BR112021009328A2

BR112021009328A2 - processo para a preparação de (s)-nicotina a partir de miosmina

Info

Publication number: BR112021009328A2
Application number: BR112021009328-1A
Authority: BR
Inventors: Raymond McCague; Ashok Srinivasan NARASIMHAN
Original assignee: Zanoprima Lifesciences Limited
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2019-03-12
Publication date: 2021-08-17
Also published as: EP3653617B1; KR102393478B1; CA3118774C; SI3653617T1; WO2020098978A1; CA3118774A1; DK3653617T3; JP2022507375A; ES2836481T3; ZA202103223B; PL3653617T3; EP3653617A1; BR112021009328B1; HUE051799T2; CN118005607A; JP7068554B2; PT3653617T; MX2021005584A; CN113272289A; HRP20201895T1

Abstract

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE (S)-NICOTINA A PARTIR DE MIOSMINA. É fornecido um processo para produzir sinteticamente (S)-nicotina ([(S)-3-(1 metilpirrolidin-2-il)piridina]).

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE (S)-NICOTINA A PARTIR DE MIOSMINA CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a um processo para produção sintética de (S)-nicotina ([(S)-3-(1-metilpirrolidin-2-il)piridina]).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A nicotina (3-[1-metilpirrolidin-2-il]piridina) é um produto natural que pode ser obtido a partir das folhas de Nicotiana, ou seja, a planta do tabaco. Há uma demanda considerável por produtos de nicotina em toda a indústria do tabaco e também em todo o campo farmacêutico. Por exemplo, continua a haver uma demanda por produtos de tabaco tradicionais, por exemplo, cigarros tradicionais, o que é provavelmente devido à natureza viciante da nicotina. No entanto, devido à crescente preocupação com o impacto prejudicial dos produtos de cigarros tradicionais na saúde do consumidor, há uma demanda crescente por produtos substitutos do tabaco que contenham nicotina, tais como dispositivos de cigarro eletrônico, adesivos, pastilhas, spray nasal e goma de mascar. Os produtos substitutos do tabaco podem ser fornecidos como substitutos dos produtos do tabaco tradicionais que, de outra forma, resultariam em efeitos cancerígenos prejudiciais; tais como devido à presença de alcaloides piridínicos, aromáticos policíclicos, fenóis e N-nitrosaminas. Os produtos substitutos do tabaco podem ser usados especificamente para tratar a dependência da nicotina. Dentro do campo farmacêutico, também há interesse nas possíveis aplicações terapêuticas da nicotina.

[003] Existem desafios para a obtenção de nicotina com níveis adequados de pureza enantiomérica e pureza química. A nicotina é opticamente ativa, ou seja, pode existir em uma das duas formas enantioméricas possíveis: (R)-nicotina ou (S)-nicotina. Existem processos para a obtenção de misturas racêmicas de nicotina (por exemplo, WO2016065209). No entanto, é reconhecido que (S)-

nicotina (ou seja, [(S)-3-(1-metilpirrolidin-2-il)piridina]) é significativamente mais ativa do que (R)-nicotina. Portanto, a demanda na indústria do tabaco e no campo farmacêutico é por nicotina com alto grau de pureza enantiomérica em relação ao enantiômero (S). A indústria farmacêutica, em particular, impõe regulamentações estritas sobre o nível necessário de pureza enantiomérica para novos produtos farmacêuticos, e é possível que o nível necessário existente de pureza enantiomérica para a nicotina possa aumentar. Além da demanda por pureza enantiomérica da nicotina, obter um alto nível de pureza química também é importante tanto na indústria farmacêutica quanto na indústria do tabaco - pureza química se refere à quantidade de nicotina (ou seja, ambas as formas enantioméricas (R) e (S)) em comparação com impurezas não nicotínicas. A indústria farmacêutica já impõe regulamentações muito rígidas sobre o nível exigido de pureza química da nicotina em comparação com as impurezas não nicotínicas. Na verdade, o padrão de referência atual da Farmacopeia dos EUA para a pureza química da nicotina é de pelo menos 99% com não mais do que 0,5% de qualquer impureza única. Uma alta pureza química também é de grande importância para a indústria do tabaco, pois os efeitos cancerígenos prejudiciais mencionados acima podem ser causados por impurezas que são capazes de exercer um efeito cancerígeno.

[004] A (S)-Nicotina pode ser obtida por extração a partir das folhas da planta do tabaco. No entanto, quando a nicotina é obtida dessa forma, normalmente tem uma pureza química inferior a 95% devido à presença de impurezas alcaloides relacionadas. Uma composição típica de uma amostra de nicotina obtida por extração a partir de folhas de tabaco compreende 93% (S)- nicotina, 2,4% (S)-nornicotina, 3,9% (S)-anatabina e 0,5% (S)-anabasina (E. Leete e M. Mueller, J. Am. Chem., Soc., 1982, 104, 6440-44). As impurezas alcaloides têm uma estrutura química semelhante à da nicotina e, consequentemente, são difíceis de remover. A composição real da nicotina também depende de fatores tais como a origem geográfica e a época da colheita.

[005] A (S)-Nicotina também pode ser obtida por um processo sintético. Existem vários exemplos no estado da técnica para produzir sinteticamente (S)- nicotina. Por exemplo, no estado da técnica há processos em que uma mistura racêmica (ou seja, igual) de (R)-nicotina e (S)-nicotina é feita, em que esta mistura racêmica é subsequentemente resolvida para obter o enantiômero (S) (US 8,389,733, US 2014/0031554 e US 8,378,111). Há também um exemplo no estado da técnica de um processo sintético para produção de (S)-nicotina usando uma enzima como biocatalisador (WO 2014/174505); o uso de biocatalisadores em processos enantiomericamente seletivos em geral são conhecidos fora do campo da nicotina (L.S. Bleicher et al. J. Org. Chem., 1998, 63, 1109-18, WO 2013/170050, WO2015/073555, P.N Scheller et al, Chembiochem, 2014, 15, 2201-4, Gand et al, J Mol. Cat. B, Enzimático, 2014, 110, 126-32). No entanto, sintetizar seletivamente (S)-nicotina em preferência ao enantiômero (R) com alta seletividade enantiomérica enquanto também atinge alta pureza química permanece um desafio.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Em um primeiro aspecto, há um processo de produção de (S)- nicotina que compreende as etapas de: (i) reduzir miosmina com uma enzima com atividade de imina redutase para formar (S)-nornicotina; e (ii) metilar a (S)-nornicotina formada a partir da etapa (i) para formar (S)- nicotina.

