KR20210082532A

KR20210082532A - 미오스민으로부터의 (s)-니코틴의 제조방법

Info

Publication number: KR20210082532A
Application number: KR1020217018020A
Authority: KR
Inventors: 레이몬드 맥카그; 아쇼크 스리니바산 나라시만
Original assignee: 자노프리마 라이프사이언시스 리미티드
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2019-03-12
Publication date: 2021-07-05
Also published as: KR102393478B1; ES2836481T3; CA3118774C; BR112021009328B1; ZA202103223B; BR112021009328A2; EP3653617A1; HRP20201895T1; JP7068554B2; DK3653617T3; CA3118774A1; EP3653617B1; CN113272289A; AU2019382117B2; SI3653617T1; CN118005607A; PL3653617T3; WO2020098978A1; HUE051799T2; PT3653617T

Abstract

(S)-니코틴([(S)-3-(1-메틸피롤리딘-2-일)피리딘])을 합성에 의해 생산하는 방법이 제공된다.

Description

미오스민으로부터의 (S)-니코틴의 제조방법

본 발명은 (S)-니코틴([(S)-3-(1-메틸피롤리딘-2-일)피리딘])을 합성에 의해 생산하기 위한 방법에 관한 것이다.

니코틴(3-[1-메틸피롤리딘-2-일]피리딘)은 니코티아나(Nicotiana), 즉 담배 식물(tobacco plant)의 잎에서 얻을 수 있는 천연 산물이다. 담배 산업과 제약 분야 전반에 걸쳐 니코틴 제품에 대한 상당한 수요가 있다. 예를 들면, 종래의 담배 제품, 예를 들면 종래의 담배에 대한 수요가 남아 있는데, 이는 니코틴의 중독성으로 인한 것인 것 같다. 그러나, 종래의 담배 제품이 소비자 건강에 미치는 해로운 영향에 대한 우려가 증가함에 따라, 전자 담배 장치, 패치, 로젠지(lozenge), 나잘 스프레이(nasal spray) 및 츄잉껌과 같은 니코틴을 함유하는 담배 대체 제품에 대한 수요가 증가하고 있다. 담배 대체 제품은, 예를 들면 피리딘 알칼로이드(pyridine alkaloid), 다환 방향족, 페놀 및 N-니트로사민의 존재 때문과 같은 해로운 발암 효과를 초래할 수 있는 종래의 담배 제품의 대체품으로 제공될 수 있다. 담배 대체 제품은 구체적으로 니코틴 의존성을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 제약 분야 내에서, 니코틴의 가능한 치료적 응용 분야에 대한 관심도 존재한다.

거울상 이성질체 순도와 화학적 순도 모두가 적절한 수준인 니코틴을 얻는데 어려움이 있다. 니코틴은 광학적으로 활성이고, 즉 니코틴은 두 가지 가능한 거울상 이성질체 형태: (R)-니코틴 또는 (S)-니코틴 중 하나로 존재할 수 있다. 니코틴의 라세미 혼합물을 얻는 방법이 존재한다(예를 들면, WO2016065209). 그러나, (S)-니코틴 (즉, [(S)-3-(1-메틸피롤리딘-2-일)피리딘])이 (R)-니코틴보다 훨씬 더 활성이 있음이 인정된다. 따라서, 담배 산업 및 제약 분야의 수요는 (S) 거울상 이성질체에 대해 높은 수준의 거울상 이성질체 순도를 갖는 니코틴에 대한 것이다. 제약 산업은 특히 새로운 의약품에 필요한 수준의 거울상 이성질체 순도에 대해 엄격한 규정을 부과하고 있으며, 니코틴에 대해 기존에 요구되는 거울상 이성질체 순도가 증가시킬 수 있는 것이 가능하다. 니코틴의 거울상 이성질체 순도에 대한 수요 이외에도, 제약 및 담배 산업 모두에서 높은 수준의 화학적 순도- 니코틴이 아닌 불순물과 비교한 니코틴의 양을 가리키는 화학적 순도 (즉, (R) 및 (S) 거울상 이성질체 형태 모두)를 얻는 것이 중요하다. 제약 산업은 이미 니코틴이 아닌 불순물에 비해 니코틴의 화학적 순도에 대해 매우 엄격한 규정을 부과하고 있다. 사실, 니코틴의 화학적 순도에 대한 현재 미국 약전 참조 표준은 99%이고, 임의의 단일 불순물의 0.5% 이하이다. 앞서 언급된 유해한 발암 효과는 발암 효과를 유발할 수 있는 불순물로 인해 발생할 수 있기 때문에, 높은 화학적 순도는 담배 산업에서 매우 중요하다.

(S)-니코틴은 담배 식물의 잎으로부터 추출함으로써 얻어질 수 있다. 그러나, 니코틴이 이러한 방법으로 얻어지는 경우, 이는 일반적으로 관련된 알칼로이드 불순물의 존재로 인해 95% 미만의 화학적 순도를 갖는다. 담배 잎으로부터 추출에 의해 얻어진 니코틴 샘플의 일반적인 조성은 93% (S)-니코틴, 2.4% (S)-노르니코틴, 3.9% (S)-아나타빈(anatabine) 및 0.5% (S)-아나바신(anabasine)을 포함한다(E. Leete and M. Mueller, J. Am. Chem., Soc., 1982, 104, 6440-44). 알칼로이드 불순물은 니코틴과 유사한 화학적 구조를 가지고, 결과적으로 제거하기 어렵다. 또한, 니코틴의 실제 조성은 지리적 공급처 및 수확 시기와 같은 요인에 따라 달라진다.

또한, (S)-니코틴은 합성 공정에 의해 수득될 수 있다. 선행 기술에, (S)-니코틴을 합성에 의해 생산하기 위한 다양한 예가 존재한다. 예를 들면, 선행 기술에는 (R)-니코틴 및 (S)-니코틴의 라세미 (즉, 동등한) 혼합물이 제조되는 공정이 있으며, 여기서 이러한 라세미 혼합물은 추후에 분해되어, (S) 거울상 이성질체를 수득한다 (US 8,389,733, US 2014/0031554, 및 US 8,378,111). 또한, 선행 기술에, 효소를 생체 촉매(biocatalyst)로 사용하여 (S)-니코틴을 생산하는 합성 공정의 예가 존재하며(WO 2014/174505); 일반적으로 거울상 이성질체 선택 공정에서 생체 촉매의 사용은 니코틴 이외의 분야에도 알려져 있다(L.S. Bleicher et al, J. Org. Chem., 1998, 63, 1109-18, WO 2013/170050, WO2015/073555, P.N Scheller et al, Chembiochem, 2014, 15, 2201-4, Gand et al, J Mol. Cat. B, Enzymatic, 2014, 110, 126-32). 그럼에도 불구하고, 높은 거울상 이성질체 선택성을 갖는 (R) 거울상 이성질체보다 우선적으로 (S)-니코틴을 선택적으로 합성하는 동시에 높은 화학적 순도를 달성하는 것은 여전히 어려움이 있다.

제1 측면에서, (S)-니코틴의 제조방법이 존재하고, 상기 방법은,

(i) 이민 환원 효소 활성(imine reductase activity)을 갖는 효소로 미오스민(myosmine)을 환원시켜, (S)-노르니코틴((S)-nornicotine)을 형성하는 단계; 및

(ii) 단계 (i)에서 형성된 (S)-노르니코틴을 메틸화하여, (S)-니코틴을 형성하는 단계;를 포함한다.

