ES2836481T3 - Procedimiento para la preparación de (S)-nicotina a partir de miosmina - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para fabricar (S)-nicotina que comprende las etapas de: (i) reducir la miosmina con una enzima con actividad de imina reductasa para formar (S)-nornicotina; y (ii) metilar la (S)-nornicotina formada a partir de la etapa (i) para formar (S)-nicotina.
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento para la preparación de (S)-nicotina a partir de miosmina
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para producir sintéticamente (S)-nicotina ([(S)-3-(1 -metilpirrolidín-2-il)piridina]).
Antecedentes de la invención
La nicotina (3-[1-metilpirrolidín-2-il]piridina) es un producto natural que se puede obtener de las hojas de Nicotiana, es decir, la planta del tabaco. Hay una demanda considerable de productos con nicotina en la industria del tabaco y también en el ámbito farmacéutico. Por ejemplo, sigue habiendo una demanda de productos de tabaco tradicionales, p. ej., cigarrillos tradicionales, lo que probablemente se debe a la naturaleza adictiva de la nicotina. Sin embargo, debido a la creciente preocupación en torno al impacto perjudicial de los productos de los cigarrillos tradicionales sobre la salud del consumidor, hay una demanda creciente de productos que contienen nicotina para remplazar el tabaco, tales como dispositivos de tipo cigarrillo electrónico, parches, pastillas para chupar, pulverizador nasal y goma de mascar. Los productos de sustitución del tabaco se pueden dar a conocer como un reemplazo para los productos tradicionales del tabaco que de otra manera provocarían efectos carcinógenos perjudiciales; tal como debido a la presencia de alcaloides de piridina, compuestos aromáticos policíclicos, fenoles y N-nitrosaminas. Los productos de sustitución del tabaco se pueden usar específicamente para tratar la dependencia de la nicotina. Dentro del campo farmacéutico, también existe interés por las posibles aplicaciones terapéuticas de la nicotina.
La obtención de nicotina con niveles idóneos tanto de pureza enantiomérica como de pureza química sigue siendo un desafío. La nicotina tiene actividad óptica, es decir, puede existir en una de las dos posibles formas enantioméricas: (R) -nicotina o (S)-nicotina. Existen procedimientos para obtener mezclas racémicas de nicotina (p. ej., el documento WO2016065209). No obstante, se reconoce que la (S)-nicotina (es decir, [(S)-3-(1 -metilpirrolidín-2-il)piridina]) es significativamente más activa que la (R)-nicotina. Por lo tanto, lo que se demanda en la industria tabacalera y en el ámbito farmacéutico es la nicotina con un nivel elevado de pureza enantiomérica con respecto al enantiómero (S). La industria farmacéutica impone en concreto normativas estrictas sobre el nivel requerido de pureza enantiomérica para los nuevos productos farmacéuticos, y es posible que pueda incrementarse el nivel requerido existente de pureza enantiomérica para la nicotina. Además de la demanda de pureza enantiomérica de la nicotina, la obtención de un nivel elevado de pureza química tiene también su importancia tanto en la industria farmacéutica como en la industria tabacalera, en donde la pureza química se refiere a la cantidad de nicotina (es decir, las formas enantioméricas (R) y (S) ) en comparación con las impurezas que no son de nicotina. La industria farmacéutica ya impone unas normativas muy estrictas sobre el nivel requerido de pureza química de la nicotina en comparación con las impurezas que no son de nicotina. De hecho, el estándar actual de referencia de la Farmacopea de los EE. UU. para la pureza química de la nicotina es de al menos el 99% con no más del 0,5% de cualquier otra impureza. Una pureza química elevada tiene también una importancia significativa para la industria tabacalera, ya que los efectos carcinógenos perjudiciales mencionados más arriba pueden estar ocasionados por las impurezas que son capaces de ejercer un efecto carcinógeno.
La (S)-nicotina se puede obtener mediante la extracción de hojas de la planta del tabaco. Sin embargo, cuando la nicotina se obtiene de esta manera, tiene típicamente una pureza química de menos del 95% debido a la presencia de impurezas de alcaloides relacionados. Una composición típica de una muestra de nicotina obtenida por extracción de las hojas de tabaco comprende el 93% de (S)-nicotina, el 2,4% de (S)-nornicotina, el 3,9% de (S)-anatabina y el 0,5% de (S)-anabasina (E. Leete y M. Mueller, J. Am. Chem. Soc., 1982, 104, 6440-44). Las impurezas de los alcaloides tienen una estructura química similar a la nicotina y, por lo tanto, son difíciles de retirar. La composición real de la nicotina depende también de factores tales como el origen geográfico y la estación en la que se cosecha.
La (S)-nicotina también se puede obtener mediante procedimientos sintéticos. En la técnica anterior hay varios ejemplos de (S)-nicotina producida por medios sintéticos. Por ejemplo, en la técnica anterior hay procedimientos en los que se hace una mezcla racémica (es decir, igual) de (R)-nicotina y (S)-nicotina, en donde esta mezcla racémica se resuelve posteriormente para obtener el enantiómero (S) (documentos US 8.389.733, US 2014/0031554 y US 8.378.111). Hay también un ejemplo en la técnica anterior de un procedimiento sintético para producir la (S)-nicotina con el uso de una enzima como biocatalizador (documento WO 2014/174505); el uso de biocatalizadores en los procedimientos enantioméricamente selectivos en general se conocen fuera del campo de la nicotina (L. S. Bleicher et al, J. Org. Chem., 1998, 63, 1109-18, documento WO 2013/170050, document WO2015/073555, P. N. Scheller et al., Chembiochem, 2014, 15, 2201-4, Gand et al., J. Mol. Cat. B, Enzymatic, 2014, 110, 126-32). Sin embargo, sigue siendo un desafío la síntesis selectiva de la (S)-nicotina en preferencia sobre el enantiómero (R) con una elevada selectividad enantiomérica a la vez que también se consigue una pureza química elevada.
