JP2017510296A - 錐体細胞における増強された遺伝子発現のための組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、錐体細胞において遺伝子を発現させるためのポリヌクレオチドカセット、発現ベクターおよび方法を提供する。一局面において、哺乳動物の網膜の錐体細胞における導入遺伝子の増強された発現のためのポリヌクレオチドカセットが提供され、このポリヌクレオチドカセットは、（ａ）網膜錐体細胞に特異的なプロモーター領域と、（ｂ）上記プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と、（ｃ）ポリアデニル化部位とを含む。

Description

関連出願への相互参照
米国特許法§１１９（ｅ）にしたがって、この出願は、２０１４年３月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／９５４，３３０号および２０１５年３月２日に出願された米国仮特許出願第６２／１２７，１８５号（これらの完全な開示は、参考として本明細書に援用される）の出願日に対する優先権を主張する。
配列表に関する声明
この出願に伴う配列表が、紙でのコピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、これは、ここで参考として本明細書に援用される。この配列表を含むテキストファイルの名称は、ＡＶＢＩ＿００５＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは、３０８ＫＢであり、２０１５年３月１７日に作成されたものであり、そしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
発明の分野
本発明は、網膜障害の遺伝子療法に関する。
発明の背景
眼の視覚障害は、多くの場合、錐体細胞における公知の一次的欠陥に関する。これらとしては、スタルガルト黄斑ジストロフィー、錐体ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、脊髄小脳失調症７型、およびバルデー・ビードル症候群−１などの黄斑ジストロフィー、ならびに１色覚（ａｃｈｒｏｍｏｔｏｐｓｉａ）、青錐体１色覚（ｂｌｕｅ ｃｏｎｅ ｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｃｙ）、１型色覚（ｐｒｏｔａｎ ｄｅｆｅｃｔ）、２型色覚（ｄｅｕｔａｎ ｄｅｆｅｃｔ）、および３型色覚（ｔｒｉｔａｎ ｄｅｆｅｃｔ）を含めた色覚障害が挙げられる。
公知の原因が錐体光受容体に固有のものである障害に加えて、錐体細胞を標的とすることによって治療することができる中心黄斑の視覚障害が存在する（霊長類の中で）。これらとしては、加齢黄斑変性症、黄斑部毛細血管拡張症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、緑内障、ソースビー眼底変性症、成人卵黄様黄斑ジストロフィー、ベスト病、およびＸ連鎖性網膜分離症が挙げられる。
既存の治療に関する限定に対処する、眼疾患を治療および防止するための有望な手法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの遺伝子療法ベクターを用いて治療剤を眼に送達することである。ＡＡＶは、４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡウイルスである。野生型ＡＡＶは非病原性であり、いかなる公知の疾患とも病因学的関連がないので、ＡＡＶに基づく組換えベクターには優れた臨床的安全性が伴う。さらに、ＡＡＶにより、眼、筋肉、肺、および脳を含めた多数の組織への高度に効率的な遺伝子送達および持続的な導入遺伝子発現の可能性がもたらされる。さらに、ＡＡＶは、ヒト臨床試験において将来性があることが示されている。１つの例は、レーバー先天黒内障であり、その場合、ｒＡＡＶベクターの単回網膜下投与によって送達された治療薬を用いた治療を受けた患者では、治療の初日から４年超にわたって治療剤の発現による持続的な臨床的利益が生じた。
一般に眼疾患、特に錐体細胞を治療するための遺伝子療法において使用するためのポリヌクレオチドカセットおよび発現ベクターの設計に関して、いくつもの難題が残っている。１つの重要な難題は、標的細胞において、特に網膜の錐体細胞において導入遺伝子の十分な発現を得ることである。遺伝子移入後の導入遺伝子の十分にロバストな発現が当技術分野において長年必要とされており、まだ対処されていない。いくつかの場合には、ある特定のベクター、例えば、プラスミドＤＮＡベクターの有効性に関して、より効率的な発現が必要である。他の場合では、より好都合な安全性プロファイルを有するより低い治療用量または投与のより侵襲性の少ない経路（例えば、硝子体内と網膜下）を可能にするために、より効率的な遺伝子発現カセットが望ましい。いくつかの状況では、効率的な発現は、強力な、遍在するプロモーターを使用して達成されているが、多くの場合、標的細胞型においてのみ発現する核酸発現カセットを使用して高い導入遺伝子発現を得ることが望ましい。
例えば米国特許出願ＵＳ２０１２／０１７２４１９に開示されている、錐体細胞において導入遺伝子を発現させるための以前の試みでは、いくらかの将来性が示されたが、多くの場合、発現レベルは、最適よりも低かったか細胞特異的ではなかった。いくつもの視覚障害が錐体細胞における一次的欠陥に起因することを考慮すれば、錐体細胞において導入遺伝子を高い発現レベルで特異的に発現させることは、当技術分野における意味のある進歩である。したがって、錐体細胞において遺伝子を発現させるための改善された方法ならびに最適化された核酸カセットおよびベクターが依然として必要とされている。
本開示は、錐体細胞において遺伝子を発現させるためのポリヌクレオチドカセット、発現ベクターおよび方法を提供する。
本発明の一部の態様では、哺乳動物の網膜の錐体細胞において導入遺伝子を発現させるためのポリヌクレオチドカセットが提供される。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、増強された発現である。ある特定の実施形態では、コード配列の発現は、配列番号１に作動可能に連結した導入遺伝子の発現よりも大きい。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は錐体特異的なものである。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、網膜錐体細胞における遺伝子の発現を促進するプロモーター領域と、ポリアデニル化部位とを含む。一部の実施形態では、発現は錐体細胞において特異的なものである。一部のそのような実施形態では、プロモーター領域は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、および配列番号８３からなる群より選択される配列、またはその機能性断片に対して８５％またはそれ超の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、プロモーター領域は、４９２ヌクレオチド未満の長さである。一部の実施形態では、プロモーター領域は、配列番号５５の全長またはその機能性断片に対して８５％またはそれ超の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列から本質的になる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、本明細書では５’ＵＴＲと称される、コード配列に対して５’にある非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一部のそのような実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、および配列番号８９からなる群より選択される配列、またはその断片に対して８５％またはそれ超の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ配列の一部または全部は、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号７９に開示されているプロモーター領域に含まれる。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ配列は、プロモーター配列に対して異種性のものである。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号８５もしくは配列番号８６の全長、またはその断片に対して８５％またはそれ超の配列同一性を有する配列から本質的になる。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ポリヌクレオチドＡＴＧを含まない。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットはイントロンを含む。一部のそのような実施形態では、イントロンは、配列番号５、配列番号５９、および配列番号６０からなる群より選択される配列に対して８５％またはそれ超の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、イントロンは、５’ＵＴＲをコードするポリヌクレオチド配列内に位置する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは翻訳開始配列を含む。一部のそのような実施形態では、翻訳開始配列は、配列番号７２または配列番号７３から本質的になるポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットはエンハンサー配列を含む。一部のそのような実施形態では、エンハンサー配列は、配列番号５２またはその機能性断片に対して８５％またはそれ超の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、エンハンサー配列は、配列番号５１の全長に対して８５％またはそれ超の配列同一性を有する配列から本質的になる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、プロモーターに作動可能に連結したコード配列を含む。一部の実施形態では、コード配列は、プロモーター領域および／または５’ＵＴＲ配列に対して異種性である。一部の実施形態では、コード配列は、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、ならびに（ｉ）Ｔｈｒ６５Ｉｌｅ（ｉｉ）Ｉｌｅ１１１Ｖａｌ（ｉｉｉ）Ｓｅｒ１１６Ｔｙｒ（ｉｖ）Ｌｅｕ１５３Ｍｅｔ（ｖ）Ｉｌｅ１７１Ｖａｌ（ｖｉ）Ａｌａ１７４Ｖａｌ（ｖｉｉ）Ｉｌｅ１７８Ｖａｌ（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ１８０Ａｌａ（ｉｘ）Ｉｌｅ２３０Ｔｈｒ（ｘ）Ａｌａ２３３Ｓｅｒ（ｘｉ）Ｖａｌ２３６Ｍｅｔ（ｘｉｉ）Ｉｌｅ２７４Ｖａｌ（ｘｉｉｉ）Ｐｈｅ２７５Ｌｅｕ（ｘｉｖ）Ｔｙｒ２７７Ｐｈｅ（ｘｖ）Ｖａｌ２７９Ｐｈｅ（ｘｖｉ）Ｔｈｒ２８５Ａｌａ（ｘｖｉｉ）Ｐｒｏ２９８Ａｌａ、および（ｘｖｉｉｉ）Ｔｙｒ３０９Ｐｈｅからなる群より選択される配列番号１１の多形体に対して少なくとも８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、コード配列は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７１に対して少なくとも８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、転写開始部位とコード配列の末端との間の配列は、５００ヌクレオチド超の長さである導入遺伝子のオープンリーディングフレーム以外のオープンリーディングフレームを含有しない。一部の実施形態では、転写開始部位とコード配列の末端との間の配列は、２７３ヌクレオチド超の長さである導入遺伝子のオープンリーディングフレーム以外のオープンリーディングフレームを含有しない。一部の実施形態では、転写開始部位とコード配列の末端との間の配列は、２５０ヌクレオチド超の長さである導入遺伝子のオープンリーディングフレーム以外のオープンリーディングフレームを含有しない。一部の実施形態では、コード配列の少なくとも１つのオープンリーディングフレームが除去されている。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、網膜錐体細胞における遺伝子の発現を促進するプロモーター領域と、５’非翻訳領域と、イントロンと、翻訳開始配列と、プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と、ポリアデニル化部位とを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、遺伝子の発現を網膜錐体細胞において特異的に促進するプロモーター領域と、５’非翻訳領域と、イントロンと、翻訳開始配列と、プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と、ポリアデニル化部位とを含む。
本発明の一部の態様では、本発明のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターが提供される。一部の実施形態では、遺伝子送達ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスであり、組換えアデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質である。他の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、改変体ＡＡＶカプシドタンパク質である。ある特定の実施形態では、改変体ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号９６）、ＮＥＴＩＴＲＰ（配列番号９７）、ＫＡＧＱＡＮＮ（配列番号９８）、ＫＤＰＫＴＴＮ（配列番号９９）、ＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号１００）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号１０１）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号１０２）、およびＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号１０３）からなる群より選択されるＡＡＶ ＧＨループ内のペプチド挿入を含む。
本発明の一部の態様では、本発明のポリヌクレオチドカセットおよび医薬賦形剤を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、本発明の遺伝子送達ベクターと医薬賦形剤とを含む。
本発明の一部態様では、錐体細胞において導入遺伝子を発現させるための方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、１つまたは複数の錐体細胞に、本発明のポリヌクレオチドカセットまたは本発明の遺伝子送達ベクターを有効量で接触させるステップを含み、導入遺伝子が、１つまたは複数の錐体細胞において検出可能なレベルで発現される。一部の実施形態では、方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるものである。他の実施形態では、方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるものである。ある特定のそのような実施形態では、接触させるステップは、ポリヌクレオチドカセットまたは遺伝子送達ベクターを哺乳動物の眼の硝子体内に注射することを含む。他のそのような実施形態では、方法は、ポリヌクレオチドカセットまたは遺伝子送達ベクターを哺乳動物の眼の網膜下腔内に注射することを含む。一部の実施形態では、方法は、錐体細胞における導入遺伝子の発現を検出するステップをさらに含み、発現が、錐体細胞の８０％またはそれ超で検出される。一部の実施形態では、発現は、錐体細胞に対して特異的である。
本発明の一部の態様では、錐体細胞障害に対する治療または予防を必要とする哺乳動物における錐体細胞障害を治療または予防するための方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、哺乳動物の眼に本発明の医薬組成物を有効量で投与するステップを含み、コード配列が治療用遺伝子産物をコードするものである。一部の実施形態では、投与するステップは、医薬組成物を哺乳動物の眼の硝子体内に注射することを含む。他のそのような実施形態では、方法は、医薬組成物を哺乳動物の眼の網膜下腔内に注射することを含む。
一部の実施形態では、錐体細胞障害は、色覚障害である。ある特定の実施形態では、色覚障害は、１色覚、青錐体１色覚、１型色覚、２型色覚、および３型色覚からなる群より選択される。一部のそのような実施形態では、方法は、疾患の症状の変化を検出するステップをさらに含み、変化が、哺乳動物の色を知覚する能力の増大を含む。一部の実施形態では、錐体細胞障害は、黄斑ジストロフィーである。ある特定の実施形態では、黄斑ジストロフィーは、スタルガルト黄斑ジストロフィー、錐体ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、脊髄小脳失調症７型、およびバルデー・ビードル症候群−１からなる群より選択される。一部の実施形態では、錐体細胞障害は、中心黄斑の視覚障害である。ある特定の実施形態では、中心黄斑の視覚障害は、加齢黄斑変性症、黄斑部毛細血管拡張症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、緑内障、ソースビー眼底変性症、成人卵黄様黄斑ジストロフィー、ベスト病、杆体−錐体ジストロフィー、レーバー先天性黒内障、およびＸ連鎖性網膜分離症からなる群より選択される。一部のそのような実施形態では、方法は、疾患の症状の変化を検出するステップをさらに含む。一部のそのような実施形態では、変化は、錐体細胞の健康の安定化および／または哺乳動物の視力喪失の速度の低減を含む。特定のそのような実施形態では、変化は、錐体細胞の健康の改善および／または哺乳動物の視力の改善を含む。
本開示の新規の特色は、添付の特許請求の範囲において詳細に記載されている。本発明の原理が利用されている例示的な実施形態が記載されている以下の発明の詳細な説明および添付の図面を参照することにより、本発明の特徴および利点がよりよく理解される。
図１Ａは、錐体細胞における導入遺伝子の増強された発現のためのポリヌクレオチドカセットを示す概略図である。
図１Ｂは、錐体細胞における導入遺伝子の増強された発現のためのポリヌクレオチドカセットを含むウイルスベクターを示す概略図である。
図２は、スプライスドナーのコンセンサス配列（Ａ／Ｃ）Ａ Ｇ Ｇ Ｔ Ｐｕ Ａ Ｇ Ｕ；枝部位Ｃ Ｔ Ｐｕ Ａ Ｐｙ；Ｐｙリッチ領域；およびアクセプターＮ Ｃ Ａ Ｇ Ｇを含めた標準的な特徴を含有するイントロンの例を示す図である。
図３Ａは、５’ＵＴＲ ｍＲＮＡ構造の例である（配列番号５６）、ｐＲ２．１由来の５’ＵＴＲ ｍＲＮＡ構造（Ｍａｎｃｕｓｏら）を示す図である。この５’ＵＴＲは、２つの上流ＡＵＧおよびオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、高レベルの塩基対合およびヘアピン構造、ならびにより短いコザック配列を有する。
図３Ｂは、本開示の最適化されたカセットに由来する５’ＵＴＲ ｍＲＮＡおよび構造（配列番号５７）の例を示す図である。５’ＵＴＲは、上流ＡＵＧもＯＲＦも含まない。さらに、図３Ａの５’ＵＴＲと比較して、図３Ｂの５’ＵＴＲは短く、塩基対合が少なく、また、コザック配列がより長い。
図４Ａは、コドン最適化前のポリヌクレオチドカセットを示す図である。長さが２５０ヌクレオチドを超えるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が配列の下に灰色で示されている。
図４Ｂは、コドン最適化後であるが非導入遺伝子ＯＲＦ除去前のポリヌクレオチドカセットを示す図である。２５０ヌクレオチドを超えるＯＲＦが配列図の下に灰色で示されている。ＳＶ４０ポリＡから始まり１，３６５塩基に及ぶ逆方向の新しいＯＲＦの導入に留意されたい。
図４Ｃは、コドン最適化およびＯＲＦ除去後のポリヌクレオチドカセットを示す図である。２５０ヌクレオチドを超えるＯＲＦが配列図の下に灰色で示されている。配列が最適化されており、したがって、新しく導入されたＯＲＦが短縮または除去されていることに留意されたい。
図５は、硝子体内に送達されたＡＡＶ２改変体ＡＡＶ２−７ｍ８が、どのように、硝子体内に送達されたＡＡＶ２よりも効率的に霊長類の中心窩および傍中心窩内の網膜細胞に形質導入されるかを例示する図である。ＡＡＶ２．ＣＭＶ．ＧＦＰ（左上）；ＡＡＶ−２．５Ｔ．ＣＭＶ．ＧＦＰ（右上）（Ｅｘｃｏｆｆｏｎ Ｋ． Ｊ．ら、２００９年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １０６巻：３８６５〜３８７０頁）；（左下）ＡＡＶ２−７．８．ＣＭＶ．ＧＦＰ（Ｄａｌｋａｒａ Ｄら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ２０１３年６月１２日；５巻（１８９号）：１８９ｒａ７６）；またはＡＡＶ−ＳｈＨ１０．ＣＭＶ．ＧＦＰ（右下）（Ｋｌｉｍｃｚａｋ ＲＲら ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２００９年１０月１４日；４巻（１０号）：ｅ７４６７頁）のベクターゲノム５×１０１１個を５０μＬの体積でアフリカミドリザルの硝子体に注射し、８週間後にｉｎ ｖｉｖｏでのＯＣＴ蛍光イメージングによってＧＦＰ発現を観察した。
図６は、ｐＭＮＴＣ調節カセットにより、霊長類の中心窩錐体における遺伝子発現がどのくらいロバストに促進されるかを例示する図である。（ａ〜ｂ）ＡＡＶ２−７ｍ８．ＭＮＴＣ．ＧＦＰをヒヒの中心硝子体内に注射し、（ａ）５週間後および（ｂ）８週間後に眼底蛍光によって発現を観察した。（ｃおよびｄ）ＡＡＶ２−７ｍ８．ＭＮＴＣ．ＧＦＰを用いた注射のおよそ６カ月後の１５ミクロンの窩の切片内の、低拡大率（ｃ）および高拡大率（ｄ）での天然のＧＦＰ蛍光。
図７は、ＡＡＶ−送達ＭＮＴＣ．ＧＦＰの硝子体内注射後のマウス網膜の錐体におけるロバストかつ錐体特異的な遺伝子発現を例示する図である。（ａ〜ｂ）マウスがベクターゲノム５．０４×１０１０個の硝子体内注射を硝子体内注射によって受けた１１週間後のＧＦＰ蛍光の例。（ｃ〜ｅ）注射の１４週間後に組織学的検査のために網膜を採取し、錐体外節を、Ｌ／Ｍオプシンに対する抗体を用いて標識した（赤色）。（ｃ）では、赤色チャネルをオフにし、したがって、ネイティブなＧＦＰのみが可視であり、（ｄ）は、赤色チャネルをオンにして錐体外節の可視化を可能にした同じ画像である。（ｃ）と（ｄ）の比較により、全てではないにしてもほとんどの錐体がウイルスによって形質導入されたことが示される。（ｅ）錐体光受容体のプロファイルを示す、ｃおよびｄと同じ網膜からの、異なる角度からの画像。
図８は、スナネズミ網膜の錐体における、ｐＭＮＴＣ調節カセットによって導かれた遺伝子発現を例示する図である。ＣＭＶ、ｐＲ２．１、またはＭＮＴＣプロモーターの制御下でＧＦＰを有するウイルスのベクターゲノム１×１０１０〜２×１０１０個を５μＬ体積でスナネズミの硝子体内に注射し、ＧＦＰ発現を指定の時点で眼底蛍光イメージングによって可視化した。（ａ）硝子体内投与の４週間後に可視化した、ＡＡＶ２−７ｍ８．ＣＭＶ．ＧＦＰおよびＡＡＶ２−７ｍ８．ＭＮＴＣ．ＧＦＰによって導かれたＧＦＰの発現。スナネズミ１２−１０、１２−１１、および１２−１２にはＡＡＶ２−７ｍ８．ＣＭＶ．ＧＦＰを注射し、スナネズミ１２−１３、１２−１４、および１２−１５にはＡＡＶ２−７ｍ８．ＭＮＴＣ．ＧＦＰを注射した。ＯＤ、ｏｃｕｌｕｓ ｄｅｘｔｅｒ（右眼）。ＯＳ、ｏｃｕｌｕｓ ｓｉｎｉｓｔｅｒ（左眼）。（ｂ）ＡＡＶ２−７ｍ８．ｐＲ２．１．ＧＦＰおよびＡＡＶ２−７ｍ８．ＭＮＴＣ．ＧＦＰによって導かれたＧＦＰの発現、４週間後および８週間後に眼底蛍光イメージングによって検出した。 図８は、スナネズミ網膜の錐体における、ｐＭＮＴＣ調節カセットによって導かれた遺伝子発現を例示する図である。ＣＭＶ、ｐＲ２．１、またはＭＮＴＣプロモーターの制御下でＧＦＰを有するウイルスのベクターゲノム１×１０１０〜２×１０１０個を５μＬ体積でスナネズミの硝子体内に注射し、ＧＦＰ発現を指定の時点で眼底蛍光イメージングによって可視化した。（ａ）硝子体内投与の４週間後に可視化した、ＡＡＶ２−７ｍ８．ＣＭＶ．ＧＦＰおよびＡＡＶ２−７ｍ８．ＭＮＴＣ．ＧＦＰによって導かれたＧＦＰの発現。スナネズミ１２−１０、１２−１１、および１２−１２にはＡＡＶ２−７ｍ８．ＣＭＶ．ＧＦＰを注射し、スナネズミ１２−１３、１２−１４、および１２−１５にはＡＡＶ２−７ｍ８．ＭＮＴＣ．ＧＦＰを注射した。ＯＤ、ｏｃｕｌｕｓ ｄｅｘｔｅｒ（右眼）。ＯＳ、ｏｃｕｌｕｓ ｓｉｎｉｓｔｅｒ（左眼）。（ｂ）ＡＡＶ２−７ｍ８．ｐＲ２．１．ＧＦＰおよびＡＡＶ２−７ｍ８．ＭＮＴＣ．ＧＦＰによって導かれたＧＦＰの発現、４週間後および８週間後に眼底蛍光イメージングによって検出した。
図９Ａ〜９Ｄは、ｐＭＮＴＣ調節カセットにより、錐体プロモーターｐＲ２．１よりもロバストな、霊長類の中心窩錐体における遺伝子発現がもたらされることを実証する図である。ＡＡＶ２−７ｍ８．ＭＮＴＣ．ＧＦＰまたはＡＡＶ２−７ｍ８．ｐＲ２．１．ＧＦＰのベクターゲノム５×１０１１個を５０μＬの体積で示されている通りアフリカミドリザルの硝子体内に注射した（ＡＡＶ２−７ｍ８．ＭＮＴＣ．ＧＦＰを動物２７１および４７２に注射し、ＡＡＶ２−７ｍ８．ｐＲ２．１．ＧＦＰを動物５００および５０９に注射した）。（ａ）２週間、（ｂ）４週間、（ｃ）８週間、および（ｄ）１２週間の時点で、眼底蛍光カメラ（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）またはＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＯＣＴでの自己蛍光を使用して網膜をＧＦＰについてｉｎ ｖｉｖｏにおいて可視化した（ａ、ｂ；第８週および第１２週についてのデータは示していない）。ＯＤ、ｏｃｕｌｕｓ ｄｅｘｔｅｒ（右眼）。ＯＳ、ｏｃｕｌｕｓ ｓｉｎｉｓｔｅｒ（左眼）。 図９Ａ〜９Ｄは、ｐＭＮＴＣ調節カセットにより、錐体プロモーターｐＲ２．１よりもロバストな、霊長類の中心窩錐体における遺伝子発現がもたらされることを実証する図である。ＡＡＶ２−７ｍ８．ＭＮＴＣ．ＧＦＰまたはＡＡＶ２−７ｍ８．ｐＲ２．１．ＧＦＰのベクターゲノム５×１０１１個を５０μＬの体積で示されている通りアフリカミドリザルの硝子体内に注射した（ＡＡＶ２−７ｍ８．ＭＮＴＣ．ＧＦＰを動物２７１および４７２に注射し、ＡＡＶ２−７ｍ８．ｐＲ２．１．ＧＦＰを動物５００および５０９に注射した）。（ａ）２週間、（ｂ）４週間、（ｃ）８週間、および（ｄ）１２週間の時点で、眼底蛍光カメラ（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）またはＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＯＣＴでの自己蛍光を使用して網膜をＧＦＰについてｉｎ ｖｉｖｏにおいて可視化した（ａ、ｂ；第８週および第１２週についてのデータは示していない）。ＯＤ、ｏｃｕｌｕｓ ｄｅｘｔｅｒ（右眼）。ＯＳ、ｏｃｕｌｕｓ ｓｉｎｉｓｔｅｒ（左眼）。 図９Ａ〜９Ｄは、ｐＭＮＴＣ調節カセットにより、錐体プロモーターｐＲ２．１よりもロバストな、霊長類の中心窩錐体における遺伝子発現がもたらされることを実証する図である。ＡＡＶ２−７ｍ８．ＭＮＴＣ．ＧＦＰまたはＡＡＶ２−７ｍ８．ｐＲ２．１．ＧＦＰのベクターゲノム５×１０１１個を５０μＬの体積で示されている通りアフリカミドリザルの硝子体内に注射した（ＡＡＶ２−７ｍ８．ＭＮＴＣ．ＧＦＰを動物２７１および４７２に注射し、ＡＡＶ２−７ｍ８．ｐＲ２．１．ＧＦＰを動物５００および５０９に注射した）。（ａ）２週間、（ｂ）４週間、（ｃ）８週間、および（ｄ）１２週間の時点で、眼底蛍光カメラ（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）またはＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＯＣＴでの自己蛍光を使用して網膜をＧＦＰについてｉｎ ｖｉｖｏにおいて可視化した（ａ、ｂ；第８週および第１２週についてのデータは示していない）。ＯＤ、ｏｃｕｌｕｓ ｄｅｘｔｅｒ（右眼）。ＯＳ、ｏｃｕｌｕｓ ｓｉｎｉｓｔｅｒ（左眼）。 図９Ａ〜９Ｄは、ｐＭＮＴＣ調節カセットにより、錐体プロモーターｐＲ２．１よりもロバストな、霊長類の中心窩錐体における遺伝子発現がもたらされることを実証する図である。ＡＡＶ２−７ｍ８．ＭＮＴＣ．ＧＦＰまたはＡＡＶ２−７ｍ８．ｐＲ２．１．ＧＦＰのベクターゲノム５×１０１１個を５０μＬの体積で示されている通りアフリカミドリザルの硝子体内に注射した（ＡＡＶ２−７ｍ８．ＭＮＴＣ．ＧＦＰを動物２７１および４７２に注射し、ＡＡＶ２−７ｍ８．ｐＲ２．１．ＧＦＰを動物５００および５０９に注射した）。（ａ）２週間、（ｂ）４週間、（ｃ）８週間、および（ｄ）１２週間の時点で、眼底蛍光カメラ（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）またはＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＯＣＴでの自己蛍光を使用して網膜をＧＦＰについてｉｎ ｖｉｖｏにおいて可視化した（ａ、ｂ；第８週および第１２週についてのデータは示していない）。ＯＤ、ｏｃｕｌｕｓ ｄｅｘｔｅｒ（右眼）。ＯＳ、ｏｃｕｌｕｓ ｓｉｎｉｓｔｅｒ（左眼）。
図１０Ａ〜１０Ｄは、最適化されたｐＭＮＴＣエレメントのそれぞれの、よりロバストな観察された発現への寄与を実証する図である。（ａ）ｐＭＮＴＣ発現カセットおよびｐＲ２．１発現カセット。（ｂ）ｐＭＮＴＣ内の各エレメントを１つずつｐＲ２．１内の対応するエレメントで置き換えた実験的な発現カセット。（ｃ、ｄ）注射の（ｃ）４週間後および（ｄ）８週間後にＩＶＩＳイメージングによって検出された、試験物のそれぞれを硝子体内に注射したスナネズミの網膜におけるルシフェラーゼ導入遺伝子の発現（構築物当たりｎ＝６〜８の眼）。「７Ｍ８．ＣＭＶ」は陽性対照としての機能を果たした。 図１０Ａ〜１０Ｄは、最適化されたｐＭＮＴＣエレメントのそれぞれの、よりロバストな観察された発現への寄与を実証する図である。（ａ）ｐＭＮＴＣ発現カセットおよびｐＲ２．１発現カセット。（ｂ）ｐＭＮＴＣ内の各エレメントを１つずつｐＲ２．１内の対応するエレメントで置き換えた実験的な発現カセット。（ｃ、ｄ）注射の（ｃ）４週間後および（ｄ）８週間後にＩＶＩＳイメージングによって検出された、試験物のそれぞれを硝子体内に注射したスナネズミの網膜におけるルシフェラーゼ導入遺伝子の発現（構築物当たりｎ＝６〜８の眼）。「７Ｍ８．ＣＭＶ」は陽性対照としての機能を果たした。 図１０Ａ〜１０Ｄは、最適化されたｐＭＮＴＣエレメントのそれぞれの、よりロバストな観察された発現への寄与を実証する図である。（ａ）ｐＭＮＴＣ発現カセットおよびｐＲ２．１発現カセット。（ｂ）ｐＭＮＴＣ内の各エレメントを１つずつｐＲ２．１内の対応するエレメントで置き換えた実験的な発現カセット。（ｃ、ｄ）注射の（ｃ）４週間後および（ｄ）８週間後にＩＶＩＳイメージングによって検出された、試験物のそれぞれを硝子体内に注射したスナネズミの網膜におけるルシフェラーゼ導入遺伝子の発現（構築物当たりｎ＝６〜８の眼）。「７Ｍ８．ＣＭＶ」は陽性対照としての機能を果たした。 図１０Ａ〜１０Ｄは、最適化されたｐＭＮＴＣエレメントのそれぞれの、よりロバストな観察された発現への寄与を実証する図である。（ａ）ｐＭＮＴＣ発現カセットおよびｐＲ２．１発現カセット。（ｂ）ｐＭＮＴＣ内の各エレメントを１つずつｐＲ２．１内の対応するエレメントで置き換えた実験的な発現カセット。（ｃ、ｄ）注射の（ｃ）４週間後および（ｄ）８週間後にＩＶＩＳイメージングによって検出された、試験物のそれぞれを硝子体内に注射したスナネズミの網膜におけるルシフェラーゼ導入遺伝子の発現（構築物当たりｎ＝６〜８の眼）。「７Ｍ８．ＣＭＶ」は陽性対照としての機能を果たした。
