CN113272289A

CN113272289A - 由麦斯明制备(s)-烟碱的方法

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Publication number: CN113272289A
Application number: CN201980058561.8A
Authority: CN
Inventors: R·麦卡格; A·S·纳拉西姆汉
Original assignee: Zanoprima Lifesciences Ltd
Current assignee: Zanoprima Lifesciences Ltd
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2019-03-12
Publication date: 2021-08-17
Also published as: BR112021009328B1; JP7068554B2; BR112021009328A2; EP3653617B1; PT3653617T; PL3653617T3; HRP20201895T1; CA3118774C; ZA202103223B; SI3653617T1; DK3653617T3; AU2019382117B2; WO2020098978A1; EP3653617A1; ES2836481T3; CA3118774A1; JP2022507375A; HUE051799T2; CN118005607A; KR102393478B1

Abstract

本申请提供一种以合成方法生产(S)‑烟碱([(S)‑3‑(1‑甲基吡咯烷‑2‑基)吡啶])的方法。

Description

由麦斯明制备(S)-烟碱的方法

技术领域

本发明涉及一种以合成方法生产(S)-烟碱([(S)-3-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶])的方法。

背景技术

烟碱(3-[1-甲基吡咯烷-2-基]吡啶)是一种可以从烟草属(Nicotiana)(即，烟草植物)的叶子获得的天然产物。在整个烟草行业中以及整个制药领域中，对烟碱产品都存在相当大的需求。例如，仍然需要传统烟草产品，例如传统香烟，这可能是因为烟碱的成瘾性。然而，由于人们越来越关注传统香烟产品对消费者健康的有害影响，因此对于含烟碱的烟草替代产品(如电子烟装置、贴剂、锭剂、鼻喷雾剂和口香糖)的需求日益增长。烟草替代产品可以作为会导致有害的致癌作用(例如由于存在吡啶生物碱、多环芳族化合物、酚和N-亚硝胺)的传统烟草产品的替代品提供。烟草替代产品可特别用于治疗烟碱依赖。在制药领域中，人们还对烟碱的可能治疗应用感兴趣。

对于获得具有适当水平的对映异构体纯度和化学纯度的烟碱存在挑战。烟碱具有光学活性，即，它可以两种可能的对映异构体形式之一存在：(R)-烟碱或(S)-烟碱。存在获得烟碱的外消旋混合物的方法(例如WO2016065209)。然而，公认的是，(S)-烟碱(即，[(S)-3-(1-甲基吡咯烷-2-基)吡啶])具有比(R)-烟碱显著更高的活性。因此，在烟草工业和制药领域中，需要的是对于(S)对映异构体具有高水平对映异构体纯度的烟碱。制药工业针特别对新药物产品中所需的对映异构体纯度水平进行了严格的规定，并且目前要求的烟碱对映异构体纯度水平可能会提高。除了对烟碱的对映异构体纯度有要求外，在制药和烟草行业中，获得高的化学纯度水平也很重要——化学纯度指的是，与非烟碱杂质相比，烟碱(即，(R)和(S)对映异构体形式两者)的量。制药行业已经对烟碱相对于非烟碱杂质的要求的化学纯度水平进行了非常严格的规定。实际上，关于烟碱化学纯度，现行的美国药典(U.S.Pharmacopeia)参考标准为至少99％且任何一种杂质的含量都不超过0.5％。高的化学纯度对烟草业也非常重要，因为上述的有害致癌作用可以是由能够发挥致癌作用的杂质引起的。

(S)-烟碱可通过对烟草植物的叶进行提取获得。但是，当烟碱是以此方式获得时，由于存在相关的生物碱杂质，其化学纯度通常低于95％。通过从烟草叶中提取获得的烟碱样品的典型组成包括93％(S)-烟碱、2.4％(S)-降烟碱、3.9％(S)-新烟草碱(anatabine)和0.5％(S)-新烟碱(anabasine)(E.Leete and M.Mueller，J.Am.Chem.,Soc.,1982,104,6440-44)。生物碱杂质的化学结构与烟碱相似，因此难以去除。烟碱的实际组成还取决于诸如地理来源和收获季节等因素。

(S)-烟碱也可以通过合成方法获得。现有技术中存在用于以合成方法生产(S)-烟碱的各种实例。例如，现有技术的方法是这样的方法：其中制备(R)-烟碱和(S)-烟碱的外消旋(即，等量)混合物，该外消旋混合物随后被拆分而获得(S)对映异构体(US 8,389,733、US2014/0031554和US 8,378,111)。现有技术中还存在使用酶作为生物催化剂生产(S)-烟碱的合成方法的实例(WO 2014/174505)；在烟碱领域之外，在对映异构体选择性方法使用生物催化剂通常是已知的(LS Bleicher et al.,J.Org.Chem.,1998,63,1109-18，WO 2013/170050，WO2015/073555，PN Scheller et al.,Chembiochem,2014,15,2201-4，Gand etal.,J Mol.Cat.B，Enzymatic,2014,110,126-32)。然而，选择性地以高对映异构体选择性合成(S)-烟碱(优先于(R)对映异构体)，同时还实现高化学纯度，仍然是一个挑战。

发明内容

在第一方面，本发明提供制备(S)-烟碱的方法，其包括以下步骤：

(i)用具有亚胺还原酶活性的酶还原麦斯明(myosmine)以形成(S)-降烟碱；和

(ii)将由步骤(i)形成的(S)-降烟碱进行甲基化以形成(S)-烟碱。

出乎意料地发现，通过该方法的步骤(i)和(ii)(其中将麦斯明用作起始原料)，实现了非常高的(S)-烟碱的对映异构体纯度和化学纯度。这表明步骤(i)是优选(S)异构体的高度对映异构体选择性合成步骤，并且步骤(ii)是使该优选保留在最终烟碱产品中，同时还保持了高的化学纯度。这允许生产(S)-烟碱而无需借助于外消旋混合物的拆分。高化学纯度是特别有利的；通常与烟碱有关的不需要的杂质水平的降低导致潜在的与杂质相关的不利作用的风险降低。此外，步骤(i)和(ii)为制备(S)-烟碱提供了方便的制备方法。