미오스민을 출발 물질로 사용하는 이 방법의 단계(i) 및 (ii)에 의해, (S)-니코틴에 대해 매우 높은 거울상 이성질체 및 화학적 순도가 달성되는 것이 놀랍게도 발견되었다. 이는, 단계 (i)가 (S) 이성질체에 대한 선호도를 갖는 고도의 거울상 이성질체 선택적 합성 단계이고, 단계 (ii)가 이러한 선호가 최종 니코틴 생성물에 유지되면서, 높은 화학적 순도를 유지하도록 하는 것을 나타낸다. 이는, 라세미 혼합물의 분해능에 의존하지 않고도 (S)-니코틴을 생산할 수 있게 해준다. 높은 화학적 순도는 특히 유리하고; 일반적으로 니코틴과 관련된 바람직하지 않은 불순물의 감소된 수준은 잠재적인 불순물과 관련된 부정적인 효과의 위험을 감소시킨다. 또한, 단계 (i) 및 (ii)는 (S)-니코틴을 제조하기 위한 편리한 제조방법을 제공한다.

제2 측면에서, 약제학적 조성물의 제조방법이 존재하고, 상기 제조방법은 제1 측면의 방법을 사용하여 (S)-니코틴을 형성하는 단계, 및 하나 이상의 약제학적 부형제와 함께 약제학적 조성물 중에 상기 (S)-니코틴을 포함시키는 단계를 포함한다.

제3 측면에서, 전자 담배 장치용 제형의 제조방법이 존재하고, 상기 제조방법은 제1 측면의 방법을 사용하여 (S)-니코틴을 형성하는 단계, 및 하나 이상의 첨가제와 함께 용매 중에 상기 (S)-니코틴을 포함시키는 단계를 포함한다.

제4 측면에서, (S)-니코틴의 제조방법에서 이민 환원 효소 활성을 갖는 효소 및 미오스민의 용도가 존재한다.

제5 측면에서, 상기 (S)-니코틴의 제조방법에 사용하기 위한, 이민 환원 효소 활성을 갖는 효소 및 미오스민을 포함하는 키트가 존재한다.

당업자들이 이해하는 바와 같이, 미오스민, (S)-노르니코틴 및 (S)-니코틴은 하기 구조를 갖는다:

당업자들은 미오스민을 제조하기 위한 적절한 반응식과 친숙할 것이다.

본 명세서에서 사용되는 "이민 환원 효소 활성을 갖는 효소(enzyme with imine reductase activity)"는 이민기, 특히 2차 이민기를 상응하는 아민기, 특히 2차 아민기로 비대칭적으로 환원시킬 수 있는 효소를 말한다. 특히, 본 명세서에 개시된 공정에서 사용되는 이민 환원 효소 활성을 갖는 효소는 미오스민의 (S)-노르니코틴으로의 전환을 촉매할 수 있는 효소이다. 당업자는 이러한 효소에 대해 친숙하다. 효소는 분무 건조된 세포의 형태와 같은 다양한 형태로 반응 혼합물에 첨가될 수 있다.

바람직하게는, 이 공정은 미오스민을 (S)-노르니코틴으로 전환시킬 수 있는 효소를 사용하여, (S)-노르니코틴은 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 거울상 이성질체 과잉률로 얻어진다. 거울상 이성질체 과잉률은 실시예에 제공된 방식으로 측정된다. 본 명세서에 개시된 공정에서, 이러한 높은 거울상 이성질체 과잉률은 최종 산물로 결국 얻어지는 (S)-니코틴에 대해 달성된다.

당업자가 이해하는 바와 같이, 이민 환원 효소 활성을 갖는 효소는 일반적으로 NADH/NADPH 의존성 탈수소 효소(NADH/NADPH dependent dehydrogenase)와 같은 NADH/NADPH 의존성 산화 환원 효소(NADH/NADPH dependent oxidoreductase) 및 NADH/NADPH 의존성 이민 환원 효소(NADH/NADPH dependent imine reductase)를 포함한다. NADH/NADPH 의존성 탈수소 효소는 효소 분류 번호 E.C.1.1.1로 언급된 것을 포함하고, 특히 효소 분류 번호 E.C.1.1.1.44로 언급되는 6-포스포글루코네이트 탈수소 효소를 포함한다. 이민 환원 효소는 효소 분류 번호 E.C.1.5.1로 언급된 것, 특히 효소 분류 번호 E.C 1.5.1.48로 언급된 것을 포함한다.

이민 환원 효소의 다른 종(species)의 예는 티아졸리닐 이민(thiazolinyl imine) 환원 효소, 디하이드로폴레이트(dihydrofolate) 환원 효소, △¹-피롤린-2-카르복실레이트 환원 효소, △¹-피페리딘-2-카르복실레이트 환원 효소, 상귀나린(sanguinarine) 환원 효소 및 1,2-디하이드로 레티큐린(1,2-dihydro reticuline) 환원 효소를 포함한다. 이러한 효소는 스트렙토마이세스(Streptomyces), 베루코시스포라(Verrucosispora), 메소르히조비움(Mesorhizobium), 예르시니아(Yersinia), 슈도모나스(Pseudomonas), 칸디다 알비칸스(candida albicans), 에스숄지아(Eschscholzia) 및 파파버(Papaver)와 같은 공급원에서 분리되거나 유래될 수 있다.

또한, 가능한 효소의 예는 WO2013170050 (이 내용은 참조로 포함됨)에 개시된 것들을 포함한다.

효소는 IRED_A, IRED_B, IRED_C, IRED_D, IRED_E, IRED_F, IRED_P, IRED_X, IRED_AB, IRED-20, 또는 이들의 동족체(homologue)일 수 있다. IRED_A, IRED_B, IRED_C, IRED_D, IRED_E, IRED_F, IRED_P, IRED_X, 및 IRED_AB는 Enzymicals로부터 입수 가능하며; IRED-20은 Almac Group으로부터 입수 가능하다. 예를 들면, 하나의 양태에서, 효소는 IRED_A, IRED_B, IRED_C, IRED_D, IRED_E, IRED-20 또는 이들의 동족체이다.

본 명세서에 개시된 효소는 SEQ I.D. NO: 1, SEQ I.D. NO: 2, SEQ I.D. NO: 3, SEQ I.D. NO: 4, 또는 이들의 동족체 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 효소는 SEQ I.D. NO: 1, SEQ I.D. NO: 2, SEQ I.D. NO: 3, 또는 SEQ I.D. NO: 4 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "이의 동족체(a homologue thereof)"는 본 명세서에 개시되는 효소 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효소를 의미한다. 예를 들면, "이의 동족체"는 SEQ I.D. NO: 1, SEQ I.D. NO: 2, SEQ I.D. NO: 3, 또는 SEQ I.D. NO: 4 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효소를 의미할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 "서열 상동성(sequence identity)"은 둘 이상의 아미노산 서열 사이의 관계를 말한다. 하나의 서열에서의 위치가 비교 서열(comparator sequence)의 대응하는 위치의 동일한 아미노산 잔기로 점유되는 경우, 서열은 그 위치에서 "동일한(identical)" 것이라 한다. 퍼센트 "서열 상동성"은 두 서열에서 동일한 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 "동일한" 위치의 수를 얻음으로써 계산된다. 그 후, "동일한" 위치의 수는 비교 창의 총 위치 수로 나누고 100을 곱하여 "서열 상동성"의 퍼센트를 산출한다. "서열 상동성"의 퍼센트는 비교 창을 통해 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정된다. 비교를 위해 서열을 최적으로 정렬하기 위해, 비교 창(comparison window)에서 폴리펩티드 서열의 일부는 참조 서열이 일정하게 유지되는 동안 갭(gap)이라고 하는 추가(addition) 또는 결실(deletion)을 포함할 수 있다. 최적의 정렬은 간격이 있더라도, 참조 서열과 비교 서열 사이에 가능한 가장 많은 "동일한" 위치를 생성하는 정렬이다. 코딩 서열 간의 서열 상동성 수준은 공지된 방법을 사용하여 계산될 수 있다.