定義
「ベクター」とは、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドを含むまたはポリヌクレオチドと結合し、ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介するために使用することができる高分子または高分子の結合体（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を指す。例示的なベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、および他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。
「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスに対する略語であり、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用することができる。この用語は、別段の必要性がある場合を除き、全ての亜型、および天然に存在する形態と組換え形態の両方を包含する。「ＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ−１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ−２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ−３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ−４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ−５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ−６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ−７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ−８）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶを含む。「霊長類ＡＡＶ」とは、霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」とは、非霊長類哺乳動物に感染するＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」とは、ウシ科の哺乳動物に感染するＡＡＶを指す、などである。
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（典型的には野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質全て）およびカプシドに包まれた（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅｄ）ポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターで構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、「ｒＡＡＶベクター粒子」または単に「ｒＡＡＶベクター」と称されるのが典型的である。したがって、ベクターはｒＡＡＶ粒子内に含有されるので、ｒＡＡＶ粒子の作製とは、ｒＡＡＶベクターの作製を必ず含む。
「複製欠損」という用語は、本発明のＡＡＶウイルスベクターに対して本明細書で使用される場合、ＡＡＶベクターがそのゲノムを独立して複製およびパッケージングすることができないことを意味する。例えば、被験体の細胞にｒＡＡＶビリオンを感染させると、感染細胞において異種遺伝子が発現するが、感染細胞はＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびにアクセサリー機能遺伝子を欠くという事実から、ｒＡＡＶはそれ以上複製できない。
「ＡＡＶ改変体」または「ＡＡＶ変異体」とは、本明細書で使用される場合、ａ）改変体ＡＡＶカプシドタンパク質であって、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸の差異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含み、また、対応する、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質内に存在するアミノ酸配列を含まない親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して網膜細胞の感染性の増大を付与するものである、改変体ＡＡＶカプシドタンパク質、およびｂ）異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸で構成されるウイルス粒子を指す。
「ｒＡＡＶ」という略語は、組換えアデノ随伴ウイルスを指し、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも称される。「ｒＡＡＶベクター」とは、本明細書で使用される場合、ＡＡＶ起源のものではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶに対して異種性のポリヌクレオチド）、典型的には細胞の遺伝学的形質転換のための目的の配列を含むＡＡＶベクターを指す。一般に、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、一般には２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している。ｒＡＡＶベクターという用語は、ｒＡＡＶベクター粒子とｒＡＡＶベクタープラスミドのどちらも包含する。
本明細書で使用される場合、「遺伝子」または「コード配列」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を指す。いくつかの場合には、遺伝子は、コード配列、すなわち遺伝子産物をコードする配列からなるまたはそれから本質的になる。他の場合では、遺伝子は、追加的な非コード配列を含む。例えば、遺伝子は、コード領域の前の領域と後ろの領域、例えば、個々のコードセグメント（エクソン）の間の５’非翻訳（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列および３’ＵＴＲまたは「トレーラー」配列、ならびに介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
本明細書で使用される場合、「治療用遺伝子」とは、発現させると、それが存在する細胞または組織に対して、または当該遺伝子が発現する哺乳動物に対して有益な効果を付与する遺伝子を指す。有益な効果の例としては、状態もしくは疾患の徴候もしくは症状の寛解、状態もしくは疾患の防止もしくは阻害、または所望の特性の付与が挙げられる。治療用遺伝子としては、細胞または哺乳動物における遺伝的欠損を補正する遺伝子が挙げられる。
本明細書で使用される場合、導入遺伝子とは、ベクターによって細胞に送達される遺伝子である。
本明細書で使用される場合、「遺伝子産物」という用語は、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡもしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含めた干渉ＲＮＡなどの、ポリヌクレオチド配列の所望の発現産物を指す。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。この用語は、修飾、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、リン酸化、または標識構成成分とのコンジュゲーションがなされたアミノ酸のポリマーも包含する。
「含む」とは、列挙された要素が、例えば、組成物、方法、キットなどに必要であるが、例えば、特許請求の範囲内に入る組成物、方法、キットなどを形成するために他の要素が含まれていてもよいことを意味する。例えば、プロモーターに作動可能に連結した治療用ポリペプチドをコードする遺伝子を「含む」発現カセットは、遺伝子およびプロモーターに加えて、他の要素、例えば、ポリ−アデニル化配列、エンハンサーエレメント、他の遺伝子、リンカードメインなどを含み得る発現カセットである。
「から本質的になる」とは、記載されている、例えば、組成物、方法、キットなどの範囲が、例えば、組成物、方法、キットなどの基本的な特性および新規の特性に実質的な影響を及ぼさない指定の材料またはステップに限定されることを意味する。例えば、プロモーターに作動可能に連結した治療用ポリペプチドをコードする遺伝子およびポリアデニル化配列「から本質的になる」発現カセットは、遺伝子の転写または翻訳に実質的な影響を及ぼさない限りは、追加的な配列、例えば、リンカー配列を含んでよい。別の例として、列挙された配列「から本質的になる」改変体、または変異体、ポリペプチド断片は、それが由来する全長のナイーブなポリペプチドに基づいて配列の境界に、列挙された配列のアミノ酸配列プラスまたはマイナス約１０アミノ酸残基、例えば、列挙された結合アミノ酸残基よりも１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１残基少ない、または列挙された結合アミノ酸残基よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基多いアミノ酸残基を有する。
「からなる」とは、組成物、方法、またはキットから、特許請求の範囲において指定されていないあらゆる要素、ステップ、または成分が排除されることを意味する。例えば、プロモーターに作動可能に連結した治療用ポリペプチドをコードする遺伝子、およびポリアデニル化配列「からなる」発現カセットは、プロモーター、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、およびポリアデニル化配列のみからなる。別の例として、列挙された配列「からなる」ポリペプチドは、列挙された配列のみを含有する。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」例えば、「％配列同一性」という用語は、ヌクレオチド配列アラインメントプログラムを使用してアラインメントしたときの２つまたはそれ超のポリヌクレオチドの間、またはアミノ酸配列アラインメントプログラムを使用してアラインメントしたときの２つまたはそれ超のポリペプチド配列の間の同一性の程度を指す。同様に、「同一」またはパーセント「同一性」という用語は、２つまたはそれ超のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に関して本明細書で使用される場合、例えば、配列比較アルゴリズム、例えばＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムなどを使用して、または目視検査によって測定して、最大の対応について比較およびアラインメントしたときに同じまたは指定の百分率のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つの配列を指す。例えば、２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムに組み入れられたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８巻：４４４〜４５３頁）アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ならびにギャップ重みづけ（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）１６、１４、１２、１０、８、６、または４および長さ重みづけ（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）１、２、３、４、５、または６を使用して決定することができる。別の例として、２つのヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列ならびにギャップ重みづけ４０、５０、６０、７０、または８０および長さ重みづけ１、２、３、４、５、または６を使用して決定することができる。特に好ましいパラメータのセット（そして別段の指定がない限り使用されるべきもの）は、ギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）１２、ギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ）４、およびフレームシフトギャップペナルティ（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）５を用いたＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリング行列である。２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられたＥ． ＭｅｙｅｒｓおよびＷ． Ｍｉｌｌｅｒ（１９８９年、Ｃａｂｉｏｓ、４巻：１１〜１７頁）のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み付け残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ（ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）１２およびギャップペナルティ４を使用して決定することもできる。例えば、他のファミリーメンバーまたは関連する配列を同定するために公共のデータベースに対する検索を実施するための「クエリ配列」として本明細書に記載の核酸およびタンパク質配列を使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ、２１５巻：４０３〜１０頁）のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２を用いて実施して、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施して、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較する目的でギャップを挿入したアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２５巻：３３８９〜３４０２頁）に記載のＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定のパラメータを使用することができる。
「％相同性」という用語は、本明細書では、本明細書の「％同一性」という用語と互換的に使用され、配列アラインメントプログラムを使用してアラインメントしたときの２つまたはそれ超のアラインメントされた配列の間の核酸またはアミノ酸配列同一性のレベルを指す。例えば、本明細書で使用される場合、８０％相同性とは、規定のアルゴリズムによって決定された８０％配列同一性と同じことを意味し、したがって、所与の配列の相同体は、所与の配列の長さにわたって８０％超の配列同一性を有する。
本明細書で使用される場合、「相補物」および「相補的」という用語は、逆平行のヌクレオチド配列内の相補的な塩基残基の間で水素結合が形成されると互いと対形成することが可能な２つの逆平行のヌクレオチド配列を指す。例えば、ｓｈＲＮＡは、標的配列に対して相補的、すなわち、１００％相補的、または実質的に相補的、例えば、８０％相補的、８５％相補的、９０％相補的、９５％相補的、９８％相補的、またはそれ超相補的であり得る。「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞における内在性遺伝子、導入遺伝子またはコード配列の転写および／または翻訳を包含する。
「発現ベクター」とは、本明細書で使用される場合、目的の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む上記のまたは当技術分野で公知のベクター、例えば、プラスミド、ミニサークル（ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ）、ウイルスベクター、リポソームなどを包含し、意図された標的細胞において遺伝子産物の発現をもたらすために使用されるものである。発現ベクターはまた、標的における遺伝子産物の発現を容易にするための、コード領域に作動可能に連結した制御エレメントも含む。制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ＵＴＲ、ｍｉＲＮＡターゲティング配列などと、発現のために作動可能に連結した遺伝子（複数可）の組合せは、時には、「発現カセット」と称される。そのような制御エレメントは多く公知であり、当技術分野において入手可能である、または当技術分野において入手可能な構成成分から容易に構築することができる。
「プロモーター」とは、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼの結合を導き、それにより、ＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列、すなわち、転写を導くために十分な最小の配列を包含する。プロモーターおよび対応するタンパク質またはポリペプチドの発現は、遍在する、つまり、広範囲の細胞、組織および種において強力に活性なものであってもよく、細胞型特異的、組織特異的、または種特異的なものであってもよい。プロモーターは、「構成的」、つまり、継続的に活性なものであってもよく、「誘導性」、つまり、生物要因または非生物要因の有無によって活性化または非活性化されるものであってよい。プロモーター配列と連続していてもしてなくてもよいエンハンサー配列も本発明の核酸構築物またはベクターに含まれる。エンハンサー配列は、プロモーター依存性遺伝子発現に影響を及ぼすものであり、ネイティブな遺伝子の５’領域または３’領域に位置してよい。
「エンハンサー」とは、本明細書で使用される場合、隣接する遺伝子の転写を刺激または阻害するシス作用性エレメントを包含する。転写を阻害するエンハンサーは「サイレンサー」とも称される。エンハンサーは、コード配列から、および転写される領域の下流の位置から、数キロベース対（ｋｂ）までの距離にわたって、いずれの方向にも機能し得る（すなわち、コード配列と結び付けることができる）。
「終結シグナル配列」とは、本明細書で使用される場合、例えば、ポリアデニル化シグナル配列などの、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させる任意の遺伝子エレメントを包含する。
「ポリアデニル化シグナル配列」とは、本明細書で使用される場合、後にポリアデニル化コンセンサス配列ＡＡＴＡＡＡが続く、ＲＮＡ転写物のエンドヌクレアーゼ切断に必要な認識領域を包含する。ポリアデニル化シグナル配列により、「ポリＡ部位」、すなわち、転写後ポリアデニル化によってアデニン残基が付加されるＲＮＡ転写物上の部位がもたらされる。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」または「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、遺伝子エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル配列、ポリアデニル化配列などが近位にあり、当該エレメントが予測された様式で作動することが可能な関係にあることを指す。例えば、プロモーターによりコード配列の転写の開始が補助される場合、プロモーターは、コード領域に作動可能に連結している。この機能的な関係が維持される限りは、プロモーターとコード領域との間に残基が介在してもよい。本明細書で使用される場合、「異種性」という用語は、比較されている実体の残りとは遺伝子型として別個の実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学の技法によって異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに導入されたポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである。別の例として、そのネイティブなコード配列から取り出され、天然には連結して見いだされないコード配列に作動可能に連結したプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶは、天然に存在する、野生型ＡＡＶには通常含まれない核酸を含むｒＡＡＶであり、コードされる異種遺伝子産物は、天然に存在する野生型ＡＡＶによって通常はコードされない遺伝子産物である。
「内在性」という用語は、ヌクレオチド分子または遺伝子産物を参照して本明細書で使用される場合、宿主ウイルスまたは細胞において天然に存在するまたはそれに付随する、例えば、遺伝子または遺伝子エレメント、または遺伝子産物、例えば、ＲＮＡ、タンパク質を指す。
「ネイティブ」という用語は、本明細書で使用される場合、野生型ウイルスまたは細胞に存在するヌクレオチド配列、例えば、遺伝子、または遺伝子産物、例えば、ＲＮＡ、タンパク質を指す。「改変体」という用語は、本明細書で使用される場合、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列、例えば、ネイティブなポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の変異体、すなわち、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して１００％未満の配列同一性を有するものを指す。言い換えると、改変体は、参照ポリヌクレオチド配列、例えば、ネイティブなポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して少なくとも１つのアミノ酸の差異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含む。例えば、改変体は、全長のネイティブなポリヌクレオチド配列に対して７０％またはそれ超の配列同一性、全長のネイティブなポリヌクレオチド配列に対して、例えば、７５％または８０％またはそれ超の同一性、例えば、８５％、９０％、または９５％またはそれ超、例えば、９８％または９９％の同一性などを有するポリヌクレオチドであってよい。別の例として、改変体は、全長のネイティブなポリペプチド配列に対して７０％またはそれ超の配列同一性、例えば、７５％または８０％またはそれ超、例えば、８５％、９０％、または９５％またはそれ超の同一性など、例えば、全長のネイティブなポリペプチド配列に対して９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドであってよい。改変体は、参照、例えば、ネイティブな配列の断片と７０％またはそれ超の配列同一性、例えば、ネイティブな配列と７５％または８０％またはそれ超、例えば、８５％、９０％、または９５％またはそれ超、例えば、９８％または９９％同一性などの同一性を共有する参照、例えば、ネイティブな配列の改変体断片も含み得る。
本明細書で使用される場合、「生物活性」および「生物活性のある」という用語は、細胞内の特定の生物学的エレメントに帰する活性を指す。例えば、「免疫グロブリン」、「抗体」またはその断片もしくは改変体の「生物活性」とは、抗原性決定因子に結合し、それにより、免疫学的機能を促進する能力を指す。別の例として、ポリペプチドまたはその機能性断片もしくは改変体の生物活性とは、ポリペプチドまたはその機能性断片もしくは改変体の、例えば、結合、酵素活性などのネイティブな機能を行う能力を指す。第３の例として、遺伝子調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、コザック配列などの生物活性とは、調節エレメントまたはその機能性断片もしくは改変体の、それぞれ、作動可能に連結した遺伝子の発現の翻訳を調節する、すなわち、促進する、増強する、または活性化する能力を指す。
「投与」または「導入」という用語は、本明細書で使用される場合、組換えタンパク質を発現させるためのベクターを細胞に、被験体の細胞および／もしくは器官に、または被験体に送達することを指す。そのような投与または導入は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行うことができる。遺伝子産物を発現させるためのベクターは、典型的には、異種ＤＮＡを物理的手段（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、電気穿孔、微量注射またはリポフェクション）によって細胞に挿入することを意味するトランスフェクション；典型的には、感染因子、すなわちウイルスによって導入することを指す感染；または、典型的には、細胞にウイルスを安定に感染させることまたは１つの微生物から別の微生物にウイルス性因子（例えば、バクテリオファージ）によって遺伝物質を移入すること意味する形質導入によって細胞に導入することができる。
「形質転換」とは、典型的には、異種ＤＮＡを含む細菌または癌遺伝子を発現し、したがって、継続的な成長モードに変換されている細胞（腫瘍細胞など）を指すために使用される。細胞を「形質転換する」ために使用されるベクターは、プラスミド、ウイルスまたは他のビヒクルであり得る。
典型的には、細胞は、異種ＤＮＡ（すなわち、ベクター）を細胞に投与、導入または挿入するために使用される手段に応じて、「形質導入された」、「感染した」；「トランスフェクトされた」または「形質転換された」と称される。「形質導入された」、「トランスフェクトされた」および「形質転換された」という用語は、本明細書では、異種ＤＮＡの導入方法にかかわらず互換的に使用することができる。
「宿主細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、ベクターを用いて形質導入、感染、トランスフェクトまたは形質転換された細胞を指す。ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどであってよい。例えば温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に以前使用されたものであり、当業者には明らかになるであろう。「宿主細胞」という用語は、元の形質導入、感染、トランスフェクトまたは形質転換された細胞、およびその後代を指すことが理解されよう。
「治療」、「治療すること」などの用語は、本明細書において、一般に、所望の薬理的効果および／または生理的効果を得ることを意味するように使用される。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に防止すること、例えば、被験体において疾患またはその症状が起こる可能性を低減させることに関して予防的なものであってよく、かつ／または、疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用に対する部分的なまたは完全な治癒に関して治療的であってよい。「治療」とは、本明細書で使用される場合、哺乳動物における疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、今のところはまだそれを有すると診断されていない被験体において疾患が生じることを防止すること；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること；または（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすことを含む。治療剤は、疾患または傷害の発生の前、その間、またはその後に投与することができる。治療により患者の望ましくない臨床症状が安定化するまたは低減するような、進行中の疾患の治療が特に興味深い。そのような治療は、罹患組織が完全に機能喪失する前に行うことが望ましい。主題の療法は、疾患の症候性の段階において、いくつかの場合には疾患の症候性の段階の後に施されることが望ましい。
「個体」、「宿主」、「被験体」および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、これだけに限定されないが、サルおよびヒトを含めたヒトおよび非ヒト霊長類；哺乳動物の競技動物（例えば、ウマ）；哺乳動物の農場動物（例えば、ヒツジ、ヤギなど）；哺乳動物の愛玩動物（イヌ、ネコなど）；およびげっ歯類（例えば、マウス、ラットなど）を含めた哺乳動物を指す。
本発明の種々の組成物および方法が下に記載されている。本明細書には特定の組成物および方法が例示されているが、いくつもの代替的な組成物および方法が本発明の実施の使用に適用可能であり、適切であることが理解される。本発明の発現構築物および方法の評価は、当技術分野において標準の手順を使用して行うことができることも理解されよう。