在第二方面，本发明提供用于生产药物组合物的方法，其包括使用第一方面的方法形成(S)-烟碱，并将(S)-烟碱与一种或多种药用赋形剂一起包括在药物组合物中。

在第三方面，本发明提供用于生产用于电子烟装置的制剂的方法，其包括使用第一方面的方法形成(S)-烟碱，并且将(S)-烟碱与一种或多种添加剂包括溶剂中。

在第四方面，本发明提供麦斯明和具有亚胺还原酶活性的酶在用于形成(S)-烟碱的方法中的用途。

在第五方面，本发明提供包含麦斯明和具有亚胺还原酶活性的酶的试剂盒，其用于上述形成(S)-烟碱的方法中。

具体实施方式

如本领域技术人员所理解的，麦斯明、(S)-降烟碱和(S)-烟碱具有以下结构：

本领域技术人员熟悉用于制备麦斯明的合适的反应方案。

如本文所用的，“具有亚胺还原酶活性的酶”是指这样的酶，其能够将亚胺基(特别是仲亚胺基)不对称还原为相应的胺基(特别是仲胺基)。特别地，在本文公开的方法中使用的具有亚胺还原酶活性的酶是能够催化麦斯明向(S)-降烟碱转化的酶。本领域技术人员熟悉这样的酶。所述酶可以多种形式添加到反应混合物中，如以喷雾干燥细胞的形式。

优选地，该方法使用能够将麦斯明转化为(S)-降烟碱的酶，使得以至少90％，优选地至少95％，更优选地至少98％，最优选地至少99％的对映异构体过量获得(S)-降烟碱。对映异构体过量是以实施例中给出的方式测量。在本文公开的方法中，对于最后作为终产物而获得的(S)-烟碱，也实现了这种高的对映异构体过量。

如本领域技术人员所理解的，具有亚胺还原酶活性的酶通常包括NADH/NADPH依赖型氧化还原酶，如NADH/NADPH依赖型脱氢酶和NADH/NADPH依赖型亚胺还原酶。NADH/NADPH依赖型脱氢酶包括由酶分类号E.C.1.1.1提及的那些，并且特别包括由酶分类号E.C.1.1.1.44提及的6-磷酸葡糖酸脱氢酶。亚胺还原酶包括以酶分类号E.C.1.5.1提及的那些，尤其是以酶分类号E.C 1.5.1.48提及的那些。

不同种类的亚胺还原酶的实例包括噻唑啉基亚胺还原酶、二氢叶酸还原酶、Δ¹–吡咯啉-2-羧酸还原酶、Δ¹–哌啶-2-羧酸还原酶、血根碱(sanguinarine)还原酶和1,2-牛心果碱(reticuline)还原酶。这类酶可以分离自或衍生自以下来源：如链霉菌属(Streptomyces)、疣孢菌属(Verrucosispora)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、耶尔森菌属(Yersinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、白色念珠菌(candida albicans)、花菱草(Eschscholzia)和罂粟属(Papaver)。

可能的酶的实例还包括WO2013170050中公开的那些(其内容通过引证的方式纳入本说明书)。

酶可为IRED_A、IRED_B、IRED_C、IRED_D、IRED_E、IRED_F、IRED_P、IRED_X、IRED_AB、IRED-20或其同源物。IRED_A、IRED_B、IRED_C、IRED_D、IRED_E、IRED_F、IRED_P、IRED_X和IRED_AB购自Enzymicals；IRED-20购自Almac Group。例如，在一个实施方案中，酶为IRED_A、IRED_B、IRED_C、IRED_D、IRED_E、IRED-20或其同源物。

本文公开的酶可以包括根据SEQ I.D.NO:1、SEQ I.D.NO:2、SEQ I.D.NO:3、SEQI.D.NO:4或其同源物中任一种的氨基酸序列。在另一个实施方案中，酶包括根据SEQI.D.NO:1、SEQ I.D.NO:2、SEQ I.D.NO:3或SEQ I.D.NO:4中任一种的氨基酸序列。

如本文所用，“其同源物”是指这样的酶，其包含的氨基酸序列与本文所公开的任何一种酶具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。例如，“其同源物”可以意指这样的酶，其包含的氨基酸序列与SEQ I.D.NO:1、SEQI.D.NO:2、SEQ I.D.NO:3或SEQ I.D.NO:4中任一种的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

如本文所用的，术语“序列同一性”是指两个或更多个氨基酸序列之间的关系。当一个序列中的一个位置被比较序列的对应位置中的相同氨基酸残基占据时，则这些序列被称为在该位置处是“同一的”。“序列同一性”百分比是通过以下方式计算：测定在两个序列中出现相同氨基酸残基的位置的数量而得出“同一的”位置的数量。然后，将“同一的”位置的数量除以比较窗口中位置的总数量，再乘以100，得出“序列同一性”的百分比。通过在比较窗口中比较两个最佳比对序列来确定“序列同一性”的百分比。为了最佳比对序列以进行比较，比较窗口中多肽序列的一部分可以包含称为空位的添加或缺失，而参考序列保持不变。最佳比对是这样的比对，其即使有空位也能在参考序列和比较序列之间产生最大可能的“同一”位置数量。可以使用已知方法计算编码序列之间的序列同一性水平。

序列同一性可以使用用于测定序列同一性的可公开获得的基于计算机的方法来计算，包括BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul et al.,J.Molec.Biol.,215：403-410，(1990))、可由NCBI获得的BLASTX程序以及可由Genetics Computer Group(Madison WI)获得的Gap程序。使用Gap程序获得序列同一性的水平，其中氨基酸序列比较的Gap罚分是50，Gap长度罚分是3。

通常，步骤(i)包括在合适的辅因子(特别是NADH或NADPH)存在下用酶还原麦斯明。如本领域技术人员所理解的，可以将酶和辅因子作为单独的组分引入到反应混合物中，或者可以将它们作为同一组分(例如，以包含酶和适当的辅因子两者的微生物全细胞的形式)的一部分引入到反应混合物中。可以存在合适的辅因子再循环系统，以将辅因子从其氧化形式(NAD+或NADP+)转化为其还原形式(NADH或NADPH)。本领域技术人员熟悉适当的辅因子再循环系统，这种辅因子再循环系统包括葡萄糖(一水合物)/葡萄糖脱氢酶、甲酸/甲酸脱氢酶和异丙醇/醇脱氢酶。当存在辅因子再循环系统时，可以将辅因子以其氧化形式(即NAD+或NADP+的形式)加入反应混合物中。