서열 상동성은 BLASTP, BLASTN 및 FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol., 215 : 403-410, (1990)), NCBI로부터 입수 가능한 BLASTX 프로그램, 및 Genetics Computer Group (위스콘신, 매디슨)으로부터의 갭(Gap) 프로그램을 포함하여 서열 상동성을 결정하기 위한 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 기반 방법을 사용하여 계산될 수 있다. 서열 상동성의 수준은 아미노산 서열 비교를 위해 갭 패널티가 50이고 갭 길이 패널티가 3인 갭 프로그램을 사용하여 얻어진다.

일반적으로, 단계(i)는 적합한 보조 인자(cofactor), 특히 NADH 또는 NADPH의 존재 하에 효소로 미오스민을 환원시키는 것을 포함한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 효소 및 보조 인자는 별개의 성분으로서 반응 혼합물에 도입될 수 있거나, 예를 들면 효소와 적절한 보조 인자 모두를 함유하는 전체 미생물 세포의 형태로 동일한 성분의 일부로서 반응 혼합물에 도입될 수 있다. 보조 인자를 산화된 형태 (NAD+ 또는 NADP+)에서 환원된 형태 (NADH 또는 NADPH)로 전환하는데 적합한 보조 인자 리사이클링 시스템이 존재할 수 있다. 당업자는 글루코오스(일수화물)/글루코오스 탈수소 효소, 포르메이트/포르메이트 탈수소 효소 및 이소프로판올/알코올 탈수소 효소를 포함하는 보조 인자 리사이클링 시스템과 같은 적절한 보조 인자 리사이클링 시스템에 익숙할 것이다. 보조 인자 리사이클링 시스템이 존재하는 경우, 보조 인자는 산화된 형태, 즉 NAD+ 또는 NADP+로 반응 혼합물에 첨가될 수 있다.

보조 인자는 자체로 미오스민 100부(parts) 당 중량 기준으로 0.02부 내지 10부의 범위 내로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 보조 인자는 미오스민 100부 당 중량 기준으로 0.05부 내지 5부의 범위 내로 존재할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 보조 인자는 미오스민 100부 당 중량 기준으로 0.5부 내지 2부의 범위 내로 존재할 수 있다.

단계 (i)에 존재하는 효소의 양은 미오스민 100부 당 중량 기준으로 0.1부 내지 30부의 양으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 단계 (i)에 존재하는 효소의 양은 미오스민 100부 당 중량 기준으로 0.5부 내지 10부의 범위 내로 존재할 수 있다. 당업자는, 단계 (i)에 존재하는 효소의 양이 단계 (i)의 반응을 위한 목적하는 기간에 따라 조절될 수 있고, 더 많은 효소가 더 짧은 반응 시간을 위해 사용될 수 있고, 그 반대도 마찬가지임을 이해할 것이다.

단계 (i)는 이온 교환 수지의 존재 하에 수행될 수 있지만, 바람직하게는 단계 (i)는 이온 교환 수지의 부재 하에 수행된다. 이온 교환 수지는, 존재하는 경우, 앰버라이트 수지(Amberlite resin), 앰버리스트 수지(Amberlyst resin), 앰버제트 수지(Amberjet resin), 예를 들면 앰버라이트 IR-120, 또는 다우엑스 수지(Dowex resin)이고, 이들 이온 교환 수지의 각각은 Aldrich로부터 입수 가능하다.

단계 (i)에 가능한 pH는 pH 5-9의 범위 내일 수 있다.

(S)-노르니코틴은, (ii) 단계 (i)로부터 형성된 (S)-노르니코틴을 메틸화하여, (S)-니코틴을 형성하는 추가 단계에 의해 (S)-니코틴으로 전환된다.

놀랍게도, 단계 (ii) 이후에 (S)-니코틴이 특히 높은 화학적 순도와 특히 높은 거울상 이성질체 과잉률로 달성되는 것이 발견되었다.

메틸화 단계, 즉 단계 (ii)는 다단계 공정에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 단계 (ii)는 화합물 (예를 들면, N-포르밀-(S)-노르니코틴)을 형성한 후, 이어서 이 화합물을 메틸화 생산물, 즉 (S)-니코틴에 도달하도록 환원시키는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 그러나, 단계 (ii)는 환원성 메틸화(reductive methylation)와 같은 단일 단계 공정에 의해 수행된다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 용어 "환원성 메틸화(reductive methylation)"는 종(species)이 형성되고, 단일 단계에 의해 메틸화 산물 (즉, (S)-니코틴)에 도달하도록 환원되는 공정을 말한다.

바람직하게는, (S)-노르니코틴은 포름알데히드 또는 포름알데히드계 화합물을 사용하여 환원적으로 메틸화된다. 단계 (ii)는 이러한 시약을 사용할 때 특히 효과적이다.

본 명세서에 사용되는 포름알데히드계 화합물은 화학 반응 중에 인시투(in-situ)로 포름알데히드를 생성할 수 있는 화합물을 지칭하는데 사용된다. 당업자들은, 이것이 포름알데히드계 화합물이 반응 혼합물에 첨가된 후, 이어서 분해되어 포름알데히드(및 다른 관련 화합물)를 방출한 후, (S)-노르니코틴과 반응하여 (S)-니코틴을 형성할 수 있는 것을 의미하는 것임을 이해할 것이다. 포름알데히드계 화합물을 첨가하는 경우에, 당업자들은 인시투로 특정한 양의 포름알데히드의 방출을 달성하기 위해서 첨가되는 포름알데히드계 화합물의 적절한 양을 조절하는 방법과 친숙할 것이다.

포름알데히드는 자체로 화학식 HC(O)H를 가지며, 일반적으로 액체 또는 기체로서 도입된다. 포름알데히드는 포름알데히드의 수용액의 일부로서 반응 혼합물에 도입될 수 있다(이러한 수용액은 포르말린이라고 할 수 있음).

포름알데히드계 화합물은 일반적으로 고체 또는 액체로 도입된다. 포름알데히드계 화합물은 포름알데히드의 다이머, 포름알데히드의 폴리머, 포름알데히드의 아세탈일 수 있다. 바람직하게는, 포름알데히드계 화합물은 포름알데히드의 폴리머이다.

당업자들이 이해하는 바와 같이, 용어 "포름알데히드의 폴리머(polymer of formaldehyde)"는 3개 이상의 중합화 포름알데히드 반복 단위를 갖는 화합물을 말한다. 바람직하게는, 포름알데히드의 폴리머는 파라포름알데히드이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "파라포름알데히드(paraformaldehyde)"는 중합도가 8-100 단위인 포름알데히드의 폴리머를 말한다.

(S)-노르니코틴이 포름알데히드 또는 포름알데히드계 화합물을 사용하여 환원적으로 메틸화되는 경우, 포름알데히드 또는 포름알데히드계 화합물은 (S)-노르니코틴의 100부 당 중량 기준으로 50부 내지 110부, 바람직하게는 중량 기준으로 60부 내지 90부의 양으로 첨가될 수 있다. 이러한 양은 존재하는 포름알데히드, 포름알데히드계 화합물 및 (S)-노르니코틴의 실제 양을 말한다. 따라서, 예를 들면 (S)-노르니코틴이 용액의 일부 (예를 들면, 수용액)로 형성되고, 및/또는 포름알데히드 또는 포름알데히드계 화합물이 용액의 일부 (예를 들면, 수용액)로 반응 혼합물에 도입되는 경우, 본 명세서에 개시된 중량부는 각각의 용액에 함유된 포름알데히드, 포름알데히드계 화합물 및 (S)-노르니코틴의 실제 양을 말한다.