[007] Foi surpreendentemente descoberto que por meio das etapas (i) e (ii) deste processo, em que a miosmina é usada como material de partida, uma pureza enantiomérica e química muito elevada foi alcançada para a (S)-nicotina.

Isso indica que a etapa (i) é uma etapa sintética seletiva altamente enantiomérica com preferência para o isômero (S), e que a etapa (ii) é tal que esta preferência é retida no produto final de nicotina, embora mantendo também alta pureza química. Isso permite a produção de (S)-nicotina sem ter que recorrer à resolução de uma mistura racêmica. A alta pureza química é particularmente vantajosa; um nível reduzido de impurezas indesejáveis tipicamente associadas à nicotina resulta em um risco reduzido de potenciais efeitos negativos relacionados a impurezas. Além disso, as etapas (i) e (ii) oferecem um processo de fabricação conveniente para a produção de (S)- nicotina.

[008] Em um segundo aspecto, há um processo para a produção de uma composição farmacêutica, compreendendo formar (S)-nicotina usando o processo do primeiro aspecto e incluindo a (S)-nicotina na composição farmacêutica juntamente com um ou mais excipientes farmacêuticos.

[009] Em um terceiro aspecto, há um processo para a produção de uma formulação para um dispositivo de cigarro eletrônico, compreendendo formar (S)-nicotina usando o processo do primeiro aspecto e incluindo a (S)-nicotina em um solvente com um ou mais aditivos.

[010] Em um quarto aspecto, há o uso de miosmina e uma enzima com atividade imina redutase em um processo de formação de (S)-nicotina.

[011] Em um quinto aspecto, há um kit compreendendo miosmina e uma enzima com atividade imina redutase, para uso no processo acima de formação de (S)-nicotina.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS

[012] Como o técnico no assunto irá apreciar, miosmina, (S)-nornicotina e (S)-nicotina, tem as seguintes estruturas:

miosmina (S)-nornicotina (S)-nicotina

[013] O técnico no assunto estará familiarizado com os esquemas de reação apropriados para fazer miosmina.

[014] Como usado na presente invenção, uma "enzima com atividade de imina redutase" refere-se a uma enzima capaz de reduzir assimetricamente um grupo imina, em particular um grupo imina secundário, ao grupo amina correspondente, em particular um grupo amina secundário. Em particular, a enzima com atividade de imina redutase usada no processo divulgado na presente invenção é uma enzima capaz de catalisar a conversão de miosmina em (S)-nornicotina. O técnico no assunto está familiarizado com essas enzimas. A enzima pode ser adicionada à mistura de reação em uma variedade de formas, tais como na forma de células secas por pulverização.

[015] Preferencialmente, o processo usa uma enzima capaz de converter miosmina em (S)-nornicotina de modo que a (S)-nornicotina seja obtida com um excesso enantiomérico de pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98%, mais preferencialmente pelo menos 99%. O excesso enantiomérico é medido da maneira dada nos Exemplos. Nos processos divulgados na presente invenção, este alto excesso enantiomérico também é obtido para a (S)-nicotina que é eventualmente obtida como produto final.

[016] Como o técnico no assunto irá apreciar, as enzimas com atividade de imina redutase incluem tipicamente oxidorredutases dependentes de NADH/NADPH, tais como desidrogenases dependentes de NADH/NADPH e redutases de imina dependentes de NADH/NADPH. As desidrogenases dependentes de NADH/NADPH incluem aquelas referidas pelo número de classificação de enzima E.C.1.1.1 e incluem, em particular, 6-fosfogluconato desidrogenases, referidas pelo número de classificação de enzima E.C.1.1.1.44. As iminas redutases incluem aquelas referidas com o número de classificação de enzima E.C.1.5.1, em particular aquelas referidas com o número de classificação de enzima E.C.1.5.1.48.

[017] Exemplos de diferentes espécies de imina redutases incluem tiazolinila imina redutase, dihidrofolato redutase, Δ1-pirrolina-2-carboxilato redutase, Δ1-piperideina-2-carboxilato redutase, sanguinarina redutase e 1,2-di- hidro reticulina redutase. Essas enzimas podem ser isoladas ou derivadas de fontes tais como Streptomyces, Verrucosispora, Mesorhizobium, Yersinia, Pseudomonas, Candida albicans, Eschscholzia e Papaver.

[018] Exemplos de possíveis enzimas também incluem aquelas divulgadas em WO2013170050 (cujo conteúdo é incorporado por referência).

[019] A enzima pode ser IRED_A, IRED_B, IRED_C, IRED_D, IRED_E, IRED_F, IRED_P, IRED_X, IRED_AB, IRED-20 ou um homólogo dos mesmos. IRED_A, IRED_B, IRED_C, IRED_D, IRED_E, IRED_F, IRED_P, IRED_X e IRED_AB estão disponíveis na Enzymicals; IRED-20 está disponível no Almac Group. Por exemplo, em uma modalidade, a enzima é IRED_A, IRED_B, IRED_C, IRED_D, IRED_E, IRED-20 ou um homólogo dos mesmos.

[020] Divulgada na presente invenção, a enzima pode compreender uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID. NO: 1, SEQ ID. NO: 2, SEQ ID. NO: 3, SEQ ID. NO: 4, ou um homólogo das mesmas. Em outra modalidade, a enzima compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID. NO: 1, SEQ ID. NO: 2, SEQ ID. NO: 3, ou SEQ I.D. NO: 4.

