JP2016538860A - プロテアーゼ開裂に対する感受性を低減した変異体α−アミラーゼ、及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許出願第61/906,617号(2013年11月20日出願)に対する優先権を請求し、この出願は参照によりその全体が本明細書に援用される。
1.第1の態様では、TIMバレル構造を持つα−アミラーゼのタンパク質分解開裂に対する感受性を低減する方法であって、β−バレルの第7ストランドと第7ヘリックスを連結するループ中に存在する非カノニカルで表面が露出したアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置換して変異体α−アミラーゼを生成することを含み、変異体α−アミラーゼは、親α−アミラーゼと比較して、プロテアーゼによるβ−バレルの第7ストランドと第7ヘリックスを連結するループ中の開裂に対する感受性が低減し、配列番号3が位置の番号付けに使用される、方法を提供する。
2.段落1に記載の方法の一部の実施形態では、非カノニカルで表面が露出したアミノ酸残基は、親α−アミラーゼにおける位置333に対応する位置に存在し、配列番号3が位置の番号付けに使用される。
3.一部の実施形態では、段落2に記載の方法は、親α−アミラーゼにおける位置335に対応する位置に存在するアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置換することを更に含み、配列番号3が位置の番号付けに使用される。
4.先行する段落2又は3に記載の方法の一部の実施形態では、親α−アミラーゼは、位置333に対応する位置にグリシン又はグルタミン以外のアミノ酸残基を有する。
5.先行する段落2〜4のいずれかに記載の方法の一部の実施形態では、親α−アミラーゼは、位置333に対応する位置にスレオニンを有する。
6.先行する段落2〜5のいずれかに記載の方法の一部の実施形態では、位置333に対応する位置においてアミノ酸残基をグリシンに置換する。
7.先行する段落3〜6のいずれかに記載の方法の一部の実施形態では、親α−アミラーゼは、位置335に対応する位置にセリン以外のアミノ酸残基を有する。
8.先行する段落3〜7のいずれかに記載の方法の一部の実施形態では、位置335に対応する位置においてアミノ酸残基をセリンに置換する。
9.一部の実施形態では、先行する段落のいずれかに記載の方法は、親α−アミラーゼにおいて次の突然変異、(i)位置177、178、179、及び180に対応する位置における1つ若しくは2つ以上のアミノ酸残基の欠失、(ii)位置186に対応する位置に存在するアミノ酸残基の置換、又は(iii)位置472に対応する位置に存在するアミノ酸残基の置換、の1つ又は2つ以上を作製することを更に含み、結果として生じる変異体が、その親と比較して洗剤組成物において増大した洗剤安定性及び/又は増大したクリーニング性能を有し、配列番号3が位置の番号付けに使用される。
10.一部の実施形態では、先行する段落のいずれかに記載の方法は、親α−アミラーゼにおいて次の突然変異、(i)位置177及び178に対応する位置におけるアミノ酸残基の欠失、(ii)位置186に対応する位置に存在するアミノ酸残基のプロリンへの置換、(iii)位置472に対応する位置に存在するアミノ酸残基のアルギニン又はリシンへの置換、の1つ又は2つ以上を作製することを更に含み、結果として生じる変異体が、その親と比較して洗剤組成物において増大した洗剤安定性及び/又は増大したクリーニング性能を有し、配列番号3が位置の番号付けに使用される。
11.一部の実施形態では、段落1〜10のいずれかに記載の方法は、N125、F152、N205、及びG473に対応する位置で1つ又は2つ以上の突然変異を作製することを更に含み、配列番号3が位置の番号付けに使用される。
12.段落11に記載の方法の一部の実施形態では、変異体は、次からなる群から選択される突然変異の組み合わせを含む。
(i)N125Y+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K、
(ii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K、
(iii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472R+G473R、
(iv)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+Q337E+G472K、
(v)N125Y+E186P+T333G+A335S+G472K、
(vi)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472K、
(vii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472R+G473R、
(viii)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+G472K、
(ix)N125Y+E186P+T333G+G472K、
(x)N125Y+F152W+E186P+T333G+G472K、
(xi)N125Y+F152W+E186P+T333G+G472R+G473R、及び
(xii)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+G472K。
13.先行する段落のいずれかに記載の方法の一部の実施形態では、親又は変異体α−アミラーゼは、配列番号3に対し少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
14.別の態様では、先行する段落のいずれかに記載の方法によって調製される変異体α−アミラーゼが提供される。
15.別の態様では、親α−アミラーゼの変異体が提供され、変異体は、親α−アミラーゼにおける位置333に対応する位置に存在するアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基への置換を含み、変異体α−アミラーゼは、親α−アミラーゼと比較して、プロテアーゼによるβ−バレルの第7ストランドと第7ヘリックスを連結するループ中の開裂に対する感受性が低減し、配列番号3が位置の番号付けに使用される。
16.一部の実施形態では、段落15に記載の変異体は、親α−アミラーゼにおける位置335に対応する位置に存在するアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基への置換を更に含んで、開裂に対する感受性を更に低減し、配列番号3が位置の番号付けに使用される。
17.先行する段落15又は16に記載の変異体の一部の実施形態では、親α−アミラーゼは、位置333に対応する位置にグリシン又はグルタミン以外のアミノ酸残基を有する。
18.先行する段落15〜17のいずれかに記載の変異体の一部の実施形態では、親α−アミラーゼは、位置333に対応する位置にスレオニンを有する。
19.先行する段落15〜18のいずれかに記載の変異体の一部の実施形態では、変異体α−アミラーゼは、位置333に対応する位置にグリシンへの置換を有する。
20.先行する段落15〜19のいずれかに記載の変異体の一部の実施形態では、親α−アミラーゼは、位置335に対応する位置にセリン以外のアミノ酸残基を有する。
21.先行する段落16〜20のいずれかに記載の変異体の一部の実施形態では、変異体α−アミラーゼは、位置335に対応する位置にセリンへの置換を有する。
22.一部の実施形態では、先行する段落15〜21のいずれかに記載の変異体は、その親に関連して次の突然変異、(i)位置177、178、179、及び180に対応する位置における1つ又は2つ以上のアミノ酸残基の欠失、(ii)位置186に対応する位置に存在するアミノ酸残基の置換、並びに(iii)位置472に対応する位置に存在するアミノ酸残基の置換、の1つ又は2つ以上を含み、変異体が、その親と比較して洗剤組成物において増大した洗剤安定性及び/又は増大したクリーニング性能を有し、位置の番号付けは配列番号3を参照する。
23.一部の実施形態では、先行する段落15〜22のいずれかに記載の変異体は、その親に関連して次の突然変異、(i)位置177及び178に対応する位置におけるアミノ酸残基の欠失、(ii)位置186に対応する位置に存在するアミノ酸残基のプロリンへの置換、(iii)位置472に対応する位置に存在するアミノ酸残基のアルギニン又はリシンへの置換、の1つ又は2つ以上を更に含み、変異体が、その親と比較して洗剤組成物において増大した洗剤安定性及び/又は増大したクリーニング性能を有し、位置の番号付けは配列番号3を参照する。
24.一部の実施形態では、先行する段落15〜23のいずれかに記載の変異体は、N125、F152、N205、及びG473からなる群から選択される位置における突然変異を更に含む。
25.一部の実施形態では、先行する段落15〜24のいずれかに記載の変異体は、位置177、178、179、及び180に対応する位置における1つ又は2つ以上のアミノ酸残基の欠失を含み、次からなる群から選択される突然変異の組み合わせを更に含む。
(i)N125Y+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K、
