JP2017534261A

JP2017534261A - 養子免疫療法のためのキメラ受容体での細胞毒性細胞のターゲティング

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Publication number: JP2017534261A
Application number: JP2017514849A
Authority: JP
Inventors: グレゴリー・ビーティ; ボリス・エンヘルス; ニーラジャ・イダマカンティ; カール・エイチ・ジューン; アンドレアス・レーヴ; マイケル・シー・ミローン; ソン・ホイジュエン; エンシウ・ワン; チーロン・ウー
Original assignee: ノバルティスアーゲー; ザトラスティーズオブザユニバーシティオブペンシルバニア
Priority date: 2014-09-17
Filing date: 2015-09-17
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2035-09-17
Also published as: AU2024202889A1; AU2015317608A1; KR102590396B1; EP3194443B1; KR20170056622A; BR112017005390A2; WO2016044605A1; JP2023061944A; EP3967709A1; US11981731B2; EP3194443A1; ES2891332T3; KR20230149327A; CN107580628A; US10577417B2; AU2021203790A1; US20200377589A1; MX2017003645A; CN114621969A; JP2021097676A

Abstract

本発明は、免疫療法において使用するための、免疫エフェクター細胞の特異性および活性を制御するための組成物および方法に関する。ある態様において、本発明は、あるタイプのキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を提供し、ここで、ＣＡＲは、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞に天然に見られる成分を含むＣＡＲ設計である、“ＮＫＲ−ＣＡＲ”と名づける。ある態様において、ＮＫ受容体は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)として知られるＮＫ細胞の天然に存在する活性化および阻害性受容体を含むが、これらに限定されない。

Description

関連出願
本出願は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０８６６９４号(２０１４年９月１７日出願)およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９０５７８号(２０１４年１１月７日出願)に基づく優先権を主張する。これらの出願の内容全体を、引用により本明細書に包含させる。

発明の背景
遺伝子導入テクノロジーの使用により、主要組織適合複合体(ＭＨＣ)により課せられる制約と無関係の特異性をＴ細胞に授ける抗体結合ドメインをその表面に安定して発現するように、Ｔ細胞を遺伝子操作できる。キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)は、抗体の抗原認識フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ、または一本鎖可変領域フラグメント)と、ＣＤ３ゼータ鎖の細胞内ドメインを融合する、Ｔ細胞(ＣＡＲＴ細胞)上に発現される合成タンパク質である。ｓｃＦｖの同族抗原を発現する標的細胞との相互作用により、Ｔ細胞に発現されたＣＡＲは、標的細胞死滅(標的細胞溶解ともいう)を生じるＴ細胞活性化を惹起できる。ＣＤ１３７またはＣＤ２８の細胞内ドメインのようなさらなる共刺激性シグナルと組み合わせたとき、これらの受容体はまた増殖を生じることもできる。しかしながら、この増殖のいくぶんかは、正常Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)応答と異なり抗原非依存的であるように見える(Milone et al., 2009, Mol Ther 17(8):1453-64)。人工受容体は、ＭＨＣ分子と複合体化した抗原性ペプチドへの天然ＴＣＲ結合により産生される細胞内シグナル伝達を完全には再現しない(Brocker, 2000, Blood 96(5):1999-2001)。シグナル伝達欠損は、高レベルのＩＬ−２のようなサイトカイン非存在下での養子移入によるＣＡＲＴ細胞の長期生存を制限し得る(Lo et al., 2010, Clin Cancer Res 16(10):2769-80)。それらはまたある抗癌適用で有益であり得る制御の改変も有するが(Loskog et al., 2006, Leukemia 20(10):1819-28)、これらの制御性欠損はまた、極低レベルでもその抗原を発現する正常組織に対するその“標的外”活性の制御を障壁とする可能性ももたらす。これらの“標的外”効果は、ＣＡＲベースの治療剤を厳しく制限し、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞の初期フェーズＩ評価中の高可能性の死亡の結果となった(Morgan et al., 2010, Mol Ther 18(4):843-51)。

それゆえに、現在のＣＡＲベースの治療剤の制限を克服する、ＣＡＲ構築のための代替的アプローチが当分野で必要とされている。本発明は、当分野におけるこの充足されていない要求に取り組む。

要約
第一の面において、本発明は、精製されているかまたは天然に存在しない細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、例えば、ＮＫＲ膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、例えば、ＮＫＲ細胞質ドメインの１、２または全てを含む、精製されているかまたは天然に存在しないナチュラルキラー細胞免疫機能受容体−キメラ抗原受容体(ＮＫＲ−ＣＡＲ)ポリペプチドに関する。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチドは、細胞外抗原結合ドメイン、および膜貫通ドメイン、例えば、ＮＫＲ膜貫通ドメイン；または細胞質ドメイン、例えば、ＮＫＲ細胞質ドメインの一方または両方を含む。ある態様において、該ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチドは細胞外抗原結合ドメイン；膜貫通ドメインおよびＮＫＲ細胞質ドメインを含む。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチドは細胞外抗原結合ドメイン、ＮＫＲ膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチドは細胞外抗原結合ドメイン、ＮＫＲ膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。

ある態様において、該ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチドは、ＫＩＲ−ＣＡＲ、例えば、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲまたはｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲ、ＮＣＲ−ＣＡＲ、例えば、ａｃｔＮＣＲ−ＣＡＲ、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲ、例えば、ｉｎｈＳＬＡＭＦ−ＣＡＲ、ＦｃＲ−ＣＡＲ、例えば、ＣＤ１６−ＣＡＲ、例えば、ａｃｔＣＤ１６−ＣＡＲ、またはＣＤ６４−ＣＡＲ、例えば、ａｃｔＣＤ６４−ＣＡＲ、またはＬｙ４９−ＣＡＲ、例えば、ａｃｔＬｙ４９−ＣＡＲまたはｉｎｈＬｙ４９−ＣＡＲを含む。

ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチドはキラー細胞免疫グロブリン様受容体キメラ抗原受容体(ＫＩＲ−ＣＡＲ)を含み、ここで、ＫＩＲ−ＣＡＲはＫＩＲからの膜貫通ドメイン(ＫＩＲ膜貫通ドメイン)またはＫＩＲからの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン(ＫＩＲ細胞質ドメイン)の一方または両方を含む。ある態様において、ＫＩＲ膜貫通ドメインは、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１およびＫＩＲ３ＤＰ１からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。ある態様において、ＫＩＲ細胞質ドメインは、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１およびＫＩＲ３ＤＰ１からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲは、さらにＫＩＲＤ０ドメイン、ＫＩＲＤ１ドメインおよび／またはＫＩＲＤ２ドメインの１以上を含む。

ある態様において、ＮＫＲＣＡＲポリペプチドは天然細胞毒性受容体キメラ抗原受容体(ＮＣＲ−ＣＡＲ)を含み、ここで、ＮＣＲ−ＣＡＲは、ＮＣＲからの膜貫通ドメイン(ＮＣＲ膜貫通ドメイン)またはＮＣＲからの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン(ＮＣＲ細胞質ドメイン)の一方または両方を含む。ある態様において、ＮＣＲ膜貫通ドメインは、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。ある態様において、ＮＣＲ細胞質ドメインは、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。

ある態様において、ＮＫＲＣＡＲポリペプチドはシグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリーキメラ抗原受容体(ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲ)を含み、ここで、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲは、ＳＬＡＭＦからの膜貫通ドメイン(ＳＬＡＭＦ膜貫通ドメイン)またはＳＬＡＭＦからの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン(ＳＬＡＭＦ細胞質ドメイン)の一方または両方を含む。ある態様において、ＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインは、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥおよびＣＤ２Ｆ−１０からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。ある態様において、ＳＬＡＭＦ細胞質ドメインは、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥおよびＣＤ２Ｆ−１０からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。

ある態様において、ＮＫＲＣＡＲポリペプチドはＦｃ受容体キメラ抗原受容体(ＦｃＲ−ＣＡＲ)を含み、ここで、ＦｃＲ−ＣＡＲは、ＣＤ１６またはＣＤ６４から選択されるＦｃＲからの膜貫通ドメインまたはＣＤ１６またはＣＤ６４から選択されるＦｃＲからの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインの一方または両方を含む。

ある態様において、ＮＫＲＣＡＲポリペプチドはＬｙ４９受容体キメラ抗原受容体(Ｌｙ４９−ＣＡＲ)を含み、ここで、Ｌｙ４９−ＣＡＲは、Ｌｙ４９からの膜貫通ドメイン(Ｌｙ４９膜貫通ドメイン)またはＬｙ４９からの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン(Ｌｙ４９細胞質ドメイン)の一方または両方を含む。ある態様において、Ｌｙ４９膜貫通ドメインは、Ｌｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９ＨおよびＬｙ４９Ｄからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。ある態様において、Ｌｙ４９細胞質ドメインは、Ｌｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９ＨおよびＬｙ４９Ｄからなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。

ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチドの膜貫通ドメインはＮＫＲ膜貫通ドメインであり、ここで、ＮＫＲ膜貫通ドメインは、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ、ＮＣＲ、ＳＬＡＭＦ、ＦｃＲおよびＬｙ４９からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、ｉ)配列番号３５７、３５８または３５９のアミノ酸配列；ii)配列番号３５７、３５８または３５９のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を含むが、修飾が５を超えないアミノ酸配列；またはiii)配列番号３５７、３５８または３５９と９５〜９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチドのコードされる膜貫通ドメインは膜貫通ドメイン、例えば、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(別名“ＩＣＯＳ”)、ＦｃεＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８(ＣＤ８アルファまたはＣＤ８ベータ)、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドまたはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、ここに記載するようなＴＣＡＲの膜貫通ドメインである。

ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチドの細胞質ドメインは、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ、ＮＣＲ、ＳＬＡＭＦ、ＦｃＲおよびＬｙ４９からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインの１以上を含むＮＫＲ細胞質ドメインである。ある態様において、細胞質ドメインは、ｉ)配列番号３６０、３６１または３６２のアミノ酸配列；ii)配列番号３６０、３６１または３６２のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を含むが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列；またはiii)配列番号３６０、３６１と９５〜９９％配列同一性のアミノ酸配列を含む。

ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチドの細胞質ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインまたはアダプター分子、例えば、ＤＡＰ１２を含む。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチドのコードされる細胞質ドメインは、アダプター分子、例えば、ＤＡＰ１２またはＦｃεＲγを含む。ある態様において、細胞質ドメインは、ｉ)配列番号３３３のアミノ酸１〜１１３または配列番号３３５のアミノ酸１〜８６のアミノ酸配列；ii)配列番号３３３のアミノ酸１〜１１３または配列番号３３５のアミノ酸１〜８６に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０、または５を超えないアミノ酸配列；またはiii)配列番号３３３のアミノ酸１〜１１３または配列番号３３５のアミノ酸１〜８６と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むコードされるアダプター分子を含む。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲは、ここに記載する抗原結合ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびＤＡＰ１２を含む細胞質ドメインを含む。

ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチドの細胞質ドメインは、例えば、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(別名“ＩＣＯＳ”)、ＦｃεＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８(ＣＤ８アルファまたはＣＤ８ベータ)、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドまたはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインの１以上を含む、ここに記載するようなＴＣＡＲの細胞質ドメインである。

ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチドは、さらに、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む、リーダー配列またはシグナル配列を含む。

ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび細胞外抗原結合ドメインを含み、さらに、該膜貫通ドメインと該細胞外抗原結合ドメインの間に位置するヒンジドメインを含む。ある態様において、ヒンジドメインは、ＧＳヒンジ、ＣＤ８ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＤヒンジ、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジ、ＫＩＲヒンジ、ＮＣＲヒンジ、ＳＬＡＭＦヒンジ、ＣＤ１６ヒンジ、ＣＤ６４ヒンジおよびＬＹ４９ヒンジからなる群から選択される。ある態様において、ヒンジドメインは、ｉ)配列番号５、２、３または４のアミノ酸配列；ii)配列番号５、２、３または４のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が５を超えないアミノ酸配列；またはiii)配列番号５、２、３または４のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。

ある態様において、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、集合的に、ｉ)配列番号３３３のアミノ酸４１３〜４８７または配列番号３３５もしくは配列番号３７１のアミノ酸３８６〜４５４のアミノ酸配列；ii)配列番号３３３のアミノ酸４１３〜４８７または配列番号３３５もしくは配列番号３７１のアミノ酸３８６〜４５４に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；またはiii)配列番号３３３のアミノ酸４１３〜４８７または配列番号３３５もしくは配列番号３７１のアミノ酸３８６〜４５４と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。

前記態様のいずれかにおいて、ＮＫＲ−ＣＡＲは活性化ＮＫＲ−ＣＡＲであり、細胞外抗原結合ドメインは、ここに、例えば、表４に、記載する抗原結合ドメインである。前記態様のいずれかにおいて、細胞外抗原結合ドメインは、メソテリンに結合する非マウス抗原結合ドメインである。ある態様において、細胞外メソテリンに結合する非マウス抗原結合ドメインは、メソテリンに結合するヒトまたはヒト化抗原結合ドメインを含む。ある態様において、メソテリンに結合するヒトまたはヒト化抗原結合ドメインを表４に示す。

ある態様において、メソテリンに結合するヒト抗原結合ドメインは、表４に挙げるヒト抗メソテリン重鎖アミノ酸配列のいずれかの重鎖相補性決定領域１(ＨＣＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣＣＤＲ３)；および／または表４に挙げるヒト抗メソテリン軽鎖アミノ酸配列のいずれかの軽鎖相補性決定領域１(ＬＣＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣＣＤＲ３)を含む。ある態様において、メソテリンに結合するヒト抗原結合ドメインは、ｉ)表４に挙げるヒト抗メソテリン重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列；ii)表４に挙げるヒト抗メソテリン重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；またはiii)表４に挙げるヒト抗メソテリン重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および／またはｉ)表４に挙げるヒト抗メソテリン軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列；ii)表４に挙げるヒト抗メソテリン軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；またはiii)表４に挙げるヒト抗メソテリン軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある態様において、メソテリンに結合するヒト抗原結合ドメインは、ｉ)配列番号２３０〜２５３のいずれかのアミノ酸配列；ii)配列番号２３０〜２５３のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；またはiii)配列番号２３０〜２５３のいずれかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。このような態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲは、さらに、例えば、集合的に、配列番号３７１のアミノ酸配列、配列番号３７１に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号３７１と少なくとも９５〜９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。

第一の面において、本発明は、例えば、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、例えば、ＮＫＲ膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、例えば、ＮＫＲ細胞質ドメインの１、２または全てを含む、ここに記載するナチュラルキラー細胞免疫機能受容体−キメラ抗原受容体(ＮＫＲ−ＣＡＲ)ポリペプチドをコードする、精製されているかまたは天然に存在しない核酸分子に関する。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸分子は、細胞外抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメイン、例えば、ＮＫＲ膜貫通ドメイン；または細胞質ドメイン、例えば、ＮＫＲ細胞質ドメインの一方または両方を含む。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸分子は細胞外抗原結合ドメイン；膜貫通ドメインおよびＮＫＲ細胞質ドメインを含む。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸分子は細胞外抗原結合ドメイン、ＮＫＲ膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸分子は細胞外抗原結合ドメイン、ＮＫＲ膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。

ある態様において、核酸分子は、ＫＩＲ−ＣＡＲ、例えば、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲまたはｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲ、ＮＣＲ−ＣＡＲ、例えば、ａｃｔＮＣＲ−ＣＡＲ、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲ、例えば、ｉｎｈＳＬＡＭＦ−ＣＡＲ、ＦｃＲ−ＣＡＲ、例えば、ＣＤ１６−ＣＡＲ、例えば、ａｃｔＣＤ１６−ＣＡＲ、またはＣＤ６４−ＣＡＲ、例えば、ａｃｔＣＤ６４−ＣＡＲ、またはＬｙ４９−ＣＡＲ、例えば、ａｃｔＬｙ４９−ＣＡＲまたはｉｎｈＬｙ４９−ＣＡＲを含むＮＫＲ−ＣＡＲをコードする。

ある態様において、コードされたＫＩＲ−ＣＡＲはＫＩＲからの膜貫通ドメイン(ＫＩＲ膜貫通ドメイン)またはＫＩＲからの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン(ＫＩＲ細胞質ドメイン)の一方または両方を含む。ある態様において、ＫＩＲ膜貫通ドメインは、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１およびＫＩＲ３ＤＰ１からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。ある態様において、ＫＩＲ細胞質ドメインは、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１およびＫＩＲ３ＤＰ１からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲは、さらにＫＩＲＤ０ドメイン、ＫＩＲＤ１ドメインおよび／またはＫＩＲＤ２ドメインの１以上を含む。

ある態様において、コードされたＮＣＲ−ＣＡＲは、ＮＣＲからの膜貫通ドメイン(ＮＣＲ膜貫通ドメイン)またはＮＣＲからの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン(ＮＣＲ細胞質ドメイン)の一方または両方を含む。ある態様において、ＮＣＲ膜貫通ドメインは、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。ある態様において、ＮＣＲ細胞質ドメインは、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。

ある態様において、コードされたＳＬＡＭＦ−ＣＡＲは、ＳＬＡＭＦからの膜貫通ドメイン(ＳＬＡＭＦ膜貫通ドメイン)またはＳＬＡＭＦからの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン(ＳＬＡＭＦ細胞質ドメイン)の一方または両方を含む。ある態様において、ＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインは、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥおよびＣＤ２Ｆ−１０からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。ある態様において、ＳＬＡＭＦ細胞質ドメインは、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥおよびＣＤ２Ｆ−１０からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。

ある態様において、コードされたＦｃＲ−ＣＡＲは、ＣＤ１６またはＣＤ６４から選択されるＦｃＲからの膜貫通ドメインまたはＣＤ１６またはＣＤ６４から選択されるＦｃＲからの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインの一方または両方を含む。

ある態様において、コードされたＬｙ４９−ＣＡＲは、Ｌｙ４９からの膜貫通ドメイン(Ｌｙ４９膜貫通ドメイン)またはＬｙ４９からの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン(Ｌｙ４９細胞質ドメイン)の一方または両方を含む。ある態様において、Ｌｙ４９膜貫通ドメインは、Ｌｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９ＨおよびＬｙ４９Ｄからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。ある態様において、Ｌｙ４９細胞質ドメインは、Ｌｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９ＨおよびＬｙ４９Ｄからなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。

ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲのコードされた膜貫通ドメインはＮＫＲ膜貫通ドメインであり、ここで、ＮＫＲ膜貫通ドメインは、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ、ＮＣＲ、ＳＬＡＭＦ、ＦｃＲおよびＬｙ４９からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲのコードされた膜貫通ドメインは、配列番号３５７、３５８または３５９のアミノ酸配列；配列番号３５７、３５８または３５９のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を含むが、修飾が５を超えないアミノ酸配列；または配列番号３５７、３５８または３５９と９５〜９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸分子は配列番号３４７のヌクレオチド８０３〜８７５を含む核酸配列またはそれと９５〜９９％配列同一性を有する核酸配列を含み、これは、膜貫通ドメインをコードする。

ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチドのコードされる膜貫通ドメインは、例えば、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(別名“ＩＣＯＳ”)、ＦｃεＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８(ＣＤ８アルファまたはＣＤ８ベータ)、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドまたはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、ここに記載するようなＴＣＡＲの膜貫通ドメインである。

ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲのコードされる細胞質ドメインはＮＫＲ細胞質ドメインであり、ここで、ＮＫＲ細胞質ドメインは、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ、ＮＣＲ、ＳＬＡＭＦ、ＦｃＲおよびＬｙ４９からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインの１以上を含む。ある態様において、コードされる細胞質ドメインは、ｉ)配列番号３６０、３６１または３６２のアミノ酸配列；ii)配列番号３６０、３６１または３６２のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を含むが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列；またはiii)配列番号３６０、３６１と９５〜９９％配列同一性のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸分子は配列番号３４３のヌクレオチド８３１〜９４７、配列番号３４５のヌクレオチド８３３〜１０６０または配列番号３４７のヌクレオチド８７６〜９４９またはそれと９５〜９９％配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を含み、これは、細胞質ドメインをコードする。

ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチドのコードされる細胞質ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインまたはアダプター分子、例えば、ＤＡＰ１２を含む。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチドのコードされる細胞質ドメインは、アダプター分子、例えば、ＤＡＰ１２またはＦｃεＲγを含む。ある態様において、コードされる細胞質ドメインは、ｉ)配列番号３３３のアミノ酸１〜１１３または配列番号３３５のアミノ酸１〜８６のアミノ酸配列；ii)配列番号３３３のアミノ酸１〜１１３または配列番号３３５のアミノ酸１〜８６に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０、または５を超えないアミノ酸配列；またはiii)配列番号３３３のアミノ酸１〜１１３または配列番号３３５のアミノ酸１〜８６と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むコードされるアダプター分子を含む。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸分子は、配列番号３３２のヌクレオチド１〜３３９または配列番号３３４のヌクレオチド１〜２５８またはそれと９５〜９９％同一性を含む核酸配列を含むヌクレオチドを含む核酸配列を含み、これはアダプター分子をコードする。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲは、ここに記載する抗原結合ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびＤＡＰ１２を含む細胞質ドメインを含む。

ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチドのコードされる細胞質ドメインは、例えば、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(別名“ＩＣＯＳ”)、ＦｃεＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８(ＣＤ８アルファまたはＣＤ８ベータ)、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドまたはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインの１以上を含む、ここに記載するようなＴＣＡＲの細胞質ドメインである。

ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸分子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするリーダー配列またはシグナル配列をさらに含む。

ある態様において、コードされたＮＫＲ−ＣＡＲは、ヒンジドメインにより膜貫通ドメインに連結された、細胞外抗原結合ドメインを含む。ある態様において、ヒンジドメインは、ＧＳヒンジ、ＣＤ８ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＤヒンジ、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジ、ＫＩＲヒンジ、ＮＣＲヒンジ、ＳＬＡＭＦヒンジ、ＣＤ１６ヒンジ、ＣＤ６４ヒンジおよびＬＹ４９ヒンジからなる群から選択される。ある態様において、コードされるヒンジドメインは、ｉ)配列番号５、２、３または４のアミノ酸配列；ii)配列番号５、２、３または４のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が５を超えないアミノ酸配列；またはiii)配列番号５、２、３または４のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸分子は配列番号３５６、１６、１３、１４または１５の核酸配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を含み、これは、ヒンジドメインをコードする。

ある態様において、コードされる膜貫通ドメインおよびコードされる細胞質ドメインは、集合的に、ｉ)配列番号３３３のアミノ酸４１３〜４８７または配列番号３３５もしくは配列番号３７１のアミノ酸３８６〜４５４のアミノ酸配列；ii)配列番号３３３のアミノ酸４１３〜４８７または配列番号３３５もしくは配列番号３７１のアミノ酸３８６〜４５４に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；またはiii)配列番号３３３のアミノ酸４１３〜４８７または配列番号３３５もしくは配列番号３７１のアミノ酸３８６〜４５４と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸分子は配列番号３３２のヌクレオチド１２３７〜１４６４または配列番号３３４のヌクレオチド１１５６〜１３６５またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む核酸配列を含み、これは、集合的に膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする。

他の面において、本発明は、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲをコードする配列を含む、核酸分子、例えば、精製されたまたは天然に存在しない、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸、配列、例えば、ｍＲＮＡに関する。

ある態様において、核酸分子は、さらに、該ＮＫＲ−ＣＡＲと相互作用するアダプター分子または細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含む。ある態様において、コードされたアダプター分子は、ＤＡＰ１２またはＦｃεＲγの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、コードされたアダプター分子は、配列番号３３３のアミノ酸１〜１１３または配列番号３３５のアミノ酸１〜８６のアミノ酸配列；配列番号３３３のアミノ酸１〜１１３または配列番号３３５のアミノ酸１〜８６に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０、または５を超えないアミノ酸配列；または配列番号３３３のアミノ酸１〜１１３または配列番号３３５のアミノ酸１〜８６と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸分子は配列番号３３２のヌクレオチド１〜３３９または配列番号３３４のヌクレオチド１〜２５８またはそれと９５〜９９％同一性を含む核酸配列を含む核酸配列を含み、これは、アダプター分子をコードする。

ある態様において、核酸分子は、さらに、ＴＣＡＲまたは第二ＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。ある態様において、コードされたＴＣＡＲまたはコードされる第二ＮＫＲ−ＣＡＲは、メソテリンではない標的抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。

ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸分子は、さらに、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａからなる群から選択されるペプチド開裂部位をコードする核酸配列を含み、ここで、ペプチド開裂部位をコードする核酸は、ＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸配列を第二核酸配列、例えば、アダプター分子をコードする核酸配列に連結する。ある態様において、ペプチド開裂部位をコードする核酸配列は、配列番号５７、５８、５９または６０のアミノ酸配列；またはそれと９５〜９９％配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。

ある態様において、核酸は活性化ＮＫＲ−ＣＡＲをコードし、コードされる細胞外抗原結合ドメインは、ここに、例えば、表４に、記載する抗原結合ドメインである。前記態様のいずれかにおいて、コードされる細胞外抗原結合ドメインは、メソテリンに結合する非マウス抗原結合ドメインである。ある態様において、コードされる細胞外メソテリンに結合する非マウス抗原結合ドメインは、メソテリンに結合するヒトまたはヒト化抗原結合ドメインを含む。ある態様において、メソテリンに結合するヒトまたはヒト化抗原結合ドメインを表４に示す。

ある態様において、コードされたメソテリンに結合するヒト抗原結合ドメインは、表４に挙げるヒト抗メソテリン重鎖アミノ酸配列のいずれかの重鎖相補性決定領域１(ＨＣＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣＣＤＲ３)；および／または表４に挙げるヒト抗メソテリン軽鎖アミノ酸配列のいずれかの軽鎖相補性決定領域１(ＬＣＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣＣＤＲ３)を含む。ある態様において、コードされたメソテリンに結合するヒト抗原結合ドメインは、：ｉ)表４に挙げるヒト抗メソテリン重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列；ii)表４に挙げるヒト抗メソテリン重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；またはiii)表４に挙げるヒト抗メソテリン重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および／またはｉ)表４に挙げるヒト抗メソテリン軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列；ii)表４に挙げるヒト抗メソテリン軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；またはiii)表４に挙げるヒト抗メソテリン軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある態様において、コードされたメソテリンに結合するヒト抗原結合ドメインは、ｉ)配列番号２３０〜２５３のいずれかのアミノ酸配列；ii)配列番号２３０〜２５３のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；またはiii)配列番号２３０〜２５３のいずれかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。このような態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲは、さらに、例えば、集合的に、配列番号３７１のアミノ酸配列、配列番号３７１に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号３７１と少なくとも９５〜９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。

他の面において、本発明は、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターに関する。ある態様において、ベクターはＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターである。ある態様において、ベクターは、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターからなる群から選択される。ある態様において、ベクターは、さらに、ここに記載するアダプター分子または細胞内シグナル伝達ドメインを含む核酸配列を含む。ある態様において、ベクターは、さらに、例えば、配列番号１１の配列を含む、ここに記載するプロモーター、例えば、ＥＦ−１プロモーターを含む。

他の面において、本発明は、さらに、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲ、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸分子、ここに記載するベクターまたはここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲ複合体を含む、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、細胞毒性細胞、例えば、天然に存在するもしくは存在しないＴ細胞、ＮＫ細胞または細胞毒性Ｔ細胞またはＮＫ細胞株に関する。

ある態様において、細胞毒性細胞は、さらに、該ＮＫＲ−ＣＡＲと相互作用するアダプター分子または細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

他の面において、本発明は、細胞毒性細胞に、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲをコードする配列を含む核酸、例えば、ｍＲＮＡを導入することを含む、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲを含む、ここに記載する細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、細胞毒性細胞、例えば、天然に存在するもしくは存在しないＴ細胞、ＮＫ細胞または細胞毒性Ｔ細胞またはＮＫ細胞株を製造する方法に関する。ある態様において、方法は、さらに、細胞毒性細胞においてここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲを製造することを含む。ある態様において、方法は、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲを含む、ここに記載する細胞の集団、例えば、免疫エフェクター細胞の集団の製造を含む。

他の面において、本発明は、有効量のここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲを含む、ここに記載する細胞またはここに記載する細胞の集団、例えば、細胞毒性細胞、例えば、天然に存在するもしくは存在しないＴ細胞、ＮＫ細胞または細胞毒性Ｔ細胞またはＮＫ細胞株を哺乳動物に投与することを含む、対象を処置する方法、例えば、哺乳動物における抗腫瘍免疫を提供する方法に関する。

他の面において、本発明は、対象に有効量の例えば、ここに記載するような、ＮＫＲ−ＣＡＲを含む細胞を投与することを含む、腫瘍抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する疾患(例えば、増殖性疾患、前癌状態および腫瘍抗原の発現と関係する非癌徴候)を有する対象を処置する方法に関する。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲは活性化ＮＫＲ−ＣＡＲであり、細胞外抗原結合ドメインは、ここに、例えば、表４に、記載する抗原結合ドメインである。ある態様において、方法は、さらに、例えば、ここに記載するような、ＴＣＡＲを含む細胞の投与を含む。

ある態様において、腫瘍抗原の発現と関係する疾患は癌、例えば、ここに記載する癌である。ある態様において、癌は固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍である。

ある態様において、疾患または障害はメソテリンの発現と関係し、例えば、中皮腫(例えば、悪性胸膜中皮腫)、肺癌(例えば、非小細胞性肺癌、小細胞肺癌、扁平上皮細胞肺癌または大細胞肺癌)、膵臓癌(例えば、膵管腺癌)、卵巣癌、結腸直腸癌および膀胱癌またはこれらの任意の組み合わせである。ある態様において、疾患は、例えば、少なくとも一つの前の標準治療で進行している対象における、膵臓癌、例えば、転移膵管腺癌(ＰＤＡ)である。ある態様において、疾患は、例えば、少なくとも一つの前の標準治療で進行している対象における、中皮腫(例えば、悪性胸膜中皮腫)である。ある態様において、疾患は、少なくとも一つの前の標準治療のレジメン後進行している対象における、卵巣癌、例えば、漿液性上皮性卵巣癌である。

前記組成物および方法のさらなる特性および態様は、次の１以上を含む：
他の面において、本発明は、細胞外抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメイン、例えば、ＫＩＲ膜貫通ドメインまたは細胞質ドメイン、例えば、ＩＴＩＭ含有細胞質ドメインまたはＫＩＲ細胞質ドメインを含む、精製されているかまたは天然に存在しないＫＩＲ−ＣＡＲに関する。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよびＩＴＩＭ含有細胞質ドメインまたはＫＩＲ細胞質ドメインを含む。

ある態様において、該膜貫通ドメインは、ＤＡＰ１２の膜貫通ドメインと、相互作用、例えば、結合できる。ある態様において、該膜貫通ドメインは、正荷電基、例えば、正荷電基、例えば、側鎖を含むアミノ酸残基を含む。ある態様において、該膜貫通ドメインは、ＫＩＲ膜貫通ドメインを含む。

ある態様において、該ＫＩＲ−ＣＡＲは、活性化ＫＩＲ−ＣＡＲである。ある態様において、該ＫＩＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲ膜貫通ドメインを含む。ある態様において、該ＫＩＲ−ＣＡＲは、阻害性ＫＩＲ−ＣＡＲである。ある態様において、該ＫＩＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲ細胞質ドメインを含む。ある態様において、該ＫＩＲ−ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメイン、例えば、正荷電基、例えば、正荷電基、例えば、側鎖を含むアミノ酸残基を含む膜貫通ドメインまたはＫＩＲ膜貫通ドメインを含む。

ある態様において、ここに記載するＫＩＲ−ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗原結合ドメインを含む。ある態様において、該抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメイン、または非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、例えば、フィブロネクチンIII型抗体様分子である。ある態様において、該抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。ある態様において、該抗原結合ドメインは、ラクダ科ＶＨＨドメインを含む。

ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲは活性化ＫＩＲ−ＣＡＲであり、細胞外抗原結合ドメインは、ここに、例えば、表４に、記載する抗原結合ドメインである。

ある態様において、ここに記載するＫＩＲ−ＣＡＲは、細胞外ヒンジドメインを含む。ある態様において、細胞外ヒンジドメインはＫＩＲヒンジドメイン以外、例えば、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジドメイン以外である。ある態様において、細胞外ヒンジドメインは天然分子に由来する。ある態様において、細胞外ヒンジドメインは、ＫＩＲ以外の天然分子に由来する。ある態様において、細胞外ヒンジドメインは、天然に存在しないポリペプチド配列を含む。ある態様において、細胞外ヒンジドメインは、ヒトＣＤ８アルファからの細胞外ヒンジを含む。ある態様において、細胞外ヒンジドメインは、合成細胞外ヒンジを含む。ある態様において、細胞外ヒンジドメインは、５０、２０または１０アミノ酸長より短い。ある態様において、細胞外ヒンジドメインは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジドメインより少ないアミノ酸を有する。

ある態様において、ここに記載するＫＩＲ−ＣＡＲは、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲである。ある態様において、該ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲは、正荷電基、例えば、正荷電基、例えば、正荷電側鎖を含むアミノ酸残基を含む膜貫通ドメインまたはａｃｔＫＩＲ膜貫通ドメインを含む。ある態様において、該ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲは、ＩＴＡＭ含有ポリペプチドまたはアダプター分子からのシグナル伝達と相互作用し、促進できる。ある態様において、該ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲは、ＤＡＰ１２ポリペプチドからのシグナル伝達と相互作用し、促進できる。ある態様において、該ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲＤドメインを含む。ある態様において、該ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲＤ１ドメインを含む。ある態様において、該ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲＤ２ドメインを含む。ある態様において、該ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲＤドメインを含まない。ある態様において、該ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲ２ＤＳ２膜貫通ドメインを含む。ある態様において、該ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲ２ＤＳ２細胞質ドメインをさらに含む。ある態様において、該ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲＤドメインを含まない。

ある態様において、ここに記載するＫＩＲ−ＣＡＲの抗原結合ドメインは、標的細胞、例えば、癌細胞に提示される抗原に結合する。ある態様において、該抗原結合ドメインは、非標的細胞、例えば、非癌性細胞、例えば、標的細胞と同じタイプの非癌性細胞よりも、標的細胞、例えば、癌細胞で高度に発現される抗原である。ある態様において、該抗原結合ドメインは、ここに記載する抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原に結合する。ある態様において、腫瘍抗原は、固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、中皮腫(例えば、悪性胸膜中皮腫)、肺癌(例えば、非小細胞性肺癌、小細胞肺癌、扁平上皮細胞肺癌または大細胞肺癌)、膵臓癌(例えば、膵管腺癌)、卵巣癌、結腸直腸癌および膀胱癌またはこれらの任意の組み合わせで発現される。

ある態様において、ここに記載するＫＩＲ−ＣＡＲは、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲである。ある態様において、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲは、ｉｎｈＫＩＲ膜貫通ドメインを含む。ある態様において、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲは、ＩＴＩＭ含有細胞質ドメイン、例えば、ｉｎｈＫＩＲ細胞質ドメイン、例えば、ＫＩＲ２ＤＬまたはＫＩＲ３ＤＬ細胞質ドメインを含む。ある態様において、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲ膜貫通以外の膜貫通、例えば、ＩＬＴ(ＣＤ８５)、Ｓｉｇｌｅｃ、ＬＭＩＲ(ＣＤ３００)および／またはＳＬＡＭ遺伝子ファミリーの受容体からのＰＤ−１、ＣＴＬＡ４またはＩＴＩＭ含有受容体からの膜貫通ドメインを含む。ある態様において、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲ以外の阻害性受容体、例えば、ＩＬＴ(ＣＤ８５)、Ｓｉｇｌｅｃ、ＬＭＩＲ(ＣＤ３００)および／またはＳＬＡＭ遺伝子ファミリーの受容体からのＰＤ−１、ＣＴＬＡ４またはＩＴＩＭ含有受容体からの細胞質ドメインを含む。ある態様において、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲ以外の阻害性受容体、例えば、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、独立的に、例えば、ＩＬＴ(ＣＤ８５)、Ｓｉｇｌｅｃ、ＬＭＩＲ(ＣＤ３００)および／またはＳＬＡＭ遺伝子ファミリーの受容体からのＰＤ−１、ＣＴＬＡ４またはＩＴＩＭ含有受容体からの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。ある態様において、該細胞質ドメインＩＴＩＭを含む。ある態様において、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲＤドメインを含む。ある態様において、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲＤ０ドメインを含む。ある態様において、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲＤ１ドメインを含む。ある態様において、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲＤ２ドメインを含む。ある態様において、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲＤドメインを含まない。

ある態様において、ここに記載するｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲの抗原結合ドメインは、標的細胞、例えば、癌細胞に提示されない抗原に結合する。ある態様において、該抗原結合ドメインは、標的細胞、例えば、癌性細胞、例えば、標的細胞と同じタイプの癌性細胞よりも、非標的細胞、例えば、非癌細胞で高度に発現される抗原と結合する。ある態様において、該抗原結合ドメインは、デスモグレイン１／３(ＤＳＧ１／３)と結合する。ある態様において、ｉｎｈＣＡＲ、例えば、ｉｎｈＴＣＡＲまたはｉｎｈＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲおよびａｃｔＣＡＲ、例えば、ａｃｔＴＣＡＲまたはａｃｔＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲが提供され、ここで、ｉｎｈＣＡＲがデスモグレイン１／３(ＤＳＧ１／３)を標的とする抗原結合ドメインを含み、ａｃｔＣＡＲがＤＳＧ１／３以外の抗原、例えば、ＥＧＦＲを標的とする抗原結合ドメインを含む。ある態様において、この対を、ＥＧＦＲ発現癌、例えば、肺または結腸の腺癌の処置に使用する。ある態様において、癌細胞は、非癌細胞よりＤＳＧ１／３発現が少ない。ある態様において、この組み合わせは、ＧＩ管(すなわち口腔粘膜)の皮膚細胞または扁平上皮細胞のＣＡＲ介在を最小化できる。ある態様において、該抗原結合ドメインは、エフリン受容体またはクローディンと結合する。

他の面において、本発明は、(ａ)ＫＩＲ−ＣＡＲ、例えば、ここに記載する第一ＫＩＲ−ＣＡＲをコードする配列を含む、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、配列、例えば、ｍＲＮＡを含む、核酸、例えば、精製されたまたは天然に存在しない、核酸、例えば、核酸に関する。ある態様において、該ＫＩＲ−ＣＡＲ、例えば、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲは、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲ、例えば、ここに記載するａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲである。ある態様において、核酸はａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲをコードし、コードされる細胞外抗原結合ドメインは、ここに、例えば、表４に、記載する抗原結合ドメインである。ある態様において、該ＫＩＲ−ＣＡＲ、例えば、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲは、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲ、例えば、ここに記載するｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲである。

ある態様において、該核酸は、ＤＮＡ配列を含む。ある態様において、該核酸は、ＲＮＡ配列、例えば、ｍＲＮＡ配列を含む。

ある態様において、該核酸は、ＫＩＲ−ＣＡＲ、例えば、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲならびにｉｎｈＫＩＲ細胞質ドメイン；膜貫通ドメイン、例えば、ＫＩＲ膜貫通ドメイン；および阻害剤細胞質ドメイン、例えば、ＩＴＩＭドメイン、例えば、ｉｎｈＫＩＲＩＴＩＭドメインを含む阻害性分子をコードする配列をコードする配列を含む。ある態様において、阻害性分子は、天然に存在するｉｎｈＫＩＲまたは天然に存在するｉｎｈＫＩＲと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％相同性を有するかまたは１残基、２残基、３残基、４残基、５残基、６残基、７残基、８残基、９残基、１０残基、１５残基もしくは２０残基を超えて異ならない配列である。

ある態様において、該核酸は、ＫＩＲ−ＣＡＲ、例えば、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲをコードする配列ならびにＳＬＡＭファミリー細胞質ドメイン；膜貫通ドメイン、例えば、ＳＬＡＭファミリー膜貫通ドメイン；および阻害剤細胞質ドメイン、例えば、ＳＬＡＭファミリードメイン、例えば、ＳＬＡＭファミリーＩＴＩＭドメインを含む阻害性分子をコードする配列を含む。ある態様において、阻害性分子は、天然に存在するＳＬＡＭファミリーメンバーであるかまたはＳＬＡＭファミリーメンバーと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％相同性を有するかまたは１残基、２残基、３残基、４残基、５残基、６残基、７残基、８残基、９残基、１０残基、１５残基もしくは２０残基を超えて異ならない天然に存在する配列である。

ある態様において、ここに記載する該核酸は、さらに(ｂ)ここに記載する第二ＫＩＲ−ＣＡＲ、例えば、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲと異なる第二ＫＩＲ−ＣＡＲをコードする配列を含む。ある態様において、(ａ)および(ｂ)は、同じ核酸分子、例えば、同じベクター、例えば、同じウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置される。ある態様において、(ａ)および(ｂ)の一方が第一核酸分子、例えば、第一ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置され、他方が第二核酸分子、例えば、第二ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置される。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲは、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲである。ある態様において、いずれかのａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲ単独の結合が、相当なレベルの活性化を誘発するのに不十分である。ある態様において、第一および第二のａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲ両者の結合が、相加的または相乗的レベルの活性化をもたらす。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲは、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲである。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方はａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲであり、他方はｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲである。ある態様において、該ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲはここに記載するａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲである。ある態様において、該ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲはここに記載するｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲである。ある態様において、ここに記載する核酸は、ここに記載するａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲおよびここに記載するｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲを含む。

ある態様において、核は、さらに(ｃ)活性化シグナルを産生できる細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、アダプター分子をコードする配列を含む。ある態様において、該細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭモチーフを含む。ある態様において、該配列は、ＤＡＰ１２細胞内シグナル伝達ドメインを含むＤＡＰ１２ポリペプチドをコードする。ある態様において、該ＤＡＰ１２ポリペプチドは、さらに膜貫通ドメインを含む。ある態様において、該ＤＡＰ１２ポリペプチドは、さらに細胞外ドメインを含む。ある態様において、(ａ)、(ｂ)、および(ｃ)の各々は、同じ核酸分子、例えば、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに提示される。ある態様において、(ａ)、(ｂ)、および(ｃ)の一つは第一核酸分子、例えば、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターでコードされ、(ａ)、(ｂ)、および(ｃ)の二番目および三番目は、第二核酸分子、例えば、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターでコートされる。ある態様において、(ａ)は第一核酸分子、例えば、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに提示され、(ｂ)および(ｃ)は第二核酸分子、例えば、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに提示される。他の態様において、(ｂ)は第一核酸分子、例えば、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに提示され、(ａ)および(ｃ)は第二核酸分子、例えば、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに提示される。ある態様において、(ｃ)は第一核酸分子、例えば、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに提示され、(ｂ)および(ａ)は第二核酸分子、例えば、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに提示される。ある態様において、(ａ)、(ｂ)、および(ｃ)の各々は、異なる核酸分子、例えば、異なるベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに提示される。

ある態様において、(ｉ)該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含まないか、(ii)該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はｓｃＦｖ以外であるか、(iii)細胞表面に提示されるとき、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるときより少なく互いに結合するか、(iv)ここで、細胞表面に提示されるとき、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの存在により実質的に低減されないか、(ｖ)該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメイン、または非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、例えば、フィブロネクチンIII型抗体様分子を含むか、(vi)該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、例えば、フィブロネクチンIII型抗体様分子を含むか、(vii)該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はナノボディを含むかまたは(viii)該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はラクダ科ＶＨＨドメインを含む。

ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含まない。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はｓｃＦｖ以外である。

ある態様において、細胞表面に提示されるとき、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるときより少なく互いに結合する。ある態様において、細胞表面に提示されるとき、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの存在により実質的に低減されない。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、例えば、フィブロネクチンIII型抗体様分子を含む。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、例えば、フィブロネクチンIII型抗体様分子を含む。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はナノボディを含む。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はラクダ科ＶＨＨドメインを含む。

ある態様において、核酸は、ＴＣＡＲをコードする配列を含む。ある態様において、該ＴＣＡＲは、ＣＤ３、例えばＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖とのＴ細胞受容体複合体からの抗原結合ドメインおよび活性化細胞質ドメインを含む。ある態様において、該ＴＣＡＲは、共刺激性受容体、例えばＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＩＣＯＳまたはＯＸ４０からの共刺激性ドメインを含む。

ある態様において、(ｉ)該ＫＩＲ−ＣＡＲおよびＴＣＡＲの抗原結合ドメインは軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含まないか、(ii)該ＫＩＲ−ＣＡＲおよびＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はｓｃＦｖ以外であるか、(iii)細胞表面に提示されるとき、該ＫＩＲ−ＣＡＲおよびＴＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるときより少なく互いに結合するか、(iv)細胞表面に提示されるとき、該ＫＩＲ−ＣＡＲのその同族抗原への結合が、該第二ＴＣＡＲの存在により実質的に低減されないか、(ｖ)該ＫＩＲ−ＣＡＲおよびＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、例えば、フィブロネクチンIII型抗体様分子を含むか、(vi)該ＫＩＲ−ＣＡＲおよびＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、例えば、フィブロネクチンIII型抗体様分子を含むか、(vii)該ＫＩＲ−ＣＡＲおよびＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はナノボディを含むかまたは(viii)ここで、該ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該ＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はラクダ科ＶＨＨドメインを含む。ある態様において、該ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該ＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含まない。

ある態様において、該ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該ＴＣＡＲの抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はｓｃＦｖ以外である。ある態様において、細胞表面に提示されるとき、該ＫＩＲ−ＣＡＲおよびＴＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるときより少なく互いに結合する。ある態様において、細胞表面に提示されるとき、該ＫＩＲ−ＣＡＲのその同族抗原への結合が、該第二ＴＣＡＲの存在により実質的に低減されない。ある態様において、該ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該ＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、例えば、フィブロネクチンIII型抗体様分子を含む。ある態様において、該ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該ＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、例えば、フィブロネクチンIII型抗体様分子を含む。ある態様において、該ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該ＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はナノボディを含む。ある態様において、該ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該ＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はラクダ科ＶＨＨドメインを含む。

ある態様において、該ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該ＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはメソテリンに結合し、他方は異なる抗原結合ドメイン、例えば、同じ標的(メソテリン)または異なる標的(例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１、またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７)に結合する。

他の面において、本発明は、(ａ)ここに記載する第一ＫＩＲ−ＣＡＲを含む、細胞毒性細胞、例えば、天然に存在するもしくは存在しないＴ細胞、ＮＫ細胞または細胞毒性Ｔ細胞またはＮＫ細胞株細胞、例えば、ＮＫ９２に関する。ある態様において、該細胞毒性細胞はＴ細胞である。ある態様において、該細胞毒性細胞はＮＫ細胞である。ある態様において、該細胞毒性細胞はＮＫ細胞株由来、例えば、ＮＫ９２細胞である。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲはここに記載するａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲである。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲはここに記載するｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲである。

ある態様において、該細胞毒性細胞は、ＫＩＲ−ＣＡＲ、例えば、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲおよびｉｎｈＫＩＲ細胞質ドメイン；膜貫通ドメイン、例えば、ＫＩＲ膜貫通ドメイン；および阻害剤細胞質ドメイン、例えば、ＩＴＩＭドメイン、例えば、ｉｎｈＫＩＲＩＴＩＭドメインを含む阻害性分子を含む。ある態様において、阻害性分子は、天然に存在するｉｎｈＫＩＲまたは天然に存在するｉｎｈＫＩＲと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％相同性を有するかまたは１残基、２残基、３残基、４残基、５残基、６残基、７残基、８残基、９残基、１０残基、１５残基もしくは２０残基を超えて異ならない配列である。

ある態様において、該細胞毒性細胞は、ＫＩＲ−ＣＡＲ、例えば、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲおよびＳＬＡＭファミリー細胞質ドメイン；膜貫通ドメイン、例えば、ＳＬＡＭファミリー膜貫通ドメイン；および阻害剤細胞質ドメイン、例えば、ＳＬＡＭファミリードメイン、例えば、ＳＬＡＭファミリーＩＴＩＭドメインを含む阻害性分子を含む。ある態様において、阻害性分子は、天然に存在するＳＬＡＭファミリーメンバーまたは天然に存在するＳＬＡＭファミリーメンバーと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％相同性を有するかまたは１残基、２残基、３残基、４残基、５残基、６残基、７残基、８残基、９残基、１０残基、１５残基もしくは２０残基を超えて異ならない配列である。

ある態様において、細胞毒性細胞は、さらに、(ｂ)ここに記載する第二ＫＩＲ−ＣＡＲ、例えば、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲと異なる第二ＫＩＲ−ＣＡＲを含む。ある態様において、該ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方はａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲであり、他方はｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲである。ある態様において、該ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲはここに記載するａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲである。ある態様において、該ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲの一方はここに記載するｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲである。ある態様において、ここに記載する細胞毒性細胞は、ここに記載するａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲおよびここに記載するｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲを含む。

ある態様において、細胞毒性細胞は、さらに、例えば、活性化シグナルを産生できる、例えば、該細胞に外来性である、活性化シグナルを産生できる、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、アダプター分子を含む。ある態様において、該細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭモチーフを含む。ある態様において、該細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１２細胞内シグナル伝達ドメインを含むＤＡＰ１２ポリペプチドを含む。ある態様において、該ＤＡＰ１２ポリペプチドは、さらに膜貫通ドメインを含む。ある態様において、該ＤＡＰ１２ポリペプチドは、さらに細胞外ドメインを含む。

ある態様において、細胞毒性細胞は、ここに記載する第一および第二のＫＩＲ−ＣＡＲを含み、ここで、(ｉ)該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含まないか、(ii)該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はｓｃＦｖ以外であるか、(iii)細胞表面に提示されるとき、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるときより少なく互いに結合するか、(iv)細胞表面に提示されるとき、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの存在により実質的に低減されないか、(ｖ)該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、例えば、フィブロネクチンIII型抗体様分子を含む、(vi)該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、例えば、フィブロネクチンIII型抗体様分子を含むか、(vii)ここで、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はナノボディを含むかまたは(viii)該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はラクダ科ＶＨＨドメインを含む。

ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含まない。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はｓｃＦｖ以外である。ある態様において、細胞表面に提示されるとき、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるときより少なく互いに結合する。ある態様において、細胞表面に提示されるとき、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの存在により実質的に低減されない。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、例えば、フィブロネクチンIII型抗体様分子を含む。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、例えば、フィブロネクチンIII型抗体様分子を含む。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はナノボディを含む。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はラクダ科ＶＨＨドメインを含む。

ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはメソテリンに結合し、他方は異なる抗原結合ドメイン、例えば、同じ標的(メソテリン)または異なる標的(例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１、またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７)に結合する。

ある態様において、細胞毒性細胞は、ここに記載するようなＫＩＲ−ＣＡＲを含み、さらにＴＣＡＲを含む。ある態様において、該ＴＣＡＲは、抗原結合ドメインおよび一次刺激ドメインを含む。ある態様において、該ＴＣＡＲは、共刺激ドメインを含む。

ある態様において、細胞毒性細胞、例えば、天然に存在するもしくは存在しないＴ細胞、ＮＫ細胞または細胞毒性Ｔ細胞またはＮＫ細胞株、例えば、ＮＫ９２細胞は、ここに記載するような核酸；またはここに記載する核酸によりコードされるＫＩＲ−ＣＡＲを含む。ある態様において、該細胞毒性細胞はＴ細胞である。ある態様において、該細胞毒性細胞はＮＫ細胞である。ある態様において、該細胞毒性細胞は、ＮＫ細胞株由来、例えば、ＮＫ９２である。

他の面において、本発明は、ここに記載する細胞を製造する方法であって、細胞毒性細胞に、ここに記載する核酸を該細胞に導入することを含む、方法に関する。ある態様において、該方法は、細胞毒性細胞において、ここに記載するＫＩＲ−ＣＡＲを形成することを含む。

他の面において、本発明は、哺乳動物に有効量のここに記載する細胞を投与することを含む、対象を処置する方法、例えば、哺乳動物における抗腫瘍免疫を提供する方法に関する。ある態様において、該細胞は自己である。ある態様において、該細胞は同種である。ある態様において、細胞はＴ細胞、例えば、自己Ｔ細胞である。ある態様において、細胞は同種Ｔ細胞である。ある態様において、細胞はＮＫ細胞、例えば、自己ＮＫ細胞である。ある態様において、細胞は同種ＮＫ細胞である。ある態様において、細胞はＮＫ細胞株由来細胞、例えば、ＮＫ９２である。ある態様において、該哺乳動物はヒトである。ある態様において、方法は、該哺乳動物、例えば、ヒトに対して、該処置の副作用を評価することを含む。ある態様において、該副作用は、急性呼吸促迫症候群、発熱性好中球減少症、低血圧、脳症、肝臓高トランスアミナーゼ血症、発作またはマクロファージ活性化症候群を含む。ある態様において、方法は、副作用を有する該ヒトを、ここに記載する薬剤、例えば、抗サイトカイン剤、例えば、腫瘍壊死因子アンタゴニスト、例えば、ＴＮＦ−Ｉｇ融合体、例えば、エタネルセプト、ＩＬ−６アンタゴニスト、例えば、ＩＬ−６受容体アンタゴニスト、例えば、抗ＩＬ６受容体抗体、例えば、トシリズマブまたはコルチコステロイドで処置することをさらに含む。ある態様において、処置は、該ヒトへの抗ＩＬ６受容体抗体の投与を含む。

ある態様において、腫瘍抗原の発現と関係する疾患は癌、例えば、ここに記載する癌である。ある態様において、癌は、固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、中皮腫(例えば、悪性胸膜中皮腫)、肺癌(例えば、非小細胞性肺癌、小細胞肺癌、扁平上皮細胞肺癌または大細胞肺癌)、膵臓癌(例えば、膵管腺癌)、卵巣癌、結腸直腸癌および膀胱癌またはこれらの任意の組み合わせである。ある態様において、疾患は、例えば、少なくとも一つの前の標準治療で進行している対象における、膵臓癌、例えば、転移膵管腺癌(ＰＤＡ)である。ある態様において、疾患は、例えば、少なくとも一つの前の標準治療で進行している対象における、中皮腫(例えば、悪性胸膜中皮腫)である。ある態様において、疾患は、少なくとも一つの前の標準治療のレジメン後進行している対象における、卵巣癌、例えば、漿液性上皮性卵巣癌である。

ある態様において、方法は、メソテリンまたはＣＤ１９の発現と関係する疾患を有する哺乳動物、例えば、ヒトの処置を含む。ある態様において、方法は、望まない細胞増殖と関係する障害、例えば、癌を有する哺乳動物、例えば、ヒトの処置を含む。ある態様において、該障害は、膵臓癌、中皮腫、肺癌、卵巣癌、白血病またはリンパ腫である。

他の面において、本発明は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、例えば、正荷電基、例えば、正荷電基、例えば、正荷電側鎖を含むアミノ酸残基を含む膜貫通ドメインまたはＮＣＲ膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、例えば、ＮＣＲ細胞質ドメインを含む、精製されているかまたは天然に存在しないＮＣＲ−ＣＡＲ、例えば、活性化ＮＣＲ−ＣＡＲに関する。

ある態様において、該ＮＣＲ−ＣＡＲは、正荷電基、例えば、正荷電基、例えば、正荷電側鎖を含むアミノ酸残基を含む膜貫通ドメイン、例えば、ＮＣＲ膜貫通ドメイン、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６細胞質ドメインを含む。ある態様において、該ＮＣＲ−ＣＡＲは、例えば、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγまたはＣＤ３ζ細胞質ドメインを含む、アダプター分子または細胞内シグナル伝達分子と相互作用できる細胞質ドメインを含む。ある態様において、該ＮＣＲ−ＣＡＲ、例えば、ＮＫｐ３０−ＣＡＲは、アダプター分子または細胞内シグナル伝達分子と相互作用できる膜貫通ドメイン、例えば、ＤＡＰ１２を含む。ある態様において、該ＮＣＲ−ＣＡＲは、ＮＫｐ４６−ＣＡＲを含む。ある態様において、該ＮＫｐ４６−ＣＡＲは、アダプター分子または細胞内シグナル伝達分子と相互作用できる、正荷電基、例えば、正荷電基、例えば、正荷電側鎖を含むアミノ酸残基を含む膜貫通ドメインまたは例えば、ＮＣＲ膜貫通ドメイン、例えば、ＦｃＲγまたはＣＤ３ζ細胞質ドメインを含むものを含む。ある態様において、ここに記載する該ＮＣＲ−ＣＡＲは、該膜貫通ドメインと該細胞外抗原結合ドメインの間に配置されたヒンジドメインをさらに含む。

ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲは活性化ＮＣＲ−ＣＡＲであり、細胞外抗原結合ドメインは、ここに、例えば、表４に、記載する抗原結合ドメインである。

他の面において、本発明は、ここに記載するＮＣＲ−ＣＡＲをコードする配列を含む、核酸、例えば、精製されたまたは天然に存在しない、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸、配列、例えば、ｍＲＮＡに関する。ある態様において、核酸は、ＮＫｐ３０−ＣＡＲおよび所望により、アダプター分子または細胞内シグナル伝達分子、例えば、ＤＡＰ１２をコードする配列を含む。ある態様において、該ＮＣＲ−ＣＡＲ、例えば、ＮＫｐ４６−ＣＡＲは、アダプター分子または細胞内シグナル伝達分子、例えば、ＦｃＲγまたはＣＤ３ζ分子と相互作用できる正荷電基、例えば、正荷電基、例えば、正荷電側鎖を含むアミノ酸残基を含む膜貫通ドメインまたはＮＣＲ膜貫通ドメインを含む。ある態様において、核酸は、さらに、アダプター分子または細胞内シグナル伝達分子をコードする配列を含み、これは、例えば、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγまたはＣＤ３ζを含む。

ある態様において、核酸はａｃｔＮＣＲ−ＣＡＲをコードし、コードされる細胞外抗原結合ドメインは、ここに、例えば、表４に、記載する抗原結合ドメインである。

他の面において、本発明は、ここに記載するＮＣＲ−ＣＡＲを含む、細胞毒性細胞、例えば、天然に存在するもしくは存在しないＴ細胞、ＮＫ細胞または細胞毒性Ｔ細胞またはＮＫ細胞株に関する。ある態様において、細胞毒性細胞は、さらに、例えば、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγまたはＣＤ３ζ細胞質ドメインを含む、アダプター分子または細胞内シグナル伝達分子を含む。ある態様において、細胞毒性細胞は、ＮＫｐ３０−ＣＡＲおよび所望により、アダプター分子または細胞内シグナル伝達分子、例えば、ＤＡＰ１２を含む。ある態様において、該ＮＫｐ４６−ＣＡＲは、アダプター分子または細胞内シグナル伝達分子と相互作用できる膜貫通ドメイン、例えば、ＦｃＲγまたはＣＤ３ζ分子を含む。

他の面において、本発明は、細胞毒性細胞に、ここに記載するＮＣＲ−ＣＡＲをコードする配列を含む核酸を導入することを含む、ここに記載する細胞を製造する方法に関する。ある態様において、方法は、ここに記載するＮＣＲ−ＣＡＲを細胞毒性細胞に形成することを含む。

他の面において、本発明は、哺乳動物に有効量のここに記載する細胞、例えば、ここに記載するＮＣＲ−ＣＡＲを含む、ここに記載する本発明の細胞を投与することを含む、対象を処置する方法、例えば、哺乳動物における抗腫瘍免疫を提供する方法に関する。

他の面において、本発明は、対象に、有効量の例えば、ここに記載するような、ＮＣＲ−ＣＡＲを含む細胞を投与することを含む、腫瘍抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する疾患(例えば、増殖性疾患、前癌状態および腫瘍抗原の発現と関係する非癌徴候)を有する対象を処置する方法に関する。ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲは活性化ＮＣＲ−ＣＡＲであり、細胞外抗原結合ドメインは、ここに、例えば、表４に、記載する抗原結合ドメインである。

他の面において、本発明は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、例えば、正荷電基、例えば、正荷電基、例えば、正荷電側鎖を含むアミノ酸残基を含む膜貫通ドメイン、例えば、ＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインおよびＳＬＡＭＦ細胞質ドメインを含む、精製されているかまたは天然に存在しないＳＬＡＭＦ−ＣＡＲ、例えば、阻害性ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲに関する。ある態様において、該ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲは、ＳＬＡＭＦ、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥまたはＣＤ２Ｆ−１０細胞質ドメインを含む。ある態様において、該ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲは、さらに、該膜貫通ドメインと該細胞外抗原結合ドメインの間に配置されたヒンジドメインを含む。

他の面において、本発明は、ここに記載するＳＬＡＭＦ−ＣＡＲをコードする配列を含む、核酸、例えば、精製されたまたは天然に存在しない、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸、配列、例えば、ｍＲＮＡに関する。

他の面において、本発明は、ここに記載するＳＬＡＭＦ−ＣＡＲを含む、細胞毒性細胞、例えば、天然に存在するもしくは存在しないＴ細胞、ＮＫ細胞または細胞毒性Ｔ細胞またはＮＫ細胞株に関する。

他の面において、本発明は、細胞毒性細胞に、ここに記載するＳＬＡＭＦ−ＣＡＲをコードする配列を含む核酸を導入することを含む、ここに記載するＳＬＡＭＦ−ＣＡＲを含む細胞毒性細胞を製造する方法に関する。ある態様において、方法は、ここに記載するＳＬＡＭＦ−ＣＡＲを細胞毒性細胞に形成することを含む。

他の面において、本発明は、哺乳動物に、有効量のここに記載するＳＬＡＭＦ−ＣＡＲを含む細胞を投与することを含む、対象を処置する方法、例えば、哺乳動物における抗腫瘍免疫を提供する方法に関する。

他の面において、本発明は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよびＣＤ１６またはＣＤ６４細胞質ドメインを含む、精製されているかまたは天然に存在しないＦｃＲ−ＣＡＲ、例えば、ＣＤ１６−ＣＡＲ、例えば、活性化ＣＤ１６−ＣＡＲまたはＣＤ６４−ＣＡＲ、例えば、活性化ＣＤ６４−ＣＡＲに関する。ある態様において、該ＦｃＲ−ＣＡＲはＣＤ１６−ＣＡＲである。ある態様において、該ＦｃＲ−ＣＡＲはＣＤ６４−ＣＡＲである。ある態様において、該ＦｃＲ−ＣＡＲは、アダプター分子または細胞内シグナル伝達分子、例えば、ＦｃＲγまたはＣＤ３ζドメインと、例えば、膜貫通ドメイン、例えば、正荷電基、例えば、正荷電基、例えば、正荷電側鎖を含むアミノ酸残基を含む膜貫通ドメインまたは例えば、ＣＤ１６またはＣＤ６４膜貫通ドメインを介して相互作用できる。ある態様において、該ＦｃＲ−ＣＡＲは、さらに、該膜貫通ドメインと該細胞外抗原結合ドメインの間に配置されたヒンジドメインを含む。

他の面において、本発明は、ここに記載するＦｃＲ−ＣＡＲをコードする配列を含む、精製されたまたは天然に存在しない、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸、配列、例えば、ｍＲＮＡに関する。ある態様において、核酸は、さらに、細胞質活性化ドメイン、例えば、ＦｃＲγまたはＣＤ３ζ細胞質ドメインを含むアダプター分子または細胞内シグナル伝達分子を含む。ある態様において、該ＦｃＲ−ＣＡＲおよび該細胞質活性化ドメインは、別の核酸分子、例えば、別のベクター、例えば、別のウイルスベクター、例えば、別のレンチウイルスベクターに配置される。

他の面において、本発明は、ここに記載するＦｃＲ−ＣＡＲを含む、細胞毒性細胞、例えば、天然に存在するもしくは存在しないＴ細胞、ＮＫ細胞または細胞毒性Ｔ細胞またはＮＫ細胞株に関する。ある態様において、細胞毒性細胞は、さらに、細胞質活性化ドメイン、例えば、ＦｃＲγまたはＣＤ３ζ細胞質ドメインを含む。

他の面において、本発明は、細胞毒性細胞に、ここに記載するＦｃＲ−ＣＡＲをコードする配列を含む核酸を導入することを含む、ここに記載するＦｃＲ−ＣＡＲを含む細胞を製造する方法に関する。ある態様において、方法は、ここに記載するＦｃＲ−ＣＡＲを細胞毒性細胞に形成することを含む。

他の面において、本発明は、哺乳動物に、有効量のここに記載するＦｃＲ−ＣＡＲを含む細胞を投与することを含む、対象を処置する方法、例えば、哺乳動物における抗腫瘍免疫を提供する方法に関する。

他の面において、本発明は、精製されたまたは天然に存在しない細胞外抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメイン、例えば、Ｌｙ４９膜貫通ドメインまたは細胞質ドメイン、例えば、ＩＴＩＭ含有細胞質ドメイン、例えば、Ｌｙ４９細胞質ドメインを含むＬｙ４９−ＣＡＲに関する。ある態様において、Ｌｙ４９−ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよびＬｙ４９細胞質ドメインを含む。ある態様において、該Ｌｙ４９−ＣＡＲは、活性化Ｌｙ４９−ＣＡＲ、例えば、Ｌｙ４９ＤまたはＬｙ４９Ｈである。ある態様において、該Ｌｙ４９−ＣＡＲは、正荷電膜貫通ドメイン、例えば、正荷電Ｌｙ４９膜貫通ドメインを含む。ある態様において、該Ｌｙ４９−ＣＡＲは、ＩＴＡＭ含有細胞質ドメイン、例えば、ＤＡＰ１２と相互作用できる。ある態様において、該Ｌｙ４９−ＣＡＲは、Ｌｙ４９膜貫通ドメインを含む。ある態様において、該ＫＩＲ−ＣＡＲは、阻害性Ｌｙ４９−ＣＡＲ、例えば、Ｌｙ４９ＡまたはＬｙ４９Ｃである。ある態様において、該Ｌｙ４９−ＣＡＲは、ＩＴＩＭ含有細胞質ドメイン、例えば、Ｌｙ４９細胞質ドメインを含む。ある態様において、該Ｌｙ４９−ＣＡＲは、独立的にＬｙ４９Ａ−Ｌｙ４９Ｗから選択される、Ｌｙ４９膜貫通ドメインまたはＬｙ４９細胞質ドメインを含む。ある態様において、該Ｌｙ４９−ＣＡＲは、さらに、該膜貫通ドメインと該細胞外抗原結合ドメインの間に配置されたヒンジドメインを含む。

他の面において、本発明は、ここに記載するＬｙ４９−ＣＡＲをコードする配列を含む、核酸、例えば、精製されたまたは天然に存在しない、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸、配列、例えば、ｍＲＮＡに関する。ある態様において、核酸は、さらに、細胞質活性化ドメイン、例えば、ＤＡＰ１２細胞質ドメインを含む。ある態様において、該Ｌｙ４９−ＣＡＲおよび該細胞質活性化ドメインは、別の核酸分子、例えば、別のベクター、例えば、別のウイルスベクター、例えば、別のレンチウイルスベクターに配置される。

他の面において、本発明は、ここに記載するＬｙ４９−ＣＡＲを含む、細胞毒性細胞、例えば、天然に存在するもしくは存在しないＴ細胞、ＮＫ細胞または細胞毒性Ｔ細胞またはＮＫ細胞株に関する。ある態様において、細胞毒性細胞は、さらに、細胞質活性化ドメイン、例えば、ＤＡＰ１２細胞質ドメインを含む。

他の面において、本発明は、細胞毒性細胞に、ここに記載するＬｙ４９−ＣＡＲをコードする配列を含む核酸を導入することを含む、ここに記載するＬｙ４９−ＣＡＲを含む細胞毒性細胞を製造する方法に関する。

他の面において、本発明は、ここに記載するＬｙ４９−ＣＡＲを細胞毒性細胞に形成することを含む、ここに記載するＬｙ４９−ＣＡＲを含む細胞を製造する方法に関する。

他の面において、本発明は、哺乳動物に有効量のここに記載する細胞、例えば、ここに記載するＬｙ４９−ＣＡＲを含む細胞を投与することを含む、対象を処置する方法、例えば、哺乳動物における抗腫瘍免疫を提供する方法に関する。

他の面において、本発明は、抗原結合ドメインを含む第一の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体および抗原結合ドメインを含む第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体を含む、細胞、例えば細胞毒性細胞に関し、ここで、(ｉ)該第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方の抗原結合ドメインは軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含まないか、(ii)該第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はｓｃＦｖ以外であるか、(iii)細胞表面に提示されるとき、該第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるときより少なく互いに結合するか、(iv)細胞表面に提示されるとき、該第一の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の抗原結合ドメインのその同族抗原への結合が該第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の存在により実質的に低減されないか、(ｖ)該第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、例えば、フィブロネクチンIII型抗体様分子を含む、(vi)該第一および該第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、例えば、フィブロネクチンIII型抗体様分子を含むか、(vii)該第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はナノボディを含むか、そして(viii)該第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はラクダ科ＶＨＨドメインを含む。ある態様において、該細胞はＴ細胞である。ある態様において、該細胞はＮＫ細胞である。ある態様において、該細胞は、ＮＫ細胞株由来、例えば、ＮＫ９２である。ある態様において、該第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方はＴＣＡＲである。ある態様において、該第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の両者はＴＣＡＲである。ある態様において、該第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方はＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲである。ある態様において、該第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の両者はＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲである。ある態様において、該第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方の抗原結合ドメインは軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含まない。ある態様において、細胞表面に提示されるとき、該第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるときより少なく互いに結合する。ある態様において、細胞表面に提示されるとき、該第一の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の抗原結合ドメインのその同族抗原への結合が該第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の存在により実質的に低減されない。ある態様において、該第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、例えば、フィブロネクチンIII型抗体様分子を含む。ある態様において、該第一該第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、例えば、フィブロネクチンIII型抗体様分子を含む。ある態様において、該第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はナノボディを含む。ある態様において、該第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はラクダ科ＶＨＨドメインを含む。ある態様において、本発明は、ここに記載する抗原結合ドメインを含む第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体をコードする配列を含む、核酸、例えば、精製されたまたは天然に存在しない、核酸を含む。ある態様において、本発明は、細胞にここに記載する核酸を導入することを含む、ここに記載する細胞を製造する方法を含む。ある態様において、本発明は、ここに記載する第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体を細胞毒性細胞に形成することを含む、ここに記載する細胞を製造する方法を含む。ある態様において、本発明は、哺乳動物に、有効量のここに記載する細胞を投与することを含む、対象を処置する方法、例えば、哺乳動物における抗腫瘍免疫を提供する方法に関する。

他の面において、本発明は、ここに記載する細胞または核酸を含む、キットに関する。

他の面において、本発明は、ＫＩＲ−ＣＡＲ(キラー細胞免疫グロブリン受容体様−キメラ抗原受容体)をコードする単離核酸配列に関し、ここで、単離核酸配列は、抗原結合ドメインおよびＫＩＲの核酸配列またはそのフラグメントを含む。ある態様において、抗原結合ドメインは、マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体およびそのフラグメントからなる群から選択される。ある態様において、フラグメントはＦａｂまたはｓｃＦｖである。ある態様において、抗原結合ドメインは、ここに、例えば、表４に、記載する抗原結合ドメインである。ある態様において、ＫＩＲは、活性化ＫＩＲ、阻害性ＫＩＲおよびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。ある態様において、少なくとも１ヒンジ領域が活性化ＫＩＲから除去されている。

他の面において、本発明は、抗原結合ドメインおよびＫＩＲまたはそのフラグメントを含む、単離ＫＩＲ−ＣＡＲ(キラー細胞免疫グロブリン様受容体−キメラ抗原受容体)に関する。ある態様において、抗原結合ドメインは、マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体およびそのフラグメントからなる群から選択される。ある態様において、フラグメントはＦａｂまたはｓｃＦｖである。ある態様において、抗原結合ドメインは、ここに、例えば、表４に、記載する抗原結合ドメインである。ある態様において、ＫＩＲは、活性化ＫＩＲ、阻害性ＫＩＲおよびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。ある態様において、少なくとも１ヒンジ領域が活性化ＫＩＲから除去されている。

他の面において、本発明は、少なくとも２ＫＩＲ−ＣＡＲを含む組成物に関し、ここで、第一ＫＩＲ−ＣＡＲは抗原結合ドメインおよび活性化ＫＩＲまたはそのフラグメントを含み、第二ＫＩＲ−ＣＡＲは抗原結合ドメインおよび阻害性ＫＩＲまたはそのフラグメントを含む。ある態様において、第一ＫＩＲ−ＣＡＲにおける抗原結合ドメインは、腫瘍に提示される抗原に特異的であり、例えば、ここに、例えば、表４に記載する抗原結合ドメインであり、第二ＫＩＲ−ＣＡＲにおける抗原結合ドメインは、正常細胞に提示される抗原に特異的である。

他の面において、本発明は、少なくとも２ＫＩＲ−ＣＡＲを含む遺伝子修飾したＴ細胞に関し、ここで、第一ＫＩＲ−ＣＡＲは抗原結合ドメインおよび活性化ＫＩＲまたはそのフラグメントを含み、第二ＫＩＲ−ＣＡＲは抗原結合ドメインおよび阻害性ＫＩＲまたはそのフラグメントを含む。ある態様において、第一ＫＩＲ−ＣＡＲにおける抗原結合ドメインは、腫瘍に提示される抗原に特異的であり、例えば、ここに、例えば、表４に記載する抗原結合ドメインであり、第二ＫＩＲ−ＣＡＲにおける抗原結合ドメインは、正常細胞に提示される抗原に特異的である。ある態様において、細胞はＴ細胞である。

他の面において、本発明は、哺乳動物に有効量の少なくとも２ＫＩＲ−ＣＡＲを含む細胞を投与することを含む、哺乳動物における抗腫瘍免疫を提供する方法に関し、ここで、第一ＫＩＲ−ＣＡＲは抗原結合ドメインおよび活性化ＫＩＲまたはそのフラグメントを含み、第二ＫＩＲ−ＣＡＲは抗原結合ドメインおよび阻害性ＫＩＲまたはそのフラグメントを含む。ある態様において、第一ＫＩＲ−ＣＡＲにおける抗原結合ドメインは、腫瘍に提示される抗原に特異的であり、例えば、ここに、例えば、表４に記載する抗原結合ドメインであり、第二ＫＩＲ−ＣＡＲにおける抗原結合ドメインは、正常細胞に提示される抗原に特異的であり、それにより、細胞の標的外活性を制御する。ある態様において、細胞はＴ細胞である。

他の面において、本発明は、哺乳動物に有効量の少なくとも２ＫＩＲ−ＣＡＲを含む細胞を投与することを含む、腫瘍抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する疾患(例えば、増殖性疾患、前癌状態および腫瘍抗原の発現と関係する非癌徴候)を有する対象を処置する方法に関し、ここで、第一ＫＩＲ−ＣＡＲは抗原結合ドメインおよび活性化ＫＩＲまたはそのフラグメントを含み、第二ＫＩＲ−ＣＡＲは抗原結合ドメインおよび阻害性ＫＩＲまたはそのフラグメントを含む。ある態様において、第一ＫＩＲ−ＣＡＲは、ここに、例えば、表４に、記載する抗原結合ドメインを含む。

特記しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により共通して理解される意味を有する。本発明の実施または試験にここに記載するものに類似するまたは同等な方法および材料を使用できるが、適当な方法および材料を下に記載する。ここに記載するすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体を引用により本明細書に包含させる。加えて材料、方法および実施例は専ら例示を意図するものであり、限定の意図はない。タイトル、サブタイトルまたは番号または文字表記、例えば、(ａ)、(ｂ)、(ｉ)などは、読みやすくするためだけのものである。本明細書におけるタイトルまたは番号または文字表記の使用は、当該工程または要素がアルファベット順で実施すべきであることまたは工程もしくは要素が必ず互いに分離していることを必要とするものではない。本発明の他の特性、目的および利点は、明細書および図面ならびに特許請求の範囲から明らかである。

本発明の他の特性、目的および利益は、明細書および図面ならびに特許請求の範囲から明らかである。

図面の簡単な説明
好ましい本発明の態様の次の詳細な記載は、添付する図面と組み合わせてみたとき、よりよく理解される。本発明の説明の目的で、現時点で好ましい態様を図に示す。しかしながら、本発明は図面に示す厳密な配置および装置に限定されないことは理解されるべきである。

図１Ａおよび１Ｂを含む図１は、天然に存在する阻害性および活性化ＫＩＲ(図１Ａ)およびｓｃＦｖベースの活性化ＫＩＲ−ＣＡＲ(図１Ｂ)の構造を示す、一連の概略図である。

図２は、ＤＡＰ１２シグナル伝達分子と組み合わせて活性化ＫＩＲベースのＣＡＲの送達に使用するレンチウイルスベクターの概概略図である。

図３は、メソテリン特異的ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲが初代ヒトＴ細胞の表面に効率的に発現され得ることを示す図である。ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８マイクロビーズで刺激し、記載するＣＡＲを形質導入するかまたは偽遺伝子導入し、エクスビボで拡張させた。発現は、ビオチニル化ヤギ抗マウスＦ(ａｂ)２特異的ポリクローナルＩｇＧ(Jackson Immunologics)と続くストレプトアビジン−ＰＥでの染色を使用して検出した。

図４は、ＳＳ１ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲを発現するＴ細胞が、メソテリンリガンドを発現するように操作した標的Ｋ５６２細胞(ＫＴ−ｍｅｓｏ)に細胞毒性活性を示すことを示す。ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８マイクロビーズで刺激し、記載するＣＡＲを形質導入するかまたは偽遺伝子導入し、エクスビボで拡張させた。１０^５のメソテリンを発現するＣＦＳＥ標識Ｋ５６２細胞(ＫＴ−ｍｅｓｏ)または野生型対照Ｋ５６２を、種々の比のＣＡＲ発現Ｔ細胞と、１６時間、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。Ｋ５６２標的細胞を、次いで、countbrightビーズおよび生存能染色(７ＡＡＤ)を使用して、フローサイトメトリーにより数えた。溶解したＫ５６２細胞のパーセンテージ(溶解パーセント)を、エフェクターＴ細胞を含まない一夜培養後に残っている生存可能Ｋ５６２数からエフェクターＴ細胞とのインキュベーション後に残っている生存可能標的細胞数を減じ、次いでエフェクターＴ細胞を含まない一夜培養後に残っている生存可能Ｋ５６２数で除することにより計算した。

図５Ａおよび５Ｂを含む図５は、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジが除かれた活性化ＫＩＲＣＡＲ(ＫＩＲ２ＳＣＡＲ)を示す一連の概略図である。図５Ａに示すＴＣＲ活性化の動態隔離モデルに基づき、メソテリン特異的ＳＳ１ＫＩＲＣＡＲは、適切な隔離を可能にするには長すぎるヒンジを有することと考えられる。それゆえに、メソテリン特異的ＫＩＲＣＡＲヒンジを短くすることは、機能を改善すると考えられる。図５Ｂは、ヒンジとしてのＫＩＲ２ＤＳ２からの２Ｉｇ様ドメインを伴わず、ＳＳ１ｓｃＦｖがＫＩＲ膜貫通ドメインに融合したことを示す模式図である。

図６Ａおよび６Ｂを含む図６は、完全長野生型ＫＩＲ２ＤＳ２へのＳＳ１ｓｃＦｖの融合により形成したＣＡＲと比較して、ＳＳ１ｓｃＦｖベースのＫＩＲＳ２ＣＡＲがメソテリン発現標的細胞に増強された細胞溶解性活性を示す、一連の画像である。初代ヒトＴ細胞を、ＣＤ３／２８マイクロビーズで刺激し、続いてＳＳ１−ＫＩＲ２ＤＳ２活性化ＫＩＲ−ＣＡＲ、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２活性化ＫＩＲＣＡＲ、ＳＳ１ゼータＣＡＲのいずれかでレンチウイルス形質導入した。偽非形質導入Ｔ細胞(ＮＴＤ)を対照として使用した。Ｔ細胞を、対数増殖期の最後まで拡張させた。ＳＳ１特異的ＣＡＲの表面発現を、図６Ａに示すように、ビオチニル化ヤギ抗マウスＦ(ａｂ)２特異的ポリクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーと、続くストレプトアビジン−ＰＥ検出により決定した。図６Ｂに示すのは、メソテリン存在下または非存在下かつＣＦＳＥで染色したＫ５６２標的細胞を、示すように図６Ａで特徴付けしたエフェクターＴ細胞と、１０：１〜１：１の範囲の種々のエフェクターＴ細胞対標的比を使用して、混合した。標的Ｋ５６２細胞溶解を、図４について記載するように、生存可能ＣＦＳＥ＋細胞の％を決定するために、フローサイトメトリーを使用して評価した。示すデータは、エフェクター細胞非存在下の標的細胞と比較した、標的細胞溶解％計算値である。

図７Ａおよび７Ｂを含む図７は、ＣＤ１９ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲとＳＳ１ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲの共発現を示す一連の画像である。ＪｕｒｋａｔＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞、記載するＫＩＲＣＡＲまたは非形質導入(ＮＤＴ)で形質導入し、記載するように、ＣＤ１９およびメソテリン抗原の存在下または非存在下、標的細胞と１：１で混合した。結果は、Ｊｕｒｋａｔと標的細胞の混合２４時間後のＧＦＰ発現を示す(図７Ａ)。図７Ｂは、メソテリン−Ｆｃ融合タンパク質およびＦＭＣ６３抗ＣＤ１９ｓｃＦｖイディオタイプに特異的なモノクローナル抗体での染色により決定して、メソテリンおよびＣＤ１９イディオタイプの表面発現を示す。

図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃを含む図８は、メソテリンを標的とする活性化ＫＩＲベースのＣＡＲまたはＴＣＲゼータベースのＣＡＲの両者との野生型ＰＤ−１の共発現を示す一連の画像である。初代ヒトＴ細胞をＣＤ３／２８マイクロビーズで刺激し、続いてＳＳ１−ＫＩＲＳ２活性化ＫＩＲＣＡＲまたはＳＳ１ゼータＣＡＲでレンチウイルス形質導入した。偽非形質導入細胞(ＮＴＤ)を陰性対照として使用した。Ｔ細胞を９日間拡張させ、表面ＣＡＲ発現を、メソテリン−Ｆｃ、続くＰＥにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＦｃ特異的抗体での染色により決定した(図８Ａ)。Ｋ５６２細胞株(野生型[ｗｔ]、メソテリン発現[ｍｅｓｏ]またはメソテリンおよびＰＤ−Ｌ１共発現[ｍｅｓｏ−ＰＤＬ１])をＣＡＫ１抗メソテリン特異的モノクローナル抗体で染色して、標的におけるメソテリン発現を確認した(図８Ｂ)。図８Ａに示すように形質導入した初代ヒトＴ細胞を、ＢＴＸＥＣＭ８３０エレクトロポレーター(ＰＤ１＋)または偽遺伝子導入(ＰＤ１−)を使用して１０μgの野生型ＰＤ１をコードするインビトロ転写ＲＮＡに電気穿孔した。ＰＤ−１の表面発現を、ＡＰＣにコンジュゲートした抗ＰＤ１モノクローナルを使用して発現させた(図８Ｃ)。

図９は、共発現野生型ＰＤ−１と、メソテリンを標的とする活性化ＫＩＲベースのＣＡＲおよびＴＣＲゼータベースのＣＡＲの両者の組み合わせが、メソテリン特異的活性化ＫＩＲ−ＣＡＲ細胞毒性のＰＤ−１リガンド１(ＰＤＬ−１)依存的阻害に至ることを示す図である。初代ヒトＴ細胞をＣＤ３／２８マイクロビーズで刺激し、続いて、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２活性化ＫＩＲＣＡＲ、ＳＳ１ゼータＣＡＲまたは偽遺伝子導入(ＮＴＤ)でレンチウイルス形質導入した。Ｔ細胞を、９日間拡張させ、続いてＢＴＸＥＣＭ８３０エレクトロポレーター(ＰＤ１＋)または偽遺伝子導入(ＰＤ１−)を使用する１０μgの野生型ＰＤ１をコードするインビトロ転写ＲＮＡで５×１０^６Ｔ細胞をエレクトロポレーションした。ＳＳ１特異的ＣＡＲの表面発現およびＰＤ−１を図８に示すように決定した。無メソテリンまたはＰＤＬ−１存在下もしくは非存在下でメソテリンを発現するＫ５６２標的細胞を、示すように、３０：１〜１：１の種々のエフェクターＴ細胞対標的比を使用して、示すように異なるＴ細胞条件で混合した。標的Ｋ５６２細胞溶解を、４時間のインキュベーション後残存する生存可能細胞を定量するためのｃａｌｃｅｉｎＡＭ色素法を使用して評価した。示すデータは、エフェクター細胞非存在下の標的細胞に対して比較した標的細胞溶解％の計算値である。

図１０は、共刺激性ドメイン(ＳＳ１−ｚ、ＳＳ１−２８ｚまたはＳＳ１−ＢＢｚ)存在下または非存在下、メソテリン特異的活性化ＫＩＲベースのＣＡＲ(ＳＳ１−ＫＩＲＳ２)またはＴＣＲゼータベースのＣＡＲを発現するドナーからのＴ細胞によるインターフェロンガンマ(ＩＦＮ−γ)およびインターロイキン−２産物を示す画像である。初代ヒトＴ細胞を刺激し、続いて示す活性化ＫＩＲＣＡＲまたはＴＣＲゼータベースのＣＡＲでレンチウイルス形質導入した。発現後、形質導入Ｔ細胞を、２：１比でＫ５６２(Ｋｗｔ)またはＫ５６２−メソテリン細胞(Ｋｍｅｓｏ)と混合した。サイトカイン濃度を、刺激２４時間後、複数の非依存的ドナーにおいて示されたサイトカインに対するＥＬＩＳＡにより上清において決定した。反復測定ＡＮＯＶＡは、ＩＦＮ−γ(ｐ＝０.００２)およびＩＬ−２(ｐ＝０.０１５６)の有意なＣＡＲ効果を示した。ＩＦＮ−γについてＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２(ＳＳ１ＫＩＲ)対偽(事後対応のあるｔ検定、ｐ＝０.０１６２)。ＩＬ−２についてＳＳ１−ＫＩＲ対ＳＳ１−２８ｚ(事後対応のあるｔ検定、ｐ＝０.０４０８)。

