KR20210100746A - 원추세포에서 증강된 유전자 발현을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

원추세포에서 증강된 유전자 발현을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 개시는 폴리뉴클레오티드 카세트, 발현 벡터 및 원추세포에서 유전자의 발현 방법을 제공한다.

Description

원추세포에서 증강된 유전자 발현을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCED GENE EXPRESSION IN CONE CELLS}
관련 출원의 교차 참조
35 U.S.C. § 119 (e)에 따라서, 본 출원은, 그의 전체 개시가 참조로서 본원에 포함되는, 2014년 3월 17일자로 출원된 미국 가특허출원 번호 제61/954,330호; 및 2015년 3월 2일자로 출원된 미국 가특허출원 번호 제62/127,185호의 출원일에 대해 우선권을 주장한다.
서열 목록에 대한 진술
본 출원과 연관된 서열목록이 종이 사본 대신에 text 포맷으로 제공되고, 이에 명세서 내에 참조로서 포함된다. 서열목록을 함유하는 text 파일의 명칭은 AVBI_005_02WO_ST25.txt이다. 이 text 파일은 308 KB이고, 2015년 3월 17일자에 생성되었으며, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되었다.
기술 분야
본 발명은 망막 장애 (retinal disorder)의 유전자 요법에 관한 것이다.
눈의 시각 장애는 종종 원추세포에서 알려된 일차적인 결함에 관련된다. 이에는 스타가르트 황반 이영양증, 원추 이영양증, 원추-간상 이영양증, 척수소뇌성 실조증 유형 7, 및 바르데-비들 증후군-1과 같은 황반 이영양증뿐만 아니라, 색맹, 청색 원추 단색형색각, 및 적색각이상, 녹색각이상, 및 청색각이상 결함을 비롯한 색각 장애가 포함된다.
원인이 원추 광수용체에 본질적인 것으로 알려진 이들 장애에 덧붙여, 원추세포를 표적함으로써 치료될 수 있는 중심 황반의 시각 장애 (영장류 내)가 있다. 이들에는 연령-관련 황반변성, 황반 모세혈관확장증, 막망 색소변성증, 당뇨병성 망막증, 망막 정맥 폐색, 녹내장, 솔스비 안저 이상증, 성인 난환형 황반 이영양증, 베스트병, 및 X-연관 망막분리가 포함된다.
기존 치료의 한계를 해소하는 안과 질환을 치료 및 예방하는 유망한 접근법이 아데노-연관 바이러스 (AAV)와 같은 유전자 요법 벡터를 이용한 눈으로의 치료제의 전달이다. AAV는 4.7 kb, 단일 가닥 DNA 바이러스이다. 야생형 AAV가 비병원성이고 임의의 공지된 질환과 어떠한 병인학적 연관도 없기 때문에, AAV 기반 재조합 벡터는 우수한 임상적 안전성과 연관이 있다. 또한, AAV는 매우 효과적인 유전자 발현 능력 및 눈, 근육, 폐 및 뇌를 비롯한 다수의 조직에서 지속적인 전이유전자의 발현을 제공한다. 나아가, AAV는 인간 임상 시험에서 유망한 것으로 나타났다. 일 예시가 rAAV 벡터의 단일 망막하 투여에 의해 전달된 치료제로 처치된 환자가 치료 개시일로부터 4년 이상 치료제의 발현으로부터 지속적인 임상적 이익을 경험하였던 레베르 선천성 흑암시이다.
일반적으로 눈질환 및 구체적으로 원추세포를 치료하기 위한 유전자 요법에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드 카세트 및 발현 벡터의 설계와 관련한 다수의 도전에 직면해 있다. 하나의 유의미한 도전이 표적 세포, 특히 망막의 원추세포에서 전이유전자의 충분한 발현을 획득하고 있다. 당해 분야의 오랫동안 지속되온 충족되지 않은 요구는 유전자 전달에 이은 전이유전자의 충분히 강력한 발현이었다. 일부 경우에, 더욱 효율적인 발현은 특정 벡터, 예를 들어 플라스미드 DNA 벡터의 효능에 대해 요구된다. 다른 경우에, 더욱 효율적인 유전자 발현 카세트는 더 유리한 안정성 프로파일 또는 덜 침습적인 투여 경로 (예컨대, 유리체 내 vs. 망막하)를 갖는 더 낮은 치료적 용량을 허용하기에 바람직하다. 일부 설정에서, 효과적인 발현이 강력한, 편재성 프로모터를 사용하여 달성되었지만, 표적 세포 유형에서만 발현되는 핵산 발현 카세트를 사용하여 높은 전이유전자 발현을 갖는 것이 종종 바람직하다.
원추세포에서 전이유전자를 발현시키기 위한, 예를 들어 미국특허출원 제2012/0172419호에 개시된 바와 같은, 이전의 노력은 약간의 유망함을 나타내었지만, 종종 발현 수준이 최적 미만이거나 세포 특이적이지 않았다. 다수의 시각 장애가 원추세포의 일차적 결함에서 비롯된다는 점을 감안하면, 높은 발현 수준으로, 원추세포에서의 전이유전자의 특이적 발현은 당해 분야에서 의미 심장한 발전을 나타낼 것이다. 따라서, 원추세포에서 유전자 발현을 위한 개선된 방법 및 최적화된 핵산 카세트 및 벡터가 여전히 요구된다.
본 발명은 원추세포에서 유전자의 발현을 위한 폴리뉴클레오티드 카세트, 발현 벡터 및 방법을 제공한다.
발명의 일부 측면에서, 포유동물 망막의 원추세포에서 전이유전자의 발현을 위해 폴리뉴클레오티드 카세트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 전이유전자의 발현은 증강된 발현이다. 특정 실시양태에서, 코딩 서열의 발현은 서열번호 1에 작동가능하게 연결된 전이유전자의 발현보더 더 높다. 일부 실시양태에서, 전이유전자의 발현은 원추체-특이적이다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트는 망막 원추세포에서 유전자의 발현을 촉진하는 프로모터 영역; 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현은 원추세포에서 특이적이다. 일부 이러한 실시양태에서, 프로모터 영역은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81. 서열번호 82, 및 서열번호 83로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 영역은 492개 미만 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 프로모터 영역은 서열번호 55의 전장에 대해 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 단편으로 필수적으로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트는, 본원에서 5'UTR로 언급되는, 코딩 서열에 대한 5' 비번역 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 5'UTR은 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 및 서열번호 89로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5'UTR 서열의 일부 또는 전부는, 예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 또는 서열번호 79에 기술된 바와 같은 프로모터 영역으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 5'UTR 서열은 프로모터 서열에 대해 이종이다. 일부 실시양태에서, 5'UTR은 서열번호 85 또는 서열번호 86의 전장에 대해 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 단편으로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 5'UTR은 폴리뉴클레오티드 ATG를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트는 인트론을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 인트론은 서열번호 5, 서열번호 59, 및 서열번호 60으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인트론은 5'UTR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 내부에 위치한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트는 번역 개시 서열을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 번역 개시 서열은 서열번호 72 또는 서열번호 73으로 필수적으로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트는 인핸서 서열을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 인핸서 서열은 서열번호 52에 대해 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인핸서 서열은 서열번호 51의 전장에 대해 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열로 필수적으로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코딩 서열은 프로모터 영역 및/또는 5'UTR 서열에 대해 이종이다. 일부 실시양태에서, 코딩 서열은 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 및 (i) Thr65Ile (ii) Ile111Val (iii) Ser116Tyr (iv) Leu153Met (v) Ile171Val (vi) Ala174Val (vii) Ile178Val (viii) Ser180Ala (ix) Ile230Thr (x) Ala233Ser (xi) Val236Met (xii) Ile274Val (xiii) Phe275Leu (xiv) Tyr277Phe (xv) Val279Phe (xvi) Thr285Ala (xvii) Pro298Ala; 및 (xviii) Tyr309Phe로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열번호 11의 다형체에 적어도 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 코딩 서열은 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 또는 서열번호 71에 대해 적어도 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 전사 개시 부위와 코딩 서열의 말단 사이의 서열은 전이유전자 개방 판독 프레임 (open reading frame) 이외에, 500개 초과의 뉴클레오티드 길이인 개방 판독 프레임을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 전사 개시 부위와 코딩 서열의 말단 사이의 서열은 전이유전자 개방 판독 프레임 이외에, 273개 초과의 뉴클레오티드 길이인 개방 판독 프레임을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 전사 개시 부위와 코딩 서열의 말단 사이의 서열은 전이유전자 개방 판독 프레임 이외에, 250개 초과의 뉴클레오티드 길이인 개방 판독 프레임을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 코딩 서열의 적어도 하나의 개방 판독 프레임이 제거되어 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 망막 원추세포에서 유전자의 발현을 촉진하는 프로모터 영역; 5' 비번역 영역; 인트론; 번역 개시 서열; 프로모터 영역에 작동가능하게 연결된 코딩 서열; 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 망막 원추세포에서 특이적으로 유전자의 발현을 촉진하는 프로모터 영역; 5' 비번역 영역; 인트론; 번역 개시 서열; 프로모터 영역에 작동가능하게 연결된 코딩 서열; 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다.
발명의 일부 측면에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 유전자 전달 벡터는 재조합 아데노-연관 바이러스이고, 재조합 아데노-연관 바이러스는 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 야생형 AAV 캡시드 단백질이다. 다른 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 변이체 AAV 캡시드 단백질이다. 특정 실시양태에서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 LGETTRP (서열번호 96), NETITRP (서열번호 97), KAGQANN (서열번호 98), KDPKTTN (서열번호 99), KDTDTTR (서열번호 100), RAGGSVG (서열번호 101), AVDTTKF (서열번호 102), 및 STGKVPN (서열번호 103)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 AAV GH 루프 (loop) 내에 펩티드 삽입을 포함한다.
발명의 일부 측면에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 및 약제학적 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 유전자 전달 벡터 및 약제학적 부형제를 포함한다.
발명의 일부 측면에서, 원추세포에서 전이유전자를 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 원추세포를 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 또는 본 발명의 유전자 전달 벡터의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하고, 전이유전자는 하나 이상의 원추세포에서 검출가능한 수준으로 발현된다. 일부 실시양태에서, 방법은 시험관 내이다. 다른 실시양태에서, 방법은 생체 내이다. 특정의 이러한 실시양태에서, 접촉은 포유동물 눈의 유리체 내로 폴리뉴클레오티드 카세트 또는 유전자 전달 벡터의 주입을 포함한다. 다른 이러한 실시양태에서, 방법은 포유동물 눈의 망막하 공간 내로 폴리뉴클레오티드 카세트 또는 유전자 전달 벡터의 주입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 원추세포에서 전이유전자의 발현을 검출하는 것을 추가로 포함하고, 발현은 원추세포의 80% 이상에서 검출된다. 일부 실시양태에서, 발현은 원추세포에 특이적이다.
발명의 일부 측면에서, 원추세포 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 포유동물에서 원추세포 장애의 치료 또는 예방을 위한 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량을 포유동물의 눈에 투여하는 것을 포함하고, 코딩 서열은 치료적 유전자 산물을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 투여는 포유동물 눈의 유리체 내로 약제학적 조성물의 주입을 포함한다. 다른 이러한 실시양태에서, 방법은 포유동물 눈의 망막하 공간 내로 약제학적 조성물의 주입을 포함한다.
일부 실시양태에서, 원추세포 장애는 색각 장애이다. 특정 실시양태에서, 색각 장애는 색맹, 청색 원추 단색형색각, 적색각이상 결함, 녹색각이상 결함, 및 청색각이상 결함으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 이러한 실시양태에서, 방법은 질환 증상의 변화를 검출하는 것을 추가로 포함하고, 변화는 색깔을 인식하는 포유동물의 능력의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 원추세포 장애는 황반 이영양증이다. 특정 실시양태에서, 황반 이영양증은 스타가르트 황반 이영양증, 원추 이영양증, 원추-간상 이영양증, 척수소뇌성 실조증 유형 7, 및 바르데-비들 증후군-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 원추세포 장애는 중심 황반의 시각 장애이다. 특정 실시양태에서, 중심 황반의 시각 장애는 연령-관련 황반변성, 황반 모세혈관확장증, 막망 색소변성증, 당뇨병성 망막증, 망막 정맥 폐색, 녹내장, 솔스비 안저 이상증, 성인 난환형 황반 이영양증, 베스트병, 간상-원추 이영양증, 레베르 선천성 흑암시, 및 X-연관 망막분리로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 이러한 실시양태에서, 방법은 질환 증상의 변화를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 변화는 원추세포의 건강상태의 안정화 및/또는 포유동물의 시력 상실률의 감소를 포함한다. 특정의 이러한 실시양태에서, 변화는 원추세포의 건강상태의 개선 및/또는 포유동물의 시력의 개선을 포함한다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, "벡터"는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 이와 연관되고 세포에 폴리뉴클레오티드의 전달을 매개하는데 사용될 수 있는 거대분자 또는 거대분자들의 연합을 지칭한다. 예시적인 벡터에는, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀, 및 기타 유전자 전달 비히클이 포함된다.
용어 "AAV"는 아데노-연관 바이러스의 약어이고, 바이러스 자체 또는 이의 유도체를 지칭하는데 사용될 수 있다. 용어는, 달리 요구되는 경우를 제외하고, 모든 아형과 자연 발생적인 형태 및 재조합 형태 둘 모두를 포함한다. 용어 "AAV"에는 AAV 유형 1 (AAV-1), AAV 유형 2 (AAV-2), AAV 유형 3 (AAV-3), AAV 유형 4 (AAV-4), AAV 유형 5 (AAV-5), AAV 유형 6 (AAV-6), AAV 유형 7 (AAV-7), AAV 유형 8 (AAV-8), 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 및 양 AAV가 포함된다. "영장류 AAV"는 영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하고, "비-영장류 AAV"는 비-영장류 포유동물을 감염시키는 AAV를 지칭하며, "소 AAV"는 소과 포유동물을 감염시키는 AAV를 지칭한다.
"AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "rAAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 (전형적으로 야생형 AAV의 모든 캡시드 단백질에 의함)로 이루어진 바이러스 입자 및 캡시드 조립된 (encapsidated) 폴리뉴클레오티드 rAAV 벡터를 지칭한다. 입자가 이종 폴리뉴클레오티드 (즉, 포유동물 세포에 전달되는 전이유전자와 같이 야생형 AAV 게놈이 아닌 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 경우, 이는 전형적으로 "rAAV 벡터 입자" 또는 간단히 "rAAV 벡터"로 지칭된다. 따라서, rAAV 입자의 생성은 이러한 벡터가 rAAV 입자 내에 함유되기 때문에, rAAV 벡터의 생성을 필연적으로 포함한다.
본 발명의 AAV 바이러스 벡터와 관련하여 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "복제 결함"은 AAV 벡터가 독립적으로 복제하고 그의 게놈을 패키징할 수 없는 것을 의미한다. 예를 들어, 개체의 세포가 rAAV 비리온에 감염된 경우, 이종 유전자는 감염된 세포에서 발현되지만, 감염된 세포에 AAV rep 및 cap 유전자 및 부속 기능 유전자가 결여되어 있다는 사실로 인해, rAAV는 더 이상 복제를 할 수 없다.
본원에 사용된 바와 같이, "AAV 변이체" 또는 "AAV 변형체"는: a) 변이체 AAV 캡시드 단백질이 상응하는 모체 AAV 캡시드 단백질에 대해 적어도 하나의 아미노산 차이 (예컨대, 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실)를 포함하고, 변이체 캡시드 단백질이 상응하는 모체 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 세포의 감염성에 비해 망막 세포의 증가된 감염성을 부여하고, AAV 캡시드 단백질이 자연 발생적인 AAV 캡시드 단백질에 존재하는 아미노산 서열을 포함하지 않는, 변이체 AAV 캡시드 단백질; 및 b) 이종 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산으로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다.
약어 "rAAV"는 재조합 아데노-연관 바이러스를 지칭하고, 재조합 AAV 벡터 (또는 "rAAV 벡터")로도 언급된다. 본원에 사용된 바와 같이 "rAAV 벡터"는 AAV 기원이 아닌 폴리뉴클레오티드 서열 (즉, AAV에 이종인 폴리뉴클레오티드), 전형적으로 세포의 유전적 형질전환을 위한 관심 서열을 포함하는 AAV 벡터를 지칭한다. 일반적으로, 이종 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나, 일반적으로 2개의 AAV 역방향 말단 반복 서열 (ITR)에 의해 연접된다 (flanked). 용어 rAAV 벡터는 rAAV 벡터 입자 및 rAAV 벡터 플라스미드 둘 모두를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자" 또는 "코딩 서열"은 유전자 산물을 인코딩하는 시험관 내 또는 생체 내 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일부 경우에, 유전자는 코딩 서열, 즉 유전자 산물을 인코딩하는 서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어진다. 다른 경우에, 유전자는 부가적인, 비-코딩 서열을 포함한다. 예를 들어, 유전자는 코딩 서열 이전 및 이후의 영역, 예컨대 5' 비번역 (5' UTR) 또는 "리더" 서열 및 3' UTR 또는 "트레일러" 서열, 뿐만 아니라 개별적인 코딩 분절들 (엑손) 사이의 개재 서열 (인트론)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료적 유전자"는 발현되는 경우, 이들이 존재하는 세포 또는 조직에, 또는 그 유전자가 발현되는 포유동물에 유익한 효과를 부여하는 유전자를 지칭한다. 유익한 효과의 예시는 병태 또는 질환의 징후 또는 증상의 완화, 병태 또는 질환의 예방 또는 억제, 바람직한 특성의 부여를 포함한다. 치료적 유전자는 세포 또는 포유동물에서 유전적 결함을 교정하는 유전자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 전이유전자는 벡터에 의해 세포에 전달되는 유전자이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 산물"은 폴리펩티드, 펩티드, 단백질 또는 작은 간섭 RNA (siRNA), miRNA 또는 작은 헤어핀 RNA (shRNA)를 비롯한 간섭 RNA와 같은 폴리뉴클레오티드 서열의 바람직한 발현 산물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드," "펩티드," 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 폴리머를 지칭한다. 이 용어는 또한 변형, 예를 들어 이황화 결합 형성, 당화, 지질화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합이 도입되어 있는 아미노산 폴리머를 포함한다.
"포함하는"은, 언급된 요소들이, 예를 들어 조성물, 방법, 키트 등에 요구되지만, 다른 요소들이 특허청구범위의 범주 내에서, 예를 들어 조성물, 방법, 키트 등을 형성하기 위해 포함될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 프로모터에 작동가능하게 연결된 치료적 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 "포함하는" 발현 카세트는 유전자 및 프로모터에 덧붙여 다른 요소들, 예컨대 폴리-아데닐화 서열, 인핸서 요소, 기타 유전자, 링커 도메인 등을 포함할 수 있는 발현 카세트이다.
"필수적으로 이루어진"은, 예를 들어, 조성물, 방법, 키트 등의 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 특정된 재료 또는 단계로 기술된, 예를 들어 조성물, 방법, 키트 등의 범주의 제한을 의미한다. 예를 들어, 프로모터에 작동가능하게 연결된 치료적 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자 및 폴리아데닐화 서열로 "필수적으로 이루어진" 발현 카세트는, 이들이 유전자의 전사 또는 번역에 실질적으로 영향을 미치지 않는 한, 부가적인 서열, 예컨대 링커 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예시로서, 언급된 서열로 "필수적으로 이루어진" 변이체, 또는 변이체, 폴리펩티드 단편은 언급된 서열의 아미노산 서열에 플러스 마이너스 이것이 유래하는 전장의 나이브 (naive) 폴리펩티드를 기준으로 이 서열의 경계에 약 10개 아미노산, 예컨대 언급된 경계 아미노산 잔기의 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 잔기 미만, 또는 언급된 경계 아미노산 잔기의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 잔기 초과를 갖는다.
"이루어진"은, 조성물, 방법 또는 키트로부터 특허청구범위에 특정되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분의 배제를 의미한다. 예를 들어, 프로모터에 작동가능하게 연결된 치료적 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자, 및 폴리아데닐화 서열로 "이루어진" 발현 카세트는 프로모터, 치료적 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 폴리아데닐화 서열로만 이루어진다. 또 다른 예시로서, 언급된 서열로 "이루어진" 폴리펩티드는 언급된 서열만을 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "서열 동일성", 예컨대 "% 서열 동일성"은 뉴클레오티드 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬되는 경우 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 사이; 또는 아미노산 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬되는 경우 2개 이상의 폴리펩티드 서열 사이의 동일성의 정도를 지칭한다. 유사하게, 2개 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 맥락에서 본원에 사용되는 경우 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은, 예를 들어 스미스-워터만 (Smith-Waterman) 알고리즘 등과 같은 서열 비교 알고리즘을 사용하여 또는 시각적 검사에 의해 측정되는 바와 같이, 최대 상응성에 대해 비교되고 정렬되는 경우 동일하거나 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정된 배율을 갖는 2개의 서열을 지칭한다. 예를 들어, 2개 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 블로섬 (Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램 내로 포함된 니들만 및 분쉬 (Needleman and Wunsch) 알고리즘 (1970, J. Mol. Biol. 48: 444-453)을 사용하여 결정될 수 있다. 또 다른 예시로서, 2개 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 특히 바람직한 파라미터 세트 (및 달리 명시되지 않는 한 사용되어야 하는 것)는 갭 패널티 12, 갭 연장 패널티 4, 및 프레임쉬프트 갭 패널티 5를 이용한 블로섬 62 스코어링 매트릭스이다. 2개 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 또한 PAM120 가중치 잔기표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 포함된 E. 메이어 및 W. 밀러의 알고리즘 (1989, Cabios, 4: 11-17)을 사용하여 결정할 수 있다. 본원에 기술된 핵산 및 단백질 서열은, 예를 들어 다른 패밀리 일원 또는 관련 서열을 동정하기 위하여 공공의 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "조회 서열"로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al., 1990, J. Mol. Biol, 215: 403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 본 발명의 핵산 분자에 동종인 뉴클레오티드 서열을 획득하기 위하여 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어 길이 = 12를 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질 분자에 동종인 아미노산 서열을 획득하기 위하여 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어 길이 = 3을 사용하여 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭화된 (gapped) 정렬을 획득하기 위하여, 갭화된 BLAST가 문헌 [Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res, 25: 3389-3402]에 기술된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 갭화된 BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각 프로그램 (예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.
용어 "% 상동성"은 본원에서 용어 "% 동일성"과 호환적으로 사용되고 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬되는 경우 2개 이상의 정렬된 서열 사이의 핵산 또는 아미노산 서열 동일성의 수준을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, 80% 상동성은 규정된 알고리즘에 의해 결정된 80% 서열 동일성과 같은 것을 의미하고, 따라서 소정의 서열의 동족체는 소정의 서열의 길이에 걸쳐서 80% 초과의 서열 동일성을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보" 및 "상보적인"은 역평행 뉴클레오티드 서열 내 상보적 염기 잔기들 사이에 수소 결합의 형성 시 서로 짝을 이룰 수 있는 2개의 역평행의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, shRNA는 표적 서열에 상보적일 수 있는데, 즉 100% 상보적, 또는 실질적으로 상보적, 예컨대 80% 상보적, 85% 상보적, 90% 상보적, 95% 상보적, 98% 상보적, 또는 그 이상일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어, "발현"은 세포에서 내인성 유전자, 전이유전자 또는 코딩 서열의 전사 및/또는 번역을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현 벡터"는 상기에 논의되거나 당해 분야에 공지된, 관심 유전자 산물을 암호화하고 의도된 표적 세포에서 유전자 산물의 발현을 초래하는데 사용되는 벡터, 예컨대 플라스미드, 미니서클 (minicircle), 바이러스 벡터, 리포좀 등을 포함한다. 발현 벡터는 또한 표적에서 유전자 산물의 발현을 용이하게 하기 위해 인코딩 영역에 작동가능하게 연결된 제어 요소를 포함한다. 프로모터, 인핸서, UTRs, miRNA 표적화 서열 등과 같은 제어 요소와, 발현을 위해 이들이 작동가능하게 연결되는 유전자 또는 유전자들의 조합은 종종 "발현 카세트"로 언급된다. 다수의 이러한 제어 요소가 공지되어 있고 당해 분야에서 이용가능하거나 당해 분야에서 이용가능한 성분들로부터 용이하게 제작될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프로모터"는 RNA 폴리머라제의 결합을 지시하여 그로써 RNA 합성을 촉진하는 DNA 서열, 즉 전사를 지시하기에 충분한 최소 서열을 포함한다. 프로모터 및 상응하는 단백질 또는 폴리펩티드 발현은 편재적일 수 있는데, 이는 광범위한 세포, 조직 및 종에서 또는 세포-유형 특이적, 조직-특이적, 또는 종-특이적으로 강력히 활성임을 의미한다. 프로모터는 지속적으로 활성임을 의미하는 "구성적"일 수 있거나, 또는 프로모터가 생물 또는 비생물 인자의 존재 또는 부재에 의해 활성화 또는 비활성화될 수 있음을 의미하는, "유도성"일 수 있다. 프로모터 서열과 인접하거나 인접하지 않을 수 있는 인핸서 서열이 또한 본 발명의 핵산 작제물 또는 벡터 내에 포함된다. 인핸서 서열은 프로모터-의존성 유전자 발현에 영향을 미치고 천연 유전자의 5' 또는 3' 영역에 위치할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "인핸서"는 인접한 유전자의 전사를 촉진하거나 억제하는 시스-작용성 요소를 포함한다. 전사를 억제하는 인핸서는 또한 "사일렌서 (silencer)"로 명명된다. 인핸서는 코딩 서열로부터 최대 수 킬로베이스 쌍 (kb)에 걸쳐서 전사된 영역의 하류 위치로부터, 어느 한 방향으로도 기능할 수 있다 (즉, 코딩 서열과 연합될 수 있다).
본원에 사용된 바와 같이, "종결 시그널 서열"은, 예를 들어 폴리아데닐화 시그널 서열과 같이, RNA 폴리머라제가 전사를 종결하게 만드는 임의의 유전적 요소를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "폴리아데닐화 시그널 서열"은 폴리아데닐화 컨센서스 서열 AATAAA에 수반되는 RNA 전사체의 엔도뉴클리아제 절단에 필요한 인식 영역을 포함한다. 폴리아데닐화 시그널 서열은 "폴리A 부위", 즉 아데닌 잔기가 전사 후 폴리아데닐화에 의해 부가될 RNA 전사체 상의 부위를 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "작동적으로 연결된" 또는 "작동가능하게 연결된"은 유전적 요소들, 예컨대 프로모터, 인핸서, 종결 시그널 서열, 폴리아데닐화 서열 등의 병렬구조를 지칭하는데, 여기서 요소들은 예상된 방식으로 작동하도록 이들을 허용하는 관계에 놓인다. 예를 들어, 만약 프로모터가 코딩 서열의 전사 개시에 기여한다면, 프로모터는 코딩 영역에 작동적으로 연결된다. 이 기능적 관계가 유지되는 한 모로모터와 코딩 영역 사이에 개재 잔기가 존재할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이종"은 그것이 비교되는 본질의 나머지 것으로부터 유전자형으로 구분되는 본질로부터 유래됨을 의미한다. 예를 들어, 유전공학 기술에 의해 상이한 종 유래의 플라스미드 또는 벡터 내로 도입된 폴리뉴클레오티드는 이종 폴리뉴클레오티드이다. 또 다른 예시로서, 그의 천연 코딩 서열로부터 제거되어 그에 연결됨이 자연적으로 발견되지 않는 코딩 서열에 작동적으로 연결된 프로모터는 이종 프로모터이다. 따라서, 예를 들어, 이종 유전자 산물을 인코딩하는 이종 핵산을 포함하는 rAAV는 자연-발생적인, 야생형 AAV에 일반적으로 포함되지 않는 핵산을 포함하는 rAAV이고, 인코딩된 이종 유전자 산물은 자연-발생적인 야생형 AAV에 의해 일반적으로 인코딩되지 않는 유전자 산물이다.