(ii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K、
(iii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472R+G473R、
(iv)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+Q337E+G472K、
(v)N125Y+E186P+T333G+A335S+G472K、
(vi)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472K、
(vii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472R+G473R、
(viii)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+G472K、
(ix)N125Y+E186P+T333G+G472K、
(x)N125Y+F152W+E186P+T333G+G472K、
(xi)N125Y+F152W+E186P+T333G+G472R+G473R、及び
(xii)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+G472K。
26.先行する段落15〜24のいずれかに記載の変異体の一部の実施形態では、親又は変異体は、配列番号3に対し少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
27.別の態様では、段落14〜26のいずれかに記載のα−アミラーゼを含む組成物が提供される。
28.一部の実施形態では、段落27に記載の組成物は、界面活性剤を更に含む。
29.一部の実施形態では、段落27又は28に記載の組成物は、洗濯洗剤、洗濯洗剤添加剤、又は手洗い若しくは自動食器洗い洗剤である。
30.一部の実施形態では、段落27〜29のいずれかに記載の組成物は、プロテアーゼ、へミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、脂肪分解酵素、メタロ脂肪分解(metallolipolytic)酵素、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドラーゼ、クチナーゼ、ぺクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナーゼ、ケラチナーゼ、還元酵素、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ(malanase)、β−グルカナーゼ、アラビノシターゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、メタロプロテイナーゼ、アマドリアーゼ、及びPcuAmy1以外のα−アミラーゼからなる群から選択される1つ又は2つ以上の追加の酵素、又はそれらの変異体を更に含む。
31.一部の実施形態では、段落27に記載の組成物は、デンプンを含む組成物の糖化用、液化後SSF用、若しくは事前液化なしの直接SSF用、又は発酵飲料若しくは焼成食品の生産用である。
32.一部の実施形態では、段落27又は28に記載の組成物は、織物湯通し用である。
33.別の態様では、段落14〜26のいずれかに記載のポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドが提供される。
34.一部の実施形態では、段落33に記載のポリヌクレオチドは、配列番号1のポリヌクレオチドに対し少なくとも80%の核酸配列同一性を有するか、又は配列番号1のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
35.別の態様では、段落33又は34に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。
36.別の態様では、段落35に記載の発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
37.別の態様では、グルコースを含む組成物の生産、液化デンプンの生産、食材若しくは飲料の生産、デンプン質の染みの洗浄、又は織物湯通しに際し、段落16〜26のいずれかに記載のα−アミラーゼの使用が提供される。
38.別の態様では、表面からデンプン質の染み又は汚れを除去する方法であって、表面を、段落16〜26のいずれかに記載の有効な量の変異体α−アミラーゼを含む組成物及び任意追加的に界面活性剤と接触させることと、α−アミラーゼがデンプン質の染み中に存在するデンプン成分を加水分解できるようにして、水溶液に溶解するより小さなデンプン由来の分子を産生することと、を含み、それによって、表面からデンプン質の染みを除去し、組成物が、任意追加的に、プロテアーゼ、へミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、脂肪分解酵素、メタロ脂肪分解酵素、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドラーゼ、クチナーゼ、ぺクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナーゼ、ケラチナーゼ、還元酵素、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシターゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、メタロプロテイナーゼ、アマドリアーゼ、及びPcuAmy1以外のα−アミラーゼからなる群から選択される少なくとも1つの追加の酵素、又はそれらの変異体を更に含む、方法が提供される。
39.別の態様では、織物を湯通しする方法であって、糊付けされた織物を段落14〜26のいずれかに記載の有効な量の変異体α−アミラーゼと接触させることと、α−アミラーゼが織物用糊のデンプン成分を加水分解できるようにして、水溶液に溶解するより小さなデンプン由来の分子を産生することと、を含み、それによって、織物から織物用糊を除去する方法が提供される。
40.別の態様では、デンプンを含む組成物を糖化してグルコースを含む組成物を生産するための方法であって、デンプンを含む組成物を段落14〜26のいずれかに記載の有効な量の変異体α−アミラーゼと接触させることと、デンプンを含む組成物を糖化させてグルコースを含む組成物を生産することと、を含み、α−アミラーゼがデンプン溶液のグルコースへの糖化を触媒する、方法が提供される。
41.段落40に記載の方法の一部の実施形態では、デンプンを含む組成物は、液化デンプン、ゼラチン化デンプン、又は顆粒デンプンを含む。
42.別の態様では、食材又は飲料を調製する方法であって、デンプンを含む食材又は飲料を段落14〜26のいずれかに記載のα−アミラーゼと接触させることと、α−アミラーゼがデンプンを加水分解できるようにして、より小さなデンプン由来の分子を産生することと、を含み、その方法が、食材又は飲料をグルコアミラーゼ、ヘキソキナーゼ、キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、プルラナーゼ、β−アミラーゼ、変異体α−アミラーゼでないα−アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、イソアミラーゼ、酸化還元酵素、エステラーゼ、トランスフェラーゼ、ペクチナーゼ、α−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、又はこれらの組み合わせと接触させることを任意追加的に更に含む、方法が提供される。
43.段落40〜42のいずれかに記載の方法の一部の実施形態では、α−アミラーゼは、宿主細胞によって発現され分泌される。
44.段落43に記載の方法の一部の実施形態では、デンプンを含む組成物は、宿主細胞に接触する。
45.段落43又は44に記載の方法の一部の実施形態では、宿主細胞はグルコアミラーゼ又は他の酵素を更に発現し、分泌する。
46.段落43〜45のいずれかに記載の方法の一部の実施形態では、宿主細胞は、組成物を発酵させ得るものである。
この発明を実施するための形態に従い、以下の略記及び定義を適用する。なお、単数形「a」、「an」、及び「the」には、文脈上明らかな別段の指示がない限り、複数の指示対象が含まれることに、留意されたい。したがって、例えば「酵素」という場合には、複数のこうした酵素が含まれ、「添加量」という場合には、当業者には周知の1つ又は2つ以上の添加量及びその等価物などが含まれる。
以下の略語/頭字語は、別途記載のない限り、以下の意味を有する。
