ES2278534B1 - Preparacion de beta-carbolinas de productos naturales y alimentos con actividad como inhibidores de monoaminooxidasa (mao). - Google Patents
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Abstract
Preparación de beta-carbolinas de productos naturales y alimentos con actividad como inhibidores de monoaminooxidasa (MAO). Procedimiento de preparación de moléculas del tipo beta-carbolina a partir de aminoácidos de alimentos y productos naturales, que actúan como inhibidores reversibles de la enzima monoaminooxidasa (MAO). Los inhibidores reversibles de MAO se emplean en prevención y tratamiento terapéutico de enfermedades o condiciones relacionadas con desórdenes neurológicos como depresión, adicción, trastornos endocrinos, y en neuroprotección contra enfermedades degenerativas. Los preparados de beta-carbolinas podrían tener utilidad, por tanto, como preparados farmacéuticos, preparados nutracéuticos y en alimentos funcionales o suplementos dietéticos.
Description
Preparación de beta-carbolinas
de productos naturales y alimentos con actividad como inhibidores
de monoaminooxidasa (MAO).
La presente invención se encuadra en el sector
químico y describe un procedimiento de preparación de moléculas del
tipo beta-carbolina detectadas en alimentos y en
productos naturales y que actúan como inhibidores reversibles de la
enzima monoaminooxidasa (MAO). El procedimiento de obtención se
hace a partir de aminoácidos y se caracteriza por utilizar una
enzima peroxidasa como biocatalizador. Los preparados de
beta-carbolinas podrían tener utilidad como
preparados farmacéuticos, preparados nutracéuticos y en alimentos
funcionales o suplementos dietéticos.
La monoaminooxidasa (MAO) (EC 1.4.3.4) es una
enzima con FAD como cofactor que está localizada en el exterior de
la membrana de la mitocondria en células del cerebro, intestino,
hígado, mucosa intestinal, músculos, y otros órganos. Cataliza la
oxidación de neuroaminas como dopamina, serotonina, norepinefrina,
aminas vasoactivas, como tiramina, y neurotoxinas como el MPTP.
Como productos finales de su metabolismo se libera H_{2}O_{2},
aldehídos y amonio. Se han identificado dos isoenzimas de MAO, la
MAO A y la B, que se diferencian por los sustratos que admiten y
por la acción específica de inhibidores. La MAO A cataliza la
oxidación de serotonina y norepinefrina, y se inhibe por
clorgilina, mientras que la MAO B oxida preferencialmente
feniletilamina y bencilamina y se inhibe por
R-deprenyl. La tiramina, dopamina y triptamina son
sustratos de ambas enzimas. La enzima MAO juega un papel
fisiológico muy destacado en el sistema nervioso central y en los
órganos periféricos. La actividad anormal de MAO B se ha
relacionado con enfermedades neurodegenerativas como Parkinson y
Alzheimer, mientras que la actividad de MAO A juega un destacado
papel en condiciones psiquiátricas como la depresión.
La enzima MAO es una diana tradicional de
estudio farmacológico para la obtención de inhibidores en el
tratamiento de desordenes neurológicos (Binda et al. Nature
Structural Biol. 9, 2002, 22-26; Szelenyi, 1993;
Inhibitors of monoamine oxidase B. Pharmacology and clinical use in
neurodogenerative disorders. Virkháuser Verlag, Basel; Kalgutkar
et al. Chem. Res. Toxicol. 14, 1139-1162,
2001). Los inhibidores de MAO ayudan a regular los niveles
-inhibiendo su degradación- de monoaminas y neurotransmisores
(dopamina, norepinefrina y serotonina) que se liberan en diferentes
partes del cerebro y del organismo, en general. Por ello, afectan a
numerosas funciones mediadas por éstos como el comportamiento y
estado de ánimo, la función motora, la función endocrina, la
memoria y la adicción y dependencia. El uso de inhibidores de la
MAO tiene utilidad en tratamiento y prevención de estados de
depresión, melancolía, pánico, bulimia, Parkinson, y desorden
obsesivo-compulsivo (K.R.R. Krishnan, "Monoamine
Oxidase Inhibitors" The American Psychiatric Press
Textbook of Pharmacology, American Psychiatric Press, IC.
Washington, D.C. 1995, PP 183-193). Inhibidores de
la MAO A se han utilizado como antidepresivos y los inhibidores de
la MAO B en el tratamiento del Parkinson (McDaniel, 1986, Clin.