뉴클레오티드 분자 또는 유전자 산물과 관련하여 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "내인성"은 숙주 바이러스 또는 세포에서 자연 발생적이거나 이와 연합된 핵산 서열, 예컨대 유전자 또는 유전적 요소, 또는 유전자 산물, 예컨대 RNA, 단백질이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "천연"은 야생형 바이러스 또는 세포에 존재하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 유전자, 또는 유전자 산물, 예컨대 RNA, 단백질을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 레퍼런스 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열, 예를 들어 천연 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 변이체, 즉 레퍼런스 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 변이체를 지칭한다. 다르게 말하면, 변이체는 레퍼런스 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대 천연 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 비해 적어도 하나의 아미노산 차이 (예컨대, 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실)를 포함한다. 예를 들어, 변이체는 전장의 천연 폴리뉴클레오티드 서열과 70% 이상의 서열 동일성, 예컨대 전장의 천연 폴리뉴클레오티드 서열과 75% 또는 80% 이상의 동일성, 예컨대 85%, 90%, 또는 95% 이상, 예를 들어, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또 다른 예시로서, 변이체는 전장의 천연 폴리펩티드 서열에 70% 이상의 서열 동일성, 예컨대 전장의 천연 폴리펩티드 서열에 75% 또는 80% 이상의 동일성, 예컨대 85%, 90%, 또는 95% 이상, 예를 들어, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 변이체는 또한 레퍼런스, 예컨대 천연 서열의 단편과 70% 이상의 서열 동일성, 예컨대 천연 서열과 75% 또는 80% 이상의 동일성, 예컨대 85%, 90%, 또는 95% 이상, 예를 들어, 98% 또는 99% 동일성을 공유하는 레퍼런스, 예컨대 천연 서열의 변이체 단편을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 활성" 및 "생물학적으로 활성인"은 세포에서 특정 생물학적 요소에 기인하는 활성을 지칭한다. 예를 들어, "면역글로불린", "항체" 또는 이의 단편 또는 변이체의 "생물학적 활성"은 항원결정기에 결합하고 그로써 면역학적 기능을 촉진하는 활성을 지칭한다. 또 다른 예시로서, 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체의 생물학적 활성은, 예컨대 결합, 효소적 활성 등의 그의 고유한 기능을 수행하기 위한 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체의 능력을 지칭한다. 세 번째 예시로서, 프로모터, 인핸서, 코작 서열 등과 같은 유전자 조절성 요소의 생물학적 활성은 그에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 조절, 즉 촉진하거나, 증강시키거나, 또는 활성화시키는 조절성 요소 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체의 능력을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투여하는" 또는 "도입하는"은 개체의 세포, 세포들 및/또는 장기에, 또는 개체에 재조합 단백질 발현을 위한 벡터의 전달을 지칭한다. 이러한 투여 또는 도입은 생체 내, 시험관 내 또는 생체 외에서 일어날 수 있다. 유전자 산물의 발현을 위한 벡터는 전형적으로 물리적 수단 (예컨대, 칼슘포스페이트 형질감염, 전기천공, 미세주입 또는 리포펙션)에 의한 세포 내로의 이종 DNA의 삽입을 의미하는, 형질감염; 전형적으로 감염성 제제, 즉 바이러스를 이용한 도입을 지칭하는, 감염; 또는 전형적으로 바이러스를 이용한 세포의 안정적인 감염 또는 바이러스 제제 (예컨대, 박테리오파아지)를 이용해 하나의 미생물로부터 다른 미생물로 유전적 물질의 전달을 의미하는, 형질도입에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.
"형질전환"은 전형적으로 발암유전자를 발현하고 따라서 종양 세포와 같이 지속적인 성장 모드로 전환되어 있는 이종 DNA 또는 세포를 포함하는 세균을 지칭하기 위해 사용된다. 세포를 "형질전환하기" 위해 사용되는 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 다른 비히클일 수 있다.
전형적으로, 세포는 세포 내로 이종 DNA의 투여, 도입 또는 삽입을 위해 사용된 수단 (즉, 벡터)에 따라 "형질도입", "감염", "형질감염", 또는 "형질전환"된 것으로 지칭된다. 용어 "형질도입된", "형질감염된" 및 "형질전환된"은 이종 DNA의 도입 방법과 무관하게 본원에서 호환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 벡터로 형질도입되거나, 감염되거나, 형질감염되거나, 또는 형질전환되어 있는 세포를 지칭한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 입자, 파아지 등일 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것들이고, 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 용어 "숙주 세포"가 원래의 형질도입, 감염, 형질감염, 또는 형질전환된 세포 및 이의 자손세포를 지칭하는 것으로 인식될 것이다.
용어 "치료", "치료하는" 등은 본원에서 일반적으로 바람직한 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 달성하는 것을 의미하기 위해 사용된다. 이 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는, 예컨대 질환 또는 이의 증상이 개체에서 발생하는 가능성을 감소시키는 측면에서 예방적일 수 있고/있거나, 질환 및/또는 질환에 기인한 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 측면에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 "치료"는 포유동물에서 질환의 임의의 치료를 포함하고, (a) 질환에 걸리기 쉽지만 아직 이 질환이 발병한 것으로 진단되지는 않은 개체에서 질환이 발생하는 것을 예방하고; (b) 질환을 억제하고, 즉 그의 발달을 저지하고; 또는 (c) 질환을 완화하고, 즉, 질환의 퇴행을 야기하는 것을 포함한다. 치료제는 질환 또는 손상의 개시 전에, 도중에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 바람직하지 않은 임상적 증상을 안정화시키거나 감소시키는, 진행 중인 질환의 치료가 특히 관심의 대싱이다. 이러한 치료는 이환된 조직에서 완전한 기능 상실 전에 수행되는 것이 바람직하다. 개체 요법은 질환의 증후성 (symptomatic) 단계 도중에, 일부 경우에는 질환의 증후성 단계 후에 투여되는 것이 바람직할 것이다.
용어 "개인", "숙주", "개체", 및 "환자"는 본원에서 호환적으로 사용되고, 이로 제한되는 것은 아니지만, 유인원 및 인간을 비롯한 인간 및 비-인간 영장류; 포유류 경기용 동물 (예컨대, 말); 포유류 가축 동물 (예컨대, 양, 염소 등); 포유류 애완동물 (개, 고양이 등); 및 설치류 (예컨대, 마우스, 랫트 등)를 포함하는 포유동물을 지칭한다.
본 발명의 다양한 조성물 및 방법이 하기에 기술된다. 특정 조성물 및 방법이 본원에 예시된다고 하더라도, 다수의 대안적인 임의의 조성물 및 방법이 본 발명을 실시하는데 사용하기에 적용가능하고 적합한 것으로 이해된다. 본 발명의 발현 작제물 및 방법의 평가가 당해 분야에 표준인 절차들을 이용하여 수행될 수 있음이 또한 이해될 것이다.
본 발명의 실시는, 달리 언급되지 않는 한, 당해 분야의 숙련자의 범위 내에 속하는, 세포생물학, 분자생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 생화학 및 면역학의 통상의 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은, 예컨대 이들 각각이 본원에 참조로서 명백히 포함되는, ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammal Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); and "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al., eds., 1991)]와 같은 문헌에 상세히 설명되어 있다.
본 발명의 여러 측면이 예시를 위한 실시예 적용에 관하여 하기에 기술된다. 다수의 특정한 세부항목, 관계, 및 방법이 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해 개시되는 것으로 이해되어야 한다. 그러나 관련 분야의 숙련자는 본 발명이 하나 이상의 특정한 세부항목 없이 또는 다른 방법을 이용하여 실시될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다. 일부 행위가 다른 순서로 일어나고/나거나 다른 행위 또는 사건과 동시에 일어날 수 있기 때문에, 본 발명은 행위 또는 사건의 예시된 순서에 의해 제한되지 않는다. 나아가, 모든 예시된 행위 또는 사건이 본 발명에 따른 방법론을 실행하는데 요구되는 것은 아니다.
본원에 사용된 방법론은 단지 특정 실시양태를 기술하기 위한 것으로 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나" (a, an) 및 "상기" (the)는, 당해 문맥이 명백히 달리 명시하지 않는 한, 또한 복수 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 나아가, 용어 "포함하는", "포함한다", "갖는", "갖는다", "갖고" 또는 이의 변형어는, 이러한 용어가 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도되어, 상세한 설명 및/또는 특허청구범위에 사용된다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당해 분야의 숙련자에 의해 결정되는 바와 같이 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내를 의미하고, 이는 부분적으로 그 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 좌우될 것이다. 예를 들어, "약"은 당해 분야에서 실시당 1 또는 1 초과 표준 편차 내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 바람직하게는 최대 10%, 더욱 바람직하게는 최대 5%, 및 더욱 바람직하게는 여전히 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 이 용어는 값의 10배 이내, 바람직하게는 5배 이내, 더욱 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 본 출원 및 특허청구범위에 특정 값이 기술되는 경우, 달리 지시하지 않는 한, 용어 "약"이 특정 값에 대한 허용가능한 오차 이내를 의미하는 것으로 추정되어야 한다.
본원에 언급된 모든 간행물은 그 간행물이 인용된 부분과 관련하여 방법 및/또는 재료를 설명하고 기술하기 위한 참조로서 본원에 포함된다. 모순이 있는 경우에는 본 발명의 개시가 포함된 간행물의 임의의 개시를 대체하는 것으로 이해된다.
또한 특허청구범위가 임의의 선택적 요소를 배제하도록 작성될 수 있음이 주목된다. 따라서, 이 진술은 특허청구범위 요소의 열거와 관련하여 "오로지", "단지" 등과 같은 이러한 배타적 용어의 사용, 또는 "부정적" 제한의 사용에 대한 선행 근거를 제공하는 것으로 의도된다.
본원에 논의된 간행물은 오로지 본 출원의 출원일 이전에 이들의 개시만을 제공한다. 본 발명이 앞선 발명에 의해 이러한 공개에 선행할 자격이 없는 것이라는 어떠한 승인도 본원에는 없는 것으로 해석된다. 또한, 제공된 공개일은 개별적으로 확인될 필요가 있는 실제 공개일과 다를 수 있다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어는 당해 분야의 숙련자에게 이해되는 바와 같은 의미를 가지며 본 발명의 실시는 당해 분야의 숙련자의 지식 범위 내인 미생물학 및 재조합 DNA 공학의 통상의 기술을 이용할 것이다.
본 발명은 원추세포에서 유전자의 발현을 위한 폴리뉴클레오티드 카세트 및 발현 벡터를 제공한다. 예를 들어, 개인에서 원추세포 장애의 치료 또는 예방을 위해, 원추세포에서 유전자의 발현을 촉진하는데 있어 이들 조성물의 사용을 위한 방법이 또한 제공된다. 본 발명의 이들 및 다른 목적, 이점 및 특징은 하기에 더욱 완전히 서술되는 바와 같은 조성물 및 방법의 상세한 기술의 이해 시 당해 분야의 숙련자에 의해 자명할 것이다.
조성물
본 발명의 일부 측면에서, 조성물은 원추세포에서 전이유전자의 발현을 위해 제공된다. 본원에서 "원추 광수용체 (cone photoreceptor)" 또는 "원추체 (cone)"로도 언급되는, "원추세포"는, 상대적으로 밝은 빛에서 최상으로 작용하는 눈의 망막 내 광수용체의 아형을 의미한다. 원추체는 빛의 특정 파장에 감수성이고 따라서 색의 인지를 보조한다. 또한, 원추체는 간상 광수용체보다 자극에 더 빠르게 반응하고, 간상체보다 이미지의 더 미세한 디테일 및 더 신속한 변화를 인지하여, 그로써 시각적 디테일이 독서 및 운전과 같이 일차적으로 중요한 활동에 대해 고도의 예민한 시력을 지원한다. 원추체는 이들의 외분절의 원추-유사 모양에 의해 망막의 단면도에서 용이하게 식별가능하다. 이들은 또한 망막 내 이들의 위치에 의해 용이하게 식별가능한데, 가장 높은 밀도의 원추체는 "중심와 (fovea centralis)" 또는 "와 오목 (foveal pit)"으로도 불리는, 망막의 황반의 중심에 위치한 1.5 mm 함몰에 존재한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 원추세포에서 전이유전자의 발현을 위해 제공되는 조성물은 폴리뉴클레오티드 카세트이다. "폴리뉴클레오티드 카세트"는, 전형적으로 서로에 작동가능하게 연결된 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대 조절성 요소, 번역 개시 서열, 코딩 서열, 종결 서열 등을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 유사하게, "원추세포에서 전이유전자의 발현을 위한 폴리뉴클레오티드 카세트"는, 원추세포에서 전이유전자의 발현을 촉진하는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 5'UTR, 번역 개시 서열, 코딩 서열, 종결 서열 등의 조합을 의미한다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트는 하기를 포함한다:
(a) 원추세포에서 코딩 서열의 발현을 촉진하는 프로모터 영역; 및
(b) 프로모터 영역에 작동가능하게 연결된 코딩 서열.
또 다른 예시로서, 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트는 하기를 포함한다:
(a) 망막 원추세포에서 코딩 서열의 발현을 촉진하는 프로모터 영역;
(b) 번역 개시 서열; 및
(c) 프로모터 영역에 작동가능하게 연결된 코딩 서열.
세 번째 예시로서, 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트는 하기를 포함한다:
(a) 망막 원추세포에서 코딩 서열의 발현을 촉진하는 프로모터 영역;
(b) 5' 비번역 영역;
(c) 번역 개시 서열; 및
(d) 프로모터 영역에 작동가능하게 연결된 코딩 서열.
네 번째 예시로서, 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트는 하기를 포함한다:
(a) 망막 원추세포에서 코딩 서열의 발현을 촉진하는 프로모터 영역;
(b) 5' 비번역 영역;
(c) 인트론;
(d) 번역 개시 서열; 및
(e) 프로모터 영역에 작동가능하게 연결된 코딩 서열.
다섯 번째 예시로서, 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트는 하기를 포함한다:
(a) 망막 원추세포에서 코딩 서열의 발현을 촉진하는 프로모터 영역;
(b) 5' 비번역 영역;
(c) 인트론;
(d) 번역 개시 서열; 및
(e) 폴리아데닐화 서열.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 원추세포에서 전이유전자의 증강된 발현을 제공한다. 본 발명의 실시예에 의해 입증되는 바와 같이, 본 발명자들은 개별적 및 상승적으로 원추세포에서 전이유전자의 증강된 발현을 제공하는 다수의 폴리뉴클레오티드 요소들, 즉 당해 분야에 공지된 것들에 비해 개선된 요소들을 발견하였다. "증강된"은, 예컨대 당해 분야에 공지된 바와 같은, 비교가능한 조절성 요소에 작동가능하게 연결된 전이유전자를 운반하는 원추세포에서에 비해 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트를 운반하는 원추세포에서 증가되고, 증대되거나, 또는 더 강력한 것을 의미한다. 달리 말하면, 전이유전자의 발현은 본 발명의 하나 이상의 최적화된 요소를 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드 카세트, 즉 참조 대조군으로부터의 발현에 비해 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트로부터 증가되고, 증대되거나, 또는 더 강력하다. 예를 들어, 전이유전자의 발현은 예컨대 당해 분야에 공지된 바와 같은, 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된 전이유전자를 운반하는 원추세포에서보다 본원에 기술된 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 원추세포에서 증강되거나, 또는 증대되거나, 또는 더 강력하다. 또 다른 예시로서, 전이유전자의 발현은 상이한 인핸서 서열에 작동가능하게 연결된 전이유전자를 운반하는 원추세포에서보다 본원에 기술된 인핸서 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 원추세포에서 증강되거나, 또는 증대되거나, 또는 더 강력하다. 또 다른 예시로서, 전이유전자의 발현은 상이한 5'UTR 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 전이유전자를 운반하는 원추세포에서보다 본원에 기술된 5'UTR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 원추세포에서 증강되거나, 또는 증대되거나, 또는 더 강력하다. 또 다른 예시로서, 전이유전자의 발현은 당해 분야에 공지된 바와 같은 상이한 인트론성 서열에 작동가능하게 연결된 전이유전자를 운반하는 원추세포에서보다 본원에 기술된 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 원추세포에서 증강되거나, 또는 증대되거나, 또는 더 강력하다. 비교를 위한 참조로서 사용될 수 있는 요소 (예컨대, 프로모터, 인핸서 서열, 5'UTRs, 및 인트론)를 포함하는 예시적인 서열에는 천연 L-옵신 프로모터 (서열번호 1) 및 이의 변이체에 의해 포함되는 서열, 합성 프로모터 pR2.1 (서열번호 50) 및 이의 변이체 (예컨대, pR1.7, pR1.5, pR1.1)(예컨대, 미국특허출원 제2013/0317091호에 기술된 바와 같음)에 의해 포함되는 서열, 및 IRBP/GNAT2 프로모터 (미국특허출원 제2014/0275231호)에 의해 포함되는 서열이 포함된다.
이론에 의해 구속됨이 없이, 세포에서 전이유전자의 증강된 발현은 세포에서 유전자 산물의 더 신속한 생성 또는 세포에서 더 안정한 유전자 산물에 기인하는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트에 의한 전이유전자의 증강된 발현은 다수의 방식으로 관찰될 수 있다. 예를 들어, 증강된 발현은 원추세포에의 폴리뉴클레오티드 카세트의 접촉 이후에 전이유전자의 발현을, 전이유전자가 예컨대 당해 분야에 공지된 바와 같은 비교가능한 조절성 요소에 작동가능하게 연결되었을 때 검출될 수 있는 발현보다 더 빨리, 예컨대 7일 더 빨리, 2주 더 빨리, 3주 더 빨리, 4주 더 빨리, 8주 더 빨리, 12주 또는 그 이상 더 빨리 검출함으로써 관찰될 수 있다. 증강된 발현은 또한 세포당 유전자 산물의 양에서의 증가로서 관찰될 수 있다. 예를 들어, 원추세포당 유전자 산물의 양은 2배 이상의 증가, 예컨대 3배 이상의 증가, 4배 이상의 증가, 5배 이상의 증가, 또는 10배 이상의 증가일 수 있다. 증강된 발현은 또한 폴리뉴클레오티드 카세트에 의해 운반되는 검출가능한 수준의 전이유전자를 발현하는 다수의 원추세포에서의 증가로서 관찰될 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 수준의 전이유전자를 발현하는 다수의 원추세포에서 2배 이상의 증가, 예컨대 3배 이상의 증가, 4배 이상의 증가, 5배 이상의 증가, 또는 10배 이상의 증가일 수 있다. 또 다른 예시로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 통상의 폴리뉴클레오티드 카세트에 비해 세포의 더 많은 비율에서 검출가능한 수준의 전이유전자를 증진시킬 수 있는데; 예를 들어, 통상의 카세트는, 예를 들어 특정 영역에서 원추세포의 5% 미만에서 검출가능한 수준의 전이유전자 발현을 증진시킬 수 있는 반면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 그 영역에서 원추세포의 5% 이상에서 검출가능한 수준의 발현을 증진시키고; 예컨대 접촉하는 원추세포의 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 또는 45% 이상, 일부 경우에는 50% 이상, 55% 이상; 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 예를 들어 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상이 검출가능한 수준의 유전자 산물을 발현할 것이다. 증강된 발현은 또한, 예컨대 안저 촬영, OCT, 적응 광학, cERG, 색각 검사, 시력 검사 등과 같이 당해 분야에 공지되고 본원에 기술된 바와 같은 측정 수단을 사용하여 측정되는 바와 같이, 원추세포의 생존력 및/또는 기능에의 변경으로서 관찰될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 전형적으로 프로모터 영역을 포함한다. 프로모터 영역이 망막 원추세포에서 코딩 서열의 발현을 촉진하는 한, 임의의 적합한 프로모터 영역 또는 그 안의 프로모터 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 포유동물 망막 원추세포; 더욱 바람직하게는 영장류 망막 원추세포; 더욱 바람직하게는 협비원류 (Catarrhini) 망막 원추세포; 더욱 더 바람직하게는 인간 망막 원추세포에서 유전자의 발현을 특이적으로 촉진한다. "특이적으로"는, 프로모터가 주로 다른 세포 유형에 비해 표적 세포에서 유전자의 발현을 촉진하는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 원추세포에서의 발현을 특이적으로 촉진하는 프로모터 영역이 사용되는 경우, 눈에 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트의 전달 후 유전자 발현의 50% 초과, 예를 들어 발현의 60%, 65%, 70% 또는 75% 이상의 적어도 어느 하나, 예컨대 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 그 이상의 적어도 어느 하나가 원추세포에서 일어날 것이다.
예시적인 적합한 프로모터 영역에는 492 L-옵신 프로모터 영역 (서열번호 1), 491 L-옵신 프로모터 영역 (서열번호 53), 496 L-옵신 프로모터 영역 (서열번호 79), M-옵신 프로모터 영역 (서열번호 2, 서열번호 54), 최소 M-옵신 프로모터 영역 (서열번호 55, 서열번호 93), 본원에 최초로 기술된 바와 같은 코어 M-옵신 프로모터 서열 (서열번호 80), S-옵신 프로모터 영역 (서열번호 3), hRK 프로모터 영역, 및 원추 아레스틴 (arrestin) 프로모터 영역과 같은 임의의 원추체-특이적 유전자에 대한 프로모터 영역; 또는 원추세포에서 유전자의 발현을 촉진하는 활성을 보유하는 이의 일부 또는 변이체가 포함된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트에 사용될 수 있는 프로모터 영역의 일부 또는 단편의 비제한적인 예시에는 5'UTR의 즉시 상류의 프로모터 서열, 및 당해 분야에 공지된 바와 같은 전사 인자를 위한 정준 결합 서열이 포함된다. 이러한 부분 또는 단편은 당해 분야에 공지되거나 본원에 기술된 바와 같은 임의의 편리한 방법을 이용하여 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 54 및 서열번호 55에서 5'UTR의 즉시 상류의 프로모터 서열은, 예컨대 UCSC 게놈 BLAT 브라우저와 같이 공적으로 이용가능한 수단을 이용하여; 또는, 예컨대 본원의 실시예에 기술된 바와 같이, 리포터 유전자에의 작동가능한 연결 및 원추세포 내로의 도입을 통한 실증적 검사에 의해 서열번호 54의 뉴클레오티드 1-406 또는 서열번호 55의 뉴클레오티드 1-154로 필수적으로 이루어진 바와 같은 서열의 인 실리코 (in silico) 평가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 더 짧은 프로모터 서열은 다른 뉴클레오티드 요소를 위한 벡터 내 더 많은 공간을 제공하기 때문에 이들이 더 긴 프로모터 서열보다 바람직하다. 일부 실시양태에서, 프로모터 영역은 492개 미만의 염기쌍 길이이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 기능적 단편은 서열번호 1의 뉴클레오티드 1-10 또는 그 이상을 포함하지 않는데, 예를 들어, 기능적 단편은 서열번호 1의 뉴클레오티드 1-20 또는 그 이상, 뉴클레오티드 1-30 또는 그 이상, 뉴클레오티드 1-40 또는 그 이상, 뉴클레오티드 1-50 또는 그 이상, 예컨대 뉴클레오티드 1-60 또는 그 이상, 뉴클레오티드 1-70 또는 그 이상, 뉴클레오티드 1-80 또는 그 이상, 뉴클레오티드 1-90 또는 그 이상, 뉴클레오티드 1-100 또는 그 이상, 일부 경우에는 서열번호 1의 뉴클레오티드 1-120 또는 그 이상, 뉴클레오티드 1-140 또는 그 이상, 뉴클레오티드 1-160 또는 그 이상, 뉴클레오티드 1-180 또는 그 이상, 뉴클레오티드 1-200 또는 그 이상, 뉴클레오티드 1-220 또는 그 이상, 뉴클레오티드 1-240 또는 그 이상, 또는 약 뉴클레오티드 1-260을 포함하지 않는다. 포유동물 또는 영장류 원추세포에서 발현을 유도할 수 있는 프로모터 영역을 동정하는 임의의 적합한 방법이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트에 사용될 수 있는 프로모터 영역 및 프로모터 서열을 동정하기 위하여 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트의 프로모터 영역은 본원에 기술된 프로모터 영역의 하나, 예컨대 492 L-옵신 프로모터 영역 (서열번호 1), 491 L-옵신 프로모터 영역 (서열번호 53), 496 L-옵신 프로모터 영역 (서열번호 79), M 옵신 프로모터 영역 (서열번호 2, 서열번호 54), 최소 M 옵신 프로모터 영역 (서열번호 55, 서열번호 93), 본원에 기술된 코어 M-옵신 프로모터 서열 (서열번호 80), 또는 S 옵신 프로모터 영역 (서열번호 3), 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체, 예컨대 전술한 서열에 대해 75% 이상, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 (예컨대, 80%, 85%, 90% 또는 95%)의 동일성을 갖는 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트의 프로모터 서열은 본원에 기술된 프로모터 영역의 하나, 즉 서열번호 1, 서열번호 53, 서열번호 79, 서열번호 2, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 93, 서열번호 80, 또는 서열번호 3, 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체, 예컨대 전술한 서열의 전장에 플러스 마이너스 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 뉴클레오티드에 대해, 75% 이상, 예컨대 80%, 또는 그 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 (예컨대, 80%, 85%, 90% 또는 95%)의 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 기능적 단편의 하나로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트의 프로모터 영역은 본원에 기술된 프로모터 영역의 하나, 즉 서열번호 1, 서열번호 53, 서열번호 79, 서열번호 2, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 93, 서열번호 80, 또는 서열번호 3, 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체, 예컨대 전술한 서열의 전장에 대해 75% 이상, 예컨대 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 동일성을 갖는 서열 또는 이의 기능적 단편의 하나로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 프로모터 영역은 서열번호 74로 필수적으로 이루어진다. 일부 이러한 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호 80으로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 프로모터는, 예컨대 합성 프로모터 pR2.1, pR1.7,pR1.1, 및 IRBP/GNAT2와 같이 당해 분야에 공지된 다른 프로모터에 비해 원추세포에서 증강된 발현을 초래한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트는 인핸서 요소를 추가로 포함한다. 인핸서는 전사를 향상시키기 위해 당해 분야에 공지된 핵산 요소이고, 이들이 조절하는 유전자와 관련된 부위에, 예컨대 인트론의 상류, 하류, 내부 등에 위치할 수 있다. 임의의 인핸서 요소는 프로모터와 조합하여 사용될 때 유전자의 발현을 향상시키는 한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 및 유전자 요법 벡터에 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 인핸서 요소는 망막 원추세포에 특이적이고; 더욱 바람직하게는, 영장류 망막 원추세포에 특이적이고; 더욱 바람직하게는 협비원류 망막 원추세포에; 더욱 더 바람직하게는 인간 망막 원추세포에 특이적이다. "특이적으로"는, 인핸서가 주로 다른 세포 유형에 비해 표적 세포에서 유전자의 발현을 향상시키는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 원추세포에서 발현을 특이적으로 향상시키는 인핸서가 사용되는 경우, 눈에 벡터의 전달 후 유전자의 발현의 50% 초과, 예를 들어 발현의 60%, 65%, 70%, 75% 이상의 적어도 하나, 예컨대 발현의 적어도 80%, 및 더욱 바람직하게는 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 그 이상이 원추세포에서 일어날 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트에 사용될 수 있는 예시적인 인핸서 영역은 인핸서 활성을 보유하는 임의의 원추체-특이적 유전자에 대한 인핸서 영역 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하고, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 것들을 포함한다. 예를 들어, 유전자좌 제어 영역 (Locus Control Region, LCR)으로 언급되는, L/M 최소 옵신 인핸서 (Wang et al., 1992. Neuron 9: 429-440) (서열번호 52)가 원추세포에서 유전자 발현을 향상시키기 위해 사용될 수 있고; 이의 부재는 청색 원추 단색형색각을 초래한다 (Nathans et al., 1989; Science, 245: 831-838). LCR은, 예를 들어 AAV 벡터를 이용한 유전자 요법에 유용한 것으로 나타났다 (Li et al., Vision Research 48(2008): 332-338). 나아가, 36 bp "코어" LCR 서열로 필수적으로 이루어진 기능적 단편이 원추세포에서 옵신 프로모터로부터의 발현에 필요하고 이에 충분한 것으로 동정되었다 (Komaromy et al. Targeting gene expression to cones with human cone opsin promoters in recombinant AAV. Gene Ther. 2008; 15(14):1049-55) (서열번호 51). 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트의 인핸서는 서열번호 51 또는 서열번호 52를 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트의 인핸서는 서열번호 51 또는 서열번호 52로 필수적으로 이루어진다.