用語「アミラーゼ」又は「デンプン分解酵素」は、とりわけ、デンプンの分解を触媒可能な酵素を指す。α−アミラーゼは、デンプン内のα−D−(1→4)O−グリコシド結合を切断する加水分解酵素である。一般的に、αアミラーゼ(EC 3.2.1.1;α−D−(1→4)−グルカングルカノヒドロラーゼ)は、デンプン分子内部のα−D−(1→4)O−グリコシド結合をランダムに切断して、(1〜4)−α−結合型D−グルコース単位を3つ以上含有するポリサッカライドを生成するエンド型酵素として定義される。対照的に、β−アミラーゼ(EC 3.2.1.2;α−D−(1→4)−グルカンマルトヒドロラーゼ)などのエキソ型デンプン分解酵素、及びマルトジェニックα−アミラーゼ(EC 3.2.1.133)などの一部の生成物特異的アミラーゼは、基質の非還元性末端からポリサッカライド分子を切断する。β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ(EC 3.2.1.20;α−D−グルコシドグルコヒドロラーゼ)、グルコアミラーゼ(EC 3.2.1.3;α−D−(1→4)−グルカングルコヒドロラーゼ)、及びマルトテトラオシダーゼ(EC 3.2.1.60)及びマルトヘキサオシダーゼ(EC3.2.1.98)などの生成物特異的アミラーゼは、特定の長さのマルト−オリゴ糖類、又は特定のマルトオリゴ糖類の富化シロップを生成し得る。
本発明の組成物及び方法の一態様は、由来となる親α−アミラーゼと比較してタンパク質分解開裂に対する感受性を低減した変異体α−アミラーゼ酵素に関連する。理論に制限されるものではないが、特定のα−アミラーゼは、タンパク質分解開裂の影響を受けやすい表面が露出したループにアミノ酸配列を含有すると考えられている。そのような配列は、例えば、特定条件下で活性を調整するためにプロテアーゼの存在下でα−アミラーゼを不安定にするように進化している場合がある。あるいは、そのような配列は、親α−アミラーゼが通常プロテアーゼが存在する環境に曝されなかったために進化した場合もあり、その場合はプロテアーゼに対する耐性を促進する選択圧が存在しなかった。そのような配列の存在の理由に関わらず、工業用途において優れたデンプン加水分解活性及び性能を呈する一部のα−アミラーゼが、プロテアーゼに対する感受性のためだけに商業的に有用でないことが観察されてきた。本発明の組成物及び方法は、そのようなα−アミラーゼをプロテアーゼが存在することが既知又は期待される用途で使用できるようにする。
N125Y+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K、
N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K、
N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472R+G473R、
N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+Q337E+G472K、
N125Y+E186P+T333G+A335S+G472K、
N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472K、
N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472R+G473R、
N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+G472K、
N125Y+E186P+T333G+G472K、
N125Y+F152W+E186P+T333G+G472K、
N125Y+F152W+E186P+T333G+G472R+G473R、及び
N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+G472K。
本発明のα−アミラーゼを、例えば、分泌又は細胞内の発現によって宿主細胞内で生産することができる。α−アミラーゼを含む培養された細胞材料(例えば、全細胞ブロス)は、α−アミラーゼの細胞培地への分泌を経て得ることができる。任意追加的に、最終α−アミラーゼの所望の純度に応じて、α−アミラーゼを宿主細胞から単離するか又は更には細胞ブロスから単離することができる。α−アミラーゼをコードする遺伝子は、当業者に周知の手法によりクローン化し、発現させることができる。好適な宿主細胞は、細菌由来の真菌(酵母及び糸状菌を含む)、及び植物細胞(藻類を含む)を含む。特に有用な宿主細胞としては、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、又はトリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)が挙げられる。他の宿主細胞としては、例えば、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)、又はB.リケニフォルミス(B. licheniformis)、並びにストレプトマイセス(Streptomyces)などの細菌細胞が挙げられる。
α−アミラーゼをコードする核酸を含むDNAコンストラクトを構築して、宿主細胞で発現させることができる。遺伝子暗号において周知の縮重により、同一のアミノ酸配列をコードする異なるポリヌクレオチドを常軌の手法により設計及び作成することができる。特定の宿主細胞のためコドンの使用を最適化することも、当業界では周知である。α−アミラーゼをコードする核酸をベクターに組み込むことができる。以降に記載のものなどの周知の形質転換法を使用し、ベクターを宿主細胞に移入させることができる。
DNAコンストラクト又は発現ベクターのいずれかを含む単離細胞は、アミラーゼの組み換え産生において、宿主細胞として有利に使用される。細胞は、宿主染色体にDNAコンストラクト(1つ又は2つ以上のコピー)を都合よく組み込むことにより、酵素をコードするDNAコンストラクトで形質転換することができる。DNA配列がより安定的に細胞に維持される傾向があることから、この組み込みは一般的に有利なものと考えられる。DNAコンストラクトの宿主染色体への組み込みは、例えば、同種又は異種組み換え法によるものなどの従来法により実施することができる。あるいは、細胞は、異なる種類の宿主細胞に関連して上記される通りに発現ベクターにより形質転換させることができる。
アミラーゼの生産方法は、酵素の生成を促す条件下で上述したような宿主細胞を培養すること、並びに、細胞及び/又は培養培地から酵素を回収することとを含んでよい。
宿主細胞においてアミラーゼの発現を評価するため、アッセイでは、発現タンパク質、対応するmRNA、又はα−アミラーゼ活性を測定することができる。例えば、好適なアッセイとしては、適切に標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用するノーザンブロット、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、及びインサイチューハイブリダイゼーションが挙げられる。好適なアッセイとしては、例えば、培養培地中のグルコースなどの還元糖を直接測定するアッセイによる、試料中アミラーゼ活性の測定も挙げられる。例えば、グルコース濃度は、グルコース試薬キットNo.15−UV(Sigma Chemical Co.)又はTechnicon Autoanalyzerなどの器具を用いて測定することができる。α−アミラーゼ活性はまた、後述のPAHBAH又はABTSアッセイなどの任意の既知の方法によって測定することもできる。
発酵、分離、及び濃縮法は、当該技術分野において周知であり、濃縮α−α−アミラーゼポリペプチド含有溶液を調製するために、従来法を使用することができる。
本発明のα−アミラーゼは、様々な工業的用途で有用である。例えば、α−アミラーゼは、デンプン変換プロセス、特に液化したデンプンの糖化プロセスで有用である。所望の最終製品は、酵素によるデンプン基質の変換により生産され得る任意の生成物であってよい。例えば、所望の製品は、グルコース及びマルトースが豊富なシロップであってもよく、このシロップはHFCSの調製などの他のプロセスで使用することができるか、又は複数の他の有用な製品、例えば、アスコルビン酸中間生成物(例えば、グルコン酸;2−ケト−L−グロン酸;5−ケト−グルコン酸;及び2,5−ジケトグルコン酸);1,3−プロパンジオール;芳香族性アミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、及びトリプトファン);有機酸(例えば、乳酸、ピルビン酸、コハク酸塩、イソクエン酸、及びオキサロ酢酸);アミノ酸(例えば、セリン及びグリシン);抗生物質;抗菌剤;酵素;ビタミン;及びホルモンなどに変換することができる。
一般的な当業者は、本開示のプロセスで使用するデンプン基質の調製に使用し得る、利用可能な方法をよく理解している。例えば、有用なデンプン基質は、塊茎類、根類、茎類、豆類、穀物又は全粒から得ることができる。より具体的には、粒状デンプンは、トウモロコシ、トウモロコシの穂軸、小麦、大麦、ライ麦、ライ小麦、ミロ、サゴ、キビ、キャッサバ、タピオカ、ソルガム、米、エンドウ豆、豆、バナナ、又はジャガイモから得ることができる。トウモロコシはデンプンを約60〜68%含有し、大麦はデンプンを約55〜65%含有し、キビはデンプンを約75〜80%含有し、小麦はデンプンを約60〜65%含有し、白米はデンプンを70〜72%含有する。具体的には、想到されるデンプン基質は、トウモロコシデンプン及び小麦デンプンである。穀類由来のデンプンは摩砕されていても、未精製でもよく、穀粒、糠、及び/又は穂軸といったトウモロコシ固形分を含む。デンプンは、高精製した生デンプン、又はデンプン精製プロセスで得られる原材料であってよい。様々なデンプンもまた市販されている。例えば、トウモロコシデンプンは、Cerestar、Sigma、及びKatayama Chemical Industry Co.(Japan)より入手可能であり、小麦デンプンは、Sigmaより入手可能であり、サツマイモデンプンは、Wako Pure Chemical Industry Co.(Japan)より入手可能であり、じゃがいもデンプンは、Nakaari Chemical Pharmaceutical Co.(Japan)より入手可能である。