図１１は、複合ｌｕｍｉｎｅｘベースの免疫アッセイにより評価した上清におけるサイトカイン濃度のヒートマップである(Cytokine Human 10-Plex Panel, Life Technologies)。各サイトカインに対する最低濃度に対して、ドナーおよび条件を標準化した後の相対的濃度のヒートマップを、Ｒ総計ソフトウエアに含まれたヒートマップパッケージを使用して作成した。

図１２Ａ〜１２Ｂを含む図１２は、強力な細胞毒性活性を有するメソテリン特異的ＫＩＲベースのキメラ抗原受容体(ＫＩＲ−ＣＡＲ)操作Ｔ細胞の構築を記載する。初代ヒトＴ細胞をＣＤ３／２８マイクロビーズで刺激し、続いてＧＦＰおよびｄｓＲｅｄ(対照)またはＤＡＰ１２およびｄｓＲｅｄ(ＤＡＰ１２)を発現するレンチウイルスベクターで形質導入した。細胞を、対数増殖期の最後までエクスビボで拡張させた。各形質導入集団からの５×１０^６Ｔ細胞を、ＢＴＸＥＣＭ８３０エレクトロポレーターを使用して１０μgのＳＳ１−ＫＩＲＳ２をコードするインビトロ転写ＲＮＡで電気穿孔した。ｄｓＲｅｄおよびＳＳ１−ＫＩＲＳ２の両者の発現を、ビオチニル化ヤギ抗マウスＦ(ａｂ)２特異的ポリクローナル抗体、続くストレプトアビジン−ＰＥを使用して、検出したＳＳ１−ＫＩＲＳ２を用いるフローサイトメトリーで評価した。図１２Ａの上部パネルはＴ細胞発現ｄｓＲｅｄの同定のためのゲーティング戦略を示し、これを次いでパネルの株に示すようにＳＳ１−ＫＩＲＳ２発現で分析した。図１２Ｂは、４時間^５１Ｃｒ放出アッセイを使用して評価した、野生型Ｋ５６２細胞(Ｋ５６２−ｗｔ)またはメソテリンを発現するＫ５６２細胞(Ｋ５６２−メソテリン)に対する細胞毒性に介在する、図１２Ａで特徴付けした細胞の能力を示す。

図１３は、内因性ＴＣＲの発現がＳＳ１−ＫＩＲＳ２およびＤＡＰ１２発現に影響されないことを示す。５×１０^６初代ヒトＴ細胞を、ＢＴＸＥＣＭ８３０エレクトロポレーターを使用して１０μgのＳＳ１−ＫＩＲＳ２をコードするインビトロ転写ＲＮＡまたは偽遺伝子導入で電気穿孔した。一夜インキュベーション後、遺伝子導入Ｔ細胞を、ビオチニル化ヤギ抗マウスＦ(ａｂ)２特異的ポリクローナル抗体、続くストレプトアビジン−ＰＥを使用するＳＳ１−ＫＩＲＳ２の発現について染色した。Ｖβ１３.１の発現を、ＴＣＲのこのＶβ鎖に特異的なＰＥコンジュゲートモノクローナル抗体を使用して評価した。

図１４は、メソテリン特異的ＫＩＲベースのＣＡＲ(ＳＳ１−ＫＩＲＳ２)がＴ細胞増殖を刺激する能力は、抗原依存性であるが、さらなるＣＤ２８共刺激に非依存的であることを示す。初代ヒトＴ細胞をＣＤ３／２８マイクロビーズで刺激し、続いてＳＳ１−ＫＩＲＳ２およびＤＡＰ１２またはメソテリン特異的ＴＣＲゼータＣＡＲ(ＳＳ１ゼータ)でレンチウイルス形質導入した。偽非形質導入細胞(ＮＴＤ)を陰性対照として使用した。無メソテリン(Ｋ５６２ｗｔ)またはメソテリンを発現する(Ｋ５６２−メソテリン)Ｋ５６２標的細胞を、２：１比のエフェクターＴ細胞対標的細胞で、示す種々のＴ細胞条件で混合した。Ｋ５６２−メソテリンで刺激したＴ細胞を、モノクローナル抗ＣＤ２８アゴニスト抗体(クローン９.３)無しまたは１μg／mL存在下の条件にさらに分けた。生存可能Ｔ細胞数を、記載する時点でビーズベースの計数を使用するフローサイトメトリーにより計数し、抗原刺激後倍加する集団数を計算した。

図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄおよび１５Ｅを含む図１５は、メソテリン特異的ＫＩＲ−ＣＡＲ修飾Ｔ細胞が、ＣＤ２８またはＣＤ１３７(４−１ＢＢ)共刺激性ドメインを担持する第二世代ＴＣＲ−ζベースのＣＡＲと比較して、インビボで増強された抗腫瘍活性を示すことを示す。図１５Ａは、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ_ｃ ^−／−(ＮＳＧ)マウスに、２×１０^６メソテリンを発現する中皮腫由来細胞(ＥＭ−ｍｅｓｏ細胞)を皮下移植した実験を示す。腫瘍移植２０日後、各動物に、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８スティミュレータービーズで刺激し、続いて共刺激性ドメイン(ＳＳ１−ζ、ＳＳ１−ＢＢζおよびＳＳ１−２８ζ)存在下または非存在下の一連のＣＤ３ζベースのＣＡＲまたはメソテリン特異的ＫＩＲベースのＣＡＲ、ＤＡＰ１２を有するＳＳ１−ＫＩＲＳ２でレンチウイルス形質導入した、５×１０^６Ｔ細胞を静脈内注射した。偽遺伝子導入Ｔ細胞(ＮＴＤ)を対照として使用した。腫瘍体積を、記載する時間にカリパスで測定した(ｎ＝７マウス／群)。図１５Ｂは、ＫＩＲ−ＣＡＲのインビボ活性が、血液、脾臓または腫瘍におけるＴ細胞生着と非依存的であることを示す。ヒトＣＤ４５＋Ｔ細胞頻度を、実験終了時フローサイトメトリーにより評価し、データを、血液、脾臓および腫瘍消化における総生存可能細胞パーセンテージとしてあらわす。図１５Ｃは、ＳＳ１−２８ζおよびＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２ＣＡＲＴ細胞処置群でＣＤ３＋ＴＩＬの同等な頻度が観察されることを示す。図１５Ａに示すのと同じモデルを使用した。３０日目(ＣＡＲＴ注入１０日後)の腫瘍におけるＣＤ３＋ヒトリンパ球頻度を、フローサイトメトリーで評価した。図１５Ｄは、ＤＡＰ１２修飾Ｔ細胞が、腫瘍根絶にメソテリン特異的ＫＩＲベースのＣＡＲを必要とすることを示す。図１５Ａに示すのと同じモデルを使用した。４００万Ｔ細胞発現ＤＡＰ１２およびｄｓＲｅｄ(ＤＡＰ１２)、ＳＳ１−２８ｚまたはＳＳ１−ＫＩＲＳ２およびＤＡＰ１２(ＳＳ１−ＫＩＲＳ２)を２０日目に静脈内中注射し、腫瘍体積を経時的にカリパス測定により評価した。矢印は、機能的および表現型分析に使用したＴＩＬ単離の時間を示す。図１５Ｅは、図１５Ｄに記載するマウスから単離したＴＩＬの抗原特異的細胞毒性活性を示す。抗原特異的細胞毒性を、ホタルルシフェラーゼ発現ＥＭ−ｍｅｓｏ細胞またはＥＭｐ細胞(メソテリン発現を欠く親ＥＭ細胞)と、記載するＥ：Ｔ比で１８時間共培養することにより評価した。

図１６Ａおよび１６Ｂを含む図１６は、ＣＤ１９特異性を有するＫＩＲベースのＣＡＲが、抗原特異的標的細胞毒性を誘発できることを示す。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ活性化後、Ｔ細胞を、ＦＭＣ６３由来ｓｃＦｖが完全長ＫＩＲ２ＤＳ２と融合しているＣＤ１９特異的ＫＩＲベースのＣＡＲ(ＣＤ１９−ＫＩＲ２ＤＳ２)またはＦＭＣ６３ｓｃＦｖを、短リンカー[Ｇｌｙ]_４−Ｓｅｒリンカーを介してＫＩＲ２ＤＳ２の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと融合することにより産生したＫＩＲベースのＣＡＲ(ＣＤ１９−ＫＩＲＳ２)と共に、バイシストロニックレンチウイルスベクター発現ＤＡＰ１２で形質導入した。形質導入Ｔ細胞を対数増殖期の最後まで培養し、ＣＤ１９特異的ＫＩＲベースのＣＡＲの発現を、ビオチニル化ヤギ抗マウスＦ(ａｂ)２ポリクローナル抗体、続くＳＡ−ＰＥを使用するフローサイトメトリーにより評価した。ＣＤ１９発現をする(Ｋ５６２−ＣＤ１９)またはしない(Ｋ５６２−ｗｔ)^５１Ｃｒ標識Ｋ５６２標的細胞を、種々のＴ細胞対標的細胞(Ｅ：Ｔ比)比で混合した。細胞毒性を、４時間で上清から放出される^５１Ｃｒの画分の測定により決定した。偽遺伝子導入(ＮＴＤ)またはＣＤ１９に特異的なＣＤ３ζベースのＣＡＲで形質導入した(ＣＤ１９−ｚ)対照Ｔ細胞も、それぞれ、陰性および陽性対照として含ませた。

図１７Ａおよび１７Ｂを含む図１７は、ＣＤ１９−ＫＩＲＳ２インビボ活性を示す。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ_ｃ ^−／−(ＮＳＧ)マウスに、ＣＤ１９を発現する白血病細胞株である１００万Ｎａｌｍ−６ＣＢＧ腫瘍細胞を０日目に尾静脈注射により静脈内に移植した。Ｔ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８スティミュレータービーズで刺激し、続いて１日目に共刺激性ドメイン(ＣＤ１９ｚ、１９ＢＢｚ)存在下または非存在下一連のＣＤ１９特異的ＣＤ３ζベースのＣＡＲまたはＣＤ１９特異的ＫＩＲベースのＣＡＲ、ＤＡＰ１２を有するＣＤ１９−ＫＩＲＳ２(１９ＫＩＲＳ２)でレンチウイルス形質導入した。偽非形質導入Ｔ細胞(ＮＴＤ)を対照として使用した。Ｔ細胞を、対数増殖期の最後までエクスビボで拡張させ、白血病細胞株注射５日後、マウスあたり２００万ＣＡＲＴ細胞で静脈内注射した。腫瘍負荷を生物発光造影により評価した。５動物を、各Ｔ細胞条件で分析した。図１７Ａは、個々の動物の５日目(Ｔ細胞注射前のベースライン)および白血病細胞移植１５日後の個々の生物発光光子束を示す。図１７Ｂは、各処置群の経時的な中央全流束を示す。

図１８は、メソテリンを有するＮＫｐ４６ベースのＮＣＲＣＡＲが、抗原特異的細胞毒性を特に誘発することを示す。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ活性化後、Ｔ細胞を、ＤＡＰ１２およびＳＳ１−ＫＩＲＳ２(対照)、またはＦｃεＲγおよびメソテリン特異的ＮＫｐ４６ベースのＣＡＲ(ＳＳ１−ＮＫｐ４６)またはＦｃεＲγおよび天然ＮＫｐ４６細胞外ドメインが切断されているメソテリン特異的ＮＫｐ４６ＣＡＲ(ＳＳ１−ＴＮＫｐ４６)を発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターで形質導入した。メソテリン特異的ＣＡＲの発現を、図１８Ａに示すように、ビオチニル化ヤギ抗マウスＦ(ａｂ)２ポリクローナル抗体、続くＳＡ−ＰＥを使用するフローサイトメトリーにより評価した。Ｔ細胞を、種々のエフェクターＴ細胞対標的Ｋ５６２細胞比(Ｅ：Ｔ比)でメソテリンを発現する^５１Ｃｒ標識Ｋ５６２標的細胞と混合した。細胞毒性を、図１８Ｂに示すように、自発的放出と比較した４時間で上清から放出される^５１Ｃｒの画分の測定により決定した。

図１９は、図２１〜２３に示す実験で使用する受容体の概略図を示す。

図２０は、ＫＩＲ２ＤＬ３リガンドＨＬＡ−Ｃｗを発現するＫ５６２−ｍｅｓｏ細胞株の産生および特徴づけを示す。Ｋ５６２細胞(Ｋ５６２)またはＫ５６２細胞発現メソテリン(Ｋ５６２−ｍｅｓｏ)をＨＬＡ−Ｃｗ３アレルで形質導入し、続いて蛍光活性化セルソーティングをして、メソテリンを発現する(Ｋ５６２−ｍｅｓｏ−ＨＬＡＣｗ)またはしない(Ｋ５６２−ＨＬＡＣｗ)Ｋ５６２細胞発現ＨＬＡ−Ｃｗを得た。ＨＬＡ−Ｃｗ３発現を、ＨＬＡ−Ａ、ＢおよびＣアレル(クローンＷ６／３２)を認識するＡＰＣコンジュゲートモノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーにより評価した。

図２１は、初代ヒトＴ細胞におけるＳＳ１−ＫＩＲＳ２およびＫＩＲ２ＤＬ３の共発現を示す。初代ヒトＴ細胞をＣＤ３／２８マイクロビーズで刺激し、続いて野生型ＫＩＲ２ＤＬ３と共にＳＳ１−ＫＩＲＳ２およびＤＡＰ１２(ＳＳ１−ＫＩＲＳ２)または偽遺伝子導入(ＮＴＤ)でレンチウイルス形質導入した。Ｔ細胞を、対数増殖期の最後まで拡張させた。表面メソテリン特異的ＣＡＲの発現およびＫＩＲ２ＤＬ３を、メソテリン−Ｆｃで染色し、続いてＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃおよびＫＩＲ２ＤＬ３外部ドメインに対するモノクローナル抗体により決定した。

図２２は、ＫＩＲＣＡＲと共発現させたＫＩＲ２ＤＬ３が、標的細胞のＨＬＡ−Ｃｗ存在下、抗原特異的細胞毒性を抑制できることを示す。図２１い記載のように産生し、特徴づけしたＴ細胞を、図２２に記載のように産生し、産生した^５１Ｃｒ標的標的Ｋ５６２細胞と混合した。細胞毒性を、エフェクター細胞非存在下の標的細胞と比較した、４時間で上清から放出される^５１Ｃｒの画分の測定により決定した。

図２３は、図２４に示す実験に使用する受容体の概略図を示す。

図２４は、各受容体各々の結合特異性を維持しながら、Ｔ細胞表面上の２ｓｃＦｖベースのキメラ受容体を共発現することができないことを示す。ＪｕｒｋａｔＴ細胞を、ＳＳ１−ＫＩＲ２ＤＬ３をコードするレンチウイルスベクターを使用して形質導入した。これらの細胞を、続いて、種々のベクター希釈で、ＣＤ１９−ＫＩＲ２ＤＳ２をコードする第二レンチウイルスベクターで形質導入した。ＳＳ１特異的ｓｃＦｖの発現を、メソテリン−Ｆｃ、続くＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃを使用して評価した。ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖ発現を、ＦＭＣ６３イディオタイプに特異的なＰＥコンジュゲートモノクローナル抗体を使用して評価した。

図２５は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲの発現がまたＳＳ１ゼータ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合ＣＡＲを共発現する細胞表面のメソテリン結合部位の発現も減少させることを示す。初代ヒトＴ細胞をＣＤ３／２８マイクロビーズで刺激し、続いてＣ末端ｍＣｈｅｒｒｙ融合(ＳＳ１ｚ−ｍＣｈ)またはＦＭＣ６３由来ＣＤ１９特異的４１ＢＢゼータＣＡＲ(１９ｂｂｚ)を単独でまたは組み合わせて担持するＳＳ１ｓｃＦｖゼータＣＡＲでレンチウイルス形質導入した。偽遺伝子導入細胞を対照として使用した。Ｔ細胞を、対数増殖期の最後まで拡張させた、およびｄｓＲｅｄならびに表面ＣＡＲ発現を、メソテリン−Ｆｃ、続くＦＩＴＣにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＦｃ特異的ポリクローナル抗体での染色後、フローサイトメトリーにより決定した。

図２６は、ＳＳ１ｓｃＦｖの結合部位の相互排他的発現がＦＭＣ６３ｓｃＦｖに独特でないことを示す図である。初代ヒトＴ細胞をＣＤ３／２８マイクロビーズで刺激し、続いてＳＳ１ｓｃＦｖゼータＣＡＲまたは種々のＣＤ１９特異的４１ＢＢゼータＣＡＲ(交互のＶＨおよびＶＬ配向[Ｈ２ＬおよびＬ２Ｈ]を有する１９ＢＢｚ[ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ、２１４ｄｓｃＦｖまたはＢＬ２２ｓｃＦｖＣＡＲ)でレンチウイルス形質導入した。ＮＴＤは、染色対照として使用する偽遺伝子導入細胞をいう。さらに、別のセットのＴ細胞を、上記のようにＳＳ１ｓｃＦｖゼータＣＡＲおよび異なるＣＤ１９特異的ＣＡＲと共形質導入した。Ｔ細胞を対数増殖期の最後まで拡張させ、表面ＣＡＲ発現を、ビオチニル化タンパク質Ｌ(カッパ軽鎖認識)、続くストレプトアビジンＡＰＣ染色と同時の、メソテリン−Ｆｃ、続くＰＥにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＦｃ特異的ポリクローナル抗体で決定した。共形質導入細胞は、ＦＭＣ６３ベースのＣＡＲで見られる相互排他的発現が他のｓｃＦｖ−ＣＡＲでも観察される。

図２７Ａおよび２７Ｂを含む図２７は、２ｓｃＦｖ分子が細胞表面に発現されたときのｓｃＦｖ結合喪失の推定機構(図２７Ａ)およびラクダ科単一ＶＨＨドメインベースのＣＡＲがｓｃＦｖベースのＣＡＲと組み合わせてＴ細胞表面に発現されたときのこの相互作用の推定回避を示す。

図２８は、ラクダ科単一ＶＨＨドメインベースのＣＡＲが、明らかな受容体相互作用なしでｓｃＦｖベースのＣＡＲと組み合わせてＴ細胞表面に発現できることを示す。ＮＦＡＴ依存性プロモーター(ＮＦ−ＧＦＰ)下のＪｕｒｋａｔＴ細胞発現ＧＦＰを、メソテリン特異的活性化ＣＡＲ(ＳＳ１−ＣＡＲ)、ＣＤ１９特異的活性化(１９−ＣＡＲ)またはＥＧＦＲに特異的なラクダ科ＶＨＨドメインを使用して産生したＣＡＲ(ＶＨＨ−ＣＡＲ)で形質導入した。活性化ＣＡＲで形質導入後、細胞を、ＣＤ１９(１９−ＰＤ１)を認識するさらなる阻害性ＣＡＲで形質導入して、活性化および阻害性ＣＡＲ(ＳＳ１＋１９ＰＤ１、１９＋１９ＰＤ１またはＶＨＨ＋１９ＰＤ１)の両者を共発現する細胞を産生した。形質導入ＪｕｒｋａｔＴ細胞を、１)全標的抗原を欠く(Ｋ５６２)、２)メソテリン(Ｋ−ｍｅｓｏ)、ＣＤ１９(Ｋ−１９)またはＥＧＦＲ(Ａ４３１)のみを発現する、３)ＥＧＦＲおよびメソテリン(Ａ４３１−メソテリン)またはＣＤ１９(Ａ４３１−ＣＤ１９)の組み合わせを発現するまたは４)ＣＤ１９およびメソテリンの組み合わせを発現する(Ｋ−１９／ｍｅｓｏ)いずれかである種々の細胞株と２４時間共培養した。スティミュレーター細胞無し(ｎｏｓｔｉｍ)または１μg／mLのＯＫＴ３を伴うＫ５６２(ＯＫＴ３)を含むさらなる条件も、それぞれ、ＮＦＡＴ活性化の陰性および陽性対照として包含させた。ＮＦＡＴ活性化のマーカーとしてのＧＦＰ発現を、フローサイトメトリーにより評価した。

図２９は、ＫＩＲ２ＤＳ２配列アノテーションを示す。図２９に提供するヌクレオチド配列は、配列番号３４２と命名する。図２９に提供するアミノ酸配列は、配列番号３４３と命名する。

図３０は、ＫＩＲ２ＤＬ３配列アノテーションを示す。図３０に提供するヌクレオチド配列は配列番号３４４と命名する。図３０に提供するアミノ酸配列は配列番号３４５と命名する。

図３１は、ＮＫｐ４６配列アノテーションを示す。図３１に提供するヌクレオチド配列は配列番号３４６と命名する。図３１に提供するアミノ酸配列は番号３４７と命名する。

図３２は、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２配列アノテーションを示す。図３２に提供するヌクレオチド配列は配列番号３４８と命名する。図３２に提供するアミノ酸配列は番号３４９と命名する。

図３３は、ＳＳ１−ＫＩＲ２ＤＳ２配列アノテーションを示す。図３３に提供するヌクレオチド配列は配列番号３５０と命名する。図３３に提供するアミノ酸配列は番号３５１と命名する。

図３４は、ＳＳ１−ｔＮＫｐ４６配列アノテーションを示す。図３４に提供するアミノ酸配列は番号３５２と命名する。図３４に提供するアミノ酸配列は番号３５３と命名する。

図３５は、ＳＳ１−ＫＩＲＬ３配列アノテーションを示す。図３５に提供するヌクレオチド配列は配列番号３５４と命名する。図３５に提供するアミノ酸配列は番号３５５と命名する。

図３６は、メソテリン特異的ＣＤ３ζおよびＫＩＲベースのＣＡＲが、メソテリンを発現する中皮腫由来細胞(ＥＭ−ｍｅｓｏ細胞)に対する類似する抗原特異的インビトロ細胞毒性を有することを示す。初代ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８スティミュレータービーズで刺激し、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２メソテリン特異的ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターで形質導入した。発現後、Ｔ細胞を、記載するエフェクター対標的(Ｅ：Ｔ)比で^５１Ｃｒ標識Ｋ５６２細胞発現ＥＭ−ｍｅｓｏと混合した。％溶解を決定した。

図３７は、２８ζ ＣＡＲＴ処置マウスからのＴＩＬが、メソテリンを発現する中皮腫由来細胞(ＥＭ−ｍｅｓｏ細胞)の刺激でＩＦＮγ分泌を喪失することを示す。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γｃ −／−(ＮＳＧ)マウスに、２×１０^６のＥＭ−ｍｅｓｏ細胞を皮下注射した。５×１０^６の記載するＣＡＲを形質導入した初代ヒトＴ細胞を、１６日にＩＶ注射した。ＣＡＲＴ細胞注入１８日後、ＴＩＬをＣＤ４５磁気ビーズで単離し、記載するエフェクター対標的(Ｅ：Ｔ)比でＥＭ−ｍｅｓｏと混合した。サイトカイン濃度を、ＥＬＩＳＡにより上清で決定した。

図３８は、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２Ｔ細胞がインビボで強固な抗腫瘍活性を仲介することを示す。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γｃ −／−(ＮＳＧ)マウスに、２×１０^６のメソテリンを発現する中皮腫由来細胞(ＥＭ−ｍｅｓｏ細胞)を皮下注射した。５×１０^６の記載するＣＡＲを形質導入した初代ヒトＴ細胞を２０日にＩＶ注射した。腫瘍体積を、記載する時間にカリパスにより測定した。

図３９Ａ、３９Ｂおよび３９Ｃを含む図３９は、メソテリン特異的ＣＡＲの構造を示す模式図である。図３９Ａは、メソテリン特異的多鎖ＫＩＲ−ＣＡＲである。図３９Ｂは、ＤＡＰ１２を含むメソテリン特異的単鎖ＫＩＲ−ＣＡＲである。図３９Ｃは、ＣＤ２８およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むメソテリン特異的ＣＡＲである。

図４０は、多鎖ＫＩＲＳ／ＤＡＰ１２および単鎖ＤＡＰ１２構築物を含む、メソテリンベースのＣＡＲ構築物のインビボ抗腫瘍活性を含む。

図４１は、フローサイトメトリー分析で検出した、ヒト初代Ｔ細胞のメソテリンベースのＫＩＲ−ＣＡＲの表面発現を示す。

図４２Ａおよび４２Ｂを含む図４２は、メソテリンを発現しない標的細胞(Ｋ５６２)(図４２Ａ)またはメソテリンを発現するように操作した標的細胞(Ｋ５６２−ｍｅｓｏ)(図４２Ｂ)に対するメソテリンベースのＫＩＲ−ＣＡＲの抗原特異的細胞毒性活性を示す。

図４３Ａおよび４３Ｂを含む図４３は、メソテリン発現標的細胞(Ｋ５６２−ｍｅｓｏ、黒色棒)またはメソテリンを発現しない対照標的細胞(Ｋ５６２、白抜き棒)存在下培養したときのメソテリンベースのＫＩＲ−ＣＡＲのサイトカイン産生を示す。図４３ＡはＩＦＮガンマ産生を示す；図４３ＢはＩＬ−２サイトカイン産生を示す。

図４４Ａ、４４Ｂ、４４Ｃ、４４Ｄおよび４４Ｅを含む図４４は、単一ベクターにおける種々の配置、例えば、Ｕ６制御ｓｈＲＮＡがＥＦ１アルファ制御ＣＡＲコード化要素の上流または下流にある場合を示す。図４４Ａおよび４４Ｂに記載する構築物例において、転写は、同じ方向のＵ６およびＥＦ１アルファプロモーターにより生じる。図４４Ｃおよび４４Ｄにおける構築物例において、転写は、異なる方向のＵ６およびＥＦ１アルファプロモーターにより生じる。図４４Ｅにおいて、ｓｈＲＮＡ(および対応するＵ６プロモーター)は第一ベクターにあり、ＣＡＲ(および対応するＥＦ１アルファプロモーター)は第二ベクターにある。

図４５は、例示的２ＲＣＡＲ配置の構造を記載する。抗原結合メンバーは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよびスイッチドメインを含む。細胞内結合メンバーはスイッチドメイン、共刺激性シグナル伝達ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む。２配置は、ここに記載する第一および第二のスイッチドメインが、抗原結合メンバーおよび細胞内結合メンバーに対して異なる配向であり得ることを示す。他のＲＣＡＲ配置を、さらにここに記載する。

図４６は、ＣＡＲ発現、形質導入Ｔ細胞の増殖が、細胞培養系における低用量のＲＡＤ００１の存在により刺激されることを示す。ＣＡＲＴを、種々の濃度のＲＡＤ００１存在下、Ｎａｌｍ−６細胞と共培養した。ＣＡＲ陽性ＣＤ３陽性Ｔ細胞数(黒色)および総Ｔ細胞数(灰色)を、共培養４日後に評価した

図４７は、ＲＡＤ００１の０.３mg／kg、１mg／kg、３mg／kgおよび１０mg／kg(ｍｐｋ)での連日投薬または媒体投薬でのＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞の腫瘍増殖測定を示す。丸は媒体を示す；四角は１０mg／kg用量のＲＡＤ００１を示す；三角は３mg／kg用量のＲＡＤ００１を示し、逆三角は１mg／kg用量のＲＡＤ００１を示し；菱形は０.３mg／kg用量のＲＡＤ００１を示す。

図４８Ａおよび４８Ｂを含む図４８は、ＮＡＬＭ６腫瘍を有するＮＳＧマウスの血中のＲＡＤ００１の量を示す薬物動態曲線を示す。図４８Ａは、第一用量のＲＡＤ００１後０日目ＰＫを示す。図４８Ｂは、最終ＲＡＤ００１投与後１４日目ＰＫを示す。菱形は１０mg／kg用量のＲＡＤ００１を示す；四角は１mg／kg用量のＲＡＤ００１を示す；三角は３mg／kg用量のＲＡＤ００１を示す；ｘは１０mg／kg用量のＲＡＤ００１を示す。

図４９Ａおよび４９Ｂを示す図４９は、ＲＡＤ００１投薬存在下および非存在下のヒト化ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞のインビボ増殖を示す。低用量のＲＡＤ００１(０.００３mg／kg)連日が、正常レベルのｈｕＣＡＲ１９増殖を超える、ＣＡＲＴ細胞増殖の増強に至ることを示す。図４９Ａは、ＣＤ４^＋ＣＡＲＴ細胞を示す；図４９ＢはＣＤ８^＋ＣＡＲＴ細胞を示す。丸はＰＢＳを示す；四角はｈｕＣＴＬ０１９を示す；三角はｈｕＣＴＬ０１９と３mg／kg ＲＡＤ００１を示す；逆三角はｈｕＣＴＬ０１９と０.３mg／kg ＲＡＤ００１を示す；菱形はｈｕＣＴＬ０１９と０.０３mg／kg ＲＡＤ００１を示す；丸はｈｕＣＴＬ０１９と０.００３mg／kg ＲＡＤ００１を示す。

詳細な記載
ある面において、本発明は、Ｔ細胞または他の細胞毒性細胞、例えば、ＮＫ細胞の特異性および活性を制御するための組成物および方法を提供する。ある態様において、ＮＫ細胞受容体(ＮＫＲ)、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲ、ＮＣＲ−ＣＡＲ、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲ、ＦｃＲ−ＣＡＲまたはＬｙ４９−ＣＡＲに基づくキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)、例えば、ＮＫ細胞受容体ＣＡＲ(ＮＫＲ−ＣＡＲ)が提供される。ある態様において、本発明は、あるタイプのキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を提供し、ここで、ＣＡＲはＮＫＲ、例えば、“ＫＩＲ−ＣＡＲ”と呼ばれ、これはナチュラルキラー(ＮＫ)細胞に見られる受容体の成分を含むＣＡＲ設計である。ある態様において、ＮＫ受容体は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)を含むが、これらに限定されない。ＫＩＲは、活性化ＫＩＲまたは阻害性ＫＩＲとして機能できる。

本発明のＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲの一つの利点は、ＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲが、操作Ｔ細胞の標的外活性を制御するために、細胞毒性細胞、例えば、Ｔ細胞、特異性を制御する方法を提供することである。ある例において、本発明のＫＩＲ−ＣＡＲは、増殖するのに共刺激を必要としない。

ＮＫＲ−ＣＡＲは、アダプタータンパク質、例えば、ＩＴＡＭ含有アダプタータンパク質によりシグナルを送達する。ある態様において、本発明のＫＩＲ−ＣＡＲは活性化ＫＩＲを含み、これは、そのシグナルを、免疫チロシンベースの活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)含有膜タンパク質、ＤＡＰ１２との相互作用により送達し、これは、これらのタンパク質の膜貫通ドメインの残基が介在する。

ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲは、阻害性モチーフにより阻害性シグナルを送達できる。ある態様において、本発明のＫＩＲ−ＣＡＲは、免疫チロシンベースの阻害性モチーフ(ＩＴＩＭ)との相互作用によりそのシグナルを送達する阻害性ＫＩＲを含む。ＩＴＩＭを含む細胞質ドメインを担持するＫＩＲは、ＮＫ細胞溶解性およびサイトカイン産生活性の阻害に至る活性化シグナルを無効にする。しかしながら、本発明は阻害性ＫＩＲに限定されるべきではない。むしろ、阻害性シグナルと関係する細胞質ドメインを有するあらゆる阻害性タンパク質を、本発明のＣＡＲの構築に使用できる。

したがって、本発明は、ＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲを含む組成物、それを含むベクター、ウイルス粒子に包装されたＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲベクターを含む組成物およびＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲを含む組み換えＴ細胞または他の細胞毒性細胞を提供する。本発明はまたＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲ(ＫＩＲ−ＣＡＲＴ)を発現する遺伝子修飾したＴ細胞または他の細胞毒性細胞、例えば、ＮＫ細胞、または培養ＮＫ細胞、例えば、ＮＫ９２細胞を製造する方法も含み、ここで、発現されるＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲは、ＮＫＲ、例えば、ＫＩＲからの細胞内シグナル伝達分子を有する特異的抗体の抗原認識ドメインを含む。例えば、ある態様において、細胞内シグナル伝達分子は、ＫＩＲＩＴＡＭ、ＫＩＲＩＴＩＭなどを含むが、これらに限定されない。

したがって、本発明は、ＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲを発現するように修飾されたＴ細胞または他の細胞毒性細胞の特異性および活性を制御する組成物および方法を提供する。本発明はまた、複数のタイプのＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲ(例えば活性化ＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲおよび阻害性ＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲ)を含む細胞も提供し、ここで、複数のタイプのＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲは、シグナル伝達に参加してＴ細胞活性化を制御する。この面において、腫瘍細胞を殺すが、正常バイスタンダー細胞に影響しないように、ＮＫＲ−ＣＡＲ細胞毒性細胞、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲＴ細胞を効率的に調節かつ制御することが有利である。それゆえに、ある態様において、本発明はまた、正常非癌性細胞の枯渇を最小化しながら癌性細胞を殺し、それにより、ＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲ治療の特異性を改善する方法を提供する。

ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲアプローチは、細胞に発現される複数のタイプのＣＡＲの物理的分離を含み、ここで、複数のタイプのＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲのその標的抗原への結合は、ＮＫＲ−ＣＡＲ細胞毒性細胞、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲＴ細胞、活性化に必要である。例えばＫＩＲ−ＣＡＲアプローチにおいて、複数のタイプのＫＩＲ−ＣＡＲからの各ＫＩＲ−ＣＡＲは、異なる細胞内シグナル伝達ドメインを有する。例えば、複数のタイプのＫＩＲ−ＣＡＲをＫＩＲ−ＣＡＲＴ細胞活性化の誘発に使用するとき、第一タイプのＫＩＲ−ＣＡＲは、活性化ＫＩＲからの細胞内ドメインのみを含んでよく、第二タイプのＣＡＲは、阻害性ＫＩＲからの細胞内ドメインのみを含んでよい。この方法で、Ｔ細胞の条件的活性化が、活性化ＫＩＲ−ＣＡＲ(ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲ)の、目的の悪性細胞上の抗原への結合により産生される。悪性細胞ではなく、正常細胞に存在する抗原を指向する抗原結合ドメインを担持する阻害性ＫＩＲ−ＣＡＲ(ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲ)は、Ｔ細胞が正常細胞と遭遇したとき、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲからの活性化効果の減衰を提供する。

ある態様において、本発明は、少なくとも２ＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、少なくとも２ＫＩＲ−ＣＡＲを発現するように操作したＴ細胞または他の細胞毒性細胞を提供し、ここで、第一ＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲはａｃｔＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲであり、第二ＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲはｉｎｈＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲである。ある態様において、本発明はｉｎｈＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲを提供し、ここで、ｉｎｈＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲの正常細胞への結合は、細胞毒性細胞の阻害、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲＴ細胞活性の阻害をもたらす。ある態様において、ｉｎｈＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲの非癌性細胞と関係する抗原への結合は、ＮＫＲ−ＣＡＲ細胞毒性細胞、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲＴ細胞の死をもたらす。

ある態様において、本発明のｉｎｈＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲを、ＣＡＲの活性を制御するために、既存のＣＡＲと組み合わせて使用できる。ＣＡＲの例は、全体を引用により本明細書に包含させるＰＣＴ／ＵＳ１１／６４１９１号に記載されている。

抗原結合ドメイン(ＣＭＥＲ)を含む複数のキメラ膜包埋受容体を有する細胞において、ＣＭＥＲの抗原結合ドメイン間の相互作用が、例えば、相互作用が、抗原結合ドメインの１以上の、その同族抗原へ結合する能力を阻害するかまたは未知同族抗原との新規結合部位を作る可能性のため、望ましくない可能性があることも判明した。したがって、ここに開示されるのは、第一および第二の天然に存在しないＣＭＥＲを有する細胞であって、ここで、抗原結合ドメインは、このような相互作用が最小である。またここに開示されるのは、第一および第二の天然に存在しないこのようなＣＭＥＲをコードする核酸、ならびにこのような細胞および核酸を製造および使用する方法である。ある態様において、該第一および該第二の天然に存在しないＣＭＥＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールドを含む。

定義
特記しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により共通して理解される意味を有する。ここに開示するものに類似するまたは等価なあらゆる方法および材料を本発明の実施および／または試験に使用できるが、好ましい材料および方法は、ここに記載される。本発明の記載および請求に際し、次の用語を、定義が提供されるならば、それがどのようにそれが定義されているかにしたがい、使用する。

ここで使用する用語は、特定の態様を記載するためだけの目的であり、限定を意図しないことも理解されるべきである。

単数表現は、ここでは、文法上の目的が１個以上(すなわち、少なくとも１)をいうために使用する。例として、“要素”は、１個の要素または１を超える要素を意味する。

ここで使用する“約”は、量、期間などのような測定可能な値をいうとき、特定した値からの±２０％または±１０％、ある場合±５％、ある場合±１％、ある場合±０.１％のばらつきを、このようなばらつきが開示された方法の実施において妥当であるとして、包含することを意味する。

ここで使用する用語“アダプター分子”は、２以上の分子の相互作用を可能にする配列を有するポリペプチドをいい、ある態様において、細胞毒性細胞の活性化または不活性化を促進する。例えば、ＤＡＰ１２の場合、これは、膜貫通ドメイン内の荷電相互作用による活性化ＫＩＲとの相互作用および細胞質ドメイン内のリン酸化ＩＴＡＭ配列によるＺＡＰ７０またはＳｙｋのようなシグナル伝達分子との相互作用を含む。

用語“抗原”または“Ａｇ”は、免疫応答を惹起する分子をいう。この免疫応答は、抗体産生または特異的免疫適格細胞の活性化または両者が関与し得る。当業者は、実質的に全タンパク質またはペプチドを含むあらゆる巨大分子が抗原として働き得ることを理解する。さらに、抗原は組み換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡが、それゆえに、“抗原”を、当該用語がここで使用される限り、コードすることを理解する。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がないことを理解する。本発明が、１を超える遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むが、これらに限定されず、これらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を惹起するポリペプチドをコードするように種々の組み合わせで配置されることが容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が全く“遺伝子”によりコードされる必要がないことを理解する。抗原を合成により製造できるかまたは生体サンプルに由来し得ることは容易に明らかである。このような生体サンプルは、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または他の生物学的成分を伴う液体を含み得るが、これらに限定されない。

ここで使用する用語“抗腫瘍効果”は、腫瘍体積減少、腫瘍細胞数減少、転移数減少、余命延長、腫瘍細胞増殖減少、腫瘍細胞生存減少または癌性状態に付随する種々の生理学的症状改善を含むが、これらに限定されない種々の手段により顕在化され得る生物学的効果をいう。“抗腫瘍効果”はまたそもそも腫瘍の発生の予防における本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても顕在化され得る。

ここで使用する用語“アフェレーシス”は、ドナーまたは患者の血液をドナーまたは患者から採り、選択した特定の成分を分ける装置を通し、残りをドナーまたは患者の循環に、例えば、返血により戻す、当分野で認められている体外過程をいう。それゆえに、“アフェレーシスサンプル”の文脈においては、アフェレーシスを使用して得たサンプルをいう。

用語“自己抗原”は、本発明により、外来であるかのように免疫系により認識される、あらゆる自己抗原をいう。自己抗原は、細胞表面受容体を含む、細胞タンパク質、リンタンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質を含むが、これらに限定されない。

ここで使用する用語“自己免疫性疾患”は、自己免疫性応答に起因する障害として定義する。自己免疫性疾患は、自己抗原への不適切かつ過剰な応答の結果である。自己免疫性疾患の例は、数あるなかで、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病(Ｉ型)、ジストロフィー型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、脈管炎、白斑症、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎を含むが、これらに限定されない。

ここで使用する用語“自己”は、後に再導入される個体と同じ個体由来のあらゆる物質をいう。

ここで使用する用語“同種”は、物質が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する何らかの物質をいう。２以上の個体は、１以上の座位の遺伝子が同一でないとき、互いに同種異系といわれる。ある面において、同じ種の個体由来の同種異系物質は、抗原性に相互作用するのに十分遺伝的に似ていない可能性がある。ある態様において、同種は、同じ種の異なる動物に由来する移植片をいう。

ここで使用する用語“キメラ抗原受容体”または“ＣＡＲ”は、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞からの、細胞免疫機能受容体またはアダプター分子と構造的および機能的性質を共有する、キメラポリペプチドをいう。ＣＡＲは、ＴＣＡＲおよびＮＫＲ−ＣＡＲを含む。ある態様において、ＣＡＲは、同族抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。同族抗原への結合により、ＣＡＲは、それが配置される細胞毒性細胞を活性化または不活性化できるかまたは細胞の抗腫瘍活性を制御するかまたは他に細胞の免疫応答を制御することができる。

ある態様において、ＣＡＲポリペプチド構築物におけるドメインは、同じポリペプチド鎖にあり、例えば、キメラ融合タンパク質を含む。ある態様において、ＣＡＲポリペプチド構築物におけるドメインは互いに隣接しておらず、例えば、ここに記載するようなＲＣＡＲにおいて提供されるように、例えば、異なるポリペプチド鎖にある。

ここで使用する用語“ナチュラルキラー細胞免疫機能受容体−キメラ抗原受容体”または“ＮＫＲ−ＣＡＲ”は、ＮＫ細胞からのナチュラルキラー細胞免疫機能受容体(ＮＫＲ)またはアダプター分子と機能的および構造的性質を共有するＣＡＲをいう。ある態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、例えば、ＮＫＲ膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメイン、例えば、ＮＫＲ細胞質ドメインの２または全てを含む。

ここで使用する用語“Ｆｃ受容体−キメラ抗原受容体”または“ＦｃＲ−ＣＡＲ”は、Ｆｃ受容体(ＦｃＲ)と機能的および構造的性質を共有するＣＡＲをいう。ここで使用する用語“キラー細胞免疫グロブリン様受容体−キメラ抗原受容体”または“ＫＩＲ−ＣＡＲ”は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)と機能的および構造的性質を共有するＣＡＲをいう。

ここで使用する用語“Ｌｙ４９受容体−キメラ抗原受容体”または“Ｌｙ４９−ＣＡＲ”は、Ｌｙ４９受容体(Ｌｙ４９)と機能的および構造的性質を共有するＣＡＲをいう。

ここで使用する用語“天然細胞毒性受容体−キメラ抗原受容体”または“ＮＣＲ−ＣＡＲ”は、天然細胞毒性受容体(ＮＣＲ)と機能的および構造的性質を共有するＣＡＲをいう。

ここで使用する用語“シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリー−キメラ抗原受容体”または“ＳＬＡＭ−ＣＡＲ”または“ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲ”は、ＳＬＡＭまたはＳＬＡＭＦと機能的および構造的性質を共有するＣＡＲをいう。

ここで使用する用語Ｔ細胞ベースのキメラ抗原受容体”または“ＴＣＡＲ”は、Ｔ細胞からの細胞免疫機能受容体またはアダプター分子と機能的および構造的性質を共有するＣＡＲをいう。ある態様において、ＴＣＡＲは、抗原ドメイン、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび所望により１以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。

ここで使用する用語“抗体”は、標的抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子由来のタンパク質、またはポリペプチド配列をいう。抗体は、天然源または組み換え源由来の完全免疫グロブリンであってよく、完全免疫グロブリンの免疫反応性部分であってよい。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル、多鎖または単鎖、または完全免疫グロブリンであってよく、天然源または組み換え源由来であり得る。抗体は、一般に免疫グロブリン分子の四量体である。ここに記載する抗体分子は、例えば、ここに記載するような、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(ｓｄＡｂ)、単鎖抗体(ｓｃＦｖ)およびヒト化またはヒト抗体を含む、抗体の抗原結合部分が、連続ポリペプチド鎖の一部として発現される、多様な形態で存在し得る。

用語“抗体フラグメント”は、完全抗体またはその組み換えバリアントの少なくとも一部をいい、抗原のような標的に対する、抗体フラグメントの認識および特異的結合をあたえるのに十分である、完全抗体の抗原決定可変領域をいう。抗体フラグメントの例は、単鎖ドメイン抗体(ｓｄＡｂ)、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２およびＦｖフラグメント、直線状抗体、ｓｃＦｖ抗体、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、直線状抗体、ｓｄＡｂ(ＶＬまたはＶＨのいずれか)のような単一ドメイン抗体、ラクダ科ＶＨＨドメインおよびヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結した２Ｆａｂフラグメントを含む二価フラグメントのような抗体フラグメントから形成された多特異的抗体および抗体の単離ＣＤＲまたは他のエピトープ結合フラグメントをいう。抗原結合フラグメントはまた単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、二重特異性抗体、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビスｓｃＦｖに取り込まれ得る(例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005参照)。抗原結合フラグメントは、フィブロネクチンIII型(Ｆｎ３)のようなポリペプチドに基づくスキャフォールドに移植もできる(フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許６,７０３,１９９号参照)。

用語“ｓｃＦｖ”は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１抗体フラグメントおよび重鎖の可変領域を含む少なくとも１抗体フラグメントを含む融合タンパク質をいい、ここで、軽鎖および重鎖可変領域は、短可動性ポリペプチドリンカーにより隣接して連結され、単鎖ポリペプチドとして発現されることが可能であり、ｓｃＦｖはそれが由来する完全抗体の特異性を保持する。特記しない限り、ここで使用するｓｃＦｖは、いずれの順序でＶＬおよびＶＨ可変領域を含んでもよく、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関してｓｃＦｖはＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでも、ＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでもよい。

ここで使用する用語“相補性決定領域”または“ＣＤＲ”は、抗原特異性および結合親和性を与える、抗体可変領域内のアミノ酸の配列をいう。例えば、一般に、各重鎖可変領域に３ＣＤＲ(例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３)および各軽鎖可変領域に３ＣＤＲ(ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３)が存在する。あるＣＤＲの厳密なアミノ酸配列境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(“Ｋａｂａｔ”番号付けスキーム)、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948(“Ｃｈｏｔｈｉａ”番号付けスキーム)またはこれらの組み合わせにより記載のものを含む多くの周知のスキームのいずれかを使用して決定できる。Ｋａｂａｔ番号付けスキーム下、ある態様において、重鎖可変ドメイン(ＶＨ)のＣＤＲアミノ酸残基は３１〜３５(ＨＣＤＲ１)、５０〜６５(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)と番号付けされ；そして軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)におけるＣＤＲアミノ酸残基は２４〜３４(ＬＣＤＲ１)、５０〜５６(ＬＣＤＲ２)および８９〜９７(ＬＣＤＲ３)と番号付けされる。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム下、ある態様において、ＶＨにおけるＣＤＲアミノ酸は２６〜３２(ＨＣＤＲ１)、５２〜５６(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)と番号付けされ；そしてＶＬにおけるＣＤＲアミノ酸残基は２６〜３２(ＬＣＤＲ１)、５０〜５２(ＬＣＤＲ２)および９１〜９６(ＬＣＤＲ３)と番号付けされる。複合ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームにおいて、ある態様において、ＣＤＲは、ＫａｂａｔＣＤＲ、ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲまたは両者の一部であるアミノ酸残基に対応する。例えば、ある態様において、ＣＤＲは、ＶＨ、例えば、哺乳動物ＶＨ、例えば、ヒトＶＨにおけるアミノ酸残基２６〜３５(ＨＣＤＲ１)、５０〜６５(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)；およびＶＬ、例えば、哺乳動物ＶＬ、例えば、ヒトＶＬにおけるアミノ酸残基２４〜３４(ＬＣＤＲ１)、５０〜５６(ＬＣＤＲ２)および８９〜９７(ＬＣＤＲ３)に対応する。

本発明のＣＡＲ組成物の抗体または抗体そのフラグメントを含む部分は、抗原結合ドメインが、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(ｓｄＡｂ)、単鎖抗体(ｓｃＦｖ)およびヒト化またはヒト抗体を含む、連続ポリペプチド鎖の一部として発現される、多様な形態で存在し得る(Harlowet al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Har低et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。ある面において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる面において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。

ここで使用する用語“結合ドメイン”または“抗体分子”(ここでは“抗標的(例えば、メソテリン)結合ドメイン”とも称する)は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、タンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントをいう。用語“結合ドメイン”または“抗体分子”は、抗体および抗体フラグメントを包含する。ある態様において、抗体分子は多特異性抗体分子であり、例えば、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、ここで、複数の中の第一免疫グロブリン可変ドメイン配列は第一エピトープに対する結合特異性を有し、複数の中の第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は第二エピトープに対する結合特性を有する。ある態様において、多特異性抗体分子は二特異性抗体分子である。二特異性抗体は、２以下の抗原に特異性を有する。二特異性抗体分子は、第一エピトープに対する結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに対する結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。

ここで使用する“抗体重鎖”は、天然に存在する立体構造での全抗体分子に存在する、２タイプのポリペプチド鎖の大きいほうをいう。

ここで使用する“抗体軽鎖”は、天然に存在する立体構造での全抗体分子に存在する、２タイプのポリペプチド鎖の小さいほうをいう。κおよびλ軽鎖は、二つの主抗体軽鎖アイソタイプをいう。

ここで使用する用語“合成抗体”または“組み換え抗体”は、例えば、ここに記載するようにバクテリオファージにより発現された抗体分子のような、組み換えＤＮＡテクノロジーを使用して産生される、抗体分子を意味する。本用語はまた本用語はまた抗体分子をコードするＤＮＡ分子の合成により産生され、そのＤＮＡ分子が抗体タンパク質または抗体を特定するアミノ酸配列を発現するものである抗体を意味するとも解釈すべきであり、ここで、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当分野で利用可能であり、周知である合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列テクノロジーを使用して得られている。

ここで使用する用語“癌”は、異常細胞の急速かつ未制御の増殖により特徴付けられる疾患をいう。癌細胞は、局所的にまたは血流およびリンパ系により体の他の部分に拡散できる。種々の癌の例はここに記載され、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌、神経膠腫などを含むが、これらに限定されない。用語“腫瘍”および“癌”は、ここでは交換可能に使用し、例えば、両用語は固形および液性、例えば、拡散もしくは循環腫瘍を含む。ここで使用する用語“癌”または“腫瘍”は、前悪性、ならびに悪性癌および腫瘍を含む。

用語“組み合わせ”は、一投与単位形態の固定された組み合わせまたは本発明の化合物および組み合わせパートナー(例えば“治療剤”または“併用剤”とも称する下記のような他の薬剤)を、独立して同時にまたは一定間隔で、特に組み合わせパートナーが協調的、例えば相乗効果を示すことを可能にする間隔で別々に投与し得る組み合わせ投与をいう。単一成分をキットに包装してもまたは別々でもよい。要素の一方または両方(例えば、粉末または液体)を、投与前に所望の用量に再構成または希釈し得る。ここに使用する用語“共投与”または“組み合わせ投与”などは、選択した組み合わせパートナーを、それを必要とする一対象(例えば患者)に投与することを包含することを意図し、これら薬剤が必ずしも同じ投与経路でまたは同時に投与されるものではない処置レジメンを包含することを意図する。ここで使用する用語“医薬組み合わせ”は、１個を超える活性成分の混合または組み合わせに由来する産物を意味し、活性成分の固定されたおよび固定されていない組み合わせの両者を含む。用語用語“固定された組み合わせ”は、複数活性成分、例えば本発明の化合物および組み合わせパートナーが、両者とも患者に、同時に一個の物または投与量として投与されることを意味する。用語“固定されていない組み合わせ”は、複数活性成分、例えば本発明の化合物および組み合わせパートナーを、別々の物として、同時に、一緒にまたは別々に具体的時間制限なく患者に投与し、ここで、このような投与が、患者の体内で２化合物の治療的有効レベルを提供することを意味する。後者はまたカクテル療法、例えば３種以上の活性成分の投与にも適用される。

用語“保存的配列修飾”は、当該アミノ酸配列を含む抗体または抗体フラグメントの結合特性に顕著に影響しないまたは変えないアミノ酸修飾をいう。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発のような当分野で知られる標準技術により、本発明の抗体または抗体フラグメントに修飾を導入できる。保存的置換は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。それゆえに、本発明のＣＡＲ内の１以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えてよく、改変したＣＡＲのＦＲβに結合する能力を、ここに記載する機能的アッセイを使用して試験できる。

“構成的”プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、細胞内の遺伝子産物の産生を、該細胞の大部分のまたは全ての生理学的条件下で引き起こす、ヌクレオチド配列をいう。

アダプター分子およびシグナル伝達ドメインについて適用される、細胞質および細胞内は、ここでは相互交換可能に使用する。

ここで使用する用語“由来する”は、第一分子と第二分子の関係を示す。一般に第一分子と第二分子の構造的類似性をいい、第二分子に由来する第一分子の過程または源限定を暗示または包含しない。例えば、ＣＤ３ゼータ分子に由来する細胞内シグナル伝達ドメインの場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、必要な機能、すなわち、適切な条件下でシグナルを産生する能力を有するように、十分なＣＤ３ゼータ構造を保持する。細胞内シグナル伝達ドメインを産生する特定の過程の限定を暗示または包含しない、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインを提供するために、ＣＤ３ゼータ配列から出発し、細胞内シグナル伝達ドメインに到達するために望まない配列を削除するかまたは変異させなければならないことを意味しない。

用語“刺激”は、刺激性分子(例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体)とその同族リガンドの結合により誘発され、それによりＴＣＲ／ＣＤ３複合体によるシグナル伝達のような、しかし、これに限定されない、シグナル伝達事象を介在する、一次応答をいう。刺激は、ＴＧＦ−βの下方制御および／または細胞骨格構造再構築などのような、ある分子の発現改変も仲介する。

用語“刺激性分子”は、Ｔ細胞シグナル伝達経路の少なくともある面では刺激性方向にＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する、初代細胞質シグナル伝達配列を提供するＴ細胞により発現される分子をいう。ある面において、一次シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と、ペプチドを載せたＭＨＣ分子の結合により開始され、これは、増殖、活性化、分化などを含むが、これらに限定されないＴ細胞応答の仲介に至る。刺激性方向に作用する初代細胞質シグナル伝達配列(“一次シグナル伝達ドメイン”とも呼ばれる)は、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有初代細胞質シグナル伝達配列の例は、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(“ＩＣＯＳ”としても知られる)、ＦｃεＲＩおよびＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものを含むが、これらに限定されない。本発明の特定のＣＡＲにおいて、いずれかの１以上の本発明のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号９として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号１０として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。

用語“抗原提示細胞”または“ＡＰＣ”は、表面に主要組織適合抗原(ＭＨＣ)と複合体化した外来抗原を呈示するアクセサリー細胞(例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など)のような免疫系細胞をいう。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体(ＴＣＲ)を使用してこれらの複合体を認識し得る。ＡＰＣは抗原を処理し、それらをＴ細胞に提示する。

ここで使用する用語“細胞内シグナル伝達ドメイン”は、分子の細胞内部分をいう。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを産生できる。例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞における、免疫エフェクター機能の例は、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解性活性およびヘルパー活性を含む。。ある態様において、細胞内シグナルドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化された機能の実施を指示する。細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達の切断された一部を使用する範囲内で、このような切断された一部を、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、完全鎖の代わりに使用してよい。用語細胞内シグナル伝達ドメインは、それゆえに、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆる切断された一部を含むことを意図する。

ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは初代細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。初代細胞内シグナル伝達ドメインの例は、一次刺激または抗原依存刺激を担う分子に由来するものを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性細胞内ドメインを含み得る。共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインの例は、共刺激性シグナルまたは抗原非依存的刺激を担う分子に由来するものを含む。例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の場合、初代細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞受容体の細胞質配列を含むことができ、共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは共受容体または共刺激性分子の細胞質配列を含むことができる。

一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭ含有初代細胞質シグナル伝達配列の例は、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(“ＩＣＯＳ”)、ＦｃεＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものを含むが、これらに限定されない。

用語“ゼータ”または代替的にゼータ鎖”、“ＣＤ３ゼータ”または“ＴＣＲゼータ”は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４.１として提供されるタンパク質または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な塩基として定義され、“ゼータ刺激性ドメイン”または代替的に“ＣＤ３ゼータ刺激性ドメイン”または“ＴＣＲゼータ刺激性ドメイン”は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分であるゼータ鎖の細胞質ドメイン由来のアミノ酸残基として定義する。ある面において、ゼータの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４.１の残基５２〜１６４または、その機能的オルソログである非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基を含む。ある面において、“ゼータ刺激性ドメイン”または“ＣＤ３ゼータ刺激性ドメインは、配列番号９。ある面において、“ゼータ刺激性ドメイン”または“ＣＤ３ゼータ刺激性ドメインは配列番号１０として提供される配列である。

用語“共刺激性分子”は、共刺激性リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の同族結合パートナーをいい、それにより、増殖のような、しかし、それに限定されないＴ細胞による共刺激性応答が仲介される。共刺激性分子は、効率的免疫応答に必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激性分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃbp、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含むが、これらに限定されない。

共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性分子の細胞内部分をいう。細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体または天然細胞内シグナル伝達ドメイン全体またはその機能的フラグメントを含み得る。

用語“４−１ＢＢ”は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８.２として提供されるアミノ酸配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーをいう；そして“４−１ＢＢ共刺激ドメイン”は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８.２のアミノ酸残基２１４〜２５５または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基として定義される。ある面において、“４−１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号７として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。

ここで使用する用語“免疫エフェクター細胞”は、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の増強に関与する細胞をいう。免疫エフェクター細胞の例は、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、ナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞、肥満細胞および骨髄由来貪食細胞を含む。

ここで使用する用語“免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答”は、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する、例えば、免疫エフェクター細胞の、機能または応答をいう。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の死滅を促進するまたは成長もしくは増殖を阻害するＴ細胞またはＮＫ細胞の特性をいう。Ｔ細胞の場合、一次刺激および共刺激は免疫エフェクター機能または応答の例である。

用語“エフェクター機能”は、細胞の特殊化された機能をいう。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。

用語“コードする”は、ヌクレオチドの規定された配列(すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ)またはアミノ酸の規定された配列のいずれかを有する生物学的過程において他のポリマーおよび巨大分子の合成の鋳型として役立つ、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列の固有の特性およびそれ由来の生物学的特性をいう。それゆえに、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物系においてタンパク質を産生するならば、タンパク質をコードする。遺伝子またはｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される、ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供されるコード鎖および非コード鎖の両者を、タンパク質または該遺伝子またはｃＤＮＡの他の産物をコードするとしていうことができる。

特に断らない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全ヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。

用語“有効量”または“治療有効量”は、ここでは相互交換可能に使用し、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、ここに記載するような化合物、製剤、物質または組成物の量をいう。このような結果は、当分野で適当な何らかの手段により決定したウイルス感染の阻害を含むが、これに限定されない。

ここで使用する用語“内在性”は、生物、細胞、組織または系に由来するまたはそれらの中で産生されるあらゆる物質をいう。

ここで使用する用語“外来性”は、生物、細胞、組織または系の外から導入されたまたはそれらの外で産生されるあらゆる物質をいう。

ここで使用する用語“発現”は、プロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義する。

用語“発現”用語“発現”は、プロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳をいう。

用語“転移ベクター”は、単離核酸を含み、単離核酸の細胞内部への送達に使用できる組成物をいう。多数のベクターが当分野で知られ、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むが、これらに限定されない。それゆえに、用語“転移ベクター”は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。本用語はまた、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなどのような、核酸の細胞への転移を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに含むとも解釈すべきである。ウイルス転移ベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。

“発現ベクター”は、発現するヌクレオチド配列に操作可能に連結した発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含む、ベクターをいう。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用領域を含み、発現のための他の要素は宿主により細胞またはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターは、組み換えポリヌクレオチドを取り込むコスミド、プラスミド(例えば、裸のまたはリポソームに含まれた)およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような、当分野で知られる全てのこのようなものを含む。

ここで使用する用語“ベクター”は、核酸分子の送達および／または発現に使用できる、あらゆる媒体をいう。それは、ここに記載するような伝達ベクターまたは発現ベクターであり得る。

用語“相同”または“同一性”は、２ポリマー分子間、例えば、２核酸分子間、例えば、２ＤＮＡ分子または２ＲＮＡ分子間または２ポリペプチド分子間のブユニット配列同一性をいう。２分子の両者におけるサブユニットが同じモノマーサブユニットで占拠されているとき；例えば、２ＤＮＡの各々におけるある位置がアデニンで占拠されているならば、それらは、その位置で相同または同一である。２配列間の相同性は、マッチしたまたは相同な位置の数の直接関数である；例えば、２配列の位置の半分(例えば、１０サブユニット長ポリマー中５位置)が相同であるならば、２配列は５０％相同である；位置の９０％(例えば、１０中９)がマッチするまたは相同であるならば、２配列は９０％相同である。

非ヒト(例えば、マウス)抗体の“ヒト化”形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)_２または抗体の他の抗原結合部分配列)である。大部分、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲからの残基で置換されている、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも輸入したＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含んでよい。これらの修飾は、抗体性能のさらなる調整および最適化のために行う。一般に、ヒト化抗体は、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンに対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものに対応する、実質的に全ての、少なくとも１、および一般に２可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、所望によりまた、一般にヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部を含んでよい。さらなる詳細について、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照のこと。

“完全ヒト”は、分子全体がヒト起源または抗体もしくは免疫グロブリンのヒト形態と同一のアミノ酸配列からなる、抗体または抗体フラグメントのような免疫グロブリンをいう。

ここで使用する“指示書”は、本発明の組成物および方法の有用性を説明するのに使用できる、刊行物、記録、ダイアグラムまたは他のあらゆる表現媒体である。本発明のキットの指示書は、例えば、本発明の核酸、ペプチドおよび／または組成物を含む容器に添付されてよくまたは核酸、ペプチドおよび／または組成物を含む容器とともに出荷されてよい。あるいは、指示書は、指示書および化合物が受領者により相補的に使用すべきであるとの指示伴って容器と別に出荷しもてよい。

用語“単離”は、自然な状態から変えられたまたは除かれたことを意味する。例えば、生存動物中に天然に存在する核酸またはペプチドは“単離”されていないが、その自然な状態の併存物質から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、“単離”されている。単離核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在できまたは、例えば、宿主細胞のような、非天然環境で存在できる。

本発明の文脈において、一般的に生じる核酸塩基について次の略語を使用する。“Ａ”はアデノシンをいい、“Ｃ”はシトシンをいい、“Ｇ”はグアノシンをいい、“Ｔ”はチミジンをいい、そして“Ｕ”はウリジンをいう。

特に断らない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全ヌクレオチド配列を含む。用語タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、あるバージョンにおいてイントロンを含む場合には、イントロンも含み得る。

ここで使用する“レンチウイルス”は、レトロウイルス科ファミリーの属をいう。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できるという点で、レトロウイルスの中でも独特である；それらは、相当量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達でき、それゆえに、それらは遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の一つである。ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。レンチウイルス由来のベクターは、インビボでの相当レベルの遺伝子導入を達成する手段を提供する。

用語“レンチウイルスベクター”は、少なくとも一部レンチウイルスゲノムに由来するベクターをいい、特に、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464(2009)において提供されるような自己不活性化レンチウイルスベクターを含む。臨床で使用し得るレンチウイルスベクターの他の例は、ＯｘｆｏｒｄＢｉｏＭｅｄｉｃａからのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ(登録商標)遺伝子送達テクノロジー、ＬｅｎｔｉｇｅｎからのＬＥＮＴＩＭＡＸ^TMを含むが、これらに限定されない。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に知られる。

ｓｃＦｖの文脈においてここで使用する用語“柔軟性ポリペプチドリンカー”または“リンカー”は、可変重鎖領域と可変軽鎖領域を一緒に連結するために、単独でまたは組み合わせで使用されるグリシンおよび／またはセリン残基のようなアミノ酸からなるペプチドリンカーをいう。ある態様において、柔軟性ポリペプチドリンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列(Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)_ｎ(配列番号３８)(ここで、ｎは１以上の正の整数である)を含む。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５およびｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９およびｎ＝１０である。ある態様において、柔軟性ポリペプチドリンカーは、(Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ)_４(配列番号２７)または(Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ)_３(配列番号２８)を含むが、これらに限定されない。他の態様において、リンカーは、(Ｇｌｙ_２Ｓｅｒ)、(ＧｌｙＳｅｒ)または(Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ)(配列番号２９)の複数反復を含む。ＷＯ２０１２／１３８４７５号(引用により本明細書に包含させる)に記載のリンカーも本発明の範囲内に含まれる。

ここで使用する“ＮＫ細胞免疫機能受容体”または“ＮＫＲ”は、ＮＫ細胞において発現される内因性の天然に存在する膜貫通タンパク質をいい、これは、抗原提示細胞のリガンドと結合し、ＮＫ細胞免疫機能応答を調節でき、例えば、ＮＫ細胞の細胞溶解性活性またはサイトカイン分泌を調節できる。ＮＫＲは、活性化(活性化ＮＫＲ、またはａｃｔＮＫＲ)、または阻害(阻害性ＮＫＲ、またはｉｎｈＮＫＲ)に貢献する。一般に、ＮＫＲは、細胞外リガンド結合ドメイン(ＥＣＤ)、膜貫通ドメイン(ＴＭ)および細胞内細胞質ドメイン(ＩＣＤ)を含む。ＮＫＲは、ＫＩＲ２ＤＳ２のような受容体のキラー免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)ファミリー、ＮＫｐ４６(ＮＣＲ１)のような受容体のＮＫ細胞受容体(ＮＣＲ)受容体ファミリー、２Ｂ４のような受容体のシグナル伝達リンパ球活性化受容体(ＳＬＡＭ)ファミリー(ＳＬＡＭＦ)およびＩｇＧ結合受容体、ＣＤ１６(ＦｃγＲIII)のようなＦｃ結合受容体を含む。ＮＫＲにより調節されるＮＫ細胞免疫機能応答の例は、標的細胞死滅(しばしば細胞毒性または細胞溶解とも呼ばれる)、サイトカイン分泌および／または増殖である。一般に、ここに記載する方法および組成物における使用に適するＮＫＲは、ヒトＮＫＲ(またはｈＮＫＲ)である。ある態様において、マウスＮＫおよびＴ細胞においてＫＩＲと同じ機能を提供するように、収束進化により現れるマウスにおけるＬｙ４９受容体ファミリーも包含される。

用語“操作可能に連結”は、制御配列と異種核酸配列の間の、後者の発現を生じる機能的連結をいう。例えば、第一核酸配列は、第一核酸配列が第二核酸配列と機能的関係におかれたとき、操作可能に連結している。例えば、プロモーターは、プロモーターがコーディング配列の転写または発現に影響するならば、コーディング配列に操作可能に連結する。一般に、操作可能に連結したＤＮＡ配列は隣接し、そして、２タンパク質コーディング領域を合わせる必要があるとき、同じリーディングフレーム内にある。

免疫原性組成物の“非経腸”投与なる用語は、例えば、皮下(ｓ.ｃ.)、静脈内(ｉ.ｖ.)、筋肉内(ｉ.ｍ.)または胸骨内注射または点滴技術を含む。

ここで使用する用語“核酸”、“核酸分子”または“ポリヌクレオチド”は相互交換可能に使用し、ヌクレオチドの鎖を定義する。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。それゆえに、ここで使用する核酸およびポリヌクレオチドは相互交換可能である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、これを単量体“ヌクレオチド”に加水分解できるとの一般的知識を有する。単量体ヌクレオチドをヌクレオシドに加水分解できる。ここで使用するポリヌクレオチドは、通常のクローニングテクノロジーおよびＰＣＲ^TMなどを使用する、組み換え手段、すなわち、組み換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列クローニングおよび合成手段を含むが、これらに限定されない、任意の当分野で利用可能な手段による全核酸配列をいう。ある態様において、ここでの核酸は、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)またはリボ核酸(ＲＮＡ)またはＤＮＡまたはそのＲＮＡの組み合わせ、およびそのポリマーの単鎖または二本鎖形態のいずれかでの組み合わせを含む。用語“核酸”は、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む。ある態様において、核酸分子は合成(例えば、化学合成)または組み換えである。特に限定しない限り、本用語は、対照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似する方法で代謝される、天然ヌクレオチドのアナログまたは誘導体を含む核酸を包含する。特に断らない限り、特定の核酸配列はまた、黙示的に保存的に修飾されたそのバリアント(例えば、縮重コドン置換)、アレル、オルソログ、ＳＮＰおよび相補的配列ならびに明示的に示される配列も包含する。具体的に、縮重コドン置換は、１以上の選択した(または全)コドンの３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を産生することにより達成し得る(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。

ここで使用する用語“ペプチド”、“ポリペプチド”および“タンパク質”は相互交換可能に使用し、ペプチド結合により共有結合したアミノ酸残基からなる化合物をいう。タンパク質またはペプチドは少なくとも２アミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸数の上限の設定はない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合により連結した２以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチドまたはタンパク質を含む。ここで使用する本用語は、例えば、ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとしても一般に呼ばれる短鎖および一般にタンパク質として当分野で呼ばれ、多くのタイプが存在する長鎖の両者をいう。“ポリペプチド”は、とりわけ、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同ポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチドまたはこれらの組み合わせを含む。

ここで使用する用語“プロモーター”は、ポリヌクレオチド配列の特定の転写の開始に必要な、細胞の合成装置または導入された合成装置により認識されるＤＮＡ配列として定義される。

ここで使用する用語“プロモーター／制御性配列”は、該プロモーター／制御配列に操作可能に連結した遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。ある例において、この配列はコアプロモーター配列であってよく、他の例において、この配列はまた遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の制御要素も含んでよい。プロモーター／制御配列は、例えば、組織特異的方法で遺伝子産物を発現するものであり得る。

用語“誘導性”プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、実質的に当該細胞中にプロモーターに対応するインデューサーが存在するときのみ細胞において遺伝子産物を産生させる、ヌクレオチド配列である。

用語“組織特異的”プロモーターは、遺伝子によりコードされるまたは特定化されるポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、実質的に、当該細胞が組織タイプの細胞であるときにのみ、細胞において遺伝子産物を産生させる、ヌクレオチド配列である。

用語“シグナル伝達経路”は、細胞のある部分から細胞の他の部分へのシグナルの伝達に役割を有する多様なシグナル伝達分子間の生化学的関係をいう。用語“細胞表面受容体”は、シグナルを受け、細胞膜を通過してシグナルを伝達できる分子および分子複合体を含む。

用語“対象”は、免疫応答が惹起され得る生存生物(例えば、哺乳動物、ヒト)を含むことを意図する。

ここで使用する“実質的に精製された”細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞をいう。実質的に精製された細胞はまた、天然に存在する状態では通常関係している他の細胞型から分離されている細胞もいう。ある例において、実質的に精製された細胞の集団は、細胞の均一集団をいう。他の例において、この用語は、単に、その天然の状態で本来関係している細胞から分離されている細胞をいう。ある面において、細胞は、インビトロで培養される。他の面において、細胞は、インビトロで培養されない。

ここで使用する５’キャップ(別名ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７−メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡｍ^７Ｇキャップ)は、転写開始直後に真核メッセンジャーＲＮＡの“前面”または５’末端に付加されている修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、第一転写ヌクレオチドに連結した末端基からなる。その存在は、リボゾームによる認識およびＲＮａｓｅからの保護に重要である。キャップ付加は転写と結びつき、互いに影響し合うように共転写的に生じる。転写開始直後、合成中のｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼと結合したキャップ合成複合体により結合される。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多工程生化学反応として進行する。キャッピング部分は、安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡの機能性を調節するために修飾できる。

ここで使用する“インビトロ転写ＲＮＡ”は、インビトロで合成されている、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡをいう。一般に、インビトロ転写ＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから産生される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡを産生するために使用する鋳型を含む。

ここで使用する“ポリ(Ａ)”は、ポリアデニル化によりｍＲＮＡに結合した一連のアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい態様において、ポリＡは５０〜５０００(配列番号３０)、好ましくは６４を超え、より好ましくは１００を超え、最も好ましくは３００または４００を超える。ポリ(Ａ)配列は、局在化、安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡ機能性を調節するために、化学的にまたは酵素的に修飾できる。

ここで使用する“ポリアデニル化”は、メッセンジャーＲＮＡ分子への、ポリアデニリル部分またはその修飾バリアントの供給結合をいう。真核生物において、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)分子は、３’末端でポリアデニル化されている。３’ポリ(Ａ)テイルは、酵素、ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によりプレｍＲＮＡに添加されたアデニンヌクレオチドの長い配列(しばしば数百)である。高等真核生物において、ポリ(Ａ)テイルは、特異的配列、ポリアデニル化シグナルを含む転写物に添加される。ポリ(Ａ)テイルおよびそれに結合したタンパク質は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から守るのに役立つ。ポリアデニル化は、転写終結、ｍＲＮＡの核からの排出および翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、核でＤＮＡのＲＮＡへの転写直後だけでなく、さらに、細胞質で後に起こり得る。転写が終結された後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと結合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用により開裂される。開裂部位は、通常、開裂部位近くの塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在により特徴付けられる。ＭＲＮＡが開裂された後、アデノシン残基は、開裂部位の遊離３’末端に付加される。

ここで使用する“一過性”は、数時間、数日または数週間の期間の非統合導入遺伝子の発現をいい、ここで、発現の期間は、宿主細胞におけるゲノムに統合されたときまたは安定プラスミドレプリコン内に含まれるときの遺伝子の発現期間より短い。

ここで使用する用語“治療”は、処置および／または予防を意味する。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解または根絶により得られる。

用語“遺伝子導入”または“形質転換”または“形質導入”は、外来性核酸が宿主細胞に伝達または導入される過程をいう。“遺伝子導入”または“形質転換”または“形質導入”細胞は、外来性核酸が遺伝子導入、形質転換または形質導入されているものである。細胞は、初代対象細胞およびその子孫を含む。

ここで使用する用語“処置”および“処置する”は、１以上の治療剤(例えば、本発明のＣＡＲのような１以上の治療剤)の投与に起因する、増殖性障害の進行、重症度および／または期間の減少または改善または増殖性障害の１以上の症状(好ましくは、１以上の認識できる症状)の改善をいう。特定の態様において、用語“処置”および“処置する”は、患者により必ずしも認識できるものではない、腫瘍増殖のような増殖性障害の少なくとも一つの測定可能な身体的パラメータの改善をいう。他の態様において、用語“処置”および“処置する”は、身体的な、例えば、認識できる症状の安定化、生理学的な、例えば、身体的パラメータの安定化のいずれかまたは両者の、増殖性障害の進行阻害をいう。他の態様において、用語“処置”および“処置する”は、腫瘍サイズまたは癌性細胞数の減少または安定化をいう。

ここで使用する用語“予防”は、疾患または疾患状態に対する予防または防御的処置を意味する。

ここで使用する用語“腫瘍抗原”は、癌または腫瘍細胞の表面に、完全にまたはフラグメント(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)として発現され、癌または腫瘍細胞への薬剤の優先的なターゲティングに有用である、分子(一般にタンパク質、炭水化物または脂質)である。ある態様において、腫瘍抗原は、正常細胞および癌細胞の両者により発現されるマーカー、例えば、細胞系譜マーカー、例えば、Ｂ細胞のＣＤ１９またはＣＤ１２３である。ある態様において、腫瘍抗原は、正常細胞と比較して癌細胞で過発現されている、例えば、正常細胞と比較して１倍過発現、２倍過発現、３倍過発現またはそれ以上過発現されている、細胞表面分子である。ある態様において、腫瘍抗原は、正常細胞で発現される分子と比較して、癌細胞で不適切に合成される細胞表面分子、例えば、欠失、付加または変異を含む分子である。ある態様において、腫瘍抗原は、癌細胞の表面上に、全体的であれフラグメンとしてであれ(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)、排他的に発現され、正常細胞の表面には合成または発現されない。

ある態様において、本発明のＣＡＲは、ＭＨＣ提示ペプチドに結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント)を含むＣＡＲを含む。通常、内在性タンパク質由来のペプチドは主要組織適合遺伝子複合体(ＭＨＣ)クラスＩ分子のポケットを満たし、ＣＤ８^＋Ｔリンパ球のＴ細胞受容体(ＴＣＲ)により認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、全有核細胞により構成的に発現される。癌において、ウイルス特異的および／または腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫療法のための細胞表面標的の独特なクラスを表す。ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ２の状況におけるウイルスまたは腫瘍抗原由来のペプチドを標的とするＴＣＲ様抗体は記載されている(例えば、Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21):1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100参照)。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｓｃＦｖファージ提示ライブラリーのようなライブラリーのスクリーニングにより特定できる。

ここで使用する用語“転写制御下”または“操作可能に連結”は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写およびポリヌクレオチドの発現の開始を制御するのに、ポリヌクレオチドに対して正しい位置および配向にあることを意味する。

“ベクター”は、単離核酸を含み、単離核酸を細胞内部に送達するのに使用できる組成物である。多数のベクターが知られ、直線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むが、これらに限定されない。それゆえに、用語“ベクター”は、自律複製プラスミドまたはウイルスを含む。本用語はまた、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなどのような、核酸の細胞への移入を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物も含むと解釈すべきである。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。

ここで使用する用語“特異的に結合”は、サンプルに存在する同族結合パートナータンパク質を認識し、結合する抗体またはリガンドを意味するが、該抗体またはリガンドは、サンプル中の他の分子を実質的に認識または結合しない。

用語“刺激”は、刺激性分子とその同族リガンドの結合により誘発され、それにより、適切なＮＫ受容体を介するシグナル伝達のような、しかし、これに限定されない、シグナル伝達事象に介在する、一次応答を意味する。

用語“異種”は、異なる種の動物由来の移植片をいう。

用語“特異的に結合”は、サンプルに存在する同族結合パートナー(例えば、Ｔ細胞に存在する刺激性および／または共刺激性分子)タンパク質を認識し、結合する抗体またはリガンドをいうが、その抗体またはリガンドはサンプルにおける他の分子を実質的に認識または結合しない。

ここで使用する用語“制御可能キメラ抗原受容体(ＲＣＡＲ)”は、一連のポリペプチド、一般に最も単純な態様で２ポリペプチドをいい、免疫エフェクター細胞にあるとき、細胞に標的細胞、一般に癌細胞に対する特異性および制御可能な細胞内シグナル産生を与える。ある態様において、ＲＣＡＲは、ＣＡＲ分子に関連して定義したように、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激性分子を含む細胞質シグナル伝達ドメイン(ここでは“細胞内シグナル伝達ドメイン”とも呼ぶ)を含む。ある態様において、ＲＣＡＲにおける一連のポリペプチドは互いに連続しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖中にある。ある態様において、ＲＣＡＲは、二量体化分子の存在下、ポリペプチドを互いに結合できる、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合できる、二量体化スイッチを含む。ある態様において、ＲＣＡＲは、ここに記載するような細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)、例えば、ＲＣＡＲ発現細胞(ここでは“ＲＣＡＲＸ細胞”とも呼ぶ)で発現される。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＴ細胞であり、ＲＣＡＲＴ細胞と称する。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＮＫ細胞であり、ＲＣＡＲＮ細胞と称する。ＲＣＡＲは、ＲＣＡＲ発現細胞に、標的細胞、一般に癌細胞に対する特異性および、ＲＣＡＲ発現細胞の免疫エフェクター特性を最適化できる制御可能細胞内シグナル産生または増殖を提供する。ある態様において、ＲＣＡＲ細胞は、少なくとも一部、抗原結合ドメインにより結合される抗原を含む標的細胞に対する特性を提供するのを抗原結合ドメインに頼る。

ここで使用する用語“膜アンカー”または“膜繋留ドメイン”は、細胞外または細胞内ドメインを原形質膜に繋留するのに十分なポリペプチドまたは部分、例えば、ミリストイル基をいう。

ここで使用する“スイッチドメイン”は、例えば、ＲＣＡＲをいうとき、二量体化分子の存在下、他のスイッチドメインと結合するもの、一般にポリペプチドベースのものをいう。結合は、第一スイッチドメインに結合、例えば融合した第一のものと、第二スイッチドメインに結合、例えば融合した第二のものの機能的カップリングをもたらす。第一および第二スイッチドメインは、まとめて二量体化スイッチとして呼ばれる。ある態様において、第一および第二スイッチドメインは互いに同一であり、例えば、同じ一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にホモ二量体化スイッチと呼ばれる。ある態様において、第一および第二スイッチドメインは互いに異なり、例えば、異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にヘテロ二量体化スイッチと呼ばれる。ある態様において、スイッチは細胞内である。ある態様において、スイッチは細胞外である。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースのもの、例えば、ＦＫＢＰまたはＦＲＢベースの物であり、二量体化分子は小分子、例えば、ラパログである。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースのもの、例えば、ｍｙｃペプチドに結合するｓｃＦｖであり、二量体化分子は、１以上のｍｙｃｓｃＦｖと結合するポリペプチド、そのフラグメントまたはポリペプチドの多量体、例えば、ｍｙｃリガンドまたはｍｙｃリガンドの多量体である。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースのもの、例えば、ｍｙｃ受容体であり、二量体化分子は抗体またはそのフラグメント、例えば、ｍｙｃ抗体である。

ここで使用する用語“二量体化分子”は、例えば、ＲＣＡＲをいうとき、第一スイッチドメインと第二スイッチドメインの結合を促進する分子をいう。ある態様において、二量体化分子は対象に天然に存在しないかまたは顕著な二量体化をもたらす濃度で生じない。ある態様において、二量体化分子は小分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。

用語“生物学的同等”は、対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)の対照用量または対照量により産生される効果と同等な効果を産生するのに必要な対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)以外の薬剤の量をいう。ある態様において、効果は、例えば、インビボまたはインビトロアッセイにおいて評価した、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイで測定した、例えば、Ｐ７０Ｓ６キナーゼ阻害により測定した、ｍＴＯＲ阻害のレベルまたはウェスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定である。ある態様において、効果は、細胞選別により測定して、ＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞比の改変である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的同等量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同じレベルのＰ７０Ｓ６キナーゼ阻害を達成する量または用量である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的同等量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同じレベルのＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞比を達成する量または用量である。

用語“低い免疫増強用量”はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンまたは触媒的ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて使用したとき、例えば、Ｐ７０Ｓ６キナーゼ活性の阻害により測定して、ｍＴＯＲ活性を一部、しかし完全ではなく、阻害するｍＴＯＲ阻害剤の用量をいう。例えば、Ｐ７０Ｓ６キナーゼの阻害により、ｍＴＯＲ活性を評価する方法は、ここに記載する。本用量は、完全な免疫抑制を生じるには不十分であるが、免疫応答の増強に十分である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い免疫増強用量は、ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞数減少および／またはＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞数増加またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞比増加をもたらす。

ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い免疫増強用量は、ナイーブ免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の数の増加をもたらす。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い免疫増強用量は、次の１以上をもたらす：
１以上の次のマーカーの発現の増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＣＤ６２Ｌ^高、ＣＤ１２７^高、ＣＤ２７^＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；および
次の特徴のいずれか一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ^高、増加したＣＤ１２７^高、増加したＣＤ２７^＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２；
ここで、上記の何れかの変化は、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に、生じる。

ここで使用する“難治性”は、処置に応答しない疾患、例えば、癌をいう。ある態様において、難治性癌は、処置前または開始時点で処置に耐性であり得る。他の態様において、難治性癌は、処置中に耐性になり得る。難治性癌は、耐性癌とも呼ばれる。

ここで使用する“再発性”または“再発”は、一定期間の改善または応答後、例えば、先の治療、例えば、癌治療の処置後の、疾患(例えば、癌)または癌のような疾患の兆候および症状への逆転またはその再出現をいう。最初の応答期間は、癌細胞のレベルの、ある閾値未満、例えば、２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％未満への低下を含む。再出現は、癌細胞のレベルの、ある閾値を越える、例えば、２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％を超える増加を含み得る。例えば、Ｂ−ＡＬＬの状況において、例えば、再出現は、例えば、完全応答後の、血液、骨髄(＞５％)または髄外部位のいずれかへの芽細胞の再出現を含み得る。完全応答は、この状況において、＜５％ＢＭ芽細胞を含み得る。より一般的に、ある態様において、応答(例えば、完全応答または部分応答)は、検出可能なＭＲＤ(最小残存疾患)の不在を含み得る。ある態様において、応答の最初の期間は少なくとも１日、２日、３日、４日、５日または６日；少なくとも１週間、２週間、３週間または４週間；少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、８ヶ月、１０ヶ月または１２ヶ月；または少なくとも１年、２年、３年、４年または５年続く。

ある態様において、ＣＤ１９阻害剤を含む治療、例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ治療は、処置に再発または難治性であり得る。再発または難治性は、ＣＤ１９喪失(例えば、抗原喪失変異)またはＣＤ１９レベルを減少させる他のＣＤ１９改変(例えば、ＣＤ１９陰性クローンのクローン選択による)によりもたらされ得る。このようなＣＤ１９喪失または改変を担持する癌は、ここで、“ＣＤ１９陰性癌”または“ＣＤ１９陰性再発癌”)と呼ぶ。ＣＤ１９陰性癌は、ＣＤ１９を１００％喪失する必要がないが、癌が再発しまたは難治性となるようにＣＤ１９治療の有効性を減らすのに十分低減していると理解すべきである。ある態様において、ＣＤ１９陰性癌は、ＣＤ１９ＣＡＲ治療に由来する。

範囲：本開示をとおして、本発明の種々の面は、範囲形式で示され得る。範囲形式での記載は単に便宜さおよび簡潔さのためであり、本発明の範囲上の確定的な限定として解釈してはならないと理解されるべきである。よって、範囲の記載は、具体的に記載された全ての可能な下位範囲ならびにその範囲内の個々の数値を有すると考慮すべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのような具体的に開示された下位範囲、ならびにその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、２.７、３、４、５、５.３および６を有すると解釈すべきである。他の例として、９５〜９９％同一性のような範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する何かを含み、９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％および９８〜９９％同一性のような下位範囲を含む。これは、範囲の広さと無関係に適用される。