辅因子本身可以以每100份麦斯明0.02重量份至10重量份的范围存在。优选地，辅因子可以以每100份麦斯明0.05重量份至5重量份的范围存在。更优选地，辅因子可以以每100份麦斯明0.5重量份至2重量份的范围存在。

步骤(i)中存在的酶的量可以每100份麦斯明0.1重量份至30重量份的量存在。优选地，步骤(i)中存在的酶的量可以0.5重量份至10重量份的麦斯明的量存在。本领域技术人员应理解，可以根据步骤(i)的反应的所需时间来调整步骤(i)中存在的酶的量，其中为了反应时间更短，可以使用更多的酶，反之亦然。

步骤(i)可以在离子交换树脂的存在下进行，但优选步骤(i)在不存在离子交换树脂的情况下进行。当存在离子交换树脂时，该离子交换树脂是Amberlite树脂、Amberlyst树脂、Amberjet树脂(如Amberlite IR-120)或Dowex树脂，其中这些离子交换树脂均可购自Aldrich。

步骤(i)的可能的pH可以在pH 5-9的范围内。

将(S)-降烟碱通过另一步骤转化为(S)-烟碱：

(ii)将由步骤(i)形成的(S)-降烟碱进行甲基化，形成(S)-烟碱。

出乎意料地发现，在步骤(ii)之后，获得了具有特别高的化学纯度和特别高的对映异构体过量的(S)-烟碱。

甲基化步骤(即步骤(ii))可以通过多步骤方法进行。例如，步骤(ii)可包括形成化合物(例如N-甲酰基-(S)-降烟碱)，然后再还原该化合物以得到甲基化产物，即(S)-烟碱。然而，优选地，步骤(ii)是通过一步法(如，还原性甲基化)进行。如本领域技术人员所理解的，术语“还原性甲基化”是指通过单个步骤形成并还原物质以得到甲基化产物(即，(S)-烟碱)的过程。

优选地，使用甲醛或基于甲醛的化合物将(S)-降烟碱还原性甲基化。当使用这样的试剂时，步骤(ii)是特别有效的。

如本文所用，基于甲醛的化合物是指能够在化学反应过程中原位产生甲醛的化合物。本领域技术人员应理解，这意味着基于甲醛的化合物被添加到反应混合物中，然后分解而释放甲醛(和其他相关的化合物)，其然后可与(S)-降烟碱反应而形成(S)-烟碱。在添加基于甲醛的化合物的情况下，本领域技术人员熟悉如何调整所添加的基于甲醛的化合物的合适量，以实现原位释放特定量的甲醛。

甲醛本身的化学式为HC(O)H，并且通常以液体或气体形式引入。可以将甲醛作为甲醛水溶液(这种水溶液可称为福尔马林)的一部分引入到反应混合物中。

基于甲醛的化合物通常以固体或液体形式引入。该基于甲醛的化合物可以是甲醛的二聚体、甲醛的聚合物或甲醛的缩醛(acetal)。优选地，基于甲醛的化合物是甲醛的聚合物。

如本领域技术人员所理解的，术语“甲醛的聚合物”是指具有三个或更多个聚合的甲醛重复单元的化合物。优选地，甲醛的聚合物是多聚甲醛。如本文所用，术语“多聚甲醛”是指聚合度为8-100个单元的甲醛聚合物。

当使用甲醛或基于甲醛的化合物对(S)-降烟碱进行还原性甲基化时，可以以每100份(S)-降烟碱50重量份至110重量份(优选60重量份至90重量份)的量添加甲醛或基于甲醛的化合物。这样的量是指所存在的甲醛、基于甲醛的化合物和(S)-降烟碱的实际量。因此，如果例如当(S)-降烟碱作为溶液(例如水溶液)的一部分形成和/或当甲醛或基于甲醛的化合物作为溶液(例如水溶液)的一部分引入反应混合物时，本文所公开的重量份是指各溶液中所含的甲醛、基于甲醛的化合物和(S)-降烟碱的实际量。

在甲基化步骤是还原性甲基化步骤的情况下，还原剂可以是甲酸、氰基硼氢化钠或钯/氢，优选甲酸。如本领域技术人员所理解的，还原剂的合适量将取决于所使用的具体还原剂。例如，当还原剂为甲酸时，还原剂可以以每100份(S)-降烟碱40-110重量份的量存在，优选40-100重量份，更优选50重量份至70重量份。这样的量是指所存在的还原剂和(S)-降烟碱的实际量。

优选地，可以在不分离由步骤(i)形成的(S)-降烟碱的情况下进行步骤(i)和(ii)。这允许形成具有高的对映异构体过量和高的化学纯度的(S)-烟碱，同时使用了特别方便的合成途径。避免了需要从步骤(i)形成的反应混合物中分离(S)-降烟碱，然后再将其转化为(S)-烟碱，其优点是提供了一种特别方便的合成路线，这是因为昂贵的工厂时间和能量(例如，由于需要大量用于萃取的溶剂和/或浓缩溶液)导致(S)-降烟碱的分离是过程密集型的。例如，在步骤(i)中，(S)-降烟碱可以作为水溶液的一部分而形成，其中随后将包含(S)-降烟碱的水溶液直接用于步骤(ii)中。因此，对由步骤(i)形成的(S)-降烟碱的水溶液进行甲基化步骤(步骤(ii))。当以这种方式进行该方法时，优选通过使用多聚甲醛或者通过使用作为水溶液的一部分被引入反应混合物中的甲醛，对(S)-降烟碱进行还原性甲基化。当以这种方式进行该方法时，更优选通过使用作为水溶液的一部分被引入反应混合物中的甲醛对(S)-降烟碱进行还原性甲基化，这是因为已发现，随着该过程的进行，这减少了反应混合物的不希望的起泡。

使用本文公开的方法生产的(S)-烟碱具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％的对映异构体过量。本领域技术人员熟悉如何测量对映异构体过量。对映异构体过量可以例如以实施例中给出的方式测量。