하나 이상의 카피의 L/M 최소 옵신 인핸서를 포함하는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 L/M 인핸서 요소, 및 전장의 L/M 옵신 인핸서, 또는 원추체-특이적 방식의 유전자 발현을 향상시키는 활성을 보유하는 이의 다른 부분 또는 변이체가 본 발명의 조성물에서 용도를 갖는다. 영장류 원추세포에서 발현을 유도할 수 있는 인핸서 서열을 동정하기에 적합한 임의의 방법이, 본원의 교시에 근거하여 숙련자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 이러한 인핸서를 동정하기 위해 사용될 수 있다.
프로모터 및 인핸서 영역의 길이는 이들의 의도된 목적을 위해 임의의 적합한 길이일 수 있고, 프로모터와 인핸서 영역 사이의 간격은 유전자 산물의 원추체-특이적 발현을 촉진하기에 적합한 임의의 간격일 수 있다. 다양한 바람직한 실시양태에서, 인핸서는 프로모터의 0-1500; 0-1250; 0-1000; 0-750; 0-600; 0-500; 0-400; 0-300; 0-200; 0-100; 0-90; 0-80; 0-70; 0-60; 0-50; 0-40; 0-30; 0-20; 또는 0-10 뉴클레오티드 상류에 위치된다. 프로모터는 인코딩된 유전자의 상류에서 임의의 적합한 거리일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 5' 비번역 영역을 인코딩하는 서열, 즉 5' 비번역 영역을 코딩 서열로 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이는 5'UTR로도 불린다. 발현 카세트에서, 5'UTR은 당해 분야에 전사 개시 부위와 단백질 번역이 시작되는 코작 (Kozak) 서열 사이의 서열로서 알려져 있다. 5'UTR의 이차 mRNA 구조는 전사 수준에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 특히, 증강된 유전자 발현을 위해, 본 발명에서 5'UTR 영역의 서열은 비효율적인 리보좀 스캐닝 및 위 (false) 번역 개시로 인해 번역 효율을 저하시키는 것으로 알려진 이차 구조 및 상류 AUG (uAUG) 코돈을 최소화하거나 회피하도록 선택된다 (Kozak, 1995. PNAS 92: 2662). 문헌 [Davuluri et al., Genome Research, 2000: 10 (11); 1807-1816]을 참조한다. 예를 들어, 인간 유전자 HSP70 유래의 5'UTR 서열 (서열번호 58)은, 아마도 IRES 기전에 기인한, mRNA 번역을 증강시키는 이의 독특한 능력에 대해 동정되었다 (Rubtsova et al., 2003. PNAS 278(25): 22350-22356; Vivinus et al, 2001. Eur J Biochem. 268: 1908-1917). 임의의 5' UTR이 사용될 수 있지만, 이상적으로는 5'UTR의 서열은 최소 이차 mRNA 구조 및 상류 AUG 서열을 갖는다. 달리 말하면, 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트의 전사 개시 부위와 번역 개시 부위 사이의 서열은 폴리뉴클레오티드 ATG를 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 5' UTR은 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 또는 서열번호 89; 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체, 예를 들어, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 및 서열번호 89로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 5'UTR 서열의 일부 또는 전부는, 예를 들어 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 또는 서열번호 79에 기술된 바와 같은 프로모터 영역으로 구성된다. 다른 실시양태에서, 5'UTR은 프로모터 영역; 예컨대 5' UTR 서열을 인코딩하지 않는 서열번호 84의 코어 프로모터 서열로 구성되지 않는다. 일부 실시양태에서, 5'UTR 서열은 프로모터 서열에 대해 이종이다. 다양한 바람직한 실시양태에서, UTR의 3' 말단은 코딩 서열의 0-20; 0-15; 0-10; 0-9; 0-8; 0-7; 0-6; 또는 0-5 뉴클레오티드 상류이고, 이의 5' 말단은 근위 프로모터 영역의 0-20; 0-15; 0-10; 0-9; 0-8; 0-7; 0-6; 또는 0-5 뉴클레오티드 하류이다. 일부 실시양태에서, 5'UTR 요소는 당해 분야에 공지된 다른 5'UTRs, 예컨대 합성 프로모터 pR2.1, pR1.7, pR1.1, 및 IRBP/GNAT2로 구성된 5'UTRs에 비해, 원추세포에서 증강된 발현을 초래한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 스플라이스 공여체/수용체 영역을 포함하는 인트론을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인트론은 프로모터 영역의 하류에 위치하고 유전자의 번역 개시 서열의 상류에 위치하며, 즉 인트론은 5'UTR 내부에 위치한다. 다른 실시양태에서, 인트론은 유전자의 번역 개시 서열의 하류에 위치하고, 즉 인트론은 코딩 서열 내부에 위치한다. 당해 분야에 일반적으로 알려진 바와 같이, 인트론은 RNA로 전사되고 인트론 스플라이싱을 통해 mRNA 프로세싱 동안에 제거되는 DNA 폴리뉴클레오티드이다. 인트론을 함유하는 폴리뉴클레오티드 카세트는 일반적으로 인트론이 없는 것들보다 더 높은 발현을 갖는다. 인트론은 2배 내지 500배로 발현을 촉진할 수 있다 (Buchman and Berg, 1988. Mol Cel Bio, 8(10): 4395). 효율적으로 스플라이싱된 인트론은 전-스플라이스 공여체, 분지점, 및 Py 풍부 영역 (Senapathy et al, 1990; Meth. Enzymol. 183, 252-78; Wu and Krainer, 1999; Mol Cell Biol 19(5): 3225-36)을 함유한다. 5' 인트론은 일반적으로 3' 말단에 있는 인트론에 비해 더욱 효과적이다 (Huang and Gorman, 1990; Mol Cell Bio, 10:1805). 인트론이 일반적으로 유전자 발현 수준을 증가시키는 것으로 알려져 있다고 하더라도, (만약에 있다면) 소정의 cDNA의 특이적 증가는 실증적이고 검사되어야만 하는데; 예를 들어 pSI 벡터 내 키메릭 인트론은 21배 CAT 발현을 증가시키지만, 루시퍼라제 발현은 단지 3배 증가시킨다.
포유동물 또는 영장류 원추세포에서 인식되는 스플라이스 공여체/수용체 영역을 포함하여, 인트론이 결과의 mRNA 산물로부터 스플라이싱될 수 있는 한, 임의의 인트론이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트에 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 인트론은 서열번호 5에 따른 SV40 인트론을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, 인트론은 pSI 유래의 키메릭 인트론 (서열번호 60) 또는 이의 변이체를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, 인트론은 CMV 인트론 A 또는 이의 변이체를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 인트론은 pR2.1 인트론 (서열번호 59) 또는 이의 변이체, 또는 대안적으로, 토끼 또는 인간 베타 글로빈 인트론 (Xu et al, 2001, Gene 272: 149; Xu et al., 2002; J Control Rel 81:155) 또는 이의 변이체를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 이러한 실시양태에서, 인트론은 서열번호 5, 서열번호 59, 및 서열번호 60으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 전형적으로, 인트론은 프로모터 영역 및/또는 5'UTR에 대해 이종이다.
일부 실시양태에서, 인트론은 5'UTR 내부에 존재한다. 다시 말하면, 5'UTR을 인코딩하는 DNA 서열은 인트론성 DNA 서열에 의해 방해된다. 예를 들어, 서열번호 84인 5'UTR에 대한 코딩 서열은 이들 사이에 인트론성 서열을 갖는 두 부분, 예컨대 서열번호 85 및 서열번호 86으로 인코딩될 수 있다. 또 다른 예시로서, 서열번호 88인 5'UTR에 대한 코딩 서열은 이들 사이에 인트론성 서열을 갖는 두 부분, 예컨대 서열번호 89 및 서열번호 73으로 인코딩될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 인트론의 3' 말단은 유전자의 0-20; 0-15; 0-10; 0-9; 0-8; 0-7; 0-6; 또는 0-5 뉴클레오티드 상류이고, 이의 5' 말단은 근위 프로모터 영역의 0-20; 0-15; 0-10; 0-9; 0-8; 0-7; 0-6; 또는 0-5 뉴클레오티드 하류이다. 다른 실시양태에서, 인트론은 유전자의 코딩 서열 내부에 존재한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 "코작 서열" 또는 "코작 번역 개시 서열"로도 알려진, 번역 개시 서열을 포함한다. 이는 리보좀이 부착하고 번역이 시작되는 핵산 서열이다. 예시에는 ACCATGG (Kozak, 1986. Cell, 44: 283-292) 및 (GCC)GCC(A/G)CCATGG (Kozak, 1987. Nucl Acid Res; 15(20): 8125) (서열번호 73)이 포함된다. 임의의 적합한 코작 서열이 바람직하게는 망막 원추세포에서 코딩 서열의 발현을 증가시키기 위해 선택된 폴리뉴클레오티드 카세트에 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 번역 개시 서열은 서열번호 72를 포함한다. 대안적인 실시양태에서, 번역 개시 서열은 서열번호 73을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코작 요소는 당해 분야에 공지된 다른 코작 서열, 예컨대 합성 프로모터 pR2.1, pR1.7, pR1.1, 및 IRBP/GNAT2로 구성된 코작 서열에 비해 원추세포에서 증강된 발현을 초래한다.
본 발명의 일부 측면에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는, 예컨대 원추세포 장애 등을 치료하고, 세포 생존력 및/또는 기능에 대해 유전자가 갖는 효과를 결정하기 위해, 동물의 원추세포에 유전자의 전달을 위해 사용된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 시험관 내 또는 생체 내에서 동물의 원추세포에 전이유전자로서 전달되는 유전자를 추가로 포함한다. 유전자 코딩 서열은 전형적으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트의 프로모터 영역에, 그리고 인핸서 요소가 존재하는 경우에는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트의 인핸서 요소에 작동가능하게 연결되어, 프로모터 및 선택적으로 인핸서 요소가 개체의 원추세포에서 코딩 서열 또는 cDNA의 발현을 촉진하게 한다.
원추세포에서 발현되는 코딩 서열은 임의의 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대 유전자 산물, 예컨대 폴리펩티드 또는 RNA-계 치료제 (siRNA, 안티센스, 리보자임, shRNA 등)를 인코딩하는 유전자 또는 cDNA일 수 있다. 코딩 서열은 그것이 작동가능하게 연결되는 프로모터 서열 및/또는 5'UTR 서열에 대해 이종일 수 있는데, 즉 이와 자연적으로 작동가능하게 연합되지 않을 수 있다. 별법으로, 코딩 서열은 그것이 작동가능하게 연결되는 프로모터 서열 및/또는 5'UTR 서열에 대해 내인성일 수 있는데, 즉 프로모터 또는 5'UTR과 실재하여 연합된다. 유전자 산물은 원추세포에 내재적일 수 있거나, 또는 이는 외재적일 수 있는데, 예컨대 분비될 수 있다. 예를 들어, 전이유전자가 치료적 유전자인 경우, 코딩 서열은 원추세포 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료제로서, 또는 다르게는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 4색형 (tetrachromatic) 색각을 증진시키는 것을 비롯해, 시력을 증강시키는 수단으로서 사용될 수 있는 목적하는 유전자 산물 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 인코딩하는 임의의 유전자일 수 있다. 다양한 바람직한 실시양태에서, 전이유전자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료적 단백질 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 인코딩한다:
(a) 서열번호 7 (서열번호 6) 호모 사피엔스 옵신 1 (원추 색소), 단파-감수성 (OPN1SW), mRNA NCBI 레퍼런스 서열: NM_001708.2;
(b) 서열번호 9 (서열번호 8) 호모 사피엔스 옵신 1 (원추 색소), 중파-감수성 (OPN1MW), mRNA NCBI 레퍼런스 서열: NM_000513.2;
(c) 서열번호 11 (서열번호 10) 호모 사피엔스 옵신 1 (원추 색소), 장파-감수성 (OPN1LW), mRNA NCBI 레퍼런스 서열: NM_020061.4;
(d) 서열번호 13 (서열번호 12) ATP 결합 카세트 망막 유전자 (ABCR) 유전자 (NM_000350);
(e) 서열번호 15 (서열번호 14) 망막 색소화된 상피-특이적 65 kD 단백질 유전자 (RPE65) (NM_000329);
(f) 서열번호 17 (서열번호 16) 망막 결합 단백질 1 유전자 (RLBP1) (NM_000326);
(g) 서열번호 19 (서열번호 18) 페리페린/망막 변성 지연 유전자, (NM_000322);
(h) 서열번호 21 (서열번호 20) 아레스틴 (SAG) (NM_000541);
(i) 서열번호 23 (서열번호 22) 알파-트랜스듀신 (GNAT1) (NM_000172);
(j) 서열번호 24 구아닐레이트 사이클라제 활성화제 1A (GUCA1A) (NP_ 000400.2);
(k) 서열번호 25 망막 특이적 구아닐레이트 사이클라제 (GUCY2D), (NP_000171.1);
(l) 서열번호 26 및 27 원추 사이클릭 뉴클레오티드 관문 양이온 채널의 알파 서브유닛 (CNGA3) (NP_001073347.1 또는 NP_001289.1);
(m) 서열번호 28 인간 원추 트랜스듀신 알파 서브유닛 (불완전 색맹);
(n) 서열번호 29 원추 cGMP-특이적 3',5'-사이클릭 포스포디에스터라제 서브유닛 알파', 단백질 (원추 이영양증 유형 4);
(o) 서열번호 30 망막 원추 로돕신-감수성 cGMP 3',5'-사이클릭 포스포디에스터라제 서브유닛 감마, 단백질 (망막 원추 이영양증 유형 3A);
(p) 서열번호 31 원추 간상 호메오박스, 단백질 (원추-간상 이영양증);
(q) 서열번호 32 원추 광수용체 사이클릭 뉴클레오티드-관문 채널 베타 서브유닛, 단백질 (전색맹);
(r) 서열번호 33 원추 광수용체 cGMP-관문 양이온 베타-서브유닛, 단백질 (예를 들어 핀젤라페스 (Pingelapese) 섬주민들 중에서, 완전 색맹);
(s) 서열번호 35 (서열번호 34) 막망 색소변성증 1 (상염색체 우성) (RP 1);
(t) 서열번호 37 (서열번호 36) 막망 색소변성증 GTPase 조절인자 상호작용 단백질 1 (RPGRIP 1);
(u) 서열번호 39 (서열번호 38) PRP8;
(v) 서열번호 41 (서열번호 40) 중심체성 단백질 290 kDa (CEP290);
(w) 서열번호 43 (서열번호 42) IMP (이노신 5'-모노포스페이트) 디히드로게나제 1 (IMPDH1), 전사체 변이체 1;
(x) 서열번호 45 (서열번호 44) 아릴 히드로카본 수용체 상호작용 단백질-유사 1 (AIPL1), 전사체 변이체 1;
(y) 서열번호 47 (서열번호 46) 레티놀 디히드로게나제 12 (모두-트랜스/9-시스/11-시스) (RDH12);
(z) 서열번호 49 (서열번호 48) 레베르 선천성 흑암시 5 (LCA5), 전사체 변이체 1; 및
(aa) 예시적인 OPN1LW/OPN1MW2 다형체 (OPN1LW (L 옵신) 대비) 폴리펩티드 서열; 숫자의 좌측에 있는 아미노산은 L 옵신 서열에 존재하는 잔기이고; 숫자는 L 옵신 내 잔기 번호이고, 숫자의 우측에 있는 잔기는 L 옵신으로부터의 변형이다. 이들 실시양태에 따른 다형체는 Thr65Ile; Ile111Val; Ser116Tyr; Leu153Met; Ile171Val; Ala174Val; Ile178Val; Ser180Ala; Ile230Thr; Ala233Ser; Val236Met; Ile274Val; Phe275Leu; Tyr277Phe; Val279Phe; Thr285Ala; Pro298Ala; Tyr309Phe로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다;
(ab) 부가적인 옵신 서열 변형 1 (서열번호 61);
(ac) 부가적인 옵신 서열 변형 2 (서열번호 62);
(ad) 부가적인 옵신 서열 변형 3 (서열번호 63);
(ae) 부가적인 옵신 서열 변형 4 (서열번호 64);
(af) 부가적인 옵신 서열 변형 5 (서열번호 65);
(ag) 부가적인 옵신 서열 변형 6 (서열번호 65);
(ah) 부가적인 옵신 서열 변형 7 (서열번호 66);
(ai) 부가적인 옵신 서열 변형 8 (서열번호 67);
(aj) 부가적인 옵신 서열 변형 9 (서열번호 68);
(ak) hCHR2 (채널 로돕신) (서열번호 69);
(al) NpHR (할로로돕신) (서열번호 70); 및
(am) eGFP (서열번호 71).
일부 실시양태에서, 전이유전자에 의해 인코딩되는 코딩 서열은 상기 또는 본원에 기술된 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드에 적어도 85% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 따라서, 예를 들어, 코딩 서열은 OPN1LW, OPNIMW, 또는 OPN1SW에 의해 인코딩되는 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 원추 옵신을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 코딩 서열은 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 또는 서열번호 71에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다.
(a)-(c) 및 (aa-aj)에 언급된 단백질은 모두 색각에 관여한다. 예시적인 다형체에는 이들을 발현하는 원추세포에서 색소의 스펙트럼에 영향을 미치는 위치 65, 116, 180, 230, 233, 277, 285, 및 309에서의 것들을 포함한다. 위치 274, 275, 277, 279, 285, 298 및 309는 모두 M 옵신으로부터 L 옵신을 구별한다.
(d)-(z)에 언급된 단백질은 막망 색소변성증 (폴리펩티드 "e"-"l", "s"-"y"), 불완전 전색맹 (폴리펩티드 "m"), 스타르가르트 (폴리펩티드 "d"); 레베르 선천성 흑암시 (폴리펩티드 "z"); 원추 이영양증, 예컨대 원추 이영양증 유형 4 (폴리펩티드 "n"); 망막 원추 이영양증; 예를 들어, 망막 원추 이영양증 유형 3A (폴리펩티드 "o"); 원추-간상 이영양증 (폴리펩티드 "p"); 전색맹 (폴리펩티드 "q"); 및 예를 들어, 핀젤라페스 (Pingelapese) 섬주민들 중에서, 완전 색맹 (폴리펩티드 "r")에서와 같은 예시적인 눈 질환-연관 유전자이다.
본 발명의 일 실시양태에서, 전이유전자의 코딩 서열은 변형되거나, 또는 드물게 나타나는 코돈을 더욱 빈번하게 나타나는 코돈으로 대체함으로써 발현을 증강시키기 위해 "코돈 최적화"된다. 코딩 서열은 번역용 아미노산을 인코딩하는 mRNA 서열의 일부분이다. 번역 도중에, 61개 트리뉴클레오티드 코돈 각각은 20개 아미노산의 하나로 번역되고, 이는 유전적 암호에서 축퇴성, 또는 중복성을 초래한다. 그러나, 상이한 세포 유형, 및 상이한 동물 종은 상이한 빈도로 동일한 아미노산을 코딩하는 tRNAs (각각 안티코돈 보유함)를 이용한다. 유전자 서열이 상응하는 tRNA에 의해 드물게 나타나는 코돈을 함유하는 경우, 리보좀 번역 기구는 둔화될 수 있고, 이는 효율적인 번역을 방해한다. 발현은 특정 종에 대해 코딩 서열이 고도로 나타나고/나거나 고도로 발현된 인간 단백질에 의해 이용되는 코돈을 이용하지만, 동일한 단백질 서열을 인코딩하도록 변형되는 "코돈 최적화"를 통해 향샹될 수 있다 (Cid-Arregui et al., 2003; J. Virol. 77: 4928). 본 발명의 일 측면에서, 전이유전자의 코딩 서열은 포유동물 또는 영장류에서 드물게 발현되는 코돈을 영장류에서 빈번하게 발현되는 코돈으로 대체하도록 변형된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 전이유전자에 의해 인코딩되는 코딩 서열은 상기에 또는 본원에 기술된 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드에 적어도 85% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 98% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖고, 코딩 서열의 적어도 하나의 코돈이 상기에 또는 본원에 기술된 서열 내 상응하는 코돈보다 더 높은 tRNA 빈도를 갖는, 폴리펩티드를 인코딩한다.
본 발명의 부가적인 실시양태에서, 전이유전자의 코딩 서열은 바람직한 전이유전자를 인코딩하지 않는 개방 판독 프레임 (ORF)의 종결 또는 제거에 의해 발현을 증강시키도록 변형된다. 개방 판독 프레임 (ORF)은 개시 코돈을 수반하고 정지 코돈을 함유하지 않는 핵산 서열이다. ORF는 정방향 또는 역방향일 수 있고, 관심 유전자에 대해 "프레임 내 (in frame)" 또는 "프레임 외 (out frame)"일 수 있다. 이러한 개방 판독 프레임은 관심 유전자와 더불어 발현 카세트 내에서 발현될 가능성을 가지며, 바람직하지 않은 부작용을 초래할 수 있다. 본 발명의 일 측면에서, 전이유전자의 코딩 서열은 코돈 용법을 추가로 변경함으로써 개방 판독 프레임을 제거하도록 변형된다. 이는 관심 유전자에서 아미노산 서열을 보존하고 고도로 이용되는 코돈 (즉, < 20%의 빈도를 갖는 코돈은 회피함)은 유지하면서, 개시 코돈 (ATG)을 제거하고 역방향 또는 프레임 외 ORF로 정지 코돈 (TAG, TAA, 또는 TGA)을 도입함으로써 달성되었다. 본 발명에서, 전이유전자의 코딩 서열은 코돈 최적화 및 비-전이유전자 ORF의 제거의 어느 하나 또는 이 두 기술 모두에 의해 최적화될 수 있다. 당해 분야의 숙련자에게 명백해지는 바와 같이, 코돈 최적화 도중에 도입된 ORF를 제거하기 위하여 코돈 최적화 이후에 비-전이유전자 ORF를 제거하거나 최소화하는 것이 바람직하다. 코돈 최적화 및 ORF의 제거의 예시가 도3A - 3C에 나타나 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 폴리아데닐화 영역을 추가로 포함한다. 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, RNA 폴리머라제 II 전사체는 폴리 A 시그널, 폴리 A 영역 또는 폴리 A 테일로도 알려진, 폴리아데닐화 영역의 절단 및 부가에 의해 종결된다. 폴리 A 영역은 종종 모티프 AAUAAA의 반복을 갖는, 다수의 연속적인 아데노신 모노포스페이트를 함유한다. SV40, 소 성장 호르몬, 인간 성장 호르몬 및 토끼 베타 글로빈을 비롯한 몇몇 효율적인 폴리아데닐화 부위가 동정되어 있다 (Xu et al, 2001; Gene 272: 149; Xu et al., 2002; J Control Rel. 81: 155). 원추세포에서 전이유전자의 발현을 위한 가장 효율적인 폴리A 시그널은 관심 세포 유형 및 종과 사용된 특정 벡터에 좌우될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트는 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 90 또는 서열번호 91 또는 임의의 전술한 서열의 기능적 단편 또는 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리A 영역을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 폴리A 영역은 서열번호 90 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 폴리A 영역은 서열번호 90 또는 이의 변이체로 필수적으로 이루어진다.
숙련자에게 인식될 것인 바와 같이, 전술한 폴리뉴클레오티드 요소들의 2개 이상이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트를 생성하기 위해 조합될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 향상된 5'UTR 서열에 작동가능하게 연결된 향상된 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역, 예를 들어 서열번호 84 또는 서열번호 85에 작동가능하게 조합된 서열번호 80을 포함할 수 있고, 예컨대 서열번호 2, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 93, 서열번호 94, 또는 서열번호 95를 참조한다. 또 다른 예시로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 향상된 프로모터 서열 또는 영역에 작동가능하게 연결된 향상된 인핸서 서열 또는 영역, 예를 들어 서열번호 80, 서열번호 2, 서열번호 54, 서열번호 55, 또는 서열번호 93에 작동가능하게 조합된 서열번호 51 또는 서열번호 52를 포함할 수 있고; 예컨대 서열번호 92 또는 서열번호 95를 참조한다. 또 다른 예시로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 향상된 인트론 서열과 작동가능하게 연결된 향상된 5'UTR 서열, 예를 들어 서열번호 60에 작동가능하게 조합된 서열번호 84 또는 서열번호 86을 포함할 수 있고; 예컨대 서열번호 94 또는 서열번호 95를 참조한다. 또 다른 예시로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 향상된 인트론 서열 및 향상된 코작 서열에 작동가능하게 연결된 향상된 5'UTR 서열, 예를 들어, 서열번호 60 및 서열번호 73에 작동가능하게 조합된 서열번호 84 또는 서열번호 86을 포함할 수 있고; 예컨대 서열번호 95를 참조한다. 또 다른 예시로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 작동가능하게 연결된 향상된 인핸서, 향상된 프로모터, 향상된 5'UTR, 향상된 인트론, 향상된 코작 및 향상된 폴리A 영역을 포함할 수 있고; 예컨대 서열번호 95를 참조한다. 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 요소들 모두의 다른 조합이 숙련자에 의해 용이하게 인식될 것이다.
부가적으로, 당해 분야의 숙련자에 의해 인식될 것인 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 카세트는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 특정 유전자 발현 벡터를 위한 클로닝을 용이하게 하는 제한 부위 및 조절성 요소를 포함하는 다른 요소를 선택적으로 함유할 수 있다. 조절성 서열의 예시에는 AAV 벡터용 ITR, 플라스미드 벡터용 세균성 서열, 파아지 인테그라제 벡터용 attP 또는 attB 부위, 및 트랜스포존용 전치 (transposable) 요소가 포함된다.