本発明の実施では、別段の指定のない限り、当業者の技術の範囲内に入る、細胞生物学、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、生化学および免疫学の従来の技法を用いる。そのような技法は、それぞれが参照により本明細書に明白に組み込まれる、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ編、１９８４年）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７年）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ． Ｍ． Ｗｅｉｒ ＆ Ｃ． Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ． Ｍ． Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ． Ｐ． Ｃａｌｏｓ編、１９８７年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）；「ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４年）；および「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｊ． Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１年）などの文献において十分に説明されている。
本発明のいくつかの態様が例示のために適用の例を参照して下に記載されている。多数の特定の詳細、関係、および方法は、本発明の完全な理解をもたらすために記載されていることが理解されるべきである。しかし、本発明は、特定の詳細のうちの１つまたは複数を伴わずにまたは他の方法を用いて実施できることは関連分野の当業者には容易に理解されよう。本発明は、例示されている行為または事象の順序に限定されず、いくつかの行為は他の行為または事象と異なる順序で、かつ／またはそれと同時になされ得る。さらに、例示された行為または事象の全てが本発明による方法体系を実行するために必要であるとは限らない。
本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明を限定するものではない。本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、複数の形態も同様に含むものとする。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語またはその変形が発明の詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用されている限りでは、そのような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様に、包括的なものとする。
「約」または「およそ」という用語は、当業者により決定される特定の値に対する許容される誤差範囲内に入ることを意味し、許容される誤差範囲は、一部において、どのように値を測定または決定するか、つまり、測定システムの限界に依存する。例えば、「約」とは、当技術分野における実施に従って、１または１超の標準偏差の範囲内を意味し得る。あるいは、「約」とは、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、およびより好ましくはさらに１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁分の範囲内、好ましくは５倍以内、およびより好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が出願および特許請求の範囲に記載されている場合、別段の指定のない限り、特定の値について許容される誤差範囲を意味する「約」という用語が想定されているものとする。
本明細書で言及されている全ての刊行物は、引用された刊行物に関連して方法および／または材料を開示し、説明するために参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある限りでは、組み込まれた刊行物のいかなる開示にも本開示が取って代わることが理解される。
特許請求の範囲は、いかなる任意選択の要素も排除するように立案することができることにも留意する。そのように、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単に」、「のみ」などの排他的な用語の使用、または「否定的」限定の使用の前提としての機能を果たすものとする。
本明細書で考察されている刊行物は、単に、本出願の出願日より前のそれらの開示について提供されている。本明細書におけるいずれも、本発明が、先行発明に基づいてそのような刊行物に先行する権限がないことを容認するとは解釈されない。さらに、示された刊行物の日付は、独立に確認する必要があり得る実際の刊行物の日付とは異なる可能性がある。
別段の指定のない限り、本明細書で使用される用語は全て、当業者にとっての意味と同じ意味を有し、本発明の実施では、当業者の知見の範囲内に入る微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の技法を用いる。
発明の詳細な説明
本開示は、錐体細胞において遺伝子を発現させるためのポリヌクレオチドカセットおよび発現ベクターを提供する。例えば、個体における、例えば、錐体細胞障害を治療または予防するための、錐体細胞における遺伝子の発現の促進においてこれらの組成物を使用する方法も提供される。これらおよび他の本発明の目的、利点および特徴は、以下により十分に記載されている組成物および方法の詳細を読めば、当業者には明白になるであろう。
組成物
本開示の一部の態様では、錐体細胞において導入遺伝子を発現させるための組成物が提供される。「錐体細胞」は、本明細書では、「錐体光受容体」または「錐体」とも称され、比較的明るい光の中で最もよく機能する、眼の網膜内の光受容体細胞の亜型を意味する。錐体は、特定の波長の光に対して感受性であり、したがって、色の知覚を支持する。さらに、錐体は、杆体光受容体よりも刺激に対して速く応答し、杆体よりも像内の細かい詳細および迅速な変化を知覚し、したがって、読書や運転などの視覚的な細部が最も重要になる活動のために高い視力を維持する。錐体は、網膜の断面において、それらの外節が錐体様形状であることによって容易に同定可能である。錐体はまた、網膜内でのそれらの位置によっても容易に同定可能であり、最も高密度の錐体は、「中心窩（ｆｏｖｅａ ｃｅｎｔｒａｌｉｓ）」または「中心窩（ｆｏｖｅａｌ ｐｉｔ）」と称される網膜の黄斑の中心に位置する１．５ｍｍの凹部に存在する。
本開示の一部の実施形態では、錐体細胞における導入遺伝子の発現をもたらす組成物は、ポリヌクレオチドカセットである。「ポリヌクレオチドカセット」とは、２つまたはそれ超のポリヌクレオチド配列、例えば、調節エレメント、翻訳開始配列、コード配列、終結配列などを、典型的には、互いに作動可能に連結して含むポリヌクレオチド配列を意味する。同様に、「錐体細胞において導入遺伝子を発現させるためのポリヌクレオチドカセット」とは、錐体細胞における導入遺伝子の発現を促進する２つまたはそれ超のポリヌクレオチド配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、５’ＵＴＲ、翻訳開始配列、コード配列、終結配列などの組合せを意味する。
例えば、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、
（ａ）錐体細胞におけるコード配列の発現を促進するプロモーター領域と、
（ｂ）プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と
を含む。
別の例として、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、
（ａ）網膜錐体細胞におけるコード配列の発現を促進するプロモーター領域と、
（ｂ）翻訳開始配列と、
（ｃ）プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と
を含む。
第３の例として、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、
（ａ）網膜錐体細胞におけるコード配列の発現を促進するプロモーター領域と、
（ｂ）５’非翻訳領域と、
（ｃ）翻訳開始配列と、
（ｄ）プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と
を含む。
第４の例として、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、
（ａ）網膜錐体細胞におけるコード配列の発現を促進するプロモーター領域と、
（ｂ）５’非翻訳領域と、
（ｃ）イントロンと、
（ｄ）翻訳開始配列と、
（ｅ）プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と
を含む。
第５の例として、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、
（ａ）網膜錐体細胞におけるコード配列の発現を促進するプロモーター領域と、
（ｂ）５’非翻訳領域と、
（ｃ）イントロンと、
（ｄ）翻訳開始配列と、
（ｅ）ポリアデニル化配列と
を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドカセットにより、錐体細胞における導入遺伝子の増強された発現がもたらされる。本開示の実用的な実施例によって実証される通り、本発明者らは、錐体細胞における導入遺伝子の増強された発現を個別にかつ相乗的にもたらすいくつものポリヌクレオチドエレメント、すなわち、当技術分野で公知のものと比較して改善されたエレメントを発見した。「増強された」とは、本開示のポリヌクレオチドカセットを有する錐体細胞において、例えば当技術分野で公知の同等の調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を有する錐体細胞におけるものと比較して導入遺伝子の発現が増加している、増大している、またはより強力であることを意味する。言い換えると、本開示のポリヌクレオチドカセットからの導入遺伝子の発現は、本開示の１つまたは複数の最適化されたエレメントを含まないポリヌクレオチドカセット、すなわち、参照対照からの発現と比較して増加する、増大する、またはより強力になる。例えば、本明細書に開示されているプロモーターを含むポリヌクレオチドカセットを含む錐体細胞では、例えば当技術分野で公知の異なるプロモーターと作動可能に連結した導入遺伝子を有する錐体細胞におけるものよりも、導入遺伝子の発現が増強される、または増大する、またはより強力になる。別の例として、本明細書に開示されているエンハンサー配列を含むポリヌクレオチドカセットを含む錐体細胞では、異なるエンハンサー配列と作動可能に連結した導入遺伝子を有する錐体細胞におけるものよりも、導入遺伝子の発現が増強される、または増加する、増大する、またはより強力になる。別の例として、本明細書に開示されている５’ＵＴＲをコードするポリヌクレオチドカセットを含む錐体細胞では、異なる５’ＵＴＲコード配列に作動可能に連結した導入遺伝子を有する錐体細胞におけるものよりも、導入遺伝子の発現が増強される、または増加する、増大する、またはより強力になる。別の例として、本明細書に開示されているイントロンを含むポリヌクレオチドカセットを含む錐体細胞では、当技術分野で公知の異なるイントロン配列に作動可能に連結した導入遺伝子を有する錐体細胞におけるものよりも、導入遺伝子の発現が増強される、または増加する、増大する、またはより強力になる。比較用の参照として使用することができるエレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、５’ＵＴＲ、およびイントロン）を含む例示的な配列としては、例えば米国特許出願第２０１３／０３１７０９１号に開示されているネイティブなＬ−オプシンプロモーター（配列番号１）およびその改変体に含まれる配列、合成プロモーターｐＲ２．１（配列番号５０）およびその改変体（例えば、ｐＲ１．７、ｐＲ１．５、ｐＲ１．１）に含まれる配列、ならびにＩＲＢＰ／ＧＮＡＴ２プロモーター（米国特許出願第２０１４／０２７５２３１号）に含まれる配列が挙げられる。
理論に束縛されることを望むものではないが、細胞における導入遺伝子の増強された発現は、細胞において遺伝子産物がより速く蓄積すること、または細胞における遺伝子産物がより安定であることに起因すると考えられる。したがって、本開示のポリヌクレオチドカセットによる導入遺伝子の増強された発現は、いくつものやり方で観察することができる。例えば、増強された発現は、導入遺伝子の発現が、ポリヌクレオチドカセットを錐体細胞と接触させた後、導入遺伝子が例えば当技術分野で公知の同等の調節エレメントに作動可能に連結した場合に検出される発現よりも早く、例えば、７日早く、２週間早く、３週間早く、４週間早く、８週間早く、１２週間早く、またはそれ超の期間だけ早く検出されることによって観察することができる。増強された発現は、細胞当たりの遺伝子産物の量が増加することによっても観察することができる。例えば、錐体細胞当たりの遺伝子産物の量が２倍増加もしくはそれ超、例えば、３倍増加もしくはそれ超、４倍増加もしくはそれ超、５倍増加もしくはそれ超、または１０倍増加もしくはそれ超増加し得る。増強された発現は、ポリヌクレオチドカセットに保有される導入遺伝子を検出可能なレベルで発現する錐体細胞の数の増加として観察することもできる。例えば、導入遺伝子を検出可能なレベルで発現する錐体細胞の数が２倍増加またはそれ超、例えば、３倍増加もしくはそれ超、４倍増加もしくはそれ超、５倍増加もしくはそれ超、または１０倍増加もしくはそれ超増加し得る。別の例として、本発明のポリヌクレオチドにより、従来のポリヌクレオチドカセットと比較してより大きな百分率の細胞において検出可能なレベルの導入遺伝子を促進することができ、例えば、従来のカセットにより、例えば、ある特定の領域内の錐体細胞の５％未満で検出可能なレベルの導入遺伝子発現を促進することができる場合、本発明のポリヌクレオチドでは、その領域内の錐体細胞の５％またはそれ超で検出可能なレベルの発現が促進され、例えば、接触させた錐体細胞の１０％またはそれ超、１５％またはそれ超、２０％またはそれ超、２５％またはそれ超、３０％またはそれ超、３５％またはそれ超、４０％またはそれ超、または４５％またはそれ超、いくつかの場合には５０％またはそれ超、５５％またはそれ超；６０％またはそれ超、６５％またはそれ超、７０％またはそれ超、または７５％またはそれ超、例えば、８０％もしくはそれ超、８５％もしくはそれ超、９０％もしくはそれ超、または９５％またはそれ超で検出可能なレベルの遺伝子産物が発現される。増強された発現は、例えば、当技術分野で公知のおよび本明細書に記載の、例えば、眼底撮影法、ＯＣＴ、補償光学（ａｄａｐｔｉｖｅ ｏｐｔｉｃｓ）、ｃＥＲＧ、色覚検査、視力検査などの評価ツールを使用して測定される錐体細胞の生存能力および／または機能の変更として観察することもできる。
本開示のポリヌクレオチドカセットは、典型的には、プロモーター領域を含む。その中の任意の適切なプロモーター領域またはプロモーター配列を、当該プロモーター領域により網膜錐体細胞におけるコード配列の発現が促進される限りは、主題のポリヌクレオチドカセットに使用することができる。一部の実施形態では、プロモーターにより、哺乳動物の網膜錐体細胞、より好ましくは霊長類網膜錐体細胞において、より好ましくはＣａｔａｒｒｈｉｎｉ網膜錐体細胞において、なおより好ましくはヒト網膜錐体細胞において、遺伝子の発現が特異的に促進される。「特異的に」とは、プロモーターにより、遺伝子の発現が、標的細胞において他の細胞型と比較して優勢に促進されることを意味する。したがって、例えば、錐体細胞における発現を特異的に促進するプロモーター領域を用いると、主題のポリヌクレオチドカセットを眼に送達した後、発現の５０％超、例えば、発現の少なくとも６０％、６５％、７０％または７５％もしくはそれ超のいずれか、例えば、遺伝子の発現の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ超のいずれかが錐体細胞におけるものになる。
例示的な適切なプロモーター領域としては、任意の錐体特異的遺伝子に対するプロモーター領域、例えば、４９２Ｌ−オプシンプロモーター領域（配列番号１）、４９１Ｌ−オプシンプロモーター領域（配列番号５３）、４９６Ｌ−オプシンプロモーター領域（配列番号７９）、Ｍ−オプシンプロモーター領域（配列番号２、配列番号５４）、最小Ｍ−オプシンプロモーター領域（配列番号５５、配列番号９３）、本明細書において初めて開示されるコアＭ−オプシンプロモーター配列（配列番号８０）、Ｓ−オプシンプロモーター領域（配列番号３）、ｈＲＫプロモーター領域、および錐体アレスチンプロモーター領域、または錐体細胞における遺伝子の発現を促進する活性を保持するその部分もしくは改変体などが挙げられる。主題のポリヌクレオチドカセットへの使用が見いだされるプロモーター領域の部分または断片の非限定的な例としては、５’ＵＴＲのすぐ上流のプロモーター配列、および当技術分野で公知の転写因子に対する標準的な結合配列が挙げられる。そのような部分または断片は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載の任意の都合のよい方法を使用して容易に決定することができる。例えば、配列番号５４および配列番号５５の５’ＵＴＲのすぐ上流のプロモーター配列は、例えば、ＵＣＳＣゲノムＢＬＡＴブラウザなどの公的に入手可能なツールを使用して配列番号５４のヌクレオチド１〜４０６または配列番号５５のヌクレオチド１〜１５４から本質的になる配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏ評価することによって、または、例えば本明細書の実用的な実施例に記載の通りレポーター遺伝子との作動可能な連結および錐体細胞への導入による経験的な試験によって容易に決定することができる。一部の実施形態では、ベクター内で他のヌクレオチドエレメントに対してより多くの空間がもたらされるので、短いプロモーター配列が長いプロモーター配列よりも好ましい。一部の実施形態では、プロモーター領域は４９２塩基対未満の長さである。例えば、一部の実施形態では、機能性断片は、配列番号１のヌクレオチド１〜１０またはそれ超を含まず、例えば、機能性断片は、配列番号１のヌクレオチド１〜２０またはそれ超、ヌクレオチド１〜３０またはそれ超、ヌクレオチド１〜４０またはそれ超、ヌクレオチド１〜５０またはそれ超、例えば、配列番号１のヌクレオチド１〜６０またはそれ超、ヌクレオチド１〜７０またはそれ超、ヌクレオチド１〜８０またはそれ超、ヌクレオチド１〜９０またはそれ超、ヌクレオチド１〜１００またはそれ超、いくつかの場合には、配列番号１のヌクレオチド１〜１２０もしくはそれ超、ヌクレオチド１〜１４０もしくはそれ超、ヌクレオチド１〜１６０もしくはそれ超、ヌクレオチド１〜１８０もしくはそれ超、ヌクレオチド１〜２００もしくはそれ超、ヌクレオチド１〜２２０もしくはそれ超、ヌクレオチド１〜２４０もしくはそれ超、またはおよそヌクレオチド１〜２６０を含まない。哺乳動物または霊長類の錐体細胞における発現を駆動することが可能なプロモーター領域を同定するための任意の適切な方法を使用して、本開示のポリヌクレオチドカセットへの使用が見いだされるプロモーター領域およびその中のプロモーター配列を同定することができる。
一部の実施形態では、主題のポリヌクレオチドカセットのプロモーター領域は、本明細書に開示されているプロモーター領域、例えば、４９２Ｌ−オプシンプロモーター領域（配列番号１）、４９１Ｌ−オプシンプロモーター領域（配列番号５３）、４９６Ｌ−オプシンプロモーター領域（配列番号７９）、Ｍオプシンプロモーター領域（配列番号２、配列番号５４）、最小Ｍオプシンプロモーター領域（配列番号５５、配列番号９３）、本明細書に開示されているコアＭ−オプシンプロモーター配列（配列番号８０）、またはＳオプシンプロモーター領域（配列番号３）、またはその機能性断片もしくは改変体、例えば、上述の配列もしくはその機能性断片に対して、７５％またはそれ超、例えば、８０％もしくはそれ超、８５％もしくはそれ超、９０％もしくはそれ超、または９５％もしくはそれ超（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％）の同一性を有する配列のうちの１つを含む。一部の実施形態では、主題のポリヌクレオチドカセットのプロモーター配列は、本明細書に開示されているプロモーター領域、すなわち配列番号１、配列番号５３、配列番号７９、配列番号２、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９３、配列番号８０、もしくは配列番号３、またはその機能性断片もしくは改変体、例えば、上述の配列の全長プラスマイナス１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド、またはその機能性断片に対して７５％もしくはそれ超、例えば、８０％もしくはそれ超、８５％もしくはそれ超、９０％もしくはそれ超、または９５％もしくはそれ超（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％）の同一性を有する配列のうちの１つから本質的になる。一部の実施形態では、主題のポリヌクレオチドカセットのプロモーター領域は、本明細書に開示されているプロモーター領域、すなわち配列番号１、配列番号５３、配列番号７９、配列番号２、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９３、配列番号８０、もしくは配列番号３、またはその機能性断片もしくは改変体、例えば、上述の配列の全長またはその機能性断片に対して７５％またはそれ超、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ超の同一性を有する配列のうちの１つからなる。ある特定の実施形態では、プロモーター領域は、配列番号７４から本質的になる。一部のそのような実施形態では、プロモーター配列は、配列番号８０から本質的になる。一部の実施形態では、プロモーターにより、当技術分野で公知の他のプロモーター、例えば、合成プロモーターｐＲ２．１、ｐＲ１．７、ｐＲ１．１、およびＩＲＢＰ／ＧＮＡＴ２と比較して、錐体細胞における増強された発現がもたらされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、エンハンサーエレメントをさらに含む。エンハンサーは、転写を増強することが当技術分野で公知の核酸エレメントであり、当該エンハンサーにより調節される遺伝子と関連したどこにでも、例えば、上流、下流、イントロン内などに位置してよい。プロモーターと組み合わせて使用したときに遺伝子の発現を増強するものである限りは、任意のエンハンサーエレメントを本開示のポリヌクレオチドカセットおよび遺伝子療法ベクターに使用することができる。好ましい実施形態では、エンハンサーエレメントは、網膜錐体細胞に対して特異的である、より好ましくは、エンハンサーエレメントは、霊長類網膜錐体細胞、より好ましくはＣａｔａｒｒｈｉｎｉ網膜錐体細胞、なおより好ましくはヒト網膜錐体細胞に対して特異的である。「特異的に」とは、エンハンサーにより、標的細胞において他の細胞型と比較して遺伝子の発現が優勢に増強されることを意味する。したがって、例えば、錐体細胞における発現を特異的に増強するエンハンサーを用いると、ベクターを眼に送達した後、発現の５０％超、例えば、発現の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％またはそれ超のいずれか、例えば、遺伝子の発現の少なくとも８０％、および好ましくは８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ超が錐体細胞におけるものになる。
本開示のポリヌクレオチドカセットへの使用が見いだされる例示的なエンハンサー領域としては、エンハンサー活性を保持する、任意の錐体特異的遺伝子またはそれらの断片もしくは改変体に対するエンハンサー領域を含む、それから本質的になる、あるいはそれからなるものが挙げられる。例えば、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と称されるＬ／Ｍ最小オプシンエンハンサー（Ｗａｎｇら、１９９２年、Ｎｅｕｒｏｎ ９巻：４２９〜４４０頁）（配列番号５２）を使用して、錐体細胞における遺伝子発現を増強することができ、それが存在しないと、青錐体１色覚が生じる（Ｎａｔｈａｎｓら、１９８９年；Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４５巻：８３１〜８３８頁）。ＬＣＲは、例えばＡＡＶベクターを用いた遺伝子療法において有用であることが示されている（Ｌｉら、Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８巻（２００８年）：３３２〜３３８頁）。さらに、３６ｂｐの「コア」ＬＣＲ配列から本質的になる機能性断片が、錐体細胞におけるオプシンプロモーターからの発現に必要かつ十分であることが同定されている（Ｋｏｍａｒｏｍｙら Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｏ ｃｏｎｅｓ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｃｏｎｅ ｏｐｓｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００８年；１５巻（１４号）：１０４９〜５５頁）（配列番号５１）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットのエンハンサーは、配列番号５１または配列番号５２を含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットのエンハンサーは、配列番号５１または配列番号５２から本質的になる。
Ｌ／Ｍ最小オプシンエンハンサーの１つまたは複数のコピーを含む１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１１００ヌクレオチド、１２００ヌクレオチド、１３００ヌクレオチド、１４００ヌクレオチド、１５００ヌクレオチド、１６００ヌクレオチド、１７００ヌクレオチド、１８００ヌクレオチド、１９００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、またはそれ超のヌクレオチドのＬ／Ｍエンハンサーエレメント、および完全なＬ／Ｍオプシンエンハンサー、または、遺伝子の発現を錐体特異的な様式で増強する活性を保持するその他の部分もしくは改変体が本組成物に使用される。本明細書における教示に基づいて当業者には理解される通り、霊長類錐体細胞における発現を駆動することが可能なエンハンサー配列を同定するための任意の適切な方法を使用して、そのようなエンハンサーを同定することができる。
プロモーター領域およびエンハンサー領域の長さは、それらの意図された目的に適した任意の長さであってよく、プロモーター領域とエンハンサー領域との間隔は、遺伝子産物の錐体特異的発現を促進するために適した任意の間隔であってよい。種々の好ましい実施形態では、エンハンサーは、プロモーターの０〜１５００ヌクレオチド上流；０〜１２５０ヌクレオチド上流；０〜１０００ヌクレオチド上流；０〜７５０ヌクレオチド上流；０〜６００ヌクレオチド上流；０〜５００ヌクレオチド上流；０〜４００ヌクレオチド上流；０〜３００ヌクレオチド上流；０〜２００ヌクレオチド上流；０〜１００ヌクレオチド上流；０〜９０ヌクレオチド上流；０〜８０ヌクレオチド上流；０〜７０ヌクレオチド上流；０〜６０ヌクレオチド上流；０〜５０ヌクレオチド上流；０〜４０ヌクレオチド上流；０〜３０ヌクレオチド上流；０〜２０ヌクレオチド上流；または０〜１０ヌクレオチド上流に位置する。プロモーターは、コードされる遺伝子から任意の適切な距離だけ上流にあってよい。
一部の実施形態では、主題のポリヌクレオチドカセットは、５’ＵＴＲとも称される、５’非翻訳領域をコードする配列、すなわち、コード配列に対して５’にある非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド配列を含む。発現カセットにおいて、５’ＵＴＲは、転写開始部位とタンパク質翻訳が開始されるコザック配列の間との配列として当技術分野で公知である。５’ＵＴＲの二次ｍＲＮＡ構造が転写レベルに影響を及ぼすことが公知である。具体的には、増強された遺伝子発現のために、本発明における５’ＵＴＲ領域の配列は、二次構造および非効率的なリボソームスキャニングおよび誤った翻訳開始に起因して翻訳効率を低減させることが公知である上流ＡＵＧ（ｕＡＵＧ）コドンが最小になるまたは回避されるように選択する（Ｋｏｚａｋ、１９９５年、ＰＮＡＳ ９２巻：２６６２頁）。Ｄａｖｕｌｕｒｉら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００年：１０巻（１１号）；１８０７〜１８１６頁を参照されたい。例えば、ヒト遺伝子ＨＳＰ７０由来の５’ＵＴＲ配列（配列番号５８）は、おそらくＩＲＥＳ機構に起因した、ｍＲＮＡ翻訳を増強する通常見られない能力が同定されている（Ｒｕｂｔｓｏｖａら、２００３年、ＰＮＡＳ ２７８巻（２５号）：２２３５０〜２２３５６頁；Ｖｉｖｉｎｕｓら、２００１年、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６８巻：１９０８〜１９１７頁）。任意の５’ＵＴＲを使用することができるが、５’ＵＴＲの配列は最小の二次的ｍＲＮＡ構造および上流ＡＵＧ配列を有することが理想的である。言い換えると、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットの転写開始部位と翻訳開始部位との間の配列はポリヌクレオチドＡＴＧを含有しない。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、もしくは配列番号８９；またはその機能性断片もしくは改変体、例えば、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、および配列番号８９からなる群より選択される配列、もしくはその断片に対して８５％またはそれ超の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、あるいはそれからなる。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ配列の一部または全部は、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号７９に開示されているプロモーター領域に含まれる。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、プロモーター領域に含まれない；例えば、５’ＵＴＲ配列をコードしないコアプロモーター配列である配列番号８４を参照されたい。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ配列は、プロモーター配列に対して異種性のものである。種々の好ましい実施形態では、ＵＴＲの３’末端は、コード配列の０〜２０ヌクレオチド上流；０〜１５ヌクレオチド上流；０〜１０ヌクレオチド上流；０〜９ヌクレオチド上流；０〜８ヌクレオチド上流；０〜７ヌクレオチド上流；０〜６ヌクレオチド上流；または０〜５ヌクレオチド上流であり、ＵＴＲの５’末端は、近位のプロモーター領域の０〜２０ヌクレオチド下流；０〜１５ヌクレオチド下流；０〜１０ヌクレオチド下流；０〜９ヌクレオチド下流；０〜８ヌクレオチド下流；０〜７ヌクレオチド下流；０〜６ヌクレオチド下流；または０〜５ヌクレオチド下流である。一部の実施形態では、５’ＵＴＲエレメントにより、当技術分野で公知の他の５’ＵＴＲ、例えば、合成プロモーターｐＲ２．１、ｐＲ１．７、ｐＲ１．１、およびＩＲＢＰ／ＧＮＡＴ２に含まれる５’ＵＴＲと比較して、錐体細胞における増強された発現がもたらされる。