ＮＫＲ−ＣＡＲＳ
ここに開示されるのは、例えば、天然に存在しないキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を有する、細胞毒性細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の特異性および活性を制御する組成物および方法である。ある態様において、ＣＡＲはＮＫＲ−ＣＡＲである。ＮＫＲ−ＣＡＲは、ＮＫ細胞免疫機能受容体(またはＮＫＲ)と機能的および構造的性質を共有するＣＡＲである。ＮＫＲおよびＮＫＲ−ＣＡＲを、ここに、例えば、下に記載する。下記のように、多様なＮＫＲがＮＫＲ−ＣＡＲの基礎として作用できる。

ＮＫ細胞免疫機能受容体(ＮＫＲＳ)およびＮＫ細胞
ここに記載するように、ＮＫ細胞免疫機能受容体(またはＮＫＲ)は、ＮＫ細胞に発現される内因性の天然に存在する膜貫通タンパク質をいい、これは、抗原提示細胞のリガンドと結合し、ＮＫ細胞免疫機能応答を調節でき、例えば、ＮＫ細胞の細胞溶解性活性またはサイトカイン分泌を調節できる。

ＮＫ細胞は、リンパ系前駆細胞から骨髄で発生する単核細胞であり、形態学的特性および生物学的性質は、一般に表面抗原分類(ＣＤ)ＣＤ１６、ＣＤ５６および／またはＣＤ５７の発現；細胞表面のアルファ／ベータまたはガンマ／デルタＴＣＲ複合体の不在；“自己”主要組織適合複合体(ＭＨＣ)／ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)タンパク質を発現できない標的細胞に結合し、殺す能力；および活性化ＮＫ受容体に対するリガンドを発現する、腫瘍細胞または他の疾患細胞を殺す能力を含む。ＮＫ細胞は、先に免疫化または活性化する必要はなく、数タイプの腫瘍細胞株と結合し、殺すその能力により特徴付けられる。ＮＫ細胞はまた免疫系に制御性効果を発揮する可溶性タンパク質およびサイトカインも遊離できる；そして、複数回の細胞分裂に付し、親細胞と類似する生物学的性質を有する娘細胞を産生できる。インターフェロンおよび／またはサイトカインによる活性化により、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞と標的細胞の直接の物理的接触を必要とする機構により、腫瘍細胞および細胞内病原体に感染した細胞の溶解に介在する。標的細胞の溶解は、ＮＫ細胞から結合標的表面への細胞毒性顆粒および標的原形質膜に浸透し、アポトーシスまたは計画細胞死を誘発する、パーフォリンおよびグランザイムＢのようなエフェクタータンパク質の放出を含む。正常な、健常細胞は、ＮＫ細胞による溶解から保護される。ＮＫ細胞活性は、刺激性および阻害性シグナルの両者を含む複合な機構により制御される。

要するに、ＮＫ細胞の溶解性活性が、標的細胞のリガンドとの相互作用により、正または負の細胞内シグナルを伝達する、種々の細胞表面受容体により制御される。これらの受容体を介して伝達される正および負のシグナルのバランスが、標的細胞がＮＫ細胞により溶解される(殺される)か否かを決定する。ＮＫ細胞刺激性シグナルは、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６のような天然細胞毒性受容体(ＮＣＲ)；ならびにＮＫＧ２Ｃ受容体、ＮＫＧ２Ｄ受容体、ある活性化キラー細胞免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)および他の活性化ＮＫ受容体が介在する(Lanier, Annual Review of Immunology 2005; 23:225-74)。ＮＫ細胞阻害性シグナルは、主要組織適合複合体(ＭＨＣ)クラスＩ分子を認識するＬｙ４９、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａならびにある阻害性ＫＩＲのような受容体により介在され得る(Karre et al., Nature 1986; 319:675-8; Ohlen et al, Science 1989; 246:666-8)。これらの阻害性受容体は、他の細胞に存在するＭＨＣクラスＩ分子(ＨＬＡクラスＩを含む)の多型決定基に結合し、ＮＫ細胞介在溶解を阻止する。

ＫＩＲ−ＣＡＲＳ
ここに開示されるのは、抗原結合ドメインおよびキラー細胞免疫グロブリン様受容体ドメインを含むキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)分子(ＫＩＲ−ＣＡＲ)である。ある態様において、本発明のＫＩＲ−ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面に発現される。

ＫＩＲ−ＣＡＲベースのＮＫＣＡＲＳ
キラー細胞免疫グロブリン様受容体と称するＫＩＲは、ヒトおよび非ヒト霊長類で特徴付けされており、多型１型経膜分子が、ＮＫ細胞およびあるＴ細胞を含む、リンパ球のあるサブセットに存在する。ＫＩＲは、ＭＨＣクラスＩ分子のアルファ１および２ドメインにおける決定基と相互作用し、本明細書の他の箇所に記載するように、ＫＩＲがＮＫ細胞に対して刺激性または阻害性であるかにより異なる。

ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲと機能的および構造的性質を共有するＫＩＲ−ＣＡＲを含む。

ＫＩＲは、ＮＫ細胞に見られる細胞表面タンパク質のファミリーである。それらは、全細胞型に発現されるＭＨＣクラスＩ分子との相互作用により、これらの細胞の死滅機能を制御する。この相互作用により、これらはウイルス感染細胞または腫瘍細胞を検出することが可能となる。大部分のＫＩＲは阻害性であり、そのＭＨＣの認識が、それを発現するＮＫ細胞の細胞毒性活性を抑制することを意味する。限られた数のＫＩＲしか、細胞を活性化する能力を有しない。

ＫＩＲ遺伝子ファミリーは、染色体１９(１９ｑ１３.４)に位置する白血球受容体複合体(ＬＲＣ)の１００〜２００Kb領域内にコードされる、少なくとも１５遺伝子座(ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３および２偽遺伝子、ＫＩＲ２ＤＰ１およびＫＩＲ３ＤＰ１)を有する。ＬＲＣは、急速に進化している免疫遺伝子の大きな、１Mbの密集からなり、これは、特有のＩｇ様細胞外ドメインを有する他の細胞表面分子をコードする遺伝子を含む。さらに、拡張されたＬＲＣは、膜貫通アダプター分子ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２をコードする遺伝子を含む。

ＫＩＲ遺伝子は、４〜１６Kb(完全ゲノム配列)で長さが変わり、４〜９エクソンを含み得る。ＫＩＲ遺伝子は、構造的特性により３群の一つに属するとして分類される：(１)Ｄ１およびＤ２立体構造を有する２細胞外ドメインタンパク質をコードするＩ型ＫＩＲ２Ｄ遺伝子；(２)Ｄ０およびＤ２立体構造を有する２細胞外ドメインタンパク質をコードする構造的に多岐のII型ＫＩＲ２Ｄ遺伝子；そして最後に(３)３細胞外Ｉｇ様ドメイン(Ｄ０、Ｄ１およびＤ２)を有するタンパク質をコードするＫＩＲ３Ｄ遺伝子。

偽遺伝子ＫＩＲ２ＤＰ１ならびにＫＩＲ２ＤＬ１−３およびＫＩＲ２ＤＳ１−５遺伝子を含むＩ型ＫＩＲ２Ｄ遺伝子は、８エクソンならびに偽エクソン３配列を含む。この偽エクソンは、Ｉ型ＫＩＲ２Ｄで不活性化されている。いくつかの例において、これは、そのヌクレオチド配列がＫＩＲ３Ｄエクソン３配列と高い程度の同一性を示し、特徴的３塩基欠損を有する場所である、イントロン２−エクソン３スプライス部位に位置するヌクレオチド置換による。他の例では、早発性終止コドンが、エクソン３の差次的スプライシングを開始させる。Ｉ型ＫＩＲ２Ｄ群の遺伝子内で、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２は、これらのエキソンを全ての他のＫＩＲと区別するエクソン７に共通欠損を共有し、これは、短エクソン７配列に至る。同様に、Ｉ型ＫＩＲ２Ｄ内で、ＫＩＲ２ＤＬ１−３は、エクソン９における領域をコードする細胞質テイルの長さによってのみ、ＫＩＲ２ＤＳ１−５と異なる。ＫＩＲ２ＤＰ１偽遺伝子構造は、ＫＩＲ２ＤＬ１−３と、前者が一塩基対欠損により短エクソン４配列を有することによって異なる。

II型ＫＩＲ２Ｄ遺伝子は、ＫＩＲ２ＤＬ４およびＫＩＲ２ＤＬ５を含む。ＫＩＲ３ＤおよびＩ型ＫＩＲ２Ｄと異なり、II型ＫＩＲ２Ｄは、特徴的に、全ての他のＫＩＲにおけるエクソン４に対応する領域が欠失している。さらに、II型ＫＩＲ２Ｄ遺伝子は、Ｉ型ＫＩＲ２Ｄ遺伝子と、前者が翻訳エクソン３を処理するのに対し、Ｉ型ＫＩＲ２Ｄ遺伝子はその場所で非翻訳偽エクソン３配列を有することにより異なる。II型ＫＩＲ２Ｄ遺伝子内で、ＫＩＲ２ＤＬ４は、さらに、ＫＩＲ２ＤＬ５(ならびに他のＫＩＲ遺伝子)と、そのエクソン１配列の長さにより区別される。ＫＩＲ２ＤＬ４において、エクソン１は、６ヌクレオチド長く、他のＫＩＲ遺伝子に存在するものと異なる開始コドンを有することが判明した。この開始コドンは、他のＫＩＲ遺伝子に存在する開始コドンに対応するＫＩＲ２ＤＬ４における第二潜在的開始コドンよりも、‘コザック転写開始コンセンサス配列’とよく一致する。

ＫＩＲ３Ｄ遺伝子は９エクソン含み、構造的に関係するＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ３ＤＬ２およびＫＩＲ３ＤＬ３遺伝子を含む。ＫＩＲ３ＤＬ２ヌクレオチド配列は、全ＫＩＲ遺伝子で最長であり、完全ゲノム配列で１６,２５６bpおよびｃＤＮＡで１,３６８bpに及ぶ。ＫＩＲ３Ｄ群内で、４ＫＩＲ遺伝子が、エクソン９における細胞質テイルをコードする領域と長さが異なる。ＫＩＲタンパク質の細胞質テイルの長さは、１４アミノ酸残基長(あるＫＩＲ３ＤＳ１アレルにおける)〜１０８アミノ酸残基長(ＫＩＲ２ＤＬ４タンパク質における)で変わり得る。さらに、ＫＩＲ３ＤＳ１は、ＫＩＲ３ＤＬ１またはＫＩＲ３ＤＬ２と、前者が短エクソン８配列を有することにより異なる。ＫＩＲ３ＤＬ３は、他のＫＩＲ配列と、それがエクソン６を完全に欠くことにより異なる。観察された大部分の極端なＫＩＲ遺伝子構造差異は、ＫＩＲ３ＤＰ１のものであった。この遺伝子フラグメントは、エクソン６〜９を完全に欠き、時にエクソン２も欠く。存在する遺伝子の残存部分(エクソン１、３、４および５)は、他のＫＩＲ３Ｄ配列、特にＫＩＲ３ＤＬ３配列と高レベルの配列同一性を共有する。

ＫＩＲタンパク質は、特徴的Ｉｇ様ドメインをその細胞外領域に有し、あるＫＩＲタンパク質において、これは、ＨＬＡクラスＩリガンド結合に包含される。これらはまたＮＫ細胞に形質導入されるシグナルのタイプを規定する点で、機能的に関係する膜貫通および細胞質領域を有する。ＫＩＲタンパク質は２または３Ｉｇ様ドメイン(ゆえにＫＩＲ２ＤまたはＫＩＲ３Ｄ)ならびに短または長細胞質テイル(ＫＩＲ２ＤＳまたはＫＩＲ２ＤＬとして表される)を有し得る。２ドメインＫＩＲタンパク質を、存在する膜遠位Ｉｇ様ドメインの起点により２分に細分する。Ｉ型ＫＩＲ２Ｄタンパク質 (ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４およびＫＩＲ２ＤＳ５)は、ＫＩＲ３ＤＤ１Ｉｇ様ドメインの起点に得る維持する膜遠位Ｉｇ様ドメインを有するが、Ｄ０ドメインを欠く。このＤ１Ｉｇ様ドメインは、対応するＫＩＲ遺伝子の４エクソンにより主にコードされる。II型ＫＩＲ２Ｄタンパク質、ＫＩＲ２ＤＬ４およびＫＩＲ２ＤＬ５は、ＫＩＲ３Ｄタンパク質に存在するＤ０ドメインに類似する配列の膜遠位Ｉｇ様ドメインを有するが、しかしながら、II型ＫＩＲ２ＤはＤ１ドメインを欠く。長細胞質テイルは、通常２免疫チロシンベースの阻害性モチーフ(ＩＴＩＭ)を含み、これは、阻害性シグナルをＮＫ細胞に伝達する。短細胞質テイルは、膜貫通領域に正荷電アミノ酸残基を有し、これにより、活性化シグナルを産生できるＤＡＰ１２シグナル伝達分子との結合を可能にする。この例外はＫＩＲ２ＤＬ４であり、これはＮ末端ＩＴＩＭを１つのみ含む。さらに、ＫＩＲ２ＤＬ４はまたその膜貫通ドメインに荷電残基(アルギニン)も有し、阻害性および活性化の両シグナルをこの受容体に誘発させる特徴を示す。ＫＩＲは、潜在的標的細胞の表面のＭＨＣクラスＩリガンドの認識により阻害性または活性化シグナルを送達することにより、ヒトＮＫ細胞の応答を制御する。

ＫＩＲタンパク質は、３０６〜４５６アミノ酸残基まで長さが変わる。タンパク質長の差異は、大部分存在するＩｇ様ドメイン数の結果であるが、細胞質領域長多様性も影響を与える因子である。大部分のＫＩＲタンパク質のリーダーペプチドは２１アミノ酸残基長である。しかしながら、異なる開始コドンの存在は、ＫＩＲ２ＤＬ４タンパク質における対応して長いリーダーペプチドを産生する。

Ｄ０Ｉｇ様ドメインはII型ＫＩＲ２Ｄタンパク質に存在し、ＫＩＲ３Ｄタンパク質は約９６アミノ酸残基長である。Ｉ型ＫＩＲ２ＤおよびＫＩＲ３Ｄタンパク質のＤ１ドメインは１０２アミノ酸残基長であるが、全ＫＩＲタンパク質のＤ２ドメインは９８アミノ酸残基長である。幹領域の長さは、大部分のＫＩＲタンパク質に存在する２４アミノ酸残基から、多岐のＫＩＲ３ＤＬ３タンパク質におけるわずか７アミノ酸残基で変化する。膜貫通領域は、大部分のＫＩＲタンパク質で２０アミノ酸残基長であるが、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２タンパク質においてエクソン７における３塩基対欠損の結果、１残基短い。最後に、ＫＩＲタンパク質の細胞質領域は、あるＫＩＲ３ＤＳ１アレルにおける２３アミノ酸残基からＫＩＲ３ＤＬ２タンパク質に存在する９６アミノ酸残基までの大きな長さの変動を示す。

ヒトＫＩＲポリペプチド(Homo sapiens)のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手可能であり、例えば、受け入れ番号ＮＰ＿０３７４２１.２(ＧＩ：１３４２６８６４４)、ＮＰ＿７０３１４４.２(ＧＩ：４６４８８９４６)、ＮＰ＿００１２２９７９６.１(ＧＩ：３３８９６８８５２)、ＮＰ＿００１２２９７９６.１(ＧＩ：３３８９６８８５２)、ＮＰ＿００６７２８.２(ＧＩ：１３４２６８６４２)、ＮＰ＿０６５３９６.１(ＧＩ：１１９６８１５４)、ＮＰ＿００１０１８０９１.１(ＧＩ：６６２６７７２７)、ＮＰ＿００１０７７００８.１(ＧＩ：１３４１３３２４４)、ＮＰ＿０３６４４４.１(ＧＩ：６９１２４７２)、ＮＰ＿０５５３２７.１(ＧＩ：７６５７２７７)、ＮＰ＿０５６９５２.２(ＧＩ：７１１４３１３９)、ＮＰ＿０３６４４６.３(ＧＩ：１１６５１７３０９)、ＮＰ＿００１０７４２３９.１(ＧＩ：１２４１０７６１０)、ＮＰ＿００２２４６.５(ＧＩ：１２４１０７６０６)、ＮＰ＿００１０７４２４１.１(ＧＩ：１２４１０７６０４)、ＮＰ＿０３６４４５.１(ＧＩ：６９１２４７４)参照。

ＫＩＲの命名は、細胞外ドメイン数(ＫＩＲ２ＤおよびＫＩＲ３Ｄはそれぞれ２および３細胞外Ｉｇドメインを有する)および細胞質テイルが長いか(ＫＩＲ２ＤＬまたはＫＩＲ３ＤＬ)または短いか(ＫＩＲ２ＤＳまたはＫＩＲ３ＤＳ)に基づく。あるＫＩＲの存在または不在は、単一個体に存在するＮＫ集団内でＮＫ細胞毎に代わる。ヒトの中で、またＫＩＲ遺伝子の比較的高レベルの多型があり、あるＫＩＲ遺伝子はある個体に存在するが、全ての個体に存在しない。ＮＫ細胞のＫＩＲアレルの発現は確率的に制御されており、ある個体において、個体の遺伝子型によって、あるリンパ球が１、２またはそれ以上のＫＩＲを発現することを意味する。単一個体のＮＫ細胞は、一般にＫＩＲの異なる組み合わせを発現し、ＭＨＣクラスＩ分子に異なる特異性を有するＮＫ細胞のレパートリーを提供する。

あるＫＩＲ遺伝子産物は、適切なリガンドに結合したとき、リンパ球活性の刺激を引き起こす。活性化ＫＩＲは、全て、刺激性シグナルをＮＫ細胞に伝達する免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を有するアダプター分子と結合する、荷電経膜残基を有する短細胞質テイルを有する。対照的に、阻害性ＫＩＲは、ＭＨＣクラスＩリガンドとの結合により、阻害性シグナルをＮＫ細胞に伝達する、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ(ＩＴＩＭ)を含む長細胞質テイルを有する。既知阻害性ＫＩＲは、ＫＩＲ２ＤＬおよびＫＩＲ３ＤＬサブファミリーのメンバーを含む。２Ｉｇドメイン(ＫＩＲ２ＤＬ)を有する阻害性ＫＩＲは、ＨＬＡ−Ｃアロタイプを含む：ＫＩＲ２ＤＬ２(以前はｐ５８.２と命名)および密接に関係する、アレル遺伝子産物ＫＩＲ２ＤＬ３の両者は、“群１”ＨＬＡ−Ｃアロタイプ(ＨＬＡ−Ｃｗ１、−３、−７および−８を含む)を認識し、一方ＫＩＲ２ＤＬ１(ｐ５８.１)は、“群２”ＨＬＡ−Ｃアロタイプ(例えばＨＬＡ−Ｃｗ２、−４、−５および−６)を認識する。ＫＩＲ２ＤＬ１による認識は、ＨＬＡ−Ｃアレルの８０位のＬｙｓ残基の存在により指示される。ＫＩＲ２ＤＬ２およびＫＩＲ２ＤＬ３認識は、ＨＬＡ−Ｃの８０位のＡｓｎ残基の存在により指示される。重要なことに、ＨＬＡ−Ｃアレルの大部分は、８０位にＡｓｎ残基またはＬｙｓ残基のいずれかを有する。それゆえに、ＫＩＲ２ＤＬ１、−２および−３は、集合的に、ヒトに見られるＨＬＡ−Ｃアロタイプの本質的に全てを認識する。３Ｉｇドメインを有する一つのＫＩＲ、ＫＩＲ３ＤＬ１(ｐ７０)は、ＨＬＡ−Ｂｗ４アレルにより共有されるエピトープを認識する。最後に、３Ｉｇドメインを有する分子のホモダイマーであるＫＩＲ３ＤＬ２(ｐ１４０)は、ＨＬＡ−Ａ３および−Ａ１１を認識する。

しかしながら、本発明は、ＩＴＩＭを含む細胞質テイルを含む阻害性ＫＩＲに限定すべきではない。むしろ、阻害性シグナルと関係する細胞質ドメインを有するあらゆる阻害性タンパク質を、本発明のＣＡＲの構築に使用できる。阻害性タンパク質の非限定的例は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１などを含むが、これらに限定されない。これらのタンパク質は、Ｔ細胞活性化を阻害することが知られている。

したがって、本発明は、ＫＩＲまたはそのフラグメントに融合した、他に抗原結合ドメインとも称する標的特異的結合要素を含む、細胞外ドメインを含むＫＩＲ−ＣＡＲを提供する。ある態様において、ＫＩＲは、刺激性シグナルをＮＫ細胞に伝達する、免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を有するアダプター分子と結合した、短細胞質テイルを含む、活性化ＫＩＲを提供する(本明細書の他の箇所ではａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲと称する)。ある態様において、ＫＩＲは、阻害性シグナルを伝達する、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ(ＩＴＩＭ)を含む、長細胞質テイルを含む、阻害性ＫＩＲに関する(本明細書の他の箇所ではｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲと称する)。ある例において、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲを構築するとき、活性化ＫＩＲのためのヒンジ領域を除去することが望ましい。これは、本発明が、一部、ＫＩＲ２ＳＣＡＲを産生するためのＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジが除かれた活性化ＫＩＲＣＡＲの発見に基づき、このＫＩＲＳ２ＣＡＲが、完全長野生型ＫＩＲ２ＤＳ２を含むａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲと比較して、増強された細胞溶解性活性を示すからである。

本発明の所望の分子をコードする核酸配列は、標準法を使用する、例えば遺伝子を発現する細胞からのライブラリーのスクリーニング、それを含むことが知られるベクターからの遺伝子の導出、またはそれを含む細胞および組織からの直接の単離のような、当分野で知られる組み換え方法を使用して得ることができる。あるいは、目的の遺伝子を、クローン化ではなく、合成により産生できる。

本発明は、細胞に直接形質導入できるＫＩＲ−ＣＡＲを発現するレトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物を含む。本発明はまた、細胞に直接遺伝子導入できる、ＲＮＡ構築物も含む。遺伝子導入に使用するためのｍＲＮＡを産生する方法は、一般に５０〜２０００塩基長の、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)、５’キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)、発現する遺伝子およびポリＡテイルを含む構築物を産生するための、特別に設計されたプライマーを有する鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ富化を含む。このように産生されたＲＮＡは、異なる種の細胞に効率的に遺伝子導入され得る。ある態様において、鋳型は、ＫＩＲ−ＣＡＲの配列を含む。

ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲは、抗原結合ドメインおよびＫＩＲ膜貫通ドメインを含む。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲは、抗原結合ドメインおよびＫＩＲ細胞内ドメイン、例えば、ｉｎｈＫＩＲ細胞内ドメインを含む。

ここで使用する用語ＫＩＲＤドメインは、ＫＩＲのＤ０、Ｄ１またはＤ２ドメインをいう。

ここで使用する用語ＫＩＲＤドメインは、ＫＩＲのＤドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドドメインをいう。

ここで使用する用語ＫＩＲＤ０ドメインは、ＫＩＲのＤ０ドメインをいう。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲＤ０ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲＤ０ドメインまたはここに記載するＫＩＲＤ０ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲＤ０ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲＤ０ドメインまたはここに記載するＫＩＲＤ０ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲＤ０ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲＤ０ドメインまたはここに記載するＫＩＲＤ０ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲＤ０ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲＤ０ドメインまたはここに記載するＫＩＲＤ０ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＫＩＲＤ１ドメインは、ＫＩＲのＤ１ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドドメインをいう。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲＤ１ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲＤ１ドメインまたはここに記載するＫＩＲＤ１ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲＤ１ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲＤ１ドメインまたはここに記載するＫＩＲＤ１ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲＤ１ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲＤ０ドメインまたはここに記載するＫＩＲＤ１ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲＤ１ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲＤ１ドメインまたはここに記載するＫＩＲＤ１ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＫＩＲＤ２ドメインは、ＫＩＲのＤ２ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドドメインをいう。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲＤ２ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲＤ２ドメインまたはここに記載するＫＩＲＤ２ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲＤ２ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲＤ２ドメインまたはここに記載するＫＩＲＤ２ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲＤ２ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲＤ２ドメインまたはここに記載するＫＩＲＤ２ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲＤ２ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲＤ２ドメインまたはここに記載するＫＩＲＤ２ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＫＩＲヒンジまたは幹ドメインは、ＫＩＲのヒンジまたは幹ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドドメインをいう。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＫＩＲヒンジもしくは幹ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＫＩＲヒンジもしくは幹ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＫＩＲヒンジもしくは幹ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＫＩＲヒンジもしくは幹ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＫＩＲ膜貫通ドメインは、ＫＩＲの膜貫通ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドドメインをいう。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲ膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲ膜貫通ドメインまたはここに記載するＫＩＲ膜貫通ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲ膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲ膜貫通ドメインまたはここに記載するＫＩＲ膜貫通ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲ膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲ膜貫通ドメインまたはここに記載するＫＩＲ膜貫通ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲ膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲ膜貫通ドメインまたはここに記載するＫＩＲ膜貫通ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用するＫＩＲ細胞内ドメインは、ＫＩＲの細胞内ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドドメインをいう。ＫＩＲ細胞内ドメインは、阻害性ＫＩＲ細胞内ドメイン(ここでは、ｉｎｈＫＩＲ細胞内ドメインと称する)および活性化ＫＩＲ細胞内ドメイン(ここではａｃｔＫＩＲ細胞内ドメインと称する)を含む。ある態様において、ｉｎｈＫＩＲ細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ配列を含む。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲ細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲ細胞内ドメインまたはここに記載するＫＩＲ細胞内ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲ細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲ細胞内ドメインまたはここに記載するＫＩＲ細胞内ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲ細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲ細胞内ドメインまたはここに記載するＫＩＲ細胞内ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲ細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＫＩＲ細胞内ドメインまたはここに記載するＫＩＲ細胞内ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ＮＣＲ
ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲは、ＮＣＲと機能的および構造的性質を共有する、ＮＣＲ−ＣＡＲを含む。

ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞は、腫瘍およびウイルス感染細胞の破壊に特殊化された、細胞毒性リンパ系細胞である。細胞毒性Ｔリンパ球と異なり、ＮＫ細胞は抗原特異的受容体を発現しない。形質転換細胞の認識は、大量の細胞表面受容体と標的細胞の表面マーカーの結合により生じる。ＮＫ細胞表面受容体は、ＮＫ細胞介在細胞毒性を活性化するかまたは阻害するかにより区別され得る。異なる受容体間の多くの相互作用が、ＮＫと標的細胞のシナプスの形成に至るように見える。シナプスでの活性化および阻害性シグナルの組込みが、ＮＫ細胞が標的細胞に対する細胞溶解性機能を発揮すべきか否かを支持する。活性化受容体の中で、Ｉｇ様分子のファミリーは、天然細胞毒性受容体(ＮＣＲ)と呼ばれる。これらの天然細胞毒性受容体は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６分子を含む。ＮＣＲは、腫瘍細胞認識におけるＮＫ細胞のための重要な活性化受容体である。全３ＮＣＲが、腫瘍およびウイルス感染細胞両者の排除に関与する。後者において、抗ウイルス活性は、ＮＫｐ４４と、インフルエンザウイルスまたはセンダイウイルスのヘマグルチニンの相互作用により開始される。ＮＫｐ４６は、インフルエンザウイルスヘマグルチニンまたはセンダイウイルスヘマグルチニン−ノイラミニダーゼへの結合によりウイルス感染細胞を標的とする。対照的に、ＮＫ細胞介在細胞毒性が、ＮＫｐ３０のヒトサイトメガロウイルスタンパク質ｐｐ６５への結合により阻害される(例えば、Arnon, et. al., Nat. Immunol. (2005) 6:515-523参照)。

ヒトＮＣＲポリペプチドのアミノ酸配列(Homo sapiens)は、ＮＣＢＩデータベースから入手可能であり、例えば、受け入れ番号ＮＰ＿００４８１９.２(ＧＩ：１５３９４５７８２)、Ｏ１４９３１.１(ＧＩ：４７６０５７７０)、Ｏ９５９４４.２(ＧＩ：２５１７５７３０３)、Ｏ７６０３６.１(ＧＩ：４７６０５７７５)、ＮＰ＿００１１３８９３９.１(ＧＩ：２２４５８６８６５)および／またはＮＰ＿００１１３８９３８.１(ＧＩ：２２４５８６８６０)を参照のこと。

ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲは、抗原結合ドメインおよびＮＣＲ膜貫通ドメインを含む。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲは、抗原結合ドメインおよびＮＣＲ細胞内ドメインを含む。

ここで使用するＮＣＲ細胞外ドメイは、ＮＣＲの細胞外ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲのＮＣＲ細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＮＣＲ細胞外ドメインまたはここに記載するＮＣＲ細胞外ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲのＮＣＲ細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＮＣＲ細胞外ドメインまたはここに記載するＮＣＲ細胞外ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲのＮＣＲ細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＮＣＲ細胞外ドメインまたはここに記載するＮＣＲ細胞外ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲのＮＣＲ細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＮＣＲ細胞外ドメインまたはここに記載するＮＣＲ細胞外ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＮＣＲヒンジまたは幹ドメインは、ＮＣＲのヒンジまたは幹ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲのＮＣＲヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＮＣＲヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＮＣＲヒンジもしくは幹ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲのＮＣＲヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＮＣＲヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＮＣＲヒンジもしくは幹ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲのＮＣＲヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＮＣＲヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＮＣＲヒンジもしくは幹ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲのＮＣＲヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＮＣＲヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＮＣＲヒンジもしくは幹ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＮＣＲ膜貫通ドメインは、ＮＣＲの膜貫通ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲのＮＣＲ膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＮＣＲ膜貫通ドメインまたはここに記載するＮＣＲ膜貫通ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲのＮＣＲ膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＮＣＲ膜貫通ドメインまたはここに記載するＮＣＲ膜貫通ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲのＮＣＲ膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＮＣＲ膜貫通ドメインまたはここに記載するＮＣＲ膜貫通ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲのＮＣＲ膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＮＣＲ膜貫通ドメインまたはここに記載するＮＣＲ膜貫通ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＮＣＲ細胞内ドメインは、ＮＣＲの細胞内ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲのＮＣＲ細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＮＣＲ細胞内ドメインまたはここに記載するＮＣＲ細胞内ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲのＮＣＲ細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＮＣＲ細胞内ドメインまたはここに記載するＮＣＲ細胞内ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲのＮＣＲ細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＮＣＲ細胞内ドメインまたはここに記載するＮＣＲ細胞内ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＮＣＲ−ＣＡＲのＮＣＲ細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＮＣＲ細胞内ドメインまたはここに記載するＮＣＲ細胞内ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ＳＬＡＭ受容体
ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲは、ＳＬＡＭＦと機能的および構造的性質を共有する、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲを含む。

免疫細胞受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子(ＳＬＡＭ)ファミリーは、免疫グロブリン(Ｉｇ)スーパーファミリーの分子のＣＤ２ファミリーと密接に関係する。ＳＬＡＭファミリー(ＳＬＡＭＦ)は、現在、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥおよびＣＤ２Ｆ−１０と名づけられた９メンバーを含む。一般に、ＳＬＡＭ分子は、２〜４細胞外Ｉｇドメイン、膜貫通セグメントおよび細胞内チロシン富領域を含む。本分子は、多様な免疫細胞型で種々に発現される。いくつかは自己リガンドであり、ＳＬＡＭは、ヒト麻疹ウイルス受容体として同定されている。いくつかのＳＨ２含有アダプタータンパク質は、ＳＬＡＭファミリーメンバーの細胞内ドメインと結合し、ＳＨ２Ｄ１Ａ(別名ＳＬＡＭ関連タンパク質[ＳＡＰ])およびＳＨ２Ｄ１Ｂ(別名ＥＡＴ２)を含む受容体シグナル伝達を介在することが知られている。例えば、Ｔ細胞およびＮＫ細胞において、活性化ＳＬＡＭファミリー受容体は、チロシンリン酸化され、アダプターＳＡＰおよび続いてＳｒｃキナーゼＦｙｎを補充する。後に続くシグナル伝達カスケードは、Ｔ細胞−抗原提示細胞およびＮＫ細胞−標的細胞相互作用の結果に影響する。

ヒトＳＬＡＭ受容体ポリペプチドのアミノ酸配列(Homo sapiens)は、ＮＣＢＩデータベースから入手可能であり、例えば、受け入れ番号ＮＰ＿０５７４６６.１(ＧＩ：７７０６５２９)、ＮＰ＿０６７００４.３(ＧＩ：１９９２３５７２)、ＮＰ＿００３０２８.１(ＧＩ：４５０６９６９)、ＮＰ＿００１１７１８０８.１(ＧＩ：２９６４３４２８５)、ＮＰ＿００１１７１６４３.１(ＧＩ：２９６０４０４９１)、ＮＰ＿００１７６９.２(ＧＩ：２１３６１５７１)、ＮＰ＿２５４２７３.２(ＧＩ：２２６３４２９９０)、ＮＰ＿０６４５１０.１(ＧＩ：９９１０３４２)および／またはＮＰ＿００２３３９.２(ＧＩ：５５９２５５７８)を参照のこと。

ある態様において、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲは、抗原結合ドメインおよびＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインを含む。ある態様において、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲは、抗原結合ドメインおよびＳＬＡＭＦ細胞内ドメインを含む。

ここで使用する用語ＳＬＡＭＦ細胞外ドメインは、ＳＬＡＭＦの細胞外ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲのＳＬＡＭＦ細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＳＬＡＭＦ細胞外ドメインまたはここに記載するＳＬＡＭＦ細胞外ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲのＳＬＡＭＦ細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＳＬＡＭＦ細胞外ドメインまたはここに記載するＳＬＡＭＦ細胞外ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲのＳＬＡＭＦ細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＳＬＡＭＦ細胞外ドメインまたはここに記載するＳＬＡＭＦ細胞外ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲのＳＬＡＭＦ細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＳＬＡＭＦ細胞外ドメインまたはここに記載するＳＬＡＭＦ細胞外ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＳＬＡＭＦヒンジまたは幹ドメインは、ＳＬＡＭＦのヒンジまたは幹ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲのＳＬＡＭＦヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＳＬＡＭＦヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＳＬＡＭＦヒンジもしくは幹ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲのＳＬＡＭＦヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＳＬＡＭＦヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＳＬＡＭＦヒンジもしくは幹ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲのＳＬＡＭＦヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＳＬＡＭＦヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＳＬＡＭＦヒンジもしくは幹ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲのＳＬＡＭＦヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＳＬＡＭＦヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＳＬＡＭＦヒンジもしくは幹ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインは、ＳＬＡＭＦの膜貫通ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲのＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインまたはここに記載するＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲのＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインまたはここに記載するＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲのＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインまたはここに記載するＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲのＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインまたはここに記載するＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＳＬＡＭＦ細胞内ドメインは、ＳＬＡＭＦの細胞内ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲのＳＬＡＭＦ細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＳＬＡＭＦ細胞内ドメインまたはここに記載するＳＬＡＭＦ細胞内ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲのＳＬＡＭＦ細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＳＬＡＭＦ細胞内ドメインまたはここに記載するＳＬＡＭＦ細胞内ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲのＳＬＡＭＦ細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＳＬＡＭＦ細胞内ドメインまたはここに記載するＳＬＡＭＦ細胞内ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲのＳＬＡＭＦ細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＳＬＡＭＦ細胞内ドメインまたはここに記載するＳＬＡＭＦ細胞内ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

Ｆｃ結合受容体
ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲは、ＣＤ１６およびＣＤ６４と機能的および構造的性質を共有する、Ｆｃ受容体、ＦｃＲ−ＣＡＲ、例えば、ＣＤ１６−ＣＡＲおよびＣＤ６４−ＣＡＲに基づくＣＡＲを含む。

活性化により、ＮＫ細胞はサイトカインおよびケモカインを豊富に産生し、同時に強力な細胞溶解性活性を発揮する。ＮＫ細胞の活性化は、直接殺腫瘍細胞で見られるような、ＮＫ細胞受容体の標的細胞のリガンドへの直接結合を介してまたは抗原担持細胞に結合した抗体のＦｃ部分の結合によるＦｃ受容体(ＣＤ１６；ＦｃγＲIII)の架橋を介して生じ得る。このＣＤ１６結合(ＣＤ１６架橋)は、ＣＤ１６関連アダプター鎖、ＦｃＲγまたはＣＤ３ζの一方または両方を産生する細胞内シグナルを経るＮＫ細胞応答を開始する。ＣＤ１６の惹起は、γまたはζ鎖のリン酸化をもたらし、これが続いてチロシンキナーゼ、ｓｙｋおよびＺＡＰ−７０を補充し、迅速かつ強力なエフェクター機能に至るシグナル伝達のカスケードを開始する。最も有名なエフェクター機能は、抗体依存性細胞性細胞毒性の過程を経て近隣標的細胞を殺す毒性タンパク質を運搬する細胞質顆粒の遊離である。ＣＤ１６架橋はまたサイトカインおよびケモカインも産生させ、これが、続いて、一連の免疫応答を活性化しかつ組織化する。

しかしながら、ＴおよびＢリンパ球と異なり、ＮＫ細胞は、生殖系列コード化活性化受容体を使用する標的認識について限られた能力しか有さないと考えられていた(Bottino et al., Curr Top Microbiol Immunol. 298:175-182 (2006); Stewart et al., Curr Top Microbiol Immunol. 298:1-21 (2006))。ＮＫ細胞は、活性化Ｆｃ受容体ＣＤ１６を発現し、これがＩｇＧ被覆標的細胞を認識し、それにより標的認識が拡張される((Ravetch & Bolland, Annu Rev Immunol. 19:275-290 (2001); Lanier Nat. Immunol. 9(5):495-502 (2008); Bryceson & Long, Curr Opin Immunol. 20(3):344-352 (2008))。数ＮＫ細胞活性化受容体の発現およびシグナル伝達活性は物理的に結合したアダプターを必要とし、これは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を経てシグナルを伝達する。これらのアダプターの中で、ＦｃＲγおよびＣＤ３ζ鎖は、ジスルフィド結合ホモダイマーまたはヘテロダイマーとしてＣＤ１６および天然細胞毒性受容体(ＮＣＲ)と結合でき、これらの鎖は全成熟ＮＫ細胞により発現されると考えられている。

ＣＤ１６のアミノ酸配列(Homo sapiens)はＮＣＢＩデータベースから入手可能であり、例えば、受け入れ番号ＮＰ＿０００５６０.５(ＧＩ：５０７２６９７９)、ＮＰ＿００１２３１６８２.１(ＧＩ：３４８０４１２５４)を参照のこと。

ある態様において、ＦｃＲ−ＣＡＲは、抗原結合ドメインおよびＦｃＲ膜貫通ドメインを含む。ある態様において、ＦｃＲ−ＣＡＲは、抗原結合ドメインおよびＦｃＲ細胞内ドメインを含む。

ここで使用するＣＤ１６細胞外ドメインは、ＣＤ１６の細胞外ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＣＤ１６−ＣＡＲのＣＤ１６細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ１６細胞外ドメインまたはここに記載するＣＤ１６細胞外ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＣＤ１６−ＣＡＲのＣＤ１６細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ１６細胞外ドメインまたはここに記載するＣＤ１６細胞外ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＣＤ１６−ＣＡＲのＣＤ１６細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ１６細胞外ドメインまたはここに記載するＣＤ１６細胞外ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＣＤ１６−ＣＡＲのＣＤ１６細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ１６細胞外ドメインまたはここに記載するＣＤ１６細胞外ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＣＤ１６ヒンジまたは幹ドメインは、ＣＤ１６のヒンジまたは幹ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＣＤ１６−ＣＡＲのＣＤ１６ヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ１６ヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＣＤ１６ヒンジもしくは幹ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＣＤ１６−ＣＡＲのＣＤ１６ヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ１６ヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＣＤ１６ヒンジもしくは幹ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＣＤ１６−ＣＡＲのＣＤ１６ヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ１６ヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＣＤ１６ヒンジもしくは幹ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＣＤ１６−ＣＡＲのＣＤ１６ヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ１６ヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＣＤ１６ヒンジもしくは幹ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＣＤ１６膜貫通ドメインは、ＣＤ１６の膜貫通ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＣＤ１６−ＣＡＲのＣＤ１６膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ１６膜貫通ドメインまたはここに記載するＣＤ１６膜貫通ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＣＤ１６−ＣＡＲのＣＤ１６膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ１６膜貫通ドメインまたはここに記載するＣＤ１６膜貫通ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＣＤ１６−ＣＡＲのＣＤ１６膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ１６膜貫通ドメインまたはここに記載するＣＤ１６膜貫通ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＣＤ１６−ＣＡＲのＣＤ１６膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ１６膜貫通ドメインまたはここに記載するＣＤ１６膜貫通ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＣＤ１６細胞内ドメインは、ＣＤ１６の細胞内ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＣＤ１６−ＣＡＲのＣＤ１６細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ１６細胞内ドメインまたはここに記載するＣＤ１６細胞内ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＣＤ１６−ＣＡＲのＣＤ１６細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ１６細胞内ドメインまたはここに記載するＣＤ１６細胞内ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＣＤ１６−ＣＡＲのＣＤ１６細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ１６細胞内ドメインまたはここに記載するＣＤ１６細胞内ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＣＤ１６−ＣＡＲのＣＤ１６細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ１６細胞内ドメインまたはここに記載するＣＤ１６細胞内ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＣＤ６４細胞外ドメインは、ＣＤ６４の細胞外ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＣＤ６４−ＣＡＲのＣＤ６４細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ６４細胞外ドメインまたはここに記載するＣＤ６４細胞外ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＣＤ６４−ＣＡＲのＣＤ６４細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ６４細胞外ドメインまたはここに記載するＣＤ６４細胞外ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＣＤ６４−ＣＡＲのＣＤ６４細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ６４細胞外ドメインまたはここに記載するＣＤ６４細胞外ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＣＤ６４−ＣＡＲのＣＤ６４細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ６４細胞外ドメインまたはここに記載するＣＤ６４細胞外ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＣＤ６４ヒンジまたは幹ドメインは、ＣＤ６４のヒンジまたは幹ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＣＤ６４−ＣＡＲのＣＤ６４ヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ６４ヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＣＤ６４ヒンジもしくは幹ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＣＤ６４−ＣＡＲのＣＤ６４ヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ６４ヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＣＤ６４ヒンジもしくは幹ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＣＤ６４−ＣＡＲのＣＤ６４ヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ６４ヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＣＤ６４ヒンジもしくは幹ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＣＤ６４−ＣＡＲのＣＤ６４ヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ６４ヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＣＤ６４ヒンジもしくは幹ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＣＤ６４膜貫通ドメインは、ＣＤ６４の膜貫通ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＣＤ６４−ＣＡＲのＣＤ６４膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ６４膜貫通ドメインまたはここに記載するＣＤ６４膜貫通ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＣＤ６４−ＣＡＲのＣＤ６４膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ６４膜貫通ドメインまたはここに記載するＣＤ６４膜貫通ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＣＤ６４−ＣＡＲのＣＤ６４膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ６４膜貫通ドメインまたはここに記載するＣＤ６４膜貫通ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＣＤ６４−ＣＡＲのＣＤ６４膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ６４膜貫通ドメインまたはここに記載するＣＤ６４膜貫通ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＣＤ６４細胞内ドメインは、ＣＤ６４の細胞内ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＣＤ６４−ＣＡＲのＣＤ６４細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ６４細胞内ドメインまたはここに記載するＣＤ６４細胞内ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＣＤ６４−ＣＡＲのＣＤ６４細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ６４細胞内ドメインまたはここに記載するＣＤ６４細胞内ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＣＤ６４−ＣＡＲのＣＤ６４細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ６４細胞内ドメインまたはここに記載するＣＤ６４細胞内ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＣＤ６４−ＣＡＲのＣＤ６４細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＤ６４細胞内ドメインまたはここに記載するＣＤ６４細胞内ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

Ｌｙ４９および関係するキラー細胞レクチン様受容体
ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲは、Ｌｙ４９と機能的および構造的性質を共有するＬｙ４９−ＣＡＲを含む。

Ｌｙ４９受容体は、マウスにおける少なくとも２３の同定された遺伝子(Ｌｙ４９Ａ−Ｗ)に由来する。これらの受容体は、構造が異なる(Ｃ型レクチンスーパーファミリーのII型膜内在性タンパク質)にも関わらず、ヒトにおけるＫＩＲにより演じられるのと同じ役割を大部分マウスＮＫ細胞およびＴ細胞において共有し、それらはまたヒトＫＩＲのような相当な程度の遺伝的変異も含む。Ｌｙ４９とＫＩＲ受容体の著しい機能的類似性は、受容体のこれらの群が、ＮＫ細胞およびＴ細胞において同じ生理的機能を実施するように、独立的に、しかし、集中的に進化したことを示唆する。

ヒトにおけるＫＩＲと同様、異なるＬｙ４９受容体が異なるＭＨＣクラスＩアレルを認識し、ＮＫ細胞のサブセットで差示的に発現される。元のプロトタイプＬｙ４９受容体、Ｌｙ４９ＡおよびＬｙ４９Ｃは、ＫＩＲ２ＤＬ３のような阻害性ＫＩＲに類似する２免疫チロシンベースの阻害性モチーフ(ＩＴＩＭ)を担持する細胞質ドメインを有する。これらのドメインは、ホスファターゼ、ＳＨＰ−１を補充し、阻害性ＫＩＲのように、ＮＫ細胞の活性化およびＴ細胞の制限に働く。阻害性Ｌｙ４９分子に加えて、Ｌｙ４９ＤおよびＬｙ４９Ｈのような数ファミリーメンバーがＩＴＩＭ含有ドメインの喪失を有し、代わりに、ヒトにおけるＫＩＲ２ＤＳ２のような活性化ＫＩＲに類似して、シグナル伝達アダプター分子、ＤＡＰ１２と相互作用する能力を有する。

Ｌｙ４９ファミリーメンバーのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手可能であり、例えば、受け入れ番号ＡＡＦ８２１８４.１(ＧＩ：９２３０８１０)、ＡＡＦ９９５４７.１(ＧＩ：９８０１８３７)、ＮＰ＿０３４７７８.２(ＧＩ：１３３９２２５９３)、ＮＰ＿０３４７７９.１(ＧＩ：６７５４４６２)、ＮＰ＿００１０９５０９０.１(ＧＩ：１９７３３３７１８)、ＮＰ＿０３４７７６.１(ＧＩ：２１３２７６６５)、ＡＡＫ１１５５９.１(ＧＩ：１３０２１８３４)および／またはＮＰ＿０３８８２２.３(ＧＩ：９２５６５４９)を参照のこと。

ある態様において、Ｌｙ４９−ＣＡＲは、抗原結合ドメインおよびＬｙ４９膜貫通ドメインを含む。ある態様において、Ｌｙ４９−ＣＡＲは、抗原結合ドメインおよびＬｙ４９細胞内ドメインを含む。

ここで使用する用語ＬＹ４９細胞外ドメインは、ＬＹ４９の細胞外ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＬＹ４９−ＣＡＲのＬＹ４９細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＬＹ４９細胞外ドメインまたはここに記載するＬＹ４９細胞外ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＬＹ４９−ＣＡＲのＬＹ４９細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＬＹ４９細胞外ドメインまたはここに記載するＬＹ４９細胞外ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＬＹ４９−ＣＡＲのＬＹ４９細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＬＹ４９細胞外ドメインまたはここに記載するＬＹ４９細胞外ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＬＹ４９−ＣＡＲのＬＹ４９細胞外ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＬＹ４９細胞外ドメインまたはここに記載するＬＹ４９細胞外ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＬＹ４９ヒンジまたは幹ドメインは、ＬＹ４９のヒンジまたは幹ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＬＹ４９−ＣＡＲのＬＹ４９ヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＬＹ４９ヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＬＹ４９ヒンジもしくは幹ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＬＹ４９−ＣＡＲのＬＹ４９ヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＬＹ４９ヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＬＹ４９ヒンジもしくは幹ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＬＹ４９−ＣＡＲのＬＹ４９ヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＬＹ４９ヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＬＹ４９ヒンジもしくは幹ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＬＹ４９−ＣＡＲのＬＹ４９ヒンジまたは幹ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＬＹ４９ヒンジもしくは幹ドメインまたはここに記載するＬＹ４９ヒンジもしくは幹ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＬＹ４９膜貫通ドメインは、ＬＹ４９の膜貫通ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＬＹ４９−ＣＡＲのＬＹ４９膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＬＹ４９膜貫通ドメインまたはここに記載するＬＹ４９膜貫通ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＬＹ４９−ＣＡＲのＬＹ４９膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＬＹ４９膜貫通ドメインまたはここに記載するＬＹ４９膜貫通ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＬＹ４９−ＣＡＲのＬＹ４９膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＬＹ４９膜貫通ドメインまたはここに記載するＬＹ４９膜貫通ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＬＹ４９−ＣＡＲのＬＹ４９膜貫通ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＬＹ４９膜貫通ドメインまたはここに記載するＬＹ４９膜貫通ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ここで使用する用語ＬＹ４９細胞内ドメインは、ＬＹ４９の細胞内ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＬＹ４９−ＣＡＲのＬＹ４９細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＬＹ４９細胞内ドメインまたはここに記載するＬＹ４９細胞内ドメインと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＬＹ４９−ＣＡＲのＬＹ４９細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＬＹ４９細胞内ドメインまたはここに記載するＬＹ４９細胞内ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＬＹ４９−ＣＡＲのＬＹ４９細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＬＹ４９細胞内ドメインまたはここに記載するＬＹ４９細胞内ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＬＹ４９−ＣＡＲのＬＹ４９細胞内ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＬＹ４９細胞内ドメインまたはここに記載するＬＹ４９細胞内ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

細胞内シグナル伝達ドメインまたはアダプター分子、例えば、ＤＡＰ１２
あるＮＫＲ−ＣＡＲは、他の分子、例えば、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＩＴＡＭを含む分子と相互作用する。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインはＤＡＰ１２である。

ＤＡＰ１２は、構造的特性および仮定機能により、そう名づけられる。ある細胞表面受容体は、内因性機能性を欠き、これは、仮説上他のタンパク質パートナーと相互作用でき、１２kDタンパク質であることを示唆する。シグナル伝達機構は、ＩＴＡＭシグナルを含み得る。

ＤＡＰ１２は、ＣＤ３への仮説上の関係(Olcese, et al. (1997) J. Immunol. 158:5083-5086参照)、ＩＴＡＭ配列の存在(Thomas (1995) J. Exp. Med. 181:1953-1956参照)、あるサイズ予測(Olcese；およびTakase, et al. (1997) J. Immunol. 159:741-747参照)および他の特性に基づき、配列データベースから同定された。特に、膜貫通ドメインは荷電残基を含むと仮説だてられ、これは、塩がその推定受容体パートナー、ＫＩＲＣＤ９４タンパク質の対応する膜貫通セグメントおよび恐らく他の類似タンパク質と架橋するのを可能とする。Daeron, et al. (1995) Immunity 3:635-646参照。

実際、既知ＫＩＲ、ＭＩＲ、ＩＬＴおよびＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体分子の多くは、実際に、機能的受容体複合体の一部であるアクセサリータンパク質と機能し得る。Olcese, et al. (1997) J. Immunol. 158:5083-5086; およびTakase, et al. (1997) J. Immunol. 159:741-747参照。

ここで使用する用語ＤＡＰ１２ドメインは、ＤＡＰ１２の細胞質ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいい、一般にＩＴＡＭドメインを含む。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＤＡＰ１２ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＤＡＰ１２またはここに記載するＤＡＰ１２と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＤＡＰ１２ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＤＡＰ１２またはここに記載するＤＡＰ１２とその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＤＡＰ１２ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＤＡＰ１２またはここに記載するＤＡＰ１２と５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＤＡＰ１２ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＤＡＰ１２またはここに記載するＤＡＰ１２と異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ＤＡＰ１０は、一部、ＤＡＰ１２との相同性および他の特性により同定された。特に、ＩＴＡＭ活性化モチーフを示すＤＡＰ１２と対照的に、ＤＡＰ１０はＩＴＩＭ阻害性モチーフを示す。ＭＤＬ−１は、ＤＡＰ１２とのその機能的関係により同定された。

例えば、ＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０と、そのアクセサリー受容体との機能的相互作用は、通常、切断受容体方では見られない受容体における構造的組み合わせの使用を可能にし得る。それゆえに、ＤＡＰ１２およびＤＡＰ１０のようなアクセサリータンパク質を経るシグナル伝達機構は、例えば、ＫＩＲ、ＭＩＲ、ＩＬＴおよびＣＤ９４ＮＫＧ２型受容体との、他のＫＩＲ様受容体複合体の興味深い操作を可能にする。機能的シグナル伝達複合体を形成するようにＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０と相互作用する完全受容体の切断型は、構築され得る。

ＤＡＰ１２の霊長類ヌクレオチド配列は、配列番号３３２のヌクレオチド１〜３３９に対応し、アミノ酸配列は、配列番号３３３のアミノ酸１〜１１３に対応する。シグナル配列は、ｍｅｔ(−２６)からｇｌｎ(−１)またはａｌａ１まで伸びているように見え、成熟タンパク質ほぼａｌａ１(またはｇｌｎ２)、細胞外ドメイン、ａｌａ１からｐｒｏ１４まで伸びており；細胞外ドメインは、７位および９位に２システインを含み、これはさらなる同型または異型アクセサリータンパク質へのジスルフィド結合を可能にする可能性があり；膜貫通領域は、ほぼｇｌｙ１５またはｖａｌ１６からほぼｇｌｙ３９まで伸びており；そしてＩＴＡＭモチーフはｔｙｒ６５からｌｅｕ７９(ＹｘｘＬ−６／８ｘ−ＹｘｘＬ)まで伸びる(配列番号３４１)。ＬＶＡ０３ＡＥＳＴが同定され、他の重複配列の抽出に使用された。またヒトＤＡＰ１２の部分であるＧｅｎｂａｎｋＨｕｍａｎＥＳＴ；いくつか、しかし全てではない、包括的ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＡ４８１９２４；Ｈ３９９８０；Ｗ６０９４０；Ｎ４１０２６；Ｒ４９７９３；Ｗ６０８６４；Ｗ９２３７６；Ｈ１２３３８；Ｔ５２１００；ＡＡ４８０１０９；Ｈ１２３９２；Ｗ７４７８３；およびＴ５５９５９も参照のこと。

阻害性ＮＫＲ−ＣＡＲＳ
本発明は、ある種のＣＡＲＴ細胞療法により、非癌性細胞の枯渇を制限するための組成物および方法を提供する。ここに開示するように、ある種のＣＡＲＴ細胞療法は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)として知られる、ＮＫ細胞の活性化および阻害性受容体を含むが、これらに限定されないＮＫ受容体を含む。よって、本発明は、活性化ＮＫＲ−ＣＡＲ(ａｃｔＮＫＲ−ＣＡＲ)、例えば、活性化ＫＩＲ−ＣＡＲ(ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲ)および阻害性ＮＫＲ−ＣＡＲ(ｉｎｈＮＫＲ−ＣＡＲ)、例えば、阻害性ＫＩＲ−ＣＡＲ(ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲ)を含むが、これらに限定されない、ＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲを含む、組成物および使用方法を提供する。

ある態様において、ＩｎｈＫＩＲ−ＣＡＲのＫＩＲは、阻害性シグナル(本明細書の他の箇所ではｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲと称する)を伝達する免疫受容体抑制性チロシンモチーフ(ＩＴＩＭ)を含む長細胞質テイルを含む、阻害性ＫＩＲを含む。

ある態様において、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲは、ＫＩＲ以外の阻害性分子の細胞質ドメインを含む。これらの阻害性分子は、ある態様において、細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低減させ得る。阻害性分子の細胞質ドメインを、例えば、融合により、ＫＩＲの膜貫通ドメインに結合し得る。阻害性分子の例を表１に示す。

ある態様において、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲは、ＰＤ１細胞質ドメインを含む。ここで使用する用語ＰＤ１細胞質ドメインは、ＰＤ１の細胞質ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＰＤ１細胞質ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＰＤ１細胞質ドメインまたはここに記載するＰＤ１細胞質ドメイン(配列番号３３８)と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＰＤ１細胞質ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＰＤ１細胞質ドメインまたはここに記載するＰＤ１細胞質ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＰＤ１細胞質ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＰＤ１細胞質ドメインまたはここに記載するＰＤ１細胞質ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＰＤ１細胞質ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＰＤ１細胞質ドメインまたはここに記載するＰＤ１細胞質ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ある態様において、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲは、ＣＴＬＡ−４細胞質ドメインを含む。ここで使用する用語ＣＴＬＡ−４細胞質ドメインは、ＣＴＬＡ−４の細胞質ドメインの構造的および機能的性質を有するポリペプチドをいう。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＣＴＬＡ−４細胞質ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＴＬＡ−４細胞質ドメインまたはここに記載するＣＴＬＡ−４細胞質ドメイン(配列番号３３９)と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有する。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＣＴＬＡ−４細胞質ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＴＬＡ−４細胞質ドメインまたはここに記載するＣＴＬＡ−４細胞質ドメインとその残基が１５％、１０％、５％、２％または１％を超えて異ならない。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＣＴＬＡ−４細胞質ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＴＬＡ−４細胞質ドメインまたはここに記載するＣＴＬＡ−４細胞質ドメインと５、４、３、２または１残基を超えて異ならない。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲのＣＴＬＡ−４細胞質ドメインは、対照配列、例えば、天然に存在するＣＴＬＡ−４細胞質ドメインまたはここに記載するＣＴＬＡ−４細胞質ドメインと異ならないまたは１００％相同性を共有する。

ある態様において、ｉｎｈＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲは、非標的またはバイスタンダー細胞の抗原との結合により、ｉｎｈＮＫＲ−ＣＡＲを含む細胞毒性細胞を不活性化する。下記の大部分はｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲに関するが、本発明は、他のｉｎｈＮＫＲ−ＣＡＲの類似する適用も含む。

ある態様において、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲを発現するＴ細胞は、その標的との結合により抗腫瘍性質を発揮し、一方、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲがその標的と結合したとき、細胞活性の阻害をもたらす。

ＫＩＲ−ＣＡＲのタイプに関わらず、ＫＩＲ−ＣＡＲは、細胞質ドメインに融合する抗原結合ドメインを有する細胞外ドメインを含むように、操作する。ある態様において、ＫＩＲ−ＣＡＲは、Ｔ細胞で発現されたとき、抗原特異性に基づく抗原認識を再指示できる。抗原の例はＣＤ１９であり、なぜなら、この抗原がＢ細胞リンパ腫に発現されるからである。しかしながら、ＣＤ１９はまた正常Ｂ細胞でも発現され、ゆえに抗ＣＤ１９ドメインを含むＣＡＲは、正常Ｂ細胞の枯渇に至り得る。正常Ｂ細胞の枯渇は、Ｂ細胞が通常感染制御においてＴ細胞を助けるため、処置対象を感染に感受性とする。本発明は、ＫＩＲ−ＣＡＲＴ細胞療法中の正常組織の枯渇を制限するための組成物および方法を提供する。ある態様において、本発明は、健常バイスタンダー細胞の枯渇を制限しながら、ＫＩＲ−ＣＡＲＴ細胞療法を使用する癌および他の障害を処置する方法を提供する。

ある態様において、本発明は、ＫＩＲ−ＣＡＲＴ細胞活性の調節または制御を含む。ある態様において、本発明は、複数のタイプのＫＩＲ−ＣＡＲを発現するように遺伝子修飾したＴ細胞と関係する組成物および方法を含み、ここで、ＫＩＲ−ＣＡＲＴ細胞活性化は、複数のタイプのＫＩＲ−ＣＡＲのその標的受容体への結合に依存する。複数のタイプのＫＩＲ−ＣＡＲの結合への依存は、ＫＩＲ−ＣＡＲＴ細胞の溶解性活性の特異性を改善し、それにより正常健常組織を枯渇する可能性を減らす。

他の態様において、本発明は、阻害性ＫＩＲ−ＣＡＲを有する遺伝子修飾Ｔ細胞と関係する組成物および方法を含む。ある態様において、阻害性ＫＩＲ−ＣＡＲは、正常、非癌性、細胞および阻害性細胞質ドメインと結合する抗原を認識する、細胞外抗原結合ドメインを含む。

ある態様において、本発明は、Ｔ細胞をｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲおよびａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲを発現するように遺伝子修飾したデュアルＫＩＲ−ＣＡＲを提供する。ある態様において、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲの正常、非癌性細胞への結合は、デュアルＫＩＲ−ＣＡＲＴ細胞の阻害をもたらす。例えば、ある態様において、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲの正常、非癌性細胞への結合は、デュアルＫＩＲ−ＣＡＲＴ細胞の死をもたらす。他の態様において、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲの正常、非癌性細胞への結合は、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲのシグナル伝達の阻害をもたらす。さらに他の態様において、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲの正常、非癌性細胞への結合は、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲＴ細胞が抗腫瘍活性を発揮することを阻止するシグナル伝達シグナルの誘導をもたらす。したがって、本発明の少なくとも１ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲおよび少なくとも１ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲを含むデュアルＫＩＲ−ＣＡＲは、デュアルＫＩＲ−ＣＡＲＴ細胞の活性を制御する機構を提供する。

ある態様において、本発明は、正常健常組織の枯渇を最小にしながら、ＫＩＲ−ＣＡＲＴ細胞療法を癌および他の障害の処置に使用する方法を提供する。癌は、造血器腫瘍、固形腫瘍、原発または転移腫瘍であり得る。本発明の組成物および方法を使用して処置可能な他の疾患は、ウイルス、細菌および寄生虫感染症ならびに自己免疫性疾患を含む。

細胞外ヒンジドメイン
ここで使用する用語細胞外ヒンジドメインは、膜貫通ドメインと抗原結合ドメインの間に位置するＮＫＲ−ＣＡＲのポリペプチド配列をいう。ある態様において、細胞外ヒンジドメインは、細胞の外表面と抗原結合ドメインの間の十分な距離ならびに細胞と抗原結合ドメインの間の立体障害を最小化する柔軟性を可能とする。ある態様において、細胞外ヒンジドメインは、ＮＫＲ−ＣＡＲを含む細胞と抗原担持細胞、例えば、標的細胞の結合を妨害しないように十分に短いかまたは柔軟である。ある態様において、細胞外ヒンジドメインは、２〜２０、５〜１５、７〜１２または８〜１０アミノ酸長である。ある態様において、ヒンジドメインは、少なくとも５０、２０または１０残基を含む。ある態様において、ヒンジは１０〜３００、１０〜２５０または１０〜２００残基長である。ある態様において、ヒンジが細胞から伸びる距離は、ヒンジが標的細胞表面との結合を妨害しないように、十分短い。ある態様において、ヒンジは、細胞毒性細胞表面から２０、１５または１０ナノメートル未満伸びる。それゆえに、ヒンジの適合性は、ヒンジの直線長、アミノ酸残基数および柔軟性により影響され得る。ＩｇＧ４ヒンジは２００アミノ酸長ほど長い可能性があるが、細胞毒性細胞表面から伸びる距離は、Ｉｇドメイン折りたたみにより小さい。約４３アミノ酸であるＣＤ８アルファヒンジは、むしろ約８nm長の直線である。対照的に、ＩｇＧ４Ｃ２およびＣ３ヒンジは約２００アミノ酸長であるが、ＣＤ８アルファヒンジと同等な細胞毒性細胞表面からの距離を有する。理論に縛られることを望まないが、伸長の類似性は、柔軟性により影響される。

ある例において、細胞外ヒンジドメインは、例えば、ヒトタンパク質、そのフラグメントまたは短オリゴまたはポリペプチドリンカーからのヒンジである。

ある態様において、ヒンジは人工配列である。ある態様において、ヒンジは、グリシン−セリンダブレットを含む短オリゴペプチドリンカーである。

ある態様において、ヒンジは天然に存在する配列である。ある態様において、ヒンジは、ヒトＩｇ(免疫グロブリン)ヒンジまたはそのフラグメントであり得る。ある態様において、例えば、ヒンジは、ＩｇＧ４ヒンジのアミノ酸配列(配列番号３)を含む(例えば、からなる)。ある態様において、例えば、ヒンジは、ＩｇＤヒンジのアミノ酸配列(配列番号４)を含む(例えば、からなる)。ある態様において、ヒンジは、ヒトＣＤ８ヒンジまたはそのフラグメントであり得る。ある態様において、例えば、ヒンジは、ＣＤ８ヒンジのアミノ酸配列(配列番号２)を含む(例えば、からなる)。ヒンジドメインのさらなる配列例を表５に提供する。

ＴＣＡＲＳ
ある態様において、本発明のＣＡＲ細胞療法は、ＴＣＡＲと組み合わせたＮＫＲ−ＣＡＲを含む。ある態様において、本発明のＣＡＲ細胞療法は、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲ発現細胞は、さらに、ＴＣＡＲを含む、例えば、発現する。別の態様において、本発明のＣＡＲ細胞療法は、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲを発現する第一細胞およびＴＣＡＲを発現する第二細胞を含む。

ある態様において、ＴＣＡＲは、細胞内ドメイン、例えば、細胞質ドメインに融合した抗原結合ドメインを含む。ある態様において、細胞質ドメインは細胞内シグナル伝達ドメインを含み、それが融合している細胞外ドメイン、例えば、抗原結合ドメインがカウンターリガンドに結合したとき、細胞内シグナルを生じる。細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび共刺激性シグナル伝達ドメインを含み得る。ある態様において、ＴＣＡＲ分子は、ＴＣＡＲ分子が免疫細胞と一般に関係しているポリペプチド由来する、ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、共刺激性シグナル伝達ドメイン、阻害性ドメインなどを含むように、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞における発現のために構築され得る。例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞での発現のためのＴＣＡＲは４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインを含み得る。この場合、４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータドメインの両者は、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞と関係するポリペプチド由来である。他の態様において、ＴＣＡＲ分子は、ＴＣＡＲ分子が、免疫エフェクター細胞と一般に関係しないポリペプチドに由来するドメインを含むように、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞における発現のために構築され得る。あるいは、ＮＫ細胞における発現のためのＴＣＡＲは、Ｔ細胞由来の４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３ゼータドメインを含み得る(例えば、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１３／０３３６２６号参照)。

次の部分は、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲおよびＴＣＡＲの構築および発現およびその使用方法に関する。

抗原結合ドメイン
ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＫＩＲ−ＣＡＲおよびＴＣＡＲは、細胞外領域に抗原結合ドメインを含む。ここで使用する用語“抗原結合ドメイン”は、標的抗原、一般に標的細胞、例えば、癌細胞上の抗原に親和性を有する分子をいう。抗原結合ドメインの例は、ポリペプチド、例えば、抗体分子(抗体およびその抗原結合フラグメント、例えば、免疫グロブリン、単一ドメイン抗体(ｓｄＡｂ)およびｓｃＦｖを含む)または非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチンなどを含む。ある態様において、抗原結合ドメインは、単一ポリペプチドである。ある態様において、抗原結合ドメインは、１、２またはそれ以上のポリペプチドを含む。

抗原結合ドメインの選択は、標的細胞表面を規定するリガンドまたは受容体のタイプおよび数による。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態と関係する標的細胞の細胞表面マーカーとして働く、リガンドまたは受容体を認識するように選択し得る。リガンドまたは受容体として働き得る細胞表面マーカーの例は、特定の疾患状態と関係する細胞表面マーカー、例えば、ウイルス疾患、細菌疾患、寄生虫感染症、自己免疫性疾患および望まない細胞増殖と関係する障害、例えば、癌、例えば、ここに記載する癌の細胞表面マーカーを含む。

本開示の文脈において、“腫瘍抗原”または“増殖性障害抗原”または“増殖性障害と関係する抗原”は、特定の増殖性障害に共通する抗原をいう。ある面において、本発明の増殖性障害抗原は、原発または転移黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌(例えば、ＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣ)、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、神経膠芽腫、神経芽腫、子宮癌、頸部癌、腎臓癌、甲状腺癌、膀胱癌、腎臓癌および乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸癌のような腺癌などを含むが、これらに限定されない癌由来である。ある態様において、癌は、Ｂ細胞急性リンパ系白血病(“ＢＡＬＬ”)、Ｔ細胞急性リンパ系白血病(“ＴＡＬＬ”)、急性リンパ系白血病(ＡＬＬ)、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)；慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の慢性白血病；Ｂ細胞前リンパ性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞−または大細胞−濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、周辺帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を含むが、これらに限定されないさらなる血液癌または血液学的状態を含むが、これらに限定されない。

ある態様において、腫瘍抗原は、哺乳動物の癌腫瘍に由来する腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)により免疫学的に認識される１以上の抗原性癌エピトープを含む。

腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞介在免疫応答を惹起する腫瘍細胞により産生されるタンパク質である。本発明の抗原結合ドメインの選択は、処置する特定のタイプの癌による。腫瘍抗原は当分野で周知であり、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２０６０６号に記載する腫瘍抗原を含む。ある態様において、腫瘍抗原は、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)、ＥＧＦＲｖIII、インターロイキン−１１受容体アルファ(ＩＬ−１１Ｒａ)、インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２(ＩＬ−１３ＲａまたはＣＤ２１３Ａ２)、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、Ｂ７Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｋｉｔ(ＣＤ１１７)、炭酸脱水酵素(ＣＡ−ＩＸ)、ＣＳ−１(別名ＣＤ２サブセット１)、ムチン１、細胞表面関連(ＭＵＣ１)、ＢＣＭＡ、易切断領域(ＢＣＲ)およびアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１(Ａｂｌ)からなる癌遺伝子融合タンパク質ｂｃｒ−ａｂｌ、受容体チロシン−タンパク質キナーゼＥＲＢＢ２(ＨＥＲ２／ｎｅｕ)、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン(ＡＦＰ)、未分化リンパ腫キナーゼ(ＡＬＫ)、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、サイクリンＢ１、レクチン反応性ＡＦＰ、Ｆｏｓ関連抗原１、アドレナリン受容体ベータ３(ＡＤＲＢ３)、サイログロブリン、チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２(ＥｐｈＡ２)、終末糖化産物の受容体(ＲＡＧＥ−１)、腎臓遍在性１(ＲＵ１)、腎臓遍在性２(ＲＵ２)、滑膜肉腫、Ｘブレークポイント２(ＳＳＸ２)、Ａキナーゼ係留タンパク質４(ＡＫＡＰ−４)、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(ＬＣＫ)、プロアクロシン結合タンパク質ｐ３２(ＯＹ−ＴＥＳ１)、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５(ＰＡＸ５)、Ｔ細胞により認識される扁平上皮細胞癌抗原３(ＳＡＲＴ３)、Ｃ型レクチン様分子−１(ＣＬＬ−１またはＣＬＥＣＬ１)、フコシルＧＭ１、ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分(ＧｌｏｂｏＨ)、ＭＮ−ＣＡＩＸ、上皮性細胞接着分子(ＥＰＣＡＭ)、ＥＶＴ６−ＡＭＬ、トランスグルタミナーゼ５(ＴＧＳ５)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(ｈＴＥＲＴ)、ポリシアル酸、胎盤特異的１(ＰＬＡＣ１)、腸カルボキシルエステラーゼ、ルイスＹ抗原、シアリルルイス接着分子(ｓＬｅ)、リンパ球抗原６複合体、座位Ｋ９(ＬＹ６Ｋ)、ヒートショックタンパク質７０−２変異(ｍｕｔｈｓｐ７０−２)、Ｍ−ＣＳＦ、ｖ−ｍｙｃ鳥骨髄骨髄除去ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ(ＭＹＣＮ)、ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ(ＲｈｏＣ)、チロシナーゼ関連タンパク質２(ＴＲＰ−２)、シトクロムＰ４５０１Ｂ１(ＣＹＰ１Ｂ１)、ＣＣＣＴＣ結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(ＢＯＲＩＳまたはBrother of the regulator of imprinted sites)、プロスターゼ、前立腺特異的抗原(ＰＳＡ)、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３(ＰＡＸ３)、前立腺酸ホスファターゼ(ＰＡＰ)、癌／精巣抗原１(ＮＹ−ＥＳＯ−１)、癌／精巣抗原２(ＬＡＧＥ−１ａ)、ＬＭＰ２、神経細胞接着分子(ＮＣＡＭ)、腫瘍タンパク質ｐ５３(ｐ５３)、ｐ５３変異体、ラット肉腫(Ｒａｓ)変異体、糖タンパク質１００(ｇｐ１００)、プロステイン、ＯＲ５１Ｅ２、パネキシン３(ＰＡＮＸ３)、前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)、前立腺幹細胞抗原(ＰＳＣＡ)、、高分子量黒色腫関連抗原(ＨＭＷＭＡＡ)、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１(ＨＡＶＣＲ１)、血管内皮細胞増殖因子受容体２(ＶＥＧＦＲ２)、血小板由来増殖因子受容体ベータ(ＰＤＧＦＲ−ベータ)、レグマイン、ヒト乳頭腫ウイルスＥ６(ＨＰＶＥ６)、ヒト乳頭腫ウイルスＥ７(ＨＰＶＥ７)、サバイビン、テロメラーゼ、精子タンパク質１７(ＳＰＡ１７)、ステージ特異的胚性抗原−４(ＳＳＥＡ−４)、チロシナーゼ、ＴＣＲガンマ交互読取枠タンパク質(ＴＡＲＰ)、ウィルムス腫瘍タンパク質(ＷＴ１)、前立腺−癌腫瘍抗原−１(ＰＣＴＡ−１)、アポトーシスの黒色腫阻害因子(ＭＬ−ＩＡＰ)、ＭＡＧＥ、黒色腫関連抗原１(ＭＡＧＥ−Ａ１)、黒色腫癌精巣抗原−１(ＭＡＤ−ＣＴ−１)、黒色腫癌精巣抗原−２(ＭＡＤ−ＣＴ−２)、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原１(ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１)、Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ(ＸＡＧＥ１)、伸長因子２変異(ＥＬＦ２Ｍ)、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合ｇｅｎｅ)、Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ(ＮＡ１７)、好中球エラスターゼ、肉腫転座切断点、乳腺分化抗原(ＮＹ−ＢＲ−１)、エフリンＢ２、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ９７、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、アンドロゲン受容体、インスリン増殖因子(ＩＧＦ)−Ｉ、ＩＧＦ−II、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ガングリオシドＧＤ２(ＧＤ２)、ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド(ＯＡｃＧＤ２)、ガングリオシドＧＤ３(ａＮｅｕ５Ａｃ(２−８)ａＮｅｕ５Ａｃ(２−３)ｂＤＧａｌｐ(１−４)ｂＤＧｌｃｐ(１−１)Ｃｅｒ)、ガングリオシドＧＭ３(ａＮｅｕ５Ａｃ(２−３)ｂＤＧａｌｐ(１−４)ｂＤＧｌｃｐ(１−１)Ｃｅｒ)、Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ(ＧＰＲＣ５Ｄ)、Ｇタンパク質共役受容体２０(ＧＰＲ２０)、染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１(ＣＸＯＲＦ６１)、葉酸受容体(ＦＲａ)、葉酸受容体ベータ、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１(ＲＯＲ１)、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３(Ｆｌｔ３)、腫瘍関連糖タンパク質７２(ＴＡＧ７２)、Ｔｎ抗原(ＴＮＡｇまたは(ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ))、アンギオポエチン結合細胞表面受容体２(Ｔｉｅ２)、腫瘍内皮マーカー１(ＴＥＭ１またはＣＤ２４８)、腫瘍内皮マーカー７関連(ＴＥＭ７Ｒ)、クローディン６(ＣＬＤＮ６)、甲状腺刺激ホルモン受容体(ＴＳＨＲ)、ウロプラキン２(ＵＰＫ２)、メソテリン、プロテアーゼセリン２１(TestisinまたはＰＲＳＳ２１)、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(ＦＡＰ)、嗅覚受容体５１Ｅ２(ＯＲ５１Ｅ２)、ＥＴＳ転座バリアント遺伝子６、染色体１２ｐに位置(ＥＴＶ６−ＡＭＬ)、ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１(ＬＡＩＲ１)；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント(ＦＣＡＲまたはＣＤ８９)；白血球免疫グロブリン様受容体ｓｕｂファミリーＡメンバー２(ＬＩＬＲＡ２)；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ(ＣＤ３００ＬＦ)；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ(ＣＬＥＣ１２Ａ)；骨髄間質細胞抗原２(ＢＳＴ２)；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２(ＥＭＲ２)；リンパ球抗原７５(ＬＹ７５)；グリピカン−３(ＧＰＣ３)；Ｆｃ受容体様５(ＦＣＲＬ５)；および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１(ＩＧＬＬ１)から選択される。好ましい態様において、腫瘍抗原は、葉酸受容体(ＦＲａ)、メソテリン、ＥＧＦＲｖIII、ＩＬ−１３Ｒａ、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、ＣＡ−ＩＸ、ＭＵＣ１、ＨＥＲ２およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

ある態様において、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関係する１以上の抗原性癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として働き得る多数のタンパク質を発現する。これらの分子は、黒色腫におけるＭＡＲＴ−１、チロシナーゼおよびＧＰ１００ならびに前立腺癌における前立腺酸ホスファターゼ(ＰＡＰ)および前立腺特異的抗原(ＰＳＡ)のような組織特異的抗原を含むが、これらに限定されない。他の標的抗原は、癌遺伝子ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２のような形質転換関連分子を含む。標的抗原のさらに他の群は、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)のような癌胎児性抗原を含む。Ｂ細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個体の腫瘍に独特な、真の腫瘍特異的免疫グロブリン抗原からなる。ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３７のようなＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。

腫瘍抗原の非限定的例は次のものを含む：ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ(ＭＡＲＴ−Ｉ)、ｇｐ１００(Ｐｍｅｌ１７)、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２のような分化抗原およびＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５のような腫瘍特異的多系列抗原；ＣＥＡのような過発現胚性抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕのような過発現癌遺伝子および変異腫瘍サプレッサー遺伝子；ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲのような染色体転座に起因する独特な腫瘍抗原；およびエプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ)抗原Ｅ６およびＥ７のようなウイルス抗原。他の大きな、タンパク質ベースの抗原は、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７.１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ベータ−Ｃａｔｅｎｉｎ、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ−フェトプロテイン、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３／ＣＡ２７.２９／ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３／ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０／Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰおよびＴＰＳを含む。

標的とする所望の抗原によって、本発明のＣＡＲは、所望の抗原標的に特異的な適切な抗原結合ドメインを含むように操作され得る。

抗体分子由来の抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗体分子、例えば、１以上のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、例えば、ヒトまたはラクダ科起源の、例えば、重鎖可変ドメイン(ＶＨ)、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)および可変ドメイン(ＶＨＨ)に由来し得る。ある例において、抗原結合ドメインが、ＣＡＲが最終的に使用されるのと同じ種由来であることが有益であり、例えば、ヒトでの使用のために、ＣＡＲ、例えば、ここに記載する、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲの抗原結合ドメインが、ヒトまたはヒト化抗原結合ドメインを含むことが有益であり得る。抗体は、当分野で知られる技術を使用して得ることができる。

ある面において、ｓｃＦｖは、リーダー配列と連続し、同じリーディングフレームにある。ある面において、リーダー配列は、配列番号１として提供するアミノ酸配列である。

ある面において、抗原結合ドメインは、フラグメント、例えば、単鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)である。ある面において、抗原結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、(Ｆａｂ’)２、または二機能性(例えば二特異的)ハイブリッド抗体である(例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105(1987))。ある面において、本発明の抗体およびそのフラグメントは、野生型のまたは増強した親和性で腫瘍抗原タンパク質またはそのフラグメントと結合する。

ある例において、ｓｃＦｖｓは、当分野で知られる方法により製造できる(例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。上記および他の箇所に記載のように、ＳｃＦｖ分子は、可動性ポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨ領域とＶＬ領域を一緒に連結することにより産生できる。ｓｃＦｖ分子は、最適長および／またはアミノ酸組成を有するリンカー(例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー)を含む。柔軟ポリペプチドリンカー長は、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短ポリペプチドリンカーを用いるならば(例えば、５〜１０アミノ酸)、鎖内折りたたみは阻止される。鎖内折りたたみは、２可変領域が一体となって機能的エピトープ結合部位を形成させるためにも必要である。リンカー配向およびサイズの例は、例えば、引用により本明細書に包含させるHollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開２００５／０１００５４３号、２００５／０１７５６０６号、２００７／００１４７９４号およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０２０２５８号およびＷＯ２００７／０２４７１５号参照。

ｓｃＦｖは、そのＶＬ領域とＶＨ領域の間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上のアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含み得る。ある態様において、ｓｃＦｖのペプチドリンカーは、可変重鎖および可変軽鎖領域を連結するために、単独でまたは組み合わせて使用される、グリシンおよび／またはセリン残基のようなアミノ酸からなる。ある態様において、柔軟ポリペプチドリンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、例えば、アミノ酸配列(Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎ(ここで、ｎは１以上の正の整数である)(配列番号４０)を含む。ある態様において、柔軟ポリペプチドリンカーは、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２７)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号２８)を含むが、これらに限定されない。他の態様において、リンカーは(Ｇｌｙ２Ｓｅｒ)、(ＧｌｙＳｅｒ)または(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)(配列番号２９)の複数反復を含む。

ある態様において、抗原結合ドメインは、単一ドメイン抗原結合(ＳＤＡＢ)分子である。ＳＤＡＢ分子は、相補的決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である分子を含む。例は、重鎖可変ドメイン、軽鎖を天然に欠く結合分子、慣用の４鎖抗体由来の単一ドメイン、操作されたドメインおよび抗体由来のもの以外の単一ドメインスキャフォールドを含むが、これらに限定されない。ＳＤＡＢ分子は、当分野のまたは将来的な単一ドメイン分子であり得る(例えば、下により詳細に記載)。ＳＤＡＢ分子は、当分野で知られるあらゆるものまたはあらゆる将来的な単一ドメイン分子であり得る。ＳＤＡＢ分子は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含むが、これらに限定されないいずれかの種由来であり得る。この用語はまたラクダ科およびサメ以外の種由来の天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含む。

ある面において、ＳＤＡＢ分子は、例えば、サメの血清に見られる新規抗原受容体(ＮＡＲ)として知られる免疫グロブリンアイソタイプ由来であるような、魚類で見られる免疫グロブリンの可変領域に由来し得る。ＮＡＲ(“ＩｇＮＡＲ”)の可変領域由来の単一ドメイン分子を製造する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１号およびStreltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909に記載されている。

他の面によって、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖を欠く重鎖として知られる天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子である。このような単一ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４０４６７８号およびHamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448に記載されている。明確化するために、天然に軽鎖を欠く重鎖分子由来のこの可変ドメインは、ここでは、４鎖免疫グロブリンの慣用のＶＨと区別するために、ＶＨＨまたはナノボディとして知られる。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコ由来であり得る。ラクダ科以外の他の種は天然に軽鎖を欠く重鎖分子を産生し得、このようなＶＨＨは本発明の範囲内である。

ある態様において、ＳＤＡＢ分子は、１以上の標的抗原に結合する相補性可変ドメインまたは免疫グロブリン定常領域、例えば、Ｆｃ領域を欠く、１以上の単一ドメイン分子(例えば、ナノボディ)を含む単鎖融合ポリペプチドである。

ＳＤＡＢ分子は、組み換え、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化および／またはインビトロ産生され得る(例えば、ファージディスプレーにより選択)。

ある態様において、抗原結合ドメイン部分は、ヒト抗体またはそのフラグメントを含む。

ある態様において、非ヒト抗体は、抗体の特異的配列または領域が、ヒトで天然に産生される抗体との類似性を高めるように修飾される、ヒト化である。ある態様において、抗原結合ドメインは、ヒト化である。

非ヒト抗体を、ＣＤＲ移植(例えば、各々をその全体を引用により本明細書に包含させる、欧州特許ＥＰ２３９,４００号；国際公開ＷＯ９１／０９９６７号；および米国特許５,２２５,５３９号、５,５３０,１０１号および５,５８５,０８９号参照)、ベニアリングまたはリサーフェシング(例えば、各々をその全体を引用により本明細書に包含させる欧州特許ＥＰ５９２,１０６号およびＥＰ５１９,５９６号；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4／5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; およびRoguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973参照)、鎖シャッフリング(例えば、その全体を引用により本明細書に包含させる米国特許５,５６５,３３２号参照)および、例えば、各々引用によりその全体を本明細書に包含させる米国特許出願公開ＵＳ２００５／００４２６６４号、米国特許出願公開ＵＳ２００５／００４８６１７、米国特許６,４０７,２１３号、米国特許５,７６６,８８６号、国際公開ＷＯ９３１７１０５号、Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994)およびPedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)に記載の技術を含むが、これらに限定されない、当分野で知られる多様な方法を使用してヒト化できる。しばしば、フレームワーク領域におけるフレームワーク残基を、抗原結合を変える、例えば改善するために、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換する。これらのフレームワーク置換は、当分野で周知の方法、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリングおよび特定の位置の異常フレームワーク残基を同定するための配列比較により、同定される(例えば、引用により本明細書に包含させるQueen et al.、米国特許５,５８５,０８９号；およびRiechmann et al., 1988, Nature, 332:323参照)。好ましい態様において、ヒト化抗体分子は、ここに記載する配列、例えば、ここに記載する可変軽鎖および／または可変重鎖、例えば、表４に記載するヒト化可変軽鎖および／または可変重鎖を含む。