[021] Conforme usado na presente invenção, "um homólogo do mesmo" significa uma enzima que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade de sequência a qualquer uma das enzimas divulgadas na presente invenção. Por exemplo, "um homólogo do mesmo" pode significar uma enzima compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID. NO: 1, SEQ ID. NO: 2, SEQ ID. NO: 3, ou SEQ I.D. NO: 4.

[022] Conforme usado na presente invenção, o termo "identidade de sequência" refere-se a uma relação entre duas ou mais sequências de aminoácidos. Quando uma posição em uma sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido na posição correspondente da sequência comparadora, as sequências são referidas como "idênticas" nessa posição. A percentagem de "identidade de sequência" é calculada determinando o número de posições nas quais o resíduo de aminoácido idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições "idênticas". O número de posições "idênticas" é então dividido pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicado por 100 para produzir a porcentagem de "identidade de sequência." A porcentagem de "identidade de sequência" é determinada pela comparação de duas sequências alinhadas de forma otimizada em uma janela de comparação. A fim de alinhar de forma otimizada as sequências para comparação, a porção de uma sequência polipeptídica na janela de comparação pode compreender adições ou deleções denominadas lacunas enquanto a sequência de referência é mantida constante. Um alinhamento ótimo é aquele alinhamento que, mesmo com lacunas, produz o maior número possível de posições "idênticas" entre as sequências de referência e de comparação. Os níveis de identidade de sequência entre as sequências de codificação podem ser calculados usando métodos conhecidos.

[023] A identidade de sequência pode ser calculada usando métodos baseados em computador disponíveis publicamente para determinar a identidade de sequência incluindo o BLASTP, BLASTN e FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410, (1990)), o programa BLASTX disponível em NCBI e o programa Gap de Genetics Computer Group (Madison Wl). Os níveis de identidade de sequência são obtidos usando o programa Gap, com uma penalidade de Gap de 50 e uma penalidade de comprimento de Gap de 3 para as comparações de sequência de aminoácidos.

[024] Geralmente, a etapa (i) compreende reduzir miosmina com a enzima na presença de um adequado cofator, em particular NADH ou NADPH. Como o técnico no assunto irá apreciar, a enzima e o cofator podem ser introduzidos na mistura de reação como componentes separados, ou podem ser introduzidos na mistura de reação como parte do mesmo componente, por exemplo, na forma de células microbianas inteiras que contêm ambos a enzima e o cofator apropriado. Um sistema de reciclagem de cofator adequado pode estar presente para converter o cofator a partir de sua forma oxidada (NAD+ ou

NADP+) para sua forma reduzida (NADH ou NADPH). O técnico no assunto estará familiarizado com os sistemas de reciclagem de cofator apropriados, tais como sistemas de reciclagem de cofator incluindo glicose (monohidrato)/glicose desidrogenase, formato/formato desidrogenase e isopropanol/álcool desidrogenase. Quando um sistema de reciclagem de cofator está presente, o cofator pode ser adicionado à mistura de reação em sua forma oxidada, ou seja, como NAD+ ou NADP+.

[025] O próprio cofator pode estar presente na faixa de 0,02 partes a 10 partes em peso por 100 partes de miosmina. Preferencialmente, o cofator pode estar presente na faixa de 0,05 partes a 5 partes em peso por 100 partes de miosmina. Mais preferencialmente, o cofator pode estar presente na faixa de 0,5 partes a 2 partes em peso por 100 partes de miosmina.

[026] A quantidade de enzima presente na etapa (i) pode estar presente em uma quantidade de 0,1 partes a 30 partes em peso por 100 partes de miosmina. Preferencialmente, a quantidade de enzima presente na etapa (i) pode estar presente em uma quantidade de 0,5 partes a 10 partes em peso de miosmina. O técnico no assunto apreciará que a quantidade de enzima presente na etapa (i) pode ser ajustada dependendo do período de tempo desejado para a reação da etapa (i), em que mais enzima pode ser usada por um tempo de reação mais curto e vice-versa.

[027] A etapa (i) pode ser realizada na presença de uma resina de troca iônica, porém preferencialmente a etapa (i) é realizada na ausência de uma resina de troca iônica. A resina de troca iônica, quando presente, é uma resina Amberlite, uma resina Amberlyst, uma resina Amberjet, tal como Amberlite IR- 120, ou uma resina Dowex, em que cada uma dessas resinas de troca iônica está disponível na Aldrich.

[028] O possível pH para a etapa (i) pode estar na faixa de pH 5-9.

[029] A (S)-nornicotina é convertida em (S)-nicotina por uma etapa adicional de: (ii) metilar a (S)-nornicotina formada a partir da etapa (i) para formar (S)- nicotina.

[030] Foi surpreendentemente descoberto que após a etapa (ii) a (S)- nicotina foi alcançada com pureza química particularmente elevada e excesso enantiomérico particularmente elevado.

[031] A etapa de metilação, ou seja, a etapa (ii), pode ser realizada por meio de um processo de várias etapas. Por exemplo, a etapa (ii) pode compreender formar um composto (por exemplo, N-formil-(S)-nornicotina) e, em seguida, a redução deste composto para chegar ao produto metilado, ou seja, (S)-nicotina. Preferencialmente, no entanto, a etapa (ii) é realizada por meio de um processo de etapa única, tal como metilação redutora. Como o técnico no assunto apreciará, o termo "metilação redutora" refere-se a um processo pelo qual uma espécie é formada e reduzida para chegar ao produto metilado (ou seja, (S)-nicotina) por meio de uma única etapa.

[032] Preferencialmente, a (S)-nornicotina é redutoramente metilada usando formaldeído ou um composto à base de formaldeído. A etapa (ii) é particularmente eficaz quando se usa tais reagentes.

