CN107653283B - 一种黄霉素的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黄霉素的制备方法，是将黄霉素种子罐培养液转移到发酵罐中，以专用发酵培养基进行发酵，并提供了专用发酵培养基的组成。本发明的有益效果为：本发明提供的黄霉素的制备方法，能够有效节省黄霉素生产成本，每罐批次发酵可以节约原材料成本4900‑5600元；产素效率高，本发明在180小时的效价与补油工艺240小时的效价相当甚至高于补油工艺；发酵过程不补料，无需补料罐与补料系统支持，以及避免了在补料当中人力物力的损耗。

Description

一种黄霉素的制备方法
技术领域
本发明涉及抗生素生产技术领域，具体涉及一种黄霉素的制备方法。
背景技术
黄霉素(Flavomycin)属于弱酸性的磷酸多糖抗生素。黄霉素能够干扰有害细菌细胞壁物质肽聚糖的生物合成，导致细菌细胞壁的破裂，从而抑制和杀灭沙门氏菌属、梭菌属和大肠杆菌等有害细菌。黄霉素分子量很大，在消化道中不被吸收，发挥作用后以原形排出体外，在动物的各种组织及产品(如肉、蛋、奶等)中没有药物残留，目前被广泛用作动物饲料添加剂。
在现有技术中吴海燕发表的硕士学位论文中研究了黄豆饼粉，豆粕粉，棉籽蛋白粉，生物氮素，酵母粉和黄豆粉，蛋白胨对黄霉素发酵生产的影响结果表明生物氮素和黄豆饼粉作为主要有机氮源时生产能力较高。虽然这两种有机氮源在发酵生产中表现比较出色，大部分黄霉素生产厂家均将生物氮素、黄豆饼粉和豆粕粉作为主要有机氮源,如中牧实业股份有限公司申请的专利CN 101717803 A以及专利CN 105132495 A，但是发酵行业经过九年的技术积累,更为多样的有机氮源也进一步被发掘出来，在价格上与产素效果上更加适合黄霉素发酵的有机氮源也日益增多，现在再使用生物氮素、黄豆饼粉和豆粕粉作为有机氮源已经变得不合适。
《黄霉素产菌BB1213的发酵工艺优化》描述黄霉素在摇瓶发酵中32-38h之间开始大量合成黄霉素，44h后黄霉素产量变化缓慢，86-96h时黄霉素产量达到最高。从中可以看出黄霉素产素高峰期在前中期,后期产素效率较低，这是黄霉素发酵行业的一个痛点，黄霉素的发酵周期一般在220-240h之间发酵周期较长，但是后期产素效率低导致黄霉素生产效率较差。
在现有工艺当中通常使用补油工艺或者补液化淀粉工艺，补豆油工艺的作用是为了解决黄霉素在发酵初期溶氧不足，影响发酵水平这一问题。补液化淀粉工艺是为了替代豆油降低成本。但是无论是补油工艺还是补液化淀粉，都需要补料设备与补料系统以及工作人员的支持，而且其染菌风险也同样被提高，增加了生产成本。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种黄霉素的制备方法，能够有效降低黄霉素生产成本，提高黄霉素生产效率，减少发酵设备以及人力上的投入，提高企业资金利用率。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种黄霉素的制备方法，是将黄霉素种子罐培养液转移到发酵罐中，以专用发酵培养基进行发酵。
进一步的，上述的一种黄霉素的制备方法，所述黄霉素种子罐培养液的制备方法，包括以下步骤：
1)将冷冻管保藏的生产菌种Streptomyces bambergiensis YJ-172号菌种(此菌种由浙江钱江生物技术有限公司馈赠)接入已灭菌的种子培养基中，接种量为0.9-1.1毫升菌液/100毫升培养基，培养温度34-37℃，摇床转速270-300转/分，培养20-24小时获得摇瓶种子培养液；每100ml摇瓶种子培养液中含有玉米浆0.2g、黄豆粉4.0g、葡萄糖4.0g、磷酸二氢钾0.1g、氯化钠0.02g、碳酸钙0.25g，调pH为7.2-7.8即可；
