JP5460097B2 - 抗体模倣物および他の結合タンパク質のためのタンパク質骨格 - Google Patents
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Description
本発明は、例えば新規の結合特性を持つ生成物の生産に有用なタンパク質骨格に関する。
本明細書に記載される新規の抗体模倣物は、抗体に由来する断片、および例えば前掲の枠組みのような非抗体の枠組みのどちらよりも優れているように設計されている。
本発明の好ましい抗体模倣物は、哺乳類の血液および構造タンパク質で見出された共通ドメインであるフィブロネクチン3型モジュール(Fn3)の構造に基づいている。このドメインはタンパク質配列データベースの中に400回よりも多く出現し、フィブロネクチン、テンシン、細胞内の細胞骨格タンパク質、および原核生物の酵素を含むこれまでにシークエンシングされたタンパク質の2%に出現すると見積もられている(BorkおよびDoolittle、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第89巻、第8990頁、1992年;Borkら、Nature Biotech.、第15巻、第553頁、1997年;Meinkeら、J. Bacteriol.、第175巻、第1910頁、1993年;Watanabeら、J. Biol. Chem.、第265巻、第15659頁、1990年)。特定の骨格は94個のアミノ酸残基を含むヒトFn3の10番目のモジュール(10Fn3)である。このドメインの全体的な折り畳みは、最も小さな機能的抗体断片であり、ラクダおよびラマのIgG(図1、図2)において抗原認識単位の全体を含む重鎖の可変領域のものと密接に関連している。ラクダおよびラマのドメインと10Fn3ドメインの間の主要な差異は、(i)10Fn3のほうがβ鎖が少ないこと(7対9)、および(ii)ラクダおよびラマのドメインでは、互いに充填し合う2個のβシートがジスルフィド架橋により連結されているが、10Fn3ではそうでないことである。
本明細書に述べられた抗体模倣物は、他のタンパク質ドメインと融合していてもよい。例えばこれらの模倣物は、IgG(Fc)の定常領域と10Fn3モジュール、好ましくは10Fn3のC末端のような抗体模倣体を融合させることで、ヒト免疫応答に組み込まれていてもよい。このような10Fn3-Fc融合分子などにおけるFcは、免疫応答の補体構成要素を活性化し、抗体模倣物の治療上の価値を増加させる。同様に、10Fn3のような抗体模倣体とC1qのような補体タンパク質との融合は、細胞を標的化するために用いることができ、10Fn3の抗体模倣体と毒素の融合は、特定の抗原を運搬する細胞を特異的に破壊するために用いることができる。さらに、いかなる型の抗体骨格(例えば10Fn3)であっても、アルブミンと融合させて血流中での半減期および組織への浸透を増加させることができる。これらの任意の融合体を、例えば一般的に入手可能な遺伝子配列を用いて構築した組換え融合遺伝子から融合タンパク質を発現させるなどの常法により生産することができる。
単量体に加えて、本明細書に述べられている任意の骨格構築物を、結合価を増加させて、それにより抗原との結合活性を増加させるために、抗体模倣物の二量体または多量体として生産してもよい。このような多量体は、共有結合により生産されてもよい。例えば、個々の10Fn3モジュールは天然の8Fn3-9Fn3-10Fn3のC末端からN末端の結合を模倣したり、または定常領域を介して結合した抗体の二量体を模倣することによって結合させてもよい。10Fn3-Fc構築物を、10Fn3-Fc::Fc-10Fn3という一般的な図式の二量体を設計するために利用してもよい。Fc::Fcの界面に操作された結合は共有結合であっても、非共有結合であってもよい。さらに、このようなより高いオーダーの構造を作製するために、10Fn3ハイブリッドのようなハイブリッドにおいてFc以外の相手との二量体化もしくは多量体化を利用することができる。