유전자 요법 벡터
상기에 언급된 바와 같이, 본 발명의 일부 측면에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는, 예컨대 유전자가 세포 생존력 및/또는 기능에 미치는 효과의 결정, 원추세포 장애의 치료를 위해, 동물의 원추세포에 유전자를 전달하는데 사용된다. 따라서, 발명의 일부 측면에서, 원추세포에서 전이유전자의 발현을 제공하기 위한 조성물은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터이다.
원추세포에 폴리뉴클레오티드 서열을 전달하는데 용도를 확인한 임의의 통상의 유전자 요법 벡터가 본 발명의 유전자 전달 벡터에 포함된다. 예를 들어, 벡터는 단일 또는 이중 가닥 핵산, 예컨대 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자 전달 벡터는 네이키드 (naked) DNA, 예컨대 플라스미드, 미니서클 등일 수 있다. 또 다른 예시로서, 유전자 전달 벡터는 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 또는 레트로바이러스, 예컨대 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 (M-MuLV), 몰로니 마우스 육종 바이러스 (MoMSV), 하베이 마우스 육종 바이러스 (HaMuSV), 마우스 유방암 바이러스 (MuMTV), 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스 (GaLV), 고양이 백혈병 바이러스 (FLV), 스푸마바이러스, 프렌드 마우스 백혈병 바이러스, 마우스 줄기세포 바이러스 (MSCV) 및 라우스 육종 바이러스 (RSV) 또는 렌티바이러스일 수 있다. 아데노-연관 바이러스의 사용을 포함하는 실시양태가 이하에서 상세히 기술된다고 하더라도, 당해 분야의 유사한 지식 및 기술이 비-AAV 유전자 요법 벡터 또한 이용할 수 있음을 숙련자가 인식할 것으로 예상된다. 예를 들어, 이들의 전체 기재가 본원에 참조로서 포함되는, 예컨대 미국특허 제7,585,676호 및 미국특허 제8,900,858호에 개시된 레트로바이러스 벡터의 논의, 예컨대 미국특허 제7,858,367호에 개시된 아데노바이러스 벡터의 논의를 참고한다.
일부 실시양태에서, 유전자 전달 벡터는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)이다. 이러한 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 그의 5' 및 3' 말단이 기능성 AAV 역방향 말단 반복 (ITR) 서열로 연접된다. "기능성 AAV ITR 서열"은, ITR 서열이 AAV 비리온의 복구, 복제 및 패키징을 위해 의도된 바와 같이 기능하는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달 벡터에 사용하기 위한 AAV ITR는 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요가 없으며, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있거나 AAV ITR는 몇몇 AAV 혈청형, 예컨대 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10의 어느 하나로부터 유래될 수 있다. 바람직한 AAV 벡터는 전체 또는 부분적으로 결실되었지만, 기능성 연접 ITR 서열을 보유하는, 야생형 REP 및 CAP 유전자를 갖는다.
이러한 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 제한 없이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 등을 포함하는 임의의 아데노-연관 바이러스 혈청형으로부터 유래될 수 있는 AAV 캡시드 내에 캡시드 조립된다. 예를 들어, AAV 캡시드는 야생형, 또는 천연형, 캡시드일 수 있다. 특히 흥미로운 야생형 AAV 캡시드로는 AAV2, AAV5, 및 AAV9가 포함된다. 그러나, ITR에서와 같이, 캡시드는 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요가 없으며, 그보다는 캡시드가 원추세포를 형질도입할 수 있는 한, VP1, VP2 또는 VP3 서열에서 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 다르게 말하면, AAV 캡시드는 변이체 AAV 캡시드일 수 있다. 특히 흥미로운 변이체 AAV 캡시드는 AAV2의 잔기 580-600 또는 다른 AAV의 상응하는 잔기, 예컨대 그의 전체 기재가 참조로서 본원에 포함되는, 미국공개특허 제2014/0294771호에 기술된 바와 같은, LGETTRP, NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF, 또는 STGKVPN 내부에 펩티드 삽입을 포함하는 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 하나의 AAV의 캡시드 (cap) 유전자 및 상이한 AAV로부터의 ITR를 사용하여 형성된 "위형 (pseudotyped)" AAV, 예컨대 AAV2 기반 벡터 함유 플라스미드와 함께 AAV2 유래의 rep 및 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 또는 AAV9 유래의 cap을 사용하여 형성된 위형 AAV2이다. 예를 들어, AAV 벡터는 rAAV2/1, rAAV2/3, rAAV2/4, rAAV2/5, rAAV2/6, rAAV2/7, rAAV2/8, rAAV2/9 등일 수 있다. 바람직하게는, rAAV는 AAV 벡터가 독립적으로 추가 복제를 할 수 없고 그의 게놈을 패키징할 수 없는 복제 결함이다. 예를 들어, 원추세포가 rAAV 비리온으로 형질도입되는 경우, 유전자는 형질도입된 원추세포에서 발현되지만, 형질도입된 원추세포가 AAV rep 및 cap 유전자와 부속 기능성 유전자를 결여하고 있다는 사실로 인해, rAAV는 복제할 수 없다.
유전자 요법 벡터, 예컨대 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트를 캡시드 조립한 rAAV 비리온은 표준 방법론을 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, rAAV 비리온의 경우, 본 발명에 따른 AAV 발현 벡터는 AAV 헬퍼 작제물의 도입에 이어, 생산자 세포 내로 도입될 수 있는데, 상기 헬퍼 작제물은 생산자 세포에서 발현될 수 있는 AAV 코딩 영역을 포함하고 AAV 벡터에 부재인 AAV 헬퍼 기능을 보완한다. 이는 생산자 세포 내로 헬퍼 바이러스 및/또는 부가적인 벡터의 도입을 ㅅ수반하고, 헬퍼 바이러스 및/또는 부가적인 벡터는 효율적인 rAAV 바이러스 생산을 지원할 수 있는 보조 기능을 제공한다. 그 후에 생산자 세포를 배양하여 rAAV를 생산한다. 이들 단계는 표준 방법론을 이용하여 수행된다. 본 발명의 재조합 AAV 벡터를 캡시드 조립한 복제-결함 AAV 비리온은 AAV 패키징 세포 및 패키징 기술을 이용하여 당해 분야에 공지된 표준 기술에 의해 제조된다. 이들 방법의 예시는, 이들 전체가 참조로서 본원에 명백히 포함되는, 미국특허 제5,436,146호; 제5,753,500호, 제6,040,183호, 제6,093,570호 및 제6,548,286호에서 확인할 수 있다. 패키징을 위한 추가의 조성물 및 방법이 또한 그 전체가 본원에 참조로서 포함되는, 문헌 [Wang et al., 미국특허공개 제2002/0168342호]에 기술되어 있다.
이로 제한되는 것은 아니지만, 하기의 실시예에 기술된 것들과 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트의 전달을 위한 바이러스 입자를 생산하는 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 원추세포를 효과적으로 형질도입하는데 적합한 임의의 농도의 바이러스 입자가 시험관 내 또는 생체 내에서 원추세포와의 접촉을 위해 제조될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 입자는 108 벡터 게놈/ml 또는 그 이상, 예를 들어, 5×108 벡터 게놈/ml; 109 벡터 게놈/ml; 5×109 벡터 게놈/ml, 1010 벡터 게놈/ml, 5×1010 벡터 게놈/ml; 1011 벡터 게놈/ml; 5×1011 벡터 게놈/ml; 1012 벡터 게놈/ml; 5×1012 벡터 게놈/ml; 1013 벡터 게놈/ml; 1.5×1013 벡터 게놈/ml; 3×1013 벡터 게놈/ml; 5×1013 벡터 게놈/ml; 7.5×1013 벡터 게놈/ml; 9×1013 벡터 게놈/ml; 1×1014 벡터 게놈/ml, 5×1014 벡터 게놈/ml 또는 그 이상이지만, 전형적으로 1×1015 벡터 게놈/ml을 초과하지 않는 농도로 제제화될 수 있다. 유사하게, 바람직한 효과를 부여하거나 질환을 치료하기 위해 망막 원추세포의 적절한 형질도입을 제공하기에 적합한 바이러스 입자의 임의의 총 개수가 포유동물 또는 영장류의 눈에 투여될 수 있다. 다양한 바람직한 실시양태에서, 적어도 108; 5×108; 109; 5×109, 1010, 5×1010; 1011; 5 ×1011; 1012; 5×1012; 1013; 1.5 ×1013; 3×1013; 5×1013; 7.5×1013; 9×1013, 1×1014 바이러스 입자, 또는 5×1014 바이러스 입자 또는 그 이상이지만, 전형적으로 1×1015 바이러스 입자를 초과하지 않는 입자가 한쪽 눈당 주입된다. 포유동물 또는 영장류 눈에 임의의 적합한 수의 벡터가 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 방법은 단일 투여를 포함하고; 다른 실시양태에서, 다수의 투여는 담당 임상의에 의해 적합한 것으로 생각되는 바와 같은 시간에 걸쳐서 이루어진다.
본 발명의 바이러스 벡터는, 제한 없이, 1×108 벡터 게놈 또는 그 이상, 예를 들어, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 또는 1×1013 벡터 게놈 또는 그 이상, 일부 경우에는, 1×1014 벡터 게놈이지만, 일반적으로 4×1015 벡터 게놈을 초과하지 않는 것을 포함하는, 임의의 적합한 단위 용량 내로 제제화될 수 있다. 일부 경우에, 단위 용량은 최대 약 5×1015 벡터 게놈, 예컨대 1×1014 벡터 게놈 또는 그 이하, 예를 들어 1×1013, 1×1012, 1×1011, 1×1010, 또는 1×109 벡터 게놈 또는 그 이하, 일부 경우에, 1×108벡터 게놈 또는 그 이하이고, 전형적으로 1×108 벡터 게놈 이상이다. 일부 경우에, 단위 용량은 1×1010 내지 1×1011 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 단위 용량은 1×1010 내지 3×1012 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 단위 용량은 1×109 내지 3×1013 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 단위 용량은 1×108 내지 3×1014 벡터 게놈이다.
일부 경우에, 약제학적 조성물의 단위 용량은 감염 다중도 (MOI)를 이용하여 측정될 수 있다. MOI는, 핵산이 전달될 수 있는 세포에 대한 벡터 또는 바이러스 게놈의 비율, 또는 배수를 의미한다. 일부 경우에, MOI는 1×106일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1×105 - 1×107일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1×104 - 1×108일 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 적어도 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017, 및 1×1018 MOI이다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 1×108 내지 3×1014 MOI이다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 최대 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017, 및 1×1018 MOI이다.
일부 측면에서, 약제학적 조성물의 양은 약 1×108 내지 약 1×1015 재조합 바이러스, 약 1×109 내지 약 1×1014 재조합 바이러스, 약 1×1010 내지 약 1×1013 재조합 바이러스, 또는 약 1×1011 내지 약 3×1012 재조합 바이러스를 포함한다.
본 발명의 rAAV 조성물의 제조 시에, rAAV 비리온의 생산을 위해, 예를 들어, 포유동물 세포 (예컨대, 293 세포), 곤충 세포 (예컨대, SF9 세포), 미생물 및 효모를 포함하는 임의의 숙주 세포가 사용될 수 있다. 숙주 세포는 또한 AAV 벡터 게놈이 안정적으로 유지되고 패키징된 숙주 세포 또는 생산자 세포에서 AAV rep 및 cap 유전자가 안정적으로 유지되는 세포를 패키징할 수 있다. 예시적인 패키징 및 생산자 세포는 SF-9, 293, A549 또는 HeLa 세포로부터 유래한다. AAV 벡터는 당해 분야에 공지된 표준 기술을 이용하여 정제되고 제제화된다.
원추세포와 생체 내에서 접촉하는 경우에, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터는 눈으로의 전달에 적합한 바와 같이 처리될 수 있다. 특히, 본 발명은 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 카세트 또는 유전자 전달 벡터 및 약제학적으로-허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 또는 유전자 전달 벡터는 일반적으로 안정하고, 비독성이고, 바람직한 제형을 제조하는데 유용한 약제학적으로-허용가능한 담체, 희석제 및 시약과 조합될 수 있고, 영장류 사용에 허용가능한 부형제를 포함한다. 이러한 부형제는 고체, 액체, 반고체일 수 있고, 에어로졸의 경우에는, 기체일 수 있다. 이러한 담체 또는 희석제의 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 물, 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민이 포함된다. 보조적 활성 화합물이 또한 제제 내로 혼입될 수 있다. 제제에 사용되는 용액 또는 현탁액은 주사용수, 식염수액, 고정화유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항생제 화합물; 아스코르브산 또는 소디움 바이설페이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)과 같은 킬레이팅 화합물; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제; 응집 방지를 위한 트윈 20과 같은 계면활성제; 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 장성 (tonicity) 조절을 위한 화합물을 포함할 수 있다. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절될 수 있다.
본 발명의 내복용에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 추가로 포함한다. 정맥 내 투여를 위해, 적합한 담체에는 생리학적 식염수, 정균수, 또는 인산염 완충 식염수 (PBS)가 포함된다. 일부 경우에, 조성물은 멸균이고 용이한 주사능이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 특정 실시양태에서, 이는 제조 및 보관 조건 하에서 안정하고 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보호된다. 담체는, 예컨대, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는, 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성이, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등 다양한 항생제 및 항진균제에 의해 달성될 수 있다. 다수의 경우에, 조성물 내에, 예를 들어 당류, 만니톨과 같은 다가알코올, 소르비톨, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 경구 조성물의 연장된 흡수는 조성물 내 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 암모늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함하으로써 일어날 수 있다.
멸균 용액은 요구되는 바와 같이, 상기에 열거된 성분들의 하나 또는 이의 조합과 활성 화합물을 적합한 용매 중에 요구되는 양으로 혼입하고, 이어서 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 상기에 열거된 것들로부터 요구되는 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 이의 미리 멸균 여과된 용액으로부터 활성 화합물의 분말 더하기 임의의 부가적인 바람직한 성분의 분말을 양산하는 진공 건조 및 동결-건조이다.
일 실시양태에서, 활성 화합물은 몸체로부터의 신속한 제거로부터 화합물을 보호할 담체와 함께, 예컨대 임플란트 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 제형으로 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴릭락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머가 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 재료들 또한 상업적으로 입수할 수 있다. 리포좀 현탁액 (바이러스 항원에 대한 단일클론 항체를 갖는 감염된 세포에 표적화된 리포좀 포함)이 또한 약제학적으로 허용가능한 담체로 사용될 수 있다. 이들은 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 미국특허 제4,522,811호에 기술된 바와 같은 방법에 따라서 제조될 수 있다.
투여의 용이성 및 투약의 균일성을 위해 경구 또는 비경구 조성물을 투약 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같이, 투약 단위 형태는 치료되는 개체를 위한 단일 투약에 적합한 물리적으로 독립된 단위를 지칭하고; 각 단위는 요구되는 약제학적 담체와 관련하여 바람직한 치료적 효과를 나타내도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투약 단위 형태에 대한 설명서는 활성 화합물 및 달성되는 특정의 치료적 효과의 고유의 특성, 및 개인의 치료를 위한 활성 화합물과 같은 배합 분야에 내재적인 제한들에 의해 지시되고 직접적으로 좌우된다.
약제학적 조성물은 용기, 팩, 또는 분배기, 예컨대 사전충전 주사기와 같은 주사기 내에 투여를 위한 사용설명서와 함께 포함될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 임의의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 또는 이러한 에스테르의 염, 또는 인간을 비롯한 동물에의 투여 시, 생물학적으로 활성 대사물 또는 이의 잔사를 (직접적으로 또는 간적접으로) 제공할 수 있는, 임의의 다른 화합물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 전구약물 및 약제학적으로 허용가능한 염, 이러한 전구약물의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 기타 생체-등가물에 관한 것이다.
용어 "전구약물"은 몸체 또는 이의 세포 내에서 효소 또는 다른 화학물질 및/또는 조건의 작용에 의해 활성 형태 (즉, 약물)로 전환되는 불활성 형태로 제조되는 치료제를 나타낸다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 본 발명의 화합물의 생리학적 및 약제학적으로 허용가능한 염: 즉, 모체 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 보유하고 그에 바람직하지 않은 독성학적 효과를 부과하지 않는 염을 지칭한다. 다양한 약제학적으로 허용가능한 염이 당해 분야에 공지되어 있고, 예컨대 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th edition, Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985 (and more recent editions thereof), in the "Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology", 3rd edition, James Swarbrick (Ed.), Informa Healthcare USA (Inc.), NY, USA, 2007, and in J. Pharm. Sci. 66: 2 (1977). Also, for a review on suitable salts, see Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use by Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, 2002)]에 기술되어 있다.
약제학적으로 허용가능한 염기 부가염은 금속 또는 아민, 예컨대 알칼리 및 알칼리토 금속 또는 유기 아민을 이용해 형성된다. 양이온으로 사용되는 금속은 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등을 포함한다. 아민은 N-N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 디시클로헥실아민, 에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 및 프로카인을 포함한다 [예를 들어, 문헌 (Berge et al., "Pharmaceutical Salts," J. Pharma Sci., 1977, 66, 119) 참조]. 상기 산 화합물의 염기 부가염은 통상의 방식으로 염을 생산하기에 충분한 양의 바람직한 염기와 유리 산 형태를 접촉시킴으로써 제조된다. 유리 산 형태는 통상의 방식으로 산과 염 형태를 접촉시키고 유기 산을 분리함으로써 재생성될 수 있다. 유리 산 형태는 극성 용매 중의 용해도와 같은 특정한 물리적 특성이 다소 이들 각각의 염과 다르지만, 그 이외에 염은 본 발명의 목적을 위해 이들 각각의 유리 산과 등가이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 또는 유전자 전달 벡터, 예컨대 재조합 바이러스 (비리온)는 포유동물 환자, 특히 영장류, 더욱 구체적으로 인간에의 투여를 위한 약제학적 조성물 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 또는 유전자 전달 벡터, 예컨대 비리온은 바람직하게는 3 내지 8 범위의 pH, 더욱 바람직하게는 6 내지 8 범위의 pH에서 비독성, 불활성, 약제학적으로 허용가능한 수성 담체 내에 제제화될 수 있다. 이러한 멸균 조성물은 재구성 시 허용가능한 pH를 갖는 수성 완충제에 용해된 치료적 분자를 인코딩하는 핵산을 함유하는 벡터 또는 비리온을 포함할 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제, 예를 들어 식염수, 인산염 완충 식염수, 인산염 및 아미노산, 폴리머, 폴리올, 당류, 완충제, 보존제 및 기타 단백질과의 혼합물로서 치료학적 유효량의 벡터 또는 비리온을 포함한다. 예시적인 아미노산, 폴리머 및 당류 등은 옥틸펜옥시 폴리에톡시 에탄올 화합물, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 화합물, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 수크로스, 프럭토스, 말토스, 글루코스, 만니톨, 덱스트란, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 자일리톨, 락토스, 트레할로스, 소 또는 인간 혈청 알부민, 시트레이트, 아세테이트, 링거액 및 행크액, 시스테인, 아르기닌, 카르니틴, 알라닌, 글리신, 리신, 발린, 류신, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 및 글리콜이다. 바람직하게는, 이 제형은 4℃에서 적어도 6개월간 안정하다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 완충제, 예컨대 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 나트륨 포스페이트/나트륨 설페이트, 트리스 완충제, 글리신 완충제, 멸균수 및 문헌 [Good et al. (1966) Biochemistry 5: 467]에 기술된 것들과 같이 숙련자에게 공지된 기타 완충제를 포함한다. 종약 억제 유전자를 포함하는 약제학적 조성물이 아데노바이러스 벡터 전달 시스템 내 포함되는 완충제의 pH는 6.5 내지 7.75, 바람직하게는 7 내지 7.5, 가장 바람직하게는 7.2 내지 7.4의 범위 내일 수 있다.
방법
상기에 언급된 바와 같이, 본원에서 종합적으로 "본 발명의 조성물"로 언급되는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 및 유전자 전달 벡터는 동물의 원추세포에서 전이유전자를 발현하는데 있어 용도를 확인한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은, 예컨대 유전자가 원추세포 생존력 및/또는 기능에 미치는 효과를 결정하기 위한 연구에 사용될 수 있다. 또 다른 예시로서, 본 발명의 조성물은, 예컨대 원추세포 장애를 치료하기 위한 약제에 사용될 수 있다. 따라서, 발명의 일부 측면에서, 원추세포에서 유전자의 발현을 위한 방법이 제공되고, 이 방법은 원추세포를 본 발명의 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 접촉은 시험관 내에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 접촉은 생체 내에서 일어나는데, 즉, 본 발명의 조성물은 개체에 투여된다.
원추세포가 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터와 시험관 내에서 접촉되는 경우, 세포는 임의의 포유동물 종, 예컨대 설치류 (예컨대, 마우스, 래트, 모래쥐, 다람쥐), 토끼, 고양이, 개, 염소, 양, 돼지, 말, 소, 영장류, 인간 유래일 수 있다. 세포는 확립된 세포주, 예컨대 WERI 세포, 661W 세포 유래일 수 있고, 또는 이들은 일차 세포일 수 있는데, "일차 세포", "일차 세포주", 및 "일차 배양"은 개체로부터 유래되었고 제한된 회수의 계대 배양, 즉 분할 (splittings) 동안 시험관 내에서 성장이 허용되었던 세포 또는 세포 배양물을 지칭하기 위해 본원에서 호환적으로 사용된다. 예를 들어, 일차 배양은, 고비 단계를 통과하기에 충분한 회차는 아니지만, 0회, 1회, 2회, 4회, 5회, 10회, 또는 15회 계대되었을 수 있는 배양이다. 전형적으로, 본 발명의 일차 세포주는 시험관 내에서 10회 미만의 계대 동안 유지된다.
만약 세포가 일차 세포라면, 이들은 예컨대 전체 외식체 (whole explants), 생검 등의 임의의 통상의 방법에 의해 포유동물로부터 채취할 수 있다. 적합한 용액이 채취된 세포의 분산 또는 현탁을 위해 사용될 수 있다. 이러한 용액은 일반적으로 5-25 mM의 낮은 농도에서 허용가능한 완충제와 함께, 송아지 태아 혈청 또는 다른 자연 발생적인 인자가 용이하게 보충된, 통상의 식염수, PBS, 행크 평형화된 염 용액 등과 같은, 일반적으로 평형화된 염 용액일 것이다. 통상의 완충제에는 HEPES, 포스페이트 완충제, 락테이트 완충제 등이 포함된다. 세포는 즉시 사용될 수 있거나, 또는 장기간 동안 보관되고 냉동될 수 있고, 해동되고 재사용될 수 있다. 이러한 경우에, 세포는 보통 10% DMSO, 50% 혈청, 40% 완충된 배지, 또는 이러한 냉동 온도에서 세포를 보존하기 위해 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 다른 용액 중에서 냉동되고, 냉동된 배양 세포를 해동하기 위해 당해 분야에 일반적으로 공지된 방식으로 해동될 것이다.
전이유전자의 발현을 촉진하기 위하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터는 약 30분 내지 24시간 또는 그 이상, 예컨대, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 12시간, 16시간, 18시간, 20시간, 24시간 등 동안 세포와 접촉할 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터는 1회 이상의 회차, 예컨대 1회, 2회, 3회, 또는 3회 초과의 회차로 본 발명의 세포에 제공될 수 있고, 세포는 각각의 접촉 사건 후에 약간의 시간 동안, 예컨대 16-24시간 동안 제제(들)과 인큐베이션되게 하였고, 그 시간 후에 배지를 신선한 배지로 교체하고 세포를 더욱 배양하였다. 세포의 접촉은 임의의 배양 배지에서 세포의 생존을 촉진하는 임의의 배양 조건 하에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 세포는 송아지 태아 혈청 또는 열 불활성화 염소 혈청 (약 5-10%), L-글루타민, 티올, 특히 2-머캅토에탄올, 및 항생제, 예컨대 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 이스코브 (Iscove's) 변형 DMEM 또는 RPMI 1640과 같은, 편리한 임의의 적합한 영양 배지 중에 현탁될 수 있다. 배양은 세포가 그에 반응성인 성장 인자를 함유할 수 있다. 본원에 정의된 바와 같이, 성장 인자는 막횡단 수용체에 대한 특이적 효과를 통해서, 배양액에서 또는 원래 조직에서, 세포의 생존, 성장 및/또는 분화를 촉진할 수 있는 분자이다. 성장 인자는 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 인자를 포함한다.
전형적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터의 유효량이 세포에서 전이유전자의 발현을 생산하기 위해 제공된다. 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 유효량은, 예컨대 전이유전자의 유전자 산물의 존재 또는 수준의 검출, 원추세포의 생존력 또는 기능에 대한 효과의 검출 등에 의해 실증적으로 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터의 유효량은 당해 분야에 공지된 폴리뉴클레오티드 카세트, 예컨대 pR2.1 (서열번호 50의 뉴클레오티드 1-2274), pR1.7, pR1.5, pR1.1, 또는 IRBP/GNAT2 카세트의 동일한 양에 비해 원추세포에서 더 많은 전이유전자의 발현을 촉진할 것이다. 전형적으로, 발현은 레퍼런스, 또는 대조군, 당해 분야에 공지된 것과 같은 폴리뉴클레오티드 카세트로부터의 발현에 비해, 2배 이상, 예를 들어 3배, 4배, 또는 5배 이상, 일부 경우에서는, 10배, 20배 또는 50배 이상, 예컨대 100배 증강될 것이다.
일부 실시양태에서, 전이유전자가 선택성 마커인 경우에서와 같이, 세포의 집단은 잔여 집단으로부터 변형된 세포를 분리함으로써 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 세포들에 대해 농화될 수 있다. 분리는 사용된 선택성 마커에 적합한 임의의 통상의 분리 기술에 의해서일 수 있다. 예를 들어, 전이유전자가 형광성 마커라면, 세포는 형광 활성화 세포 분류에 의해서 분리될 수 있는 반면, 전이유전자가 세포 표면 마커라면, 세포는 친화성 분리 기술, 예컨대 자기 분리, 친화성 크로마토그래피, 고체 매트릭스에 부착된 친화성 제제를 이용한 "패닝 (panning)", 또는 기타 통상의 기술에 의해 이종 집단으로부터 분리될 수 있다. 정확한 분리를 제공하는 기술에 형광 활성화 세포 분류기가 포함되는데, 이는 다양한 색깔 채널, 저 각도 및 둔감한 (obtuse) 빛 산란 검출 채널, 임피던스 채널 등과 같이, 다양한 정도의 정교함을 가질 수 있다. 세포는 사균과 연관된 염료 (예컨대, 프로피디움 요오드화물)를 사용하여 사균에 대해 선택될 수 있다. 세포의 생존력에 과도하게 해롭지 않은 임의의 기술이 이용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포에 대해 고도로 농화된 세포 조성물이 이러한 방식으로 달성된다. "고도로 농화된"은, 유전적으로 변형된 세포가 세포 조성물의 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 예를 들어, 약 95% 이상, 또는 세포 조성물의 98% 이상일 것임을 의미한다. 달리 말하면, 조성물은 유전적으로 변형된 세포의 실질적으로 순수한 조성물일 수 있다.