2)将步骤1)得到的摇瓶种子培养液通过无菌操作转入已灭菌的种子罐，培养基使用种子培养基，搅拌转速120-160r/min，罐温35-37℃培养40-48h，获得种子罐种子培养液；种子罐培养基组成为：玉米淀粉43g/L、玉米浆7g/L、玉米蛋白粉25g/L、碳酸钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、α-淀粉酶8μ/g玉米淀粉。
进一步的，上述的一种黄霉素的制备方法，发酵的具体条件为：发酵温度35-37℃，移种量为发酵培养基体积的15-20％，发酵罐搅拌转速为200-300r/min，通气比1：(1.2-1.5)，发酵周期为180小时。
进一步的，上述的一种黄霉素的制备方法，发酵的具体条件为：发酵温度36℃，移种量为发酵培养基体积的18％，发酵罐搅拌转速为280r/min，通气比1：1.3，发酵周期为180小时。
进一步的，上述的一种黄霉素的制备方法，发酵培养基的组成为：玉米淀粉45-50g/L、玉米浆7g/L、玉米蛋白粉23g/L、豆油20-25g/L、磷酸二氢钾0.08g/L、碳酸钙4g/L、氯化铵3g/L、氯化钠0.002g/L、硫酸铜0.003g/L、硫酸镁0.2g/L、聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.1g/L、α-淀粉酶8μ/g玉米淀粉。
进一步的，上述的一种黄霉素的制备方法，发酵培养基的组成为：玉米淀粉46g/L、玉米浆7g/L、玉米蛋白粉23g/L、豆油24g/L、磷酸二氢钾0.08g/L、碳酸钙4g/L、氯化铵3g/L、氯化钠0.002g/L、硫酸铜0.003g/L、硫酸镁0.2g/L、聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.1g/L、α-淀粉酶8μ/g玉米淀粉。
本发明采用了比吴海燕的氮源优化更为多样的有机氮源进行筛选,最终得到更为适合黄霉素生产的有机氮源玉米蛋白粉，玉米蛋白粉蛋白含量高,用于黄霉素生产用量少,产抗能力更强。如75吨发酵罐计料体积按60吨来算，需要1.8吨豆粕粉，而使用本技术配方玉米蛋白粉只需要1.29吨就能满足工艺要求，且两种氮源价格接近一定程度上降低了生产成本。表1显示为玉米蛋白粉检验报告，表2显示为豆粕粉检验报告。
表1
检验项目 标准规定 检验结果
性状 呈粉状或颗粒状、无发霉、结块、虫蛀 合格
气味 具有蛋白粉固有气味，无腐败变质气味 合格
色泽 呈浅黄色至黄褐色、色泽均匀 合格
干燥失重 ≤12.0％ 4％
蛋白质 ≥50.0％ 66.0％
粗灰分 ≤4.0％ 2.4％
表2
检验项目 标准规定 检验结果
性状 浅黄色颗粒或粉末、无霉变 合格
鉴别 具有大豆特殊腥味 合格
干燥失重 ≤13.0％ 4％
蛋白质 ≥45.0％ 47.3％
针对黄霉素后期产素慢，生产效率低的问题(黄霉素作为次级代谢产物生产厂家改进工艺的思路一般是提高后期黄霉素产素水平，对于前期产素的研究涉及较少)，本发明提供了自己的独特解决方案，利用有机氮源玉米蛋白粉易于被生产菌吸收利用，且能够刺激生产菌快速产抗，通过研究4.5％-5.0％液化淀粉在发酵前期能够刺激生产菌快速产抗。提高前期的产抗速率，从而在较短的周期内达到甚至超过原工艺水平。
基于前面的技术改进，为了保证发酵培养基原有碳氮比，本发明经过优化豆油含量被控制在2.0％-2.5％。较低的豆油含量显著改善了原4％的豆油配方引起的发酵初期溶氧偏低问题，再利用现新疆本地动力成本低的优势，适当提高搅拌转速与通风量，使得生产菌在最耗氧的初期，无需补水等来改善溶氧。
发酵流程如图1所示。
本发明与现有技术相比：生产成本低，发酵产素效率高，发酵水平与现有技术相当甚至更高，对发酵设备要求低，不需要补料罐和补料系统。表3显示为本发明与现有补豆油工艺成本对比。
表3
补豆油工艺 本发明工艺
豆油(公斤) 3000-3300 1500-1875
淀粉(公斤) 2250 3375-3750
豆粕粉(公斤) 1800 -
玉米蛋白粉(公斤) - 1290
成本 32572.5-34378.5 24456-27707.25