Compendio de la invención
En un primer aspecto, existe un procedimiento para fabricar la (S)-nicotina, que comprende las etapas de:
(i) reducir la miosmina con una enzima con actividad de imina reductasa para formar la (S)-nornicotina; y
(ii) metilar la (S)-nornicotina formada a partir de la etapa (i) para formar la (S)-nicotina.
Sorprendentemente se encontró que por medio de las etapas (i) y (ii) de este procedimiento, donde la miosmina se utilizaba como el material de partida, se conseguía que la (S)-nicotina tuviera una pureza química y enantiomérica muy elevadas. Esto indica que la etapa (i) es una etapa sintética muy selectiva del enantiómero, con preferencia por el isómero (S), y que la etapa (ii) es tal que esta preferencia se conserva en el producto final de nicotina, a la vez que se mantiene también una gran pureza química. Esto permite producir la (S)-nicotina sin tener que recurrir a la resolución de una mezcla racémica. La gran pureza química es particularmente ventajosa; un nivel reducido de las purezas indeseables típicamente asociadas a la nicotina da lugar a una reducción del riesgo de posibles efectos negativos relacionados con las impurezas. Además, las etapas (i) y (ii) ofrecen un procedimiento de fabricación cómodo para producir la (S)-nicotina.
En un segundo aspecto, existe un procedimiento para producir una composición farmacéutica, que comprende la formación de la (S)-nicotina mediante el procedimiento del primer aspecto, y la inclusión de la (S)-nicotina en la composición farmacéutica junto con uno o más excipientes farmacéuticos.
En un tercer aspecto, existe un procedimiento para producir una formulación de un dispositivo de cigarrillo electrónico, que comprende la formación de la (S)-nicotina mediante el procedimiento del primer aspecto, y la inclusión de la (S)-nicotina en un disolvente con uno o varios aditivos.
En un cuarto aspecto, está el uso de la miosmina y una enzima con actividad de imina reductasa en un procedimiento para formar la (S)-nicotina.
Descripción de las realizaciones preferidas
Tal y como el experto en la técnica apreciará, la miosmina, la (S)-nornicotina y la (S)-nicotina tienen las estructuras siguientes:
El experto estará familiarizado con los esquemas de reacción adecuados para fabricar la miosmina.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, una «enzima con actividad de imina reductasa» se refiere a una enzima capaz de reducir de manera asimétrica un grupo imina, en concreto un grupo de imina secundaria, al correspondiente grupo amina, en concreto un grupo de amina secundaria. En concreto, la enzima con actividad de imina reductasa utilizada en el procedimiento descrito en la presente memoria es una enzima capaz de catalizar la conversión de la miosmina en (S)-nornicotina. El experto en la técnica está familiarizado con tales enzimas. La enzima se puede añadir a la mezcla de reacción en una amplia gama de formas, tal como en forma de células secadas para pulverización.
Preferiblemente, el procedimiento utiliza una enzima capaz de convertir la miosmina en (S)-nornicotina de tal modo que se obtiene la (S)-nornicotina con un exceso enantiomérico de al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, más preferiblemente al menos el 98%, lo más preferiblemente al menos el 99%. El exceso enantiomérico se mide de la manera en que se describe en los ejemplos. En los procedimientos descritos en la presente memoria, este exceso
enantiomérico elevado también se consigue para la (S)-nicotina que finalmente se consigue obtener como el producto final.
Tal y como el experto en la técnica apreciará, las enzimas con actividad de imina reductasa incluyen típicamente las oxidorreductasas dependientes de NADH/NADPH, tales como las deshidrogenasas dependientes de NADH/NADPH y las imina reductasas dependientes de NADH/NADPH. Las deshidrogenasas dependientes de NADH/NADPH incluyen las citadas mediante el número E.C.1.1.1. de la clasificación de enzimas, e incluye, en concreto, las deshidrogenasas del 6-fosfogluconato, citadas mediante el número E.C.1.1.1.44. de la clasificación de enzimas. Las imina reductasas incluyen las citadas con el número E.C.1.5.1 de la clasificación de enzimas, en concreto las citadas con el número E.C 1.5.1.48. de la clasificación de enzimas.
Los ejemplos de especies diferentes de imina reductasas incluyen la tiazolinilo imina reductasa, la dihidrofolato reductasa, la A1-pirrolina-2-carboxilato reductasa, la A1-piperideína-2-carboxilato reductasa, la sanguinarina reductasa y la 1,2-dihidrorreticulina reductasa. Tales enzimas se pueden aislar o pueden proceder de fuentes tales como Streptomyces, Verrucosispora, Mesorhizobium, Yersinia, Pseudomonas, Candida albicans, Eschscholzia y Papaver.
Los ejemplos de enzimas posibles también incluyen las descritas en la solicitud de patente internacional WO2013170050 (cuyo contenido se incorpora mediante referencia).
La enzima puede ser IRED_A, IRED_B, IRED_C, IRED_D, IRED_E, IRED_F, IRED_P, IRED_X, IRED_AB, IRED-20, o un homólogo de las mismas. IRED_A, IRED_B, IRED_C, IRED_D, IRED_E, IRED_F, IRED_P, IRED_X e IRED_AB están disponibles en Enzymicals; IRED-20 está disponible en Almac Group. Por ejemplo, en una realización, la enzima es IRED_A, IRED_B, Ir Ed_C, IRED_D, IRED_E, IRED-20, o un homólogo de las mismas.