本明細書で使用するとき、用語「液化」又は「液化する」は、デンプンが、より低い粘性の、かつより短鎖のデキストリンに変換されるプロセスを意味する。概ね、このプロセスには、α−アミラーゼの添加と同時の、又はそれに先立つ、デンプンの糊化が含まれるが、任意選択で、追加の液化誘導性の酵素が添加されてもよい。いくつかの実施形態では、上記に述べたようにして調製したデンプン基質を、水とともにスラリー化する。このデンプンスラリーは、乾燥固形分の重量パーセントとして、約10〜55%、約20〜45%、約30〜45%、約30〜40%、又は約30〜35%のデンプンを含有してよい。α−アミラーゼ(EC 3.2.1.1)を、例えば定量ポンプを使用してスラリーに添加してもよい。この用途で典型的に使用されるα−アミラーゼは、熱的に安定な細菌由来のα−アミラーゼであり、例えば、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)α−アミラーゼである。通常、α−アミラーゼは、例えば、デンプンの乾燥物1kg当たり約1500単位で供給される。α−アミラーゼの安定性及び活性を最適化するため、スラリーのpHは、典型的には約pH5.5〜6.5に調整され、約1mMのカルシウム(約40ppmの遊離カルシウムイオン)もまた添加することができる。ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)変異体、又はその他のα−アミラーゼは、異なる条件を必要とする場合がある。液化後のスラリー中に残存する細菌由来のα−アミラーゼは、続く反応工程にてpHを下げることを含む、多くの方法を介して、又は酵素がカルシウムに依存する場合には、スラリーからカルシウムを取り除くことにより、不活性化できる。
液化デンプンは、所望により他の酵素(複数種類可)の存在下で、α−アミラーゼを使用することにより、より低DP(例えば、DP1+DP2)の糖類に富むシロップへと糖化することができる。糖化産物の正確な組成は、使用される酵素の組み合わせ、並びに加工される粒状デンプンの種類に依存する。有利には、提供されたα−アミラーゼを使用して得ることができるシロップは、糖化されたデンプン中の全オリゴ糖での重量パーセントにして、30%を超えるDP2(例えば、45%〜65%又は55%〜65%)を含有してもよい。糖化デンプン中の(DP1+DP2)の重量%は、約70%、例えば、75%〜85%又は80%〜85%を超過し得る。本発明のアミラーゼはまた、シロップ製品中において、グルコースを比較的高い収率(例えば、DP1>20%)で生産する。
アミラーゼを用いた処理により生産された可溶性デンプン加水分解物は、高フルクトースのトウモロコシシロップ(HFCS)などの、高フルクトースデンプン系シロップ(HFSS)へと変換できる。この変換は、グルコースイソメラーゼ、特に固体担体に固定化されたグルコースイソメラーゼを使用して達成することができる。pHを、約6.0〜約8.0、例えば、pH7.5(イソメラーゼに依存)に上昇させ、及びCa2+をイオン交換により除去する。好適なイソメラーゼとして、SWEETZYME(登録商標)、IT(Novozymes A/S);G−ZYME(登録商標)IMGI、及びG−ZYME(登録商標)G993、KETOMAX(登録商標)、G−ZYME(登録商標)G993、G−ZYME(登録商標)G993液、及びGENSWEET(登録商標)IGIが挙げられる。異性化の後、この混合物は、典型的には、約40〜45%(例えば、42%)のフルクトースを含有する。
可溶性デンプン加水分解物、具体的にはグルコースに富むシロップは、典型的には、アルコール生産酵母に関しては約32℃(例えば30℃〜35℃)の温度で、発酵生物とデンプン加水分解物を接触させることによって、発酵させることができる。発酵の温度及びpHは、発酵生物に依存することになる。EOF生産物としては、クエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、イタコン酸及び他のカルボン酸類、グルコノデルタラクトン、エリソルビン酸ナトリウム、リジン及び他のアミノ酸類、オメガ3脂肪酸、ブタノール、イソプレン、1,3−プロパンジオール、並びに他の生体材料などの代謝産物が挙げられる。
α−アミラーゼは、グルコアミラーゼ(EC 3.2.1.3)(例えば、トリコデルマ(Trichoderma)グルコアミラーゼ又はその変異体)と組み合わせることもできる。グルコアミラーゼの例は、優れた比活性及び熱安定性を保有するトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)グルコアミラーゼ(TrGA)及びその変異体である。米国特許出願公開第2006/0094080号、同第2007/0004018号、及び同第2007/0015266号(Danisco US Inc.)を参照されたい。TrGAの好適な変異体としては、グルコアミラーゼ活性と、野生型TrGAに対して、少なくとも80%、少なくとも90%、又は少なくとも95%の配列同一性とを有するものが挙げられる。α−アミラーゼは、TrGAにより触媒された糖化プロセスで生産されるグルコースの収率を有利に増加させる。
本発明は、また、アミラーゼを含む「食品組成物」(食品製品、動物飼料、及び/又は、食品/飼料添加物などが挙げられるが、これらに限定されない)、及びα−アミラーゼを、1種類又は2種類以上の食品材料と混合することを含む、そのような食品組成物の調製方法、又は、その使用にも関する。
アミラーゼを使用した、布地を処理する(例えば、織物を湯通しする)組成物及び方法もまた想到される。布地の処理方法は、当該技術分野において周知である(例えば、米国特許第6,077,316号を参照されたい)。例えば、布地の感触及び外観は、その布地を溶液中でアミラーゼと接触させることを含む方法により改善することができる。布地は、圧力下で溶液により処理することができる。
本発明の組成物及び方法の一態様は、アミラーゼを構成成分として含有する洗浄組成物である。アミラーゼポリペプチドは、手洗い、洗濯物洗浄、食器洗浄、及び他の硬質表面の洗浄のための洗剤組成物の成分として使用することができる。
好ましくは、アミラーゼは、洗剤中のアミラーゼに従来から使用されている濃度で、又はそれに近い濃度で、洗剤に組み込まれる。例えば、アミラーゼポリペプチドは、(酵素タンパク質純分として計算して)洗浄/食器洗浄液1リットル当たり、0.00001〜1mgのアミラーゼに相当する量で添加されてもよい。次に例示する通り、配合例を本明細書において提供する。
HDL洗濯洗剤組成物例には、アニオン性洗浄界面活性剤(線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアルコキシ化硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩、及び/又はこれらの混合物からなる群から選択される)、及び場合により非イオン性界面活性剤(線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換アルキルアルコキシ化アルコール、例えば、C8〜C18アルキルエトキシ化アルコール及び/又はC6〜C12アルキルフェノールアルコキシレートからなる群から選択される)を含有する洗浄界面活性剤(10%〜40% wt/wt)が含まれ、非イオン性洗浄界面活性剤に対するアニオン性洗浄界面活性剤(6.0〜9の親水性指数(HIc)を有する)の重量比は1:1超である。好適な洗浄性界面活性剤としてはまた、カチオン性洗浄性界面活性剤(アルキルピリジニウム化合物、アルキル四級アンモニウム化合物、アルキル四級ホスホニウム化合物、アルキル三級スルホニウム化合物、及び/又はこれらの混合物の群から選択される);双性イオン性及び/又は両性の洗浄性界面活性剤(アルカノールアミンスルホベタインの群から選択される);両性界面活性剤;半極性非イオン性界面活性剤及びこれらの混合物が挙げられる。