本发明技术已在75吨发酵罐上规模生产，技术可靠，发酵周期180小时，平均效价为14813μ/ml，高于2016年度补油工艺平均放罐效价10753μ/ml(发酵周期240小时)。
本发明的技术关键点为：
(1)基础培养基中以玉米蛋白粉原料；
(2)培养基中玉米淀粉与豆油配比重新调整；
(3)发酵过程工艺控制及参数调整；
(4)发酵过程不补料工艺。
本发明的有益效果为：
(1)本发明节省黄霉素生产成本：
从表3可以看出每罐批发酵可以节约原材料成本4900-5600(元)。
(2)产素效率高：
从表4可以看出本发明在180小时的效价与补油工艺240小时的效价相当甚至高于补油工艺。
(3)发酵过程不补料，无需补料罐与补料系统支持，以及在补料当中人力物力的损耗。
具体实施方式
本发明黄霉素制备方法中，种子罐培养液的制备方法如下：
(1)将冷冻管保藏的生产菌种Streptomyces bambergiensis YJ-172号菌种(此菌种由浙江钱江生物技术有限公司馈赠)接入已灭菌的种子培养基中，接种量为0.9-1.1毫升菌液/100毫升培养基，培养温度34-37℃，摇床转速270-300转/分，培养20-24小时获得摇瓶种子培养液。
种子培养基配方：(g/100ml)
玉米浆0.2、黄豆粉4.0、葡萄糖4.0、磷酸二氢钾0.1、氯化钠0.02、碳酸钙0.25、PH7.2-7.8(消后6.5-6.8)。
(2)将上述摇瓶种子培养液通过无菌操作转入已灭菌的种子罐，培养基使用种子培养基，搅拌转速120-160r/min，罐温35-37℃培养40-48h，获得种子罐种子培养液。
种子罐培养基：玉米淀粉43g/L、玉米浆7g/L、玉米蛋白粉25g/L、碳酸钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、α-淀粉酶8μ/g玉米淀粉。
(3)最后将种子罐培养液转移到发酵罐中，35-37℃培养。其中移种量为按照体积百分比计发酵培养基体积的15-20％，发酵罐搅拌转速为200-300r/min，每分钟通气比1：1.2-1：1.5，发酵周期为180小时。
发酵培养基：玉米淀粉45-50g/L、玉米浆7g/L、玉米蛋白粉23g/L、豆油20-25g/L、磷酸二氢钾0.08g/L、碳酸钙4g/L、氯化铵3g/L、氯化钠0.002g/L、硫酸铜0.003g/L、硫酸镁0.2g/L、聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.1g/L、α-淀粉酶8μ/g玉米淀粉。
以下实例除了发酵培养基配方和步骤(3)发酵罐过程工艺参数有区别外，其余均采用上述发酵过程。
实施例1：
步骤(3)中，将种子罐培养液转移到发酵罐中，35-37℃培养。其中移种量为15体积％发酵培养基体积，发酵罐搅拌转速为200r/min，每分钟通气比1：1.2，发酵周期为180小时
发酵培养基：玉米淀粉50g/L、玉米浆7g/L、玉米蛋白粉23g/L、豆油20g/L、磷酸二氢钾0.08g/L、碳酸钙4g/L、氯化铵3g/L、氯化钠0.002g/L、硫酸铜0.003g/L、硫酸镁0.2g/L、聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.1g/L、α-淀粉酶8μ/g玉米淀粉。
实施例2：
步骤(3)中，将种子罐培养液转移到发酵罐中，35-37℃培养。中移种量为16体积％发酵培养基体积，发酵罐搅拌转速为230r/min，每分钟通气比1：1.3，发酵周期为180小时
发酵培养基:玉米淀粉50g/L、玉米浆7g/L、玉米蛋白粉23g/L、豆油20g/L、磷酸二氢钾0.08g/L、碳酸钙4g/L、氯化铵3g/L、氯化钠0.002g/L、硫酸铜0.003g/L、硫酸镁0.2g/L、聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.1g/L、α-淀粉酶8μ/g玉米淀粉。