Pharmacol. 9, 207-234, 1986; Tabakman, et al.
BioEssays 26, 80-90, 2003). No obstante, a pesar de
su eficacia, la utilización de inhibidores de la MAO en
farmacología ha tenido un uso limitado, debido a que los
inhibidores más activos son inhibidores irreversibles que inhiben
tanto la MAO en el cerebro como también la MAO periférica. Como
resultado pueden provocar crisis hipertensivas cuando interaccionan
con ciertos alimentos (por ejemplo los alimentos fermentados), con
alto contenido en tiramina, que no se puede degradar por MAO.
Numerosos procesos biológicos generan
intermedios oxidantes muy reactivos que se conocen como especies
reactivas de oxígeno y de nitrógeno. Estas especies se asocian con
un amplio rango de patologías y enfermedades como la isquemia,
ateroesclerosis, trombosis y embolias, afecciones alérgicas e
inflamatorias como asma bronquial, artritis reumatoide, Alzheimer,
Parkinson, envejecimiento, cataratas, diabetes, y neoplasias. Una
de las especies oxidantes más conocidas es el peróxido de hidrógeno
(H_{2}O_{2}), generado por el metabolismo celular. En este
sentido, el metabolismo de monoaminas por la MAO es una de las
fuentes principales de generación de H_{2}O_{2}. La enzima MAO
participa en los procesos de neurodegeneración mediante la
degradación de dopamina y la generación de H_{2}O_{2}; pero
también al bioactivar neurotoxinas como el MPTP
(1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina).
De ahí el uso de inhibidores de la MAO (principalmente de la MAO B,
como por ej. deprenyl) para el tratamiento de condiciones
neurodegenerativas (Tabakman, et al. BioEssays 26,
80-90, 2003; Kalgutkar et al. 2001 Chem. Res.
Toxicol. 14, 1139-1162; Tipton et al. 1998,
WO9840102). Además, se ha señalado que la disminución de la
enfermedad de Parkinson que al parecer se da entre los fumadores
puede estar relacionada con la inhibición de la enzima MAO (Fowler,
et al. NeuroToxicology 24, 75-82, 2003). En
este sentido, se han aislado beta-carbolinas en
humo del tabaco, que podrían contribuir a la inhibición de MAO A y
B en fumadores (Herraiz y Chaparro, Biochem. Biophys. Res. Commun.
326, 378-386,
2005).
2005).
Las beta-carbolinas son
alcaloides indólicos bioactivos con numerosas propiedades
farmacológicas. Se han obtenido
tetrahidro-beta-carbolinas con
actividad farmacológica como agentes antihipertensivos (Patente US
4361566, Nov 30, 1982), antimetastásicos (Patente US 6069150, May
30, 2000), neuromoduladores (Patente US 5861409, Jan. 19, 1999),
agentes neuroprotectores contra la peroxidación lipídica
(Kawashima, et al. Chem. Pharm. Bull. 43,
783-785, 1995). Recientemente se ha descrito la
preparación y utilización de
tetrahidro-beta-carbolinas con
sustituyentes fenólicos como antioxidantes (Patente ES2211295,
Julio 7, 2004). Las moléculas del tipo beta- carbolinas aromáticas
también han sido objeto de atención por sus propiedades
neuro-farmacológicas. Las
beta-carbolinas ejercen actividad neuromoduladora
por su acción sobre receptores serotoninérgicos, opioides, receptor
de benzodiacepinas, sitios de unión de imidazolinas e inhibición de
MAO (Airaksinen y Kari, Med. Biol. 59, 1981,
190-211; Robinson et al. Ann. N.Y. Acad.
Sci. 1009, 157-166, 2003; Kim et al. 1997,
Arch. Biochem. Biophys. 337, 137-142; Herraiz y
Chaparro, Biochem. Biophys. Res. Commun. 326,
378-386, 2005), y por ello, pueden estar implicadas
en procesos relacionados con la regulación de los niveles de
neurotransmisores. Como resultado de su actividad biológica las
beta-carbolinas manifiestan efectos farmacológicos
en modelos animales como vasodilatadores, antidepresivos, y
relación con fenómenos de adicción-dependencia e
ingesta de alimentos, etc. (Robinson et al. Ann. N.Y. Acad.
Sci. 1009, 157-166, 2003).