ヒト化抗体は、非ヒトである源から残留している１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、一般に“インポート”可変ドメインからとられる、“インポート”残基という。それゆえに、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリン分子由来のＣＤＲおよびヒトからのフレームワーク領域を含む。抗体のヒト化は当分野で知られ、本質的に、Winter and co-workers (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従い、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより、すなわち、ＣＤＲ移植(内容を引用によりその全体を本明細書に包含させるＥＰ２３９,４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７号；および米国特許４,８１６,５６７号；６,３３１,４１５号；５,２２５,５３９号；５,５３０,１０１号；５,５８５,０８９号；６,５４８,６４０号)により実施できる。このようなヒト化抗体および抗体フラグメントにおいて、非ヒト種からの対応する配列により置換されるのは実質的に完全より少ないヒト可変ドメインである。このようなヒト化キメラ抗体において、実質的に完全ヒト可変ドメイン未満が非ヒト種からの対応する配列で置換されている。実施に際し、ヒト化抗体は、一般にいくらかのＣＤＲ残基および恐らくいくつかのフレームワーク(ＦＲ)残基が、齧歯類抗体の類似部位からの残基で置換されている、ヒト抗体である。抗体のヒト化は、ベニアリングまたはリサーフェシング(ＥＰ５９２,１０６号；ＥＰ５１９,５９６号；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4／5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); およびRoguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)))または鎖シャッフリング(米国特許５,５６５,３３２号)によっても達成でき、その内容は、引用によりその全体を本明細書に包含させる。

ある態様において、本発明の抗体は、さらに、ここに開示するＶＨおよび／またはＶＬ配列の１以上を有する抗体を出発物質として使用し、修飾抗体を設計することによって製造でき、この修飾抗体は、出発抗体と比較して性質が改変され得る。種々の態様において、抗体は、可変領域の一方または両方(すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ)内、例えば１以上のＣＤＲ領域内および／または１以上のフレームワーク領域内の１以上のアミノ酸の修飾により操作される。

他の面において、抗原結合ドメインは、Ｔ細胞受容体(“ＴＣＲ”)またはそのフラグメント、例えば、単鎖ＴＣＲ(ｓｃＴＣＲ)である。このようなＴＣＲを製造する方法は、当分野で知られる。例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000); Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004); Aggen et al, Gene Ther. 19(4):365-74 (2012)参照(文献は、引用によりその全体をここに包含させる)。例えば、リンカー(例えば、柔軟ペプチド)により連結したＴ細胞クローンから、ＶαおよびＶβ遺伝子を含むｓｃＴＣＲが、操作される。このアプローチは、それ自体細胞内であるが、しかしながら、このような抗原(ペプチド)のフラグメントが、ＭＨＣにより癌細胞表面に提示されている、癌関連標的に有用である。

ある態様において、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲまたはＴＣＡＲ分子は、ここに記載する腫瘍抗原と特異的に結合するｓｃＦｖを含む抗原結合ドメインを含む。ここに記載する腫瘍抗原と特異的に結合するｓｃＦｖのアミノ酸配列を表４に提供する。ある態様において、表４に提供するｓｃＦｖ配列のＣＤＲに下線を引く。あるＣＤＲの厳密なアミノ酸配列境界は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａに記載のものまたはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームの組み合わせを含む、多数の周知の番号付けスキームのいずれかを使用して、決定できる。

表４に提供するｓｃＦｖ配列は、ｓｃＦｖの可変重鎖および可変軽鎖を連結するリンカー配列を含む。リンカー配列は、ここに記載するリンカー配列、例えば、表５に提供するリンカー配列のいずれでもよい。

表４に提供するｓｃＦｖ配列のいくつかの配列はリーダー配列、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するが、表４に提供するｓｃＦｖ配列のいくつかは、リーダー配列、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含まないことも注意すべきである。リーダー配列、例えば、配列番号１を伴いまたは伴わずに表４に提供するｓｃＦｖ配列も本発明に包含される。当業者は、リーダー配列、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を伴うまたは伴わないＣＡＲのｓｃＦｖまたは抗原結合ドメインを、表４に提供する配列を使用して容易に使用できる。

ある態様において、メソテリンに対する抗原結合ドメインは、表４に記載する抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｓ１、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、１０、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１５、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ１９、Ｍ２０、Ｍ２１、Ｍ２２、Ｍ２３またはＭ２４、例えば、ｓｓ１、Ｍ５またはＭ１１の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。ある態様において、メソテリンに対する抗原結合ドメインは、表４に記載するヒト抗メソテリン結合ドメイン、例えば、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、１０、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１５、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ１９、Ｍ２０、Ｍ２１、Ｍ２２、Ｍ２３またはＭ２４、例えば、Ｍ５またはＭ１１のヒト抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。ある態様において、メソテリンに結合する抗原結合ドメインは、引用により本明細書に包含するＷＯ２０１５／０９０２３０号の表２〜３の抗原結合ドメインである。

ある態様において、メソテリンに結合するヒト抗原結合ドメインは、マウス抗原結合ドメインＳ１(表４に示す)により結合されるエピトープと同じエピトープに結合する。ある態様において、メソテリンに結合するヒト抗原結合ドメインは、マウス抗原結合ドメインＳ１(表４に示す)により結合されるエピトープと異なるエピトープに結合する。引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１５／０９０２３０号に記載のように、表４に記載するＭ−５およびＭ−１１ヒト抗メソテリン結合ドメインは、ＳＳ１と異なるエピトープに結合する。

ある態様において、ＣＬＬ−１に対する抗原結合ドメインは、Ｒ＆Ｄ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｂｃａｍから入手可能な抗体、例えば、ＰＥ−ＣＬＬ１−ｈｕＣａｔ＃３５３６０４(BioLegend)；およびＰＥ−ＣＬＬ１(ＣＬＥＣ１２Ａ) Ｃａｔ＃５６２５６６(ＢＤ)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。ある態様において、ＣＬＬ−１に対する抗原結合部分は、表４に記載する抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えば、１３９１１５、１３９１１６、１３９１１７、１３９１１８、１３９１１９、１３９１２０、１３９１２１、１３９１２１、１３９１２２、１４６２５９、１４６２６１、１４６２６２、１４６２６３、１４６２６４または１８１２８６の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。

ある態様において、ＣＤ１２３に対する抗原結合ドメインは、表４に記載する抗ＣＤ１２３結合ドメイン、例えば、ＣＤ１２３−１、ＣＤ１２３−２、ＣＤ１２３−３、ＣＤ１２３−４またはｈｚＣＡＲ１−３２の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。ある態様において、ＣＤ１２３に対する抗原結合ドメインは、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１４／１３０６３５号の表１〜２の抗原結合ドメインである。ある態様において、ＣＤ３３に対する抗原結合ドメインは、例えば、Bross et al., Clin Cancer Res 7(6):1490-1496 (2001) (Gemtuzumab Ozogamicin, hP67.6),Caron et al., Cancer Res 52(24):6761-6767 (1992) (Lintuzumab, HuM195), Lapusan et al., Invest New Drugs 30(3):1121-1131 (2012) (AVE9633), Aigner et al., Leukemia 27(5): 1107-1115 (2013) (AMG330, CD33 BiTE), Dutour et al., Adv hematol 2012:683065 (2012), and Pizzitola et al., Leukemia doi:10.1038/Lue.2014.62 (2014)に記載される抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。ある態様において、ＣＤ３３の抗原結合部分は、表４に記載する抗ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、１４１６４３、１４１６４４、１４１６４５、１４１６４６、１４１６４７、１４１６４８、１４１６４９、１４１６５０、１４１６５１、２２１３またはＭｙ９６の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。

ある態様において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Mujoo et al., Cancer Res. 47(4):1098-1104 (1987); Cheung et al., Cancer Res 45(6):2642-2649 (1985), Cheung et al., J Clin Oncol 5(9):1430-1440 (1987), Cheung et al., J Clin Oncol 16(9):3053-3060 (1998), Handgretinger et al., Cancer Immunol Immunother 35(3):199-204 (1992)に記載する抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。ある態様において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、ｍＡｂ１４.１８、１４Ｇ２ａ、ｃｈ１４.１８、ｈｕ１４.１８、３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８、３Ｇ６、８Ｂ６、６０Ｃ３、１０Ｂ８、ＭＥ３６.１および８Ｈ９から選択される抗体の抗原結合部分であり、例えば、ＷＯ２０１２０３３８８５号、ＷＯ２０１３０４０３７１号、ＷＯ２０１３１９２２９４号、ＷＯ２０１３０６１２７３号、ＷＯ２０１３１２３０６１号、ＷＯ２０１３０７４９１６号およびＷＯ２０１３８５５５２号参照のこと。ある態様において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、米国公開２０１００１５０９１０号またはＰＣＴ公開ＷＯ２０１１１６０１１９号に記載の抗体の抗原結合部分である。

ある態様において、ＢＣＭＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＷＯ２０１２１６３８０５号、ＷＯ２００１１２８１２号およびＷＯ２００３０６２４０１号に記載する抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。ある態様において、ｂｃｍａに対する抗原結合ドメインは、表４に記載する抗ｂｃｍａ結合ドメイン、例えば、１３９１００、１３９１０１、１３９１０２、１３９１０３、１３９１０４、１３９１０５、１３９１０６、１３９１０７、１３９１０８、１３９１０９、１３９１１０、１３９１１１、１３９１１２、１３９１１３、１３９１１４、１４９３６２、１４９３６３、１４９３６４、１４９３６５、１４９３６６、１４９３６７、１４９３６８、１４９３６９、ＥＢｃ１９７８−Ａ４、ＥＢＣ１９７８−Ｇ１、ＥＢＢＣ１９７８−Ｃ７、ＥＢＢＣ１９７８−Ｄ１０、ＥＢＢＣ１９７８−Ａ１０、ＥＢＢＣ１９７８−Ｄ４、ＥＢＢＣ１９７８−Ｇ４、ＥＢＢＣ１９７９−Ｃ１、ＥＢＢＣ１９７９−Ｃ１２、ＥＢＢＣ１９８０−Ｇ４、ＥＢＢＣ１９８０−Ｄ２、ＥＢＢＣ１９８０−Ａ２、ＥＢＢＣ１９８１− Ｃ３、ｈｕｓｃＦｖＢＣＭＡ１またはｈｕｓｃＦｖＢＣＭＡ２の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。

ある態様において、ＷＴ−１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Dao et al., Sci Transl Med 5(176):176ra33 (2013)；またはＷＯ２０１２／１３５８５４号に記載する抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。ある態様において、ＷＴ１に対する抗原結合ドメインは、表４に記載する抗ＷＴ１結合ドメイン、例えば、ＥＳＫ１、ＷＴ１−２、ＷＴ１−３、ＷＴ１−４、ＷＴ１−５、ＷＴ１−６またはＷＴ１−７の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。

ある態様において、ＣＬＤＮ６に対する抗原結合ドメインは抗体ＩＭＡＢ０２７(Ganymed Pharmaceuticals)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲであり、例えば、clinicaltrial.gov/show/NCT02054351参照のこと。ある態様において、ＣＬＤＮ６に対する抗原結合ドメインは、表４に記載する抗ＣＬＤＮ６結合ドメイン、例えば、ｍｕＭＡＢ６４Ａ、ｍＡｂ２０６−ＬＣＣまたはｍＡｂ２０６−ＳＵＢＧの抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。

ある態様において、抗原結合ドメインは、上記抗体からの１、２、３(例えば、全３）重鎖ＣＤＲ、ＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３および／または上記抗体からの１、２、３(例えば、全３）軽鎖ＣＤＲ、ＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む。ある態様において、抗原結合ドメインは、上記抗体の重鎖可変領域および／または可変軽鎖領域を含む。

非抗体スキャフォールド
ある態様において、抗原結合ドメインは、非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、アンキリン、ドメイン抗体、リポカリン、小型モジュラー免疫医薬、マキシボディ、プロテインＡまたはアフィリンを含む。非抗体スキャフォールドは、細胞の標的抗原に結合する能力を有する。ある態様において、抗原結合ドメインは、細胞に発現される天然に存在するタンパク質のポリペプチドまたはそのフラグメントである。ある態様において、抗原結合ドメインは、非抗体スキャフォールドを含む。多種多様な非抗体スキャフォールドを、得られたポリペプチドが、標的細胞の標的抗原に特異的に結合する少なくとも１結合領域を含む限り、用いることができる。

非抗体スキャフォールドは：フィブロネクチン(Novartis, MA)、アンキリン(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd., Cambridge, MA, およびAblynx nv, Zwijnaarde, Belgium)、リポカリン(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、小型モジュラー免疫医薬(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、マキシボディ(Avidia, Inc., Mountain View, CA)、プロテインＡ(Affibody AG, Sweden)、およびアフィリン(ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン)(Scil Proteins GmbH, Halle, Germany)を含む。

フィブロネクチンスキャフォールドは、フィブロネクチンIII型ドメイン(例えば、フィブロネクチンIII型の第十モジュール(^１０Ｆｎ３ドメイン))に基づき得る。フィブロネクチンIII型ドメインは、７個または８個のベータ鎖を有し、これは２個のベータシート間に分散され、これらのシート自体、タンパク質のコアを形成するように互いに包み合い、さらにループを含み(ＣＤＲに類似)、これはベータ鎖を互いに連結し、溶媒暴露されている。ベータシートサンドイッチの各端に少なくとも３種のこのようなループが存在し、該端はベータ鎖の方向に垂直なタンパク質の境界である(ＵＳ６,８１８,４１８号参照)。この構造のため、この非抗体スキャフォールドは、このような抗体の性質および親和性が似ている、抗原結合特性を模倣する。これらのスキャフォールドは、インビボの抗体親和性成熟過程に類する、インビトロのループ無作為化およびシャフリング戦略に使用できる。

アンキリンテクノロジーは、異なる標的への結合のために使用できる、可変領域を担持するためのスキャフォールドとしてのアンキリン由来反復モジュールを有するタンパク質の使用に基づく。アンキリン反復モジュールは、２個の逆平行α螺旋およびβターンからなる３３アミノ酸ポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソームディスプレイを使用して、大部分最適化される。

アビマーは、ＨＥＲ３のような天然Ａドメイン含有タンパク質由来である。これらのドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用のために天然で使用され、ヒトにおいて、２５０を超えるタンパク質が、構造上Ａドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーにより連結された多数の異なる“Ａドメイン”モノマー(２〜１０)からなる。アビマーは、例えば、米国特許出願公開２００４０１７５７５６号；２００５００５３９７３号；２００５００５３９７３号；２００５００４８５１２号；および２００６０００８８４４号に記載の方法を使用して、標的抗原に結合できるように製造できる。

アフィボディ親和性リガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの一つのスキャフォールドを基礎とする３重螺旋束からなる、小さい、単純タンパク質である。プロテインＡは、細菌スタフィロコッカス・アウレウスからの表面タンパク質である。このスキャフォールドドメインは５８アミノ酸からなり、そのうち１３個は、多数のリガンドバリアントを含むアフィボディライブラリーの製造のために無作為化される(例えば、ＵＳ５,８３１,０１２号参照)。アフィボディ分子は抗体を模倣し、１５０kDaである抗体分子量と比較して、６kDaの分子量を有する。その小さいサイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は抗体のものに類似する。

タンパク質エピトープ模倣物(ＰＥＭ)は、タンパク質−タンパク質相互作用に関係する主要二次構造である、タンパク質のベータ−ヘアピン二次構造を模倣する中程度のサイズの、環状、ペプチド様分子(ＭＷ１〜２kDa)である。

各々抗原結合ドメイン(ＣＭＥＲ)を含む複数のキメラ膜包埋受容体を有する細胞で、当該ＣＭＥＲの抗原結合ドメイン間の相互作用が、例えば、抗原結合ドメインの１以上がその同族抗原と結合する能力ことを阻害するため、望ましくないことがあることが判明した。したがって、ここに開示されるのは、同じ細胞で発現されたとき、このような相互作用が最小化された抗原結合ドメインを含む、第一および第二の天然に存在しないＣＭＥＲである。ある態様において、複数のＣＭＥＲは、２ＴＣＡＲを含む。ある態様において、複数のＣＭＥＲはＴＣＡＲおよび他のＣＭＥＲを含む。ある態様において、複数のＣＭＥＲは２ＮＫＲ−ＣＡＲを含む。ある態様において、複数のＣＭＥＲはＮＫＲ−ＣＡＲおよび他のＣＭＥＲを含む。ある態様において、複数のＣＭＥＲはＴＣＡＲおよびＮＫＲ−ＣＡＲを含む。

ある態様において、本願発明は第一および第二のＣＭＥＲを含む、ここで、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの一方の抗原結合ドメインは、可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含まない。ある態様において、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はｓｃＦｖではない。ある態様において、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールドを含む。ある態様において、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの一方の抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。ある態様において、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの一方の抗原結合ドメインは、ラクダ科ＶＨＨドメインを含む。

ある態様において、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメもしくはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。ある態様において、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はナノボディを含む。ある態様において、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はラクダ科ＶＨＨドメインを含む。

ある態様において、細胞表面に提示されるとき、該第一ＣＭＥＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該第二ＣＭＥＲの存在により実質的に低減されない。ある態様において、該第二ＣＭＥＲ存在下の該第一ＣＭＥＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該第二ＣＭＥＲ非存在下の該第一ＣＭＥＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合の８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。

ある態様において、細胞表面に提示されるとき、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるときより少なく互いに結合する。ある態様において、該第一ＣＭＥＲおよび該第二ＣＭＥＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるより８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％少なく互いに結合する。

ある態様において、本願発明は第一および第二のＫＩＲ−ＣＡＲを含み、ここで、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含まない。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はｓｃＦｖではない。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールドを含む。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ラクダ科ＶＨＨドメインを含む。

ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメもしくはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はナノボディを含む。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はラクダ科ＶＨＨドメインを含む。

ある態様において、細胞表面に提示されるとき、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの存在により実質的に低減されない。ある態様において、該第二ＫＩＲ−ＣＡＲ存在下の該第一ＫＩＲ−ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該第二ＫＩＲ−ＣＡＲ非存在下の該第一ＫＩＲ−ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合の８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。

ある態様において、細胞表面に提示されるとき、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるときより少なく互いに結合する。ある態様において、該第一ＫＩＲ−ＣＡＲおよび該第二ＫＩＲ−ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるより８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％少なく互いに結合する。

ある態様において、本願発明は第一および第二のＴＣＡＲを含み、ここで、該第一ＴＣＡＲおよび該第二ＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含まない。ある態様において、該第一ＴＣＡＲおよび該第二ＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はｓｃＦｖではない。ある態様において、該第一ＴＣＡＲおよび該第二ＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインまたは非抗体スキャフォールドを含む。ある態様において、該第一ＴＣＡＲおよび該第二ＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。ある態様において、該第一ＴＣＡＲおよび該第二ＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ラクダ科ＶＨＨドメインを含む。

ある態様において、該第一ＴＣＡＲおよび該第二ＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメもしくはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。ある態様において、該第一ＴＣＡＲおよび該第二ＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はナノボディを含む。ある態様において、該第一ＴＣＡＲおよび該第二ＴＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はラクダ科ＶＨＨドメインを含む。

ある態様において、細胞表面に提示されるとき、該第一ＴＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該第二ＴＣＡＲの存在により実質的に低減されない。ある態様において、該第二ＴＣＡＲ存在下の該第一ＴＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該第二ＴＣＡＲ非存在下の該第一ＴＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合の８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。

ある態様において、細胞表面に提示されるとき、該第一ＴＣＡＲおよび該第二ＴＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるときより少なく互いに結合する。ある態様において、該第一ＴＣＡＲおよび該第二ＴＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるより８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％少なく互いに結合する。

二特異的ＣＡＲ
ある態様において、例えば、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲまたはＴＣＡＲについて、ここに記載する抗原結合ドメインは、多特異的抗体分子、例えば、二特異的抗体分子を含む。二特異性抗体は、２以下の抗原に特異性を有する。二特異性抗体分子は、第一エピトープに対する結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに対する結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。ある態様において、第一および第二エピトープは同じ抗原、例えば、同じタンパク質(または多量体タンパク質のサブユニット)である。ある態様において、第一および第二エピトープは重複する。ある態様において、第一および第二エピトープは重複しない。ある態様において、第一および第二エピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質(または多量体タンパク質の異なるサブユニット)にある。ある態様において、二特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列ならびに第二エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。ある態様において、二特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体および第二エピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。ある態様において、二特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントを含む。ある態様において、二特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントを含む。

ある態様において、抗体分子は、多特異性(例えば、二特異性または三特異性)抗体分子である。二特異性またはヘテロ二量体抗体分子を産生するためのプロトコールは当分野で知られる；例えば、ＵＳ５７３１１６８号に記載の、“ノブ・イン・ア・ホール”アプローチ；例えば、ＷＯ０９／０８９００４号、ＷＯ０６／１０６９０５号およびＷＯ２０１０／１２９３０４号に記載のような静電的ステアリングＦｃ対形成；例えば、ＷＯ０７／１１０２０５号に記載のような鎖交換操作ドメイン(ＳＥＥＤ)ヘテロ二量体形成；例えば、ＷＯ０８／１１９３５３号、ＷＯ２０１１／１３１７４６号およびＷＯ２０１３／０６０８６７号に記載のようなＦａｂアーム交換；例えば、ＵＳ４４３３０５９号に記載のような、例えば、アミン反応性基とスルフヒドリル反応性基を有するヘテロ二官能性試薬を使用して二特異性構造を製造するための、抗体架橋結合による、二重抗体コンジュゲート；例えば、ＵＳ４４４４８７８号に記載のような、２重鎖間のジスルフィド結合の還元および酸化のサイクルを経る異なる抗体からの半抗体(重−軽鎖対またはＦａｂ)の組み換えにより産生する二特異性抗体決定基；例えば、ＵＳ５２７３７４３号に記載のような、３機能性抗体、スルフヒドリル反応性基により架橋された３Ｆａｂ’フラグメント；例えば、ＵＳ５５３４２５４号に記載のような、生合成結合タンパク質、例えば、Ｃ末端テイル、好ましくはジスルフィドまたはアミン反応性化学架橋結合により架橋されたｓｃＦｖの対；例えば、ＵＳ５５８２９９６号に記載のような、二機能性抗体、例えば、置換された定常ドメインを有する、ロイシンジッパー(例えば、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ)により二量体化された異なる結合特性を有するＦａｂフラグメント；例えば、ＵＳ５５９１８２８号に記載のような、二特異性およびオリゴ特異性一価およびオリゴ価受容体、例えば、一方の抗体のＣＨ１領域と他方の一般に軽鎖を伴う抗体のＶＨ領域の間のポリペプチドスペーサーを経て連結した２抗体(２Ｆａｂフラグメント)のＶＨ−ＣＨ１領域；例えば、ＵＳ５６３５６０２号に記載のような、二特異性ＤＮＡ−抗体コンジュゲート、例えば、二本鎖切片のＤＮＡを経た抗体またはＦａｂフラグメントの架橋；例えば、ＵＳ５６３７４８１号に記載のような、二特異性融合タンパク質、例えば、親水性らせん状ペプチドリンカーを間に含み、完全定常領域を含む、２ｓｃＦｖを含む発現構築物；例えば、ＵＳ５８３７２４２号に記載のような、多価および多特異性結合タンパク質、例えば、Ｉｇ重鎖可変領域の結合領域を有する第一ドメインおよびＩｇ軽鎖可変領域の結合領域を有する第二ドメインを有し、一般に二重特異性抗体(二特異性、三特異性、四特異性の分子を作るための高次構造も包含される)と呼ばれるポリペプチドの二量体；例えば、ＵＳ５８３７８２１号に記載のような、二特異性／多価分子を形成するように二量体できる、ペプチドスペーサーでさらに抗体ヒンジ領域およびＣＨ３領域に結合した、連結ＶＬ鎖およびＶＨ鎖を有するミニボディ構築物；二特異性二重特異性抗体を形成するように二量体を形成できる、いずれかの配向で短ペプチドリンカー(例えば、５または１０アミノ酸)またはによりまたはリンカー無しで連結されたＶＨおよびＶＬドメイン；例えば、ＵＳ５８４４０９４号に記載のような、三量体および四量体；例えば、ＵＳ５８６４０１９号に記載のような、一連のＦＶ(またはｓｃＦｖ)を形成するようにさらにＶＬドメインと結合した、Ｃ末端で架橋可能基とのペプチド結合により連結した一連のＶＨドメイン(またはファミリーメンバーにおけるＶＬドメイン)；および、例えば、ＵＳ５８６９６２０号に記載のような、ｓｃＦＶまたは二重特異性抗体形態の両者を使用して、例えば、ホモ二価、ヘテロ二価、三価および四価構造を形成するように、非共有または化学架橋により多価構造に合わさっている、ペプチドリンカーにより連結してＶＨドメインおよびＶＬドメインの両者を有する一本鎖結合ポリペプチドを、例えば、含むが、これらに限定されない。多特異性および二特異性分子およびそれを製造するためのさらなる例は、例えば、ＵＳ５９１０５７３号、ＵＳ５９３２４４８号、ＵＳ５９５９０８３号、ＵＳ５９８９８３０号、ＵＳ６００５０７９号、ＵＳ６２３９２５９号、ＵＳ６２９４３５３号、ＵＳ６３３３３９６号、ＵＳ６４７６１９８号、ＵＳ６５１１６６３号、ＵＳ６６７０４５３号、ＵＳ６７４３８９６号、ＵＳ６８０９１８５号、ＵＳ６８３３４４１号、ＵＳ７１２９３３０号、ＵＳ７１８３０７６号、ＵＳ７５２１０５６号、ＵＳ７５２７７８７号、ＵＳ７５３４８６６号、ＵＳ７６１２１８１号、ＵＳ２００２００４５８７Ａ１号、ＵＳ２００２０７６４０６Ａ１号、ＵＳ２００２１０３３４５Ａ１号、ＵＳ２００３２０７３４６Ａ１号、ＵＳ２００３２１１０７８Ａ１号、ＵＳ２００４２１９６４３Ａ１号、ＵＳ２００４２２０３８８Ａ１号、ＵＳ２００４２４２８４７Ａ１号、ＵＳ２００５００３４０３Ａ１号、ＵＳ２００５００４３５２Ａ１号、ＵＳ２００５０６９５５２Ａ１号、ＵＳ２００５０７９１７０Ａ１号、ＵＳ２００５１００５４３Ａ１号、ＵＳ２００５１３６０４９Ａ１号、ＵＳ２００５１３６０５１Ａ１号、ＵＳ２００５１６３７８２Ａ１号、ＵＳ２００５２６６４２５Ａ１号、ＵＳ２００６０８３７４７Ａ１号、ＵＳ２００６１２０９６０Ａ１号、ＵＳ２００６２０４４９３Ａ１号、ＵＳ２００６２６３３６７Ａ１号、ＵＳ２００７００４９０９Ａ１号、ＵＳ２００７０８７３８１Ａ１号、ＵＳ２００７１２８１５０Ａ１号、ＵＳ２００７１４１０４９Ａ１号、ＵＳ２００７１５４９０１Ａ１号、ＵＳ２００７２７４９８５Ａ１号、ＵＳ２００８０５０３７０Ａ１号、ＵＳ２００８０６９８２０Ａ１号、ＵＳ２００８１５２６４５Ａ１号、ＵＳ２００８１７１８５５Ａ１号、ＵＳ２００８２４１８８４Ａ１号、ＵＳ２００８２５４５１２Ａ１号、ＵＳ２００８２６０７３８Ａ１号、ＵＳ２００９１３０１０６Ａ１号、ＵＳ２００９１４８９０５Ａ１号、ＵＳ２００９１５５２７５Ａ１号、ＵＳ２００９１６２３５９Ａ１号、ＵＳ２００９１６２３６０Ａ１号、ＵＳ２００９１７５８５１Ａ１号、ＵＳ２００９１７５８６７Ａ１号、ＵＳ２００９２３２８１１Ａ１号、ＵＳ２００９２３４１０５Ａ１号、ＵＳ２００９２６３３９２Ａ１号、ＵＳ２００９２７４６４９Ａ１号、ＥＰ３４６０８７Ａ２号、ＷＯ０００６６０５Ａ２号、ＷＯ０２０７２６３５Ａ２号、ＷＯ０４０８１０５１Ａ１号、ＷＯ０６０２０２５８Ａ２号、ＷＯ２００７０４４８８７Ａ２号、ＷＯ２００７０９５３３８Ａ２号、ＷＯ２００７１３７７６０Ａ２号、ＷＯ２００８１１９３５３Ａ１号、ＷＯ２００９０２１７５４Ａ２号、ＷＯ２００９０６８６３０Ａ１号、ＷＯ９１０３４９３Ａ１号、ＷＯ９３２３５３７Ａ１号、ＷＯ９４０９１３１Ａ１号、ＷＯ９４１２６２５Ａ２号、ＷＯ９５０９９１７Ａ１号、ＷＯ９６３７６２１Ａ２号、ＷＯ９９６４４６０Ａ１号に見ることができる。上に引用した出願の内容は、引用によりその全体を本明細書に包含させる。

二特異性抗体分子の各抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)内で、ＶＨは、ＶＬの上流でも下流でもよい。ある態様において、上流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、そのＶＬ(ＶＬ_１)の上流のそのＶＨ(ＶＨ_１)と共に配置され、下流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、そのＶＬ(ＶＬ_２)の上流のそのＶＨ(ＶＨ_２)と共に配置され、その結果全体的二特異性抗体分子は、配置ＶＨ_１−ＶＬ_１−ＶＬ_２−ＶＨ_２を有する。他の態様において、上流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、そのＶＨ(ＶＨ_１)の上流のそのＶＬ(ＶＬ_１)と共に配置され、下流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、そのＶＨ(ＶＨ_２)の上流のそのＶＬ(ＶＬ_２)と共に配置され、その結果、全体的二特異性抗体分子は配置ＶＬ_１−ＶＨ_１−ＶＨ_２−ＶＬ_２を有する。場合により、リンカーは、２抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)の間、例えば、構築物がＶＨ_１−ＶＬ_１−ＶＬ_２−ＶＨ_２として配列されるならば、ＶＬ_１とＶＬ_２の間または構築物がＶＬ_１−ＶＨ_１−ＶＨ_２−ＶＬ_２として配置されるならばＶＨ_１とＶＨ_２の間に配置される。リンカーは、ここに記載するリンカー、例えば、(Ｇｌｙ_４−Ｓｅｒ)_ｎリンカー(ここで、ｎは１、２、３、４、５または６、好ましくは４である)であってよい(配列番号６３)。一般に、２ｓｃＦｖ間のリンカーは、２ｓｃＦｖのドメイン間の誤対合を避けるのに十分長くなければならない。場合により、リンカーは、第一ｓｃＦｖのＶＬとＶＨの間に配置される。場合により、リンカーは、第二ｓｃＦｖのＶＬとＶＨの間に配置される。複数リンカーを有する構築物において、リンカーのいずれかの２以上は同一でも異なってもよい。よって、ある態様において、二特異性ＣＡＲは、ここに記載するような配置で、ＶＬ、ＶＨおよび場合により１以上のリンカーを含む。

ある面において、二特異的抗体分子は、ここに記載する腫瘍抗原に結合特異性を有する、例えば、ここに記載するような、例えば、表４に記載するような、ｓｃＦｖを含むまたはここに記載するｓｃＦｖからの軽鎖ＣＤＲおよび／または重鎖ＣＤＲを含む第一免疫グロブリン可変ドメイン配列、例えば、ｓｃＦｖおよび異なる抗原の第二エピトープに結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。ある面において、第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、腫瘍に発現される抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原に結合特異性を有する。

ＣＡＲ配列例
ある態様において、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲまたはＴＣＡＲは、表５に提供する１以上の配列を含み得る。

ＮＫＲ−ＣＡＲおよびＮＫＲ−ＣＡＲの要素の配列の例をさらにここに提供する。

メソテリンに結合する抗原結合ドメインおよびＫＩＲ２ＤＳ２ドメインを含む細胞質ドメインを含むＫＩＲ−ＣＡＲの核酸配列を下に提供する。ここに記載する抗原結合ドメインのいずれも、下に提供するメソテリン抗原結合ドメインの代替であり得る。

ＳＳ１ＫＩＲ２ＤＳ２遺伝子配列(配列番号３２７)
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メソテリンに結合する抗原結合ドメインおよびＫＩＲＳ２ドメインを含む細胞質ドメインを含むＫＩＲ−ＣＡＲの核酸配列を下に提供する。ここに記載する抗原結合ドメインのいずれも、下に提供するメソテリン抗原結合ドメインの代替であり得る。

ＳＳ１ＫＩＲＳ２遺伝子配列(配列番号３２８)
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メソテリンに結合する抗原結合ドメインおよびＫＩＲ２ＤＬ３ドメインを含む細胞質ドメインを含むＫＩＲ−ＣＡＲの核酸配列を下に提供する。ここに記載する抗原結合ドメインのいずれも、下に提供するメソテリン抗原結合ドメインの代替であり得る。

ＳＳ１ＫＩＲ２ＤＬ３遺伝子配列(配列番号３２９)
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ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインおよびＫＩＲ２ＤＳ２ドメインを含む細胞質ドメインを含むＫＩＲ−ＣＡＲの核酸配列を下に提供する。

ＣＤ１９ＫＩＲ２ＤＳ２構築物配列(配列番号３３０)
gtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcgcgcaattaaccctcactaaagggaacaaaagctggagctgcaagcttaatgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacctgaaagcgaaagggaaaccagagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcctcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcgattagactgtagcccaggaatatggcagctagattgtacacatttagaaggaaaagttatcttggtagcagttcatgtagccagtggatatatagaagcagaagtaattccagcagagacagggcaagaaacagcatacttcctcttaaaattagcaggaagatggccagtaaaaacagtacatacagacaatggcagcaatttcaccagtactacagttaaggccgcctgttggtgggcggggatcaagcaggaatttggcattccctacaatccccaaagtcaaggagtaatagaatctatgaataaagaattaaagaaaattataggacaggtaagagatcaggctgaacatcttaagacagcagtacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggctgcatacgcgtcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgtgcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgagctagaATGGGGGGACTTGAACCCTGCAGCAGGCTCCTGCTCCTGCCTCTCCTGCTGGCTGTAAGTGGTCTCCGTCCTGTCCAGGCCCAGGCCCAGAGCGATTGCAGTTGCTCTACGGTGAGCCCGGGCGTGCTGGCAGGGATCGTGATGGGAGACCTGGTGCTGACAGTGCTCATTGCCCTGGCCGTGTACTTCCTGGGCCGGCTGGTCCCTCGGGGGCGAGGGGCTGCGGAGGCAGCGACCCGGAAACAGCGTATCACTGAGACCGAGTCGCCTTATCAGGAGCTCCAGGGTCAGAGGTCGGATGTCTACAGCGACCTCAACACACAGAGGCCGTATTACAAAgTCGAGGGCGGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGGatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgggatccGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgctagcACGCGTggtggcggaggttctggaggtgggggttcccagggggcctggccacatgagggagtccacagaaaaccttccctcctggcccacccaggtcccctggtgaaatcagaagagacagtcatcctgcaatgttggtcagatgtcaggtttgagcacttccttctgcacagagaggggaagtataaggacactttgcacctcattggagagcaccatgatggggtctccaaggccaacttctccatcggtcccatgatgcaagaccttgcagggacctacagatgctacggttctgttactcactccccctatcagttgtcagctcccagtgaccctctggacatcgtcatcacaggtctatatgagaaaccttctctctcagcccagccgggccccacggttttggcaggagagagcgtgaccttgtcctgcagctcccggagctcctatgacatgtaccatctatccagggagggggaggcccatgaacgtaggttctctgcagggcccaaggtcaacggaacattccaggccgactttcctctgggccctgccacccacggaggaacctacagatgcttcggctctttccgtgactctccctatgagtggtcaaactcgagtgacccactgcttgtttctgtcacaggaaacccttcaaatagttggccttcacccactgaaccaagctccaaaaccggtaaccccagacacctgcatgttctgattgggacctcagtggtcaaaatccctttcaccatcctcctcttctttctccttcatcgctggtgctccaacaaaaaaaatgctgctgtaatggaccaagagcctgcagggaacagaacagtgaacagcgaggattctgatgaacaagaccatcaggaggtgtcatacgcataaGtcgacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggaattcgagctcggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagctatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctacgcttttgcgtcgagacgtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcccaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgg

ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインおよびＰＤ１ドメインを含む細胞質ドメインを含む阻害性ＣＡＲの核酸配列を下に提供する。

ＣＤ１９−ＰＤ１キメラＣＡＲ配列(配列番号３３１)
TGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgctagcACGCGTggtggcggaggttctggaggtgggggttccaccctggtggttggtgtcgtgggcggcctgctgggcagcctggtgctgctagtctgggtcctggccgtcatctgctcccgggccgcacgagggacaataggagccaggcgcaccggccagcccctgaaggaggacccctcagccgtgcctgtgttctctgtggactatggggagctggatttccagtggcgagagaagaccccggagccccccgtgccctgtgtccctgagcagacggagtatgccaccattgtctttcctagcggaatgggcacctcatcccccgcccgcaggggctcagctgacggccctcggagtgcccagccactgaggcctgaggatggacactgctcttggcccctctgaGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTAGTGGCGCC

本発明はまた、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲを含み、さらに、ＣＡＲ発現細胞を活性化するために、例えば、ＣＡＲ発現細胞の増殖または細胞毒性活性を高めるために、シグナル伝達を促進するための、ＮＫＲ−ＣＡＲと相互作用するアダプター分子を含む核酸分子およびコード化アミノ酸配列も提供する。ここに記載する抗原結合ドメインのいずれも、下に提供するＮＫＲ−ＣＡＲ構築物における抗原結合ドメインの代替であり得る。

ＤＡＰ１２の核酸配列は次のとおりである。
ATGGGGGGACTTGAACCCTGCAGCAGGTTCCTGCTCCTGCCTCTCCTGCTGGCTGTAAGTGGTCTCCGTCCTGTCCAGGTCCAGGCCCAGAGCGATTGCAGTTGCTCTACGGTGAGCCCGGGCGTGCTGGCAGGGATCGTGATGGGAGACCTGGTGCTGACAGTGCTCATTGCCCTGGCCGTGTACTTCCTGGGCCGGCTGGTCCCTCGGGGGCGAGGGGCTGCGGAGGCAGCGACCCGGAAACAGCGTATCACTGAGACCGAGTCGCCTTATCAGGAGCTCCAGGGTCAGAGGTCGGATGTCTACAGCGACCTCAACACACAGAGGCCGTATTACAAATGA
(配列番号３６７)
ＤＡＰ１２のアミノ酸配列は次のとおりである。
MGGLEPCSRFLLLPLLLAVSGLRPVQVQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALA
VYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK
(配列番号３６８)

ＦｃｅＲｇの核酸配列は次のとおりである。
ATGATTCCAGCAGTGGTCTTGCTCTTACTCCTTTTGGTTGAACAAGCAGCGGCCCTGGGAGAGCCTCAGCTCTGCTATATCCTGGATGCCATCCTGTTTCTGTATGGAATTGTCCTCACCCTCCTCTACTGCCGACTGAAGATCCAAGTGCGAAAGGCAGCTATAACCAGCTATGAGAAATCAGATGGTGTTTACACGGGCCTGAGCACCAGGAACCAGGAGACTTACGAGACTCTGAAGCATGAGAAACCACCACAGTAG
(配列番号３６９)
ＦｃｅＲｇのアミノ酸配列は次のとおりである。
MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEK
SDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ
(配列番号３７０)

ＮＫＲ−ＣＡＲおよびアダプター分子を含む多鎖ＮＫＲ−ＣＡＲの核酸配列もここに提供する。このような構築物において、ＮＫＲ−ＣＡＲおよびアダプター分子の核酸配列は、ペプチド開裂部位、例えば、Ｔ２Ａをコードする核酸配列により連結される。これらの核酸分子は開裂前に単鎖ポリペプチドとして翻訳され、単鎖ポリペプチドのアミノ酸配列もここに提供する。

ペプチド開裂部位Ｔ２Ａにより連結された、メソテリンに結合する抗原結合ドメイン、例えば、ＳＳ１、およびＫＩＲＳ２細胞質ドメインを含むＮＫＲ−ＣＡＲならびにＤＡＰ１２アダプター分子を含む核酸およびアミノ酸配列を下に提供する。
ＤＡＰ１２−Ｔ２Ａ−ＳＳ１−ＫＩＲＳ２(配列番号３３２)
１４６４bp ＤＮＡ

ATGGGGGGAC TTGAACCCTG CAGCAGGTTC CTGCTCCTGC CTCTCCTGCT GGCTGTAAGT
GGTCTCCGTC CTGTCCAGGT CCAGGCCCAG AGCGATTGCA GTTGCTCTAC GGTGAGCCCG
GGCGTGCTGG CAGGGATCGT GATGGGAGAC CTGGTGCTGA CAGTGCTCAT TGCCCTGGCC
GTGTACTTCC TGGGCCGGCT GGTCCCTCGG GGGCGAGGGG CTGCGGAGGC AGCGACCCGG
AAACAGCGTA TCACTGAGAC CGAGTCGCCT TATCAGGAGC TCCAGGGTCA GAGGTCGGAT
GTCTACAGCG ACCTCAACAC ACAGAGGCCG TATTACAAAG TCGAGGGCGG CGGAGAGGGC
AGAGGAAGTC TTCTAACATG CGGTGACGTG GAGGAGAATC CCGGCCCTAG GATGGCCTTA
CCAGTGACCG CCTTGCTCCT GCCGCTGGCC TTGCTGCTCC ACGCCGCCAG GCCGGGATCC
CAGGTACAAC TGCAGCAGTC TGGGCCTGAG CTGGAGAAGC CTGGCGCTTC AGTGAAGATA
TCCTGCAAGG CTTCTGGTTA CTCATTCACT GGCTACACCA TGAACTGGGT GAAGCAGAGC
CATGGAAAGA GCCTTGAGTG GATTGGACTT ATTACTCCTT ACAATGGTGC TTCTAGCTAC
AACCAGAAGT TCAGGGGCAA GGCCACATTA ACTGTAGACA AGTCATCCAG CACAGCCTAC
ATGGACCTCC TCAGTCTGAC ATCTGAAGAC TCTGCAGTCT ATTTCTGTGC AAGGGGGGGT
TACGACGGGA GGGGTTTTGA CTACTGGGGC CAAGGGACCA CGGTCACCGT CTCCTCAGGT
GGAGGCGGTT CAGGCGGCGG TGGCTCTAGC GGTGGTGGAT CGGACATCGA GCTCACTCAG
TCTCCAGCAA TCATGTCTGC ATCTCCAGGG GAGAAGGTCA CCATGACCTG CAGTGCCAGC
TCAAGTGTAA GTTACATGCA CTGGTACCAG CAGAAGTCAG GCACCTCCCC CAAAAGATGG
ATTTATGACA CATCCAAACT GGCTTCTGGA GTCCCAGGTC GCTTCAGTGG CAGTGGGTCT
GGAAACTCTT ACTCTCTCAC AATCAGCAGC GTGGAGGCTG AAGATGATGC AACTTATTAC
TGCCAGCAGT GGAGTAAGCA CCCTCTCACG TACGGTGCTG GGACAAAGTT GGAAATCAAA
GCTAGCGGTG GCGGAGGTTC TGGAGGTGGG GGTTCCTCAC CCACTGAACC AAGCTCCAAA
ACCGGTAACC CCAGACACCT GCATGTTCTG ATTGGGACCT CAGTGGTCAA AATCCCTTTC
ACCATCCTCC TCTTCTTTCT CCTTCATCGC TGGTGCTCCA ACAAAAAAAA TGCTGCTGTA
ATGGACCAAG AGCCTGCAGG GAACAGAACA GTGAACAGCG AGGATTCTGA TGAACAAGAC
CATCAGGAGG TGTCATACGC ATAA

ＤＡＰ１２−Ｔ２Ａ−ＳＳ１−ＫＩＲＳ２(配列番号３３３)
４８８ａａタンパク質

配列
MGGLEPCSRF LLLPLLLAVS GLRPVQVQAQ SDCSCSTVSP GVLAGIVMGD LVLTVLIALA
VYFLGRLVPR GRGAAEAATR KQRITETESP YQELQGQRSD VYSDLNTQRP YYKVEGGGEG
RGSLLTCGDV EENPGPRMAL PVTALLLPLA LLLHAARPGS QVQLQQSGPE LEKPGASVKI
SCKASGYSFT GYTMNWVKQS HGKSLEWIGL ITPYNGASSY NQKFRGKATL TVDKSSSTAY
MDLLSLTSED SAVYFCARGG YDGRGFDYWG QGTTVTVSSG GGGSGGGGSS GGGSDIELTQ
SPAIMSASPG EKVTMTCSAS SSVSYMHWYQ QKSGTSPKRW IYDTSKLASG VPGRFSGSGS
GNSYSLTISS VEAEDDATYY CQQWSKHPLT YGAGTKLEIK ASGGGGSGGG GSSPTEPSSK
TGNPRHLHVL IGTSVVKIPF TILLFFLLHR WCSNKKNAAV MDQEPAGNRT VNSEDSDEQD
HQEVSYA

ペプチド開裂部位Ｔ２Ａにより連結した、メソテリンに結合する抗原結合ドメイン、例えば、ＳＳ１、およびＴＮＫｐ４６細胞質ドメインを含むＮＫＲ−ＣＡＲ、ならびにＦｃεＲγアダプター分子を含む核酸およびアミノ酸配列を下に提供する。
ＦＣＥＲＧ−Ｔ２Ａ−ＳＳ１−ＴＮＫｐ４６(配列番号３３４)
１３６５bp ＤＮＡ

配列
ATGATTCCAG CAGTGGTCTT GCTCTTACTC CTTTTGGTTG AACAAGCAGC GGCCCTGGGA
GAGCCTCAGC TCTGCTATAT CCTGGATGCC ATCCTGTTTC TGTATGGAAT TGTCCTCACC
CTCCTCTACT GCCGACTGAA GATCCAAGTG CGAAAGGCAG CTATAACCAG CTATGAGAAA
TCAGATGGTG TTTACACGGG CCTGAGCACC AGGAACCAGG AGACTTACGA GACTCTGAAG
CATGAGAAAC CACCACAGTC CGGAGGCGGC GGAGAGGGCA GAGGAAGTCT TCTAACATGC
GGTGACGTGG AGGAGAATCC CGGCCCTAGG ATGGCCTTAC CAGTGACCGC CTTGCTCCTG
CCGCTGGCCT TGCTGCTCCA CGCCGCCAGG CCGGGATCCC AGGTACAACT GCAGCAGTCT
GGGCCTGAGC TGGAGAAGCC TGGCGCTTCA GTGAAGATAT CCTGCAAGGC TTCTGGTTAC
TCATTCACTG GCTACACCAT GAACTGGGTG AAGCAGAGCC ATGGAAAGAG CCTTGAGTGG
ATTGGACTTA TTACTCCTTA CAATGGTGCT TCTAGCTACA ACCAGAAGTT CAGGGGCAAG
GCCACATTAA CTGTAGACAA GTCATCCAGC ACAGCCTACA TGGACCTCCT CAGTCTGACA
TCTGAAGACT CTGCAGTCTA TTTCTGTGCA AGGGGGGGTT ACGACGGGAG GGGTTTTGAC
TACTGGGGCC AAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGGTG GAGGCGGTTC AGGCGGCGGT
GGCTCTAGCG GTGGTGGATC GGACATCGAG CTCACTCAGT CTCCAGCAAT CATGTCTGCA
TCTCCAGGGG AGAAGGTCAC CATGACCTGC AGTGCCAGCT CAAGTGTAAG TTACATGCAC
TGGTACCAGC AGAAGTCAGG CACCTCCCCC AAAAGATGGA TTTATGACAC ATCCAAACTG
GCTTCTGGAG TCCCAGGTCG CTTCAGTGGC AGTGGGTCTG GAAACTCTTA CTCTCTCACA
ATCAGCAGCG TGGAGGCTGA AGATGATGCA ACTTATTACT GCCAGCAGTG GAGTAAGCAC
CCTCTCACGT ACGGTGCTGG GACAAAGTTG GAAATCAAAG CTAGCGGTGG CGGAGGTTCT
GGAGGTGGGG GTTCCTTAAC CACAGAGACG GGACTCCAGA AAGACCATGC CCTCTGGGAT
CACACTGCCC AGAATCTCCT TCGGATGGGC CTGGCCTTTC TAGTCCTGGT GGCTCTAGTG
TGGTTCCTGG TTGAAGACTG GCTCAGCAGG AAGAGGACTA GAGAGCGAGC CAGCAGAGCT
TCCACTTGGG AAGGCAGGAG AAGGCTGAAC ACACAGACTC TTTGA

ＦＣＥＲＧ−Ｔ２Ａ−ＳＳ１−ＴＮＫｐ４６(配列番号３３５)

配列
MIPAVVLLLL LLVEQAAALG EPQLCYILDA ILFLYGIVLT LLYCRLKIQV RKAAITSYEK
SDGVYTGLST RNQETYETLK HEKPPQSGGG GEGRGSLLTC GDVEENPGPR MALPVTALLL
PLALLLHAAR PGSQVQLQQS GPELEKPGAS VKISCKASGY SFTGYTMNWV KQSHGKSLEW
IGLITPYNGA SSYNQKFRGK ATLTVDKSSS TAYMDLLSLT SEDSAVYFCA RGGYDGRGFD
YWGQGTTVTV SSGGGGSGGG GSSGGGSDIE LTQSPAIMSA SPGEKVTMTC SASSSVSYMH
WYQQKSGTSP KRWIYDTSKL ASGVPGRFSG SGSGNSYSLT ISSVEAEDDA TYYCQQWSKH
PLTYGAGTKL EIKASGGGGS GGGGSLTTET GLQKDHALWD HTAQNLLRMG LAFLVLVALV
WFLVEDWLSR KRTRERASRA STWEGRRRLN TQTL

ペプチド開裂部位Ｔ２Ａにより連結した、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインおよびＫＩＲＳ２細胞質ドメインを含むＮＫＲ−ＣＡＲならびにＤＡＰ１２アダプター分子を含む核酸およびアミノ酸配列を下に提供する。
ＤＡＰ１２−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９−ＫＩＲＳ２(配列番号３３６)
１４７０bp ＤＮＡ

配列
ATGGGGGGAC TTGAACCCTG CAGCAGGTTC CTGCTCCTGC CTCTCCTGCT GGCTGTAAGT
GGTCTCCGTC CTGTCCAGGT CCAGGCCCAG AGCGATTGCA GTTGCTCTAC GGTGAGCCCG
GGCGTGCTGG CAGGGATCGT GATGGGAGAC CTGGTGCTGA CAGTGCTCAT TGCCCTGGCC
GTGTACTTCC TGGGCCGGCT GGTCCCTCGG GGGCGAGGGG CTGCGGAGGC AGCGACCCGG
AAACAGCGTA TCACTGAGAC CGAGTCGCCT TATCAGGAGC TCCAGGGTCA GAGGTCGGAT
GTCTACAGCG ACCTCAACAC ACAGAGGCCG TATTACAAAG TCGAGGGCGG CGGAGAGGGC
AGAGGAAGTC TTCTAACATG CGGTGACGTG GAGGAGAATC CCGGCCCTAG GATGGCCTTA
CCAGTGACCG CCTTGCTCCT GCCGCTGGCC TTGCTGCTCC ACGCCGCCAG GCCGGGATCC
GACATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA CAGAGTCACC
ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGT AAATATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCA
GATGGAACTG TTAAACTCCT GATCTACCAT ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA
AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAGCAA
GAAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTAATACGC TTCCGTACAC GTTCGGAGGG
GGGACTAAGT TGGAAATAAC AGGTGGCGGT GGCTCGGGCG GTGGTGGGTC GGGTGGCGGC
GGATCTGAGG TGAAACTGCA GGAGTCAGGA CCTGGCCTGG TGGCGCCCTC ACAGAGCCTG
TCCGTCACAT GCACTGTCTC AGGGGTCTCA TTACCCGACT ATGGTGTAAG CTGGATTCGC
CAGCCTCCAC GAAAGGGTCT GGAGTGGCTG GGAGTAATAT GGGGTAGTGA AACCACATAC
TATAATTCAG CTCTCAAATC CAGACTGACC ATCATCAAGG ACAACTCCAA GAGCCAAGTT
TTCTTAAAAA TGAACAGTCT GCAAACTGAT GACACAGCCA TTTACTACTG TGCCAAACAT
TATTACTACG GTGGTAGCTA TGCTATGGAC TACTGGGGTC AAGGAACCTC AGTCACCGTC
TCCTCAGCTA GCGGTGGCGG AGGTTCTGGA GGTGGGGGTT CCTCACCCAC TGAACCAAGC
TCCAAAACCG GTAACCCCAG ACACCTGCAT GTTCTGATTG GGACCTCAGT GGTCAAAATC
CCTTTCACCA TCCTCCTCTT CTTTCTCCTT CATCGCTGGT GCTCCAACAA AAAAAATGCT
GCTGTAATGG ACCAAGAGCC TGCAGGGAAC AGAACAGTGA ACAGCGAGGA TTCTGATGAA
CAAGACCATC AGGAGGTGTC ATACGCATAA

ＤＡＰ１２−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９−ＫＩＲＳ２(配列番号３３７)
４８９ａａタンパク質

配列
MGGLEPCSRF LLLPLLLAVS GLRPVQVQAQ SDCSCSTVSP GVLAGIVMGD LVLTVLIALA
VYFLGRLVPR GRGAAEAATR KQRITETESP YQELQGQRSD VYSDLNTQRP YYKVEGGGEG
RGSLLTCGDV EENPGPRMAL PVTALLLPLA LLLHAARPGS DIQMTQTTSS LSASLGDRVT
ISCRASQDIS KYLNWYQQKP DGTVKLLIYH TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ
EDIATYFCQQ GNTLPYTFGG GTKLEITGGG GSGGGGSGGG GSEVKLQESG PGLVAPSQSL
SVTCTVSGVS LPDYGVSWIR QPPRKGLEWL GVIWGSETTY YNSALKSRLT IIKDNSKSQV
FLKMNSLQTD DTAIYYCAKH YYYGGSYAMD YWGQGTSVTV SSASGGGGSG GGGSSPTEPS
SKTGNPRHLH VLIGTSVVKI PFTILLFFLL HRWCSNKKNA AVMDQEPAGN RTVNSEDSDE
QDHQEVSYA*

ある態様において、膜貫通ドメインはＫＩＲ２ＤＳ２膜貫通ドメインである。ＫＩＲ２ＤＳ２膜貫通ドメインのアミノ酸配列は次のとおりである。
VLIGTSVVKIPFTILLFFLL(配列番号３５７)

ある態様において、膜貫通ドメインはＫＩＲ２ＤＬ３膜貫通ドメインである。ＫＩＲ２ＤＬ３膜貫通ドメインのアミノ酸配列は次のとおりである。
VLIGTSVVIILFILLLFFLL(配列番号３５８)

ある態様において、膜貫通ドメインはＮＫｐ４６膜貫通ドメインである。ＮＫｐ４６膜貫通ドメインのアミノ酸配列は次のとおりである。
LLRMGLAFLVLVALVWFLVEDWLS(配列番号３５９)

ある態様において、細胞質ドメインは、ＫＩＲ２ＤＳ２、例えば、図２９に示すような天然に存在するＫＩＲＳ２ＤＳ２由来である。ＫＩＲＳ２ドメインとも称するＫＩＲ２ＤＳ２由来細胞質ドメインのアミノ酸配列は次のとおりである。
HRWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTVNSEDSDEQDHQEVSYA(配列番号３６０)

ある態様において、細胞質ドメインは、ＫＩＲ２ＤＬ３、例えば、図３０に示すような天然に存在するＫＩＲ２ＤＬ３由来である。ＫＩＲＬ３ドメインとも称するＫＩＲ２ＤＬ３由来細胞質ドメインのアミノ酸配列は次のとおりである。
HRWCCNKKNAVVMDQEPAGNRTVNREDSDEQDPQEVTYAQLNHCVFTQRKITHPSQRPKTPPTDIIVYTELPNAEP(配列番号３６１)

ある態様において、細胞質ドメインは、ＮＫｐ４６、例えば、図３１に示すような天然に存在するＮＫｐ４６由来である。ｔＮＫｐ４６またはＴＮＫｐ４６ドメインとも称するＮＫｐ４６由来細胞質ドメインのアミノ酸配列は次のとおりである。
RKRTRERASRASTWEGRRRLNTQTL(配列番号３６２)

ある態様において、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、集合的に、下に提供するアミノ酸配列を有する。
VLIGTSVVKIPFTILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTVNSEDSDEQDHQEVSYA(配列番号３７１)

メソテリンに結合するヒト抗原結合ドメインを含むＫＩＲ−ＣＡＲの核酸およびアミノ酸配列もここに提供する。例えば、リーダー配列、ヒトメソテリン特異的抗原結合ドメインＭ５およびＫＩＲＳ２細胞質ドメインを含むＫＩＲ−ＣＡＲの核酸配列を下に提供する。下線を引いた配列は、任意の他の抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載するヒト抗メソテリンｃＦｖと容易に相互交換できる、Ｍ５ｓｃＦｖの配列を示す。
Atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgggatcccaagtccaactcgttcaatcaggcgcagaagtcgaaaagcccggagcatcagtcaaagtctcttgcaaggcttccggctacaccttcacggactactacatgcactgggtgcgccaggctccaggccagggactggagtggatgggatggatcaacccgaattccgggggaactaactacgcccagaagtttcagggccgggtgactatgactcgcgatacctcgatctcgactgcgtacatggagctcagccgcctccggtcggacgataccgccgtgtactattgtgcgtcgggatgggacttcgactactgggggcagggcactctggtcactgtgtcaagcggaggaggtggatcaggtggaggtggaagcgggggaggaggttccggcggcggaggatcagatatcgtgatgacgcaatcgccttcctcgttgtccgcatccgtgggagacagggtgaccattacttgcagagcgtcccagtccattcggtactacctgtcgtggtaccagcagaagccggggaaagccccaaaactgcttatctatactgcctcgatcctccaaaacggcgtgccatcaagattcagcggttcgggcagcgggaccgactttaccctgactatcagcagcctgcagccggaagatttcgccacgtactactgcctgcaaacctacaccaccccggacttcggacctggaaccaaggtggagatcaaggctagcggtggcggaggttctggaggtgggggttcctcacccactgaaccaagctccaaaaccggtaaccccagacacctgcatgttctgattgggacctcagtggtcaaaatccctttcaccatcctcctcttctttctccttcatcgctggtgctccaacaaaaaaaatgctgctgtaatggaccaagagcctgcagggaacagaacagtgaacagcgaggattctgatgaacaagaccatcaggaggtgtcatacgcataa
(配列番号３６３)

リーダー配列、ヒトメソテリン特異的抗原結合ドメインＭ５およびＫＩＲＳ２細胞質ドメインを含むＫＩＲ−ＣＡＲのアミノ酸配列を下に提供する。下線を引いた配列は、任意の他の抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載するヒト抗メソテリンｃＦｖと容易に相互交換できる、Ｍ５ｓｃＦｖの配列を示す。
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSQVQLVQSGAEVEKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASGWDFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRYYLSWYQQKPGKAPKLLIYTASILQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQTYTTPDFGPGTKVEIKASGGGGSGGGGSSPTEPSSKTGNPRHLHVLIGTSVVKIPFTILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTVNSEDSDEQDHQEVSYA
(配列番号３６４)

他の例において、リーダー配列、ヒトメソテリン特異的抗原結合ドメインＭ５およびＫＩＲＳ２細胞質ドメインを含み、さらにペプチド開裂部位およびアダプター分子ＤＡＰ１２配列を含む多鎖ＫＩＲ−ＣＡＲの核酸配列を下に提供する。下線を引いた配列は、任意の他の抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載するヒト抗メソテリンｃＦｖと容易に相互交換できる、Ｍ５ｓｃＦｖの配列を示す。太字配列はＤＡＰ１２配列を示し、斜体配列はペプチド開裂部位Ｔ２Ａを示す。
(配列番号３６５)

リーダー配列、ヒトメソテリン特異的抗原結合ドメインＭ５およびＫＩＲＳ２細胞質ドメインを含み、さらにペプチド開裂部位およびアダプター分子ＤＡＰ１２配列を含む多鎖ＫＩＲ−ＣＡＲのアミノ酸配列を下に提供する。下線を引いた配列は、任意の他の抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載するヒト抗メソテリンｃＦｖと容易に相互交換できる、Ｍ５ｓｃＦｖの配列を示す。太字配列はＤＡＰ１２配列を示し、斜体配列はペプチド開裂部位Ｔ２Ａを示す。
(配列番号３６６)

細胞質ドメイン
ここに記載するＣＡＲ、例えば、ＮＫＲ−ＣＡＲまたはＴＣＡＲの細胞質ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが導入されている免疫エフェクター細胞の正常エフェクター機能の少なくとも一つを活性化できる。

本発明のＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例は、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)および抗原受容体結合後にシグナル伝達の開始に協調して働く共受容体の細胞質配列、ならびに同じ機能的能力を有するこれらの配列のあらゆる誘導体またはバリアントおよびあらゆる組み換え配列を含む。

ＴＣＲ単独により産生されたシグナルが、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の完全活性化に不十分であり、二次的および／または共刺激性シグナルも必要であることが知られている。それゆえに、免疫エフェクター細胞活性化、例えば、Ｔ細胞活性化またはＮＫ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列が介在するということができる：ＴＣＲを介する抗原依存性一次活性化を開始するもの(一次細胞内シグナル伝達ドメイン)および二次的または共刺激性シグナルを提供するために抗原非依存的方法で働くもの(二次的細胞質ドメイン、例えば、共刺激性ドメイン)。

一次細胞内シグナル伝達ドメイン
ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、融合している細胞外ドメイン、例えば、抗原結合ドメインが同族抗原に結合したとき、細胞内シグナルを産生する。これは、一次刺激性分子由来であり、例えば、一次刺激性分子の細胞内配列を含む。これは、例えば、融合している抗原結合ドメインが同族抗原と結合したとき、細胞内シグナルを産生するのに十分な一次刺激性分子配列を含む。

一次刺激性分子は、同族リガンドとの結合により、例えば、それが発現される細胞で免疫エフェクター応答を介在する分子である。一般に、抗原を含む同族リガンドとの結合に依存する、細胞内シグナルを産生する。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、例示的一次刺激性分子であり、ペプチドと共に充填された同族リガンド、例えば、ＭＨＣ分子への結合により、細胞内シグナルを産生する。一般に、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３一次刺激性分子の場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインによる細胞内シグナルの産生は、一次刺激性分子の抗原への刺激による。

一次刺激は、ＴＧＦ−βの下方制御および／または細胞骨格構造の再編成などのような、ある分子の発現の改変を仲介し得る。刺激は、例えば、共刺激存在下であってよく、Ｔ細胞の免疫エフェクター機能の最適化、例えば、増加をもたらす。例えば、Ｔ細胞の状況における、刺激は、Ｔ細胞応答、例えば、増殖、活性化、分化などを仲介できる。

ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナル伝達モチーフ、例えば、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはＩＴＡＭを含む。一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲゼータ(ＣＤ３ゼータ)、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(別名“ＩＣＯＳ”)、ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、およびＣＤ６６ｄからのＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達配列を含み得る。

ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインの例を表２に提供する。

ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、天然ＩＴＡＭドメインと比較して、改変された(例えば、増加または減少した)活性を有する、修飾ＩＴＡＭドメイン、例えば、変異ＩＴＡＭドメインを含む。ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、修飾ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化および／または切断ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインを吹くう。ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、１、２、３、４またはそれ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。

一次細胞内シグナル伝達ドメインは一次刺激性分子の機能的フラグメントまたはアナログを含む(例えば、ＣＤ３ゼータ − GenBank Acc. No. BAG36664.1)。細胞内領域全体または融合したもしくは二量体化スイッチにより連結された抗原結合ドメインが同族抗原に結合したとき、細胞内シグナルの産生に十分である細胞内領域のフラグメントを含み得る。ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、天然に存在する一次刺激性分子、例えば、表２に開示する一次刺激性分子、例えば、ヒト(GenBank Acc. No. BAG36664.1)または他の哺乳動物、例えば、非ヒト種、例えば、齧歯類、サル、霊長類またはマウス細胞内一次刺激性分子と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％配列同一性を有する。ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号９または配列番号１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％配列同一性を有する。

ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、天然に存在するヒト一次刺激性分子、例えば、ここに開示する天然に存在するヒト一次刺激性分子と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有するかまたはその対応する残基と３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない。

ＴＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを、それ自体で含んでよくまたはそれをＴＣＡＲの状況で有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせてよい。例えば、ＴＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータ鎖部分および１以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激性シグナル伝達ドメインの例を下に提供する。

共刺激性シグナル伝達ドメイン
ある態様において、共刺激性シグナル伝達ドメインは、融合しているかもしくは二量体化スイッチにより連結された抗原結合ドメインが同族リガンドに結合したとき、細胞内シグナルを生じる。それは共刺激性分子由来である。それは、例えば、融合しているかもしくは二量体化スイッチにより連結された抗原結合ドメインが同族リガンドに結合したとき、細胞内シグナルを生じるのに十分な一次共刺激性分子配列を含む。

共刺激性分子は、免疫エフェクター応答を促進する、抗原受容体またはそのカウンターリガンド以外の細胞表面分子である。いくつかの例において、それらは、効率的なまたは増強された免疫応答に必要である。一般に、共刺激性分子は、ある態様において、抗原、例えば、Ｔ細胞の抗原結合ドメインにより認識される抗原以外である、同族リガンドへの結合に依存する細胞内シグナルを産生する。一般に、一次刺激性分子および共刺激性分子からのシグナル伝達は、免疫エフェクター応答に貢献し、いくつかの例において両者は、免疫エフェクター応答の効率的なまたは増強された賛成に必要である。

共刺激性シグナル伝達ドメインは、共刺激性分子(例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、およびＩＣＯＳ)の機能的フラグメントまたはアナログを含む。それは、細胞内領域全体または、例えば、融合しているかもしくは二量体化スイッチにより連結された抗原結合ドメインが、同族抗原と結合したとき、細胞内シグナルの産生に十分な共刺激性分子の細胞内領域のフラグメントを含み得る。ある態様において、共刺激性シグナル伝達ドメインは、ここに記載する天然に存在する共刺激性分子、例えば、ヒトまたは他の哺乳動物、例えば、非ヒト種、例えば、齧歯類、サル、霊長類またはマウス細胞内共刺激性分子と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％配列同一性を有する。ある態様において、共刺激性ドメインは、配列番号７、配列番号８、配列番号３６または配列番号３８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％配列同一性を有する。

共刺激性シグナル伝達ドメイン(細胞内シグナル伝達ドメイン)の例を、表３に提供する。

ある態様において、共刺激性シグナル伝達ドメインは、天然に存在するヒト一次刺激性分子、例えば、ここに開示する、例えば、表３に提供する、天然に存在するヒト共刺激性分子と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有するかまたはその対応する残基と３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない。

ＴＣＡＲの細胞質ドメイン内の細胞内シグナル伝達配列は、互いに、無作為のまたは特定の順番で連結され得る。所望により、短オリゴまたはポリペプチドリンカー、例えば、２〜１０アミノ酸(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸)長が、細胞内シグナル伝達配列の愛暖オ結合を形成し得る。ある態様において、グリシン−セリンダブレットを適当なリンカーとして使用できる。ある態様において、単アミノ酸、例えば、アラニン、グリシンを適当なリンカーとして使用できる。

ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインを２以上の、例えば、２、３、４、５またはそれ以上の、共刺激性シグナル伝達ドメインを含むように設計できる。ある態様において、２以上の、例えば、２、３、４、５またはそれ以上の、共刺激性シグナル伝達ドメインが、リンカー分子、例えば、ここに記載するリンカー分子により離される。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、リンカー分子はグリシン残基である。ある態様において、リンカーはアラニン残基である。

ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインを、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計する。ある面において、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含むシグナル伝達ドメインである。ある面において、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１８の核酸配列によりコードされる。ある面において、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号９(変異体ＣＤ３ゼータ)または配列番号１０(野生型ヒトＣＤ３ゼータ)のアミノ酸配列を含むシグナル伝達ドメインである。

ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。ある面において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、配列番号１９の核酸配列によりコードされる。ある面において、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号９(変異体ＣＤ３ゼータ)または配列番号１０(野生型ヒトＣＤ３ゼータ)のアミノ酸配列を含むシグナル伝達ドメインである。

ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。ある面において、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号３７の核酸配列によりコードされる。ある面において、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号９(変異体ＣＤ３ゼータ)または配列番号１０(野生型ヒトＣＤ３ゼータ)のアミノ酸配列を含むシグナル伝達ドメインである。

ある面において、細胞内シグナル伝達ドメイは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、ＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインは、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。ある面において、ＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインは、配列番号３９の核酸配列によりコードされる。ある面において、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号９(変異体ＣＤ３ゼータ)または配列番号１０(野生型ヒトＣＤ３ゼータ)のアミノ酸配列を含むシグナル伝達ドメインである。

膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、種々の態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する膜貫通ドメインを含むように設計できる。先に記載のように、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＮＫＲの膜貫通ドメイン、例えば、ＫＩＲ膜貫通ドメイン、ＮＣＲ膜貫通ドメイン、ＳＬＡＭＦ膜貫通ドメイン、ＦｃＲ膜貫通ドメイン、例えば、ＣＤ１６膜貫通ドメインまたはＣＤ６４膜貫通ドメインまたはＬｙ４９膜貫通ドメインであり得る。あるいは、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲまたはＴＣＡＲの膜貫通ドメインは、下記の膜貫通ドメインのいずれか一つであり得る。

膜貫通ドメインは、天然由来でも組み換え源由来でもよい。源が天然であるとき、ドメインは、あらゆる膜結合または膜貫通タンパク質由来であり得る。ある面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合したときは常に細胞内ドメインにシグナル伝達できる。本発明において特に有用な膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８(例えば、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ)、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の少なくとも膜貫通領域を含み得る。ある態様において、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃbp、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２ＣおよびＣＤ１９の少なくとも膜貫通領域を含み得る。

膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１以上のさらなるアミノ酸、例えば、膜貫通が由来したタンパク質の細胞外領域と関係する１以上のアミノ酸(例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５アミノ酸の細胞外領域)および／または膜貫通タンパク質が由来したタンパク質の細胞内領域と関係する１以上のさらなるアミノ酸(例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５アミノ酸の細胞内領域)を含み得る。ある面において、膜貫通ドメインは、使用するＣＡＲの他方のドメインの一つと結合するものである。ある例において、膜貫通ドメインは、同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのこのようなドメインの結合を避けるために、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するために、選択またはアミノ酸置換により修飾され得る。ある面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞、細胞表面の他のＣＡＲとホモ二量体化できる。異なる面において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞に存在する天然結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するために修飾または置換され得る。

ある例において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質からのヒンジを介して、ＣＡＲの細胞外領域、例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインに結合できる。例えば、ある態様において、ヒンジは、ヒトＩｇ(免疫グロブリン)ヒンジ、例えば、ＩｇＧ４ヒンジまたはＣＤ８ａヒンジであり得る。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号２のアミノ酸配列を含む(例えば、それからなる)。ある面において、膜貫通ドメインは、配列番号６の膜貫通ドメインを含む(例えば、それからなる)。

ある面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号３のアミノ酸配列のヒンジを含む。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号１４のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。

ある面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＤヒンジを含む。例えば、ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号４のアミノ酸配列のヒンジを含む。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号１５のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。

ある面において、膜貫通ドメインは組み換えであってよく、この場合、優勢にロイシンおよびバリンのような疎水性残基を含む。ある面において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットを、組み換え膜貫通ドメインの各末端に見ることができる。

所望により、２〜１０アミノ酸長の短オリゴまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質領域の間の結合を形成し得る。グリシン−セリンダブレットは、特に適当なリンカーを提供する。例えば、ある面において、リンカーは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。ある態様において、リンカーは、配列番号１６のヌクレオチド配列によりコードされる。

ある面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。

キメラＴＣＲ
ある面において、ここに記載する抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する、例えば、表４に提供するような、抗体または抗体フラグメントを、Ｔ細胞受容体(“ＴＣＲ”)鎖の定常ドメインの１以上、例えば、ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータ鎖に移植して、所望の腫瘍抗原に特異的に結合するキメラＴＣＲを作ることができる。理論に縛られることを望まないが、キメラＴＣＲは、抗原結合によるＴＣＲ複合体によりシグナル伝達すると考えられる。このようなキメラＴＣＲは、当分野で知られる方法により製造できる(例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377; Zhang T et al, Cancer Gene Ther 2004; 11: 487-496; Aggen et al, Gene Ther. 2012 Apr;19(4):365-74))。

ある態様において、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲ発現細胞、例えば、ここに記載するＫＩＲ−ＣＡＲ発現細胞は、さらに、キメラＴＣＲを含む。別の態様において、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲ発現細胞を、キメラＴＣＲを発現する細胞と組み合わせて投与する。このような態様において、キメラＴＣＲの抗原結合ドメインは、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲと同じ腫瘍抗原に結合しても、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲと異なる腫瘍抗原に結合してもよい。

スプリットＣＡＲ
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、スプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣＡＲアプローチは、引用により本明細書に包含させる刊行物ＷＯ２０１４／０５５４４２号およびＷＯ２０１４／０５５６５７号により詳細に記載されている。簡潔にいうと、スプリットＣＡＲシステムは、第一抗原結合ドメインおよび共刺激性ドメイン(例えば、４−１ＢＢ)を有する第一ＣＡＲを発現する細胞を含み、該細胞はまた第二抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータ)を有する第二ＣＡＲも発現する。細胞が第一抗原と遭遇したとき、共刺激性ドメインが活性化され、細胞が増殖する。細胞が第二抗原に遭遇したとき、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化され、細胞死滅活性が開始される。それゆえに、ＣＡＲ発現細胞は、両抗原の存在下でのみ完全に活性化される。ある態様において、第一抗原結合ドメインはここに記載する腫瘍抗原を認識し、第二抗原結合ドメイン異なるここに記載する腫瘍抗原を認識する。

キメラ抗原受容体を制御するための戦略
ＣＡＲ活性が制御され得る多くの方法がある。ある態様において、ＣＡＲ活性が制御できる制御可能ＣＡＲは、ＣＡＲ治療の安全性および有効性を最適化するために望ましい。例えば、例えば、二量体化ドメインに融合した、カスパーゼを使用するアポトーシスの誘導(例えば、Di et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683参照)を、本発明のＣＡＲ治療における安全スイッチとして使用できる。他の例において、ＣＡＲ発現細胞はまた誘導性カスパーゼ−９(ｉＣａｓｐａｓｅ−９)分子も発現でき、これは、二量体化因子薬物(例えば、ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ(ＡＰ１９０３(Bellicum Pharmaceuticals)またはＡＰ２０１８７(Ariad)とも呼ばれる)の投与により、細胞のカスパーゼ−９活性化およびアポトーシスに至る。ｉＣａｓｐａｓｅ−９分子は、二量体化(ＣＩＤ)結合ドメインの化学誘導因子を含み、これは、ＣＩＤ存在下で二量体化に介在する。これは、ＣＡＲ発現細胞の誘導的および選択的枯渇に至る。ある場合、ｉＣａｓｐａｓｅ−９分子は、ＣＡＲコードベクターと別の核酸分子によりコードされる。ある場合、ｉＣａｓｐａｓｅ−９分子は、ＣＡＲコードベクターと同じ核酸分子によりコードされる。ｉＣａｓｐａｓｅ−９は、ＣＡＲ発現細胞の何らかの毒性を避けるための安全スイッチを提供できる。例えば、Song et al. Cancer Gene Ther. 2008; 15(10):667-75; Clinical Trial Id. No. NCT02107963; およびDi Stasi et al. N. Engl. J. Med. 2011; 365:1673-83参照。

本発明のＣＡＲ治療を制御するための代替的戦略は、例えば、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)の誘発により、例えば、ＣＡＲ発現細胞を消失させることにより、ＣＡＲ活性の脱活性化または遮断する小分子または抗体の利用を含む。例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、細胞死、例えば、ＡＤＣＣまたは補体誘導性細胞死を誘発できる分子により認識される抗原も発現し得る。例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞はまた抗体または抗体フラグメントにより標的化され得る受容体も発現し得る。このような受容体の例は、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン(例えば、インテグリンανβ３、α４、αΙ3／4β３、α４β７、α５β１、ανβ３、αν)、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー(例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２)、ＰＤＧＦ受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ−１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ１、ＴＡＧ−７２、ＩＬ−６受容体、５Ｔ４、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＣＤ１５、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ｌｇＥ受容体、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７／ベイシジン、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７およびＥＧＦＲおよびその切断バージョン(例えば、１以上の細胞外エピトープを保持するが、細胞質ドメイン内の１以上の領域を欠くバージョン)を含む。

例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、シグナル伝達能力を欠くが、ＡＤＣＣを誘発できる分子、例えば、セツキシマブ(アービタックス(登録商標))により認識されるエピトープを保持する切断型上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)も発現し、その結果、セツキシマブの投与がＡＤＣＣおよび続くＣＡＲ発現細胞の枯渇を誘発する(例えば、ＷＯ２０１１／０５６８９４号およびJonnalagadda et al., Gene Ther. 2013; 20(8)853-860参照)。他の戦略は、例えば、ＡＤＣＣによりＣＡＲ発現細胞の選択的枯渇をもたらす、リツキシマブに結合する、ここに記載するＣＡＲ発現細胞におけるＣＤ３２およびＣＤ２０抗原両者からの標的エピトープをあわせる、高度に小型のマーカー／自殺遺伝子の発現を含む(例えば、Philip et al., Blood. 2014; 124(8)1277-1287参照)。ここに記載するＣＡＲ発現細胞を枯渇させる他の方法は、例えば、ＡＤＣＣ誘発により、破壊するために、成熟リンパ球、例えば、ＣＡＲ発現細胞に選択的に結合し、標的とするモノクローナル抗ＣＤ５２抗体であるキャンパスの投与を含む。他の態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲリガンド、例えば、抗イディオタイプ抗体を使用して選択的に標的化され得る。ある態様において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えば、ＡＤＣＣまたはＡＤＣ活性を引き起こし、それによりＣＡＲ発現細胞数を減らすことができる。他の態様において、ＣＡＲリガンド、例えば、抗イディオタイプ抗体は、細胞致死を誘発する薬剤、例えば、トキシンに結合させ、それによりＣＡＲ発現細胞数を減らすことができる。あるいは、ＣＡＲ分子自体、下記のように、活性が制御され得る、例えば、活性化または遮断され得るように配置できる。

他の態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、Ｔ細胞枯渇剤により認識される標的タンパク質も発現し得る。ある態様において、標的タンパク質はＣＤ２０であり、Ｔ細胞枯渇剤は抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブである。このような態様において、Ｔ細胞枯渇剤を、例えば、ＣＡＲ誘発毒性を軽減するために、ＣＡＲ発現細胞の減少または除去が望まれるとき、投与する。他の態様において、Ｔ細胞枯渇剤は、ここでの実施例に記載するような、抗ＣＤ５２抗体、例えば、アレムツズマブである。

他の態様において、制御可能ＣＡＲ(ＲＣＡＲ)は、ここに記載する標準的ＣＡＲの要素、例えば、抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが、別々のポリペプチドまたはメンバーに配置された、一連の、一般に最も単純な態様において２つの、ポリペプチドを含む。ある態様において、一連のポリペプチドは、二量体化分子存在下、互いにポリペプチドを結合できる、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合できる、二量体化スイッチを含む。このような制御可能ＣＡＲのさらなる記載および例示定期配置は、ここにおよび、引用により本明細書にその全体を包含させる国際公開ＷＯ２０１５／０９０２２９号に提供される。

ある面において、ＲＣＡＲは、２ポリペプチドまたはメンバーを含む：１)例えば、ここに記載する初代細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン２)例えば、ここに記載のような腫瘍抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバー。場合により、ＲＣＡＲは、ここに記載する膜貫通ドメインを含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達メンバー上、抗原結合メンバー上または両者の上に配置できる。(特に断らない限り、ＲＣＡＲのメンバーまたは要素がここに記載されるものであるとき、順序は記載したとおりであり得るが、他の順序も同様に含まれる。換言すると、ある態様において、順序は本書に記載のとおりであるが、他の態様において、順序は異なり得る。例えば、膜貫通領域の一端の要素の順序は例と異なってよく、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインに対するスイッチドメインの配置は異なって、例えば逆でよい)。

ある態様において、第一および第二スイッチドメインは、細胞内または細胞外二量体化スイッチを形成できる。ある態様において、二量体化スイッチは、例えば、第一および第二スイッチドメインが同一であるホモ二量体化スイッチでも、例えば、第一および第二スイッチドメインが互いに異なるヘテロ二量体化スイッチでもよい。

ある態様において、ＲＣＡＲは、“多スイッチ”を含み得る。多スイッチは、ヘテロ二量体化スイッチドメインまたはホモ二量体化スイッチドメインを含み得る。多スイッチは、複数の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のスイッチドメインを、独立して、第一メンバー、例えば、抗原結合メンバーおよび第二メンバー、例えば、細胞内シグナル伝達メンバー上に含む。ある態様において、第一メンバーは複数の第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインを含んでよく、第二メンバーは複数の第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよい。ある態様において、第一メンバーは第一および第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよく、第二メンバーは第一および第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよい。

ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、初代細胞内シグナル伝達ドメインおよび１以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。

ある態様において、抗原結合メンバーは、１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、１以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含み得る。ある態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば、２または３の、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択される、ここに記載する共刺激性シグナル伝達ドメインを含み、ある態様において、初代細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、抗原結合メンバーは、細胞外から細胞内方向で、次の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む：４−１ＢＢ−ＣＤ２７；４１ＢＢ−ＣＤ２７；ＣＤ２７−４−１ＢＢ；４−１ＢＢ−ＣＤ２８；ＣＤ２８−４−１ＢＢ；ＯＸ４０−ＣＤ２８；ＣＤ２８−ＯＸ４０；ＣＤ２８−４−１ＢＢ；または４−１ＢＢ−ＣＤ２８。このような態様において、細胞内結合メンバーはＣＤ３ゼータドメインを含む。このような態様において、ＲＣＡＲは、(１)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび２共刺激ドメインおよび第一スイッチドメインを含む抗原結合メンバー；および(２)膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメインおよび少なくとも一つの初代細胞内シグナル伝達ドメインおよび第二スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

ある態様は、抗原結合メンバーがＣＡＲ細胞表面に繋留されていないＲＣＡＲを提供する。これは、細胞内シグナル伝達メンバーを有する細胞が、該細胞を、抗原結合メンバーをコードする配列で形質転換する必要はなく、１以上の抗原結合ドメインと好都合に対合することを可能とする。このような態様において、ＲＣＡＲは１)第一スイッチドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、初代細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；および２)抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバーを含み、ここで、抗原結合メンバーは膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメインを含まず、場合により細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、ＲＣＡＲは、３)第二抗原結合ドメイン、例えば、抗原結合ドメインにより結合されるのと異なる抗原に結合する第二抗原結合ドメイン；および第二スイッチドメインを含む第二抗原結合メンバーをさらに含み得る。

またここで提供されるのは、抗原結合メンバーが二特異性活性化およびターゲティング能を含む、ＲＣＡＲである。この態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば、２、３、４または５抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖを含んでよく、ここで、各原結合ドメインは、標的抗原、例えば異なる抗原または同じ抗原、例えば、同じ抗原の同一または異なるエピトープに結合する。ある態様において、複数の抗原結合ドメインはタンデムであり、場合により、リンカーまたはヒンジ領域が抗原結合ドメインの各々の間に配置される。適当なリンカーおよびヒンジ領域は、ここに記載される。

ある態様は、増殖のスイッチングが可能な配置を有するＲＣＡＲを提供する。この態様において、ＲＣＡＲは１)場合により、膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメイン；例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０およびスイッチドメインから選択される１以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；および２)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび初代細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインを含む抗原結合メンバーを含み、ここで、抗原結合メンバーはスイッチドメインを含まないまたは細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化するスイッチドメインを含まない。ある態様において、抗原結合メンバーｄは、共刺激性シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ホモ二量体化スイッチからのスイッチドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ヘテロ二量体化スイッチの第一スイッチドメインを含み、ＲＣＡＲは、ヘテロ二量体化スイッチの第二スイッチドメインを含む第二細胞内シグナル伝達メンバーを含む。このような態様において、第二細胞内シグナル伝達メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバーと同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、二量体化スイッチは細胞内である。ある態様において、二量体化スイッチは細胞外である。

ここに記載するＲＣＡＲ配置のいずれかにおいて、第一および第二スイッチドメインは、ここに記載するようなＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含む

またここで提供されるのは、ここに記載するＲＣＡＲを含む細胞である。ＲＣＡＲを発現するように操作したあらゆる細胞を、ＲＣＡＲＸ細胞として使用できる。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＴ細胞であり、ＲＣＡＲＴ細胞と称する。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＮＫ細胞であり、ＲＣＡＲＮ細胞と称する。

またここで提供されるのは、ＲＣＡＲコード化配列を含む核酸およびベクターである。ＲＣＡＲの種々の要素をコードする配列は、同じ核酸分子、例えば、同じプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置できる。ある態様において、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は、同じ核酸、例えば、ベクターに存在できる。対応するタンパク質の産生は、例えば、別々のプロモーターの使用によりまたはバイシストロニック転写産物(これは、単一翻訳産物の開裂または２つの別々のタンパク質産物の翻訳により２タンパク質の産生を生じ得る)の使用により、達成できる。ある態様において、開裂可能ペプチドをコードする配列、例えば、Ｐ２ＡまたはＦ２Ａ配列を、(ｉ)と(ii)の間に配置する。ある態様において、ＩＲＥＳ、例えば、ＥＭＣＶまたはＥＶ７１ＩＲＥＳをコードする配列を、(ｉ)と(ii)の間に配置する。これらの態様において、(ｉ)および(ii)は、単一ＲＮＡとして転写される。ある態様において、は、(ｉ)および(ii)が別々のｍＲＮＡとして転写されるように、第一プロモーターは(ｉ)に操作可能に連結し、第二プロモーターは(ii)に操作可能に連結する。