例示的なHDD洗濯洗剤組成物は、アニオン性洗浄性界面活性剤(例えば、線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアルコキシ化硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩、及び/又はこれらの混合物からなる群から選択される)、非イオン性界面活性剤(例えば、線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換C8〜C18アルキルエトキシラート、及び/又はC6〜C12アルキルフェノールアルコキシレート)、カチオン性洗浄性界面活性剤(例えば、アルキルピリジニウム化合物、アルキル四級アンモニウム化合物、アルキル四級ホスホニウム化合物、アルキル三級スルホニウム化合物、及びこれらの混合物)、双性イオン性及び/又は両性の洗浄性界面活性剤(例えば、アルカノールアミンスルホベタイン)、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤及びこれらの混合物を含有する洗浄性界面活性剤;リン酸塩フリーのビルダー(例えば、ゼオライトビルダー例は、0wt%〜10wt%未満の範囲内にゼオライトA、ゼオライトX、ゼオライトP及びゼオライトMAPを含む)、リン酸塩ビルダー(例えば、0wt%〜10wt%未満の範囲内のトリポリリン酸ナトリウム)、クエン酸、クエン酸塩及びニトリロ三酢酸、ケイ酸塩(例えば、0wt%〜10wt%未満の範囲内のケイ酸ナトリウム若しくはケイ酸カリウム又はメタケイ酸ナトリウム、又は層状ケイ酸塩(SKS−6))を含むビルダー;炭酸塩(例えば、0wt%〜80wt%未満の範囲内の炭酸ナトリウム及び/又は炭酸水素ナトリウム);並びに光漂泊剤(例えば、スルホン化亜鉛フタロシアニン、スルホン化アルミニウムフタロシアニン、キサンテン誘導体色素、及びこれらの混合物)疎水性若しくは親水性漂白活性剤(例えば、ドデカノイルオキシベンゼンスルホネート、デカノイルオキシベンゼンスルホネート、デカノイルオキシ安息香酸又はその塩、3,5,5−トリメチル(trimethy)ヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート、テトラアセチルエチレンジアミン−TAED、ノナノイルオキシベンゼンスルホネート−NOBS、ニトリルクワット(nitrile quats)、及びこれらの混合物)、過酸化水素源(例えば、その無機過水和物塩例としては、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩、又は過ケイ酸塩のモノ又はテトラヒドレートナトリウム塩が挙げられる)、予備形成親水性及び/若しくは疎水性過酸(例えば、過カルボン酸及び塩、過炭酸及び塩、過イミド酸及び塩、ペルオキシ一硫酸及び塩、並びにこれらの混合物)、並びに/又は漂白触媒(例えば、イミン漂白促進剤(例として、イミニウムカチオン及びポリイオンが挙げられる)、イミニウム双性イオン、変性アミン、変性アミンオキシド、N−スルホニルイミン、N−ホスホニルイミン、N−アシルイミン、チアジアゾール二酸化物、ペルフルオロイミン、環状糖ケトン、及びこれらの混合物、並びに含金属漂白触媒(例えば、亜鉛又はアルミニウムなどの補助金属のカチオン、及びエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸(メチレンホスホン酸)などの金属イオン封鎖剤と共に、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン、又はマンガンカチオン、及びこれらの水溶性塩)を含む漂白剤、を含む。
例示的なADW洗剤組成物は、0〜10重量%の量で存在するエトキシ化非イオン性界面活性剤、アルコールアルコキシル化界面活性剤、エポキシ末端処理ポリ(オキシアルキル化)アルコール、又はアミンオキシド界面活性剤を含む非イオン性界面活性剤;リン酸塩ビルダー(例えば、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、その他のオリゴマーリン酸塩、トリポリリン酸ナトリウム−STPP)及びリン酸塩フリーのビルダー(例えば、メチルグリシン二酢酸(MGDA)並びにこれらの塩及び誘導体、グルタミンN,N二酢酸(GLDA)並びにこれらの塩及び誘導体、イミノジコハク酸(IDS)並びにこれらの塩及び誘導体、カルボキシメチルイヌリン並びにこれらの塩及び誘導体、ニトリロ三酢酸(NTA)、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)、B−アラニン二酢酸(B−ADA)及びこれらの塩、ポリカルボン酸のホモポリマー及びコポリマー並びにこれらの部分的に又は完全に中和された塩、単量体ポリカルボン酸及びヒドロキシカルボン酸並びにこれらの塩を0.5重量%〜50重量%の範囲で含むアミノ酸系化合物を5〜60%の範囲で含むビルダー;寸法安定性をもたらすための約0.1重量%〜約50重量%の範囲のスルホン化/カルボキシル化ポリマー;約0.1重量%〜約10重量%の範囲の乾燥助剤(例えば、ポリエステル、特にアニオン性ポリエステル、任意追加的に3〜6個の官能基を有する更なるモノマー(官能基は、典型的には重縮合、ポリカーボネート−、ポリウレタン−及び/若しくはポリ尿素−ポリオルガノシロキサン化合物又はこれらの、特に反応性環状炭酸及び尿素タイプの前駆化合物、の助けとなる酸、アルコール、又はエステル官能基));約1重量%〜約20重量%の範囲のケイ酸塩(ケイ酸ナトリウム若しくはケイ酸カリウム(例えば二ケイ酸ナトリウム)、メタケイ酸ナトリウム、及び結晶性フィロケイ酸塩を含む);無機漂白剤(例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩、及び過ケイ酸塩等の過水和物塩)及び有機漂白剤(例えば、ジアシル及びテトラアシルペルオキシドを含む有機ペルオキシ酸、特にジペルオキシドデカン二酸、ジペルオキシテトラデカン二酸、及びジペルオキシヘキサデカン二酸);漂白活性剤(即ち、約0.1重量%〜約10重量%の範囲の有機過酸前駆体);漂白触媒(例えば、マンガントリアザシクロノナン及び関連する錯体、Co、Cu、Mn、及びFeビスピリジルアミン及び関連する錯体、並びにペンタミジンアセテートコバルト(III)及び関連する錯体);約0.1重量%〜5重量%の範囲の金属ケア剤(例えば、ベンゾトリアゾール(benzatriazoles)、金属塩及び錯体、並びに/又はケイ酸塩);自動食器洗浄洗剤組成物1グラム当たり活性酵素約0.01〜5.0mgの範囲内の酵素(例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、リンオキシダーゼ、ぺルオキシダーゼ/オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リゾホスホリパーゼ、アシル基転移酵素、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、及びこれらの混合物);及び酵素安定剤成分(例えば、オリゴ糖、ポリサッカライド、及び無機二価金属塩)を含む。
本発明のアミラーゼを添加し得る、例示的な更なる洗剤処方を以下の番号を付した段落に記載する。
布片及び微小布片アッセイを含む、数多くのα−アミラーゼ洗浄アッセイが当該技術分野において既知である。添付の実施例は、このようなアッセイをほんのわずかに記載する。
本発明のα−アミラーゼは、醸造(即ち、発酵麦芽飲料の製造)のプロセスにおいて使用される醸造用組成物の成分であってもよい。非発酵性炭水化物は、最終的なビールにおいて溶解した固形物の大半を占める。この残留物は、麦芽のアミラーゼが、デンプンのアルファ−1,6−結合を加水分解できないために、残留する。非発酵性炭水化物は、ビール0.35L(12オンス)当たり、約50カロリーとなる。アミラーゼは、グルコアミラーゼ、並びに任意選択で、プルラナーゼ、及び/又はイソアミラーゼと組み合わされて、デンプンをデキストリン及び発酵性の糖へと変換することを助け、最終的なビール中の残余非発酵性炭水化物を減らす。
α−アミラーゼは、液化、及び/又は糖化方法において使用されたとき、ヨウ素陽性デンプン(IPS)を低減させることができる。IPSの発生源の1つは、加水分解を逃れたアミロース由来、及び/又は老化デンプンポリマー由来である。デンプン分子には、互いに結合して、結晶度を増加させようとする傾向があるため、デンプンの老化は、エージングの際のデンプンペースト、又はゲルにおいて、自然発生的に起こる。低濃度の溶液は、デンプン分子がより大きな一体物へと進行的に結合することに起因して、次第に濁るようになる。自然発生的な沈殿が起こり、沈殿したデンプンは、デンプン本来の、冷水に不可溶な状態へと戻る。より高濃度のペーストは、冷却の際、ゲルへと凝固し、このゲルは、エージングの際には、デンプン分子の結合が増すことに起因して、着実に固化していく。このことは、隣接するデンプン分子のヒドロキシ基間に水素結合を形成する強い傾向があるために起こる。J.A.Radley,ed.,Starch and its Derivatives 194〜201(Chapman and Hall,London(1968))を参照されたい。
PcuAmy1のクローニング及び発現
PcuAmy1(NCBI受託番号:ZP_07385374.1)は、細菌株パエニバチルス・カードラノリティカス(Paenibacillus curdlanolyticus)由来のα−アミラーゼである。発現プラスミドを作製し、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)中でのその発現を評価した。発現コンストラクトを、GeneRay Biotech Co.,Ltd(Shanghai,China)によって合成した。この発現コンストラクトは、aprEプロモーター、B.ズブチリス(B. subtilis)中で標的タンパク質分泌を指示するために用いられるaprEシグナル配列、ペプチドAla−Gly−Lysをコードして標的タンパク質の分泌を促進するAGK−proAprEという名前のオリゴヌクレオチド、及びPcuAmy1の最適化配列(配列番号1)を含有する。合成コンストラクトをXhoI及びEcoRIで消化し、同じ制限酵素で消化されたp2JMベースのベクターに連結して発現プラスミドp2JM706を得た。このライゲーション混合物を使用して、ケミカルコンピテント大腸菌(E. coli)TOP10セル(Invitrogen Corp.)をメーカーのプロトコルに従って形質転換した。この形質転換細胞を、アンピシリン50ppmを加えたLuria寒天プレート上に蒔いて、37℃°で一晩インキュベートした。3個の形質転換体をプレートから採取して、アンピシリン50ppmを加えたLuriaブロス5mLに接種した。培養物を37℃°で一晩増殖させた。プラスミドを抽出し、PcuAmy1遺伝子の配列をDNA塩基配列決定法.により確認した。