一部の実施形態では、主題のポリヌクレオチドカセットは、スプライスドナー／アクセプター領域を含むイントロンをさらに含む。一部の実施形態では、イントロンは、プロモーター領域の下流に位置し、遺伝子の翻訳開始配列の上流に位置する、すなわち、イントロンは、５’ＵＴＲ内に位置する。他の実施形態では、イントロンは、遺伝子の翻訳開始配列の下流に位置する、すなわち、イントロンは、コード配列内に位置する。一般に、当技術分野で公知の通り、イントロンは、ＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡプロセシングの間にイントロンスプライシングによって除去されるＤＮＡポリヌクレオチドである。イントロンを含有するポリヌクレオチドカセットは、一般に、イントロンを有さないものよりも高い発現を有する。イントロンにより、発現が２倍〜５００倍刺激され得る（ＢｕｃｈｍａｎおよびＢｅｒｇ、１９８８年、Ｍｏｌ Ｃｅｌ Ｂｉｏ、８巻（１０号）：４３９５頁）。効率的にスプライシングされたイントロンは、プレスプライスドナー、枝分かれ部位、およびＰｙリッチ領域を含有する（Ｓｅｎａｐａｔｈｙら、１９９０年；Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３巻、２５２〜７８頁；ＷｕおよびＫｒａｉｎｅｒ、１９９９年；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９巻（５号）：３２２５〜３６頁）。５’イントロンは、一般に、３’末端にあるイントロンと比較して、より効率的である（ＨｕａｎｇおよびＧｏｒｍａｎ、１９９０年；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ、１０巻：１８０５頁）。一般に、イントロンにより遺伝子発現レベルが上昇することが公知であるが、所与のｃＤＮＡの特異的な増加（もしあれば）は経験的なものであり、試験しなければならない。例えば、ｐＳＩベクター内のキメライントロンにより、ＣＡＴ発現は２１倍上昇したが、ルシフェラーゼ発現の上昇はわずか３倍であった。
哺乳動物錐体細胞または霊長類錐体細胞において認識されるスプライスドナー／アクセプター領域を含み、したがって得られたｍＲＮＡ産物からイントロンをスプライシングにより除去することができる限りは、任意のイントロンを主題のポリヌクレオチドカセットに使用することができる。一実施形態では、イントロンは、配列番号５によるＳＶ４０イントロンを含む、それから本質的になる、またはそれからなる。別の実施形態では、イントロンは、ｐＳＩ（配列番号６０）に由来するキメライントロンもしくはその改変体を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。別の実施形態では、イントロンは、ＣＭＶイントロンＡもしくはその改変体を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。さらに別の実施形態では、イントロンは、ｐＲ２．１イントロン（配列番号５９）またはその改変体、あるいは、ウサギまたはヒトベータグロビンイントロンまたはその改変体を含む、それから本質的になる、またはそれからなる（Ｘｕら、２００１年、Ｇｅｎｅ ２７２巻：１４９頁；Ｘｕら２００２年；Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ ８１巻：１５５頁）。一部のそのような実施形態では、イントロンは、配列番号５、配列番号５９、および配列番号６０からなる群より選択される配列に対して８５％またはそれ超の配列同一性を有する配列を含む。典型的には、イントロンは、プロモーター領域および／または５’ＵＴＲに対して異種性である。
一部の実施形態では、イントロンは、５’ＵＴＲ内に存在する。言い換えれば、５’ＵＴＲをコードするＤＮＡ配列はイントロンＤＮＡ配列によって遮られている。例えば、配列番号８４である５’ＵＴＲのコード配列は、２つの部分、例えば、配列番号８５および配列番号８６でコードされ、それらの間にイントロン配列があるものであってよい。別の例として、配列番号８８である５’ＵＴＲのコード配列は、２つの部分、例えば、配列番号８９および配列番号７３でコードされ、それらの間にイントロン配列があるものであってよい。種々の実施形態では、イントロンの３’末端は遺伝子の０〜２０ヌクレオチド上流；０〜１５ヌクレオチド上流；０〜１０ヌクレオチド上流；０〜９ヌクレオチド上流；０〜８ヌクレオチド上流；０〜７ヌクレオチド上流；０〜６ヌクレオチド上流；または０〜５ヌクレオチド上流であり、イントロンの５’末端は近位のプロモーター領域の０〜２０ヌクレオチド下流；０〜１５ヌクレオチド下流；０〜１０ヌクレオチド下流；０〜９ヌクレオチド下流；０〜８ヌクレオチド下流；０〜７ヌクレオチド下流；０〜６ヌクレオチド下流；または０〜５ヌクレオチド下流である。他の実施形態では、イントロンは、遺伝子のコード配列内に存在する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドカセットは、「コザック配列」または「コザック翻訳開始配列」としても公知の翻訳開始配列を含む。これは、リボソームが付着し、翻訳が開始される核酸配列である。例として、ＡＣＣＡＴＧＧ（Ｋｏｚａｋ、１９８６年、Ｃｅｌｌ、４４巻：２８３〜２９２頁）および（ＧＣＣ）ＧＣＣ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＴＧＧ（Ｋｏｚａｋ、１９８７年、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ；１５巻（２０号）：８１２５頁）（配列番号７３）が挙げられる。任意の適切なコザック配列をポリヌクレオチドカセットに使用することができ、それは網膜錐体細胞におけるコード配列の発現が増加するように選択することが好ましい。一実施形態では、翻訳開始配列は配列番号７２を含む。代替の実施形態では、翻訳開始配列は配列番号７３を含む。一部の実施形態では、コザックエレメントにより、当技術分野で公知の他のコザック配列、例えば、合成プロモーターｐＲ２．１、ｐＲ１．７、ｐＲ１．１、およびＩＲＢＰ／ＧＮＡＴ２に含まれるコザック配列と比較して、錐体細胞における増強された発現がもたらされる。
本発明の一部の態様では、例えば、遺伝子が細胞の生存能力および／または機能に対して有する効果を決定するために、錐体細胞障害を治療するなどのために、主題のポリヌクレオチドカセットを使用して遺伝子を動物の錐体細胞に送達する。したがって、一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドカセットは、導入遺伝子としてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて動物の錐体細胞に送達される遺伝子をさらに含む。遺伝子コード配列は、典型的には、主題のポリヌクレオチドカセットのプロモーター領域に作動可能に連結しており、エンハンサーエレメントが存在する例では、主題のポリヌクレオチドカセットのエンハンサーエレメントに作動可能に連結しており、したがって、プロモーターおよび場合によってエンハンサーエレメントにより、被験体の錐体細胞におけるコード配列またはｃＤＮＡの発現が促進される。
錐体細胞において発現されるコード配列は、任意のポリヌクレオチド配列、例えば、遺伝子産物をコードする遺伝子またはｃＤＮＡ、例えば、ポリペプチドまたはＲＮＡに基づく治療薬（ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、リボザイム、ｓｈＲＮＡなど）であってよい。コード配列は、それが作動可能に連結したプロモーター配列および／または５’ＵＴＲ配列に対して異種性であってよい、すなわち、天然にはそれと作動可能に結びついていないものであってよい。あるいは、コード配列は、それが作動可能に連結したプロモーター配列および／または５’ＵＴＲ配列に対して内在性であってよい、すなわち、天然にそのプロモーターまたは５’ＵＴＲと結びついたものであってよい。遺伝子産物は、錐体細胞において内因的に作用するものであってもよく、外因性に作用するものであってもよい、例えば、分泌されるものであってもよい。例えば、導入遺伝子が治療用遺伝子である場合、コード配列は、錐体細胞疾患または障害を治療するための治療薬として、または、これだけに限定されないが、４色型色覚の促進を含めた、他の点で視覚を増強するための手段として使用することができる所望の遺伝子産物またはその機能性断片もしくは改変体をコードする任意の遺伝子であってよい。種々の好ましい実施形態では、導入遺伝子は、以下からなる群より選択される治療用タンパク質またはその機能性断片もしくは改変体をコードする：
（ａ）配列番号７（配列番号６）Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓオプシン１（錐体色素）、短波長感受性（ＯＰＮ１ＳＷ）、ｍＲＮＡ ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿００１７０８．２；
（ｂ）配列番号９（配列番号８）Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓオプシン１（錐体色素）、中波長感受性（ＯＰＮ１ＭＷ）、ｍＲＮＡ ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０００５１３．２；
（ｃ）配列番号１１（配列番号１０）Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓオプシン１（錐体色素）、長波長感受性（ＯＰＮ１ＬＷ）、ｍＲＮＡ ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０２００６１．４；
（ｄ）配列番号１３（配列番号１２）ＡＴＰ結合性カセット網膜遺伝子（ＡＢＣＲ）遺伝子（ＮＭ＿０００３５０）；
（ｅ）配列番号１５（配列番号１４）網膜色素上皮に特異的６５ｋＤタンパク質遺伝子（ＲＰＥ６５）（ＮＭ．＿０００３２９）；
（ｆ）配列番号１７（配列番号１６）網膜結合性タンパク質１遺伝子（ＲＬＢＰ１）（ＮＭ．＿０００３２６）；
（ｇ）配列番号１９（配列番号１８）ペリフェリン／網膜変性症遅延遺伝子（ＮＭ＿０００３２２）；
（ｈ）配列番号２１（配列番号２０）アレスチン（ＳＡＧ）（ＮＭ＿０００５４１）；
（ｉ）配列番号２３（配列番号２２）アルファ−トランスデューシン（ＧＮＡＴ１）（ＮＭ＿０００１７２）；
（ｊ）配列番号２４ グアニル酸シクラーゼ活性化因子１Ａ（ＧＵＣＡ１Ａ）（ＮＰ＿０００４００．２）；
（ｋ）配列番号２５ 網膜特異的グアニル酸シクラーゼ（ＧＵＣＹ２Ｄ）（ＮＰ＿０００１７１．１）；
（ｌ）配列番号２６＆２７ 錐体環状ヌクレオチドゲーティング陽イオンチャネルのアルファサブユニット（ＣＮＧＡ３）（ＮＰ＿００１０７３３４７．１またはＮＰ＿００１２８９．１）；
（ｍ）配列番号２８ ヒト錐体トランスデューシンアルファサブユニット（不完全１色覚（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｃｈｒｏｍｏｔｏｐｓｉａ））；
（ｎ）配列番号２９ 錐体ｃＧＭＰ特異的３’，５’−環状ホスホジエステラーゼサブユニットアルファ’、タンパク質（錐体ジストロフィー４型）；
（ｏ）配列番号３０ 網膜錐体ロドプシン感受性ｃＧＭＰ３’，５’−環状ホスホジエステラーゼサブユニットガンマ、タンパク質（網膜錐体ジストロフィー３Ａ型）；
（ｐ）配列番号３１ 錐体杆体ホメオボックス、タンパク質（錐体杆体ジストロフィー）；
（ｑ）配列番号３２ 錐体光受容体環状ヌクレオチドゲーティングチャネルベータサブユニット、タンパク質（１色覚）；
（ｒ）配列番号３３ 錐体光受容体ｃＧＭＰゲーティング陽イオンチャネルベータ−サブユニット、タンパク質（全色盲（ｔｏｔａｌ ｃｏｌｏｒ ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ）、例えば、Ｐｉｎｇｅｌａｐｅｓｅ Ｉｓｌａｎｄｅｒｓの間での）；
（ｓ）配列番号３５（配列番号３４）網膜色素変性症１（常染色体優性）（ＲＰ１）；
（ｔ）配列番号３７（配列番号３６）網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節因子相互作用タンパク質１（ＲＰＧＲＩＰ１）；
（ｕ）配列番号３９（配列番号３８）ＰＲＰ８；
（ｖ）配列番号４１（配列番号４０）中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）；
（ｗ）配列番号４３（配列番号４２）ＩＭＰ（イノシン５’−一リン酸）デヒドロゲナーゼ１（ＩＭＰＤＨ１）、転写物改変体１；
（ｘ）配列番号４５（配列番号４４）アリール炭化水素受容体相互作用タンパク質様１（ＡＩＰＬ１）、転写物改変体１；
（ｙ）配列番号４７（配列番号４６）レチノールデヒドロゲナーゼ１２（オールトランス／９−シス／１１−シス）（ＲＤＨ１２）；
（ｚ）配列番号４９（配列番号４８）レーバー先天黒内障５（ＬＣＡ５）、転写物バリアント１；および
（ａａ）例示的なＯＰＮ１ＬＷ／ＯＰＮ１ＭＷ２多形体（ＯＰＮ１ＬＷ（Ｌオプシン）ポリペプチド配列と比較；数字の左側のアミノ酸はＬオプシン配列に存在する残基であり、数字はＬオプシンにおける残基番号であり、数字の右側の残基はＬオプシンからの変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）である。これらの実施形態による多形体は、Ｔｈｒ６５Ｉｌｅ；Ｉｌｅ１１１Ｖａｌ；Ｓｅｒ１１６Ｔｙｒ；Ｌｅｕ１５３Ｍｅｔ；Ｉｌｅ１７１Ｖａｌ；Ａｌａ１７４Ｖａｌ；Ｉｌｅ１７８Ｖａｌ；Ｓｅｒ１８０Ａｌａ；Ｉｌｅ２３０Ｔｈｒ；Ａｌａ２３３Ｓｅｒ；Ｖａｌ２３６Ｍｅｔ；Ｉｌｅ２７４Ｖａｌ；Ｐｈｅ２７５Ｌｅｕ；Ｔｙｒ２７７Ｐｈｅ；Ｖａｌ２７９Ｐｈｅ；Ｔｈｒ２８５Ａｌａ；Ｐｒｏ２９８Ａｌａ；Ｔｙｒ３０９Ｐｈｅから選択されるアミノ酸置換のうちの１つまたは複数を含み得る；
（ａｂ）追加的なオプシン配列変異１（配列番号６１）；
（ａｃ）追加的なオプシン配列変異２（配列番号６２）；
（ａｄ）追加的なオプシン配列変異３（配列番号６３）；
（ａｅ）追加的なオプシン配列変異４（配列番号６４）；
（ａｆ）追加的なオプシン配列変異５（配列番号６５）；
（ａｇ）追加的なオプシン配列変異６（配列番号６５）；
（ａｈ）追加的なオプシン配列変異７（配列番号６６）；
（ａｉ）追加的なオプシン配列変異８（配列番号６７）；
（ａｊ）追加的なオプシン配列変異９（配列番号６８）；
（ａｋ）ｈＣＨＲ２（チャネルロドプシン）（配列番号６９）；
（ａｌ）ＮｐＨＲ（ハロロドプシン）（配列番号７０）；および
（ａｍ）ｅＧＦＰ（配列番号７１）。
一部の実施形態では、導入遺伝子によりコードされるコード配列は、上または本明細書に開示されている配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも８５％配列同一性、例えば、少なくとも９０％配列同一性、例えば、少なくとも９５％配列同一性、少なくとも９８％配列同一性、または少なくとも９９％配列同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、例えば、コード配列は、ＯＰＮ１ＬＷ、ＯＰＮＩＭＷ、またはＯＰＮ１ＳＷによりコードされるポリペプチドに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一性、少なくとも９８％配列同一性、または少なくとも９９％配列同一性を有する錐体オプシンをコードする。一部の実施形態では、コード配列は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７１に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
（ａ）〜（ｃ）および（ａａ〜ａｊ）に列挙されているタンパク質は全て色覚に関与する。例示的な多形体としては、それらを発現する錐体細胞における色素のスペクトルに影響を及ぼす６５位、１１６位、１８０位、２３０位、２３３位、２７７位、２８５位、および３０９位におけるものが挙げられる。２７４位、２７５位、２７７位、２７９位、２８５位、２９８位および３０９位は一緒になってＬオプシンとＭオプシンを区別する。
（ｄ）〜（ｚ）に列挙されているタンパク質は、網膜色素変性症（ポリペプチド「ｅ」〜「ｌ」、「ｓ」〜「ｙ」）、不完全１色覚（ポリペプチド「ｍ」）、スタルガルト（ポリペプチド「ｄ」）；レーバー先天黒内障（ポリペプチド「ｚ」）；錐体ジストロフィー４型などの錐体ジストロフィー（ポリペプチド「ｎ」）；網膜錐体ジストロフィー；例えば、網膜錐体ジストロフィー３Ａ型（ポリペプチド「ｏ」）；錐体杆体ジストロフィー（ポリペプチド「ｐ」）；１色覚（ポリペプチド「ｑ」）；および全色盲、例えば、Ｐｉｎｇｅｌａｐｅｓｅ Ｉｓｌａｎｄｅｒｓの間（ポリペプチド「ｒ」）におけるものなどの、例示的な眼疾患関連遺伝子である。
本発明の一実施形態では、発現を増強するために、導入遺伝子コード配列を、まれに表されるコドンをより頻繁に表されるコドンで置き換えることによって改変または「コドン最適化」する。コード配列は、翻訳のためのアミノ酸をコードするｍＲＮＡ配列の部分である。翻訳の間、６１種のトリヌクレオチドコドンのそれぞれが２０種のアミノ酸のうちの１つに翻訳され、それにより、遺伝暗号の縮重、または重複性が生じる。しかし、異なる細胞型、および異なる動物種は、同じアミノ酸をコードするｔＲＮＡ（それぞがアンチコドンを有する）を異なる頻度で利用する。遺伝子配列が、対応するｔＲＮＡでまれに表されるコドンを含有する場合、リボソーム翻訳機構は遅くなり、効率的な翻訳が妨げられる可能性がある。特定の種に関する「コドン最適化」によって発現を改善することができ、その場合、コード配列を、同じタンパク質配列をコードするが、高度に表され、かつ／または高度に発現されるヒトタンパク質に利用されるコドンを利用するように変更する（Ｃｉｄ−Ａｒｒｅｇｕｉら、２００３年；Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７７巻：４９２８頁）。本発明の一態様では、導入遺伝子のコード配列を、哺乳動物または霊長類においてまれに発現するコドンが霊長類において頻繁に発現するコドンで置き換えられるように改変する。例えば、一部の実施形態では、導入遺伝子によりコードされるコード配列は、上または本明細書に開示されている配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも８５％配列同一性、例えば、少なくとも９０％配列同一性、例えば、少なくとも９５％配列同一性、少なくとも９８％同一性、少なくとも９９％同一性を有するポリペプチドをコードし、コード配列の少なくとも１つのコドンのヒトにおけるｔＲＮＡ頻度は、上または本明細書に開示されている配列の対応するコドンよりも高い。
本発明の追加的な実施形態では、導入遺伝子コード配列を、所望の導入遺伝子をコードしないオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の終結または除去により、発現が増強されるように改変する。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドンの後に続く、終止コドンを含有しない核酸配列である。ＯＲＦは、順方向であっても逆方向であってもよく、また、目的の遺伝子と比較して「インフレーム」であっても「アウトオブフレーム」であってもよい。そのようなオープンリーディングフレームには、発現カセットにおいて目的の遺伝子と並んで発現する潜在性があり、また、望ましくない有害作用が導かれる可能性がある。本発明の一態様では、導入遺伝子のコード配列を、コドン使用をさらに変更することにより、オープンリーディングフレームが除去されるように改変する。これは、開始コドン（ＡＴＧ）を排除し、逆方向の終止コドン（ＴＡＧ、ＴＡＡ、またはＴＧＡ）またはアウトオブフレームＯＲＦを導入する一方で、目的の遺伝子におけるアミノ酸配列を保存し、高度に利用されるコドンを維持する（すなわち、頻度が２０％未満のコドンを回避する）ことによって行われた。本発明では、コドン最適化および非導入遺伝子ＯＲＦの除去のいずれによっても、または両方の技法を使用することによって導入遺伝子コード配列を最適化することができる。当業者には明らかになるように、コドン最適化の間に導入されたＯＲＦを除去するために、コドン最適化後に非導入遺伝子ＯＲＦを除去するまたは最小限にすることが好ましい。コドン最適化およびＯＲＦ除去の例が図３Ａ〜３Ｃに示されている。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドカセットは、ポリアデニル化領域をさらに含む。当技術分野で理解されている通り、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写物は、ポリＡシグナル、ポリＡ領域またはポリＡ尾部としても公知のポリアデニル化領域の切断および追加で終結する。ポリＡ領域は、多くの場合モチーフＡＡＵＡＡＡの反復を伴う多数の連続したアデノシン一リン酸を含有する。ＳＶ４０、ウシ成長ホルモン、ヒト成長ホルモンおよびウサギベータグロビンに由来するものを含めたいくつかの効率的なポリアデニル化部位が同定されている（Ｘｕら、２００１年；Ｇｅｎｅ ２７２巻：１４９頁；Ｘｕら、２００２年；Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ． ８１巻：１５５頁）。錐体細胞において導入遺伝子を発現させるための最も効率的なポリＡシグナルは、細胞型および目的の種および使用する特定のベクターに左右され得る。本発明の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号９０もしくは配列番号９１または前述の配列のいずれかのその機能性断片もしくは改変体からなる群より選択されるポリＡ領域を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。ある特定の実施形態では、ポリＡ領域は、配列番号９０またはその改変体を含む。一部のそのような実施形態では、ポリＡ領域は、配列番号９０またはその改変体から本質的になる。
当業者には理解される通り、上述のポリヌクレオチドエレメントのうちの２つまたはそれ超を組み合わせて、本開示のポリヌクレオチドカセットを創出することができる。したがって、例えば、主題のポリヌクレオチドカセットは、改善された５’ＵＴＲ配列、例えば、配列番号８４または配列番号８５と作動可能に組み合わせた配列番号８０と作動可能に連結した改善されたプロモーター配列を含むプロモーター領域を含んでよい；例えば、配列番号２、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９３、配列番号９４、または配列番号９５を参照されたい。別の例として、主題のポリヌクレオチドカセットは、改善されたプロモーター配列または領域、例えば、配列番号８０、配列番号２、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号９３と作動可能に組み合わせた配列番号５１または配列番号５２と作動可能に連結した改善されたエンハンサー配列または領域を含んでよい；例えば、配列番号９２または配列番号９５を参照されたい。別の例として、主題のポリヌクレオチドカセットは、改善されたイントロン配列、例えば、配列番号６０と作動可能に組み合わせた配列番号８４または配列番号８６と作動可能に連結した改善された５’ＵＴＲ配列を含んでよい；例えば、配列番号９４または配列番号９５を参照されたい。別の例として、主題のポリヌクレオチドカセットは、改善されたイントロン配列および改善されたコザック配列、例えば、配列番号６０とおよび配列番号７３と作動可能に組み合わせた配列番号８４または配列番号８６と作動可能に連結した改善された５’ＵＴＲ配列を含んでよい；例えば、配列番号９５を参照されたい。別の例として、主題のポリヌクレオチドカセットは、作動可能に連結した、改善されたエンハンサー、改善されたプロモーター、改善された５’ＵＴＲ、改善されたイントロン、改善されたコザックおよび改善されたポリＡ領域を含んでよい；例えば、配列番号９５を参照されたい。本明細書に開示されているまたは当技術分野で公知のエレメントの他の組合せは、当業者には容易に理解されよう。
さらに、当業者には理解される通り、ポリヌクレオチドカセットは、場合によって、これだけに限定されないが、クローニングを容易にするための制限部位および特定の遺伝子発現ベクターに対する調節エレメントを含めた他のエレメントを含有してよい。調節配列の例としては、ＡＡＶベクターに対するＩＴＲ、プラスミドベクターに対する細菌配列、ファージインテグラーゼベクターに対するａｔｔＰ部位またはａｔｔＢ部位、およびトランスポゾンに対する転移因子が挙げられる。
遺伝子療法ベクター
上で示唆した通り、本発明の一部の態様では、例えば、遺伝子が細胞の生存能力および／または機能に対して有する効果を決定するために、錐体細胞障害を治療するなどのために、主題のポリヌクレオチドカセットを使用して、遺伝子を動物の錐体細胞に送達する。したがって、本発明の一部の態様では、錐体細胞における導入遺伝子の発現をもたらす組成物は遺伝子送達ベクターであり、当該遺伝子送達ベクターは本開示のポリヌクレオチドカセットを含む。
錐体細胞へのポリヌクレオチド配列の送達への使用が見いだされる任意の都合のよい遺伝子療法ベクターは本開示の遺伝子送達ベクターに包含される。例えば、ベクターは、一本鎖核酸または二本鎖核酸、例えば、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡを含んでよい。例えば、遺伝子送達ベクターは、裸のＤＮＡ、例えば、プラスミド、ミニサークルなどであってよい。別の例として、遺伝子送達ベクターは、ウイルス、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））またはレンチウイルスであってよい。アデノ随伴ウイルスの使用を包含する実施形態が以下により詳細に記載されているが、当業者には同様の知見が理解されることおよび当業者は同様に非ＡＡＶ遺伝子療法ベクターにも導かれ得ることが予想される。例えば、全開示が参照により本明細書に組み込まれる、例えば、米国特許第７，５８５，６７６号および米国特許第８，９００，８５８号におけるレトロウイルスベクターに関する考察、ならびに例えば、米国特許第７，８５８，３６７号におけるアデノウイルスベクターに関する考察を参照されたい。
一部の実施形態では、遺伝子送達ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスである（ｒＡＡＶ）。そのような実施形態では、主題のポリヌクレオチドカセットは、５’末端および３’末端で機能性ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接している。「機能性ＡＡＶ ＩＴＲ配列」とは、ＩＴＲ配列が、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングに関して意図された通り機能することを意味する。したがって、本発明の遺伝子送達ベクターに使用するためのＡＡＶ ＩＴＲは必ずしも野生型ヌクレオチド配列を有さなくてよく、ヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換によって変更されたものであってよい、または、ＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０のいずれかに由来するものであってよい。好ましいＡＡＶベクターは、野生型ＲＥＰ遺伝子およびＣＡＰ遺伝子が全部または一部欠失しているが、機能性の隣接ＩＴＲ配列を保持する。
そのような実施形態では、主題のポリヌクレオチドカセットは、これだけに限定することなく、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０などを含めた任意のアデノ随伴ウイルス血清型に由来するものであってよいＡＡＶカプシド内に包まれている。例えば、ＡＡＶカプシドは、野生型、またはネイティブなカプシドであってよい。特に興味深い野生型ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ９を含む。しかし、ＩＴＲと同様に、カプシドは、必ずしも野生型ヌクレオチド配列を有さなくてよく、むしろ、カプシドが錐体細胞を形質導入することができるものである限りは、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列またはＶＰ３配列内のヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されたものであってよい。言い換えると、ＡＡＶカプシドは、改変体ＡＡＶカプシドであってよい。特に興味深い改変体ＡＡＶカプシドとしては、全開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願ＵＳ２０１４／０２９４７７１に開示されている、ＡＡＶ２の残基５８０〜６００または別のＡＡＶの対応する残基、例えば、ＬＧＥＴＴＲＰ、ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦ、またはＳＴＧＫＶＰＮ内にペプチド挿入を含むものが挙げられる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、１つのＡＡＶのカプシド（ｃａｐ）遺伝子と異なるＡＡＶ由来のｒｅｐ遺伝子およびＩＴＲとを使用することによって創出される、「シュードタイピング」されたＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２由来のｒｅｐとＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９由来のｃａｐとを、ＡＡＶ２に基づくベクターを含有するプラスミドと共に使用することによって創出される、シュードタイピングされたＡＡＶ２である。例えば、ＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ２／１、ｒＡＡＶ２／３、ｒＡＡＶ２／４、ｒＡＡＶ２／５、ｒＡＡＶ２／６、ｒＡＡＶ２／７、ｒＡＡＶ２／８、ｒＡＡＶ２／９などであってよい。ｒＡＡＶは、ＡＡＶベクターがそのゲノムを独立してさらに複製しパッケージングすることができないという点で複製欠損であることが好ましい。例えば、錐体細胞にｒＡＡＶビリオンを用いて形質導入すると、形質導入された錐体細胞において遺伝子が発現されるが、形質導入された錐体細胞はＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびにアクセサリー機能遺伝子を欠くという事実に起因して、ｒＡＡＶは複製することができない。
