそれら
を使用した。種々のプロモーターを選択し、それらには、弱いプロモーターとして始まり
極端に低いレベルまで下がるものから、非常に高く始まってやや低いレベルまでしか落ち
ないものまでが含まれた。このようにしたのは、ロバストな成長を支持するために初期の
ＦＡＤ２にどの程度の発現が必要になるのか、及びゼロリノール酸表現型を達成するため
に脂質産生期間中に要求されるＦＡＤ２がどの程度の少なさであるのかが、先験的に不明
であったためである。
スクリーニングに選択したプロモーターエレメント及びそれらの対立形質は、それらの
下流遺伝子にちなんで命名し、以下のとおりである。
１．カルバモイルリン酸シンターゼ（ＰｍＣＰＳ１ｐ及びＰｍＣＰＳ２ｐ）
２．ジフチンシンターゼ（ｄｉｐｔｈｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）（ＰｍＤＰＳ１ｐ及び
ＰｍＤＰＳ２ｐ）
３．無機ピロホスファターゼ（ＰｍＩＰＰ１ｐ）
４．アデノシルホモシステイナーゼ（ＰｍＡＨＣ１ｐ及びＰｍＡＨＣ２ｐ）
５．ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ（ＰｍＰＰＩ１ｐ及びＰｍＰＰＩ
２ｐ）
６．ＧＭＰシンテターゼ（ＰｍＧＭＰＳ１ｐ及びＰｍＧＭＰＳ２ｐ）
７．グルタミン酸シンターゼ（ＰｍＧＳｐ）
８．クエン酸シンターゼ（ＰｍＣＳ１ｐ及びＰｍＣＳ２ｐ）
９．γグルタミルヒドロラーゼ（ＰｍＧＧＨ１ｐ）
１０．アセトヒドロキシ酸イソメラーゼ（ＰｍＡＨＩ１ｐ及びＰｍＡＨＩ２ｐ）
１１．システインエンドペプチダーゼ（ＰｍＣＥＰ１ｐ）
１２．脂肪酸デサチュラーゼ２（ＰｍＦＡＤ２−１ｐ及びＰｍＦａｄ２−２ｐ）［対照］
２つの代表的な遺伝子、即ちＰｍＩＰＰ（無機ピロホスファターゼ）及びＰｍＡＨＣ（
アデノシルホモシステイナーゼ）の転写物プロフィールは極めて強力に始まり（４０００
〜５０００ＴＰＭ）、しかし細胞が活性脂質産生に入ると、そのレベルは急速に下降する
。ＰｍＩＰＰの転写物レベルはほぼ０ＴＰＭまで下落するが、ＰｍＡＨＣのレベルは約２
５０ＴＰＭまで下落した後、残りの発酵にわたりそのまま留まる。他のプロモーターは全
て（それらの下流遺伝子転写物レベルに基づけば）、同様の下方発現プロファイルを示し
た。
エレメントをＰＣＲ増幅し、可能ならば対立遺伝子のプロモーターを同定し、クローニ
ングし、それに従い命名し、例えばカルバモイルリン酸シンターゼの２つの遺伝子のプロ
モーターエレメントはＰｍＣＰＳ１ｐ及びＰｍＣＰＳ２ｐと命名した。比較としてＰｍＦ
ＡＤ２−１及びＰｍＦＡＤ２−２のプロモーターエレメントもまた増幅し、ＰｍＦＡＤ２
−１遺伝子の駆動に使用した。一方、本例では、本発明者らはＦＡＤ２−１発現、従って
Ｃ１８：２レベルを使用して新規に同定される下方調節されるプロモーターを調べた（原
則的にこれらのプロモーターエレメントは任意の目的遺伝子の下方調節に使用することが
できる）。
Δｆａｄ２株Ｓ５２０４におけるＰｍＣＰＳ１ｐの発現下でのＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ
ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ脂肪酸デサチュラーゼ２（ＰｍＦＡＤ２−１）の発現に使用される
構築物−［ｐＳＺ３３７７］：Δｆａｄ２Δｆａｔａ１ Ｓ５２０４株を構築物ｐＳＺ３
３７７で形質転換した。この形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する。構築物ｐＳＺ３
３７７（６Ｓ：：ＰｍＨＸＴ１ｐ−ＳｃＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：：ＰｍＣＰＳ１ｐ−ＰｍＦ
ＡＤ２−１−ＣｖＮＲ：：６Ｓ）における関連する制限部位は、小文字、下線及び太字で
示され、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、Ｅｃｏ
ＲＶ、ＳｐｅＩ、ＡｆＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転
換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６Ｓ遺伝子座
での相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＵＴＥＸ １４
３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅメリビアーゼ（ＳｃＭＥＬ１）遺伝子の発現を駆動するＵＴＥ
Ｘ １４３５由来のヘキソース輸送体（ＨＸＴ１）遺伝子プロモーターは、囲い文字のテ
キストにより示す。ＳｃＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大
文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃ
ｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲは小文字の下線テキス
トにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈ
ｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＵＴＥＸ １４３５ ＣＰＳ１ｐプロモーターが続く。
ＰｍＦＡＤ２−１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、
太字のイタリックにより示し、一方、残りの遺伝子は太字のイタリックにより示す。Ｃ．
ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示
し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＵＴＥＸ １４３５ ６Ｓゲノム領
域が続く。正しいリーディングフレーム及び標的配列を確実にするため、最終構築物を配
列決定した。
ｐＳＺ３３７７に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：