메틸화 단계가 환원성 메틸화 단계인 경우, 환원제는 포름산, 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride), 또는 팔라듐/수소, 바람직하게는 포름산일 수 있다. 당업자들이 이해하는 바와 같이, 환원제의 적절한 양은 사용되는 구체적인 환원제에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 환원제가 포름산인 경우, 환원제는 (S)-노르니코틴의 100부 당 중량 기준으로 40-110부, 바람직하게는 40-100부, 더욱 바람직하게는 50부 내지 70부의 양으로 존재할 수 있다. 이러한 양은 존재하는 환원제 및 (S)-노르니코틴의 실제 양을 말한다.

바람직하게는, 단계 (i) 및 (ii)는 단계 (i)로부터 형성된 (S)-노르니코틴을 분리하지 않고 수행될 수 있다. 이는, 특히 편리한 합성 경로를 사용하면서 높은 거울상 이성질체 과잉률 및 높은 화학적 순도로 (S)-니코틴의 형성을 가능하게 한다. 이것을 (S)-니코틴으로 전환하기 전에 단계 (i)에서 형성된 반응 혼합물로부터 (S)-노르니코틴을 분리할 필요성을 피하는 것은 특히 편리한 합성 경로를 제공하는 이점이 있는데, 이는 (S)-노르니코틴의 분리는 비싼 공정 시간 및 에너지의 결과로 공정 집약적일 수 있기 때문이다(예를 들면, 추출 및/또는 용액의 끓음을 위한 많은 양의 용매에 대한 필요성으로 인해). 예를 들면, 단계 (i)에서 (S)-노르니코틴은 수용액의 일부로서 형성될 수 있으며, 여기서 (S)-노르니코틴을 함유하는 수용액은 단계 (ii)에서 직접 사용하기 위해 전달된다. 결과적으로, 메틸화 단계 (단계 (ii))는 단계 (i)로부터 형성되는 (S)-노르니코틴의 수용액에 수행된다. 공정이 이 방식으로 수행되는 경우에, (S)-노르니코틴은 파라포름알데히드를 사용하거나, 수용액의 일부로 반응 혼합물에 도입된 포름 알데히드를 사용함으로써, 환원적으로 메틸화되는 것이 바람직하다. 이러한 방식으로 공정을 수행하는 경우, 반응 혼합물에 수용액의 일부로 도입된 포름알데히드를 사용함으로써 (S)-노르니코틴을 환원적으로 메틸화하는 것이 더욱 바람직한데, 이는 공정이 진행됨에 따라 반응 혼합물의 바람직하지 않은 거품을 감소시키는 것을 발견했기 때문이다.

본 명세서에서 개시되는 공정을 사용하여 제조된 (S)-니코틴은 거울상 이성질체 과잉률이 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99%이다. 당업자들은 거울상 이성질체 과잉률을 측정하는 방법이 친숙할 것이다. 거울상 이성질체 과잉률은, 예를 들면 실시예에 제공된 방식으로 측정될 수 있다.

본 명세서에 개시된 공정을 사용하여 제조된 (S)-니코틴은 화학적 순도가 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 99%이다. 당업자들은 화학적 순도를 측정하는 방법에 친숙할 것이다. 화학적 순도는, 예를 들면 실시예에 제공된 방식으로 측정될 수 있다. 실시예에 의해 달성되는 화학적 순도의 수준은 특히 높다.

상기 방법 단계를 사용하여 제조된 (S)-니코틴은 하나 이상의 약제학적 부형제와 함께 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 바람직하게는, 약제학적 조성물은 경피 패치(transdermal patch), 로젠지(lozenge), 또는 흡입 제형(inhalation formulation)이다.

또한, 상기 방법 단계를 사용하여 제조된 (S)-니코틴은 전자 담배 장치에 포함하기 위한 제형에 포함될 수 있다. 이 제형은 하나 이상의 첨가제를 갖는 용매 중에 (S)-니코틴을 포함한다. 이 용매는 글리세롤(glycerol), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 물, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 용매는 글리세롤 및 프로필렌글리콜을 포함하고, 글리세롤 대 프로필렌글리콜의 비율은 부피 기준으로 80:20 내지 20:80의 범위 내이다. 하나 이상의 첨가제는 하나 이상의 향미료(flavouring agent)를 포함할 수 있다.

또한, (S)-니코틴을 형성하는 방법을 사용하기 위해 이민 환원 효소 활성을 갖는 효소 및 미오스민을 포함하는 키트(kit)가 제공된다.

특히 바람직한 반응식은 하기 도식 1로 나타냈다:

[도식 1]

본 발명은 하기의 비제한적인 실시예로 설명될 것이다.

실시예

하기 실시예는 본 명세서에 개시된 공정과 관련된 결과를 보여준다. 다양한 시약은 공정을 예시화하기 위해 사용되었다.

사용된 효소는 하기를 포함한다:

하기에 제공된 아미노산 서열 (a) 또는 (b)를 갖는 베루코시스포라 마리스(Verrucosispora maris)(균주 AB-18-032, 유니프롯(Uniprot): F4F8G5_VERMA)의 IRED_A - 서열 (a)는 SEQ I.D. NO: 1에 대응하고, 서열 (b)는 SEQ I.D. NO: 2에 대응한다.

(a) 헥사히스티딘 태그(hexahistidine tag)와 사용되는, 총 302개 아미노산 잔기:

MHHHHHHAADSRAPVTVIGLGAMGSALARAFLAAGHPTTVWNRSPDKADDLVGQGAVRAATVADAMSAGNLIVICVLDYRAMREIIDSTGHSPADRVIVNLTSGTPGDARATAAWAQEQGMEYIDGAIMATPSMIGSEETLIFYGGPQEVYDAHADTLRSIAGAGTYLGEEPGLPSLYDVALLGLMWTTWAGFMHSAALLASEKVPAAAFLPYAQAWFEYVISPEVPNLATQVDTGAYPDNDSTLGMQTVAIEHLVEASRTQGVDPTLPEFLHARAEQAIRRGHAGDGFGAVFEVLRAPAAQ

(b) 원래 효소, 총 296개의 아미노산 잔기:

MAADSRAPVTVIGLGAMGSALARAFLAAGHPTTVWNRSPDKADDLVGQGAVRAATVADAMSAGNLIVICVLDYRAMREIIDSTGHSPADRVIVNLTSGTPGDARATAAWAQEQGMEYIDGAIMATPSMIGSEETLIFYGGPQEVYDAHADTLRSIAGAGTYLGEEPGLPSLYDVALLGLMWTTWAGFMHSAALLASEKVPAAAFLPYAQAWFEYVISPEVPNLATQVDTGAYPDNDSTLGMQTVAIEHLVEASRTQGVDPTLPEFLHARAEQAIRRGHAGDGFGAVFEVLRAPAAQ

하기에 제공된 아미노산 서열 (a) 또는 (b)를 갖는 메소히조비움 속(Mesorhizobium sp.) L48C026A00의 IRED_B, 일명 6-포스포글리코네이트 탈수소 효소(6-phosphogluconate dehydrogenase) - 서열 (a)는 SEQ I.D. NO: 3에 대응하고, 서열 (b)는 SEQ I.D. NO: 4에 대응한다.