使用本文公开的方法生产的(S)-烟碱的具有至少98％，优选至少99％的化学纯度。本领域技术人员熟悉如何测量化学纯度。化学纯度可以例如以实施例中给出的方式测量。通过实施例获得的化学纯度水平特别高。

使用上述方法步骤生产的(S)-烟碱可与一种或多种药用赋形剂一起被包含在药物组合物中。优选地，药物组合物是透皮贴剂、锭剂或吸入制剂。

使用上述方法步骤制备的(S)-烟碱也可以被包含在用于电子烟装置的制剂中。该制剂包括在具有一种或多种添加剂的溶剂中的(S)-烟碱。溶剂可以包括甘油、丙二醇、水或其混合物。优选地，溶剂包括甘油和丙二醇，其中甘油与丙二醇的比例范围为80:20至20:80(以体积计)。一种或多种添加剂可包括一种或多种调味剂。

本文还提供了用于形成(S)-烟碱的方法的试剂盒，其包含麦斯明和具有亚胺还原酶活性的酶。

特别优选的反应方案在下文示出为方案1：

将通过以下非限制性实施例说明本发明。

实施例

下列实施例证明了与本文公开的方法有关的结果。已经使用各种试剂来举例说明该方法。

使用的酶包括以下酶：

来自海疣孢菌(Verrucosispora maris)(菌株AB-18-032，Uniprot：F4F8G5_VERMA)的IRED_A，其具有下文给出的氨基酸序列(a)或(b)——序列(a)对应于SEQ I.D.NO:1，序列(b)对应于SEQ I.D.NO:2。

(a)当带有六组氨酸标签使用时，共有302个氨基酸残基：

MHHHHHHAADSRAPVTVIGLGAMGSALARAFLAAGHPTTVWNRSPDKADDLVGQGAVRAATVADAMSAGNLIVICVLDYRAMREIIDSTGHSPADRVIVNLTSGTPGDARATAAWAQEQGMEYIDGAIMATPSMIGSEETLIFYGGPQEVYDAHADTLRSIAGAGTYLGEEPGLPSLYDVALLGLMWTTWAGFMHSAALLASEKVPAAAFLPYAQAWFEYVISPEVPNLATQVDTGAYPDNDSTLGMQTVAIEHLVEASRTQGVDPTLPEFLHARAEQAIRRGHAGDGFGAVFEVLRAPAAQ

(b)原始酶，共有296个氨基酸残基：

MAADSRAPVTVIGLGAMGSALARAFLAAGHPTTVWNRSPDKADDLVGQGAVRAATVADAMSAGNLIVICVLDYRAMREIIDSTGHSPADRVIVNLTSGTPGDARATAAWAQEQGMEYIDGAIMATPSMIGSEETLIFYGGPQEVYDAHADTLRSIAGAGTYLGEEPGLPSLYDVALLGLMWTTWAGFMHSAALLASEKVPAAAFLPYAQAWFEYVISPEVPNLATQVDTGAYPDNDSTLGMQTVAIEHLVEASRTQGVDPTLPEFLHARAEQAIRRGHAGDGFGAVFEVLRAPAAQ

来自中慢生根瘤菌属种(Mesorhizobium sp.)L48C026A00的IRED_B，又称6-磷酸葡糖酸脱氢酶，其具有下文给出的氨基酸序列(a)或(b)——序列(a)对应于SEQ I.D.NO:3，序列(b)对应于SEQ I.D.NO:4。

(a)带有六组氨酸标签使用时，共有310个氨基酸残基：

MHHHHHHASNVCVLGAGRMGSSIARTLLDRGYPTWVWNRTAAKCEPLAALGAKVASSVQEGIQAAEVVIINVLDYAASDALLKRDGIASALAGKAVVQLTSGSPRLAREEARWVEAHGAGYLDGAIMATPDFIGKPETAMLYSGSRDVYEKHKPLLFALGGGTNYVGELPGQASALDTALLTQMWGGLFGALQGMAVAEAEGLDLETFRNHLSAFKPVVDASLFDLVDRTNARRFAGDDATLASLGAHYSAFQHLLEACEERGLDAAMPRAMDMIFRQALSLGSMEDDLASLALLFRNGSPRQSREPANA

(b)原始酶，共有304个氨基酸残基

MASNVCVLGAGRMGSSIARTLLDRGYPTWVWNRTAAKCEPLAALGAKVASSVQEGIQAAEVVIINVLDYAASDALLKRDGIASALAGKAVVQLTSGSPRLAREEARWVEAHGAGYLDGAIMATPDFIGKPETAMLYSGSRDVYEKHKPLLFALGGGTNYVGELPGQASALDTALLTQMWGGLFGALQGMAVAEAEGLDLETFRNHLSAFKPVVDASLFDLVDRTNARRFAGDDATLASLGAHYSAFQHLLEACEERGLDAAMPRAMDMIFRQALSLGSMEDDLASLALLFRNGSPRQSREPANA

实施例1

用10mM麦斯明和NADP+(0.5mM)、葡萄糖(25mM)、葡萄糖脱氢酶(10U/ml)和具有亚胺还原酶活性的酶的溶液在0.5mL规模下进行生物转化。表1中详述了所用的酶，可购自Enzymicals。每种酶的用量为9mg/ml无细胞提取物(估计约0.9mg/ml所含的酶)。特别对于IRED_B和IRED_C，进行了另外的测试，其使用0.9mg/ml无细胞提取物。

由生物转化获得的(S)-降烟碱的对映异构体过量是由以下方式确定：使用Chiralpak AD-H柱(250x 4.6mm id(内径))，在30℃下用己烷:乙醇:二乙胺74.9：25.0：0.1(v/v/v)的混合物以1ml/min洗脱18分钟。该方法还用于测量麦斯明向降烟碱的转化，已测定了在254nm处的uv吸收检测的相对响应因子为2.18:1。