GCCGACAACGGCACAATCATGCAGTATTTCGAGTGGTACCTGCCGAACGACGGAGCGCACTGGAACAGACTTAATAACGACGCACAAAACCTGAAAAATGTGGGCATCACGGCAGTGTGGATTCCTCCGGCATACAAGGGCGGCAGCTCAGCAGATGTTGGCTACGGAGTTTACGATACATACGACCTGGGCGAGTTCAATCAGAAAGGCACGGTCAGAACAAAGTACGGAACGAAGAGCGAACTGATTTCAGCGGTCAACAATCTTCACGCAAAGGGCATTGCGGTTTACGGCGACGTGGTCCTGAACCATAGAATGAATGCGGATGCAACGGAGCTTGTGGATGCGGTTGAGGTGGATCCGAACAACAGAAACGTCGAGACGACAAGCACGTATCAGATCCAGGCATGGACGCAATACGATTTCCCGGGCAGAGGCAACACGTACAGCAGCTTTAAATGGAGATGGTATCACTTCGACGGCGTCGACTGGGACCAGAGCAGAGGCCTGAACAGAATCTATAAGCTGAGAGGCGATGGCAAGGATTGGGACTGGGAGGTCGACAGCGAGTACGGCAACTACGATTACCTGATGGGAGCGGACCTGGACTTCAACCACCCGGATGTGGTTAACGAAACAAAGACATGGGGCAAATGGTTTGTGAACACGGTGAACCTGGATGGCGTCAGACTGGACGCGGTTAAGCACATCAAGTTCGACTTCATGAGAGACTGGGTGAACAACGTGAGAAGCACGACGGGCAAGAACCTTTTCGCAGTTGGCGAGTATTGGCACTACGACGTGAACAAACTGAACAGCTACATCACGAAGACGAATGGCACGATGAGCCTGTTCGACGTGCCGCTGCACTTTAGATTTTATGATGCAAGCAACGGCGGAGGCGGCTACGACATGAGAAACCTGCTGAATAACACGCTGATGAGCAGCAACCCGATGAAGGCGGTTACATTCGTTGAGAACCATGACACACAACCGACGCAGGCCCTGCAATCAACGGTCCAAAGCTGGTTTAAGCCGCTTGCGTATGCTACAATCCTGACGAGAGAGCAAGGCTACCCGTGCGTTTTCTACGGCGACTATTATGGAACAAGCGACGGCAAAATTAGCAGCTACAAGCCGATCATGGATAAGCTTCTTAACGCGAGAAAGGTGTACGCCTACGGCACGCAGAGAGATTACTTCGATCATCCGGACATCGTTGGCTGGACAAGAGAAGGCGATGCAGCACATGCTGGCTCAGGACTGGCAACGCTTATCACAGATGGCCCTGGCGGAAGCAAGTGGATGTATGTTGGAACGTCAAAGGCAGGCCAGGTCTGGACGGATAAAACAGGAAACAGAAGCGGAACGGTGACGATTGATGCCAATGGCTGGGGAAACTTTTGGGTTAATGGCGGATCAGTTAGCGTTTGGGCAAAATAA
ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLRGDGKDWDWEVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPTQALQSTVQSWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNGGSVSVWAK
PcuAmy1の変異体PcuAmy1−v1のクローニング及び発現
Arg−177及びGly−178の欠失を有するPcuAmy1変異体(PcuAmy1−v1)(即ち、del(R177,G178)、ΔR177−ΔG178、又はΔRG;Suzuki,Y.et al.(1989)J.Biol.Chem.264:18933〜38))を発現プラスミド内で構築して、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)中の発現を評価した。4個のプライマーを配列番号1に基づき、遺伝子操作を受けた制限部位及び重複区域を用いて設計した。まず、Arg−177及びGly−178の前の前側部分断片並びにArg−177及びGly−178の後側部分配列をPCRによって別々に得た。次にオーバーラップエクステンションPCRを、これらの2つの断片を組み合わせて実行し、完全長PcuAmy1−v1遺伝因子を得た。
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PcuAmy1及び変異体のタンパク質分解開裂
野生型PcuAmy1アミラーゼ又はPcuAmy−v1変異体のスブチリシンプロテアーゼによるインキュベーションは、反応生成物がSDS/PAGE電気泳動を受けるときに観察されるようにタンパク質の開裂につながる。図2は、増加するGG36プロテアーゼ(ゲルの上に示されるように0〜40μg)の存在下での20μgのPcuAmy1−v1の開裂を示すSDS/PAGEゲルの画像である。ゲルの右側の文字は、(A)無傷の完全長PcuAmy1−v1、(B)PcuAmy1−v1の第1の開裂産物、(C)GG36プロテアーゼ、(D)GG36タンパク質調製物中の汚染物質、及び(E)PcuAmy1−v1の第2の開裂産物を示す。PcuAmy−v1アミラーゼのスブチリシンプロテアーゼによるインキュベーション後に観察された主な分解産物は、約38及び16kDaの分子量(それぞれB及びE)を有する。タンパク質分解量は、使用されるプロテアーゼの濃度に依存する。これは、一般的に用いられるスブチリシンプロテアーゼを含有する酵素洗剤処方に含めるための最適以下のPcuAmy1アミラーゼを生成する。
タンパク質分解開裂に対するPcuAmy1変異体の耐性
この実施例では、PcuAmy1−v3を発現するバチルス・ズブチリス株(Bacillus subtilis strains)のコンストラクション及び更なる変異体3A〜3Lを記載する。PcuAmy1−v3は、突然変異E186P、G472K並びに欠失R177及びG178を有するPcuAmy1の変異体である。置換E186P並びにR177及びG178における欠失は、PcuAmy1の洗剤安定性を向上させる。置換G472Kは、クリーニング性能を改善する。これらの突然変異はいずれもプロテアーゼ感度に何ら影響を及ぼさない(データは示さず)。したがって、プロテアーゼ安定性における他の突然変異の影響を調査するために作製された変異体にこれらの突然変異を含めても、結果に干渉しない。
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個々の及び組み合わせた突然変異の影響の更なる分類
実施例4に記載の小スケールの試験の結果は、位置T333における突然変異がPcuAmy1のタンパク質分解開裂を著しく減少させること、及びA335、Q337、及びS342における突然変異から更なる効果が得られることを示唆している。T351Wの突然変異もまた、PcuAmy1のタンパク質分解開裂を減少させる。プロテアーゼ耐性に対するこれらの突然変異の関連条件をより良好に特性化するために、以下の追加の変異体を実施例4に記載されたものと類似の方法で作製した。
PcuAmy1−v10:Δ R177−ΔG178−E186P−T333G−Q337E−G472K
PcuAmy1−v11:Δ R177−ΔG178−E186P−T333G−A335S−G472K
PcuAmy1−v12:Δ R177−ΔG178−E186P−A335S−Q337E−G472K
PcuAmy1−v13:Δ R177−ΔG178−E186P−T333G−A335S−Q337E−T351W−G472K
PcuAmy1−v3B:ΔR177−ΔG178−E186P−T333G−A335S−Q337E−G472K
PcuAmy1−v3L:ΔR177−ΔG178−E186P−T333G−A335S−Q337E−S342T−G472K。
PcuAmy1変異体のクリーニング性能
精製されたPcuAmy1−v3B及びPcuAmy1−v3Lのクリーニング性能をマイクロスウォッチ洗浄アッセイで分析した。デンプンの境界を示す指示染料を含む綿布片上のCFT CS−28米デンプン(Center for Testmaterials,BV(Vlaardingen,Netherlands))を、ディスク形成用に直径5.5mmで抜き打ち形成した。2枚のディスクを3つの平底ノンバインディング96ウェルアッセイプレートの各ウェル内に定置した。