Las
tetrahidro-beta-carbolinas y
beta-carbolinas se han detectado en alimentos hasta
en varios cientos de mg/L (Herraiz, J. Agric. Food Chem. 44,
3057-3065, 1996; Herraiz, Food Additives and
Contaminants 21, 1041-1050, 2004). Se sabe que se
forman durante la producción, procesado y almacenado de alimentos
(Herraiz, ACS Symposium Series 871, 405-426, 2004).
La síntesis orgánica de beta-carbolinas es posible
por varios procedimientos. En cambio, en la naturaleza, estos
compuestos se generan siguiendo el esquema de la Figura 1, a través
de una condensación de Pictet-Spengler. Así, las
beta- carbolinas simples pueden prepararse por un procedimiento
conocido de ciclación del tipo Pictet-Spengler,
biomimetizando la formación de estos compuestos en los productos
naturales y alimentos, a partir de los precursores aminoácidos y
posterior oxidación del anillo de
tetrahidro-beta-carbolina. Esta
oxidación se puede realizar con agentes químicos diversos como
dicromato, agentes tipo Fenton, nitrito (Herraiz, 2004, ACS Symp.
Ser. 871, 405-426, 2004), aunque con poca
eficiencia relativa y reacciones poco limpias con productos
secundarios que hay que eliminar, y por tanto con las consiguientes
etapas adicionales de aislamiento. En este sentido, la
característica principal de esta invención es que se utilizan
enzimas como biocatalizador para la preparación de las
beta-carbolinas a partir de los correspondientes
compuestos
tetrahidro-beta-carbolinas (Figura
1). Para ello se pueden emplear peroxidasas comerciales. Entre
estas, pueden utilizarse peroxidasas de plantas (rábano picante,
soja y otras), de hongos, de microorganismos, o de origen animal
como lactoperoxidasa, o mieloperoxidasa. Las peroxidasas son enzimas
con grupo hemo que catalizan de manera eficiente la oxidación de
diversos sustratos utilizando peroxido de hidrógeno
(H_{2}O_{2}) (Dunford, H.B. In peroxidases in chemistry and
biology. Everse, J.; Everse, K.E.; Grisham, M.B., eds. Vol. II pp
1-24. CRC Press, Boca Raton, FL. 1991). Estas
enzimas pueden funcionar como biocatalizadores en una variedad de
oxidaciones y sobre un amplio espectro de sustratos, y hacen uso
del H_{2}O_{2} que es un oxidante "limpio", por lo que su
uso potencial es considerable (Van Deurzen et al. Tetrahedron
53, 13183-13220,
1997).
1997).
Así pues, la obtención de los productos
beta-carbolina de esta invención se realiza a
partir de precursores naturales como el aminoácido triptófano,
aminoácido esencial en la dieta, y análogos de éste que aparecen
como metabolitos en productos naturales de plantas y otros
organismos; se realiza por condensación con los aldehídos
formaldehído, y acetaldehído, que también ocurren naturalmente en
extractos vegetales. Para la preparación se sigue un proceso
biomimético a la síntesis de alcaloides
beta-carbolina en la naturaleza. La condensación
para dar las
tetrahidro-beta-carbolinas podría
producirse o favorecerse en determinados sustratos alimentarios que
contengan triptófano y aldehídos, o en complementos nutricionales.
En su defecto, se podrían utilizar como precursores directos los
ácidos
1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolinas-3-carboxílico
(ver figura 1) que se encuentran en numerosos alimentos y productos
naturales (Herraiz, 2004, ACS Symp. Ser. 871,
405-426, 2004). El paso característico y relevante
de esta invención es la obtención final de
beta-carbolinas a partir de los ácidos
tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxílico
que se hace por una oxidación limpia con H_{2}O_{2} catalizada
por enzimas peroxidasas.
Las beta-carbolinas logradas
pueden tener actividad psico-farmacológica o
neuroprotectora, por ser inhibidores de MAO y también por su acción
potencial sobre otros receptores neuronales. Los inhibidores de la
MAO pueden actuar reduciendo la formación de especies reactivas de
oxígeno (H_{2}O_{2} y otras), y a la vez, elevando los niveles
de neuroaminas del cerebro. Por ello, las
beta-carbolinas obtenidas por el procedimiento de la
presente invención podrían tener utilidad potencial como agentes
farmacéuticos, nutracéuticos, complementos dietéticos o alimentos
funcionales, sólos o en combinación con otras sustancias o
fármacos, en una variedad de condiciones que tienen que ver con la
actividad de MAO, como depresión, desordenes emocionales y de
estado de ánimo, enfermedades neurodegenerativas (Parkinson y
Alzheimer), abuso de drogas, antiadicción (tabaquismo, y otros),
dependencia, y desórdenes de la alimentación.
