JP2022507375A

JP2022507375A - ミオスミンから（ｓ）－ニコチンを調製する方法

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Publication number: JP2022507375A
Application number: JP2021526250A
Authority: JP
Inventors: マッケイグ，レイモンド; スリニヴァサンナラシムハン，アショク
Original assignee: ザノプリマライフサイエンシズリミテッド
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2019-03-12
Publication date: 2022-01-18
Anticipated expiration: 2039-03-12
Also published as: CA3118774C; DK3653617T3; CA3118774A1; WO2020098978A1; BR112021009328A2; ZA202103223B; AU2019382117B2; HUE051799T2; KR20210082532A; ES2836481T3; PT3653617T; CN113272289A; BR112021009328B1; PL3653617T3; CN118005607A; MX2021005584A; SI3653617T1; KR102393478B1; EP3653617B1; HRP20201895T1

Abstract

（Ｓ）－ニコチン（［（Ｓ）－３－（１－メチルピロリジン－２－イル）ピリジン］）を合成によって生産する方法が、提供される。

Description

本発明は、（Ｓ）－ニコチン（［（Ｓ）－３－（１－メチルピロリジン－２－イル）ピリジン］）を合成によって生産する方法に関する。

ニコチン（３－［１－メチルピロリジン－２－イル］ピリジン）は、タバコ属（Nicotiana）、すなわちタバコ植物の葉から得られ得る天然物である。タバコ産業、更には医薬分野の全体でニコチン製品に対する大きな需要がある。例えば、伝統的なタバコ製品、例えば伝統的な紙巻きたばこの需要は依然としてあり、それはニコチンの常習性による可能性が高い。しかしながら、消費者の健康に対する伝統的な紙巻きたばこ製品の有害な影響に関する懸念の広がりのため、電子たばこデバイス、パッチ、口内錠、鼻腔用スプレーおよびチューインガムなど、含ニコチンタバコ代用製品の需要が増大している。タバコ代用製品は、ピリジンアルカロイド、多環式芳香族、フェノールおよびＮ－ニトロソアミンの存在などにより有害な発癌効果をもたらす伝統的なタバコ製品の代替品として提供されてもよい。タバコ代用製品は、ニコチン依存症を治療するために特に使用されてもよい。医薬分野においては、ニコチンの治療適用の可能性に対する関心も存在する。

適切なレベルの鏡像異性純度と化学純度の両方でニコチンを得るには課題が存在する。ニコチンは光学活性があり、すなわち、２つの考え得る鏡像異性形態：（Ｒ）－ニコチンまたは（Ｓ）－ニコチンのうちの１つで存在し得る。ニコチンのラセミ混合物を得る方法が、存在する（例えば国際公開第２０１６０６５２０９号パンフレット）。しかしながら、（Ｓ）－ニコチン（すなわち［（Ｓ）－３－（１－メチルピロリジン－２－イル）ピリジン］）が、（Ｒ）－ニコチンより有意に活性があることは認知されている。したがって、タバコ産業および医薬分野における需要は、（Ｓ）鏡像異性体について鏡像異性純度のレベルが高いニコチンに対してである。特に医薬産業は、新たな医薬品に対して鏡像異性純度の要求レベルに厳しい規定を課しており、ニコチンの鏡像異性純度の既存の要求レベルが増大する可能性があると考えられる。ニコチンの鏡像異性純度に対する需要に加えて、高レベルの化学純度を得ることも医薬とタバコ産業両方において重要である。化学純度とは、非ニコチン不純物と比較したニコチン（すなわち（Ｒ）と（Ｓ）両方の鏡像異性形態）の量を指す。医薬産業は、非ニコチン不純物と比較してニコチンの化学純度の要求レベルについて極めて厳しい規定をすでに課している。実際に、ニコチンの化学純度に関する現在の米国薬局方参照基準は、少なくとも９９％であり、いかなる単一の不純物も０．５％以下である。上記の有害な発癌効果は、発癌効果を及ぼす能力がある不純物に起因し得るので、高い化学純度はタバコ産業にも著しく重要なものである。

（Ｓ）－ニコチンは、タバコ植物の葉から抽出することによって得ることができる。しかしながら、ニコチンがこの方法で得られる場合、関連するアルカロイド不純物の存在のため、一般にニコチンの化学純度は９５％未満である。タバコ葉から抽出することによって得られるニコチン試料の典型的な組成物は、（Ｓ）－ニコチン９３％、（Ｓ）－ノルニコチン２．４％、（Ｓ）－アナタビン３．９％および（Ｓ）－アナバシン０．５％を含む（E. Leete and M. Mueller, J. Am. Chem., Soc., 1982, 104, 6440-44）。アルカロイド不純物は、ニコチンと類似の化学構造のものであり、したがって除去が困難である。ニコチンの実際の組成物は、地理的供給源および収穫の季節などの因子によって決まる。

（Ｓ）－ニコチンは、合成方法によって得られてもよい。（Ｓ）－ニコチンを合成によって生産するための様々な例が、先行技術にある。例えば、先行技術において、（Ｒ）－ニコチンおよび（Ｓ）－ニコチンのラセミ（すなわち等量）混合物が作られ、このラセミ混合物が、その後分割されて（Ｓ）鏡像異性体を得る方法がある（米国特許第８，３８９，７３３号明細書、米国特許出願公開第２０１４／００３１５５４号明細書および米国特許第８，３７８，１１１号明細書）。生体触媒である酵素を使用して（Ｓ）－ニコチンを生産する合成方法の例も先行技術にある（国際公開第２０１４／１７４５０５号パンフレット）；鏡像異性的に選択的な方法おける生体触媒の使用は、ニコチン分野以外で一般に公知である（L.S. Bleicher et al, J. Org. Chem., 1998, 63, 1109-18、国際公開第２０１３／１７００５０号パンフレット、国際公開第２０１５／０７３５５５号パンフレット、P.N Scheller et al, Chembiochem, 2014, 15, 2201-4、Gand et al, J Mol. Cat. B, Enzymatic, 2014, 110, 126-32）。にもかかわらず、高い化学純度も達成しながら高い鏡像異性選択性で（Ｒ）鏡像異性体に優先して（Ｓ）－ニコチンを選択的に合成することは、課題のままである。