10Fn3は抗体模倣物の生産に好ましい骨格を表すにもかかわらず、本明細書に記載の分子においては、他の分子が10Fn3を置換していてもよい。これらに限定されることはないが、ヒト以外の動物および原核生物から得られる関連したFn3モジュール、ならびにヒトフィブロネクチンモジュール1Fn3-9Fn3および11Fn3-17Fn3を含む。さらに、テネイシンおよびアンジュリンのような10Fn3と配列に相同性を持つ他のタンパク質から得られたFn3モジュールを使用してもよい。免疫グロブリン様の折畳みを持つ(ただしVHドメインに関連しない配列を持つ)他の代表的な骨格は図21に示されており、N-カドヘリン、ICAM-2、タイチン、GCSF受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、E-カドヘリン、および抗生物質色素蛋白質が含まれる。関連する構造を持つ別のドメインは、ミエリン膜接着分子PO、CD8、CD4、CD2、クラスI MHC、T細胞抗原受容体、CD1、C2、およびVCAM-1のI-setドメイン、ミオシン結合タンパク質CのI-set免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質HのI-set免疫グロブリンドメイン、テロキンのI-set免疫グロブリンドメイン、テリキン、NCAM、トウィチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、GC-SF受容体、インターフェロンγ受容体、βガラクトシダーゼ/グルクロニダーゼ、βグルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼに由来する可能性がある。または、免疫グロブリン様の折畳みを1つまたは複数含む任意の他のタンパク質が利用できる。そのようなタンパク質は、例えば、プログラムSCOP(Murzinら、J. Mol. Biol. 247:536 (1995); Lo Conteら、Nucleic Acids Res, 25:257 (2000))を用いて同定できる。
本明細書に記載の抗体模倣物は、新規または改良された結合タンパク質を導出するために、いかなる技術において使用してもよい。一つの特定の例として、結合の標的をカラム樹脂またはマイクロタイタープレートのウェルのような固相支持体に固定化し、候補となる骨格に基づく結合タンパク質のライブラリーに標的を接触させる。このようなライブラリーは、10Fn3のCDR様ループの配列および/または長さを無作為化することで野生型10Fn3の骨格から構築された10Fn3クローンのような抗体模倣体クローンから成っていてもよい。望ましい場合には、このライブラリーは、例えばショスタック(Szostak)ら、米国特許出願第09/007,005号および同第09/247,190号;ショスタック(Szostak)ら、国際公開公報第98/31700号;ならびにロバーツ(Roberts)およびショスタック(Szostak)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1997年、第94巻、第12297〜12302頁に記載の技術によって生産されたRNA-タンパク質融合体ライブラリーであってもよい。またはDNA-タンパク質ライブラリーであってもよい(例えば、Lohse、「DNA-タンパク質融合体およびそれらの使用法(DNA-Protein Fusions and Uses Thereof)」、米国特許出願第60/110,549号、米国特許出願第09/459,190号、および国際公開公報第00/32823号)。この融合体ライブラリーを固定された標的と共にインキュベートし、支持体を洗浄して非特異的な結合物を除去し、高ストリンジェントな条件下における最も強い結合物を溶出してPCRにかけて配列情報を回収するか、または配列にさらなる変異を加えたりもしくは加えなかったりして選択段階を繰り返すのに使用することができる結合物の新規のライブラリーを作製する。抗原に対して十分な親和性を持つ結合物を得られるまでには、選択ラウンドが多数回行われる可能性がある。
本明細書に記載の抗体模倣物は、関心対象の任意の抗原とも結合するように導出することができる。これらのタンパク質は天然抗体に比べて熱力学的に優れた性質を持ち、インビトロで急速に導出することができる。したがって、これらの抗体模倣物は、研究、治療、診断の分野を含む、抗体が使用されるすべての分野においても抗体の代わりに用いることができる。さらに、これらの骨格は抗体に比べて可溶性でかつ安定性の性質を持つので、本明細書に述べられた抗体模倣物は抗体分子が破壊されたり、または不活性化されたりするような条件下でも使用することができる。最後に、本発明の骨格は事実上いかなる化合物とも結合するように導出することができるので、これらの分子は完全に新規であり、研究、治療、および診断の分野における使用も見出されている結合タンパク質を提供する。
上述された例示的な骨格分子は、例えば以下のような選択手順で生産され、かつ検査された。