あるいは、ＲＣＡＲの種々の要素をコードする配列を、種々の核酸分子、例えば、異なるプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置できる。例えば、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列を第一核酸、例えば、第一ベクターに配置でき、(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は、第二核酸、例えば、第二ベクターに存在できる。

二量体化スイッチ
二量体化スイッチは非共有でも共有でもよい。非共有二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の非共有相互作用を促進する。共有二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の共有相互作用を促進する。

ある態様において、ＲＣＡＲは、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰまたはＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチを含む。ＦＫＢＰ１２(ＦＫＢＰまたはＦＫ５０６結合タンパク質)は、天然産物免疫抑制剤、ラパマイシンのための最初の細胞内標的として働く、豊富な細胞質タンパク質である。ラパマイシンは、ＦＫＢＰおよび大ＰＩ３ＫホモログＦＲＡＰ(ＲＡＦＴ、ｍＴＯＲ)に結合する。ＦＲＢは、ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体の結合のために十分であるＦＲＡＰの９３アミノ酸部分である(Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51.)。

ある態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチは、二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログを使用できる。

ＦＫＢＰのアミノ酸配列は次のとおりである。
D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S Y(配列番号４３)

ある態様において、ＦＫＢＰスイッチドメインは、ラパマイシンまたはラパログの存在下、ＦＲＢまたはそのフラグメントもしくはアナログと結合する能力を有するＦＫＢＰのフラグメント、例えば、配列番号４３の下線を引いた部分であり、それは次のとおりである。
V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S(配列番号４４)

ＦＲＢのアミノ酸配列は次のとおりである。
ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK(配列番号４５)

ここで使用する用語“ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチ”は、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１の存在下、ＦＲＢまたはそのフラグメントまたはアナログと結合する能力を有するＦＫＢＰフラグメントまたはそのアナログを含み、配列番号５４または５５のＦＫＢＰ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するかまたは３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない第一スイッチドメイン；およびラパマイシンまたはラパログの存在下に、ＦＲＢまたはそのフラグメントまたはアナログと結合する能力を有するＦＲＢフラグメントまたはそのアナログを含み、配列番号４５のＦＲＢ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するかまたは３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない第二スイッチドメインを含む、二量体化スイッチをいう。ある態様において、ここに記載するＲＣＡＲは、配列番号４３(または配列番号４４)に開示するアミノ酸残基を含む１スイッチドメインおよび配列番号４５に開示するアミノ酸残基を含む１スイッチドメインを含む。

ある態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化スイッチは、ＦＲＢベースのスイッチドメイン、例えば、修飾ＦＲＢスイッチドメイン、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよび二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１の間の複合体形成が変えられた、例えば、増強された、修飾ＦＲＢスイッチドメインを含む。ある態様において、修飾ＦＲＢスイッチドメインは、アミノ酸位置Ｌ２０３１、Ｅ２０３２、Ｓ２０３５、Ｒ２０３６、Ｆ２０３９、Ｇ２０４０、Ｔ２０９８、Ｗ２１０１、Ｄ２１０２、Ｙ２１０５およびＦ２１０８から選択される、１以上の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の変異を含み、ここで、野生型アミノ酸は、いずれかの他の天然に存在するアミノ酸への変異されている。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２に変異を含み、ここで、Ｅ２０３２は、フェニルアラニン(Ｅ２０３２Ｆ)、メチオニン(Ｅ２０３２Ｍ)、アルギニン(Ｅ２０３２Ｒ)、バリン(Ｅ２０３２Ｖ)、チロシン(Ｅ２０３２Ｙ)、イソロイシン(Ｅ２０３２Ｉ)、例えば、配列番号４６またはロイシン(Ｅ２０３２Ｌ)、例えば、配列番号４７に変異されている。ある態様において、変異体ＦＲＢはＴ２０９８に変異を含み、ここで、Ｔ２０９８は、フェニルアラニン(Ｔ２０９８Ｆ)またはロイシン(Ｔ２０９８Ｌ)、例えば、配列番号４８に変異されている。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２およびＴ２０９８に変異を含み、ここで、Ｅ２０３２はいずれかのアミノ酸に変異され、Ｔ２０９８はいずれかのアミノ酸に変異され、例えば、配列番号４９である。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２ＩおよびＴ２０９８Ｌ変異を含み、例えば、配列番号５０である。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含み、例えば、配列番号５１である。

他の適当な二量体化スイッチは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースの二量体化スイッチ、ジベレリンベースの二量体化スイッチ、タグ／バインダー二量体化スイッチおよびハロタグ／ｓｎａｐタグ二量体化スイッチを含む。ここに提供する手引きに従い、このようなスイッチおよび関連する二量体化分子は、当業者に明らかである。

二量体化分子
スイッチドメイン間の結合は、二量体化分子により促進される。二量体化分子存在下、スイッチドメイン間の相互作用または結合は、第一スイッチドメインに結合、例えば融合しているポリペプチドと、第二スイッチドメインに結合、例えば融合しているポリペプチドの間のシグナル伝達を可能にする。非律速レベルの二量体化分子存在下、シグナル伝達は、例えば、ここに記載する系で測定して、１.１倍、１.２倍、１.３倍、１.４倍、１.５倍、１.６倍、１.７倍、１.８倍、１.９倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍増加する。

ラパマイシンおよびラパマイシンアナログ(ラパログと呼ぶこともある)、例えば、ＲＡＤ００１は、ここに記載するＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチにおける二量体化分子として使用できる。ある態様において、二量体化分子は、ラパマイシン(シロリムス)、ＲＡＤ００１(エベロリムス)、ゾタロリムス、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３(リダフォロリムス)、バイオリムスおよびＡＰ２１９６７から選択できる。ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチで使用するのに適するさらなるラパマイシンアナログは、“組み合わせ治療”なる表題の部分または“低用量のｍＴＯＲ阻害剤との組み合わせ”なる表題の小部分にさらに記載する。

ＣＡＲのケモカイン受容体との共発現
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＮＫＲ−ＣＡＲ発現細胞、例えば、ここに記載するＫＩＲ−ＣＡＲ発現細胞は、さらに、ケモカイン受容体分子を含む。Ｔ細胞におけるケモカイン受容体ＣＣＲ２ｂまたはＣＸＣＲ２のトランスジェニック発現は、黒色腫および神経芽腫を含むＣＣＬ２−またはＣＸＣＬ１分泌固形腫瘍への輸送を増強する(Craddock et al., J Immunother. 2010 Oct; 33(8):780-8およびKershaw et al., Hum Gene Ther. 2002 Nov 1; 13(16):1971-80)。それゆえに、理論に縛られることを望まないが、腫瘍、例えば、固形腫瘍により分泌されるケモカインを認識するＣＡＲ発現細胞で発現されるケモカイン受容体は、ＣＡＲ発現細胞の腫瘍への帰巣を改善し、ＣＡＲ発現細胞の腫瘍への浸潤を促進し、そしてＣＡＲ発現細胞の抗腫瘍効果を増強すると考えられる。ケモカイン受容体分子は、天然に存在するまたは組み換えケモカイン受容体またはそのケモカイン結合フラグメントを含む。ここに記載するＣＡＲ発現細胞における発現に適するケモカイン受容体分子は、ＣＸＣケモカイン受容体(例えば、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６またはＣＸＣＲ７)、ＣＣケモカイン受容体(例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０またはＣＣＲ１１)、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体(例えば、ＣＸ３ＣＲ１)、ＸＣケモカイン受容体(例えば、ＸＣＲ１)またはそのケモカイン結合フラグメントを含む。ある態様において、ここに記載するＣＡＲと共に発現するケモカイン受容体分子は、腫瘍により発現されるケモカインに基づき選択する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、さらに、ＣＣＲ２ｂ受容体またはＣＸＣＲ２受容体を含む、例えば、発現する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲおよびケモカイン受容体分子は、同じベクターにあるまたは２つの異なるベクターにある。ここに記載するＣＡＲおよびケモカイン受容体分子が同じベクターにある態様において、ＣＡＲおよびケモカイン受容体分子は、各々、２つの異なるプロモーターの制御下にあるかまたは同じプロモーターの制御下にある。

ＣＡＲをコードする核酸構築物
本発明はまたここに記載する１以上のＣＡＲ構築物をコードする核酸分子を提供する。ある面において、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。ある面において、核酸分子は、ＤＮＡ構築物として提供される。

ある態様において、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸分子は、さらに、細胞内シグナル伝達ドメインまたはアダプター分子をコードする核酸を含む。

本発明はまた本発明のＤＮＡが挿入されているベクターも提供する。レンチウイルスのようなレトロウイルス由来のベクターは、それらが導入遺伝子の長期の安定した組み込みおよび娘細胞への伝播を可能にするため、長期遺伝子導入を達成するのに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞のような非増殖細胞を形質導入できる点で、マウス白血病ウイルスのようなオンコ−レトロウイルス由来のベクターを超えるさらなる利点を有する。さらに低免疫原性であるという付加的利点も有する。レトロウイルスベクターは、例えば、ガンマレトロウイルスベクターでもあり得る。ガンマレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル(ψ)、プライマー結合部位(ＰＢＳ)、１以上の(例えば、２)末端反復配列(ＬＴＲ)および目的の導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子を含み得る。ガンマレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖのようなウイルス構造的遺伝子を欠き得る。ガンマレトロウイルスベクターの例は、マウス白血病ウイルス(MLＶ)、脾フォーカス形成ウイルス(ＳＦＦＶ)および骨髄増殖性肉腫ウイルス(ＭＰＳＶ)およびそれら由来のベクターを含む。他のガンマレトロウイルスベクターは、例えば、Tobias Maetzig et al., “Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application” Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713に記載される。

他の態様において、所望の本発明のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター(Ａ５／３５)である。他の態様において、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、ｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙ、ｃｒｉｓｐｅｒ、ＣＡＳ９および亜鉛フィンガーヌクレアーゼのようなトランスポゾンを使用して達成できる。引用により本明細書に包含する、下記June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716参照。

概説すると、ＣＡＲをコードする天然または合成核酸の発現は、一般に、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸またはその一部をプロモーターに操作可能に連結させ、当該構築物を発現ベクターに取り込むことにより達成される。ベクターは、真核生物での複製および組込みに適し得る。典型的クローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列およびプロモーターを含む。

本発明の構築物の発現はまた、標準遺伝子送達プロトコールを使用する、核酸免疫化および遺伝子治療にも使用し得る。遺伝子送達のための方法が当分野で知られる。例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させる、米国特許５,３９９,３４６号、５,５８０,８５９号、５,５８９,４６６号参照。他の態様において、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。

核酸は、多数のタイプのベクターにクローン化できる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローン化できる。特に興味深いベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクターおよびシークエンシングベクターを含む。

さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形で細胞に提供され得る。ウイルスベクターテクノロジーは当分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NYおよび他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適当なベクターは、少なくとも１生物で機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位および１以上の選択可能マーカーを含む(例えば、ＷＯ０１／９６５８４号；ＷＯ０１／２９０５８号；および米国特許６,３２６,１９３号)。

多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子を、当分野で知られる技術を使用して、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子に包装できる。次いで、組み換えウイルスが単離され、対象の細胞にインビボまたはエクスビボで送達され得る。多数のレトロウイルス系が当分野で知られる。ある態様において、アデノウイルスベクターを使用する。多数のアデノウイルスベクターが当分野で知られる。ある態様において、レンチウイルスベクターを使用する。

さらなるプロモーター要素、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。一般に、これらは、開始部位の上流３０〜１１０bpの領域に位置するが、多数のプロモーターが、最近、同様に開始部位の下流に機能的要素を含むことが示されている。プロモーター要素間の空間はしばしば可動性であり、それゆえに、要素が互いに逆になったり移動したときにプロモーター機能が保持される。チミジンキナーゼ(ｔｋ)プロモーターにおいて、プロモーター要素間の空間は、活性が落ち始める前、５０bp離れるまで増加し得る。プロモーターによって、個々の要素は、転写を活性化するために協調的または独立的に機能できるように見える。プロモーターの例は、ＣＭＶＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。

哺乳動物Ｔ細胞においてＣＡＲ導入遺伝子の発現ができるプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然ＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素送達を担う、伸長因子−１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは哺乳動物発現プラスミドで広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローン化された導入遺伝子からＣＡＲ発現を駆動するのに有効であることが示されている。例えば、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464(2009)参照。ある面において、ＥＦ１ａプロモーターは、配列番号１１として提供される配列を含む。

プロモーターの他の例は、最初期サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに操作可能に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる、強い構成的プロモーター配列である。しかしながら、サルウイルス４０(ＳＶ４０)初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス(ＭＭＴＶ)、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)末端反復配列(ＬＴＲ)プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、伸長因子−１αプロモーターを含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター配列ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターのような、しかしこれらに限定されないヒト遺伝子プロモーターも使用し得る。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定すべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部であるとして意図される。誘導性プロモーターの使用は、操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を、発現が望まれるときに発現を活性化し、発現が望まれないときに発現を遮断することができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。

ある態様において、ベクターはレンチウイルスベクターである。ある態様において、ベクターは、さらにプロモーターを含む。ある態様において、プロモーターは、ＥＦ−１プロモーターである。

ある態様において、ベクターは、インビトロ転写ベクター、例えば、ここに記載する核酸分子のＲＮＡを転写するベクターである。ある態様において、ベクターにおける核酸配列は、さらに、例えば、約１５０アデノシン塩基を含む、ポリ(Ａ)テイル、例えば、ここに記載するポリＡテイルを含む。ある態様において、ベクターにおける核酸配列は、さらに、３’ＵＴＲを含む。

プロモーターの他の例は、ホスホグリセラートキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターである。ある態様において、切断ＰＧＫプロモーター(例えば、野生型ＰＧＫプロモーター配列と比較したとき、１以上の、例えば、１、２、５、１０、１００、２００、３００または４００ヌクレオチド欠失を有するＰＧＫプロモーター)が望ましいことがある。ＰＧＫプロモーター例のヌクレオチド配列を下に提供する

ＷＴＰＧＫプロモーター
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT
(配列番号５２)

切断ＰＧＫプロモーター例：
ＰＧＫ１００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG
(配列番号５３)
ＰＧＫ２００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG
(配列番号５４)
ＰＧＫ３００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG
(配列番号５５)
ＰＧＫ４００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG
(配列番号５６)

ベクターは、例えば、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター(例えば、ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)遺伝子から)、エピソーム複製および原核生物における複製を可能にする要素(例えばＳＶ４０起源およびＣｏｌＥ１または当分野で知られるその他)および／または選択を可能にする要素(例えば、アンピシリン耐性遺伝子および／またはゼオシンマーカー)も含み得る。

ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入する発現ベクター遺伝子導入またはウイルスベクターによる感染が探求される細胞の集団から発現細胞から発現細胞の同定および選択を容易にするために、選択可能マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子または両者も含んでよい。他の面において、選択可能マーカーは、ＤＮＡの別の断面に担持され、共遺伝子導入法において使用される。選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子のいずれも、宿主細胞における発現が可能であるように、適切な制御配列が隣接し得る。有用な選択可能マーカーは、例えば、ｎｅｏなどの、抗生物質耐性遺伝子を含む。

レポーター遺伝子は、恐らく遺伝子導入されている細胞を同定し、制御配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在または発現されず、発現がある容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする、遺伝子である。レポーター遺伝子の発現を、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入されてから適当な時間後にアッセイする。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る(例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適当な発現系は周知であり、既知技術により製造できまたは商業的に入手できる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物を、プロモーターとして同定する。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子により連結でき、薬剤のプロモーター駆動転写を調節する能力についての評価に使用できる。

ある態様において、ベクターは、さらに、第二ＣＡＲ、例えば、第二ＮＫＲ−ＣＡＲ、ＴＣＡＲまたは阻害性ＣＡＲをコードする核酸を含み得る。ある態様において、第二ＣＡＲは、標的抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。ある態様において、第一ＣＡＲにより結合される抗原は、第二ＣＡＲにより結合されるのと同じ抗原である。あるいは、第一ＣＡＲにより結合される抗原は、第二ＣＡＲにより結合されるのと異なる抗原である。例えば、第一ＣＡＲはメソテリンに結合し、第二ＣＡＲは異なる腫瘍抗原または正常細胞に提示される抗原に結合する。

ある態様において、ベクターは、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸およびＴＣＡＲをコードする核酸を含む。ある態様において、ＴＣＡＲは、腫瘍抗原、例えば、ＮＫＲ−ＣＡＲにより結合されるのと異なる腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。ある態様において、ＴＣＡＲは抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインはここに記載する一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータまたは表２により提供されるものおよび所望により、１以上のここに記載する共刺激性シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳまたは表３を含む。

ある態様において、ベクターは、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸および阻害性ＣＡＲをコードする核酸を含む。ある態様において、阻害性ＣＡＲは、正常細胞、例えば、ＮＫＲ−ＣＡＲにより認識される抗原も発現する正常細胞に見られるが、癌細胞に見られない抗原と結合する抗原結合ドメインを含む。ある態様において、阻害性ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび阻害性分子の細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦＲベータの細胞内ドメインであり得る。

ある態様において、ベクターは、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲおよび第一ＮＫＲ−ＣＡＲにより認識される抗原以外の抗原と特異的に結合する第二ＣＡＲ、例えば、第二ＮＫＲ−ＣＡＲ、阻害性ＣＡＲまたはＴＣＡＲをコードする２以上の核酸配列を含み得る。このような態様において、ＣＡＲをコードする２以上の核酸配列は、同じフレームの単一核酸分子および単一ポリペプチド鎖としてコードされる。この面において、２以上のＣＡＲは、例えば、１以上のペプチド開裂部位により離され得る(例えば、自己開裂部位または細胞内プロテアーゼの基質)。

ある態様において、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターは、さらに、アダプター分子をコードする核酸配列を含む。このような態様において、２以上の核酸配列は、同じフレームの単一核酸分子および単一ポリペプチド鎖としてコードされる。この態様において、ＮＫＲ−ＣＡＲおよびアダプター分子１以上のペプチド開裂部位により離されてよく(例えば、自己開裂部位または細胞内プロテアーゼの基質)、ここで、ＮＫＲ−ＣＡＲ、アダプター分子およびペプチド開裂部位は同じフレームにあり、単一ポリペプチド鎖としてコードされる。

ペプチド開裂部位の例は次のものを含み、ここで、ＧＳＧ残基は任意である。
Ｔ２Ａ：(GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P(配列番号５７)
Ｐ２Ａ：(GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P(配列番号５８)
Ｅ２Ａ：(GSG) Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P(配列番号５９)
Ｆ２Ａ：(GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P(配列番号６０)

細胞に遺伝子を導入し、発現させる方法は当分野で知られる。発現ベクターの状況において、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞に、当分野のいずれかの方法により容易に導入できる。例えば、例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段により、宿主細胞に移入される。

ポリヌクレオチドを、多くの種々の方法のいずれか、例えば、エレクトロポレーション(ＡｍａｘａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ−ＩＩ(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments, Boston, Mass.)またはGene Pulser II(BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator(Eppendort, Hamburg Germany)、リポフェクションを使用するカチオンリポソーム介在遺伝子導入、ポリマーカプセル封入、ペプチド介在遺伝子導入または“遺伝子銃”のような微粒子銃粒子送達システム(例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)参照)を含むが、これらに限定されない、商業的に入手可能な方法を使用して、標的細胞に導入できる。

宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、微量注入、エレクトロポレーションなどを含む。ベクターおよび／または外来性核酸を含む細胞を産生する方法は、当分野で周知である。例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY参照)。

宿主細胞に目的のポリヌクレオチドを導入するための生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞への遺伝子挿入に最も広く使用される方法となってきている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許５,３５０,６７４号および５,５８５,３６２号参照。

宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズおよび水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系のようなコロイド分散体系を含む。インビトロおよびインビボで送達媒体として使用するための代表的コロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。標的化ナノ粒子または他の適当なサブミクロンサイズの送達系を用いるポリヌクレオチドの送達のような、最新式の核酸の標的化送達の他の方法が利用可能である。

非ウイルス送達系を利用する場合、代表的送達媒体はリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入のために意図される(インビトロ、エクスビボまたはインビボ)。他の面において、核酸は、脂質と結合され得る。脂質と結合した核酸は、リポソームの水性内部への被包、リポソームの脂質二重層内への分散、リポソームとオリゴヌクレオチドの両者と結合する連結分子を介するリポソームへの結合、リポソームへの封入、リポソームとの複合体化、脂質含有溶液への分散、脂質との混合、脂質との組み合わせ、脂質中の懸濁液としての包含、ミセル内への包含または複合体化または他の方法で脂質と結合する。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター結合組成物は、溶液中の何らかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造において、ミセルとしてまたは“崩壊”構造を有して存在し得る。それらはまた単に溶液に分散され、恐らく、サイズまたは形が均一ではない凝集体を形成し得る。脂質は、天然に存在するまたは合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、例えば、脂質は、細胞質に天然に生じる脂肪滴ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドのような長鎖脂肪族炭化水素を含む化合物群およびその誘導体を含む。

使用に適する脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(“ＤＭＰＣ”)は、Sigma, St. Louis, MOから得ることができ、リン酸ジセチル(“ＤＣＰ”)はK & K Laboratories(Plainview, NY)から得ることができ；コレステロール(“Ｃｈｏｉ”)はCalbiochem-Behringから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール(“ＤＭＰＧ”)および他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL.)から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質の原液を、約−２０℃で保存できる。クロロホルムを、メタノールよりも容易に揮発するために、唯一の溶媒として使用する。“リポソーム”は、封入された脂質二重層または凝集体の産生により形成される多様な単および多層状脂質媒体を包含する一般的用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を伴う小胞構造を有することにより特徴付けられる。多層状リポソームは、水性媒体により分離された、複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されたときに自然に形成される。脂質要素は、閉構造形成前に自己凝集し、水および溶解した溶質を脂質二重層の間に封入する(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10)。しかしながら、通常の小胞構造と異なる構造を溶液で有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造であるかまたは単に脂質分子の不均一凝集体として存在すると考えられ得る。リポフェクタミン−核酸複合体もまた考慮される。

外来性核酸を宿主細胞に導入するまたはそうでなければ細胞を本発明の阻害剤に曝す方法に関係なく、宿主細胞における組み換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、多様なアッセイを行い得る。このようなアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲのような当業者に周知の“分子生物学的”アッセイ、薬剤の同定に使用するための、例えば、免疫学的手段(ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット)により、特定のペプチドの存在または不在を検出するような“生化学的”アッセイまたは本発明の範囲内に入るここに記載するアッセイを含む。

本発明は、さらに、核酸分子をコードするＣＡＲを含むベクターを提供する。ある面において、ＣＡＲベクターを、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に直接形質導入できる。ある面において、ベクターはクローニングまたは発現ベクター、例えば、１以上のプラスミド(例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重分染色体)、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物を含むが、これらに限定されない、ベクターである。ある面において、ベクターは、哺乳動物免疫エフェクター細胞、例えば、哺乳動物Ｔ細胞または哺乳動物ＮＫ細胞でＣＡＲ構築物を発現できる。ある面において、哺乳動物Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。

ＲＮＡ遺伝子導入
ここに開示するのは、インビトロ転写ＲＮＡＣＡＲ、例えば、ＲＮＡＮＫＲ−ＣＡＲを産生する方法である。本発明はまた、細胞に直接遺伝子導入できるＲＮＡ構築物をコードするＮＫＲ−ＣＡＲも含む。ある態様において、ＲＮＡ構築物をコードするＮＫＲ−ＣＡＲは、さらに、ここに記載するＴＣＡＲをコードする核酸配列を含む。遺伝子導入に使用するｍＲＮＡを使用するための方法は、一般に５０〜２０００塩基長(配列番号３５)を産生するための、特異的に設計したプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ付加を含み、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)、５’キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)、発現させる核酸およびポリＡテイルを含む構築物を含む。このように産生したＲＮＡは、異なる種類の細胞を効率的に遺伝子導入できる。ある面において、鋳型は、ＮＫＲ−ＣＡＲの配列を含む。

ある面において、ＮＫＲ−ＣＡＲは、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)により転写される。ある面において、ＮＫＲ−ＣＡＲをコードするｍＲＮＡは、ＮＫＲ−ＣＡＲ細胞の産生のためにＴ細胞に導入される。ある面において、ＮＫＲ−ＣＡＲをコードするｍＲＮＡは、ＮＫＲ−ＣＡＲ細胞の産生のためにＮＫ細胞に導入される。

ある態様において、インビトロ転写ＲＮＡＮＫＲ−ＣＡＲを、一過性遺伝子導入の形で細胞に導入できる。ＲＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)産生鋳型を使用するインビトロ転写により産生する。任意の源からの目的のＤＮＡを、適切なプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロｍＲＮＡ合成のための鋳型に、ＰＣＲにより著幾節変換できる。ＤＮＡの源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列または任意の他の適切なＤＮＡの源であり得る。ある態様において、インビトロ転写のための所望の鋳型は、本発明のＮＫＲ−ＣＡＲである。例えば、ＲＮＡＮＫＲ−ＣＡＲの鋳型は、抗腫瘍抗体の単鎖可変ドメインを含む細胞外領域；ヒンジ領域、膜貫通ドメイン(例えば、ＫＩＲの膜貫通ドメイン)を含む。ある態様において、インビトロ転写の所望の鋳型は、別々の鋳型にＫＩＲ−ＣＡＲおよびＤＡＰ１２を含む。ある態様において、インビトロ転写の所望の鋳型は、同じ鋳型にＫＩＲ−ＣＡＲおよびＤＡＰ１２を含む。ＤＡＰ１２の鋳型は、膜貫通ドメインおよび細胞内領域を含む。

ある態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡはオープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノムからの天然に存在するＤＮＡ配列由来であり得る。ある態様において、核酸は、５’および／または３’非翻訳領域(ＵＴＲ)のいくぶんかまたは全てを含み得る。核酸はエクソンおよびイントロンを含み得る。ある態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡはヒト核酸配列である。他の態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、５’および３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。ＤＮＡは、あるいは、天然に存在する生物で通常発現されない人工ＤＮＡ配列であり得る。人工ＤＮＡ配列の例は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するようにライゲートされた遺伝子の部分を含むものである。ライゲートされたＤＮＡの部分は、単一生物由来でも１を超える生物由来でもよい。

ＰＣＲを使用して、遺伝子導入に使用するｍＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型を産生する。ＰＣＲを実施する方法は、当分野で周知である。ＰＣＲにおいて使用するプライマーは、ＰＣＲのための鋳型として使用するＤＮＡの領域に実質的に相補的である領域を有するように設計する。ここで使用する“実質的に相補的”は、プライマー配列の残基の大部分または全てが相補的であるまたは１以上の塩基が非相補的またはミスマッチである、ヌクレオチドの配列をいう。実質的に相補的配列は、ＰＣＲに使用するアニーリング条件下で、ＤＮＡ標的とアニールまたはハイブリダイズできる。プライマーは、ＤＮＡ鋳型のいずれかの部分と実質的に相補的であるように設計できる。例えば、プライマーは、５’および３’ＵＴＲを含む、細胞において通常転写される(オープンリーディングフレーム)核酸の部分を増幅するように設計できる。プライマーは、目的の特定のドメインをコードする核酸の部分を増幅するようにも設計できる。ある態様において、プライマーは、５’および３’ＵＴＲの全てまたは一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコーディング領域を増幅するように設計する。ＰＣＲに有用なプライマーは、当分野で周知である合成法により産生できる。“順方向プライマー”は、増幅するＤＮＡ配列の上流であるＤＮＡ鋳型上にヌクレオチドに対して実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含むプライマーである。“上流”は、コード鎖に対して、増幅するＤＮＡ配に対する５位をいうためにここで使用する。“逆方向プライマー”は、増幅するＤＮＡ配列の下流である、二本鎖ＤＮＡ鋳型に対して実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。“下流”は、コード鎖に対して、増幅するＤＮＡ配に対する３位をいうためにここで使用する。

ＰＣＲに有用なあらゆるＤＮＡポリメラーゼをここに開示する方法で使用できる。試薬およびポリメラーゼは、多数の業者から市販されている。

安定性および／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用し得る。ＲＮＡは、好ましくは５’および３’ＵＴＲを有する。ある態様において、５’ＵＴＲは、１〜３０００ヌクレオチド長である。コーディング領域に付加する５’および３’ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの異なる領域をアニールするＰＣＲのためのプライマーの設計を含むが、これに限定されない、異なる方法により変わり得る。この試みを使用して、当業者は、転写ＲＮＡの遺伝子導入後、最適翻訳効率を達成するのに必要な５’および３’ＵＴＲ長を修飾できる。

５’および３’ＵＴＲは、目的の核酸のための天然に存在する、内在性５’および３’ＵＴＲであり得る。あるいは、目的の核酸に対して内在性ではないＵＴＲ配列を、順方向および逆方向プライマーへのＵＴＲ配列の取り込みによりまたは鋳型のいずれかの他の修飾により付加できる。目的の核酸に対して内在性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率の修飾のために有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列のＡＵリッチ要素は、ｍＲＮＡの安定性を低下させることが知られる。それゆえに、３’ＵＴＲを、当分野で周知であるＵＴＲの特性に基づき、転写されたＲＮＡの安定性を増加するように選択および設計できる。

ある態様において、５’ＵＴＲは、内在性核酸のＫｏｚａｋ配列を含み得る。あるいは、目的の核酸に対して内在性ではない５’ＵＴＲを上記のようにＰＣＲにより付加するとき、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を、５’ＵＴＲ配列の付加により再設計できる。Ｋｏｚａｋ配列は、あるＲＮＡ転写物の翻訳効率を上げることはできるが、効率的翻訳を可能とするために全ＲＮＡで必要であるようには見えない。多くのｍＲＮＡについてのＫｏｚａｋ配列に対する必要性は、当分野で知られる。他の態様において、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞で安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであり得る。他の態様において、種々のヌクレオチドアナログを、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨害するために、３’または５’ＵＴＲにおいて使用できる。

遺伝子クローニングの必要性なしにＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を可能にするために、転写のプロモーターは、転写する配列の上流のＤＮＡ鋳型に結合すべきである。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列が順方向プライマーの５’末端に結合されたとき、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のＰＣＲ産物に取り込まれる。ある好ましい態様において、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載するような、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターは、Ｔ３およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列が当分野で知られる。

好ましい態様において、ｍＲＮＡは、リボソーム結合、翻訳開始および細胞におけるｍＲＮＡの安定性を決定する、５’末端および３’ポリ(Ａ)テイルの両者にキャップを有する。環状ＤＮＡ鋳型、例えば、プラスミドＤＮＡ上で、ＲＮＡポリメラーゼは真核細胞における発現に適しない長いコンカテマー産物を産生する。３’ＵＴＲの末端で直線化されたプラスミドＤＮＡの転写は、転写後ポリアデニル化されても、真核遺伝子導入に有効ではない正常サイズのｍＲＮＡを生じる。

直鎖状ＤＮＡ鋳型で、ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼは鋳型の最後の塩基を越えて転写物の３’末端を伸長できる(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003))。

ＤＮＡ鋳型に伸びるポリＡ／Ｔの組込みの慣用法は分子クローニングである。しかしながらプラスミドＤＮＡに統合されたポリＡ／Ｔ配列は、プラスミド不安定性を生じ得て、これが、なぜ細菌細胞から得たプラスミドＤＮＡ鋳型がしばしば欠失および他の異常で高度に汚染されているかの理由である。これによりクローニング工程が骨がおれ、時間かかかるだけでなく、しばしば信頼できないものとなる。これが、クローニングを伴わないポリＡ／Ｔ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型の産生を可能にする方法が非常に望まれているかの理由である。

転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、１００ＴテイルのようなポリＴテイルを含む逆方向プライマーを使用するＰＣＲ中(配列番号３１)(サイズは５０〜５０００Ｔであり得る(配列番号３２))またはＤＮＡライゲーションまたはインビトロ組み換えを含むが、これらに限定されないいずれかの他の方法によりＰＣＲ後に産生できる。ポリ(Ａ)テイルはまたＲＮＡに安定性を提供し、その分解を減らす。一般に、ポリ(Ａ)テイルの長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正に相関する。ある態様において、ポリ(Ａ)テイルは、１００〜５０００アデノシンである(配列番号３３)。

ＲＮＡのポリ(Ａ)テイルは、大腸菌ポリＡポリメラーゼ(Ｅ−ＰＡＰ)のようなポリ(Ａ)ポリメラーゼの使用により、インビトロ転写後さらに伸長できる。ある態様において、ポリ(Ａ)テイルの１００ヌクレオチドから３００〜４００ヌクレオチドへの長さの延長(配列番号３４)は、ＲＮＡの翻訳効率の約２倍増加を生じる。さらに、３’末端への異なる化学基の付加は、ｍＲＮＡ安定性を増加させ得る。このような結合は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含み得る。例えば、ＡＴＰアナログは、ポリ(Ａ)ポリメラーゼを使用してポリ(Ａ)テイルに取り込まれ得る。ＡＴＰアナログは、ＲＮＡの安定性をさらに高め得る。

５’キャップもＲＮＡ分子に安定性を提供する。好ましい態様において、ここに開示する方法により産生されたＲＮＡは、５’キャップを含む。５’キャップは当分野で知られ、ここに記載する技術を使用して提供される(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。

ここに開示する方法により産生されたＲＮＡは配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)配列も含み得る。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存的リボソーム結合を開始し、翻訳開始を促進する、あらゆるイルス、染色体または人工設計配列であり得る。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤および界面活性剤のような細胞透過性および生存能を促進する因子を含み得る、細胞電気穿孔法に適するいずれかの溶質を包含できる。

ＲＮＡを、多数の異なる方法、例えば、商業的に利用可能な方法のいずれかを使用して、標的細胞に導入でき、これは、電気穿孔法(Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.)またはGene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator (Eppendort, Hamburg Germany)、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム介在遺伝子導入、ポリマー封入、ペプチド介在遺伝子導入または“遺伝子銃”のような微粒子銃粒子送達系(例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)参照)を含むが、これらに限定されない。

所望の分子をコードする核酸配列は、標準技術を使用する、例えば遺伝子を発現する細胞からのライブラリーのスクリーニング、それを含むことが知られるベクターからの遺伝子の導出またはそれを含む細胞および組織からの直接の単離のような、当分野で知られる組み換え方法を使用して得ることができる。あるいは、目的の遺伝子を、クローン化ではなく、合成により産生できる。

非ウイルス送達方法
ある面において、非ウイルス方法を使用して、細胞または組織または対照に、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ＮＫＲ−ＣＡＲまたはＴＣＡＲをコードする核酸を送達できる。

ある態様において、非ウイルス方法は、トランスポゾン(転位因子とも呼ばれる)の使用を含む。ある態様において、トランスポゾンは、ゲノムの位置にそれ自体挿入できるＤＮＡの断片、例えば、自己複製性であり、そのコピーをゲノムに挿入することができるＤＮＡの断片または長い核酸の外にスプライシングされ、ゲノムの他の場所に挿入されることができるＤＮＡの断片である。例えば、トランスポゾンは、転位のための逆位反復フランキング遺伝子からなるＤＮＡ配列を含む

トランスポゾンを使用する核酸送達法の例は、ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙトランスポゾン系(ＳＢＴＳ)およびｐｉｇｇｙＢａｃ(ＰＢ)トランスポゾン系を含む。例えば、Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1 (2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21 (2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9 (2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; およびDing et al. Cell. 122.3 (2005):473-83(これらは全て引用により本明細書に包含させる)を参照のこと。

ＳＢＴＳは２要素を含む：１)導入遺伝子を含むトランスポゾンおよび２)トランスポサーゼ酵素の源。トランスポサーゼは、担体プラスミド(または他のドナーＤＮＡ)から、宿主細胞染色体／ゲノムのような標的ＤＮＡにトランスポゾンを転位できる。例えば、トランスポサーゼは、担体プラスミド／ドナーＤＮＡに結合し、トランスポゾン(導入遺伝子含有)をプラスミドの外に切り出し、宿主細胞のゲノムに入れる。例えば、Aronovich et al. supra参照。

トランスポゾンの例は、ｐＴ２ベースのトランスポゾンを含む。例えば、その全てを引用により本明細書に包含させるGrabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47; およびSingh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971参照。トランスポサーゼの例は、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポサーゼ、例えば、ＳＢ１０トランスポサーゼまたはＳＢ１１トランスポサーゼを含む(例えば、サイトメガロウイルスプロモーターから発現できる、機能亢進トランスポサーゼ)。例えば、全て引用により本明細書に包含させるAronovich et al.; Kebriaei et al.; およびGrabundzija et al.参照。

ＳＢＴＳの使用は、導入遺伝子、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸の効率的組込みおよび発現を可能にする。ここに提供されるのは、例えば、ＳＢＴＳのようなトランスポゾン系を使用する、ここに記載するＣＡＲを安定に発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を産生する方法である。

ここに記載する方法によって、ある態様において、ＳＢＴＳ要素を含む１以上の核酸、例えば、プラスミドが細胞に送達される(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)。例えば、核酸は、核酸(例えば、プラスミドＤＮＡ)送達の標準法、例えば、ここに記載する方法、例えば、電気穿孔法、遺伝子導入またはリポフェクションにより送達される。ある態様において、核酸は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を含むトランスポゾンを含む。ある態様において、核酸は、導入遺伝子(例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸)を含むトランスポゾンならびにトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む。他の態様において、例えば、デュアルプラスミド系、例えば、第一プラスミドが導入遺伝子を含むトランスポゾンを含み、第二プラスミドがトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む、２核酸の系が提供される。例えば、第一および第二核酸は、宿主細胞に共送達される。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞が、ヌクレアーゼ(例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系または操作されたメガヌクレアーゼ再操作ホーミングエンドヌクレアーゼ)を使用する、ＳＢＴＳおよび遺伝子編集の遺伝子挿入の組合せを使用して産生される。

ある態様において、非ウイルス送達方法の使用は、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の再プログラミングおよび対照への細胞の直接注入を可能にする。非ウイルスベクターの利点は、患者集団に見合うために必要な十分量の産生が容易かつ比較的安価であること、保存中の安定性および免疫原性の欠如を含むが、これらに限定されない。

他の態様において、非ウイルス送達システムを使用するとき、送達媒体例は、リポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入に企図される(インビトロ、エクスビボまたはインビボ)。他の面において、核酸は、脂質と結合され得る。脂質と結合した核酸は、リポソームの水性内部への被包、リポソームの脂質二重層内への分散、リポソームとオリゴヌクレオチドの両者と結合する連結分子を介するリポソームへの結合、リポソームへの封入、リポソームとの複合体化、脂質含有溶液への分散、脂質との混合、脂質との組み合わせ、脂質中の懸濁液としての包含、ミセル内への包含または複合体化または他の方法で脂質と結合する。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター結合組成物は、溶液中の何らかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造において、ミセルとしてまたは“崩壊”構造を有して存在し得る。それらはまた単に溶液に分散され、恐らく、サイズまたは形が均一ではない凝集体を形成し得る。脂質は、天然に存在するまたは合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、例えば、脂質は、細胞質に天然に生じる脂肪滴ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドのような長鎖脂肪族炭化水素を含む化合物群およびその誘導体を含む。

細胞の供給源
増殖および遺伝的修飾または他の修飾の前に、細胞(例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の供給源を、対象から得ることができる。用語“対象”は、免疫応答が惹起できる生存生物(例えば、哺乳動物)を含むことを意図する。対象の例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそれらのトランスジェニック種を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む、多数の供給源から得ることができる。

本発明のある態様において、当分野で利用可能ないずれかの数の免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)系を使用し得る。本発明のある態様において、Ｔ細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ^ＴＭ分離のような、当業者に知られるあらゆる技術を使用して、対象から採取した血液の単位から得ることができる。ある好ましい態様において、個体の循環血液からの細胞をアフェレーシスにより得る。アフェレーシス産物は、一般にＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含む、リンパ球、赤血球および血小板を含む。ある態様において、アフェレーシスにより採取した細胞は血漿画分を除去するために洗浄し、細胞を続くプロセシング過程のために適切な緩衝液または媒体に入れる。本発明のある態様において、細胞を、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で洗浄する。別の態様において、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてよくまたは全てではないにしても多くの二価カチオンを欠いてよい。カルシウム非存在下の初期活性化過程は、活性化の増強に至る。当業者には容易に認識されるように、洗浄工程は、製造業者の指示に従う、半自動化“フロースルー”遠心分離(例えば、Cobe 2991 cell processor、Baxter CytoMateまたはHaemonetics Cell Saver 5)により達成され得る。洗浄後、細胞を、例えば、無Ｃａ、無ＭｇＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅＡまたは他の緩衝剤を含むまたは含まない食塩水溶液のような、多様な生体適合性緩衝液に再懸濁し得る。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない要素を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁し得る。

本出願の方法は、５％以下、例えば２％の、ヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を利用でき、既知培養培地条件および組成物、例えばSmith et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement” Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038／cti.2014.31に記載のものを用いることができることは認識される。

他の態様において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ^ＴＭ勾配による遠心分離または対向流遠心溶出法により単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離する。ＣＤ３^＋、ＣＤ２８^＋、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋、ＣＤ４５ＲＡ^＋およびＣＤ４５ＲＯ^＋Ｔ細胞のようなＴ細胞の特異的下位集団を、陽性または陰性選択技術によりさらに単離し得る。例えば、ある態様において、Ｔ細胞を、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な時間、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ(登録商標)Ｍ−４５０ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔのような抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８(例えば、３ｘ２８)コンジュゲートビーズとインキュベーションすることにより単離する。ある態様において、時間は約３０分である。さらなる態様において、時間は３０分〜３６時間またはそれより長い範囲およびその間のいずれかの整数値である。さらなる態様において、時間は少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間である。さらに他の好ましい態様において、時間は１０〜２４時間である。ある好ましい態様において、インキュベーション時間は２４時間である。白血病を有する患者からのＴ細胞の単離について、２４時間のような長いインキュベーション時間が細胞終了を増加させ得る。腫瘍組織または免疫不全状態個体から腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)を単離するような、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ないあらゆる状況において、Ｔ細胞を単離するために長いインキュベーション時間が使用され得る。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の捕獲効率を高め得る。それゆえに、単にＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと結合させる時間を短くするまたは長くするおよび／またはビーズ対Ｔ細胞比を増加または減少させる(さらにここに記載するとおり)ことにより、Ｔ細胞の亜集団が、培養開始時または工程中の他の時点で優先的に選択される。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体比を増加または減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団が、培養開始時または工程中の他の時点で優先的に選択される。複数回の選択も本発明で使用できることを当業者は認識する。ある態様において、選択過程を実施し、“未選択”細胞を活性化および増殖過程で使用することが望ましいことがある。“未選択”細胞もさらなる選択に付し得る。

陰性選択によるＴ細胞集団富化は、陰性に選択される細胞に独特な表面マーカーを指向する抗体の組み合わせにより達成できる。一つの方法は、陰性に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫粘着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４^＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、一般にＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含む。ある態様において、一般にＣＤ４^＋、ＣＤ２５^＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ^＋およびＦｏｘＰ３^＋を発現する制御性Ｔ細胞について富化または陽性選択することが望ましいことがある。あるいは、ある態様において、Ｔ制御性細胞を、抗Ｃ２５コンジュゲートビーズまたは他の類似選択法により枯渇させる。

ここに記載する方法は、例えば、ここに記載する、例えば、陰性選択技術を使用する、例えば、Ｔ制御性細胞枯渇集団、ＣＤ２５^＋枯渇細胞である、免疫エフェクター細胞の特異的亜集団、例えば、Ｔ細胞の選択を含み得る。好ましくは、Ｔ制御性枯渇細胞の集団は３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５^＋細胞を含む。

ある態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５^＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して集団から除去する。ある態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドを、基質、例えば、ビーズにコンジュゲートするかまたは他に基質、例えば、ビーズ上に被覆させる。ある態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントを、ここに記載の基質にコンジュゲートさせる。

ある態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５^＋Ｔ細胞を、MiltenyiＴＭからのＣＤ２５枯渇剤を使用して集団から除去する。ある態様において、細胞対ＣＤ２５枯渇剤の比は１ｅ７細胞対２０μLまたは１ｅ７細胞対１５μLまたは１ｅ７細胞対１０μLまたは１ｅ７細胞対５μLまたは１ｅ７細胞対２.５μLまたは１ｅ７細胞対１.２５μLである。ある態様において、例えば、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５^＋枯渇のために、５億細胞／mlを使用する。さらなる面において、６億、７億、８億または９億細胞／mlの細胞濃度を使用する。

ある態様において、枯渇すべき免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０^９ＣＤ２５^＋Ｔ細胞を含む。他の面において、枯渇すべき免疫エフェクター細胞の集団は、約１×１０^９〜１×１０^１０(およびその間のいずれかの整数値)ＣＤ２５^＋Ｔ細胞を含む。ある態様において、得られたＴ制御性枯渇細胞集団は、２×１０^９Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５^＋細胞またはそれ以下(例えば、１×１０^９、５×１０^８、１×１０^８、５×１０^７、１×１０^７またはそれ以下のＣＤ２５^＋細胞)を含む。

ある態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５^＋細胞を、例えば、チュービング１６２−０１のような、枯渇チュービングセットと共にＣｌｉｎｉＭＡＣ系を使用して集団から除去する。ある態様において、ＣｌｉｎｉＭＡＣ系を、例えば、ＤＥＰＬＥＴＩＯＮ２.１のような、枯渇設定において動かす。

特定の理論に縛られることを望まないが、アフェレーシス前またはＣＡＲ発現細胞産物の製造中の対象における免疫細胞の負のレギュレーターのレベルの減少(例えば、望まない免疫細胞、例えば、Ｔ_ＲＥＧ細胞の数の減少)は、対象の再発リスクを減らし得る。例えば、Ｔ_ＲＥＧ細胞を枯渇する方法は当分野で知られる。例えば、Ｔ_ＲＥＧ細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体(抗ＧＩＴＲここに記載する抗体)、ＣＤ２５枯渇およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

ある態様において、製造法は、ＣＡＲ発現細胞製造前のＴ_ＲＥＧ細胞の数の減少(例えば、枯渇)を含む。例えば、製造法は、例えば、サンプル、例えば、アフェレーシスサンプルと抗ＧＩＴＲ抗体および／または抗ＣＤ２５抗体(またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド)を接触させ、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)産物の製造前にＴ_ＲＥＧ細胞を枯渇させることを含む。

ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞採取前にＴ_ＲＥＧ細胞を減らす１以上の治療で前処置されており、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再び必要とするリスクを軽減する。ある態様において、ある態様において、Ｔ_ＲＥＧ細胞を低減する方法は、対象へのシクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせの１以上の投与を含むが、これらに限定されない。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせの１以上の投与は、ＣＡＲ発現細胞産物注入前、注入中または注入後に行い得る。

ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞の採取前にシクロホスファミドで前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再発するリスクを軽減する。ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞の採取前に抗ＧＩＴＲ抗体で前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再発するリスクを軽減する。

ある態様において、除去すべき細胞の集団は、制御性Ｔ細胞または腫瘍細胞ではなく、ＣＡＲＴ細胞の増殖および／または機能に他に負に影響する細胞、例えばＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５または潜在的免疫抑制性細胞により発現される他のマーカーを発現する細胞である。ある態様において、このような細胞は、制御性Ｔ細胞および／または腫瘍細胞と同時にまたは該枯渇後にまたは他の順序で除去することが意図される。

ここに記載する方法は、１を超える選択工程、例えば、１を超える枯渇工程を含み得る。陰性選択によるＴ細胞集団の富化は、例えば、陰性に選択される細胞に独特な表面マーカーを指向する抗体の組み合わせにより達成できる。一つの方法は、陰性に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、陰性磁気免疫付着またはフローサイトメトリーを経る細胞選別および／または選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４^＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルはＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含み得る。

ここに記載する方法は、さらに腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂを発現する細胞の集団からの除去を含み、それによりＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲの発現に適するＴ制御性枯渇、例えば、ＣＤ２５^＋枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供する。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、Ｔ制御性、例えば、ＣＤ２５^＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを同じ基質、例えば、ビーズに結合でき、これを、細胞の除去に使用できまたは抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。他の態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５^＋細胞の除去および腫瘍抗原発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれの順序で生じてもよい。

チェックポイント阻害剤、例えば、ここに記載するチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えば、ＰＤ１^＋細胞、ＬＡＧ３^＋細胞およびＴＩＭ３^＋細胞の１以上の集団からの除去を含み、それによりＴ制御性枯渇、例えば、ＣＤ２５^＋枯渇細胞およびチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えば、ＰＤ１^＋、ＬＡＧ３^＋および／またはＴＩＭ３^＋枯渇細胞の集団を提供する方法も提供される。チェックポイント阻害剤例は、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡおよびＬＡＩＲ１を含む。ある態様において、チェックポイント阻害剤発現細胞は、Ｔ制御性、例えば、ＣＤ２５^＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを同じビーズに結合でき、それを細胞の除去に使用できまたは抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。他の態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５^＋細胞の除去およびチェックポイント阻害剤発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれ順序の順序で生じてもよい。

ある態様において、Ｔ細胞ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢおよびパーフォリンまたは他の適切な分子、例えば、他のサイトカインの１以上を発現するＴ細胞集団を選択できる。細胞発現についてスクリーニングする方法は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載する方法により決定できる。

陽性または陰性選択により所望の細胞の集団を単離するために、細胞および表面(例えば、ビーズのような粒子)の濃度は変わり得る。ある態様において、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞を一緒に混合する体積を顕著に低下させる(例えば、細胞濃度を増加させる)ことが望まれ得る。例えば、ある態様において、２０億細胞／mlの濃度を使用する。ある態様において、１０億細胞／mlの濃度を使用する。さらなる態様において、１億細胞／ml超を使用する。さらなる態様において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらなる態様において、細胞の７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの濃度を使用する。さらなる態様において、１億２５００万または１億５０００万細胞／mlの濃度を使用できる。高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化および細胞増殖を増加できる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞のまたは多くの腫瘍細胞が存在するサンプル(すなわち、白血病性血液、腫瘍組織など)からのより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は、治療的価値を有しており、取得することが望ましい。例えば、高濃度細胞の使用は、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８^＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。

関連する態様において、低濃度の細胞を使用することが望ましいことがある。Ｔ細胞と表面(例えば、ビーズのような粒子)の混合物を顕著に希釈することにより、粒子と細胞の相互作用が最小化される。これは、粒子に結合する所望の抗原を高量で発現する細胞で選択する。例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度でＣＤ８^＋Ｔ細胞より効率的に捕獲される。ある態様において、使用する細胞の濃度は５×１０ｅ６／mlである。他の態様において、使用する濃度は約１×１０^５／ml〜１×１０^６／mlおよびその間のいずれかの整数値であり得る。

他の態様において、細胞を、種々の長さの時間、種々の速度で、２〜１０℃または室温でローテータでインキュベートし得る。

刺激のためのＴ細胞はまた洗浄工程後凍結させ得る。理論に縛られることを望まないが、凍結と続く解凍工程は、細胞集団から顆粒球およびある程度単球を除去することにより、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程後、細胞を凍結溶液に懸濁し得る。多くの凍結溶液およびパラメータが当分野で知られ、この状況において有用であるが、ある方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳまたは１０％Ｄｅｘｔｒａｎ４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯまたは３１.２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１.２５％デキストロース５％、０.４５％ＮａＣｌ、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯを含む培養培地または例えば、ＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅＡを含む他の適当な細胞凍結媒体を使用し、次いで細胞を１°／分の速度で−８０℃に凍結し、気相の液体窒素貯蔵タンクに保存する制御凍結の他の方法ならびに直ぐに−２０℃または液体窒素の非制御凍結も使用できる。

ある態様において、凍結保存細胞をここに記載するように解凍し、洗浄し、本発明の方法を使用する活性化の前に室温で１時間休息させる。

本発明の状況でさらに企図されるのは、血液サンプルまたはアフェレシス産物の対象からの採取を、ここに記載した拡大させた細胞が必要となる前の時点で行うことである。つまり、拡大させる細胞の源を必要なあらゆる時点で採取し、Ｔ細胞のような所望の細胞を、例えば、Ｔ細胞療法のために、そのようなＴ細胞療法から利益を得るであろう様々な疾患または状態のためにその後使用するために、単離および凍結できる。ある態様において、血液サンプルまたはアフェレシスを、一般に健常な対象から採る。ある態様において、血液サンプルまたはアフェレシスを、疾患を発症するリスクがあるが、疾患をまだ発症していない一般に健常な対象から採り、興味ある細胞をその後の使用のために単離し、凍結する。ある態様において、Ｔ細胞を増殖させ、凍結し、後に使用し得る。ある態様において、サンプルを、ここに記載する特定の疾患と診断された直ぐ後に、しかし処置前に患者から単離する。さらなる態様において、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸およびＦＫ５０６のような免疫抑制性剤、抗体または他のキャンパス、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８および照射のような他の免疫除去剤のような手段での処置を含むが、これらに限定されない、任意の数の適切な処置モダリティーの前に、対象からの血液サンプルまたはアフェレシスから単離する。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン(シクロスポリンおよびＦＫ５０６)を阻害するかまたは増殖因子誘発シグナル伝達(ラパマイシン)に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)。さらなる態様において、細胞を患者から単離し、骨髄または幹細胞移植、フルダラビンのような化学療法剤、外部ビーム放射線療法(ＸＲＴ)、シクロホスファミドまたはＯＫＴ３またはキャンパスのような抗体を使用するＴ細胞除去療法と組み合わせた(例えば、前、同時または後)その後の使用のために凍結する。ある態様において細胞を前もって単離し、その後の、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなＢ細胞除去療法後の処置のために凍結できる。

本発明のさらなる態様において、Ｔ細胞を、対象に機能的Ｔ細胞を残す処置の後、患者から直接得る。ある癌処置、特に免疫系を損傷させる薬物での処置後、処置の直後、患者が通常該処置から回復するまでの間、得られるＴ細胞の品質がエクスビボで増殖する能力について最適であるまたは改善されていることが観察されている。同様に、ここに記載する方法を使用するエクスビボ操作後、これらの細胞は、生着およびインビボ増殖について好ましい状態であり得る。それゆえに、本発明の状況において、Ｔ細胞、樹状細胞または造血細胞系譜の他の細胞を含む血液細胞をこの回復期に採取することが企図される。さらに、ある態様において、可動化(例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの可動化)およびコンディショニングレジメンを使用して、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生および／または増殖に好都合である条件を、特に、治療後の定められた時間枠中に、対象に形成できる。細胞型の例には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞および免疫系の他の細胞を含む。

ある態様において、免疫エフェクターＣＡＲ分子を発現する細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子は、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を受けた対象から得る。ある態様において、ＣＡＲを発現するように操作される免疫エフェクター細胞の集団、例えば、Ｔ細胞を、対象または対象から採取したＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が少なくとも一過性に増加するように、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投薬から十分な時間後または十分な用量の後に、採取する。

他の態様において、ＣＡＲを発現するように操作されているまたは操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の数を増やすまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比を増やす量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、エクスビボで処理できる。

ある態様において、Ｔ細胞集団は、ジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫＲＮＡまたはタンパク質を発現しないかまたはＤＧＫ活性が低下したまたは阻害された細胞である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ発現を低減または阻止するための遺伝的方法、例えば、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。あるいは、ＤＧＫ欠損細胞は、ここに記載するＤＧＫ阻害剤での処置により産生できる。

ある態様において、Ｔ細胞集団は、イカロス欠損である。イカロス欠損細胞は、イカロスＲＮＡまたはタンパク質を発現しないかまたはイカロス活性が低下したまたは阻害された細胞を含み、イカロス欠損細胞は、イカロス発現を低減または阻止するための遺伝的方法、例えば、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。あるいは、イカロス欠損細胞は、イカロス阻害剤、例えば、レナリドマイドでの処置により産生できる。

ある態様において、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫ欠損およびイカロス欠損であり、例えば、ＤＧＫおよびイカロスを発現せずまたはＤＧＫおよびイカロス活性が低下または阻害されている。このようなＤＧＫおよびイカロス欠損細胞は、ここに記載する方法のいずれかにより産生できる。

ある態様において、ＮＫ細胞を対象から得る。他の態様において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えば、ＮＫ−９２細胞株(Conkwest)である。

同種ＣＡＲ免疫エフェクター細胞
ここに記載するある態様において、免疫エフェクター細胞は、同種免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。例えば、細胞は、同種Ｔ細胞、例えば、機能的Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)および／またはヒト白血球抗原(ＨＬＡ)、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIの発現を欠く同種Ｔ細胞である。

機能的ＴＣＲを欠くＴ細胞は、例えば、その表面に何ら機能的ＴＣＲを発現しないように操作され、機能的ＴＣＲを含む１以上のサブユニットを発現しないように操作され(例えば、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、ＴＣＲイプシロンおよび／またはＴＣＲゼータの発現がない(または発現の減少を示す)ように操作される)またはその表面に微少の機能的ＴＣＲを産生するように操作され得る。あるいは、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１以上の変異したまたは切断型の発現により、実質的に障害されたＴＣＲを発現する。用語“実質的に障害されたＴＣＲ”は、このＴＣＲが、宿主で有害な免疫反応を惹起しないことを意味する。

ここに記載するＴ細胞は、例えば、その表面に機能的ＨＬＡを発現しないように操作され得る。例えば、ここに記載するＴ細胞は、細胞表面発現ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラス１および／またはＨＬＡクラスIIが下方制御されるように操作され得る。ある面において、ＨＬＡの下方制御は、ベータ−２ミクログロブリン(Ｂ２Ｍ)の発現の減少または排除を伴い得る。

ある態様において、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲおよび機能的ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIを欠き得る。

機能的ＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を欠く修飾Ｔ細胞は、ＴＣＲまたはＨＬＡの１以上のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンを含む、いずれかの適当な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列(ＣＲＩＳＰＲ)転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡのノックダウンを含み得る。

ある態様において、同種細胞は、例えば、ここに記載する方法で、阻害性分子を発現しないまたは低レベルで発現する細胞である。例えば、細胞は、例えば、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下できる、阻害分子を発現しないまたは阻害分子を低レベルで発現する細胞であり得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータを含む。ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による、阻害分子の阻害はＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。ある態様において、例えば、ここに記載する、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用できる。

ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
ある態様において、ＴＣＲ発現および／またはＨＬＡ発現を、細胞におけるＴＣＲおよび／またはＨＬＡおよび／またはここに記載する阻害分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)をコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用して、阻害できる。

Ｔ細胞におけるｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの発現は、例えば、レンチウイルス発現系のような、いずれかの慣用の発現系を使用して達成できる。

ＴＣＲの要素の発現を下方制御する代表的ｓｈＲＮＡは、例えば、米国公開２０１２／０３２１６６７号に開示されている。ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスII遺伝子の発現を下方制御する代表的ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、例えば、米国公開ＵＳ２００７／００３６７７３号に開示されている。

ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ
ここで使用する“ＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ”は、一連の群生性等間隔短回文反復配列またはこのような一連の反復を含む系をいう。ここで使用する“Ｃａｓ”は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をいう。“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ”系は、ＴＣＲおよび／またはＨＬ遺伝子および／またはここに記載する阻害分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)の発現抑制または変異に使用できる、ＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓ由来の系をいう。

天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、配列決定された真正細菌ゲノムの約４０％および配列決定された古細菌の９０％に見られる。Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172。この系は、プラスミドおよびファージのような外来遺伝的要素に対する抵抗性を付与する１種の原核生物免疫系であり、後天性免疫の形態を提供する。Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、マウスまたは霊長類のような真核生物における遺伝子エディティング(特定の遺伝子のサイレンシング、増強または変更)に使用するために修飾されている。Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8。これは、真核細胞に、特別に設計したＣＲＩＳＰＲおよび１以上の適切なＣａｓを含むプラスミドを導入することにより達成される。

ＣＲＩＳＰＲ座位と呼ばれることもあるＣＲＩＳＰＲ配列は、交互の反復およびスペーサーを含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲにおいて、スペーサーは、通常細菌に対して外来であるプラスミドまたはファージ配列のような配列を含み、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において、スペーサーはＴＣＲまたはＨＬＡ遺伝子配列に由来する。

ＣＲＩＳＰＲ座位からのＲＮＡは構成的に発現され、Ｃａｓタンパク質により小ＲＮＡに加工される。これらは、反復配列が隣接したスペーサーを含む。ＲＮＡは、他のＣａｓタンパク質を、ＲＮＡまたはＤＮＡレベルで外来性遺伝的要素に対して発現抑制するように導く。Horvath et al. (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7。スペーサーは、それゆえに、ｓｉＲＮＡに類似して、ＲＮＡ分子の鋳型として働く。Pennisi (2013) Science 341: 833-836。

多くの異なるタイプの細菌で自然に生じるように、ＣＲＩＳＰＲの正確な配置および構造、Ｃａｓ遺伝子の機能および数およびそれらの産物は種毎にいくぶん異なる。Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663; and Stern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340。例えば、Ｃｓｅ(Ｃａｓサブタイプ、大腸菌)タンパク質(例えば、ＣａｓＡ)は、機能的複合体、カスケードを形成し、これは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ転写物を、カスケードが保持するスペーサー−反復単位に加工する。Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964。他の原核生物において、Ｃａｓ６は、ＣＲＩＳＰＲ転写物を加工する。大腸菌におけるＣＲＩＳＰＲベースのファージ不活性化はカスケードおよびＣａｓ３を必要とするが、Ｃａｓ１またはＣａｓ２を必要としない。パイロコッカス・フリオサスおよび他の原核生物におけるＣｍｒ(ＣａｓＲＡＭＰモジュール)タンパク質は、小ＣＲＩＳＰＲＲＮＡと機能的複合体を形成し、これは相補的標的ＲＮＡを認識し、開裂する。より単純なＣＲＩＳＰＲ系は、二重らせんの各鎖のための２活性切断部位を有するヌクレアーゼであるタンパク質Ｃａｓ９を頼る。Ｃａｓ９と修飾ＣＲＩＳＰＲ座位ＲＮＡの組み合わせを、遺伝子エディティングのための系に使用できる。Pennisi (2013) Science 341: 833-836。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子を編集でき(塩基対の付加または欠失)または未成熟終止を導入でき、これは、そうしてＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を減少させる。あるいはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を、ＲＮＡ干渉のように使用し、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子を可逆性形式でオフにできる。哺乳動物細胞において、例えば、ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質をＴＣＲおよび／またはＨＬＡプロモーターに導くことができ、ＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断する。

当分野で知られるテクノロジー、例えば、米国公開２０１４００６８７９７号およびCong (2013) Science 339: 819-823に記載のものを使用して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を産生できる。例えば、Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576、米国特許８,８７１,４４５号；８,８６５,４０６号；８,７９５,９６５号；８,７７１,９４５号；および８,６９７,３５９号に記載されるもののような、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する当分野で知られる他の人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系も産生できる。

ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＴＡＬＥＮ
“ＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するためのＴＡＬＥＮ”は、ＨＬＡおよび／またはＴＣＲ遺伝子および／またはここに記載する阻害分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼをいう。

ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ開裂ドメインを融合することにより人工的に産生される。転写アクティベーター様効果(ＴＡＬＥ)は、ＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子の部分を含む、いずれかの所望のＤＮＡ配列に結合するように操作できる。操作されたＴＡＬＥとＤＮＡ開裂ドメインを合わせることにより、ＨＬＡまたはＴＣＲ配列を含む、いずれかの所望のＤＮＡ配列に特異的な、制限酵素を産生できる。次いで、これらを細胞に導入でき、そこで、それらはゲノムエディティングのために使用され得る。Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6;およびBoch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501。

ＴＡＬＥは、ザントモナス細菌により分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、１２番目および１３番目のアミノ酸以外、反復した、高度に保存的３３〜３４アミノ酸配列を含む。これらの２箇所は高度に可変であり、特定のヌクレオチド認識と強い相関を示す。それらは、それゆえに、所望のＤＮＡ配列と結合するように操作され得る。

ＴＡＬＥＮを産生するために、ＴＡＬＥタンパク質を、野生型または変異ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼであるヌクレアーゼ(Ｎ)と融合する。ＴＡＬＥＮにおいて使用するために、ＦｏｋＩについていくつかの変異が行われており、これらは、例えば、開裂特異性または活性の改善を含む。Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793;およびGuo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96。

ＦｏｋＩドメインは、二量体として機能し、適切な配向および間隔を有する標的ゲノムにおける部位のための独特なＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする。ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ開裂ドメインの間のアミノ酸残基数および２の個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基数の両者が、高レベルの活性を達成するために重要なパラメータであると考えられる。Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8。

ＨＬＡまたはＴＣＲＴＡＬＥＮを細胞内で使用して、二重鎖切断(ＤＳＢ)を産生できる。変異は、修復機構が切断を非相同末端結合により不適切に修復するならば、切断部位に導入できる。例えば、不適切な修復は、フレームシフト変異を導入し得る。あるいは、外来ＤＮＡを、ＴＡＬＥＮと共に細胞に導入でき、外来ＤＮＡの配列および染色体配列により、この方法はＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子における欠損の補正またはｗｔＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子におけるこのような欠損の導入に使用でき、そうして、ＨＬＡまたはＴＣＲの発現を減少させる。

ＨＬＡまたはＴＣＲにおける配列に特異的なＴＡＬＥＮは、モジュラー要素を使用する多様なスキームを含む、当分野で知られるいずれかの方法を使用して構築できる。Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509。

ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
“ＺＦＮ”または“亜鉛フィンガーヌクレアーゼ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＺＦＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するためのＺＦＮ”は、ＨＬＡおよび／またはＴＣＲ遺伝子および／またはここに記載する阻害分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである、亜鉛フィンガーヌクレアーゼをいう。

ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合したＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン(またはその誘導体)を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、１以上の亜鉛フィンガーを含む。Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782;およびKim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160。

亜鉛フィンガーは、１以上の亜鉛イオンにより安定化される小タンパク質構造モチーフである。亜鉛フィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を含むことができ、約３bp配列を認識できる。既知特異性の多様な亜鉛フィンガーを合わせて、約６bp、９bp、１２bp、１５bpまたは１８bp配列を認識する多フィンガーポリペプチドを産生できる。ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッド系、細菌ワンハイブリッドおよびツーハイブリッド系および哺乳動物細胞を含む、特異的配列を認識する亜鉛フィンガー(およびそれらの組み合わせ)を産生するための多様な選択およびモジュラーアセンブリー技術が利用可能である。

ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡを開裂するために二量体化しなければならない。それゆえに、ＺＦＮの対が、非パリンドロームＤＮＡ部位を標的とすることが必要である。２つのそれぞれのＺＦＮは、そのヌクレアーゼが適切に離れて、ＤＮＡの逆の鎖に結合しなければならない。Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5。

またＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡに二重鎖切断を創製でき、これは、不適切に修復されたならばフレームシフト変異を創製でき、細胞におけるＨＬＡおよび／またはＴＣＲの発現および量の減少に至る。ＺＦＮはまた、ＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子における変異のために相同組換えと使用もできる。

ＨＬＡおよび／またはＴＣＲにおける配列に特異的なＺＦＮは、当分野で知られるいずれかの方法を使用して構築できる。Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7; Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96；米国特許公開２０１１／０１５８９５７号；および米国特許公開２０１２／００６０２３０号。

テロメラーゼ発現
何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、ある態様において、治療的Ｔ細胞は、Ｔ細胞における短縮されたテロメアのために、患者における残留性が短く、したがって、テロメラーゼ遺伝子を用いる遺伝子導入は、Ｔ細胞のテロメアを延長し、患者におけるＴ細胞の残留性を改善し得る。Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)参照。それゆえに、ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、異所性にテロメラーゼサブユニットを、例えば、テロメラーゼの触媒的サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴ発現する。ある面において、本開示は、細胞とテロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒的サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を接触させることを含む、ＣＡＲ発現細胞を産生する方法を提供する。細胞を、ＣＡＲをコードする構築物と接触させる前に、同時にまたは後に核酸と接触させ得る。

ある面において、本開示は、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を製造する方法に関する。ある態様において、本方法は、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を提供し、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸を接触させ、そして、免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を、ＣＡＲおよびテロメラーゼ発現を可能とする条件下に接触させることを含む。

ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はＤＮＡである。ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、テロメラーゼサブユニットの発現を駆動できるプロモーターを含む。

ある態様において、ｈＴＥＲＴは、GenBank Protein ID AAC51724.1のアミノ酸配列を有し(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)、次のとおりである。
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD(配列番号６１)

ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１５７の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有する。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１５７の配列を有する。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端または両方に欠失(例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない)を含む。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端または両方にトランスジェニックアミノ酸配列(例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない)を含む。

ある態様において、ｈＴＥＲＴは、GenBank Accession No. AF018167の核酸配列によりコードされる(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)。
1 caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc
61 cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc
121 tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg
181 gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg
241 cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg
301 cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg
361 cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct
421 acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc
481 gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg
541 tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca
601 ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg
661 cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga
721 ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg
781 ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga
841 cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag
901 ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc
961 agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc
1021 ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc
1081 ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg
1141 agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc
1201 tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc
1261 agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag
1321 cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg
1381 acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt
1441 acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc
1501 acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca
1561 agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca
1621 ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg
1681 ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt
1741 atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga
1801 gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt
1861 cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc
1921 gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag
1981 ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt
2041 tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg
2101 gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc
2161 cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc
2221 aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc
2281 gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc
2341 acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg
2401 agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca
2461 gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg
2521 gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct
2581 gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc
2641 tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa
2701 ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga
2761 agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga
2821 tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg
2881 tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc
2941 gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt
3001 gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct
3061 acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc
3121 atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc
3181 tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg
3241 ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc
3301 tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc
3361 agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg
3421 cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg
3481 agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc
3541 ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct
3601 gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc
3661 tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc
3721 agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc
3781 cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc
3841 caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt
3901 gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg
3961 ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa
4021 aaaaaaa(配列番号６２)

ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１５８の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する核酸によりコードされる。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１５８の核酸によりコードされる。

細胞の活性化および増殖
細胞は、例えば、米国特許６,３５２,６９４号；６,５３４,０５５号；６,９０５,６８０号；６,６９２,９６４号；５,８５８,３５８号；６,８８７,４６６号；６,９０５,６８１号；７,１４４,５７５号；７,０６７,３１８号；７,１７２,８６９号；７,２３２,５６６号；７,１７５,８４３号；５,８８３,２２３号；６,９０５,８７４号；６,７９７,５１４号；６,８６７,０４１号；および米国特許出願公開２００６０１２１００５号に記載する方法を使用して、一般的に活性化および増殖できる。

一般に、本発明のＴ細胞を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体結合シグナルを刺激する薬剤が結合したその表面とＴ細胞の表面上の共刺激性分子を刺激するリガンドを接触させることにより増殖させる。特に、Ｔ細胞集団は、表面上に固定された抗ＣＤ３抗体または抗原結合そのフラグメントまたは抗ＣＤ２抗体との接触またはカルシウムイオノフォアと組み合わせたタンパク質キナーゼＣアクティベーター(例えば、ブリオスタチン)との接触により、ここに記載するように刺激し得る。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子と結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖刺激に適する条件下、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用できる。抗ＣＤ２８抗体の例は９.３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８を含み(Diaclone, Besancon, France)、当分野で一般に知られる他の方法のように使用できる(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。

ある態様において、Ｔ細胞のための一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコールにより提供し得る。例えば、例えば、各シグナルを提供する薬剤は溶液中でも、表面と結合していてよい。表面に結合しているとき、薬剤は同じ表面(すなわち、“ｃｉｓ”形態)または別の表面(すなわち、“ｔｒａｎｓ”形態)に結合し得る。あるいは、あるいは、一方の薬剤が表面に結合し、他方のが溶液にあってよい。ある態様において、共刺激シグナルを提供する薬剤は細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤は溶液中であるかまたは表面と結合する。ある態様において、両剤は溶液中にあり得る。ある態様において、薬剤は不溶性形態であり、Ｆｃ受容体または抗体または薬剤と結合する他の結合剤を発現する細胞のような表面に架橋され得る。この点に関して、例えば、本発明におけるＴ細胞の活性化および増殖のために意図される人工抗原提示細胞(ａＡＰＣ)について、米国特許出願公開２００４０１０１５１９号および２００６００３４８１０号を参照のこと。

ある態様において、２剤は、ビーズに、同じビーズ、すなわち、“ｃｉｓ”または別のビーズ、すなわち、“ｔｒａｎｓ”で固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は抗ＣＤ３抗体または抗原結合そのフラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は抗ＣＤ２８抗体または抗原結合そのフラグメントであり、両剤が、等価な分子量で同じビーズに共固定化される。ある態様において、ＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖およびＴ細胞増殖のためのビーズに結合した１：１比の各抗体を使用する。本発明のある態様において、１：１比を使用して観察された増殖と比較して、Ｔ細胞増殖の増殖が観察されるように、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比を使用する。ある特定の態様において、１：１比を使用して観察された増殖と比較して、約１〜約３倍増加が観察される。ある態様において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体比は１００：１〜１：１００およびその間の全ての整数値の範囲である。本発明のある態様において、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合している、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８比が１未満である。本発明のある態様において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体比は２：１より大きい。ある特定の態様において、ビーズに結合した１：１００ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある態様において、ビーズに結合した１：７５ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。さらなる態様において、ビーズに結合した１：５０ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある態様において、ビーズに結合した１：３０ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある好ましい態様において、ビーズに結合した１：１０ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある態様において、ビーズに結合した１：３ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。さらなる態様において、ビーズに結合した３：１ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。

１：５００〜５００：１およびその間のいずれかの整数値の粒子対細胞比を、Ｔ細胞または他の標的細胞の刺激のために使用し得る。当業者には容易に認識され得るように、粒子対細胞比は、標的細胞に対する粒子径による。例えば、小さいサイズのビーズは少ない細胞しか結合できず、大きなビーズはたくさん結合できる。ある態様において、細胞対粒子比は、１：１００〜１００：１およびその間のいずれかの整数値の範囲であり、さらなる態様において１：９〜９：１およびその間のいずれかの整数値からなる比をＴ細胞刺激に使用し得る。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合粒子対Ｔ細胞の比は、上記のように変わりうるが、しかしながらある好ましい値は１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１および１５：１を含み、一つの好ましい比は少なくとも１：１粒子対Ｔ細胞である。ある態様において、１：１以下の粒子対細胞比を使用する。ある特定の態様において、好ましい粒子：細胞比は１：５である。さらなる態様において、粒子対細胞比は、刺激の日により変わり得る。例えば、ある態様において、粒子対細胞比は、１日目は１：１〜１０：１であり、さらなる粒子をその後１０日目まで連日または隔日で細胞に添加し、最終比１：１〜１：１０である(添加の比の細胞数に基づく)。ある特定の態様において、粒子対細胞比は刺激１日目に１：１であり、刺激３日目および５日目に１：５に調節する。ある態様において、粒子を、１日目の１：１および刺激３日目および５日目の１：５の最終比に基づき、連日または隔日で添加する。ある態様において、粒子対細胞比は、刺激１日目は２：１であり、刺激３日目および５日目に１：１０に調節する。ある態様において、粒子を、１日目の１：１および３日目および５日目の１：１０の最終比に基づき、連日または隔日で添加する。当業者は、多様な他の比が本発明における使用に適し得ることを認識する。特に、比は、粒子径ならびに細胞サイズおよびタイプによる。ある態様において、使用するための最も典型的な比は、１日目の１：１、２：１および３：１付近である。

本発明のさらなる態様において、Ｔ細胞のような細胞を、薬剤被覆ビーズと組み合わせ、ビーズおよび細胞をその後分離し、次いで細胞を培養する。異なる態様において、培養前に、薬剤被覆ビーズおよび細胞を分離するが、一緒に培養する。さらなる態様において、ビーズおよび細胞を、磁気力のような力の適用によりまず濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより細胞刺激を誘導する。

例として、細胞表面タンパク質を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合した常磁性ビーズ(３ｘ２８ビーズ)とＴ細胞を接触させることにより、ライゲートし得る。ある態様において、細胞(例えば、１０^４〜１０^９Ｔ細胞)およびビーズ(例えば、ＤＹＮＡビーズＳ(登録商標)Ｍ−４５０ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ常磁性ビーズを１：１比)を、緩衝液、例えばＰＢＳ(カルシウムおよびマグネシウムのような二価カチオン不含)中で合わせる。再び、いずれかの細胞濃度を使用し得ることは当業者には容易に認識され得る。例えば、標的細胞は、サンプル中に極めて稀であり、サンプルの０.０１％しか含まれないかまたはサンプル全体(すなわち、１００％)が目的の標的細胞で構成され得る。したがって、あらゆる細胞数が本発明の状況と一体となる。ある態様において、細胞と粒子の最大接触を確実にするために、粒子および細胞を混合する体積を顕著に減少させる(すなわち、細胞の濃度を高める)ことが望ましいことがある。例えば、ある態様において、約２０億細胞／mlの濃度を使用する。他の態様において、１０億細胞／ml超を使用する。さらなる態様において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらなる態様において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらなる態様において、１億２５００万または１億５０００万細胞／mlの濃度を使用できる。高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化および細胞増殖を増加できる。さらに、高細胞濃度の使用はＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞の集団は、治療的価値を有し得て、得ることが望まれる。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８^＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする

ある態様において、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸が形質導入された細胞を、例えば、ここに記載する方法により増殖する。ある態様において、細胞を、数時間(例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間)〜約１４日(例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日または１４日)の期間の培養により増殖する。ある態様において、細胞は、４〜９日の期間増殖される。ある態様において、細胞は、８日以下、例えば、７日、６日または５日の期間増殖される。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲ細胞は、５日の培養により増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件で、９日間培養で増殖された同じ細胞よりも強力である。効力は、例えば、多様なＴ細胞機能、例えば増殖、標的細胞死、サイトカイン産生、活性化、遊走またはそれらの組み合わせにより規定され得る。ある態様において、５日増殖された細胞、例えば、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下に９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍または４倍増加を示す。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲを発現する細胞は、５日の培養により増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件下に９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを示す。ある態様において、５日増殖された細胞、例えば、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下に９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルのpg／mlで、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上増加する。

本発明のある態様において、混合物を、数時間(約３時間)〜約１４日またはその間のいずれかの時間的整数値、培養してよい。ある態様において、混合物を２１日培養し得る。本発明のある態様において、ビーズおよびＴ細胞を一緒に約８日培養する。ある態様において、ビーズおよびＴ細胞を一緒に２〜３日培養する。Ｔ細胞の培養期間が６０日以上となるような、数サイクルの刺激も望まれ得る。Ｔ細胞培養に適する条件は、血清(例えば、胎児ウシまたはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは当業者に知られる細胞増殖のためのいずれかの他の添加剤を含む、増殖および生存能に必要な因子を含み得る、適切な培地(例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ１５(Lonza))を含む。細胞の増殖のための他の添加剤は、界面活性剤、プラスマネートおよびＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールのような還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、無血清または適切な量の血清(または血漿)が添加されたまたは規定されたセットのホルモンおよび／またはＴ細胞の増殖および拡大に十分な量のサイトカインが添加されたＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５およびＸ−Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは実験的培養においてのみ包含され、対象に注入すべき細胞の培養には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度(例えば、３７℃)および雰囲気(例えば、空気＋５％ＣＯ_２)で維持される。

ある態様において、細胞は、例えば、フローサイトメトリーのようなここに記載する方法により測定して、１４日の増殖期間にわたり、細胞の少なくとも２００倍(例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍)増加をもたらす１以上のインターロイキンを含む、適切な培地(例えば、ここに記載する培地)で増殖させる。ある態様において、細胞は、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７(例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７)の存在下増殖させる。

ある態様において、ここに記載する方法、例えば、ＣＡＲ発現細胞製造法は、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５^＋Ｔ細胞を、例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して、細胞集団から除去することを含む。細胞集団からＴ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５^＋Ｔ細胞を除去する方法は、ここに記載される。ある態様において、方法、例えば、製造法は、さらに細胞集団(例えば、ＣＤ２５^＋Ｔ細胞のようなＴ制御性細胞が枯渇されている細胞集団；または抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと前に接触された細胞集団)とＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の接触を含む。例えば、細胞集団(例えば、抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと先に接触されている)を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の存在下で増殖させる。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、インターロイキン−１５(ＩＬ−１５)ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体アルファ(ＩＬ−１５Ｒａ)ポリペプチドまたはＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの組み合わせ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで接触させることを含む。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両者の組合せを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両者を含む組成物と接触させる。ある態様において、接触は、リンパ球亜集団、例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の生存および増殖をもたらす。

種々の刺激時間に曝されているＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスした末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団(ＴＣ、ＣＤ８^＋)より大きいヘルパーＴ細胞集団(ＴＨ、ＣＤ４^＋)を有する。ＣＤ３およびＣＤ２８受容体での刺激によるＴ細胞のエクスビボ増殖は、約８〜９日目前まで主にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を産生するが、約８〜９日目後、Ｔ細胞の集団は、徐々に大きくなるＴＣ細胞の集団を含む。したがって、処置の目的によって、対象に、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を注入することは有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されているならば、このサブセットを大きな程度まで増殖させることが有利であり得る。

さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞増殖過程の経過中に、顕著に、しかし大部分、再現性よく変化する。そうして、このような再現性は、特定の目的のために活性化Ｔ細胞産物をあつらえる能力を可能とする。

ここに開示する方法の代わりにまたはこれと組み合わせて、ＣＡＲリガンドの使用を含む、ＣＡＲ発現細胞(例えば、インビトロまたはインビボ(例えば、臨床モニタリング))、免疫細胞増殖および／または活性化および／またはＣＡＲ特異的選択の１以上の検出および／または定量のための方法および組成物が開示される。一つの例示的態様において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ分子に結合する、例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインに結合する抗体である(例えば、抗原結合ドメインに結合する抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体；または細胞外結合ドメインの定常領域に結合する抗体)。他の態様において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ抗原分子である(例えば、ここに記載のような)。

ある面において、ＣＡＲ発現細胞を検出および／または定量する方法が開示される。例えば、ＣＡＲリガンドは、インビトロまたはインビボでＣＡＲ発現細胞の検出および／または定量に使用できる(例えば、患者におけるＣＡＲ発現細胞の臨床モニタリングまたは患者への投薬)。方法は、
ＣＡＲリガンド(場合により、標識ＣＡＲリガンド、例えば、タグ、ビーズ、放射活性または蛍光標識を含むＣＡＲリガンド)を提供し；
ＣＡＲ発現細胞を獲得し(例えば、製造サンプルまたは臨床サンプルのようなＣＡＲ発現細胞含有サンプルの獲得)；
ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンドを、結合が生じる条件下で接触させ、それにより、存在するＣＡＲ発現細胞のレベル(例えば、量)を検出することを含む。ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンドの結合は、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡなどのような標準技術を使用して検出できる。

他の面において、増殖および／または活性化細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)を増殖する方法が開示される。方法は、
ＣＡＲ発現細胞(例えば、第一ＣＡＲ発現細胞または一過性に発現されるＣＡＲ細胞)を提供し)；
該ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンド、例えば、ここに記載するようなＣＡＲリガンドを、免疫細胞拡張および／または増殖が生じる条件下で接触させ、それにより、活性化および／または増殖集団を産生することを含む。

ある態様において、ＣＡＲリガンドは存在する(例えば、基質、例えば、天然に存在しない基質に固定化または結合される)。ある態様において、基質は、非細胞基質である。非細胞基質は、例えば、プレート(例えば、マイクロタイタープレート)、膜(例えば、ニトロセルロース膜)、マトリックス、チップまたはビーズから選択される固体支持体であり得る。ある態様において、ＣＡＲリガンドは、基質に存在する(例えば、基質表面上)。ＣＡＲリガンドを、基質に共有非共有(例えば、架橋)により固定、結合または会合させ得る。ある態様において、ＣＡＲリガンドは、ビーズに結合(例えば、共有結合)する。前記態様において、免疫細胞集団をインビトロまたはエクスビボで増殖できる。方法は、さらに、例えば、ここに記載する方法のいずれかを使用して、ＣＡＲ分子のリガンド存在下、免疫細胞の集団を培養することをさらに含む。

他の態様において、細胞を増殖および／または活性化する方法は、さらに第二刺激性分子、例えば、ＣＤ２８の添加を含む。例えば、ＣＡＲリガンドおよび第二刺激性分子を基質、例えば、１以上のビーズに固定し、それにより細胞増殖および／または活性化を増加させ得る。

さらに他の面において、ＣＡＲ発現細胞を選択または富化する方法を提供する。方法は、ＣＡＲ発現細胞とここに記載のようなＣＡＲリガンドを接触させ、ＣＡＲリガンドの結合に基づき細胞を選択することを含む。

さらに他の態様において、ＣＡＲ発現細胞を枯渇、減少および／または死滅する方法が提供される。方法は、ＣＡＲ発現細胞とここに記載するようなＣＡＲリガンドを接触させ；そして細胞を、ＣＡＲリガンドの結合に基づきターゲティングし、それによりＣＡＲ発現細胞の数を減らすおよび／または殺すことを含む。ある態様において、ＣＡＲリガンドは、毒性剤と結合する(例えば、トキシンまたは細胞除去剤)。他の態様において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えば、ＡＤＣＣまたはＡＤＣ活性を生じ得る。