원추세포가 생체 내에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터와 접촉하게 되는 경우, 개체는 임의의 포유동물, 예컨대 설치류 (예컨대, 마우스, 래트, 모래쥐), 토끼, 고양이, 개, 염소, 양, 돼지, 말, 소, 또는 영장류일 수 있다. 특정 실시양태에서, 개체는 협비원소목 (Parvorder Catarrhini)의 영장류이다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 협비원류는 고등 영장류의 2개 하류문의 하나이고 (다른 하나는 광비류임 (New World monkeys)), 구세계 원숭이 (Old World monkeys) 및 유인원류를 포함하며, 이는 다시 소형 유인원류 또는 긴팔원숭이류 및 대형 유인원류로 더욱 분류되고, 이는 오랑우탄, 고릴라, 침팬지, 보노보 (bonobos), 및 인간으로 이루어진다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 영장류는 인간이다.
본 발명의 조성물은 임의의 적합한 방법에 의해 개체의 망막에 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 유리체 내 주입 또는 망막하 주입을 통해 안구 내로 투여될 수 있다. 유리체 내 주입을 통해서 또는 망막하 주입을 통해서 벡터를 전달하는 일반적인 방법은 하기의 간단한 개요에 의해 설명될 것이다. 이들 예시는 단지 방법의 특정한 특성을 설명하는 것을 의미할 뿐이고, 어떠한 방식으로도 제한하는 것이 아니다.
망막하 투여의 경우, 벡터는 수술 현미경을 이용하면서 직접적인 관찰 하에서 망막하로 주입되는 현탁액의 형태로 전달될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 조성물의 1 내지 200 μL, 예컨대 50 μL, 100 μL, 150 μL, 또는 200 μL이지만, 200 μL를 초과하지 않는 부피가 이러한 방법에 의해 투여될 것이다. 이 과정은 망막하 공간 내로 1회 이상의 작은 망막절개 (retinotomies)를 통한 미세 캐뉼라를 사용하여 벡터 현탁액의 주입에 이은 유리체 절제술 (vitrectomy)을 포함할 수 있다. 간략히, 수술 내내 (예컨대, 식염수의) 주입에 의한 정상적인 안구 부피를 유지하기 위해 주입 캐뉼라가 그 자리에서 봉합될 수 있다. 유리체 절제술은 적합한 내경 크기 (예를 들어, 20 내지 27 게이지)의 캐뉼라를 사용하여 수행되고, 이때 제거되는 유리체 겔의 부피는 주입 캐뉼라로부터 식염수 또는 다른 등장액의 주입ㅇ으로 대체된다. (1) 그의 피질 (후유리체막)의 제거가 캐뉼라에 의한 망막의 침투를 용이하게 하고; (2) 이의 제거 및 유체 (예컨대, 식염수)로의 대체가 벡터의 안구 내 주입을 수용하기 위한 공간을 생성하며; (3) 그의 제어된 제거가 망막 파열 및 계획되지 않은 망막 분리의 가능성을 감소시키기 때문에, 유리체 절제술이 유리하게 실시된다.
유리체 내 투여의 경우, 벡터는 현탁액의 형태로 전달될 수 있다. 처음에, 국소 소독액에 이어서 국소 마취제를 눈의 표면에 적용한다. 기구를 사용하거나 사용하지 않고, 눈을 뜬 상태로 유지하고, 직접 관찰 하에서 짧고, 좁은, 예를 들어 30 게이지 바늘을 이용해 벡터를 개체 눈의 유리체강 내로 공막을 통해 주입한다. 전형적으로, 본 발명의 조성물의 1 내지 100 μL, 예컨대 25 μL, 50 μL, 또는 100 μL, 및 보통 100 μL 미만의 부피를 유리체의 제거 없이 유리체 내 주입에 의해 눈에 전달할 수 있다. 대안적으로, 유리체 절제술이 수행될 수 있고, 전체 부피의 유리체 겔이 본 발명의 조성물의 주입으로 대체된다. 이러한 경우에, 최대 약 4 mL의 본 발명의 조성물이, 예컨대 인간의 눈에 전달될 수 있디. 유리체 내 투여는 일반적으로 잘 용인된다. 절차가 종료되면, 종종 주입 부위에 경미한 발적이 일어난다. 때로는 함부로 다룰 수 없는 경우도 있지만, 대부분의 환자는 아무런 통증도 보고하지 않는다. 이 과정 후에 아무런 안대 또는 눈 보호구도 요구되지 않으며, 활동이 제한되지 않는다. 종종, 항생제 안약이 감염 예방을 돕기 위하여 수일간 처방된다.
본 발명의 방법 및 조성물은, 적어도 부분적으로, 원추 광수용체 세포의 유전자 요법에 의해 해소될 수 있는 임의의 상태의 치료에 용도를 갖는다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 원추세포 요법을 필요로 하는 개인의 치료에 있어 용도를 갖는다. 원추세포 요법을 필요로 하는 사람은, 원추세포 장애가 발병하였거나 발병할 위험에 있는 개인을 의미한다. "원추세포 장애"는, 망막 원추세포에 영향을 주는 임의의 장애를 의미하고, 이로 제한되는 것은 아니지만, 원추세포 내부의 결함, 즉 원추-내인성 결함과 연관된 눈의 시각 장애를 포함하는, 예컨대 스타가르트 황반 이영양증, 원추 이영양증, 원추-간상 이영양증, 척수소뇌성 실조증 유형 7, 및 바르데-비들 증후군-1과 같은 황반 이영양증; 뿐만 아니라 전색맹, 불완전 전색맹, 청색 원추 단색형색각, 및 적색각이상, 녹색각이상, 및 청색각이상 결함을 포함하는 색각 장애; 뿐만 아니라 (영장류에서) 원추세포를 표적함으로써 치료될 수 있는 중심 황반의 시각 장애, 예컨대 연령-관련 황반변성, 황반 모세혈관확장증, 막망 색소변성증, 당뇨병성 망막증, 망막 정맥 폐색, 녹내장, 솔스비 안저 이상증, 성인 난환형 황반 이영양증, 베스트병, 간상-원추 이영양증, 레베르 선천성 흑암시, 및 X-연관 망막분리를 포함한다.
스타가르트 황반 이영양증. 스타가르트병 및 노란점 안저 (fundus flavimaculatus)로도 알려진, 스타가르트 황반 이영양증은 법적 실명에 이를 때까지 진행성 시력 상실을 야기하는 청소년 황반 변성의 유전적 형태이다. 증상의 개시는 일반적으로 6세 내지 30세의 나이에 나타난다 (평균 약 16-18세). ABCA4, CNGB3, ELOVL4, PROM1을 포함하는 몇몇 유전자 내 돌연변이가 이 장애와 연관이 있다. 증상은 전형적으로 스무살까지 발생하고, 파형 시야 (wavy vision), 맹점, 흐릿함, 손상된 색각, 및 희미한 조명에 적응하는데 어려움이 포함된다. 스타가르트병의 주요 증상은 20/50 내지 20/200의 범위인 시력의 상실이다. 또한, 스타가르트병 환자들은 섬광에 민감하고; 잔뜩 흐린 날이 약간의 안도를 제공한다. 황반이 손상될 때, 시력이 가장 눈에 띄게 손상되고, 이는 안저 검사에 의해 관찰될 수 있다.
원추 이영양증. 원추 이영양증 (COD)은 원추세포의 손실을 특징으로 하는 유전적인 안구 장애이다. 원추 이영양증의 가장 일반적인 증상은 시력 상실 (십대 후반에서 60대 범위의 개시 연령), 강한 빛에 대한 민감성, 및 불량한 색각이다. 일반적으로 시력은 점진적으로 악화되지만, 20/200으로 급격히 악화될 수 있고; 그 후에, 더 심각한 경우에는, "카운팅 핑거 (counting fingers)" 시력으로 저하된다. 색깔 검사표 (HRR 시리즈)를 이용한 색각 검사는 적-녹 및 청-황 표에서 다수의 오류를 나타낸다. 원추체 기능의 주관적 및 객관적 비정상이 검안경적 (ophthalmoscopic) 변화가 나타날 수 있기 전에 발견되기 때문에, 이영양증이 일차인 것으로 여겨진다. 그러나, 망막 색소 상피 (RPE)가 신속히 관여하게 되고, 이는 황반을 주로 포함하는 망막 이영양증을 초래한다. 검안경을 통한 안저 검사는 원추 이영양증에서 초기에는 본질적으로 정상이고, 명백한 황반 변화는 보통 시력 상실 후에 잘 일어난다. 검안경적 검사 도중에 나타난 황반 병소의 가장 일반적인 유형은 불스 아이 (bull's-eye) 외관을 가지며 중심의 더 어두운 영역을 둘러싼 위축성 색소 상피의 도넛-유사 지역으로 이루어진다. 원추 이영양증의 또 다른, 덜 빈번한 형태에서는, 황반 영역에서 얼룩덜룩한 색소 응괴를 갖는 후극부의 상당한 미만성 위축이 존재한다. 드물게, 맥락막모세혈관층 (choriocapillaris) 및 더 큰 맥락막 혈관의 위축이 초기 단계의 환자에서 보여진다. 플루오레세인 혈관촬영 (FA)은 검안경에 의해 보여지기에는 너무 미세한 망막 내 초기 변화를 검출할 수 있기 때문에 원추 이영양증을 가질 것으로 의심되는 사람의 정밀검사에서 유용한 보조술이다. 안저 변화의 광범위한 스펙트럼 및 초기 단계에서 진단하는데 있어서의 곤란성으로 인해, 망막전위도검사 (ERG)는 진단을 내리기에 최선의 검사이다. ERG 상에서 비정상적 원추체 기능은 검사가 조명이 밝은 (well-lit) 방 (명소 ERG)에서 수행될 때 감소된 단일-섬광 및 깜박임 반응에 의해 나타난다. GUCA1A, PDE6C, PDE6H, 및 RPGR를 비롯한 여러 유전자에서의 돌연변이가 이 장애와 연관이 있다.
원추-간상 이영양증. 원추-간상 이영양증 (CRD, 또는 CORD)은 색소성 망막병증의 그룹에 속하는 유전적 망막 이영양증이다. CRD는 황반 영역에 주로 국소화된, 안저 검사에서 식별가능한 망막 색소 침착 및 원추세포 및 간상세포 둘 모두의 손실을 특징으로 한다. 간상 광수용체의 일차적 손실 및 이후에 후속된 원추 광수용체에서의 이차 손실로부터 비롯되는 간상-원추 이영양증 (RCD)과는 달리, CRD는 사건의 반대 순서를 나타낸다: 일차 원추 관련, 또는, 종종, 원추체 및 간상체 둘 모두의 동시 손실에 의함. 증상은 감소된 시력, 색각 결함, 광선공포증 (photoaversion) 및 중심 시야에서 감소된 감수성을 포함하고, 이후에 주변 시력 및 야맹증의 점진적인 손실을 수반한다. ADAM9, PCDH21, CRX, GUCY2D, PITPNM3, PROM1, PRPH2, RAX2, RIMS1, RPGR, 및 RPGRIP1을 포함하는 여러 유전자에서의 돌연변이가 이 장애와 연관이 있다.
척수소뇌성 실조증 유형 7. 척추소뇌성 실조증은 걸음걸이의 더딘 진행성의 불균형을 특징으로 하는 진행성, 퇴행성, 유전적 질환이고, 손, 말하기 및 눈 운동의 부조화와 연관된다. 다양한 유형의 SCA가 존재하는데, 척수소뇌성 실조증 유형 7 (SCA-7)은 시각적인 문제가 부조화와 더불어 일어날 수 있다는 점에서 대부분의 다른 SCAs와 다르다. SCA-7은 ATXN7/SCA7 유전자에서 상염색체 우성 돌연변이와 연관이 있다. 질환이 40세 이전에 분명히 나타나는 경우, 부조화보다는 시각적인 문제가 전형적으로 질환의 최초 징후이다. 초기 증상은 색깔을 구별하는데 있어서의 곤란성과 감소된 중심 시력을 포함한다. 또한, 운동실조의 증상 (불균형, 느린 눈 운동, 및 감각 및 반사에의 경미한 변화)이 검출가능할 수 있다. 운동 제어의 상실, 불명확한 말하기, 및 삼키는데 있어서의 곤란성이 이 질환이 진행함에 따라 두드러진다.
바르데-비들 증후군-1. 바르데-비들 증후군-1 (BBS-1)은 패밀리 내 및 패밀리간 모두에서 가변적인 발현도 및 광범위한 임상적 가변성을 갖는 다면발현성 (pleiotropic) 장애이다. 주된 임상적 특징은 야맹증이 선행된 소아기-발병 시력 상실; 측후성 다지증; 성인기 내내 문제가 되는 유아기 동안의 몸통 비만증; 모든 개인이 아닌 일부에서 특이적 학습 장애; 남성 성적불성숙 (hypogenitalism) 및 복합 여성 생식기 기형; 및 이환율 및 사망률의 주된 원인인, 신장 기능장애를 갖는, 간상-원추 이영양증이다. 시력 상실은 바르데-비들 증후군의 주된 특징들 중 하나이다. 야간 시력의 문제가 유년기 중반에서 명백해지고, 이어서 주변 시력에서 발생하는 맹점이 수반된다. 시간의 경과에 따라서, 이들 맹점은 확대되고 병합되어 터널성 시야 (tunnel vision)를 만든다. 바르데-비들 증후군을 갖는 대부분의 사람들은 또한 흐려진 중심 시야 (불량한 시력)가 발병하고 청소년기 또는 초기 성인기에 법적으로 실명이 된다. 바르데-비들 증후군은 섬모 기능에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려지거나 의심되는 14개 상이한 유전자들 (종종 BBS 유전자로 불림)에서의 돌연변이에서 비롯될 수 있으며, BBS1 및 BBS10에서의 돌연변이가 가장 일반적이다.
전색맹. 전색맹, 또는 간상 단색형색각 (Rod monochromatism)은 개체가 색깔 인식의 완전한 결여를 경험하고, 그로써 개체가 흑색, 백색, 및 회색의 음영만을 보는 장애이다. 다른 증상에는 감소된 시력, 광선공포증, 안구진탕, 작은 중심 암점, 및 중심외 주시가 포함된다. 이 장애는 이들의 광회피 활성 및/또는 이들의 안구진탕에 의해 대략 6개월 정도의 어린이에서 빈번하게 나타난다. 시력 및 눈 운동의 안정성은 일반적으로 생애의 처음 6-7년 동안에 향상된다 (그러나 여전히 20/200의 상태임). CNGB3, CNGA3, GNAT2, PDE6C, 및 PDE6HI에서의 돌연변이가 이 장애와 연관이 있었다.
불완전 전색맹. 불완전 전색맹은 전색맹과 유사하지만 더 낮은 침투도를 갖는다. 불완전 전색맹에서, 증상은 감소된 형태에서를 제외하고 완전 전색맹의 증상과 유사하다. 불완전 전색맹을 갖는 개인은 안구진탕 또는 광선공포증 존재 또는 부재의 감소된 시력을 갖는다. 나아가, 이들 개인은 원추세포 기능의 단지 부분적인 손상을 나타내지만 여전히 간상세포 기능을 보유하고 있다.
청색 원추 단색형색각. 청색 원추 (S 원추체) 단색형색각 (BCM)은 대략 100,000명 개인 중 1명이 걸리는, 드문 X-연관 선천적 정지상 원추 기능장애 증상이다. BCM에 걸린 남성은 L 및 M-옵신 유전자에 대한 유전적 유전자좌에서의 돌연변이로 인해, 망막에서 기능적 장파장 감수성 (L) 또는 중파장 감수성 (M) 원추체를 갖지 않는다. 색깔 식별은 출생시부터 심각하게 손상되고, 시력은 잔존하는 보존된 S 원추 및 간상 광수용체로부터 유도된다. BCM은 전형적으로 감소된 시력 (6/24 내지 6/60), 진자 안구진탕, 광선공포증을 나타내고, 환자는 종종 근시를 갖는다. 간상체-특이적 및 최대 망막전도 (ERG)는 보통 아무런 명백한 이상도 나타내지 않는 반면, 30 Hz 원추 ERG는 검출될 수 없었다. 단일 섬광 명순응 ERG가, 미미하고 후기이지만, 종종 판독가능하고, S 원추 ERG는 잘 보존된다.
색각 결함. 색각 결함 (CVD), 또는 색맹은 조명 조건하에서 색깔을 보거나, 색깔 차이를 인지하는데 있어 무능력 또는 감소된 능력이다. 색맹을 앓고 있는 개인은 다수의 색각 검사, 예컨대, 색깔 ERG (cERG), 가성동색표 (pseudoisochromatic plates) [이시하라표 (Ishihara plates), 하디-랜드-리터 다색표 (Hardy-Rand-Ritter polychromatic plates)], FM 100 색상 검사 (Farnsworth-Munsell 100 hue test), 판즈워쓰 패널 (Farnsworth's panel) D-15, 씨티 유니버시티 검사 (City University test), 콜너의 규칙 (Kollner's rule) 등의 어느 하나를 사용한 것과 같이 동정될 수 있다. 색각 결함의 예시에는 적색각이상 결함, 녹색각이상 결함, 및 청색각이상 결함이 포함된다. 적색각이상 결함은 적색맹 (적색 광에 무감각) 및 적색약 (적색 광에 감소된 감수성)을 포함하고, L-옵신 유전자 (OPN1LW)에서의 돌연변이와 연관된다. 녹색각이상 결함은 녹색맹 (녹색 광에 무감각) 및 녹색약 (녹색 광에 감소된 감수성)을 포함하고, M-옵신 유전자 (OPN1MW)에서의 돌연변이와 연관된다. 청색각이상 결함은 청색맹 (청색 광에 무감각) 및 청색약 (청색 광에 감소된 감수성)을 포함하고, S-옵신 유전자 (OPN1SW)에서의 돌연변이와 연관된다.
연령-관련 황반변성. 연령-관련 황반변성 (AMD)은 50대 이상의 사람들에게 시력 상실을 야기하는 주된 요인중 하나이다. AMD는 주로 독서, 운전, 및 안면 인식과 같은 섬세한 작업에 요구되는 중심 시력에 영향을 미친다. 이 상태에서의 시력 상실은 황반 내 광수용체의 점진적인 악화로부터 비롯된다. 측면 (주변) 시력 및 야간 시력은 일반적으로 영향을 받지 않는다.
건식, 또는 "비삼출" 형태, 및 습식, 또는 "삼출" 또는 "신생혈관" 형태로 알려진 2가지 주된 유형의 연령-관련 황반변성이 연구자들에 의해 기술되었고, 이 두가지 형태 모두는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트의 맥락에서 전이유전자를 전달함으로써 치료될 수 있다.
건식 AMD는 망막 색소 상피와 황반의 기저 맥락막 사이에 결정체라 불리는 황색 침착물의 증가를 특징으로 하는데, 이는 안저 촬영에 의해 관찰될 수 있다. 이는 서서히 진행되는 시력의 상실을 초래한다. 이 상태는 시력 상실이 종종 다른 쪽보다 한쪽 눈에서 먼저 일어난다고 하더라도, 전형적으로 양쪽 눈 모두에 영향을 미친다. 다른 변화에는 색소 변화 및 RPE 위축이 포함된다. 예를 들어, 중심 지도모양 위축, 또는 "GA"라고 불리는 특정 경우에, 눈의 중심부에서 망막 색소 상피의 위축 및 광수용체의 후속 상실이 관찰된다. 건식 AMD는 보체 캐스케이드에서 CD59 및 유전자에서의 돌연변이와 연관되어 있다.
습식 AMD는 건식 AMD의 진행된 상태로, 건식 AMD 환자의 약 10%에서 야기된다. 병리학적 변화에는 망막 색소 상피 세포 (RPE) 기능장애, RPE 아래 유체 집합, 및 황반 영역 내 맥락막 혈관신생 (CNV)이 포함된다. 심각한 경우에는 유체 누출, RPE 또는 신경 망막 박리 및 파열된 혈관으로부터의 출혈이 일어날 수 있다. 건식 AMD의 증상은 직선이 물결 또는 구부러져 보이거나, 출입구 또는 도로 표지판이 편향적으로 보이거나, 사물이 원래보다 더 작거나 더 멀리 보이는 것과 같은 시력 왜곡; 감소된 중심 시력; 색깔의 감소된 강도 또는 광도; 및 시야에서 윤곽이 뚜렷한 흐릿한 점 또는 맹점을 포함할 수 있다. 갑작스럽게 발병하여 급격히 악화될 수 있다. 진단은 개체의 중심 시력에서의 결함을 검사하기 위한 암슬러 격자 (Amsler grid)의 사용 (황반 변성은 격자 내의 직선이 색 바래고, 부러지고, 또는 왜곡되게 보이게 할 수 있음), 혈관 또는 망막 이상을 관찰하기 위한 플루오레세인 혈관조영술, 및 망막 종창 (swelling) 또는 누수 혈관을 검출하기 위한 광간섭 단층촬영 (광간섭 단층촬영)의 사용을 포함할 수 있다. 다수의 세포성 인자가 CNV의 생성에 관련되어 있는데, 이들 중에는 혈관내피성장인자 (VEGF), 혈소판-유도 성장인자 (PDGF), 색소 상피-유도 인자 (PEDF), 저산소증 유발 인자 (HIF), 안지오포이에틴 (Ang), 및 다른 사이토카인, 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 및 기타가 있다.
황반 모세혈관확장증. 황반 모세혈관확장증 (MacTel)은 황반의 중심와부근 영역 내 병적으로 확장된 혈관의 형태 (모세혈관확장증)이다. 액체-충진된 낭종의 발생으로 인해 조직이 악화되고 망막 구조는 상처를 입게 되며, 이는 광수용체 세포의 영양을 손상시키고 시력을 영구적으로 파괴한다. MacTel, 유형 1 및 유형 2의 2가지 유형의 MacTel이 있다. 황반 모세혈관확장증 유형 2는 양측성 질환으로, 최근에 40세 이상의 사람들에게서 0.1%의 높은 유병률을 갖는 것으로 나타났다. 생체현미경검사에서 감소된 망막 투명도, 결정 침착, 중등의 확장 모세혈관, 둔화된 세정맥, 망막 색소 플라크, 중심와 위축, 및 신생혈관 복합체가 나타날 수 있다. 플루오레세인 혈관촬영은 초기에는 중심와에 주로 일시적인 혈관확장성 모세혈관을, 후기에는 미만성 과다형광을 보여준다. 고-해상 광간섭 단층촬영 (OCT)은 광수용체 내분절-외분절 경계의 파열, 내부 또는 외부 망막의 수준에서 저반사 (hyporeflective) 강, 및 후기에서 망막의 위축을 나타낼 수 있다. 유형 1 황반 모세혈관확장증의 경우, 이 질환은 거의 항상 한쪽 눈에서 일어나는데, 이는 유형 2와 구별된다. MacTel은 일반적으로 완전 실명을 초래하지 않는 반면, 보통 10-20년의 기간에 걸쳐서 독서 및 운전 시력에 요구되는, 중심 시력의 상실을 초래한다.
막망 색소변성증. 막망 색소변성증 (RP)은 중심 시력 상실을 초래할 수 있는 점진적인 주변 시력 상실 및 야간 시력 장애 (야맹증)를 특징으로 하는 일군의 유전적 장애이다. RP의 제시되는 징후 및 증상은 다양하지만, 전형적인 것들에는 야맹증 (야간 실명, RP에서 가장 일반적인 초기 증상); 시력 상실 (보통 주변, 그러나 진행된 경우에는, 중심 시력 상실); 및 광시증 (빛의 번쩍임 보기)이 포함된다. RP가 다수의 유전적 질환의 집합이기 때문에, 상당한 다양성이 건강진단 소견에 존재한다. 안구 검사는 안구 앞부분, 망막, 및 안저 평가뿐만 아니라, 시력 및 동공 반응의 평가를 포함한다. 일부 경우에, RP는 일 측면의 증후군, 예컨대 청각 상실과 또한 연관된 증후군 (아셔 증후근, 바르덴부르크 증후군, 알포트 증후군, 레프숨병); 컨스-세이어 증후군 (외안근마비, 안검하수, 심장 차단, 및 색소성 망막병증); 무베타지질단백혈증 (지방 흡수장애, 지용성 비타민 결핍, 척수소뇌 변성, 색소성 망막 변성); 뮤코다당질축적증 (예컨대, 헐러 증후군, 쉐이에 증후군, 산필리포 증후군); 바르데-비들 증후군 (다지증, 몸통 비만증, 신장 기능장애, 단신, 및 색소성 망막병증); 및 신경 세로이드 리포푸스신증 (치매, 발작, 및 색소성 망막병증; 영아기 형태는 얀스키-비엘슈보스키병으로 알려지고, 청소년기 형태는 보그트-스필마이어-배튼병이고, 성인기 형태는 쿠프스 증후군임)이다. 막망 색소변성증은 RHO, RP2, RPGR, RPGRIP1, PDE6A, PDE6B, MERTK, PRPH2, CNGB1, USH2A, ABCA4, BBS 유전자에서의 돌연변이와 가장 일반적으로 연관된다.
당뇨병성 망막증. 당뇨병성 망막증 (DR)은 당뇨병의 합병증에 의해 야기되는 망막에의 손상으로서, 이는 결국 실명을 초래할 수 있다. 이론에 의해 구속됨이 없이, 고혈당증-유도성 벽내 혈관주위세포 사멸 및 기저막의 비후가 혈관 벽의 부전 (incompetence)을 초래하는 것으로 생각된다. 이들 손상은 혈액-망막 장벽의 형성을 변화시키고 또한 망막 혈관이 더욱 투과성이 되게 만든다.
2단계의 당뇨병성 망막증이 존재하는데: 비-증식성 당뇨병성 망막증 (NPDR), 및 증식성 당뇨병성 망막증 (PDR)이 있다. 비증식성 당뇨병성 망막증은 당뇨병성 망막증의 제1 단계이고, 안저 검사 및 공존하는 당뇨병에 의해 진단된다. 감소된 시력의 경우, 눈 후면의 혈관 및 존재할 수 있는 임의의 망막 허혈을 가시화하기 위해 플루오레세인 혈관촬영을 수행할 수 있다. 당뇨병을 앓는 모든 사람은 NPDR이 발병할 위험이 있으며, 따라서 본 발명의 벡터를 이용한 예방적 치료의 후보자일 것이다. 증식성 당뇨병성 망막증은 당뇨병성 망막증의 제2 단계로서, 망막의 혈관신생, 유리체 출혈, 및 시야 흐려짐을 특징으로 한다. 일부 경우에, 섬유혈관 증식은 견인성 (tractional) 망막 박리를 야기한다. 일부 경우에, 혈관은 또한 눈의 전방각 내로 성장할 수 있고 신생혈관 녹내장을 초래할 수 있다. NPDR을 갖는 개인은 PDR이 발병할 증가된 위험이 있으며, 그로써 본 발명의 벡터를 이용한 예방적 치료의 후보자일 것이다.