本開示のポリヌクレオチドカセットを封入する遺伝子療法ベクター、例えば、ｒＡＡＶビリオンは、標準の方法体系を使用して作製することができる。例えば、ｒＡＡＶビリオンの場合では、本発明によるＡＡＶ発現ベクターを産生細胞に導入し、その後、ＡＡＶヘルパー構築物を導入することができ、ヘルパー構築物は、産生細胞において発現させることができるＡＡＶコード領域を含むものであり、ＡＡＶベクターの不在下でＡＡＶヘルパー機能を補完する。この後、ヘルパーウイルスおよび／または追加的なベクターを産生細胞に導入し、ここで、ヘルパーウイルスおよび／または追加的なベクターにより、効率的なｒＡＡＶウイルス産生を支持することが可能なアクセサリー機能がもたらされる。次いで、産生細胞を培養してｒＡＡＶを産生させる。これらのステップは、標準の方法体系を使用して行う。本発明の組換えＡＡＶベクターを封入する複製欠損ＡＡＶビリオンは、ＡＡＶパッケージング細胞およびパッケージング技術を使用する当技術分野で公知の標準の技法によって作出される。これらの方法の例は、例えば、それらの全体が参照により本明細書に明白に組み込まれる、米国特許第５，４３６，１４６号；同第５，７５３，５００号、同第６，０４０，１８３号、同第６，０９３，５７０号および同第６，５４８，２８６号に見いだすことができる。パッケージングするためのさらなる組成物および方法は、同様にその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷａｎｇら（ＵＳ２００２／０１６８３４２）に記載されている。
これだけに限定されないが、以下の実施例に記載されているものを含めた、主題のポリヌクレオチドカセットを送達するためのウイルス粒子を産生させるための任意の適切な方法を使用することができる。錐体細胞を有効に形質導入するために適した任意の濃度のウイルス粒子を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて錐体細胞と接触させるために調製することができる。例えば、ウイルス粒子を、１ｍｌ当たりベクターゲノム１０８個またはそれ超、例えば、１ｍＬ当たりベクターゲノム５×１０８個；１ｍＬ当たりベクターゲノム１０９個；１ｍＬ当たりベクターゲノム５×１０９個、１ｍＬ当たりベクターゲノム１０１０個、１ｍＬ当たりベクターゲノム５×１０１０個；１ｍＬ当たりベクターゲノム１０１１個；１ｍＬ当たりベクターゲノム５×１０１１個；１ｍＬ当たりベクターゲノム１０１２個；１ｍＬ当たりベクターゲノム５×１０１２個；１ｍＬ当たりベクターゲノム１０１３個；１ｍＬ当たりベクターゲノム１．５×１０１３個；１ｍＬ当たりベクターゲノム３×１０１３個；１ｍＬ当たりベクターゲノム５×１０１３個；１ｍＬ当たりベクターゲノム７．５×１０１３個；１ｍＬ当たりベクターゲノム９×１０１３個；１ｍＬ当たりベクターゲノム１×１０１４個、１ｍＬ当たりベクターゲノム５×１０１４個またはそれ超であるが、典型的には、１ｍＬ当たりベクターゲノム１×１０１５個以下の濃度で製剤化することができる。同様に、所望の効果を付与するまたは疾患を治療するための網膜錐体細胞の適切な形質導入をもたらすために適した任意の総数のウイルス粒子を哺乳動物または霊長類の眼に投与することができる。種々の好ましい実施形態では、眼当たり少なくとも１０８個；５×１０８個；１０９個；５×１０９個、１０１０個、５×１０１０個；１０１１個；５×１０１１個；１０１２個；５×１０１２個；１０１３個；１．５×１０１３個；３×１０１３個；５×１０１３個；７．５×１０１３個；９×１０１３個、１×１０１４個のウイルス粒子、または５×１０１４個もしくはそれ超のウイルス粒子であるが、典型的には、１×１０１５個以下のウイルス粒子を注射する。哺乳動物または霊長類の眼へのベクターの投与は任意の適切な回数で行うことができる。一実施形態では、方法は、単回投与を含み、他の実施形態では、担当臨床医が適切であると考える期間にわたって多数回投与を行う。
主題のウイルスベクターは、これだけに限定することなく、ベクターゲノム１×１０８個またはそれ超、例えば、ベクターゲノム１×１０９個、１×１０１０個、１×１０１１個、１×１０１２個または１×１０１３個もしくはそれ超、特定の例では、ベクターゲノム１×１０１４個であるが、通常は４×１０１５個以下ベクターゲノムを含めた任意の適切な単位投薬量に製剤化することができる。いくつかの場合には、単位投薬量は、最大でベクターゲノム約５×１０１５個、例えば、ベクターゲノム１×１０１４個またはそれ未満、例えば、１×１０１３個、１×１０１２個、１×１０１１個、１×１０１０個、または１×１０９個のベクターゲノムもしくはそれ未満、特定の例では、ベクターゲノム１×１０８個またはそれ未満、および典型的には、ベクターゲノム１×１０８個以上である。いくつかの場合には、単位投薬量は、ベクターゲノム１×１０１０〜１×１０１１個である。いくつかの場合には、単位投薬量は、ベクターゲノム１×１０１０〜３×１０１２個である。いくつかの場合には、単位投薬量は、ベクターゲノム１×１０９〜３×１０１３個である。いくつかの場合には、単位投薬量は、ベクターゲノム１×１０８〜３×１０１４個である。
いくつかの場合には、医薬組成物の単位投薬量は、感染多重度（ＭＯＩ）を使用して測定することができる。ＭＯＩとは、細胞に核酸を送達することができるベクターまたはウイルスのゲノムの比または倍率を意味する。いくつかの場合には、ＭＯＩは１×１０６であり得る。いくつかの場合には、ＭＯＩは１×１０５〜１×１０７であり得る。いくつかの場合には、ＭＯＩは１×１０４〜１×１０８であり得る。いくつかの場合には、本開示の組換えウイルスのＭＯＩは、少なくとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８である。いくつかの場合には、本開示の組換えウイルスのＭＯＩは１×１０８〜３×１０１４である。いくつかの場合には、本開示の組換えウイルスのＭＯＩは、最大で約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８である。
一部の態様では、医薬組成物の量は、組換えウイルス約１×１０８〜約１×１０１５個、組換えウイルス約１×１０９〜約１×１０１４個、組換えウイルス約１×１０１０〜約１×１０１３個、または組換えウイルス約１×１０１１〜約３×１０１２個を含む。
主題のｒＡＡＶ組成物の調製において、例えば、哺乳動物細胞（例えば、２９３細胞）、昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）、微生物および酵母を含めた、ｒＡＡＶビリオンを産生させるための任意の宿主細胞を用いることができる。宿主細胞はまた、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が宿主細胞において安定に維持されるパッケージング細胞であってもよく、またはＡＡＶベクターゲノムが安定に維持されパッケージングされる産生細胞であってもよい。例示的なパッケージング細胞および産生細胞は、ＳＦ−９細胞、２９３細胞、Ａ５４９細胞またはＨｅＬａ細胞に由来するものである。ＡＡＶベクターは、当技術分野で公知の標準の技法を使用して精製し、製剤化する。
錐体細胞をｉｎ ｖｉｖｏにおいて接触させる場合、主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターを、眼に送達するために必要に応じて処理することができる。具体的には、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドカセットまたは遺伝子送達ベクターと、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物を含む。主題のポリヌクレオチドカセットまたは遺伝子送達ベクターは、一般に安全、無毒性、かつ望ましいものであり、霊長類への使用が許容される賦形剤を含む製剤の調製において有用な薬学的に許容される担体、希釈剤および試薬と組み合わせることができる。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、または、エアロゾル組成物の場合では気体であってよい。そのような担体または希釈剤の例としては、これだけに限定されないが、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。補足的な活性化合物も製剤に組み入れることができる。製剤に使用される溶液または懸濁物としては、注射用水、食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌化合物；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化化合物；アセテート、シトレートまたはホスフェートなどの緩衝液；凝集を防止するためのＴｗｅｅｎ２０などの洗剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調整するための化合物を挙げることができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。
本発明における内用に適した医薬組成物は、滅菌水溶液、または滅菌された注射用溶液または分散物を即時調製するための分散物と滅菌粉末をさらに含む。静脈内投与に関しては、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いくつかの場合には、組成物は滅菌されたものであり、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する限りでは、流体であるべきである。ある特定の実施形態では、組成物は製造および保管の条件下で安定であり、また、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護される。担体は、例えば、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、および適切なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散の場合では必要な粒子サイズを維持することによっておよび界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｇｅｎｔ）、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。内部の組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
滅菌溶液は、必要量の活性化合物を適切な溶媒に、上に列挙されている成分の１つ、または成分の組合せと共に組み入れ、必要に応じて、その後に濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散物は、活性化合物を、基本的な分散媒および上に列挙されているものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌された注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、調製方法は、活性成分と任意の追加的な所望の成分の粉末を予め滅菌濾過したその溶液から得る、真空乾燥および凍結乾燥である。
一実施形態では、活性化合物を、化合物を体からの迅速な排除から保護する担体、例えば、埋め込み物およびマイクロカプセル封入送達系を含めた制御放出製剤などと共に調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための方法は当業者には明らかになるであろう。材料は、商業的に得ることもできる。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞にターゲティングされるリポソームを含む）を薬学的に許容される担体として使用することもできる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の通り、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
経口組成物または非経口組成物を投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、単位剤形（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ ｆｏｒｍ）に製剤化することが特に有利である。単位剤形とは、本明細書で使用される場合、治療される被験体に対する単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位が、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果がもたらされるように算出された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物の独特の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびにそのような活性化合物を個人の治療のために配合する技術分野における固有の限定によって規定され、それに直接左右される。
医薬組成物は、容器、パック、またはディスペンサー、例えば、シリンジ、例えば、充填済みシリンジに、投与の説明書と共に含めることができる。
本発明の医薬組成物は、任意の薬学的に許容される塩、エステル、もしくはそのようなエステルの塩、または、ヒトを含めた動物に投与されると、生物活性のある代謝産物またはその残渣を（直接または間接的に）もたらすことが可能な任意の他の化合物を含む。したがって、例えば、本開示は、本発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容される塩、そのようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、ならびに他の生物学的同等物にも関する。
「プロドラッグ」という用語は、不活性型で調製され、体内またはその細胞内で内在性酵素もしくは他の化学物質の作用および／または条件によって活性型（すなわち、薬物）に変換される治療剤を示す。
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生理的にかつ薬学的に許容される塩、すなわち、親化合物の所望の生物活性を保持し、それに望ましくない毒物学的な影響を与えない塩を指す。種々の薬学的に許容される塩は、当技術分野で公知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１７版、Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡ、１９８５年（およびその最新版）、「Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、第３版、Ｊａｍｅｓ Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ（編）、Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＳＡ（Ｉｎｃ．）、ＮＹ、ＵＳＡ、２００７年、およびＪ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ６６巻：２頁（１９７７年）に記載されている。また、適切な塩に関する概説については、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ： Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｕｓｅ、ＳｔａｈｌおよびＷｅｒｍｕｔｈ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２年）を参照されたい。
薬学的に許容される塩基付加塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミンなどの金属またはアミンと形成される。陽イオンとして使用される金属は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどを含む。アミンは、Ｎ−Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、およびプロカインを含む（例えば、Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」、Ｊ． Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｉ．、１９７７年、６６巻、１１９頁を参照されたい）。前記酸性化合物の塩基付加塩は、従来の様式で遊離酸の形態を十分な量の所望の塩基と接触させて塩を生じさせることによって調製される。遊離酸の形態は、従来の様式で塩の形態を酸と接触させ、遊離酸を単離することによって再生させることができる。遊離酸の形態は、それらのそれぞれの塩の形態とは、極性溶媒中の溶解度などのある特定の物理特性がいくらか異なるが、他の点では、塩は、本発明の目的上、それらのそれぞれの遊離酸と同等である。
主題のポリヌクレオチドカセットまたは遺伝子送達ベクター、例えば組換えウイルス（ビリオン）は、哺乳動物患者、特に霊長類、より具体的にはヒトに投与するための医薬組成物に組み入れることができる。主題のポリヌクレオチドカセットまたは遺伝子送達ベクター、例えば、ビリオンは、非毒性であり、不活性であり、薬学的に許容される水性担体中に、好ましくは３から８までにわたるｐＨ、より好ましくは６から８までにわたるｐＨで、製剤化することができる。そのような滅菌組成物は、再構成の際に許容されるｐＨを有する水性緩衝液に溶解させた治療用分子をコードする核酸を含有するベクターまたはビリオンを含む。
一部の実施形態では、本明細書において提供される医薬組成物は、治療有効量のベクターまたはビリオンを、薬学的に許容される担体および／または賦形剤、例えば、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ホスフェートおよびアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝液、防腐剤および他のタンパク質との混合物で含む。例示的なアミノ酸、ポリマーおよび糖などは、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアレート化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スクロース、フルクトース、デキストロース、マルトース、グルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトース、トレハロース、ウシまたはヒト血清アルブミン、シトレート、アセテート、リンゲル液、ハンクス液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リシン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンおよびグリコールである。この製剤は、４℃で少なくとも６カ月にわたって安定であることが好ましい。
一部の実施形態では、本明細書において提供される医薬組成物は、緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水、およびＧｏｏｄら（１９６６年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５巻：４６７頁に記載されているものなどの当業者に公知の他の緩衝液などを含む。医薬組成物がアデノウイルスベクター送達系に含有された腫瘍抑制因子遺伝子を含む緩衝液のｐＨは、６．５〜７．７５、好ましくは７〜７．５、および最も好ましくは７．２〜７．４の範囲内であってよい。
方法
上で示唆した通り、本明細書では集合的に「主題の組成物」と称される主題のポリヌクレオチドカセットおよび遺伝子送達ベクターを、動物の錐体細胞における導入遺伝子の発現において用途が見いだされている。例えば、主題の組成物は、例えば、錐体細胞の生存能力および／または機能に対する遺伝子の効果を決定するための研究において使用することができる。別の例として、主題の組成物は、例えば、錐体細胞障害を治療するための医薬に使用することができる。したがって、本発明の一部の態様では、錐体細胞において遺伝子を発現させるための方法であって、錐体細胞を本開示の組成物と接触させるステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、接触させるステップをｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、接触させるステップをｉｎ ｖｉｖｏで行う、すなわち、主題の組成物を被験体に投与する。
錐体細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターと接触させる場合、細胞は、任意の哺乳動物種、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、スナネズミ、リス）、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、霊長類、ヒトに由来するものであってよい。細胞は、樹立細胞株、例えば、ＷＥＲＩ細胞、６６１Ｗ細胞に由来するものであってもよく、初代細胞であってもよく、「初代細胞」、「初代細胞株」、および「初代培養物」は、本明細書では互換的に使用され、被験体から引き出され、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて限られた数の培養物の継代、すなわち分割にわたって成長させた細胞および細胞培養物を指す。例えば、初代培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回、しかし転換期（ｃｒｉｓｉｓ ｓｔａｇｅ）を経るには不十分な回数にわたって継代された培養物である。典型的には、本発明の初代細胞株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて１０回の継代未満にわたって維持されるものである。
細胞が初代細胞である場合、任意の都合のよい方法、例えば、全外植（ｗｈｏｌｅ ｅｘｐｌａｎｔ）、生検などによって哺乳動物から採取することができる。採取された細胞を分散または懸濁させるために、適切な溶液を使用することができる。そのような溶液は、一般に、低濃度、一般に、５〜２５ｍＭの許容される緩衝液と併せた、ウシ胎仔血清または他の天然に存在する因子を都合よく補充した、平衡塩類溶液、例えば、ノーマルセーライン、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩類溶液などになる。都合のよい緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などが挙げられる。細胞はすぐに使用することもでき、長期間にわたって保管、凍結することができ、解凍し、再使用することができる。そのような場合では、細胞を、通常、１０％ＤＭＳＯ、５０％血清、４０％緩衝培地、または当技術分野で一般に使用されるものと同様のいくつかの他のそのような溶液中に凍結して細胞をそのような凍結温度で保存し、凍結させた培養細胞を解凍するための当技術分野で公知の様式で解凍する。
導入遺伝子の発現を促進するために、主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターを細胞と約３０分〜２４時間またはそれ超、例えば、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、２４時間などにわたって接触させる。主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターは、主題の細胞に、１回または複数回、例えば、１回、２回、３回、または４回以上もたらすことができ、各接触事象の後いくらかの時間、例えば１６〜２４時間にわたって細胞が薬剤と一緒にインキュベートされ、その後、培地を新鮮な培地と交換し、細胞をさらに培養する。細胞を接触させることは、細胞の生存が促進される任意の培養培地で、かつ任意の培養条件下で行うことができる。例えば、細胞を、ウシ胎仔血清または熱失活ヤギ血清（約５〜１０％）、Ｌ−グルタミン、チオール、特に２−メルカプトエタノール、および抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したイスコフ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ １６４０などの都合のよい任意の適切な栄養培地中に懸濁させることができる。培養物は、細胞が応答する増殖因子を含有してよい。本明細書で定義されている増殖因子は、培養物中またはインタクトな組織内のいずれかで、膜貫通受容体に対する特異的な効果を通じて細胞の生存、成長および／または分化を促進することが可能な分子である。増殖因子はポリペプチドおよび非ポリペプチド因子を含む。
典型的には、細胞における導入遺伝子の発現を生じさせるために、有効量の主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターが提供される。本明細書の他の箇所で考察されている通り、有効量は、例えば、導入遺伝子遺伝子産物の存在またはレベルを検出することによって、錐体細胞の生存能力または機能に対する効果を検出することなどによって、経験的に容易に決定することができる。典型的には、効果量の主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターにより、同じ量の、当技術分野で公知のポリヌクレオチドカセット、例えば、ｐＲ２．１（配列番号５０のヌクレオチド１〜２２７４）、ｐＲ１．７、ｐＲ１．５、ｐＲ１．１、またはＩＲＢＰ／ＧＮＡＴ２カセットよりも大きな、錐体細胞における導入遺伝子の発現が促進される。典型的には、発現は、例えば、当技術分野で公知の参照または対照ポリヌクレオチドカセットからの発現よりも２倍またはそれ超、例えば、３倍、４倍、または５倍もしくはそれ超、いくつかの場合には１０倍、２０倍または５０倍またはそれ超、例えば、１００倍増強される。
導入遺伝子が選択マーカーである一部の実施形態では、細胞の集団を、改変された細胞を残りの集団から分離することにより、主題のポリヌクレオチドカセットを含むものについて濃縮することができる。分離は、使用される選択マーカーに適した任意の都合のよい分離技法によって行うことができる。例えば、導入遺伝子が蛍光マーカーである場合には、蛍光活性化細胞選別によって細胞を分離することができ、導入遺伝子が細胞表面マーカーである場合には、アフィニティー分離技法、例えば、磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、固体マトリックスに付着させた親和性試薬を用いた「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」、または他の都合のよい技法によって細胞を不均質な集団から分離することができる。正確な分離をもたらす技法としては、例えば多色チャネル、小角および鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなどの様々な程度の精巧さを有し得る蛍光細胞分析分離装置が挙げられる。死細胞に関連する色素（例えば、ヨウ化プロピジウム）を用いることにより、死細胞に対して細胞を選択することができる。細胞の生存能力に対して過度に有害ではない任意の技法を用いることができる。主題のポリヌクレオチドを含む細胞について高度に濃縮された細胞組成物はこのように達成される。「高度に濃縮された」とは、遺伝子改変された細胞が、細胞組成物の７０％もしくはそれ超、７５％もしくはそれ超、８０％もしくはそれ超、８５％もしくはそれ超、９０％もしくはそれ超、例えば、細胞組成物の約９５％もしくはそれ超、または９８％もしくはそれ超になることを意味する。言い換えれば、組成物は、遺伝子改変された細胞の実質的に純粋な組成物であってよい。
錐体細胞をｉｎ ｖｉｖｏにおいて主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターと接触させる場合、被験体は、任意の哺乳動物、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、スナネズミ）、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、または霊長類であってよい。ある特定の実施形態では、被験体は、狭鼻小目（Ｐａｒｖｏｒｄｅｒ Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）の霊長類である。当技術分野で公知の通り、Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉは、高等霊長類の２つの下位区分の一方であり（もう一方は新世界ザル）、旧世界ザルおよび類人猿を含み、それらが今度はさらに小型類人猿またはテナガザルと、オランウータン、ゴリラ、チンパンジー、ボノボ、およびヒトからなる大型類人猿とに分けられる。さらに好ましい実施形態では、霊長類は、ヒトである。
主題の組成物は、任意の適切な方法によって被験体の網膜に投与することができる。例えば、主題の組成物は、硝子体内注射または網膜下注射によって眼内に投与することができる。硝子体内注射によってまたは網膜下注射によってベクターを送達するための一般的な方法は、以下の簡単な概略によって例示することができる。これらの実施例は、ただ単に方法のある特定の特徴を例示するものであり、決して限定するものではない。
網膜下投与については、ベクターを、手術用顕微鏡を使用した直接観察下で網膜下に注射される懸濁物の形態で送達することができる。典型的には、１〜２００μＬ、例えば、５０μＬ、１００μＬ、１５０μＬ、または２００μＬであるが、通常は２００μＬ以下の体積の主題の組成物をそのような方法によって投与する。この手順は、硝子体切除、その後の、ベクター懸濁物を細いカニューレを使用して１つまたは複数の小さな網膜切開部を通して網膜下腔に注射することを伴い得る。簡単に述べると、手術全体を通して、注入カニューレを定位置で縫合して、（例えば、食塩水の）注入によって正常な眼球体積を維持することができる。硝子体切除術は、適切なボアサイズ（例えば、２０〜２７ゲージ）のカニューレを使用して実施し、取り出した硝子体ゲルの体積を、注入カニューレからの食塩水または他の等張性溶液の注入によって置き換える。硝子体切除は、（１）その皮質（後部硝子体膜）の除去により、カニューレの網膜への侵入が容易になること；（２）その除去および流体（例えば、食塩水）での置き換えにより、ベクターの眼内注射を適応させるための空間が創出されること、および（３）その制御された除去により、網膜裂孔および予定外の網膜剥離の可能性が低下することから、有利に実施される。