ここに開示する方法において使用できる抗ＣＡＲ抗体の例は、例えば、ＷＯ２０１４／１９０２７３号およびJena et al., “Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials”, PLOS March 2013 8:3 e57838に記載され、その内容を引用により本明細書に包含させる。ある態様において、抗イディオタイプ抗体分子は、抗ＣＤ１９抗体分子、例えば、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖを認識する。例えば、抗イディオタイプ抗体分子は、Jena et al., PLOS March 2013 8:3 e57838に記載のＣＤ１９特異的ＣＡＲｍＡｂクローン番号１３６.２０.１と結合について競合でき；ＣＤ１９特異的ＣＡＲｍＡｂクローン番号１３６.２０.１と同じＣＤＲ(例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義またはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ定義の組合せを使用して１以上の、例えば、全ての、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＣＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３)を有し得て；ＣＤ１９特異的ＣＡＲｍＡｂクローン番号１３６.２０.１のような１以上の(例えば、２)可変領域を有し得るかまたはＣＤ１９特異的ＣＡＲｍＡｂクローン番号１３６.２０.１を含み得る。ある態様において、抗イディオタイプ抗体は、Jena et al.に記載の方法により製造した。他の態様において、抗イディオタイプ抗体分子は、ＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載の抗イディオタイプ抗体分子である。ある態様において、抗イディオタイプ抗体分子は、１３６.２０.１のようなＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載の抗体分子と同じＣＤＲ(例えば、１以上の、例えば、全ての、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＣＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３)を有し；ＷＯ２０１４／１９０２７３号の抗体分子の１以上の(例えば、２)可変領域を有してよくまたは１３６.２０.１のようなＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載の抗体分子を含み得る。他の態様において、抗ＣＡＲ抗体は、例えば、ＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載のようなＣＡＲ分子の細胞外結合ドメインの定常領域に結合する。ある態様において、抗ＣＡＲ抗体は、ＣＡＲ分子の細胞外結合ドメインの定常領域、例えば、重鎖定常領域(例えば、ＣＨ_２−ＣＨ３ヒンジ領域)または軽鎖定常領域に結合する。例えば、ある態様において、抗ＣＡＲ抗体は、ＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載の２Ｄ３モノクローナル抗体と結合について競合し、２Ｄ３と同じＣＤＲ(例えば、１以上の、例えば、全ての、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＣＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３)を有しまたは２Ｄ３の１以上の(例えば、２)可変領域を有しまたはＷＯ２０１４／１９０２７３に記載のような２Ｄ３を含む。

ある面および態様において、ここでの組成物および方法は、例えば、その全体を引用により本明細書に包含させる、２０１４年７月３１日出願の米国特許出願号に記載のような、Ｔ細胞の特定のサブセットのために最適化される。ある態様において、Ｔ細胞の最適化サブセットは、対照Ｔ細胞、例えば、同じ構築物を発現する異なるタイプ(例えば、ＣＤ８^＋またはＣＤ４^＋)のＴ細胞と比較して、残留性の増強を示す。

ある態様において、ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ここに記載するＣＡＲを含み、当該ＣＡＲは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞に適する(例えば、最適化、例えば、残留性の増強に至る)細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＩＣＯＳドメインを含む。ある態様において、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ここに記載するＣＡＲを含み、当該ＣＡＲは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞に適する(例えば、最適化、例えば、残留性の増強に至る)細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメインまたはＩＣＯＳドメイン以外の共刺激ドメインを含む。ある態様において、ここに記載するＣＡＲは、ここに記載する抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する腫瘍抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを含む。

ある面において、ここに記載するのは、対象を処置する方法、例えば、癌を有する対象を処置する方法である。方法は、該対象に、有効量の次のものを投与することを含む：
１)
抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；および
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、第一共刺激性ドメイン、例えば、ＩＣＯＳドメイン
を含むＣＡＲ(ＣＡＲ^ＣＤ４＋)を含むＣＤ４^＋Ｔ細胞；および
２)
抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；および
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、第二共刺激性ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメインまたはＩＣＯＳドメイン以外の他の共刺激性ドメイン
を含むＣＡＲ(ＣＡＲ^ＣＤ８＋)を含むＣＤ８^＋Ｔ細胞；
ここで、ＣＡＲ^ＣＤ４＋とＣＡＲ^ＣＤ８＋は互いに異なる。

所望により、方法は、さらに、次のものを投与することを含む：
３)
抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；および
細胞内シグナル伝達ドメイン
を含むＣＡＲ(第二ＣＡＲ^ＣＤ８＋)を含む、第二ＣＤ８^＋Ｔ細胞
ここで、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激性シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲ^ＣＤ８＋は、ＣＡＲ^ＣＤ８＋に提示されず、所望により、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメインを含まない。

ＣＡＲ活性のアッセイ
ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲが構築されたら、適切なインビトロおよび動物モデルにおける抗原刺激後にＴ細胞を増殖させる能力、再刺激の非存在下でのＴ細胞増殖の持続および抗癌活性のような、しかしこれらに限定されない分子の活性を評価するために、種々のアッセイが使用され得る。ＮＫＲ−ＣＡＲの効果を評価するためのアッセイは、下にさらに詳細に記載する。

初代Ｔ細胞におけるＮＫＲ−ＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析を、単量体および二量体の存在を検出するために使用できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。極めて簡潔には、ＣＡＲを発現するＴ細胞(ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の１：１混合物)をインビトロで１０日超増殖させ、続いて溶解および還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。ＣＡＲを、ＣＡＲの成分、例えば、ＮＫＲ成分、例えば、ＫＩＲ成分に特異的な抗体を使用するウェスタンブロッティングにより検出する。同じＴ細胞サブセットを、共有結合性二量体形成の評価を可能とするために非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に使用する。

抗原刺激後のＣＡＲ^＋Ｔ細胞のインビトロ増殖を、フローサイトメトリーにより測定できる。例えば、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の混合物をαＣＤ３／αＣＤ２８ａＡＰＣで刺激し、続いて分析すべきプロモーターの制御下に、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。プロモーター例は、ＣＭＶＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。ＧＦＰ蛍光を、ＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセットの培養６日目に、フローサイトメトリーにより評価する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。あるいは、ＣＤ４^＋とＣＤ８^＋Ｔ細胞の混合物を、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、２Ａリボソームスキッピング配列を使用するＣＡＲとｅＧＦＰを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを使用して、１日目にＣＡＲを形質導入する。培養物を、腫瘍抗原発現Ｋ５６２細胞、野生型Ｋ５６２細胞(Ｋ５６２野生型)または腫瘍抗原を発現しない陰性対照細胞で、再刺激する。外来性ＩＬ−２を、１００ＩＵ／mlを隔日で培養物に添加する。ＧＦＰ^＋Ｔ細胞を、ビーズベースの計数を使用するフローサイトメトリーにより数える。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。

再刺激非存在下の持続するＣＡＲ^＋Ｔ細胞増殖も測定できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡潔には、平均Ｔ細胞体積(ｆｌ)を、０日目のαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズでの刺激および１日目の記載するＣＡＲの形質導入後、培養８日目にCoulter Multisizer III粒子カウンター、Nexcelom Cellometer VisionまたはMillipore Scepterを使用して測定する。

動物モデルも、ＣＡＲ発現細胞の測定に使用できる。例えば、免疫欠損マウスにおける、メソテリンを発現する初代ヒト癌、例えば、中皮腫または卵巣癌を処置するための、ヒトメソテリン特異的ＫＩＲ−ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を使用する異種移植モデルを使用できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。極めて簡潔には、腫瘍確立後、マウスを処置群に無作為化する。種々の数のＣＡＲ発現Ｔ細胞を投与する。ＣＡＲ−発現および増殖／ＣＡＲ発現細胞の持続を種々の時点でモニターできる。動物を、週一間隔で、腫瘍進行についてモニターする。群の生存曲線を、ログランク検定で比較する。用量依存的ＣＡＲ処置応答を評価できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。

ＣＡＲ発現細胞の細胞増殖およびサイトカイン産生の評価は、先に、例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)に記載されている。簡潔には、ＣＡＲ介在増殖の評価を、洗浄したＴ細胞と、ＣＤ１９(Ｋ１９)またはＣＤ３２およびＣＤ１３７(ＫＴ３２−ＢＢＬ)を発現するＫ５６２細胞と、最終Ｔ細胞：Ｋ５６２比２：１で混合することによりマイクロタイタープレートにおいて実施する。Ｋ５６２細胞を、使用前にガンマ線で照射する。抗ＣＤ３(クローンＯＫＴ３)および抗ＣＤ２８(クローン９.３)モノクローナル抗体を、これらのシグナルがエクスビボでの長期ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖を支持するため、刺激Ｔ細胞増殖について陽性対照として役立つＫＴ３２−ＢＢＬ細胞の培養物に添加する。Ｔ細胞を、製造者による記載のとおり、Countbright^ＴＭ蛍光ビーズ(Invitrogen, Carlsbad, CA)およびフローサイトメトリーを使用して、培養において数える。ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を、ｅＧＦＰ−２Ａ連結ＣＡＲ発現レンチウイルスベクターで操作されたＴ細胞を使用するＧＦＰ発現により同定する。ＧＦＰを発現しないＣＡＲ^＋Ｔ細胞について、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を、ビオチニル化組み換え腫瘍抗原タンパク質および二次アビジン−ＰＥコンジュゲートにより検出する。Ｔ細胞のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋発現も、特異的モノクローナル抗体(BD Biosciences)を使用して同時に検出する。サイトカイン測定を、製造業者の指示に従いヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカイン細胞数測定ビーズアレイキット(BD Biosciences, San Diego, CA)を使用して再刺激２４時間後に回収した上清でまたはLuminex 30-plexキット(Invitrogen)を使用して実施する。蛍光をBD Fortessaフローサイトメーターを使用して評価し、データを製造業者の指示に従い分析する。類似の実験をＣＤ１２３ＣＡＲＴで実施できる。

細胞毒性を、標準的^５１Ｃｒ放出アッセイにより評価できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡潔には、標的細胞(Ｋ５６２ｌｉｎｅｓ発現ｔｈｅ腫瘍抗原および一次腫瘍細胞)に、^５１Ｃｒ(ＮａＣｒＯ_４として、New England Nuclear, Boston, MA)を、３７℃で２時間、頻繁に撹拌しながら充填し、完全ＲＰＭＩで２回洗浄し、マイクロタイタープレートに播種する。エフェクターＴ細胞を、ウェル中で完全ＲＰＭＩ中、標的細胞と種々のエフェクター細胞：標的細胞(Ｅ：Ｔ)比で混合する。さらなる培地のみ(自発的放出、ＳＲ)またはｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００洗剤１％溶液(全放出、ＴＲ)を含むウェルも調製する。３７℃で４時間のインキュベーション後、各ウェルから上清を回収する。放出された^５１Ｃｒを、次いでガンマ粒子カウンター(Packard Instrument Co., Waltham, MA)を使用して測定する。各条件を少なくとも３回行い、溶解のパーセントを式：溶解％＝(ＥＲ−ＳＲ)／(ＴＲ−ＳＲ)(式中、ＥＲは各実験条件で放出された平均^５１Ｃｒを示す)を使用して計算する。

造影テクノロジーを使用して、腫瘍担持動物モデルにおけるＣＡＲの特異的輸送および増殖を評価できる。このようなアッセイは、例えば、Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)に記載されている。簡潔には、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ^−／−(ＮＳＧ)マウスに、Ｎａｌｍ−６細胞をＩＶ注射し、７日後ＣＡＲ構築物でエレクトロポレーション４時間後Ｔ細胞を注射する。Ｔ細胞は、ホタルルシフェラーゼを発現するようにレンチウイルス構築物で安定にトランスフェクトされ、マウスをバイオルミネセンスについて造影する。あるいは、Ｎａｌｍ−６異種移植モデルにおけるＣＡＲ^＋Ｔ細胞の単回注射の治療有効性および特異性を、次のように測定できる。ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定に発現するように形質導入したＮａｌｍ−６を注射し、続いて７日後にＣＡＲで電気穿孔したＴ細胞を１回尾静脈注射する。動物を、注射後種々の時点で造影する。例えば、５日目(処置２日前)および８日目(ＣＡＲ^＋ＰＢＬ後２４時間)に、代表的マウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性白血病の光子密度ヒートマップを作成できる。

ここでの実施例部分に記載のものならびに当分野で知られるものを含む、他のアッセイも、本発明のＣＡＲ構築物の評価に使用できる。

治療適用
本発明は、ＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲまたは複数のタイプのＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲを発現するために修飾した細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を含み、ここで、各ＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲは、特異的抗体の抗原認識ドメインとＮＫＲの成分、例えば、ＫＩＲを組み合わせる。

ある態様において、本発明のＫＩＲ−ＣＡＲは、シグナル免疫チロシンベースの活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)含有膜タンパク質、ＤＡＰ１２との相互作用により伝達する活性化ＫＩＲを含み、これは、これらのタンパク質の膜貫通ドメイン内の残基が介在する。

ある態様において、本発明のＫＩＲ−ＣＡＲは、タンパク質のＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２およびＶａｖファミリーのような細胞質シグナル伝達タンパク質との直接的または間接的相互作用する１以上の免疫チロシンベースの阻害性モチーフ(ＩＴＩＭ)により、シグナルを伝達する阻害性ＫＩを含む。(ＩＴＩＭ)を含む細胞質ドメインを担持するＫＩＲは活性化シグナルを抑止し、ＮＫ細胞溶解性およびサイトカイン産生活性の阻害に至る。ある例において、本発明のＫＩＲ−ＣＡＲを発現する修飾Ｔ細胞は、ＫＩＲ−ＣＡＲ介在Ｔ細胞応答を誘発できる。ある態様において、１タイプを超える抗原への結合の依存は、修飾Ｔ細胞が、正常バイスタンダー細胞より腫瘍細胞の結合により応答を惹起する増強された特異性を示す。

本発明は、初代Ｔ細胞の特異性を腫瘍抗原に再指向させるための複数のタイプのＫＩＲ−ＣＡＲの使用を提供する。それゆえに、本発明はまた、複数のタイプのＫＩＲ−ＣＡＲを発現するＴ細胞を哺乳動物に投与する過程を含む、哺乳動物における標的細胞集団または組織に対するＴ細胞介在免疫応答を刺激する方法も提供し、ここで、各タイプのＫＩＲ−ＣＡＲは、予定された標的と特異的に相互作用する結合部分を含む。ある態様において、細胞は、活性化ＫＩＲを含む第一ＫＩＲ−ＣＡＲ(ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲ)、および阻害性ＫＩＲを含む第二ＫＩＲ−ＣＡＲ(ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲ)を含む。

何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、ＫＩＲ−ＣＡＲ修飾Ｔ細胞により誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動的または受動的免疫応答であり得る。さらに、ＫＩＲ−ＣＡＲ介在免疫応答は、ＫＩＲ−ＣＡＲ修飾Ｔ細胞が、ＫＩＲ−ＣＡＲにおける抗原結合ドメインに特異的な免疫応答を誘発する、養子免疫療法アプローチの一部であり得る。

処置され得る癌は、血管形成されていないまたはまだ実質的に血管形成されていないならびに血管形成された腫瘍である腫瘍を含む。癌は、非固形腫瘍(例えば血液学的腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫)を含んでも固形腫瘍を含んでもよい。本発明のＣＡＲで処置される癌のタイプは、癌腫、芽腫および肉腫およびある種の白血病またはリンパ系悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍および悪性腫瘍例えば、肉腫、癌腫および黒色腫を含むが、これらに限定されない。成人腫瘍／癌および小児腫瘍／癌も包含される。ある態様において、処置する癌は、固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍である。

血液癌は、血液または骨髄の癌である。血液学的(または血行性)癌の例は、急性白血病(例えば急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病および骨髄芽細胞性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病)、慢性白血病(例えば慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病)を含む白血病、真性多血症、リンパ腫、ホジキン疾患、非ホジキンリンパ腫(低悪性度および高悪性度形態)、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖疾患、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病および骨髄異形成を含む。

固形腫瘍は、通常嚢胞または液体領域を含まない組織の異常塊である。固形腫瘍は良性または悪性であり得る。種々のタイプの固形腫瘍が、それを形成する細胞のタイプにより名づけられる(例えば肉腫、癌腫、およびリンパ腫)。肉腫および癌のような固形腫瘍の例は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性腫瘍、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、髄様甲状腺癌、乳頭甲状腺癌、褐色細胞腫皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎臓細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、黒色腫、およびＣＮＳ腫瘍(例えば神経膠腫(例えば脳幹神経膠腫および混合型神経膠腫)、神経膠芽腫(別名多形神経膠芽腫)、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワン腫頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫および脳転移)を含む。

ある態様において、開示するのは、ＣＤ１９ＣＡＲ、例えば、ここに記載する抗ＣＤ１９結合ドメインを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする提供することを含む、癌の処置方法であって、ここで、癌細胞はＣＤ１９を発現する。ある態様において、処置する癌はＡＬＬ(急性リンパ芽球性白血病)、ＣＬＬ(慢性リンパ性白血病)、ＤＬＢＣＬ(汎発性大Ｂ細胞リンパ腫)、ＭＣＬ(マントル細胞リンパ腫またはＭＭ(多発性骨髄腫)である。

ある態様において、開示するのは、ＥＧＦＲｖIIIＣＡＲ、例えば、ここに記載する抗ＥＧＲＦｖIII結合ドメインを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする提供することを含む、癌の処置方法であって、ここで、癌細胞はＥＧＦＲｖIIIを発現する。ある態様において、処置する癌は神経膠芽腫である。

ある態様において、開示するのは、メソテリンＣＡＲ、例えば、ここに記載する抗メソテリン結合ドメインを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする提供することを含む、癌の処置方法であって、ここで、癌細胞はメソテリンを発現する。ある態様において、処置する癌は固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、中皮腫、膵臓癌、肺癌または卵巣癌である。

ある態様において、開示するのは、ＣＤ１２３ＣＡＲ、例えば、ここに記載する抗ＣＤ１２３結合ドメインを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする提供することを含む、癌の処置方法であって、ここで、癌細胞はＣＤ１２３を発現する。ある態様において、処置する癌はＡＭＬである。

ある態様において、開示するのは、ＣＬＬ−１ＣＡＲ、例えば、ここに記載する抗ＣＬＬ−１結合ドメインを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする提供することを含む、癌の処置方法であって、ここで、癌細胞はＣＬＬ−１を発現する。ある態様において、処置する癌はＡＭＬである。

ある態様において、開示するのは、ＣＤ３３ＣＡＲ、例えば、ここに記載する抗ＣＤ３３結合ドメインを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする提供することを含む、癌の処置方法であって、ここで、癌細胞はＣＤ３３を発現する。ある態様において、処置する癌はＡＭＬである。

ある態様において、開示するのは、ＧＤ２ＣＡＲ、例えば、ここに記載する抗ＧＤ２結合ドメインを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする提供することを含む、癌の処置方法であって、ここで、癌細胞はＧＤ２を発現する。ある態様において、処置する癌は神経芽腫である。

ある態様において、開示するのは、ｏ−アセチル−ＧＤ２ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする提供することを含む、癌の処置方法であって、ここで、癌細胞はｏ−アセチル−ＧＤ２を発現する。ある態様において、処置する癌は神経芽腫または黒色腫である。

ある態様において、開示するのは、ＢＣＭＡＣＡＲ、例えば、ここに記載する抗ＢＣＭＡ結合ドメインを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする提供することを含む、癌の処置方法であって、ここで、癌細胞はＢＣＭＡを発現する。ある態様において、処置する癌は多発性骨髄腫である。

ある態様において、開示するのは、ＣＬＤＮ６ＣＡＲ、例えば、ここに記載する抗ＣＬＤＮ６結合ドメインを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする提供することを含む、癌の処置方法であって、ここで、癌細胞はＣＬＤＮ６を発現する。ある態様において、処置する癌は固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、卵巣癌、肺癌または乳癌である。

ある態様において、開示するのは、ＷＴ１ＣＡＲ、例えば、ここに記載する抗ＷＴ１結合ドメインを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする提供することを含む、癌の処置方法であって、ここで、癌細胞はＷＴ１を発現する。

ある態様において、本発明のＫＩＲ−ＣＡＲ細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の抗原結合ドメインは、特定の癌を処置するように設計される。ある態様において、本発明のＫＩＲ−ＣＡＲ細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、第一抗原を標的とする第一ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲおよび第二抗原を標的とする第二ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲを発現するように修飾され、ここで、第一抗原は特定の腫瘍または癌に発言され、第二抗原は特定の腫瘍または癌に発現されない。この方法で、Ｔ細胞の条件的活性化が、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲ(または目的の悪性細胞の抗原に対するｓｃＦｖを担持する標準ＴＣＲゼータＣＡＲ)および、ＫＩＲ−ＣＡＲＴ細胞が正常細胞と遭遇したとき、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲからの活性化シグナルの阻害を提供する例えば正常組織に提示されるが、悪性組織に提示されない抗原に対するｓｃＦｖを担持するｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲにより提供される。阻害性ＣＡＲに対する有用な標的として働く抗原の例は、エフリン受容体(Pasquale, 2010, Nat Rev Cancer 10(3):165-80)およびクローディン(Singh et al., 2010, J Oncol, 2010:541957)を含み、これらは、正常組織の上皮性細胞で発現されるが、しばしば、癌(例えばＥＰＨＡ７)により選択的に喪失される。

メソテリン発現疾患および障害に対する治療適用
本発明は、メソテリンの発現と関係する疾患および障害を処置するための組成物および方法を提供する。メソテリン発現と関係する疾患または障害の例は、中皮腫(例えば、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜中皮腫)、膵臓癌または卵巣癌を含む。メソテリン発現と関係する疾患または障害は、ここに記載する固形腫瘍である。

悪性中皮腫は、中皮として知られる体内臓器を裏打ちする細胞の薄層に生じるタイプの癌である。認識される３タイプの中皮腫がある。胸膜中皮腫(例えば、悪性胸膜中皮腫またはＭＰＭ)は該疾患の最も一般的形態で、症例の約７０％を占め、胸膜として知られる肺の裏層に始まる。腹膜中皮腫は、腹膜として知られる腹腔の裏層に生じる。心膜中皮腫は、心臓を裏打ちする心膜に始まる。

対象は、アスベストに長期に曝されたならば、中皮腫を発症するリスクがあり得る。アスベストへの暴露およびアスベスト粒子の吸入は中皮腫を引き起こし得る。大部分の場合、中皮腫症状は、暴露後長年経過するまで、アスベストに曝されている対象では生じない。

胸膜中皮腫の症状は、例えば、腰痛または側胸痛および息切れを含む。他の症状は、嚥下困難、咳嗽の持続、発熱、体重減少または疲労を含む。患者のいくらかが経験するさらなる症状は、筋肉弱化、感覚能力の喪失、喀血、顔面および腕部腫脹および嗄声である。ステージ１中皮腫のような疾患の初期段階では、症状は穏やかであり得る。患者は、通常胸の一部の治まりそうにない疼痛、体重減少および発熱を報告する。

腹膜中皮腫は、腹部に端を発し、その結果、症状はしばしば腹痛、体重減少、悪心および嘔吐を含む。水分蓄積が腹部にそして癌の結果生じる。腹膜中皮腫は腹部に端を発し、しばしば肝臓、脾臓または腸を含む領域における他の臓器に広がる。重度の腹痛が、患者が最初に経験する最も一般的な訴えである。腹部の水分蓄積による不快感レベルも同様に存在し得る。腹膜中皮腫の他の症状は、排便困難、悪心および嘔吐、発熱および足のむくみを含み得る。

心膜中皮腫は、中皮腫の最も少ない形態である。心膜中皮腫は、名前が示すとおり、心臓が関係する。この稀なタイプの中皮腫癌は、心臓を囲む嚢である心膜を侵す。癌が進行するに連れて、心臓は、体に酸素を効率的に運搬することができなくなり、さらにいっそう加速しながら健康を悪化させる。心膜中皮腫と最も一般的に関係する症状は心臓発作のものによく似ており、悪心、胸痛および息切れである。

本発明の処置により利益を受ける対象は、中皮腫を有する対象または、例えば、ここに記載する症状の１つ以上の存在および／またはアスベストへの暴露を証拠として、中皮腫を有することが疑われる対象である。具体的な態様において、中皮腫は胸膜中皮腫(例えば、悪性胸膜中皮腫)である。他の面において、例えば、胸膜プラーク、良性中皮腫または中皮過形成のような前癌状態を有する対象を処置し得る。

メソテリンと関係する疾患または障害の他の例は膵臓癌である。ここに記載する方法で処置できる膵臓癌は、膵外分泌癌および膵内分泌癌を含むが、これらに限定されない。膵外分泌癌は、腺癌、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、膠質癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、肝様癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腫瘍、膵芽腫、漿液性嚢胞腺腫、印環細胞癌、充実性偽乳頭腫瘍、膵管癌および未分化癌を含むが、これらに限定されない。ある態様において、膵外分泌癌は膵管癌である。膵内分泌癌は、インスリノーマおよびグルカゴノーマを含むが、これらに限定されない。

ある態様において、膵臓癌は、あらゆる初期膵臓癌、非転移膵臓癌、原発性膵臓癌、摘出膵臓癌、進行膵臓癌、局所進行膵臓癌、転移膵臓癌、切除不能膵臓癌、寛解状態膵臓癌、再発性膵臓癌、補助療法における膵臓癌または新補助療法における膵臓癌を含む。ある態様において、膵臓癌は局所進行膵臓癌、切除不能膵臓癌または転移膵管癌である。ある態様において、膵臓癌はゲムシタビンベースの療法に耐性である。ある態様において、膵臓癌はゲムシタビンベースの療法に難治性である。

他の面において、メソテリン発現と関係する障害は卵巣癌である。卵巣癌は、腫瘍組織学により分類される。卵巣上皮性癌としても知られる表面上皮性間質腫瘍は、卵巣癌の最も一般的タイプである。漿液性腫瘍(漿液性乳頭状嚢腺癌を含む)、類内膜腫瘍および粘液性嚢胞腺腫を含む。

ここに記載する方法を使用して、多様なステージ、例えば、ステージＩ、ステージII、ステージIIIまたはステージIVの卵巣癌を処置できる。ステージ分類は、例えば、卵巣癌を摘出するとき行う。卵巣癌は次のとおりステージ分類される。
ステージＩ癌は、一方または両方の卵巣に限局する。卵巣の一方または両方が関与し、子宮および／またはファロピウス管または骨盤内の他の部位に広がっているとき、癌はステージIIである。卵巣の一方または両方が関与し、リンパ節または、腸管のように骨盤の外であるがまだ腹腔にある他の部位または肝臓表面に広がっているとき、癌はステージIII癌である。一方または両方の卵巣が関与し、癌が腹部の外または肝臓内部に広がっているとき、癌はステージIV癌である。

ある態様において、卵巣癌は１個以上の化学療法剤に耐性である。ある態様において、卵巣癌は１個以上の化学療法剤に難治性である。

ここに記載するＣＡＲ組成物で処置できる他の癌は、例えば、脳癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、肝臓癌、腎臓癌、リンパ腫、白血病、肺癌(例えば、肺腺癌)、黒色腫、転移黒色腫、中皮腫、神経芽腫、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、皮膚癌、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、子宮癌およびこれらの任意の組み合わせを含む。

本発明は、メソテリン発現細胞集団の増殖を阻止するかまたは減少させる方法を提供し、該方法は、該メソテリン発現細胞を含む細胞の集団と、該メソテリン発現細胞と結合する本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞を接触させることを含む。具体的態様において、本発明は、メソテリンを発現する癌細胞の集団の増殖を阻止するかまたは減少させる方法を提供し、該方法は、該メソテリン発現癌細胞集団と、該メソテリン発現細胞と結合する本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞を接触させることを含む。他の態様において、本発明は、メソテリンを発現する癌細胞の集団の増殖を阻止するかまたは減少させる方法を提供し、該方法は、該メソテリン発現癌細胞集団と、該メソテリン発現細胞と結合する本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞を接触させることを含む。ある態様において、本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞は、細胞および／または癌細胞の数量、数、量またはパーセンテージを、中皮腫またはメソテリン発現細胞と関係する他の癌を有する対象またはその動物モデルにおいて、陰性対照と比較して少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％または少なくとも９９％減少させる。ある面において、対象はヒトである。

本発明はまたメソテリン発現細胞と関係する障害(例えば、中皮腫)を予防、処置および／または管理する方法を提供し、該方法は、それを必要とする対象に該メソテリン発現細胞と結合する本発明の中皮腫ＣＡＲ発現細胞を投与することを含む。一つの面において、対象はヒトである。

本発明は、メソテリン発現細胞と関係する癌の再発を予防する方法を提供し、該方法は、それを必要とする対象に該メソテリン発現細胞と結合する本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞を投与することを含む。他の態様において、該方法は、それを必要とする対象に、有効量の該メソテリン発現細胞と結合する本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞を有効量の他の治療剤と組み合わせて投与することを含む。

一つの面において、本発明は、哺乳動物免疫エフェクター細胞における発現のためのプロモーターに操作可能に結合したメソテリンＣＡＲをコードする配列を含むベクターに関する。一つの面において、本発明は、メソテリン発現腫瘍の処置に使用するためのメソテリンＣＡＲを発現する組み換え免疫エフェクター細胞を提供する。一つの面において、本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞は、メソテリンＣＡＲ発現細胞が抗原に応答して活性化され、ＣＡＲ発現細胞が癌細胞を標的とし、癌の増殖が阻害されるように、腫瘍細胞と、その表面に発現される本発明のメソテリンＣＡＲの少なくとも１つを接触させる。

ある面において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞が抗原に応答して活性化され、癌細胞を標的とし、癌の増殖が阻害されるように腫瘍細胞とメソテリンＣＡＲ発現細胞を接触させることを含む、メソテリン発現癌細胞の増殖を阻止する方法を提供する。ある面において、活性化ＣＡＲＴは癌細胞を標的とし、殺す。

ある面において、本発明は、対象における癌の処置法を提供する。該方法は、対象に、癌が対象で処置されるように、メソテリンＣＡＲ発現細胞を投与することを含む。本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞で処置可能な癌の例は、メソテリンの発現と関係する癌である。一つの面において、メソテリンの発現と関係する癌は、中皮腫、膵臓癌、卵巣癌および肺癌から選択される。

本発明は、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞が、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように遺伝的に修飾され、ＣＡＲ発現細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される、ある種の細胞治療を提供する。注入された細胞はレシピエントの腫瘍細胞を死滅させ得る。抗体治療と異なり、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞はインビボで複製でき、持続した腫瘍制御に至り得る長期残留性を生じる。種々の面において、患者に投与された細胞またはその子孫は、患者への細胞投与後、患者に少なくとも４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年または５年残留する。

本発明はまた、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を一過性に発現するように、例えば、インビトロで転写されたＲＮＡにより免疫エフェクター細胞が修飾され、該ＣＡＲ発現細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される、ある種の細胞治療も含む。注入された細胞は、レシピエントにおける癌細胞を死滅させ得る。それゆえに、種々の面において、患者に投与された細胞は、患者への細胞投与後１ヶ月未満、例えば３週間、２週間、１週間存在する。

何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞により惹起される抗癌免疫応答は、受動的または能動的免疫応答であってよく、あるいはまた直接的対間接的免疫応答によるものであり得る。一つの面において、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、メソテリンを発現するヒト癌細胞に応答して特定の炎症誘発性サイトカイン分泌および強力な細胞溶解性活性を示し、バイスタンダー死滅を仲介し、確立されたヒト腫瘍の退縮を仲介する。例えば、メソテリン発現腫瘍の不均一な領域内の抗原が少ない腫瘍細胞は、隣接する抗原陽性癌細胞に対して以前は反応していたメソテリン再指向Ｔ細胞による間接的破壊に感受性であり得る。

一つの面において、本発明のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞を担持する完全ヒトｓｃＦｖは、哺乳動物におけるエクスビボ免疫化および／またはインビボ治療のためのある種のワクチンであり得る。一つの面において、哺乳動物はヒトである。

エクスビボ免疫化に関して、哺乳動物に細胞を投与する前に、インビトロで次のｉ)細胞の増殖、ii)ＣＡＲをコードする核酸の細胞への導入またはiii)細胞の凍結保存の少なくとも１つが起こる。

エクスビボ手順は当分野で周知であり、下により詳細に記載する。概説すると、細胞を哺乳動物(例えば、ヒト)から単離し、ここに開示されるＫＩＲ−ＣＡＲを発現するベクターで遺伝的に修飾(すなわち、インビトロ形質導入または遺伝子導入)する。ＫＩＲ−ＣＡＲ修飾細胞を、哺乳動物レシピエントに投与して、治療効果を提供できる。哺乳動物レシピエントはヒトであってよく、ＫＩＲ−ＣＡＲ修飾細胞は、レシピエントに関して自己であり得る。あるいは、細胞は、レシピエントに関して同種、同系または異種であり得る。

引用により本明細書に包含させる米国特許５,１９９,９４２号に記載する造血幹細胞および前駆細胞のエクスビボ増殖のための方法を、本発明の細胞に適用できる。他の適当な方法は当分野で知られ、それゆえに本発明は、細胞のエクスビボ増殖の特定の方法に制限されない。簡潔には、Ｔ細胞のエクスビボ培養および増殖は、(１)哺乳動物からの採取した末梢血または骨髄外植体からのＣＤ３４^＋造血幹細胞および前駆細胞回収；および(２)エクスビボでのこのような細胞の増殖を含む。米国特許５,１９９,９４２号に記載される細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３およびｃ−ｋｉｔリガンドのような他の因子を細胞の培養および増殖に使用できる。

エクスビボ免疫化の点で細胞ベースのワクチンを使用するのに加えて、本発明はまた患者における抗原に対する免疫応答を惹起するための、インビボ免疫化のための組成物および方法も提供する。

一般に、ここに記載するように活性化および拡張された細胞を、免疫不全状態である個体で生じる疾患の処置および予防に使用できる。特に、本発明のＫＩＲ−ＣＡＲ修飾Ｔ細胞を癌の処置に使用する。ある態様において、本発明の細胞を、癌を発症するリスクのある患者の処置に使用する。それゆえに、本発明は、処置を必要とする対象に本発明のＫＩＲ−ＣＡＲ修飾Ｔ細胞の治療有効量を投与することを含む、癌を処置または予防する方法を提供する。

本発明のＫＩＲ−ＣＡＲ修飾Ｔ細胞を単独でまたは希釈剤および／またはＩＬ−２または他のサイトカインまたは細胞集団のような他の成分と組み合わせて医薬組成物として投与し得る。簡潔にいうと、本発明の医薬組成物は、１以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または添加物と組み合わせた、ここに記載する標的細胞集団を含み得る。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などのような緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールのような炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート剤；アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)；および防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、好ましくは静脈内投与用に製剤される。

組み合わせ治療
ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、他の既知薬剤および治療と組み合わせて使用し得る。ここで使用する“組み合わせて”投与するは２(またはそれ以上)の異なる処置を、対象が障害に苦しんでいる過程の間に対象に送達することを意味し、例えば、２以上の処置を、対象が障害と診断された後にかつ障害が治癒または撲滅される前にまたは処置が他の理由で中止される前に送達される。ある態様において、投与期間の重複があるように、一方の処置の送達は、第二の処置の送達開始時にまだ行われている。これは、ここでは“同時の”または“一緒の送達”ということがある。他の態様において、他の態様において、一方の処置の送達は、他の処置の送達が始まる前に終わる。いずれかの場合のある態様において、処置は、組み合わせ投与のためにより有効である。例えば、第二処置剤はより有効である、例えば、等しい効果が少ない第二処置剤で見られるまたは第二処置剤が、第二処置剤を第一処置剤非存在下で投与したときに見られるよりも大きな程度で症状を軽減するまたは第一処置剤で同様な状況が見られる。ある態様において、送達、障害と関係する症状または他のパラメータの減少が、他方の処置剤の非存在下で一方の処置剤の送達で観察されるより大きい。２処置の効果は一部相加的、完全相加的または相加的より大きいものであり得る。送達は、送達した第一処置の効果が、第二剤の送達時になお検出可能であるようなものであり得る。

ここに記載するＣＡＲ発現細胞および少なくとも一つのさらなる治療剤を同時に、同じまたは別の組成物でまたは逐次的に投与できる。逐次投与について、ここに記載するＣＡＲ発現細胞をまず投与してよく、さらなる薬剤を次に投与してよくまたは投与の順序は逆でよい。

ＣＡＲ治療および／または他の治療剤、方法またはモダリティーを、活動性障害の期間または寛解または低活動性疾患の期間に投与できる。ＣＡＲ治療を、他の処置の処置前、処置と同時、処置後または障害の寛解中に投与できる。

組み合わせて投与するとき、ＣＡＲ治療およびさらなる薬剤(例えば、第二または第三の薬剤)または全てを、個々に、例えば、単剤療法として使用する各薬剤の量または投与より高い、低いまたは同じ量または用量で投与できる。ある態様において、ＣＡＲ治療、さらなる薬剤(例えば、第二または第三薬剤)または全ての投与される量または用量は、個々に、例えば、単剤療法として使用する各薬剤の量または用量より低い(例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％)。他の態様において、所望の効果(例えば、癌の処置)を生じるＣＡＲ治療、さらなる薬剤(例えば、第二または第三薬剤)または全ての投与される量または用量は、同じ治療効果を達成するのに必要な、個々に、例えば、単剤療法として使用する各薬剤の量または用量より低い(例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％低い)。

さらなる面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、手術、サイトカイン、放射線またはシトキサン、フルダラビン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、脱メチル化剤またはIzumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971に記載のようなペプチドワクチンのような化学療法と組み合わせた処置レジメンで使用し得る。

ある例において、本発明の化合物を、他の抗癌剤、抗アレルギー剤、制吐剤(または鎮吐剤)、鎮痛剤、細胞保護剤およびこれらの組み合わせのような他の治療剤と組み合わせる。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、化学療法剤と組み合わせて使用できる。化学療法剤の例は、アントラサイクリン(例えば、ドキソルビシン(例えば、リポソームドキソルビシン))、ビンカアルカロイド(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン)、アルキル化剤(例えば、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド)、免疫細胞抗体(例えば、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、ブレンツキシマブ)、代謝拮抗剤(例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤(例えば、フルダラビン))、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連タンパク質(ＧＩＴＲ)アゴニスト、プロテアソーム阻害剤(例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシンまたはボルテゾミブ)、サリドマイドまたはサリドマイド誘導体(例えば、レナリドマイド)のような免疫調節剤を含む。

組み合わせ治療における使用が企図される一般的化学療法剤は、アナストロゾール(アリミデックス(登録商標))、ビカルタミド(カソデックス(登録商標))、硫酸ブレオマイシン(Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ(登録商標))、ブスルファン(マイレラン(登録商標))、ブスルファン注(ブスルフェクス(登録商標))、カペシタビン(ゼローダ(登録商標))、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン(パラプラチン(登録商標))、カルムスチン(ＢｉＣＮＵ(登録商標))、クロラムブシル(リューケラン(登録商標))、シスプラチン(Ｐｌａｔｉｎｏｌ(登録商標))、クラドリビン(ロイスタチン(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)またはＮｅｏｓａｒ(登録商標))、シタラビン、シトシンアラビノシド(Cytosar-U(登録商標))、シタラビンリポソーム注射(ＤｅｐｏＣｙｔ(登録商標))、ダカルバジン(ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))、ダクチノマイシン(アクチノマイシンＤ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ)、塩酸ダウノルビシン(Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ(登録商標))、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射(ＤａｕｎｏＸｏｍｅ(登録商標))、デキサメサゾン、ドセタキセル(タキソテール(登録商標))、塩酸ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)、Ｒｕｂｅｘ(登録商標))、エトポシド(ベプシド(登録商標))、リン酸フルダラビン(フルダラ(登録商標))、５−フルオロウラシル(アドルシル(登録商標)、エフデックス(登録商標))、フルタミド(Ｅｕｌｅｘｉｎ(登録商標))、テザシチビン、ゲムシタビン(ジフルオロデオキシシチジン)、ヒドロキシ尿素(ハイドレア(登録商標))、イダルビシン(イダマイシン(登録商標))、イホスファミド(ＩＦＥＸ(登録商標))、イリノテカン(Ｃａｍｐｔｏｓａｒ(登録商標))、Ｌ−アスパラギナーゼ(ＥＬＳＰＡＲ(登録商標))、ロイコボリンカルシウム、メルファラン(アルケラン(登録商標))、６−メルカプトプリン(ピュリネソール(登録商標))、メトトレキサート(Ｆｏｌｅｘ(登録商標))、ミトキサントロン(ノバントロン(登録商標))、マイロターグ、パクリタキセル(タキソール(登録商標))、ｐｈｏｅｎｉｘ(イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ)、ペントスタチン、ポリフェプロザン２０とカルムスチンインプラント(グリアデル(登録商標))、クエン酸タモキシフェン(ノルバデックス(登録商標))、テニポシド(Ｖｕｍｏｎ(登録商標))、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン(Ｔｉｒａｚｏｎｅ(登録商標))、注射用塩酸トポテカン(ハイカムチン(登録商標))、ビンブラスチン(Ｖｅｌｂａｎ(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビノレルビン(ナベルビン(登録商標))を含む。

本発明の化合物と組み合わせるための特に興味深い抗癌剤は、アントラサイクリン；アルキル化剤；代謝拮抗剤；カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンまたはｐ７０Ｓ６キナーゼＦＫ５０６)を阻害するまたはｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する薬剤；ｍＴＯＲ阻害剤；免疫調節剤；アントラサイクリン；ビンカアルカロイド；プロテオソーム阻害剤；ＧＩＴＲアゴニストタンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；ＣＤＫ４キナーゼ阻害剤；ＢＴＫ阻害剤；ＭＫＮキナーゼ阻害剤；ＤＧＫキナーゼ阻害剤；または腫瘍溶解性ウイルスを含む。

代謝拮抗剤の例は、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤)：メトトレキサート(リウマトレックス(登録商標)、Ｔｒｅｘａｌｌ(登録商標))、５−フルオロウラシル(Ａｄｒｕｃｉｌ(登録商標)、エフデックス(登録商標)、フルオロプレクス(登録商標))、フロクスウリジン(ＦＵＤＦ(登録商標))、シタラビン(Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ(登録商標)、ＴａｒａｂｉｎｅＰＦＳ)、６−メルカプトプリン(プリントール(登録商標)))、６−チオグアニン(チオグアニンＴａｂｌｏｉｄ(登録商標))、リン酸フルダラビン(フルダラ(登録商標))、ペントスタチン(Ｎｉｐｅｎｔ(登録商標))、ペメトレキセド(アリムタ(登録商標))、ラルチトレキセド(トムデックス(登録商標))、クラドリビン(ロイスタチン(登録商標))、クロファラビン(Ｃｌｏｆａｒｅｘ(登録商標)、クロラール(登録商標))、アザシチジン(ビダーザ(登録商標))、デシタビンおよびゲムシタビン(ジェムザール(登録商標))を含むが、これらに限定されない。好ましい代謝拮抗剤は、シタラビン、クロファラビンおよびフルダラビンを含む。

アルキル化剤の例は、窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア類およびトリアゼン)：ウラシルマスタード(アミノウラシルマスタード(登録商標)、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ(登録商標)、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ(登録商標)、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ(登録商標)、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ(登録商標)、Ｎｏｒｄｏｐａｎ(登録商標)、Ｕｒａｃｉｌｎｉｔｒｏｇｅｎｍｕｓｔａｒｄ(登録商標)、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ(登録商標)、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ(登録商標)、ウラムスチン(登録商標)、ウラムスチン(登録商標))、クロルメチン(Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)、Ｎｅｏｓａｒ(登録商標)、Ｃｌａｆｅｎ(登録商標)、エンドキサン(登録商標)、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ(登録商標)、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ^ＴＭ)、イホスファミド(Ｍｉｔｏｘａｎａ(登録商標))、メルファラン(アルケラン(登録商標))、クロラムブシル(リューケラン(登録商標))、ピポブロマン(Ａｍｅｄｅｌ(登録商標)、Ｖｅｒｃｙｔｅ(登録商標))、トリエチレンメラミン(ヘメル(登録商標)、Ｈｅｘａｌｅｎ(登録商標)、Ｈｅｘａｓｔａｔ(登録商標))、トリエチレンチオホスホロアミン、テモゾロミド(テモダール(登録商標))、チオテパ(Ｔｈｉｏｐｌｅｘ(登録商標))、ブスルファン(Ｂｕｓｉｌｖｅｘ(登録商標)、マイレラン(登録商標))、カルムスチン(ＢｉＣＮＵ(登録商標))、ロムスチン(ＣｅｅＮＵ(登録商標))、ストレプトゾシン(Ｚａｎｏｓａｒ(登録商標))およびダカルバジン(ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))を含むが、これらに限定されないロムスチン(ＣｅｅＮＵ(登録商標))、ストレプトゾシン(Ｚａｎｏｓａｒ(登録商標))およびダカルバジン(ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))。アルキル化剤のさらなる例は、オキサリプラチン(エロキサチン(登録商標))；テモゾロミド(テモダール(登録商標)およびテモダール(登録商標))；ダクチノマイシン(別名アクチノマイシン−Ｄ、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ(登録商標))；メルファラン(別名Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシンおよびフェニルアラニンマスタード、アルケラン(登録商標))；アルトレタミン(別名ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ)、Ｈｅｘａｌｅｎ(登録商標))；カルムスチン(ＢｉＣＮＵ(登録商標))；ベンダムスチン(Ｔｒｅａｎｄａ(登録商標))；ブスルファン(ブスルフェクス(登録商標)およびマイレラン(登録商標))；カルボプラチン(パラプラチン(登録商標))；ロムスチン(別名ＣＣＮＵ、ＣｅｅＮＵ(登録商標))；シスプラチン(別名ＣＤＤＰ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ(登録商標)およびＰｌａｔｉｎｏｌ(登録商標)−ＡＱ)；クロラムブシル(リューケラン(登録商標))；シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)およびＮｅｏｓａｒ(登録商標))；ダカルバジン(別名ＤＴＩＣ、ＤＩＣおよびイミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))；アルトレタミン(別名ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ)、Ｈｅｘａｌｅｎ(登録商標))；イホスファミド(Ｉｆｅｘ(登録商標))；Ｐｒｅｄｎｕｍｕｓｔｉｎｅ；プロカルバジン(Ｍａｔｕｌａｎｅ(登録商標))；メクロレタミン(別名窒素マスタード、ムスチンおよび塩酸メクロロエタミン、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ(登録商標))；ストレプトゾシン(Ｚａｎｏｓａｒ(登録商標))；チオテパ(別名チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡおよびＴＳＰＡ、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ(登録商標))；シクロホスファミド(エンドキサン(登録商標)、シトキサン(登録商標)、Ｎｅｏｓａｒ(登録商標)、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ(登録商標)、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ(登録商標))；およびベンダムスチンＨＣｌ(Ｔｒｅａｎｄａ(登録商標))を含むが、これらに限定されない。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、フルダラビン、シクロホスファミドおよび／またはリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、フルダラビン、シクロホスファミドおよびリツキシマブ(ＦＣＲ)と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、対象はＣＬＬを有する。例えば、対象は、染色体１７の短腕に欠失を有する(例えば、白血病性細胞におけるｄｅｌ(１７ｐ))。他の例において、対象は、ｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶ_Ｈ)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含む。他の態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶ_Ｈ)に変異を含む白血病性細胞を含まない。ある態様において、フルダラビンを、約１０〜５０mg／ｍ^２(例えば、約１０〜１５mg／ｍ^２、１５〜２０mg／ｍ^２、２０〜２５mg／ｍ^２、２５〜３０mg／ｍ^２、３０〜３５mg／ｍ^２、３５〜４０mg／ｍ^２、４０〜４５mg／ｍ^２または４５〜５０mg／ｍ^２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、シクロホスファミドを、約２００〜３００mg／ｍ^２(例えば、約２００〜２２５mg／ｍ^２、２２５〜２５０mg／ｍ^２、２５０〜２７５mg／ｍ^２または２７５〜３００mg／ｍ^２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、リツキシマブを、約４００〜６００mg／ｍ^２(例えば、４００〜４５０mg／ｍ^２、４５０〜５００mg／ｍ^２、５００〜５５０mg／ｍ^２または５５０〜６００mg／ｍ^２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ベンダムスチンおよびリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、対象はＣＬＬを有する。例えば、対象は、染色体１７の短腕に欠失を有する(例えば、白血病性細胞におけるｄｅｌ(１７ｐ))。他の例において、対象は、ｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶ_Ｈ)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含む。他の態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶ_Ｈ)に変異を含む白血病性細胞を含まない。ある態様において、ベンダムスチンを、約７０〜１１０mg／ｍ^２(例えば、７０〜８０mg／ｍ^２、８０〜９０mg／ｍ^２、９０〜１００mg／ｍ^２または１００〜１１０mg／ｍ^２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、リツキシマブを、約４００〜６００mg／ｍ^２(例えば、４００〜４５０mg／ｍ^２、４５０〜５００mg／ｍ^２、５００〜５５０mg／ｍ^２または５５０〜６００mg／ｍ^２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよび／またはコルチコステロイド(例えば、プレドニゾン)と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン(Ｒ−ＣＨＯＰ)と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、対象は、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫(ＤＬＢＣＬ)を有する。ある態様において、対象は、巨大腫瘤がない限局したステージのＤＬＢＣＬ(例えば、７cm未満のサイズ／直径の腫瘍を含む)を有する。ある態様において、対象は、Ｒ−ＣＨＯＰと組み合わせて放射線で処置される。例えば、対象に、Ｒ−ＣＨＯＰ(例えば、１〜６サイクル、例えば、１、２、３、４、５または６サイクルのＲ−ＣＨＯＰ)、続いて放射線を投与する。ある場合、対象に、放射線後Ｒ−ＣＨＯＰ(例えば、１〜６サイクル、例えば、１、２、３、４、５または６サイクルのＲ−ＣＨＯＰ)を投与する。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよび／またはリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびリツキシマブ(ＥＰＯＣＨ−Ｒ)と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、用量調節ＥＰＯＣＨ−Ｒ(ＤＡ−ＥＰＯＣＨ−Ｒ)と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、対象は、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、Ｍｙｃ再配列侵襲性Ｂ細胞リンパ腫を有する。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、リツキシマブおよび／またはレナリドマイドと組み合わせて対象に投与する。レナリドマイド((ＲＳ)−３−(４−アミノ−１−オキソ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル)ピペリジン−２,６−ジオン)は、免疫調節剤である。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、リツキシマブおよびレナリドマイドと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、対象は濾胞性リンパ腫(ＦＬ)またはマントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)を有する。ある態様において、対象はＦＬを有し、癌治療剤で先に処置されていない。ある態様において、レナリドマイドを、約１０〜２０mg(例えば、１０〜１５mgまたは１５〜２０mg)、例えば、連日投与する。ある態様において、リツキシマブを、約３５０〜５５０mg／ｍ^２(例えば、３５０〜３７５、３７５〜４００、４００〜４２５、４２５〜４５０、４５０〜４７５または４７５〜５００mg／ｍ^２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。

ｍＴＯＲ阻害剤の例は、例えば、テムシロリムス；リダフォロリムス(以前はデフェロリムスとして既知、(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ、２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０^４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られ、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０６４３８３に記載)；エベロリムス(アフィニトール(登録商標)またはＲＡＤ００１)；ラパマイシン(ＡＹ２２９８９、シロリムス(登録商標))；セマピモド(ＣＡＳ１６４３０１−５１−３)；エムシロリムス、(５−{２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(ＡＺＤ８０５５)；２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ１０１３１０１−３６−４)；およびＮ^２−[１,４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−(配列番号６４)、分子内塩(ＳＦ１１２６、ＣＡＳ９３６４８７−６７−１)およびＸＬ７６５を含む。

免疫調節剤の例は、例えば、アフツズマブ(Ｒｏｃｈｅ(登録商標)から入手可能)；ペグフィルグラスチム(Ｎｅｕｌａｓｔａ(登録商標))；レナリドマイド(ＣＣ−５０１３、レブリミド(登録商標))；サリドマイド(サロミド(登録商標))、ａｃｔｉｍｉｄ(ＣＣ４０４７)；およびＩＲＸ−２(インターロイキン１、インターロイキン２およびインターフェロンγを含むヒトサイトカイン混合物、ＣＡＳ９５１２０９−７１−５、ＩＲＸＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手可能)を含む。

アントラサイクリンの例は、例えば、ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)およびＲｕｂｅｘ(登録商標))；ブレオマイシン(ｌｅｎｏｘａｎｅ(登録商標))；ダウノルビシン(塩酸ダウノルビシン、ダウノマイシンおよび塩酸ルビドマイシン、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ(登録商標))；ダウノルビシンリポソーム(クエン酸ダウノルビシンリポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ(登録商標))；ミトキサントロン(ＤＨＡＤ、ノバントロン(登録商標))；エピルビシン(Ｅｌｌｅｎｃｅ^ＴＭ)；イダルビシン(イダマイシン(登録商標)、イダマイシンＰＦＳ(登録商標))；マイトマイシンＣ(ムタマイシン(登録商標))；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；およびデスアセチルラビドマイシンを含む。

ビンカアルカロイドの例は、例えば、酒石酸ビノレルビン(ナベルビン(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビンデシン(Ｅｌｄｉｓｉｎｅ(登録商標)))；ビンブラスチン(別名硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチンおよびＶＬＢ、Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ(登録商標)およびＶｅｌｂａｎ(登録商標))；およびビノレルビン(ナベルビン(登録商標))を含む。

プロテオソーム阻害剤の例は、ボルテゾミブ(ベルケイド(登録商標))；カーフィルゾミブ(ＰＸ−１７１−００７、(Ｓ)−４−メチル−Ｎ−((Ｓ)−１−(((Ｓ)−４−メチル−１−((Ｒ)−２−メチルオキシラン−２−イル)−１−オキソペンタン−２−イル)アミノ)−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル)−２−((Ｓ)−２−(２−モルホリノアセトアミド)−４−フェニルブタンアミド)−ペンタンアミド)；マリゾミブ(ＮＰＩ−００５２)；イキサゾミブクエン酸エステル(MLＮ−９７０８)；デランゾミブ(ＣＥＰ−１８７７０)；およびＯ−メチル−Ｎ−[(２−メチル−５−チアゾリル)カルボニル]−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−[(１Ｓ)−２−[(２Ｒ)−２−メチル−２−オキシラニル]−２−オキソ−１−(フェニルメチル)エチル]−Ｌ−セリンアミド(ＯＮＸ−０９１２)を含む。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ブレンツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ブレンツキシマブは、抗ＣＤ３０抗体およびモノメチルオーリスタチンＥの抗体−薬物コンジュゲートである。ある態様において、対象は、ホジキンリンパ腫(ＨＬ)、例えば、再発性または難治性ＨＬを有する。ある態様において、対象はＣＤ３０^＋ＨＬを含む。ある態様において、対象は、自己幹細胞移植(ＡＳＣＴ)を受けている。ある態様において、対象は、ＡＳＣＴを受けていない。ある態様において、ブレンツキシマブを、約１〜３mg／kg(例えば、約１〜１.５mg／kg、１.５〜２mg／kg、２〜２.５mg／kgまたは２.５〜３mg／kg)を、例えば、静脈内に、例えば、３週間毎に投与する。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ブレンツキシマブおよびダカルバジンまたはブレンツキシマブとベンダムスチンの組合せと組み合わせて対象に投与する。ダカルバジンは、化学名を５−(３,３−ジメチル−１−トリアゼニル)イミダゾール−４−カルボキサミド有するアルキル化剤である。ベンダムスチンは、化学名４−[５−[ビス(２−クロロエチル)アミノ]−１−メチルベンズイミダゾール−２−イル]ブタン酸を有するアルキル化剤である。ある態様において、対象はホジキンリンパ腫(ＨＬ)を有する。ある態様において、対象は、癌治療剤で先に処置されていない。ある態様において、対象は少なくとも６０歳、例えば、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳またはそれ以上である。ある態様において、ダカルバジンを、約３００〜４５０mg／ｍ^２(例えば、約３００〜３２５mg／ｍ^２、３２５〜３５０mg／ｍ^２、３５０〜３７５mg／ｍ^２、３７５〜４００mg／ｍ^２、４００〜４２５mg／ｍ^２または４２５〜４５０mg／ｍ^２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、ベンダムスチンを、約７５〜１２５mg／ｍ^２(例えば、７５〜１００mg／ｍ^２または１００〜１２５mg／ｍ^２、例えば、約９０mg／ｍ^２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、ブレンツキシマブを、約１〜３mg／kg(例えば、約１〜１.５mg／kg、１.５〜２mg／kg、２〜２.５mg／kgまたは２.５〜３mg／kg)を、例えば、静脈内に、例えば、３週間毎に投与する。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＣＤ２０阻害剤、例えば、抗ＣＤ２０抗体(例えば、抗ＣＤ２０単−または二重特異的抗体)またはそのフラグメントと組み合わせて投与する。抗ＣＤ２０抗体の例は、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、オビヌツズマブ、ＴＲＵ−０１５(Trubion Pharmaceuticals)、オカラツズマブおよびＰｒｏ１３１９２１(Genentech)を含むが、これらに限定されない。例えば、Lim et al. Haematologica. 95.1(2010):135-43参照。

ある態様において、抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブを含む。リツキシマブは、例えば、www.accessdata.fda.gov／drugsatfda_docs／label／2010／103705s5311lbl.pdfに記載のように、ＣＤ２０に結合し、ＣＤ２０発現細胞の細胞溶解を起こすキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体ＩｇＧ１カッパである。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、リツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、対象はＣＬＬまたはＳＬＬを有する。

ある態様において、リツキシマブを、静脈内に、例えば、静脈内点滴として投与する。例えば、各点滴は、約５００〜２０００mg(例えば、約５００〜５５０mg、５５０〜６００mg、６００〜６５０mg、６５０〜７００mg、７００〜７５０mg、７５０〜８００mg、８００〜８５０mg、８５０〜９００mg、９００〜９５０mg、９５０〜１０００mg、１０００〜１１００mg、１１００〜１２００mg、１２００〜１３００mg、１３００〜１４００mg、１４００〜１５００mg、１５００〜１６００mg、１６００〜１７００mg、１７００〜１８００mg、１８００〜１９００mgまたは１９００〜２０００mg)のリツキシマブを提供する。ある態様において、リツキシマブを、１５０mg／ｍ^２〜７５０mg／ｍ^２、例えば、約１５０〜１７５mg／ｍ^２、１７５〜２００mg／ｍ^２、２００〜２２５mg／ｍ^２、２２５〜２５０mg／ｍ^２、２５０〜３００mg／ｍ^２、３００〜３２５mg／ｍ^２、３２５〜３５０mg／ｍ^２、３５０〜３７５mg／ｍ^２、３７５〜４００mg／ｍ^２、４００〜４２５mg／ｍ^２、４２５〜４５０mg／ｍ^２、４５０〜４７５mg／ｍ^２、４７５〜５００mg／ｍ^２、５００〜５２５mg／ｍ^２、５２５〜５５０mg／ｍ^２、５５０〜５７５mg／ｍ^２、５７５〜６００mg／ｍ^２、６００〜６２５mg／ｍ^２、６２５〜６５０mg／ｍ^２、６５０〜６７５mg／ｍ^２または６７５〜７００mg／ｍ^２の用量で投与し、ここで、ｍ^２は対象の体表面積を示す。ある態様において、リツキシマブを、少なくとも４日、例えば、４日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日またはそれ以上の投薬間隔で投与する。例えば、リツキシマブを、少なくとも０.５週間、例えば、０.５週間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間またはそれ以上の投薬間隔で投与する。ある態様において、リツキシマブを、一定期間、例えば、少なくとも２週間、例えば、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間またはそれより長く、ここに記載する用量および投薬間隔で投与する。例えば、リツキシマブを、ここに記載する用量および投薬間隔で、処置サイクルあたり計少なくとも４投与で投与する(例えば、処置サイクルあたり少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６またはそれ以上の投与)。

ある態様において、抗ＣＤ２０抗体はオファツムマブを含む。オファツムマブは、分子量約１４９kDaを有する抗ＣＤ２０ＩｇＧ１κヒトモノクローナル抗体である。例えば、オファツムマブはトランスジェニックマウスおよびハイブリドーマテクノロジーを使用して産生し、組み換えマウス細胞株(ＮＳ０)から発現および精製する。例えば、www.accessdata.fda.gov／drugsatfda_docs／label／2009／125326lbl.pdf；およびClinical Trial Identifier number NCT01363128、NCT01515176、NCT01626352およびNCT01397591参照。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、オファツムマブと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、対象はＣＬＬまたはＳＬＬを有する。

ある態様において、オファツムマブを、静脈内点滴として投与する。例えば、各点滴は、約１５０〜３０００mg(例えば、約１５０〜２００mg、２００〜２５０mg、２５０〜３００mg、３００〜３５０mg、３５０〜４００mg、４００〜４５０mg、４５０〜５００mg、５００〜５５０mg、５５０〜６００mg、６００〜６５０mg、６５０〜７００mg、７００〜７５０mg、７５０〜８００mg、８００〜８５０mg、８５０〜９００mg、９００〜９５０mg、９５０〜１０００mg、１０００〜１２００mg、１２００〜１４００mg、１４００〜１６００mg、１６００〜１８００mg、１８００〜２０００mg、２０００〜２２００mg、２２００〜２４００mg、２４００〜２６００mg、２６００〜２８００mgまたは２８００〜３０００mg)のオファツムマブを投与する。ある態様において、オファツムマブを約３００mgの出発用量、続いて２０００mg、例えば、約１１用量、例えば、２４週間投与する。ある態様において、オファツムマブを、少なくとも４日、例えば、４日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日またはそれ以上の投薬間隔で投与する。例えば、オファツムマブを、少なくとも１週間、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、２４週間、２６週間、２８週間、２０週間、２２週間、２４週間、２６週間、２８週間、３０週間またはそれ以上の投薬間隔で投与する。ある態様において、オファツムマブを、一定期間、例えば、少なくとも１週間、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２２週間、２４週間、２６週間、２８週間、３０週間、４０週間、５０週間、６０週間またはそれ以上または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月またはそれ以上または１年、２年、３年、４年、５年またはそれ以上、ここに記載する用量および投薬間隔で投与する。例えば、オファツムマブを、処置サイクルあたり計少なくとも２用量で、ここに記載する用量および投薬間隔で投与する(例えば、処置サイクルあたり少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０またはそれ以上の用量)。

ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、オクレリズマブを含む。オクレリズマブは、例えば、Clinical Trials Identifier Nos. NCT00077870、NCT01412333、NCT00779220、NCT00673920、NCT01194570およびKappos et al. Lancet. 19.378(2011):1779-87に記載のような、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。

ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、ベルツズマブを含む。ベルツズマブは、ＣＤ２０に対するヒト化モノクローナル抗体である。例えば、Clinical Trial Identifier No. NCT00547066、NCT00546793、NCT01101581およびGoldenberg et al. Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55参照。

ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、ＧＡ１０１を含む。ＧＡ１０１(オビヌツズマブまたはＲＯ５０７２７５９とも称する)は、ヒト化および糖鎖改変抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96; Clinical Trial Identifier Numbers: NCT01995669、NCT01889797、NCT02229422およびNCT01414205; and www.accessdata.fda.gov／drugsatfda_docs／label／2013／125486s000lbl.pdf参照。

ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、ＡＭＥ−１３３ｖを含む。ＡＭＥ−１３３ｖ(ＬＹ２４６９２９８またはオカラツズマブとも称する)は、リツキシマブと比較してＦｃγＲIIIａ受容体に対する親和性が増加し、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)活性が増強された、ＣＤ２０に対するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; and Forero-Torres et al. Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403参照。

ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、ＰＲＯ１３１９２１を含む。ＰＲＯ１３１９２１は、リツキシマブと比較してＦｃγＲIIIａへの結合が良好であり、ＡＤＣＣが増強されるように操作された、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; およびCasulo et al. Clin Immunol. 154.1(2014):37-46;およびClinical Trial Identifier No. NCT00452127参照。

ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、ＴＲＵ−０１５を含む。ＴＲＵ−０１５は、ＣＤ２０に対する抗体のドメイン由来の抗ＣＤ２０融合タンパク質である。ＴＲＵ−０１５はモノクローナル抗体より小さいが、Ｆｃ介在エフェクター機能を保持する。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25参照。ＴＲＵ−０１５は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ_２およびＣＨ３ドメインに連結した抗ＣＤ２０一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)を含むが、ＣＨ１およびＣＬドメインを欠く。

ある態様において、ここに記載する抗ＣＤ２０抗体を、治療剤、例えば、ここに記載する化学療法剤(例えば、シトキサン、フルダラビン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、デメチル化剤、ペプチドワクチン、抗腫瘍抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、アルキル化剤、抗微小管または有糸分裂阻害剤)、抗アレルギー剤、制吐剤(または鎮吐剤)、鎮痛剤または細胞保護的薬剤にコンジュゲートまたは他の方法で結合する。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、Ｂ細胞リンパ腫２(ＢＣＬ−２)阻害剤(例えば、ＡＢＴ−１９９またはＧＤＣ−０１９９とも称されるベネトクラクス)および／またはリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ベネトクラクスおよびリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ベネトクラクスは、抗アポトーシスタンパク質、ＢＣＬ−２を阻害する小分子である。ベネトクラクス(４−(４−{[２−(４−クロロフェニル)−４,４−ジメチルシクロｈｅｘ−１−エン−１−イル]メチル}ピペラジン−１−イル)−Ｎ−({３−ニトロ−４−[(テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イルメチル)アミノ]フェニル}スルホニル)−２−(１Ｈ−ピロロ[２,３−ｂ]ピリジン−５−イルオキシ)ベンズアミド)の構造を下に示す。

ある態様において、対象はＣＬＬを有する。ある態様において、対象は再発したＣＬＬを有し、例えば、対象は、先に癌治療を投与されている。ある態様において、ベネトクラクスを、約１５〜６００mg(例えば、１５〜２０mg、２０〜５０mg、５０〜７５mg、７５〜１００mg、１００〜２００mg、２００〜３００mg、３００〜４００mg、４００〜５００mgまたは５００〜６００mg)、例えば、連日投与する。ある態様において、リツキシマブを、約３５０〜５５０mg／ｍ^２(例えば、３５０〜３７５mg／ｍ^２、３７５〜４００mg／ｍ^２、４００〜４２５mg／ｍ^２、４２５〜４５０mg／ｍ^２、４５０〜４７５mg／ｍ^２または４７５〜５００mg／ｍ^２)を、例えば、静脈内で、例えば、毎月投与する。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせて投与する。ある態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞内で選択的に複製し、その死を誘発するかまたは増殖を遅延することができる。ある場合、腫瘍溶解性ウイルスは、非癌細胞に効果を有しないか効果が最小である。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性レトロウイルス、腫瘍溶解性パルボウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルスまたは腫瘍溶解性ＲＮＡウイルス(例えば、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス(ＮＤＶ)、腫瘍溶解性麻疹ウイルスまたは腫瘍溶解性水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ))を含むが、これらに限定されない。

ある態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、その全体を引用により本明細書に包含させるＵＳ２０１０／０１７８６８４Ａ１号に記載のウイルス、例えば、組み換え腫瘍溶解性ウイルスである。ある態様において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、その全体を引用により本明細書に包含させるＵＳ２０１０／０１７８６８４Ａ１号に記載のような、免疫または炎症性応答の阻害剤をコードする核酸配列(例えば、異種核酸配列)を含む。ある態様において、組み換え腫瘍溶解性ウイルス、例えば、腫瘍溶解性ＮＤＶは、アポトーシス促進性タンパク質(例えば、アポプチン)、サイトカイン(例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロン−ガンマ、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、腫瘍壊死因子−アルファ)、免疫グロブリン(例えば、ＥＤ−Ｂフィブロネクチンに対する抗体)、腫瘍関連抗原、二特異性アダプタータンパク質(例えば、ＮＤＶＨＮタンパク質およびＣＤ３またはＣＤ２８のようなＴ細胞共刺激性受容体に対する二特異性抗体または抗体フラグメント；またはヒトＩＬ−２およびＮＤＶＨＮタンパク質に対する一本鎖抗体の融合タンパク質)を含む。例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させるZamarin et al. Future Microbiol. 7.3(2012):347-67参照。ある態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、各々引用によりその全体を本明細書に包含させるＵＳ８５９１８８１Ｂ２号、ＵＳ２０１２／０１２２１８５Ａ１号またはＵＳ２０１４／０２７１６７７Ａ１号に記載のキメラ腫瘍溶解性ＮＤＶである。

ある態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、排他的に癌細胞において複製するよう設計された、条件的複製アデノウイルス(ＣＲＡｄ)である。例えば、Alemany et al. Nature Biotechnol. 18(2000):723-27参照。ある態様において、腫瘍溶解性アデノウイルスは、その全体を引用により本明細書に包含させるAlemany et al.の７２５頁の表１に記載のものを含む。

腫瘍溶解性ウイルスの例は、次のものを含むが、これらに限定されない。
Ｂ群腫瘍溶解性アデノウイルス(ColoAd1)(PsiOxus Therapeutics Ltd.)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT02053220参照)；
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)を含むアデノウイルスであるＯＮＣＯＳ−１０２(以前はＣＧＴＧ−１０２と呼ばれた)(Oncos Therapeutics)(例えば、 Clinical Trial Identifier: NCT01598129参照)；
ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼをコードする遺伝的に修飾された腫瘍溶解性ヒトアデノウイルスであるＶＣＮ−０１(VCN Biosciences, S.L.)(例えば、Clinical Trial Identifiers: NCT02045602およびNCT02045589参照)；
網膜芽細胞腫／Ｅ２Ｆ経路の脱制御を伴い癌細胞で選択的に複製するように修飾されている野生型ヒトアデノウイルス血清型５(Ｈａｄ５)由来のウイルスである条件的複製アデノウイルスＩＣＯＶＩＲ−５(Institut Catala d'Oncologia)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT01864759参照)；
ＩＣＯＶＩＲ５、腫瘍溶解性アデノウイルスで感染させた骨髄由来自己間葉性幹細胞(ＭＳＣ)を含むCelyvir(Hospital Infantil Universitario Nino Jesus, Madrid, Spain／Ramon Alemany)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT01844661参照)；
ヒトＥ２Ｆ−１プロモーターが必須Ｅ１ａウイルス遺伝子の発現を駆動し、それによりＲｂ経路欠損腫瘍細ウイルス複製および細胞毒性を制限する、条件複製腫瘍溶解性血清型５アデノウイルス(Ａｄ５)であるＣＧ００７０胞に対する(Cold Genesys, Inc.)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT02143804参照)；または
路網膜芽細胞腫(Ｒｂ)経路欠損細胞で選択的に複製し、ある種のＲＧＤ結合インテグリンをより効率的に発現する細胞に感染するように操作されているアデノウイルスであるＤＮＸ−２４０１(以前の名前デルタ−２４−ＲＧＤ)(Clinica Universidad de Navarra, Universidad de Navarra／ DNAtrix, Inc.)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT01956734参照)。

ある態様において、ここに記載する腫瘍溶解性ウイルスを、注射、例えば、皮下、動脈内、静脈内、筋肉内、髄腔内または腹腔内注射により投与する。ある態様において、ここに記載する腫瘍溶解性ウイルスを、腫瘍内、経皮、経粘膜、経口、鼻腔内または肺投与により投与する。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、Ｔ_ｒｅｇ細胞集団を減少させる分子と組み合わせて対象に投与する。Ｔ_ｒｅｇ細胞数を減らす(例えば、枯渇させる)方法は当分野で知られ、例えば、ＣＤ２５枯渇、シクロホスファミド投与、ＧＩＴＲ機能修飾を含む。理論に縛られることを望まないが、アフェレーシス前またはここに記載するＣＡＲ発現細胞投与前に対象におけるＴ_ｒｅｇ細胞数を減らすことは、腫瘍微小環境における望まない免疫細胞(例えば、Ｔ_ｒｅｇ)の数を減らし、対象の再発のリスクを減らすと考えられる。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象に、制御性Ｔ細胞(Ｔ_ｒｅｇ)を枯渇させるＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＧＩＴＲ抗体のようなＧＩＴＲを標的とするおよび／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、対象にシクロホスファミドと組み合わせて投与する。ある態様において、ＧＩＴＲ結合分子および／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子(例えば、ＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＴ_ｒｅｇ枯渇ＧＩＴＲ抗体)を、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、細胞のアフェレーシス前に投与できる。ある態様において、シクロホスファミドを、対象にＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入または再注入)前または細胞のアフェレーシス前に投与する。ある態様において、シクロホスファミドおよび抗ＧＩＴＲ抗体を、対象にＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入または再注入)前または細胞のアフェレーシス前に投与する。ある態様において、対象は癌(例えば、固形癌またはＡＬＬまたはＣＬＬのような血液癌)を有する。ある態様において、対象はＣＬＬを有する。ある態様において、対象はＡＬＬを有する。ある態様において、対象は固形癌、例えば、ここに記載する固形癌を有する。ＧＩＴＲアゴニストの例は、例えば、米国特許６,１１１,０９０号、欧州特許０９０５０５Ｂ１号、米国特許８,５８６,０２３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／００３１１８号および２０１１／０９０７５４号に記載のＧＩＴＲ融合タンパク質または、例えば、米国特許７,０２５,９６２号、欧州特許１９４７１８３Ｂ１号、米国特許７,８１２,１３５号、米国特許８,３８８,９６７号、米国特許８,５９１,８８６号、欧州特許ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０２８６８３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３９９５４号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３３８２２号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４０１９６号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００１／０３７２０号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０７５８号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１１５４５１号、米国特許７,６１８,６３２号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０５１７２６号に記載のような抗ＧＩＴＲ抗体のような、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体(例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体)を含む。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ここに記載するＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、細胞のアフェレシス前に投与できる。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスのようなラパログと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤を、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤を、細胞のアフェレーシス前に投与できる。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、例えば、ここに記載するタンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ−１阻害剤、例えば、スチボグルコン酸ナトリウムのような、例えば、ここに記載するＳＨＰ−１阻害剤である。ある態様において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤はＳＨＰ−２阻害剤である。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、キナーゼ阻害剤と組み合わせて使用できる。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、ここに記載するＣＤＫ４阻害剤、例えば、６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−(５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ)−８Ｈ−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−オン、ヒドロクロライド(パルボシクリブまたはＰＤ０３３２９９１とも呼ばれる)のような、例えば、ＣＤ４／６阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブのような、例えば、ここに記載するＢＴＫ阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシンアナログ、ＯＳＩ−０２７のような、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤であり売る。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば、４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンのような、例えば、ここに記載するＭＮＫ阻害剤である。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ、ＭＮＫ１ｂ、ＭＮＫ２ａおよび／またはＭＮＫ２ｂ阻害剤であり得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＤＧＫ阻害剤、例えば、ＤＧＫｉｎｈ１(Ｄ５９１９)またはＤＧＫｉｎｈ２(Ｄ５７９４)のような、例えば、ここに記載するＤＧＫ阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、アロイシンＡ；フラボピリドールまたはＨＭＲ−１２７５、２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(３Ｓ,４Ｒ)−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル]−４−クロメノン；クリゾチニブ(ＰＦ−０２３４１０６６；２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(２Ｒ,３Ｓ)−２−(ヒドロキシメチル)−１−メチル−３−ピロリジニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、ヒドロクロライド(Ｐ２７６−００)；１−メチル−５−[[２−[５−(トリフルオロメチル)−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]−４−ピリジニル]オキシ]−Ｎ−[４−(トリフルオロメチル)フェニル]−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン(ＲＡＦ２６５)；インジスラム(Ｅ７０７０)；ロスコビチン(ＣＹＣ２０２)；パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)；ジナシクリブ(ＳＣＨ７２７９６５)；Ｎ−[５−[[(５−ｔｅｒｔ−ブチルオキサゾール−２−イル)メチル]チオ]チアゾール−２−イル]ピペリジン−４−カルボキサミド(ＢＭＳ３８７０３２)；４−[[９−クロロ−７−(２,６−ジフルオロフェニル)−５Ｈ−ピリミド[５,４−ｄ][２]ベンズアゼピン−２−イル]アミノ]−安息香酸(MLＮ８０５４)；５−[３−(４,６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル)−１Ｈ−インダゾール−５−イル]−Ｎ−エチル−４−メチル−３−ピリジンメタンアミン(ＡＧ−０２４３２２)；４−(２,６−ジクロロベンゾイルアミノ)−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸Ｎ−(ピペリジン−４−イル)アミド(ＡＴ７５１９)；４−[２−メチル−１−(１−メチルエチル)−１Ｈ−イミダゾール−５−イル]−Ｎ−[４−(メチルスルホニル)フェニル]−２−ピリミジンアミン(ＡＺＤ５４３８)；およびＸＬ２８１(ＢＭＳ９０８６６２)から選択されるＣＤＫ４阻害剤である。

ある態様において、キナーゼ阻害剤はＣＤＫ４阻害剤、例えば、パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)であり、パルボシクリブを、一定期間、１日約５０mg、６０mg、７０mg、７５mg、８０mg、９０mg、１００mg、１０５mg、１１０mg、１１５mg、１２０mg、１２５mg、１３０mg、１３５mg(例えば、７５mg、１００mgまたは１２５mg)の用量で、例えば、２８日サイクルの１４〜２１日間連日または２１日サイクルの７〜１２日間連日投与する。ある態様において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクルまたはそれ以上のパルボシクリブを投与する。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、サイクリン依存性キナーゼ(ＣＤＫ)４または６阻害剤、例えば、ここに記載するＣＤＫ４阻害剤またはＣＤＫ６阻害剤と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＤＫ４／６阻害剤(例えば、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の両者を標的とする阻害剤)、例えば、ここに記載するＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、対象は、ＭＣＬを有する。ＭＣＬは、現在利用可能な治療にはほとんど応答しない、すなわち、本質的に不治の侵襲性癌である。ＭＣＬの多くの症例で、サイクリンＤ１(ＣＤＫ４／６のレギュレーター)が、ＭＣＬ細胞で発現される(例えば、免疫グロブリンおよびサイクリンＤ１遺伝子が関与する染色体転座のため)。それゆえに、理論に縛られないが、ＭＣＬ細胞は、高特異性(すなわち、正常免疫細胞に対する最小限の影響)でＣＤＫ４／６阻害に高度に感受性であると考えられる。ＣＤＫ４／６阻害剤単独で、ＭＣＬの処置にいくぶん有効性を有しているが、部分的寛解しか達成されず、高再発率である。ＣＤＫ４／６阻害剤の例はＬＥＥ０１１(リボシクリブ)であり、その構造を下に示す。

理論に縛られないが、ここに記載するＣＡＲ発現細胞とＣＤＫ４／６阻害剤(例えば、ＬＥＥ０１１または他のここに記載するＣＤＫ４／６阻害剤)の投与は、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤単独と比較して、高い応答性、例えば、高い寛解率および／または低い再発率を達成すると考えられる。

ある態様において、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)；ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択されるＢＴＫ阻害剤である。好ましい態様において、ＢＴＫ阻害剤はインターロイキン−２−誘導性キナーゼ(ＩＴＫ)のキナーゼ活性を低減または阻害せず、ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択される。

ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)である。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＢＴＫ阻害剤(例えば、イブルチニブ)と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５とも称す)と組み合わせて対象に投与する。イブルチニブ(１−[(３Ｒ)−３−[４−アミノ−３−(４−フェノキシフェニル)−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−１−イル]ピペリジン−１−イル]プロプ−２−エン−１−オン)の構造を下に示す。

ある態様において、対象はＣＬＬ、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)または小リンパ球性リンパ腫(ＳＬＬ)を有する。例えば、対象は、染色体１７の短腕に欠失を有する(例えば、白血病性細胞におけるｄｅｌ(１７ｐ))。他の例において、対象は、ｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある態様において、対象は再発したＣＬＬまたはＳＬＬを有し、例えば、対象は、先に癌治療を投与されている(例えば、先に１、２、３または４癌治療を投与されている)。ある態様において、対象は、難治性ＣＬＬまたはＳＬＬを有する。他の態様において、対象は、濾胞性リンパ腫、例えば、再発性または難治性濾胞性リンパ腫を有する。ある態様において、イブルチニブを、約３００〜６００mg／日(例えば、約３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０または５５０〜６００mg／日、例えば、約４２０mg／日または約５６０mg／日)、例えば、経口。ある態様において、イブルチニブを、約２５０mg、３００mg、３５０mg、４００mg、４２０mg、４４０mg、４６０mg、４８０mg、５００mg、５２０mg、５４０mg、５６０mg、５８０mg、６００mg(例えば、２５０mg、４２０mgまたは５６０mg)の用量で、連日一定期間、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクルまたはそれ以上のイブルチニブを投与する。

ある態様において、イブルチニブを、リツキシマブと組み合わせて投与する。例えば、Burger et al. (2013) Ibrutinib In Combination With Rituximab (iR) Is Well Tolerated and Induces a High Rate Of Durable Remissions In Patients With High-Risk Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL): New, Updated Results Of a Phase II Trial In 40 Patients, Abstract 675 presented at 55^th ASH Annual Meeting and Exposition, New Orleans, LA 7-10 Dec参照。理論に縛られないが、イブルチニブの添加はＴ細胞増殖性応答を増強し、Ｔ細胞をＴ−ヘルパー−２(Ｔｈ２)からＴ−ヘルパー−１(Ｔｈ１)表現型にシフトさせると考えられる。Ｔｈ１およびＴｈ２は、ヘルパーＴ細胞の表現型であり、Ｔｈ１とＴｈ２で異なる免疫応答経路を指向する。Ｔｈ１表現型は、例えば、細胞内病原体／ウイルスまたは癌性細胞のような細胞を殺すための、炎症誘発性応答または自己免疫性応答永続化と関係する。Ｔｈ２表現型は、好酸球蓄積および抗炎症性応答と関係する。

ここでの方法、使用および組成物のある態様において、ＢＴＫ阻害剤は、引用によりその全体を本明細書に包含させる国際出願ＷＯ／２０１５／０７９４１７号に記載のＢＴＫ阻害剤である。例えば、ある態様において、ＢＴＫ阻害剤は、式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩である。
〔式中、
Ｒ１は水素、場合によりヒドロキシで置換されていてよいＣ_１−Ｃ_６アルキルであり；
Ｒ２は水素またはハロゲンであり；
Ｒ３は水素またはハロゲンであり；
Ｒ４は水素であり、
Ｒ５は水素またはハロゲンであり；
またはＲ４とＲ５は互いに結合し、結合、−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_２−；−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ−；または−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−を意味し；
Ｒ６およびＲ７は互いに独立してＨ、場合によりヒドロキシで置換されていてよいＣ_１−Ｃ_６アルキル、場合によりハロゲンまたはヒドロキシまたはハロゲンで置換されていてよいＣ３−Ｃ６シクロアルキルであり；
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ、Ｒ’、Ｒ１０およびＲ１１は互いに独立してＨまたは場合によりＣ_１−Ｃ_６アルコキシで置換されていてよいＣ_１−Ｃ_６アルキルであり；またはＲ８、Ｒ９、Ｒ、Ｒ’、Ｒ１０およびＲ１１のいずれかの２個は、それらが結合している炭素原子と一体となって３〜６員飽和炭素環式環を形成してよく；
Ｒ１２は水素または場合によりハロゲンもしくはＣ_１−Ｃ_６アルコキシで置換されていてよいＣ_１−Ｃ_６アルキルであり；
またはＲ１２とＲ８、Ｒ９、Ｒ、Ｒ’、Ｒ１０またはＲ１１のいずれか一つは、それらが結合している原子と一体となって、４員、５員、６員または７員アザシクロ環を形成してよく、該環は場合によりハロゲン、シアノ、ヒドロキシル、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルまたはＣ_１−Ｃ_６アルコキシで置換されていてよく；
ｎは０または１であり；
Ｒ１３は場合によりＣ_１−Ｃ_６アルキルで置換されていてよいＣ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシまたは場合によりＣ_１−Ｃ_６アルキルもしくはＣ_１−Ｃ_６アルコキシで置換されていてよいＮ,Ｎ−ジ−Ｃ_１−Ｃ_６アルキルアミノＣ_２−Ｃ_６アルキニル；または場合によりＣ_１−Ｃ_６アルキルで置換されていてよいＣ_２−Ｃ_６アルキレニルオキシドである。〕。

ある態様において、式ＩのＢＴＫ阻害剤は、Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−３−イル)オキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｅ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−(ブト−２−エノイル)アゼチジン−３−イル)オキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−プロピオロイルアゼチジン−３−イル)オキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−(ブト−２−イノイル)アゼチジン−３−イル)オキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルピペリジン−４−イル)オキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルアクリルアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｅ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルブト−２−エンアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルプロピオｌアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｅ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(４−メトキシ−Ｎ−メチルブト−２−エンアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルブト−２−インアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(２−((４−アミノ−６−(３−(４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)ピリミジン−５−イル)オキシ)エチル)−Ｎ−メチルオキシラン−２−カルボキサミド；Ｎ−(２−((４−アミノ−６−(３−(６−シクロプロピル−８−フルオロ−１−オキソイソキノリン−２(１Ｈ)−イル)フェニル)ピリミジン−５−イル)オキシ)エチル)−Ｎ−メチルアクリルアミド；Ｎ−(３−(５−(２−アクリルアミドエトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−エチルアクリルアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−(２−フルオロエチル)アクリルアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−((１−アクリルアミドシクロプロピル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(５−(２−アクリルアミドプロポキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(ブト−２−インアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルアクリルアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルブト−２−インアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(３−(Ｎ−メチルアクリルアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−(ブト−２−イノイル)ピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−２−(３−(５−((１−アクリロイルピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)−６−シクロプロピル−３,４−ジヒドロイソキノリン−１(２Ｈ)−オンＮ−(２−((４−アミノ−６−(３−(６−シクロプロピル−１−オキソ−３,４−ジヒドロイソキノリン−２(１Ｈ)−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)ピリミジン−５−イル)オキシ)エチル)−Ｎ−メチルアクリルアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−(ブト−２−イノイル)−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；２−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)−６−シクロプロピル−３,４−ジヒドロイソキノリン−１(２Ｈ)−オンＮ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｓ)−１−アクリロイル−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(((２Ｓ,４Ｓ)−１−(ブト−２−イノイル)−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−フルオロピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−(ブト−２−イノイル)−４−フルオロピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−プロピオロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−２−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)−６−シクロプロピル−３,４−ジヒドロイソキノリン−１(２Ｈ)−オン；(Ｒ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｒ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルピペリジン−３−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｒ,３Ｓ)−１−アクリロイル−３−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−シアノピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；またはＮ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｓ)−１−アクリロイル−４−シアノピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミドから選択される。