[033] Conforme usado na presente invenção, um composto à base de formaldeído é usado para se referir a um composto que é capaz de gerar formaldeído in situ durante uma reação química. O técnico no assunto apreciará que isso significa que o composto à base de formaldeído é adicionado à mistura de reação e, em seguida, subsequentemente se decompõe para liberar formaldeído (e outros compostos relacionados) que podem então reagir com a (S)-nornicotina para formar (S)-nicotina. No caso da adição de um composto à base de formaldeído, o técnico no assunto estará familiarizado com como ajustar a quantidade apropriada do composto à base de formaldeído adicionado a fim de alcançar a liberação de uma quantidade particular de formaldeído in situ.

[034] O próprio formaldeído tem a fórmula HC(O)H e é geralmente introduzido como um líquido ou um gás. O formaldeído pode ser introduzido na mistura de reação como parte de uma solução aquosa de formaldeído (tais soluções aquosas podem ser referidas como formalina).

[035] O composto à base de formaldeído é geralmente introduzido como um sólido ou um líquido. O composto à base de formaldeído pode ser um dímero de formaldeído, um polímero de formaldeído, ou um acetal de formaldeído. Preferencialmente, o composto à base de formaldeído é um polímero de formaldeído.

[036] Como o técnico no assunto apreciará, o termo "polímero de formaldeído" refere-se a um composto com três ou mais unidades de repetição de formaldeído polimerizadas. Preferencialmente, o polímero de formaldeído é paraformaldeído. Conforme usado na presente invenção, o termo "paraformaldeído" se refere ao polímero de formaldeído com um grau de polimerização de 8–100 unidades.

[037] Quando a (S)-nornicotina é redutoramente metilada usando formaldeído ou um composto à base de formaldeído, o formaldeído ou composto à base de formaldeído pode ser adicionado em uma quantidade de 50 partes a 110 partes em peso, preferencialmente 60 partes a 90 partes em peso, por 100 partes de (S)-nornicotina. Tais quantidades referem-se às quantidades reais de formaldeído, composto à base de formaldeído e (S)-nornicotina presente. Portanto, onde, por exemplo, a (S)-nornicotina é formada como parte de uma solução (por exemplo, uma solução aquosa) e/ou quando o formaldeído ou composto à base de formaldeído é introduzido na mistura de reação como parte de uma solução (por exemplo, uma solução aquosa) as partes em peso divulgadas na presente invenção referem-se às quantidades reais de formaldeído, composto à base de formaldeído e (S)-nornicotina contidos nas respectivas soluções.

[038] Quando a etapa de metilação é uma etapa de metilação redutora, o redutor pode ser ácido fórmico, cianoborohidreto de sódio ou paládio/hidrogênio, preferencialmente ácido fórmico. Como o técnico no assunto irá apreciar, a quantidade apropriada de redutor dependerá do redutor específico usado. Por exemplo, quando o redutor é ácido fórmico, o redutor pode estar presente em uma quantidade de 40-110 partes, preferencialmente 40-100 partes, mais preferencialmente 50 partes a 70 partes em peso por 100 partes de (S)-nornicotina. Esses valores referem-se às quantidades reais de redutor e (S)-nornicotina presentes.

[039] Preferencialmente, as etapas (i) e (ii) podem ser realizadas sem isolar a (S)-nornicotina formada a partir da etapa (i). Isso permite a formação de (S)-nicotina com um alto excesso enantiomérico e uma alta pureza química, embora usando uma via sintética particularmente conveniente. Evitar a necessidade de isolamento da (S)-nornicotina da mistura de reação formada a partir da etapa (i) antes de convertê-la em (S)-nicotina tem o benefício de oferecer uma via sintética particularmente conveniente, como o isolamento da (S)-nornicotina pode ser um processo intensivo como resultado de tempo e energia dispendiosos da planta (por exemplo, devido à necessidade de grandes quantidades de solvente para extração e/ou fervura da solução). Por exemplo, na etapa (i) a (S)-nornicotina pode ser formada como parte de uma solução aquosa, em que a solução aquosa contendo a (S)-nornicotina é então transportada para uso direto na etapa (ii). Consequentemente, a etapa de metilação (etapa (ii)) é realizada na solução aquosa de (S)-nornicotina formada a partir da etapa (i). Quando o processo é realizado desta maneira, é preferencial que a (S)-nornicotina seja redutoramente metilada usando paraformaldeído ou usando formaldeído que é introduzido na mistura de reação como parte de uma solução aquosa. Quando o processo é realizado desta maneira, é mais preferencial que a (S)-nornicotina seja redutoramente metilada usando formaldeído que é introduzido na mistura de reação como parte de uma solução aquosa, pois foi descoberto que isso reduz formação de espuma indesejável da mistura de reação à medida que o processo prossegue.

[040] A (S)-nicotina produzida usando os processos divulgados na presente invenção tem um excesso enantiomérico de pelo menos 90%, preferencialmente de pelo menos 95%, mais preferencialmente de pelo menos 98%, mais preferencialmente de pelo menos 99%. O técnico no assunto estará familiarizado com como medir o excesso enantiomérico. O excesso enantiomérico pode, por exemplo, ser medido da maneira dada nos Exemplos.

[041] A (S)-nicotina produzida usando os processos divulgados na presente invenção tem uma pureza química de pelo menos 98%, preferencialmente de pelo menos 99%. O técnico no assunto estará familiarizado com como medir a pureza química. A pureza química pode, por exemplo, ser medida da maneira dada nos Exemplos. O nível de pureza química alcançado pelos exemplos é particularmente alto.

[042] A (S)-nicotina produzida usando as etapas do método acima pode ser incluída em uma composição farmacêutica juntamente com um ou mais excipientes farmacêuticos. Preferencialmente, a composição farmacêutica é um adesivo transdérmico, uma pastilha, ou uma formulação para inalação.