Tal y como se describe en la presente memoria, la enzima puede comprender una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ iD NO: 4 o un homólogo de las mismas. En otra realización, la enzima comprende una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, «un homólogo de las mismas» significa una enzima que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con cualquiera de las enzimas descritas en la presente memoria. Por ejemplo, «un homólogo de las mismas» puede significar una enzima que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «identidad de secuencia» se refiere a una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos. Cuando una posición de una secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido en la correspondiente posición de la secuencia con que se compara, se dice que las secuencias son «idénticas» en dicha posición. El porcentaje de «identidad de secuencia» se calcula con la determinación del número de posiciones en el que aparece el mismo resto de aminoácido en ambas secuencias para producir el número de posiciones «idénticas». El número de posiciones «idénticas» se divide a continuación por el número total de posiciones en la ventana de comparación y se multiplica por 100 para transmitir el porcentaje de «identidad de secuencia». El porcentaje de «identidad de secuencia» se determina mediante la comparación de dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de una ventana de comparación. Para alinear de manera óptima las secuencias a comparar, la porción de una secuencia polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones denominadas huecos, mientras que la secuencia de referencia se mantiene constante. Un alineamiento óptimo es aquel alineamiento que, incluso con huecos, produce el mayor número posible de posiciones «idénticas» entre la secuencia de referencia y la secuencia con la que se compara. El nivel de identidad de secuencia entre las secuencias codificantes se puede calcular mediante los métodos conocidos.
La identidad de secuencia se puede calcular con el uso de los métodos informáticos disponibles públicamente para determinar la identidad de secuencia, que incluyen BLASTP, BLASTN y FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410, (1990)), el programa BLASTX disponible del NCBI y el programa Gap del Genetics Computer Group (Madison WI). El nivel de identidad de secuencia se obtiene mediante el programa Gap, con una penalización por hueco de 50 y una penalización por longitud del hueco de 3 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos.
En líneas generales, la etapa (i) comprende la reducción de la miosmina con la enzima en presencia de un cofactor idóneo, en concreto NADH o NADPH. Tal y como el experto en la técnica apreciará, la enzima y el cofactor se pueden introducir en la mezcla de reacción como componentes independientes o se pueden introducir en la mezcla de reacción como parte del mismo componente, por ejemplo, en forma de células microbianas enteras que contienen tanto la enzima como el cofactor adecuado. Puede estar presente un sistema idóneo de reciclaje de los cofactores para convertir el cofactor desde su forma oxidada (NAD+ o NADP+) a su forma reducida (NADH o NADPH). El experto en la técnica estará familiarizado con los sistemas de reciclaje de cofactores adecuados, tales como los sistemas de reciclaje de cofactores que incluyen glucosa (monohidrato)/glucosa deshidrogenasa, formiato/formiato deshidrogenasa e isopropanol/alcohol deshidrogenasa. Cuando está presente un sistema de reciclaje de cofactores, se puede añadir el cofactor a la mezcla de reacción en su forma oxidada, es decir, como NAD+ o NADP+.
El propio cofactor puede estar presente en el intervalo de 0,02 partes a 10 partes en peso por 100 partes de miosmina. Preferiblemente, el cofactor puede estar presente en el intervalo de 0,05 partes a 5 partes en peso por 100 partes de miosmina. Más preferiblemente, el cofactor puede estar presente en el intervalo de 0,5 partes a 2 partes en peso por 100 partes de miosmina.
La cantidad de enzima presente en la etapa (i) puede estar presente en una cantidad de 0,1 partes a 30 partes en peso por 100 partes de miosmina. Preferiblemente, la cantidad de enzima presente en la etapa (i) puede estar presente en una cantidad de 0,5 partes a 10 partes en peso de miosmina. El experto en la técnica apreciará que la cantidad de enzima presente en la etapa (i) se puede ajustar según el periodo de tiempo deseado para la reacción de la etapa (i), en donde se puede utilizar más enzima durante un tiempo de reacción más breve y viceversa.
La etapa (i) se puede llevar a cabo en presencia de una resina de intercambio de iones; sin embargo, la etapa (i) se lleva a cabo preferiblemente en ausencia de una resina de intercambio de iones. La resina de intercambio de iones, cuando está presente, es una resina Amberlite, una resina Amberlyst, una resina Amberjet, tal como Amberlite IR-120, o una resina Dowex, en donde cada una de estas resinas de intercambio de iones está disponible de Aldrich.
El posible pH para la etapa (i) puede estar en el intervalo de pH 5-9.
La (S)-nornicotina se convierte en (S)-nicotina mediante otra etapa de: (ii) metilar la (S)-nornicotina formada a partir de la etapa (i) para formar la (S)-nicotina.
Resultó sorprendente hallar que después de la etapa (ii) se obtenía la (S)-nicotina con una pureza química particularmente elevada y un exceso enantiomérico particularmente alto.
La etapa de metilación, es decir, la etapa (ii), se puede llevar a cabo por medio de un procedimiento de varias etapas. Por ejemplo, la etapa (ii) puede comprender la formación de un compuesto (p. ej., W-formil-(S)-nornicotina) y, a continuación, la reducción de este compuesto para llegar al producto metilado, es decir, la (S)-nicotina. No obstante, la etapa (ii) se lleva a cabo preferiblemente por medio de un procedimiento con una sola etapa, tal como la metilación reductora. Tal y como apreciará el experto en la técnica, el término «metilación reductora» se refiere a un procedimiento mediante el cual se forma una especie que a su vez se reduce para llegar al producto metilado (es decir, (S)-nicotina) por medio de una sola etapa.
Preferiblemente, la (S)-nornicotina se metila y se reduce con el uso de formaldehído o un compuesto basado en el formaldehído. La etapa (ii) es particularmente eficaz cuando se utilizan tales reactivos.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, un compuesto basado en el formaldehído se utiliza para referirse a un compuesto que es capaz de generar el formaldehído in situ durante una reacción química. El experto en la técnica apreciará que esto significa que el compuesto basado en el formaldehído se añade a la mezcla de reacción y, a continuación, se degrada posteriormente para liberar el formaldehído (y otros compuestos relacionados) que, a continuación, pueden reaccionar con la (S)-nornicotina para formar la (S)-nicotina. En el caso de la adición de un compuesto basado en el formaldehído, el experto en la técnica estará familiarizado con la manera de ajustar la cantidad adecuada del compuesto basado en el formaldehído para conseguir la liberación de una cantidad concreta de formaldehído in situ.