特に断らない限り、上記式ＩのＢＴＫ阻害剤で使用した化学的用語は、引用によりその全体を本明細書に包含させる国際出願ＷＯ／２０１５／０７９４１７号に示す意味に従い使用する。

ある態様において、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス；リダフォロリムス(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ、２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０^４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られる；エベロリムス(ＲＡＤ００１)；ラパマイシン(ＡＹ２２９８９)；セマピモド；(５−{２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(ＡＺＤ８０５５)；２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ０４６９１５０２)；およびＮ^２−[１,４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−(配列番号６４)、分子内塩(ＳＦ１１２６)；およびＸＬ７６５から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である。

ある態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンを、約３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg(例えば、６mg)の用量で連日、一定期間、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクルまたはそれ以上のラパマイシンを投与する。ある態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスを、一定期間、１日約２mg、２.５mg、３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg、１１mg、１２mg、１３mg、１４mg、１５mg(例えば、１０mg)の用量で、例えば、２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクルまたはそれ以上のエベロリムスを投与する。

ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＧＰ０５２０８８；４−アミノ−３−(ｐ−フルオロフェニルアミノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン(ＣＧＰ５７３８０)；セルコスポラミド；ＥＴＣ−１７８０４４５〜２；および４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンから選択されるＭＮＫ阻害剤である。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ホスホイノシチド３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)阻害剤(例えば、ここに記載するＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば、イデラリシブまたはドゥベリシブ)および／またはリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、イデラリシブおよびリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ドゥベリシブおよびリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。イデラリシブ(ＧＳ−１１０１またはＣＡＬ−１０１とも呼ばれる；Gilead)は、ＰＩ３Ｋのデルタアイソフォームを遮断する小分子である。イデラリシブ(５−フルオロ−３−フェニル−２−[(１Ｓ)−１−(７Ｈ−プリン−６−イルアミノ)プロピル]−４(３Ｈ)−キナゾリノン)の構造を下に示す。

ドゥベリシブ(ＩＰＩ−１４５とも呼ばれる；Infinity PharmaceuticalsおよびAbbvie)は、ＰＩ３Ｋ−δ,γを遮断する小分子である。ドゥベリシブ(８−クロロ−２−フェニル−３−[(１Ｓ)−１−(９Ｈ−プリン−６−イルアミノ)エチル]−１(２Ｈ)−イソキノリノン)の構造を下に示す。

ある態様において、対象はＣＬＬを有する。ある態様において、対象は再発したＣＬＬを有し、例えば、対象は、先に癌治療を投与されている(例えば、先に抗ＣＤ２０抗体を投与されているかまたは先にイブルチニブを投与されている)。例えば、対象は、染色体１７の短腕に欠失を有する(例えば、白血病性細胞におけるｄｅｌ(１７ｐ))。他の例において、対象は、ｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶ_Ｈ)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含む。他の態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶ_Ｈ)に変異を含む白血病性細胞を含まない。ある態様において、対象は、染色体１１の長腕に欠失を有する(ｄｅｌ(１１ｑ))。他の態様において、対象はｄｅｌ(１１ｑ)を有しない。ある態様において、イデラリシブを、約１００〜４００mg(例えば、１００〜１２５mg、１２５〜１５０mg、１５０〜１７５mg、１７５〜２００mg、２００〜２２５mg、２２５〜２５０mg、２５０〜２７５mg、２７５〜３００mg、３２５〜３５０mg、３５０〜３７５mgまたは３７５〜４００mg)、例えば、ＢＩＤ投与する。ある態様において、ドゥベリシブを、約１５〜１００mg(例えば、約１５〜２５、２５〜５０、５０〜７５または７５〜１００mg)、例えば、１日２回投与する。ある態様において、リツキシマブを、約３５０〜５５０mg／ｍ^２(例えば、３５０〜３７５mg／ｍ^２、３７５〜４００mg／ｍ^２、４００〜４２５mg／ｍ^２、４２５〜４５０mg／ｍ^２、４５０〜４７５mg／ｍ^２または４７５〜５００mg／ｍ^２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。

ある態様において、キナーゼ阻害剤は、２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ−０４６９１５０２)；Ｎ−[４−[[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]カルボニル]フェニル]−Ｎ’−[４−(４,６−ジ−４−モルホリニル−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素(ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７)；２−メチル−２−{４−[３−メチル−２−オキソ−８−(キノリン−３−イル)−２,３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル]フェニル}プロパンニトリル(ＢＥＺ−２３５)；アピトリシブ(ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２)；２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−(メチルオキシ)−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミド(ＧＳＫ２１２６４５８)；８−(６−メトキシピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−(ピペラジン−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル)−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−オンマレイン酸(ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６)；３−[４−(４−モルホリニルピリド[３’,２’：４,５]フロ[３,２−ｄ]ピリミジン−２−イル]フェノール(ＰＩ−１０３)；５−(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＶＳ−５５８４、ＳＢ２３４３)；およびＮ−[２−[(３,５−ジメトキシフェニル)アミノ]キノキサリン−３−イル]−４−[(４−メチル−３−メトキシフェニル)カルボニル]アミノフェニルスルホンアミド(ＸＬ７６５)から選択されるデュアルホスファチジルイノシトール３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)およびｍＴＯＲ阻害剤である。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、未分化リンパ腫キナーゼ(ＡＬＫ)阻害剤と組み合わせて対象に投与する。ＡＬＫキナーゼの例は、クリゾチニブ(Pfizer)、セリチニブ(Novartis)、アレクチニブ(中外)、ブリガチニブ(ＡＰ２６１１３とも呼ばれる；Ariad)、エントレクチニブ(Ignyta)、ＰＦ−０６４６３９２２(Pfizer)、ＴＳＲ−０１１(Tesaro)(例えば、Clinical Trial Identifier No. NCT02048488参照)、ＣＥＰ−３７４４０(Teva)およびＸ−３９６(Xcovery)を含む。ある態様において、対象は固形癌、例えば、ここに記載する固形癌、例えば、肺癌を有する。

クリゾチニブの化学名は３−[(１Ｒ)−１−(２,６−ジクロロ−３−フルオロフェニル)エトキシ]−５−(１−ピペリジン−４−イルピラゾール−４−イル)ピリジン−２−アミンである。セリチニブの化学名は５−クロロ−Ｎ^２−[２−イソプロポキシ−５−メチル−４−(４−ピペリジニル)フェニル]−Ｎ^４−[２−(イソプロピルスルホニル)フェニル]−２,４−ピリミジンジアミンである。アレクチニブの化学名は９−エチル−６,６−ジメチル−８−(４−モルホリノピペリジン−１−イル)−１１−オキソ−６,１１−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ[ｂ]カルバゾール−３−カルボニトリルである。ブリガチニブの化学名は５−クロロ−Ｎ^２−{４−[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]−２−メトキシフェニル}−Ｎ^４−[２−(ジメチルホスホリル)フェニル]−２,４−ピリミジンジアミンである。エントレクチニブの化学名はＮ−(５−(３,５−ジフルオロベンジル)−１Ｈ−インダゾール−３−イル)−４−(４−メチルピペラジン−１−イル)−２−((テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル)アミノ)ベンズアミドである。ＰＦ−０６４６３９２２の化学名は(１０Ｒ)−７−アミノ−１２−フルオロ−２,１０,１６−トリメチル−１５−オキソ−１０,１５,１６,１７−テトラヒドロ−２Ｈ−８,４−(メテノ)ピラゾロ[４,３−ｈ][２,５,１１]−ベンズオキサジアザシクロテトラデシン−３−カルボニトリルである。ＣＥＰ−３７４４０の化学名は(Ｓ)−２−((５−クロロ−２−((６−(４−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−１−イル)−１−メトキシ−６,７,８,９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ[７]アヌレン−２−イル)アミノ)ピリミジン−４−イル)アミノ)−Ｎ−メチルベンズアミドである。Ｘ−３９６の化学名は(Ｒ)−６−アミノ−５−(１−(２,６−ジクロロ−３−フルオロフェニル)エトキシ)−Ｎ−(４−(４−メチルピペラジン−１−カルボニル)フェニル)ピリダジン−３−カルボキサミドである。

カルシウム依存的ホスファターゼカルシニューリンを阻害する(シクロスポリンおよびＦＫ５０６)または増殖因子誘発シグナル伝達に重要であるｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する薬物(ラパマイシン)(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)も使用できる。さらなる面において、本発明の細胞組成物を、患者に骨髄移植、フルダラビンのような化学療法剤、体外照射療法(ＸＲＴ)、シクロホスファミドおよび／またはＯＫＴ３またはキャンパスのような抗体を使用するＴ細胞除去療法と組み合わせて(例えば、前に、同時にまたは後に)投与し得る。ある面において、本発明の細胞組成物を、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなＢ細胞除去療法後に投与する。例えば、ある態様において、対象を、高用量化学療法剤と続く末梢血幹細胞移植の標準的処置に付す。ある態様において、移植後、対象は、本発明の増殖した免疫細胞の注入を受ける。さらなる態様において、増殖細胞を手術の前または後に投与する。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、インドールアミン２,３−ジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)阻害剤と組み合わせて対象に投与する。ＩＤＯは、アミノ酸、Ｌ−トリプトファンのキヌレニンへの分解を触媒する酵素である。多くの癌、例えば、前立腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮頸癌、胃癌、卵巣癌、頭部癌および肺癌がＩＤＯを過発現する。ｐＤＣ、マクロファージおよび樹状細胞(ＤＣ)がＩＤＯを発現できる。理論に縛られないが、Ｌ−トリプトファンの減少(例えば、ＩＤＯによる触媒)が、Ｔ細胞アネルギーおよびアポトーシスの誘発による免疫抑制性環境をもたらすと考えられる。それゆえに、理論に縛られないが、ＩＤＯ阻害剤が、例えば、ＣＡＲ発現免疫細胞の抑制または死を減少させることによりここに記載するＣＡＲ発現細胞の効果を増強できると考えられる。ある態様において、対象は、固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、前立腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮頸癌、胃癌、卵巣癌、頭部癌または肺癌を有する。ＩＤＯ阻害剤の例は、１−メチル−トリプトファン、インドキシモド(NewLink Genetics)(例えば、Clinical Trial Identifier Nos. NCT01191216; NCT01792050参照)およびＩＮＣＢ０２４３６０(Incyte Corp.)(例えば、Clinical Trial Identifier Nos. NCT01604889; NCT01685255参照)を含むが、これらに限定されない。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、骨髄由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)のモジュレーターと組み合わせて対象に投与する。ＭＤＳＣは、末梢および多くの固形腫瘍の腫瘍部位に蓄積する。これらの細胞はＴ細胞応答を抑制し、それによりＣＡＲ発現細胞療法の効果を障害する。理論に縛られないが、ＭＤＳＣモジュレーター投与は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の効果を増強すると考えられる。ある態様において、対象は、固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、神経膠芽腫を有する。ＭＤＳＣのモジュレーターの例は、ＭＣＳ１１０およびＢＬＺ９４５を含むが、これらに限定されない。ＭＣＳ１１０は、マクロファージコロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ)に対するモノクローナル抗体(ｍＡｂ)である。例えば、Clinical Trial Identifier No. NCT00757757参照。ＢＬＺ９４５は、コロニー刺激因子１受容体(ＣＳＦ１Ｒ)の小分子阻害剤である。例えば、Pyonteck et al. Nat. Med. 19(2013):1264-72参照。ＢＬＺ９４５の構造を下に示す。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、免疫抑制性形質細胞の活性を阻止または低減する薬剤と組み合わせて対象に投与する。免疫抑制性形質細胞は、オキサリプラチンのようなＴ細胞依存性免疫原性化学療法を妨害することが示されている(Shalapour et al., Nature 2015, 521:94-101)。ある態様において、免疫抑制性形質細胞は、ＩｇＡ、インターロイキン(ＩＬ)−１０およびＰＤ−Ｌ１の１以上を発言できる。ある態様において、薬剤はＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞またはＢＣＭＡＣＡＲ発現細胞である。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、インターロイキン−１５(ＩＬ−１５)ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体アルファ(ＩＬ−１５Ｒａ)ポリペプチドまたは両者の組み合わせ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５(Admune Therapeutics, LLC)と組み合わせて対象に投与する。ｈｅｔＩＬ−１５は、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒａのヘテロ二量体非共有複合体である。ｈｅｔＩＬ−１５は、例えば、引用により本明細書に包含させる米国８,１２４,０８４、米国２０１２／０１７７５９８号、米国２００９／００８２２９９号、米国２０１２／０１４１４１３号および米国２０１１／００８１３１１号に記載されている。ある態様において、ｈｅｔ−ＩＬ−１５を皮下投与する。ある態様において、対象は、癌、例えば、固形癌、例えば、黒色腫または結腸癌を有する。ある態様において、対象は、転移癌を有する。

ある態様において、ここに記載する疾患、例えば、血液学的障害、例えば、ＡＭＬまたはＭＤＳを有する対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、薬剤、例えば、細胞毒性または化学療法剤、生物学的治療(例えば、抗体、例えば、モノクローナル抗体または細胞療法)または阻害剤(例えば、キナーゼ阻害剤)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、細胞毒性剤、例えば、ＣＰＸ−３５１(Celator Pharmaceuticals)、シタラビン、ダウノルビシン、ボサロキシン(Sunesis Pharmaceuticals)、サパシタビン(Cyclacel Pharmaceuticals)、イダルビシンまたはミトキサントロンと組み合わせて投与される。ＣＰＸ−３５１は、シタラビンおよびダウノルビシンを５：１モル比で含むリポソーム製剤である。ある態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、低メチル化剤、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、アザシチジンまたはデシタビンと組み合わせて投与する。ある態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、生物学的治療、例えば、抗体または細胞療法、例えば、２２５Ａｃ−リンツズマブ(Ａｃｔｉｍａｂ−Ａ; Actinium Pharmaceuticals)、ＩＰＨ２１０２(Innate Pharma／Bristol Myers Squibb)、ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ(Seattle Genetics)またはゲムツズマブオゾガマイシン(マイロターグ；Pfizer)と組み合わせて投与する。ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａは、抗ＣＤ３３抗体に結合するピロロベンゾジアゼピン二量体を含む抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)である。Ａｃｔｉｍａｂ−Ａは、アクチニウムで標識された抗ＣＤ３３抗体(リンツズマブ)である。ＩＰＨ２１０２は、キラー免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)を標的とするモノクローナル抗体である。ある態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＦＬＴ３阻害剤、例えば、ソラフェニブ(Bayer)、ミドスタウリン(Novartis)、キザルチニブ(第一三共)、クレノラニブ(Arog Pharmaceuticals)、ＰＬＸ３３９７(第一三共)、ＡＫＮ−０２８(Akinion Pharmaceuticals)またはＡＳＰ２２１５(アステラス)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(ＩＤＨ)阻害剤、例えば、ＡＧ−２２１(Celgene／Agios)またはＡＧ−１２０(Agios／Celgene)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、細胞サイクルレギュレーター、例えば、ポロ様キナーゼ１(Ｐｌｋ１)阻害剤、例えば、ボラセルチブ(Boehringer Ingelheim)；またはサイクリン依存性キナーゼ９(Ｃｄｋ９)阻害剤、例えば、アルボシジブ(Tolero Pharmaceuticals／Sanofi Aventis)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、Ｂ細胞受容体シグナル伝達ネットワーク阻害剤、例えば、Ｂ細胞リンパ腫２(Ｂｃｌ−２)阻害剤、例えば、ベネトクラクス(Abbvie／Roche)；またはブルトン型チロシンキナーゼ(Ｂｔｋ)阻害剤、例えば、イブルチニブ(Pharmacyclics／Johnson & Johnson Janssen Pharmaceutical)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、Ｍ１アミノペプチダーゼ阻害剤、例えば、トセドスタット(CTI BioPharma／Vernalis)；ヒストンデアセチラーゼ(ＨＤＡＣ)阻害剤、例えば、pracinostat(MEI Pharma)；多キナーゼ阻害剤、例えば、リゴサチブ(Onconova Therapeutics／Baxter／SymBio)；またはペプチド性ＣＸＣＲ４逆アゴニスト、例えば、ＢＬ−８０４０(BioLineRx)と組み合わせて投与する。

他の態様において、対象は、細胞の移植、例えば、同種幹細胞移植前に、本発明のＣＡＲ発現細胞組成物の注入を受けている。好ましい態様において、ＣＡＲ発現細胞は、例えば、ＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲをコードするｍＲＮＡのエレクトロポレーションにより一過性にＮＫＲ−ＣＡＲ、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲを発現しており、それにより、腫瘍抗原の発現が、移植失敗を避けるためにドナー幹細胞の注入前に停止される。

投与中または後に本発明の化合物および／または他の抗癌剤に対するアレルギー反応を経験する患者がいるかもしれない；それゆえに、抗アレルギー剤を、アレルギー反応のリスクを最小化するためにしばしば投与する。適当な抗アレルギー剤はデキサメサゾン(例えば、デカドロン(登録商標))、ベクロメタゾン(例えば、Beclovent(登録商標))、ヒドロコルチゾン(コルチゾン、ヒドロコルチゾンナトリウムスクシネート、ヒドロコルチゾンナトリウムホスフェートとしても知られ、商品名Ａｌａ−Ｃｏｒｔ(登録商標)、ヒドロコルチゾンホスフェート、Ｓｏｌｕ−Ｃｏｒｔｅｆ(登録商標)、ＨｙｄｒｏｃｏｒｔＡｃｅｔａｔｅ(登録商標)およびＬａｎａｃｏｒｔ(登録商標)として販売)、プレドニゾロン(商品名Ｄｅｌｔａ−Ｃｏｒｔｅｌ(登録商標)、Ｏｒａｐｒｅｄ(登録商標)、Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ(登録商標)およびＰｒｅｌｏｎｅ(登録商標)として販売)、プレドニゾン(商品名Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ(登録商標)、ＬｉｑｕｉｄＲｅｄ(登録商標)、Ｍｅｔｉｃｏｒｔｅｎ(登録商標)およびＯｒａｓｏｎｅ(登録商標)として販売)、メチルプレドニゾロン(６−メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロンアセテート、メチルプレドニゾロンナトリウムスクシネートとしても知られ、商品名Ｄｕｒａｌｏｎｅ(登録商標)、Ｍｅｄｒａｌｏｎｅ(登録商標)、Ｍｅｄｒｏｌ(登録商標)、Ｍ−Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ(登録商標)およびＳｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ(登録商標)として販売)のようなコルチコステロイド；ジフェンヒドラミン(例えば、Ｂｅｎａｄｒｙｌ(登録商標))、ヒドロキシジンおよびシプロヘプタジンのような抗ヒスタミン剤；およびベータ−アドレナリン受容体アゴニスト、アルブテロール(例えば、Ｐｒｏｖｅｎｔｉｌ(登録商標))およびテルブタリン(Ｂｒｅｔｈｉｎｅ(登録商標))のような気管支拡張剤を含む。

本発明の化合物および／または他の抗癌剤の投与中および後に悪心を経験する患者がいるかもしれない；それゆえに、鎮吐剤を、悪心(胃上部)および嘔吐の予防に使用する。適当な鎮吐剤は、アプレピタント(Emend(登録商標))、オンダンセトロン(Zofran(登録商標))、グラニセトロンＨＣｌ(Ｋｙｔｒｉｌ(登録商標))、ロラゼパム(Ａｔｉｖａｎ(登録商標)。デキサメサゾン(デカドロン(登録商標))、プロクロルペラジン(Ｃｏｍｐａｚｉｎｅ(登録商標))、カソピタント(Ｒｅｚｏｎｉｃ(登録商標)およびＺｕｎｒｉｓａ(登録商標))およびこれらの組み合わせを含む。

処置中に経験する疼痛を軽減する投薬も、患者がより快適になるようにしばしば処方される。タイレノール(登録商標)のような、一般的非処方鎮痛剤がしばしば使用される。しかしながら、ヒドロコドン／パラセタモールまたはヒドロコドン／アセトアミノフェン(例えば、Ｖｉｃｏｄｉｎ(登録商標))、モルヒネ(例えば、Ａｓｔｒａｍｏｒｐｈ(登録商標)またはＡｖｉｎｚａ(登録商標))、オキシコドン(例えば、ＯｘｙＣｏｎｔｉｎ(登録商標)またはＰｅｒｃｏｃｅｔ(登録商標))、塩酸オキシモルホン(Ｏｐａｎａ(登録商標))およびフェンタニル(例えば、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ(登録商標))のようなオピオイド鎮痛剤剤も、軽度または重度疼痛に有用である。

正常細胞を処置毒性から保護するおよび臓器毒性を制限する試みの中で、細胞保護剤(例えば神経保護剤、フリーラジカルスカベンジャー、心保護剤、アントラサイクリン溢血中和剤、栄養素など)を補助剤治療として使用し得る。適当な細胞保護剤は、アミホスチン(Ｅｔｈｙｏｌ(登録商標))、グルタミン、ジメスナ(Ｔａｖｏｃｅｐｔ(登録商標))、メスナ(Ｍｅｓｎｅｘ(登録商標))、デクスラゾキサン(Ｚｉｎｅｃａｒｄ(登録商標)またはＴｏｔｅｃｔ(登録商標))、キサリプロデン(Ｘａｐｒｉｌａ(登録商標))およびロイコボリン(カルシウムロイコボリン、シトロボラム因子およびフォリン酸としても既知)を含む。

コード番号、一般名または商品名により同定した活性化合物の構造は、標準参考書“The Merck Index”の現行版またはデータベース、例えばPatents International(例えばIMS World Publications)から取り得る。

本発明の化合物と組み合わせて使用できる上記化合物を、上に引用した文献に記載のような、当分野で記載されるように製造し、投与できる。

ある態様において、本発明は、少なくとも一つの本発明の化合物(例えば、本発明の化合物)またはその薬学的に許容される塩を、ヒトまたは動物対象の投与に適する薬学的に許容される適当な担体と共に、単独でまたは他の抗癌剤と組み合わせて含む、医薬組成物を提供する。

ある態様において、本発明は、癌のような細胞増殖性疾患を有するヒトまたは動物対象を処置する方法を提供する。本発明は、治療有効量の本発明の化合物(例えば、本発明の化合物)またはその薬学的に許容される塩を、単独でまたは他の抗癌剤と組み合わせて対象に投与することを含む、処置を必要とするヒトまたは動物対象を処置する方法を提供する。

特に、組成物は、組み合わせ治療として製剤してもまたは別々に投与してもよい。

組み合わせ治療において、本発明の化合物および他の抗癌剤を、同時に、一緒にまたは逐次的に特定の時間制限なく投与してよく、ここで、このような投与が、患者体内で２化合物の治療的有効なレベルを提供する。

好ましい態様において、本発明の化合物および他の抗癌剤を、一般にいずれかの順序で注入または経口により逐次的に投与する。投薬レジメンは、疾患ステージ、患者の体力、個々の薬物の安全性プロファイルおよび個々の薬物の耐容性、ならびに組み合わせを投与する処置医および医療従事者には周知の他の基準により代わり得る。本発明の化合物および他の抗癌剤を、処置に使用する特定のサイクルにより、互いに数分、数時間、数日または数週間離れて投与する。加えて、サイクルは、処置サイクル中、一方の薬剤の他方より多い投与および薬物投与あたりの異なる用量を含む。

本発明の他の面において、ここに開示されるような１以上の本発明の化合物および組み合わせパートナを含むキットが提供される。代表的キットは、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩、(ｂ)例えば、上記のような少なくとも一つの組み合わせパートナーを含み、それによってこのようなキットは、投与指示を含む添付文書または他のラベリングを含み得る。

本発明の化合物はまた既知治療法、例えば、ホルモン投与または特に放射線と組み合わせても遊離に使用し得る。本発明の化合物は、特に放射線療法に低感受性を示す腫瘍の処置のために、特に、放射線増感剤として使用され得る。

ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞の投与に関連する副作用を低減または緩和する薬剤を投与することができる。ＣＡＲ発現細胞の投与に付随する副作用は、ＣＲＳおよびマクロファージ活性化症候群(ＭＡＳ)とも呼ばれる血液貪食リンパ組織球増多症(ＨＬＨ)を含むが、これらに限定されない。ＣＲＳの症状は、高熱、悪心、一過性低血圧、低酸素症などを含む。ＣＲＳは、発熱、疲労、食欲不振、筋肉痛、関節痛(arthalgias)、悪心、嘔吐、頭痛などの臨床的体質的徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、発疹などの臨床皮膚徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、悪心、嘔吐および下痢のような臨床的消化器徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頻呼吸および低酸素血症のような臨床的呼吸器徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頻脈、脈圧の増大、低血圧、心拍出量の増加(早期)および心拍出量の低下(後期)などの臨床的心血管徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、凝固兆候およびｄ−二量体増加、出血の有無にかかわらず低フィブリノーゲン血などの症状を含み得る。ＣＲＳは、高窒素血症などの臨床腎徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、高トランスアミナーゼ血症および高ビリルビン血症などの臨床肝徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頭痛、精神状態の変化、混乱、せん妄、言語発見障害またはフランク失語、幻覚、振戦、ジメトリア、異常歩行、発作などの臨床的神経徴候および症状を含み得る。

よって、ここに記載する方法は、対象にここに記載するＣＡＲ発現細胞を投与し、さらに、ＣＡＲ発現細胞処置に由来する可溶性因子のレベル増加を管理する１以上の薬剤の投与を含み得る。ある態様において、対象で増加し得る可溶性因子は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−６の１以上である。ある態様において、対象において増加する因子は、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびフラクタルカインの１以上である。それゆえに、これらの副作用を処置するために投与する薬剤は、これらの可溶性因子の１以上を中和する薬剤であり得る。ある態様において、これらの可溶性形態の１以上を中和する薬剤は、抗体またはその抗原結合フラグメントである、このような薬剤の例は、ステロイド(例えば、コルチコステロイド)、ＴＮＦα阻害剤およびＩＬ−６阻害剤を含むが、これらに限定されない。ＴＮＦα阻害剤の例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴールおよびゴリムマブのような抗ＴＮＦα抗体分子である。ＴＮＦα阻害剤の他の例は、エタネルセプトのような融合タンパク質である。小分子ＴＮＦα阻害剤は、キサンチン誘導体(例えばペントキシフィリン)およびブプロピオンを含むが、これらに限定されない。ＩＬ−６阻害剤の例は、トシリズマブ(ｔｏｃ)、サリルマブ、エルシリモマブ、ＣＮＴＯ３２８、ＡＬＤ５１８／ＢＭＳ−９４５４２９、ＣＮＴＯ１３６、ＣＰＳＩ−２３６４、ＣＤＰ６０３８、ＶＸ３０、ＡＲＧＸ−１０９、ＦＥ３０１およびＦＭ１０１のような抗ＩＬ−６抗体分子である。ある態様において、抗ＩＬ−６抗体分子は、トシリズマブである。ＩＬ−１Ｒベースの阻害剤の例は、アナキンラである。

ある態様において、対象に、とりわけ、例えば、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾンのような、コルチコステロイドを投与する。

ある態様において、対象に、例えば、ノルエピネフリン、ドーパミン、フェニレフリン、エピネフリン、バソプレシンまたはこれらの組み合わせのような、昇圧剤を投与する。

ある態様において、対象に解熱剤を投与できる。ある態様において、対象に鎮痛剤を投与できる。

ある態様において、対象を、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤と投与できる。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る、例えば、薬剤は、チェックポイント阻害剤である。阻害分子、例えば、プログラム細胞死１(ＰＤ１)は、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による、阻害分子の阻害はＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。ある態様において、例えば、ここに記載のような、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列(ＣＲＩＳＰＲ)、転写−アクティベータ様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用して、ＣＡＲ発現細胞の阻害分子の発現を阻害できる。ある態様において、阻害剤はｓｈＲＮＡである。ある態様において、阻害分子はＣＡＲ発現細胞内で阻害される。これらの態様において、阻害分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を、ＣＡＲの要素、例えば、要素全部をコードする核酸と連結する。

ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子を、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子が、発現、例えば、ＣＡＲ発現細胞内で発現されるようにプロモーター、例えば、Ｈ１またはＵ６駆動プロモーターに操作可能に連結する。例えば、Tiscornia G., “Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA,” Chapter 3, in Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (eds. Friedmann and Rossi)参照。Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2007; Brummelkamp TR, et al. (2002) Science 296: 550-553; Miyagishi M, et al. (2002) Nat. Biotechnol. 19: 497-500。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、要素の全てをコードする核酸分子を含む、同じベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に存在する。このような態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、要素の全てをコードする核酸に５’または３’に位置するベクター、例えば、レンチウイルスベクターに位置する。Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、要素の全てをコードする核酸と同一または異なる方向で転写され得る。

ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、要素の全てをコードする核酸分子を含むベクター以外のベクターに存在する。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲ発現細胞内で一過性に発現される。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲ発現細胞のゲノムに安定に統合される。図４４Ａ〜４４Ｅは、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を有するＣＡＲの成分、例えば、全要素を発現するベクターの例を記載する。

Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現の阻害に有用なｄｓＲＮＡ分子の例であって、ここで、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子がＰＤ−１であるものを下に提供する。

下記表７に、ＤＮＡ配列を表す配列番号２１６〜２６３と共に、ＰＤＣＤ１(ＰＤ１)ＲＮＡｉ剤の名称(マウスＰＤＣＤ１遺伝子ＮＭ＿００８７９８.２におけるそれらの位置由来)を提供する。センス(Ｓ)およびアンチセンス(ＡＳ)配列の両者を、本表では１９ｍｅｒおよび２１ｍｅｒ配列として提供する。位置(ＰｏＳ、例えば、１７６)は、マウスＰＤＣＤ１遺伝子ＮＭ＿００８７９８.２における位置番号由来であることに注意すべきである。配列番号を、“センス１９”配列番号６５〜７６；“センス２１”配列番号７７〜８８；“アセンス２１”配列番号８９〜１００；“アセンス１９”配列番号１０１〜１１２に対応する１２群で示す。

下記表８に、ＤＮＡ配列を表す配列番号２６４〜３１１と共に、ＰＤＣＤ１(ＰＤ１)ＲＮＡｉ剤(ヒトＰＤＣＤ１遺伝子におけるそれらの位置由来)を提供する。センス(Ｓ)およびアンチセンス(ＡＳ)配列の両者を、本表では１９ｍｅｒおよび２１ｍｅｒ配列として提供する。配列番号を、“センス１９”配列番号１１３〜１２４；“センス２１”配列番号１２５〜１３６；“アセンス２１”配列番号１３７〜１４８；“アセンス１９”配列番号１４９〜１６０に対応する１２群で示す。

ある態様において、阻害シグナルの阻害剤は、例えば、阻害分子と結合する抗体または抗体フラグメントであり得る。例えば、薬剤は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＣＴＬＡ４に結合する抗体または抗体フラグメントであり得る(例えば、イピリムマブ(ＭＤＸ−０１０およびＭＤＸ−１０１とも称し、ヤーボイ(登録商標)として市販；Bristol-Myers Squibb；トレメリムマブ(Pfizerから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、以前はチシリムマブ、ＣＰ−６７５,２０６として既知。))。ある態様において、ある態様において、薬剤は、ＴＩＭ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、薬剤は、ＬＡＧ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤、例えば、阻害分子の阻害剤を、同種異系ＣＡＲ、例えば、同種異系ここに記載するＣＡＲと組み合わせて投与する(例えば、ここでの同種異系ＣＡＲにおいて記載)。

ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ１に対する２リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１は、ヒト癌において豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用の阻害により逆転できる。

抗体、抗体フラグメントおよびＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の他の阻害剤は当分野で入手可能であり、ここに記載する本発明のｃａｒと組み合わせて使用し得る。例えば、ニボルマブ(別名ＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０６；Bristol-Myers Squibb)は、ＰＤ−１を特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ニボルマブ(クローン５Ｃ４)およびＰＤ−１に特異的に阻害する他のヒトモノクローナル抗体は、ＵＳ８,００８,４４９号およびＷＯ２００６／１２１１６８号に開示されている。ピディリズマブ(ＣＴ−０１１；Cure Tech)は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピディリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ１モノクローナル抗体は、ＷＯ２００９／１０１６１１号に開示されている。ランブロリズマブ(ＭＫ０３４７５とも称す；Merck)は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ランブロリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ１抗体は、ＵＳ８,３５４,５０９号およびＷＯ２００９／１１４３３５号に開示される。ＭＤＰＬ３２８０Ａ(Genentech／Roche)は、ＰＤ−Ｌ１に結合するヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＰＤ−Ｌ１に対するＭＤＰＬ３２８０Ａおよび他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許７,９４３,７４３号およびＵ.Ｓ公開２０１２００３９９０６号に記載されている。他の抗ＰＤ−Ｌ１結合剤は、ＹＷ２４３.５５.Ｓ７０(重鎖および軽鎖可変領域は、ＷＯ２０１０／０７７６３４号の配列番号２０および２１に示される)およびＭＤＸ−１１０５(別名ＢＭＳ−９３６５５９および例えば、ＷＯ２００７／００５８７４号に開示される抗ＰＤ−Ｌ１結合剤)である。ＡＭＰ−２２４(Ｂ７−ＤＣＩｇ；Amplimmune；例えば、ＷＯ２０１０／０２７８２７号およびＷＯ２０１１／０６６３４２号に開示)は、ＰＤ１とＢ７−Ｈ１の相互作用を遮断するＰＤ−Ｌ２Ｆｃ融合可溶性受容体である。他の抗ＰＤ１抗体は、とりわけ、ＡＭＰ５１４(Amplimmune)、例えば、ＵＳ８,６０９,０８９号、ＵＳ２０１００２８３３０号および／またはＵＳ２０１２０１１４６４９号に開示の抗ＰＤ１抗体を含む。

ある態様において、抗ＰＤ−１抗体またはそのフラグメントは、その全体を引用により本明細書に包含させる“ＰＤ−１に対する抗体分子およびその使用”なる表題のＵＳ２０１５／０２１０７６９号に記載するような抗ＰＤ−１抗体分子である。ある態様において、抗ＰＤ−１抗体分子は、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ａ、ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ｂ、ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ｃ、ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−ＤまたはＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ｅ；またはＵＳ２０１５／０２１０７６９号の表１に記載するようなまたは表１におけるヌクレオチド配列によりコードされるまたは前記配列のいずれかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一)である配列のいずれかから選択される抗体の重鎖および軽鎖可変領域からの少なくとも１、２、３、４、５または６ＣＤＲ(または集合的にＣＤＲのすべて)；または密接に関係するＣＤＲ、例えば、同一であるかまたは少なくとも１アミノ酸改変を有するが、改変(例えば、置換、欠失または挿入、例えば、保存的置換)が２、３または４を超えないＣＤＲを含む。

さらに他の態様において、抗ＰＤ−１抗体分子は、ここに記載する抗体からの少なくとも１、２、３または４可変領域、例えば、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ａ、ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ｂ、ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ｃ、ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−ＤまたはＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ｅのいずれかから選択される抗体；またはＵＳ２０１５／０２１０７６９号の表１に記載するようなまたは表１におけるヌクレオチド配列によりコードされる；または前記配列のいずれかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性)配列を含む。

ＴＩＭ３(Ｔ細胞免疫グロブリン−３)も、特にＩＦＮ−ｇ分泌ＣＤ４^＋Ｔヘルパー１およびＣＤ８^＋Ｔ細胞毒性１細胞において、Ｔ細胞機能を負に制御し、Ｔ細胞枯渇に重要な役割を有する。ＴＩＭ３とそのリガンド、例えば、ガレクチン−９(Ｇａｌ９)、ホスファチジルセリン(ＰＳ)およびＨＭＧＢ１の相互作用の阻害は免疫応答を高め得る。ＴＩＭ３およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で利用可能であり、ここに記載するＣＤ１９ＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ＴＩＭ３を標的とする抗体、抗体フラグメント、小分子またはペプチド阻害剤は、そのリガンドとの相互作用を阻害するためにＴＩＭ３のＩｇＶドメインに結合する。ＴＩＭ３を阻害する抗体およびペプチドは、ＷＯ２０１３／００６４９０号およびＵＳ２０１００２４７５２１号に開示されている。他の抗ＴＩＭ３抗体は、ＲＭＴ３−２３のヒト化バージョン(Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551に開示)およびクローン８Ｂ.２Ｃ１２(Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541に開示)を含む。ＴＩＭ３およびＰＤ−１を阻害する二特異性抗体はＵＳ２０１３０１５６７７４号に開示されている。

ある態様において、抗ＴＩＭ３抗体またはそのフラグメントは、その全体を引用により本明細書に包含させる“ＴＩＭ３に対する抗体分子およびその使用”なる表題のＵＳ２０１５／０２１８２７４号に記載のような抗ＴＩＭ３抗体分子である。ある態様において、抗ＴＩＭ３抗体分子は、ＡＢＴＩＭ３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０４、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０５、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０６、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０７、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０８、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０９、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１０、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１４、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１５、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１６、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１７、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１８、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１９、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２０、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２３；またはＵＳ２０１５／０２１８２７４号の表１〜４に記載するような；または表１〜４に記載するヌクレオチド配列ヌクレオチド配列によりコードされる；または前記配列のいずれかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一)である配列のいずれかから選択される抗体の重鎖および軽鎖可変領域からの少なくとも１、２、３、４、５または６ＣＤＲ(または集合的にＣＤＲのすべて)；または密接に関係するＣＤＲ、例えば、同一であるかまたは少なくとも１アミノ酸改変を有するが、改変(例えば、置換、欠失または挿入、例えば、保存的置換)が２、３または４を超えないＣＤＲを含む。

さらに他の態様において、抗ＴＩＭ３抗体分子は、ここに記載する抗体からの少なくとも１、２、３または４可変領域、例えば、ＡＢＴＩＭ３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０４、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０５、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０６、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０７、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０８、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０９、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１０、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１４、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１５、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１６、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１７、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１８、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１９、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２０、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２３のいずれかから選択される抗体；またはＵＳ２０１５／０２１８２７４号の表１〜４に記載されるような；または表１〜４におけるヌクレオチド配列によりコードされるような；または前記配列のいずれかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性)配列を含む。

他の態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５阻害剤)である。ある態様において、ＣＥＡＣＡＭの阻害剤は、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体分子である。抗ＣＥＡＣＡＭ−１抗体の例は、ＷＯ２０１０／１２５５７１号、ＷＯ２０１３／０８２３６６号、ＷＯ２０１４／０５９２５１およびＷＯ２０１４／０２２３３２号に開示され、例えば、モノクローナル抗体３４Ｂ１、２６Ｈ７および５Ｆ４；または例えば、ＵＳ２００４／００４７８５８号、ＵＳ７,１３２,２５５号およびＷＯ９９／０５２５５２号に開示のようなその組み換え形態である。他の態様において、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体は、例えば、Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371／journal.pone.0021146)に記載のようにＣＥＡＣＡＭ−５と結合するかまたは例えば、ＷＯ２０１３／０５４３３１号およびＵＳ２０１４／０２７１６１８号に記載のようにＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５と交差反応する。

理論に縛られることを望まないが、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５のような癌胎児性抗原細胞接着分子(ＣＥＡＣＡＭ)は、少なくとも一部、抗腫瘍免疫応答の阻害を仲介すると考えられる(例えば、Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529参照)。例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１は、ＴＩＭ−３のヘテロ親和性リガンドとして、そしてＴＩＭ−３介在Ｔ細胞耐容性および枯渇に役割を有するとしてが記載されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２号；Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038／nature13848)。ある態様において、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＴＩＭ−３の共遮断が、異種移植結腸直腸癌モデルにおいて抗腫瘍免疫応答を増強することが示されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２号；Huang, et al. (2014), supra参照)。他の態様において、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＰＤ−１の共遮断は、例えば、ＷＯ２０１４／０５９２５１号に記載されるようにＴ細胞耐容性を減少させる。それゆえに、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤を、ここに記載する他の免疫調節剤(例えば、抗ＰＤ−１および／または抗ＴＩＭ−３阻害剤)と使用して、癌、例えば、黒色腫、肺癌(例えば、ＮＳＣＬＣ)、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌およびここに記載の他の癌に対する免疫応答を増強させ得る。

ＬＡＧ−３(リンパ球活性化遺伝子−３またはＣＤ２２３)は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞枯渇に役割を有することが示されている、活性化Ｔ細胞およびＢ細胞に発現される細胞表面分子である。ＬＡＧ−３およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で入手可能であり、ここに記載するＣＤ１９ＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ＢＭＳ−９８６０１６(Bristol-Myers Squib)は、ＬＡＧ３を標的とするモノクローナル抗体である。ＩＭＰ７０１(Immutep)は、アンタゴニストＬＡＧ−３抗体であり、ＩＭＰ７３１(ImmutepおよびGlaxoSmithKline)は枯渇性ＬＡＧ−３抗体である。他のＬＡＧ−３阻害剤は、ＬＡＧ３の可溶性部分とＭＨＣクラスII分子のＩｇの組み換え融合タンパク質であり、抗原提示細胞(ＡＰＣ)を活性化するＩＭＰ３２１(Immutep)である。他の抗体は、例えば、ＷＯ２０１０／０１９５７０号に開示されている。

ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、例えば、第一ドメインおよび第二ドメインを含む融合タンパク質であってよく、ここで、第一ドメインは阻害分子またはそのフラグメントであり、第二ドメインは陽性シグナルと関係するポリペプチド、例えば、ここに記載の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである。ある態様において、陽性シグナルと結合するポリペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７および／またはＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または例えば、ここに記載する、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含み得る。ある態様において、融合タンパク質は、ＣＡＲを発現するのと同じ細胞により発現される。他の態様において、融合タンパク質は、ＣＡＲを発現しない細胞、例えば、Ｔ細胞により発現される。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤はｍｉＲ−１７−９２である。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲの活性を増強する薬剤はサイトカインである。サイトカインは、Ｔ細胞増殖、分化、生存および恒常性に関連する重要な機能を有する。ここに記載するＣＡＲ発現細胞を受ける対象に投与できるサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１またはこれらの組み合わせを含む。好ましい態様において、投与するサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１またはこれらの組み合わせである。サイトカインを、１日１回または１日１回以上、例えば、１日２回、１日３回または１日４回投与できる。サイトカインを、１日以上投与でき、例えば、サイトカインを２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間または４週間投与する。例えば、サイトカインを１日１回、７日間投与する。

ある態様において、サイトカインをＣＡＲ発現Ｔ細胞と組み合わせて投与する。サイトカインを、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と同時にまたは一緒に投与でき、例えば、同じ日に投与する。サイトカインをＣＡＲ発現Ｔ細胞と同じ医薬組成物に製剤しても、別の医薬組成物に製剤してもよい。あるいは、サイトカインを、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与後間もなく、例えば、ＣＡＲ発現Ｔ細胞投与１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日後に投与してよい。サイトカインを１日を超える投薬レジメンで投与する態様において、サイトカイン投薬レジメンの１日目はＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与と同じ日でよくまたはサイトカイン投薬レジメンの１日目は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日後であってよい。ある態様において、１日目に、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を対象に投与し、２日目に、サイトカインを１日１回、翌７日間投与する。好ましい態様において、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と組み合わせて投与するサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１である。

他の態様において、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞の投与から一定期間後、例えば、ＣＡＲ発現細胞の投与から少なくとも２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月または１年またはそれ以上の後に投与する。ある態様において、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞に対する対象の応答の評価後に投与する。例えば、対象にここに記載する用量およびレジメンに従い、ＣＡＲ発現細胞を投与する。ＣＡＲ発現細胞療法に対する対象の応答を、腫瘍増殖阻止、循環腫瘍細胞減少または腫瘍退縮を含む、ここに記載する方法のいずれかを使用して、ＣＡＲ発現細胞の投与２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月または１年またはそれ以上後に評価する。ＣＡＲ発現細胞療法に対して十分な応答を示さない対象にサイトカインを投与し得る。ＣＡＲ発現細胞療法に対して応答が最適以下である対象へのサイトカインの投与は、ＣＡＲ発現細胞有効性または抗癌活性を改善する。好ましい態様において、ＣＡＲ発現細胞の投与後に投与するサイトカインはＩＬ−７である。

ＣＤ１９阻害剤との組み合わせ
ここに開示する方法および組成物を、ＣＤ１９阻害剤と組み合わせで使用できる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ含有細胞、例えば、ＮＫＲ−ＣＡＲ含有細胞およびＣＤ１９阻害剤(例えば、ＣＤ１９と結合するＣＡＲ分子を発現する１以上の細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９と結合するＣＡＲ分子)を、同時にもしくは一緒にまたは逐次的に投与する。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ含有細胞およびＣＤ１９阻害剤を、対象に同時にまたは一緒に注入し、例えば、同じ注入容積に混合する。例えば、ＣＡＲ含有細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ含有細胞の集団を一緒に混合する。あるいは、ここに記載するＣＡＲおよびＣＤ１９ＣＡＲを共発現する細胞集団を投与する。他の態様において、同時投与は、例えば、予定した間隔(例えば、互いに１５分、３０分または４５分以内)の、ＣＡＲ含有細胞およびＣＤ１９阻害剤の別々の投与を含む。

ある態様において、ＣＡＲ含有細胞の開始およびＣＤ１９阻害剤の開始は、互いに１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、１２時間、１８時間または２４時間以内または互いに１日、２日、３日、４日、５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、６０日、８０日または１００日以内である。ある態様において、ＣＡＲ含有細胞送達の終了およびＣＤ１９阻害剤送達の終了は互いに１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、１２時間、１８時間または２４時間以内または互いに１日、２日、３日、４日、５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、６０日、８０日または１００日以内である。ある態様において、ＣＡＲ含有細胞送達(例えば、注入)およびＣＤ１９阻害剤送達(例えば、注入)終了の期間の重複は、少なくとも１分、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分である。ある態様において、ＣＤ１９阻害剤を、ＣＡＲ含有細胞の前に投与する。他の態様において、ＣＡＲ含有細胞を、ＣＤ１９阻害剤の前に投与する。

ある態様において、ＣＡＲ含有細胞を、ＣＤ１９阻害剤(例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ分子を発現する１以上の細胞)が対象に存在する(例えば、拡張を受けている細胞)間に投与する。他の態様において、ＣＤ１９阻害剤(例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ分子を発現する１以上の細胞)を、ＣＡＲ含有細胞が対象に存在する(例えば、拡張を受けている細胞)間に投与する。

ＣＤ１９阻害剤は、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞または抗ＣＤ１９抗体(例えば、抗ＣＤ１９単または二特異的抗体)またはそのフラグメントまたはコンジュゲートを含むが、これらに限定されない。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＤ１９ＣＡＲ細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞)と組み合わせて対象に投与する(例えば、引用により本明細書に包含させる、ＷＯ２０１２／０７９０００号に記載のような、例えば、ＣＴＬ０１９)。

他の態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１４／１５３２７０号(例えば、ＷＯ２０１４／１５３２７０号の表３)に記載するような、ヒト化抗原結合ドメインを含むＣＤ１９ＣＡＲ細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞)と組み合わせて対象に投与する。

ＣＤ１９阻害剤(例えば、第一ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞)および第二ＣＡＲ発現細胞は、同一細胞型または異なる細胞型により発現され得る。例えば、ある態様において、ＣＤ１９ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であるかまたはＣＤ１９ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。他の態様において、ＣＤ１９ＣＡＲを発現する細胞はＴ細胞であり、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞はＮＫ細胞であるかまたはＣＤ１９ＣＡＲを発現する細胞はＮＫ細胞であり、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞はＴ細胞である。他の態様において、ＣＤ１９ＣＡＲを発現する細胞およびここに記載するＣＡＲを発現する細胞は両者ともＮＫ細胞であるかまたは両者ともＴ細胞であり、例えば、両者ともＣＤ４＋Ｔ細胞または両者ともＣＤ８＋Ｔ細胞である。さらに他の態様において、単一細胞がＣＤ１９ＣＡＲおよびここに記載するＣＡＲを発現し、この細胞は、例えば、ＮＫ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のようなＴ細胞である。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞(例えば、引用により本明細書に包含するＷＯ２０１２／０７９０００号に記載のような、例えば、ＣＴＬ０１９)と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、対象は急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、例えば、ＣＤ１９陽性ＡＭＬまたはＣＤ１９陰性ＡＭＬを有する。ある態様において、対象は、ＣＤ１９^＋リンパ腫、例えば、ＣＤ１９^＋非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、ＣＤ１９^＋ＦＬまたはＣＤ１９^＋ＤＬＢＣＬを有する。ある態様において、対象は再発性または難治性ＣＤ１９^＋リンパ腫を有する。ある態様において、リンパ球枯渇性化学療法剤を、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の投与前、同時または後に投与(例えば、注入)する。一例において、リンパ球枯渇性化学療法剤を、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の投与前に対象に投与する。例えば、リンパ球枯渇性化学療法剤は、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞注入１〜４日(例えば１日、２日、３日または４日)前に終わる。ある態様において、複数用量のＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を、例えば、ここに記載するように、投与する。例えば、単一用量は、約５×１０^８ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を含む。ある態様において、リンパ球枯渇性化学療法剤を、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、非ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入)前、同時または後に対象に投与する。ある態様において、ＣＤ１９ＣＡＲＴを、非ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞、例えば、ここに記載する非ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入)前、同時または後に対象に投与する。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する疾患、例えば、ここに記載する癌の処置のために、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞、例えば、引用により本明細書に包含させる、ＷＯ２０１２／０７９０００号に記載のような、例えば、ＣＴＬ０１９と組み合わせて対象に投与する。理論に縛られることを望まないが、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞をＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与することは、初期細胞系譜癌細胞、例えば、癌幹細胞のターゲティング、免疫応答調節、制御性Ｂ細胞枯渇および／または腫瘍微小環境改善により、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の効力を改善すると考えられる。例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞は、初期細胞系譜マーカー、例えば、癌幹細胞およびＣＤ１９発現細胞を発現する癌細胞を標的とし、一方ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、後期細胞系譜マーカー、例えば、ＣＤ１２３を発現する癌細胞を標的とする。このプレコンディショニングアプローチは、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の効果を改善できる。このような態様において、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞を、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入)の前に、同時にまたは後に投与する。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９ＣＡＲも発現する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞およびＣＤ１９ＣＡＲを、ここに記載する癌、例えば、ＡＭＬの処置ために対象に投与する。ある態様において、一方または両方のＣＡＲ分子の配置は、初代細胞内シグナル伝達ドメインおよび共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。他の態様において、一方または両方のＣＡＲ分子の配置は、初代細胞内シグナル伝達ドメインおよび２以上、例えば、２、３、４または５またはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。このような態様において、ここに記載するＣＡＲ分子およびＣＤ１９ＣＡＲは、同一または異なる初代細胞内シグナル伝達ドメイン、同一または異なる共刺激性シグナル伝達ドメインまたは同数または異なる数の共刺激性シグナル伝達ドメインを有し得る。あるいは、ここに記載するＣＡＲおよびＣＤ１９ＣＡＲは、スプリットＣＡＲとして配置され、そこで、ＣＡＲ分子の一方は抗原結合ドメインおよび共刺激ドメイン(例えば、４−１ＢＢ)を含み、他のＣＡＲ分子は抗原結合ドメインおよび初代細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータ)を含む。

ある態様において、ここに記載するＣＡＲおよび第二ＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９ＣＡＲは同じベクターにあるか２の異なるベクターにある。ここに記載するＣＡＲおよび第二ＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９ＣＡＲが同じベクターにある態様において、ここに記載するＣＡＲおよび第二ＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９ＣＡＲをコードする核酸配列は同じフレームにあり、１以上のペプチド開裂部位、例えば、Ｐ２Ａにより離されている。

他の態様において、ここに開示するＣＡＲ発現細胞を、抗ＣＤ１９抗体阻害剤と組み合わせて投与する。ある態様において、抗ＣＤ１９抗体は、引用により本明細書に包含させる、ＷＯ２０１４／１５３２７０号(例えば、ＷＯ２０１４／１５３２７０号の表３)に記載のヒト化抗原結合ドメインまたはそのコンジュゲートである。他の例示的抗ＣＤ１９抗体またはフラグメントまたはそのコンジュゲートは、ブリナツモマブ、ＳＡＲ３４１９(Sanofi)、ＭＥＤＩ−５５１(MedImmune LLC)、Ｃｏｍｂｏｔｏｘ、ＤＴ２２１９ＡＲＬ(Masonic Cancer Center)、ＭＯＲ−２０８(別名ＸｍＡｂ−５５７４；MorphoSys)、ＸｍＡｂ−５８７１(Xencor)、ＭＤＸ−１３４２(Bristol-Myers Squibb)、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ(eattle Genetics)およびＡＦＭ１１(Affimed Therapeutics)を含む。例えば、Hammer. MAbs. 4.5(2012): 571-77参照。ブリナツモマブは、２ｓｃＦｖからなる二特異的抗体である − ＣＤ１９に結合するものおよびＣＤ３に結合するもの。ブリナツモマブは、癌細胞を攻撃するようＴ細胞に指示する。例えば、Hammer et al.; Clinical Trial Identifier No. NCT00274742およびNCT01209286参照。ＭＥＤＩ−５５１は、抗体依存性細胞介在細胞毒性(ＡＤＣＣ)を増強するようＦｃ操作されたヒト化抗ＣＤ１９抗体である。例えば、Hammer et al.; and Clinical Trial Identifier No. NCT01957579参照。Ｃｏｍｂｏｔｏｘは、ＣＤ１９およびＣＤ２２に結合する免疫毒素の混合物である。免疫毒素は、脱グリコシル化リシンＡ鎖に融合したｓｃＦｖ抗体フラグメントからなる。例えば、 Hammer et al.; and Herrera et al. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 31.12(2009):936-41; Schindler et al. Br. J. Haematol. 154.4(2011):471-6参照。ＤＴ２２１９ＡＲＬは、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的化し、２ｓｃＦｖｓおよび切断型ジフテリア毒素を含む、二重特異性免疫毒素である。例えば、Hammer et al.; and Clinical Trial Identifier No. NCT00889408参照。ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａは、合成細胞毒性細胞致死剤、モノメチルオーリスタチンＦ(ＭＭＡＦ)と連結した抗ＣＤ１９ヒト化モノクローナル抗体からなる抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)である。例えば、Hammer et al.; and Clinical Trial Identifier Nos. NCT01786096 and NCT01786135参照。ＳＡＲ３４１９は、開裂可能リンカーによりメイタンシン誘導体にコンジュゲートした抗ＣＤ１９ヒト化モノクローナル抗体を含む抗ＣＤ１９抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)である。例えば、Younes et al. J. Clin. Oncol. 30.2(2012): 2776-82; Hammer et al.; Clinical Trial Identifier No. NCT00549185; and Blanc et al. Clin Cancer Res. 2011;17:6448-58参照。ＸｍＡｂ−５８７１は、Ｆｃ操作、ヒト化抗ＣＤ１９抗体である。例えば、Hammer et al.参照。ＭＤＸ−１３４２は、ＡＤＣＣが増強されたヒトＦｃ操作抗ＣＤ１９抗体である。例えば、Hammer et al.参照。ある態様において、抗体分子は二特異的抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３分子である。例えば、ＡＦＭ１１は、ＣＤ１９およびＣＤ３を標的とする二特異的抗体である。例えば、Hammer et al.; and Clinical Trial Identifier No. NCT02106091参照。ある態様において、ここに記載する抗ＣＤ１９抗体を、治療剤、例えば、化学療法剤、ペプチドワクチン(例えばIzumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971に記載のもの)、免疫抑制性剤または免疫除去剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、ＦＫ５０６、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、ｃｙｔｏｘｉｎ、フルダラビン、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８またはサイトカインとコンジュゲートまたは他の方法で結合させる。

低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤との組み合わせ
ここに記載する方法は、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１のようなラパログを含むアロステリックｍＴＯＲ阻害剤を使用する。低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与(例えば、それ自体、免疫系を完全に抑制するには不十分であるが、免疫機能の改善に十分である用量)は、対象における免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＣＡＲ発現細胞の性能を最適化できる。ｍＴＯＲ阻害を測定する方法、用量、処置レジメンおよび適当な医薬組成物は、引用により本明細書に包含させる米国特許出願２０１５／０１２４００３６号に記載される。

ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、次の１以上をもたらし得る。
ｉ)ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の数の減少；
ii)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞の数の増加；
iii)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞比の増加；
iv)ナイーブＴ細胞の数の増加；
ｖ)１以上の次のマーカーの発現の増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＣＤ６２Ｌ^高、ＣＤ１２７^高、ＣＤ２７^＋およびＢＣＬ２；
vi)例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；または
vii)次の特徴のいずれか一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ^高、増加したＣＤ１２７^高、増加したＣＤ２７^＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２；
ここで、前記、例えば、ｉ)、ii)、iii)、iv)、ｖ)、vi)またはvii)のいずれかは、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。

他の態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、非処置ＣＡＲ発現細胞または非処置対象と比較して、例えば、培養または対象において、ＣＡＲ発現細胞の増殖増加または延長をもたらす。ある態様において、増殖増加は、ＣＡＲ発現細胞の数の増加と関係する。増殖の増加または延長を測定する方法は実施例９および１０に記載する。他の態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、非処置ＣＡＲ発現細胞または非処置対象と比較して、例えば、培養または対象において、ＣＡＲ発現細胞による癌細胞死の増加をもたらす。ある態様において、癌細胞死の増加は、腫瘍体積減少と関係する。癌細胞死増加を測定する方法は、実施例２に記載する。

ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与する。例えば、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与前に解しでき；ここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与前に終了でき；ここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与と同時に介しでき；ここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与と重複でき；またはここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与後継続できる。

これとは別にまたはこれに加えて、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、ここに記載するＣＡＲ分子を発現するよう操作した免疫エフェクター細胞を最適化できる。このような態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤の投与を、ここに記載するＣＡＲ分子を発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の対象からの採取前に開始または完了する。

他の態様において、ここに記載するＣＡＲ分子を発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、例えば、対象から採取後またはＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の、例えば、対象への投与前、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤存在下で培養できる。

ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、週に１回、例えば、即時放出剤形で、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１またはそれと生物学的同等用量で投与することを含む。ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、週に１回、例えば、持続放出性剤形で、０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１またはそれと生物学的同等用量の投与を含む。

ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが、９０％を超えない、少なくとも１０％であるが、９０％を超えない、少なくとも１５％であるが、９０％を超えない、少なくとも２０％であるが、９０％を超えない、少なくとも３０％であるが、９０％を超えない、少なくとも４０％であるが、９０％を超えない、少なくとも少なくとも５０％であるが、９０％を超えない、少なくとも６０％であるが、９０％を超えない、少なくとも少なくとも７０％であるが、９０％を超えない、少なくとも５％であるが、８０％を超えない、少なくとも１０％であるが、８０％を超えない、少なくとも１５％であるが、８０％を超えない、少なくとも２０％であるが、８０％を超えない、少なくとも３０％であるが、８０％を超えない、少なくとも４０％であるが、８０％を超えない、少なくとも５０％であるが、８０％を超えない、少なくとも６０％であるが、８０％を超えない、少なくとも５％であるが、７０％を超えない、少なくとも１０％であるが、７０％を超えない、少なくとも１５％であるが、７０％を超えない、少なくとも２０％であるが、７０％を超えない、少なくとも３０％であるが、７０％を超えない、少なくとも４０％であるが、７０％を超えない、少なくとも５０％であるが、７０％を超えない、少なくとも５％であるが、６０％を超えない、少なくとも１０％であるが、６０％を超えない、少なくとも１５％であるが、６０％を超えない、少なくとも２０％であるが、６０％を超えない、少なくとも３０％であるが、６０％を超えない、少なくとも４０％であるが、６０％を超えない、少なくとも５％であるが、５０％を超えない、少なくとも１０％であるが、５０％を超えない、少なくとも１５％であるが、５０％を超えない、少なくとも２０％であるが、５０％を超えない、少なくとも３０％であるが、５０％を超えない、少なくとも４０％であるが、５０％を超えない、少なくとも５％であるが、４０％を超えない、少なくとも１０％であるが、４０％を超えない、少なくとも１５％であるが、４０％を超えない、少なくとも２０％であるが、４０％を超えない、少なくとも３０％であるが、４０％を超えない、少なくとも３５％であるが、４０％を超えない、少なくとも５％であるが、３０％を超えない、少なくとも１０％であるが、３０％を超えない、少なくとも１５％であるが、３０％を超えない、少なくとも２０％であるが、３０％を超えないまたは少なくとも２５％であるが、３０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供する。

ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０Ｓ６キナーゼ阻害の程度により伝達または対応されえて、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０Ｓ６キナーゼ活性における低下レベルにより、例えば、Ｐ７０Ｓ６キナーゼ基質のリン酸化の減少により決定できる。ｍＴＯＲ阻害のレベルは、引用により本明細書に包含させる米国特許出願２０１５／０１２４００３６号にまたは引用により本明細書に包含させる米国特許７,７２７,９５０号に記載のようなＢｏｕｌａｙアッセイによるＰ７０Ｓ６キナーゼ活性の測定；ウェスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定；またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞対ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞比の変化の評価のような種々の方法により評価できる。

ここで使用する用語“ｍＴＯＲ阻害剤”は、細胞におけるｍＴＯＲキナーゼを阻害する、化合物またはリガンドまたはその薬学的に許容される塩をいう。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、アロステリック阻害剤である。アロステリックｍＴＯＲ阻害剤は、中性三環式化合物ラパマイシン(シロリムス)、例えば、ラパマイシン誘導体、ラパマイシンアナログ(ラパログとも称する)およびｍＴＯＲ活性を阻害する他のマクロライド化合物を含む、ラパマイシンと構造的および機能的類似性を有する化合物であるラパマイシン関連化合物を含む。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、触媒的阻害剤である。

ラパマイシンは、式Ａに示す構造を有する、ストレプトミセス・ハイグロスコピクスにより産生されるマクロライド抗生物質である。

例えば、McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433; 米国特許３,９２９,９９２号参照。ラパマイシンについて種々のナンバリングスキームが提唱されている。混乱を避けるため、特定のラパマイシンアナログをここで命名するとき、名称は、式Ａのナンバリングスキームを使用したラパマイシンを参照して付与する。

本発明において有用なラパマイシンアナログは、例えば、本発明において有用なラパマイシンアナログは、例えば、ラパマイシンのシクロヘキシル環上のヒドロキシ基がＯＲ_１(ここで、Ｒ_１はヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたはアミノアルキルである)で置き換えられているＯ−置換アナログ；例えば引用により本明細書に包含させる、ＵＳ５,６６５,７７２号およびＷＯ９４／０９０１０号に記載のような、エベロリムスとして知られるＲＡＤ００１である。他の適当なラパマイシンアナログは、２６位または２８位が置換されたものを含む。ラパマイシンアナログは、例えば、内容を引用により本明細書に包含させるＵＳ６,０１５,８１５号、ＷＯ９５／１４０２３号およびＷＯ９９／１５５３０号に記載のような、上記アナログのエピマー、特に４０位、２８位または２６位が置換され、場合によりさらに水素化されていてよいアナログのエピマーであってよく、例えばゾタロリムスとしても知られるＡＢＴ５７８またはその内容を引用により本明細書に包含させるＵＳ７,０９１,２１３号、ＷＯ９８／０２４４１号およびＷＯ０１／１４３８７号に記載のラパマイシンアナログ、例えばリダフォロリムスとしても知られるＡＰ２３５７３である。

ＵＳ５,６６５,７７２号からの、本発明における使用に適するラパマイシンアナログの例は、４０−Ｏ−ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(４’−ヒドロキシメチル)ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[４’−(１,２−ジヒドロキシエチル)]ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−アリル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[３’−(２,２−ジメチル−１,３−ジオキソラン−４(Ｓ)−イル)−プロプ−２’−エン−１’−イル]−ラパマイシン、(２’Ｅ,４’Ｓ)−４０−Ｏ−(４’,５’−ジヒドロキシペント−２’−エン−１’−イル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エトキシカルボニルメチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(３−ヒドロキシ)プロピル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(６−ヒドロキシ)ヘキシル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(２−ヒドロキシ)エトキシ]エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[(３Ｓ)−２,２−ジメチルジオキソラン−３−イル]メチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[(２Ｓ)−２,３−ジヒドロキシプロプ−１−イル]−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アセトキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ニコチノイルオキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(Ｎ−モルホリノ)アセトキシ]エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−Ｎ−イミダゾリルアセトキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(Ｎ−メチル−Ｎ’−ピペラジニル)アセトキシ]エチル−ラパマイシン、３９−Ｏ−デスメチル−３９,４０−Ｏ,Ｏ−エチレン−ラパマイシン、(２６Ｒ)−２６−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アセトアミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ニコチンアミドエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−(Ｎ−メチル−イミダゾ−２’−イルカルベトキサミド)エチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−エトキシカルボニルアミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−トリルスルホンアミドエチル)−ラパマイシンおよび４０−Ｏ−[２−(４’,５’−ジカルボエトキシ−１’,２’,３’−トリアゾール−１’−イル)−エチル]−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。

本発明において有用な他のラパマイシンアナログは、ラパマイシンのシクロヘキシル環上のヒドロキシ基および／または２８位のヒドロキシ基がヒドロキシエステル基で置き換えられたアナログが知られ、例えば、ＵＳＲＥ４４,７６８号に見られるラパマイシンアナログ、例えばテムシロリムスである。

本発明において有用な他のラパマイシンアナログは、１６位のメトキシ基が他の置換基、好ましくは(場合によりヒドロキシ置換)アルキニルオキシ、ベンジル、オルトメトキシベンジルまたはクロロベンジルにより置き換えられているおよび／または３９位のメトキシ基が３９炭素と共に除去され、ラパマイシンのシクロヘキシル環が３９位のメトキシ基を欠くシクロペンチル環になるものを含む；例えばその内容を引用により本明細書に包含するＷＯ９５／１６６９１号およびＷＯ９６／４１８０７号に記載のような。アナログは、ラパマイシンの４０位のヒドロキシがアルキル化されおよび／または３２−カルボニルが還元されるようにさらに修飾され得る。

ＷＯ９５／１６６９１号からのラパマイシンアナログは、１６−デメトキシ−１６−(ペント−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(ブト−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(プロパルギル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(４−ヒドロキシ−ブト−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−オルト−メトキシベンジル−ラパマイシン、１６−デメトキシ−４０−Ｏ−(２−メトキシエチル)−１６−ペント−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ホルミル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ヒドロキシメチル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−カルボキシ−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(モルホリン−４−イル)カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−[Ｎ−メチル、Ｎ−(２−ピリジン−２−イル−エチル)]カルバモイル−４２−ノル−ラパマイシンおよび３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(ｐ−トルエンスルホニルヒドラゾノメチル)−４２−ノル−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。

ＷＯ９６／４１８０７号からのラパマイシンアナログは、３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−デオキソ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ−エチル)−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−メトキシ)エチル−ラパマイシンおよび３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。

他の適当なラパマイシンアナログは、その内容を引用により本明細書に包含させるＵＳ２００５／０１０１６２４号に記載のようなウミロリムスである。

エベロリムス(アフィニトール(登録商標))としても知られるＲＡＤ００１は、化学名(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ,２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｅ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１２−{(１Ｒ)−２−[(１Ｓ,３Ｒ,４Ｒ)−４−(２−ヒドロキシエトキシ)−３−メトキシシクロヘキシル]−１−メチルエチル}−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３,２９,３５−ヘキサメチル−１１,３６−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−２,３,１０,１４,２０−ペンタオンを有する。

アロステリックｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例は、シロリムス(ラパマイシン、ＡＹ−２２９８９)、４０−[３−ヒドロキシ−２−(ヒドロキシメチル)−２−メチルプロパノエート]−ラパマイシン(テムシロリムスまたはＣＣＩ−７７９とも呼ばれる)およびリダフォロリムス(ＡＰ−２３５７３／ＭＫ−８６６９)を含む。アロステリックｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例は、ゾタロリムス(ＡＢＴ５７８)およびウミロリムスを含む。

これとは別にまたはこれに加えて、触媒的、ＡＴＰ競合的ｍＴＯＲ阻害剤が、ｍＴＯＲキナーゼドメインを直接標的とし、かつｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両者を標的とすることが判明している。これらはまた、４ＥＢＰ１−Ｔ３７／４６リン酸化およびキャップ依存性翻訳のようなラパマイシン耐性ｍＴＯＲＣ１アウトプットを調節するために、ラパマイシンのようなアロステリックｍＴＯＲ阻害剤よりもｍＴＯＲＣ１の効果的な阻害剤である。

触媒的阻害剤は、ＢＥＺ２３５または２−メチル−２−[４−(３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２,３−ジヒドロ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル)−フェニル]−プロピオニトリルまたはモノトシル酸塩形態(ＢＥＺ２３５の合成はＷＯ２００６／１２２８０６号に記載)；ＣＣＧ１６８(ＡＺＤ−８０５５としても知られる、Chresta, C.M., et al., Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298)であり、これは、化学名{５−[２,４−ビス−((Ｓ)−３−メチル−モルホリン−４−イル)−ピリド[２,３ｄ]ピリミジン−７−イル]−２−メトキシ−フェニル}−メタノール；３−[２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル]−Ｎ−メチルベンズアミド(ＷＯ０９１０４０１９号)；３−(２−アミノベンゾ[ｄ]オキサゾール−５−イル)−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−アミン(ＷＯ１００５１０４３号およびＷＯ２０１３０２３１８４号)；Ｎ−(３−(Ｎ−(３−((３,５−ジメトキシフェニル)アミノ)キノキサリン−２−イル)スルファモイル)フェニル)−３−メトキシ−４−メチルベンズアミド(ＷＯ０７０４４７２９号およびＷＯ１２００６５５２号)；ＰＫＩ−５８７(Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645)であり、これは、化学名１−[４−[４−(ジメチルアミノ)ピペリジン−１−カルボニル]フェニル]−３−[４−(４,６−ジモルホリノ−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素；ＧＳＫ−２１２６４５８(ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43)であり、これは、化学名２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−メトキシ−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミド；５−(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＷＯ１０１１４４８４号)；(Ｅ)−Ｎ−(８−(６−アミノ−５−(トリフルオロメチル)ピリジン−３−イル)−１−(６−(２−シアノプロパン−２−イル)ピリジン−３−イル)−３−メチル−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−イリデン)シアナミド(ＷＯ１２００７９２６号)を含む。

触媒的ｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例は、８−(６−メトキシ−ピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−ピペラジン−１−イル−３−トリフルオロメチル−フェニル)−１,３−ジヒドロ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２−オン(ＷＯ２００６／１２２８０６号)およびＫｕ−００６３７９４(Garcia-Martinez JM, et al.,Biochem J., 2009, 421(1), 29-42)を含む。Ｋｕ−００６３７９４は、哺乳動物ラパマイシンの標的(ｍＴＯＲ)の特異的阻害剤である。ＷＹＥ−３５４は、触媒的ｍＴｏｒ阻害剤の他の例である(Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240)。

本発明によって有用なｍＴＯＲ阻害剤はまた、前記のいずれかのプロドラッグ、誘導体、薬学的に許容される塩そのアナログも含む。

ＲＡＤ００１のようなｍＴＯＲ阻害剤は、ここに記載する特定の用量に基づき、当分野で十分に確立された方法に基づき送達用に製剤され得る。特に、ＵＳ特許６,００４,９７３号(引用により本明細書に包含させる)は、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤で使用できる製剤例を提供する。

医薬組成物および処置
本発明の医薬組成物は、ここに記載のように、ＣＡＲ発現細胞、例えば、複数のＣＡＲ発現細胞を、１以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または添加物と組み合わせて含む。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などのような緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールのような炭水化物；タンパク質；グリシンのようなポリペプチドまたはアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート剤；アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)；および防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、一つの面において静脈内投与用に製剤される。

本発明の医薬組成物を、処置する(または予防する)疾患に適する方法で投与し得る。投与の量および頻度は、患者の状態および患者の疾患のタイプおよび重症度のような因子により決定されるが、適切な用量は、臨床試験により決定され得る。

ある態様において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能レンチウイルス(ＲＣＬ)、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶｇａｇ、残留抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、貯留ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地要素、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌および真菌からなる群から選択される汚染物が実質的にない、例えば、検出可能なレベルで存在しない。ある態様において、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス、カンジダ・アルビカンス、エシェリキア・コリ、ヘモフィルス・インフルエンザエ、ナイセリア・メニンギティディス、シュードモナス・エルジノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエおよびストレプトコッカス・ピオゲネスＡ群からなる群から選択される少なくとも１つである。

“免疫学的に有効量”、“抗腫瘍有効量”、“腫瘍阻害有効量”または“治療量”が示されるとき、本発明の組成物の投与すべき正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染の程度または転移および患者(対象)の状態の個体差を考慮して医師が決定できる。ここに記載する免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を含む医薬組成物を、１０^４〜１０^９細胞／kg体重、好ましくは１０^５〜１０^６細胞／kg体重の範囲の用量で、これらの範囲内の全整数値を含み、投与し得ると一般に述べることができる。Ｔ細胞組成物を、また、この用量で複数回投与し得る。細胞を、免疫療法において一般に知られる注入技術を使用して投与できる(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988参照)。特定の患者についての最適用量および処置レジメンは、疾患の兆候についての患者のモニタリングにより当業者により容易に決定でき、それに応じて処置を調節する。

ある態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＮＫＲ−ＣＡＲ細胞、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲ細胞)の用量は、約１×１０^６、１.１×１０^６、２×１０^６、３.６×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、１.８×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８または５×１０^８細胞／kgを含む。ある態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＮＫＲ−ＣＡＲ細胞、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲ細胞)の用量は、少なくとも約１×１０^６、１.１×１０^６、２×１０^６、３.６×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、１.８×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８または５×１０^８細胞／kgを含む。ある態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＮＫＲ−ＣＡＲ細胞、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲ細胞)の用量は、最大約１×１０^６、１.１×１０^６、２×１０^６、３.６×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、１.８×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８または５×１０^８細胞／kgである。ある態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＮＫＲ−ＣＡＲ細胞、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲ細胞)の用量は、約１.１×１０^６〜１.８×１０^７細胞／kgを含む。ある態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＮＫＲ−ＣＡＲ細胞、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲ細胞)の用量は、約１×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、２×１０^９または５×１０^９細胞を含む。ある態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＮＫＲ−ＣＡＲ細胞、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲ細胞)の用量は、少なくとも約１×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、２×１０^９または５×１０^９細胞を含む。ある態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＮＫＲ−ＣＡＲ細胞、例えば、ＫＩＲ−ＣＡＲ細胞)の用量は、最大約１×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、２×１０^９または５×１０^９細胞を含む。

細胞を、免疫療法で一般的に知られる注入技術を使用して投与できる(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988参照)。

ある態様において、活性化ＣＡＲ発現細胞を対象に投与し、次いで血液を再採血し(またはアフェレシスを実施し)、本発明により細胞を活性化し、これらの活性化および拡張細胞を患者に再注入することが望ましいことがある。この工程を、数週間毎に複数回実施できる。ある態様において、Ｔ細胞を、１０cc〜４００ccの採血した血液から活性化できる。ある態様において、Ｔ細胞を、２０cc、３０cc、４０cc、５０cc、６０cc、７０cc、８０cc、９０ccまたは１００ccの採血した血液から活性化する。理論に縛られないが、この複数採血／複数再注入プロトコールの使用は、Ｔ細胞のある集団の選抜に役立ち得る。

対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、留置または移植を含む、任意の簡便な方法により実施し得る。ここに記載する組成物を、患者に経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内(ｉ.ｖ.)注射によりまたは腹腔内に投与し得る。ある態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)組成物を、患者に皮内または皮下注射により投与する。他の態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)組成物を、好ましくはｉ.ｖ.注射により投与する。ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の組成物を、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注射し得る。

本発明のある態様において、ここに記載する方法またはＴ細胞が治療レベルに拡張される当分野で知られる他の方法を使用して活性化および拡張した細胞を、患者に、抗ウイルス治療、シドフォビルおよびインターロイキン−２、ＭＳ患者のためのシタラビン(別名ＡＲＡ−Ｃ)またはナタリズマブ処置または乾癬患者のためのエファリズマブ処置またはＰＭＬ患者のための他の処置を含むが、これらに限定されない、任意の数の関連する処置モダリティーと組み合わせて(例えば、前に、同時にまたは後に)投与する。さらなる態様において、本発明のＴ細胞を、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸およびＦＫ５０６のような免疫抑制性剤、抗体またはキャンパス、抗ＣＤ３抗体または他の抗体治療剤のような他の免疫除去剤、ｃｙｔｏｘｉｎ、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および照射と組み合わせて使用し得る。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか(シクロスポリンおよびＦＫ５０６)または増殖因子誘発シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する(ラパマイシン)(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)。さらなる態様において、本発明の細胞組成物を、骨髄移植、フルダラビンのような化学療法剤、外部ビーム放射線療法(ＸＲＴ)、シクロホスファミドまたはＯＫＴ３またはキャンパスのような抗体を使用するＴ細胞除去療法と組み合わせて(例えば、前に、同時にまたは後に)、患者に投与する。他の態様において、本発明の細胞組成物を、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなＢ細胞除去療法の後に投与する。例えば、ある態様において、対象を、高用量の化学療法と続く末梢血幹細胞移植の標準処置に付し得る。ある態様において、移植後、対象は、拡張された本発明の免疫細胞の注入を受ける。さらなる態様において、拡張された細胞を手術の前または後に投与する。

特定の例示的面において、対象は、白血球を採取し、エクスビボで富化または枯渇させて、目的の細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を選択および／または単離する、白血球除去を受け得る。これらの免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)単離体を、当分野で知られる方法により増殖させ、１以上の本発明のＣＡＲ構築物が導入され、それにより１以上の本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)が創製されるように処理し得る。処置を必要とする対象を、その後高用量の化学療法剤と続く末梢血幹細胞移植の標準的処置に付し得る。ある面において、移植後または移植と同時に、対象は、増殖させた本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)の注入を受ける。さらなる面において、増殖細胞を手術の前または後に投与する。

患者に投与すべき上記処置の用量は、処置する状態の正確な性質および処置の受け手により変わる。ヒト投与のためのスケーリングは、当分野で認識されている習慣に従い実施できる。ＣＡＲＴ細胞用量およびスケジューリングの戦略は、記載されている(Ertl et al, 2011, Cancer Res, 71:3175-81; Junghans, 2010, Journal of Translational Medicine, 8:55)。

ある態様において、ＣＡＲを、例えば、インビトロ転写を使用して免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)に導入し、対象(例えば、ヒト)は、本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)の初期投与と、その後の本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)の１回以上の投与を受け、ここで、その後の１回以上の投与は、先の投与の後、１５日、例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日または２日以内に行う。ある態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)の１回を超える投与を、対象(例えば、ヒト)に１週間当たりに行い、例えば、本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)の２、３または４投与を週あたりに投与する。ある態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)の週あたり１回を超える投与を受け(例えば、１週間当たり２回、３回または４回投与)(ここではサイクルとも呼ぶ)、続いて１週間、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)投与されず、その後さらにＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)の１回以上のさらなる投与(例えば、週あたりＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)の１回を超える投与)を対象に投与する。他の態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)の１回を超えるサイクルの投与を受け、各サイクル間の期間は１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日または３日より短い。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を、隔日で１週間３回投与する。ある態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間またはそれ以上投与する。

ある面において、ＣＤ１２３ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を、レンチウイルスのようなレンチウイルスウイルスベクターを使用して賛成する。この方法で産生したＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)は、安定なＣＡＲ発現を有する。

ある面において、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴまたはＣＡＲ発現ＮＫ細胞を、ガンマレトロウイルスベクター、例えば、ここに記載するガンマレトロウイルスベクターのようなウイルスベクターを使用して産生する。これらのベクターを使用して産生したＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴまたはＣＡＲ発現ＮＫ細胞は、安定なＣＡＲ発現を有する。

ある面において、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)は、形質導入４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日後、ＣＡＲベクターを一過性に発現する。ＣＡＲの一過性発現は、ＲＮＡＣＡＲベクター送達により行われ得る。ある面において、ＣＡＲＲＮＡを、エレクトロポレーションにより、細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)に形質導入する。

一過性にＣＡＲを発現する細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)(特にマウスｓｃＦｖＣＡＲで)を使用して処置される患者で生じ得る可能性のある問題は、複数処置後のアナフィラキシーである。

この理論に縛られることを望まないが、このようなアナフィラキシー応答は、液性抗ＣＡＲ応答を発達させる患者、すなわち、抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＣＡＲ抗体が原因であると考えられる。細胞を産生する患者の抗体が、抗原への暴露の１０〜１４日の中断があるとき、ＩｇＧアイソタイプ(これはアナフィラキシーを生じない)からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを受けると考えられる。

患者が一過性ＣＡＲ治療(例えばＲＮＡ形質導入により完成されたもののような)中に抗ＣＡＲ抗体応答を産生する高リスクにあるならば、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)注入中断は１０〜１４日を超えて継続してはならない。

実施例
本発明を、次の実験的実施例を参照してさらに詳細に記載する。これらの実施例は、説明のみを目的として提供し、特に断らない限り限定を意図しない。そうして、本発明は、決して次の実施例に限定されると解釈してはならず、むしろ、ここに提供する教示の結果として明らかとなるいずれかかつ全ての異形を含むと解釈すべきである。

さらに記載せずとも、当業者は、前の記載および次の説明的実施例を使用して、本発明の化合物を製造および利用し、本願発明方法を実施できると考える。次の作業実施例は、本発明の好ましい態様を特に示し、本開示の残りをいかなる方法でも限定すると解釈してはならない。

実施例１：キメラＮＫ受容体
ここに提示する結果は、現在のＣＡＲ設計と比較して、より精密に制御され得る、Ｔ細胞のためのＣＡＲを構築する代替的アプローチを示す。実験を、少なくとも２または３キメラ融合タンパク質を含む新規、制御ＣＡＲシステムの開発のために設計した。初代Ｔ細胞活性化シグナルおよび阻害性シグナルは、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)として知られる、ＮＫ細胞の天然に存在する活性化および阻害性受容体に基づいた。

ＫＩＲは、受容体の細胞内ドメインにより、活性化および阻害性形態の両者で存在する。活性化ＫＩＲは、そのシグナルを、これらのタンパク質の膜貫通ドメイン内の残基により補充される、免疫チロシンベースの活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)含有膜タンパク質、ＤＡＰ１２との相互作用により伝達する。阻害性ＫＩＲは、ＮＫ細胞溶解性およびサイトカイン産生活性阻害に至る、活性化シグナルを無効にする免疫チロシンベースの阻害性モチーフ(ＩＴＩＭ)を含む細胞質ドメインを担持する。ＴＣＲに類似して、ＫＩＲは、タンパク質受容体の免疫グロブリンファミリーに属し、大部分が不変ＭＨＣおよびＭＨＣ様リガンドに結合する。何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、これらの相互作用が、正常細胞(通常高密度ＭＨＣクラスＩ発現)と、悪性またはウイルス感染細胞(しばしばＭＨＣクラスＩが低いかまたはない)を自然に区別するのに利用されると考えられる。

ＫＩＲ様キメラ抗原受容体(ＫＩＲ−ＣＡＲ)は、図１のような目的の標的抗原に対するｓｃｆｖと、活性化および阻害性ＫＩＲの融合により構築されている。Ｔ細胞の条件的活性化は、目的の悪性細胞の抗原への、ｓｃｆｖを担持する、活性化ＫＩＲ−ＣＡＲ(ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲ)または標準ＴＣＲゼータＣＡＲの結合により産生される。正常組織に存在するが、悪性組織に存在しない抗原を指向するｓｃｆｖを担持する阻害性ＣＡＲ(ｉｎｈＣＡＲ)は、Ｔ細胞が正常細胞に遭遇したとき、活性化ＣＡＲ一次シグナルの減衰を提供する。阻害性ＣＡＲの有用な標的として働く抗原の例は、エフリン受容体(Pasquale, 2010, Nat Rev Cancer 10(3):165-80)およびクローディン(Singh et al., 2010, J Oncol, 2010:541957)を含み、これらは、正常組織の上皮性細胞で発現されるが、しばしば、癌(例えばＥＰＨＡ７)により選択的に失われる。

実施例２：活性化ＫＩＲ−ＣＡＲ構築および活性
実験を、現在治験中である、ＴＣＲゼータ細胞質ドメインに基づき、ＣＡＲに先に取り込まれた、抗ＣＤ１９または抗メソテリンｃＦｖ(ＳＳ−１)の有効に基づき、活性化ＫＩＲ−ＣＡＲを構築するために設計した。ヒトＫＩＲ２ＤＳ２活性化ＫＩＲ受容体を、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲの最初のベース受容体として選択した。活性化シグナルを送達するために、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲは、通常Ｔ細胞で発現されないＤＡＰ１２の共発現を必要とした。それゆえに、２Ａリボソームスキップペプチドに基づく“バイシストロニック”遺伝子カセットを使用する、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲとヒトＤＡＰ１２の両者を発現するレンチウイルスベクターを構築した。レンチウイルスベクターのダイアグラムを図２に記載する。最初の試験は、ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲが初代ヒトＴ細胞およびメソテリンに結合したＳＳ１ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲが効率的に発現されたことを示した(図３)。先に開発され、公開されたＳＳ１ｓｃＦｖＣＤ３ゼータ(ＳＳ１−ζ)ＣＡＲ(Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106(9):3360-5)に類似して、ＳＳ１ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲを発現するＴ細胞は、図４に示すように、メソテリンリガンドを発現するように操作した標的Ｋ５６２細胞(ＫＴ−ｍｅｓｏ)に細胞毒性活性を示した。メソテリン標的を欠く野生型Ｋ５６２を殺す受容体は示されなかった。