[043] A (S)-nicotina produzida usando as etapas do método acima também pode ser incluída em uma formulação para inclusão em um dispositivo de cigarro eletrônico. A formulação inclui (S)-nicotina em um solvente com um ou mais aditivos. O solvente pode compreender glicerol, propilenoglicol, água ou misturas dos mesmos. Preferencialmente, o solvente compreende glicerol e propilenoglicol, em que a proporção de glicerol para propilenoglicol está na faixa de 80:20 a 20:80 em volume. O um ou mais aditivos podem incluir um ou mais agentes aromatizantes.

[044] Também fornecido na presente invenção, há um kit compreendendo miosmina e uma enzima com atividade imina redutase para uso de um processo de formação de (S)-nicotina.

[045] Um esquema de reação particularmente preferencial é exibido abaixo como esquema 1:

[046] A invenção será demonstrada com os seguintes exemplos não limitantes.

EXEMPLOS

[047] Os exemplos a seguir demonstram resultados associados ao processo revelado na presente invenção. Vários reagentes foram usados para exemplificar o processo.

[048] As enzimas usadas incluem o seguinte: IRED_A de Verrucosispora maris (cepa AB-18-032, Uniprot: F4F8G5_VERMA) com a sequência de aminoácidos (a) ou (b) dada abaixo - a sequência (a) corresponde à SEQ ID. NO: 1, e a sequência (b) corresponde à SEQ ID. NO: 2. (a) Conforme usado com a etiqueta hexahistidina, total de 302 resíduos de aminoácidos:

[049] MHHHHHHAADSRAPVTVIGLGAMGSALARAFLAAGHPTTVWNRSPDK

ADDLVGQGAVRAATVADAMSAGNLIVICVLDYRAMREIIDSTGHSPADRVIVNLTSGTP GDARATAAWAQEQGMEYIDGAIMATPSMIGSEETLIFYGGPQEVYDAHADTLRSIAGA GTYLGEEPGLPSLYDVALLGLMWTTWAGFMHSAALLASEKVPAAAFLPYAQAWFEYVIS PEVPNLATQVDTGAYPDNDSTLGMQTVAIEHLVEASRTQGVDPTLPEFLHARAEQAIRR

GHAGDGFGAVFEVLRAPAAQ (b) Enzima original, total de 296 resíduos de aminoácidos:

[050] MAADSRAPVTVIGLGAMGSALARAFLAAGHPTTVWNRSPDKADDLVGQ

GAVRAATVADAMSAGNLIVICVLDYRAMREIIDSTGHSPADRVIVNLTSGTPGDARATAA WAQEQGMEYIDGAIMATPSMIGSEETLIFYGGPQEVYDAHADTLRSIAGAGTYLGEEPG LPSLYDVALLGLMWTTWAGFMHSAALLASEKVPAAAFLPYAQAWFEYVISPEVPNLATQ VDTGAYPDNDSTLGMQTVAIEHLVEASRTQGVDPTLPEFLHARAEQAIRRGHAGDGFG AVFEVLRAPAAQ

[051] IRED_B de Mesorhizobium sp. L48C026A00 também conhecido como 6-fosfogluconato desidrogenase, com a sequência de aminoácidos (a) ou (b) dada abaixo - a sequência (a) corresponde à SEQ ID. NO: 3, e a sequência (b) corresponde à SEQ ID. NO: 4. (a) Conforme usado com a etiqueta hexahistidina, total de 310 resíduos de aminoácidos:

[052] MHHHHHHASNVCVLGAGRMGSSIARTLLDRGYPTWVWNRTAAKCEPL

AALGAKVASSVQEGIQAAEVVIINVLDYAASDALLKRDGIASALAGKAVVQLTSGSPRLAR EEARWVEAHGAGYLDGAIMATPDFIGKPETAMLYSGSRDVYEKHKPLLFALGGGTNYVG ELPGQASALDTALLTQMWGGLFGALQGMAVAEAEGLDLETFRNHLSAFKPVVDASLFD LVDRTNARRFAGDDATLASLGAHYSAFQHLLEACEERGLDAAMPRAMDMIFRQALSLG

SMEDDLASLALLFRNGSPRQSREPANA (b) Enzima original, total de 304 resíduos de aminoácidos

[053] MASNVCVLGAGRMGSSIARTLLDRGYPTWVWNRTAAKCEPLAALGAKV

ASSVQEGIQAAEVVIINVLDYAASDALLKRDGIASALAGKAVVQLTSGSPRLAREEARWVE AHGAGYLDGAIMATPDFIGKPETAMLYSGSRDVYEKHKPLLFALGGGTNYVGELPGQAS ALDTALLTQMWGGLFGALQGMAVAEAEGLDLETFRNHLSAFKPVVDASLFDLVDRTNA RRFAGDDATLASLGAHYSAFQHLLEACEERGLDAAMPRAMDMIFRQALSLGSMEDDLA

SLALLFRNGSPRQSREPANA Exemplo 1

[054] As biotransformações foram realizadas em escala de 0,5 mL com uma solução de miosmina a 10mM e NADP+ (0,5mM), glicose (25mM), glicose desidrogenase (10U/mL) e a enzima com atividade imina redutase. As enzimas usadas estão detalhadas na tabela 1, disponível na Enzymicals. Para cada enzima, a quantidade de enzima foi de 9 mg/ml de extrato livre de células (estimativa de aproximadamente 0,9 mg/ml de enzima contida). Para IRED_B e IRED_C especificamente, testes adicionais foram executados que usaram 0,9 mg/ml de extrato livre de células.

[055] O excesso enantiomérico da (S) nornicotina obtida a partir da biotransformação foi determinado usando uma coluna Chiralpak AD-H (250 x 4,6 mm id) eluindo com uma mistura de hexano:etanol:dietilamina 74,9: 25,0: 0,1 (v/v/v) a 1 ml/min ao longo de 18 min a 30 °C. Este método também foi usado para medir a conversão de miosmina em nornicotina, um fator de resposta relativo de 2,18: 1 tendo sido determinado para detecção de absorção uv a 254 nm.