结果示于下表1中。

	酶	用量	转化[％]	对映异构体过量[％S]
					i	IRED_A	9mg/ml	99.3	99.8
ii	IRED_B	9mg/ml	99.9	98.4
					iii	IRED_B	0.9mg/ml	99.3	98.4
iv	IRED_C	9mg/ml	99.3	92.9
					v	IRED_C	0.9mg/ml	100.0	99.1
vi	IRED_D	9mg/ml	99.6	99.8
					vii	IRED_E	9mg/ml	99.4	99.8
viii	IRED_F	9mg/ml	99.1	86.5
					ix	IRED_P	9mg/ml	97.7	86.6
x	IRED_X	9mg/ml	99.8	95.7
					xi	IRED_AB	9mg/ml	99.6	96.8

表1

根据式[(S)-(R)]/((S)+(R)]×100来确定(S)-降烟碱的对映异构体过量％，其中(S)和(R)分别为存在的(S)对映异构体和(R)对映异构体的量。转化％是根据麦斯明的消耗量确定，即根据式100-(麦斯明的最终量)/(麦斯的起始量)×100。

实施例2

反应以与实施例1类似的方式进行，不同之处在于相对于麦斯明底物使用1.5当量的葡萄糖和1mol％的NADP+，并且使用24小时的反应时间。所用的酶在表2、表3和表4中均有详细说明(可购自Enzymicals)。

在100mM麦斯明浓度下，使用0.9mg/mL酶无细胞提取物，结果如下表所示：

	酶	转化[％]	对映异构体过量[％S]
				i	IRED_A	63.6	99.8
ii	IRED_B	99.9	98.7
				iii	IRED_C	99.9	99.8
iv	IRED_D	99.0	99.9
				v	IRED_E	99.9	99.9

表2

在100mM麦斯明浓度下，使用9mg/mL酶无细胞提取物，结果如下表所示：

	酶	转化[％]	对映异构体过量[％S]
				i	IRED_A	99.9	99.8
ii	IRED_B	99.8	98.8
				iii	IRED_C	99.8	99.9
iv	IRED_D	99.9	100.0
				v	IRED_E	99.9	99.9

表3

在250mM麦斯明浓度下，使用9mg/mL酶无细胞提取物，结果如下表所示：

表4

实施例3

通过顶置式搅拌器(overhead stirrer)将以下物质在pH 7.5的100mM磷酸钠缓冲液(200mL)中的溶液在30℃下以200rpm混合24小时：麦斯明(20mmol，2.924g)、D-葡萄糖(30mmol，5.405g)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐(0.2mmol，157mg)、酶IRED_A(可购自Enzymicals)的无细胞提取物冻干物(1.0g)、葡萄糖脱氢酶(2000U，40mg)。在反应过程中，用HPLC分析溶液中的降烟碱，显示8小时后转化为77％，而24小时后转化超过99％，其中(S)-降烟碱为99.7％e.e。然后将该溶液在80℃下用37％的甲醛溶液(8.1g)和甲酸(2.8g)处理4小时，其中在2小时后反应完成。冷却后，加入6g固体氢氧化钠(pH 12.7)，并将混合物用2×75ml MTBE萃取。用硫酸钠干燥后，除去溶剂，得到2.25g粗的(S)-烟碱，其通过HPLC(在260nm下的面积％)测得纯度＞99％，并具有98.7％的对映异构体过量。

实施例4

通过顶置式搅拌器将以下物质在pH7.5的100mM磷酸钠缓冲液(200mL)中的溶液在30℃下以200rpm混合24小时：麦斯明(20mmol，2.924g)、D-葡萄糖(30mmol，5.405g)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐(0.2mmol，157mg)、酶IRED_B(购自Enzymicals)无细胞提取物冻干物(0.5g)、葡萄糖脱氢酶(2000U，40mg)。在反应过程中用HPLC分析溶液中的降烟碱，显示4小时后转化为91％，而6小时后转化为超过99％。24小时后，(S)-降烟碱为98.2％e.e.。然后将该溶液在80℃下用多聚甲醛(3g)和甲酸(2.8g)处理6小时，其中在4小时后反应完成。冷却后，加入6g固体氢氧化钠(pH 12.7)，并将混合物用2×75ml MTBE萃取。用硫酸钠干燥后，除去溶剂，得到2.31g粗的(S)-烟碱，其通过HPLC(在260nm下的面积％)测得纯度＞99％，并具有98.3％的对映异构体过量。

实施例5

该实施例证实了在高底物浓度下的对映选择性和转化率。该实施例以与实施例1类似的方式进行，不同之处在于，所有反应均是在24小时的时间段内，使用1.5当量的葡萄糖，NADP(1％，相对于麦斯明)、亚胺还原酶(特别是可购自Enzymicals的IRED_C(4.5mg/ml无细胞提取物)，GDH(每250mM麦斯明浓度，10U/ml)、磷酸钠缓冲液pH 7.5 100mM。结果如下所示。

	起始原料麦斯明的浓度	转化[％]	对映异构体过量[％S]
				i	250mM	99.9	99.7
ii	400mM	99.6	99.8
				iii	600mM	68.8	99.8
iv	800mM	56.5	99.7
				v	1000mM	52.4	99.6

表5

实施例6

该实施例证明了在较大规模下的对映选择性和转化率。

通过顶置式搅拌器将以下物质在pH7.5的100mM磷酸钠缓冲液(1000mL)中的溶液在30℃下以200rpm混合24小时：麦斯明(400mmol，58.5g)、D-葡萄糖(600mmol，118.9g)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐(4mmol，3.15g)、酶IRED_C(可购自enzymicals)无细胞提取物冻干物(10.0g)、葡萄糖脱氢酶CFE(0.32g)。24小时后，用HPLC分析该溶液的降烟碱，并显示出超过98％的转化。

后处理具体如下：将生物催化的反应混合物用浓硫酸酸化至pH 1-2，然后加热至90℃，持续20分钟以使所有蛋白质沉淀。用硅藻土从混合物中滤出蛋白质。将所得的澄清溶液用40％NaOH溶液碱化至pH>11，并用500mL甲基叔丁基醚(MTBE)萃取四次。合并的MTBE相用无水硫酸镁干燥，并蒸发溶剂。分离的棕黄色液体状降烟碱的产量为41.1g(70％)。

在后处理和分离之前，将降烟碱反应混合物的单独样品进行甲基化步骤。具体地，在不分离降烟碱的情况下，向生物催化的反应混合物中加入多聚甲醛(60g)和甲酸(49.2g)。将反应加热至85℃并剧烈搅拌而形成(S)-烟碱。