（発明の概要）
第１の態様において、
（ｉ）イミン還元酵素活性を有する酵素でミオスミンを還元して（Ｓ）－ノルニコチンを形成するステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）から形成された（Ｓ）－ノルニコチンをメチル化して（Ｓ）－ニコチンを形成するステップと
を含む、（Ｓ）－ニコチンを作製する方法がある。

ミオスミンが出発材料として使用される場合、この方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって（Ｓ）－ニコチンに対して極めて高い鏡像異性および化学純度が達成されることが、驚くことに判明した。これは、ステップ（ｉ）が、（Ｓ）異性体に優先傾向を持つ高度に鏡像異性選択的な合成ステップであり、ステップ（ｉｉ）が、高い化学純度も維持しながら、この優先傾向が最終的なニコチン産物において保持されるようなステップであることを示す。これにより、ラセミ混合物の分割に頼る必要なく（Ｓ）－ニコチンを生産することが可能になる。高い化学純度は、特に有利であり；ニコチンに一般に付随する望ましくない不純物のレベルの減少は、不純物に関連する潜在的な負の効果の危険性の減少をもたらす。更に、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）は、（Ｓ）－ニコチンを作製するのに簡便な製造方法を提供する。

第２の態様において、第１の態様の方法を使用して（Ｓ）－ニコチンを形成するステップと、１つまたは複数の医薬賦形剤と一緒に医薬組成物に（Ｓ）－ニコチンを含めるステップとを含む、医薬組成物を生産する方法がある。

第３の態様において、第１の態様の方法を使用して（Ｓ）－ニコチンを形成するステップと、１つまたは複数の添加物を含む溶媒中に（Ｓ）－ニコチンを含めるステップとを含む、電子たばこデバイス用の処方物を生産する方法がある。

第４の態様において、（Ｓ）－ニコチンを形成する方法におけるミオスミンおよびイミン還元酵素活性を有する酵素の使用がある。

第５の態様において、（Ｓ）－ニコチンを形成する上記方法に使用するための、ミオスミンおよびイミン還元酵素活性を含む酵素を含むキットがある。

（好ましい態様の説明）
当業者なら認識するであろうが、ミオスミン、（Ｓ）－ノルニコチンおよび（Ｓ）－ニコチンは以下の構造を有する：

当業者なら、ミオスミンを作製するのに適当な反応スキームに精通しているであろう。

本明細書では、「イミン還元酵素活性を有する酵素」とは、イミン基、特に第２級イミン基を、対応するアミン基、特に第２級アミン基へと不斉還元し得る酵素を指す。特に、本明細書に開示される方法に使用されるイミン還元酵素活性を有する酵素は、ミオスミンの（Ｓ）－ノルニコチンへの転換を触媒し得る酵素である。当業者は、そのような酵素に精通している。酵素は、噴霧乾燥細胞の形態など様々な形態で反応混合物に添加され得る。

好ましくは、（Ｓ）－ノルニコチンが少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の鏡像体過剰率で得られるように本方法は、ミオスミンを（Ｓ）－ノルニコチンに転換し得る酵素を使用する。鏡像体過剰率は、実施例に示される様式で測定される。本明細書に開示される方法において、この高い鏡像体過剰率は、最終産物として最終的に実現される（Ｓ）－ニコチンについても達成される。

当業者なら認識するであろうが、イミン還元酵素活性を有する酵素には、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ依存的脱水素酵素およびＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ依存的イミン還元酵素などのＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ依存的酸化還元酵素が一般にある。ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ依存的脱水素酵素には酵素分類番号Ｅ．Ｃ．１．１．１によって付託されているものがあり、特に６－ホスホグルコン酸脱水素酵素があり、酵素分類番号Ｅ．Ｃ．１．１．１．４４によって付託されている。イミン還元酵素には、酵素分類番号Ｅ．Ｃ．１．５．１で付託されている、特に酵素分類番号Ｅ．Ｃ１．５．１．４８で付託されているものがある。

イミン還元酵素の異なる種の例には、チアゾリニルイミン還元酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素、Δ^１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素、Δ^１－ピペリデイン－２－カルボン酸還元酵素、サンギナリン還元酵素および１，２－ジヒドロレチクリン還元酵素がある。そのような酵素は、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、ベルコシスポラ属（Verrucosispora）、メソリゾビウム属（Mesorhizobium）、エルシニア属（Yersinia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、カンジダアルビカンス（candida albicans）、エスコルチア属（Eschscholzia）およびケシ属（Papaver）などの供給源から単離または得ることができる。