La presente invención se caracteriza por
describir un procedimiento de obtención de compuestos con
estructura de beta-carbolinas de la Formula I,
basado en una reacción en medios acuosos y oxidación limpia con
H_{2}O_{2} catalizada por una enzima peroxidasa,
donde los sustituyentes R_{1},
R_{2}, pueden ser hidrógeno (H), halógeno (F, Cl, Br, I), alquilo
(CH_{3}), o metoxilo (OCH_{3}), y R_{3} H, CH_{3} o resto
alquilo (CH_{3}-(CH_{2})_{n}-. Se realiza a partir de
sustratos aminoácidos como precursores naturales, y se caracteriza
porque los preparados obtenidos son de utilidad por sus propiedades
como inhibidores reversibles de las enzimas MAO A y
B.
Como punto característico central de esta
invención, la preparación de las sustancias de la Formula I o
extractos crudos que las contengan, se realiza a partir los ácidos
tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxílico
(Figura 1) utilizados como precursores directos que se tratan con
H_{2}O_{2} en presencia de una enzima peroxidasa procedente de
plantas, microorganismos o de origen animal, en un medio tamponado
entre pH 5-8, y temperatura entre 20 y 45ºC, durante
varias horas, para obtener las beta-carbolinas, de
la Formula I, que finalmente se secan y purifican por
procedimientos convencionales.
Los precursores ácidos
tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxílico
utilizados por la peroxidasa se pueden aislar desde alimentos o
productos naturales, o se producen por reacción desde triptófano o
sus análogos por reacción con compuestos aldehídos alifáticos,
preferiblemente formaldehído y acetaldehído, en medios acuosos
ácidos preferiblemente entre pH 1 y 3, por calentamiento entre 30 y
60ºC, con posterior secado con métodos convencionales.
Al actuar como inhibidores reversibles de MAO, y
también por su unión a varios receptores del sistema nervioso
central, los productos beta-carbolina anteriores
puros, en extractos o preparados que los contengan, podrían
utilizarse en preparados o formulaciones farmacéuticas para la
prevención y el tratamiento terapéutico de enfermedades o
condiciones relacionadas con desórdenes neurológicos como
depresión, adicción, trastornos endocrinos, y en neuroproteccción
contra enfermedades degenerativas. Una vez probada su ausencia de
toxicidad, los nuevos preparados podrían aplicarse en productos
farmacéuticos, de parafarmacia, en nuevos alimentos funcionales,
complementos nutricionales y preparados nutracéuticos.
Figura 1. Reacción de
Pictet-Spengler, que se produce en alimentos y en
productos naturales para la generación de ácidos 1, 2, 3, 4
tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxílico
(A). Su posterior oxidación con una peroxidasa (B) da lugar a las
beta-carbolinas aromáticas, con propiedades de
inhibidores de MAO (C). R_{1} y R_{2} son H, F, Cl, Br, I,
OCH_{3} o resto alquilo y R_{3} es un resto alquilo.
Figura 2. Curvas de inhibición en función de la
concentración de beta-carbolinas.
Inhibición de MAO (enzimas A y B) por las
beta-carbolinas
(9H-pirido-3,4-b-indol).