El propio formaldehído tiene la fórmula HC(O)H y se suele introducir como un líquido o un gas. El formaldehído se puede introducir en la mezcla de reacción como parte de una disolución acuosa de formaldehído (tales disoluciones acuosas se pueden denominar formalina).
El compuesto basado en el formaldehído se suele introducir como un sólido o un líquido. El compuesto basado en el formaldehído puede ser un dímero de formaldehído, un polímero de formaldehído o un acetal de formaldehído. Preferiblemente, el compuesto basado en el formaldehído es un polímero de formaldehído.
Tal y como el experto en la técnica apreciará, el término «polímero de formaldehído» hace referencia a un compuesto con tres o más unidades repetidas de formaldehído polimerizadas. Preferiblemente, el polímero de formaldehído es paraformaldehído. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «paraformaldehído» se refiere a un polímero de formaldehído con un grado de polimerización de 8-100 unidades.
Cuando la (S)-nornicotina se metila a la vez que se reduce con el uso del formaldehído o de un compuesto basado en el formaldehído, el formaldehído o el compuesto basado en el formaldehído se pueden añadir en una cantidad de 50 partes a 110 partes en peso, preferiblemente de 60 partes a 90 partes en peso, por 100 partes de (S)-nornicotina. Tales cantidades se refieren a las cantidades reales presentes de formaldehído, del compuesto basado en el formaldehído y de la (S)-nornicotina. Por lo tanto, cuando por ejemplo se forma la (S)-nornicotina como parte de una disolución (p. ej., una disolución acuosa) y/o cuando el formaldehído o el compuesto basado en el formaldehído se introduce en la mezcla de reacción como parte de una disolución (p. ej., una disolución acuosa), las partes en peso descritas en la presente memoria se refieren a las cantidades reales del formaldehído, del compuesto basado en el formaldehído y de la (S)-nornicotina contenidos en las correspondientes disoluciones.
Cuando la etapa de metilación es una etapa de metilación reductora, el reductor puede ser ácido fórmico, cianoborohidruro de sodio o paladio/hidrógeno, preferiblemente ácido fórmico. Tal y como apreciará el experto en la técnica, la cantidad adecuada del reductor dependerá del reductor específico utilizado. Por ejemplo, cuando el reductor es ácido fórmico, el reductor puede estar presente en una cantidad de 40-110 partes, preferiblemente de 40-100 partes, más preferiblemente de 50 partes a 70 partes en peso por 100 partes de (S)-nornicotina. Tales cantidades se refieren a las cantidades reales presentes del reductor y de la (S)-nornicotina.
Preferiblemente, las etapas (i) y (ii) se pueden llevar a cabo sin aislar la (S)-nornicotina formada de la etapa (i). Esto permite la formación de (S)-nicotina con un exceso enantiomérico elevado y una pureza química elevada al mismo tiempo que se utiliza una ruta de síntesis particularmente cómoda. Al no tener que aislar la (S)-nornicotina de la mezcla de reacción formada en la etapa (i) antes de convertirla en la (S)-nicotina se obtiene el beneficio de ofrecer una ruta de síntesis particularmente cómoda, ya que el aislamiento de la (S)-nornicotina puede ser un procedimiento intensivo de resultas de elevados costes de tiempo y energía de la planta (por ejemplo, debido a la necesidad de grandes cantidades de disolvente para la extracción y/o la evaporación de la disolución). Por ejemplo, en la etapa (i), la (S)-nornicotina se puede formar como parte de una disolución acuosa, en donde la disolución acuosa que contiene la (S)-nornicotina prosigue a continuación para su uso directo en la etapa (ii). En consecuencia, la etapa de metilación (etapa (ii)) se realiza en la disolución acuosa de (S)-nornicotina formada en la etapa (i). Cuando el procedimiento se lleva a cabo de esta manera, es preferible que la (S)-nornicotina se metile reductivamente, bien mediante el uso de paraformaldehído o mediante el uso del formaldehído que se introduce en la mezcla de reacción como parte de una disolución acuosa. Cuando el procedimiento se lleva a cabo de esta manera, es más preferible que la (S)-nornicotina se metile reductivamente mediante el uso del formaldehído que se introduce en la mezcla de reacción como parte de una disolución acuosa, ya que se ha encontrado que esto reduce la formación indeseable de burbujas en la mezcla de reacción a medida que continúa el procedimiento.
La (S)-nicotina producida con el uso de los procedimientos descritos en la presente memoria tiene un exceso enantiomérico de al menos el 90%, preferiblemente de al menos el 95%, más preferiblemente de al menos el 98%, lo más preferiblemente de al menos el 99%. El experto en la técnica estará familiarizado con la manera de medir el exceso enantiomérico. El exceso enantiomérico puede medirse, por ejemplo, de la manera descrita en los ejemplos.
La (S)-nicotina producida con los procedimientos descritos en la presente memoria tiene una pureza química de al menos el 98%, preferiblemente de al menos el 99%. El experto en la técnica estará familiarizado con la manera de medir la pureza química. La pureza química puede medirse, por ejemplo, de la manera descrita en los ejemplos. El nivel de pureza química conseguida en los ejemplos es particularmente alto.
La (S)-nicotina producida con las etapas de los métodos de más arriba se puede incluir en una composición farmacéutica junto con uno o más excipientes farmacéuticos. Preferiblemente, la composición farmacéutica es un parche transdérmico, una pastilla para chupar o una formulación para inhalación.