考え得る酵素の例には、国際公開第２０１３１７００５０号パンフレット（その内容を参照により組み込む）に開示されているものもある。

酵素は、ＩＲＥＤ＿Ａ、ＩＲＥＤ＿Ｂ、ＩＲＥＤ＿Ｃ、ＩＲＥＤ＿Ｄ、ＩＲＥＤ＿Ｅ、ＩＲＥＤ＿Ｆ、ＩＲＥＤ＿Ｐ、ＩＲＥＤ＿Ｘ、ＩＲＥＤ＿ＡＢ、ＩＲＥＤ－２０またはその同族体でもよい。ＩＲＥＤ＿Ａ、ＩＲＥＤ＿Ｂ、ＩＲＥＤ＿Ｃ、ＩＲＥＤ＿Ｄ、ＩＲＥＤ＿Ｅ、ＩＲＥＤ＿Ｆ、ＩＲＥＤ＿Ｐ、ＩＲＥＤ＿ＸおよびＩＲＥＤ＿ＡＢは、Ｅｎｚｙｍｉｃａｌｓから入手可能であり；ＩＲＥＤ－２０は、ＡｌｍａｃＧｒｏｕｐから入手可能である。例えば、一実施形態において、酵素は、ＩＲＥＤ＿Ａ、ＩＲＥＤ＿Ｂ、ＩＲＥＤ＿Ｃ、ＩＲＥＤ＿Ｄ、ＩＲＥＤ＿Ｅ、ＩＲＥＤ－２０またはその同族体である。

本明細書に開示される酵素は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４のうちのいずれか１つによるアミノ酸配列、またはその同族体を含み得る。別の実施形態において、酵素は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のうちのいずれか１つによるアミノ酸配列を含む。

本明細書では、「その同族体」とは、本明細書に開示される酵素のうちのいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素を意味する。例えば、「その同族体」は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のうちのいずれか１つによるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素を意味し得る。

本明細書では、用語「配列同一性」とは、２つ以上のアミノ酸配列の間の関係を指す。ある配列中の位置が、コンパレーター配列の対応する位置において同じアミノ酸残基によって使用されている場合、配列はその位置で「同一である」と言われる。パーセンテージ「配列同一性」は、両方の配列中に同一アミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、「同一」位置の数を得ることによって算出される。「同一」位置の数は、次いで比較ウインドウ内の位置の合計数によって除算され、１００で乗算されて、「配列同一性」のパーセンテージを得られる。「配列同一性」のパーセンテージは、比較ウインドウの始めから終わりまで最適にアラインされた２つの配列を比較することによって決定される。比較のために配列を最適にアラインするには、参照配列が一定に保たれるのに対して、比較ウインドウ内のポリペプチド配列の部分は、ギャップと称される追加または欠失を含んでもよい。最適なアラインメントは、ギャップがあっても、参照配列とコンパレーター配列の間に可能な限り多い数の「同一」位置を生じさせるアラインメントである。コード配列の間の配列同一性のレベルは、公知の方法を使用して算出され得る。

配列同一性は、ＮＣＢＩから利用可能なＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Atschul et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410, (1990)）、ＢＬＡＳＴＸプログラム、ならびにＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）製のＧａｐプログラムを含めた配列同一性を決定するための公的に利用可能なコンピュータを使った方法を使用して算出され得る。アミノ酸配列を比較する場合、配列同一性のレベルは、ギャップペナルティ５０およびギャップ長ペナルティ３を用いてＧａｐプログラムを使用して得られる。

一般に、ステップ（ｉ）は、適切な補因子、特にＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下で酵素によりミオスミンを還元するステップを含む。当業者なら認識するであろうが、酵素および補因子は、別々の成分として反応混合物に導入されてもよく、または同じ成分の一部として、例えば酵素と適当な補因子の両方を含有する微生物全細胞の形態で反応混合物に導入されてもよい。適切な補因子リサイクル系は、その酸化形態（ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋）からその還元形態（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）へ補因子を転換するために存在し得る。当業者なら、グルコース（一水和物）／グルコース脱水素酵素、ギ酸／ギ酸脱水素酵素およびイソプロパノール／アルコール脱水素酵素を含む適当な補因子リサイクル系に精通しているであろう。補因子リサイクル系が存在する場合、補因子は、その酸化形態、すなわちＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋として反応混合物に添加されてもよい。

補因子自体は、ミオスミン１００重量部当たり、０．０２重量部～１０重量部の範囲で存在し得る。好ましくは、補因子は、ミオスミン１００重量部当たり、０．０５重量部～５重量部の範囲で存在し得る。より好ましくは、補因子は、ミオスミン１００重量部当たり、０．５重量部～２重量部の範囲で存在し得る。

ステップ（ｉ）において存在する酵素の量は、ミオスミン１００重量部当たり、０．１重量部～３０重量部の量で存在し得る。好ましくは、ステップ（ｉ）において存在する酵素の量は、ミオスミンの０．５重量部～１０重量部の量で存在し得る。当業者なら、ステップ（ｉ）において存在する酵素の量が、ステップ（ｉ）の反応の所望の時間に応じて調整され得、より短い反応時間のためにはより多くの酵素が使用され得、逆もまた同じであることを認識するであろう。

ステップ（ｉ）は、イオン交換樹脂の存在下で実施されてもよいが、好ましくは、ステップ（ｉ）は、イオン交換樹脂の非存在下で実施される。イオン交換樹脂が存在する場合、それはＡｍｂｅｒｌｉｔｅＩＲ－１２０などのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ樹脂、Ａｍｂｅｒｊｅｔ樹脂またはＤｏｗｅｘ樹脂であり、これらイオン交換樹脂のそれぞれは、Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。

ステップ（ｉ）に可能なｐＨは、ｐＨ５～９の範囲であり得る。

（Ｓ）－ノルニコチンは、更なるステップ：（ｉｉ）ステップ（ｉ）から形成された（Ｓ）－ノルニコチンをメチル化して（Ｓ）－ニコチンを形成するステップによって、（Ｓ）－ニコチンに転換される。

