CN116218803B - 亚胺还原酶及其制备方法和编码亚胺还原酶的dna - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种亚胺还原酶及其制备方法和编码亚胺还原酶的DNA，该亚胺还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。该亚胺还原酶具有较高的比酶活，以及较高的热稳定性和较大的最适pH的范围，用于催化麦斯明制备(S)‑降烟碱时，转化率和对映体过量百分率较高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种亚胺还原酶，同时本发明还涉及一种编码上述亚胺还原酶的DNA以及上述亚胺还原酶的制备方法。
背景技术
亚胺还原酶(Imine reductases，EC 1.5.1.48)是一类可以还原手性亚胺为对应的手性胺的氧化还原酶，其辅酶依赖性为NADPH。在较大位阻环状亚胺的不对称还原、酮羰基化合物的不对称还原胺化和多酶级联反应制备手性胺方面，亚胺还原酶都被投入了深入的研究和应用。
虽然目前已经报道过一些亚胺还原酶的种类，但亚胺还原酶在制备手性胺的应用方面仍存在问题：高活性种类少、来源不丰富、应用范围待扩展等。针对现有研究中存在的问题，对酶进行定点突变得到更优的突变体日渐发展，这类工作的常规包括从IRED数据库中选择合适菌种来源的酶、选择位点进行突变，并对突变体进行酶学性质的验证。目前对于亚胺还原酶的定点突变及应用具有广阔的发展空间。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种亚胺还原酶，以催化麦斯明制备(S)-降烟碱时，提高转化率和对映体过量百分率。
为达上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种亚胺还原酶，其特征在于，所述亚胺还原酶的氨基酸序列为：SEQ 1。
本发明进一步提出了一种编码上述的亚胺还原酶的DNA，所述DNA的核苷酸序列为：SEQ ID NO.2。
本发明还提出了一种上述的亚胺还原酶的制备方法，该方法包括以下步骤：
活化菌株：将负载有SEQ ID NO.2基因的基因工程菌接种至LB培养基中，控制摇床温度35-38℃，转速150-200rpm，培养12-16h，获得种子液；制备粗酶液：将所述种子液接种至TB培养基中，控制摇床温度35-38℃，转速150-200rpm，培养菌液2.5-3.5h，当OD600值为0.6-0.8时添加诱导剂，控制摇床温度18-25℃，转速150-200rpm，发酵培养20-23h，然后离心分离，收集沉淀，高压破碎，获得所述亚胺还原酶。
进一步的，所述基因工程菌的构建方法包括以下步骤：
以SEQ ID NO.2的基因为目的基因，以质粒pET28a(+)为表达载体，将所述目的基因插入所述表达载体中获得重组质粒，将所述重组质粒导入宿主菌株中，得到所述基因工程菌。
进一步的，所述宿主菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
进一步的，将所述目的基因插入所述表达载体时，选取的酶切位点是Nde I酶切位点和/或EcoR I酶切位点。
本发明还提出了一种上述的亚胺还原酶催化麦斯明制备(S)-降烟碱反应中的应用。
本发明的亚胺还原酶具有较高的比酶活，以及较高的热稳定性和较大的最适pH的范围，用于催化麦斯明制备(S)-降烟碱时，转化率和对映体过量百分率较高。本发明的亚胺还原酶的制备方法采用基因工程技术，获取表达本发明亚胺还原酶的基因工程菌，利用该基因工程菌生产亚胺还原酶，适合于目前的工业生产。本发明的亚胺还原酶用于催化麦斯明制备(S)-降烟碱的过程中，转化率和对映体过量百分率较高。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例三中测试IRED的蛋白标准曲线图；
图2为本发明实施例三中对亚胺还原酶的野生型和突变体进行pH范围的测试图；
图3为本发明实施例三中对亚胺还原酶的野生型和突变体进行温度范围的测试图；
图4为本发明实施例四的亚胺还原酶在催化麦斯明制备(S)-降烟碱反应体系示意图；
图5为本发明实施例四的亚胺还原酶在催化麦斯明制备(S)-降烟碱催化反应的进程曲线图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。另外，除本实施例特别说明之外，本实施例中所涉及的各术语及工艺依照现有技术中的一般认知及常规方法进行理解即可。