당뇨병성 황반 부종. 당뇨병성 황반 부종 (DME)은 적어도 20년 동안 당뇨병을 앓고 있는 환자의 거의 30%에 영향을 미치는 당뇨병성 막망증의 진행성, 시력-제한 합병증이고, DR로 인한 대부분의 시력 상실에 대해 원인이 된다. 이는 혈액-망막 장벽을 손상시키는 망막 미세혈관 변화로부터 기인하여, 주변 망막 내로 혈장 구성물의 누출, 및 결과적으로, 망막 부종을 초래한다. 이론에 의해 구속됨이 없이, 고혈당증, 세포 신호전달 경로에서의 지속적인 변경, 및 백혈구-매개 손상을 수반하는 만성적 미세혈관 염증이 만성적 망막 미세혈관 손상을 초래하고, 이것이 VEGF의 안구 내 수준의 증가를 촉발하고, 이는 다시 혈관구조의 투과성을 증가시키는 것으로 생각된다.
DME가 발병할 위험에 처한 환자는 긴 시간 동안에 당뇨병을 앓고 있고 중증의 고혈압 (높은 혈액 압력), 체액 저류, 저알부민혈증, 또는 고지질혈증의 하나 이상을 경험하는 환자를 포함한다. DME의 통상의 증상은 시야 흐려짐, 비문증, 및 상태가 치료되지 않고 계속 진행되는 경우에는 결국 실명이다. DME는 황반 중심의 2 디스크 직경 내에서 망막 비후와 같은 안저 검사에 의해 진단된다. 사용될 수 있는 다른 방법에는 망막 종창, 낭포 부종, 및 장액 망막 박리를 검출하기 위한 광간섭 단층촬영 (OCT); 국소 대 미만 누출의 영역을 구별하고 위치를 파악하여, 레이저 광응고가 부종을 치료하기 위해 사용되는 경우 레이저 광응고의 배치를 인도하는, 플루오레세인 혈관촬영; 및 망막에서 장기간의 변화를 평가하는데 사용될 수 있는, 색깔 입체 안저 사진술이 포함된다. 특히 본 발명의 약제학적 조성물의 투여 후 황반 부종의 진행을 추적하고 그의 치료를 관찰하기 위하여 시력이 또한 측정될 수 있다.
망막 정맥 폐색. 망막 정맥 폐색 (RVO)은 망막의 혈액을 배출시키는 순환의 일부의 차단이다. 이 차단은 모세혈관에서 백업 (back-up) 압력을 일으킬 수 있고, 이는 출혈, 및 체액과 혈액의 다른 구성물의 누출을 초래할 수 있다.
녹내장. 녹내장은 종종 눈 안에서 증가된 유체 압력 (안구내 압력)(IOP)과 연관이 있는 시신경 손상을 초래하는, 일군의 안구 (눈) 장애를 기술하는 용어이다. 이 장애는 대략 2개의 주된 카테고리, "개방-각" 및 "폐쇄-각" (또는 "각 폐쇄") 녹내장으로 구분될 수 있다. 개방-각 녹내장은 미국에서 녹내장 사례의 90%를 차지한다. 이는 통증이 없고 급작스럽게 발병하지 않는다. 유일한 징후는 서서히 진행되는 시력 상실, 및 시신경 변화 (안저 검사에서 증가된 함몰-대비-시신경유두 (cup-to-disc ratio) 비율)이다. 폐쇄-각 녹내장은 미국에서 녹내장 사례의 10% 미만을 차지하지만, 다른 나라 (특히 아시아 국가)에서는 녹내장 사례의 절반 정도로 많다. 폐쇄 각을 갖는 환자의 약 10%는 갑작스런 눈 통증, 빛 주변의 후광 보기, 붉은 눈, 매우 높은 안구 내 압력 (>30 mmHg), 메스꺼움 및 구토, 갑작스럽게 감소한 시력, 및 고정된, 중간-확장된 동공을 특징으로 하는 급성 각 폐쇄를 나타낸다. 이는 또한 일부 경우에 타원 동공과 연관이 있다. DLK, NMDA, INOS, CASP-3, Bcl-2, 또는 Bcl-xl에 의해 인코딩된 단백질의 활성을 조절하는 것이 이 상태를 치료할 수 있다.
솔스비 안저 이상증. 솔스비 안저 이상증은 TIMP3 유전자에서의 돌연변이와 연관된 상염색체 우성, 망막 질환이다. 임상적으로, 조기의, 중간-주변, 결정체 및 색각 결손이 발견된다. 일부 환자는 야맹증을 호소한다. 가장 일반적으로, 나타나는 증상은 갑작스런 시력 상실이고, 치료 불가한 황반하 혈관신생으로 인해, 인생의 30대 내지 40대에서 나타난다. 병리학적으로, 부르크막 (Bruch's membrane)의 수준에서 30 μm 두께로 재료를 함유하는 융합성 지질의 축적이 존재한다.
난황형 (Vitelliform) 황반 이영양증. 난황형 황반 이영양증은 진행성 시력 상실을 초래할 수 있는 유전적 눈 장애이다. 난황형 황반 이영양증은 황반 아래에 있는 세포에서 지방 황색 색소 (리포푸스신)의 증가와 연관이 있다. 시간의 경과에 따라서, 이 물질의 비정상적 축적이 명확한 중심 시력에 결정적인 세포를 손상시킬 수 있다. 그 결과, 이 장애를 갖는 사람들은 종종 이들의 중심 시력을 상실하고, 이들의 시야는 흐릿해지거나 왜곡될 수 있다. 난황형 황반 이영양증은 전형적으로 측면 (주변) 시력 또는 야간 시력에 영향을 미치지 않는다.
유사한 특징을 갖는 2가지 유형의 난황형 황반 이영양증이 연구자들에 의해 기술되었다. 조기-발병 형태 (베스트병)는 보통 유년기에 나타나고; 증상의 개시 및 시력 상실의 중증도는 크게 다르다. 이는 VMD2/BEST1 유전자의 돌연변이와 연관이 있다. 성인-발병 형태 (성인 난환형 황반 이영양증)는 이후에, 보통 중기-성인기에서 시작하고, 시간의 경과에 따라서 서서히 악화되는 시력 상실을 초래하는 경향이 있다. 이는 PRPH2 유전자에서의 돌연변이와 연관이 있다. 2가지 형태의 난황형 황반 이영양증 각각은 눈 검사 동안에 검출될 수 있는 황반에서의 특징적 변화를 갖는다.
간상-원추 이영양증. 간상-원추 이영양증은, 야맹증 및 주변 시야 확대의 상실을 초래하는, 간상 기능장애가 지배적인 문제이거나 적어도 원추 기능장애만큼 심각하게 발생하는, 일군의 진행성 질환이다. 물결 모양으로 경계를 이룬 (scallop-bordered) 부분 (lacunar) 위축이 망막의 망막중심부에서 보여질 수 있다. 모든 사례에서 중심 망막 세절화 (thinning)이 나타나기는 하지만 황반은 임상적 검사에 의해 단지 약간 관련된다. 색각이상 (Dyschromatopsia)은 조기에는 중등 정도이고 일반적으로 점점 심각해진다. 더 어린 개인에서 전형적인 고리 암점이 존재하더라도 시야는 중등에서 중증으로 수축된다. 주변 망막은 '백점 (white dots)'을 함유하고 종종 망막염 반점 알베센스 (retinitis punctate albescens)에서 보여지는 망막 변화와 비슷하다. 막망 색소변성증은 이 정의 하에 포함되는 질환의 주요 그룹이고, 전체적으로, 대략 3,500명당 한 명씩 영향을 미치는 것으로 추정된다. 사용된 분류 기준에 따라서, 모든 막망 색소변성증 환자의 약 60-80%는 망막 질환의 뚜렷한 (clear cut) 간상-원추 이영양증 양상을 가지며, 다른 증후군 형태를 고려하면, 모든 막망 색소변성증의 약 50-60%가 간상-원추 이영양증 비증후군 카테고리에 속한다.
레베르 선천성 흑암시. 레베르 선천성 흑암시 (LCA)는 전형적으로 생애 첫 해에 분명해지는 망막의 심각한 이영양증이다. 시각적 기능은 일반적으로 불량하고 종종 안구진탕, 부진하거나 거의-부재인 동공 반응, 광선공포증, 고도 원시, 및 고도망막을 동반한다. 시력은 20/400에 불과하다. 특징적 소견은 눈 찌르기, 누르기, 및 비비기를 포함하는 프란세티의 눈-디지털 신호 (Franceschetti's oculo-digital sign)이다. 안저의 출현은 지극히 가변적이다. 망막이 초기에는 정상적으로 보일 수 있지만, 막망 색소변성증을 연상케 하는 색소성 망막병증이 유년기 후반에 종종 관찰된다. 망막전도 (ERG)는 특징적으로 "검출할 수 없는" 또는 지극히 보통 이하이다. 17개 유전자에서의 돌연변이가 LCA를 야기하는 것으로 알려져 있다: GUCY2D (유전자좌명: LCA1), RPE65 (LCA2), SPATA7 (LCA3), AIPL1 (LCA4), LCA5 (LCA5), RPGRIP1 (LCA6), CRX (LCA7), CRB1 (LCA8), NMNAT1 (LCA9), CEP290 (LCA10), IMPDH1 (LCA11), RD3 (LCA12), RDH12 (LCA13), LRAT (LCA14), TULP1 (LCA15), KCNJ13 (LCA16), 및 IQCB1. 요컨대, 이들 유전자에서의 돌연변이는 모든 LCA 진단의 절반 이상을 차지하는 것으로 추정된다. LCA에 대해 적어도 하나의 다른 질환 유전자좌가 보고되었으나 그 유전자는 알려지지 않았다.
X-연관 망막분리. X-연관 망막분리 (XLRS)는 생애의 처음 10년 내에, 일부 경우에는 빠르면 3개월째에 발병하는, 전신적 양측성 황반 병발을 특징으로 한다. 안저 검사는 때로 스포크 휠 패턴 (spoke wheel pattern)의 인상을 남기는, 황반 내 분리 (schisis) (망막의 신경 섬유층의 분열)의 영역을 나타낸다. 주변 망막의 분리는, 주로 측두하에서 (inferotemporally), 대략 개인의 50%에서 일어난다. 이환된 남성은 전형적으로 20/60 내지 20/120의 시력을 갖는다. 시력은 종종 생애의 10대 및 20대 동안에 악화되지만 그 후에는 50대 또는 60대까지 상대적으로 안정하게 유지된다. X-연관 청소년 망막분리의 진단은 안저 소견, 전기생리학적 검사 결과, 및 분자유전학적 검사에 근거한다. RS1은 X-연관 청소년 망막분리와 연관된 유일한 유전자이다.
원추세포 장애에 걸렸거나 원추세포 장애가 발병할 위험에 처한 개인은, 제한 없이, 안저 촬영; 광간섭 단층촬영 (OCT); 적응 광학 (AO); 망막전위도검사, 예컨대 ERG, 색깔 ERG (cERG); 색각 검사, 예컨대 가성동색표 (이시하라표, 하디-랜드-리터 다색표), FM 100 색상 검사 (Farnsworth-Munsell 100 hue test), 판즈워쓰 패널 (Farnsworth's panel) D-15, 씨티 유니버시티 검사 (City University test), 콜너의 규칙 (Kollner's rule); 시력 검사, 예컨대 ETDRS 문자 검사, 스넬른 (Snellen) 시력 검사, 시야 검사, 대비 감도 검사 (contrast sensitivity test) 등을 포함하는, 당해 분야에 공지되고; 숙련자에 의해 알려질 것인 바와 같이 장애의 증상을 검출하기 위한 기술을 사용하여 용이하게 식별될 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 원추세포 장애에 걸렸거나 원추세포 장애가 발병할 위험이 있는 개인은, 제한 없이, PCR, DNA 서열 분석, 제한 소화 (restriction digestion), 서던 블롯 혼성화, 질량 분광분석 등을 포함하는, 당해 분야에 공지된 바와 같은 원추세포 장애와 연관된 유전자 돌연변이를 검출하기 위한 기술을 이용하여 용이하게 식별될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 원추세포 요법을 필요로 하는 개인을 식별하는 단계를 포함한다. 이러한 경우에, 예를 들어 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 증상의 검출, 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 바와 같은 유전자에서 돌연변이의 검출 등에 의해 개인이 원추세포 장애의 증상(들)을 갖는지 또는 원추세포 장애를 발병할 위험이 있는지를 결정하기 위한 임의의 편리한 방법이 원추세포 요법을 필요로 하는 개인을 식별하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 방법을 실시함에 있어서, 본 발명의 조성물은 전형적으로 원추세포에서 전이유전자의 발현을 초래하기에 효과적인 양으로 개체의 망막에 전달된다. 일부 실시양태에서, 방법은 원추세포에서 전이유전자의 발현을 검출하는 단계를 포함한다.
전이유전자의 발현을 검출하기 위한 다양한 방법이 존재하는데, 이들 중 하나가 본 발명의 실시양태에 사용될 수 있다. 예를 들어, 발현은 직접적으로, 예를 들어 RNA 수준에서, 예컨대 RT-PCR, 노던 블롯, RNAse 보호에 의해서; 또는 단백질 수준에서, 예컨대 웨스턴 블롯, ELISA, 면역조직화학 등에 의해서 유전자 산물의 양을 측정함으로써 검출될 수 있다. 또 다른 예시로서, 발현은 간접적으로, 즉 개체에서 원추 광수용체의 생존력 또는 기능에 대한 유전자 산물의 영향을 검출함으로써 검출될 수 있다. 예를 들어, 만약 전이유전자에 의해 인코딩된 유전자 산물이 원추세포의 생존력을 향상시킨다면, 전이유전자의 발현은, 예컨대 안저 촬영, 광간섭 단층촬영 (OCT), 적응 광학 (AO) 등에 의해 원추세포의 생존력에서의 향상을 검출함으로써 검출될 수 있다. 만약 전이유전자에 의해 인코딩된 유전자 산물이 원추세포의 활성을 변경한다면, 전이유전자의 발현은, 전달된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 방법으로, 예컨대 망막전도 (ERG) 및 색깔 ERG (cERG); 기능성 적응 광학; 색각 검사, 예컨대 가성동색표 (이시하라표, 하디-랜드-리터 다색표), FM 100 색상 검사, 판즈워쓰 패널 D-15, 씨티 유니버시티 검사, 콜너의 규칙; 시력 검사, 예컨대 ETDRS 문자 검사, 스넬른 (Snellen) 시력 검사, 시야 검사, 대비 감도 검사 (contrast sensitivity test) 등에 의해 원추세포의 활성에서의 변화를 검출함으로써 검출될 수 있다. 일부 경우에, 생존력의 향상 및 원추세포 기능의 변형 둘 모두가 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 예컨대 장애의 발병을 예방하고, 장애의 진행을 정지시키고, 장애의 진행을 역전시키는 등의 치료적 이익을 초래한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 치료적 이익이 달성되었음을 검출하는 단계를 포함한다. 숙련자는 치료적 효능의 이러한 측정이 변형되는 특정 질환에 적용가능할 것임을 이해할 것이고, 치료적 효능을 측정하기 위해 사용되는 적합한 검출 방법을 인식할 것이다. 예를 들어, 황반 변성의 치료에 있어 치료적 효능은 황반 변성 속도의 감소 또는 황반 변성 진행의 중단으로 관찰된 수 있고, 그의 효과는, 예컨대 안저 촬영, OCT, 또는 AO에 의해, 본 발명의 조성물의 투여 후의 검사 결과를 본 발명의 조성물의 투여 전의 검사 결과에 비교함으로써 관찰될 수 있다. 또 다른 예시로서, 진행성 원추 기능장애의 치료에 있어 치료적 효능은 원추 기능장애 진행 속도의 감소, 원추 기능장애 진행 중단, 또는 원추체 기능의 향상으로서 관찰될 수 있고, 그의 효과는, 예컨대 ERG 및/또는 cERG; 색각 검사; 기능성 적응 광학; 및/또는 시력 검사에 의해, 예를 들어 본 발명의 조성물의 투여 후의 검사 결과를 본 발명의 조성물의 투여 전의 검사 결과에 비교하고 원추체 생존력 및/또는 기능에 있어서의 변화를 검출함으로써 관찰될 수 있다. 세 번째 예시로서, 색각 결함의 치료에 있어 치료적 효능은 개인의 색깔 인지, 예컨대 적색 파장의 인지, 녹색 파장의 인지, 청색 파장의 인지에서의 변경으로서 관찰될 수 있고, 그의 효과는, 예컨대 cERG 및 색각 검사에 의해, 예를 들어, 본 발명의 조성물의 투여 후의 검사 결과를 본 발명의 조성물의 투여 전의 검사 결과에 비교하고 원추체 생존력 및/또는 기능에 있어서의 변화를 검출함으로써 관찰될 수 있다.
본 발명의 전이유전자를 이용한 전이유전자의 발현은 강력할 것으로 예상된다. 따라서, 일부 경우에, 예컨대 유전자 산물의 수준 측정, 치료적 효능의 측정 등에 의해 검출되는 바와 같은, 전이유전자의 발현은 투여 후 2개월 이하에, 예컨대 투여 후 4, 3 또는 2주 이하에, 예를 들어 본 발명의 조성물의 투여 1주 후에 관찰될 수 있다. 전이유전자의 발현은 또한 시간의 경과에 따라서 지속될 것으로 예상된다. 따라서, 일부 경우에, 예컨대 유전자 산물의 수준 측정, 치료적 효능의 측정 등에 의해 검출되는 바와 같은, 전이유전자의 발현은 본 발명의 조성물의 투여 후 2개월 이상, 예컨대, 4, 6, 8, 또는 10개월 이상, 일부 경우에 1년 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 또는 5년, 특정 경우에, 5년을 초과하여 관찰될 수 있다.
특정 실시양태에서, 방법은 원추세포에서 전이유전자의 발현을 검출하는 단계를 포함하고, 이때 발현은 본 발명의 하나 이상의 향상된 요소들을 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드 카세트, 즉 레퍼런스 대조군, 예컨대 이들의 전체 기재가 참조로서 본원에 포함되는, 미국특허공개 제2013/0317091호에 기술된 바와 같은 pR2.1 프로모터 또는 이의 변이체 (예컨대, pR1.7, pR1.5, pR1.1 등), 또는 예컨대 미국특허공개 제2014/0275231호에 기술된 바와 같은 합성 IRBP/GNAT2 프로모터로부터의 발현에 비해 증강된다. 전형적으로, 발현은, 예컨대 조기 검출, 더 높은 수준의 유전자 산물, 세포에 대한 더 강력한 기능적 영향 등에 의해 입증되는 바와 같이, 레퍼런스, 즉 예컨대 당해 분야에 공지된 바와 같은 대조군 폴리뉴클레오티드 카세트로부터의 발현에 비해 2배 이상, 예를 들어 3배, 4배, 또는 5배 이상, 일부 경우에 10배, 20배 또는 50배 이상, 예컨대 100배 증강될 것이다.
전형적으로, 만약 본 발명의 조성물이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 rAAV라면, 변화를 달성하기에 효과적인 양은 약 1×108 벡터 게놈 또는 그 이상, 일부 경우에 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 또는 1×1013 벡터 게놈 또는 그 이상, 특정 경우에, 1×1014 벡터 게놈 또는 그 이상이고, 보통 1×1015 벡터 게놈 이하일 것이다. 일부 경우에, 전달되는 벡터 게놈의 양은 최대 약 1×1015 벡터 게놈, 예컨대 1×1014 벡터 게놈 또는 그 이하, 예를 들어 1×1013, 1×1012, 1×1011, 1×1010, 또는 1×109 벡터 게놈 또는 그 이하, 특정 경우에 1×108 벡터 게놈이고, 전형적으로 1×108 벡터 게놈 이상이다. 일부 경우에, 전달되는 벡터 게놈의 양은 1×1010 내지 1×1011 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 전달되는 벡터 게놈의 양은 1×1010 내지 3×1012 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 전달되는 벡터 게놈의 양은 1×109 내지 3×1013 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 전달되는 벡터 게놈의 양은 1×108 내지 3×1014 벡터 게놈이다.
일부 경우에, 투여되는 약제학적 조성물의 양은 다중 감염도 (MOI)를 사용하여 측정될 수 있다. 일부 경우에, MOI는 핵산이 전달될 수 있는 세포에 대한 벡터 또는 바이러스 게놈의 비율, 또는 배수를 지칭한다. 일부 경우에, MOI는 1×106일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1×105 - 1×107일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1×104 - 1×108일 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 적어도 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017, 및 1×1018 MOI이다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 1×108 내지 3×1014 MOI이다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 최대 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017, 및 1×1018 MOI이다.
일부 측면에서, 약제학적 조성물의 양은 재조합 바이러스의 약 1×108 내지 약 1×1015 입자, 재조합 바이러스의 약 1×109 내지 약 1×1014 입자, 재조합 바이러스의 약 1×1010 내지 약 1×1013 입자, 또는 재조합 바이러스의 약 1×1011 내지 약 3×1012 입자를 포함한다.
개별 용량은 전형적으로 개체에서 측정가능한 효과를 생산하는데 요구되는 양 이상이고, 본 발명의 조성물 또는 그의 부산물의 흡수, 분포, 대사, 및 배출 ("ADME")에 대한 약동학 및 약리학을 근거로, 따라서 개체 내에서 조성물의 소인을 근거로 측정될 수 있다. 이는 망막하 (작용이 주로 국소적 효과에 적합한 곳에 직접적으로 적용됨), 유리체 내 (범-망막 효과를 위해 유리체에 적용됨), 또는 비경구 (정맥 내, 근육 내 등과 같은 전신적 경로에 의해 적용됨) 적용에 적합할 수 있는, 투여량뿐만 아니라 투여 경로의 고려를 포함한다. 효과적인 투여량 및/또는 투여 용법 (regimen)은 전임상 분석, 안전성 및 단계적 확대 및 용량 범위 검사, 개별적 임상의-환자 관계, 뿐만 아니라 본원에 기술되고 하기 실험 항목에서 예시된 것들과 같은 시험관 내 및 생체 내 분석으로부터 실증적으로 용이하게 결정될 수 있다.
본 명세서에 인용되고/되거나, 이로 제한되는 것은 아니지만, [삽입 목록]을 비롯한 출원 데이터 시트에 열거된 상기 미국특허, 미국특허출원공개, 미국특허출원, 외국특허, 외국특허출원 및 비특허 간행물 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
전술한 바로부터 발명의 특정 실시양태가 예시를 목적으로 본원에 기술되었다고 하더라도 다양한 변형이 발명의 요지 및 범주를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있음이 인식될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부하는 특허청구범위에 의해서와 같은 경우를 제외하고는 제한되지 않는다.
본 발명은 원추세포에서 유전자의 발현을 위한 폴리뉴클레오티드 카세트, 발현 벡터, 및 이를 이용한 망막 장애의 유전자 요법을 제공한다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 특허청구범위에 구체적으로 개시되어 있다. 본 발명의 특징 및 이점의 보다 양호한 이해는, 본 발명의 원리가 이용되는 예시적 실시양태을 개시하는 하기 상세한 설명, 및 첨부하는 도면을 참조함으로써 수득될 것이다:
도 1A는 원추세포에서 전이유전자의 증강된 발현을 위한 폴리뉴클레오티드 카세트의 도식적 개요를 나타낸다.
도 1B는 원추세포에서 전이유전자의 증강된 발현을 위한 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 바이러스 벡터의 도식적 개요를 나타낸다.
도 2는 스플라이스 공여체 (A/C) A G G T Pu A G U; 분지점 C T Pu A Py; Py-풍부 영역; 및 수용체 N C A G G에 대한 컨센서스 서열을 포함하는, 정준형 형상 (canonical features)을 함유하는 예시적 인트론을 나타낸다.
도 3A는 예시적 5'UTR mRNA 구조 (서열번호 56)인, pR2.1로부터의 5'UTR mRNA 구조 (Mancuso et al.)를 나타낸다. 5' UTR은 2개의 상류 AUG 및 개방 판독 프레임 (ORF), 고수준의 염기쌍 및 헤어핀 구조, 및 더 짧은 코작 (Kozak) 서열을 갖는다.
도 3B는 본 발명 개시의 최적화된 카세트로부터의 예시적인 5'UTR mRNA 및 구조 (서열번호 57)를 나타낸다. 5' UTR은 어떠한 상류 AUG 및 ORF도 포함하지 않는다. 또한, 도 3A의 5' UTR에 비해, 도 3B의 5' UTR은 더 적은 염기쌍을 가져 더 짧고; 코작 서열은 더 길다.
도 4A는 코돈 최적화 이전의 폴리뉴클레오티드 카세트를 나타낸다. 250개 초과의 뉴클레오티드 길이의 개방 판독 프레임 (ORF)은 서열 아래에 회색으로 표시된다.
도 4B는 코돈 최적화 이후지만, 비-전이유전자 ORF의 제거 전의 폴리뉴클레오티드 카세트를 나타낸다. 250개 초과의 뉴클레오티드의 ORF는 서열 도표 아래에 회색으로 표시된다. 역 방향으로의 새로운 ORF의 도입이 SV40 폴리A로부터 시작해서 1,365 염기로 확장됨에 주목한다.
도 4C는 코돈 최적화 및 ORF의 제거 후의 폴리뉴클레오티드 카세트를 나타낸다. 250개 초과의 뉴클레오티드의 ORF는 서열 도표 아래에 회색으로 표시된다. 새로 도입된 ORF가 단축되고 제거되도록 서열 최적화가 이루어졌음에 주목한다.
도 5는 유리체 내로-전달된 AAV2 변이체 AAV2-7m8이 유리체 내로-전달된 AAV2보다 얼마나 더 효율적으로 영장류의 중심와 (fovea centralis) 및 중심와부근 (parafovea)에서 망막 세포를 형질도입하는지를 보여준다. 5×1011 벡터 게놈의 AAV2.CMV.GFP (상부 좌측); AAV-2.5T.CMV.GFP (상부 우측) (Excoffon K. J., et al. 2009. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106: 3865-3870); (하부 좌측) AAV2-7.8.CMV.GFP (Dalkara D, et al. Sci Transl Med. 2013 Jun 12; 5(189): 189ra76); 또는 AAV-ShH10.CMV.GFP (하부 우측) (Klimczak RR et al. PLoS One. 2009 Oct 14; 4(10): e7467)를 50 μL의 부피로 아프리카 녹색 원숭이의 유리체 내로 주입하고, GFP 발현을 8주 후에 생체 내 OCT 형광 이미지화에 의해 관찰하였다.
도 6은 pMNTC 조절성 카세트가 영장류의 중심와 원추에서 유전자 발현을 얼마나 강력히 촉진하는지를 보여준다. (a-b) AAV2-7m8.MNTC.GFP를 개코원숭이 (baboon)의 중심 유리체 내로 주입하고 발현을 5주 후 (a) 및 8주 후 (b)에 안저 형광 (fundus fluorescence)에 의해 관찰하였다. (c 및 d) AAV2-7m8.MNTC.GFP를 주입하고 대략 6개월 후 저 배율 (c) 및 고 배율 (d)에서 중심와의 15 미크론 절편 내 자연적 GFP 형광.