Esta invención describe un procedimiento
enzimático de preparación de los compuestos
beta-carbolina simples de la Formula I en medios
acuosos. Estos se preparan por oxidación de los intermedios ácidos
tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxílico
mediante una catálisis enzimática limpia con utilización de
H_{2}O_{2}. Los compuestos obtenidos se analizaron mediante
HPLC-fluorescencia-absorbancia y
espectrometría de masas. Se utilizaron dos sistemas acoplados en
serie para la detección: fluorescencia (270 nm excitación y 343 nm
emisión; o 300/433) y absorbancia a 254 nm. Los productos se
caracterizaron por HPLC-MS con ionización de
electrospray en modo positivo y RMN. El proceso de obtención
propiamente dicho se realiza en dos etapas:
Etapa
1
Se preparan los ácido
1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxílico
en fase acuosa/ácida partiendo de aminoácidos naturales como
L-triptófano o sus análogos como triptófano con
sustituyentes en 5 6 6 del anillo bencénico (alquilo, Cl, Br,
OCH_{3}), por reacción con aldehídos, mediante una condensación
denominada de Pictet-Spengler realizada en un solo
paso en medio acuso- ácido entre pH 1 y pH 3, y temperatura entre 20
y 90°C, preferiblemente entre 35 y 60ºC. El aminoácido
L-triptófano reacciona con aldehídos alifáticos,
preferiblemente formaldehído o acetaldehído, dando lugar a las
correspondientes ácidos
tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxílico
(Figura 1). Esta reacción es conocida y ocurre por una ciclación
intramolecular de la base de Schiff que da lugar a
tetrahidro-beta-carbolinas-1,3-disustituidas
con diferentes sustituyentes en el C-1 del anillo
de tetrahidropirido dependiendo del aldehído implicado. Las
tetrahidro-beta-carbolinas
1,3-disustituidas contienen dos diastereoisómeros
(1S,3S y 1R,3S) que pueden resolverse
por RP-HPLC y así obtenerse de manera pura.
En esta reacción de condensación se puede
utilizar el aminoácido L-triptófano, o análogos de
éste como triptófano 5 o 6-sustituido en compuestos
puros o provenientes de extractos naturales o subproductos, por
reacción con los aldehídos simples acetaldehído y formaldehído,
para dar los ácidos
tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxílico.
Como procedimiento general el aminoácido
(L-triptófano o derivados) disuelto en 0.05 N
H_{2}SO_{4} se agita con el correspondiente aldehído durante
varias horas, a una temperatura entre 25-80°C para
dar una mezcla de reacción que se seca por procedimientos
convencionales de secado como por ejemplo, secado en aire caliente,
por calor a vacío, atomización, o liofilización, y se purifica por
procedimientos convencionales de purificación como cromatografía
preparativa y cristalización.
Como alternativa en esta etapa 1, los ácidos
1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxílico
de la figura 1, que se utilizan como productos de partida en la
oxidación con agua oxigenada y peroxidasa según la etapa 2, pueden
obtenerse y aislarse de alimentos o productos naturales.
Etapa
2
Los compuestos puros o preparados obtenidos en
la etapa anterior, se adicionan con solución de KOH o NaOH, o se
redisuelven en una disolución tamponada para obtener un pH entre 5
y 8, preferiblemente pH 6 o 7, y se tratan en el medio de reacción
con una enzima peroxidasa proveniente de plantas, microorganismos o
de origen animal que puede obtenerse comercialmente, en una
concentración entre 10-500 mg/L (concentración de
proteína en bruto del preparado). La reacción de oxidación comienza
al agregar una disolución fresca de H_{2}O_{2} para dar una
concentración en el medio de reacción de 0.05-10
mM, preferiblemente entre 0.1 y 1 mM, y se sigue la reacción por
HPLC, hasta la obtención de las beta-carbolinas
aromáticas formadas desde los correspondientes ácido
tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxílico
según la figura 1. El rendimiento de la conversión puede
incrementarse adicionando más agua oxigenada y/o enzima peroxidasa
si fuera necesario. Una vez obtenidos los preparados finales, estos
se tratan en medio ácido/alcohol y se centrifugan a 15000 g para
separar la enzima correspondiente. Los productos finales se secan
por procedimientos convencionales de secado; como por ejemplo,
secado en aire caliente, por calor a vacío, atomización, o
Iiofilización, y se purifican por procedimientos convencionales
como cristalización, cromatografía preparativa. También se pueden
obtener puros mediante la extracción con disolventes orgánicos
(acetato de etilo, diclorometano, y otros) en medio pH
8-9, y la consiguiente eliminación del disolvente a
vacío.