La (S)-nicotina producida con las etapas de los métodos de más arriba también se puede incluir en una formulación para la inclusión en un dispositivo de tipo cigarrillo electrónico. La formulación incluye la (S)-nicotina en un disolvente con uno o más aditivos. El disolvente puede comprender glicerol, propilenglicol, agua o mezclas de los mismos. Preferiblemente, el disolvente comprende glicerol y propilenglicol, en donde la proporción de glicerol por propilenglicol está en el intervalo de 80:20 a 20:80 en volumen. Uno o más aditivos pueden incluir uno o más saborizantes.
También se da a conocer en la presente memoria un kit que comprende miosmina y una enzima con actividad de la imina reductasa para ser usada en un procedimiento para formar la (S)-nicotina.
Un esquema de reacción particularmente preferido se muestra a continuación como esquema 1:
NADPH
miosmina (S)-normcotina (S)-mcotina
La invención se mostrará con los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos muestran los resultados asociados al procedimiento descrito en la presente memoria. Se han utilizado diferentes reactivos para ejemplificar el procedimiento.
Las enzimas utilizadas incluyen las siguientes:
IRED_A de Verrucosispora maris (cepa AB-18-032, Uniprot: F4F8G5_VERMA) con la secuencia de aminoácidos (a) o (b) que se presenta a continuación, en donde la secuencia (a) corresponde a la SEQ ID NO: 1 y la secuencia (b) corresponde a la SEQ ID NO: 2.
(a) Tal y como se utiliza con la etiqueta de hexahistidina, un total de 302 restos de aminoácidos:
MHHHHHHAADSRAPVTVIGLGAMGSALARAFLAAGHPTTVWNRSPDKADDLV
GQGAVRAATVADAMSAGNLIVICVLDYRAMREIIDSTGHSPADRVIVNLTSGTP
GDARATAAWAQEQGMEYIDGAIMATPSMIGSEETLIFYGGPQEVYDAHADTLR
SIAGAGTYLGEEPGLPSLYDVALLGLMWTTWAGFMHSAALLASEKVPAAAFLP
YAQAWFEYVISPEVPNLATQVDTGAYPDNDSTLGMQTVAIEHLVEASRTQGVD
PTLPEFLHARAEQAIRRGHAGDGFGAVFEVLRAPAAQ
(b) Enzima original, un total de 296 restos de aminoácidos:
MAADSRAPVTVIGLGAMGSALARAFLAAGHPTTVWNRSPDKADDLVGQGAVR
AATVADAMSAGNLIVICVLDYRAMREIIDSTGHSPADRVIVNLTSGTPGDARATA
AWAQEQGMEYIDGAIMATPSMIGSEETLIFYGGPQEVYDAHADTLRSIAGAGTY
LGEEPGLPSLYDVALLGLMWTTWAGFMHSAALLASEKVPAAAFLPYAQAWFE
YVISPEVPNLATQVDTGAYPDNDSTLGMQTVAIEHLVEASRTQGVDPTLPEFLH
ARAEQAIRRGHAGDGFGAVFEVLRAPAAQ
IRED_B de Mesorhizobium sp. L48C026A00, también conocida como una 6-fosfogluconato deshidrogenasa, con la secuencia de aminoácidos (a) o (b) que se presenta a continuación, en donde la secuencia (a) corresponde a la SEQ ID NO: 3 y la secuencia (b) corresponde a la SEQ ID NO: 4.
(a) Tal y como se utiliza con la etiqueta de hexahistidina, un total de 310 restos de aminoácidos:
MHHHHHHASNVCVLGAGRMGSSIARTLLDRGYPTWVWNRTAAKCEPLAALG
AKVASSVQEGIQAAEVVIINVLDYAASDALLKRDGIASALAGKAVVQLTSGSPRL
AREEARWVEAHGAGYLDGAIMATPDFIGKPETAMLYSGSRDVYEKHKPLLFAL
GGGTNYVGELPGQASALDTALLTQMWGGLFGALQGMAVAEAEGLDLETFRN
HLSAFKPVVDASLFDLVDRTNARRFAGDDATLASLGAHYSAFQHLLEACEERG
LDAAMPRAMDMIFRQALSLGSMEDDLASLALLFRNGSPRQSREPANA
(b) La enzima original, un total de 304 restos de aminoácidos
MASNVCVLGAGRMGSSIARTLLDRGYPTWVWNRTAAKCEPLAALGAKVASSV
QEGIQAAEVVIINVLDYAASDALLKRDGIASALAGKAVVQLTSGSPRLAREEAR
WVEAHGAGYLDGAIMATPDFIGKPETAMLYSGSRDVYEKHKPLLFALGGGTNY
VGELPGQASALDTALLTQMWGGLFGALQGMAVAEAEGLDLETFRNHLSAFKP
VVDASLFDLVDRTNARRFAGDDATLASLGAHYSAFQHLLEACEERGLDAAMPR
AMDMIFRQALSLGSMEDDLASLALLFRNGSPRQSREPANA
Ejemplo 1
Se llevaron a cabo biotransformaciones a una escala de 0,5 ml con una disolución de miosmina a 10 mM y NADP+ (0,5 mM), glucosa (25 mM), glucosa deshidrogenasa (10 U/ml) y la enzima con actividad de imina reductasa. Las enzimas utilizadas se detallan en la tabla 1, disponibles en Enzymicals. Para cada enzima, la cantidad de enzima fue de 9 mg/ml de extracto libre de células (se estima que aproximadamente 0,9 mg/ml contenían la enzima). Para IRED_B e IRED_C específicamente, se llevaron a cabo pruebas adicionales que utilizaron el extracto libre de células a 0,9 mg/ml.