[056] Os resultados são exibidos na Tabela 1 abaixo. Enzima Quantidade Conversão [%] Excesso Enantiomérico [% S] i IRED_A 9 mg/ml 99,3 99,8 ii IRED_B 9 mg/ml 99,9 98,4 iii IRED_B 0,9 mg/ml 99,3 98,4 iv IRED_C 9 mg/ml 99,3 92,9 v IRED_C 0,9 mg/ml 100,0 99,1

Enzima Quantidade Conversão [%] Excesso Enantiomérico [% S] vi IRED_D 9 mg/ml 99,6 99,8 vii IRED_E 9 mg/ml 99,4 99,8 viii IRED_F 9 mg/ml 99,1 86,5 ix IRED_P 9 mg/ml 97,7 86,6 x IRED_X 9 mg/ml 99,8 95,7 xi IRED_AB 9 mg/ml 99,6 96,8 Tabela 1

[057] A % de excesso enantiomérico para (S)-nornicotina foi identificada de acordo com a equação [(S)-(R)]/((S)+(R)] × 100 onde (S) e (R) são as quantidades de enantiômeros (S) e (R) presentes respectivamente. A % de conversão foi identificada de acordo com a quantidade de miosmina consumida, ou seja, de acordo com a equação 100–(quantidade final de miosmina)/(quantidade inicial de miosmina) × 100. Exemplo 2

[058] As reações foram realizadas de maneira semelhante à do exemplo 1, exceto que 1,5 equivs de glicose e 1 mol% de NADP+ foram usados em relação ao substrato de miosmina e um tempo de reação de 24 horas foi empregado. As enzimas usadas são detalhadas em cada uma das tabelas 2, 3 e 4 (disponíveis na Enzymicals).

[059] Na concentração de miosmina a 100 mM, usando extrato livre de células enzimáticas de 0,9 mg/mL, os resultados foram os exibidos na tabela abaixo: Enzima Conversão [%] Excesso Enantiomérico [% S] i IRED_A 63,6 99,8 ii IRED_B 99,9 98,7 iii IRED_C 99,9 99,8

Enzima Conversão [%] Excesso Enantiomérico [% S] iv IRED_D 99,0 99,9 v IRED_E 99,9 99,9 Tabela 2

[060] Na concentração de miosmina a 100 mM, usando extrato livre de células enzimáticas de 9 mg/mL, os resultados foram os exibidos na tabela abaixo: Enzima Conversão [%] Excesso Enantiomérico [% S] i IRED_A 99,9 99,8 ii IRED_B 99,8 98,8 iii IRED_C 99,8 99,9 iv IRED_D 99,9 100,0 v IRED_E 99,9 99,9 Tabela 3

[061] Na concentração de miosmina a 250 mM, usando extrato livre de células enzimáticas de 9 mg/mL, os resultados foram os exibidos na tabela abaixo: Excesso Enantiomérico Enzima Conversão [%] [% S] i IRED_A 100,0 99,7 ii IRED_B 99,9 98,6 iii IRED_C 100,0 99,9 iv IRED_D 100,0 99,9 v IRED_E 99,9 99,9 Tabela 4 Exemplo 3

[062] Uma solução de miosmina (20 mmol, 2,924 g), D-glicose (30 mmol,

5,405 g) nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato sal de sódio (0,2 mmol, 157 mg), enzima IRED_A (disponível na Enzymicals) extrato liofilizado livre de células (1,0 g), glicose desidrogenase (2000 U, 40 mg) em tampão fosfato de sódio 100 mM pH (200 mL) foi misturada por um agitador suspenso a 200 rpm a 30 °C durante 24 horas. A solução foi analisada para nornicotina durante o curso da reação com HPLC mostrando 77% de conversão após 8 horas, e mais de 99% de conversão após 24 h com 98,7% e.e. de (S)-Nornicotina. Esta solução foi então tratada com solução de formaldeído a 37% (8,1g) e ácido fórmico (2,8g) a 80 °C durante 4h, com a reação sendo completada após 2h. Após o resfriamento, foram adicionados 6 g de hidróxido de sódio sólido (pH 12,7) e a mistura foi extraída com 2 x 75 ml de MTBE. Após secagem sobre sulfato de sódio, o solvente foi removido para proporcionar 2,25 g de (S)-nicotina em bruto que era >99% pura por HPLC (% de área a 260 nm) e tinha 98,7% de excesso enantiomérico. Exemplo 4

[063] Uma solução de miosmina (20 mmol, 2,924 g), D-glicose (30 mmol, 5,405 g) nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato sal de sódio (0,2 mmol, 157 mg), enzima IRED_B (disponível em Enzymicals) extrato liofilizado livre de células (0,5 g), glicose desidrogenase (2.000 U, 40 mg) em tampão de fosfato de sódio a 100 mM pH7,5 (200 mL) foi misturada por um agitador suspenso a 200 rpm a 30 °C durante 24 horas. A solução foi analisada para nornicotina durante o curso da reação com HPLC mostrando 91% de conversão após 4 horas, e mais de 99% de conversão após 6 horas. Após 24 horas, o (S)-Nornicotina era 98,2% e.e. Esta solução foi então tratada com paraformaldeído (3g) e ácido fórmico (2,8g) a 80 °C durante 6h, com a reação sendo concluída após 4h. Após o resfriamento, foram adicionados 6 g de hidróxido de sódio sólido (pH 12,7) e a mistura foi extraída com 2 x 75 ml de MTBE. Após secagem sobre sulfato de sódio, o solvente foi removido para proporcionar 2,31 g de (S)-nicotina em bruto que era >99%

puro por HPLC (% de área a 260 nm) e tinha 98,3% de excesso enantiomérico. Exemplo 5

[064] Este exemplo demonstra a enantiosseletividade e a taxa de conversão em altas concentrações de substrato. Este exemplo foi realizado de maneira semelhante ao exemplo 1, exceto que todas as reações usaram glicose 1,5 equivs, NADP (1% em relação à miosmina), imina redutase, especificamente IRED_C disponível na Enzymicals (4,5 mg/ml de extrato livre de células, GDH (10U/ml por 250 mM de concentração de miosmina), tampão de fosfato de sódio pH 7,5 100 mM ao longo de um período de 24 horas. Os resultados são mostrados abaixo. Excesso Concentração de material de partida Conversão Enantiomérico de miosmina [%] [% S] i 250 mM 99,9 99,7 ii 400 mM 99,6 99,8 iii 600 mM 68,8 99,8 iv 800 mM 56,5 99,7 v 1000 mM 52,4 99,6 Tabela 5 Exemplo 6

[065] Este exemplo demonstra a enantiosseletividade e a taxa de conversão em uma escala maior.