ステップ（ｉｉ）の後、（Ｓ）－ニコチンが、特に高い化学純度および特に高い鏡像体過剰率で達成されたことが、驚くことに判明した。

メチル化ステップ、すなわち、ステップ（ｉｉ）は、複数のステップの方法によって実施されてもよい。例えば、ステップ（ｉｉ）は、化合物（例えばＮ－ホルミル－（Ｓ）－ノルニコチン）を形成するステップと、次いでこの化合物をその後還元してメチル化産物、すなわち（Ｓ）－ニコチンに至るステップとを含んでもよい。しかしながら、好ましくは、ステップ（ｉｉ）は、還元的メチル化などの単一ステップの方法で実施される。当業者なら認識するであろうが、用語「還元的メチル化」とは、それにより単一ステップで種が形成され、還元されてメチル化産物（すなわち（Ｓ）－ニコチン）に至る方法を指す。

好ましくは、（Ｓ）－ノルニコチンは、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド系化合物を使用して還元的にメチル化される。そのような試薬を使用する場合、ステップ（ｉｉ）は特に有効である。

本明細書では、ホルムアルデヒド系化合物は、化学反応の間にｉｎｓｉｔｕでホルムアルデヒドを生成する能力がある化合物を指すために使用される。これは、ホルムアルデヒド系化合物が、反応混合物に添加され、その後分解されてホルムアルデヒド（および他の関連化合物）を放出し、そのホルムアルデヒドが、（Ｓ）－ノルニコチンと次いで反応して（Ｓ）－ニコチンを形成し得ることを意味することを当業者は認識するであろう。ホルムアルデヒド系化合物を添加する場合、当業者は、添加されるホルムアルデヒド系化合物の適当な量を調整してｉｎｓｉｔｕで特定量のホルムアルデヒドの放出を達成する方法に精通しているであろう。

ホルムアルデヒド自体は、式ＨＣ（Ｏ）Ｈを有し、液体または気体として一般に導入される。ホルムアルデヒドは、ホルムアルデヒド水溶液（そのような水溶液は、ホルマリンと呼ばれる場合もある）の一部として反応混合物に導入されてもよい。

ホルムアルデヒド系化合物は、固体または液体として一般に導入される。ホルムアルデヒド系化合物は、ホルムアルデヒドの二量体、ホルムアルデヒドのポリマーまたはホルムアルデヒドのアセタールでもよい。好ましくは、ホルムアルデヒド系化合物は、ホルムアルデヒドのポリマーである。

当業者なら認識するであろうが、用語「ホルムアルデヒドのポリマー」とは、３つ以上重合したホルムアルデヒド繰り返し単位を持つ化合物を指す。好ましくは、ホルムアルデヒドのポリマーは、パラホルムアルデヒドである。本明細書では、用語「パラホルムアルデヒド」は、重合度８～１００単位を持つホルムアルデヒドのポリマーを指す。

（Ｓ）－ノルニコチンが、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド系化合物を使用して還元的にメチル化される場合、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド系化合物は、（Ｓ）－ノルニコチン１００重量部当たり、５０重量部～１１０重量部、好ましくは６０重量部～９０重量部の量で添加されてもよい。そのような量は、存在するホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド系化合物および（Ｓ）－ノルニコチンの実際の量を指す。したがって、例えば（Ｓ）－ノルニコチンが、溶液（例えば水溶液）の一部として形成される場合、および／またはホルムアルデヒドもしくはホルムアルデヒド系化合物が、溶液（例えば水溶液）の一部として反応混合物に導入される場合、本明細書に開示される重量部とは、それぞれの溶液に含有されるホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド系化合物および（Ｓ）－ノルニコチンの実際の量を指す。

メチル化ステップが還元的メチル化ステップである場合、還元剤は、ギ酸、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはパラジウム／水素であってもよく、好ましくはギ酸である。当業者なら認識するであろうが、還元剤の適当な量は、使用される特定の還元剤によって決まる。例えば、還元剤がギ酸である場合、還元剤は、（Ｓ）－ノルニコチン１００重量部当たり４０～１１０重量部、好ましくは４０～１００重量部、より好ましくは５０重量部～７０重量部の量で存在してもよい。そのような量は、還元剤および存在する（Ｓ）－ノルニコチンの実際の量を指す。

好ましくは、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）から形成された（Ｓ）－ノルニコチンを単離することなく実施されてもよい。これにより、特に簡便な合成経路を使用しながら高い鏡像体過剰率および高い化学純度の両方を持つ（Ｓ）－ニコチンの形成が可能になる。（Ｓ）－ノルニコチンの単離は、高コストの工場時間およびエネルギーのため（例えば抽出のために大量の溶媒を必要とするおよび／または溶液を煮つめることによる）集約的な方法になり得るので、これを（Ｓ）－ニコチンに転換する前にステップ（ｉ）から形成された反応混合物から（Ｓ）－ノルニコチンを単離する必要性を回避することは、特に簡便な合成経路を提供するという利点を有する。例えば、ステップ（ｉ）において（Ｓ）－ノルニコチンは水溶液の一部として形成されてもよく、その場合（Ｓ）－ノルニコチンを含有する水溶液は、ステップ（ｉｉ）おいて直接使用するために保持される。結果として、メチル化ステップ（ステップ（ｉｉ））は、ステップ（ｉ）から形成された（Ｓ）－ノルニコチンの水溶液に対して実行される。本方法がこの様式で実施される場合、（Ｓ）－ノルニコチンは、パラホルムアルデヒドを使用するか、または水溶液の一部として反応混合物に導入されるホルムアルデヒドを使用するかいずれかによって還元的にメチル化されることが好ましい。ホルムアルデヒドは方法が進行する際の反応混合物の望ましくない起泡を減少させることが分かっているので、本方法がこの様式で実施される場合、（Ｓ）－ノルニコチンは、水溶液の一部として反応混合物に導入されるホルムアルデヒドを使用することによって還元的にメチル化されることがより好ましい。