(a) 헥사히스티딘 태그와 사용되는, 총 310개 아미노산 잔기:

MHHHHHHASNVCVLGAGRMGSSIARTLLDRGYPTWVWNRTAAKCEPLAALGAKVASSVQEGIQAAEVVIINVLDYAASDALLKRDGIASALAGKAVVQLTSGSPRLAREEARWVEAHGAGYLDGAIMATPDFIGKPETAMLYSGSRDVYEKHKPLLFALGGGTNYVGELPGQASALDTALLTQMWGGLFGALQGMAVAEAEGLDLETFRNHLSAFKPVVDASLFDLVDRTNARRFAGDDATLASLGAHYSAFQHLLEACEERGLDAAMPRAMDMIFRQALSLGSMEDDLASLALLFRNGSPRQSREPANA

(b) 원래 효소, 총 304개의 아미노산 잔기:

MASNVCVLGAGRMGSSIARTLLDRGYPTWVWNRTAAKCEPLAALGAKVASSVQEGIQAAEVVIINVLDYAASDALLKRDGIASALAGKAVVQLTSGSPRLAREEARWVEAHGAGYLDGAIMATPDFIGKPETAMLYSGSRDVYEKHKPLLFALGGGTNYVGELPGQASALDTALLTQMWGGLFGALQGMAVAEAEGLDLETFRNHLSAFKPVVDASLFDLVDRTNARRFAGDDATLASLGAHYSAFQHLLEACEERGLDAAMPRAMDMIFRQALSLGSMEDDLASLALLFRNGSPRQSREPANA

실시예 1

10 mM 미오스민과 NADP+ (0.5 mM), 글루코오스 (25 mM), 글루코오스 탈수소 효소 (10 U/ml), 및 이민 환원 효소 활성을 갖는 효소의 용액을 사용하여 0.5 mL 규모로 생체 변환(biotransformation)을 수행했다. 사용된 효소는 Enzymicals로부터 입수 가능한 것으로 표 1에 나타냈다. 각 효소에 대해, 효소의 양은 9 mg/ml의 무세포 추출물(cell free extract) (약 0.9 mg/ml 함유 효소로 추정)이었다. 특히 IRED_B 및 IRED_C의 경우, 0.9 mg/ml 무세포 추출물을 사용하는 추가 시험을 실행했다.

생체 변환으로부터 수득된 (S) 노르니코틴의 거울상 이성질체 과잉률을 30 ℃에서 18분에 걸쳐 1 ml/min로 헥산:에탄올:디에틸아민 74.9:25.0:0.1 (v/v/v)의 혼합물로 용리하는 Chiralpak AD-H 컬럼 (250 × 4.6 mm id)을 사용하여 결정했다. 또한, 이 방법을 사용하여, 미오스민을 254 nm에서 uv 흡수 검출을 위해 측정된 상대 반응 계수가 2.18:1인 노르니코틴으로의 전환율을 측정하였다.

결과를 하기 표 1에 나타냈다.

[표 1]

(S)-노르니코틴에 대한 % 거울상 이성질체 과잉률은 방정식 [(S)-(R)]/((S)+(R)] × 100에 따라 확인되었고, 여기서 (S) 및 (R)은 각각 존재하는 (S) 및 (R) 거울상 이성질체의 양이다. % 전환율은 소모된 미오스민의 양에 따라, 즉 방정식 100-(미오스민의 최종 양)/(미오스민의 출발 양) × 100에 따라 확인했다.

실시예 2

1.5 당량의 글루코오스와 1 mol% NADP+를 미오스민 기질에 사용하고, 24시간 반응 시간을 적용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 유사한 방식으로 반응을 수행하였다. 사용된 효소는 표 2, 3 및 4 (Enzymicals로부터 입수 가능함)에 자세히 나타냈다.

100 mM 미오스민 농도에서, 0.9 mg/mL 효소 무세포 추출물을 사용하여, 결과는 하기 표에 나타낸 것과 같다:

[표 2]

100 mM 미오스민 농도에서, 9 mg/mL 효소 무세포 추출물을 사용하여, 결과는 하기 표에 나타낸 것과 같다:

[표 3]

250 mM 미오스민 농도에서, 9 mg/mL 효소 무세포 추출물을 사용하여, 결과는 하기 표에 나타낸 것과 같다:

[표 4]

실시예 3

미오스민 (20 mmol, 2.924 g), D-글루코오스 (30 mmol, 5.405 g) 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 소듐 염 (0.2 mmol, 157 mg), 효소 IRED_A (Enzymicals로부터 입수 가능함) 무세포 추출물 동결 건조물 (1.0 g), pH 7.5 100 mM 소듐 포스페이트 완충액 (200 mL) 중에서 글루코스 탈수소 효소 (2000 U, 40 mg)의 용액을 오버 헤드 교반기(overhead stirrer)로 30 ℃에서 24시간 동안 200 rpm으로 혼합했다. 용액을 HPLC에 의해 반응 과정 중에 노르니코틴에 대해 분석했고, 8시간 후에 77% 전환율을 보여주고, 98.7 % e.e.로 24시간 후에 99% 초과의 전환율을 보였다. 그 후, 이 용액을 80 ℃에서 4시간 동안 37% 포름알데히드 용액(8.1g) 및 포름산(2.8g)으로 처리하고, 반응을 2시간 후에 완료했다. 냉각 후, 6g의 고체 소듐 하이드록사이드를 첨가하고(pH 12.7), 혼합물을 2 × 75ml MTBE로 추출했다. 소듐 설페이트 상에서 건조시킨 후, 용매를 제거하여 2.25 g의 크루드 (S)-니코틴을 수득했고, 이는 HPLC (260 nm에서 면적%)에 의해 >99% 순수했고, 98.7%의 거울상 이성질체 과잉률을 가졌다.

실시예 4

미오스민 (20 mmol, 2.924 g), D-글루코오스 (30 mmol, 5.405 g) 니코틴 아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 소듐 염 (0.2 mmol, 157 mg), 효소 IRED_B (Enzymicals로부터 입수 가능함) 무세포 추출물 동결 건조물 (0.5 g), pH 7.5 100 mM 소듐 포스페이트 완충액 (200 mL) 중에서 글루코스 탈수소 효소 (2000 U, 40 mg)의 용액을 오버 헤드 교반기로 30 ℃에서 24시간 동안 200 rpm으로 혼합했다. 용액을 HPLC에 의해 반응 과정 중에 노르니코틴에 대해 분석했고, 4시간 후에 91% 전환율을 보여주고, 6시간 후에 99% 초과 전환율을 보여주었다. 24시간 후에, (S)-노르니코틴은 98.2 % e.e였다. 그 후, 이 용액을 80 ℃에서 6시간 동안 파라포름알데히드 용액(3g) 및 포름산(2.8g)으로 처리하고, 반응을 4시간 후에 완료했다. 냉각 후, 6g의 고체 소듐 하이드록사이드를 첨가하고(pH 12.7), 혼합물을 2 × 75ml MTBE로 추출했다. 소듐 설페이트 상에서 건조시킨 후, 용매를 제거하여 2.31 g의 크루드 (S)-니코틴을 수득했고, 이는 HPLC (260 nm에서 면적%)에 의해 >99% 순수했고, 98.3%의 거울상 이성질체 과잉률을 가졌다.

실시예 5

이 실시예는, 높은 기질 농도에서 거울상 선택성과 전환율을 설명한다. 이 실시예는 모든 반응이 글루코스 1.5 당량, NADP (미오스민에 대해 1%), 이민 환원 효소, 특히 Enzymicals로부터 입수 가능한 IRED_C (4.5 mg/ml 무세포 추출물), GDH (미오스민 농도 250 mM 당 10 U/ml), 소듐 포스페이트 완충액 pH 7.5 100mM을 24시간에 걸쳐 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 유사한 방식으로 수행했다. 결과를 하기에 나타냈다.

[표 5]

실시예 6

이 실시예는 더 큰 규모에서 거울상 선택성과 전환율을 설명한다.

미오스민 (400 mmol, 58.5 g), D-글루코오스 (600 mmol, 118.9 g) 니코틴 아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 소듐 염 (4 mmol, 3.15 g), 효소 IRED_C (Enzymicals로부터 입수 가능함) 무세포 추출물 동결 건조물 (10.0 g), pH 7.5 100 mM 소듐 포스페이트 완충액 (1000 mL) 중에서 글루코스 탈수소 효소 CFE (0.32 g)의 용액을 오버 헤드 교반기로 30 ℃에서 24시간 동안 200 rpm으로 혼합했다. 용액을 HPLC에 의해 24시간 후 노르니코틴을 분석했고, 98% 초과 전환율을 보여주었다.