[066] Uma solução de miosmina (400 mmol, 58,5 g), D-Glucose (600 mmol, 118,9 g) nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato sal de sódio (4 mmol, 3,15 g), enzima IRED_C (disponível em Enzymicals) liofilizado de extrato livre de células (10,0 g), glicose desidrogenase CFE (0,32 g) em tampão fosfato de sódio a 100 mM pH7,5 (1000 mL) foi misturada com um agitador suspenso a 200 rpm a 30 °C durante 24 horas. A solução foi analisada para nornicotina após 24 horas com HPLC e mostrou mais de 98% de conversão.

[067] Os detalhes do trabalho são os seguintes: a mistura de reação biocatalítica foi acidificada com ácido sulfúrico concentrado a pH 1-2 e, em seguida, aquecida a 90 °C por 20 minutos para precipitar todas as proteínas. As proteínas foram filtradas da mistura sobre Celite. A solução límpida resultante foi basificada com solução de NaOH a 40% até pH > 11 e extraída quatro vezes com 500 mL de éter metila terc-butílico (MTBE). As fases de MTBE combinadas foram secas sobre sulfato de magnésio anidro e o solvente evaporado. O rendimento isolado de nornicotina foi de 41,1 g (70%) como um líquido amarelo amarronzado.

[068] Uma amostra separada da mistura de reação de nornicotina antes do trabalho e do isolamento foi levada para a etapa de metilação. Especificamente, sem isolamento da nornicotina, à mistura de reação biocatalítica, foram adicionados paraformaldeído (60 g) e ácido fórmico (49,2 g). A reação foi aquecida a 85 °C e agitada vigorosamente para formar (S)-nicotina. Exemplo 7

[069] O método experimental geral para formar (S)-nicotina foi o seguinte. A biocatálise de miosmina em (S)-nornicotina usando IRED_C (disponível na Enzymicals) foi conduzida a uma concentração de miosmina a 400 mM. Ou a (S)-nornicotina foi isolada por meio de extração com éter metil-terc- butílico e remoção do solvente, ou a solução aquosa a partir da biocatálise foi aquecida a 90 °C por 15 min para precipitar as proteínas, em seguida, após o resfriamento a mistura foi acidificada a pH 1-2 com ácido sulfúrico, a proteína precipitada removida por filtração através de Celite, e a solução, em seguida, neutralizada com hidróxido de sódio aquoso a cerca de pH 7. Exemplo 7a

[070] Foi adicionada nornicotina isolada bruta a partir da redução enzimática da miosmina (92 g) a 800 ml de água. Foram adicionados paraformaldeído (74g, 4eq) e ácido fórmico (58g, 2 eq). A mistura foi aquecida gradualmente até 80-85 graus C. A análise por HPLC após 2h indicou a conclusão da reação. A mistura foi mantida à mesma temperatura por mais 2h e, em seguida, resfriada à temperatura ambiente. Foi adicionada solução de hidróxido de sódio a 50% para obter um pH de aproximadamente 13. A mistura foi extraída com 2 x 500 ml de MTBE e seca sobre sulfato de sódio. O solvente foi removido e a (S)-nicotina bruta destilada sob vácuo. Após um avanço de cerca de 4 g, 87 g de nicotina purificada foram obtidos (>99% por HPLC e 99,6%ee por HPLC quiral). Exemplo 7b

[071] A 2,5 litros de solução aquosa de nor-nicotina da mesma biocatálise usada no Exemplo 1 (5,63 g/100 ml) foi adicionado paraformaldeído (112,5g, 4eq) e ácido fórmico (88g, 2eq). A mistura foi gradualmente aquecida a 80-85 graus C, com a reação começando a cerca de 70 graus C com alguma formação de espuma devido à evolução de gás. Após 1h a 80-85 graus C, HPLC indicou que a reação estava completa. A reação foi aquecida durante 4h no total e depois resfriada. A mistura foi basificada com solução de hidróxido de sódio a 50% e extraída com MTBE (800 ml depois 500 ml). Após secagem, a mistura bruta foi destilada para dar 118,7 g (S)-nicotina (> 99% por HPLC e 99,5 por HPLC). Exemplo 7c

[072] A 2,5 litros de solução aquosa de nor-nicotina da mesma biocatálise usada no Exemplo 1 (5,63g/100ml) foi adicionado solução de formaldeído a 37% (290ml, ~ 4eq) e ácido fórmico (88g, 2eq). A mistura foi gradualmente aquecida a 80-85 graus C, com a reação começando a cerca de 60 graus C com alguma formação de espuma devido à evolução de gás. Após 1h a 80-85 graus C, HPLC indicou que a reação estava completa. A reação foi aquecida durante 4h no total e depois resfriada. A mistura foi basificada com solução de hidróxido de sódio a 50% e extraída com MTBE (800 ml depois 500 ml). Após secagem, a mistura bruta foi destilada para dar 119,1 g (S)-nicotina (> 99% por HPLC e 99,5 por HPLC). Exemplo 8