实施例一
本实施例涉及一种亚胺还原酶的挖掘和突变过程，包括以下步骤：
(1)选取模板序列：
检索现有文献中已报道的亚胺还原酶氨基酸序列，整理其物种来源、催化活性数据(底物谱、活性、酶学性质等)、蛋白结构信息以及整理蛋白结构中关键氨基酸和催化机制。整理得到14条数据较全面的亚胺还原酶氨基酸序列，使用MEGA6构建进化树，分析各序列之间亲缘关系，结合其催化数据最终选取了来源于Streptomyces viridochromogenes的IRED的氨基酸序列为模板序列。
(2)挖掘基因信息：
a.筛去冗余序列：以步骤(1)所述的蛋白序列为模板序列，通过Uniprot数据库检索Blast 1000条，选取相似度30％-90％的序列，分区间使用MEGA6构建进化树，筛去冗余序列，各区间所保留的序列数目如表一所示。
b.筛去同来源序列：在步骤2a)所保留的蛋白序列的基础上继续筛选，相同菌株来源的序列仅保留一条。各区间所保留的序列数目如表一所示，该步骤共保留693条序列。
c.选择代表序列：在步骤2b)所保留的蛋白序列的基础上继续筛选，分区间使用MEGA6构建进化树，筛去部分亲缘关系较近的序列，优先选择来源为极端或嗜性微生物的蛋白序列，根据构建好的进化树，每个分支选取若干代表性序列。各区间所保留的序列数目如表一所示，该步骤共保留252条序列。将保留的序列合并，使用MEGA6再次构建进化树，按照进化距离远近，从每个分支上选取5个以上的代表序列，同样优先选择来源为极端或者嗜性微生物的蛋白序列，最终选定36条代表序列。
d.活性位点比对：将步骤2c)选定的36条代表序列与步骤(1)整理得到的14条已报道的亚胺还原酶蛋白序列使用ESPript 3.0(https://espript.ibcp.fr)进行位点比对，选定具有潜在的亚胺还原酶活性的基因，筛选得到的基因来源于Thermomonosporaechinospora。
表一各区间保留序列数目一览表
| 筛去冗余序列 | 筛去同来源序列 | 分区间选择代表序列 | |
| 30％-40％ | 322 | 258 | 57 |
| 40％-50％ | 506 | 303 | 110 |
| 50％-60％ | 104 | 99 | 64 |
| 60％-90％ | 37 | 33 | 21 |
| 共计 | 969 | 693 | 252 |
(3)定点突变
对来源于Thermomonospora echinospora菌株的亚胺还原酶氨基酸序列进行定点突变，第100位的S突变为T，第129位的P突变为T，第175位的D突变为Y，第186位的L突变为M，第203位的A突变为I，第263位的L突变为V，突变后获得如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
实施例二
将上述的如SEQ ID NO.1所示亚胺还原酶氨基酸序列进行大肠杆菌密码子优化，得到如SEQ ID NO.2所示的可以编码上述亚胺还原酶的核苷酸序列的DNA，进而将上述DNA采用基因工程技术，以质粒pET28a(+)为表达载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，选取Nde I和EcoR I为酶切位点，插入基因工程菌E.coli BL21(DE3)，得到重组菌pET28a(+)-TeIRED-M，并将重组菌的蛋白表达制备粗酶液。具体包括以下步骤：
活化菌株：将10μLpET-28a(+)-TeIRED-M菌体接种至含50μg/mL的卡那霉素、10mL液体LB培养基中，并于37℃、180rpm的摇床中活化培养12-16h。
制备粗酶液：将活化后的菌液以1％的接种量接种至装有50mL、含50μg/mL卡那霉素的TB液体培养基中，并于37℃、180rpm的摇床中发酵培养2.5-3h，待菌液浓度OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG，在20℃、180rpm摇床中诱导表达20-23h，停止发酵。将发酵后的菌液8000rpm离心10min，弃掉上清，收集沉淀。将收集到的菌沉悬浮于50mL PBS缓冲液(100mM,pH8.0)中，用高压破碎仪进行破碎，压力为700-900bar，破碎15s，循环3次。再次离心，获得胞内上清和沉淀，上清即为得到的亚胺还原酶粗酶液，记作IRED酶液。