本明細書に開示される方法を使用して生産される（Ｓ）－ニコチンは、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の鏡像体過剰率を有する。当業者なら、鏡像体過剰率を測定する方法に精通しているであろう。例えば鏡像体過剰率は、実施例に示される様式で測定されてもよい。

本明細書に開示される方法を使用して生産される（Ｓ）－ニコチンは、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の化学純度を有する。当業者なら、化学純度を測定する方法に精通しているであろう。例えば化学純度は、実施例に示される様式で測定されてもよい。例によって達成される化学純度のレベルは、特に高い。

上記の方法ステップを使用して生産される（Ｓ）－ニコチンは、１つまたは複数の医薬賦形剤と一緒に医薬組成物に含まれてもよい。好ましくは、医薬組成物は、経皮パッチ、口内錠または吸入処方物である。

上記の方法ステップを使用して生産される（Ｓ）－ニコチンは、電子たばこデバイスに含めるための処方物に含まれてもよい。処方物は、１つまたは複数の添加物と共に溶媒中に（Ｓ）－ニコチンを含む。溶媒は、グリセロール、プロピレングリコール、水またはそれらの混合物を含んでもよい。好ましくは、溶媒は、グリセロールおよびプロピレングリコールを含み、グリセロール対プロピレングリコールの割合は、容積で８０：２０～２０：８０の範囲である。１つまたは複数の添加物は、１つまたは複数の香料を含んでもよい。

（Ｓ）－ニコチンを形成する方法を使用する、ミオスミンおよびイミン還元酵素活性を有する酵素を含むキットも、本明細書に提供される。

特に好ましい反応スキームは、スキーム１として以下に示される：

本発明は、以下の非限定的な例により実証されることになる。

以下の例は、本明細書に開示される方法に関連する結果を実証する。様々な試薬を、方法を例示するために使用した。

使用した酵素は、以下を含む：

下記アミノ酸配列（ａ）または（ｂ）を持つベルコシスポラマリス（Verrucosispora maris）（株ＡＢ－１８－０３２、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｆ４Ｆ８Ｇ５＿ＶＥＲＭＡ）由来ＩＲＥＤ＿Ａ。配列（ａ）は配列番号１と一致し、配列（ｂ）は配列番号２と一致する。

（ａ）ヘキサヒスチジンタグと共に使用して、合計３０２アミノ酸残基：

（ｂ）元の酵素、合計２９６アミノ酸残基：

下記アミノ酸配列（ａ）または（ｂ）を持つメソリゾビウム属、属種Ｌ４８Ｃ０２６Ａ００由来ＩＲＥＤ＿Ｂ、別名６－ホスホグルコン酸脱水素酵素。配列（ａ）は配列番号３と一致し、配列（ｂ）は配列番号４と一致する。

（ａ）ヘキサヒスチジンタグと共に使用して、合計３１０アミノ酸残基：

（ｂ）元の酵素、合計３０４アミノ酸残基：

[実施例１]
生体内変換を、１０ｍＭミオスミンおよびＮＡＤＰ＋（０．５ｍＭ）、グルコース（２５ｍＭ）、グルコース脱水素酵素（１０Ｕ／ｍＬ）、ならびにイミン還元酵素活性を有する酵素の溶液で、０．５ｍＬ規模で行った。使用した酵素は表１に詳述し、Ｅｎｚｙｍｉｃａｌｓから入手可能である。各酵素について、酵素の量は、無細胞抽出物９ｍｇ／ｍｌであった（含有される酵素はおよそ０．９ｍｇ／ｍｌと推定）。特にＩＲＥＤ＿ＢおよびＩＲＥＤ＿Ｃの場合、０．９ｍｇ／ｍｌ無細胞抽出物を使用する追加の試験を行った。

生体内変換から得られた（Ｓ）ノルニコチンの鏡像体過剰率を、ＣｈｉｒａｌｐａｋＡＤ－Ｈカラム（２５０×４．６ｍｍｉｄ）を使用し、ヘキサン：エタノール：ジエチルアミン７４．９：２５．０：０．１（容積／容積／容積）の混合物を用いて３０℃で、１ｍｌ／分間で１８分間溶出して決定した。この方法を使用してミオスミンのノルニコチンへの転換も測定し、相対的な応答係数２．１８：１が、２５４ｎｍでの紫外線吸収検出に対して決定された。

結果を、以下の表１に示す。

（Ｓ）－ノルニコチンの％鏡像体過剰率は、式［（Ｓ）－（Ｒ）］／［（Ｓ）＋（Ｒ）］×１００により同定され、ここで（Ｓ）および（Ｒ）は、それぞれ存在する（Ｓ）および（Ｒ）鏡像異性体の量である。％転換を、式、１００－（ミオスミンの最終量）／（ミオスミンの開始量）×１００により、すなわち消費されるミオスミンの量により同定した。

[実施例２]
反応は、ミオスミン基質に対してグルコース１．５当量および１ｍｏｌ％ＮＡＤＰ＋を使用したことを除いて例１と類似の様式で実施し、反応時間２４時間を利用した。使用した酵素を、表２、表３および表４のそれぞれに詳述する（Ｅｎｚｙｍｉｃａｌｓから入手可能）。