Para medir la actividad como inhibidores de MAO
se utilizaron enzimas MAO A y B recombinantes (BD Biosciences,
Woburn, MA, USA). Para medir la actividad enzimática de las enzimas
monoaminooxidasa (MAO-A y MAO-B),
las fracciones de proteínas de membrana con las actividades de MAO
A o B se diluyen convenientemente en 100 mM de tampón fosfato (pH
7.4). Una mezcla de reacción de 0.2 mL con 0.01 mg/mL de enzima y
0.25 mM de sustrato kinuramina en 100 mM de tampón fosfato, se
incuba a 37ºC durante 40 min de reacción. Después del periodo de
incubación la reacción se para con 75 \muL NaOH 2N seguido de la
adición de 25 \muL de ácido perclórico al 70%. Seguidamente, la
muestra se centrifuga (10000 g) durante 5 min y se determina la
formación del producto de la reacción de desaminación de kinuramina
como 4-hidroxiquinolina, mediante
RP-HPLC con DAD (absorbancia a 320 nm). Para
determinar la inhibición, las beta-carbolinas de la
Formula I preparadas según el procedimiento, se añaden al medio de
reacción conteniendo sustrato kinuramina, y enzima MAO A o B y se
determina la actividad de MAO, comparando con un control en el que
no hay inhibidor. De esta manera se puede calcular la IC_{50}
(concentración de inhibidor que produce un 50% de inhibición de la
actividad de MAO). Para determinar el tipo de inhibición se
construyen curvas de Michaelis-Menten y de
Lineweaver-Burk en distintas concentraciones de
inhibidor. La reversibilidad se determinó mediante comparación de
la actividad de la enzima después de incubar las
beta-carbolinas frente a un control en ausencia de
incubación. La IC_{50} se calculó mediante ajuste a curvas de
regresión no lineal de la actividad frente a la concentración de
inhibidor.
El análisis cromatográfico se realizó por
RP-HPLC, para determinar la desaminación de
kinuramina utilizando un HPLC 1050 (Hewlett Packard) que lleva un
detector Array de diodos (DAD) y un detector fluorescente. Se
utiliza una columna Nova-pak C18 (Waters, Milford,
MA, USA) para la separación cromatográfica en un gradiente de tampón
fosfato pH 3-acetonitrilo, e inyectando 20 \mul.
La detección por absorbancia a 320 nm y la identificación de
4-hydroxiquinolina se lleva a cabo por espectros de UV y fluorescencia, así como por coinyección con estándares.
4-hydroxiquinolina se lleva a cabo por espectros de UV y fluorescencia, así como por coinyección con estándares.
Los preparados de
beta-carbolinas descritas en la presente invención
son inhibidores de la MAO. Estos datos sugieren su utilidad
potencial para la prevención y tratamiento de condiciones de
depresión, y como neuroprotectores. Los compuestos de partida de
los que derivan son compuestos naturales que están presentes en
alimentos y productos naturales como plantas y otros (triptófano, y
análogos como metoxitriptófano), y su obtención es mediante una
reacción en medio acuoso-ácido y posterior oxidación enzimática.
Por ello, pueden generarse en extractos de alimentos, en preparados
de tipo nutracéutico, o para la obtención de alimentos con
propiedades funcionales en el alivio, prevención o tratamiento de
depresión, adicciones, obesidad, y en las enfermedades
neurodegenerativas. Estos compuestos podrían ser útiles en
productos alimenticios, cosméticos o componentes farmacéuticos.
\vskip1.000000\baselineskip
Como productos de partida se utilizan el
aminoácido L-Triptófano (1 mmol), y acetaldehído (4
mmoles), que se obtienen comercialmente, y se disuelven en un medio
acuoso-ácido de 0.05 N H_{2}SO_{4}, y se hacen reaccionar en un
matraz agitando a 30-40ºC para dar el producto
ácido (1S,3S)- y
(1R,3S)-1-metil-1,2,3,4-tetrahidro-\beta-carbolina-3-carboxílico,
en el medio de reacción con un rendimiento superior al 90%. El
correspondiente diastereoisómero (1S,3S) precipita
como compuesto muy mayoritario (12:1). Este producto intermedio se
caracteriza por RP-HPLC-DAD,
fluorescencia, RMN y MS.
El compuesto ácido
1S,3S-1-metil-1,2,3,4-tetrahidro-\beta-carbolina-3-carboxílico
obtenido en el paso anterior 1.1) se disuelve (0.5 mM) en un medio
tamponado de fosfato a pH 7 y se adiciona con una enzima peroxidasa
(peroxidasa de rábano picante, tipo II comercial de Sigma Cemical
Co., 150-250 u/mg sólido) y utilizada sin previa
purificación, en una concentración de liofilizado de 25 mg/L, y con
H_{2}O_{2} en concentración de 50 pM H_{2}O_{2}. Se incuba a
37ºC durante 40 min y se sigue la reacción por
RP-HPLC con detección a 254 nm, para obtener un
medio de reacción que contiene
1-metil-beta-carbolina
(75 \muM) (14% conversión). La utilización de 100 mg/L de enzima
y 250 \muM de H_{2}O_{2} eleva la conversión hasta el 60% con
250 \muM de sustrato obtenido en 1.1).