液体洗剤中のPcuAmy1変異体の熱安定性
市販の洗剤Persil Universal Gel Gold(Henkel(Dusseldorf,Germany))を95℃にて3時間で熱失活させ、存在する酵素活性を除去した。不活性化に続き、熱失活された洗剤中の酵素活性を、Suc−AAPF−pNA基質に基づいた、かつCeralphaアッセイ(Megazyme(Wicklow,Ireland))を使用して測定し、任意のプロテアーゼ及びアミラーゼ活性をそれぞれ消滅させるようにした。洗剤の10%溶液を次に水で作製した。
改善された性能を有する組み合わせPcuAmy1変異体
タンパク質分解開裂に対するPcuAmy1変異体を生成したので、性能を強化する突然変異の効果を検討した。突然変異の組み合わせは、位置N125、F152、E186、N205、G472、及びG473において、位置R177及びG178における欠失と組み合わせで作製された(番号付けには配列番号3を使用)。試験された変異体を表4に示す。
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Claims (46)
- TIMバレル構造を有するα−アミラーゼのタンパク質分解開裂に対する感受性を低減する方法であって、β−バレルの第7ストランドと第7ヘリックスを連結するループ中に存在する非カノニカルで表面が露出したアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置換して変異体α−アミラーゼを生成することを含み、前記変異体α−アミラーゼは、親α−アミラーゼと比較して、プロテアーゼによる前記β−バレルの前記第7ストランドと前記第7ヘリックスを連結する前記ループ中の開裂に対する感受性が低減し、配列番号3が位置の番号付けに使用される、方法。
- 前記非カノニカルで表面が露出したアミノ酸残基が、前記親α−アミラーゼにおける位置333に対応する位置に存在し、配列番号3が位置の番号付けに使用される、請求項1に記載の方法。
- 前記親α−アミラーゼにおける位置335に対応する位置に存在する前記アミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置換することを更に含み、配列番号3が位置の番号付けに使用される、請求項2に記載の方法。
- 前記親α−アミラーゼが、位置333に対応する前記位置にグリシン又はグルタミン以外のアミノ酸残基を有する、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記親α−アミラーゼが、位置333に対応する前記位置にスレオニンを有する、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 位置333に対応する前記位置において前記アミノ酸残基をグリシンに置換する、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記親α−アミラーゼが、位置335に対応する前記位置にセリン以外のアミノ酸残基を有する、請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 位置335に対応する前記位置において前記アミノ酸残基をセリンに置換する、請求項3〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記親α−アミラーゼにおいて、
(i)位置177、178、179、及び180に対応する位置における1つ若しくは2つ以上のアミノ酸残基の欠失、
(ii)位置186に対応する位置に存在するアミノ酸残基の置換、又は
(iii)位置472に対応する位置に存在するアミノ酸残基の置換、の突然変異のうち、1つ又は2つ以上を作製することを更に含み、
前記結果として生じる変異体が、前記親と比較して洗剤組成物において増大した洗剤安定性及び/又は増大したクリーニング性能を有し、配列番号3が位置の番号付けに使用される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。 - 前記親α−アミラーゼにおいて、
(i)位置177、及び178に対応する位置における前記アミノ酸残基の欠失、
(ii)位置186に対応する位置に存在するアミノ酸残基のプロリンへの置換、又は
(iii)位置472に対応する位置に存在するアミノ酸残基のアルギニン若しくはリシンへの置換、の突然変異のうち、1つ又は2つ以上を作製することを更に含み、
前記結果として生じる変異体が、前記親と比較して洗剤組成物において増大した洗剤安定性及び/又は増大したクリーニング性能を有し、配列番号3が位置の番号付けに使用される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。 - N125、F152、N205、及びG473に対応する位置で1つ又は2つ以上の突然変異を作製することを更に含み、配列番号3が位置の番号付けに使用される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異体が、
(i)N125Y+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K、
(ii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K、
(iii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472R+G473R、
(iv)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+Q337E+G472K、
(v)N125Y+E186P+T333G+A335S+G472K、
(vi)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472K、
(vii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472R+G473R、
(viii)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+G472K、
(ix)N125Y+E186P+T333G+G472K、
(x)N125Y+F152W+E186P+T333G+G472K、
(xi)N125Y+F152W+E186P+T333G+G472R+G473R、及び
(xii)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+G472Kからなる群から選択される突然変異の組み合わせを含む、請求項11に記載の方法。 - 前記親又は前記変異体α−アミラーゼが、配列番号3に対し少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法によって調製される変異体α−アミラーゼ。
- 親α−アミラーゼの変異体であって、前記変異体は、前記親α−アミラーゼにおける位置333に対応する位置に存在するアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基への置換を含み、前記変異体α−アミラーゼは、前記親α−アミラーゼと比較して、プロテアーゼによる前記β−バレルの前記第7ストランドと前記第7ヘリックスを連結するループ中の開裂に対する感受性が低減し、配列番号3が位置の番号付けに使用される、変異体。
- 開裂に対する前記感受性を更に低減するため、前記親α−アミラーゼにおける位置335に対応する位置に存在する前記アミノ酸残基の異なるアミノ酸残基への置換を更に含み、配列番号3が位置の番号付けに使用される、請求項15に記載の変異体。
- 前記親α−アミラーゼが、位置333に対応する前記位置にグリシン又はグルタミン以外のアミノ酸残基を有する、請求項15又は16に記載の変異体。
- 前記親α−アミラーゼが、位置333に対応する前記位置にスレオニンを有する、請求項15〜17のいずれか一項に記載の変異体。
- 前記変異体α−アミラーゼが、位置333に対応する前記位置にグリシンへの置換を有する、請求項15〜18のいずれか一項に記載の変異体。
- 前記親α−アミラーゼが、位置335に対応する前記位置にセリン以外のアミノ酸残基を有する、請求項15〜19のいずれか一項に記載の変異体。
- 前記変異体α−アミラーゼが、位置335に対応する前記位置にセリンへの置換を有する、請求項16〜20のいずれか一項に記載の変異体。
- 前記親に関連して、
(i)位置177、178、179、及び180に対応する位置における1つ又は2つ以上のアミノ酸残基の欠失、
(ii)位置186に対応する位置に存在するアミノ酸残基の置換、
(iii)位置472に対応する位置に存在するアミノ酸残基の置換、の突然変異のうち、1つ又は2つ以上を更に含み、
前記変異体が、前記親と比較して洗剤組成物において増大した洗剤安定性及び/又は増大したクリーニング性能を有し、位置の番号付けは配列番号3を参照する、請求項15〜21のいずれか一項に記載の変異体。 - 前記親に関連して、
(i)位置177、及び178に対応する位置におけるアミノ酸残基の欠失、