１００ｍＭミオスミン濃度で、０．９ｍｇ／ｍＬ酵素無細胞抽出物を使用した場合、結果は下表に示される通りであった：

１００ｍＭミオスミン濃度で、９ｍｇ／ｍＬ酵素無細胞抽出物を使用した場合、結果は下表に示される通りであった：

２５０ｍＭミオスミン濃度で、９ｍｇ／ｍＬ酵素無細胞抽出物を使用した場合、結果は下表に示される通りであった：

[実施例３]
ｐＨ７．５１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（２００ｍＬ）中のミオスミン（２０ｍｍｏｌ、２．９２４ｇ）、Ｄ－グルコース（３０ｍｍｏｌ、５．４０５ｇ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ナトリウム塩（０．２ｍｍｏｌ、１５７ｍｇ）、酵素ＩＲＥＤ＿Ａ（Ｅｎｚｙｍｉｃａｌｓから入手可能）無細胞抽出凍結乾燥物（１．０ｇ）、グルコース脱水素酵素（２０００Ｕ、４０ｍｇ）の溶液を、３０℃で、２００ｒｐｍでオーバーヘッドスターラーによって２４時間混合した。溶液を、反応経過中にＨＰＬＣを用いてノルニコチンについて分析し、８時間後に７７％の転換、および２４時間後に９９％以上の転換を示し、（Ｓ）－ノルニコチンｅ．ｅ．９８．７％であった。この溶液を、３７％ホルムアルデヒド溶液（８．１ｇ）およびギ酸（２．８ｇ）により８０℃で４時間次いで処理し、反応を２時間後に完了した。冷却後、固体水酸化ナトリウム６ｇを添加し（ｐＨ１２．７）、混合物を２×７５ｍｌＭＴＢＥで抽出した。硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を除去して、ＨＰＬＣによって＞純度９９％（２６０ｎｍでの領域％）であり、鏡像体過剰率９８．７％を有する粗（Ｓ）－ニコチン２．２５ｇを得た。

[実施例４]
ｐＨ７．５１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（２００ｍＬ）中のミオスミン（２０ｍｍｏｌ、２．９２４ｇ）、Ｄ－グルコース（３０ｍｍｏｌ、５．４０５ｇ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ナトリウム塩（０．２ｍｍｏｌ、１５７ｍｇ）、酵素ＩＲＥＤ＿Ｂ（Ｅｎｚｙｍｉｃａｌｓから入手可能）無細胞抽出凍結乾燥物（０．５ｇ）、グルコース脱水素酵素（２０００Ｕ、４０ｍｇ）の溶液を、３０℃で、２００ｒｐｍでオーバーヘッドスターラーによって２４時間混合した。溶液を、反応経過中にＨＰＬＣを用いてノルニコチンについて分析し、４時間後に９１％の転換、および６時間後に９９％以上の転換を示した。２４時間後、（Ｓ）－ノルニコチンは、ｅ．ｅ．９８．２％であった。この溶液を、パラホルムアルデヒド（３ｇ）およびギ酸（２．８ｇ）により８０℃で６時間次いで処理し、反応を４時間後に完了した。冷却後、固体水酸化ナトリウム６ｇを添加し（ｐＨ１２．７）、混合物を２×７５ｍｌＭＴＢＥで抽出した。硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を除去して、ＨＰＬＣによって＞純度９９％（２６０ｎｍでの領域％）であり、鏡像体過剰率９８．３％を有する粗（Ｓ）－ニコチン２．３１ｇを得た。

[実施例５]
この例は、高基質濃度における鏡像体選択性および転換率を実証する。この例は、すべての反応が、グルコース１．５当量、ＮＡＤＰ（ミオスミンに対して１％）、イミン還元酵素、特にＥｎｚｙｍｉｃａｌｓから入手可能なＩＲＥＤ＿Ｃ（４．５ｍｇ／ｍｌ無細胞抽出物）、ＧＤＨ（２５０ｍＭミオスミン濃度当たり１０Ｕ／ｍｌ）、リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５１００ｍＭを使用したことを除いて、例１と類似の様式で２４時間以上実施された。結果を、下に示す。

[実施例６]
この例は、より大きい規模における鏡像体選択性および転換率を実証する。

ｐＨ７．５１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（１０００ｍＬ）中のミオスミン（４００ｍｍｏｌ、５８．５ｇ）、Ｄ－グルコース（６００ｍｍｏｌ、１１８．９ｇ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ナトリウム塩（４ｍｍｏｌ、３．１５ｇ）、酵素ＩＲＥＤ＿Ｃ（Ｅｎｚｙｍｉｃａｌｓから入手可能）無細胞抽出凍結乾燥物（１０．０ｇ）、グルコース脱水素酵素ＣＦＥ（０．３２ｇ）の溶液を、３０℃で、２００ｒｐｍでオーバーヘッドスターラーを用いて２４時間混合した。溶液を、２４時間後にＨＰＬＣでノルニコチンについて分析し、９８％以上の転換を示した。

検査の詳細は、以下の通りである：生体触媒反応混合物を、濃硫酸でｐＨ１～２に酸性化し、次いで、９０℃に２０分間加熱してすべてのタンパク質を沈殿させた。タンパク質を、セライトにより混合物から濾過した。得られた透明な溶液を、４０％ＮａＯＨ溶液でｐＨ＞１１に塩基性化し、メチル－ｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）５００ｍＬで４回抽出した。合わせたＭＴＢＥ相を、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を蒸発させた。ノルニコチンの単離された収率は、茶黄色の液体として４１．１ｇ（７０％）であった。