硝子体内投与については、ベクターを懸濁物の形態で送達することができる。最初に、眼の表面に局所麻酔薬を適用し、その後、局所消毒溶液を適用する。器械使用を伴ってまたは伴わずに眼を開いたまま保持し、直接観察下で、短い、細い、例えば、３０ゲージの針を用いて強膜を通して被験体の眼の硝子体腔内にベクターを注射する。典型的には、１〜１００μＬ、例えば、２５μＬ、５０μＬ、または１００μＬ、通常は１００μＬ以下の体積の主題の組成物を、硝子体を除去せずに硝子体内注射によって眼に送達することができる。あるいは、硝子体切除を実施することができ、硝子体ゲルの全体積を主題の組成物の注入によって置き換える。そのような場合では、約４ｍＬまでの主題の組成物を、例えば、ヒト眼に送達することができる。硝子体内投与は、一般に、耐容性がよい。手順の終わりに、時には注射部位に軽度の発赤が生じる。時々圧痛が生じるが、大多数の患者ではいかなる疼痛も報告されていない。この手順後には眼帯も眼球保護帯も必要なく、また、活動は制限されない。時には、感染の防止を補助するために抗生物質点眼剤が数日間処方される。
本開示の方法および組成物は、少なくとも一部において、錐体光受容体細胞の遺伝子療法によって対処することが可能な任意の状態の治療において使用される。したがって、本開示の組成物および方法は、錐体細胞療法を必要とする個体の治療において使用される。錐体細胞療法を必要とする人とは、錐体細胞障害を有するまたはそれが発生するリスクがある個体を意味する。「錐体細胞障害」とは、これだけに限定されないが、錐体細胞内の欠陥に関連する眼の視覚障害、すなわち、錐体に固有の欠陥、例えば、スタルガルト黄斑ジストロフィー、錐体ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、脊髄小脳失調症７型、およびバルデー・ビードル症候群−１などの黄斑ジストロフィー；ならびに１色覚、不完全１色覚、青錐体１色覚、および１型色覚、２型色覚、および３型色覚を含めた色覚障害；ならびに錐体細胞を標的とすることによって治療することができる中心黄斑の視覚障害（霊長類）、例えば、加齢黄斑変性症、黄斑部毛細血管拡張症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、緑内障、ソースビー眼底変性症、成人卵黄様黄斑ジストロフィー、ベスト病、杆体−錐体ジストロフィー、レーバー先天性黒内障、およびＸ連鎖性網膜分離症を含めた、網膜錐体細胞に影響を及ぼすあらゆる障害を意味する。
スタルガルト黄斑ジストロフィー。スタルガルト黄斑ジストロフィーは、スタルガルト病および黄色斑眼底としても公知であり、通常は法的盲まで進行する視力喪失を引き起こす、若年性黄斑変性症の遺伝性の形態である。症状の発症は、通常、６歳から３０歳の間だと思われる（平均約１６歳〜１８歳）。ＡＢＣＡ４、ＣＮＧＢ３、ＥＬＯＶＬ４、ＰＲＯＭ１を含めたいくつかの遺伝子の変異がこの障害に関連する。症状は、典型的には２０歳までに発生し、それらとして、不安定な視覚、盲点、かすみ目（ｂｌｕｒｒｉｎｅｓｓ）、色覚が損なわれること、および薄暗い照明への適応困難が挙げられる。スタルガルト病の主要な症状は、２０／５０から２０／２００までにわたる視力の喪失である。さらに、スタルガルト病を有する者は、グレアに対して感受性であり、曇った日にはいくらかの軽減がもたらされる。黄斑が損傷を受けると視覚が最も顕著に損なわれ、これは眼底検査によって観察することができる。
錐体ジストロフィー。錐体ジストロフィー（ＣＯＤ）は、錐体細胞の喪失を特徴とする遺伝性の眼の障害である。錐体ジストロフィーの最も一般的な症状は、視力喪失（発症年齢は１０代後半から６０代までにわたる）、明るい光に対する感受性、および不十分な色覚である。視力は、通常は徐々に悪化するが、２０／２００まで急速に悪化する可能性があり、後に、より重症の場合には、「指数弁」視覚にまで急降下する。色検査表（ＨＲＲシリーズ）を使用した色覚検査では、赤色−緑色表と青色−黄色表の両方に関して多くの誤りが明らかとなる。ジストロフィーは、錐体機能の主観的なおよび客観的な異常が検眼鏡検査での変化の前に見られ得るので、一次的なものであると考えられている。しかし、網膜色素上皮（ＲＰＥ）が急速に関与し始め、主に黄斑が関与する網膜ジストロフィーが生じる。検眼鏡による眼底検査では、錐体ジストロフィーの早期には基本的に正常であり、明確な黄斑の変化は、通常、視力喪失後によく起こる。検眼鏡検査の間に見られる黄斑病変の最も一般的な型は標的状の外観を有し、中心の暗い領域の周囲の萎縮性色素上皮のドーナツ様帯域からなる。別の、より頻度の低い錐体ジストロフィーの形態では、そうではなく、後極の萎縮が拡散し、斑状色素が黄斑の領域に凝集する。まれに、脈絡毛細管板およびより大きな脈絡膜血管の萎縮が患者において早い段階で見られる。微細すぎて検眼鏡では見ることができない網膜中の早期の変化を検出することができるので、蛍光眼底血管造影（ＦＡ）は、錐体ジストロフィーを有することが疑われる人の精密検査において有用な補助法である。眼底の変化が広範であり、早い段階での診断が難しいために、網膜電図（ＥＲＧ）が未だに診断をなすための最良の検査である。ＥＲＧにおける異常な錐体機能は、検査を明るい部屋で行った場合に（明所視ＥＲＧ）シングルフラッシュおよびフリッカー応答（ｓｉｎｇｌｅ−ｆｌａｓｈ ａｎｄ ｆｌｉｃｋｅｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の低下によって示される。ＧＵＣＡ１Ａ、ＰＤＥ６Ｃ、ＰＤＥ６Ｈ、およびＲＰＧＲを含めたいくつかの遺伝子の変異がこの障害に関連付けられる。
錐体杆体ジストロフィー。錐体杆体ジストロフィー（ＣＲＤ、またはＣＯＲＤ）は、色素性網膜症の群に属する遺伝性の網膜ジストロフィーである。ＣＲＤは、黄斑の領域に主に局在する、眼底検査において目に見える網膜色素沈着、および錐体細胞と杆体細胞の両方の減少を特徴とする。一次的な杆体光受容体の減少、およびその後に続く二次的な錐体光受容体の減少によって生じる杆体錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）とは対照的に、ＣＲＤは、逆の順序の事象を反映する：最初に錐体が関与する、または、時には、錐体と杆体の両方が同時に失われる。症状としては、視力の低下、色覚異常、光嫌悪（ｐｈｏｔｏａｖｅｒｓｉｏｎ）および中心視野の感受性の低下、その後に続く進行性の周辺視覚の喪失、および夜盲症が挙げられる。ＡＤＡＭ９、ＰＣＤＨ２１、ＣＲＸ、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＰＩＴＰＮＭ３、ＰＲＯＭ１、ＰＲＰＨ２、ＲＡＸ２、ＲＩＭＳ１、ＲＰＧＲ、およびＲＰＧＲＩＰ１を含めたいくつかの遺伝子における変異がこの障害に関連付けられる。
脊髄小脳失調症７型。脊髄小脳失調症は、ゆっくりと進行する歩行の協調不能を特徴とし、多くの場合、手、発話、および眼球運動の協調不良が付随する進行性変性遺伝性疾患である。ＳＣＡには多数の型が存在し、脊髄小脳失調症７型（ＳＣＡ−７）は、他の大多数のＳＣＡとは、協調不良に加えて視覚的な問題が起こり得るという点で異なる。ＳＣＡ−７は、ＡＴＸＮ７／ＳＣＡ７遺伝子における常染色体優性変異に関連付けられる。疾患が４０歳より前に症状発現した場合、典型的には、協調不良ではなく視覚的な問題が疾患の最も早い徴候である。初期の症状としては、色の区別が困難であることおよび中心視覚の低下が挙げられる。さらに、運動失調の症状（協調不能、眼球運動が遅いこと、および感覚または反射の軽度の変化）が検出可能であり得る。疾患が進行するにつれて運動制御の喪失、不明な発話、および嚥下困難が顕著になる。
バルデー・ビードル症候群−１。バルデー・ビードル症候群−１（ＢＢＳ−１）は、家族内および家族間で観察される様々な表現度および広範囲の臨床的変動性が伴う多面的な障害である。主要な臨床的特徴は、夜盲症が先行する小児発症視力喪失を伴う杆体錐体ジストロフィー；軸後多指症；乳児期の間に症状発現し、成人期全体を通して問題があるままである体幹肥満；全てではないが一部の個体における特定の学習困難；男性性器発育不全症および複合女性尿生殖器奇形；ならびに罹患率および死亡率の主要な原因である腎機能障害である。視力喪失がバルデー・ビードル症候群の主要な特徴の１つである。夜間の視覚に関する問題が小児期の半ばまでに明白になり、その後、周辺視覚に盲点が発生する。時間をわたって、これらの盲点は拡大し、併合して管状視野が生じる。バルデー・ビードル症候群を有する大多数の人では、中心視覚のかすみ（不十分な視力）も発生し、青年期または成人期の初めまでに法的盲になる。バルデー・ビードル症候群は、線毛機能において決定的な役割を果たすことが公知であるまたは疑わしい少なくとも１４種の異なる遺伝子（多くの場合、ＢＢＳ遺伝子と称される）における変異によって生じ得、ＢＢＳ１およびＢＢＳ１０における変異が最も一般的である。
１色覚。１色覚、または杆体１色覚は、被験体の色の知覚が完全に欠如し、したがって、被験体には黒色、白色、および灰色の色合いのみしか見えないという障害である。他の症状としては、視力の低下、羞明、眼振、小さな中心暗点、および偏心固視が挙げられる。この障害は、最初に生後約６カ月の小児において、それらの羞明活性および／またはそれらの眼振によって認められる頻度が高い。視力および眼の動きの安定性は、一般に、生後６〜７年の間に改善される（しかし２０／２００近くのままである）。ＣＮＧＢ３、ＣＮＧＡ３、ＧＮＡＴ２、ＰＤＥ６Ｃ、およびＰＤＥ６ＨＩにおける変異がこの障害に関連付けられている。
不完全１色覚。不完全１色覚は、１色覚と同様であるが、浸透度が低い。不完全１色覚では、症状は、減弱した形態であること以外は完全な１色覚の症状と同様である。不完全１色覚を有する個体では視力が低下し、眼振または羞明が伴うまたは伴わない。さらに、これらの個体では、錐体細胞機能の部分的な機能障害のみが示されるが、再度杆体細胞機能は保持される。
青錐体１色覚。青錐体（Ｓ錐体）１色覚（ＢＣＭ）は、稀なＸ連鎖先天性定常錐体機能障害症候群であり、およそ１００，０００個体に１個体が罹患している。ＢＣＭに罹患している男性は、Ｌ−オプシン遺伝子およびＭ−オプシン遺伝子の遺伝子座における変異に起因して、網膜の機能的な長波長感受性（Ｌ）錐体または中波長感受性（Ｍ）錐体を有さない。出生時から色の識別が重度に損なわれ、視覚は、残りの保存されたＳ錐体および杆体光受容体に由来する。ＢＣＭでは、典型的には、視力の低下（６／２４から６／６０へ）、振子様眼振、羞明が示され、患者は多くの場合、近視を有する。杆体特異的であり最大の網膜電図（ＥＲＧ）は、通常、明確な異常を示さず、３０Ｈｚ錐体ＥＲＧは検出することができない。シングルフラッシュ明所視ＥＲＧは多くの場合、たとえ小さく遅くても記録可能であり、Ｓ錐体ＥＲＧは十分に保存される。
色覚異常。色覚異常（ＣＶＤ）、または色盲は、通常の照明条件下で色を見るまたは色の差異を知覚する能力がないことまたは能力が低下していることである。色盲に罹患している個体は、いくつもの色覚検査、例えば、カラーＥＲＧ（ｃＥＲＧ）、仮性同色表（石原表、ハーディ−ランド−リッター多色表（Ｈａｒｄｙ−Ｒａｎｄ−Ｒｉｔｔｅｒ ｐｏｌｙｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｐｌａｔｅ））、ファーンズワース・マンセル１００ヒューテスト、ファーンズワースパネルＤ−１５、シティユニバーシティテスト（Ｃｉｔｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｔｅｓｔ）、コリナールール（Ｋｏｌｌｎｅｒ’ｓ ｒｕｌｅ）などのいずれかを使用して同定することができる。色覚異常の例としては、１型色覚、２型色覚、および３型色覚が挙げられる。１型色覚は、１型２色覚（赤色光に対する非感受性）および１型３色覚（赤色光に対する感受性の低下）を含み、Ｌ−オプシン遺伝子（ＯＰＮ１ＬＷ）における変異に関連付けられる。２型色覚は、２型２色覚（緑色光に対する非感受性）および２型３色覚（緑色光に対する感受性の低下）を含み、Ｍ−オプシン遺伝子（ＯＰＮ１ＭＷ）における変異に関連付けられる。３型色覚は、３型２色覚（青色光に対する非感受性）および３型３色覚（青色光に対する感受性の低下）を含み、Ｓ−オプシン遺伝子（ＯＰＮ１ＳＷ）における変異に関連付けられる。
加齢黄斑変性症。加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、５０歳を超えた人の視力喪失の主な原因の１つである。ＡＭＤは、読書、運転、および顔の認識などの詳細な作業のために必要である中心視覚に主に影響を及ぼす。この状態における視力喪失は、黄斑における光受容体の段階的な劣化に起因する。側面（周辺）視覚および夜間視力は一般に影響を受けない。
研究者は、乾性、または「非滲出」型と、湿性、または「滲出」もしくは「新生血管」型として公知の加齢黄斑変性症の２つの主要な型について記載しており、これらはどちらも、主題のポリヌクレオチドカセットの状況で導入遺伝子を送達することによって治療することができる。
乾性ＡＭＤは、網膜色素上皮と基礎をなす黄斑の脈絡膜との間にドルーゼンと称される黄色の沈着物が蓄積することを特徴とし、これは眼底写真によって観察することができる。これにより、ゆっくりと進行する視力喪失が生じる。この状態は、典型的には、両眼の視覚に影響を及ぼすが、視力喪失は、一方の眼で他方よりも前に起こることが多い。他の変化としては、色素変化およびＲＰＥ萎縮が挙げられる。例えば、ある場合では中心地図状萎縮、または「ＧＡ」と称される、網膜色素上皮の萎縮およびその後の眼の中心部における光受容体の喪失が観察される。乾性ＡＭＤは、ＣＤ５９および補体カスケード内の遺伝子における変異に関連付けられている。
湿性ＡＭＤは、乾性ＡＭＤが進行した状態であり、乾性ＡＭＤ患者の約１０％で起こる。病理学的変化としては、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）機能障害、ＲＰＥ下の流体集合、および黄斑の領域における脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）が挙げられる。重症の場合、流体漏出、ＲＰＥまたは神経網膜脱離および破裂した血管からの出血が起こり得る。湿性ＡＭＤの症状としては、視覚的な歪み、例えば、直線が波状または湾曲して見えること、出入り口もしくは道路標識が一方に傾いて見えること、または目的物が実際よりも小さくまたは遠く見えることなど；中心視覚の低下；色の強度または輝度の低下；および視野内の明確に定義された霧視点（ｂｌｕｒｒｙ ｓｐｏｔ）または盲点を挙げることができる。発症は突然であり得、急速に悪化する。診断には、被験体の中心視覚における欠陥を検査するためのアムスラーグリッド（黄斑変性症では、グリッド内の直線が消える、壊れる、または歪むということが引き起こされ得る）、血管または網膜の異常を観察するための蛍光眼底血管造影図、および網膜腫脹または漏出血管を検出するための光干渉断層撮影法の使用が含まれ得る。いくつもの細胞因子がＣＮＶの発生に関係づけられており、それらとして、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、低酸素症誘導性因子（ＨＩＦ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、ならびに他のサイトカイン、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）およびその他が挙げられる。
黄斑部毛細血管拡張症。黄斑部毛細血管拡張症（ＭａｃＴｅｌ）は、黄斑の傍中心窩の領域における病理学的に拡張した血管の形態（毛細血管拡張症）である。液体が満たされた嚢胞の発生に起因して、組織が劣化し、網膜の構造が瘢痕化し、それにより、光受容体細胞の栄養が損なわれ、視覚が恒久的に破壊される。ＭａｃＴｅｌには、１型および２型の２つの型が存在する。黄斑部毛細血管拡張症２型は、両側性疾患であり、その有病率は、４０歳およびそれより年長の人において０．１％もの高さであることが最近示されている。生体顕微鏡により、網膜の透明度の低下、結晶性沈着、軽度に拡張した毛細血管、平滑化した細動脈、網膜色素プラーク、中心窩の萎縮、および新生血管複合体が示され得る。蛍光眼底血管造影により、初期相では末梢血管拡張性毛細血管が小窩に対して主に側頭側に示され、後期相では過蛍光が拡散する。高分解能光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）により、光受容体の内節と外節の境界の破壊、網膜の内側または外側のレベルでの低反射性腔、および後期における網膜の萎縮が示され得る。１型黄斑部毛細血管拡張症では、疾患は大抵、一方の眼で起こり、それにより２型と区別される。通常はＭａｃＴｅｌによって全盲は引き起こされないが、一般に、１０〜２０年かけて、読書および運転視覚に必要である中心視覚の喪失が引き起こされる。
網膜色素変性症。網膜色素変性症（ＲＰ）は、中心視覚の喪失に至る可能性がある、進行性の周辺視覚の喪失および夜間視力の困難（夜盲症（ｎｙｃｔａｌｏｐｉａ））を特徴とする遺伝性障害の群である。ＲＰの徴候および症状の提示は変動するが、古典的なものとして、夜盲症（ｎｙｃｔａｌｏｐｉａ）（夜盲症（ｎｉｇｈｔ ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ）、ＲＰの最も一般的で最も早い症状）；視力喪失（通常は周辺であるが、進行した場合には、中心の視力喪失）；および光視症（閃光を見ること）が挙げられる。ＲＰは、多くの遺伝性疾患の集合であるので、身体的所見には著しい変動性が存在する。眼の検査には、視力および瞳孔反応の評価、ならびに前眼部の評価、網膜の評価、および眼底検査的評価が伴う。いくつかの場合には、ＲＰは、症候群、例えば、聴力損失（アッシャー症候群、ワールデンブルグ症候群、アルポート症候群、レフサム病）；カーンズ・セイヤー症候群（外眼筋麻痺、眼瞼下垂、心ブロック、および色素性網膜症）；無ベータリポ蛋白血症（脂肪吸収不良、脂溶性ビタミン欠乏症、脊髄小脳変性症、および色素性網膜変性症）；ムコ多糖症（例えば、ハーラー症候群、シャイエ症候群、サンフィリポ症候群）；バルデー・ビードル症候群（多指症、体幹肥満、腎機能障害、低身長、および色素性網膜症）；および神経セロイドリポフスチン沈着症（認知症、発作、および色素性網膜症；小児型はヤンスキー・ビールショースキー病として公知であり、若年型はフォークト・シュピールマイアー・バッテン病として公知であり、成体型はクーフス症状群として公知である）も付随する症候群の一態様である。網膜色素変性症は、最も一般的には、ＲＨＯ、ＲＰ２、ＲＰＧＲ、ＲＰＧＲＩＰ１、ＰＤＥ６Ａ、ＰＤＥ６Ｂ、ＭＥＲＴＫ、ＰＲＰＨ２、ＣＮＧＢ１、ＵＳＨ２Ａ、ＡＢＣＡ４、ＢＢＳ遺伝子における変異に関連付けられる。
糖尿病性網膜症。糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、糖尿病の合併症によって引き起こされる網膜に対する損傷であり、最終的には失明に至る可能性がある。理論に束縛されることを望むものではないが、高血糖に誘導される壁内の周皮細胞死および基底膜の肥厚により血管壁の機能不全が導かれると考えられる。これらの損傷により、血液網膜関門の形成が変化し、また、網膜血管がより浸透性になる。
糖尿病性網膜症には、非増殖性糖尿病性網膜症（ＮＰＤＲ）、および増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）の２つのステージがある。非増殖性糖尿病性網膜症は、糖尿病性網膜症の第１のステージであり、眼底検査によって診断され、糖尿病と併存する。視覚が低下している場合では、蛍光眼底血管造影を行って眼の背部の血管および存在し得るあらゆる網膜虚血を可視化することができる。糖尿病を有する全ての人がＮＰＤＲを生じるリスクを有し、したがって、主題のベクターを用いた予防的治療の候補になる。増殖性糖尿病性網膜症は、糖尿病性網膜症の第２のステージであり、網膜の新血管形成、硝子体出血、および霧視を特徴とする。いくつかの場合には、血管結合組織増殖により、牽引性網膜剥離が引き起こされる。いくつかの場合には、前房隅角への血管の成長も起こる可能性があり、血管新生緑内障が引き起こされる。ＮＰＤＲを有する個体は、ＰＤＲが発生するリスクが高く、したがって、主題のベクターを用いた予防的治療の候補になる。
糖尿病黄斑浮腫。糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）は、糖尿病を少なくとも２０年にわたって有している患者のほぼ３０％に罹患する、進行した、視覚が限定される、糖尿病性網膜症の合併症であり、ＤＲに起因する視力喪失の大半の原因となっている。ＤＭＥは、血漿構成要素の周囲の網膜への漏出、その結果としての網膜浮腫を引き起こす、血液網膜関門を損傷する網膜の微小血管の変化から生じる。理論に束縛されることを望むものではないが、高血糖、細胞シグナル伝達経路の持続的な変更、および白血球媒介性傷害を伴う慢性微小血管炎症により、慢性の網膜微小血管の損傷が導かれ、それにより、ＶＥＧＦの眼内レベルの上昇が誘発され、今度はそれにより、脈管構造の浸透性が上昇すると考えられる。
ＤＭＥが発生するリスクがある患者としては、長時間にわたって糖尿病を有している患者、および重症の高血圧症（高血圧）、体液貯留、低アルブミン血症、または高脂血症のうちの１つまたは複数が生じている患者が挙げられる。ＤＭＥの一般的な症状は、霧視、フローター、複視、および、状態を治療せずに進行させた場合の最終的な失明である。ＤＭＥは、眼底検査により、黄斑の中心の２乳頭径以内の網膜の肥厚として診断される。用いることができる他の方法としては、網膜の腫脹、嚢胞状浮腫、および漿液性網膜剥離を検出するための光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）；限局性の漏出の領域と拡散した漏出の領域を区別し、場所を突き止め、それにより、浮腫を治療するためにレーザー光凝固を使用する場合にはレーザー光凝固の設置をガイドする蛍光眼底造影；および網膜における長期間にわたる変化を評価するために使用することができるカラー立体眼底撮影法が挙げられる。特に、黄斑浮腫の進行を追跡し、主題の医薬組成物の投与後のその治療を観察するために視力を測定することもできる。
網膜静脈閉塞症。網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）は、網膜から血液を流出させる循環の一部の遮断である。この遮断により、毛細血管にせき止める圧力が引き起こされる可能性があり、それにより、出血が導かれる可能性があり、また流体および血液の他の構成要素の漏出も導かれる可能性がある。
緑内障。緑内障とは、多くの場合、眼内の流体圧力（眼圧）（ＩＯＰ）の上昇が付随する視神経損傷をもたらす眼（ｏｃｕｌａｒ）（眼（ｅｙｅ））の障害の群を記載する用語である。この障害は、大まかに２つの主要なカテゴリー、「開放隅角」緑内障および「閉塞隅角」（または「隅角閉塞」）緑内障に分けられる。開放隅角緑内障は、米国における緑内障の症例の９０％を占める。開放隅角緑内障は、無痛であり、急性発作がない。唯一の徴候は、徐々に進行する視野の喪失、および視神経の変化（眼底検査での陥凹／乳頭径比の上昇）である。閉塞隅角緑内障は、米国における緑内障の症例の１０％未満を占めるが、他の国（特にアジア諸国）では緑内障の症例の半分にも及ぶ。閉塞隅角を有する患者の約１０％で、突発性の眼の疼痛、光の周りに光ぼけが見えること、赤目、眼圧が非常に高いこと（＞３０ｍｍＨｇ）、悪心および嘔吐、突発的な視覚の低下、および瞳孔の固定された中間散大を特徴とする急性隅角閉塞発症が示される。また、いくつかの場合には、卵形瞳孔も付随する。ＤＬＫ、ＮＭＤＡ、ＩＮＯＳ、ＣＡＳＰ−３、Ｂｃｌ−２、またはＢｃｌ−ｘｌによりコードされるタンパク質の活性を調節することにより、この状態を治療することができる。
ソースビー眼底変性症。ソースビー眼底変性症は、ＴＩＭＰ３遺伝子における変異に関連付けられる常染色体優性の網膜疾患である。臨床的に、初期の、周辺中央（ｍｉｄｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ）の、ドルーゼンおよび色覚異常が見いだされる。一部の患者は夜盲症を訴える。最も一般的に、示される症状は、治療不能な黄斑下血管新生に起因する、３０代から４０代で症状発現する突発性の視力喪失である。組織学的には、ブルッフ膜のレベルで厚さ３０μｍの物質を含有する集密的な脂質が蓄積する。
卵黄様黄斑ジストロフィー。卵黄様黄斑ジストロフィーは、進行性の視力喪失を引き起こす可能性がある遺伝性眼障害である。卵黄様黄斑ジストロフィーは、黄斑の基礎をなす細胞における脂肪性の黄色色素（リポフスチン）の蓄積に関連する。時間をわたって、この物質の異常な蓄積により、明瞭な中心視覚のために重要な細胞が損傷を受ける可能性がある。結果として、この障害を有する人は、多くの場合、中心視覚を失い、視界がかすんだまたは歪んだものになる可能性がある。卵黄様黄斑ジストロフィーは、典型的には、側面（周辺）視覚にも夜間に見る能力にも影響を及ぼさない。
研究者は、卵黄様黄斑ジストロフィーの、同様の特徴を有する２つの形態について記載している。早期発症型（ベスト病として公知）は、通常は小児期に生じ、症状の発症および視力喪失の重症度は広範に変動する。早期発症型は、ＶＭＤ２／ＢＥＳＴ１遺伝子における変異に関連付けられる。成人発症型（成人卵黄様黄斑ジストロフィー）は、遅く、通常は成人期半ばに始まり、時間をわたってゆっくりと悪化する視力喪失が引き起こされる傾向がある。成人発症型は、ＰＲＰＨ２遺伝子における変異に関連付けられている。卵黄様黄斑ジストロフィーの２つの形態は、それぞれ、眼検査の間に検出することができる黄斑の特徴的な変化を有する。
杆体錐体ジストロフィー。杆体錐体ジストロフィーは、夜盲症および周辺視野の広がりの喪失が導かれる杆体機能障害が支配的な問題であるかまたは少なくとも錐体機能障害と同様の重症度で起こる、進行性疾患のファミリーである。網膜の周辺中央におけるスカラップ縁ラクナ萎縮（ｓｃａｌｌｏｐ−ｂｏｒｄｅｒｅｄ ｌａｃｕｎａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）が見られる可能性がある。黄斑は、臨床検査によって軽度にのみ関与するが、網膜中心の薄化は全ての場合において見られる。色弱は、初期には軽症であり、通常はより重症になる。視野は中程度または重度に狭まるが、若年の個体では典型的な輪状暗点が存在する。周辺網膜は、「白色点」を含有し、多くの場合、白点状網膜炎において見られる網膜の変化と似ている。網膜色素変性症は、この定義に含まれる疾患の主な群であり、全体として、およそ３，５００人に１人に罹患すると推定される。使用される分類基準に応じて、網膜色素変性症の全患者の約６０〜８０％が、明快な網膜疾患の杆体錐体ジストロフィーのパターンを有し、他の症候性の形態を考慮に入れると、全ての網膜色素変性症の約５０〜６０％が杆体錐体ジストロフィー非症候性カテゴリーに入る。
レーバー先天性黒内障。レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）は、典型的には、生後１年以内に明らかになる重症の網膜のジストロフィーである。通常は視覚機能が不十分であり、多くの場合、眼振、瞳孔応答が緩慢であるまたはほとんどないこと、羞明、高度の遠視、および円錐角膜を伴う。視力は２０／４００よりも良くなることはめったにない。特徴的な所見は、眼を突くこと、押すこと、およびこすることを含むフランチェスケッティの眼指徴候である。眼底の外観は大きく変動する。網膜は、最初は正常に見えるが、小児期の後期には網膜色素変性症によく似ている色素性網膜症が頻繁に観察される。網膜電図（ＥＲＧ）は、特徴的に「検出可能でない」または重度に亜正常である。１７種の遺伝子における変異によりＬＣＡが引き起こされることが公知である：ＧＵＣＹ２Ｄ（遺伝子座名：ＬＣＡ１）、ＲＰＥ６５（ＬＣＡ２）、ＳＰＡＴＡ７（ＬＣＡ３）、ＡＩＰＬ１（ＬＣＡ４）、ＬＣＡ５（ＬＣＡ５）、ＲＰＧＲＩＰ１（ＬＣＡ６）、ＣＲＸ（ＬＣＡ７）、ＣＲＢ１（ＬＣＡ８）、ＮＭＮＡＴ１（ＬＣＡ９）、ＣＥＰ２９０（ＬＣＡ１０）、ＩＭＰＤＨ１（ＬＣＡ１１）、ＲＤ３（ＬＣＡ１２）、ＲＤＨ１２（ＬＣＡ１３）、ＬＲＡＴ（ＬＣＡ１４）、ＴＵＬＰ１（ＬＣＡ１５）、ＫＣＮＪ１３（ＬＣＡ１６）、およびＩＱＣＢ１。総合して、これらの遺伝子における変異が、全ＬＣＡ診断の半分超の原因であることが推定される。ＬＣＡに関する少なくとも１種の他の疾患遺伝子座が報告されているが、遺伝子は分かっていない。
Ｘ連鎖性網膜分離症。Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）は、対称的な両側性の黄斑の関与を特徴とし、生後１０年以内、いくつかの場合には、生後３カ月の早さで発症する。眼底検査により、時には車輪のスポークパターンの陥凹が生じる、黄斑におけるスキーシス（網膜の神経線維層の分裂）の領域が示される。主に下側頭への周辺網膜のスキーシスが個体のおよそ５０％において起こる。罹患した男性は、典型的には、２０／６０〜２０／１２０の視覚を有する。視力は、多くの場合、１０代および２０代の間に劣化するが、その後、５０代または６０代まで比較的安定したままになる。Ｘ連鎖若年性網膜分離症の診断は、眼底所見、電気生理学的検査、および分子遺伝学的検査の結果に基づく。ＲＳ１は、Ｘ連鎖若年性網膜分離症に関連することが公知の唯一の遺伝子である。
錐体細胞障害に罹患しているまたは錐体細胞障害が発生するリスクがある個体は、当技術分野で公知の通り、これだけに限定することなく、当業者に公知の、眼底撮影法；光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）；補償光学（ＡＯ）；網膜電図検査、例えば、ＥＲＧ、カラーＥＲＧ（ｃＥＲＧ）；仮性同色表（石原表、ハーディ−ランド−リッター多色表）、ファーンズワース・マンセル１００ヒューテスト、ファーンズワースパネルＤ−１５、シティユニバーシティテスト、コリナールールなどの色覚検査；ならびにＥＴＤＲＳ文字検査（ＥＴＤＲＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ｔｅｓｔ）、スネレン視力検査（Ｓｎｅｌｌｅｎ ｖｉｓｕａｌ ａｃｕｉｔｙ ｔｅｓｔ）、視野検査、コントラスト感度検査などの視力検査などを含めた、障害の症状を検出するための技法を使用して容易に同定することができる。それに加えて、またはその代わりに、錐体細胞障害に罹患しているまたは錐体細胞障害が発生するリスクがある個体は、当技術分野で公知の通り、これだけに限定することなく、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列解析、制限消化、サザンブロットハイブリダイゼーション、質量分析などを含めた、錐体細胞障害に関連する遺伝子変異を検出するための技法を使用して容易に同定することができる。一部の実施形態では、方法は、錐体細胞療法を必要とする個体を同定するステップを含む。そのような例では、例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の症状を検出することによるもの、本明細書または当技術分野で公知の遺伝子の変異を検出することによるものなどの、個体が錐体細胞障害の症状を有するまたは錐体細胞障害が発生するリスクがあるかどうかを決定するための任意の都合のよい方法を利用して、錐体細胞療法を必要とする個体を同定することができる。
本主題の方法の実施において、主題の組成物を、典型的には、被験体の網膜に、錐体細胞における導入遺伝子の発現をもたらすために有効な量で送達する。一部の実施形態では、方法は、錐体細胞における導入遺伝子の発現を検出するステップを含む。