정밀 검사의 상세는 다음과 같다: 생촉매 반응 혼합물을 농축된 황산으로 pH 1-2로 산성화한 후, 90 ℃에서 20분 동안 가열하여, 모든 단백질을 침전시켰다. 단백질은 셀라이트를 통해 혼합물로부터 여과했다. 생성된 투명한 용액을 40% NaOH 용액으로 pH > 11로 염기성화하고, 500 mL 메틸 tert-부틸 에테르 (MTBE)로 4 회 추출했다. 결합된 MTBE 상을 무수 마그네슘 설페이트 상에서 건조시키고, 용매를 증발시켰다. 노르니코틴의 분리된 수율은 갈색-황색 액체로서 41.1 g (70 %)이었다.

정밀 검사 및 분리 전에 노르니코틴 반응 혼합물의 개별 샘플을 메틸화 단계를 통해 취했다. 구체적으로, 노르니코틴을 분리하지 않고, 생체 촉매 반응 혼합물에 파라포름알데히드 (60 g) 및 포름산 (49.2 g)을 첨가했다. 반응을 85 ℃로 가열하고, 격렬하게 교반하여, (S)-니코틴을 형성했다.

실시예 7

(S)-니코틴을 형성하는 일반적인 실험 방법은 다음과 같다. IRED_C (Enzymicals로부터 입수 가능함)를 사용하여 미오스민의 (S)-노르니코틴으로의 생체 촉매 반응을 400 mM 미오스민의 농도에서 수행했다. (S)-노르니코틴을 메틸-tert 부틸 에테르로 추출하고 용매를 제거함으로써 분리하거나, 또는 생체 촉매 반응으로부터의 수용액을 90 ℃에서 15분 동안 가열하여 단백질을 침전시킨 후 혼합물을 냉각시킨 후 황산으로 pH 1-2로 산성화하고, 침전된 단백질을 셀라이트를 통해 여과에 의해 제거한 후, 용액을 소듐 하이드록사이드 수용액으로 약 pH 7로 중화시켰다.

실시예 7a

미오스민의 효소 환원으로부터 분리된 크루드 노르니코틴 (92g)을 800 ml의 물에 첨가했다. 파라포름알데히드 (74g, 4eq) 및 포름산 (58g, 2eq)을 첨가했다. 혼합물을 점차적으로 80-85 ℃로 승온시켰다. 2시간 후 HPLC 분석은 반응의 완료를 나타냈다. 혼합물을 동일한 온도에서 추가 2시간 동안 유지한 후, 실온으로 냉각시켰다. 50% 소듐 하이드록사이드 용액을 첨가하여, 약 13의 pH를 얻었다. 혼합물을 2 × 500 ml MTBE로 추출하고, 소듐 설페이트 상에서 건조시켰다. 용매를 제거하고, 크루드 (S)-니코틴을 진공하에 증류시켰다. 약 4g의 앞 부분 후에, 87g의 정제된 니코틴을 수득했다 (HPLC에 의해 > 99% 및 키랄 HPLC에 의해 99.6% ee).

실시예 7b

실시예 1에서 사용된 것과 동일한 생체 촉매 반응 (5.63g/100ml)으로부터 얻어진 2.5 리터의 노르-니코틴 수용액에 파라포름알데히드 (112.5g, 4eq) 및 포름산 (88g, 2eq)을 첨가했다. 혼합물을 점차적으로 80-85 ℃로 가열하여, 반응을 약 70 ℃에서 시작하고 가스 발생으로 인해 약간의 거품이 발생했다. 80-85 ℃에서 1시간 후, HPLC는 반응이 완료됨을 나타냈다. 반응을 총 4시간 동안 가열한 후 냉각했다. 혼합물을 50% 소듐 하이드록사이드 용액으로 염기성화 하고, MTBE로 추출했다(800ml 이후 500ml). 건조 후, 크루드 혼합물을 증류하여, 118.7g (S)-니코틴 (HPLC에 의해 > 99% 및 HPLC에 의해 99.5% ee)을 수득했다.

실시예 7c

실시예 1에서 사용된 것과 동일한 생체 촉매 반응 (5.63g/100ml)으로부터 얻어진 2.5 리터의 노르-니코틴 수용액에 37% 포름알데히드 용액 (290ml, ~4eq) 및 포름산 (88g, 2eq)을 첨가했다. 혼합물을 점차적으로 80-85 ℃로 가열하여, 반응을 약 60 ℃에서 시작하고 가스 발생으로 인해 약간의 거품이 발생했다. 80-85 ℃에서 1시간 후, HPLC는 반응이 완료됨을 나타냈다. 반응을 총 4시간 동안 가열한 후 냉각했다. 혼합물을 50% 소듐 하이드록사이드 용액으로 염기성화 하고, MTBE로 추출했다(800ml 이후 500ml). 건조 후, 크루드 혼합물을 증류하여, 119.1g (S)-니코틴 (HPLC에 의해 > 99% 및 HPLC에 의해 99.5% ee)을 수득했다.

실시예 8

미오스민 (298g)과 글루코오스 일수화물 (505g)의 용액을 0.1M 디포타슘 수소 포스페이트 완충액(dipotassium hydrogen phosphate buffer) (6L)에서 제조했다. 앰버라이트 IR-120 수지 (2kg, 습식)를 이온 교환 수지로 첨가하고, 용액을 12M 소듐 하이드록사이드 (약 0.3 L)로 pH 7로 조정한 후, 안정된 pH를 보증하기 위해 25 ℃에서 밤새 교반했다. 글루코오스 탈수소화 효소 GDH-102 (6 g), 베타-NADP+ (6 g) 및 Almac Group으로부터 입수 가능한 효소 IRED-20 (30 g)을 첨가한 후, 혼합물을 25 ℃에서 유지하면서 150 rpm으로 교반하면서, 4M 포타슘 하이드록사이드를 첨가하여 pH를 6.8-7.0 범위 내로 유지했다. 72시간 후, 용액을 디켄팅하고(decanted), 앰버라이트 수지를 탈이온수(3 × 3 L)로 세정했다. 그 후, 앰버라이트 수지를 컬럼으로 옮기고, 탈이온수(4 L)로 추가 세정한 후, 3시간 동안 2M 암모늄 용액(4 L)과 흔들고, 2M 암모니아 (10 L)로 추가 세정했다. 혼합 용액을 감압 하에 농축 건조시켜, (S)-노르니코틴 (131.2 g)을 황색 액체로서 수득했다. 반응 혼합물에서 노르니코틴을 추가로 회수하기 위해, 재활성화된 앰버라이트 수지 (2 kg)를 여기에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. 상기와 동일한 처리를 반복하여, 추가 (S)-노르니코틴 (59.8 g)을 회수하여, 총 수율을 191.0g으로 만들었다. 상기 2개의 배치는 별도로 (S)-니코틴으로 전환되었다. 더 큰 배치의 경우, (S)-노르니코틴 (126.2g)을 물 (1L) 중 파라포름알데히드 (154.5g) 및 포름산 (118g)과 조합하고, 생성된 교반 혼합물을 밤새 85 ℃로 가열했다. 그 후, 혼합물을 0 ℃로 냉각시키고, 12M 소듐 하이드록사이드로 pH 14로 조정했다. 혼합물을 메틸 tert-부틸 에테르 (3 × 8 vols)로 추출했다. 유기 상을 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, 농축 건조시켜, 크루드 (S)-니코틴을 황색 액체 (131.2g)로서 수득했다. (S)-노르니코틴 (59.8g)의 두 번째 배치도 마찬가지로 동일한 방식으로 크루드 (S)-니코틴 (60.7g)으로 전환되어, 크루드 니코틴의 총 수율이 191.9g이 되었다. 이들을 혼합하고, 감압 (0.53-0.67 mbar에서 bp 70-77 ℃) 증류하여, (S)-니코틴 (174.5g)을 무색 액체로서 수득했고, 이는 HPLC에 의해 결정된 거울상 이성질체 과잉률이 99.38%이고, HPLC에 의해 측정된 화학적 순도가 99.96%였다. 거울상 이성질체 과잉률 및 화학적 순도를 측정하는데 사용된 추가 공정을 하기에 나타냈다.