構築物ｐＳＺ３３７７におけるＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲ間の
組換えはトランスジェニック系においてＰｍＦＡＤ２−１の複数のコピーをもたらし、次
にはこれが、最も高い可能性としては発酵終了時により高いＣ１８：２レベルとして現れ
得る。目標は０％最終Ｃ１８：２の株を作り出すことであったため、本発明者らはこの組
換えを回避する予防策を講じた。別のバージョンの上記プラスミドＳｃＭＥＬ１遺伝子は
、後ろにＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ３’ＵＴＲの代わりにＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔ
ｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ ２５０）伸長因子１ａ（ＣｐＥＦ１ａ）３’ＵＴＲが続い
た。構築物ｐＳＺ３３８４及びこの３’ＵＴＲを有する他の構築物（以下に記載される）
で使用されるＣ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ ２５０）伸長因子１ａ（Ｃ
ｐＥＦ１ａ）３’ＵＴＲの配列を以下に示す。プラスミドｐＳＺ３３８４は、６Ｓ：：Ｐ
ｍＨＸＴ１ｐ−ＳｃＭＥＬ１−ＣｐＥＦ１ａ：：ＰｍＣＰＳ１ｐ−ＰｍＦＡＤ２−１−Ｃ
ｖＮＲ：：６Ｓと表すことができる。
ｐＳＺ３３８４におけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ （ＵＴＥ
Ｘ ２５０）伸長因子１ａ （ＣｐＥＦ１ａ） ３’ＵＴＲのヌクレオチド配列：
Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ ２５０）伸長因子１ａ ３’ＵＴＲ配
列は、５’末端側に制限部位ＳｎａＢＩ及び３’末端側にＥｃｏＲＶ（小文字、太字の下
線テキストで示される）が隣接する。ＳｃＭＥＬ１終止コドンの後にＣｐＥＦ１ａ ３’
ＵＴＲを含むプラスミド（ｐＳＺ３３８４及び以下に記載する他のもの）は、５’Ｓｎａ
ＢＩ部位の前に１０個の追加的なヌクレオチドを含むことが注記される。これらのヌクレ
オチドは、Ｓ．ＳｃＭＥＬ１終止コドンの後にＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３
’ＵＴＲを含むプラスミドには存在しない。
上記に記載する組換えＣｖＮＲ−プロモーター−ＰｍＦＡＤ２−１−ＣｖＮＲ又は非組
換えＣｐＥＦ１ａ−プロモーター−ＰｍＦＡＤ２−１−ＣｖＮＲ発現ユニットのいずれか
を発現するプラスミドｐＳＺ３３７７及びｐＳＺ３３８４に加えて、上述の他のプロモー
ターエレメントを使用するプラスミドをＳ５２０４での発現用に構築した。これらの構築
物は、それらの形質転換識別名（Ｄ番号）と共に、以下のとおり記載することができる。
上記の構築物は、ＰｍＦＡＤ２−１を駆動するプロモーターエレメントを除き、ｐＳＺ
３３７７又はｐＳＺ３３８４と同じである。上記の構築物に使用した種々のプロモーター
エレメントの配列を以下に示す。
プラスミドｐＳＺ３３７８及びｐＳＺ３３８５に含まれるカルバモイルリン酸シンターゼ
対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＣＰＳ２ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３３７９及びｐＳＺ３３８６に含まれるジフチンシンターゼ（ｄｉｐｔ
ｈｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＤＰ
Ｓ１ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３３８０及びｐＳＺ３３８７に含まれるジフチンシンターゼ（ｄｉｐｔ
ｈｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＤＰ
Ｓ２ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３４８０及びｐＳＺ３４８１に含まれる無機ピロホスファターゼ対立遺
伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＩＰＰ１ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３５０９及びｐＳＺ３５１６に含まれるアデノシルホモシステイナーゼ
対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＡＨＣ１ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３５１０に含まれるアデノシルホモシステイナーゼ対立遺伝子２プロモ
ーターのヌクレオチド配列（ＰｍＡＨＣ２ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３５１３及びｐＳＺ３６８９に含まれるペプチジル−プロリルシス−ト
ランスイソメラーゼ対立遺伝子１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＰＰＩ１ｐプロ
モーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３５１４及びｐＳＺ３５１８に含まれるペプチジル−プロリルシス−ト
ランスイソメラーゼ対立遺伝子２プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＰＰＩ２ｐプロ
モーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３５１５及びｐＳＺ３５１９に含まれるＧＭＰシンテターゼ対立遺伝子
１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＧＭＰＳ１ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３５２０に含まれるＧＭＰシンテターゼ対立遺伝子２プロモーターのヌ
クレオチド配列（ＰｍＧＭＰＳ２ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３６８４及びｐＳＺ３６８６に含まれるクエン酸シンターゼ対立遺伝子
１プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＣＳ１ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３６８５に含まれるクエン酸シンターゼ対立遺伝子２プロモーターのヌ
クレオチド配列（ＰｍＣＳ２ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３６８８に含まれるγグルタミルヒドロラーゼ対立遺伝子１プロモータ
ーのヌクレオチド配列（ＰｍＧＧＨ１ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３５１７に含まれるアセトヒドロキシ酸イソメラーゼ対立遺伝子１プロ
モーターのヌクレオチド配列（ＰｍＡＨＩ１ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３５１１に含まれるアセトヒドロキシ酸イソメラーゼ対立遺伝子２プロ
モーターのヌクレオチド配列（ＰｍＡＨＩ２ｐプロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３５１２に含まれるシステインエンドペプチダーゼ対立遺伝子１プロモ
ーターのヌクレオチド配列（ＰｍＣＥＰ１プロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３３７５及び３３８２に含まれる脂肪酸デサチュラーゼ２対立遺伝子１
プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＦＡＤ２−１プロモーター配列）：
プラスミドｐＳＺ３３７６及び３３８３に含まれる脂肪酸デサチュラーゼ２対立遺伝子２
プロモーターのヌクレオチド配列（ＰｍＦＡＤ２−２プロモーター配列）：
上述の構築物が成長及び脂肪酸プロフィールに及ぼす影響を決定するため、それらの構
築物を独立にΔｆａｄ２Δｆａｔａ１株Ｓ５２０４に形質転換した。一次形質転換体をク
ローン精製し、標準的な脂質産生条件下、ｐＨ５．０又はｐＨ７．０で成長させた。形質
転換によって生じた一組の代表的なクローンから得られたプロフィールを、表８４〜表１
１４に示す。
野生型Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株（Ｓ３１５０、Ｓ１９２０又はＳ１３３１など）におけ
る内因性ＰｍＦＡＤ２−１及びＰｍＦＡＤ２−２の組み合わせベースライン発現は、５〜
７％のＣ１８：２として現れる。Ｓ５２０４はＰｍＫＡＳＩＩを過剰発現し、それにより
Ｃ１６：０からＣ１８：０への伸長がもたらされる。このＣ１８：０プールの増加は、最
終的にはＰｍＳＡＤ２によって不飽和化されるため、Ｃ１８：１レベルの上昇をもたらす
。さらにＳ５２０４におけるＰｍＦＡＤ２の両方のコピー（即ち、ＰｍＦＡＤ２−１及び
ＰｍＦＡＤ２−２）の破壊がＣ１８：１からＣ１８：２へのさらなる不飽和化を防止し、
０％リノール酸（Ｃ１８：２）のユニークな高オレイン酸油（Ｃ１８：１）をもたらす。
しかしながら、上述のとおり、０％Ｃ１８：２のどの株も成長が極めて悪く、成長／生産
性を維持するためにリノール酸の外因的な添加を必要とする。Ｓ５２０４などの株を誘導
性ＰｍＡＭＴ０３ｐによって駆動されるＰｍＦＡＤ２−１で補完すると、０％のＣ１８：
２レベルで最終的な高Ｃ１８：１を維持しながらも成長表現型をレスキューすることがで
きる。しかしながら、データは、発酵の初期段階でＰｍＡＭＴ０３が止まり、従って任意
の補完株がその完全な成長及び生産性の潜在的可能性を実現する能力が深刻に損なわれる
ことを示唆している。本研究の目標は、発酵の初期段階に（Ｔ０〜Ｔ３０時間；発酵槽中
の回分供給される過剰のＮとは関係なく）補完株の効率的な成長を可能にし、次に細胞が
活性脂質産生に入ると（培地中のＮが枯渇したとき）有効に止まり、従って補完株がなお
も極めて高いＣ１８：１及び０％のＣ１８：２レベルで終わり得るプロモーターエレメン
トを同定することであった。比較として、本発明者らはまた、ＰｍＦＡｄ２−１ｐ又はＰ
ｍＦＡＤ２−２ｐのいずれかのプロモーターエレメントによって駆動されるＰｍＦＡＤ２