導入遺伝子の発現を検出するためのいくつものやり方が存在し、そのいずれも、主題の実施形態において使用することができる。例えば、発現は、直接、すなわち、遺伝子産物の量を、例えばＲＮＡレベルで、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ＲＮＡｓｅ保護によって；または、タンパク質レベルで、例えばウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査などによって測定することによって検出することができる。別の例として、発現は、間接的に、すなわち、被験体における錐体光受容体の生存能力または機能に対する遺伝子産物の影響を検出することによって検出することができる。例えば、導入遺伝子によりコードされる遺伝子産物により錐体細胞の生存能力が改善される場合、導入遺伝子の発現は、錐体細胞の生存能力の改善を、例えば、眼底撮影法、光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）、補償光学（ＡＯ）などによって検出することによって検出することができる。導入遺伝子によりコードされる遺伝子産物により錐体細胞の活性が変更される場合、導入遺伝子の発現は、錐体細胞の活性の変化を、例えば、送達されたポリヌクレオチドの存在を検出するやり方として、網膜電図（ＥＲＧ）およびカラーＥＲＧ（ｃＥＲＧ）；機能性補償光学；仮性同色表（石原表、ハーディ−ランド−リッター多色表）、ファーンズワース・マンセル１００ヒューテスト、ファーンズワースパネルＤ−１５、シティユニバーシティテスト、コリナールールなどの色覚検査；ならびにＥＴＤＲＳ文字検査、スネレン視力検査、視野検査、コントラスト感度検査などの視力検査によって検出することによって検出することができる。いくつかの場合には、生存能力の改善と錐体細胞機能の改変の両方を検出することができる。
一部の実施形態では、主題の方法により、治療的利益、例えば、障害の発生の防止、障害の進行の停止、障害の進行の逆転などがもたらされる。一部の実施形態では、主題の方法は、治療的利益が達成されたことを検出するステップを含む。当業者には、そのような治療的有効性の測定基準を改変される特定の疾患に適用可能であることが理解され、また、治療的有効性を測定するために使用する適切な検出方法が理解されよう。例えば、黄斑変性症の治療における治療的有効性は、黄斑変性症の速度の低下または黄斑変性症の進行の休止、例えば、眼底撮影法、ＯＣＴ、またはＡＯにより、主題の組成物を投与した後の検査結果と主題の組成物を投与する前の検査結果を比較することによって観察され得る効果として観察することができる。別の例として、進行性の錐体機能障害の治療における治療的有効性は、錐体機能障害の進行の速度の低下として、錐体機能障害の進行の休止として、または錐体機能の改善として、例えば、ＥＲＧおよび／もしくはｃＥＲＧ；色覚検査；機能性補償光学；ならびに／または視力検査により、例えば主題の組成物を投与した後の検査結果と主題の組成物を投与する前の検査結果を比較し、錐体の生存能力および／または機能の変化を検出することによって観察することができる効果として観察することができる。第３の例として、色覚異常の治療における治療的有効性は、個体の色の知覚、例えば、赤色波長の知覚、緑色波長の知覚、青色波長の知覚の変更として、例えば、ｃＥＲＧおよび色覚検査により、例えば、主題の組成物を投与した後の検査結果を主題の組成物を投与する前の検査結果と比較し、錐体の生存能力および／または機能の変化を検出することによって観察することができる効果として観察することができる。
主題の導入遺伝子を使用した導入遺伝子の発現は、ロバストであることが予想される。したがって、いくつかの場合には、例えば、遺伝子産物のレベルを測定することによって、治療的有効性を測定することなどによって検出される導入遺伝子の発現を、投与後２カ月またはそれ未満の時点で、例えば、投与後４週間、３週間または２週間またはそれ未満、例えば、主題の組成物の投与後１週間の時点で観察することができる。導入遺伝子の発現はまた、ある期間にわたって持続することも予測される。したがって、いくつかの場合には、例えば、遺伝子産物のレベルを測定することによって、治療的有効性を測定することなどによって検出される導入遺伝子の発現は、主題の組成物の投与後２カ月またはそれ超の時点で、例えば、４カ月、６カ月、８カ月、または１０カ月またはそれ超、いくつかの場合には１年またはそれ超、例えば、２年、３年、４年、または５年、特定の例では、５年超の時点で観察することができる。
ある特定の実施形態では、方法は、導入遺伝子の錐体細胞における発現を検出するステップを含み、発現は、本開示の１つまたは複数の改善されたエレメントを含まないポリヌクレオチドカセット、すなわち、参照対照、例えば、例えば、全開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１３／０３１７０９１号に開示されているｐＲ２．１プロモーターまたはその改変体（例えば、ｐＲ１．７、ｐＲ１．５、ｐＲ１．１など）、または米国特許出願第２０１４／０２７５２３１号に開示されている合成ＩＲＢＰ／ＧＮＡＴ２プロモーターからの発現と比較して増強されたものである。典型的には、発現は、参照、すなわち、例えば当技術分野で公知の対照ポリヌクレオチドカセットからの発現と比較して２倍またはそれ超、例えば、より早い検出、高レベルの遺伝子産物、細胞に対するより強力な機能的影響などによって証明される通り、例えば、３倍、４倍、または５倍またはそれ超、いくつかの場合には、１０倍、２０倍または５０倍またはそれ超、例えば、１００倍増強される。
典型的には、主題の組成物が本開示の主題のポリヌクレオチドカセットを含むｒＡＡＶである場合、変化を達成するための有効量は、ベクターゲノム約１×１０８個またはそれ超、いくつかの場合には、ベクターゲノム１×１０９個、１×１０１０個、１×１０１１個、１×１０１２個、または１×１０１３個またはそれ超、特定の例では、ベクターゲノム１×１０１４個またはそれ超、および通常はベクターゲノム１×１０１５個以下になる。いくつかの場合には、送達されるベクターゲノムの量は、最大でベクターゲノム約１×１０１５個、例えば、ベクターゲノム１×１０１４個またはそれ未満、例えば、ベクターゲノム１×１０１３個、１×１０１２個、１×１０１１個、１×１０１０個、または１×１０９個もしくはそれ未満、特定の例では、ベクターゲノム１×１０８個、典型的には、ベクターゲノム１×１０８個以上である。いくつかの場合には、送達されるベクターゲノムの量は、ベクターゲノム１×１０１０個〜１×１０１１個である。いくつかの場合には、送達されるベクターゲノムの量は、ベクターゲノム１×１０１０個〜３×１０１２個である。いくつかの場合には、送達されるベクターゲノムの量は、ベクターゲノム１×１０９個〜３×１０１３個である。いくつかの場合には、送達されるベクターゲノムの量は、ベクターゲノム１×１０８個〜３×１０１４個である。
いくつかの場合には、投与される医薬組成物の量は、感染多重度（ＭＯＩ）を使用して測定することができる。いくつかの場合には、ＭＯＩは、核酸を送達することができる細胞に対するベクターまたはウイルスのゲノムの比または倍率を指し得る。いくつかの場合には、ＭＯＩは、１×１０６であり得る。いくつかの場合には、ＭＯＩは、１×１０５〜１×１０７であり得る。いくつかの場合には、ＭＯＩは、１×１０４〜１×１０８であり得る。いくつかの場合には、本開示の組換えウイルスのＭＯＩは、少なくとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８である。いくつかの場合には、本開示の組換えウイルスのＭＯＩは、１×１０８〜３×１０１４である。いくつかの場合には、本開示の組換えウイルスのＭＯＩは、最大で約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８である。
一部の態様では、医薬組成物の量は、組換えウイルスの粒子約１×１０８〜約１×１０１５個、組換えウイルスの粒子約１×１０９〜約１×１０１４個、組換えウイルスの粒子約１×１０１０〜約１×１０１３個、または組換えウイルスの粒子約１×１０１１〜約３×１０１２個を含む。
個々の用量は、典型的には、被験体に対する測定可能な効果を生じさせるために必要な量以上であり、主題の組成物またはその副産物の吸収、分布、代謝、および排出（「ＡＤＭＥ」）に関する薬物動態学および薬理学に基づいて、したがって、被験体内の組成物の処分（ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）に基づいて決定することができる。これには、投与経路ならびに投薬量の考察が含まれ、これは、網膜下への適用（主に局部的な効果のために、作用が望まれる場所に直接適用する）、硝子体内への適用（汎網膜効果のために、硝子体内に適用する）、または非経口的適用（全身経路、例えば、静脈内、筋肉内などによって適用する）のために調整することができる。用量および／または投薬レジメンの有効量は、前臨床アッセイから、安全性および漸増および用量範囲試験、個々の臨床医−患者関係、ならびに本明細書に記載されており、以下の実験の節で例示されているものなどのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイから、経験的に容易に決定することができる。
本明細書において参照されている、かつ／または本出願データシートに列挙されている上記の全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
前述のことから、本明細書には例示のために本発明の特定の実施形態が記載されているが、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく種々の改変が成され得る。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲以外には限定されないことが理解されよう。
以下の実施例は、本発明をどのように作製し、使用するかについての全開示および記載を当業者に提供するために提示され、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定するものでもなく、以下の実験が、実施した全ての実験または唯一の実験であることを表すものでもない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関しては正確さを確実にするための試みが行われているが、いくらかの実験的な誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の指定のない限り、部分は重量による部分であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は、大気圧または大気圧付近の圧力である。
分子および細胞生化学における一般的な方法は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＨａＲＢｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１年）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９年）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６年）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９年）；Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ ＆ Ｌｏｅｗｙ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５年）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ． Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７年）；およびＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８年）などの標準の教本に見いだすことができる。本開示において言及される遺伝子操作用の試薬、クローニングベクター、およびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＣｌｏｎＴｅｃｈなどの商業的な供給業者から入手可能である。
背景
錐体杆体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、スタルガルト黄斑ジストロフィー、および１色覚などの黄斑ジストロフィー；１型色覚、２型色覚、および３型色覚などの色覚障害；ならびに加齢黄斑変性症、黄斑部毛細血管拡張症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、緑内障、ソースビー眼底変性症、成人卵黄様黄斑ジストロフィー、ベスト病、およびＸ連鎖性網膜分離症などの中心黄斑の視覚障害を含めた多くの錐体光受容体に関連する障害を治療するための新しい療法が必要とされている。これらの視覚障害は錐体光受容体の機能および／または生存能力の喪失に関連するので、これらの障害は、錐体光受容体に治療用遺伝子を送達して錐体の生存能力および機能をレスキューすることによって治療可能であり得ることが仮定される。
そのために、錐体特異的発現のためにエンハンサー、プロモーター、５’ＵＴＲ、イントロン、コザック、およびポリアデニル化配列が設計されたポリヌクレオチドカセット「ｐＭＮＴＣ」を設計した（図１０ａ）。カセットには、Ｌ−オプシンゲノム遺伝子座およびＭ−オプシンゲノム遺伝子座由来のＬＣＲエンハンサー配列、ならびに転写開始部位の上流の約１４０ヌクレオチドを含むＭ−オプシン遺伝子由来の短縮型プロモーター配列を含めた。さらに、カセットには、Ｍ−オプシン５’ＵＴＲに基づくが、最小の二次構造を有するように（図３を参照されたい）、および３’末端においてイントロンが挿入された追加的な配列を含むように改変した５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含めた。使用したイントロン配列は、ヒトβ−グロビン遺伝子および枝の第１のイントロン由来の５’ドナー部位と、免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のリーダーと本体との間にあるイントロン由来の３’アクセプター部位とを有するｐＳＩキメライントロンであった（Ｂｏｔｈｗｅｌｌ， Ａ．Ｌ．ら（１９８１年）Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ＮＰｂ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｅｖｉｄｅｎｔ ｉｎ ａ ｇａｍｍａ ２ａ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ． Ｃｅｌｌ ２４巻、６２５〜３７頁）。ドナー部位およびアクセプター部位の配列は、枝分かれ部位と共に、スプライシングのコンセンサス配列に適合するように変化させた（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ， Ｐ．、Ｓｈａｐｉｒｏ， Ｍ．Ｂ．およびＨａｒｒｉｓ， Ｎ．Ｌ．（１９９０年）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３巻、２５２〜７８頁）。ｐＭＮＴＣ ポリヌクレオチドカセットには、強力なコザック配列およびＳＶ４０ポリアデニル化配列も含めた。
導入遺伝子を錐体細胞に送達するための最良のＡＡＶを同定するための実験も実施した。遺伝子療法を目的とした、網膜の細胞へのポリヌクレオチドの成功裏の送達は、ＡＡＶおよびレンチウイルスなどのウイルスベクターを使用して達成されている。しかし、これらのウイルスは、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）網膜の細胞に到達させるためには網膜下に注射しなければならず、この手順には網膜損傷のリスクがある。より破壊的でない手法は、硝子体内注射による投与である。しかし、ＡＡＶまたはレンチウイルスを硝子体内送達した後の錐体光受容体の効率的な形質導入は実証されたことがない：網膜錐体細胞を高効率で形質導入する能力を有するＡＡＶに関する報告が存在する（Ｍｅｒｉｇａｎら、ＩＯＶＳ ２００８年、４９ Ｅ−ａｂｓｔｒａｃｔ４５１４）一方、後の報告では、これらのベクターの有効性が疑問視されている（Ｙｉｎら、ＩＯＶＳ ２０１１年、５２巻（５号）：２７７５〜２７８３頁）。
結果
ＡＡＶ２の定向進化により、野生型ＡＡＶ２よりも良好に光受容体に形質導入することが可能なウイルス改変体「７ｍ８」の同定が導かれた（ＤａｌｋａｒａらＳｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１３年）。しかし、網膜は、杆体と錐体の２つの型の光受容体を含有し、ＡＡＶ２−７ｍ８により錐体光受容体それ自体に、およびより詳細には、窩の高度に錐体が豊富な領域内の錐体光受容体に形質導入することが可能かどうかを実証した報告は存在しない。この可能性を試験するために、本発明者らは、ＧＦＰに作動可能に連結した遍在するプロモーターＣＭＶの発現カセットを有するＡＡＶ２−７ｍ８をアフリカミドリザルの網膜に硝子体内注射によって送達した。硝子体内に送達されたＡＡＶ２−７ｍ８．ＣＭＶ．ＧＦＰにより、霊長類の中心窩（中心窩の中心にある直径０．３５ｍｍの杆体が存在しない網膜の領域）および傍中心窩（凹部の縁）内の網膜細胞への形質導入が、硝子体内に送達されたＡＡＶ２または網膜細胞への形質導入が当技術分野において以前示されている他のＡＡＶ改変体よりも効率的になされると思われた。ＡＡＶ２−７ｍ８によっても試験した他のＡＡＶによっても、霊長類窩の錐体、小窩を取り囲み、窩の傾きを形成する直径１．５ｍｍの錐体が豊富な網膜の領域への形質導入はできないと思われた（図５）。
本発明者らは、次に、ＧＦＰに作動可能に連結したｐＭＮＴＣを含むゲノムをＡＡＶ２−７ｍ８カプシド内にパッケージングし、このベクター組成物の、硝子体内に注射された際にｉｎ ｖｉｖｏで錐体細胞においてＧＦＰ導入遺伝子を発現させる能力を評価した。いくつもの種において、マウス（３％錐体）、ラット（１％錐体）、スナネズミ（１３％錐体）、および非ヒト霊長類（５％錐体）を含めた全光受容体の間で様々な数の網膜錐体細胞を用いて発現を評価した。図５の本発明者らの結果に反して、非ヒト霊長類の窩全体を通して強力な遺伝子発現を検出することができた（図６）。これらのデータから、硝子体内に送達されたＡＡＶ２−７ｍ８により、実際、網膜の錐体への形質導入が可能であること、および、ｐＭＮＴＣが錐体細胞においてロバストな発現カセットとして作用することが示される。ラット（データは示していない）およびスナネズミ（図８Ａ）の硝子体内に注射した網膜においてもロバストなレポーター遺伝子発現が見られ、全ての種において、発現レベルおよび解剖学的位置は錐体の存在量および位置と相関した。
ｐＭＮＴＣ誘導性発現の細胞特異性を決定するために、形質導入されたマウス網膜の全組織標本（ｗｈｏｌｅ ｍｏｕｎｔ）を、錐体ＬオプシンおよびＭオプシンに対して特異的である抗体を使用して免疫組織化学的検査によって分析した。錐体光受容体の外節のみを標識するＬ／Ｍオプシンの発現が、ＡＡＶ２−７ｍ８．ＭＮＴＣ．ＧＦＰベクターからＧＦＰが発現したマウス網膜の錐体の事実上全てで観察され（図７）、これにより、導入遺伝子のＭＮＴＣ誘導性発現が高度に錐体特異的であることが示される。さらに、Ｌ／Ｍオプシン特異的抗体により標識された錐体の外節の８０％またはそれ超でもＧＦＰ導入遺伝子が発現し、これにより、ＡＡＶ２−７ｍ８により錐体への形質導入が高度に効率的になされることが示される（図７）。
次に本発明者らは、ｐＭＮＴＣの錐体細胞における発現を促進する能力と、ｐＲ２．１の錐体細胞における発現を促進する能力を比較した。ｐＲ２．１は、ヒトＬ／Ｍオプシンエンハンサー（「ＬＣＲ」）およびヒトＬ−オプシン遺伝子由来のプロモーター領域を含む。さらに、ｐＲ２．１は、その３’末端で追加的な５’ＵＴＲ配列と融合したＬ−オプシン５’ＵＴＲを含み、改変ＳＶ４０後期１６ｓイントロン配列が挿入されている。この後にＬ−オプシンコザック配列が続き、次いでこれが典型的には導入遺伝子とインフレームで連結している。カセットの最後はＳＶ４０ポリＡ尾部である。
ＡＡＶ２−７ｍ８．ＭＮＴＣ．ＧＦＰおよびＡＡＶ２−７ｍ８．ｐＲ２．１．ＧＦＰのウイルス調製物をｉｎ ｖｉｖｏでスナネズミおよび非ヒト霊長類の網膜に硝子体内送達し、２週間後、４週間後、８週間後、および１２週間後に眼底自己蛍光およびＯＣＴによって網膜をｉｎ ｖｉｖｏでイメージングした。ｐＭＮＴＣ．ＧＦＰ発現カセットを有するｒＡＡＶで形質導入されたスナネズミ網膜では、ｐＲ２．１．ＧＦＰ発現カセットを有するスナネズミ網膜と比較してＧＦＰレポーター発現がより早く、より強力に、より多くの錐体において検出された（図８Ｂ）。同様に、ｐＭＮＴＣ．ＧＦＰ発現カセットを有するｒＡＡＶで形質導入された非ヒト霊長類網膜では、ｐＲ２．１発現カセットで形質導入されたＮＨＰ網膜と比較して、ＧＦＰレポーター発現がより早く、より多くの錐体において検出された（図９、ｎ＝４の眼）。スナネズミおよびＮＨＰのどちらにおいても、試験期間全体を通して、ＧＦＰは、一貫して、ｐＭＮＴＣから、ｐＲ２．１からよりも強力であることが観察された。
ｐＭＮＴＣ発現カセット内のエレメントのそれぞれの、発現の全体的な改善に対する寄与を決定するために、ｐＭＮＴＣ内のエレメントのそれぞれを１つずつｐＲ２．１発現カセット由来の対応するエレメントで置換した一連の発現構築物をクローニングした。次いで、これらの構築物をＡＡＶ２−７ｍ８にパッケージングし、硝子体内注射によってスナネズミ網膜に送達した。４週間後および８週間後にｉｎ ｖｉｖｏにおいて、眼全体にわたるレポーター発現の定量的な読み取りをもたらすｉｎ ｖｉｖｏ生物発光（ＩＶＩＳ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によってスナネズミ網膜を評価した。
予測通り、ｐＭＮＴＣの制御下でのルシフェラーゼレポーターの発現は、ｐＲ２．１の制御下でのルシフェラーゼレポーターの発現よりも高かった。ｐＭＮＴＣプロモーター配列を、それに対して最も高い配列相同性を有するｐＲ２．１プロモーター配列（配列番号８３）で置き換えることにより、発現が低下し（構築物ｐＭＮＴＣ＿ｐＲ２．１ Ｌ３’Ｐ）、同様に、ｐＲ２．１の５’ＵＴＲより遠位にあるｐＲ２．１プロモーター配列（配列番号８２）を含めた場合も発現が低下した（構築物ｐＭＮＴＣ＿ｐＲ２．１−Ｌ５’Ｐ）。また、ｐＭＮＴＣ ５’ＵＴＲに、ｐＲ２．１ ５’ＵＴＲにおいて観察される２つの偽の開始配列（「ＡＵＧ１」および「ＡＵＧ２」）を導入することによっても発現が低下した（構築物ｐＭＮＴＣ＿２．１−ＡＵＧ１／２）。興味深いことに、ｐＭＮＴＣ ５’ＵＴＲを、これらの偽の開始を除去した改変ｐＲ２．１ ５’ＵＴＲ配列（配列番号８７、ヌクレオチド１７をＣに変化させ、ｎｔ６１および６２をＣＡに変化させた）で置き換えた場合には発現は低下せず（ｐＭＮＴＣ＿ｐＲ２．１−５’ＵＴＲ）、これにより、ｐＲ２．１ ５’ＵＴＲエレメント内に偽のＡＵＧがなければ、ｐＲ２．１−５’ＵＴＲにより錐体細胞における強力な発現が促進されることが示唆される。同様に興味深いことに、ｐＲ２．１イントロン（配列番号５９）により、ｐＭＮＴＣのｐＳＩキメライントロンよりもロバストな発現がもたらされると思われ、これにより、本開示のポリヌクレオチドカセットにｐＲ２．１イントロンを含めることを、錐体細胞における発現をさらに改善するために使用できることが示唆される。最後に、Ｌ／Ｍエンハンサー（ｐＲ２．１およびｐＭＮＴＣのどちらにおいても見いだされる）を除去することによっても発現が低下した。ポリＡ尾部も最初は発現に対して有意な影響を及ぼすと思われたが、このｐＲ２．１エレメントを含むｐＭＮＴＣ構築物の再配列決定により、ポリＡ尾部は導入遺伝子に作動可能に連結していないことが明らかになり、それにより、何故この構築物からはバックグラウンドレベルの発現しか観察されなかったのかが説明される。したがって、Ｌ／ＭオプシンＬＣＲ、ＬオプシンプロモーターではなくＭオプシンコアプロモーターを含めること、および５’ＵＴＲ内の偽の開始を排除することは全て、ｐＭＮＴＣプロモーターを使用して達成される遺伝子発現の増強に寄与する。
結論として、本発明者らは、網膜の錐体に対するポリヌクレオチドの硝子体内送達のために使用することができる、ＧＨループ内に７ｍ８ペプチドを含むＡＡＶ改変体を同定した。同様に、本発明者らは、錐体光受容体における強力な発現を促進するために使用することができるいくつものポリヌクレオチドカセットエレメントを同定した。総合すると、これらの発見は、錐体に関連する障害に対する治療剤の開発を容易にすることができる改善を表すものである。
材料および方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＷＥＲＩ−ＲＢ−１細胞における導入遺伝子発現。ＳｈａａｂａｎおよびＤｅｅｂ、１９９８年；ＩＯＶＳ ３９巻（６号）８８５〜８９６頁に記載されている方法に従って、錐体光受容体色素細胞を発現するＷＥＲＩ−Ｒｂ−１網膜芽細胞腫細胞に、本開示のポリヌクレオチドカセットをトランスフェクトする。クローニング（Ｍａｎｉａｔｉｓら）などの、分子生物学の十分に確立された技法を使用して、または新規のＤＮＡ合成により、ポリヌクレオチドカセットをプラスミドＤＮＡとしてトランスフェクトする。全ての調節エレメントをカセット内に配置し、増強型ＧＦＰタンパク質を駆動するために使用する。次いで、非ウイルストランスフェクションに関する確立された技法を使用して、例えば、脂質に基づくトランスフェクション試薬（Ａｌｔｏｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＮＶ）またはリポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してプラスミドＤＮＡを細胞に導入する。次いで、細胞を７２時間にわたって培養し、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡を使用してｅＧＦＰ発現を測定する。本発明のポリヌクレオチドカセット（すなわち、錐体光受容体での発現のために設計した構築物）をトランスフェクトした細胞における導入遺伝子発現を、最適化されていない対応物（すなわち、ｐＲ２．１に基づくもの）と比較し、改善されたエレメントを有するカセットからのほうが強力であることが見いだされる。
６６１Ｗ細胞などの、錐体オプシンを発現する他の哺乳動物の細胞株を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏにおける発現も評価する（Ｔａｎら、ＩＯＶＳ ２００４年；４５巻（３号）７６４〜７６８頁）。
同様に、錐体光受容体に特異的なタンパク質を発現するように操作した非光受容体細胞株を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏにおける発現を評価する。そのような系は、ＣＲＸ／Ｓｐ１を発現するように遺伝子操作されたＨＥＫ２９３細胞を用いて記載されている（Ｋｈａｎｉら、ＩＯＶＳ ２００７年；４８巻：３９５４頁）。生理的遺伝子（オプシン、ＡＣＨＲ遺伝子）だけでなくマーカー遺伝子も使用する（ｅＧＦＰ、ｄｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ルシフェラーゼ）。生理的遺伝子を、ｍＲＮＡレベル（例えば、ＲＴ−ＰＣＲによって）またはタンパク質レベル（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットによって）を調査することによって試験する。
動物飼育。全ての実験は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＳｏｃｉｅｔｙおよびＳｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅにより採用された動物の飼育および使用に関する原理に合致し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認されたものであった。
小動物試験。発現カセットのコード配列によりコードされる遺伝子産物の発現を、マウス、ラット、およびスナネズミにおいてｉｎ ｖｉｖｏで評価する。これは、発現カセットを含むｒＡＡＶ調製物をｉｎ ｖｉｖｏで硝子体内注射することによって達成される（Ｌｉら、２００８年；Ｍｏｌ Ｖｉｓ ４８巻：３３２〜３３８頁）。その代わりにプラスミドＤＮＡの電気穿孔を実施することができることに留意されたい（Ｍａｔｓｕｄａ／Ｃｅｐｋｏ）。
マウス試験。この試験において使用したマウスはＣ５７ＢＬ／６であった。動物をケタミン／キシラジンで麻酔した（１１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）。試験物をローディングした斜端（ｂｅｖｅｌｅｄ）３４ゲージ使い捨て針を眼の硝子体に挿入し、体積１．５μｌ中ｒＡＡＶのベクターゲノム５．０４×１０１０個を硝子体内に注射した。
スナネズミおよびラット試験。この試験ではスナネズミ（Ｍｅｒｉｏｎｅｓ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）およびブラウンノルウェーラットを使用した。１０％フェニレフリンおよび０．５％トロピカミドを用いて瞳孔を散大させた。動物を、ケタミン／キシラジン溶液（ラットに対しては７０ｍｇ／ｍＬのケタミンおよび１０ｍｇ／ｍＬのキシラジン；スナネズミに対しては２５ｍｇ／ｍＬのケタミンおよび０．３ｍｇ／ｍＬのキシラジン）０．１〜０．２ｍＬの腹腔内または筋肉内注射を用いて麻酔した。１００μＬのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジ中に試験物をローディングした斜端３４ゲージ使い捨て針を、縁から約１ｍｍの最適化された上側頭点（ｓｕｐｅｒｉｏｒ−ｔｅｍｐｏｒａｌ ｐｏｉｎｔ）において強膜を通して眼の硝子体に挿入した。体積５μＬ中試験物（２×１０１０ｖｇのｒＡＡＶ．ＧＦＰ、または１．１５×１０１０ｖｇのｒＡＡＶ．ルシフェラーゼ）のベクターゲノム１×１０１０〜２×１０１０個を、微量注入ポンプを用いて硝子体内にゆっくりと注射し、その後、適切な試験物の分配を確実にするために、針の先端を注射された眼に注射位置で１０秒間保持した。次いで、針を抜いた。
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）試験。ポリヌクレオチドカセットおよび発現ベクターを大型動物においても試験する。これは、ＡＡＶを使用することによって、例えば、Ｍａｎｃｕｓｏらの技法を使用して行う。簡単に述べると、ＡＡＶカセットを作出し、発現カセットをカプシドで包むＡＡＶを製造し、ウイルス調製物を非ヒト霊長類に、硝子体内（硝子体内に最大１７０μＬ）または網膜下（異なる位置に最大３回、１００μＬの注射；注射前に硝子体切除術を実施することができる）に注射する。レポーター（ＧＦＰ）、カラーＥＲＧ、および／または、ケンブリッジカラーテスト（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｏｌｏｒ Ｔｅｓｔ）を使用したまたは標的が視野に入った時にサッケード（眼球運動）を行うよう訓練した動物に対する行動検査によって発現を評価する。アイトラッカーを使用してサッケードをモニターする。治療前に、動物を、色覚検査を実施するためにまたは色の付いた標的を見た時にサッケードを行うように訓練する。ＥＲＧを実施して存在する錐体のスペクトル感度を推定する。色覚検査成績およびＥＲＧからのデータにより、動物が二色性色覚（色盲）であることの証拠がもたらされる。ＧＦＰ遺伝子を有するベクターを受けた動物に関して、ＲｅｔＣａｍ ＩＩまたは同様のデバイスをＧＦＰの励起を生じさせる光の下で用いた眼底イメージングを使用して発現をモニターする。動物の内在性色素と比較してスペクトル感度が異なる光色素遺伝子を受けた動物に関して、最大１０６の異なる網膜の位置においてスペクトル感度を測定するための多焦点カラーＥＲＧを使用して、および行動検査によって発現をモニターする。