도 7은 AAV-전달 MNTC.GFP의 유리체 내 주입 후 마우스 망막의 원추에서 강력하고 원추-특이적인 유전자 발현을 나타낸다. (a-b) 유리체 내 주입을 통한 5.04×1010 벡터 게놈의 유리체 내 주입을 투여받은 마우스에서 11주 후의 GFP 형광의 예시. (c-e) 망막을 주입 14주 후 조직학을 위해 적출하고 원추 외분절을 L/M 옵신에 대한 항체 (적색)로 표지하였다. (c)에서 적색 채널이 꺼지고 그 상태에서만 천연 GFP가 보이고, (d)는 원추 외분절의 시각화를 허용하기 위해 적색 채널 온 상태에서의 동일한 이미지이다. (c) 및 (d)의 비교는 전부는 아니더라도 대부분의 원추가 바이러스에 의해 형질되입되었음을 보여준다. (e) 상이한 각도로부터 c 및 d에서와 같이 원추 광수용체 프로파일을 나타내는 동일한 망막으로부터의 이미지.
도 8은 모래쥐 (Mongolian gerbil) 망막의 원추 내에서 pMNTC 조절성 카세트에 의해 지시된 유전자 발현을 나타낸다. 1×1010 - 2×1010 벡터 게놈의 CMV, pR2.1, 또는 MNTC 프로모터의 제어 하에서 GFP를 보유하는 바이러스를 5 μL의 부피로 모래쥐의 유리체 내로 주입하고, GFP 발현을 안저 형광 이미지화에 의해 지정된 시점에서 시각화하였다. (a) 유리체 내 투여 4주 후 시각화된, AAV2-7m8.CMV.GFP 및 AAV2-7m8.MNTC.GFP에 의해 지시된 GFP 발현. 모래쥐 12-10, 12-11, 및 12-12에는 AAV2-7m8.CMV.GFP를 주입한 반면, 모래쥐 12-13, 12-14, 및 12-15에는 AAV2-7m8.MNTC.GFP를 주입하였다. OD, 우안 (oculus dexter)(오른쪽 눈). OS, 좌안 (oculus sinister)(왼쪽 눈). (b) 안저 형광 이미지화에 의해 검출된 바와 같은 4 및 8주 후 AAV2-7m8.pR2.1.GFP 및 AAV2-7m8.MNTC.GFP에 의해 지시된 GFP의 발현.
도9A-9D는 pMNTC 조절성 카세트가 원추 프로모터 pR2.1보다 영장류의 중심와 원추에서 더욱 강력한 유전자 발현을 제공함을 입증한다. 5×1011 벡터 게놈의 AAV2-7m8.MNTC.GFP 또는 AAV2-7m8.pR2.1.GFP를 지시된 바와 같이 50 μL의 부피로 아프리카 녹색 원숭이의 유리체 내로 주입하였다 (동물 271 및 472 내로 AAV2-7m8.MNTC.GFP; 동물 500 및 509 내로 AAV2-7m8.pR2.1.GFP). 망막을 (a) 2주, (b) 4주, (c) 8주, 및 (d) 12주째에 안저 형광 카메라 (a, b, c, d) 또는 하이델베르그 스펙트랄리스 (Heidelberg Spectralis) OCT 상의 자동형광을 사용하여 GFP에 대해 생체 내에서 시각화하였다 (a, b; 8주 및 12째에 대한 데이터 미제시). OD, 우안 (오른쪽 눈). OS, 좌안 (왼쪽 눈).
도10A-10D는 관찰된 더욱 강력한 발현에 대해 최적화된 pMNTC 요소들 각각의 기여를 입증한다. (a) pMNTC 및 pR2.1 발현 카세트. (b) pMNTC 내 각 요소가 pR2.1 내 상응하는 요소로 하나씩 대체된, 실험적 발현 카세트. (c, d) 주입 (c) 4주 및 (d) 8주 후에 IVIS 이미지화에 의해 검출되는 바와 같이, 각각의 검사 품목 (작제물 (construct) 당 n=6-8개 눈)이 유리체 내로 주입된 모래쥐의 망막에서 루시퍼라제 전이유전자의 발현. "7m8.CMV"가 양성 대조군으로 제공되었다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 구성하고 만들고 사용하는 방법의 완전한 기술 및 설명을 숙련자에게 제공하기 위해 개시되고, 발명자가 그들의 발명으로서 고려하는 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 또한 하기 실험이 전부이거나 단지 실시된 실험만인 것을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 수 (예컨대, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위한 노력이 이루어졌지만 일부 실험적 오차 및 편차가 이에 대해 고려되어야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 부 (parts)는 중량부이고, 분자량은 중량평균 분자량이고, 온도는 섭씨의 도이고, 압력은 대기압이거나 이에 근접한다.
분자 및 세포 생화학의 일반적 방법을 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); and Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)]과 같은 표준 교과서에서 확인할 수 있으며, 이들의 기재는 참조로서 본원에 포함된다. 본 발명의 개시에 언급된 유전자 조작을 위한 시약, 클로닝 벡터, 및 키트는 바이오라드 (BioRad), 스트라타진 (Stratagene), 인비트로젠 (Invitrogen), 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich), 및 클론텍 (ClonTech)과 같은 상업적 판매자로부터 이용가능하다.
배경
황반 이영양증, 예컨대 원추-간상 이영양증, 원추 이영양증, 스타가르트 황반 이영양증, 및 전색맹; 색각 장애, 예컨대 적색각이상, 녹색각이상, 및 청색각이상 결함; 및 중심 황반의 시각 장애, 예컨대 연령-관련 황반변성, 황반 모세혈관확장증, 막망 색소변성증, 당뇨병성 망막증, 망막 정맥 폐색, 녹내장, 솔스비 안저 이상증, 성인 난환형 황반 이영양증, 베스트병, 및 X-연관 망막분리를 포함하는, 다수의 원추 광수용체 연관 장애의 치료를 위한 신규 요법이 요구된다. 이들 시각 장애는 원추 광수용체의 기능 및/또는 생존력의 상실과 연관이 있기 때문에, 이들 장애가 원추체 생존력 및 기능을 복구하기 위해 원추 광수용체에 치료적 유전자를 전달함으로써 치료될 수 있을 것으로 가정된다.
이를 달성하기 위해, 인핸서, 프로모터, 5'UTR, 인트론, 코작, 및 폴리아데닐화 서열이 원추체-특이적 발현용으로 설계된 폴리뉴클레오티드 카세트 "pMNTC"를 고안하였다 (도 10a). 이 카세트는 전사 개시 부위 상류에 약 140개 뉴클레오티드를 포함하는, L- 및 M-옵신 게놈 유전자좌 유래의 LCR 인핸서 서열 및 M-옵신 유전자 유래의 절두된 (truncated) 프로모터 서열을 포함한다. 또한, 카세트는 M-옵신 5'UTR에 근거하지만 최소한의 이차 구조를 갖고 (도 3 참조) 그로 인트론이 삽입된 그의 3' 말단에 부가적인 서열을 포함하도록 변형된 5' 비번역 영역 (5' UTR)을 포함한다. 사용된 인트론성 서열은 인간 β-글로빈 유전자의 제1 인트론으로부터의 5'-공여체 부위 및 면역글로불린 유전자 중쇄 가변 영역의 리더 및 주요부 사이에 존재하는 인트론의 3'-수용체 부위를 갖는 pSI 키메릭 인트론이었다 (Bothwell, A.L. et al. (1981) Heavy chain variable region contribution to the NPb family of antibodies: Somatic mutation evident in a gamma 2a variable region. Cell, 24, 625-37). 공여체 및 수용체 부위의 서열을, 분지점 부위와 함께, 스플라이싱을 위한 컨센서스 서열에 매치하도록 변화시켰다 (Senapathy, P., Shapiro, M.B. and Harris, N.L. (1990) Meth. Enzymol. 183, 252-78). pMNTC 폴리뉴클레오티드 카세트는 또한 강력한 코작 서열 및 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함하였다.
또한, 원추세포에 전이유전자를 전달하는데 최선의 AAV를 동정하기 위해 실험을 수행하였다. 유전자 요법을 위해 망막 세포에 폴리뉴클레오티드의 성공적인 전달이 AAV 및 렌티바이러스와 같은 바이러스 벡터를 사용하여 달성되고 있다. 그러나, 이들 바이러스는 비-인간 영장류 (NHP) 망막의 세포에 도달하기 위해 망막하로 주입되어야만 하고, 이 과정은 망막 손상의 위험성을 안고 수행된다. 덜 파괴적인 접근법이 유리체 내 주입에 의해 투여된다. 그러나, AAV 또는 렌티바이러스의 유리체 내 전달에 이은 원추 광수용체의 효율적인 형질도입은 전혀 입증된 바 없으며: 고효율로 망막 원추세포를 형질도입하는 능력을 갖는 AAV의 존재가 보고되었으나 (Merigan et al. IOVS 2008, 49 E-abstract 4514), 이후 보고는 이들 벡터의 효능에 의문을 제시하였다 (Yin et al. IOVS 2011, 52(5): 2775-2783).
결과
AAV2의 유도된 진화는 야생형 AAV2보다 우수하게 광수용체를 형질도입할 수 있는 바이러스 변이체 "7m8"의 식별을 초래하였다 (Dalkara et al. Sci Transl Med 2013). 그러나, 망막은 2가지 유형의 광수용체, 간상체 및 원추체를 함유하고, AAV2-7m8은 원추 광수용체를, 더욱 구체적으로는 중심와의 고도의 원추체-농화된 영역에서 원추 광수용체를, 그 자체로서, 형질도입할 수 있는지 여부를 입증한 보고는 존재하지 않는다. 이러한 가능성을 검사하기 위하여, 본 발명자들은 GFP에 작동가능하게 연결된 편재성 프로모터 CMV의 발현 카세트를 보유하는 AAV2-7m8을 유리체 내 주입에 의해 아프리카 녹색 원숭이의 망막에 전달하였다. 유리체 내로 전달된 AAV2-7m8.CMV.GFP는 망막 세포를 형질도입하는 것으로 당해 분야에 이전에 보고된 유리체 내로-전달된 AAV2 또는 다른 AAV 변이체보다 더욱 효율적으로 영장류의 중심와 (중심와 오목의 중심에서 망막의 0.35 mm 직경 간상체-부재 영역) 및 중심와부근 (함몰의 가장자리)에서 망막 세포를 형질도입하는 것으로 나타났다. 검사된 AAV2-7m8도 다른 AAV도 속오목 (중심와)을 둘러싸고 오목의 경사를 형성하는 망막의 1.5 mm-직경 원추체-농화된 영역인 영장류 중심와의 원추체를 형질도입할 수는 없는 것으로 나타났다 (도 5).
이어서 본 발명자들은 GFP에 작동가능하게 연결된 pMNTC를 포함하는 게놈을 AAV2-7m8 캡시드 내에 패키징하고 유리체 내로 주입되는 경우 생체 내에서 GFP 전이유전자를 원추세포에서 발현하는 이 벡터 조성물의 능력을 평가하였다. 발현을 마우스 (3% 원추체), 래트 (1% 원추체), 모래쥐 (gerbil) (13% 원추체), 및 비인간 영장류 (5% 원추체)를 포함하는, 전체 광수용체 중에 망막 원추세포의 수를 달리하면서 다수의 종에서 평가하였다. 도 5에서의 본 발명의 결과와 대조적으로, 강력한 유전자 발현이 비인간 영장류 중심와 전체에서 검출될 수 있었다 (도 6). 이들 데이터는 유리체 내로 전달된 AAV2-7m8이, 실제로, 망막 원추체를 형질도입할 수 있고, pMNTC가 원추세포에서 강력한 발현 카세트로서 작용함을 나타낸다. 강력한 리포터 유전자의 발현이 또한 래트 (데이터 미제시) 및 모래쥐 (도 8A)의 유리체 내로 주입된 망막에서 나타났는데, 발현 수준 및 해부학적 위치는 모든 종에서 원추체 양 및 위치와 서로 연관되어 있었다.
pMNTC-유도된 발현의 세포-특이성을 결정하기 위하여, 형질도입된 마우스 망막의 온조직 표본 (whole mount)을 원추 L 및 M 옵신에 특이적인 항체를 사용한 면역조직화학으로 분석하였다. 원추 광수용체의 외분절만을 표지하는, L/M 옵신의 발현이 AAV2-7m8.MNTC.GFP 벡터로부터 GFP를 발현한 마우스 망막의 원추체 모두에서 시각적으로 관찰되었는데 (도 7), 이는 전이유전자의 MNTC-유도된 발현이 고도로 원추체-특이적임을 나타낸다. 나아가, L/M 옵신-특이적 항체에 의해 표지되었던 원추 외분절의 80% 이상이 또한 GFP 전이유전자를 발현하였는데, 이는 AAV2-7m8이 매우 효율적으로 원추체를 형질도입한다는 것을 나타낸다 (도 7).
본 발명자들은 이어서 원추세포에서 발현을 촉진하는 pMNTC의 능력을 pR2.1과 비교하였다. pR2.1은 인간 L/M 옵신 인핸서 ("LCR") 및 인간 L-옵신 유전자 유래의 프로모터 영역을 포함한다. 또한, pR2.1은 변형된 SV40 후기 16s 인트론성 서열이 삽입되어 있는, 그의 3' 말단에서 부가적인 5'UTR 서열에 융합된 L-옵신 5'UTR을 포함한다. 이는 L-옵신 코작 서열이 수반되고, 그 후에 전형적으로 전이유전자에 인-프레임 연결된다. 카세트의 말단에 SV40 폴리A 테일이 있다.
AAV2-7m8.MNTC.GFP 및 AAV2-7m8.pR2.1.GFP의 바이러스 제조물을 생체 내에서 모래쥐 및 비인간 영장류의 망막에 유리체 내로 전달하고, 망막을 안저 자가형광 및 OCT로 생체 내에서 2주, 4주, 8주, 및 12주 후에 이미지화하였다. GFP 리포터 발현은 pR2.1.GFP 발현 카세트를 보유하는 모래쥐 망막에 비해 pMNTC.GFP 발현 카세트를 보유하는 rAAV로 형질도입된 모래쥐 망막에서 더 빨리, 더 강력히, 더 많은 원추체에서 검출되었다 (도 8B). 유사하게, GFP 리포터 발현은 pR2.1 발현 카세트로 형질도입된 NHP 망막에 비해 pMNTC.GFP 발현 카세트를 보유하는 rAAV로 형질도입된 비인간 영장류 망막에서 더 빨리 더 많은 원추체에서 검출되었다 (도 9, n = 4개 눈). 모래쥐 및 NHP 둘 모두에서, GFP는 연구 기간 내내 pR2.1로부터보다 pMNTC로부터 더 강력한 것으로 일관되게 관찰되었다.
발현의 전반적인 향상에 대한 pMNTC 발현 카세트 내 각 요소의 기여를 결정하기 위하여, pMNTC 내 각 요소가 하나씩 pR2.1 발현 카세트로부터의 상응하는 요소로 대체되어 있는 일련의 발현 작제물을 클로닝하였다. 이들 작제물을 그 후에 AAV2-7m8 내로 패키징하고 모래쥐 망막에 유리체 내 주입으로 전달하였다. 모래쥐 망막을 4주 및 8주 후에 생체 내에서 생체내 생체발광으로 평가하였고 (IVIS 이미징 시스템, PerkinElmer), 이는 전체 눈에 걸쳐서 리포터 발현의 정량적 판독을 제공한다.
예상되는 바와 같이, pMNTC의 제어 하에서 루시퍼라제 리포터의 발현이 pR2.1 제어 하의 루시퍼라제 리포터의 발현보다 더 높았다. pR2.1의 5'UTR에 더 멀리 존재하는 pR2.1 프로모터 서열 (서열번호 82)의 포함에서 그러한 바와 같이 (작제물 pMNTC_pR2.1-L5'P), 그에 대해 최대 서열 상동성을 갖는 pR2.1 프로모터 서열 (서열번호 83)로 pMNTC 프로모터 서열의 대체는 발현을 감소시켰다 (작제물 pMNTC_pR2.1 L3'P). pR2.1 5'UTR에서 관찰되었던 2개의 위 개시 서열 ("AUG1" 및 "AUG2")의 pMNTC 5'UTR 내로의 도입에 의해 발현이 또한 감소되었다 (작제물 pMNTC_2.1-AUG1/2). 흥미롭게도, pMNTC 5'UTR이 이들 위 개시 서열이 제거되어 있는 변형된 pR2.1 5'UTR 서열로 대체되었을 경우에는 발현이 감소하지 않았는데 (서열번호 87, 뉴클레오티드 17이 C로 변경되고, nt 61 및 62가 CA로 변경됨) (pMNTC_pR2.1-5'UTR), 이는 pR2.1 5'UTR이 pR2.1 5'UTR 요소에서 위 AUG가 없다면 원추세포에서 강력한 발현을 촉진할 것임을 제안한다. 또한 흥미롭게도, pR2.1 인트론 (서열번호 59)은 pMNTC의 pSI 키메릭 인트론보다 더욱 강력한 발현을 제공하는 것으로 나타났는데, 이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 내 pR2.1 인트론의 함유가 원추세포에서의 발현을 더욱 향상시키기 위해 사용될 수 있음을 제안한다. 마지막으로, L/M 인핸서의 제거 (pR2.1 및 pMNTC 둘 모두에서 확인됨)가 또한 발현을 감소시켰다. 폴리A 테일이 처음에는 발현에 유의미한 영향을 미치는 것처럼 보였다고 하더라도, 이 pR2.1 요소를 포함하는 pMNTC 작제물의 재-서열분석은 폴리A 테일이 전이유전자에 작동가능하게 연결되지 않았음을 규명하였고, 그로 인해 왜 오로지 배경 수준의 발현만이 이 작제물로부터 관찰되었는지를 설명하였다. 따라서, L/M 옵신 LCR, L 옵신 프로모터보다 M 옵신 코어 프로모터의 함유, 및 5'UTR에서 위 개시 서열의 배제 모두가 pMNTC 프로모터를 사용하여 달성되는 유전자 발현에서의 증대에 기여한다.
결론적으로, 본 발명자들은 망막 원추체로 폴리뉴클레오티드의 유리체 내 전달을 위해 사용될 수 있는, GH 루프 내에 7m8 펩티드를 포함하는 AAV 변이체를 확인하였다. 유사하게, 본 발명자들은 원추 광수용체에서 강력한 발현을 촉진하기 위해 사용될 수 있는 다수의 폴리뉴클레오티드 카세트 요소들을 확인하였다. 종합하면, 이들 발견은 원추체-연관 장애를 위한 치료제의 개발을 촉진할 수 있는 향상을 나타낸다.
재료 및 방법
WERI-RB-1 세포에서 시험관 내 전이유전자의 발현. 원추 광수용체 색소 세포를 발현하는 WERI-Rb-1 망막모세포종 세포를 문헌 [Shaaban and Deeb, 1998; IOVS 39(6): 885-896]에 기술된 방법에 따라서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트로 형질감염시킨다. 폴리뉴클레오티드 카세트를 클로닝 (Maniatis et al.)과 같은 분자 생물학의 잘 확립된 기술을 이용하거나 또는 드 노보 (de novo) DNA 합성을 통해서 플라스미드 DNA로서 형질감염시킨다. 모든 조절성 요소는 카세트 내에 배치되고 증강된 GFP 단백질을 유도하기 위해 사용된다. 플라스미드 DNA가 그 후에 비-바이러스 형질감염을 위한 확립된 기술을 이용하여, 예를 들어 지질-계 형질감염 시약 (Altogen Biosystems, NV) 또는 리포펙타민 LTX (Life Technologies)를 사용하여 세포 내로 도입된다. 그 후에 세포를 72시간 동안 배양하고 eGFP 발현을 유세포 분석기 및 형광 현미경을 사용하여 측정한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 (즉, 원추 광수용체 발현을 위해 고안된 작제물)로 형질감염된 세포에서의 전이유전자 발현을 비-최적화 대응물 (즉, pR2.1에 근거한 것들)과 비교하고 개선된 요소들을 보유하는 카세트로부터 더 강력한 것을 확인하였다.
661W 세포와 같이, 원추 옵신을 발현하는 다른 포유동물 세포주를 사용하여 시험관 내 발현을 또한 평가하였다 (Tan et al., IOVS 2004; 45(3) 764-768).
유사하게, 원추 광수용체-특이적 단백질을 발현하도록 조작되어 있는 비-광수용체 세포주를 사용하여 시험관 내 발현을 평가하였다. 이러한 시스템은 CRX/Sp1을 발현하도록 유전적으로 조작되어 있는 HEK293 세포를 이용하여 기술되어 있다 (Khani et al., IOVS 2007; 48: 3954). 마커 유전자 (eGFP, dsRed, mCherry, 루시퍼라제)뿐만 아니라 생리적 유전자 (옵신, ACHR 유전자)가 또한 사용된다. 생리적 유전자는 mRNA 수준 (예컨대, RT-PCR에 의해) 또는 단백질 수준 (예컨대, ELISA 또는 웨스턴 블롯에 의해)을 조사함으로써 검사된다.
동물 관리. 모든 실험은 미국생리학협회 (American Physiological Society) 및 신경과학협회 (Society for Neuroscience)에 의해 채택된 동물 관리 및 사용에 관한 원칙에 따랐으며, 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC)에 의해 승인받았다.
소동물 연구. 발현 카세트의 코딩 서열에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 발현을 마우스, 래트 및 모래쥐에서 생체 내에서 평가하였다. 이는 발현 카세트를 포함하는 rAAV 제조물의 생체 내로의 유리체 내 주입에 의해 달성된다 (Li et al., 2008; Mol Vis 48: 332-338). 플라스미드 DNA의 전기천공이 대신 실시될 수 있음에 주목한다 (Matsuda/Cepko).
마우스 연구. 이 연구에 사용된 마우스는 C57BL/6이었다. 동물을 케타민/자일라진 (110 mg/kg 복강 내)으로 안락사시켰다. 검사 품목으로 채워진 경사형 (beveled) 34 게이지 일회용 바늘을 눈의 유리체 내로 삽입하고, 1.5 μl 부피의 5.04 × 1010 벡터 게놈의 rAAV를 유리체 내로 주입하였다.
모래쥐 및 래트 연구. 모래쥐 (Meriones unguiculatus) 및 갈색 노르웨이 래트를 이 연구에 사용하였다. 동공을 10% 페닐에프린 및 0.5% 트로피카미드를 사용하여 팽창시켰다. 동물을 0.1-0.2 mL의 케타민/자일라진 용액의 복강 내 또는 근육 내 주입으로 안락사시켰다 (래트의 경우 70 mg/mL 케타민 및 10 mg/mL 자일라진; 모래쥐의 경우 25 mg/mL 케타민 및 0.3 mg/mL 자일라진). 100 μL 헤밀튼 주사기 내에 검사 품목으로 채워진 경사형 34 게이지 일회용 바늘을 가장자리로부터 약 1 mm 떨어진 최적화된 상측두 지점 (superior-temporal point)에서 공막을 통해 눈의 유리체 내로 삽입하였다. 5 μl 부피로 1 × 1010 - 2 × 1010 벡터 게놈의 검사 품목 (2 × 1010 vg의 rAAV.GFP, 또는 1.15 × 1010 vg의 rAAV.루시퍼라제)을 유리체 내로 미세-주입 펌프를 이용하여 서서히 주입하고, 그 후에 검사 품목의 적절한 분배를 보장하기 위하여 바늘 팁을 10초간 주입된 위치에서 주입된 눈에 유지하였다. 그 후에 바늘을 제거하였다.
비-인간 영장류 (NHP) 연구. 폴리뉴클레오티드 카세트 및 발현 벡터를 또한 대동물에서 검사하였다. 이는 AAV를 사용하여, 예를 들어 Mancuso 등의 기술을 이용하여 수행된다. 간략히, AAV 카세트를 만들고, 발현 카세트를 캡시드 조립한 AAV를 제조하고, 바이러스 제조물을 비인간 영장류에서 유리체 내로 (유리체에서 최대 170 μL) 또는 망막하로 (다른 위치에서 최대 3회, 100 μL 주입; 유리체 절제가 주입 전에 실시될 수 있음) 주입한다. 발현을 리포터 (GFP), 색깔 ERG에 의해, 및/또는 캠브리지 색깔 테스트 (Cambridge Color Test)를 이용한 행동 검사에 의해 또는 표적이 가시 영역 내로 들어올 때 단속적 운동 (saccade) (안구 운동)을 하도록 훈련된 동물에 대해 평가하였다. 단속성 운동을 눈 추적기를 사용하여 모니터링하였다. 처리 전에, 채색된 표적을 볼 때 색각 검사를 수행하거나 단속적 운동을 하도록 동물을 훈련시킨다. 존재하는 원추체의 분광 감수성을 평가하기 위해 ERG를 수행한다. 색각 검사 성능 및 ERG로부터의 데이터는 동물이 이색성 (색맹)이라는 증거를 제공한다. GFP 유전자를 보유하는 벡터가 투여된 동물의 경우, GFP의 여기를 초래하는 빛 하에서 RetCam II 또는 유사한 장치를 사용한 안저 이미지화를 이용하여 발현을 모니터링하였다. 동물의 내인성 색소에 비해 분광 감수성이 다른 광색소 유전자를 투여받은 동물의 경우, 최대 106 상이한 망막 위치에서 분광 감수성을 측정하기 위한 다초점 색깔 ERG를 사용하고 행동 검사에 의해 발현을 모니터링하였다.
개코원숭이를 10-15 mg/kg 케타민에 이어 세보플루오란으로 진정시켰다. 아프리카 녹색 원숭이를 5:1 케타민:자일라진 혼합물 (100 mg/ml 케타민 및 20 mg/ml 자일라진의 0.2 ml/kg)의 근육 내 주입으로 진정시켰다. 동공확대 (mydriasis)를 국소 10% 페닐에프린으로 달성하였다. 주입을 용이하게 하기 위해 눈벌리개 (eye speculum)를 눈에 설치하였다. 한 방울의 프로파라카인 (proparacaine) 염산염 0.5% 및 이어서 5% 베타딘 용액을 적용하였고, 이어서 멸균 식염수로 세정하였다. 개코원숭이 (도 6)는 눈당 2.02 × 1012 vg의 최종 투여량을 생산하기 위해 유리체 내 주입에 의해 rAAV의 3.4 × 1013 vg 제조물 60 μl를 투여받았다. 아프리카 녹색 원숭이는 눈당 5 × 1011 vg의 최종 투여량을 생산하기 위해 ITV 주입에 의해 rAAV 벡터의 1 × 1013 vg 제조물 50 μl를 투여받았다. 중심 유리체로의 ITV 주입은 안구외 및 안구내 바늘 배치의 완전한 가시화를 가능케 하는 수술적 배율 하에서 가장자리에서 ~2.5 mm 떨어진 거상연 (ora serrata)의 수준에서 측두하로 삽입된 31-게이지 0.375 인치 바늘 (Terumo)을 사용하여 투여된다. 중심 유리체 배치는 주입 시점에 바늘 팁의 직접적인 관찰에 의해 확인하였다. ITV 주입에 이어서 국소 삼중 항생제 연고를 투여하였다.
세극-등 현미경검사 (Slit-lamp biomicroscopy). 각 원숭이 눈의 안구 앞부분을 염증을 모니터링하기 위하여 기저선 스크리닝 도중 및 주입-후 4주째 (28일째), 8주째 (56일째) 및 12주째 (84일째)에 세극-등 현미경검사로 검사하였다. 어떠한 비정상도 관찰되지 않았다.