複合体のライブラリーは、CDR様ループに対応する無作為化された部位を各々1個含む3つの断片から構築した。無作為化された残基は、図18に下線をつけた配列で示されているが、10Fn3 BCループ(ラマVHのCDR-H1に対応)の残基23〜29;10Fn3 DEループ(ラマVHのCDR-H2に対応)の残基52〜55;および10Fn3 FGループ(ラマVHのCDR-H3に対応)の残基78〜87である。断片は、その中にあるCDR-H様ループの名前に基づいて、BC、DE、およびFGと名付けた。各々の断片には、10Fn3および無作為化された配列に加えて、His6ドメインのN末端またはFLAGペプチドタグのC末端をコードする伸長部分が含まれた。各DNA断片には、2つの断片間(すなわち、BCおよびDE断片間もしくはDEおよびFG断片間)の各接合部にEar IタイプIIS制限エンドヌクレアーゼの認識配列が含まれた。この制限酵素は、すべての外来非10Fn3配列を除去し、隣接する断片を一緒にスプライシングさせた。さらに変異および選択ラウンドの間に、3つの10Fn3断片を組換えのように混合させる。
を用いて、ヒト肝臓ライブラリー(Maxim Biotech、カリフォルニア州南サンフランシスコ)からクローニングした。10Fn3クローンのPCRで得られた野生型セグメントおよびオリゴヌクレオチド合成で得られた無作為化セグメントから、3つの異なるライブラリーが構築された。BCr-DEr-FGrライブラリーは、BC、DE、およびFGループの選択された残基を無作為化することによって得られた;BCr-DEwt-FGrライブラリーは、BCおよびFGループの選択された残基を無作為化し、DEループ配列を野生型のまま残すことによって得られた;BCwt-DEwt-FGrライブラリーは、FGループのみの選択された残基を無作為化することによって得られた。
T7Tmv(インビトロ翻訳に必要なT7プロモーターおよびTMV非翻訳領域を導入する):
Unispl-s(Robertsら、1997、上記、ピューロマイシン含有リンカーにmRNAを連結するために用いられるスプリントオリゴヌクレオチド)
A18---2PEG(DNA-ピュロマイシンリンカー):
5’-(A)18(PEG)2CCPur(配列番号:14)
を用いてDNAリンカーと整列化させた。アンビオンウサギ網状赤血球溶解物に基づく翻訳キット(Ambion rabbit reticulocyte lysate-based translation kit)を用いて、35Sメチオニンの存在下で、mRNA-DNA-ピューロマイシン分子を翻訳した。得られたmRNA-DNA-ピューロマイシン-融合体タンパク質をオリゴ(dT)セルロース(タイプ7、Amersham Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイ)を用いて精製し、逆転写酵素(Superscript(商標)II、Gibco, Life Technologies、メリーランド州ロックビル)および上述したRTプライマー(Unisplint-SもしくはflagASA)を用いて、製造者の指示(好ましくは、70℃で2分間アニーリングおよび42℃で40分間反応)に従ってDNAの相補鎖を合成した。
RNA-タンパク質融合体の形態のマスターライブラリーが、TNF-αとの結合を選択するために供された(Pepro Tech、ニュージャージー州ロッキーヒル)。最初に2つの方法が行われた:1つでは標的をアガロースカラムに固定化し、1つでは標的をBIACOREチップに固定化した。最初に、アガロースカラムへのバックグラウンドの結合体を最小限にするために条件の大幅な最適化を行い、50mM HEPES pH 7.4、0.02% Triton、100μg/ml変性されたサケ精子DNAという好ましい緩衝液の条件を得た。この緩衝液中では、10Fn3-RNA融合体のTNF-α-セファロースへの非特異的結合は0.3%であった。10Fn3-RNA/cDNAライブラリーのTNF-α-セファロースへの非特異的結合バックグラウンドは0.1%であることが見出された。
R9およびR10から得られた61クローンのうちの38は、ユニークなアミノ酸配列を持っており、これは驚くべき多様性である。おそらくTNF-αに対する優れた結合のために複数回単離された10のクローンは、表1に示されている(全体の配列は図25)。
は、調べたクローンのうちでTNF-αからの解離定数が最も低い4つのうちの2つだった(表1)。