实施例3：
步骤(3)中，将种子罐培养液转移到发酵罐中，35-37℃培养。中移种量为17体积％发酵培养基体积，发酵罐搅拌转速为250r/min，每分钟通气比1：1.4，发酵周期为180小时
发酵培养基:玉米淀粉50g/L、玉米浆7g/L、玉米蛋白粉23g/L、豆油20g/L、磷酸二氢钾0.08g/L、碳酸钙4g/L、氯化铵3g/L、氯化钠0.002g/L、硫酸铜0.003g/L、硫酸镁0.2g/L、聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.1g/L、α-淀粉酶8μ/g玉米淀粉。
实施例4：
步骤(3)中，将种子罐培养液转移到发酵罐中，35-37℃培养。中移种量为18体积％发酵培养基体积，发酵罐搅拌转速为280r/min，每分钟通气比1：1.3，发酵周期为180小时
发酵培养基:玉米淀粉50g/L、玉米浆7g/L、玉米蛋白粉23g/L、豆油20g/L、磷酸二氢钾0.08g/L、碳酸钙4g/L、氯化铵3g/L、氯化钠0.002g/L、硫酸铜0.003g/L、硫酸镁0.2g/L、聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.1g/L、α-淀粉酶8μ/g玉米淀粉。
实施例5：
步骤(3)中，将种子罐培养液转移到发酵罐中，35-37℃培养。中移种量为20体积％发酵培养基体积，发酵罐搅拌转速为300r/min，每分钟通气比1：1.5，发酵周期为180小时
发酵培养基:玉米淀粉50g/L、玉米浆7g/L、玉米蛋白粉23g/L、豆油20g/L、磷酸二氢钾0.08g/L、碳酸钙4g/L、氯化铵3g/L、氯化钠0.002g/L、硫酸铜0.003g/L、硫酸镁0.2g/L、聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.1g/L、α-淀粉酶8μ/g玉米淀粉。
实施例6：
步骤(3)中，将种子罐培养液转移到发酵罐中，35-37℃培养。中移种量为18体积％发酵培养基体积，发酵罐搅拌转速为280r/min，每分钟通气比1：1.3，发酵周期为180小时
发酵培养基:玉米淀粉45g/L、玉米浆7g/L、玉米蛋白粉23g/L、豆油25g/L、磷酸二氢钾0.08g/L、碳酸钙4g/L、氯化铵3g/L、氯化钠0.002g/L、硫酸铜0.003g/L、硫酸镁0.2g/L、聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.1g/L、α-淀粉酶8μ/g玉米淀粉。
实施例7：
步骤(3)中，将种子罐培养液转移到发酵罐中，35-37℃培养。中移种量为18体积％发酵培养基体积，发酵罐搅拌转速为280r/min，每分钟通气比1：1.3，发酵周期为180小时
发酵培养基:玉米淀粉46g/L、玉米浆7g/L、玉米蛋白粉23g/L、豆油24g/L、磷酸二氢钾0.08g/L、碳酸钙4g/L、氯化铵3g/L、氯化钠0.002g/L、硫酸铜0.003g/L、硫酸镁0.2g/L、聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.1g/L、α-淀粉酶8μ/g玉米淀粉。
实施例8：
步骤(3)中，将种子罐培养液转移到发酵罐中，35-37℃培养。中移种量为18体积％发酵培养基体积，发酵罐搅拌转速为280r/min，每分钟通气比1：1.3，发酵周期为180小时
发酵培养基:玉米淀粉47g/L、玉米浆7g/L、玉米蛋白粉23g/L、豆油23g/L、磷酸二氢钾0.08g/L、碳酸钙4g/L、氯化铵3g/L、氯化钠0.002g/L、硫酸铜0.003g/L、硫酸镁0.2g/L、聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.1g/L、α-淀粉酶8μ/g玉米淀粉。