(ii)位置186に対応する位置に存在するアミノ酸残基のプロリンへの置換、
(iii)位置472に対応する位置に存在する前記アミノ酸残基のアルギニン又はリシンへの置換、の突然変異のうち、1つ又は2つ以上を更に含み、
前記変異体が、前記親と比較して洗剤組成物において増大した洗剤安定性及び/又は増大したクリーニング性能を有し、前記位置の番号付けは配列番号3を参照する、請求項15〜22のいずれか一項に記載の変異体。 - N125、F152、N205、及びG473からなる群から選択される位置における突然変異を更に含む、請求項15〜23のいずれか一項に記載の変異体。
- 位置177、178、179、及び180に対応する位置における1つ又は2つ以上のアミノ酸残基の欠失を含み、
(i)N125Y+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K、
(ii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K、
(iii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472R+G473R、
(iv)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+Q337E+G472K、
(v)N125Y+E186P+T333G+A335S+G472K、
(vi)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472K、
(vii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472R+G473R、
(viii)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+G472K、
(ix)N125Y+E186P+T333G+G472K、
(x)N125Y+F152W+E186P+T333G+G472K、
(xi)N125Y+F152W+E186P+T333G+G472R+G473R、及び
(xii)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+G472Kからなる群から選択される突然変異の組み合わせを更に含む、請求項15〜24のいずれかに記載の変異体。 - 前記親又は前記変異体が、配列番号3に対し少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項15〜24のいずれか一項に記載の変異体。
- 請求項14〜26のいずれか一項に記載のα−アミラーゼを含む組成物。
- 界面活性剤を更に含む、請求項27に記載の組成物。
- 前記組成物が、洗濯洗剤、洗濯洗剤添加剤、又は手洗い用若しくは自動食器洗い洗剤である、請求項27又は28に記載の組成物。
- プロテアーゼ、へミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、脂肪分解酵素、メタロ脂肪分解酵素、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドラーゼ、クチナーゼ、ぺクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナーゼ、ケラチナーゼ、還元酵素、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシターゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、メタロプロテイナーゼ、アマドリアーゼ、及びPcuAmy1以外のα−アミラーゼからなる群から選択される1つ又は2つ以上の追加の酵素、又はそれらの変異体を更に含む、請求項27〜29のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、デンプンを含む組成物の糖化用、液化後SSF用、若しくは事前液化なしの直接SSF用、又は発酵飲料若しくは焼成食品の生産用である、請求項27に記載の組成物。
- 前記組成物が織物湯通し用である、請求項27又は28に記載の組成物。
- 請求項14〜26のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチド。
- 配列番号1の前記ポリヌクレオチドに対し少なくとも80%の核酸配列同一性を有するか、又は配列番号1の前記ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項33に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項33又は34に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項35に記載の前記発現ベクターを含む、宿主細胞。
- グルコースを含む組成物の生産、液化デンプンの生産、食材若しくは飲料の生産、デンプン質の染みの洗浄、又は織物湯通しにおける、請求項16〜26のいずれか一項に記載のα−アミラーゼの用法。
- 表面からデンプン質の染み又は汚れを除去する方法であって、
前記表面を、請求項16〜26のいずれか一項に記載の有効な量の前記変異体α−アミラーゼを含む組成物及び任意追加的に界面活性剤と接触させることと、
前記α−アミラーゼが前記デンプン質の染み中に存在するデンプン成分を加水分解できるようにして、水溶液に溶解するより小さなデンプン由来の分子を産生することと、を含み、
それによって、前記表面から前記デンプン質の染みを除去し、
前記組成物が、任意追加的に、プロテアーゼ、へミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、脂肪分解酵素、メタロ脂肪分解酵素、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドラーゼ、クチナーゼ、ぺクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナーゼ、ケラチナーゼ、還元酵素、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシターゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、メタロプロテイナーゼ、アマドリアーゼ、及びPcuAmy1以外のα−アミラーゼからなる群から選択される少なくとも1つの追加の酵素、又はそれらの変異体を更に含む、方法。 - 織物を湯通しする方法であって、
糊付けされた織物を請求項14〜26のいずれか一項に記載の有効な量の変異体α−アミラーゼと接触させることと、
前記α−アミラーゼが前記織物用糊のデンプン成分を加水分解できるようにして、水溶液に溶解するより小さなデンプン由来の分子を産生することと、を含み、
それによって、前記織物から前記織物用糊を除去する、方法。 - デンプンを含む組成物を糖化して、グルコースを含む組成物を生産するための方法であって、
前記デンプンを含む組成物を請求項14〜26のいずれか一項に記載の有効な量の変異体α−アミラーゼと接触させることと、
前記デンプンを含む組成物を糖化させて前記グルコースを含む組成物を生産することと、を含み、
前記α−アミラーゼが前記デンプン溶液のグルコースへの前記糖化を触媒する、方法。 - 前記デンプンを含む組成物が、液化デンプン、糊化デンプン、又は粒状デンプンを含む、請求項40に記載の方法。
- 食材又は飲料を調製する方法であって、
デンプンを含む食材又は飲料を請求項14〜26のいずれか一項に記載のα−アミラーゼと接触させることと、
前記α−アミラーゼが前記デンプンを加水分解できるようにして、より小さなデンプン由来の分子を産生することと、を含み、
前記方法が、前記食材又は飲料をグルコアミラーゼ、ヘキソキナーゼ、キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、プルラナーゼ、β−アミラーゼ、前記変異体α−アミラーゼでないα−アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、イソアミラーゼ、酸化還元酵素、エステラーゼ、トランスフェラーゼ、ペクチナーゼ、α−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、又はこれらの組み合わせと接触させることを任意追加的に更に含む、方法。 - 前記α−アミラーゼが宿主細胞により発現され、分泌される、請求項40〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記デンプンを含む組成物を前記宿主細胞と接触させる、請求項43に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、更にグルコアミラーゼ又は他の酵素を発現し、分泌する、請求項43又は44に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、前記組成物を発酵させ得るものである、請求項43〜45のいずれか一項に記載の方法。
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