El exceso enantiomérico de la (S)-nornicotina obtenida de la biotransformación se determinó con el uso de una columna de Chiralpak AD-H (250 x 4,6 mm de diámetro interno) eluida con una mezcla de hexano:etanol:dietilamina a 74,9:25,0:0,1 (v/v/v) a 1 ml/min durante 18 min a 30°C. Este método también se utilizó para medir la conversión de
la miosmina en nornicotina, un factor relativo de respuesta de 2,18:1 que se ha determinado mediante la detección de absorción UV a 254 nm.
Los resultados se muestran en la tabla 1 que viene a continuación.
Tabla 1
El % de exceso enantiomérico para la (S)-nornicotina se identificó según la ecuación [(S)-(R)]/((S) (R)] x 100 donde (S) y (R) son las cantidades presentes de los enantiómeros (S) y ®, respectivamente. El % de conversión se identificó según la cantidad de miosmina consumida, esto es, según la ecuación 100 - (cantidad final de miosmina)/(cantidad de partida de miosmina) x 100.
Ejemplo 2
Las reacciones se llevaron a cabo de una manera similar al ejemplo 1, excepto que se utilizaron 1,5 equivalentes de glucosa y un 1% en moles de NADP+ con respecto al sustrato de miosmina y se empleó un tiempo de reacción de 24 h. Las enzimas utilizadas se detallan en cada una de las tablas 2, 3 y 4 (disponibles en Enzymicals).
A una concentración de miosmina de 100 mM, con el uso de 0,9 mg/ml de extracto enzimático libre de células, los resultados fueron como los que se muestran en la tabla que viene a continuación:
Tabla 2
A una concentración de miosmina de 100 mM, con el uso del extracto enzimático libre de células a 9 mg/ml, los resultados fueron como los que se muestran en la tabla que viene a continuación:
Tabla 3
A una concentración de miosmina de 250 mM, con el uso de un extracto enzimático libre de células a 9 mg/ml, los resultados fueron como los que se muestran en la tabla que viene a continuación:
Tabla 4
Ejemplo 3
Una disolución de miosmina (20 mmol, 2,924 g), D-glucosa (30 mmol, 5,405 g), sal sódica del fosfato del dinucleótido de adenina y nicotinamida (0,2 mmol, 157 mg), liofilizado (1,0 g) del extracto libre de células con la enzima IRED_A (disponible de Enzymicals), glucosa deshidrogenasa (2000 U, 40 mg) en el tampón de fosfato de sodio a 100 mM y pH 7,5 (200 ml) se mezcló mediante un agitador superior a 200 rpm a 30°C durante 24 h. La disolución se analizó para la nornicotina durante el transcurso de la reacción con una HPLC que mostró que el 77% se había convertido después de 8 h, y la conversión fue superior al 99% después de 24 h con un exceso enantiomérico de (S)-nornicotina del 98,7%. A continuación, esta disolución se trató con una disolución de formaldehído al 37% (8,1 g) y ácido fórmico (2,8 g) a 80°C durante 4 h, y la reacción se completó al cabo de 2 h. Después de enfriarla, se le añadieron 6 g de hidróxido de sodio sólido (pH 12,7) y la mezcla se extrajo con 2 x 75 ml de MTBE. Después de secarla sobre sulfato de sodio, el disolvente se retiró para proporcionar 2,25 g de (S)-nicotina bruta que era pura a > 99% por HPLC (% del área a 260 nm) y tenía un exceso enantiomérico del 98,7%.
Ejemplo 4
Una disolución de miosmina (20 mmol, 2,924 g), D-glucosa (30 mmol, 5,405 g), sal sódica del fosfato del dinucleótido de adenina y nicotinamida (0,2 mmol, 157 mg), liofilizado (0,5 g) del extracto libre de células con la enzima IRED_B (disponible de Enzymicals), glucosa deshidrogenasa (2000 U, 40 mg) en el tampón de fosfato de sodio a 100 mM y pH 7,5 (200 ml) se mezcló mediante un agitador superior a 200 rpm a 30°C durante 24 h. La disolución se analizó para la nornicotina durante el transcurso de la reacción por HPLC que mostró que el 91% se había convertido después de 4 h, y la conversión fue superior al 99% después de 6 h. Al cabo de 24 h, el exceso enantiomérico de la (S)-nornicotina era del 98,2%. A continuación, esta disolución se trató con paraformaldehído (3 g) y ácido fórmico (2,8 g) a 80°C durante 6 h, y la reacción se completó al cabo de 4 h. Después de enfriarla, se le añadieron 6 g de hidróxido de sodio sólido (pH 12,7) y la mezcla se extrajo con 2 x 75 ml de MTBE. Después de secarla sobre sulfato de sodio, el disolvente se retiró para proporcionar 2,31 g de (S)-nicotina bruta que era pura a > 99% por HPLC (% del área a 260 nm) y tenía un exceso enantiomérico del 98,3%.
Ejemplo 5
Este ejemplo demuestra la selectividad de enantiómero y la tasa de conversión a concentraciones elevadas del sustrato. Este ejemplo se llevó a cabo de una manera similar al ejemplo 1, excepto que todas las reacciones utilizaron 1,5 equivalentes de glucosa, NADP (1% con respecto a la miosmina), imina reductasa, específicamente IRED_C disponible en Enzymicals (extracto libre de células a 4,5 mg/ml), GDH (10 U/ml por 250 mM de concentración de miosmina), tampón de fosfato de sodio a 100 mM, pH 7,5, durante un periodo de tiempo de 24 h. Los resultados se muestran a continuación.
Tabla 5
Ejemplo 6
En este ejemplo se demuestra la selectividad de enantiómero y la tasa de conversión a una escala más grande.
Una disolución de miosmina (400 mmol, 58,5 g), D-glucosa (600 mmol, 118,9 g), sal sódica del fosfato del dinucleótido de adenina y nicotinamida (4 mmol, 3,15 g), liofilizado (10,0 g) del extracto libre de células con la enzima IRED_C (disponible en Enzymicals), glucosa deshidrogenasa CFE (0,32 g) en el tampón de fosfato de sodio a 100 mM y pH 7,5 (1000 ml) se mezcló mediante un agitador superior a 200 rpm a 30°C durante 24 h. La disolución se analizó para la nornicotina al cabo de 24 h por HPLC y se mostró una conversión por encima del 98%.