−１でＳ５２０４を補完した。
ＰｍＦＡＤ２−１ｐ又はＰｍＦＡＤ２−２ｐのいずれかのプロモーターエレメントによ
って駆動されるＰｍＦＡＤ２−１によるＳ５２０４の補完は、ＰｍＦＡＤ２−１コピー数
を増幅するように設計されるか（例えばｐＳＺ３３７５又はｐＳＺ３３７６）、又はＰｍ
ＦＡＤ２−１コピー数が１つに制限されたもの（ｐＳＺ３３８２又はｐＳＺ３３８３）の
いずれかのベクターを使用すると、Ｃ１８：２レベルの完全な回復をもたらす。これらの
株におけるＰｍＦＡＤ２−１のコピー数が最終Ｃ１８：２レベルに及ぼす効果は極めてご
く僅かであるように見える。
他方で、新規プロモーターエレメントのいずれかによって駆動されるＰｍＦＡＤ２−１
の発現は、最終的なＣ１８：２レベルの顕著な減少をもたらす。ＦＡＤ２−１を駆動する
新規プロモーターを発現する様々な株の代表的なプロフィールを表８４〜表１１４に示す
。Ｃ１８：２レベルのこの低下は、ＰｍＦＡＤ２−１のコピー数が１つに制限されている
株ではなお一層明白である。ＰｍＤＰＳ１（Ｄ２０９１及びＤ２０９８）、ＰｍＤＰＳ２
（Ｄ２０９２及びＤ２０９９）、ＰｍＰＰＩ１（Ｄ２２６３及びＤ２４４０）、ＰｍＰＰ
Ｉ２（Ｄ２２６４及びＤ２２６８）、ＰｍＧＭＰＳ１（Ｄ２２６５及びＤ２２６９）、Ｐ
ｍＧＭＰＳ２（Ｄ２２７０）などのプロモーターエレメントは、単一コピー又は複数コピ
ーの両方のＰｍＦＡＤ２−１バージョンで０％又は０．５％未満の最終Ｃ１８：２レベル
の株をもたらした。残りのプロモーターは、１〜５％の範囲の最終Ｃ１８：２レベルをも
たらした。一つの予想外の結果は、Ｄ２４３４及びＤ２４３５におけるＰｍＦＡＤ２−１
を駆動するＰｍＡＨＣ１ｐ及びＰｍＡＨＣ２ｐからのデータであった。これらのプロモー
ターは両方ともに、複数コピーＦＡＤ２−１バージョンで極めて高いレベルのＣ１８：２
（９〜２０％）をもたらした。Ｄ２２６６における単一コピーバージョンでの最終Ｃ１８
：２レベルは、よりトランスクリプトームデータと合致し、窒素枯渇環境で細胞が活性化
して脂質を産生しているときにはＰｍＡＨＣプロモーター活性及び対応するＰｍＡＨＣ転
写が重度に下方調節されることが示唆される。トランスクリプトームを簡単に見ると、Ｐ
ｍＡＨＣの初期転写が極めて高く（４０００〜５５００ＴＰＭ）、次にはそれが約２５０
ＴＰＭまで急降下することが明らかになった。従って、ＰｍＦＡＤ２−１に複数のコピー
を有する株（Ｄ２４３４及びＤ２４３５）においては、発酵初期に産生された多量のＰｍ
ＦＡＤ２−１タンパク質が残存し、高いＣ１８：２レベルをもたらすことが考えられ得る
。単一コピーＰｍＦＡＤ２−１株ではこれは該当せず、従ってＤ２２６６においてはＣ１
８：２レベルの上昇は見られない。
０％の最終Ｃ１８：２レベルの補完株において、重要な問題は、それが最初の段階で補
完されたかどうかであった。これを確かめるため、代表的な株を親Ｓ５２０４株及び先に
ＡＭＴ０３ｐ駆動ＰｍＦＡＤ２−１で補完したＳ２５３２（即ちＳ４６９５）株と共に９
６ウェルブロックにおいてシード培地で成長させた。培養物は０．１ＯＤ単位毎ｍｌで播
種し、種々の時点でＯＤ７５０を確認した。成長が極めて悪かったＳ５２０４と比較して
、Ｓ４６９５及び新規に補完した株のみが２０時間及び４４時間で任意の意味のあるＯＤ
まで成長し（表１１５）、上記で同定されたプロモーターが初期に活性であり、細胞が活
性脂質産生期間に入るとオフになることが実証された。
ここで発見されたこれらのプロモーター、又はその変異体は、微細藻類細胞を含めた細
胞で発現する脂肪酸合成遺伝子（例えば、本明細書に開示されるＦＡＴＡ、ＦＡＴＢ、Ｓ
ＡＤ、ＦＡＤ２、ＫＡＳＩ／ＩＶ、ＫＡＳＩＩ、ＬＰＡＡＴ又はＫＣＳ遺伝子のいずれか
）又は他の遺伝子若しくは遺伝子抑制エレメントの調節に使用し得ることが企図される。
変異体は、ここに開示される配列と例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、
９５、９６、９７、９８、９９％又はそれ以上の同一性を有し得る。
実施例６４：ＳＯＳ濃度を増加させ、且つトリ飽和物を低下させるための高ＳＯＳ油の分
画
乾燥分画法及び溶媒分画法を用いて微細藻類油を分画した。出発物質は、ＳＯＳトリグ
リセリドが高い油であった。この油はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株Ｓ
７５６６から産生され、この株では内因性ＫＡＳＩＩ遺伝子がＳＡＤＩＩ遺伝子座に挿入
され（従ってそれをノックアウトする）；加えて、Ｇａｒｃｉｎｉａ ｍａｎｇｏｓｔａ
ｎａ由来のＣ１８選択的ＦＡＴＡ１遺伝子が挿入され、ＦＡＤＩＩヘアピンＲＮＡが産生
された（上記に記載したとおり）。培養及び抽出後、油は精製、漂白及び脱臭した。油の
脂肪酸プロフィールは表１１５に提供する。ＳＯＳ ＴＡＧ面積％は約６２％であった。
ＲＢＤ処理の間、油中の総トリ飽和物（即ち、ＳＳＳ、ＰＳＳ、ＰＰＳ、ＰＰＰ等、３つ
の完全飽和アシル鎖を有するトリグリセリド）は５．１％から１．２％に低下した。
溶媒（アセトン又はヘキサン）及び乾燥分画を用いて油を分画した。アセトン分画（１
：１油−溶媒、ｗ／ｗ；５℃で結晶化）は、ＳＯＳ高濃度化ステアリン画分の良好な回収
をもたらし、オレイン画分中のＳＯＳは比較的少なかった。ＳＯＳは７７％で、ステアリ
ン画分について総トリ飽和物＜１％であった。
ヘキサン分画（１：１油−溶媒、ｗ／ｗ；５℃で結晶化）は、より高レベル（８５％）
のＳＯＳをもたらし、しかしより高いトリ飽和物（１．６％）もまたもたらした。従って
、一段階溶媒分画を用いると、７５％超のＳＯＳ及び２％未満のトリ飽和物の油を得るこ
とが可能であった。
乾燥分画もまた、ＳＯＳの高濃度化及びトリ飽和物の低下に成功した。概略的な手法は
、高温での結晶化によってトリ飽和物を除去し、次に低温でＯＯＳを除去することであっ
た。逆の順序もまた試し、より優れた結果が得られた。また、ＳＯＳ高濃度化（「ステア
リン」）画分をアセトンでリンスすると、オレイン画分の除去の助けとなることも分かっ
た。
一つの試験では、油を２４℃で結晶化させ、ステアリン画分をアセトンでリンスした。
分析によれば、ＯＯＳレベルが低下したことが示された。ステアリン画分を加熱して放冷
し、２９℃で一晩結晶化させた。得られた液体油を結晶化したトリ飽和物と分離すると、
８４％のＳＯＳ及び＜０．５％の総トリ飽和物の生成物が得られた。リパーゼベースのｓ
ｎ−２プロフィール分析により、当該位置の９６％超を不飽和脂肪酸が占め（９３．３％
のオレイン酸、３．２％のリノール酸、及び０．２％のリノレン酸）、一方、そこに位置
するステアリン酸は僅か２．２％であったことが明らかになった。
二段階乾燥分画油のＤＳＣ加熱曲線サーモグラム及びＤＳＣで得られる固形脂肪含有量
曲線をコクムバターのものと比較した。２つの油は本質的に同一の最大ヒートフロー温度
を有し、ＤＳＣで得られるＳＦＣ曲線は重ね合わせることができる。油は機能上コクムバ
ターと同様の挙動を示すと予想し得る。
実施例６５：６０％超のＳＯＳ含有量の微生物油の生成
ここで、本発明者らは、微細藻Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおいて
、ＳＡＤ２遺伝子の対立遺伝子の破壊、ＫＡＳＩＩの過剰発現、内在性ＦＡＴＡ−１のノ
ックアウト、内在性ＦＡＴＡと比べてよりステアリン酸特異的なＦＡＴＡ（Ｇａｒｃｉｎ
ｉａ ｍａｎｇｏｓｔａｎａ由来のＧａｒｍＦＡＴＡ１）の過剰発現及びＦＡＤ２ ＲＮ
Ａｉの活性化により、本発明者らが構造化脂肪として有用な６０％超のＳＯＳを蓄積する
能力を有する株を作成することを実証する。
ＳＡＤ活性を低下させるため、ＳＡＤ２−１及びＳＡＤ２−２対立遺伝子において組み
換えられ、且つ選択可能なマーカーＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈｉａｌｉａｎａ ＴＨ
ＩＣ（ＡｔＴＨＩＣ、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓでの発現にコドン最適化されている）を
発現するように設計されたＤＮＡ構築物で株Ｓ３１５０を形質転換した。ＴＨＩＣは４−
アミノ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリミジンシンターゼをコードし、それによ
りチアミンの添加なしに成長することを可能にする。形質転換体は外因性チアミンの非存
在下で選択した。
ＳＡＤ２−１除去構築物ｐＳＺ２６０１を作製するため、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔ
ｈａｌｉａｎａ ＴＨＩＣ遺伝子（ＡｔＴＨＩＣ、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓでの発現に
コドン最適化されている）を形質転換の選択可能なマーカーとして利用した。形質転換Ｄ
ＮＡの配列は配列番号１４８に示される。関連する制限部位は小文字の太字で示され、５
’−３’にＢｓｐＱＩ、ＰｍｅＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱ
Ｉ及びＰｍｅＩである。構築物の５’及び３’隣接部の下線の配列は、ＳＡＤ２−１遺伝
子座における相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍ
ｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、ＡｔＴＨＩ
Ｃ遺伝子（４−アミノ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリミジンシンターゼ活性を
コードし、それにより外因性チアミンの非存在下での株の成長を可能にする）の発現を駆
動するＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＡＣＴプロモーター（Ｃｐ
ＡＣＴ）は、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＡｔＴＨＩＣのイニシエーターＡ
ＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小
文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（Ｃ
ｖＮＲ）遺伝子の３’ＵＴＲは、スモールキャピタルにより示す。
ｐＳＺ２６０１由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：