ヒヒを、１０〜１５ｍｇ／ｋｇのケタミン、その後セボフルラン（ｓｅｖｏｆｌｕｏｒａｎｅ）を用いて鎮静させた。アフリカミドリザルを、５：１ ケタミン：キシラジンミックス（１００ｍｇ／ｍｌのケタミンおよび２０ｍｇ／ｍｌのキシラジンを０．２ｍｌ／ｋｇ）を筋肉内注射することで鎮静させた。局所的１０％フェニレフリンを用いて散瞳を達成した。開瞼器を眼に設置して注射を容易にした。塩酸プロパラカイン０．５％、次いで５％ベタジン溶液の滴下を適用し、その後、滅菌食塩水ですすいだ。ヒヒ（図６）には、３．４×１０１３ｖｇのｒＡＡＶの調製物６０μｌを硝子体内（ＩＴＶ）注射して眼当たり２．０２×１０１２ｖｇの最終用量を得た。アフリカミドリザルには、１×１０１３のｒＡＡＶベクターの調製物５０μＬをＩＴＶ注射して、眼当たり５×１０１１ｖｇの最終用量を得た。外科的な拡大率の下で縁の約２．５ｍｍ後方の鋸状縁のレベルで下側頭に挿入した３１ゲージ０．３７５インチの針（Ｔｅｒｕｍｏ）を使用して中心硝子体へのＩＴＶ注射を行って、眼球外および眼球内の針の配置の完全な可視化を可能にした。中心硝子体の位置を注射時に針の先端で直接観察することによって確認した。ＩＴＶ注射の後に、局所的な三重抗生物質軟膏剤を投与した。
細隙灯生体顕微鏡検査。各サルの眼の前眼部を、ベースラインスクリーニング中および注入後第４週（２８日目）、第８週（５６日目）および第１２週（８４日目）に細隙灯生体顕微鏡検査によって検査して炎症をモニターした。異常は観察されなかった。
眼底検査および写真。ラットおよびスナネズミ網膜の眼検査および眼底撮影法を、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｍｉｃｒｏｎ ＩＶ眼底顕微鏡を使用して実施した。全ての動物に対してベースラインスクリーニング／写真撮影を行って、眼の健康を確認し、次いで、指定時点で写真撮影してＧＦＰ導入遺伝子の発現をモニターした。視神経および網膜に関するあらゆる変化または病変全体の外観をカラー眼底撮影法によって記録し、フルオレセインフィルターを用いた蛍光眼底イメージングを使用してＧＦＰの発現を可視化した。
ＮＨＰの網膜検査、眼底色および蛍光写真、ならびに自己蛍光ＯＣＴを、Ｔｏｐｃｏｎ ＴＲＣ−５０ＥＸ網膜カメラをＣａｎｏｎ ６ＤデジタルイメージングハードウェアおよびＮｅｗ Ｖｉｓｉｏｎ Ｆｕｎｄｕｓ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＳｙｓｔｅｍソフトウェアおよびＳｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＯＣＴ Ｐｌｕｓと共に使用することよって実施した。全ての動物に対してベースラインイメージングを行った。ＧＦＰ発現も硝子体内ベクター注射後第２週、第４週、第８週、および第１２週に実証した。
ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ。ｒＡＡＶ．ルシフェラーゼを送達した後の網膜におけるルシフェラーゼの発現を、硝子体内注射の２週間後、４週間後および８週間後にＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用してｉｎ ｖｉｖｏで定量化した。スナネズミに１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）（１５ｍｇ／ｍｌのルシフェリン、１５ｍｌ／ｋｇの用量）を皮下注射した。およそ２２分後、動物を、４％イソフルランを３〜５分吸入させることによって鎮静させた。その後すぐに、動物をイメージングプラットフォームに対で置き、各動物の一方の眼の発光を定量化し、その後すぐに反対側の眼のイメージングを行った。ナイーブなスナネズミを陰性標準として使用し、発光のバックグラウンドレベルは、典型的には、毎秒１×１０４光子の発光を記録した。イメージングの前にファントムマウス（生物発光イメージング用のＸＰＭ−２ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒファントムマウス）を使用した生物発光の検証を実施してイメージングシステムの較正を確実にした。
免疫組織化学的検査。致死量のペントバルビタールナトリウムを用いてマウスを安楽死させ、まず、ＰＢＳ中、１ｍＬ当たり２単位のヘパリンを含有する０．１３Ｍのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２〜７．４を用い、次にＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用い、次にＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド＋１％グルタルアルデヒドを用いた心臓灌流によって組織を固定した。グルタルアルデヒドがＲＰＥに付着した神経網膜を保持する働きをし、したがって、錐体の外節はインタクトなままであった。各溶液を投与の直前に約３７℃に温め、灌流液約３５〜４０ｍＬを各段階で送達した。灌流を停止したら、マウスを湿ったペーパータオルで包み、２〜３時間さらに固定させた後、眼球摘出および切開を行った。
恒久的なインクを使用して眼の方向に印を付け、前眼部を取り出し、アイカップを４％ＰＦＡ中に４℃で一晩固定し、次いで、ＰＢＳ中、４℃で保管した。４％ＰＦＡに２時間にわたって浸漬した組織の間の切開した網膜を平坦化し、次いで、それらを培養プレートに移してさらに６時間にわたって固定することによって網膜全組織標本を作出した。その後、ＰＦＡを０．０３％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳと交換した。
回転式卓上振とう機で抗体標識を行った。非特異的な標識を遮断するために、全組織標本を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、５％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ番号００４−０００−１２０）、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ番号００１−０００−１６１）、および０．０３％トリトンＸ−１００を含有する溶液と一緒に４℃で一晩インキュベートした。この試験において使用した一次抗体は、１：２００に希釈したウサギ抗赤色−緑色（Ｌ／Ｍ）オプシン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ番号ＡＢ５４０５）であった。検体をＰＢＳ中で３回、それぞれ３０分にわたって洗浄し、次いで、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ジヒドロクロリド１：１０，０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ番号Ｄ−２１４９０）プラス二次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした。Ｌ／Ｍ−オプシン抗体に対する二次抗体は、抗体希釈緩衝液中に１：２００に希釈した、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識したロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ番号Ａ２１２０６）であった。二次抗体と一緒にインキュベートした後、３回の３０分にわたるＰＢＳ洗浄、４％パラホルムアルデヒドを用いた３０分にわたる後固定、およびさらに３回の３０分にわたるＰＢＳ洗浄を行った。最後に、網膜スライスを、グリセロール中２％ＤＡＢＣＯを伴うスライド上に置き、カバーガラスで覆った。
顕微鏡。マウス網膜全組織標本の広視野画像を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ１０００を２０×（オープンエア）対物レンズおよび１．５×光学ズームを伴うカメラセットと共に使用して取得した。各検体について、０．５μｍ離して５０枚の光学的切片を取得し、Ｍ−オプシンＺ−スタックをＩｍａｇｅＪで再構築した。Ｚ−スタックを、外節の長さが面内になるように方向付け、抗体染色の開始場所と終了場所の間の距離を外節の長さの推定値として測定した。さらに、Ｚ−スタックの３Ｄ投影を生成し、外節内の可視のＭ−オプシンを有する錐体の数を定量化することができた。
Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦｌｕｏＶｉｅｗＴＭ ＦＶ１０００を使用して共焦点像スライスを取得した。２０×油浸レンズを使用して切片を画像化し（０．５μｍ離して４０枚の画像を取得した）、Ｚ−スタックをＩｍａｇｅＪで再構築した。Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用してチャネル曝露レベルを画像内および画像にわたって平衡させた。網膜全組織標本について、１０×オープンエアレンズを使用して画像を取得し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐのネイティブモザイク構築ソフトウェアを用いてモザイクを構築した。
ポリヌクレオチドカセットの組織特異性を試験する実験。この場合、ＧＦＰをコードする構築物を、硝子体内、網膜下、または静脈内などの１つまたは複数の投与経路によって注射する。次いで、動物を屠殺し、組織を、ｑＰＣＲ（構築物の存在を示すＤＮＡ配列を検出するため）およびＧＦＰ発現（構築物が活発に発現する領域を検出するため）によって分析する。ＤＮＡ配列が存在しないことにより、所与の組織への体内分布がないことが示され、一方、ＤＮＡ配列が存在し、それと共に導入遺伝子発現（ｍＲＮＡまたはタンパク質レベル）が欠如していることにより、ベクターは存在しているがその組織では発現していないことが示される。このように、錐体光受容体に対する特異性のレベルを確立し、視神経、肝臓、脾臓、または脳組織などの標的とされていない組織における発現を伴わず、発現を標的錐体光受容体細胞に制限することに関する本発明の有用性を決定するために使用することができる。硝子体内ＡＡＶは、脳に生体内分布することが公知であり（Ｐｒｏｖｏｓｔら）、したがって、錐体光受容体を標的とするための、高度に発現する改善された構築物は、発現を網膜の標的細胞に限定し、オフターゲットの導入遺伝子発現に付随する潜在的な有害事象を限定するために有用であると思われる。
上記では、ただ単に本発明の原理が例示されている。当業者は本明細書においてはっきりとは記載されていない、または示されていないが、本発明の原理を具体化し、その主旨および範囲内に含まれる種々の取り合わせを考案することができることが理解されよう。さらに、本明細書において列挙されている全ての例および条件付きの言葉は、主に、読者が本発明の原理および当技術分野を推進するために本発明者らが与える概念を理解するために役立てることを意図しており、そのような具体的に列挙された実施例および条件に限定されないと解釈されるべきである。さらに、本明細書において、本発明の原理、態様および実施形態ならびにその特定の実施例が列挙されている全ての記載は、それらの構造的等価物および機能的等価物の両方を包含するものとする。さらに、そのような等価物は、現在公知の等価物と、今後開発される等価物、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たす、開発される任意の要素の両方を包含するものとする。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され、記載されている例示的な実施形態に限定されるものではない。そうではなく、本発明の範囲および主旨は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。

Claims (57)

  1. 哺乳動物の網膜の錐体細胞における導入遺伝子の増強された発現のためのポリヌクレオチドカセットであって、
    （ａ）網膜錐体細胞に特異的なプロモーター領域と、
    （ｂ）前記プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と、
    （ｃ）ポリアデニル化部位と
    を含む、ポリヌクレオチドカセット。
  2. 前記プロモーター領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、および配列番号８３からなる群より選択される配列、またはその機能性断片に対して８５％またはそれ超の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドカセット。
  3. 前記プロモーター領域が、配列番号５５の全長またはその機能性断片に対して８５％またはそれ超の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列から本質的になる、請求項２に記載のポリヌクレオチドカセット。
  4. 前記コード配列の５’側にある非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
  5. 前記コード配列の５’側にある非翻訳領域をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、および配列番号８９からなる群より選択される配列、またはその断片に対して８５％またはそれ超の配列同一性を有する配列を含む、請求項４に記載のポリヌクレオチドカセット。
  6. 前記コード配列の５’側にある前記非翻訳領域が、ポリヌクレオチドＡＴＧを含まない、請求項４または５に記載のポリヌクレオチドカセット。
  7. 前記コード配列の５’側にある非翻訳領域をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号８５もしくは配列番号８６の全長、またはその断片に対して８５％またはそれ超の配列同一性を有する配列から本質的になる、請求項４に記載のポリヌクレオチドカセット。
  8. イントロンをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
  9. 前記イントロンが、配列番号５、配列番号５９、および配列番号６０からなる群より選択される配列に対して８５％またはそれ超の配列同一性を有する配列を含む、請求項８に記載のポリヌクレオチドカセット。
  10. 前記イントロンが、前記コード配列の５’側にある非翻訳領域をコードする前記ポリヌクレオチド配列内に位置する、請求項９に記載のポリヌクレオチドカセット。
  11. 翻訳開始配列をさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
  12. 前記翻訳開始配列が、配列番号７２または配列番号７３から本質的になるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載のポリヌクレオチドカセット。
  13. 配列番号５２またはその機能性断片に対して８５％またはそれ超の配列同一性を有するエンハンサー配列をさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
  14. 前記エンハンサー配列が、配列番号５１の全長に対して８５％またはそれ超の配列同一性を有する配列から本質的になる、請求項１３に記載のポリヌクレオチドカセット。
  15. 前記コード配列の発現が、哺乳動物の錐体細胞に導入した際、前記プロモーター領域を配列番号１のプロモーター領域で置き換えた場合の前記コード配列の発現よりも大きい、請求項１から１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
  16. ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質と、
    ｂ）ＡＡＶ ＩＴＲが隣接した請求項１から１５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセットと
    を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
  17. 請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセットまたは請求項１６に記載のｒＡＡＶと医薬賦形剤とを含む医薬組成物。
  18. 錐体細胞において導入遺伝子を発現させるための方法であって、
    １つまたは複数の錐体細胞に、請求項１から１５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセットまたは請求項１６に記載の組換えアデノ随伴ウイルスを有効量で接触させるステップ
    を含み、前記導入遺伝子が、１つまたは複数の前記錐体細胞において検出可能なレベルで発現される、方法。
  19. 前記錐体細胞における発現を検出するステップを含み、発現が、前記錐体細胞の６０％またはそれ超で検出される、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記導入遺伝子が、錐体細胞において特異的に検出可能なレベルで発現される、請求項１９に記載の方法。
  21. 錐体細胞障害に対する治療または予防を必要とする哺乳動物における錐体細胞障害を治療または予防するための方法であって、前記哺乳動物の眼に請求項１７に記載の医薬組成物を有効量で投与するステップを含み、コード配列が治療用遺伝子産物をコードするものである、方法。
  22. 前記錐体細胞障害が、黄斑ジストロフィー、色覚障害、または中心黄斑の視覚障害である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記色覚障害が、１色覚、青錐体１色覚、１型色覚、２型色覚、および３型色覚からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
  24. 疾患の症状の変化を検出するステップをさらに含み、前記変化が、前記哺乳動物の色を知覚する能力の増大を含む、請求項２２または２３に記載の方法。
  25. 前記黄斑ジストロフィーが、スタルガルト黄斑ジストロフィー、錐体ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、脊髄小脳失調症７型、およびバルデー・ビードル症候群−１からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
  26. 前記中心黄斑の視覚障害が、加齢黄斑変性症、黄斑部毛細血管拡張症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、緑内障、ソースビー眼底変性症、成人卵黄様黄斑ジストロフィー、ベスト病、杆体錐体ジストロフィー、レーバー先天性黒内障、およびＸ連鎖性網膜分離症からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
  27. 疾患の症状の変化を検出するステップをさらに含み、前記変化が、前記哺乳動物の視力喪失の速度の低減を含む、請求項２５または２６に記載の方法。
  28. 哺乳動物の網膜の錐体細胞における導入遺伝子の増強された発現のためのポリヌクレオチドカセットであって、
    （ａ）網膜錐体細胞に特異的なプロモーター領域と、
    （ｂ）前記プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と、
    （ｃ）ポリアデニル化部位と
    を含む、ポリヌクレオチドカセット。
  29. 哺乳動物の網膜の錐体細胞における導入遺伝子の増強された発現のためのポリヌクレオチドカセットであって、
    （ａ）網膜錐体細胞に特異的なプロモーター領域と、
    （ｂ）５’非翻訳領域と、
    （ｃ）イントロンと、
    （ｄ）翻訳開始配列と、
    （ｅ）前記プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と、
    （ｆ）ポリアデニル化部位と
    を含む、ポリヌクレオチドカセット。
  30. 転写開始部位と前記翻訳開始部位との間の配列が、ポリヌクレオチドＡＴＧを含有しない、請求項２８または２９に記載のポリヌクレオチドカセット。
  31. 前記プロモーター領域が４９２塩基対未満の長さである、請求項２８または２９に記載のポリヌクレオチドカセット。
  32. 前記プロモーター領域を用いた前記コード配列の発現が、配列番号１として列挙されているプロモーター領域を用いた発現よりも大きい、請求項２８または２９に記載のポリヌクレオチドカセット。
  33. 転写開始部位と前記コード配列の末端との間の配列が、５００ヌクレオチド超の長さである前記導入遺伝子のオープンリーディングフレーム以外のオープンリーディングフレームを含有しない、請求項２８または２９に記載のポリヌクレオチドカセット
  34. 転写開始部位と前記コード配列の末端との間の配列が、２５０ヌクレオチド超の長さである前記導入遺伝子のオープンリーディングフレーム以外のオープンリーディングフレームを含有しない、請求項２８または２９に記載のポリヌクレオチドカセット。
  35. 転写開始部位と前記コード配列の末端との間の配列が、１００ヌクレオチド超の長さである前記導入遺伝子のオープンリーディングフレーム以外のオープンリーディングフレームを含有しない、請求項２８または２９に記載のポリヌクレオチドカセット。
  36. 前記コード配列についてのオープンリーディングフレーム以外に２７３ｂｐ超のオープンリーディングフレームを含有しない、請求項２８または２９に記載のポリヌクレオチドカセット。
  37. 前記コード配列が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、ならびに（ｉ）Ｔｈｒ６５Ｉｌｅ（ｉｉ）Ｉｌｅ１１１Ｖａｌ（ｉｉｉ）Ｓｅｒ１１６Ｔｙｒ（ｉｖ）Ｌｅｕ１５３Ｍｅｔ（ｖ）Ｉｌｅ１７１Ｖａｌ（ｖｉ）Ａｌａ１７４Ｖａｌ（ｖｉｉ）Ｉｌｅ１７８Ｖａｌ（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ１８０Ａｌａ（ｉｘ）Ｉｌｅ２３０Ｔｈｒ（ｘ）Ａｌａ２３３Ｓｅｒ（ｘｉ）Ｖａｌ２３６Ｍｅｔ（ｘｉｉ）Ｉｌｅ２７４Ｖａｌ（ｘｉｉｉ）Ｐｈｅ２７５Ｌｅｕ（ｘｉｖ）Ｔｙｒ２７７Ｐｈｅ（ｘｖ）Ｖａｌ２７９Ｐｈｅ（ｘｖｉ）Ｔｈｒ２８５Ａｌａ（ｘｖｉｉ）Ｐｒｏ２９８Ａｌａ、および（ｘｖｉｉｉ）Ｔｙｒ３０９Ｐｈｅからなる群より選択される配列番号１１の多形体からなる群より選択されるポリペプチドを含む治療用タンパク質をコードする、請求項２８または２９に記載のポリヌクレオチドカセット。
  38. 前記コード配列が、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、および配列番号７１からなる群より選択されるポリヌクレオチド、ならびに（ｉ）Ｔｈｒ６５Ｉｌｅ（ｉｉ）Ｉｌｅ１１１Ｖａｌ（ｉｉｉ）Ｓｅｒ１１６Ｔｙｒ（ｉｖ）Ｌｅｕ１５３Ｍｅｔ（ｖ）Ｉｌｅ１７１Ｖａｌ（ｖｉ）Ａｌａ１７４Ｖａｌ（ｖｉｉ）Ｉｌｅ１７８Ｖａｌ（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ１８０Ａｌａ（ｉｘ）Ｉｌｅ２３０Ｔｈｒ（ｘ）Ａｌａ２３３Ｓｅｒ（ｘｉ）Ｖａｌ２３６Ｍｅｔ（ｘｉｉ）Ｉｌｅ２７４Ｖａｌ（ｘｉｉｉ）Ｐｈｅ２７５Ｌｅｕ（ｘｉｖ）Ｔｙｒ２７７Ｐｈｅ（ｘｖ）Ｖａｌ２７９Ｐｈｅ（ｘｖｉ）Ｔｈｒ２８５Ａｌａ（ｘｖｉｉ）Ｐｒｏ２９８Ａｌａ、および（ｘｖｉｉｉ）Ｔｙｒ３０９Ｐｈｅからなる群より選択される配列番号１１の多形体をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２８または２９に記載のポリヌクレオチドカセット。
  39. 前記プロモーター領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５３、配列番号５４、および配列番号５５からなる群より選択される配列を含む、請求項２８または２９に記載のポリヌクレオチドカセット。
  40. 哺乳動物における錐体細胞遺伝子療法のための方法であって、錐体細胞遺伝子療法を必要とする哺乳動物の眼に、
    （ａ）網膜錐体細胞に特異的なプロモーター領域と、
    （ｂ）前記プロモーター領域に作動可能に連結した、治療薬をコードするコード配列と
    を含むポリヌクレオチドカセットを含む組換え遺伝子送達ベクターを投与するステップを含み、
    前記哺乳動物の錐体細胞における前記治療薬のｉｎ ｖｉｖｏ発現が、錐体細胞遺伝子療法を必要とする前記哺乳動物の治療に役立つ、方法。
  41. 哺乳動物における錐体細胞遺伝子療法のための方法であって、錐体細胞遺伝子療法を必要とする前記哺乳動物の眼に、
    （ａ）網膜錐体細胞に特異的なプロモーター領域と、
    （ｂ）５’非翻訳領域と、
    （ｃ）イントロンと、
    （ｄ）翻訳開始配列と、
    （ｅ）前記プロモーター領域に作動可能に連結した、治療薬をコードするコード配列と
    を含むポリヌクレオチドカセットを含む組換え遺伝子送達ベクターを投与するステップを含み、
    前記哺乳動物の錐体細胞における前記治療薬のｉｎ ｖｉｖｏ発現が、錐体細胞遺伝子療法を必要とする前記哺乳動物の治療に役立つ、方法。
  42. 前記遺伝子療法が、錐体細胞障害の治療に役立つ、請求項４０または４１に記載の方法。
  43. 前記遺伝子療法が、分泌タンパク質の送達に役立つ、請求項４０または４１に記載の方法。
  44. 前記イントロンが、配列番号５、配列番号５９、および配列番号６０からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の方法。
  45. 前記錐体細胞障害が、青錐体１色覚、１型２色覚、２型２色覚、１型３色覚、２型３色覚、１色覚、不完全１色覚、杆体錐体変性症、網膜色素変性症（ＲＰ）、黄斑変性症、錐体ジストロフィー、失明、スタルガルト病、およびレーバー先天性黒内障からなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
  46. 前記プロモーターが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、および配列番号５５からなる群より選択される配列を含む、請求項４０または４１に記載の方法。
  47. 前記遺伝子送達ベクターが、前記プロモーターの上流にエンハンサーエレメントをさらに含み、前記遺伝子が前記エンハンサーエレメントに作動可能に連結している、請求項４０または４１に記載の方法。
  48. 前記遺伝子送達ベクターが、スプライスドナー／アクセプター領域を含むイントロンをさらに含み、前記イントロンが、前記プロモーター領域の下流に位置し、かつ遺伝子の上流に位置する、請求項４０に記載の方法。
  49. 前記コード配列が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、ならびに：（ｉ）Ｔｈｒ６５Ｉｌｅ（ｉｉ）Ｉｌｅ１１１Ｖａｌ（ｉｉｉ）Ｓｅｒ１１６Ｔｙｒ（ｉｖ）Ｌｅｕ１５３Ｍｅｔ（ｖ）Ｉｌｅ１７１Ｖａｌ（ｖｉ）Ａｌａ１７４Ｖａｌ（ｖｉｉ）Ｉｌｅ１７８Ｖａｌ（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ１８０Ａｌａ（ｉｘ）Ｉｌｅ２３０Ｔｈｒ（ｘ）Ａｌａ２３３Ｓｅｒ（ｘｉ）Ｖａｌ２３６Ｍｅｔ（ｘｉｉ）Ｉｌｅ２７４Ｖａｌ（ｘｉｉｉ）Ｐｈｅ２７５Ｌｅｕ（ｘｉｖ）Ｔｙｒ２７７Ｐｈｅ（ｘｖ）Ｖａｌ２７９Ｐｈｅ（ｘｖｉ）Ｔｈｒ２８５Ａｌａ（ｘｖｉｉ）Ｐｒｏ２９８Ａｌａ、および（ｘｖｉｉｉ）Ｔｙｒ３０９Ｐｈｅからなる群より選択される配列番号１１の多形体からなる群より選択されるポリペプチドを含む治療用タンパク質をコードする、請求項４０または４１に記載の方法。
  50. 前記コード配列が、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、および配列番号７１からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む治療用タンパク質をコードする、請求項４０に記載の方法。
  51. 前記遺伝子送達ベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子送達ベクターを含む、請求項４０、４１または４６に記載の方法。
  52. 前記哺乳動物において視覚的能力を回復させる、請求項４０、４１または４６に記載の方法。
  53. 前記哺乳動物が、青錐体１色覚、１型２色覚、２型２色覚、１型３色覚、２型３色覚に罹患している霊長類であり、前記霊長類が、前記療法の結果として新しい色を見ることが可能になる、請求項４０、４１または４６に記載の方法。
  54. 前記プロモーターが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、および配列番号５５からなる群より選択される配列を含み、遺伝子が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、ならびに（ｉ）Ｔｈｒ６５Ｉｌｅ（ｉｉ）Ｉｌｅ１１１Ｖａｌ（ｉｉｉ）Ｓｅｒ１１６Ｔｙｒ（ｉｖ）Ｌｅｕ１５３Ｍｅｔ（ｖ）Ｉｌｅ１７１Ｖａｌ（ｖｉ）Ａｌａ１７４Ｖａｌ（ｖｉｉ）Ｉｌｅ１７８Ｖａｌ（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ１８０Ａｌａ（ｉｘ）Ｉｌｅ２３０Ｔｈｒ（ｘ）Ａｌａ２３３Ｓｅｒ（ｘｉ）Ｖａ１２３６Ｍｅｔ（ｘｉｉ）Ｉｌｅ２７４Ｖａｌ（ｘｉｉｉ）Ｐｈｅ２７５Ｌｅｕ（ｘｉｖ）Ｔｙｒ２７７Ｐｈｅ（ｘｖ）Ｖａ１２７９Ｐｈｅ（ｘｖｉ）Ｔｈｒ２８５Ａｌａ（ｘｖｉｉ）Ｐｒｏ２９８Ａｌａ、および（ｘｖｉｉｉ）Ｔｙｒ３０９Ｐｈｅからなる群より選択される配列番号１１の多形体からなる群より選択される配列を含むポリペプチドをコードする、請求項４０または４１に記載の方法。
  55. 前記哺乳動物が、光受容体は健康である視覚障害を有する霊長類である、請求項４０または４１に記載の方法。
  56. 請求項１、２８、または２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセットを含むパッケージされたウイルス粒子を含む製剤。
  57. 請求項１、２８、または２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセットを用いてトランスフェクトまたは形質導入された組換え宿主細胞。
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