实施例7

形成(S)-烟碱的一般实验方法如下。在麦斯明浓度为400mM下，使用IRED_C(可购自Enzymicals)进行麦斯明生物向(S)-降烟碱的生物催化。通过用甲基叔丁基醚萃取并除去溶剂来分离(S)-降烟碱，或者，将来自生物催化的水溶液在90℃下加热15分钟沉淀出蛋白质，然后将冷却后的混合物用硫酸酸化至pH 1-2，通过硅藻土过滤除去沉淀的蛋白质，然后用氢氧化钠水溶液将溶液中和至约pH 7。

实施例7a

将从麦斯明(92g)的酶还原物中分离出的粗降烟碱加入800ml水中。加入多聚甲醛(74g，4eq)和甲酸(58g，2eq)。将混合物逐渐温热至80-85℃。2h后的HPLC分析表明反应完成。将该混合物在相同温度下再保持2小时，然后冷却至室温。加入50％氢氧化钠溶液以获得约13的pH。混合物用2×500ml MTBE萃取，并用硫酸钠干燥。除去溶剂，并在真空下蒸馏粗(S)-烟碱。在大约4g的初馏物后，获得87g纯的烟碱(通过HPLC测得>99％，通过手性HPLC测得>99.6％ee)。

实施例7b

向来自与实施例1中使用的相同生物催化的2.5升降烟碱水溶液(5.63g/100ml)中加入多聚甲醛(112.5g，4eq)和甲酸(88g，2eq)。将该混合物逐渐加热至80-85℃，其中反应在约70℃下开始，由于放出气体而有些起泡。在80-85℃下1小时后，HPLC表明反应完成。将反应总共加热4h，然后冷却。将混合物用50％氢氧化钠溶液碱化，并用MTBE(800ml，然后500ml)萃取。干燥后，将粗混合物蒸馏，得到118.7g(S)-烟碱(通过HPLC测得＞99％，通过HPLC测得＞99.5％ee)。

实施例7c

向来自与实施例1使用的相同生物催化的2.5升降烟碱水溶液(5.63g/100ml)中加入37％的甲醛溶液(290ml，

)和甲酸(88g，2eq)。将该混合物逐渐加热至80-85℃，其中反应在约60℃下开始，由于放出气体而有些起泡。在80-85℃下1小时后，HPLC表明反应完成。将反应总共加热4h，然后冷却。将混合物用50％氢氧化钠溶液碱化，并用MTBE(800ml，然后500ml)萃取。干燥后，将粗混合物蒸馏，得到119.1g(S)-烟碱(通过HPLC测得＞99％，通过HPLC测得＞99.5％ee)。

实施例8

在0.1M磷酸氢二钾缓冲液(6L)中配制麦斯明(298g)和一水合葡萄糖(505g)的溶液。加入Amberlite IR-120树脂(2kg，湿)作为离子交换树脂，并用12M氢氧化钠(约0.3L)将溶液调节至pH7，然后在25℃下搅拌过夜以确保稳定的pH。加入葡萄糖脱氢酶GDH-102(6g)、β-NADP+(6g)和可购自Almac Group的酶IRED-20(30g)，然后将混合物以150rpm搅拌，同时保持在25℃下，并通过加入4M氢氧化钾使pH保持在6.8-7.0范围内。72小时后，将溶液倒出，并用去离子水(3×3L)洗涤Amberlite树脂。然后将Amberlite树脂转移至柱中，再用去离子水(4L)洗涤，然后用2M氨溶液(4L)振荡3小时，再用2M氨水(10L)洗涤。合并的溶液减压浓缩至干燥，得到黄色液体状的(S)-降烟碱(131.2g)。为了从反应混合物中进一步回收降烟碱，向其中加入再活化的Amberlite树脂(2kg)，并将混合物在室温下搅拌过夜。重复与上述相同的处理以进一步回收(S)-降烟碱(59.8g)，使总产量达到191.0g。将上述两批分别转化为(S)-烟碱。对于较大的批次，将(S)-降烟碱(126.2g)与溶于水(1L)中的多聚甲醛(154.5g)和甲酸(118g)混合，并将得到的搅拌混合物加热至85℃过夜。然后将混合物冷却至0℃，并用12M氢氧化钠调节至pH 14。用甲基叔丁基醚(3×8体积)萃取混合物。有机相用无水硫酸镁干燥，浓缩至干燥，得到黄色液体状的粗(S)-烟碱(131.2g)。同样以相同方式将第二批的(S)-降烟碱(59.8g)转化成粗(S)-烟碱(60.7g)，使粗烟碱的总产量为191.9g。将它们合并并且在减压下蒸馏(在0.53-0.67mbar下，沸点为70-77℃)，得到无色液体状的(S)-烟碱(174.5g)，由HPLC测定的对映异构体过量为99.38％，由HPLC测定的化学纯度为99.96％。下面给出了用于测量对映异构体过量和化学纯度的方法的更多内容。

由HPLC测定的对映异构体纯度：使用Chiracel OD-H柱，用比例为95:5正己烷和1-丁醇并含有0.1％的二乙胺洗脱。(R)-对映异构体在6.1分钟时被洗脱，(S)-对映异构体在5.6分钟时被洗脱。对映异构体过量是由根据式[(S)-(R)]/((S)+(R)]确定的峰面积来确定的。由此确定的对映异构体过量为99.38％。

由HPLC测定的化学纯度：使用X-Bridge C18色谱柱，洗脱液包含(i)20mM碳酸氢铵水溶液(pH＝8.7)和(ii)乙腈的混合物，梯度程序为：0-10分钟，比例为95:5；10-13分钟，比例为70:30；13-16分钟，比例为10:90；然后是95:5。温度为35℃。检测器的条件为在260nm波长下的UV吸收。在12.132分钟处发现0.04％面积的单一杂质，而在9.925分钟处发现烟碱。在0.04％面积处具有单一杂质的情况下，认为纯度为99.96％。相比之下，在蒸馏之前，所使用的两个批次的加权平均值为99.70％。