HPLC에 의한 거울상 이성질체 순도: n-헥산 및 1-부탄올을 95:5의 비율로 용리하고, 0.1% 디에틸아민을 함유하는 Chiracel OD-H 컬럼을 사용했다. (R)-거울상 이성질체를 6.1분에 용리했고, (S)-거울상 이성질체를 5.6분에 용리했다. 거울상 이성질체 과잉률은 방정식 [(S)-(R)]/((S)+(R)]에 따라 확인된 피크 면적으로부터 결정되었다. 따라서, 거울상 이성질체 과잉률은 99.38 %로 결정되었다.

HPLC에 의한 화학적 순도: 95:5로 0-10분; 70:30로 10-13분; 10:90으로 13-16분; 이어서 95:5의 구배 프로그램으로 (i) 물 (pH=8.7) 중 20 mM 암모늄 비카보네이트(ammonium bicarbonate) 및 (ii) 아세토니트릴의 혼합물을 포함하는 용리액과 함께 X-Bridge C18 컬럼 사용했다. 온도는 35 ℃였다. 검출기의 조건은 260 nm의 파장에서 UV 흡수였다. 0.04% 면적에서 12.132분에 단일 불순물이 발견된 반면에 9.925분에 니코틴이 발견되었다. 0.04% 면적에 단일 불순물을 사용하여, 순도는 99.96%로 간주되었다. 대조적으로, 증류 이전에 사용된 2개 배치의 가중 평균(weighted average)은 99.70%였다.

SEQUENCE LISTING <110> Zanoprima Lifesciences Limited <120> Process <130> APC00904EP <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 302 <212> PRT <213> Verrucosispora maris <400> 1 Met His His His His His His Ala Ala Asp Ser Arg Ala Pro Val Thr 1 5 10 15 Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu Ala Arg Ala Phe Leu 20 25 30 Ala Ala Gly His Pro Thr Thr Val Trp Asn Arg Ser Pro Asp Lys Ala 35 40 45 Asp Asp Leu Val Gly Gln Gly Ala Val Arg Ala Ala Thr Val Ala Asp 50 55 60 Ala Met Ser Ala Gly Asn Leu Ile Val Ile Cys Val Leu Asp Tyr Arg 65 70 75 80 Ala Met Arg Glu Ile Ile Asp Ser Thr Gly His Ser Pro Ala Asp Arg 85 90 95 Val Ile Val Asn Leu Thr Ser Gly Thr Pro Gly Asp Ala Arg Ala Thr 100 105 110 Ala Ala Trp Ala Gln Glu Gln Gly Met Glu Tyr Ile Asp Gly Ala Ile 115 120 125 Met Ala Thr Pro Ser Met Ile Gly Ser Glu Glu Thr Leu Ile Phe Tyr 130 135 140 Gly Gly Pro Gln Glu Val Tyr Asp Ala His Ala Asp Thr Leu Arg Ser 145 150 155 160 Ile Ala Gly Ala Gly Thr Tyr Leu Gly Glu Glu Pro Gly Leu Pro Ser 165 170 175 Leu Tyr Asp Val Ala Leu Leu Gly Leu Met Trp Thr Thr Trp Ala Gly 180 185 190 Phe Met His Ser Ala Ala Leu Leu Ala Ser Glu Lys Val Pro Ala Ala 195 200 205 Ala Phe Leu Pro Tyr Ala Gln Ala Trp Phe Glu Tyr Val Ile Ser Pro 210 215 220 Glu Val Pro Asn Leu Ala Thr Gln Val Asp Thr Gly Ala Tyr Pro Asp 225 230 235 240 Asn Asp Ser Thr Leu Gly Met Gln Thr Val Ala Ile Glu His Leu Val 245 250 255 Glu Ala Ser Arg Thr Gln Gly Val Asp Pro Thr Leu Pro Glu Phe Leu 260 265 270 His Ala Arg Ala Glu Gln Ala Ile Arg Arg Gly His Ala Gly Asp Gly 275 280 285 Phe Gly Ala Val Phe Glu Val Leu Arg Ala Pro Ala Ala Gln 290 295 300 <210> 2 <211> 296 <212> PRT <213> Verrucosispora maris <400> 2 Met Ala Ala Asp Ser Arg Ala Pro Val Thr Val Ile Gly Leu Gly Ala 1 5 10 15 Met Gly Ser Ala Leu Ala Arg Ala Phe Leu Ala Ala Gly His Pro Thr 20 25 30 Thr Val Trp Asn Arg Ser Pro Asp Lys Ala Asp Asp Leu Val Gly Gln 35 40 45 Gly Ala Val Arg Ala Ala Thr Val Ala Asp Ala Met Ser Ala Gly Asn 50 55 60 Leu Ile Val Ile Cys Val Leu Asp Tyr Arg Ala Met Arg Glu Ile Ile 65 70 75 80 Asp Ser Thr Gly His Ser Pro Ala Asp Arg Val Ile Val Asn Leu Thr 85 90 95 Ser Gly Thr Pro Gly Asp Ala Arg Ala Thr Ala Ala Trp Ala Gln Glu 100 105 110 Gln Gly Met Glu Tyr Ile Asp Gly Ala Ile Met Ala Thr Pro Ser Met 115 120 125 Ile Gly Ser Glu Glu Thr Leu Ile Phe Tyr Gly Gly Pro Gln Glu Val 130 135 140 Tyr Asp Ala His Ala Asp Thr Leu Arg Ser Ile Ala Gly Ala Gly Thr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Glu Glu Pro Gly Leu Pro Ser Leu Tyr Asp Val Ala Leu 165 170 175 Leu Gly Leu Met Trp Thr Thr Trp Ala Gly Phe Met His Ser Ala Ala 180 185 190 Leu Leu Ala Ser Glu Lys Val Pro Ala Ala Ala Phe Leu Pro Tyr Ala 195 200 205 Gln Ala Trp Phe Glu Tyr Val Ile Ser Pro Glu Val Pro Asn Leu Ala 210 215 220 Thr Gln Val Asp Thr Gly Ala Tyr Pro Asp Asn Asp Ser Thr Leu Gly 225 230 235 240 Met Gln Thr Val Ala Ile Glu His Leu Val Glu Ala Ser Arg Thr Gln 245 250 255 Gly Val Asp Pro Thr Leu Pro Glu Phe Leu His Ala Arg Ala Glu Gln 260 265 270 Ala Ile Arg Arg Gly His Ala Gly Asp Gly Phe Gly Ala Val Phe Glu 275 280 285 Val Leu Arg Ala Pro Ala Ala Gln 290 295 <210> 3 <211> 310 <212> PRT <213> Mesorhizobium sp. L48C026A00 <400> 3 Met His His His His His His Ala Ser Asn Val Cys Val Leu Gly Ala 1 5 10 15 Gly Arg Met Gly Ser Ser Ile Ala Arg Thr Leu Leu Asp Arg Gly Tyr 20 25 30 Pro Thr Trp Val Trp Asn Arg Thr Ala Ala Lys Cys Glu Pro Leu Ala 35 40 45 Ala Leu Gly Ala Lys Val Ala Ser Ser Val Gln Glu Gly Ile Gln Ala 50 55 60 Ala Glu Val Val Ile Ile Asn Val Leu Asp Tyr Ala Ala Ser Asp Ala 65 70 75 80 Leu Leu Lys Arg Asp Gly Ile Ala Ser Ala Leu Ala Gly Lys Ala Val 85 90 95 Val Gln Leu Thr Ser Gly Ser Pro Arg Leu Ala Arg Glu Glu Ala Arg 100 105 110 Trp Val Glu Ala His Gly Ala Gly Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala 115 120 125 Thr Pro Asp Phe Ile Gly Lys Pro Glu Thr Ala Met Leu Tyr Ser Gly 130 135 140 Ser Arg Asp Val Tyr Glu Lys His Lys Pro Leu Leu Phe Ala Leu Gly 145 150 155 160 Gly Gly Thr Asn Tyr Val Gly Glu Leu Pro Gly Gln Ala Ser Ala Leu 165 170 175 Asp Thr Ala Leu Leu Thr Gln Met Trp Gly Gly Leu Phe Gly Ala Leu 180 185 190 Gln Gly Met Ala Val Ala Glu Ala Glu Gly Leu Asp Leu Glu Thr Phe 195 200 205 Arg Asn His Leu Ser Ala Phe Lys Pro Val Val Asp Ala Ser Leu Phe 210 215 220 Asp Leu Val Asp Arg Thr Asn Ala Arg Arg Phe Ala Gly Asp Asp Ala 225 230 235 240 Thr Leu Ala Ser Leu Gly Ala His Tyr Ser Ala Phe Gln His Leu Leu 245 250 255 Glu Ala Cys Glu Glu Arg Gly Leu Asp Ala Ala Met Pro Arg Ala Met 260 265 270 Asp Met Ile Phe Arg Gln Ala Leu Ser Leu Gly Ser Met Glu Asp Asp 275 280 285 Leu Ala Ser Leu Ala Leu Leu Phe Arg Asn Gly Ser Pro Arg Gln Ser 290 295 300 Arg Glu Pro Ala Asn Ala 305 310 <210> 4 <211> 304 <212> PRT <213> Mesorhizobium sp. L48C026A00 <400> 4 Met Ala Ser Asn Val Cys Val Leu Gly Ala Gly Arg Met Gly Ser Ser 1 5 10 15 Ile Ala Arg Thr Leu Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Thr Trp Val Trp Asn 20 25 30 Arg Thr Ala Ala Lys Cys Glu Pro Leu Ala Ala Leu Gly Ala Lys Val 35 40 45 Ala Ser Ser Val Gln Glu Gly Ile Gln Ala Ala Glu Val Val Ile Ile 50 55 60 Asn Val Leu Asp Tyr Ala Ala Ser Asp Ala Leu Leu Lys Arg Asp Gly 65 70 75 80 Ile Ala Ser Ala Leu Ala Gly Lys Ala Val Val Gln Leu Thr Ser Gly 85 90 95 Ser Pro Arg Leu Ala Arg Glu Glu Ala Arg Trp Val Glu Ala His Gly 100 105 110 Ala Gly Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala Thr Pro Asp Phe Ile Gly 115 120 125 Lys Pro Glu Thr Ala Met Leu Tyr Ser Gly Ser Arg Asp Val Tyr Glu 130 135 140 Lys His Lys Pro Leu Leu Phe Ala Leu Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Val 145 150 155 160 Gly Glu Leu Pro Gly Gln Ala Ser Ala Leu Asp Thr Ala Leu Leu Thr 165 170 175 Gln Met Trp Gly Gly Leu Phe Gly Ala Leu Gln Gly Met Ala Val Ala 180 185 190 Glu Ala Glu Gly Leu Asp Leu Glu Thr Phe Arg Asn His Leu Ser Ala 195 200 205 Phe Lys Pro Val Val Asp Ala Ser Leu Phe Asp Leu Val Asp Arg Thr 210 215 220 Asn Ala Arg Arg Phe Ala Gly Asp Asp Ala Thr Leu Ala Ser Leu Gly 225 230 235 240 Ala His Tyr Ser Ala Phe Gln His Leu Leu Glu Ala Cys Glu Glu Arg 245 250 255 Gly Leu Asp Ala Ala Met Pro Arg Ala Met Asp Met Ile Phe Arg Gln 260 265 270 Ala Leu Ser Leu Gly Ser Met Glu Asp Asp Leu Ala Ser Leu Ala Leu 275 280 285 Leu Phe Arg Asn Gly Ser Pro Arg Gln Ser Arg Glu Pro Ala Asn Ala 290 295 300