Los detalles del procedimiento de aislamiento y purificación son los siguientes: la mezcla de la reacción biocatalítica se acidificó con ácido sulfúrico concentrado hasta pH 1-2, luego se calentó a 90°C durante 20 min para precipitar todas las proteínas. Las proteínas se retiraron de la mezcla por filtración sobre Celite. La disolución transparente resultante se basificó con la disolución de NaOH al 40% para dar pH >11 y se extrajo cuatro veces con 500 ml de éter terc-butílico de metilo (MTBE). Las fases de MTBE combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro y se evaporó el disolvente. El rendimiento del aislamiento de nornicotina fue de 41,1 g (70%) como un líquido amarillo parduzco.
Se tomó una muestra independiente de la mezcla de reacción de nornicotina antes del procedimiento de aislamiento y purificación que se llevó a la etapa de metilación. En concreto, sin aislamiento de la nornicotina, a la mezcla de la reacción biocatalítica se le añadieron paraformaldehído (60 g) y ácido fórmico (49,2 g). La reacción se calentó a 85°C y se agitó vigorosamente para formar la (S)-nicotina.
Ejemplo 7
El método experimental general para formar la (S)-nicotina fue el que viene a continuación. La biocatálisis de la miosmina en (S)-nornicotina con el uso de IRED_C (disponible en Enzymicals) se llevó a cabo a una concentración de miosmina de 400 mM. Tanto la (S)-nornicotina que se aisló mediante extracción con éter terc-butílico de metilo y la retirada del disolvente, como la disolución acuosa que se obtuvo de la biocatálisis, se calentaron a 90°C durante 15 min para precipitar las proteínas, y a continuación, después de enfriarla, la mezcla se acidificó hasta pH 1-2 con ácido sulfúrico, la proteína precipitada se retiró por filtración a través de Celite, y la disolución se neutralizó entonces con hidróxido de sodio acuoso a aproximadamente pH 7.
Ejemplo 7a
La nornicotina aislada en bruto a partir de la reducción enzimática de la miosmina (92 g) se añadió a 800 ml de agua. Se le añadieron paraformaldehído (74 g, 4 eq) y ácido fórmico (58 g, 2 eq.). La mezcla se calentó gradualmente a 80-85°C. El análisis por HPLC al cabo de 2 h indicó que se había completado la reacción. La mezcla se mantuvo a la misma temperatura durante 2 h más y luego se enfrió a temperatura ambiente. Se le añadió la disolución de hidróxido de sodio al 50% para obtener un pH de aproximadamente 13. La mezcla se extrajo con 2 x 500 ml de MTBE y se secó sobre sulfato de sodio. El disolvente se retiró y la (S)-nicotina bruta se destiló al vacío. Después de predeterminar aproximadamente 4 g, se obtuvieron 87 g de nicotina purificada (>99% por HPLC y el 99,6% de ee por HPLC quiral).
Ejemplo 7b
A los 2,5 l de la disolución acuosa de nornicotina de la misma biocatálisis que se utilizó en el ejemplo 1 (5,63 g/100 ml) se les añadió paraformaldehído (112,5 g, 4 eq.) y ácido fórmico (88 g, 2 eq.). La mezcla se calentó gradualmente a 80-85°C, dado que la reacción comenzaba a aproximadamente 70°C con algo de espuma debido a la evolución del gas. Al cabo de 1 h a 80-85°C, la HPLC indicó que la reacción se había completado. La reacción se calentó durante 4 h en total y luego se enfrió. La mezcla se basificó con la solución de hidróxido de sodio al 50% y se extrajo con MTBE (800 ml, luego 500 ml). Después del secado, la mezcla en bruto se destiló para dar 118,7 g de (S)-nicotina (> 99% por HPLC y el 99,5% de ee por HPLC).
Ejemplo 7c
A los 2,5 l de la disolución acuosa de nornicotina de la misma biocatálisis que se utilizó en el ejemplo 1 (5,63 g/100 ml) se les añadió una disolución de formaldehído al 37% (290 ml, aproximadamente 4 eq.) y ácido fórmico (88 g, 2 eq.). La mezcla se calentó gradualmente a 80-85°C, dado que la reacción comenzaba a aproximadamente 60°C con algo de espuma debido a la evolución del gas. Al cabo de 1 h a 80-85°C, la HPLC indicó que la reacción se había completado. La reacción se calentó durante 4 h en total y luego se enfrió. La mezcla se basificó con la disolución de hidróxido de sodio al 50% y se extrajo con MTBE (800 ml, luego 500 ml). Después del secado, la mezcla en bruto se destiló para dar 119,1 g de (S)-nicotina (> 99% por HPLC y el 99,5% de ee por HPLC).