検査および単離の前にノルニコチン反応混合物の別々の試料を、メチル化ステップに送った。特に、ノルニコチンを単離せずに生体触媒反応混合物にパラホルムアルデヒド（６０ｇ）およびギ酸（４９．２ｇ）を添加した。反応を８５℃に加熱し、強く撹拌して（Ｓ）－ニコチンを形成させた。

[実施例７]
（Ｓ）－ニコチンを形成させる一般的な実験的方法は、以下の通りであった。ＩＲＥＤ＿Ｃ（Ｅｎｚｙｍｉｃａｌｓから入手可能）を使用するミオスミンの（Ｓ）－ノルニコチンへの生体触媒作用を、ミオスミン濃度４００ｍＭで行った。（Ｓ）－ノルニコチンは、メチル－ｔ－ブチルエーテルによる抽出および溶媒除去によって単離されたか、または生体触媒作用の水溶液を９０℃で１５分間加熱してタンパク質を沈殿させ、次いで冷却後、混合物を硫酸でｐＨ１～２に酸性化し、沈殿タンパク質をセライトでの濾過によって除去し、溶液を水酸化ナトリウム水溶液で約ｐＨ７に次いで中和したかいずれかであった。

[実施例７ａ]
ミオスミン（９２ｇ）の酵素還元から粗単離したノルニコチンを、水８００ｍｌに添加した。パラホルムアルデヒド（７４ｇ、４当量）およびギ酸（５８ｇ、２当量）を添加した。混合物を、８０～８５℃まで徐々に温めた。２時間後のＨＰＬＣ分析は、反応の完了を示した。混合物を更に２時間同じ温度で保ち、次いで室温まで冷却した。５０％水酸化ナトリウム溶液を添加して、およそ１３のｐＨを得た。混合物を、ＭＴＢＥ２×５００ｍｌで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、粗（Ｓ）－ニコチンを真空下で蒸留した。約４ｇの前留分後に、精製ニコチン８７ｇを得た（ＨＰＬＣによって＞９９％およびキラルＨＰＬＣによって９９．６％ｅｅ）。

[実施例７ｂ]
実施例１に使用した同じ生体触媒作用からの水性ノルニコチン溶液２．５リットル（５．６３ｇ／１００ｍｌ）に、パラホルムアルデヒド（１１２．５ｇ、４当量）およびギ酸（８８ｇ、２当量）を添加した。混合物を８０～８５℃まで徐々に加熱し、反応は、ガス発生による若干の発泡を伴って約７０℃で始まった。８０～８５℃で１時間後、ＨＰＬＣは、反応が完了していることを示した。反応を、合計４時間加熱し、次いで冷却した。混合物を、５０％水酸化ナトリウム溶液で塩基性化し、ＭＴＢＥ（８００ｍｌ、次いで５００ｍｌ）で抽出した。乾燥後、粗混合物を蒸留して（Ｓ）－ニコチン１１８．７ｇ（ＨＰＬＣにより＞９９％およびＨＰＬＣにより９９．５％ｅｅ）を得た。

[実施例７ｃ]
実施例１に使用した同じ生体触媒作用からの水性ノルニコチン溶液２．５リットル（５．６３ｇ／１００ｍｌ）に、３７％ホルムアルデヒド溶液（２９０ｍｌ、およそ４当量）およびギ酸（８８ｇ、２当量）を添加した。混合物を８０～８５℃まで徐々に加熱し、反応は、ガス発生による若干の発泡を伴って約６０℃で始まった。８０～８５℃で１時間後、ＨＰＬＣは、反応が完了していることを示した。反応を、合計４時間加熱し、次いで冷却した。混合物を、５０％水酸化ナトリウム溶液で塩基性化し、ＭＴＢＥ（８００ｍｌ、次いで５００ｍｌ）で抽出した。乾燥後、粗混合物を蒸留して（Ｓ）－ニコチン１１９．１ｇ（ＨＰＬＣにより＞９９％およびＨＰＬＣにより９９．５％ｅｅ）を得た。