9回および10回目の選択後のTNF-αの遊離タンパク質プールの見かけの平均Kd値は、区別不可能(それぞれ4nMおよび6 nM;表1)だった;この親和性の類似は最後のラウンドの選択での濃縮が比較的低レベル(10倍)だったこと、および2つのプールの配列組成が類似していることと一貫している。さらに4回の選択を行なった後の遊離タンパク質プールの見かけの平均Kdは3 nMで、やはりR9およびR10プールと区別不能だった。
9回および10回目の選択で作製された2つのプールに複数回現れる全てのクローン、およびBCwt-DEwt-FGrライブラリーに由来する唯一のクローン(クローンT09.08)について、解離定数が決定された。
重複したクローンが単離されたにも関わらず、9回および10回の選択後のTNF-α結合プールには、数多くの異なるクローン、すなわち、標本にした61クローンでは38の異なる配列が、含まれていた。したがって、これらのクローンの中で優れたTNF-α結合を示すサブセットを回収するために、より厳密な結合要件を用いたさらなる選択が行われた。従って、さらに4回の選択(R11-R14)が標的濃度のコントロールが容易な溶液中で行われた。TNF-αの濃度は0.5 nMに限定され、DNA/mRNA-10Fn3プールの濃度は0.1 nMに限定された。さらに、ストレプトアビジンコートの常磁性ビーズに結合した10Fn3/ TNF-α複合体の洗浄の長さと温度も、引き上げられた。
上述のように、本明細書に記述される選択では、さらにライブラリーの多様性を増やすために、選択段階の全てまたは一部の後に変異誘発を行なうこともできる。1つの平行選択戦略では、ラウンドの間のDNA増幅に変異性PCRを組み込んだ(CadwellおよびJoyce, PCR Methods Appl. 2:28 (1992))。このテクニックは、上述のR8後に溶出される多様なDNAプールから始められた。このプールを変異性PCRで増幅したが、プールを7つの等量の部分に分け、標的頻度0.8%, 1.6%, 2.4%, 3.2%, 4.0%, 4.8%, および5.6%で変異誘発した。この7つのPCR反応を合わせ、混合物からcDNA/RNA-タンパク質融合体を作製し、溶液中で選択ラウンドを行なった。第2回の変異誘発ラウンドM10の前に、3つの別の反応0.8%, 1.6%, および2.4%で変異性PCRを行なった。2つの残るラウンドM11およびM12は、標準的なTaq PCRを用いて行なった。変異誘発以外は、M9-M12の選択条件はR11-R14と同じだった。調べた20のM12クローンは、前の2つの選択プロトコールを用いて選択したクローンよりも強い結合を示した(表3;全配列は図25)。TNF-αへの最も強い結合はM12.04で、観察されたKdは20 pMだった。これらの結果は、選択後期における低レベルの無作為の変異導入が、選択された抗体模倣物の結合親和性(20 pM対90 pM)、および選択できる速度(12回対14回)の両方を改善し得ることを示す。さらに、この変異導入の手法における強い結合体の頻度は約5%であるのに対し、他の選択では約3%だった。
選択単位として共有結合のmRNA-タンパク質融合体を用いておこなったTNF-αに結合できる10Fn3の選択は、20 pMという低い解離定数を持つ分子が勝ち残った。これらのKd値は、他の抗体模倣物骨格および選択方法を用いる他の選択の基準と比較して勝るものである。したがって、10Fn3に基づく骨格および共有結合のmRNA-タンパク質融合体に基づくインビトロの選択方法は、広範囲の抗原に対する抗体模倣物の開発に利用できる可能性がある。さらに、本明細書に記述されるナノモルレベル以下のTNF-α結合10Fn3変異体は、治療、研究、診断のための薬剤となる可能性がある。さらに、このインビトロ選択方法は自動化できるので、そのような骨格および選択方法の組み合せは、ゲノムスケールでの用途がある。
野生型10Fn3は、インテグリン結合性のトリペプチドモチーフであるアルギニン78-グリシン79-アスパラギン酸80(「RGDモチーフ」)をFGループの先端に含んでいる。このトリペプチドに基づくインテグリンとの結合および潜在性の炎症応答をインビボで回避するために、密接に関連した野生型11Fn3ドメインで見出される配列で、活性を持たない配列であるセリン78-グリシン79-グルタミン酸80(「SGE変異体」)を含む10Fn3の変異体を生産した。このSGE変異体は、N末端にHis6タグを付けて大腸菌中で遊離タンパク質として発現し、金属キレートカラムに続いてサイズ排除カラム上で均質性によって精製される。