ＳＡＤ２−１破壊構築物、ｐＳＺ２６０７からの形質転換ＤＮＡの配列は、配列番号１
４９に示される。関連する制限部位は小文字の太字で示され、５’−３’にＰｍｅＩ、Ｋ
ｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩ及びＰｍｅＩである。構築物の５’
及び３’隣接部の下線の配列は、ＳＡＤ２−１遺伝子座における相同組換えによる形質転
換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮ
Ａを表す。５’から３’方向に進んで、ＡｔＴＨＩＣ遺伝子（４−アミノ−５−ヒドロキ
シメチル−２−メチルピリミジンシンターゼ活性をコードし、それにより外因性チアミン
の非存在下での株の成長を可能にする）の発現を駆動するＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔ
ｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＡＣＴプロモーター（ＣｐＡＣＴ）は、小文字、囲い文字のテキ
ストにより示す。ＡｔＴＨＩＣのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文
字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒ
ｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＣｖＮＲ）遺伝子の３’ＵＴＲは、スモ
ールキャピタルにより示す。
ｐＳＺ２６０７由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：




ＳＡＤ２−２破壊構築物、ｐＳＺ２６２２からの形質転換ＤＮＡの配列は、以下の配列
番号１５０に示される。関連する制限部位は小文字の太字で示され、５’−３’にＢｓｐ
ＱＩ、ＰｍｅＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩ及びＰｍｅＩで
ある。構築物の５’及び３’隣接部の下線の配列は、ＳＡＤ２−１遺伝子座における相同
組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉ
ｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、ＡｔＴＨＩＣ遺伝子（４−ア
ミノ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリミジンシンターゼ活性をコードし、それに
より外因性チアミンの非存在下での株の成長を可能にする）の発現を駆動するＣｈｌｏｒ
ｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＡＣＴプロモーター（ＣｐＡＣＴ）は、小文
字、囲い文字のテキストにより示す。ＡｔＴＨＩＣのイニシエーターＡＴＧ及びターミネ
ーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリック
で示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＣｖＮＲ）遺伝子の
３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。
ｐＳＺ２６２２由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：




それぞれｐＳＺ２６０１、ｐＳＺ２６０７及びｐＳＺ２６２２に由来する構築物Ｄ１５
５７、Ｄ１５６５及びＤ１５６６を、先述のとおりＳ３１５０に形質転換した。一次形質
転換体をクローン精製し、低窒素脂質産生条件下、ｐＨ５で成長させた。代表的なクロー
ンから得られた脂肪酸プロフィールを表１１７にまとめる。Ｄ１５５７及びＤ１５６５形
質転換体に由来するＳＡＤ２−１破壊株はＣ１８：１を代償に１３．４％のＣ１８：０を
蓄積したことから、これらの株でＳＡＤ活性が著しく低下したことが示される。ＳＡＤ２
−２破壊株ではＣ１８：０レベルは８．５％に増加したに過ぎなかったことから、ＳＡＤ
２−２の発現又は活性がＳＡＤ２−１より低かったことが示唆される。本発明者らはまた
、Ｃ１８：０が上昇した株においてＣ２０：０レベルが１．１％まで増加したことも観察
し、Ｃ１８：０が小胞体（ＥＲ）における脂肪酸伸長反応に有効なプライマーであったこ
とが実証された。
Ｃ１６：０を代償にしてＣ１８：０蓄積を増加させるため、本発明者らは、ＳＡＤ２−
１を除去すると同時にコドン最適化バージョンの内在性β−ケトアシル−ＡＣＰシンター
ゼＩＩ（ＰｍＫＡＳＩＩ）遺伝子を過剰発現するＤＮＡ構築物を作成した。ＳＡＤ２−１
除去、ＰｍＫＡＳＩＩ過剰発現構築物、ｐＳＺ２６２４からの形質転換ＤＮＡの配列は、
以下の配列番号１５１に示される。関連する制限部位は小文字の太字で示され、５’−３
’にＰｍｅＩ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、ＳａｃＩ、ＡｖｒＩＩ、ＥｃｏＲＶ、Ａ
ｆｌＩＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｓｐＱＩ及びＰｍｅＩである
。構築物の５’及び３’隣接部の下線の配列は、ＳＡＤ２−１遺伝子座における相同組換
えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由
来のゲノムＤＮＡを表す。ＳＡＤ２−１ ５’組み込み隣接部は内因性ＳＡＤ２−１プロ
モーターを含み、ＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子のインサイチューでの活性化を可能にした。５’
から３’方向に進んで、ＰｍＫＡＳＩＩプラスチド標的配列をコードする領域は、小文字
、下線のイタリックにより示す。成熟ＰｍＫＡＳＩＩポリペプチドをコードする配列は小
文字のイタリックで示され、一方、３ｘＦＬＡＧエピトープコード配列は太字のイタリッ
クである。ＰｍＫＡＳＩＩ−ＦＬＡＧのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡ
は大文字のイタリックにより示す。２つのスペーサー領域は小文字テキストにより表す。
ＡｔＴＨＩＣ遺伝子の発現を駆動するＣｐＡＣＴプロモーターは、小文字、囲い文字のテ
キストにより示す。ＡｔＴＨＩＣのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大
文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏ
ｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＣｖＮＲ）遺伝子の３’ＵＴＲはスモ
ールキャピタルにより示す。
ｐＳＺ２６２４由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：