\vskip1.000000\baselineskip
Como productos de partida se utilizan el
aminoácido L-Triptófano (1.5 mmoles) y formaldehído
(4 mmoles), que se obtienen comercialmente, se disuelven en un
medio acuoso-ácido de 0.05 N H_{2}SO_{4} y se hacen reaccionar
en un matraz agitando 30-40ºC para dar el producto
ácido
1,2,3,4-tetrahidro-\beta-carbolina-3-carboxílico,
en el medio de reacción en un rendimiento de 90%. El producto
precipita en frío y se caracteriza por
RP-HPLC-DAD, fluorescencia, RMN y
MS.
El compuesto ácido
1,2,3,4-tetrahidro-6-carbolina-3-carboxílico
obtenido en el paso anterior 1.1) se disuelve (0.5 mM) en medio
tamponado de fosfato a pH 7 y se adiciona con una enzima peroxidasa
(peroxidasa de rábano, tipo II, Sigma; 150-250 u/mg
sólido), obtenida comercialmente y utilizada sin previa
purificación, en una concentración de liofilizado comercial de 25
mg/L, y con H_{2}O_{2} en concentración de 100 \muM
H_{2}O_{2}. Se incuba a 37ºC durante 40 min y se sigue la
reacción por RP-HPLC con detección a 254 nm, para
obtener un medio de reacción que contiene
beta-carbolina (101 \muM) (20% conversión). La
utilización de 250 mg/L de peroxidasa comercial de rábano y 100 pM
de H_{2}O_{2} eleva la conversión hasta el 45% de conversión
cuando se utiliza 250 \muM de sustrato obtenido en 1.1).
\vskip1.000000\baselineskip
Como productos de partida se utilizan el
aminoácido 5-metoxi-D,L-Triptófano (1.5
mmoles) y acetaldehído (6 mmoles), que se obtienen comercialmente,
se disuelven en un medio acuoso-ácido de 0.05 N H_{2}SO_{4} y
se hacen reaccionar en un matraz agitando a temperatura ambiente
para dar el producto ácido
6-metoxi-1-metil-1,2,3,4-tetrahidro-\beta-carbolina-3-carboxílico,
en una mezcla de diastereorisómeros en el medio de reacción en un
rendimiento superior al 90%. El producto precipita en frío y se
caracteriza por RP-HPLC-DAD,
fluorescencia.
El compuesto ácido
6-metoxi-1,2,3,4-tetrahidro-\beta-carbolina-3-carboxílico
obtenido en el paso anterior 1.1) se disuelve en medio tamponado de
fosfato a pH 7 (0.5 mM) y se adiciona con una enzima peroxidasa
(peroxidasa de rábano picante, tipo II; 150-250 u/mg
sólido), obtenida comercialmente y utilizada sin previa
purificación, en una concentración de liofilizado comercial de 25
mg/L, y con H_{2}O_{2} en concentración de 100 \muM
H_{2}O_{2}. Se incuba a 37ºC durante 40 min y se sigue la
reacción por RP-HPLC con detección a 254 nm, para
obtener un medio de reacción que contiene
6-metoxi-1-metil-beta-carbolina.
- a)
- Las beta-carbolinas se evalúan como inhibidores de las enzimas recombinantes MAO A y B. Para ello, medios de reacción (0.2 mL) que contienen 0.01 mg/mL de proteína de membrana, kinuramina (0.25 mM), y tampón fosfato 100 mM pH7.4, se incuban en ausencia (control) o en presencia de diferentes concentraciones del inhibidor beta-carbolina, y a 37ºC durante 40 min. Se determina la formación del producto de la reacción de desaminación de kinuramina resultante como 4-hidroxiquinolina. Se obtienen los siguientes valores de IC_{50} de la Tabla 1, calculados desde curvas de inhibición de la Figura 1
La inhibición por las
beta-carbolinas obtenidas según el procedimiento de
invención es competitiva como se deduce de los resultados de la
inhibición a distintas concentraciones de sustrato e inhibidores y
se construyen curvas de Lineweaver-Burk. La
inhibición de las beta-carbolinas resultó ser
reversible al comparar la actividad de la enzima cuando ha sido
incubada en presencia del inhibidor frente a los correspondientes
controles.