8kDの10Fn3ドメインの半減期を延ばすために、天然抗体を模倣するより大きい分子も構築されている。この10Fn3-Fc分子は、宿主のIgGの定常領域にある-CH1-CH2-CH3(図11)もしくは-CH2-CH3ドメインを含んでおり、これらの構築物中では、10Fn3ドメインはIgGのVHドメインの代わりにN末端に結合されている(図11および図12)。このような抗体様構築物は、天然の免疫応答を利用できる可能性と同様に、タンパク質の薬物動態を改善させるべきである。
Mo 5PCR-NdeI:
Mo5PCR-His-NdeI(His6精製タグを有する、代わりのN末端用):
本明細書に記載の任意の抗体模倣体は、マイクロチップのような固体支持体上で免疫化してもよい。10Fn3骨格のような本明細書の骨格がタンパク質チップ適用に適しているのは、 (1) ベンチまたは自動化装置で迅速に選択できる多くの結合基を支持する能力があり、かつ (2) 生物物理学的特性が優れているためである。
チップ表面にFn3を基にした抗体模倣体のような抗体模倣体を固定するために、いくつかの典型的な手法が利用できる。例えば、このような抗体模倣体はRNA-タンパク質融合体として、融合体のRNA部分をワトソン・クリックハイブリダイゼーションによって、チップ表面に固定化したベースの相補的DNAに固定することができる(例えば、Adressable Protein Assays、米国特許出願第60/080,686号;米国特許出願第09/282,734号、および国際公開公報第99/51773号;およびMethods for Encoding and Sorting In Vitro Translated Protein、米国特許出願第60/151,261号および米国特許出願第09/648,040号に記述)。または、抗体模倣体は、チップ表面に直接遊離のタンパク質として固定できる。チップ表面に抗体模倣体を沈着させるためには、手作業およびロボット装置が使用できる。アレイ形式で高密度に抗体模倣体を沈着させるためには、スポットロボットが使用できる(例えば、Luekingら、Anal Biochem. 1999 May 15; 270(1):103-11の方法による)。抗体模倣体をチップ表面に結合させるためには、別の方法も利用できる。「酵素学の方法(Methods in Enzymology )」(M. MosbachおよびB. Danielsson編)、第135巻および136巻、Academic Press、Orlando、Florida、1987;ニルソン(Nilsson)ら、Protein Expr. Purif. 1997 Oct;11(1):1〜16、およびその参考文献に記述されるものを含め、いくつかの標準的な固定化手法が使用できる。抗体模倣体の方向性を持った固定化は、チップに結合した抗体模倣体の結合容量を増加させる際に役立つ。方向性を持った結合のための典型的な手法は、リュー(Lu)ら、The Analyst (1996)、vol. 121、p29R-32R;およびターコバ(Turkova)、J Chromatogr B Biomed Sci App. 1999 Feb 5;722(1-2):11-31に記述されている。さらに、抗体模倣体をチップ表面に結合させるための本明細書に記述されるいかなる方法も、抗体模倣体をビーズ、または他の支持体に固定するために使用できる。
骨格結合物の選択された集団を用いて、例えば、生物試料のような試料中で、分析物標的の検出および/または定量ができる。この種の診断解析を行なうためには、関心対象の標的に対する選択された骨格結合体を適当な支持体上に固定して、多機能タンパク質チップを作製する。次に、チップに試料を載せ、試料中の成分で結合物に結合するものを、固定化した結合物の標的特異性に基づいて同定する。この手法を用いると、試料中の1つまたは複数の成分が、同時に同定または定量できる(例えば、試料のプロファイリングのための手段として)。
チップ上で骨格を選択するための1つの典型例では、無作為化ループBC、DE、およびFGを持つヒト10Fn3変異体のライブラリーを用いて、TNF-αに対して10Fn3に基づく選択が行われた。ライブラリーは、1つの無作為化ループを含め、ヒト10Fn3の約3分の1をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ含む、3つのDNA断片から構築された。上記のループ残基をコードするDNA配列は、関心対象の残基のコドンが (NNS)nで置換されたように、オリゴヌクレオチド合成によって再構築された。式中、Nは4つのデオキシリボヌクレオチド(A, C, GまたはT)のいずれかであり、SはCまたはGを表す。各断片のC末端は、FLAG精製タグの配列を含んでいた。