本例の方法を用いて、ＫＡＳＩＩ、及びＧａｒｃｉｎｉａ ｍａｎｇｏｓｔａｎａ Ｆ
ＡＴＡを過剰発現させ、及び内在性ＳＡＤ、ＦＡＤ２、及びＦＡＴＡの発現を低下させる
ことにより、本発明者らは、５５％超のＳＯＳで、Ｓａｔ−Ｏ−Ｓａｔ（ここでＯはオレ
イン酸であり、Ｓａｔは任意の飽和脂肪酸である）が約７０〜７５％及びトリ飽和（ｔｒ
ｉｓａｔｕｒａｔａｔｅｄ）ＴＡＧが６．５％未満の油を産生したＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍ
ｉｓの株を作製した。
実施例６６：ＫＡＳＩＩ、ＦＡＴＡ及びＬＰＡＡＴ導入遺伝子を組み合わせることによる
ＳＯＳが高い油の生成
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおいて、本発明者らは、Ｐ．ｍｏｒｉ
ｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩを過剰発現させ、内在性ＳＡＤ２対立遺伝子をノックアウトし
、内在性ＦＡＴＡ対立遺伝子をノックアウトし、並びにＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ由
来のＬＰＡＡＴ及びＧａｒｃｉｎｉａ ｍａｎｇｏｓｔａｎａ由来のＦＡＴＡ遺伝子（「
ＧａｒｍＦＡＴ１」）の両方を過剰発現させた。得られた株は、５５％超のＳＯＳ、７０
％超のＳａｔ−Ｏ−Ｓａｔ、及び８％未満のトリ飽和ＴＡＧを有する油を産生した。
ＳＡＤ２部位における相同組換え用に設計されたフランキング領域を有する線状化プラ
スミドで基本株を形質転換した。上記の例にあるとおり、構築物はＳＡＤ２を除去し、Ｐ
．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩを過剰発現した。ＴｈｉＣ選択マーカーを使用した
。この株を、インベルターゼを選択マーカーとして使用する６Ｓ染色体部位における相同
組換えによって、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＳＡＳＤ１プラスチド標的ペプチドを有す
るＧａｒｍＦＡＴＡ１を過剰発現するように設計された構築物でさらに形質転換した。得
られた株は、約６２％のステアリン酸、６％のパルミチン酸、５％のリノール酸、４５％
のＳＯＳ及び２０％のトリ飽和物を有する油を産生した。
ＧａｒｍＦＡＴＡ１発現構築物（ｐＳＺ３２０４）からの形質転換ＤＮＡの配列は、以
下の配列番号１５２に示される。関連する制限部位は小文字の太字で示され、５’−３’
にＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｖｒＩＩ、ＥｃｏＲＶ、
ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＣｌａＩ、ＡｆｌＩＩ、ＳａｃＩ及びＢｓｐＱＩである。構築物の
５’及び３’隣接部の下線の配列は、６Ｓ遺伝子座における相同組換えによる形質転換Ｄ
ＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを
表す。５’から３’方向に進んで、株による外因性ショ糖の利用を可能にするＳａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＵＣ２（ＳｃＳＵＣ２）遺伝子の発現を駆
動するＣｒＴＵＢ２プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃＳＵ
Ｃ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示し
、一方、コード領域は小文字のイタリックにより表す。ＣｖＮＲ遺伝子の３’ＵＴＲはス
モールキャピタルにより示す。スペーサー領域は小文字テキストにより表す。キメラＣｐ
ＳＡＤ１ｔｐ＿ＧａｒｍＦＡＴＡ１＿ＦＬＡＧ遺伝子の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏ
ｒｍｉｓ ＳＡＤ２−２（ＰｍＳＡＤ２−２）プロモーターは、小文字、囲い文字のテキ
ストにより示す。イニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリック
により示す；ＣｐＳＡＤ１ｔｐをコードする配列は、小文字、下線のイタリックにより表
し；ＧａｒｍＦＡＴＡ１成熟ポリペプチドをコードする配列は、小文字のイタリックによ
り示し；及び３Ｘ ＦＬＡＧエピトープタグは、大文字、太字のイタリックにより表す。
第２のＣｖＮＲ ３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。
ｐＳＺ３２０４由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：






得られた株を、内在性ＦＡＴＡで組み換えられ（及びそれによりそれを破壊し）、また
ＵＡＰＡ１プロモーターの制御下でＢ．ｎａｐｕｓ由来のＬＰＡＡＴも発現するように設
計された構築物で、且つメリビオース（ｍｅｌｂｉｏｓｅ）での選択を伴う選択可能なマ
ーカーとしてαガラクトシダーゼを使用して、さらに形質転換した。得られた株は、ＳＯ
Ｓ（約５７〜６０％）及びＳａｔ−Ｏ−Ｓａｔ（約７０〜７６％）の産生の増加及びトリ
飽和物量（４．８〜７．６％）の減少を示した。
本発明者らがＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ＬＰＡＴ２（Ｂｎ１．１３）遺伝子及び
ＰｍＦＡＤ２ｈｐＡ ＲＮＡｉ構築物の両方をＦＡＴＡ−１遺伝子座に標的化することに
よってＳＯＳ産生を最大化し且つトリ飽和ＴＡＧの形成を最小化した高Ｃ１８：０ Ｓ６
５７３バックグラウンドで、株を作成した。ＰｍＦＡＤ２ｈｐＡ発現構築物ｐＳＺ４１６
４からの形質転換ＤＮＡの配列は、以下の配列番号１５３に示される。関連する制限部位
は小文字の太字で示され、５’−３’にＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、
ＢａｍＨＩ、ＮｄｅＩ、ＮｓｉＩ、ＡｆｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｉＷＩ、Ｘ
ｈｏＩ、ＳａｃＩ及びＢｓｐＱＩである。構築物の５’及び３’隣接部の下線の配列は、
ＦＡＴＡ−１遺伝子座における相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを
可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進
んで、株による外因性メリビオースの利用を可能にするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＭＥＬ１（ＳｃａｒＭＥＬ１）遺伝子の発現を駆動するＰｍ
ＨＸＴ１プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃａｒＭＥＬ１の
イニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示し、一方
、コード領域は小文字のイタリックにより表す。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＰＧＫ遺伝
子の３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。スペーサー領域は小文字テキストによ
り表す。ＢｎＬＰＡＴ２（Ｂｎ１．１３）遺伝子の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍ
ｉｓ ＵＡＰＡ１プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。イニシエー
ターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示す；ＢｎＬＰＡＴ２
（Ｂｎ１．１３）をコードする配列は、小文字、下線のイタリックにより表す。ＣｖＮＲ
遺伝子の３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。第２のスペーサー領域は小文字テ
キストにより表す。ＰｍＦＡＤ２ｈｐＡヘアピン配列の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａ
ｒｄｔｉｉ ＣｒＴＵＢ２プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。フ
ォワード方向のＦＡＤ２エクソン１配列は小文字のイタリックで示し；ＦＡＤ２イントロ
ン１配列は小文字、太字のイタリックで表し；ショートリンカー領域は小文字テキストで
示し、及び逆方向のＦＡＤ２エクソン１配列は小文字、下線のイタリックで示す。第２の
ＣｖＮＲ ３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。
ｐＳＺ４１６４由来の形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列：






本発明の記載される実施形態は単に例示を目的としているに過ぎず、当業者には数多く
の変形例及び改良例が明らかであろう。かかる変形例及び改良例は全て、本発明の範囲内
に含まれることが意図される。例えば、様々なトリグリセリド油を、油又は油から作られ
た化学品の極性、溶解性、及び泡高さなどのパラメータを適合させるように中鎖及び長鎖
脂肪酸の混合物に調整することができる。加えて、遺伝子のノックアウトが求められる場
合、突然変異及びＲＮＡｉ又はアンチセンスなどの阻害性物質の発現を含めたノックダウ
ン技術を用いて同等の結果を達成し得る。
関連する実施形態において、細胞はタイプ（ｉｉ）のものであり、且つ配列番号１１、８７、８９、１５９、１６２又は１６３のいずれかと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％の核酸配列同一性を有するタンパク質を任意選択でコードする第２のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を少なくとも含む。油は少なくとも３０％のＣ１０：０及び少なくとも３０％のＣ１２：０を有し得る。油はＡＳＴＭ Ｄ４４５によって測定したとき４０℃で３０ｃＳ未満及び任意選択で２５ｃＳ±２０％の粘度を有し得る。Ｃ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸は２０％、１０％又は５％以内にバランスしていてもよい。

別の実施形態において、方法は、油産生細胞、任意選択で微細藻を培養する工程を含み、それにより細胞は、１０％未満のパルミチン酸、８５％超のオレイン酸を有する油を産生する。任意選択で、細胞は、ＦＡＤ及びＦＡＴＡノックアウトを有する微細藻であり、外来性ＫＡＳＩＩ遺伝子を発現する。

関連する実施形態において、方法は、油産生細胞、任意選択で微細藻を培養する工程を含み、それにより細胞は、ラウリン酸とミリスチン酸との合計が少なくとも５０％であり；総飽和脂肪酸が少なくとも５０％であり、且つカプリン酸及びラウリン脂肪酸レベルが２０％以内にバランスしており；又はカプリン酸が少なくとも４５％であり、且つラウリン酸が少なくとも４５％である脂肪酸プロフィールを有する油を産生する。具体的な関連実施形態において、ラウリン酸とミリスチン酸との合計は少なくとも６０％、７０％又は７５％である。任意選択で、細胞は外来性植物ＦＡＴＢ遺伝子を含む。任意選択で、細胞は外来性ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ遺伝子を含む。