[実施例８]
ミオスミン（２９８ｇ）およびグルコース一水和物（５０５ｇ）の溶液を、０．１Ｍリン酸水素二カリウム緩衝液（６Ｌ）中に作った。アンバーライトＩＲ－１２０樹脂（２ｋｇ、含水）をイオン交換樹脂として添加し、溶液を１２Ｍ水酸化ナトリウム（約０．３Ｌ）でｐＨ７に調整し、次いで２５℃で終夜撹拌して安定なｐＨを確実にした。グルコース脱水素酵素ＧＤＨ－１０２（６ｇ）、ベータ－ＮＡＤＰ＋（６ｇ）およびＡｌｍａｃＧｒｏｕｐから入手可能な酵素ＩＲＥＤ－２０（３０ｇ）を添加し、混合物を２５℃に保ち、４Ｍ水酸化カリウムの添加によってｐＨを６．８～７．０に維持しながら１５０ｒｐｍで次いで攪拌した。７２時間後、溶液をデカンテーションし、アンバーライト樹脂を脱イオン水（３×３Ｌ）で洗浄した。次いで、アンバーライト樹脂をカラムへ移し、脱イオン水（４Ｌ）で更に洗浄し、次いで２Ｍアンモニア水（４Ｌ）と共に３時間振盪し、２Ｍアンモニア（１０Ｌ）で更に洗浄した。合わせた溶液を減圧下で乾燥するまで濃縮して、（Ｓ）－ノルニコチン（１３１．２ｇ）を黄色の液体として得た。反応混合物から更なるノルニコチンを回収するために、再活性化したアンバーライト樹脂（２ｋｇ）を添加し、混合物を室温で終夜攪拌した。同じ処理を上記の通り繰り返して、更なる（Ｓ）－ノルニコチン（５９．８ｇ）を回収し、合計収率１９１．０ｇになった。上の２つのバッチを、別々に（Ｓ）－ニコチンに転換した。より大きいバッチのために、（Ｓ）－ノルニコチン（１２６．２ｇ）を水（１Ｌ）中のパラホルムアルデヒド（１５４．５ｇ）およびギ酸（１１８ｇ）と組み合わせ、得られた撹拌した混合物を、終夜８５℃に加熱した。混合物を、次いで０℃に冷却し、１２Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ１４に調整した。混合物を、メチル－ｔ－ブチルエーテル（３×８容積）で抽出した。有機相を、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、乾燥するまで濃縮し、黄色の液体（１３１．２ｇ）として粗（Ｓ）－ニコチンを得た。（Ｓ）－ノルニコチンの第２のバッチ（５９．８ｇ）を、同じ様式で粗（Ｓ）－ニコチン（６０．７ｇ）へと同じく変換し、粗ニコチンの合計収率１９１．９ｇをもたらした。これらを組み合わせ、減圧下で蒸留して（０．５３～０．６７ｍｂａｒでｂ．ｐ．７０～７７℃）、ＨＰＬＣで決定した鏡像体過剰率９９．３８％およびＨＰＬＣで決定した化学純度９９．９６％を持つ無色液体として（Ｓ）－ニコチン（１７４．５ｇ）を得た。更なる方法を使用して、以下の鏡像体過剰率および化学純度を測定した。

ＨＰＬＣによる鏡像異性純度：比率９５：５のｎ－ヘキサンおよび１－ブタノールで溶出し、０．１％ジエチルアミンを含有するＣｈｉｒａｃｅｌＯＤ－Ｈカラムを使用する。（Ｒ）－鏡像異性体は６．１分間で、（Ｓ）－鏡像異性体は５．６分間で溶出された。鏡像体過剰率は、式［（Ｓ）－（Ｒ）］／［（Ｓ）＋（Ｒ）］により同定したピークの領域から決定される。それにより鏡像体過剰率を、９９．３８％と決定した。

ＨＰＬＣによる化学純度：９５：５で０～１０分間、７０：３０で１０～１３分間；１０：９０で１３～１６分間；その後９５：５の勾配プログラムで（ｉ）水中の２０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ＝８．７）および（ｉｉ）アセトニトリルの混合物を含む溶離液でＸ－ＢｒｉｄｇｅＣ１８カラムを、使用する。温度は、３５℃であった。検出器の条件は、波長２６０ｎｍの紫外線吸収であった。９．９２５分におけるニコチンに対して、１２．１３２分に面積０．０４％で単一の不純物が見られた。面積０．０４％での単一の不純物により、純度を９９．９６％とみなした。比較すると、蒸留前の、使用した２つのバッチの加重平均は９９．７０％であった。

Claims

（ｉ）イミン還元酵素活性を有する酵素でミオスミンを還元して（Ｓ）－ノルニコチンを形成するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）から形成された前記（Ｓ）－ノルニコチンをメチル化して（Ｓ）－ニコチンを形成するステップと
を含む、（Ｓ）－ニコチンを作製する方法。
ステップ（ｉｉ）が、還元的メチル化によって実施される、請求項１に記載の方法。
ステップ（ｉｉ）において、前記（Ｓ）－ノルニコチンが、還元剤の存在下でホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド系化合物を使用して還元的にメチル化される、請求項２に記載の方法。
前記ホルムアルデヒドが、水溶液の一部として導入される、請求項３に記載の方法。
前記ホルムアルデヒド系化合物が、ホルムアルデヒドの二量体、ホルムアルデヒドのポリマーまたはホルムアルデヒドのアセタールである、請求項３に記載の方法。
前記還元剤が、ギ酸、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはパラジウム／水素である、請求項２～４のいずれかに記載の方法。
前記還元剤がギ酸である、請求項２～４のいずれかに記載の方法。
ステップ（ｉ）から形成された前記（Ｓ）－ノルニコチンを単離することなく実施される、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
ステップ（ｉ）において前記（Ｓ）－ノルニコチンが水溶液の一部として形成され、ステップ（ｉｉ）が、前記水溶液に含有される前記（Ｓ）－ノルニコチンをメチル化するステップを含む、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
ステップ（ｉｉ）において前記（Ｓ）－ノルニコチンが、水溶液の一部として導入されるホルムアルデヒドを使用して還元的にメチル化される、請求項９に記載の方法。
前記（Ｓ）－ニコチンが、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の鏡像体過剰率で得られる、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
請求項１～１１のいずれかに記載の方法に従って（Ｓ）－ニコチンを形成するステップと、１つまたは複数の医薬賦形剤と一緒に医薬組成物に前記（Ｓ）－ニコチンを含めるステップとを含む、医薬組成物を生産する方法。
前記医薬組成物が、経皮パッチ、口内錠または吸入処方物である、請求項１２に記載の方法。
請求項１～１１のいずれかに記載の方法に従って（Ｓ）－ニコチンを形成するステップと、１つまたは複数の添加物を含む溶媒中に前記（Ｓ）－ニコチンを含めるステップとを含む、電子たばこデバイス用の処方物を生産する方法。
（Ｓ）－ニコチンを形成する方法におけるミオスミンおよびイミン還元酵素活性を有する酵素の使用であって、前記方法が、請求項１～１１のいずれか一項に記載の特徴を含む、使用。