Ejemplo 8
Una disolución de miosmina (298 g) y monohidrato de glucosa (505 g) se preparó en el tampón de hidrogenofosfato de dipotasio a 0,1 M (6 l). Se le añadió la resina Amberlite IR-120 (2 kg, húmeda) a modo de resina de intercambio de iones y la disolución se ajustó a pH 7 con hidróxido de sodio a 12 M (aproximadamente 0,3 l), luego se agitó durante una noche a 25°C para garantizar un pH estable. Se le añadió glucosa deshidrogenasa GDH-102 (6 g), p-NADP+ (6 g) y la enzima IRED-20 disponible del grupo Almac (30 g), la mezcla se agitó luego a 150 rpm mientras que se mantenía a 25°C y se mantenía el pH en el intervalo de 6,8-7,0 con adiciones de hidróxido de potasio a 4 M. Al cabo de 72 h, la
disolución se decantó y la resina Amberlite se lavó con agua desionizada (3 x 3 l). La resina de Amberlite se transfirió entonces a una columna y se lavó adicionalmente con agua desionizada (4 l), luego se agitó durante 3 h con la disolución de amoníaco a 2 M (4 l) y además se lavó con amoníaco a 2 M (10 l). Las disoluciones combinadas se concentraron a presión reducida hasta la sequedad para dar la (S)-nornicotina (i 31,2 g) como un líquido amarillo. Para recuperar más nornicotina desde la mezcla de reacción, se le añadió la resina de Amberlite reactivada (2 kg) y la mezcla se agitó durante una noche a temperatura ambiente. El mismo tratamiento se repitió como más arriba para recuperar más (S)-nornicotina (59,8 g), lo que da el rendimiento total de 191,0 g. Los dos lotes de más arriba se convirtieron en (S)-nicotina por separado. Para el lote mayor, la (S)-nornicotina (126,2 g de) se combinó con paraformaldehído (154,5 g) y ácido fórmico (118 g) en agua (1 l) y la mezcla agitada resultante se calentó a 85°C durante una noche. Luego, la mezcla se enfrió a 0°C y se ajustó a pH 14 con hidróxido de sodio a 12 M. La mezcla se extrajo con éter ferc-butílico de metilo (3 x 8 volúmenes). La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y se concentró hasta la sequedad para dar la (S)-nicotina bruta como un líquido amarillo (131,2 g). El segundo lote de (S)-nornicotina (59,8 g) se había transformado asimismo en (S)-nicotina bruta (60,7 g) de la misma manera, lo que dio un rendimiento total de nicotina en bruto de 191,9 g. Estos se combinaron y se destilaron a presión reducida (punto de ebullición de 70-77°C a 0,53-0,67 mbar) para dar a conocer la (S)-nicotina (174,5 g) como un líquido incoloro con un exceso enantiomérico del 99,38% según se determinó por HPLC y una pureza química del 99,96%, según se determinó por HPLC. A continuación, se ofrecen más detalles del procedimiento utilizado para medir el exceso enantiomérico y la pureza química.
Pureza enantiomérica por HPLC: con el uso de una columna Chiracel OD-H y la elución con n-hexano y 1 -butanol en una relación de 95:5 y que contiene el 0,1% de dietilamina. El enantiómero (R) se eluyó a los 6,1 min y el enantiómero (S) a los 5,6 min. El exceso enantiomérico se determina a partir del área de los picos identificados según la ecuación [(S)-(R)]/((S)+(R)]. El exceso enantiomérico se determinó que era, por tanto, del 99,38%.
Pureza química por HPLC: con el uso de una columna X-Bridge C18 con un eluyente que comprende una mezcla de (i) bicarbonato de amonio a 20 mM en agua (pH = 8,7) y (ii) acetonitrilo en un programa de gradiente de 0-10 min a 95:5, 10-13 min a 70:30, 13-16 min a 10:90, y posteriormente 95:5. La temperatura era de 35°C. Las condiciones del detector eran de absorción UV a una longitud de onda de 260 nm. Una única impureza a 12,132 min con un área del 0,04% se encontró frente a la nicotina a 9,925 min. Con una única impureza cuya área era del 0,04%, la pureza se consideró que era del 99,96%. En comparación, antes de la destilación, el promedio ponderado de los dos lotes utilizados era del 99,70%.
Claims (15)
1. Un procedimiento para fabricar (S)-nicotina que comprende las etapas de:
(i) reducir la miosmina con una enzima con actividad de imina reductasa para formar (S)-nornicotina; y
(ii) metilar la (S)-nornicotina formada a partir de la etapa (i) para formar (S)-nicotina.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en donde la etapa (ii) se lleva a cabo por medio de metilación reductora.
3. El procedimiento según la reivindicación 2, en donde la (S)-nornicotina se metila reductoramente en la etapa (ii) utilizando formaldehído o un compuesto a base de formaldehído en presencia de un reductor.
4. El procedimiento según la reivindicación 3, en donde el formaldehído se introduce como parte de una disolución acuosa.
5. El procedimiento según la reivindicación 3, en donde el compuesto a base de formaldehído es un dímero de formaldehído, un polímero de formaldehído o un acetal de formaldehído.
6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde el reductor es ácido fórmico, cianoborohidruro de sodio, o paladio/hidrógeno.
7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde el reductor es ácido fórmico.
8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el procedimiento se lleva a cabo sin aislamiento de la (S)-nornicotina formada de la etapa (i).
9. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se forma (S)-nornicotina en la etapa (i) como parte de una disolución acuosa, y en donde la etapa (ii) comprende la metilación de (S)-nornicotina contenida en la disolución acuosa.
10. El procedimiento según la reivindicación 9, en donde la (S)-nornicotina se metila reductoramente en la etapa (ii) utilizando formaldehído introducido como parte de una disolución acuosa.
11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la (S)-nicotina se obtiene con un exceso enantiomérico de al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, más preferiblemente al menos el 98%, lo más preferiblemente al menos el 99%.
12. Un procedimiento para producir una composición farmacéutica, que comprende formar (S)-nicotina según el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, e incluir (S)-nicotina en la composición farmacéutica junto con uno o más excipientes farmacéuticos.
13. El procedimiento según la reivindicación 12, en donde la composición farmacéutica es un parche transdérmico, una pastilla para chupar o una formulación para inhalación.
14. Un procedimiento para producir una formulación para un dispositivo de tipo cigarrillo electrónico, que comprende formar (S)-nicotina según el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, y que incluye (S)-nicotina en un disolvente con uno o más aditivos.
15. El uso de miosmina y una enzima con actividad de imina reductasa en un procedimiento para formar (S)-nicotina, en donde el procedimiento comprende las características de cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
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