別の態様において、本発明は、配列番号９０若しくは９１と少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％のヌクレオチド同一性又は遺伝子コードの縮重に起因して等価な配列を有するか、或いは配列番号９０又は９１と少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％のアミノ酸同一性を有する酵素をコードするＦＡＴＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を含む組換え細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ＦＡＴＢ遺伝子の発現に起因して脂肪酸プロフィールがシフトしているトリグリセリドを産生する。

油産生細胞は、任意選択で、バイオリアクター／発酵槽で培養されてもよい。例えば、従属栄養油産生微細藻類細胞は、糖含有栄養ブロスで培養することができる。任意選択で、培養は二段階：シード段階及び脂質産生段階で進めることができる。シード段階では、細胞数がスターター培養物から増加する。従って、シード段階は、典型的には、急速な細胞分裂を促進するように設計された栄養リッチな窒素充満培地を含む。シード段階後、栄養制限（例えば窒素希薄）条件下で細胞に糖が供給されてもよく、これにより糖がトリグリセリドに変換されることになる。例えば、脂質産生段階における細胞分裂速度はシード段階と比べて５０％、８０％以上低下し得る。加えて、シード段階と脂質産生段階との間での培地の変動によって組換え細胞が誘導され、異なる脂質合成遺伝子が発現することにより、産生されるトリグリセリドが変化し得る。例えば、以下で考察するとおり、内在性又は外来性遺伝子の前に窒素感受性及び／又はｐＨ感受性プロモーターを置くことができる。これは、シード段階における細胞の最適成長を支持しない脂質産生段階で油が産生されるべきである場合に特に有用である。以下の例では、細胞は脂肪酸デサチュラーゼをｐＨ感受性プロモーターと共に有し、従って脂質産生段階ではリノール酸が低い油が産生される一方、シード段階中には細胞分裂に十分なリノール酸を有する油が産生される。得られる低リノール酸油は酸化安定性が極めて高い。

これらの油はまた、細胞分裂期間中はリノール酸を産生する細胞機構を用いることにより、しかし脂質産生期間中はリノール酸を減らして又はそれなしに、リノール酸を培養物に補足する必要なしに（又はその必要性を低減して）生成することができる。リノール酸を産生する細胞機構は、油産生期間中に産生するリノール酸が実質的に少なくなるように調節可能であり得る。この調節は、１つ又は複数のデサチュラーゼ遺伝子の転写調節か又は阻害物質の産生の調節（例えば、調節されたヘアピンＲＮＡ／ＲＮＡｉ産生）を介し得る。例えば、脂肪酸Δ１２デサチュラーゼ活性の大部分、好ましくは全てを、細胞分裂期間はデサチュラーゼを発現するが油蓄積期間中はそれが低下し又は消失するように調節された調節可能なプロモーター下に置くことができる。この調節は、本明細書の例に記載されるとおり、ｐＨ、及び／又は窒素濃度などの細胞培養条件、又は他の環境条件と関係付けることができる。実際には、条件は、物質（例えば、酸又は塩基の添加によるプロトン）を添加若しくは除去するか、又は細胞に物質（例えば、窒素供給栄養素）を消費させて、デサチュラーゼ活性の調節に所望の切り替えを生じさせることにより操作され得る。

かかる低レベルの多価不飽和物を有することの一つの帰結は、油が酸化に対して極めて安定することである。実際、ある場合に油は、これまでに知られているどの細胞油と比べても高い安定性を有し得る。特定の実施形態では、油は抗酸化剤の添加なしに、１１０℃で、ＡＯＣＳ Ｃｄ １２ｂ−９２．ランシマット試験条件下１０時間、１５時間、２０時間、３０時間、４０時間、５０時間、６０時間、又は７０時間までに未だ電気伝導度の変曲点に達しない安定性を有する。極めて安定した油について、かかる試験では、かかる長い試験期間により蒸発が起こるため、水の補充が必要となり得ることが注記される（実施例５を参照のこと）。例えば油は、抗酸化剤の添加なしに１１０℃で４０〜５０時間又は４１〜４６時間のＯＳＩ値を有し得る。抗酸化剤（食品に好適なもの等）が添加される場合、計測されるＯＳＩ値はさらに高くなり得る。例えば、トコフェロール（１００ｐｐｍ）及びパルミチン酸アスコルビル（５００ｐｐｍ）又はＰＡＮＡ及びパルミチン酸アスコルビルを添加すると、かかる油は、ランシマット試験により計測したとき、１１０℃で１００又は２００時間を超える酸化安定性指数（ＯＳＩ値）を有し得る。別の例において、１０５０ｐｐｍの混合トコフェロール及び５００ｐｍのパルミチン酸アスコルビルを、１％未満のリノール酸又は１％未満のリノール酸＋リノレン酸を含む油に添加する；結果として、この油は１１０℃で１、２、３、４、５、６、７、８、又は９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６、２０、３０、４０又は５０日、５〜１５日、６〜１４日、７〜１３日、８〜１２日、９〜１１日、約１０日、又は約２０日間安定である。油はまた、１３０℃で１、２、３、４、５、６、７、８、又は９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６、２０、３０、４０又は５０日、５〜１５日、６〜１４日、７〜１３日、８〜１２日、９〜１１日、約１０日、又は約２０日間安定であり得る。特定の例では、かかる油は、１００時間を超えて（観察時約１２８時間）安定であることが認められた。さらなる実施形態において、抗酸化剤を添加しない細胞油の１２０℃でのＯＳＩ値は１５時間又は２０時間より長く、又は１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、又は２５〜５０時間、又は５０〜１００時間の範囲である。

場合により、細胞は、単独の改変として、或いはステアリン酸を増加させる他の１つ以上の遺伝子改変との組み合わせで、外因性ステアリン酸遊離アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを含み得る。例えば、細胞が、Ｃ１８：０−ＡＣＰの切断に選択性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを過剰発現するように操作されてもよい。実施例９は、微細藻類、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ １４３５）の脂肪酸プロフィールにおいてステアリン酸を約３．７％から約３０．４％（８倍超）に増加させる外因性Ｃ１８：０選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現について記載する。実施例４１は、ＰｒｏｔｏｔｈｅｃａにおいてＣ１８：０レベルを上昇させる働きをするＣ１８：０選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのさらなる例を提供する。任意選択で、ステアリン酸選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子は、実施例９又は実施例４１の遺伝子産物（配列番号２８、６５、６７、６９、７１、７３、又は７５（存在する場合にＦＬＡＧタグを除く））と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％のアミノ酸同一性を有する酵素をコードする。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの導入は、１つ以上の内在性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ対立遺伝子のノックアウト又はノックダウンと組み合わせることができる。チオエステラーゼの導入はまた、エロンガーゼ（ＫＣＳ）又はβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの過剰発現と組み合わせることもできる。加えて、１つ以上の外来遺伝子（例えば、ＳＡＤ又はＫＡＳＩＩをコードするもの）を、環境条件によって（例えば、調節可能なプロモーターと作動可能に連結した状態に置くことにより）調節してもよい。特定の例では、ｐＨ及び／又は窒素濃度を用いてａｍｔ０３プロモーターを調節する。次に環境条件を調整することにより、細胞トリグリセリド中に現れるステアリン酸の所望の量を（例えばオレイン酸濃度の２倍となるよう）産生するように細胞が調整され得る。これらの操作の結果として、細胞は少なくとも５、１０、１５、又は２０倍のステアリン酸の増加を呈し得る。