上述LB液体培养基的组成为：5g/L酵母浸粉、10g/L胰蛋白胨、10g/LNaCl。TB液体培养基的组成为：24g/L酵母浸粉、12g/L胰蛋白胨、0.4％甘油、10％磷酸钾缓冲液(pH6.5)。
实施例三
本实施例涉及挖掘得到的亚胺还原酶进行突变后的酶活测试过程。
酶活力单位U定义为：30℃，pH8.0条件下，每分钟催化1μM NADPH氧化成NADP+所需要的IRED的量定义为1U。本实施例是在30℃下，在1mL的反应体系中，其中含10mM的底物麦斯明，0.15mM的NADPH，100mM PBS缓冲液(pH 8.0)以及适量的酶，检测反应体系在340nm处，1min内吸光值的减少量。
其中，采用Bradford法测定反应体系中IRED的蛋白浓度，蛋白标准曲线如图1所示。
根据比酶活计算公式:比酶活(U/mg)＝U/mg，30℃，pH8.0的条件下得到野生型IRED的比酶活为70-85U/g，突变体的酶活为160-180U/g。
pH应用范围的测定：取适量酶液，分别于不同pH(4.0-13.0)的缓冲液中孵育5min，在30℃下，测定野生型和突变体在不同pH缓冲液中的酶活力，以各自在最适pH条件下的酶活力作为对照(100％)。得到的结果如图2所示，突变体的pH作用范围广于野生型，并且在不同的pH条件下，突变体酶活均高于野生型菌体。
温度应用范围的测定：取适量酶液，分别在10-75℃范围内孵育5min后，在各自最适pH下测定不同温度的酶活力，以各自在最适温度下的酶活力作为对照(100％)。得到的结果如图3所示，突变体的温度作用范围广于野生型，并且在不同的温度条件下，突变体酶活均高于野生型菌体。
实施例四
本实施例涉及到实施例二的亚胺还原酶在催化麦斯明制备(S)-降烟碱反应中的应用，反应体系如图4所示。
实施例二的IRED酶液与甲酸脱氢酶(FDH)酶液等比例添加至15mL的反应体系中，其中包含20mM麦斯明、0.5mM NADP+和40mM甲酸钠，于30℃，400rpm的摇床中反应8h以上，由HPLC测定不同时间反应转化率和对映异构体过量，获得反应进程曲线如图5所示。
转化获得的(S)-降烟碱的对映异构体过量由以下方式确定：使用XDB-C18柱，在25℃下以1mL/min流速洗脱，流动相A为乙酸：氨水：水＝2.5：0.6：96.9(v:v:v)流动相B为：乙腈，流动相A和流动相B的比例为90：10，检测波长为254nm。
图5可知，本发明的亚胺还原酶液与麦斯明于30℃反应10h以上，测得反应最终转化率99％和对映异构体过量97％。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (7)
1.一种亚胺还原酶，其特征在于，所述亚胺还原酶的氨基酸序列为：SEQ IDNO.1。
2.一种编码权利要求1所述的亚胺还原酶的DNA，其特征在于，所述DNA的核苷酸序列为：SEQ ID NO.2。
3.一种权利要求1所述的亚胺还原酶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
活化菌株：将负载有SEQ ID NO.2基因的基因工程菌接种至LB培养基中，控制摇床温度35-38℃，转速150-200rpm，培养12-16h，获得种子液；
制备粗酶液：将所述种子液接种至TB培养基中，控制摇床温度35-38℃，转速150-200rpm，培养菌液2.5-3.5h，当OD600值为0.6-0.8时添加诱导剂，控制摇床温度18-25℃，转速150-200rpm，发酵培养20-23h，然后离心分离，收集沉淀，高压破碎，获得所述亚胺还原酶。
4.一种如权利要求3所述的亚胺还原酶的制备方法，其特征在于，所述基因工程菌的构建方法包括以下步骤：
以SEQ ID NO.2的基因为目的基因，以质粒pET28a(+)为表达载体，将所述目的基因插入所述表达载体中获得重组质粒，将所述重组质粒导入宿主菌株中，得到所述基因工程菌。
5.一种如权利要求4所述的亚胺还原酶的制备方法，其特征在于：所述宿主菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
6.一种如权利要求4所述的亚胺还原酶的制备方法，其特征在于：将所述目的基因插入所述表达载体时，选取的酶切位点是NdeI酶切位点和/或EcoRI酶切位点。
7.一种根据权利要求1所述的亚胺还原酶催化麦斯明制备(S)-降烟碱反应中的应用。
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