Fn3融合体をチップ表面に固定するための第1段階として、自動DNA合成装置(PE BioSystems Expedite 8909)で、固相支持体ホスホラミダイド法でオリゴヌクレオチド捕捉プローブを調製した。全ての試薬はグレン・リサーチ(Glen Research)から入手した。合成は、ジスルフィド結合を含む固相支持体から開始して、最終的に3'末端のチオール官能性が得られた。添加される最初の4つの単量体は、ヘキサエチレンオキシドユニットで、20のT単量体が続いた。5'末端のDMT基は除去されなかった。捕捉プローブは固相支持体から開裂し、水酸化アンモニウムで脱保護し、真空遠心分離で乾燥するまで濃縮し、トリエチルアンモニウム酢酸緩衝液中のアセトニトリル勾配を用いて、逆相HPLCで精製した。HPLCの適当な画分を回収し、真空遠心分離で乾燥するまで蒸発させ、30分間の80% AcOH処理によって5'末端のDMT基を除去した。酸は気化により除去し、次にオリゴヌクレオチドは100 mM DTTで30分間処理してジスルフィド結合を開裂させた。DTTはEtOAcで繰り返し抽出して除去した。オリゴヌクレオチドは残りの水相からエタノール沈殿させ、逆相HPLCによって純度を確認した。
洗浄済の1×3インチの顕微鏡スライドグラス(Goldseal, #3010)を、ナノストップ(Nanostrip)(Cyantek)で15分間、10% NaOH水溶液、70℃で3分間、および1% HCl水溶液で1分間、各試薬の後に脱イオン水で十分にすすぎながら処理した。その後、スライドは無水硫酸カルシウム上で真空乾燥器中で数時間乾燥させた。95%アセトン/5%水中の1%アミノプロピルトリメトキシシランを調製し、20分間加水分解させた。スライドグラスは、穏やかに撹拌しながら加水分解したシラン溶液に5分間浸した。毎回新しい95%アセトン/5%水を用いて、スライドを5分間穏やかに撹拌しながら10回洗浄し、過剰なシランを除去した。その後、スライドを110℃で20分間加熱することにより、保存処理した。シラン処理したスライドは、新しく調製した90% DMF/10%ピリジン中の0.2%フェニレン1,4-ジイソチオシアネート溶液に、穏やかに撹拌しながら2時間浸した。その後、90% DMF/10%ピリジン、メタノール、およびアセトンで順次洗浄した。空気乾燥後、機能化したスライドは、真空乾燥器中で無水硫酸カルシウム上で0℃で保存した。市販のアミン反応性スライド(3-D Link, Surmodics)を用いて、同様な結果が得られた。
ラウンド10のTNF-α選択由来の約1 pmolの10Fn3融合体プールを、総容量350μL中での0.02%トゥイーン20および2 mMバナジルリボヌクレオチド複合体を含む、5×SSCに調節した。400μLガスケット装置下で全体量をマイクロアレイに添加し、この集合を室温で18時間、連続的に回転させた。ハイブリダイゼーション後、スライドを500 mLの5×SSC、2.5×SSC、および1×SSCで順次5分ずつ洗浄した。液体の痕跡は遠心分離で除去し、スライドを空気乾燥させた。
他の態様は、特許請求の範囲内である。
Claims (20)
- 少なくとも1個の変異したループを有する改変された10番目のフィブロネクチン3型ドメイン(10Fn3)を含み、少なくとも1個の変異したループが、BC、DE、またはFGループでありかつ天然の10番目のフィブロネクチン3型ドメインの対応するBC、DE、またはFGループに関して1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、該天然の10番目のフィブロネクチン3型ドメインが少なくとも10 nMの強さのKdで結合しない化合物に対して少なくとも10 nMの強さのKdで結合するタンパク質であって、
(a)10番目のフィブロネクチン3型ドメインを提供する段階;
(b)10番目のフィブロネクチン3型ドメインのBCループ、DEループ、およびFGループからなる群より選択される少なくとも1個のループを無作為化することによって、10番目のフィブロネクチン3型ドメインの変異した誘導体を作製し、それによって10番目のフィブロネクチン3型ドメインを含むタンパク質のライブラリーを構築する段階であって、該ループのアミノ酸配列が、天然のヒトの10番目のフィブロネクチン3型ドメインの配列に関して1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、段階;
(c)該ライブラリーに該化合物を接触させる段階;
(d)少なくとも1μMのKdの強さで該化合物に結合する少なくとも1つのタンパク質を該ライブラリーから選択する段階;および