いくつかある発見の中でも特に、上記の考察及び以下の実施例は、微生物又は植物において一般に高Ｓａｔ−Ｕｎｓａｔ−Ｓａｔ油及び詳細にはＳＯＳ油を得るための特定の経路を強調する。従って、遺伝子工学技術を任意選択で古典的な突然変異誘発及び育種と組み合わせて用いることにより、出発株と比べて少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、又はそれ以上のＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ又はＳＯＳ産生量の増加を有する微細藻又は高等植物を作製し得る可能性がある。別の態様では、野生型が２０％、３０％、４０％又は５０％未満のＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ又はＳＯＳを産生する種のＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ又はＳＯＳ濃度を増加させることで、ＳａｔＵｎｓａｔＳａｔ又はＳＯＳをそれぞれ少なくとも３０％、４０％、５０％又は６０％まで増加させることができる。出発又は野生型生物と比べた主な変化は、ステアリン酸量の増加（例えば、ステアリン酸から形成されるオレイン酸の量が例えばＳＡＤ活性の低下によって低下することによる、及び／又はステアリン酸に変換されるパルミチン酸の量がＦＡＴＡの活性の低下及び／又はＫＡＳＩＩの活性の増加によって増加することによる、及びＦＡＤ２／ＦＡＤｃ活性の低下によってリノール酸の量が減少することによる）することである。

ＶＩＩＩ．高中鎖油
本発明の実施形態において、細胞は、細胞中又は細胞の油中の中鎖脂肪酸（例えば、Ｃ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、又はＣ１６：０脂肪酸）のレベルを上昇させる働きをする組換え核酸を有する。細胞中又は細胞の油中の中鎖脂肪酸のレベルを増加させる一つの方法は、単独の改変として、或いは１つ以上の他の遺伝子改変との組み合わせで、中鎖脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して活性を有する外因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＦａｔＢ遺伝子によりコードされるもの）を発現するように細胞を操作することである。細胞又は細胞の油中の中鎖脂肪酸レベルを増加させるさらなる遺伝子改変は、置換アシルグリセロエステルのｓｎ−２位への中鎖脂肪酸アシル基の転移を触媒する活性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする外来性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現である。例えば、ＬＰＡＡＴ遺伝子は、実施例４３〜４４に開示される中鎖選択的ＬＰＡＡＴ（配列番号７７、７８、７９、８１、８２、８４、及び８５）と７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％のアミノ酸配列同一性を有し、又は７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の核酸配列同一性（又は遺伝子コードの縮重に起因して等価な配列）を有し得る。特定の関連する実施形態では、外因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びＬＰＡＡＴの両方が細胞で安定に発現する。ある実施形態では、組換え核酸は、外因性中鎖特異的チオエステラーゼ、及び置換アシルグリセロエステルのｓｎ−２位への中鎖脂肪酸アシル基の転移を触媒する外因性ＬＰＡＡＴの発現を生じさせる油産生細胞に（特にプラスチド微生物細胞に）導入される。結果として、細胞は、それが産生するＴＡＧ中の中鎖脂肪酸の割合が１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０倍、又はそれを超えて増加するように作られ得る。外因性ＬＰＡＡＴを導入すると、外来性中鎖選択的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを単独で導入するのと比較して、ｓｎ−２位における中鎖脂肪酸が１．２、１．５、１．７、２、３、４倍又はそれを超えて増加し得る。ある実施形態では、中鎖脂肪酸は、細胞によって産生されるＴＡＧ脂肪酸の３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％超である。様々な実施形態において、中鎖脂肪酸は、ラウリン酸、ミリスチン酸、又はパルミチン酸である。実施例３、４３、及び４４は、脂肪酸プロフィールの変化をもたらす微細藻類細胞における植物ＬＰＡＡＴの発現を記載する。これらの例にあるとおり、細胞はまた、外因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（これもまた植物由来であってよい）も、所与の脂肪酸アシル−ＡＣＰ鎖長に対する選択性を伴い発現し得る。例えば、微細藻類細胞は、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ８〜Ｃ１２、又はＣ８〜Ｃ１０脂肪酸を選択的に切断するＬＰＡＡＴ及びアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子を含み得る。特定の実施形態において、かかる細胞は、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、又は９０〜９９％、＞２０％、＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％又は＞９０％のＣ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ８〜Ｃ１２、又はＣ８〜Ｃ１０脂肪酸を含む脂肪酸プロフィールの細胞油を産生する能力を有する。他のＬＰＡＡＴは、Ｃ１６又はＣ１８脂肪酸を選択的に切断し得る（実施例４４を参照のこと）。脂肪酸デサチュラーゼ経路のさらなる遺伝子操作（例えば、以下に記載するとおり）により、油の安定性を増加させることができる。

特定の実施形態において、組換え細胞は、置換アシルグリセロエステルのｓｎ−２位への中鎖脂肪酸アシル基の転移を触媒するリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸と、ＡＣＰからの中鎖脂肪酸の切断を触媒する活性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸とを含む。結果として、一実施形態において、産生される油は、組換え核酸の結果としてＣ１０及びＣ１２脂肪酸が上昇し、且つＣ１６、Ｃ１８、及びＣ１８：１脂肪酸が低下した脂肪酸プロフィールにより特徴付けられ得る。実施例３を参照されたく、ここではＣｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びＣｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ ＬＰＡＡＴ遺伝子の過剰発現によりＣ１２脂肪酸の割合が非形質転換細胞における約０．０４％から約４６％に増加し、Ｃ１０脂肪酸の割合が非形質転換細胞における約０．０１％から約１１％に増加した。例えば、ＦＡＴＢ遺伝子は、配列番号１０又は１１と７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％のアミノ酸配列同一性を有し、又は７５、８０、８５ ９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の核酸配列同一性（又は遺伝子コードの縮重に起因して等価な配列）を有し得る。関連する実施形態では、中鎖脂肪酸産生の増加は７０％より大きく、７５〜８５％、７０〜９０％、９０〜２００％、２００〜３００％、３００〜４００％、４００〜５００％、又は５００％より大きい。

高オレイン酸高安定性油産生株ＡＱ：ＰｍＦＡＤ２の下方調節に使用される構築物の作成。高い酸化安定性の油を産生する株を作成するため、ＡＰにヘアピンＰｍＦＡＤ２を導入してＰｍＦＡＤ２発現を下方調節した。株ＡＱは、ｐＳＺ３３７２ ＤＮＡ（６ＳＡ：：ＰｍＨＸＴ１：ＳｃａｒＭＥＬ１：ＣｖＮＲ：：ＣｒＴＵＢ２：ヘアピンＰｍＦＡＤ２：ＣｖＮＲ：：６ＳＢ）を株ＡＰに形質転換することによって作成される安定系である。この構築物では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＭＥＬ１遺伝子を選択可能なマーカーとして利用して、以前記載された形質転換方法（遺伝子銃）を用いる相同組換えによってヘアピンＰｍＦＡＤ２をＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株ＡＱの６Ｓ核染色体座に導入した。

ｐＳＺ３３７２形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する。ｐＳＺ３３７２における関連する制限部位は、小文字、太字及び下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、Ｋｐｎ Ｉ、ＳｐｅＩ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６Ｓ遺伝子座での相同組換えによる標的化した組み込みを可能にする６ＳＡゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＭＥＬ１遺伝子の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＨＸＴ１プロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃａｒＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ β−チューブリンプロモーターが続く。ヘアピンＰｍＦＡＤ２カセットは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＦＡＤ２エクソン１（イタリックの下線テキストにより示される）、ＰｍＦＡＤ２のイントロン（イタリックの小文字テキスト）と、続いて逆位ＰｍＦＡＤ２エクソン１（イタリックの下線テキストにより示される）を含む。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される６ＳＢゲノム領域が続く。

実施例５８：Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＰＭ）ＦＡＤ２及びＦＡＴＡ遺伝子のノックアウト並びにＰｍＫＡＳＩＩ遺伝子の過剰発現による高オレイン酸「ゼロ」リノール酸株の作成 微細藻類のトリアシルグリセロールは、内在性ＦＡＴＡ１及びＦＡＤｃ遺伝子の下方調節並びに内在性ＫＡＳＩＩ活性の過剰発現などの分子遺伝学的手法を利用してオレイン酸（Ｃ１８：１）のレベルを大幅に高濃度化することができる。この例では、本発明者らは、これらの手法を単一のトランスジェニック系に組み合わせる試みに注力する。ＦＡＴＡ１対立遺伝子の単一コピーを破壊すると同時にＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＫＡＳＩＩ遺伝子を過剰発現する構築物を、株Ｒ及び株Ｄと命名される種々のΔｆａｄ２系に導入した（図２４の系統図を参照）。得られた株、例えば株ＡＳ及び株ＡＺは、＜０．０５％のＣ１８：２で約９０％のＣ１８：１を産生する。