- b)
- En un segundo test, se evaluó la actividad como inhibidores de MAO de los ácidos 1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxílico (precursores de beta-carbolinas en la reacción con peroxidasa), después de la oxidación con peroxidasa, para dar las correspondientes beta-carbolinas. En este experimento, los compuestos ácido 1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxílico se tratan con peroxidasa (25 mg/L peroxidasa de rábano picante tipo II Sigma) durante 40 min a 37ºC, en presencia de H_{2}O_{2} 50 \muM, y se sigue la actividad inhibidora de MAO de la mezcla obtenida sobre la desaminación de kinuramina (250 \muM), incubando otros 40 min a 37ºC. Los datos se recogen en la tabla 2.
Concluyendo, el procedimiento descrito permite
obtener compuestos y preparados conteniendo
beta-carbolinas que tienen actividad de inhibición
de MAO A y B. La inhibición de las beta-carbolinas
sobre MAO es reversible y, en principio, carecerían de los riesgos
ocasionados en la inhibición irreversible asociada a crisis
hipertensivas debidas a la ingestión de aminas vasoactivas
(tiramina). La invención describe un procedimiento para obtener
beta-carbolinas previamente descritas en productos
naturales y alimentos, que mimetiza las rutas biosintéticas que
conducen a estos compuestos, con la incorporación de una etapa
singular de oxidación enzimática catalizada con enzimas
peroxidasas. Los preparados obtenidos por este procedimiento
sencillo podrían tener utilidad como preparados dietéticos o
medicinales.
Claims (5)
1. Un procedimiento de obtención de compuestos
beta-carbolina de productos naturales y alimentos
inhibidores de la enzima monoaminooxidasa MAO,
caracterizadas por ser compuestos de acuerdo a la Fórmula
I,
donde los sustituyentes R_{1},
R_{2}, son hidrógeno (H), halógeno (F, Cl, Br, I), alquilo
(CH_{3}, CH_{3}-(CH_{2})_{n}-) o metoxilo
(OCH_{3}), y R_{3} es H, CH_{3} o alquilo (CH_{3}-
(CH_{2})_{n}-;
por utilizar como biocatalizador una enzima
peroxidasa
por ser producidos por reacción de oxidación con
H_{2}O_{2} a partir de los precursores ácido
1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxílico
proveniente de plantas, microorganismos o de origen animal, y
y por realizarse la reacción en un medio acuoso
tamponado entre pH 5 y 8, y temperatura entre 20 y 50ºC.
2. Un procedimiento de obtención de compuestos
beta-carbolina de productos naturales y alimentos
inhibidores de la enzima monoaminooxidasa MAO, según la
reivindicación 1 caracterizadas porque los precursores ácidos
1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxílico
utilizados, son producidos por reacción del triptófano o sus
análogos, con aldehídos alifáticos, preferiblemente formaldehído y
acetaldehído, en medios acuosos-ácidos preferiblemente entre pH 1 y
3, con temperatura entre 30 y 80ºC.
3. Un procedimiento de obtención de compuestos
beta-carbolina de productos naturales y alimentos
inhibidores de la enzima monoaminooxidasa MAO, según la
reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque los precursores
aminoácidos iniciales se obtienen desde extractos de plantas,
alimentos, subproductos alimentarios o microorganismos.
4. Un procedimiento de obtención de compuestos
beta-carbolina de productos naturales y alimentos
inhibidores de la enzima monoaminooxidasa MAO, según la
reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque los compuestos
de la fórmula 1 se concentran, purifican total o parcialmente y se
secan, mediante procedimientos convencionales de concentración,
purificación y secado.
5. La utilización de los compuestos compuestos
beta-carbolina de productos naturales y alimentos
inhibidores de la enzima monoaminooxidasa MAO de la formula I
obtenidos según las reivindicaciones 1 a 4, por sus propiedades como
inhibidores reversibles de la monoaminooxidasa (MAO) en preparados
farmacéuticos, productos de parafarmacia, nutracéuticos, y alimentos
funcionales, para la prevención, alivio o mitigación de diversas
condiciones que tienen que ver con la actividad de MAO como
depresión, adiciones, dependencias, trastornos de la alimentación,
y neuroprotección.
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| ES200600175A ES2278534B1 (es) | 2006-01-26 | 2006-01-26 | Preparacion de beta-carbolinas de productos naturales y alimentos con actividad como inhibidores de monoaminooxidasa (mao). |
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