(e)段階(d)で選択された少なくとも1つのタンパク質を用いて、段階(b)〜(d)を繰り返す段階;および
(f)少なくとも10 nMのKdの強さで該化合物に結合する少なくとも1つのタンパク質を選択する段階
を含み、それによって少なくとも10 nMのKdの強さで該化合物に結合するタンパク質が得られる、方法
によって得ることができる、前記タンパク質。 - BCループ、DEループ、及びFGループのそれぞれのアミノ酸配列が、天然の10番目のフィブロネクチン3型ドメインの配列に関して1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、請求項1記載のタンパク質。
- 少なくとも1 nMの強さ、少なくとも500 pMの強さ、少なくとも100 pMの強さ、または少なくとも20 pMの強さのKdで結合する、請求項1または2記載のタンパク質。
- 天然のヒト10Fn3のアミノ酸配列が配列番号:33に記載されている、請求項1または2記載のタンパク質。
- 天然のヒト10Fn3のBCループが、配列番号:33に記載の配列のアミノ酸残基21〜31位の間を通り、天然のヒト10Fn3のDEループが、配列番号:33に記載の配列のアミノ酸残基51〜56位の間を通り、かつ天然のヒト10Fn3のFGループが、配列番号:33に記載の配列のアミノ酸残基76〜88位の間を通る、請求項4記載のタンパク質。
- ジスルフィド結合を持たない、請求項1または2記載のタンパク質。
- インテグリン結合モチーフを持たない、請求項1または2記載のタンパク質。
- 固相支持体上に固定された、請求項1または2記載のタンパク質。
- 固相支持体上に固定されたアレイの一部である、請求項8記載のタンパク質。
- 固相支持体がチップまたはビーズである、請求項8記載のタンパク質。
- 該化合物に結合できない異種タンパク質に結合した、請求項1または2記載のタンパク質。
- 異種タンパク質が抗体または抗体ドメイン、免疫グロブリンFcドメイン、補体タンパク質、毒素タンパク質、またはアルブミンタンパク質である、請求項11記載のタンパク質。
- 核酸に共有結合している、請求項1または2記載のタンパク質。
- 核酸がそのタンパク質をコードしている、請求項13記載のタンパク質。
- 前記核酸がRNAである、請求項14記載のタンパク質。
- 請求項1または2記載のタンパク質をコードする核酸。
- 前記化合物が腫瘍壊死因子α(TNF-α)である、請求項1または2記載のタンパク質。
- 少なくとも1個の変異したループを有する10番目のフィブロネクチン3型ドメイン(10Fn3)を含むタンパク質を得る方法であって、少なくとも1個の変異したループが、BC、DE、またはFGループでありかつ天然の10番目のフィブロネクチン3型ドメインの対応するBC、DE、またはFGループに関して1つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該タンパク質が、該天然の10番目のフィブロネクチン3型ドメインが少なくとも10 nMの強さのKdで結合しない化合物に対して少なくとも10 nMの強さのKdで結合し、
(a)10番目のフィブロネクチン3型ドメインを提供する段階;
(b)10番目のフィブロネクチン3型ドメインのBCループ、DEループ、およびFGループからなる群より選択される少なくとも1個のループを無作為化することによって、10番目のフィブロネクチン3型ドメインの変異した誘導体を作製し、それによって10番目のフィブロネクチン3型ドメインを含むタンパク質のライブラリーを構築する段階であって、該ループのアミノ酸配列が、天然のヒトの10番目のフィブロネクチン3型ドメインの配列に関して1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、段階;
(c)該化合物を該ライブラリーに接触させる段階;
(d)少なくとも1μMの強さのKdで該化合物に結合する少なくとも1つのタンパク質を該ライブラリーから選択する段階;および
(e)段階(d)で選択された少なくとも1つのタンパク質を用いて、段階(b)〜(d)を繰り返す段階;および
(f)少なくとも10 nMのKdの強さで該化合物に結合する少なくとも1つのタンパク質を選択する段階
を含み、それによって少なくとも10 nMのKdの強さで該化合物に結合するタンパク質が得られる、方法。 - 前記化合物がタンパク質である、請求項18記載の方法。
- 前記タンパク質がTNF-αである、請求項19記載の方法。
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