[073] Uma solução de miosmina (298 g) e monohidrato de glicose (505 g) foi preparada em tampão de hidrogenofosfato dipotássico a 0,1 M (6L). A resina Amberlite IR-120 (2 kg, úmida) foi adicionada como a resina de troca iônica e a solução ajustada para pH 7 com hidróxido de sódio a 12M (cerca de 0,3 L), em seguida, agitada durante a noite a 25 °C para garantir um pH estável. Foram adicionadas glicose desidrogenase GDH-102 (6 g), beta-NADP+ (6 g) e enzima IRED-20 disponível no Grupo Almac (30 g), em seguida, a mistura foi agitada a 150 rpm enquanto mantida a 25 °C com o pH mantido na faixa de 6,8-7,0 por meio de adições de hidróxido de potássio a 4M. Após 72 h, a solução foi decantada e a resina Amberlite foi lavada com água desionizada (3 x 3 L). Em seguida, a resina Amberlite foi transferida para uma coluna e adicionalmente lavada com água desionizada (4 L), em seguida, agitada por 3 horas com solução de amônia a 2M (4 L) e adicionalmente lavada com amônia a 2M (10 L). As soluções combinadas foram concentradas sob pressão reduzida até a secura para dar (S)-Nornicotina (131,2 g) como um líquido amarelo. A fim de recuperar mais nornicotina da mistura de reação, resina Amberlite reativada (2 kg) foi adicionada e a mistura foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. O mesmo tratamento foi repetido como acima para recuperar mais (S)-Nornicotina (59,8 g) trazendo o rendimento total para 191,0 g. As duas bateladas anteriores foram convertidas em (S)-nicotina separadamente. Para a batelada maior, a (S)- nornicotina (126,2 g de) foi combinada com paraformaldeído (154,5 g) e ácido fórmico (118 g) em água (1 L) e a mistura agitada resultante aquecida a 85 °C durante a noite. A mistura foi então resfriada a 0 °C e ajustada para pH 14 com hidróxido de sódio a 12M. A mistura foi extraída com éter metil terc-butílico (3 x 8 vols). A fase orgânica foi seca com sulfato de magnésio anidro e concentrada até à secura para dar(S)-nicotina em bruto como um líquido amarelo (131,2 g). A segunda batelada de (S)-nornicotina (59,8 g) foi igualmente transformada em (S)-nicotina bruta (60,7 g) da mesma maneira dando um rendimento total de nicotina bruta de 191,9 g. Estes foram combinados e destilados sob pressão reduzida (b.p. 70-77˚C a 0,53-0,67 mbar (53 Pa-67 Pa)) para fornecer (S)-nicotina (174,5 g) como um líquido incolor com um excesso enantiomérico de 99,38% conforme determinado por HPLC, e uma pureza química de 99,96%, conforme determinado por HPLC. Mais sobre o processo usado para medir o excesso enantiomérico e a pureza química são dados abaixo.

[074] Pureza enantiomérica por HPLC: usando uma coluna Chiracel OD-H eluindo com n-hexano e 1-butanol em uma razão de 95:5 e contendo 0,1% de dietilamina. O (R)-enantiômero eluiu em 6,1 min e o (S)-enantiômero em 5,6 min. O excesso enantiomérico é determinado a partir da área dos picos identificados de acordo com a equação [(S)-(R)]/((S)+(R)]. O excesso enantiomérico foi assim determinado como 99,38%.

[075] Pureza química por HPLC: Usando uma coluna X-Bridge C18 com um eluente compreendendo uma mistura de (i) bicarbonato de amônio a 20 mM em água (pH = 8,7) e (ii) acetonitrila em um programa de gradiente de 0-10 min a 95:5, 10-13 min a 70:30; 13-16 min a 10:90; e subsequentemente 95:5. A temperatura era de 35 graus C. As condições do detector eram de absorção de UV a um comprimento de onda de 260 nm. Uma única impureza a 12,132 minutos a 0,04% de área foi encontrada versus nicotina a 9,925 minutos. Com uma única impureza a 0,04% de área, a pureza foi considerada como 99,96%. Em comparação, antes da destilação, a média ponderada das duas bateladas usadas era de 99,70%.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para produzir (S)-nicotina, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) reduzir miosmina com uma enzima com atividade de imina redutase para formar (S)-nornicotina; e (ii) metilar a (S)-nornicotina formada a partir da etapa (i) para formar (S)- nicotina.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (ii) é realizada por meio de metilação redutora.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que na etapa (ii) a (S)-nornicotina é redutoramente metilada usando formaldeído ou um composto à base de formaldeído na presença de um redutor.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o formaldeído é introduzido como parte de uma solução aquosa.

5. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o composto à base de formaldeído é um dímero de formaldeído, um polímero de formaldeído ou um acetal de formaldeído.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que o redutor é ácido fórmico, cianoborohidreto de sódio ou paládio/hidrogênio.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que o redutor é ácido fórmico.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser realizado sem isolamento da (S)-nornicotina formada a partir da etapa (i).

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que, na etapa (i), a (S)-nornicotina é formada como parte de uma solução aquosa, e em que a etapa (ii) compreende metilar a (S)- nornicotina contida na solução aquosa.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que, na etapa (ii), a (S)-nornicotina é redutoramente metilada usando formaldeído introduzido como parte de uma solução aquosa.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a (S)-nicotina é obtida com um excesso enantiomérico de pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98%, mais preferencialmente pelo menos 99%.

12. Processo para produzir uma composição farmacêutica, caracterizado pelo fato de que compreende formar (S)-nicotina de acordo com o processo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e incluir a (S)-nicotina na composição farmacêutica juntamente com um ou mais excipientes farmacêuticos.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é um adesivo transdérmico, uma pastilha ou uma formulação de inalação.

14. Processo para produzir uma formulação para um dispositivo de cigarro eletrônico, caracterizado pelo fato de que compreende formar (S)-nicotina de acordo com o processo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e incluir a (S)-nicotina em um solvente com um ou mais aditivos.

15. Uso de miosmina e de uma enzima com atividade de imina redutase, caracterizado pelo fato de ser em um processo para formar (S)-nicotina, em que o processo compreende as características definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.