メソテリン陽性標的細胞に対するＳＳ１ＫＩＲＣＡＲの細胞毒性活性が同等なＣＡＲ表面発現を有する同抗原をターゲティングする標準ＴＣＲゼータベースのＣＡＲより低かったため、メソテリンＣＡＲは、その長さのためにＣＤ４５から偏折するのに最適ではない細胞外ヒンジ(野生型ＫＩＲ２ＤＳ２に基づく)を有し得ると考えられた。ＣＤ４５からの活性化ＩＴＡＭベースの受容体の動態隔離は、ＴＣＲ活性化の重要な機構であり、Ｔ細胞と標的細胞膜の間の約１４〜１５nmの規模の長さに依存する(Choudhuri et al., 2005, Nature 436(7050):578-82)。ＫＩＲ２ＤＳ２ベースのＳＳ１ＫＩＲ−ＣＡＲは、メソテリンの部分的結晶構造に基づき２０nmより長い規模を有すると推定され、ＳＳ１エピトープが、標的細胞膜から約１０nm距離であり(Ma et al., 2012, J Biol Chem 287(40):33123-31)および約１０nmと概算されるＣＡＲの可能性を示し、ｓｃＦｖに加えて各Ｉｇ様ドメインがＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジにおいて約３.５nmであると推定される。それゆえに、図５に模式的に示すようなＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジが除かれた活性化ＫＩＲＣＡＲ(ＫＩＲＳ２ＣＡＲ)を構築した。ＳＳ１ｓｃＦｖベースのＫＩＲＳ２ＣＡＲが、完全長野生型ＫＩＲ２ＤＳ２へのＳＳ１ｓｃＦｖの融合により形成したＣＡＲと比較して、メソテリン発現標的細胞に対する増強された細胞溶解性活性を示した(図６)。この最適化ＫＩＲＳ２ＣＡＲはまたＣＤ８アルファ細胞外ヒンジを有するＳＳ１ｓｃＦｖベースのＴＣＲゼータＣＡＲを超える増強された活性も示した。

実施例３：ＩｎｈＫＩＲ−ＣＡＲ構築および活性
阻害性ＫＩＲ−ＣＡＲを、阻害性ＫＩＲ２ＤＬ３受容体ベースへの抗メソテリンＳ１ｓｃＦｖの融合に基づき構築した。初期の試験は、ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲが初代ヒトＴ細胞で効率的に発現されることを示した。ＣＤ１９ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲ、ＳＳ１ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲおよびＳＳ１ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲ単独または組み合わせを、ＮＦＡＴ駆動プロモーター制御下にｄｓＧＦＰレポーター担持ＪｕｒｋａｔＴ細胞に導入し、この重要なＴ細胞シグナル伝達経路の活性化をモニターした。ＣＤ１９ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲまたはＳＳ１ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲ単独を発現するＪｕｒｋａｔＴ細胞は、ＣＤ１９およびメソテリン(ＫＴ−ｍｅｓｏ／ＣＤ１９)の両者を発現するＫ５６２により効率的に発現されたが、ＣＤ１９ａｃｔＫＩＲ−ＣＡＲおよびＳＳ１ｉｎｈＫＩＲ−ＣＡＲを共発現するＪｕｒｋａｔＴ細胞は、同ＫＴ−ｍｅｓｏ／ＣＤ１９標的細胞による活性化の著しい減少を示した(図７Ａ)；しかしながら、イディオタイプ特異的試薬を使用するＣＤ１９およびメソテリンｃＦｖ結合の表面発現の分析は、驚くべきことに、異なるｓｃＦｖ標的特異性の発現が相互排他的であることを示した(図７Ｂ)。

実施例４：天然阻害性受容体システムに対する活性化ＫＩＲ−ＣＡＲ設計の感受性
２ｓｃＦｖＣＡＲの共発現が限定的であるため、ＰＤ−１受容体由来の阻害性シグナルに対するＫＩＲベースの活性化ＣＡＲの感受性を評価する戦略を進めた。ＰＤ−１は、ＴＣＲシグナル伝達を負に制御するホスファターゼを集めるために、阻害性ＫＩＲと同様に細胞質ドメインにおいてＩＴＩＭを使用するＴ細胞における天然受容体である。略図を図１９に示す。ここに提示する結果は、野生型ＰＤ−１がメソテリンをターゲティングする活性化ＫＩＲベースのＣＡＲおよびＴＣＲゼータベースのＣＡＲの両者で過発現することを示す(図８Ａおよび８Ｃ)。結果はまた、この組み合わせが、メソテリン特異的活性化ＫＩＲ−ＣＡＲ細胞毒性のＰＤ−１リガンド１(ＰＤＬ−１)依存性阻害に至ることを示す(図９)。Ｔ細胞(すなわちＰＤ−１遺伝子導入していないＴ細胞)により発現される正常ＰＤ−１の状況で、ＫＩＲ−ＣＡＲは、ＴＣＲゼータベースのＣＡＲと比較して、ＰＤ−Ｌ１過発現標的細胞に遭遇したとき、低阻害を示した。何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、これは、一般に阻害性受容体リガンドを発現する腫瘍に遭遇したとき、ＫＩＲ−ＣＡＲの利点となり得ると考えられる。

実施例５：ＫＩＲＣＡＲの共刺激依存的活性化
実験を、Kloss et al. (Kloss et al., 2013, Nat Biotechnol 31(1):71-5)による標準ＣＡＲについての記載と比較して、ＫＩＲ−ＣＡＲシステムにおけるキメラ共刺激性受容体(ＣＣＲ)の効果を測定するように設計した。実験はまたアゴニスト抗体、クローン９.３を使用する、Ｔ細胞における内因性ＣＤ２８受容体の結合による、ＫＩＲについての共刺激性依存性活性化要求を評価するためにも設計した。図１４に示すように、ＫＩＲＳ２ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激非存在下で、メソテリン陽性標的に応答して強固な増殖を示した。この増殖は、共刺激が増殖に重要であることを示した、ＴＣＲゼータＣＡＲでの観察より優れた。このデータは、ＫＩＲベースのＣＡＲが、抗原特異的増殖についてＴＣＲゼータＣＡＲと同じ共刺激要求を有しない可能性があり(Milone et al., 2009, Mol Ther 17(8):1453-64; Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106(9):3360-5)、この共刺激独立性は、現在のＴＣＲゼータベースのＣＡＲに対するＫＩＲベースのＣＡＲの顕著な利点であり得ることを示唆する。実験を、インビボ前臨床設定にける共刺激性ドメイン存在下および非存在下のＣＡＲに対するＫＩＲベースのＣＡＲを試験するために、ヒト化マウスにおけるＫＩＲベースのＣＡＲを評価するために設計した(実施例５におけるデータおよび実験を実施例６にも示す)。

実施例６：キラー免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)ベースのキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)は、固形腫瘍における強固な細胞毒性活性を誘発する
ＣＤ３−ζおよび共刺激性受容体の細胞質ドメインにｃｉｓで連結した抗原結合ドメインを担持するキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)は、Ｔ細胞毒性を腫瘍に向ける操作のために強力な方法を提供する(Grupp et al., The New England journal of medicine, 368(16):1509-18, 2013; Brentjens et al., Science translational medicine, 5(177):177ra38, 2013; Porter et al., The New England journal of medicine, 365(8):725-33, 2011)。メソテリンをターゲティングする単鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)(ＳＳ１)が、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞において正常に発現される刺激性キラー免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)であるＫＩＲ２ＤＳ２の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに連結した代替的キメラ受容体をここに記載する。このＳＳ１−ＫＩＲＳ２ＫＩＲベースのＣＡＲは、アダプター分子ＤＡＰ１２と組み合わせてヒトＴ細胞に導入されたとき、インビトロ強固な抗原特異的細胞毒性活性およびサイトカイン分泌および増殖のようなエフェクター機能を誘発する。ＫＩＲ−ＣＡＲおよびＤＡＰ１２を発現するように修飾したＴ細胞は、標準ＣＤ３ζベースのＣＡＲを形質導入したＴ細胞と比較して、抵抗性腫瘍異種移植モデルにおいて顕著に増強された抗腫瘍活性を示し、ＫＩＲベースのＣＡＲが、第二および第三世代ＣＤ３ζベースのＣＡＲを制限する腫瘍内の阻害性シグナルに打ち勝つことができることを示す。ここに提供するデータは、さらに、固形腫瘍を含む癌におけるＫＩＲベースのＣＡＲの臨床的評価を支持する。

“第一世代”ＣＡＲは、特異的抗原ターゲティングのための抗体からの単鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)を使用する、単一キメラ受容体への免疫チロシンベースの活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)含有細胞質ドメインの取り込みにより設計された(Sadelain et al., Cancer discovery, 3(4):388-98, 2013)。ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢおよびＯＸ−４０のような共刺激性受容体からの多数の異なるさらなるシグナル伝達ドメインを、Ｔ細胞の増殖、生存および機能を増強するためにこれらの受容体にタンデムで取り込んだ(Finney HM et al. J Immunol. 1998;161:2791-2797; Maher J. et al. Nat Biotech 2002; 20:70-75; Finney HM et al. J Immunol. 2004; 18:676-684; Milone et al., 2009, Mol Ther 17(8):1453-64; Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106(9):3360-5)。これらの“第二世代”(１共刺激性ドメイン)および“第三世代”(２共刺激性ドメイン)ＣＡＲは、癌の前臨床動物モデルで機能の増強を示し、数共刺激増強ＣＡＲが、現在、癌の初期相ヒト臨床試験にある(Barrett DM et al. Ann Rev Med 2014; 65:333-347にレビュー)。

一本鎖ＣＡＲが強固な抗原特異的細胞毒性活性を誘発するが、高度に保存されたＩＴＡＭドメインを利用する天然受容体を、一般にＴ細胞受容体(ＴＣＲ)−ＣＤ３複合体、Ｂ細胞受容体(ＢＣＲ)−Ｉｇα／β複合体およびＦｃ受容体(ＦｃＲ)複合体のような、別々のリガンド結合およびＩＴＡＭ含有シグナル伝達鎖からなる、多鎖複合体に構築する。多鎖免疫受容体複合体の潜在的利益は、リガンド結合とシグナル伝達分子の間の多相互作用を経て利用可能なシグナルの大きな多様性およびリガンド結合鎖の内在化と分離可能な持続性ＩＴＡＭシグナル伝達を含んで多様である点である(Sigalov et al., Advances in experimental medicineおよびbiology, 640:ix-xi, 2008)。通常異種受容体に見られる数受容体の要素のＣＡＲへの組み合わせの結果は、十分には解明されていない；しかしながら、アネルギーおよび抗原非依存的シグナル伝達がある設計で観察されている(Brocker, Blood, 96(5):1999-2001, 2000; Brocker et al., The Journal of experimental medicine. 181(5):1653-9, 1995; Milone et al., Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy, 17(8):1453-64, 2009)。

ここに請求する本発明は、受容体複合体内のサブユニットと免疫細胞内の他の受容体の天然に選択された相互作用により、Ｔ細胞活性化に大きな効力を有する、より“天然”多鎖免疫受容体設計により構築されたＣＡＲである。キラー免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)およびＤＡＰ１２多鎖免疫受容体複合体はＣＡＲの基礎として選択された((Thielens et al., Current opinion in immunology, 24(2):239-45, 2012)。天然細胞毒性に寄与する場所であるナチュラルキラー細胞により発現されるが、ＫＩＲ発現はまたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞でも見られる(Moretta et al., Immunological reviews, 155:105-17, 1997; Falk et al., Human immunology; 61(12):1219-32, 2000; Remtoula et al., Journal of immunology, 180(5):2767-71, 2008)。ＫＩＲ２ＤＳ２のような活性化ＫＩＲは、内在性シグナル伝達活性が知られていない短細胞質ドメインを有する。しかしながら、ＫＩＲは、ＮＫ細胞において、ＤＡＰ１２、ＳｙｋおよびＺａｐ７０キナーゼの結合ができるＩＴＡＭ含有アダプター分子の二量体と非共有結合複合体を形成する(Lanier et al., Nature, 391(6668):703-7, 1998)。リガンド結合による細胞毒性刺激に加えて、ＫＩＲはまたＤＡＰ１２非存在下でＴ細胞内で共刺激性効果を示すことも示され、これらの分子がＴ細胞における一次誘起活性および共刺激の両者を提供できることを示唆する(Snyder et al., Journal of immunology, 173(6):3725-31, 2004)。

図１に模式的に示すように、メソテリン特異的ＳＳ１ｓｃＦｖを活性化ＫＩＲ、ＫＩＲ２ＤＳ２(ＳＳ１−ＫＩＲＳ２)の膜貫通および短い細胞質ドメインにスプライシングすることにより、ＫＩＲベースのＣＡＲを構築した(Hassan et al., Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research, 8(11):3520-6, 2002)。ＩＴＡＭ含有アダプター分子、ＤＡＰ１２は、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞において構成的に発現されるが、ヒトＴ細胞のサブセットにおいてのみ発現される(Moretta et al.)。それゆえに、両方の分子の同時発現を達成するために、テッサザイニアウイルス２Ａ(Ｔ２Ａ)配列によって分離されたメソテリン特異的ＫＩＲ−ベースのＣＡＲ(ＳＳ１−ＫＩＲＳ２)およびＤＡＰ１２分子の両方をコードするバイシストロニックレンチウイルスベクターを作製した(図２)。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８活性化後のＳＳ１−ＫＩＲＳ２およびＤＡＰ１２バイシストロニックレンチウイルスによる初代ヒトＴ細胞の形質導入は、ＣＤ３ζベースのＳＳ１ζ ＣＡＲに匹敵するＳＳ１−ＫＩＲＳ２の強固な表面発現を示した(図６)。偽遺伝子導入Ｔ細胞またはＴ細胞形質導入ＣＤ３ζ細胞質ドメインを含むメソテリン特異的ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞で観察された動態と同等の動態で、ポリクローナル抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激後にＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２共形質導入Ｔ細胞が拡大した(データは示さず)。ＫＩＲベース対ＣＤ３ζ(ＳＳ１−ｚ)ＣＡＲＴ細胞の細胞毒性活性を比較した。ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２形質導入Ｔ細胞は、ＳＳ１ζ構築物と同程度の強度で、ヒトメソテリン(Ｋ−ｍｅｓｏ)を発現するＫ５６２細胞に強力な細胞毒性活性を示した。操作Ｔ細胞のいずれも、野生型Ｋ５６２(Ｋｗｔ)に溶解性活性を示さず、同族メソテリン標的抗原によるＳＳ１−ＫＩＲＳ２受容体の特異的活性化を支持する(図６)。

ＫＩＲ２ＤＳ２の発現が、検出可能なＤＡＰ１２発現の非存在下でのＴ細胞において記載されているため、ＤＡＰ１２共送達の存在下または非存在下のＳＳ１−ＫＩＲＳ２受容体の発現および機能を評価した。ＤＡＰ１２を赤色蛍光タンパク質、ｄｓＲｅｄ(ＤＡＰ１２−ｄｓＲｅｄ)またはｄｓＲｅｄ発現対照ベクター(ｄｓＲｅｄ)と共発現するレンチウイルスベクターを使用して、Ｔ細胞をレンチウイルスＤＡＰ１２または対照ベクターで形質導入、続いてＳＳ１−ＫＩＲＳ２を発現するインビトロ転写ＲＮＡで遺伝子導入した。ＳＳ１−ＫＩＲＳ２は、ＤＡＰ１２の添加なしで、Ｔ細胞表面に発現された；しかしながら、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２の表面発現は、ＤＡＰ１２添加で、約１log増加した(図１２Ａ)。ＳＳ１−ＫＩＲＳ２の発現にも関わらず、ＤＡＰ１２無しのＴ細胞は、メソテリン発現標的細胞を溶解せず、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２惹起Ｔ細胞毒性活性におけるＤＡＰ１２の必要性を示す(図１２Ｂ)。これらのデータは、キメラＫＩＲがＴ細胞クローンの天然ＫＩＲ２ＤＳ２受容体について以前に報告されているようなＤＡＰ１２とのその関連性とは独立してシグナルを提供する可能性を排除するものではない(Snyder et al.)。

天然ＫＩＲ２ＤＳ２とＤＡＰ１２の非共有結合は、ＫＩＲ膜貫通(ＴＭ)ドメインのアスパラギン酸残基とＤＡＰ１２ＴＭドメインのリジン残基との間の静電相互作用に依存する(Feng et al., PLoS biology, 4(5):e142, 2006)。ＴＣＲおよびＣＤ３サブユニットのＴＭドメインにおけるこれらのイオン化可能なアミノ酸残基の配置は、相互作用にある特異性を提供するＫＩＲおよびＤＡＰ１２とは異なると考えられるが、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２が共送達ＤＡＰ１２の代わりにＣＤ３複合体の成分との相互作用する可能性を検討した。ＣＤ３複合体とＴＣＲ鎖との結合は細胞表面上のＴＣＲ発現に必要であるため、ＣＤ３成分に対するＫＩＲの競合は、以前にクローン化されたＴＣＲの発現で観察された正常なＴＣＲ発現を妨げると予想される。異所性Ｖβ鎖のＴ細胞への導入は、複合体アセンブリ中の競合のために、内因性内因性ＴＣＲＶβの表面発現を減少させることが示されている(Varela-Rohena et al., Nature medicine, 14(12):1390-5, 2008)。偽形質導入対照Ｔ細胞と比較した、ＫＩＲＳ２形質導入ポリクローナルＴ細胞におけるＴＣＲＶβ １３.１＋の同様の頻度および強度は、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２と内因性ＣＤ３複合体のメンバーとの間の有意な相互作用の不在を支持する(図１３)。

細胞傷害活性は、Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍活性にとって重要なエフェクター機能であるが、サイトカイン分泌およびＴ細胞増殖を誘発する抗原受容体の能力も、一般にインビボでの強力な抗腫瘍活性と相関する重要な特徴である。それゆえに、共刺激性ドメインなしまたはＣＤ２８もしくは４−１ＢＢ共刺激性ドメイン(それぞれＳＳ１−２８ζおよびＳＳ１−ＢＢζ)を伴うＣＤ３ζベースのＣＡＲを担持するＴ細胞(ＳＳ１−ζ)に対する、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２修飾Ｔ細胞による抗原惹起インターフェロン−γ(ＩＦＮ−γ)およびインターロイキン−２(ＩＬ−２)分泌を比較した。ＳＳ１−ζ構築物は、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両者の最低の分泌を刺激した(図１０、１１)。インターフェロン−γ産物は増加し、Ｔ細胞発現ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２またはＳＳ１−ＢＢζで同等であったが、ＳＳ１−２８ζ ＣＡＲを発現するＴ細胞は、顕著に多いＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産物を示した(図１０)。サイトカインおよびケモカインのより大きなパネルの分析は、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２はＳＳ１−ζおよびＳＳ１−ＢＢζ ＣＡＲに匹敵する匹敵する抗原誘発サイトカインおよびケモカイン分泌の大きさを有するＣＤ３ζベースのＣＡＲ全体で質的に類似した発現パターンを刺激することを示す(図１１)。

ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２受容体も、同族抗原に応答してＴ細胞増殖の強力なスティミュレーターであった(図１４)。ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２Ｔ細胞は、強力な増殖のための追加の補助刺激シグナルに依存する標準ＳＳ１−ζ ＣＡＲとは異なり、抗ＣＤ２８アゴニスト抗体の添加によりＳＳ１ζに匹敵する増殖を示す。ＤＡＰ１２の非存在下でのＳＳ１−ＫＩＲ２により提供される共刺激の機構は、他のアダプター分子とのＫＩＲ相互作用に関連する(Synder et al.)。Ｔ細胞によって天然に発現されるさらなる受容体は、Ｔ細胞の活性化および増殖にさらに寄与する共送達ＤＡＰ１２を利用することもできる。特に、インテグリンはＴ細胞に共刺激シグナルを提供することができる(Brunmark et al. (1996) PNAS USA 93(25):14736-41; Zuckerman et al. (1998) J. Immunol. 160(7):3259-68)。ＤＡＰ１２は、マクロファージおよび好中球におけるインテグリンによる裏返しシグナル伝達に重要であるように見え(Jakus et al. (2007) Trends in Cell Biol. 17(10):493-501; Mocsai et al. (2006) Nature Immunol. 7(12):1326-33)、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２活性に貢献するＴ細胞におけるＬＦＡ−１および他のインテグリンへの独特なシグナル伝達活性に貢献し得る。

ＣＤ２８および４−１ＢＢは、インビボでのＣＡＲＴ細胞活性のためにＣＡＲに導入されている(Carpenito et al. (2009) PNAS USA 106(9):3360-65)；しかしながら、共刺激は、常に免疫抑制性腫瘍微小環境に打ち勝つわけではない。最近、ＥＭ−ｍｅｓｏ細胞(悪性中皮腫を有する患者の胸膜浸出液由来の細胞株)の異種移植片を担持する免疫欠損ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ_ｃ ^−／−(ＮＳＧ)マウスに注射されたＳＳ１−ＢＢζ ＣＡＲＴ細胞が、インビボで拡張するが、腫瘍微小環境内で、腫瘍浄化の失敗と相関する機能低下となることが報告された(Moon et al. (2014) Clinical Cancer Res. 20:4262-4273)。ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２修飾Ｔ細胞細胞の活性は、この中皮腫の高耐性モデルにおいて評価された。共刺激を伴うまたは伴わないＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２およびＣＤ３ζベースのＣＡＲは、インビトロでＥＭ−ｍｅｓｏ細胞を同等の有効性で溶解することができる。偽遺伝子導入およびＤＡＰ１２−ｄｓＲｅｄ形質導入Ｔ細胞は、ＥＭ−ｍｅｓｏ細胞に対する最小の溶解活性を示す(図３６)。偽、ＳＳ１ζおよびＳＳ１ＢＢζ形質導入Ｔ細胞の単回静脈内注射は、確立されたＥＭ−メソ異種移植片に対して観察可能な抗腫瘍効果を有さなかった(図１５Ａ)。腫瘍増殖は、ＳＳ１−２８細胞ＣＡＲＴ細胞によって顕著に遅延した；しかしながら、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２修飾Ｔ細胞のみが、５２日目にＥＭ−メソ腫瘍増殖を有意に抑制した腫瘍の退縮を誘導した(ｐ＜０.００１、事後ＳｃｈｅｆｆｅＦ検定を伴うＡＮＯＶＡ)。ＳＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２をＤＡＰ１２単独またはＳＳ１−２８ζ操作Ｔ細胞と比較する第２の実験は、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２Ｔ細胞の同様の増強された抗腫瘍活性を示した(図３８)。ＫＩＲベースのＣＡＲの強力な活性は、メソテリン特異性に独特のものではない。ＣＤ１９特異的ＫＩＲベースのＣＡＲもまた、第二世代ＣＤ３ζ ＣＡＲに匹敵するインビトロ活性で構築された(図１６Ｂ)。ＮＡＬＭ−６白血病異種移植モデルにおける試験はまた、第一世代のＣＡＲより優れており、−１ＢＢ共刺激性ドメインを有する第二世代ＣＡＲに匹敵するＫＩＲ−ＣＡＲの有効性を示した。

ＥＭ−メソ異種移植モデルにおけるＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２Ｔ細胞の増強された抗腫瘍活性の機序を探索するために、Ｔ細胞生着および腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)の分析を行った。ＳＳ１−ＢＢζ ＣＡＲＴ細胞を受けたマウスのみが、血液および脾臓において検出可能なヒトＣＤ４５(ｈＣＤ４５)陽性細胞を有し、インビボＣＡＲ＋Ｔ細胞の持続性に対する４−１ＢＢ補助刺激ドメインの以前に観察された効果と一致した(Milone et al.)。ｈＣＤ４５＋腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)は、偽又はまたはＳＳ１ζ処置マウスにおいてほとんど検出されなかった。対照的に、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２、ＳＳ１−２８ζおよびＳＳ１−４１ＢＢζ ＣＡＲＴ細胞で処置した腫瘍は、各群で同等な頻度で、総生存可能細胞の２〜４％を構成するｈＣＤ４５＋ＴＩＬを有した(図１５Ｂ)。免疫組織化学染色は、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２、ＳＳ１−２８ζおよびＳＳ１−４１ＢＢζ ＣＡＲＴ細胞処置マウスの腫瘍内のＣＤ８＋およびＣＤ４＋ＴＩＬ(データは示していない)を示し、フローサイトメトリー分析を確認する。ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２Ｔ細胞の増加した効力は、それゆえに、腫瘍増殖の後期の腫瘍内のＴＩＬ頻度と無関係である。ＴＩＬの比較が、後の時点の腫瘍体積の大きな差異により制限されるため、Ｔ細胞注射後の早期時点を評価した。Ｔ細胞注射後１０日目、ｈＣＤ４５＋ＴＩＬの同等な結果がＳＳ１−２８ζおよびＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２ＣＡＲＴ細胞処置群で観察されたが、ＳＳ１−ＢＢζ ＣＡＲＴ細胞群にはほとんどＣＤ４５＋ＴＩＬが存在しなかった(図１５Ｂ)。これらの単離ＴＩＬの制限された分析は、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２ＣＡＲＴ細胞のみが、ＥＭ−ｍｅｓｏ細胞に対するインビトロ溶解性活性が可能であったことを示す(データは示していない)。これらの結果は、腫瘍誘発低機能とともに、腫瘍へのＳＳ１−ＢＢζ Ｔ細胞の遅延蓄積が、腫瘍発達部位での高い頻度にも関わらず、これらの細胞の乏しい抗腫瘍活性の根底となることを示す。反復実験を実施し、Ｔ細胞注射後１８日目に単離したＴＩＬを有するＳＳ１−２８ζおよびＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２ＣＡＲＴ細胞を比較し、表現型および機能的分析のための多数のＴＩＬを得た。単離ＳＳ１−２８ζ ＴＩＬは、処置に使用した凍結保存Ｔ細胞と比較して、有意に現象した細胞毒性活性および抗原特異的ＩＦＮ−γ産物を示した。対照的に、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２ＣＡＲＴ細胞処置腫瘍からのＴＩＬは、凍結保存細胞と同等のインビトロ細胞毒性およびＩＦＮ−γ産物を示した(図１５Ｅおよび図３７)。ＴＩＬおよび凍結保存細胞からのＣＡＲタンパク質についてのタンパク質用怪物の免疫ブロッティングは、ＣＡＲ発現の喪失を示す(データは示していない)。ＴＩＬへのＣＡＲの不在は、腫瘍微小環境内の非形質導入Ｔ細胞に対する、ＳＳ１−２８ζ ＣＡＲＴ細胞の発現下方制御または乏しい生存によるものであろう。

結論として、ここに提供するデータは、ＫＩＲベースのＣＡＲおよびＤＡＰ１２の組み合わせが、Ｔ細胞に対する人工抗原特異性を付与するための非常に有効な抗原特異的受容体システムを提供することを示す。ほぼ同等なインビトロ活性にもかかわらず、さらに、このＫＩＲベースのＣＡＲが、ここで使用するモデル腫瘍システムにおいて、１以上の共刺激性ドメインとＣＤ３ζに基づくＣＡＲと比較して、恐らく、不活性化に対する耐性の増加による、改善はるかに改善された抗腫瘍効果を有することを示した。この増加した有効性およびのＤＡＰ１２関連リガンド結合受容体ならびにＦｃＲγのようなさらなる天然ＩＴＡＭ含有受容体システムに基づくキメラ受容体設計の機構へのさらなる調査を進める。

実施例７：ＫＩＲベースのＣＡＲは、標的細胞のＨＬＡ発現による調節を可能にする天然阻害性ＫＩＲと共発現させることができる
ＫＩＲ２ＤＬ３リガンドＨＬＡ−Ｃｗを発現するＫ５６２−ｍｅｓｏ細胞株の産生および特徴づけ
材料および方法：野生型Ｋ５６２細胞または予めメソテリンを発現するように操作したＫ５６２株(Ｋ５６２−ｍｅｓｏ)に、ＨＬＡ−Ｃｗ３アレルをコードするレンチウイルスベクターを形質導入した。細胞は、蛍光活性化細胞ソーティングによってメソテリンおよびＨＬＡ−Ｃｗ３の一様な発現について選別した。ＨＬＡ−Ｃｗ３発現は、ＡＰＣにコンジュゲートしたＷ６／３２抗ＨＬＡＡ、Ｂ、Ｃ抗体で染色した後、フローサイトメトリーによって確認した。

結果：メソテリンまたはＨＬＡ−Ｃｗ３単独または組み合わせで発現するＫ５６２細胞株を産生できる(図２０)。

初代ヒトＴ細胞におけるＳＳ１−ＫＩＲＳ２およびＫＩＲ２ＤＬ３の共発現
材料および方法：初代ヒトＴ細胞を、抗ＣＤ３／２８マイクロビーズで刺激し、活性化後１日目にＤＡＰ１２およびＳＳ１−ＫＩＲＳ２単独でまたはＫＩＲ２ＤＬ３を発現するレンチウイルスベクターと組み合わせて発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターのいずれかでの形質導入にした。ＳＳ１−ＫＩＲＳ２ＣＡＲの発現を、ビオチニル化ヤギ抗マウスＦ(ａｂ)２ポリクローナル抗体と続くＳＡ−ＡＰＣを使用するフローサイトメトリーにより評価した。ＫＩＲ２ＤＬ３発現を、ＫＩＲ２Ｄ特異的モノクローナル抗体により評価した。

結果：メソテリン特異的ＫＩＲベースのＣＡＲとＤＡＰ１２(ＫＩＲＳ２)単独、ＫＩＲ２ＤＬ３単独または２受容体の組み合わせを発現する初代ヒトＴ細胞を産生できた(図２１)。

ＫＩＲＣＡＲと共発現させたＫＩＲ２ＤＬ３は、標的細胞のＨＬＡ−Ｃｗ存在下、抗原特異的細胞毒性を抑制できる
材料および方法：初代ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３／２８マイクロビーズで刺激し、ＤＡＰ１２およびＳＳ１−ＫＩＲＳ２を発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターで形質導入した。５μgのインビトロ転写ｍＲＮＡコード化ＫＩＲ２ＤＬ３を、エクスビボ拡大１０日後、レンチウイルス形質導入Ｔ細胞にエレクトロポレーションにより導入した。これらのＴ細胞集団を、記載するように種々のエフェクターＴ細胞対標的Ｋ５６２細胞比(Ｅ：Ｔ比)で^５１Ｃｒ標識Ｋ５６２標的細胞(Ｋ５６２、Ｋ５６２−ｍｅｓｏ、Ｋ５６２−ＨＬＡＣｗおよびＫ５６２−ｍｅｓｏ／ＨＬＡＣｗ)に添加した。細胞毒性を、４時間で上清から放出される^５１Ｃｒの画分の測定により決定した。

結果：ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２発現Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ｃｗ３発現と関係なく、メソテリンを発現するＫ５６２細胞を死滅できた。対照的に、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２受容体複合体および阻害性ＫＩＲ、ＫＩＲ２ＤＬ３を共発現するＴ細胞は、ＨＬＡ−Ｃｗ３とともにメソテリンを発現するＫ５６２に対して強固な細胞毒性を示さなかった；しかしながら、これらの細胞は、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２修飾Ｔ細胞に匹敵するメソテリンのみを発現するＫ５６２細胞に対する細胞毒性活性を示した。これらの結果は、阻害性ＫＩＲ受容体が活性化ＫＩＲベースのＣＡＲの機能活性を調節する能力を示す(図２２)。

実施例８：ＣＤ１９特異性を有するＫＩＲベースのＣＡは、インビトロおよびインビボで抗原特異的標的細胞毒性を誘発できる
ＣＤ１９特異性を有するＫＩＲベースのＣＡＲは、インビトロで抗原特異的標的細胞毒性を誘発できる
材料および方法：抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ活性化後、Ｔ細胞を、ＤＡＰ１２のみを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを、ＦＭＣ６３由来ｓｃＦｖが完全長ＫＩＲ２ＤＳ２に融合しているＣＤ１９特異的ＫＩＲベースのＣＡＲ(ＣＤ１９−ＫＩＲ２ＤＳ２)または短リンカー[Ｇｌｙ]_４−Ｓｅｒリンカーを経てＦＭＣ６３ｓｃＦｖの膜貫通ドメインとＫＩＲ２ＤＳ２の細胞質ドメインを融合することにより産生したＫＩＲベースのＣＡＲ(ＣＤ１９−ＫＩＲＳ２)のいずれかと形質導入した。形質導入Ｔ細胞を対数増殖期の最後まで培養し、ＣＤ１９特異的ＫＩＲベースのＣＡＲの発現を、ビオチニル化ヤギ抗マウスＦ(ａｂ)２ポリクローナル抗体、続くＳＡ−ＰＥを使用するフローサイトメトリーにより評価した。ＣＤ１９発現を有する(Ｋ５６２−ＣＤ１９)または有しない(Ｋ５６２−ｗｔ)^５１Ｃｒ標識Ｋ５６２標的細胞を、種々のＴ細胞対標的細胞比(Ｅ：Ｔ比)で混合した。細胞毒性を、４時間で上清から放出される^５１Ｃｒの画分の測定により決定した。偽遺伝子導入(ＮＴＤ)またはＣＤ１９に特異的なＣＤ３ζベースのＣＡＲで形質導入した(ＣＤ１９−ｚ)対照Ｔ細胞も、それぞれ、陰性および陽性対照として含ませた。

結果：フローサイトメトリー分析は、ＣＤ１９−ＫＩＲ２ＤＳ２、ＣＤ１９−ＫＩＲＳ２およびＣＤ１９−ｚで形質導入したＴ細胞の表面のＣＤ１９特異的ｓｃＦｖの発現を示す(図１６Ａ)。ＣＤ１９−ＫＩＲ２ＤＳ２またはＣＤ１９−ＫＩＲＳ２とＤＡＰ１２を発現すｒｕT細胞は、抗原特異的様式で標的細胞を死滅させることができた(図１６Ｂ)。ＫＩＲベースのＣＡＲ修飾Ｔ細胞により示される細胞毒性は、ＣＤ１９特異的ＣＤ３ζベースのＣＡＲを発現するＴ細胞と同等であるか、高かった。

ＣＤ１９−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２でのＴ細胞形質導入は、ヒト白血病異種移植における腫瘍退縮を誘発する
材料および方法：ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ_ｃ ^−／−(ＮＳＧ)マウスに、１００万Ｎａｌｍ−６ＣＢＧ腫瘍細胞、ＣＤ１９を発現する白血病細胞株を０日目に尾静脈から静脈内移植した。本実験において、Ｔ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８スティミュレータービーズで刺激し、続いて、図に示すように、共刺激性ドメイン(ＣＤ１９−ｚ、ＣＤ１９−ＢＢｚ)またはＣＤ１９特異的ＫＩＲベースのＣＡＲ、ＤＡＰ１２を有するＣＤ１９−ＫＩＲＳ２を伴うまたは伴わない一連のＣＤ３ベースのＣＡＲで１日目にレンチウイルス形質導入した。偽遺伝子導入Ｔ細胞(ＮＴＤ)を対照として使用した。Ｔ細胞を、対数増殖期の最後までエクスビボで拡張させ、白血病細胞株注射５日後、マウスあたり２００万ＣＡＲＴ細胞で静脈内注射した。腫瘍負荷を生物発光造影により評価した。５動物を、各Ｔ細胞条件で分析した (図１７)。

結果：示すインビボ実験において(図１７)、ＮＴＤＴ細胞は腫瘍増殖に影響を有さず、ＣＤ１９ｚ、ＣＤ１９ＢＢｚおよびＣＤ１９−ＫＩＲＳ２形質導入Ｔ細胞は種々の抗腫瘍効果を示した。ＣＤ１９ｚＴ細胞を注入したマウスは、腫瘍負荷のわずかな減少を示したが、検出可能レベルの蛍光を維持した。対照的に、ＣＤ１９ＢＢｚまたはＣＤ１９ＫＩＲＳ２Ｔ細胞を注入したマウスにおける腫瘍細胞蛍光は、Ｔ細胞注射わずか７日後、検出の加減まで低下し(図１７Ｂ、点線)、Ｔ細胞接近不可能な歯根における白血病細胞の小さな貯留槽の外側で完全なクリアランスを示した。１５目までに、偽Ｔ細胞群の腫瘍負荷はエンドポイント(２×１０^１０光子／秒)を超え、殺し、ＣＤ１９ＢＢｚおよびＣＤ１９ＫＩＲＳ２群の蛍光は、検出限界下限のままであった。

実施例９：ラクダ科単一ＶＨＨドメインベースのＣＡＲは、明らかな受容体相互作用なしに、ｓｃＦｖベースのＣＡＲと組み合わせてＴ細胞表面に発現され得る
材料および方法：ＮＦＡＴ依存性プロモーター(ＮＦ−ＧＦＰ)下にＧＦＰを発現するＪｕｒｋａｔＴ細胞を、メソテリン特異的活性化ＣＡＲ(ＳＳ１−ＣＡＲ)、ＣＤ１９特異的活性化(１９−ＣＡＲ)またはＥＧＦＲに特異的なラクダ科ＶＨＨドメインを使用して産生したＣＡＲ(ＶＨＨ−ＣＡＲ)で形質導入した。活性化ＣＡＲで形質導入後、細胞を、ＣＤ１９を認識するさらなる阻害性ＣＡＲＣＤ１９(１９−ＰＤ１)で形質導入し、活性化および阻害性ＣＡＲの両者を共発現する細胞を産生した(ＳＳ１＋１９ＰＤ１、１９＋１９ＰＤ１またはＶＨＨ＋１９ＰＤ１)。形質導入ＪｕｒｋａｔＴ細胞を、１)全標的抗原を欠く(Ｋ５６２)、２)メソテリン(Ｋ−ｍｅｓｏ)、ＣＤ１９(Ｋ−１９)またはＥＧＦＲ(Ａ４３１)のみを発現する、３)ＥＧＦＲおよびメソテリン(Ａ４３１−メソテリン)またはＣＤ１９(Ａ４３１−ＣＤ１９)の組み合わせを発現するまたは４)ＣＤ１９およびメソテリンの組み合わせを発現する(Ｋ−１９／ｍｅｓｏ)いずれかである種々の細胞株と２４時間共培養した。スティミュレーター細胞無し(ｎｏｓｔｉｍ)またはＫ５６２と１μｇ／mLのＯＫＴ３(ＯＫＴ３)を含むさらな条件も、それぞれ、ＮＦＡＴ活性化の陰性および陽性対照として包含させた。ＮＦＡＴ活性化のマーカーとしてのＧＦＰ発現を、フローサイトメトリーにより評価した。

結果：ラクダ科および関係する種(例えばラマ)は、単一重鎖様可変ドメインを有する抗体を天然に産生する。ラクダ科ＶＨＨドメインとして知られるこのドメインは、軽鎖可変ドメインと対合せずに存在するように進化している。図２７Ａは、2つの異種ｓｃＦｖ分子が、受容体共発現中の同族リガンドへのｓｃＦｖ結合の観察された破壊によって示されるように、細胞の表面に提示されたときに互いに解離して再会合する可能性を概略的に示す(図２５および図２６)。図２７Ｂは、ＶＨＨドメインベースのＣＡＲと組み合わせた細胞の表面上に提示されたｓｃＦｖＣＡＲの間の予想される減少した相互作用の概略図を示す。図２８は、Ｊｕｒｋａｔの表面上の２ｓｃＦｖベースのＣＡＲ(ＳＳ１−ｚ活性化ＣＡＲおよびＣＤ１９−ＰＤ１阻害性ＣＡＲ)の共発現が、活性化ＣＡＲ(ＳＳ１−ｚ)が、阻害性受容体リガンドの不在にも関わらず、そのＣＡＲに対するその同族リガンドを認識し、Ｔ細胞の活性化を引き起こすことを不可能とすることを示す。これは、観察された表面のリガンド結合の減少と一致する(図２５)。対照的に、同じ阻害性ＣＡＲ(ＣＤ１９−ＰＤ１)とラクダ科ＶＨＨベースの活性化ＣＡＲ(ＶＨＨ−ｚ)の共発現は、ＶＨＨベースの活性化ＣＡＲが同族ＥＧＦＲリガンドを認識する能力に影響を及ぼさない。これらのデータは、ＶＨＨベースの活性化ＣＡＲが、ｓｃＦｖとＶＨＨドメインとの相互作用の低下した能力に起因して受容体間の有意な相互作用なしにｓｃＦｖベースのＣＡＲで発現され得る、図２７Ｂに示されるモデルを支持する。

実施例１０：メソテリン特異性を有するＮＫｐ４６ベースのＮＣＲＣＡＲは、抗原特異的細胞毒性を誘発する
材料および方法：抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ活性化後、Ｔ細胞を、ＤＡＰ１２およびＳＳ１−ＫＩＲＳ２(対照)、またはＦｃεＲγおよびメソテリン特異的ＮＫｐ４６ベースのＣＡＲ(ＳＳ１−ＮＫｐ４６)またはＦｃεＲγおよび天然ＮＫｐ４６細胞外ドメインが切断されているメソテリン特異的ＮＫｐ４６ＣＡＲ(ＳＳ１−ＴＮＫｐ４６)を発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターで形質導入した。メソテリン特異的ＣＡＲの発現を、ビオチニル化ヤギ抗マウスＦ(ａｂ)２ポリクローナル抗体、続くＳＡ−ＰＥを使用するフローサイトメトリーにより評価した(図１８)。Ｔ細胞を、種々のエフェクターＴ細胞対標的Ｋ５６２細胞比(Ｅ：Ｔ比)でメソテリンを発現する^５１Ｃｒ標識Ｋ５６２標的細胞と混合した。細胞毒性を、自然発生的放出と比較した、４時間で上清から放出される^５１Ｃｒの画分の測定により決定した。

結果：ＳＳ１−ＮＫｐ４６およびＳＳ１−ＮＫｐ４６受容体両者は、Ｔ細胞表面発現を示す。ＳＳ１−ＮＫｐ４６形質導入Ｔ細胞は、ＫＩＲベースのＳＳ１−ＫＩＲＳ２ＣＡＲと同等な強固な標的細胞細胞溶解を示す。ＳＳ１−ＮＫｐ４６は、抗エフェクター対標的細胞比でのみ明らかであった弱い細胞毒性活性を示した(図１８)。これらのデータは、Ｔ細胞細胞溶解性活性の再指向に使用するための抗原特異的キメラ免疫受容体を、ＫＩＲベースのＣＡＲの創製に使用したのと同じ設計を使用して、天然細胞毒性受容体(ＮＣＲ)から産生できることを示す。

実施例１１：ｓｃＦｖドメインの相互作用
材料および方法：図２４において、ＪｕｒｋａｔＴ細胞を、メソテリン特異的阻害性ＫＩＲベースのＣＡＲ(ＳＳ１−ＫＩＲ２ＤＬ３)をコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。これらの形質導入細胞を、次いで、ＣＤ１９特異的活性化ＫＩＲベースのＣＡＲ(ＣＤ１９−ＫＩＲ２ＤＳ２)をコードするレンチウイルスベクターの種々の希釈で形質導入した。これらのＫＩＲ−ＣＡＲを図２３に模式的に示す。両ＣＡＲでの形質導入後、標的リガンドと結合できる完全ｓｃＦｖを有するＣＡＲの表面発現を有する細胞の頻度を、メソテリン−Ｆｃ融合タンパク質、続くＰＥで標識した二次的抗Ｆｃ抗体およびＡＰＣで標識した抗ＣＤ１９特異的(クローンＦＭＣ６３)抗イディオタイプモノクローナル抗体の両者での染色後、フローサイトメトリーにより評価した。図２５において、抗ＣＤ３／２８−活性化初代ヒトＴ細胞をＣ末端に融合したｍＣｈｅｒｒｙを担持するメソテリン特異的ＣＤ３ｚベースのＣＡＲ(ＳＳ１ｚ−ｍＣｈ)、ＣＤ３ｚおよび４−１ＢＢ細胞質ドメインを有するＣＤ１９特異的ＣＡＲ(１９ｂｂｚ)またはＳＳ１ｚ−ｍＣｈおよび１９ｂｂｚ両者の組み合わせをコードする種々のレンチウイルスベクターで形質導入した。ｍＣｈｅｒｒｙおよび機能的ＳＳ１ｓｃＦｖの発現を、メソテリン−Ｆｃ融合タンパク質での染色と続くＦＩＴＣ標識二次的抗Ｆｃ抗体での染色後、フローサイトメトリーにより評価した。図２６において、抗ＣＤ３／２８−活性化初代ヒトＴ細胞を、メソテリン特異的ＣＤ３ｚベースのＣＡＲ(ＳＳ１ｚ)、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖを担持するＣＤ１９特異的ＣＡＲ(１９ｂｂｚ)または２１ｄ４ｓｃＦｖを担持するＣＤ１９特異的ＣＡＲ(２１ｄ４ｂｂｚ)またはＢＬ２２ｓｃＦｖを担持するＣＤ１９特異的ＣＡＲ(ＢＬ２２ｂｂｚ)のいずれかをコードする種々のレンチウイルスベクターで形質導入し、ここで、ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ(Ｈ２Ｌ)における軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に５’の重鎖可変ドメイン(ＶＨ)またはＶＨ(Ｌ２Ｈ)に５’に位置するＶＬからなった。各ＣＤ１９特異的ＣＡＲでの形質導入後、Ｔ細胞を次いでＳＳ１ｚと共形質導入した。メソテリンへのＳＳ１ｚ結合および抗ＣＤ１９ｓｃＦｖの表面発現を、メソテリン−Ｆｃ融合タンパク質と、続くＦＩＴＣまたはビオチニル化タンパク質Ｌで標識した二次的抗Ｆｃ抗体と続くストレプトアビジンコンジュゲートＡＰＣでの染色後、フローサイトメトリーで評価した。

結果：図２４は、細胞表面への２完全、リガンド結合ｓｃＦｖベースのＣＡＲ(ＳＳ１−ＫＩＲ２ＤＬ３およびＣＤ１９−ＫＩＲ２ＤＳ２)の共発現が相互排他的であることを示す。図２６は、リガンド結合の喪失が、ＳＳ１ｚ−ｍＣｈおよび１９ｂｂｚと共形質導入された細胞におけるメソテリン結合の減少を有するｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞の存在により説明されるように、細胞におけるＣＡＲの発現と無関係に起こるｋとを示す。図２６は、ｓｃＦｖ結合機能喪失に至るｓｃＦｖ間の相互作用が、異なるｓｃＦｖベースのＣＡＲを使用して観察できることを示し、この効果の普遍性を支持する。これらの観察は、ｓｃＦｖの一方の可変ドメインが、異種ｓｃＦｖベースのキメラ受容体との分子間ペアリングを受けることができ、単一ＣＡＲ内のｓｃＦｖによる結合の喪失に至る、図２７パネルＡに記載したモデルと一致する。

実施例１２：キラー免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)に基づくキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)は、固形腫瘍における細胞毒性活性を誘発する
ＣＤ３ζおよび共刺激性受容体ＣＤ２８または４−１ＢＢの細胞質ドメインにｃｉｓで連結した抗原結合ドメインを担持する単一キメラ分子に基づくキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)は、腫瘍に対するＴ細胞毒性を操作する強力な方法を提供する。ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞およびＴ細胞に通常発現されるキラー免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)に基づくキメラ多鎖受容体を使用した。単鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)のＫＩＲの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインへの融合により構築しし、これは、メソテリン(ＳＳ１−ＫＩＲ)をターゲティングするＫＩＲベースのＣＡＲが、さらなる共刺激に非依存的である抗原誘発増殖を有するＣＤ３ζベースのＣＡＲと同等の抗原特異的細胞毒性活性およびサイトカイン産生を誘発することを示した。Ｔ細胞免疫療法に耐性の中皮腫の異種移植モデルを使用して、メソテリンをターゲティングするＫＩＲベースのＣＡＲが、共刺激を有するメソテリン特異的ＣＤ３ζベースのＣＡＲを担持するＴ細胞と比較して、後者のＣＡＲ修飾Ｔ細胞のインビボ持続性にも関わらず、より強力な抗腫瘍活性を示すことをさらに示した。腫瘍浸潤性リンパ球の評価は、ＫＩＲベースのＣＡＲ＋Ｔ細胞が、共刺激性受容体ドメインを有するＣＤ３ζベースのＣＡＲと比較して、腫瘍微小環境内で機能低下の獲得に対する抵抗性を示すことを示す。ＫＩＲベースのＣＡＲが、第二世代ＣＤ３ζベースのＣＡＲが限られた活性を示す腫瘍の退縮を誘発する効果は、さらに、中皮腫および他の腫瘍、例えば、他の固形腫瘍におけるＫＩＲベースのＣＡＲの臨床的評価を支持する。

実施例１３：メソテリン特異的ＣＡＲのインビボ抗腫瘍活性
実施例６に記載する異種移植実施例に類似して、一連のメソテリンベースのＣＡＲ構築物を、インビボ抗腫瘍活性を評価するために中皮腫のモデルで評価した。３メソテリン特異的ＣＡＲ構築物を試験した(図３９に示す)：ＳＳ１抗原結合ドメインおよびＣＤ２８を含む細胞質ドメインおよびＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二世代ＣＡＲ構築物(ＳＳ１−２８ζ、図３９Ｃ)、１鎖にＳＳ１抗原結合ドメインおよびＫＩＲ２ＤＳ２細胞質ドメインを、他鎖にアダプター分子ＤＡＰ１２を含む多鎖ＫＩＲ−ＣＡＲ(ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２、図３９Ａ)およびＳＳ１抗原結合ドメインおよびＤＡＰ１２を含む細胞質ドメインを含む単鎖ＫＩＲ−ＣＡＲ(ＳＳ１−ＤＡＰ１２、図３９Ｂ)。使用したＳＳ１−ＤＡＰ１２構築物の膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインであった。

成体ＮＳＧマウスに、２×１０^６ＥＭ−ｍｅｓｏ細胞を先におよび実施例６に記載のように皮下注射した。初代ヒトＴ細胞を、ＳＳ１−２８ζ、ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２、ＳＳ１−ＤＡＰ１２で形質導入し、９０％形質導入効率を達成するかまたは偽遺伝子導入した。４.３×１０^６のＣＡＲ形質導入または偽遺伝子導入初代ヒトＴ細胞を、腫瘍インプラント後２０日目に静脈内注射した。腫瘍体積を、示す時点で、式(π／６)×(長さ)×(幅)^２を使用してカリパスで測定した(ｎ＝５マウス／群)。腫瘍体積を、４０日目(腫瘍退縮の直前)および５２日目(実験の終了時)にＣＡＲＴ細胞処置群にわたって測定し、一元配置ＡＮＯＶＡ(ｐ＜０.００１)で比較し、群間比較を、事後ＳｃｈｅｆｆｅＦ検定で実施した。＊は、両時点で偽対照と統計的に異なることを示す(ｐ＜０.００１)。

図４０に示すように、ＳＳ１−ＤＡＰ１２は抗腫瘍活性を示し、偽遺伝子導入および無Ｔ細胞対照と比較して、腫瘍体積を減少させた。ＳＳ１−ＫＩＲＳ２／ＤＡＰ１２は、実施例６に記載する結果に類似して、ＳＳ１−２８ζ構築物により達成されるのと同等な強固な抗腫瘍活性を示した。

実施例１４：メソテリンと結合するヒト抗原結合ドメイン含有ＮＫＲ−ＣＡＲのインビトロ活性
メソテリンに結合するヒト抗原結合ドメイン含有ＮＫＲ−ＣＡＲを産生した。表４に提供するようなメソテリン、Ｍ−５、Ｍ−１１、Ｍ−１２、Ｍ−１４、Ｍ−１６、Ｍ−１７、Ｍ−２１およびＭ−２３に結合するヒトｓｃＦｖ配列を、ＫＩＲ２ＤＳ２由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと融合させ、以後、ｈｕＭｅｓｏ−ＫＩＲＳ２と証する。レンチウイルス構築物を、先の実施例に記載のように、例えば、ペプチド開裂部位Ｔ２ＡによりＮＫＲ−ＣＡＲに連結したＤＡＰ１２をさらに含むバイシストロニックレンチウイルスベクターで産生した。種々のインビトロアッセイを実施して、ヒト抗メソテリンｃＦｖ含有メソテリン特異的ＮＫＲ−ＣＡＲのＣＡＲ活性を評価した。

表面発現
初代ヒトＴ細胞におけるｈｕＭｅｓｏ−ＫＩＲＳ２構築物の表面発現を決定するために、アッセイを実施した。初代ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｔ細胞アクティベータービーズ(Dynabeads(登録商標)ＣＤ３／ＣＤ２８ＣＴＳ^TM、Life Technologies)で刺激した。刺激２４時間後、Ｔ細胞を、ｈｕＭｅｓｏ−ＫＩＲＳ２ＣＡＲ：Ｍ−５、Ｍ−１１、Ｍ−１２、Ｍ−１４、Ｍ−１６、Ｍ−１７、Ｍ−２１、およびＭ２３または対照ＳＳ１−ＰＬＥＮＳおよびＳＳ１−ＰＴＲＰＥをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。細胞を７〜８日拡張させ、可溶性メソテリン−Ｖ５−Ｈｉｓｘ１２、続くＶ５エピトープへのＦＩＴＣコンジュゲート抗体またはビオチニル化ヤギ抗ヒト抗体、続くＰＥコンジュゲートＳＡを使用して、記載するＣＡＲの発現をフローサイトメトリーにより分析した。ｈｕＭｅｓｏ−ＫＩＲＳ２構築物の表面発現を、図４１に示すように、フローサイトメトリー分析で定量した。ｈｕＭｅｓｏ−ＫＩＲＳ２構築物は、初代ヒトＴ細胞表面の発現を示した。

細胞毒性
ＣＡＲ細胞発現ｈｕＭｅｓｏ−ＫＩＲＳ２の標的特異的細胞毒性活性もアッセイした。初代ヒトＴ細胞発現ｈｕＭｅｓｏ−ＫＩＲＳ２を^５１Ｃｒ標識メソテリン発現標的細胞(メソテリンを発現するように操作したＫ５６２細胞、Ｋ５６２−ｍｅｓｏ)またはメソテリンを発現しない対照標的細胞(Ｋ５６２細胞、Ｋ５６２)と、種々のエフェクターＴ細胞対標的細胞比で混合した(０：１、１０：１、２０：１および３０：１)。細胞毒性を、４時間後上清に放出される^５１Ｃｒの画分の測定により決定した。メソテリン(Ｋ５６２)を発現しない対照細胞での対照実験から予測されるとおり、全てのＣＡＲ発現細胞は、相当量の細胞毒性を示さなかった。図４２Ｂにおいて、非形質導入(ＮＴＤ)細胞は、抗原特異的細胞毒性を示さなかった。Ｍ−２３およびＭ−１２ｓｃＦｖ含有ＨｕＭｅｓｏ−ＫＩＲＳ２は、わずかな抗原特異的細胞毒性を示した。しかしながら、Ｍ−５、Ｍ−１１、Ｍ−１６、Ｍ−１７およびＭ−２１含有ｈｕＭｅｓｏ−ＫＩＲＳ２は、ＳＳ１含有対照と類似レベルで、相当な抗原特異的細胞毒性を示した。

サイトカイン産生
ｈｕＭｅｓｏ−ＫＩＲＳ２発現ＣＡＲ細胞のサイトカイン産生も評価した。先に記載のように、初代ヒトＴ細胞を刺激し、ｈｕＭｅｓ−ＫＩＲＳ２で形質導入し、拡張した。発現後、形質導入Ｔ細胞をＫ５６２(メソテリン陰性細胞、白抜き棒)またはメソテリンを発現するように操作したＫ５６２細胞(黒色棒)と２：１比で混合した。サイトカイン濃度(ＩＦＮγおよびＩＬ−２)を、刺激２４時間後上清で、記載するサイトカインについてのＥＬＩＳＡにより決定した。図４３Ａに示すように、Ｍ−５、Ｍ−１１、Ｍ−１４、Ｍ−１６、Ｍ−１７およびＭ−２３含有ｈｕＭｅｓｏ−ＫＩＲＳ２発現ＣＡＲ細胞はＩＦＮγを産生した。図４３Ｂに示すように、Ｍ−５、Ｍ−１１、Ｍ１６およびＭ１７含有ｈｕＭｅｓ−ＫＩＲＳ２発現細胞はＩＬ−２を産生した。

実施例１５：低用量ＲＡＤ００１は、細胞培養モデルにおけるＣＡＲＴ増殖を刺激する
インビトロでのＣＡＲＴ細胞増殖に対するＲＡＤ００１の低用量の効果を、ＣＡＲＴ発現細胞と標的細胞を種々の濃度のＲＡＤ００１存在下で共培養することにより評価した。

材料および方法
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の産生
ヒト化、抗ヒトＣＤ１９ＣＡＲ(ｈｕＣＡＲＴ１９)レンチウイルス転移ベクターを、ＶＳＶｇ偽型レンチウイルス粒子に封入されたゲノム材料を産生するために使用した。ヒト化抗ヒトＣＤ１９ＣＡＲ(ｈｕＣＡＲＴ１９)のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、２０１４年３月１５日に出願されたＰＣＴ出願、ＷＯ２０１４／１５３２７０号に記載されたＣＡＲ１、ＩＤ１０４８７５であり、そこで配列番号８５および３１とされている。

レンチウイルス転移ベクターＤＮＡを、３パッケージング要素ＶＳＶｇｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｒｅｖと、リポフェクタミン試薬と組み合わせて混合し、レンチ−Ｘ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトする。培地をその後２４時間および３０時間に交換し、ウイルス含有培地を採取し、濾過し、−８０℃で保存する。ＣＡＲＴを、健常ドナー血液またはｌｅｕｋｏｐａｋの陰性磁気選択により得た新鮮または凍結ナイーブＴ細胞の形質導入により産生する。Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズと２４時間インキュベーションすることにより活性化し、ウイルス上清または濃縮ウイルス(それぞれ、ＭＯＩ＝２または１０)を培養に添加する。修飾Ｔ細胞を約１０日増殖させる。細胞形質導入のパーセンテージ(細胞表面のＣＡＲを発現)およびＣＡＲ発現レベル(相対蛍光強度、Geo Mean)を、７〜９日目にフローサイトメトリー分析で決定する。増殖速度遅延および約３５０fLに近づくＴ細胞サイズの組み合わせが、Ｔ細胞をその後の分析のために凍結保存する状態を決定する。

ＣＡＲＴ増殖評価
ＣＡＲＴの機能性を評価するために、Ｔ細胞を融解し、計数し、生存能をCellometerで評価する。各培養における多数のＣＡＲ陽性細胞を、非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)を使用して標準化する。ＣＡＲＴに対するＲＡＤ００１の影響を、５０nMから開始してＲＡＤ００１のタイトレーションにより試験した。全共培養実験において使用する標的細胞株は、ＣＤ１９を発現し、ルシフェラーゼを発現するように形質導入されたヒト前Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)細胞株、Ｎａｌｍ−６である。

ＣＡＲＴの増殖を測定するために、Ｔ細胞を標的細胞と１：１比で培養する。アッセイを４日行い、細胞をＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＡＲ発現について染色する。多数のＴ細胞を、対照としてカウンティングビーズを使用するフローサイトメトリーにより評価する。

結果
ＣＡＲＴ細胞の増殖能力を、４日共培養アッセイで試験した。多数のＣＡＲ陽性ＣＤ３陽性Ｔ細胞(濃色棒)および総ＣＤ３陽性Ｔ細胞(薄色棒)を、ＣＡＲ形質導入および非形質導入Ｔ細胞とＮａｌｍ−６の培養後評価した(図３９)。ｈｕＣＡＲＴ１９細胞は、０.０１６nM未満のＲＡＤ００１の存在下で培養したとき増殖し、化合物が高濃度ではそれより少なく増殖した。重要なことに、０.００３２および０.０１６nM ＲＡＤ００１両者で、増殖はＲＡＤ００１非添加で観察されるより高かった。非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)は検出可能な増殖を示さなかった。

実施例１６：低用量ＲＡＤ００１はインビボでＣＡＲＴ増殖を刺激する
本実施例は、ｈｕＣＡＲ１９細胞が種々の濃度のＲＡＤ００１存在下でインビボで増殖する能力を評価する。

材料および方法：
ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞：ＮＡＬＭ６ヒト急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)細胞株は、再発ＡＬＬ患者の末梢血から展開された。その後、細胞はホタルルシフェラーゼでタグ付けされた。これらの懸濁細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩで増殖させた。

マウス：６週齢ＮＳＧ(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl／SzJ)マウスを、Jackson Laboratory(stock number 005557)から得た。

腫瘍インプラント：ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞を、インビトロで１０％熱不活性化ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩで増殖および拡張した。次いで、細胞を１５mlコニカルチューブに移し、２回冷滅菌ＰＢＳで洗浄した。ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞を、次いで、計数し、ＰＢＳ１ミリリットルあたり１０×１０^６細胞濃度で再懸濁した。細胞を氷上に置き、直ぐに(１時間以内に)マウスにインプラントした。ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞を、１００μl体積で、合計マウスあたり１×１０^６細胞で尾静脈に静脈注射した。

ＣＡＲＴ細胞投与：マウスに、腫瘍インプラント７日後５×１０^６ＣＡＲＴ細胞を投与した。細胞を、３７℃水浴で一部溶かし、その後、１mlの冷滅菌ＰＢＳを細胞を含むチューブに添加しながら完全に融解した。融解細胞を１５mlファルコンチューブに移し、ＰＢＳで最終体積１０mlに合わせた。細胞を、各１０００rpmで１０分、２回洗浄し、次いで、血球計数器で計数した。Ｔ細胞を、次いで、冷ＰＢＳ１mlあたり５０×１０^６ＣＡＲＴ細胞濃度で懸濁し、マウスに投与するまで氷上に維持した。マウスに、１００μlのＣＡＲＴ細胞を、マウスあたり５×１０^６ＣＡＲＴ細胞の用量で、尾静脈から静脈注射した。群あたり８マウスが、１００μlのＰＢＳ単独(ＰＢＳ)またはヒト化ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞で処置された。

ＲＡＤ００１投与：１mg ＲＡＤ００１に相当する５０mg濃縮マイクロエマルジョンを製剤し、投与時にＤ５Ｗ(デキストロース５％水溶液)に再懸濁した。マウスに、２００μlの所望の用量のＲＡＤ００１を連日経口投与(強制喫食)した。

ＰＫ分析：マウスに、腫瘍インプラント７日後から開始して、連日ＲＡＤ００１を投与した。投与群は次のとおりであった：０.３mg／kg、１mg／kg、３mg／kgおよび１０mg／kg。マウスは最初のおよび最後のＲＡＤ００１投与０日目および１４日後、ＰＫ分析のために次の時点で採血した：１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間および２４時間。

結果：
ＲＡＤ００１の増殖および薬物動態を、ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ腫瘍担持ＮＳＧマウスで試験した。ＲＡＤ００１単独の連日経口投与は、ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ腫瘍増殖に影響を有しなかった(図４０)。ＲＡＤ００１の薬物動態分析は、腫瘍担持マウスの血中でかなり安定であることを示した(図４１Ａおよび４１Ｂ)。０日目および１４日目両者のＰＫ分析は、血中のＲＡＤ００１濃度が、試験した最低用量(０.３mg／kg)の投与の２４時間後でも１０nm以上であることを示す。

これらの用量に基づき、ｈｕＣＡＲ１９ＣＡＲＴ細胞を、これらの細胞の増殖能を決定するために、ＲＡＤ００１を伴いまたは伴わずに投与した。使用した最高用量は、投与２４時間後の血中のＲＡＤ００１のレベルに基づき、３mg／kgであった。最後のＲＡＤ００１の投与の２４時間後ＲＡＤ００１濃度が１０nMを超えていたため、いくつかのＲＡＤ００１の低用量を、ＣＡＲＴ細胞でのインビボ研究に使用した。ＣＡＲＴ細胞を、連日経口ＲＡＤ００１投与開始１日前にＩＶ投与した。マウスを、Ｔ細胞増殖についてＦＡＣＳでモニターした。

最低用量のＲＡＤ００１は、ＣＡＲＴ細胞の増殖増加を示す(図４２)。この増殖増加は、ＣＤ８^＋ＣＡＲＴ細胞よりもＣＤ４^＋ＣＡＲＴ細胞でより明白であり、長い。しかしながら、ＣＤ８^＋ＣＡＲＴ細胞で、増殖増加は、ＣＡＲＴ細胞投与後最初の時点でしか見ることができない。ある態様において、ＲＮＡＣＡＲＴ細胞を、チェックポイント阻害剤と組み合わせても使用できる。

ここに引用する各および全ての特許、特許出願および刊行物の開示を、その全体を、引用により本明細書に包含させる。本発明は、特定の態様を参照して開示しているが、本発明の他の態様およびバリエーションが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく他の当業者により考案され得ることは明らかである。点分お請求項は、全てのこのような態様および同等なバリエーションを含むことを意図する。

Claims

ナチュラルキラー細胞免疫機能受容体−キメラ抗原受容体(ＮＫＲ−ＣＡＲ)をコードする単離核酸分子であって、ここで、コードされるＮＫＲ−ＣＡＲが
細胞外メソテリンに結合する非マウス抗原結合ドメインおよび
膜貫通ドメイン、例えば、ＮＫＲ膜貫通ドメイン；または
細胞質ドメイン、例えば、ＮＫＲ細胞質ドメイン
の一方または両方を含む、
単離核酸分子。
コードされるＮＫＲ−ＣＡＲが細胞外非マウスメソテリンに結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよびＮＫＲ細胞質ドメインを含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
細胞外非マウスメソテリンに結合する抗原結合ドメインがヒトまたはヒト化メソテリンに結合する抗原結合ドメインである、請求項１または２に記載の単離核酸分子。
コードされるメソテリンに結合するヒト抗原結合ドメインが、表４に挙げるヒト抗メソテリン重鎖アミノ酸配列のいずれかの重鎖相補性決定領域１(ＨＣＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣＣＤＲ３)；および／または表４に挙げるヒト抗メソテリン軽鎖アミノ酸配列のいずれかの軽鎖相補性決定領域１(ＬＣＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣＣＤＲ３)を含む、請求項３に記載の単離核酸分子。
メソテリンに結合するヒト抗原結合ドメインが：
ｉ)表４に挙げるヒト抗メソテリン重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列；
ii)表４に挙げるヒト抗メソテリン重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
iii)表４に挙げるヒト抗メソテリン重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域；
および／または
ｉ)表４に挙げるヒト抗メソテリン軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列；
ii)表４に挙げるヒト抗メソテリン軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
iii)表４に挙げるヒト抗メソテリン軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項３または４に記載の単離核酸分子。
メソテリンに結合するヒト抗原結合ドメインが
ｉ)配列番号２３４、２４０、２３０〜２３３、２３５〜２３９および２４１〜２５３のいずれかのアミノ酸配列；
ii)配列番号２３４、２４０、２３０〜２３３、２３５〜２３９および２４１〜２５３のいずれかに少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
iii)配列番号２３４、２４０、２３０〜２３３、２３５〜２３９および２４１〜２５３のいずれかと９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項３〜５のいずれかに記載の単離核酸分子。
コードされるＮＫＲ−ＣＡＲが
キラー細胞免疫グロブリン様受容体キメラ抗原受容体(ＫＩＲ−ＣＡＲ)であって、ＫＩＲ−ＣＡＲはＫＩＲからの膜貫通ドメイン(ＫＩＲ膜貫通ドメイン)またはＫＩＲからの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン(ＫＩＲ細胞質ドメイン)の一方または両方を含むもの；
天然細胞毒性受容体キメラ抗原受容体(ＮＣＲ−ＣＡＲ)であって、ＮＣＲ−ＣＡＲがＮＣＲからの膜貫通ドメイン(ＮＣＲ膜貫通ドメイン)またはＮＣＲからの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン(ＮＣＲ細胞質ドメイン)の一方または両方を含むもの；
シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリーキメラ抗原受容体(ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲ)であって、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲがＳＬＡＭＦからの膜貫通ドメイン(ＳＬＡＭＦ膜貫通ドメイン)またはＳＬＡＭＦからの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン(ＳＬＡＭＦ細胞質ドメイン)の一方または両方を含むもの；
Ｆｃ受容体キメラ抗原受容体(ＦｃＲ−ＣＡＲ)であって、ＦｃＲ−ＣＡＲがＣＤ１６またはＣＤ６４から選択されるＦｃＲからの膜貫通ドメインまたはＣＤ１６またはＣＤ６４から選択されるＦｃＲからの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインの一方または両方を含むもの；または
Ｌｙ４９受容体キメラ抗原受容体(Ｌｙ４９−ＣＡＲ)であって、Ｌｙ４９−ＣＡＲがＬｙ４９からの膜貫通ドメイン(Ｌｙ４９膜貫通ドメイン)またはＬｙ４９からの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン(Ｌｙ４９細胞質ドメイン)の一方または両方を含むもの
を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の単離核酸分子。
ＫＩＲ膜貫通ドメインがＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１およびＫＩＲ３ＤＰ１からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項７に記載の単離核酸分子。
ＫＩＲ細胞質ドメインがＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１およびＫＩＲ３ＤＰ１からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項７に記載の単離核酸分子。
ＫＩＲ−ＣＡＲがさらにＫＩＲＤ０ドメイン、ＫＩＲＤ１ドメインおよび／またはＫＩＲＤ２ドメインの１以上を含む、請求項７〜９のいずれかに記載の単離核酸分子。
ＮＣＲ膜貫通ドメインがＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項７に記載の単離核酸分子。
ＮＣＲ細胞質ドメインがＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項７に記載の単離核酸分子。
ＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインがＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥおよびＣＤ２Ｆ−１０からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項７に記載の単離核酸分子。
ＳＬＡＭＦ細胞質ドメインがＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥおよびＣＤ２Ｆ−１０からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項７に記載の単離核酸分子。
Ｌｙ４９膜貫通ドメインがＬｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９ＨおよびＬｙ４９Ｄからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項７に記載の単離核酸分子。
Ｌｙ４９細胞質ドメインがＬｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９ＨおよびＬｙ４９Ｄからなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項７に記載の単離核酸分子。
コードされる膜貫通ドメインがＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＮＫｐ４６、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)、天然細胞毒性受容体(ＮＣＲ)、シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリー(ＳＬＡＭＦ)、Ｆｃ受容体(ＦｃＲ)およびＬｙ４９受容体(Ｌｙ４９)からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含むＮＫＲ膜貫通ドメインを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の単離核酸分子。
ｉ)コードされる膜貫通ドメインが配列番号３５７、３５８または３５９のアミノ酸配列；配列番号３５７、３５８または３５９のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を含むが、修飾が５を超えないアミノ酸配列；または配列番号３５７、３５８または３５９と９５〜９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか；または
ii)配列番号３４３のヌクレオチド７７１〜８３０、配列番号３４５のヌクレオチド７７３〜８３２または配列番号３４７のヌクレオチド８０３〜８７５を含む膜貫通ドメインをコードする核酸配列またはそれと９５〜９９％配列同一性を有する核酸配列またはそれと９５〜９９％配列同一性を有する核酸配列を含む、
請求項１７に記載の単離核酸分子。
コードされる細胞質ドメインが、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＮＫｐ４６、ＤＡＰ１２、ＫＩＲ、ＮＣＲ、ＳＬＡＭＦ、ＦｃＲおよびＬｙ４９からなる群から選択されるタンパク質の１以上の機能的シグナル伝達ドメインを含むＮＫＲ細胞質ドメインを含む、請求項１〜６および１７〜１８のいずれかに記載の単離核酸分子。
ｉ)コードされる細胞質ドメインが配列番号３６０、３６１または３６２のアミノ酸配列；配列番号３６０、３６１または３６２のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を含むが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列；または配列番号３６０、３６１または３６２と９５〜９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか；または
ii)配列番号３４３のヌクレオチド８３１〜９４７、配列番号３４５のヌクレオチド８３３〜１０６０または配列番号３４７のヌクレオチド８７６〜９４９を含む細胞質ドメインをコードする核酸配列またはそれと９５〜９９％配列同一性を有する核酸配列を含む、
請求項１９に記載の単離核酸分子。
さらに、配列番号１のアミノ酸配列をコードするリーダー配列を含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の単離核酸分子。
細胞外非マウスメソテリンに結合する抗原結合ドメインがヒンジドメインにより膜貫通ドメインに連結している、請求項１〜２１のいずれかに記載の単離核酸分子。
コードされるヒンジドメインがＣＤ８ヒンジ、ＧＳヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＤヒンジ、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジ、ＫＩＲヒンジ、ＮＣＲヒンジ、ＳＬＡＭＦヒンジ、ＦｃＲヒンジおよびＬＹ４９ヒンジからなる群から選択される、請求項２２に記載の単離核酸分子。
ｉ)コードされるヒンジドメインが配列番号５、２、３または４のアミノ酸配列；配列番号５、２、３または４のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が５を超えないアミノ酸配列；または配列番号５、２、３または４のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むか；または
ii)ヒンジドメインをコードする核酸配列が配列番号３５６、１６、１３、１４または１５の核酸配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する核酸配列を含む、
請求項２３に記載の単離核酸分子。
ｉ)コードされる膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインが、集合的に
配列番号３３３のアミノ酸４１３〜４８７または配列番号３３５のアミノ酸３８６〜４５４のアミノ酸配列；
配列番号３３３のアミノ酸４１３〜４８７または配列番号３３５のアミノ酸３８６〜４５４に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
配列番号３３３のアミノ酸４１３〜４８７または配列番号３３５のアミノ酸３８６〜４５４と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むか；または
ii)膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする核酸配列が配列番号３３２のヌクレオチド１２３７〜１４６４または配列番号３３４のヌクレオチド１１５６〜１３６５またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、
請求項６に記載の単離核酸分子。
アダプター分子をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜２５のいずれかに記載の単離核酸分子。
コードされるアダプター分子がＤＡＰ１２またはＦｃイプシロン受容体ガンマ(ＦｃεＲγ)の機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項２６に記載の単離核酸分子。
ｉ)コードされるアダプター分子が配列番号３３３のアミノ酸１〜１１３または配列番号３３５のアミノ酸１〜８６のアミノ酸配列；
配列番号３３３のアミノ酸１〜１１３または配列番号３３５のアミノ酸１〜８６に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０、または５を超えないアミノ酸配列；または
配列番号３３３のアミノ酸１〜１１３または配列番号３３５のアミノ酸１〜８６と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むか；または
ii)アダプター分子をコードする核酸配列が配列番号３３２のヌクレオチド１〜３３９または配列番号３３４のヌクレオチド１〜２５８を含むヌクレオチドを含む、
請求項２６または２７に記載の単離核酸分子。
Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａからなる群から選択されるペプチド開裂部位をコードする核酸配列をさらに含み、ペプチド開裂部位をコードする核酸がＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸配列をアダプター分子をコードする核酸配列に連結する、請求項２６〜２８のいずれかに記載の単離核酸分子。
ペプチド開裂部位をコードする核酸配列が配列番号５７、５８、５９または６０のアミノ酸配列；またはそれと９５〜９９％配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、請求項２９に記載の単離核酸分子。
ＴＣＡＲまたは第二ＮＫＲ−ＣＡＲをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の単離核酸分子。
コードされるＴＣＡＲまたは第二ＮＫＲ−ＣＡＲがメソテリンではない標的抗原に結合する抗原結合ドメインを含む、請求項３１に記載の単離核酸分子。
請求項１〜３２のいずれかに記載の核酸分子によりコードされる、精製されたまたは天然に存在しないポリペプチド。
細胞外メソテリンに結合する非マウス抗原結合ドメインおよび
膜貫通ドメイン、例えば、ＮＫＲ膜貫通ドメイン；または
細胞質ドメイン、例えば、ＮＫＲ細胞質ドメイン
の一方または両方
を含む、単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
ＮＫＲ−ＣＡＲが細胞外非マウスメソテリンに結合する抗原結合ドメイン；膜貫通ドメインおよびＮＫＲ細胞質ドメインを含む、請求項３４に記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
細胞外非マウスメソテリンに結合する抗原結合ドメインがヒトまたはヒト化メソテリンに結合する抗原結合ドメインである、請求項３３または３４に記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
メソテリンに結合するヒト抗原結合ドメインが表４に挙げるヒト抗メソテリン重鎖アミノ酸配列のいずれかの重鎖相補性決定領域１(ＨＣＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣＣＤＲ３)；および／または表４に挙げるヒト抗メソテリン軽鎖アミノ酸配列のいずれかの軽鎖相補性決定領域１(ＬＣＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣＣＤＲ３)を含む、請求項３６に記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
メソテリンに結合するヒト抗原結合ドメインが
ｉ)表４に挙げるヒト抗メソテリン重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列；
ii)表４に挙げるヒト抗メソテリン重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
iii)表４に挙げるヒト抗メソテリン重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列；
を含む重鎖可変領域；
および／または
ｉ)表４に挙げるヒト抗メソテリン軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列；
ii)表４に挙げるヒト抗メソテリン軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
iii)表４に挙げるヒト抗メソテリン軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項３６または３７に記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
メソテリンに結合するヒト抗原結合ドメインが
ｉ)配列番号２３４、２４０、２３０〜２３３、２３５〜２３９および２４１〜２５３のいずれかのアミノ酸配列；
ii)配列番号２３４、２４０、２３０〜２３３、２３５〜２３９および２４１〜２５３のいずれかに少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
iii)配列番号２３４、２４０、２３０〜２３３、２３５〜２３９および２４１〜２５３のいずれかと９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項３６〜３８のいずれかに記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
ＮＫＲ−ＣＡＲが
ＫＩＲ−ＣＡＲであって、ＫＩＲ−ＣＡＲはＫＩＲからの膜貫通ドメイン(ＫＩＲ膜貫通ドメイン)またはＫＩＲからの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン(ＫＩＲ細胞質ドメイン)の一方または両方を含むもの；
ＮＣＲ−ＣＡＲであって、ＮＣＲ−ＣＡＲがＮＣＲからの膜貫通ドメイン(ＮＣＲ膜貫通ドメイン)またはＮＣＲからの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン(ＮＣＲ細胞質ドメイン)の一方または両方を含むもの；
ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲであって、ＳＬＡＭＦ−ＣＡＲがＳＬＡＭＦからの膜貫通ドメイン(ＳＬＡＭＦ膜貫通ドメイン)またはＳＬＡＭＦからの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン(ＳＬＡＭＦ細胞質ドメイン)の一方または両方を含むもの；
ＦｃＲ−ＣＡＲであって、ＦｃＲ−ＣＡＲがＣＤ１６またはＣＤ６４から選択されるＦｃＲからの膜貫通ドメインまたはＣＤ１６またはＣＤ６４から選択されるＦｃＲからの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインの一方または両方を含むもの；または
Ｌｙ４９−ＣＡＲであって、Ｌｙ４９−ＣＡＲがＬｙ４９からの膜貫通ドメイン(Ｌｙ４９膜貫通ドメイン)またはＬｙ４９からの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン(Ｌｙ４９細胞質ドメイン)の一方または両方を含むもの
を含む、請求項３４〜３９のいずれかに記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
ＫＩＲ膜貫通ドメインがＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１およびＫＩＲ３ＤＰ１からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項４０に記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
ＫＩＲ細胞質ドメインがＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１およびＫＩＲ３ＤＰ１からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項４０に記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
ＫＩＲ−ＣＡＲがさらにＫＩＲＤ０ドメイン、ＫＩＲＤ１ドメインおよび／またはＫＩＲＤ２ドメインの１以上を含む、請求項４０〜４２のいずれかに記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
ＮＣＲ膜貫通ドメインがＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項４０に記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
ＮＣＲ細胞質ドメインがＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項４０に記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
ＳＬＡＭＦ膜貫通ドメインがＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥおよびＣＤ２Ｆ−１０からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項４０に記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
ＳＬＡＭＦ細胞質ドメインがＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥおよびＣＤ２Ｆ−１０からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項４０に記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
Ｌｙ４９膜貫通ドメインがＬｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９ＨおよびＬｙ４９Ｄからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項４０に記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
Ｌｙ４９細胞質ドメインがＬｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９ＨおよびＬｙ４９Ｄからなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項４０に記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
膜貫通ドメインがＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ、ＮＣＲ、ＳＬＡＭＦ、ＦｃＲおよびＬｙ４９からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含むＮＫＲ膜貫通ドメインを含む、請求項３４〜３９のいずれかに記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
膜貫通ドメインが
ｉ)配列番号３５７、３５８または３５９のアミノ酸配列；
ii)配列番号３５７、３５８または３５９のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を含むが、修飾が５を超えないアミノ酸配列；または
iii)配列番号３５７、３５８または３５９と９５〜９９％配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項５０に記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
細胞質ドメインが、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＮＫｐ４６、ＤＡＰ１２、ＫＩＲ、ＮＣＲ、ＳＬＡＭＦ、ＦｃＲおよびＬｙ４９からなる群から選択されるタンパク質の１以上の機能的シグナル伝達ドメインを含むＮＫＲ細胞質ドメインを含む、請求項３４〜３９および５０〜５１のいずれかに記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
細胞質ドメインが
ｉ)配列番号３６０、３６１または３６２のアミノ酸配列；
ii)配列番号３６０、３６１または３６２のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を含むが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列；または
iii)配列番号３６０、３６１または３６２と９５〜９９％配列同一性のアミノ酸配列
を含む、請求項５２に記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
配列番号１のアミノ酸配列を含むリーダー配列をさらに含む、請求項３４〜５３のいずれかに記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
細胞外非マウスメソテリンに結合する抗原結合ドメインがヒンジドメインにより膜貫通ドメインに連結している、請求項３４〜５４のいずれかに記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
ヒンジドメインがＣＤ８ヒンジ、ＧＳヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＤヒンジ、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジ、ＫＩＲヒンジ、ＮＣＲヒンジ、ＳＬＡＭＦヒンジ、ＣＤ１６ヒンジ、ＣＤ６４ヒンジおよびＬＹ４９ヒンジからなる群から選択される、請求項５５に記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
ヒンジドメインが
ｉ)配列番号５、２、３または４のアミノ酸配列；
ii)配列番号５、２、３または４のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が５を超えないアミノ酸配列；または
iii)配列番号５、２、３または４のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項５６に記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインが集合的に
ｉ)配列番号３３３のアミノ酸４１３〜４８７または配列番号３３５のアミノ酸３８６〜４５４のアミノ酸配列；
ii)配列番号３３３のアミノ酸４１３〜４８７または配列番号３３５のアミノ酸３８６〜４５４に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
iii)配列番号３３３のアミノ酸４１３〜４８７または配列番号３３５のアミノ酸３８６〜４５４と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項３９に記載の単離ＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド。
請求項１〜３２のいずれかに記載の核酸によりコードされるＮＫＲ−ＣＡＲまたは請求項３３〜５８のいずれかに記載のＮＫＲ−ＣＡＲおよびアダプター分子を含む、ＮＫＲ−ＣＡＲ複合体。
アダプター分子ｈｓＤＡＰ１２またはＦｃεＲγである、請求項５９に記載のＮＫＲ−ＣＡＲ複合体。
ＮＫＲ−ＣＡＲがＮＫＲ−ＣＡＲの細胞外非マウス抗原結合ドメインのメソテリンへの結合によりアダプター分子と相互作用する、請求項５９または６０に記載のＮＫＲ−ＣＡＲ複合体。
ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ分子またはこれらの組み合わせである、請求項１〜３２のいずれかに記載の核酸分子。
ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターである、請求項１〜３２のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項６３に記載のベクター。
配列番号１１の配列を含むＥＦ−１プロモーターをさらに含む、請求項６３または６４に記載のベクター。
請求項１〜３２のいずれかに記載の核酸分子、請求項３３〜５８のいずれかに記載のＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド、請求項６３〜６５のいずれかに記載のベクターまたは請求項５９〜６１のいずれかに記載のＮＫＲ−ＣＡＲ複合体を含む、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞。
細胞毒性細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項６５に記載の細胞。
免疫エフェクター細胞に、請求項１〜３２のいずれかに記載の核酸分子または請求項６３〜６５のいずれかに記載のベクターを導入することを含む、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞を製造する方法。
哺乳動物に請求項１〜３２のいずれかに記載の核酸分子、請求項３３〜５８のいずれかに記載のＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド、請求項６３〜６５のいずれかに記載のベクター、または請求項５９〜６１のいずれかに記載のＮＫＲ−ＣＡＲ複合体を含む細胞の有効量を投与することを含む、哺乳動物における抗腫瘍免疫を提供する方法。
哺乳動物に請求項１〜３２のいずれかに記載の核酸分子、請求項３３〜５８のいずれかに記載のＮＫＲ−ＣＡＲポリペプチド、請求項６３〜６５のいずれかに記載のベクターまたは請求項５９〜６１のいずれかに記載のＮＫＲ−ＣＡＲ複合体を含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団の有効量を投与することを含む、疾患または障害を有する哺乳動物を処置する方法。
疾患または障害がメソテリンの発現と関係する、請求項７０に記載の方法。
疾患または障害が中皮腫、悪性胸膜中皮腫、非小細胞性肺癌、小細胞肺癌、扁平上皮細胞肺癌、大細胞肺癌、膵臓癌、膵管腺癌、膵臓転移、卵巣癌、結腸直腸癌および膀胱癌またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項７０または７１に記載の方法。