Δｆａｄ２株の株ＡＳ及び株ＺにおけるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ脂肪酸デサチュラーゼ２（ＰｍＦＡＤ２−１）の発現に使用される構築物−［ｐＳＺ２７２１］。Δｆａｄ２Δｆａｔａ１株ＡＳ及び株Ｚを構築物ｐＳＺ２７２１で形質転換した。形質転換ＤＮＡの配列は、以下に提供する。構築物ｐＳＺ２７２１（６Ｓ：：ＣｐＡＣＴ−ＳｃＭＥＬ１−ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ３−ＰｍＦＡＤ２−１−ＣｖＮＲ：：６Ｓ）における関連する制限部位は、小文字、下線及び太字で示され、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ １、ＫｐｎＩ、Ｘｂａ Ｉ、Ｍｆｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＢｓｐＱ Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。太字で小文字の配列は、６Ｓ遺伝子座での相同組換えによるＰｍＦＡＤ２−１の標的化した組み込みを可能にするＵＴＥＸ １４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＥＬ１遺伝子の発現を駆動するＵＴＥＸ ２５０由来のアクチン（ＡＣＴ）遺伝子プロモーターは、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲは小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内因性ＡＭＴ０３プロモーターが続く。ＰｍＦＡＤ２−１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りの遺伝子は太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるＵＴＥＸ １４３５ ６Ｓゲノム領域が続く。正しいリーディングフレーム及び標的配列を確実にするため、最終構築物を配列決定した。

ｐＳＺ３３９０： ｐＳＺ３３９０は、ＤＡＯ１ｂ：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭｅｌ１−ＣｖＮＲ：ＰｍＵＡＰＡ１ｎｏＳａｃＩ−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＦＬＡＧＥｘｔＡ−ＣｖＮＲ：：ＤＡＯ１ｂとして表すことができる。構築物における関連する制限部位、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩは、小文字、太字、及び下線で示される。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。構築物の５’末端及び３’末端における太字で小文字の配列は、ＤＡＯ１ｂ遺伝子座への相同組換えによる組み込みを標的化するＵＴＥＸ １４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、選択カセットは、Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＭＥＬ１遺伝子（メリビオースで成長する能力を付与する）の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＨＸＴ１プロモーター及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを有する。プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃａｒＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは太字、大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。３’ＵＴＲは、小文字、下線のテキストにより示す。異種Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＳＡＤ１プラスチド標的トランジットペプチドに融合した、ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＦＬＡＧＥｘｔＡ遺伝子を含む第２のカセットは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＡＰＡ１ ｐＨ５応答性プロモーターによって駆動され、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを有する。このカセットでは、ＵＡＰＡ１プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＦＬＡＧＥｘｔＡ遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは、太字、大文字のイタリックで示し、一方、コード領域は小文字のイタリックにより示す。３’ＵＴＲは、小文字、下線のテキストにより示す。

ｐＳＺ３４９３構築物における関連する制限部位、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩは、小文字、太字、及び下線で示される。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。構築物の５’末端及び３’末端における太字で小文字の配列は、ＤＡＯ１ｂ遺伝子座への相同組換えによる組み込みを標的化するＵＴＥＸ １４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、選択カセットは、Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＭＥＬ１遺伝子（メリビオースで成長する能力を付与する）の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＨＸＴ１プロモーター及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを有する。プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃａｒＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは太字、大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。３’ＵＴＲは、小文字、下線のテキストにより示す。第２のカセットは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＡＭＴ３ ｐＨ７応答性プロモーターによって駆動されるＣｈｓＦＡＴＢ３遺伝子を含み、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを有する。このカセットでは、ＡＭＴ３プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＣｈｓＦＡＴＢ３遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは、太字、大文字のイタリックで示し、一方、コード領域は小文字のイタリックにより示す。３’ＵＴＲは、小文字、下線のテキストにより示す。

ｐＳＺ３５３１：ｐＳＺ３５３１は、ＴＨＩ４Ａ：：ＰｍＨＸＴ１−ＳｃａｒＭｅｌ１−ＣｐＥＦ１ａ：ＰｍＵＡＰＡ１ｎｏＳａｃＩ−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＦＬＡＧＥｘｔＡ−ＣｖＮＲ：：ＴＨＩ４Ａとして表すことができる。この構築物に関連する制限部位、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩは、小文字、太字、及び下線で示される。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端の境界を定める。構築物の５’末端及び３’末端における太字で小文字の配列は、ＴＨＩ４Ａ遺伝子座への相同組換えによる組み込みを標的化するＵＴＥＸ １４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、選択カセットは、Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＭＥＬ１遺伝子（メリビオースで成長する能力を付与する）の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＨＸＴ１プロモーター及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＥＦ１Ａ遺伝子３’ＵＴＲを有する。プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃａｒＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは太字、大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。３’ＵＴＲは、小文字、下線のテキストにより示す。異種Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ ＳＡＤ１プラスチド標的トランジットペプチドに融合した、ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＦＬＡＧＥｘｔＡ遺伝子を含む第２のカセットは、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＡＰＡ１ ｐＨ５応答性プロモーターによって駆動され、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを有する。このカセットでは、ＵＡＰＡ１プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＦＬＡＧＥｘｔＡ遺伝子のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは、太字、大文字のイタリックで示し、一方、コード領域は小文字のイタリックにより示す。３’ＵＴＲは、小文字、下線のテキストにより示す。





本発明者らがＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ＬＰＡＴ２（Ｂｎ１．１３）遺伝子及びＰｍＦＡＤ２ｈｐＡ ＲＮＡｉ構築物の両方をＦＡＴＡ−１遺伝子座に標的化することによってＳＯＳ産生を最大化し且つトリ飽和ＴＡＧの形成を最小化した高Ｃ１８：０ Ｓ６５７３バックグラウンドで、株を作成した。ＰｍＦＡＤ２ｈｐＡ発現構築物ｐＳＺ４１６４からの形質転換ＤＮＡの配列は、以下の配列番号１５３に示される。関連する制限部位は小文字の太字で示され、５’−３’にＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｄｅＩ、ＮｓｉＩ、ＡｆｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｉＷＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ及びＢｓｐＱＩである。構築物の５’及び３’隣接部の下線の配列は、ＦＡＴＡ−１遺伝子座における相同組換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、株による外因性メリビオースの利用を可能にするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＭＥＬ１（ＳｃａｒＭＥＬ１）遺伝子の発現を駆動するＰｍＨＸＴ１プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。ＳｃａｒＭＥＬ１のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックにより表す。Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＰＧＫ遺伝子の３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。スペーサー領域は小文字テキストにより表す。ＢｎＬＰＡＴ２（Ｂｎ１．１３）遺伝子の発現を駆動するＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ ＵＡＰＡ１プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。イニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示す；ＢｎＬＰＡＴ２（Ｂｎ１．１３）をコードする配列は、小文字、下線のイタリックにより表す。ＣｖＮＲ遺伝子の３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。第２のスペーサー領域は小文字テキストにより表す。ＰｍＦＡＤ２ｈｐＡヘアピン配列の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ＣｒＴＵＢ２プロモーターは、小文字、囲い文字のテキストにより示す。フォワード方向のＦＡＤ２エクソン１配列は小文字のイタリックで示し；ＦＡＤ２イントロン１配列は小文字、太字のイタリックで表し；ショートリンカー領域は小文字テキストで示し、及び逆方向のＦＡＤ２エクソン１配列は小文字、下線のイタリックで示す。第２のＣｖＮＲ ３’ＵＴＲはスモールキャピタルにより示す。

Claims (1)

  1. 本明細書に記載の発明。
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