안저 검사 및 촬영술. 래트 및 모래쥐 망막의 안구 검사 및 안저 촬영을 피닉스 미크론 (Phoenix Micron) IV 안저 현미경을 사용하여 수행하였다. 모든 동물은 안구 건강상태를 확인하기 위해 기저선 스크리닝/촬영을 실시하였고, 그 후에 GFP 전이유전자의 발현을 모니터링하기 위하여 지정된 시점에서 촬영하였다. 시신경 및 망막에의 임의의 변화 또는 육안 병소의 출현을 색깔 안저 촬영에 의해 기록하였고 GFP의 발현을 플루오르세인 필터를 이용한 형광 안저 이미징으로 가시화하였다.
망막 검사, 안저 색깔 및 형광 촬영술, 및 NHP의 자가형광 OCT를 캐논 6D 디지털 이미징 하드웨어 및 뉴비전 (New Vision) 안저 이미지 분석 소프트웨어 및 스펙트랄리스 (Spectralis) OCT 플러스가 구비된 탑콘 (Topcon) TRC-50EX 망막 카메라를 사용하여 수행하였다. 모든 동물에 기저선 이미지화를 수행하였다. GFP 발현을 또한 유리체 내 벡터 주입-후 2, 4, 8 및 12주째에 기록하였다.
IVIS 이미징 시스템. rAAV.루시퍼라제의 전달 이후 망막에서 루시퍼라제의 발현을 유리체 내 주입-후 2, 4, 및 8주째에 생체 내에서 IVIS 이미징 시스템을 사용하여 정량하였다. 모래쥐에 150 mg/kg의 루시페린 (PerkinElmer) (15 ml/kg의 용량으로 15 mg/ml의 루시페린)을 피하로 주입하였다. 대략 22분 후에, 동물을 3-5분간 4% 이소플루란을 흡입시켜 진정시켰다. 그 후에 즉시, 동물을 쌍으로 이미징 플랫폼 위에 놓아두고, 각 동물의 한쪽 눈의 발광을 반대쪽 눈의 이미지화에 이어서 즉시 정량하였다. 전형적으로 1 × 104 광자/초의 발광을 기록하는 발광 배경 수준을 갖는 나이브 (naive) 모래쥐를 음성 표준으로 사용하였다. 이미징 시스템의 보정을 보장하기 위해 유령 마우스 (생체발광 이미징용 XPM-2 퍼킨 엘머 유령 마우스)를 이용한 생체발광 확인을 이미지화 전에 수행하였다.
면역조직화학. 마우스를 치사량의 펜토바르비탈 나트륨염으로 안락사시키고 먼저 mL당 2 유닛의 헤파린을 함유하는 0.13 M 인산염 완충 식염수 (PBS) (pH 7.2-7.4)로, 이어서 PBS 중의 4% 파라포름알데히드 (PFA), 이어서 PBS 중의 4% 파라포름알데히드 플러스 1% 글루타르알데히드를 이용한 심장 관류를 통해 조직을 고정시켰다. 글루타르알데히드는 원추체 외분절이 온전한 상태로 남을 수 있도록 신경 망막을 RPE에 부착된 상태로 유지하기 위해 제공된다. 각 용액을 투여 전에 ~37℃로 가온하였고 ~35-40 mL의 관류액을 각 단계에서 전달하였다. 일단 관류가 중단되면, 마우스를 촉촉한 종이 수건으로 감싸고 안구적출 및 절개 전에 2-3시간 동안 추가로 고정되게 놔두었다.
영구적인 잉크를 사용하여 눈의 방향을 표시하고, 안구 앞부분을 제거하고, 아이-컵 (eye-cup)을 4℃에서 밤새 4% PFA 중에서 고정한 후, 4℃에서 PBS 중에서 보관하였다. 망막 온조직 표본을 2시간 동안 4% PFA 중에 함침된 조직들 사이에 절개된 망막을 편평화한 후 이들을 6시간 이상의 고정화를 위해 배양 플레이트로 옮겼다. 그 후에, PFA를 0.03% 아지드화 나트륨 함유 PBS (Sigma)로 교체하였다.
회전 테이블 진탕기 상에서 항체 표지를 수행하였다. 비-특이적 표지를 차단하기 위하여, 온조직 표본을 PBS (pH 7.4) 중에 5% 당나귀 혈청 (Jackson ImmunoResearch, Cat #004-000-120), 1 mg/ml BSA (Jackson ImmunoResearch, Cat #001-000-161), 및 0.03% 트리톤 X-100을 함유하는 용액과 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이 연구에 사용된 일차 항체는 1:200으로 희석된 토끼 항 적-녹색 (L/M) 옵신 (Millipore, Cat # AB5405)이었다. 표본을 각 30분간 3회 PBS로 세척한 후, DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 염산염 1:10,000; Invitrogen, Cat # D-21490) 플러스 이차 항체와 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. L/M-옵신 항체에 대한 이차 항체는 항체 희석 완충제 (Invitrogen, Cat # A21206)로 1:200 희석된 알렉사 플루오르 (Alexa Fluor) 488 표지된 당나귀 항-토끼 IgG(H+L)였다. 이차 항체와의 인큐베이션에 이어 30분간 PBS로 3회 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 30분간 후-고정하고, 30분간 PBS로 3회 더 세척하였다. 마지막으로, 망막 절편을 글리세롤 중의 2% DABCO와 함께 슬라이드 위에 놓아두고 커버 슬립으로 덮었다.
현미경검사법. 마우스 망막 온조직 표본의 광각 이미지를 20× (open-air) 대물렌즈를 구비한 니콘 이클립스 (Nikon Eclipse) E1000 및 1.5× 광학 줌을 구비한 카메라 세트를 사용하여 획득하였다. 각 표본에 대해, 50개의 광학 절편을 0.5 μm 사이를 두고 취하고 M-옵신 Z-스택 (stack)을 ImageJ로 재구성하였다. Z-스택을 외분절의 길이가 면 내에 있도록 배양하였고, 항체 염색이 시작되고 끝난 사이의 거리를 외분절의 길이의 척도로서 평가하였다. 또한, Z-스택의 3D 프로젝션을 생성하였고 외분절에서 시각적 M-옵신을 갖는 원추체의 개수를 정량할 수 있었다.
공초점 이미지 슬라이스를 Olympus FluoViewTM FV1000을 사용하여 획득하였다. 절편을 20× 유침 (oil immersion) 렌즈 (0.5 μm 사이를 두고 40개 이미지를 취함)를 사용하여 이미지화하였고 Z-스택을 ImageJ로 재구성하였다. 채널 노출 수준을 어도비 포토샵 (Adobe Photoshop)을 사용하여 이미지 내 및 이미지간에 평형화하였다. 망막 온조직 표본의 경우, 이미지를 10× 오픈-에어 렌즈를 사용하여 취하였고 모자이크를 어도비 포토샵 고유의 모자이크 컨스트럭션 소프트웨어를 이용하여 구성하였다.
폴리뉴클레오티드 카세트의 조직 특이성을 검사하는 실험. 이 경우에, GFP를 인코딩하는 작제물을 유리체 내, 망막하, 또는 근육 내와 같은 하나 이상의 투여 경로를 통해 주입한다. 그 후에 동물을 희생시키고 조직을 - 작제물의 존재를 나타내는 DNA 서열을 검출하기 위해 - qPCR 및 - 작제물이 활발히 발현되는 영역을 검출하기 위해 - GFP 발현으로 분석하였다. DNA 서열의 부재는 소정의 조직에 대한 생체분포의 결여를 나타내는 반면, 전이유전자 발현 (mRNA 또는 단백질 수준)의 결여와 함께 DNA 서열의 존재는 그 조직에서 발현의 부재이지만 벡터의 존재를 나타낸다. 이 방식으로, 원추 광수용체에 대한 특이성의 수준을 확립할 수 있고, 시신경, 간, 비장, 또는 뇌 조직과 같은 비-표적 조직에서의 발현 없이 원추 광수용체 세포로 발현을 제한하는 측면에서 본 발명의 유용성을 결정하는데 사용될 수 있다. 유리체 내 AAV는 뇌에 생체분포하는 것으로 알려져 있고 (Provost et al) 그래서 다원추 광수용체를 표적하는 고도로 발현된, 향상된 작제물이 망막의 표적 세포로 발현을 제한하고 비-표적 전이유전자 발현과 연관된 가능한 부정적인 효과를 제한하는데 유용할 것이다.
전술한 바는 단지 본 발명의 원리를 설명한다. 당해 분야의 숙련자는, 본원에 명백히 기술되거나 나타나지 않더라도, 발명의 원리를 구현하고 그의 요지 및 범주 내에 포함되는 다양한 배합을 고안할 수 있을 것으로 이해될 것이다. 나아가, 본원에 언급된 모든 예시 및 조건부 용어는 주로 독자가 발명의 원리 및 발명자들에 의해 당해 분야를 발전시키는데 기여한 원리를 이해하는 것을 보조하기 위한 것으로 의도되고, 이렇게 특별히 언급된 예시 및 조건으로 제한되지 않는 것으로 해석될 것이다. 더욱이, 발명의 원리, 측면, 및 실시양태뿐만 아니라 이의 특정한 예시를 언급하는 본원의 모든 진술은 이들의 구조적 및 기능적 등가물 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 이러한 등가물에는 현재 알려진 등가물과 미래에 개발될 등가물, 즉 구조와 무관하게, 동일한 기능을 수행하는 개발된 임의의 요소들 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명의 범주는 본원에 나타내고 기술된 예시적인 실시양태로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 그보다, 본 발명의 범주 및 요지는 첨부된 특허청구범위에 의해 구현된다.
SEQUENCE LISTING <110> Adverum Biotechnologies, Inc. University of washington <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCED GENE EXPRESSION IN CONE CELLS <130> IPA161278-US-D1 <150> US 61/954,330 <151> 2014-03-17 <150> US 62/127,185 <151> 2015-03-02 <160> 103 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 494 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggatccggtt ccaggcctcg gccctaaata gtctccctgg gctttcaaga gaaccacatg 60 agaaaggagg attcgggctc tgagcagttt caccacccac cccccagtct gcaaatcctg 120 acccgtgggt ccacctgccc caaaggcgga cgcaggacag tagaagggaa cagagaacac 180 ataaacacag agagggccac agcggctccc acagtcaccg ccaccttcct ggcggggatg 240 ggtggggcgt ctgagtttgg ttcccagcaa atccctctga gccgcccttg cgggctcgcc 300 tcaggagcag gggagcaaga ggtgggagga ggaggtctaa gtcccaggcc caattaagag 360 atcaggtagt gtagggtttg ggagctttta aggtgaagag gcccgggctg atcccacagg 420 ccagtataaa gcgccgtgac cctcaggtga tgcgccaggg ccggctgccg tcggggacag 480 ggctttccat agcc 494 <210> 2 <211> 494 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ttatttagta gaaacggggt ttcaccatgt tagtcaggct ggtcgggaac tcctgacctc 60 aggagatcta 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Gln Ala Ala Phe Met Gly Thr Val Phe Leu Ile Gly 35 40 45 Phe Pro Leu Asn Ala Met Val Leu Val Ala Thr Leu Arg Tyr Lys Lys 50 55 60 Leu Arg Gln Pro Leu Asn Tyr Ile Leu Val Asn Val Ser Phe Gly Gly 65 70 75 80 Phe Leu Leu Cys Ile Phe Ser Val Phe Pro Val Phe Val Ala Ser Cys 85 90 95 Asn Gly Tyr Phe Val Phe Gly Arg His Val Cys Ala Leu Glu Gly Phe 100 105 110 Leu Gly Thr Val Ala Gly Leu Val Thr Gly Trp Ser Leu Ala Phe Leu 115 120 125 Ala Phe Glu Arg Tyr Ile Val Ile Cys Lys Pro Phe Gly Asn Phe Arg 130 135 140 Phe Ser Ser Lys His Ala Leu Thr Val Val Leu Ala Thr Trp Thr Ile 145 150 155 160 Gly Ile Gly Val Ser Ile Pro Pro Phe Phe Gly Trp Ser Arg Phe Ile 165 170 175 Pro Glu Gly Leu Gln Cys Ser Cys Gly Pro Asp Trp Tyr Thr Val Gly 180 185 190 Thr Lys Tyr Arg Ser Glu Ser Tyr Thr Trp Phe Leu Phe Ile Phe Cys 195 200 205 Phe Ile Val Pro Leu Ser Leu Ile Cys Phe Ser Tyr Thr Gln Leu Leu 210 215 220 Arg Ala Leu Lys Ala Val Ala Ala Gln Gln Gln Glu Ser Ala Thr Thr 225 230 235 240 Gln Lys Ala Glu Arg Glu Val Ser Arg Met Val Val Val Met Val Gly 245 250 255 Ser Phe Cys Val Cys Tyr Val Pro Tyr Ala Ala Phe Ala Met Tyr Met 260 265 270 Val Asn Asn Arg Asn His Gly Leu Asp Leu Arg Leu Val Thr Ile Pro 275 280 285 Ser Phe Phe Ser Lys Ser Ala Cys Ile Tyr Asn Pro Ile Ile Tyr Cys 290 295 300 Phe Met Asn Lys Gln Phe Gln Ala Cys Ile Met Lys Met Val Cys Gly 305 310 315 320 Lys Ala Met Thr Asp Glu Ser Asp Thr Cys Ser Ser Gln Lys Thr Glu 325 330 335 Val Ser Thr Val Ser Ser Thr Gln Val Gly Pro Asn 340 345 <210> 8 <211> 1998 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cccactggcc ggtataaagc accgtgaccc tcaggtgacg caccagggcc ggctgccgtc 60 ggggacaggg ctttccatag ccatggccca gcagtggagc ctccaaaggc tcgcaggccg 120 ccatccgcag gacagctatg aggacagcac ccagtccagc atcttcacct acaccaacag 180 caactccacc agaggcccct tcgaaggccc gaattaccac atcgctccca gatgggtgta 240 ccacctcacc agtgtctgga tgatctttgt ggtcattgca tccgtcttca caaatgggct 300 tgtgctggcg gccaccatga agttcaagaa gctgcgccac ccgctgaact ggatcctggt 360 gaacctggcg gtcgctgacc tggcagagac 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aataaacaca aaaggtagaa ttacaaagga 2280 aatgatagtg caagattcag atagtcccct taaaggaggg atactttgtg aggaagacct 2340 ccagaaaagt gatactgtaa ttgaatcaaa tactttttgt tccaaaagta atctcaattc 2400 cacgatttcc aagaatttcc atagaaataa attaaatact actcaaaatt ccaaggttca 2460 aggactttta accaaaagaa aatctagatc actaaataaa ataagcttag gagcacctaa 2520 aaaaagagaa atcggtcaaa gagataaagt gtttcctcac aatgaatcta aatattgcaa 2580 aagtactttt gaaaacaaaa gtttatttca tgtatttaac atccttgagc aaaaacccaa 2640 agatttttat gcaccgcaat ctcaagcaga agtggcatct gggtatttga gaggaatggc 2700 aaagaagagt ttagtttcaa aagttactga ttcacacata actttaaaaa gccagaaaaa 2760 acgtaaaggg gataaagtga aagcaagtgc tattttaagt aaacaacatg ctacaaccag 2820 ggcaaattct ttagcttctt tgaaaaaacc tgattttcct gaggctattg ctcatcattc 2880 aattcaaaat tatatacaga gttggttgca gaacataaat ccatatccaa ctttaaagcc 2940 tataaaatca gctccagtat gtagaaatga aacgagtgtg gtaaattgta gcaataatag 3000 tttttcaggg aatgatcccc atacaaattc tggaaaaata agtaattttg ttatggaaag 3060 taataagcac ataactaaaa ttgccggttt 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gatctgggcc 540 gccgtgtgga ccgccccccc catcttcggc tggagccggt actggcccta cggcctgaag 600 accagctgcg gccccgacgt gttcagcggc agcagctacc ccggcgtgca gagctacatg 660 atcgtgctga tggtgacctg ctgcatcacc cccctgagca tcatcgtgct gtgctacctg 720 caggtgtggc tggccatccg ggccgtggcc aagcagcaga aggagagcga gagcacccag 780 aaggccgaga aggaggtgac ccggatggtg gtggtgatgg tgctggcctt ctgcttctgc 840 tggggcccct acgccttctt cgcctgcttc gccgccgcca accccggcta ccccttccac 900 cccctgatgg ccgccctgcc cagctacttc gccaagagcg ccaccatcta caaccccgtg 960 atctacgtgt tcatgaaccg gcagttccgg aactgcatcc tgcagctgtt cggcaagaag 1020 gtggacgacg gcagcgagct gagcagcgcc agcaagaccg aggtgagcag cgtgagcagc 1080 gtgagccccg cc 1092 <210> 65 <211> 1092 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 atggcccagc agtggagcct gcagcggctg gccggccggc acccccagga cagctacgag 60 gacagcaccc agagcagcat cttcacctac accaacagca acagcacccg gggccccttc 120 gagggcccca actaccacat cgccccccgg tgggtgtacc acctgaccag cgtgtggatg 180 atcttcgtgg tgatcgccag cgtgttcacc aacggcctgg tgctggccgc cacaatgaag 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construct <400> 87 cgtgaccctc aggtgatgcg ccagggccgg ctgccgtcgg ggacagggct ttccatagcc 60 atgctagagg atccggtact cgaggaactg aaaaaccaga aagttaactg gcctgtacgg 120 aagtgttact tctgctctaa aagctgcgga attgtacccg cggccgcggg acagggcttt 180 ccata 185 <210> 88 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized 5'UTR construct <400> 88 cgtgaccctc aggtgatgcg ccagggccgg ctgccgtcgg ggacagggct ttccatagcc 60 atgctagagg atccggtact cgaggaactg aaaaaccaga aagttaactg 110 <210> 89 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized 5'UTR construct <400> 89 gcctgtacgg aagtgttact tctgctctaa aagctgcgga attgtacccg cggccgcggg 60 acagggcttt ccata 75 <210> 90 <211> 235 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct poly A region <400> 90 ggccgcgggg atccagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga 60 atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc 120 attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt 180 cagggggaga tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg tggta 235 <210> 91 <211> 152 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct poly A region <400> 91 ggccgcgggg atccagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga 60 atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc 120 attataagct gcaataaaca agttaacaac aa 152 <210> 92 <211> 1714 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 cctacagcag ccagggtgag attatgaggc tgagctgaga atatcaagac tgtaccgagt 60 agggggcctt ggcaagtgtg gagagcccgg cagctggggc agagggcgga gtacggtgtg 120 cgtttacgga cctcttcaaa cgaggtagga aggtcagaag tcaaaaaggg aacaaatgat 180 gtttaaccac acaaaaatga aaatccaatg gttggatatc cattccaaat acacaaaggc 240 aacggataag tgatccgggc caggcacaga aggccatgca cccgtaggat tgcactcaga 300 gctcccaaat gcataggaat agaagggtgg gtgcaggagg ctgaggggtg gggaaagggc 360 atgggtgttt catgaggaca gagcttccgt ttcatgcaat gaaaagagtt tggagacgga 420 tggtggtgac tggactatac acttacacac ggtagcgatg gtacactttg tattatgtat 480 attttaccac gatcttttta aagtgtcaaa ggcaaatggc caaatggttc cttgtcctat 540 agctgtagca gccatcggct gttagtgaca aagcccctga gtcaagatga cagcagcccc 600 cataactcct aatcggctct cccgcgtgga gtcatttagg agtagtcgca ttagagacaa 660 gtccaacatc taatcttcca ccctggccag ggccccagct ggcagcgagg gtgggagact 720 ccgggcagag cagagggcgc tgacattggg gcccggcctg gcttgggtcc ctctggcctt 780 tccccagggg ccctctttcc ttggggcttt cttgggccgc cactgctccc gctcctctcc 840 ccccatccca ccccctcacc ccctcgttct tcatatcctt ctctagtgct ccctccactt 900 tcatccaccc ttctgcaaga gtgtgggacc acaaatgagt tttcacctgg cctggggaca 960 cacgtgcccc cacaggtgct gagtgacttt ctaggacagt aatctgcttt aggctaaaat 1020 gggacttgat cttctgttag ccctaatcat caattagcag agccggtgaa ggtgcagaac 1080 ctaccgcctt tccaggcctc ctcccacctc tgccacctcc actctccttc ctgggatgtg 1140 ggggctggca cacgtgtggc ccagggcatt ggtgggattg cactgagctg ggtcattagc 1200 gtaatcctgg acaagggcag acagggcgag cggagggcca gctccggggc tcaggcaagg 1260 ctgggggctt cccccagaca ccccactcct cctctgctgg acccccactt catagggcac 1320 ttcgtgttct caaagggctt ccaaatagca tggtggcctt ggatgcccag ggaagcctca 1380 gagttgctta tctccctcta gacagaaggg gaatctcggt caagagggag aggtcgccct 1440 gttcaaggcc acccagccag ctcatggcgg taatgggaca aggctggcca gccatcccac 1500 cctcagaagg gacccggtgg ggcaggtgat ctcagaggag gctcacttct gggtctcaca 1560 ttcttccagc aaatccctct gagccgcccc cgggggctcg cctcaggagc aaggaagcaa 1620 ggggtgggag gaggaggtct aagtcccagg cccaattaag agatcagatg gtgtaggatt 1680 tgggagcttt taaggtgaag aggcccgggc tgat 1714 <210> 93 <211> 234 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized promoter sequence <400> 93 ccagcaaatc cctctgagcc gcccccgggg gctcgcctca ggagcaagga agcaaggggt 60 gggaggagga ggtctaagtc ccaggcccaa ttaagagatc agatggtgta ggatttggga 120 gcttttaagg tgaagaggcc cgggctgatc ccactggccg gtataaagca ccgtgaccct 180 caggtgacgc accagggccg gctgccgtcg gggacagggc tttccatagc ccag 234 <210> 94 <211> 235 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized intron sequence <400> 94 cccactggcc ggtataaagc accgtgaccc tcaggtgacg caccagggcc ggctgccgtc 60 ggggacaggg ctttccatag cccaggtaag tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga 120 ccaatagaaa ctgggcttgt cgagacagag aagactcttg cgtttctgat aggcacctat 180 tggtcttact gacatccact ttgcctttct ctccacaggc ccagagagga gacag 235 <210> 95 <211> 1958 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cassette comprising optimized enhance, optimized promoter, optimized 5'UTR, optimized intron, optimized kozak and optimized polyA region <400> 95 cctacagcag ccagggtgag attatgaggc tgagctgaga atatcaagac tgtaccgagt 60 agggggcctt ggcaagtgtg gagagcccgg cagctggggc agagggcgga gtacggtgtg 120 cgtttacgga cctcttcaaa cgaggtagga aggtcagaag tcaaaaaggg aacaaatgat 180 gtttaaccac acaaaaatga aaatccaatg gttggatatc cattccaaat acacaaaggc 240 aacggataag tgatccgggc caggcacaga aggccatgca cccgtaggat tgcactcaga 300 gctcccaaat gcataggaat agaagggtgg gtgcaggagg ctgaggggtg gggaaagggc 360 atgggtgttt catgaggaca gagcttccgt ttcatgcaat gaaaagagtt tggagacgga 420 tggtggtgac tggactatac acttacacac ggtagcgatg gtacactttg tattatgtat 480 attttaccac gatcttttta aagtgtcaaa ggcaaatggc caaatggttc cttgtcctat 540 agctgtagca gccatcggct gttagtgaca aagcccctga gtcaagatga cagcagcccc 600 cataactcct aatcggctct cccgcgtgga gtcatttagg agtagtcgca ttagagacaa 660 gtccaacatc taatcttcca ccctggccag ggccccagct ggcagcgagg gtgggagact 720 ccgggcagag cagagggcgc tgacattggg gcccggcctg gcttgggtcc ctctggcctt 780 tccccagggg ccctctttcc ttggggcttt cttgggccgc cactgctccc gctcctctcc 840 ccccatccca ccccctcacc ccctcgttct tcatatcctt ctctagtgct ccctccactt 900 tcatccaccc ttctgcaaga gtgtgggacc acaaatgagt tttcacctgg cctggggaca 960 cacgtgcccc cacaggtgct gagtgacttt ctaggacagt aatctgcttt aggctaaaat 1020 gggacttgat cttctgttag ccctaatcat caattagcag agccggtgaa ggtgcagaac 1080 ctaccgcctt tccaggcctc ctcccacctc tgccacctcc actctccttc ctgggatgtg 1140 ggggctggca cacgtgtggc ccagggcatt ggtgggattg cactgagctg ggtcattagc 1200 gtaatcctgg acaagggcag acagggcgag cggagggcca gctccggggc tcaggcaagg 1260 ctgggggctt cccccagaca ccccactcct cctctgctgg acccccactt catagggcac 1320 ttcgtgttct caaagggctt ccaaatagca tggtggcctt ggatgcccag ggaagcctca 1380 gagttgctta tctccctcta gacagaaggg gaatctcggt caagagggag aggtcgccct 1440 gttcaaggcc acccagccag ctcatggcgg taatgggaca aggctggcca gccatcccac 1500 cctcagaagg gacccggtgg ggcaggtgat ctcagaggag gctcacttct gggtctcaca 1560 ttcttccagc aaatccctct gagccgcccc cgggggctcg cctcaggagc aaggaagcaa 1620 ggggtgggag gaggaggtct aagtcccagg cccaattaag agatcagatg gtgtaggatt 1680 tgggagcttt taaggtgaag aggcccgggc tgatcccact ggccggtata aagcaccgtg 1740 accctcaggt gacgcaccag ggccggctgc cgtcggggac agggctttcc atagcccagg 1800 taagtatcaa ggttacaaga caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac 1860 agagaagact cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct 1920 ttctctccac aggcccagag aggagacagg ccgccacc 1958 <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide insertion in the AAV GH loop <400> 96 Leu Gly Glu Thr Thr Arg Pro 1 5 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide insertion in the AAV GH loop <400> 97 Asn Glu Thr Ile Thr Arg Pro 1 5 <210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide insertion in the AAV GH loop <400> 98 Lys Ala Gly Gln Ala Asn Asn 1 5 <210> 99 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide insertion in the AAV GH loop <400> 99 Lys Asp Pro Lys Thr Thr Asn 1 5 <210> 100 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide insertion in the AAV GH loop <400> 100 Lys Asp Thr Asp Thr Thr Arg 1 5 <210> 101 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide insertion in the AAV GH loop <400> 101 Arg Ala Gly Gly Ser Val Gly 1 5 <210> 102 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide insertion in the AAV GH loop <400> 102 Ala Val Asp Thr Thr Lys Phe 1 5 <210> 103 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide insertion in the AAV GH loop <400> 103 Ser Thr Gly Lys Val Pro Asn 1 5

Claims (1)

  1. 포유동물에서 원추세포 유전자 요법을 위한 방법으로서,
    (a) 망막 원추세포에 특이적인 프로모터 영역; 및
    (b) 치료제를 인코딩하는 코딩 서열로, 프로모터 영역에 작동가능하게 연결된 코딩 서열
    을 포함하는 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 재조합 유전자 전달 벡터를 원추세포 유전자 요법을 필요로 하는 포유동물의 눈에 투여하는 단계를 포함하고, 포유동물의 원추세포에서 치료제의 생체 내 발현이 원추세포 유전자 요법을 필요로 하는 포유동물을 치료하도록 제공되는 것인, 방법.
    .
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