序列表

<110> Zanoprima Lifesciences Limited

<120> 方法

<130> APC00904EP

<140>

<141>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 302

<212> PRT

<213> 海疣孢菌（Verrucosispora maris）

<400> 1

Met His His His His His His Ala Ala Asp Ser Arg Ala Pro Val Thr

1 5 10 15

Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu Ala Arg Ala Phe Leu

20 25 30

Ala Ala Gly His Pro Thr Thr Val Trp Asn Arg Ser Pro Asp Lys Ala

35 40 45

Asp Asp Leu Val Gly Gln Gly Ala Val Arg Ala Ala Thr Val Ala Asp

50 55 60

Ala Met Ser Ala Gly Asn Leu Ile Val Ile Cys Val Leu Asp Tyr Arg

65 70 75 80

Ala Met Arg Glu Ile Ile Asp Ser Thr Gly His Ser Pro Ala Asp Arg

85 90 95

Val Ile Val Asn Leu Thr Ser Gly Thr Pro Gly Asp Ala Arg Ala Thr

100 105 110

Ala Ala Trp Ala Gln Glu Gln Gly Met Glu Tyr Ile Asp Gly Ala Ile

115 120 125

Met Ala Thr Pro Ser Met Ile Gly Ser Glu Glu Thr Leu Ile Phe Tyr

130 135 140

Gly Gly Pro Gln Glu Val Tyr Asp Ala His Ala Asp Thr Leu Arg Ser

145 150 155 160

Ile Ala Gly Ala Gly Thr Tyr Leu Gly Glu Glu Pro Gly Leu Pro Ser

165 170 175

Leu Tyr Asp Val Ala Leu Leu Gly Leu Met Trp Thr Thr Trp Ala Gly

180 185 190

Phe Met His Ser Ala Ala Leu Leu Ala Ser Glu Lys Val Pro Ala Ala

195 200 205

Ala Phe Leu Pro Tyr Ala Gln Ala Trp Phe Glu Tyr Val Ile Ser Pro

210 215 220

Glu Val Pro Asn Leu Ala Thr Gln Val Asp Thr Gly Ala Tyr Pro Asp

225 230 235 240

Asn Asp Ser Thr Leu Gly Met Gln Thr Val Ala Ile Glu His Leu Val

245 250 255

Glu Ala Ser Arg Thr Gln Gly Val Asp Pro Thr Leu Pro Glu Phe Leu

260 265 270

His Ala Arg Ala Glu Gln Ala Ile Arg Arg Gly His Ala Gly Asp Gly

275 280 285

Phe Gly Ala Val Phe Glu Val Leu Arg Ala Pro Ala Ala Gln

290 295 300

<210> 2

<211> 296

<212> PRT

<213> 海疣孢菌（Verrucosispora maris）

<400> 2

Met Ala Ala Asp Ser Arg Ala Pro Val Thr Val Ile Gly Leu Gly Ala

1 5 10 15

Met Gly Ser Ala Leu Ala Arg Ala Phe Leu Ala Ala Gly His Pro Thr

20 25 30

Thr Val Trp Asn Arg Ser Pro Asp Lys Ala Asp Asp Leu Val Gly Gln

35 40 45

Gly Ala Val Arg Ala Ala Thr Val Ala Asp Ala Met Ser Ala Gly Asn

50 55 60

Leu Ile Val Ile Cys Val Leu Asp Tyr Arg Ala Met Arg Glu Ile Ile

65 70 75 80

Asp Ser Thr Gly His Ser Pro Ala Asp Arg Val Ile Val Asn Leu Thr

85 90 95

Ser Gly Thr Pro Gly Asp Ala Arg Ala Thr Ala Ala Trp Ala Gln Glu

100 105 110

Gln Gly Met Glu Tyr Ile Asp Gly Ala Ile Met Ala Thr Pro Ser Met

115 120 125

Ile Gly Ser Glu Glu Thr Leu Ile Phe Tyr Gly Gly Pro Gln Glu Val

130 135 140

Tyr Asp Ala His Ala Asp Thr Leu Arg Ser Ile Ala Gly Ala Gly Thr

145 150 155 160

Tyr Leu Gly Glu Glu Pro Gly Leu Pro Ser Leu Tyr Asp Val Ala Leu

165 170 175

Leu Gly Leu Met Trp Thr Thr Trp Ala Gly Phe Met His Ser Ala Ala

180 185 190

Leu Leu Ala Ser Glu Lys Val Pro Ala Ala Ala Phe Leu Pro Tyr Ala

195 200 205

Gln Ala Trp Phe Glu Tyr Val Ile Ser Pro Glu Val Pro Asn Leu Ala

210 215 220

Thr Gln Val Asp Thr Gly Ala Tyr Pro Asp Asn Asp Ser Thr Leu Gly

225 230 235 240

Met Gln Thr Val Ala Ile Glu His Leu Val Glu Ala Ser Arg Thr Gln

245 250 255

Gly Val Asp Pro Thr Leu Pro Glu Phe Leu His Ala Arg Ala Glu Gln

260 265 270

Ala Ile Arg Arg Gly His Ala Gly Asp Gly Phe Gly Ala Val Phe Glu

275 280 285

Val Leu Arg Ala Pro Ala Ala Gln

290 295

<210> 3

<211> 310

<212> PRT

<213> 中慢生根瘤菌属种（Mesorhizobium sp.） L48C026A00

<400> 3

Met His His His His His His Ala Ser Asn Val Cys Val Leu Gly Ala

1 5 10 15

Gly Arg Met Gly Ser Ser Ile Ala Arg Thr Leu Leu Asp Arg Gly Tyr

20 25 30

Pro Thr Trp Val Trp Asn Arg Thr Ala Ala Lys Cys Glu Pro Leu Ala

35 40 45

Ala Leu Gly Ala Lys Val Ala Ser Ser Val Gln Glu Gly Ile Gln Ala

50 55 60

Ala Glu Val Val Ile Ile Asn Val Leu Asp Tyr Ala Ala Ser Asp Ala

65 70 75 80

Leu Leu Lys Arg Asp Gly Ile Ala Ser Ala Leu Ala Gly Lys Ala Val

85 90 95

Val Gln Leu Thr Ser Gly Ser Pro Arg Leu Ala Arg Glu Glu Ala Arg

100 105 110

Trp Val Glu Ala His Gly Ala Gly Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala

115 120 125

Thr Pro Asp Phe Ile Gly Lys Pro Glu Thr Ala Met Leu Tyr Ser Gly

130 135 140

Ser Arg Asp Val Tyr Glu Lys His Lys Pro Leu Leu Phe Ala Leu Gly

145 150 155 160

Gly Gly Thr Asn Tyr Val Gly Glu Leu Pro Gly Gln Ala Ser Ala Leu

165 170 175

Asp Thr Ala Leu Leu Thr Gln Met Trp Gly Gly Leu Phe Gly Ala Leu

180 185 190

Gln Gly Met Ala Val Ala Glu Ala Glu Gly Leu Asp Leu Glu Thr Phe

195 200 205

Arg Asn His Leu Ser Ala Phe Lys Pro Val Val Asp Ala Ser Leu Phe

210 215 220

Asp Leu Val Asp Arg Thr Asn Ala Arg Arg Phe Ala Gly Asp Asp Ala

225 230 235 240

Thr Leu Ala Ser Leu Gly Ala His Tyr Ser Ala Phe Gln His Leu Leu

245 250 255

Glu Ala Cys Glu Glu Arg Gly Leu Asp Ala Ala Met Pro Arg Ala Met

260 265 270

Asp Met Ile Phe Arg Gln Ala Leu Ser Leu Gly Ser Met Glu Asp Asp

275 280 285

Leu Ala Ser Leu Ala Leu Leu Phe Arg Asn Gly Ser Pro Arg Gln Ser

290 295 300

Arg Glu Pro Ala Asn Ala

305 310

<210> 4

<211> 304

<212> PRT

<213> 中慢生根瘤菌属种（Mesorhizobium sp.） L48C026A00

<400> 4

Met Ala Ser Asn Val Cys Val Leu Gly Ala Gly Arg Met Gly Ser Ser

1 5 10 15

Ile Ala Arg Thr Leu Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Thr Trp Val Trp Asn

20 25 30

Arg Thr Ala Ala Lys Cys Glu Pro Leu Ala Ala Leu Gly Ala Lys Val

35 40 45

Ala Ser Ser Val Gln Glu Gly Ile Gln Ala Ala Glu Val Val Ile Ile

50 55 60

Asn Val Leu Asp Tyr Ala Ala Ser Asp Ala Leu Leu Lys Arg Asp Gly

65 70 75 80

Ile Ala Ser Ala Leu Ala Gly Lys Ala Val Val Gln Leu Thr Ser Gly

85 90 95

Ser Pro Arg Leu Ala Arg Glu Glu Ala Arg Trp Val Glu Ala His Gly

100 105 110

Ala Gly Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala Thr Pro Asp Phe Ile Gly

115 120 125

Lys Pro Glu Thr Ala Met Leu Tyr Ser Gly Ser Arg Asp Val Tyr Glu

130 135 140

Lys His Lys Pro Leu Leu Phe Ala Leu Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Val

145 150 155 160

Gly Glu Leu Pro Gly Gln Ala Ser Ala Leu Asp Thr Ala Leu Leu Thr

165 170 175

Gln Met Trp Gly Gly Leu Phe Gly Ala Leu Gln Gly Met Ala Val Ala

180 185 190

Glu Ala Glu Gly Leu Asp Leu Glu Thr Phe Arg Asn His Leu Ser Ala

195 200 205

Phe Lys Pro Val Val Asp Ala Ser Leu Phe Asp Leu Val Asp Arg Thr

210 215 220

Asn Ala Arg Arg Phe Ala Gly Asp Asp Ala Thr Leu Ala Ser Leu Gly

225 230 235 240

Ala His Tyr Ser Ala Phe Gln His Leu Leu Glu Ala Cys Glu Glu Arg

245 250 255

Gly Leu Asp Ala Ala Met Pro Arg Ala Met Asp Met Ile Phe Arg Gln

260 265 270

Ala Leu Ser Leu Gly Ser Met Glu Asp Asp Leu Ala Ser Leu Ala Leu

275 280 285

Leu Phe Arg Asn Gly Ser Pro Arg Gln Ser Arg Glu Pro Ala Asn Ala

290 295 300

Claims

1.一种制备(S)-烟碱的方法，其包括以下步骤：

(i)用具有亚胺还原酶活性的酶还原麦斯明，形成(S)-降烟碱；和

(ii)将由步骤(i)形成的(S)-降烟碱进行甲基化，形成(S)-烟碱。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)是通过还原性甲基化进行。

3.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(ii)中，在还原剂的存在下使用甲醛或基于甲醛的化合物对(S)-降烟碱进行还原性甲基化。

4.根据权利要求3所述的方法，其中将甲醛作为水溶液的一部分引入。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述基于甲醛的化合物为甲醛的二聚体、甲醛的聚合物或甲醛的缩醛。

6.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述还原剂为甲酸、氰基硼氢化钠或钯/氢。

7.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述还原剂为甲酸。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法是在不分离由步骤(i)形成的(S)-降烟碱的情况下进行。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，(S)-降烟碱作为水溶液的一部分形成，并且其中步骤(ii)包括对水溶液中所包含的(S)-降烟碱进行甲基化。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，在步骤(ii)中，使用作为水溶液的一部分被引入的甲醛对(S)-降烟碱进行还原性甲基化。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中(S)-烟碱是以至少90％，优选地至少95％，更优选地至少98％，最优选地至少99％的对映异构体过量获得。

12.一种用于生产药物组合物的方法，包括根据前述权利要求中任一项所述的方法形成(S)-烟碱，并将(S)-烟碱与一种或多种药用赋形剂一起包括在所述药物组合物中。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述药物组合物为透皮贴剂、锭剂或吸入制剂。

14.一种用于生产用于电子烟装置的制剂的方法，其包括根据权利要求1-11中任一项所述的方法形成(S)-烟碱，并将(S)-烟碱一种或多种添加剂包括溶剂中。

15.麦斯明和具有亚胺还原酶活性的酶在形成(S)-烟碱的方法中的用途，其中所述方法包括权利要求1-11中任一项所述的特征。