Claims

(S)-니코틴의 제조방법으로서,
상기 방법은,
(i) 이민 환원 효소 활성을 갖는 효소로 미오스민(myosmine)을 환원시켜, (S)-노르니코틴((S)-nornicotine)을 형성하는 단계; 및
(ii) 단계 (i)에서 형성된 (S)-노르니코틴을 메틸화하여, (S)-니코틴을 형성하는 단계;를 포함하는 것인, (S)-니코틴의 제조방법.
제1항에 있어서,
단계 (ii)는 환원성 메틸화(reductive methylation)에 의해 수행되는 것인, (S)-니코틴의 제조방법.
제2항에 있어서,
단계 (ii)에서 (S)-노르니코틴은 환원제의 존재 하에 포름알데히드 또는 포름 알데히드계 화합물을 사용하여 환원적으로 메틸화되는 것인, (S)-니코틴의 제조방법.
제3항에 있어서,
상기 포름알데히드는 수용액의 일부로서 도입되는 것인, (S)-니코틴의 제조방법.
제3항에 있어서,
상기 포름알데히드계 화합물은 포름알데히드의 다이머(dimer), 포름알데히드의 폴리머, 또는 포름알데히드의 아세탈인 것인, (S)-니코틴의 제조방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 환원제는 포름산(formic acid), 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride), 또는 팔라듐/수소(palladium/hydrogen)인 것인, (S)-니코틴의 제조방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 환원제는 포름산인 것인, (S)-니코틴의 제조방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 단계 (i)로부터 형성된 (S)-노르니코틴의 분리 없이 수행되는 것인, (S)-니코틴의 제조방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (i)에서 (S)-노르니코틴은 수용액의 일부로 형성되고, 단계 (ii)는 상기 수용액 내에 함유되는 (S)-노르니코틴을 메틸화하는 것을 포함하는 것인, (S)-니코틴의 제조방법.
제9항에 있어서,
단계 (ii)에서 (S)-노르니코틴은 수용액의 일부로 도입되는 포름알데히드를 사용하여 환원적으로 메틸화되는 것인, (S)-니코틴의 제조방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (S)-니코틴은 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 거울상 이성질체 과잉률(enantiomeric excess)로 수득되는 것인, (S)-니코틴의 제조방법.
약제학적 조성물의 제조방법으로서, 상기 방법은,
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 따라 (S)-니코틴을 형성하는 단계, 및 하나 이상의 약제학적 부형제와 함께 약제학적 조성물 중에 상기 (S)-니코틴을 포함시키는 단계를 포함하는 것인, 약제학적 조성물의 제조방법.
제12항에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 경피 패치, 로젠지(lozenge), 또는 흡입 제형(inhalation formulation)인 것인, 약제학적 조성물의 제조방법.
전자 담배 장치용 제형의 제조방법으로서, 상기 방법은,
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 따라 (S)-니코틴을 형성하는 단계, 및 하나 이상의 첨가제와 함께 용매 중에 상기 (S)-니코틴을 포함시키는 단계를 포함하는 것인, 전자 담배 장치용 제형의 제조방법.
(S)-니코틴의 제조방법에서 이민 환원 효소 활성을 갖는 효소 및 미오스민의 용도로서, 상기 방법은 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 특징을 포함하는 것인, 용도.