实施例9：
步骤(3)中，将种子罐培养液转移到发酵罐中，35-37℃培养。中移种量为18体积％发酵培养基体积，发酵罐搅拌转速为280r/min，每分钟通气比1：1.3，发酵周期为180小时
发酵培养基:玉米淀粉48g/L、玉米浆7g/L、玉米蛋白粉23g/L、豆油22g/L、磷酸二氢钾0.08g/L、碳酸钙4g/L、氯化铵3g/L、氯化钠0.002g/L、硫酸铜0.003g/L、硫酸镁0.2g/L、聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.1g/L、α-淀粉酶8μ/g玉米淀粉。
上述实施例放罐效价表：
表4显示为不同发酵配方及不同工艺的放罐效价。
表4
Figure BDA0001453059170000071
本发明所用物料来源如表5所示。
表5
物料名称 购买厂家
玉米淀粉 新疆一禾生物科技有限责任公司
玉米浆 河南鑫洋实业有限责任公司
玉米蛋白粉 新疆一禾生物科技有限责任公司
豆油 益海(昌吉)粮油化工有限公司
磷酸二氢钾 四川胜丰磷化工有限公司
碳酸钙 博乐市莹雪碳酸钙制造有限公司
氯化铵 乌鲁木齐艺丰双利化工有限公司
氯化钠 新疆精河盐化有限公司
硫酸铜 天津市盛奥化学试剂有限公司
硫酸镁 南风化工集团股份有限公司
聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚 宜兴市江山生物科技有限公司
α-淀粉酶 邢台市新华酶制剂厂
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种黄霉素的制备方法，其特征在于，是将黄霉素种子罐培养液转移到发酵罐中，以发酵培养基进行发酵；所述黄霉素种子罐培养液的制备方法，包括以下步骤：
1)将冷冻管保藏的生产菌种Streptomyces bambergiensis YJ-172号菌种接入已灭菌的种子培养基中，接种量为0.9-1.1毫升菌液/100毫升培养基，培养温度34-37℃，摇床转速270-300转/分，培养20-24小时获得摇瓶种子培养液；每100ml摇瓶种子培养液中含有玉米浆0.2g、黄豆粉4.0g、葡萄糖4.0g、磷酸二氢钾0.1g、氯化钠0.02g、碳酸钙0.25g，调pH为7.2-7.8即可；
2)将步骤1)得到的摇瓶种子培养液通过无菌操作转入已灭菌的种子罐，培养基使用种子培养基，搅拌转速120-160r/min，罐温35-37℃培养40-48h，获得种子罐种子培养液；种子罐培养基组成为：玉米淀粉43g/L、玉米浆7g/L、玉米蛋白粉25g/L、碳酸钙0 .3g/L、磷酸二氢钾0 .2g/L、α-淀粉酶8μ/g玉米淀粉；
发酵的具体条件为：发酵温度36℃，移种量为发酵培养基体积的18％，发酵罐搅拌转速为280r/min，通气比1：1 .3，发酵周期为180小时；
发酵培养基的组成为：玉米淀粉45-50g/L、玉米浆7g/L、玉米蛋白粉23g/L、豆油20-25g/L、磷酸二氢钾0 .08g/L、碳酸钙4g/L、氯化铵3g/L、氯化钠0.002g/L、硫酸铜0.003g/L、硫酸镁0.2g/L、聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.1g/L、α-淀粉酶8μ/g玉米淀粉。
2.根据权利要求1所述的一种黄霉素的制备方法，其特征在于，发酵培养基的组成为：玉米淀粉46g/L、玉米浆7g/L、玉米蛋白粉23g/L、豆油24g/L、磷酸二氢钾0.08g/L、碳酸钙4g/L、氯化铵3g/L、氯化钠0.002g/L、硫酸铜0.003g/L、硫酸镁0.2g/L、聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.1g/L、α-淀粉酶8μ/g玉米淀粉。
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